ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ ΚΑΙ ΥΨΗΛΗΣ ΠΡΟΣΤΙΘΕΜΕΝΗΣ ΑΞΙΑΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΠΟ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΙΚΗ ΒΙΟΜΑΖΑ

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ ΚΑΙ ΥΨΗΛΗΣ ΠΡΟΣΤΙΘΕΜΕΝΗΣ ΑΞΙΑΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΠΟ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΙΚΗ ΒΙΟΜΑΖΑ"

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΤΟΜΕΑΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ, ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ ΚΑΙ ΕΓΚΑΤΑΣΤΑΣΕΩΝ ΑΝΝΑ Α. ΚΑΡΑΠΑΤΣΙΑ Διπλωματούχος Χημικός Μηχανικός ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ ΚΑΙ ΥΨΗΛΗΣ ΠΡΟΣΤΙΘΕΜΕΝΗΣ ΑΞΙΑΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΠΟ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΙΚΗ ΒΙΟΜΑΖΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2015

2 ΑΝΝΑ Α. ΚΑΡΑΠΑΤΣΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ ΚΑΙ ΥΨΗΛΗΣ ΠΡΟΣΤΙΘΕΜΕΝΗΣ ΑΞΙΑΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΠΟ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΙΚΗ ΒΙΟΜΑΖΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Τομέας Ανάλυσης, Σχεδιασμού και Ρύθμισης των Χημικών Διεργασιών και Εγκαταστάσεων Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: 23 Ιουνίου 2015 ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Καθηγητής Κ. Κυπαρισσίδης, Επιβλέπων Καθηγήτρια Μ. Λιακοπούλου-Κυριακίδου, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Α. Κοκόσης, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγήτρια Α. Ζαμπανιώτου, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγήτρια Α. Λεμονίδου, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Ν. Καλογεράκης, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Δ. Κυριακίδης, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής

3 ΑΝΝΑ Α. ΚΑΡΑΠΑΤΣΙΑ Α.Π.Θ. «Πειραματική μελέτη παραγωγής βιοκαυσίμων και υψηλής προστιθέμενης αξίας βιοχημικών προϊόντων από λιγνοκυτταρινική βιομάζα» ISBN «Η έγκριση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν 5343/1932, άρθρο 202, παρ.2).

4 Κάθε επίτευγμα, κάθε βήμα προς τα εμπρός στη γνώση, προκύπτει από το θάρρος, από τη σκληρότητα απέναντι στον εαυτό μας, από την καθαρότητα απέναντι στον εαυτό μας. Φ. Νίτσε

5 Έκθεση Πρωτοτυπίας Έκθεση Πρωτοτυπίας Σ τα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε ολοκληρωμένη παραγωγή βιοκαυσίμων και βιοχημικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία παρήχθησαν σε συνδυασμό βιοαιθανόλη και ηλεκτρικό οξύ μέσω μικροβιακών καλλιέργειών που χρησιμοποίησαν ως πρώτη ύλη τα φυσικά σάκχαρα του φυτού Phalaris aquatica L. (φαλαρίδα). Η βιοαιθανόλη αποτελεί λύση στη γενικότερη εξάρτηση από τα ορυκτά καύσιμα, στο πρόβλημα του περιορισμού τους και ταυτόχρονα στη βλαβερή παραγωγή αεριών του θερμοκηπίου κατά τη χρήση τους. Τα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς προέρχονται από την πιο υποσχόμενη πηγή πρώτων υλών λόγω της αφθονίας των λιγνοκυτταρινικών υλικών στη φύση. Η πλούσια σύνθεση των δομικών συστατικών της λιγνοκυτταρίνης οδηγεί σε ένα ευρύ φάσμα προϊόντων και προτείνεται τα τελευταία χρόνια η ολοκληρωμένη επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας μέσω σύγχρονων βιοδιυλιστηρίων που στηρίζονται σε φιλικές τεχνολογίες προς το περιβάλλον. Η ιδέα ενός σύγχρονου βιοδιυλιστηρίου προωθεί τη συνδυασμένη παραγωγή ενός βιοκαυσίμου μεγάλης δυναμικότητας με την παραγωγή ενός τουλάχιστον βιοχημικού υλικού με πιθανότατα μικρότερο μερίδιο αγοράς, αλλά υψηλή προστιθέμενη αξία. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αξιοποιείται πλήρως για πρώτη φορά το λιγνοκυτταρινικό φυτό Phalaris aquatica (φαλαρίδα) που αποτελεί Μεσογειακό είδος με υψηλή παραγωγή βιομάζας και πλούσια πηγή φυσικών πολυσακχαριτών. Το πρώτο από τα βασικά στάδια της διεργασίας μετατροπής της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας σε βιοαιθανόλη και ηλεκτρικό οξύ είναι η αποτελεσματική προεπεξεργασία της βιομάζας, στοχεύοντας στην αλλαγή της δομικής της σύστασης, στην απομάκρυνση ή στη διαφοροποίηση των δεσμών της λιγνίνης και στην υδρόλυση των ημικυτταρινών. Το στάδιο σημείωσε σημαντική μετατροπή των ημικυτταρινών και υψηλή συγκέντρωση της ξυλόζης και των συνολικών σακχάρων. Η -i-

6 Έκθεση Πρωτοτυπίας στερεή βιομάζα που παραλαμβάνεται από τις βέλτιστες εφαρμοζόμενες συνθήκες της προεπεξεργασίας διαθέτει το χαμηλότερο βαθμό κρυσταλλικότητας και εφαρμόζεται για τη βελτιστοποίηση του δεύτερου κύριου σταδίου της διεργασίας, της ενζυμικής υδρόλυσης. Η στατιστική ανάλυση του πειραματικού σχεδιασμού οδηγεί σε υψηλές αποδόσεις του σταδίου και ικανοποιητική παραγωγή γλυκόζης. Επιπρόσθετα, η συγκέντρωση της γλυκόζης αυξήθηκε με εφαρμογή ημι-συνεχούς τροφοδοσίας στερεής βιομάζας και ταυτόχρονη τροφοδοσία ενζύμου με μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης του υδρολύματος. Εν συνεχεία, το ρεύμα εξόδου της ενζυμικής υδρόλυσης (υδρόλυμα), που διαθέτει αφθονία μονομερών σακχάρων (γλυκόζη), χρησιμοποιήθηκε στην παραγωγή του τελικού προϊόντος της αιθανόλης. Κατά τη ζύμωση από τον μικροοργανισμό S. cerevisiae, οι παράμετροι που επηρεάζουν τις συνθήκες του βιο-συστήματος μελετήθηκαν μέσω πειραματικού σχεδιασμού σε ασυνεχείς συνθήκες, καθώς και σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων. Ο πειραματικός στατιστικός σχεδιασμός μελέτησε την επίδραση του αερισμού, της πηγής αζώτου, του ph, του είδους του στελέχους και του μεγέθους του ενοφθαλμίσματος στη διαμόρφωση πλαισίου λειτουργίας για τη μεγιστοποίηση της απόδοσης σε αιθανόλη (%). Οι συνθήκες ημι-συνεχούς λειτουργίας, οι οποίες καταστρώθηκαν εμπειρικά με διαφορετικό ρυθμό τροφοδοσίας (σταθερό ή εκθετικό), επιτάχυναν την παραγωγή της βιοαιθανόλης μεγιστοποιώντας την παραγωγικότητα της μεθόδου σε σχέση με τις τιμές της βιβλιογραφίας. Η παρούσα μελέτη έθεσε ως στόχο την ταυτόχρονη παραγωγή ενός βιοκαυσίμου (βιοαιθανόλης) και ενός υλικού προστιθέμενης αξίας (ηλεκτρικού οξέος). Το υδρόλυμα που προέρχεται από την υδρόλυση των ημικυτταρινών ( ξυλόζη) και το υδρόλυμα που προέρχεται από την υδρόλυση της κυτταρίνης (γλυκόζη) χρησιμοποιούνται ως πηγές άνθρακα για το αναερόβιο βακτήριο A. succinogenes. Η συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος για το βέλτιστο συνδυασμό είναι ικανοποιητική και η μεταφορά των βέλτιστων συνθηκών της ζύμωσης στο βιοαντιδραστήρα με σύγκριση της διαφορετικής παροχής CO2, συνεχή και ασυνεχή κατά περίπτωση, αύξησε τη συγκέντρωση και την απόδοση. Ο συνδυασμός της παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος με ζύμωση των σακχάρων που προέρχονται από την κατεργασία της βιομάζας, θα μπορούσε να καταστήσει πιο οικονομικά εφικτό το εγχείρημα του βιοδιυλιστηρίου. Η τεχνοοικονομική μελέτη για την αποτίμηση της διεργασίας για δεδομένη διάρκεια ζωής της μονάδας για 20 χρόνια προέβλεψε μια σχετικά μικρή απόδοση -ii-

