ΤΟ ΠΑΡΑ ΕΙΓΜΑ ΤΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΜΥΚΗΤΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΑΠΟ ΑΝΩΤΕΡΑ ΦΥΤΑ ΚΑΙ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ

ΤΟ ΠΑΡΑ ΕΙΓΜΑ ΤΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΜΥΚΗΤΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΑΠΟ ΑΝΩΤΕΡΑ ΦΥΤΑ ΚΑΙ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ Β. Σοφιανοπούλου Ινστιτούτο Βιολογίας, ΕΚΕΦΕ

ιαµεµβρανικές πρωτεΐνες υπεύθυνες για την κυτταρική επικοινωνία µέσω της εξειδικευµένης και ελεγχόµενης µεταφοράς µεταβολιτών (σάκχαρα, αµινοξέα, πεπτίδια, νουκλεοσίδια, νουκλεοτιδικές βάσεις, αζωτούχες ενώσεις, βιταµίνες, ιόντα, ορµόνες, νευροδιαβιβαστές κλπ) Μηχανισµούς αναγνώρισης και πρόσδεσης µεταβολιτών παρόµοιους µε αυτoύς των ενζύµων

ΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ 1. ΚΑΝΑΛΙΑ 2. ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ (Saier, 2000; Mol.Biol.Rev. 64: 354-411) Κανάλια: κανάλια µε δευτεροταγείς δοµές α-έλικας κανάλια δευτεροταγείς δοµές β-βαρελιού (πορίνες) κανάλια τοξινών κανάλια πεπτιδίων

Πρωτεΐνες µεταφορείς: κατατάσσονται µε κριτήριο τις ενεργειακές τους απαιτήσεις παθητικοί και ενεργητικοί πρωτογενούς ενεργότητας δευτερογενούς ενεργότητας τροποποιητές υποστρώµατος (group translocators) συµµεταφορείς αντιµεταφορείς µονοµεταφορείς

Ρόλος των µεταφορέων στους ανώτερους οργανισµούς Ανακατανοµή ή/και ανακύκληση ενδογενών µεταβολιτών σε διάφορους ιστούς ο µεταφερόµενος µεταβολίτης µπορεί να χρησιµεύει ως µοριακό σήµα, νευροδιαβιβαστής, µόριο άµυνας ή ορµόνη Αποµάκρυνση τοξικών µεταβολιτών και ξενοβιοτιοτικών φαρµάκων Γενετικές ασθένειες οφείλονται στη µη φυσιολογική δοµή ή λειτουργία πρωτεϊνικών µεταφορέων (κυστική ίνωση, γενική ή συγγενής µυοτονία, υπερκαλαµική περιοδική παράλυση, κληρονοµική δρεπανοκυττάρωση, δυσαπορρόφηση γλυκόζης, κυστινουρία και καλοήθη ή επιθετικά χολοστατικά σύνδροµα)

Βιολογικά συστήµατα µελέτης διαµεµβρανικών µεταφορέων 1. Saccharomyces cerevisiae 2. ωοκύτταρα Χenopus 3. in vitro συστήµατα (καλλιέργειες κυττάρων από έντοµα ή τον άνθρωπο) 4. Αspergillus nidulans?

Aspergillus nidulans µη παθογόνος ευκαρυωτικός µικροοργανισµός πρότυπο σύστηµα µελέτης πολλαπλών κυτταρικών λειτουργιών µικρός χρόνος ανάπτυξης σε απλά και φθηνά θρεπτικά µέσα σχετικά υψηλή αποδοτικότητα µετασχηµατισµού και δυνατότητα αποµόνωσης σταθερά µετασχηµατισµένων στελεχών, διαθεσιµότητα µεγάλου αριθµού µεταλλαγµένων στελεχών γνωστή και διαθέσιµη η αλληλουχία γονιδιώµατος (2.7χ10 7 bp) φυλετικό, αγενή και παραφυλετικό κύκλο ανάπτυξης ευκολία µελέτης συγκεκριµένων µεταφορέων µε απλές δοκιµασίες ανάπτυξης και µετρήσεις πρόσληψης ραδιοσηµασµένων µεταβολιτών σε καθορισµένο γενετικό υπόβαθρο

ATP de novo GTP AMP IMP XMP GMP αδενίνη υποξανθίνη ξανθίνη γουανίνη ουρικό οξύ αλλαντοΐνη αλλαντοϊκό οξύ ουρεΐδογλυκίνη γλυοξυλική ουρία ουρία αµµωνία