7 Έκθεση Πρωτοτυπίας του κεφαλαίου. Συνεπώς, η παραγωγή βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη βιοχημική κατεργασία της φαλαρίδας αποτελεί μία οριακά κερδοφόρα επένδυση, με υψηλό ρίσκο. Τα παραπάνω πρωτότυπα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής οδήγησαν στις παρακάτω δημοσιεύσεις σε επιστημονικά περιοδικά και σε ειδικές εκδόσεις επιστημονικών συνεδρίων: Karapatsia A., Penloglou G., Pappas I., Kiparissides C., 2014, Bioethanol production via the fermentation of Phalaris aquatica L. hydrolysate, Chemical Engineering Transactions, 37, Karapatsia A., Penloglou G., Chatzidoukas C., Kiparissides C., 2014, Development of a Macroscopic Model for the Production of Bioethanol with High Yield and Productivity via the Fermentation of Phalaris aquatica L. Hydrolysate, Computer Aided Process Engineering, accepted for publication. Karapatsia A., Penloglou G., Chatzidoukas C., Kiparissides C, 2014, Fed-batch Saccharomyces cerevisiae fermentation of hydrolysate sugars: A dynamic model-based approach for high yield bioethanol production, Biomass and Bioenergy, under review process. Karapatsia A., Penloglou G., Pappas I., Kotrotsiou O., Kiparissides C., 2014, Dilute acid pretreatment optimization of Phalaris aquatica L. lignocellulosic biomass towards bioethanol production, Renewable Energy,, under review process. Karapatsia A., Penloglou G., Pappas I., Kiparissides C., 2013, An Integrated Approach for the Production of Bioethanol and High Value Bio-Products From Lignocellulosic Biomass, Annual Meeting of American Institute of Chemical Engineers (AICHE), San Francisco, USA. Karapatsia A., Penloglou G., Pappas I.A. Kiparissides C, 2013, (Poster), Fermentation of Sugars from Phalaris aquatica L. Hydrolysate for Bioethanol Production, 21 st European Biomass Conference and Exhibition, Copenhagen, Denmark. Pappas I.A., Karapatsia A., Penloglou G., Kiparissides C, 2013, (Poster), Enzymatic conversion of Phalaris aquatica L. lignocellulosic biomass into fermentable sugars for bioethanol production, 21 st European Biomass Conference and Exhibition, Copenhagen, Denmark. -iii-

8 Έκθεση Πρωτοτυπίας Kαραπατσιά Α., Πενλόγλου Γ., Παππάς Ι.Α., Κυπαρισσίδης Κ., 2013, «Μελέτη και Βελτιστοποίηση της Παραγωγής Βιοαιθανόλης 2ης Γενιάς κατά την ολοκληρωμένη επεξεργασία της Λιγνοκυτταρινικής Βιομάζας του φυτού Phalaris aquatica L.», 9ο ΠΕΣΧΜ: Η Συμβολή της Χημικής Μηχανικής στην Αειφόρο Ανάπτυξη, Αθήνα, Ελλάδα. Karapatsia Α., Pappas Ι.Α., Penloglou G., Kiparissides C., 2012, On the bioconversion of Phalaris aquatica L. lignocellulosic biomass into biofuels and high added-value chemicals, Biofuels for Sustainable Development of Southern Europe (Bio4SuD), November 2012, Thessaloniki, Greece. -iv-

9 Ευχαριστίες Ευχαριστίες A ρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέπων μου καθηγητή Κωνσταντίνο Κυπαρισσίδη για την ευκαιρία που μου έδωσε πριν από τέσσερα χρόνια να συμμετάσχω στο δυναμικό του εργαστηρίου Χημικής Μηχανικής Β του τμήματος Χημικών Μηχανικών, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου και του εργαστηρίου Μηχανικής Πολυμερών και Βιοχημικής του Εθνικού Κέντρου Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης. Η επίβλεψη και η καθοδήγηση του ήταν πάντα καίρια και καθοριστική και τον ευχαριστώ για την ηθική και οικονομική υποστήριξη που μου παρείχε όλα αυτά τα χρόνια. Στη συνέχεια, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της τριμελούς μου επιτροπής, την καθηγήτρια Μαρία Λιακοπούλου-Κυριακίδου για την καθοδήγηση της από τα φοιτητικά μου ακόμη χρόνια και τον καθηγητή Αντώνη Κοκόση για τις καθοριστικές του παρεμβάσεις. Η επιστημονική κατάρτιση των τριών καθηγητών της τριμελούς μου επιτροπής αποτέλεσε κίνητρο για την βέλτιστη απόδοση μου κατά τη διεξαγωγή της διδακτορικής μου διατριβής μου. Επίσης, η συνεργασία μου τον τελευταίο χρόνο με το λέκτορα Χρήστο Χατζηδούκα με εξέλιξε ως επιστήμονα χάρη στην πλήρη αφοσίωση που επιδεικνύει στη δουλειά του και τον ευχαριστώ για την άψογη συνεργασία μας. Η συνεισφορά του διδάκτορος Γιάννη Πενλόγλου στη διεξαγωγή της διδακτορικής μου διατριβής ήταν καθοριστική. Τον ευχαριστώ για την ανιδιοτελή του προσφορά γνώσεων και τεχνικών και την άψογη συνεργασία μας. Το κλίμα φιλίας που αναπτύχθηκε μεταξύ μας κατέστησε τη διεκπεραίωση των εργασιών μας πιο ευχάριστη. Επίσης, ευχαριστώ τον διδάκτορα Γιάννη Παππά για το ξεκίνημα της διδακτορικής μου διατριβής σε εξέλιξη

10 Ευχαριστίες της δικής του διατριβής. Οι πειραματικές απαιτήσεις αναλυτικών τεχνικών της εργασίας μου δε θα ολοκληρωνόταν χωρίς τη συνεισφορά της διδάκτορος Ολυμπίας Κοτρώτσιου, την οποία και ευχαριστώ. Φυσικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω το σύνολο του προσωπικού του εργαστηρίου Χημικής Μηχανικής Β για το υψηλό επιστημονικό επίπεδο και το ευχάριστο κλίμα εργασίας και ιδιαίτερα την Αλέκα Πλατίδου και Μαρία Μπλούτσου για τη διεκπεραίωση οποιονδήποτε διαδικαστικών θεμάτων. Τέλος, τη σημαντικότερη υποστήριξη σε κάθε επίπεδο μου προσέφεραν οι αγαπημένοι μου άνθρωποι και η οικογένεια μου με ιδιαίτερη αυτή του συντρόφου μου Σάββα Χαλναρίδη. Ευχαριστώ ακόμα, τις φίλες μου Jovana Milenkovic και Τζουλιάνα Κράια με τις οποίες δημιουργήσαμε μία ευχάριστη εργασιακή καθημερινότητα. Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του ερευνητικού έργου «Αειφόρος Παραγωγή Βιοκαυσίμων και Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Βιοχημικών Προϊόντων από Λιγνοκυτταρινική Βιομάζα ΛΙΓΝΟΦΟΣ», χρηματοδοτούμενου από τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας, Εθνικό Στρατηγικό Πλαίσιο Αναφοράς (ΕΣΠΑ) , Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα & Επιχειρηματικότητα (ΕΠΑΝ ΙΙ).

11 Περίληψη Περίληψη Η αειφόρος παραγωγή βιοαιθανόλης και βιοχημικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας από λιγνοκυτταρινική βιομάζα αποτελεί λύση στη γενικότερη εξάρτηση από τα ορυκτά καύσιμα, στο πρόβλημα του περιορισμού τους και ταυτόχρονα στη βλαβερή παραγωγή αεριών του θερμοκηπίου κατά τη χρήση τους. Η βιοαιθανόλη αποτελεί συμπληρωματικό βιοκαύσιμο της βενζίνης που καταλήγει σε καθαρότερη καύση της, ενώ η παραγωγή της από λιγνοκυτταρινούχα υλικά αποτελεί τη νέα τεχνολογία βιοκαυσίμων δεύτερης γενιάς. Τα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς προέρχονται από την πιο υποσχόμενη πηγή πρώτων υλών λόγω της αφθονίας των λιγνοκυτταρινικών υλικών στη φύση. Καθώς, η σύγχρονη τεχνολογία της παραγωγής βιοαιθανόλης και υψηλής αξίας βιοχημικών προϊόντων απαιτεί την εφαρμογή βιοτεχνολογικών μεθόδων κατά την επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, η αφθονία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας προσφέρει τη δυνατότητα της έστω μερικής αντικατάστασης των παραδοσιακών ορυκτών καυσίμων ως ανανεώσιμη πηγή ενέργειας και η πλούσια σύνθεση των δομικών συστατικών της οδηγεί σε ένα ευρύ φάσμα προϊόντων, προτείνεται τα τελευταία χρόνια η ολοκληρωμένη επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας μέσω σύγχρονων βιοδιυλιστηρίων που στηρίζονται σε φιλικές τεχνολογίες προς το περιβάλλον. Η ιδέα ενός σύγχρονου βιοδιυλιστηρίου προωθεί τη συνδυασμένη παραγωγή ενός βιοκαυσίμου μεγάλης δυναμικότητας με την παραγωγή ενός τουλάχιστον βιοχημικού υλικού με πιθανότατα μικρότερο μερίδιο αγοράς, αλλά υψηλή προστιθέμενη αξία. Για παράδειγμα, το ηλεκτρικό οξύ αποτελεί ένα σημαντικό ενδιάμεσο βιοχημικό προϊόν που παράγεται μικροβιακά, βρίσκει πληθώρα βιομηχανικών εφαρμογών -i-

12 Περίληψη και προσφέρει προστιθέμενη αξία στην ολοκληρωμένη επεξεργασία της βιομάζας. Η μελέτη της παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από λιγνοκυτταρινούχα φυτά είναι ένα σύνθετο αντικείμενο που απαιτεί εξειδικευμένη έρευνα στο κάθε στάδιο της συνολικής διεργασίας και των παραγόντων που διαμορφώνουν το αποτέλεσμα του. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αξιοποιείται πλήρως για πρώτη φορά το λιγνοκυτταρινικό φυτό Phalaris aquatica (φαλαρίδα) που αποτελεί Μεσογειακό είδος με υψηλή παραγωγή βιομάζας (6,3-11 tn/ha) και πλούσια πηγή φυσικών πολυσακχαριτών (σύνολο δομικών υδατανθράκων 698,31 g/kg ΞΜ). Η επεξεργασία του φυτού ακολούθησε ένα ολοκληρωμένο διάγραμμα ροής που μετατρέπει την ξηρή βιομάζα σε βιοαιθανόλη και ηλεκτρικό οξύ. Το πρώτο από τα βασικά στάδια της διεργασίας μετατροπής της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας σε βιοαιθανόλη και ηλεκτρικό οξύ είναι η αποτελεσματική προεπεξεργασία της βιομάζας, στοχεύοντας στην αλλαγή της δομικής της σύστασης, στην απομάκρυνση ή στη διαφοροποίηση των δεσμών της λιγνίνης και στην υδρόλυση των ημικυτταρινών. Ακολουθεί η χρήση των σακχαρολυτικών ενζύμων στο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης της κυτταρίνης, η οποία διαλυτοποιείται παράγοντας μονομερή σάκχαρα (γλυκόζη), τα οποία με τη σειρά τους ζυμώνονται από το σακχαρομύκητα S. cerevisiae προς το τελικό προϊόν της αιθανόλης. Επίσης, τα μονομερή σάκχαρα (κυρίως ξυλόζη), προερχόμενα από την υδρόλυση των ημικυτταρινών, χρησιμοποιούνται για τη μικροβιακή παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος μετά από ένα ενδιάμεσο στάδιο ουδετεροποίησης. Κατά τη μελέτη της ολοκληρωμένης βιοχημικής διεργασίας, βελτιστοποιήθηκαν τα επιμέρους στάδια της με τη χρήση στατιστικών εργαλείων. Το στάδιο της προεπεξεργασίας βελτιστοποιήθηκε ως προς τη συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης, τη μετατροπή των ημικυτταρινών και το βαθμό κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας ως αποτέλεσμα της προεπεξεργασίας στα δομικά χαρακτηριστικά της βιομάζας. Ο βέλτιστος σχεδιασμός της αποτελεσματικής αραιής όξινης υδρόλυσης πραγματοποιήθηκε μέσω στατιστικής ανάλυσης με εφαρμογή πειραματικού σχεδιασμού Taguchi, λαμβάνοντας υπόψη τις σημαντικότερες παραμέτρους της αντίδρασης (θερμοκρασία, περιεκτικότητα οξέος και χρόνος αντίδρασης). Επιπρόσθετα, το στάδιο της προεπεξεργασίας κρίθηκε μέσω του συνδυαστικού συντελεστή έντασης (CSF), ως προς την επίδραση της ένταση των συνθηκών του σταδίου, στη μετατροπή των ημικυτταρινών, στη συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης και στην αποικοδόμηση των μονομερών σακχάρων σε μικρότερες παρεμποδιστικές ενώσεις. -ii-

13 Περίληψη Οι βέλτιστες επιλεγμένες συνθήκες είναι 110 o C θερμοκρασία, 2% w/v περιεκτικότητα θειικού οξέος και 60 min χρόνος αντίδρασης, οι οποίες επέφεραν μετατροπή ημικυτταρινών 75,04%, ελάχιστα χαμηλότερη τιμή από τη μέγιστη που σημειώθηκε σε ιδιαίτερα ισχυρές συνθήκες υδρόλυσης (80,41%). Η συγκέντρωση της ξυλόζης στο βέλτιστο χειρισμό αντιστοιχεί σε τιμή 10,75 g/l και η συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων 20,04 g/l. Αντίστοιχα, η μέγιστη τιμή της παραγόμενης ξυλόζης που σημειώθηκε είναι 15,52 g/l και των συνολικών σακχάρων 21,47 g/l. Στη συνέχεια, η στερεή βιομάζα, η οποία προέρχεται από το βελτιστοποιημένο στάδιο της προεπεξεργασίας και περιλαμβάνει το σύνολο της κυτταρίνης, οδηγήθηκε στο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. Η στερεή βιομάζα που παραλαμβάνεται από τις βέλτιστες εφαρμοζόμενες συνθήκες της προεπεξεργασίας διαθέτει το χαμηλότερο βαθμό κρυσταλλικότητας (61,2%), χαρακτηριστικό που ευνοεί την αποτελεσματική υδρόλυση της κυτταρίνης. Ο πειραματικός σχεδιασμός Box Behnken χρησιμοποιήθηκε για τη βελτιστοποίηση του δεύτερου κύριου σταδίου της διεργασίας, βασισμένος σε τέσσερις ανεξάρτητες μεταβλητές της ενζυμικής υδρόλυσης (περιεκτικότητα στερεής βιομάζας, περιεκτικότητα ενζύμου, συγκέντρωση επιφανειοδραστικού συστατικού και χρόνος αντίδρασης), αξιολογώντας, μέσω στατιστικής ανάλυσης, την επίδραση τους στη μεγιστοποίηση της παραγόμενης γλυκόζης, που οδηγεί σε υψηλότερες αποδόσεις του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης. Οι επιλεγμένες συνθήκες της βελτιστοποίησης είναι 4% w/v η περιεκτικότητα προεπεξεργασμένης βιομάζας, 20 FPU/g βιομάζας η περιεκτικότητα του ενζύμου της κυτταρινάσης, 48 h χρόνος αντίδρασης και 0,04 g/g βιομάζας η συγκέντρωση επιφανειοδραστικού. Ο συνδυασμός των βελτιστοποιημένων παραγόντων κατέληξε σε παραγωγή γλυκόζης 12,3 g/l και απόδοση σε γλυκόζη 64,8%. Επιπρόσθετα, η συγκέντρωση της γλυκόζης αυξήθηκε με εφαρμογή ημι-συνεχούς τροφοδοσίας στερεής βιομάζας και ταυτόχρονη τροφοδοσία ενζύμου ανά διαστήματα των έξι ωρών. Η μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης γλυκόζης του υδρολύματος που σημειώθηκε ήταν 45,5 g/l με απόδοση γλυκόζης 67,9%. Επιπρόσθετα, το ρεύμα εξόδου της ενζυμικής υδρόλυσης (υδρόλυμα), που διαθέτει αφθονία μονομερών σακχάρων (γλυκόζη), χρησιμοποιήθηκε, χωρίς απαιτητικό ενδιάμεσο στάδιο για τη συμπύκνωση του, στην παραγωγή του τελικού προϊόντος της αιθανόλης. Κατά τη ζύμωση από τον μικροοργανισμό S. cerevisiae, οι παράμετροι που επηρεάζουν τις συνθήκες του βιο- -iii-