Η µελέτη των µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων είναι πρωταρχικής φυσιολογικής, κλινικής, φαρµακολογικής και αγροτικής σπουδαιότητας

Οικογένειες Μεταφορέων Νουκλεοτιδικών Βάσεων ΝΑΤ (Νucleobase Ascorbate Transporters): αρχαιοβακτήρια, ευβακτήρια, ευκάρυα (µύκητες, έντοµα, φυτά, θηλαστικά) PbuX, UraA, PyrP, UapA, UapC, hsvct1, hsvct2 ΕΝΤ (Εquilibrative Nucleoside Transporters): θηλαστικά, πρωτόζωα hεντ1-3, rent1-3 PRΤ (Purine Related Transporters): αρχαιοβακτήρια, ευβακτήρια, µύκητες CodB, FUR4, FCY2 PUP (PUrine Permeases): φυτά AtPUP1 - AtPUP15 UPS (Ureide Permeases): φυτά AtUPS1 AtUPS5

Μεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων της οικογένειας ΝΑΤ µεταφορείς δευτερογενούς ενεργότητας συντηρηµένη περιοχή 12 αµινοξέων, αλληλουχία υπογραφής >21% ταυτότητα, > 40% οµοιότητα αµινοξικής αλληλουχίας

Γιατί ο Aspergillus nidulans??? Στους περισσότερους µικροοργανισµούς η πρόσληψη πουρινών και πυριµιδινών εξυπηρετεί δύο κύριες λειτουργίες: τη βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων και νουκλεικών οξέων τη χρήση κυρίως των πουρινών ως πηγές αζώτου µετονκαταβολισµότουςσε ουρία και αµµωνία S. cerevisiae: έχει χάσει την ικανότητά του να καταβολίζει πουρίνες. Αυτό το γεγονός αντανακλάται στην εξέλιξη των συστηµάτων πρόσληψης νουκλεοτιδικών βάσεων του µύκητα, που περιλαµβάνουν µεταφορείς ειδικούς για την πρόσληψη πουρινών και πυριµιδινών που ανακυκλώνονται κατά τη βιοσύνθεση νουκλεικών οξέων ενώ δεν διαθέτουν µεταφορείς οξειδωµένων πουρινών, ουρικού οξέος και ξανθίνης που µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως πηγές αζώτου 1. Ικανότητα χρήσης ευρέος φάσµατος νουκλεοτιδικών βάσεων ως µοναδικές πηγές αζώτου (ουρικό οξύ, ξανθίνη, αδενίνη, γουανίνη, υποξανθίνη) 2. Καλά µελετηµένο σύστηµα µεταφοράς πουρινών

Μεταφορείς πουρινών του Aspergillus nidulans UapA: υψηλής συγγένειας, υψηλής µεταφορικής ικανότητας υπεύθυνος για τη µεταφορά των οξειδωµένων πουρινών (ουρικό οξύ και ξανθίνη) UapC: υψηλής συγγένειας, µέσης/χαµηλής µεταφορικής ικανότητας γενικός µεταφορέας πουρινών και αναλόγων τους ΑzgA: υψηλής συγγένειας, υψηλής µεταφορικής ικανότητας µεταφορέας αδενίνης, γουανίνης και υποξανθίνης UapA και UapC: 62% ταύτιση αµινοξικής αλληλουχίας

ΝΑΤ ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ ΣΤΑ ΦΥΤΑ 13 φυτικά γονίδια 1 παράλογο από το ice plant (Mesembryanthenum crystallium) 11 παράλογα από την Arabidopsis 30 EST κλώνοι (ρύζι, ντοµάτα, σόγια κλπ) LPE1 (Leaf permease1) από το καλαµπόκι

LPE1 πρωτεΐνη Χαρακτηριστικά των µελών της οικογένειας ΝΑΤ 487 αµινοξέα, ΜW 53.2 kd 25% ταυτότητα µε τοµεταφορέα UapA, 10-12 πιθανά διαµεµβρανικά τµήµατα Όχι αλληλουχίες πρόσδεσης στο DNA Όχι σηµατοδοτικές αλληλουχίες για στόχευση σε ενδοκυτταρικές δοµές (µιτοχόνδρια, χλωροπλάστες) αλληλουχία υπογραφής ανενεργοποίηση του γονιδίου lpe1 προκαλεί δοµικές αλλαγές στους χλωροπλάστες τον κατ εξοχήν τόπο βιοσύνθεσης των πουρινών