14 Περίληψη συστήματος μελετήθηκαν μέσω πειραματικού σχεδιασμού Taguchi σε ασυνεχείς συνθήκες, καθώς και οι παρεμποδιστικοί παράγοντες και οι περιορισμοί που θέτουν οι ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με υψηλές συγκεντρώσεις σακχάρων. Ο πειραματικός στατιστικός σχεδιασμός μελέτησε την επίδραση του αερισμού, της πηγής αζώτου, του ph, του είδους του στελέχους και του μεγέθους του ενοφθαλμίσματος στη διαμόρφωση πλαισίου λειτουργίας για τη μεγιστοποίηση της απόδοσης σε αιθανόλη (%). Η συνεισφορά του αζώτου στην καλλιέργεια του σακχαρομύκητα κρίθηκε ως σημαντικά υψηλή, καθώς και η επίδραση του ph και της προέλευσης του στελέχους του μικροοργανισμού αξιολογήθηκαν ως λιγότερο καθοριστικές στο τελικό αποτέλεσμα της απόδοσης σε αιθανόλη. Οι παράγοντες αερισμός και μέγεθος ενοφθαλμίσματος συμμετείχαν ελάχιστα στη διαμόρφωση του τελικού αποτελέσματος. Στη συνέχεια, η εφαρμογή μίας σειράς διαφορετικών πολιτικών τροφοδοσίας κατά τις συνθήκες ημι-συνεχούς λειτουργίας, οι οποίες καταστρώθηκαν εμπειρικά με διαφορετικό ρυθμό τροφοδοσίας (σταθερό ή εκθετικό), επιτάχυνε την παραγωγή της βιοαιθανόλης μεγιστοποιώντας την παραγωγικότητα της μεθόδου και την περιεκτικότητα του ρεύματος εξόδου σε βιοαιθανόλη (7,5% v/v). Η εκθετική πολιτική τροφοδοσίας με υψηλή συγκέντρωση αρχικών σακχάρων πέτυχε 59,1 g/l συγκέντρωση αιθανόλης με σημαντικά υψηλή παραγωγικότητα αιθανόλης (2,2 (g/(l h)). Οι σύγχρονες επιταγές της έρευνας και της αγοράς κατευθύνουν την παραγωγή των βιοκαυσίμων δεύτερης γενιάς από λιγνοκυτταρινική βιομάζα στο συνδυασμό διαφορετικών τελικών προϊόντων σύμφωνα με τις αρχές του σύγχρονου βιοδιυλιστηρίου. Η ιδέα αυτή υλοποιείται ήδη σε βιομηχανίες που μεταφέρουν τη διεργασία της συνδυασμένης παραγωγής ηλεκτρικού οξέος και αιθανόλης σε βιομηχανική κλίμακα. Η παρούσα μελέτη έθεσε ως στόχο την ταυτόχρονη παραγωγή ενός βιοκαυσίμου (βιοαιθανόλης) και ενός υλικού προστιθέμενης αξίας (ηλεκτρικού οξέος). Το υδρόλυμα που προέρχεται από την υδρόλυση των ημικυτταρινών με 21,4 g/l ξυλόζης και το υδρόλυμα που προέρχεται από την υδρόλυση της κυτταρίνης με παραγωγή ως και 45,5 g/l γλυκόζης χρησιμοποιούνται ως πηγές άνθρακα για το αναερόβιο βακτήριο A. succinogenes. Ιδιαίτερη βαρύτητα δόθηκε στη μελέτη της επίδρασης των παραγόντων του περιβάλλοντος (αναλογία σακχάρων, συγκέντρωση σακχάρων, συγκέντρωση ανθρακικού μαγνησίου, συγκέντρωση όξινου φωσφορικού καλίου και συγκέντρωση εκχυλίσματος μαγιάς) στην παραγόμενη συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος, μέσω πειραματικού σχεδιασμού Taguchi. Η πηγή αζώτου (εκχύλισμα μαγιάς) καθώς και η πηγή CO2 -iv-

15 Περίληψη (MgCO3) διαμορφώνουν σε μεγάλο βαθμό το αποτέλεσμα της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος. Η συνολική συγκέντρωση των σακχάρων δεν επιδρά στην απόδοση του ηλεκτρικού οξέος ενώ ο λόγος της γλυκόζης προς την ξυλόζη επιφέρει αλλαγές στη διαμόρφωση του αποτελέσματος. Η συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος για το βέλτιστο συνδυασμό είναι 5,99 g/l και η μεταφορά των βέλτιστων συνθηκών της ζύμωσης στο βιοαντιδραστήρα αύξησε τη συγκέντρωση σε 11,44 g/l και την απόδοση σε 57,2%. Η σύγκριση της ζύμωσης με διαφορετική παροχή CO2, συνεχή και ασυνεχή κατά περίπτωση, υπέδειξε ότι ο μικροοργανισμός μπορεί να δεσμεύσει το απαραίτητο για την ανάπτυξη του διοξείδιο του άνθρακα από διαφορετικές πηγές, όπως είναι το ανθρακικό ασβέστιο, χωρίς να αλλάζει ιδιαίτερα η παραγωγικότητα του. Ο συνδυασμός της παραγωγής βιοαιθανόλης με πηγή άνθρακα τη γλυκόζη της ενζυμικής υδρόλυσης και της παραγωγής ηλεκτρικού οξέος με ζύμωση των υπολοίπων σακχάρων που προέρχονται από την κατεργασία της βιομάζας, θα μπορούσε να καταστήσει πιο οικονομικά εφικτό το εγχείρημα του βιοδιυλιστηρίου. Η τεχνοοικονομική μελέτη για την αποτίμηση της διεργασίας για δεδομένη διάρκεια ζωής της μονάδας για 20 χρόνια προέβλεψε μια σχετικά μικρή απόδοση του κεφαλαίου. Συνεπώς, η παραγωγή βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη βιοχημική κατεργασία της φαλαρίδας αποτελεί μία οριακά κερδοφόρα επένδυση, με υψηλό ρίσκο, καθώς το εσωτερικό επιτόκιο υπολογίστηκε στο 10,4% ενώ ο δείκτης απόδοσης κεφαλαίου στο 1,04. Ανάμεσα σε πληθώρα μελετών πάνω στην παραγωγή της βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα, η παρούσα διατριβή παρουσιάζει το συνδυασμό της παραγωγής του βιοκαυσίμου με την παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος, ενός βιοχημικού υλικού υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η βελτιστοποίηση της υδρόλυσης της λιγνοκυτταρίνης, της διεργασίας σακχαροποίησης και τελικά της ζύμωσης των σακχάρων καταλήγει σε ένα πλούσιο ρεύμα αιθανόλης με υψηλές τιμές παραγωγικότητας, που προέρχεται από ένα επίσης πλούσιο ρεύμα σακχάρων. Επιπρόσθετα, η προτεινόμενη εκμετάλλευση των λοιπών σακχάρων με στόχο την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος είναι εφικτή, παρουσιάζοντας συγχρόνως περιθώρια βελτίωσης των αποδόσεων. Η ολοκληρωμένη βιοχημική διεργασία με το συνδυασμό της μικροβιακής παραγωγής της αιθανόλης και του ηλεκτρικού οξέος από λιγνοκυτταρινική βιομάζα μελετήθηκε και προτείνεται ως κατάλληλη για μεταφορά της σε μεγαλύτερη κλίμακα. -v-

16 Abstract Abstract Τ he sustainable bioethanol and high-added value biochemicals production from lignocellulosic biomass constitute a potential solution to address the global dependence on fossil fuels, their constant limitation and simultaneously the greenhouse gases reduction. Bioethanol is an additional to gasoline biofuel which results in cleaner combustion. Its production from lignocellulosic materials introduces the new technology of second generation biofuels. Second generation biofuels derive from lignocellulosic biomass, the most promising source of raw materials, due to its abundance in nature. As the modern technology of bioethanol and high added-value biochemicals production requires the application of biotechnological methods to the treatment of lignocellulosic biomass, the abundancy of lignocellulosic biomass tends to replace traditional fossil fuels as a renewable energy source, and the large variety of structural components of lignocellulose leads to a wide range of end products, an integrated lignocellulosic biomass treatment leans towards the application of modern and environmental friendly biorefineries. Thus, the idea of a bio-refinery is established on the combined production of large capacity biofuels with lower market share biochemicals which offer high added-value. In specific, succinic acid is an important intermediate product, microbially produced, which finds multitude of industrial applications and provides added-value to the integrated treatment of biomass. The experimental study of bioethanol and succinic acid production from lignocellulosic biomass represents a complex subject that requires specialized research at each stage of the overall process and the factors that affect the process efficiency. -vi-

17 Abstract In the present dissertation, Phalaris aquatica (Harding grass) is completely utilized as a lignocellulosic resource for the first time. Harding grass is a Mediterranean species with high biomass production ( tn/ha) and a rich source of natural polysaccharides (total structural carbohydrates g/kg DM). Biomass treatment is described by an integrated flowchart, which converts dry plant biomass into bioethanol and succinic acid. The main stages of the lignocellulosic biomass conversion process into bioethanol and succinic acid begin with the effective pretreatment process for the alteration of the lignocellulose structural composition, the removal or the transformation of the lignin bonds and the hemicellulose hydrolysis. Moreover, saccharolytic enzymes are used for the hydrolysis of cellulose at the stage of enzymatic hydrolysis, producing monomer sugars (glucose), which are further fermented by S. cerevisiae yeast into ethanol. Monomer hemicellulose sugars (primarily xylose), which are produced during the pretreatment stage, are exploited as well for the microbial production of succinic acid after an additional step of neutralization. During the study of the integrated biochemical process, the main steps were separately optimized with the aid of statistical tools. The pretreatment step was optimized with respect to the produced xylose concentration, the conversion of hemicellulose and the crystallinity index of the pretreated biomass which reflects the alteration of the structural characteristics of the biomass. The optimal design of an effective dilute acid hydrolysis process was implemented through a statistical study with an experimental Taguchi design, which took into account three significant reaction parameters (temperature, acid concentration and reaction time). Moreover, the pretreatment stage was evaluated, through a combined severity factor, for the effect of the severity of the stage parameters on the hemicellulose conversion, the xylose concentration and the degradation of monomeric sugars into smaller inhibitory compounds. The optimal conditions, which maximize the response parameters, are 110 o C temperature, 2% w / v sulfuric acid concentration and 60 min reaction time, which led to 75.04% hemicellulose conversion, a slightly lower value than the highest one measured (80.41%) under severe hydrolysis conditions. The optimal run yielded g/l xylose concentration and g/l total sugars concentration. The highest xylose and total sugars concentration were g/l and g/l, respectively. In addition, the solid biomass, coming from the optimized pretreatment stage, containing the entire available cellulose, is digested through an enzymatic hydrolysis step. The specific -vii-