Ενδείξεις ότι η πρωτεΐνη LPE1 συµµετέχει σε µονοπάτια διακίνησης των νουκλεοτιδικών βάσεων διαµέσου µεµβρανών Η µελέτη των µηχανισµών και των συστηµάτων µεταφοράς νουκλεοτιδικών βάσεων δεν είναι εύκολο να πραγµατοποιηθεί σε φυτικά κύτταρα: ο χειρισµός τους σε εργαστηριακές συνθήκες είναι σύνθετος και η παρουσία στα φυτικά κύτταρα πολλαπλών µεταφορέων ΝΑΤ ή PUT οδηγεί σε αυξηµένη πιθανότητα παρουσίας αλληλο-επικαλυπτόµενων εξειδικεύσεων στα διαφορετικά συστήµατα µεταφοράς Το γονίδιο lpe1 παρουσιάζει παρόµοια περιεκτικότητα σε GC µε το γονίδιο uapa Λειτουργική έκφραση της φυτικής πρωτεΐνης στον ασκοµύκητα (βιοχηµική και φυσιολογική λειτουργία)

Γενετικός µετασχηµατισµός του στελέχους ACZ (uapa - uapc - azga - argb-) µε κατάλληλο φορέα έκφρασης (pan-lpe1) SstI uapa promoter NcoI XbaI uapa terminator SalI/XhoI KpnI Φορέας έκφρασης pan-lpe1 5 και 3 ρυθµιστικές περιοχές του γονιδίου uapa το γονίδιο argb που κωδικοποιεί το ένζυµο ornithine carbamoyl transferase που εµπλέκεται στο µονοπάτι βιοσύνθεσης της αργινίνης cdna lpe1 κλώνο 1.6kb 5 UapA 3 UapA ArgB LPE1 NcoI-BamHI XbaI CCATGGATCCCGTGAAGGCCGAG//AGGTACTTCCCCTCGCTCTAGTCTAGA Fusion protein M D P V K A E //R Y F P S L * LPE1 M P P V K A E //R Y F P S L * ACZ: αυξότροφο για την αργινίνη πλήρη απώλεια λειτουργίας των ενδογενών µεταφορέων πουρινών µη ανάπτυξη σε ΜΜ παρουσία διαφορετικών πουρινών ως µοναδικές πηγές αζώτου

γενετικός µετασχηµατισµός στελέχους - δέκτη uapa uapc azga argb εκφράζει µη λειτουργικούς τους ενδογενείς µεταφορείς πουρινών και το ένζυµο ArgB του µονοπατιού βιοσύνθεσης της αργινίνης + κυκλικός φορέας έκφρασης αποµόνωση µετασχηµατισµένων στελεχών σε ελάχιστο θρεπτικό υλικό απουσία αργινίνης

Γενετικές µελέτες µετασχηµατισµένων στελεχών ACZ:pAN-Lpe1 urea NH 4 + Τα µετασχηµατισµένα µε τις φυτικές αλληλουχίες στελέχη αναπτύσσονται µε διαφορετικό ρυθµό σεουρικόοξύκαι ξανθίνη αλλά όχι παρουσία υποξανθίνης, αδενίνης ή γουανιδίνης ως µοναδικές πηγές αζώτου proline uric acid Τα στελέχη LP2 και LP5 αναπτύσσονται έχοντας συµπαγή µορφολογία ανάλογη του στελέχους φυσικού τύπου και του στελέχους που εκφράζει το µεταφορέα UapA TαστελέχηLP4 και LP6 δεν έχουν συµπαγή µορφολογία και παρουσιάζουν µειωµένο ρυθµό ανάπτυξης και σε πηγές αζώτου διαφορετικές των πουρινών uapa - uapa + LP5 LP6 LP2 LP4

Μοριακή Ανάλυση lpe1- Μετασχηµατισµένων Στελεχών ανάλυση κατά Southern uapa uapa+ LP2 LP5 LP4 LP6 lpe1

Μοριακή Ανάλυση lpe1- Μετασχηµατισµένων Στελεχών ανάλυση κατά Southern uapa uapa+ LP2 LP5 lpe1 αριθµός αντιγράφων γονιδίου lpe1 ανάλυση κατά Northern lpe1 επίπεδα έκφρασης γονιδίου lpe1 acn 0 0 1 3.4