18 Abstract pretreated biomass, exhibits the lowest crystallinity index (61.2%) in comparison to other pretreatment runs, which favors an efficient cellulose hydrolysis. The experimental Box Behnken design is utilized for the optimization of the second main process step through a statistical analysis, based on four independent variables of the enzymatic hydrolysis (solid biomass content, enzyme content, surfactant concentration and reaction time), evaluated for their effect on the maximization of the produced glucose concentration, which leads to higher enzymatic hydrolysis yields. The optimal conditions are 4% w/v pretreated biomass concentration, 20 FPU/g biomass cellulase content, 48 h reaction time and 0.04 g/g biomass surfactant concentration. The combination of optimized factors resulted in 12.3 g/l glucose concentration and 64.8% glucose yield. Furthermore, a fed-batch module was implemented to increase the glucose concentration by applying simultaneous feeding of biomass and enzyme loading every six hours. The maximum glucose concentration at the hydrolysate was 45.5 g/l and 67.9% glucose yield. Additionally, the enzymatic hydrolysate, which consists of abundant monomer sugars (glucose), was fermented to yield ethanol by the microorganism S. cerevisiae, without excruciating demands of intermediate concentration step. The parameters affecting the conditions of the bio-system were studied through an experimental Taguchi design in batch module and the inhibitory factors and constraints imposed by fed-batch operating conditions under high sugars concentration were also assessed. Thus, the experimental statistical design determined the effect of aeration, nitrogen source content, ph value, the strain type and the inoculum size to the operating framework for maximizing ethanol yield (%). The contribution of nitrogen to the yeast cultivation was considered significantly high and the effects of ph and microorganism strain were evaluated as less determining to the final performance on ethanol production. The aeration and the inoculum size contributed the least in the final result. Moreover, the implementation of different feeding policies for fed-batch conditions with different feeding rates (constant or exponential), which were empirically identified, enhanced the production of bioethanol and maximized the ethanol productivity and the content of the bioethanol output (7.5% v/v). The exponential feeding policy with high initial sugar concentration reached 59.1 g/l ethanol concentration with significantly high ethanol productivity (2.2 g/(l h)). -viii-

19 Abstract Modern research and market demands drive the production of second generation biofuels deriving from lignocellulosic biomass to the combination with different end-products. The exploitation of the different outputs of lignocellulosic biomass treatment and the by-products of the process apply the ideas of modern bio-refinery. The biorefinery project is already implemented by industries that upgrade the process of cogeneration of succinic acid and ethanol on an industrial scale. This study sets out the production of a biofuel (bioethanol) and a value added material (succinic acid) from lignocellulosic biomass of harding grass. The hydrolysate obtained from hemicellulose hydrolysis with 21.4 g/l xylose and the hydrolysate obtained from cellulose hydrolysis with 45.5 g/l glucose are used as the carbon sources for the anaerobic bacteria Actinobacillus succinogenes. Particular attention was given to the study of five environmental factors (sugar ratio, total sugars, magnesium carbonate, dipotassium phosphate and yeast extract concentration) that affect the output concentration of succinic acid, through an experimental Taguchi design. The nitrogen source (yeast extract) and the CO2 source (MgCO3) critically determines the result of the succinic acid concentration. The concentration of total sugars does not increase the yield of succinic acid, however the changes of glucose to xylose ratio resulted in significant effects. The concentration of succinic acid for the optimum combination is 5.99 g/l and the upscale of the fermentation conditions to the bioreactor increased the concentration to g/l and the succinic acid yield to 57.2%. The comparison of the two bioreactors with continuous and intermittent carbon dioxide supply indicated that the microorganism can bind essential carbon dioxide for its development from different sources, such as calcium carbonate, without significant losses of productivity. The combination of bioethanol production deriving from glucose and succinic acid production deriving from other monomer sugars is considered as more economically feasible option for a bio-refinery concept. The techno-economic study for a given unit lifetime of 20 years predicts a relatively small return of capital. Therefore, the production of bioethanol and succinic acid from the biochemical treatment of harding grass is a marginally profitable investment with high risk, since the internal rate of return is estimated at 10.4% while the profit index to Among various studies on the production of bioethanol from lignocellulosic biomass, the present thesis demonstrates the combination of the biofuel production with the production of succinic acid, a high added-value biochemical. Optimization of the lignocellulose pretreatment, the saccharification process and the sugars fermentation, resulted in a rich -ix-

20 Abstract ethanol stream with high productivity values, deriving from a rich sugars stream, as well. In addition, the proposed exploitation of the rest monomer sugars for the production of succinic acid seems feasible, while showing true potential for yields improvement. The integrated biochemical process of ethanol and succinic acid production from lignocellulosic biomass has been studied and proven suitable for expansion to a larger scale. -x-

21 Περιεχόμενα Πίνακας Περιεχομένων Περίληψη... i Abstract... vi Πίνακας Περιεχομένων... 1 Κατάλογος Πινάκων... 6 Κατάλογος Σχημάτων Κεφάλαιο 1 - Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα Βιοαιθανόλη δεύτερης γενιάς Εισαγωγή στα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας μέσω βιοδιυλιστηρίου Ηλεκτρικό Οξύ Λιγνοκυτταρινική βιομάζα Χαρακτηριστικά του Phalaris aquatιca Πειραματικός Σχεδιασμός Μέθοδος Επιφανειών Απόκρισης (Response Surface Methods, RSM) Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi Σκοπός της Διατριβής Βιβλιογραφία 1 ου Κεφαλαίου

22 Περιεχόμενα Κεφάλαιο 2 - Υλικά και Μέθοδοι Υλικά και Μέθοδοι για την Προεπεξεργασία Λιγνοκυτταρινική Βιομάζα Περιγραφή Πειραματικής διάταξης Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi Συνδυαστικός συντελεστής έντασης (CSF) Αναλυτικές Μέθοδοι Χαρακτηρισμός της βιομάζας Μέτρηση Σακχάρων Δομικά Χαρακτηριστικά της Βιομάζας Υλικά και Μέθοδοι για την Ενζυμική Υδρόλυση Περιγραφή Πειραματικής διάταξης Πειραματικός Σχεδιασμός Box-Behnken Αναλυτικές Μέθοδοι Υλικά και Μέθοδοι για την Καλλιέργεια των Μικροοργανισμών Καλλιέργεια Σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae Στέλεχος Μικροοργανισμού Διατήρηση Μικροοργανισμού Προκαλλιέργεια Μικροοργανισμού Ζύμωση Μικροοργανισμού Πειραματικός Σχεδιασμός Αποστείρωση του Θρεπτικού Μέσου Λειτουργία του Βιοαντιδραστήρα Ρύθμιση του ph κατά την Καλλιέργεια Ζύμωση σε Ημι-συνεχείς συνθήκες (fed-batch) Συμπύκνωση του Υδρολύματος Καλλιέργεια Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Στέλεχος Διατήρηση Στελέχους Προκαλλιέργεια του Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Ζύμωση του Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Πειραματικός Σχεδιασμός

23 Περιεχόμενα Λειτουργία του Βιοαντιδραστήρα Εξουδετέρωση του υδρολύματος Αναλυτικές Μέθοδοι του Σταδίου της Ζύμωσης Δειγματοληψία Μέτρηση της Κυτταρικής Αύξησης On line μετρήσεις Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης Μέτρηση O2 και CO Υπολογισμός Απόδοσης Σταδίου Βιβλιογραφία 2 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 3 - Προεπεξεργασία Εισαγωγή στην Προεπεξεργασία Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Προεπεξεργασίας Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi Αξιολόγηση ως προς το Συνδυαστικό Συντελεστή Έντασης Αλλαγές στα δομικά χαρακτηριστικά της βιομάζας Βιβλιογραφία 3 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 4 - Ενζυμική Υδρόλυση Εισαγωγή στην Ενζυμική Υδρόλυση Βιο-καταλύτες Κατανόηση του φαινομένου της ενζυμικής υδρόλυσης Τα επιφανειοδραστικά στην ενζυμική υδρόλυση Τεχνολογίες για μείωση του κόστους της Ενζυμικής Υδρόλυσης Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Ενζυμικής Υδρόλυσης Βελτιστοποίηση του σταδίου της Ενζυμικής Υδρόλυσης μέσω Παραγοντικού Πειραματικού Σχεδιασμού Box Βenhken Αύξηση τη ποσότητας του στερεού υποστρώματος Στρατηγική Ημι-συνεχούς τροφοδοσίας Βιβλιογραφία 4 ου Κεφαλαίου

24 Περιεχόμενα Κεφάλαιο 5 - Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Εισαγωγή στη Ζύμωση Γενική Περιγραφή Επίδραση διαφορετικών παραμέτρων στη Ζύμωση Ημισυνεχείς συνθήκες τροφοδοσίας Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Ζύμωσης Βελτιστοποίηση του σταδίου της Ζύμωσης μέσω Ορθογώνιου Πειραματικού Σχεδιασμού Taguchi Ζύμωση του Saccharomyces cerevisiae υπό ημι-συνεχείς συνθήκες Αύξηση της συγκέντρωσης αιθανόλης μέσω υψηλής συγκέντρωσης αρχικής τροφοδοσίας γλυκόζης Βιβλιογραφία 5 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 6 - Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του Actinobacillus succinogenes Εισαγωγή στη Ζύμωση Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Ζύμωσης Καλλιέργεια του βακτηρίου A. succinogenes σε κωνικές φιάλες Βελτιστοποίηση του σταδίου της Ζύμωσης μέσω Ορθογώνιου Πειραματικού Σχεδιασμού Taguchi Ζύμωση του Actinobacillus succinogenes σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα Βιβλιογραφία 6 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 7 - Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις Οικονομικά στοιχεία για την παραγωγή αιθανόλης Οικονομικά στοιχεία για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος Οικονομική αποτίμηση μιας ολοκληρωμένης μονάδας Παραδοχές για τη δυναμικότητα της μονάδας Καθορισμός της τιμής πώλησης των προϊόντων Εκτίμηση Κόστους Πάγιας Επένδυσης της μονάδας

25 Περιεχόμενα Εκτίμηση Λειτουργικού Κόστους Μονάδας Βασικά Οικονομικά Μεγέθη και Οικονομικοί Δείκτες Συμπεράσματα της διατριβής Προτάσεις Βιβλιογραφία 7 ου Κεφαλαίου Σύμβολα Συντομογραφίες Παράρτημα Α - Πειραματικός Σχεδιασμός Α.1 Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi A.1.1 Λόγος Σήματος προς Θόρυβο A.1.2 Κατάταξη παραμέτρων Α.2 Βασικές έννοιες στατιστικής ανάλυσης Α.3 Διαγράμματα Υπολειμμάτων Στατιστικής Ανάλυσης Βιβλιογραφία Παραρτήματος Α Παράρτημα Β - Αναλυτικές Μέθοδοι Προσδιορισμού Β.1 Μέθοδος Δινιτρο - σαλικυλικού οξέος Β.2 Μέθοδος Ενζυμικής Μέτρησης Αιθανόλης Β.3 Μέτρηση Βαθμού Κρυσταλλικότητας, XRD Βιβλιογραφία Παραρτήματος Β Παράρτημα Γ - Τεχνοοικονομική Ανάλυση Γ.1 Τεχνοοικονομικά ανάλυση Βιβλιογραφία Παραρτήματος Γ Παράρτημα Δ - Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης Δ.1 Φωτογραφίες Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης

26 Κατάλογος Πινάκων Κατάλογος Πινάκων Πίνακας 1.1. Σύσταση επί ξηρής βιομάζας σε ποσοστό % για διάφορα είδη λιγνοκυτταρινικής βιομάζας 39 Πίνακας 2.1. Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi (L9) για το στάδιο της Προεπεξεργασίας 60 Πίνακας 2.2. Πίνακας 2.3. Πειραματικός σχεδιασμός Box-Behnken τεσσάρων παραγόντων για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. 66 Σύσταση του θρεπτικού μέσου διατήρησης του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae. 69 Πίνακας 2.4. Σύσταση θρεπτικού μέσου προκαλλιέργειας του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae. 70 Πίνακας 2.5. Σύσταση του θρεπτικού μέσου ζύμωσης του σακχαρομύκητα S. cerevisiae.. 72 Πίνακας 2.6. Πίνακας 2.7. Πίνακας 2.8. Πίνακας 2.9. Σύσταση διαλύματος ιχνοστοιχείων του θρεπτικού μέσου της ζύμωσης του σακχαρομύκητα S. cerevisiae.. 73 Πειραματικός σχεδιασμός Taguchi για την καλλιέργεια του σακχαρομύκητα S. cerevisiae. 73 Πολιτική τροφοδοσίας της ζύμωσης σε ημισυνεχείς συνθήκες στην κωνική φιάλη 78 Διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας στον βιοαντιδραστήρα σε ημισυνεχείς συνθήκες λειτουργίας 78-6-

27 Κατάλογος Πινάκων Πίνακας Σύσταση του θρεπτικού μέσου διατήρησης του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. 80 Πίνακας Σύσταση θρεπτικού μέσου προκαλλιέργειας του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. 81 Πίνακας Πίνακας 3.1. Πίνακας 3.2. Πειραματικός σχεδιασμός Taguchi κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. 84 Διαφορετικές μέθοδοι προεπεξεργασίας λιγνοκυτταρινικής βιομάζας συγκρινόμενοι ως προς τα πλεονεκτήματα και τους περιορισμούς του 105 Ορθογώνιος Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi τριών παραγόντων σε τρία επίπεδα με τα πειραματικά αποτελέσματα για τη συγκέντρωση ξυλόζης, τη συγκέντρωση συνολικών σακχάρων και τη μετατροπή των ημικυτταρινών 109 Πίνακας 3.3. Κατάταξη των παραμέτρων σύμφωνα με τη μεγιστοποίηση δύο διαφορετικών κριτηρίων, (α) την απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού (συγκέντρωση ξυλόζης), (β) το λόγο Απόκρισης/Θορύβου (S/N) 111 Πίνακας 3.4. Πίνακας 4.1. Πίνακας 4.2. Πίνακας 4.3. Πίνακας 5.1. Συσχέτιση των τριών μεταβλητών θερμοκρασίας, περιεκτικότητα οξέος και χρόνος αντίδρασης με το βαθμό κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας της φαλαρίδας με αραιό θειικό οξύ. 122 Πειραματικός Σχεδιασμός Επιφανειών Απόκρισης Box Behnken τεσσάρων παραγόντων σε τρία επίπεδα με τα πειραματικά αποτελέσματα για τη συγκέντρωση γλυκόζης Ανάλυση Διακύμανσης για το γραμμικό μοντέλο παλινδρόμησης Box Behnken για τη συγκέντρωση γλυκόζης Μέγιστη συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) με βάση την άριστη λύση του εμπειρικού μοντέλου παλινδρόμησης Ορθογώνιος Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi πέντε παραγόντων σε μικτά επίπεδα με τα πειραματικά αποτελέσματα για την κυτταρική βιομάζα, τη συγκέντρωση και την απόδοση της αιθανόλης

28 Κατάλογος Πινάκων Πίνακας 5.2. Κατάταξη των παραμέτρων σύμφωνα με τη μεγιστοποίηση δύο διαφορετικών κριτηρίων, (α) την απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού (απόδοση αιθανόλης), (β) το λόγο Απόκρισης/Θορύβου (S/N) 182 Πίνακας 5.3. Συνθήκες ζύμωσης όπως βελτιστοποιήθηκαν από το στατιστικό σχεδιασμό Taguchi. 185 Πίνακας 5.4. Αποτελέσματα κυτταρικής βιομάζας, συγκέντρωσης αιθανόλης, παραγωγικότητας αιθανόλης και απόδοση για διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας 195 Πίνακας 5.5. Πίνακας 6.1. Πίνακας 6.2. Συγκεντρωτικά Αποτελέσματα για τις τρεις δοκιμές εκθετικής τροφοδοσίας του αντιδραστήρα για διαφορετική διάρκεια και ρυθμό τροφοδοσίας. 200 Σύσταση θρεπτικού μέσου ζύμωσης για πρωταρχικά πειράματα ανάπτυξης του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. 213 Πειραματικά αποτελέσματα του στατιστικού σχεδιασμού Taguchi για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος από τον μικροοργανισμό Actinobacillus succinogenes 218 Πίνακας 6.3. Κατάταξη των παραμέτρων σύμφωνα με τη μεγιστοποίηση δύο διαφορετικών κριτηρίων, (α) την απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού (συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος), (β) το λόγο Σήματος/Θορύβου (S/N) Πίνακας 6.4. Πίνακας 7.1. Συγκεντρωτικά αποτελέσματα για τις δύο καλλιέργειες του Actinobacillus succinogenes σε επίπεδο αντιδραστήρα με και χωρίς παροχή διοξειδίου του άνθρακα Υπάρχουσες και δοκιμαστικές μονάδες και επενδύσεις για την παραγωγή βιοαιθανόλης ανά τον κόσμο Πίνακας 7.2. Κατανομή πάγιου κόστους επένδυσης. 248 Πίνακας 7.3. Μεταβλητό Λειτουργικό Κόστος μονάδας παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. 249 Πίνακας 7.4. Βασικά Οικονομικά Μεγέθη της επένδυσης. 253 Πίνακας 7.5. Βασικοί Οικονομικοί Δείκτες της επένδυσης διάρκειας 20 χρόνων. 254 Πίνακας 7.6. Υπάρχουσες και μελλοντικές χρήσεις της λιγνίνης

29 Κατάλογος Πινάκων Πίνακας A.1. Μέθοδος Υπολογισμού των παραμέτρων της κατάταξης του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi. 277 Πίνακας Α.2. Πίνακας Ανάλυσης Διακύμανσης