η ικανότητα ανάπτυξης των lpe1-µετασχηµατισµένων στελεχών σε ουρικό οξύ ή ξανθίνη οφείλεται στην ενσωµάτωση των φυτικών αλληλουχιών στο γονιδίωµα τουµύκητα και την έκφρασή τους ο ρυθµός ανάπτυξης εξαρτάται από τη θέση ενσωµάτωσης των φυτικών αλληλουχιών και τον αριθµό των αντιγράφων τους, ο οποίος καθορίζει τα επίπεδα έκφρασης της αλληλουχίας lpe1

Αυτογονιµοποίηση-Selfing Κατά τη διάρκεια του φυλετικού κύκλου ανάπτυξης του µύκητα (µειώσεις) όταν υπάρχουν πολλαπλά αντίγραφα πλασµιδιακής αλληλουχίας ενσωµατωµένα στο γονιδίωµάτου, ευνοείται οµόλογος ανασυνδυασµός µεταξύ των αντιγράφων αυτών, που συχνά οδηγεί σε άνιση ανακατανοµή τουαριθµού τους σε µερικούς απογόνους που προέρχονται από διαφορετικά ασκοσπόρια Αποµόνωση απογόνων είτε µε µειωµένο είτε µε αυξηµένο αριθµό αντιγράφων µιας αλληλουχίας LP2 X LP2

Γενετικές µελέτες απόγονων στελεχών LP2, µετά από αυτογονιµοποίηση (selfing) uapa - uapa + LP5 LP2 LP2-S2 LP2-S1 LP2-S0 ουρία Ουρικό οξύ ξανθίνη

Ανάλυση κατά Southern Lpe1 (~9 kb) uapa - uapa + LP2 LP5 LP2-S0 LP2-S1 LP2-S2

Ανάλυση κατά Northern Lpe1 acn 0 0 1 3.4 0.8 5.7 0.4 uapa + uapa - LP2 LP5 LP2-S0 LP2-S1 LP2-S2

τα επίπεδα έκφρασης της αλληλουχίας lpe1, που είναι ευθέως ανάλογα του αριθµού των ενσωµατωµένων πλασµιδιακών αντιγράφων, καθορίζουν την ικανότητα ανάπτυξης σε ουρικό οξύ ή ξανθίνη

Βιοχηµικά Χαρακτηριστικά Μεταφορέα LPΕ1 ρυθµός πρόσληψης ξανθίνης ρυθµός πρόσληψης ξανθίνης (pmol min -1 10-7 κονίδια) 0,3 0,2 0,1 0 0 20 40 60 80 100 120 συγκέντρωση υποστρώµατος (µμ) K m = 30 µμ ±2.5µΜ 1/[V] (1/pmol min -1 10-7 κονιδιοσπόρια) 200 150 100 50 0 Γράφηµα Lineweaver-Burk y = 141,83x + 4,5869 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1/[S] (1/µΜ) V max = 0.22 pmol min -1 10-7 κονιδιοσπόρια

ο Μεταφορέας LPE1 Είναι ευτερογενούς Ενεργότητας επίδραση ενώσεων που διαταράσσουν την ηλεκτροχηµική προωθητική δύναµητηςµεµβράνης στην πρόσληψη ξανθίνης από το µεταφορέα LPE1 LPE1 UapA % πρόσληψη 3 Η -ξανθίνης 120 100 80 60 40 20 0 απουσία αναστολέα DCCD CCCP

% πρόσληψης 3 Η-ξανθίνης Προσδιορισµός της Ειδίκευσης της πρωτεΐνης LPE1 1. Πειράµατα ανταγωνισµού πρόσληψης 10µΜ 3 Η-ξανθίνης παρουσία 300µΜ µηραδιοσηµασµένου ανταγωνιστή 120 100 80 60 40 20 UapA LPE1 0 καφεΐνη ουρακίλη κυτοσίνη θυµίνη γουανίνη αδενίνη υποξανθίνη ουρικό οξύ ξανθίνη

% πρόσληψης 3 Η-ξανθίνης 2. Πειράµατα ανταγωνισµού πρόσληψης 10µΜ 3 Η-ξανθίνης παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων ασκορβικού οξέος 100 UapA LPE1 80 60 40 20 0 100mM 90mM 75mM 45mM 10mM 5mM 0.3mM 35mM 22.5mM 20mM L-ασκορβικό οξύ 0.3mΜ ξανθίνη

το Ασκορβικό Οξύ Προσδένεται Εξειδικευµένα στο Μεταφορέα LPE1 120 100 80 60 40 20 LP2 % πρόσληψης 3 H-προλίνης 0 10 mm 5 mm 0.3 mm προλίνη 20 mm 35 mm 45 mm L-ασκορβικό οξύ