30 Κατάλογος Σχημάτων Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 1.1. Η παραγωγή των βιοκαυσίμων στην Ευρώπη των 28 την περίοδο σε ktoe 23 Σχήμα 1.2. Σχήμα 1.3. Σχήμα 1.4. Σχήμα 1.5. Διαφορετικές οδοί για την παραγωγή βιοκαυσίμων πρώτης και δεύτερης γενιάς.. 24 Διάγραμμα Ροής της βιοτεχνολογικής παραγωγής βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα 29 Προτεινόμενη στρατηγική βιοδιυλιστηρίου βασισμένου στην επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας για την παραγωγή βιοαιθανόλης και ποικιλίας βιοχημικών υλικών και χημικών που προέρχονται από θερμοχημική διεργασία. 33 Διάφορα προϊόντα και χημικές ενώσεις που παρασκευάζονται από το ηλεκτρικό οξύ 35 Σχήμα 1.6. Το φυτό Phalaris aquatica στο σημείο καλλιέργειας σε ύψος 1,5 m. 41 Σχήμα 1.7. Διάφορα μέρη (ταξιανθία, σπόρος, ρίζα) του φυτού Phalaris aquatica L 42 Σχήμα 1.8. Πειραματικός σχεδιασμός Box Behnken τριών παραμέτρων.. 46 Σχήμα 1.9. Διάγραμμα παραμέτρων Taguchi 48 Σχήμα Διάγραμμα Ροής για τη συνολική διεργασία παραγωγής αιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα Phalaris aquatica

31 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 2.1. Σχήμα 2.2. Χρωματογράφημα (Χρόνος Έκλουσης Ένταση Σήματος) του Αναλυτή Δείκτη Διάθλασης κατά την Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης για μίγμα πρότυπων Σακχάρων με συγκέντρωση 20 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της Προεπεξεργασίας. 63 Χρωματογράφημα (Χρόνος Έκλουσης Ένταση Σήματος) του Αναλυτή Δείκτη Διάθλασης κατά την Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης για μίγμα πρότυπων Σακχάρων με συγκέντρωση 20 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της Ενζυμικής Υδρόλυσης. 67 Σχήμα 2.3. Τρυβλία διατήρησης μεμονωμένων αποικιών του Saccharomyces cerevisiae.. 69 Σχήμα 2.4. Δομή των παρεμποδιστικών ενώσεων που προέρχονται από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα 86 Σχήμα 2.5. Σχήμα 2.6. Σχήμα 2.7. Σχήμα 3.1. Σχήμα 3.2. Σχήμα 3.3. Καμπύλη γραμμικής συσχέτισης της οπτικής πυκνότητας (OD) των κυττάρων του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae με το βάρος της ξηρής βιομάζας (συγκέντρωση βιομάζας, DCW). 88 Εικόνα μικροσκοπίου (α) με οπτική πυκνότητα OD=15 και (β) με οπτική πυκνότητα OD= Χρωματογράφημα (Χρόνος Έκλουσης Ένταση Σήματος) του Αναλυτή Δείκτη Διάθλασης κατά την Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης για μίγμα πρότυπων Σακχάρων με συγκέντρωση 25 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της Ζύμωσης.. 90 Δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Οι ίνες της κυτταρίνης όπως περιβάλλονται από ημικυτταρίνες και λιγνίνη 97 Αλλαγή στη δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας με τη δράση της προεπεξεργασίας 99 Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi της προεπεξεργασίας

32 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 3.4. Σχήμα 3.5. Σχήμα 3.6. Σχήμα 3.7. Σχήμα 3.8. Ανάλυση Διακύμανσης (ANOVA) για τις τρεις ελεγχόμενες παραμέτρους κατά την προεπεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας της φαλαρίδας με αραιό θειικό οξύ 113 Διαγράμματα κύριων επιδράσεων των τριών παραγόντων θερμοκρασία, οξύ, χρόνος αντίδρασης στη συγκέντρωση της ξυλόζης κατά την προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica 114 Διαγράμματα κύριων επιδράσεων των τριών παραγόντων θερμοκρασία, οξύ, χρόνος αντίδρασης στη μετατροπή των ημικυτταρινών κατά την προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica. 115 Διάγραμμα Χωροσταθμικών Καμπυλών των συνθηκών της προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica: (α) Περιεκτικότητα Οξέος και (β) Θερμοκρασία για την παραγωγή της συγκέντρωσης Ξυλόζης 116 Σχηματική Απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού για τη συσχέτιση της συγκέντρωσης της ξυλόζης με τη θερμοκρασία, την περιεκτικότητα οξέος και το χρόνο της αντίδρασης, με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της προεπεξεργασίας 117 Σχήμα 3.9. Ραβδόγραμμα σχηματικής απεικόνισης των συντελεστών της κάθε παραμέτρου του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού για τη συσχέτιση της συγκέντρωσης της ξυλόζης με τη θερμοκρασία, την περιεκτικότητα οξέος και το χρόνο αντίδρασης της προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica Σχήμα Σχήμα Επίδραση του συνδυαστικού συντελεστή έντασης (CSF) στη μετατροπή των ημικυτταρινών, στη συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης και των λοιπών σακχάρων κατά την προεπεξεργασία της βιομάζας του Phalaris aquatica. 119 Επίδραση του συνδυαστικού συντελεστή έντασης (CSF) στο βαθμό κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας του φυτού Phalaris aquatica

33 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα 4.1. Σχήμα 4.2. Σχήμα 4.3. Βαθμός κρυσταλλικότητας σε σχέση με τα ποσοστά μετατροπής των ημικυτταρινών κατά τον πειραματικού σχεδιασμό Taguchi για την προεπεξεργασία της βιομάζας του Phalaris aquatica 124 Σχηματική Απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού για τη συσχέτιση του βαθμού κρυσταλλικότητας με τη θερμοκρασία, την περιεκτικότητα οξέος και το χρόνο της αντίδρασης, με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της προεπεξεργασίας. 125 Εικόνες Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης (SEM) με εμφανείς τις αλλαγές στη δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας 126 Σχηματική απεικόνιση της ενζυμικής δράσης κατά την προσρόφηση των ενζύμων πάνω στο αδιάλυτο υπόστρωμα της κυτταρίνης. 132 Σχηματική απεικόνιση της προσρόφησης του ενζύμου στο υπόστρωμα παρουσία παρεμποδιστικών ενώσεων. 133 Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Box Behnken στο στάδιο της Ενζυμικής υδρόλυσης 142 Σχήμα 4.4. Σχηματική απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Box Behnken σχεδιασμού για τη συσχέτιση της συγκέντρωσης της γλυκόζης με τη βιομάζα, την ποσότητα ενζύμου, τη συγκέντρωση PEG 4000 και το χρόνο της αντίδρασης, με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ενζυμικής υδρόλυσης Σχήμα 4.5. Συνεισφορά των τεσσάρων παραγόντων και των μεταξύ τους αλληλεπιδράσεων στη συγκέντρωση της γλυκόζης σύμφωνα με την Ανάλυση Διακύμανσης για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης Σχήμα 4.6. Διαγράμματα Επιφανειών Απόκρισης με τις αλληλεπιδράσεις δύο παραγόντων στη συγκέντρωση της γλυκόζης: (α) βιομάζας-χρόνου, (β) ενζύμου-βιομάζας, (γ) βιομάζα-επιφανειοδραστικού (δ) ενζύμου-χρόνου, (ε) επιφανειοδραστικού-χρόνου, (στ) ενζύμου-επιφανειοδραστικού