3. Ανταγωνιστική αναστολή (competitive ihhibition) της πρόσληψηςξανθίνηςαπότοασκορβικόοξύ Τιµές K m συγγένειας του µεταφορέα LPE1 για τη ξανθίνη παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων ασκορβικού οξέος Συγκεντρώσεις Ασκορβικού οξέος 5 mm 10 mm 45 mm K m 34 µμ 47 µμ 59 µμ 92 µμ

Λειτουργικός χαρακτηρισµός της πρωτεΐνης LPE1 απότοκαλαµπόκι µε την έκφρασή της στον Aspergillus nidulans Η πρωτεΐνη LPE1 είναι ένας υψηλής συγγένειας, υψηλής µεταφορικής ικανότητας εξειδικευµένος µεταφορέας οξειδωµένων πουρινών (ξανθίνης και ουρικού οξέος) Είναι µεταφορέας δευτερογενούς ενεργότητας και λειτουργεί ως συµµεταφορέας πρωτονίων εσµεύει αλλά δεν µεταφέρει ασκορβικό οξύ Ηθέσηενσωµάτωσης, αριθµόςτωναντιγράφωνκαι τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου lpe1 καθορίζουν τη λειτουργική έκφραση της πρωτεΐνης LPE1

O Aspergillus nidulans εισάγεται ως πρότυπο σύστηµα έκφρασης ετερόλογων µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων Argyrou, Sophianopoulou, Shultes, Diallinas, Plant Cell 13, 953-964 (2001)

ΝΑΤ ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ (ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ ΑΣΚΟΡΒΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ) hsvct1, hsvct2 (human Sodium-dependent Vitamin C Transporters) hsvct1(yslp3): νεφρός, έντερο, ήπαρ (Km=233,8 µμ) hsvct2 (YSLP2): στους περισσότερους από τους ιστούς που έχουν µελετηθεί (Km=22,6 µμ)

Γενετικός µετασχηµατισµός του στελέχους ACZ (uapa - uapc - azga - argb - ) µε κατάλληλο φορέα έκφρασης (pns335/svct2/argb) SstI uapa promoter NcoI XbaI uapa terminator SalI/XhoI KpnI 5 UapA 3 UapA ArgB SVCT2/SVCT1 NcoI / BamHI XbaI φορέας pns335/svct2/argb

Γενετικές και Λειτουργικές Μελέτες ACZ : hsvct2 - Μετασχηµατισµένων Στελεχών αµµωνία ουρικό οξύ WT S2 510 S5 Μετρήσεις Πρόσληψης 3 H ξανθίνης τα µετασχηµατισµένα στελέχη δεν µεταφέρουν ξανθίνη

Λειτουργική έκφραση του δεύτερου ανθρώπινου µεταφορέα ασκορβικού οξέος, hsvct1, στον A. nidulans απουσία ασκορβικού παρουσία ασκορβικού uapa uapa + W2 WT W1 W3

Μεταφορείς ασκορβικού οξέος ARGB 510 W2 W1 wt B - S3 -L-ασκορβικό οξύ + 0.5%L-ασκορβικό οξύ + 0.5%L- ασκορβικό οξύ, 100mΜ NaCl

o A. nidulans µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως σύστηµα ετερόλογης έκφρασης και µελετών σχέσεων δοµής/λειτουργίας µεταφορέων ασκορβικού οξέος της οικογένειας ΝΑΤ από τα θηλαστικά

O Αspergillus nidulans καθιερώνεται ως πρότυπο σύστηµα για το λειτουργικό χαρακτηρισµόκαιτη µελέτη των σχέσεων δοµής λειτουργίας γονιδίων που κωδικοποιούν µεταφορείς της οικογένειας ΝΑΤ από ανώτερους οργανισµούς

ηµοσιεύσεις: Βιβλιογραφία: 1. G. Diallinas, J. Valdez, V. Sophianopoulou, A. Rosa and C. Scazzocchio, 1998. Chimeric purine transportersof Aspergillus nidulans define a domain critical for function and specificity conserved in bacteria, plant and metazoan homologues. EMBO J. 17 (14): 3827-3837. 2. E. Argyrou, V. Sophianopoulou, N. Schultes and G. Diallinas, 2001. Functional characterization of a maize purine transporter by expression in Aspergillus nidulans. Plant Cell 13 (4): 953-964. 3. G. Diallinas and V. Sophianopoulou, 2002. Nucleobase transporters as a novel tool in molecular pharmacology. Rev. Clin. Pharmacokinetics, International Edition 16: 33-35