34 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 4.7. Σχήμα 4.8. Σχήμα 4.9. Σχήμα Σχήμα Συγκέντρωση της γλυκόζης για διαφορετικές αναλογίες μεταξύ των δύο εμπορικά διαθέσιμων ενζύμων κυτταρινάση και β - γλυκοσιδάση κατά την ενζυμική υδρόλυση 153 Επίδραση της αύξησης του περιεχόμενου στερεού στη συγκέντρωση της γλυκόζης σε συγκριτικά πειράματα ενζυμικής υδρόλυσης. 154 Συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) για δύο διαφορετικά διαστήματα τροφοδοσίας της ενζυμικής υδρόλυσης, 6 και 12 ωρών Απόδοση γλυκόζης (%) για δύο διαφορετικά διαστήματα τροφοδοσίας της ενζυμικής υδρόλυσης, 6 και 12 ωρών 156 Παραγωγικότητα γλυκόζης (g/(l h)) για δύο διαφορετικά διαστήματα τροφοδοσίας της ενζυμικής υδρόλυσης, 6 και 12 ωρών 157 Σχήμα Συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) για δύο διαφορετικά περιεχόμενα ενζύμων 20 και 30 FPU/g βιομάζας, κατά την ενζυμική υδρόλυση 158 Σχήμα Απόδοση γλυκόζης (%) για δύο διαφορετικά περιεχόμενα ενζύμων 20 και 30 FPU/g βιομάζας, κατά την ενζυμική υδρόλυση Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα 5.1. Σχήμα 5.2. Σχήμα 5.3. Παραγωγικότητα γλυκόζης (g/(l h)) για δύο διαφορετικά περιεχόμενα ενζύμων 20 και 30 FPU/g βιομάζας, κατά την ενζυμική υδρόλυση 159 Συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) για πολιτική ημι-συνεχούς τροφοδοσίας βιομάζας μέχρι την τελική τιμή 14% w/v, ενζύμου 20 FPU/g βιομάζας, κάθε 6 ώρες, κατά την ενζυμική υδρόλυση 161 Παραγωγικότητα γλυκόζης (g/(l h)) για πολιτική ημι-συνεχούς τροφοδοσίας βιομάζας μέχρι την τελική τιμή 14% w/v, ενζύμου 20 FPU/g βιομάζας, κάθε 6 ώρες, κατά την ενζυμική υδρόλυση 161 Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου του μικροοργανισμού S. cerevisiae κατά την αναπαραγωγική του φάση 168 Καμπύλη ανάπτυξης μικροοργανισμού. Τα στάδια που διακρίνονται είναι η λανθάνουσα φάση, η εκθετική φάση ανάπτυξης, η φάση επιβράδυνσης και η στατική φάση. 169 Σχηματική απεικόνιση του μεταβολισμού της γλυκόζης στον σακχαρομύκητα S. cerevisiae. Παρατηρούνται τρία βασικά στοιχεία της κινητικής του -14-

35 Κατάλογος Σχημάτων κυττάρου: ο περιορισμός της αναπνοής (αερόβια παραγωγή αιθανόλης), η αποθήκευση των συνολικών υδατανθράκων στο εσωτερικό του κυττάρου και τα λοιπά συστατικά της κυτταρικής βιομάζας (Fiechter & Seghezzi, 1992) Σχήμα 5.4. Σχήμα 5.5. Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi της ζύμωσης του Saccharomyces cerevisiae υπό ασυνεχείς συνθήκες 177 Σχηματική Απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ζύμωσης υπό ασυνεχείς συνθήκες του Saccharomyces cerevisiae 177 Σχήμα 5.6. Ραβδόγραμμα σχηματικής απεικόνισης των συντελεστών της κάθε παραμέτρου του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού για τη συσχέτιση της απόδοσης σε αιθανόλη με την περιεκτικότητα αζώτου, το είδος και το μέγεθος του ενοφθαλμίσματος, τον αερισμό και το ph κατά τη ζύμωση υπό ασυνεχείς συνθήκες του Saccharomyces cerevisiae Σχήμα 5.7. Σχήμα 5.8. Σχήμα 5.9. Σχήμα Σχήμα Συνεισφορά των πέντε παραγόντων στο γραμμικό μοντέλο της απόδοσης της αιθανόλης σύμφωνα με την Ανάλυση Διακύμανσης για το στάδιο της ζύμωσης του Saccharomyces cerevisiae 178 Κύριες επιδράσεις μελετούμενων παραγόντων: (α) αζώτου, (β) ph, (γ) συντελεστής αερισμού, ko, (δ) στέλεχος, (ε) ενοφθάλμισμα, στην απόδοση της αιθανόλης (%) για το στάδιο της ζύμωσης του S. cerevisiae. 184 Συγκέντρωση Αιθανόλης, Καταναλισκόμενων Σακχάρων και Κυτταρικής Βιομάζας κατά την καλλιέργεια του S. cerevisiae σε θρεπτικό μέσο με βελτιστοποιημένες συνθήκες. 186 Απόδοση (%) της αιθανόλης σε σχέση με τη θεωρητική τιμή και Συνολική Παραγωγικότητα (g/l h) αιθανόλης σε σχέση με το χρόνο της καλλιέργειας S. cerevisiae σε θρεπτικό μέσο με βελτιστοποιημένες συνθήκες. 186 Προφίλ τροφοδοσίας γλυκόζης για τη ζύμωση του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας σε κωνική φιάλη ως προς την οπτική πυκνότητα σε 600 nm

36 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας σε κωνική φιάλη. 188 Τροφοδοσία αντιδραστήρα με σταθερό ρυθμό ίσο με τη μέση τιμή του ρυθμού κατανάλωσης των σακχάρων 191 Τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό τροφοδοσίας των σακχάρων βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,23 h -1 ) 191 Τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό τροφοδοσίας των σακχάρων βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,35 h -1 ) 192 Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με τροφοδοσία αντιδραστήρα με σταθερό ρυθμό ίσο με τη μέση τιμή του ρυθμού κατανάλωσης των σακχάρων Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,23 h -1 ) του μικροοργανισμού 194 Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,35 h -1 ) του μικροοργανισμού. 195 Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae σε επίπεδο αντιδραστήρα με υψηλά αρχικά σάκχαρα και τροφοδοσία για 33 ώρες Σχήμα Παραλλαγές του εκθετικού ρυθμού τροφοδοσίας της γλυκόζης όπως εφαρμόστηκε σε καλλιέργεια χαμηλών (20 g/l) και υψηλών (100 g/l) αρχικών σακχάρων. Τρεις δοκιμές για διαφορετική διάρκεια και μέγιστη τιμή τροφοδοσίας γλυκόζης 199 Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae σε επίπεδο αντιδραστήρα με υψηλά αρχικά σάκχαρα και τροφοδοσία για 36 ώρες

37 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae σε επίπεδο αντιδραστήρα με υψηλά αρχικά σάκχαρα και τροφοδοσία για 33 ώρες που μειώνεται αντίστροφα 201 Σχήμα 6.1. Σχήμα 6.2. Σχήμα 6.3. Σχήμα 6.4. Σχήμα 6.5. Σχηματική απεικόνιση της μεταβολικής διαδρομής του σχηματισμού ηλεκτρικού οξέος από το βακτήριο Actinobacillus succinogenes 207 Οι δύο διαφορετικές μεταβολικές οδοί για τη μετατροπή του φωσφοενολοπυροσταφυλικού οξέος στα τελικά προϊόντα: ηλεκτρικό οξύ (C4), αιθανόλη και οξικό οξύ (C3) Καμπύλη ανάπτυξης του μικροοργανισμού A. succinogenes στο θρεπτικό μέσο της ζύμωσης 214 Παραγωγή ηλεκτρικού, μυρμηκικού και οξικού οξέος και η πορεία των καταναλισκόμενων σακχάρων σε σχέση με το χρόνο κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού A. succinogenes. 214 Σχηματική απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου της συσχέτισης της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος με το λόγο των σακχάρων, τη συνολική συγκέντρωση τους, την περιεκτικότητα MgCO3, K2HPO4 και εκχυλίσματος μαγιάς με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes Σχήμα 6.6. Ραβδόγραμμα σχηματικής απεικόνισης των συντελεστών της κάθε παραμέτρου του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού της συσχέτισης της συγκέντρωσης ηλεκτρικού οξέος με το λόγο των σακχάρων, τη συνολική συγκέντρωση τους, την περιεκτικότητα MgCO3, K2HPO4 και εκχυλίσματος μαγιάς με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes Σχήμα 6.7. Σχήμα 6.8. Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes Συνεισφορά των πέντε παραγόντων μαζί με τους συντελεστές p για το γραμμικό μοντέλο της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος σύμφωνα με την Ανάλυση Διακύμανσης για το στάδιο της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes

38 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 6.9. Διαγράμματα κύριων επιδράσεων των πέντε ελεγχόμενων μεταβλητών στον παράγοντα ελέγχου (συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος) 226 Σχήμα Παραγωγή ηλεκτρικού οξέος κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού A. succinogenes σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα με παράλληλη παροχή CO Σχήμα 7.1. Σχήμα 7.2. Σχήμα 7.3. Σχήμα 7.4. Σχήμα 7.5. Σχήμα Α.1. Σχήμα Α.2. Σχήμα Α.3. Κόστος παραγωγής αιθανόλης ως συνάρτηση των επιμέρους εξόδων: λειτουργικό κόστος, κόστος πρώτης ύλης, μεταβλητά λειτουργικά έξοδα, κεφαλαιακό κόστος 237 Ανάλυση Ευαισθησίας της συμμετοχής διαφορετικών παραμέτρων στο λειτουργικό κόστος της διεργασίας παραγωγής αιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. 238 Συσχέτιση της τιμής πώλησης της αιθανόλης σε σχέση με την ποσότητα του ηλεκτρικού οξέος που συμπαράγεται για βραχυπρόθεσμο και για μακροπρόθεσμο σενάριο Διάγραμμα Ροής με ισοζύγια μάζας για τη συνολική διεργασία παραγωγής αιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα (Βάση: 1000 g ξηρής βιομάζας) Κατανομή Λειτουργικού Κόστους μιας μονάδας παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από λιγνοκυτταρινική βιομάζα 251 Ιστόγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής της συγκέντρωσης της ξυλόζης πρόβλεψης από τα πειραματικά αποτελέσματα σε συνάρτηση με τη συχνότητα εμφάνισης τους, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της προεπεξεργασίας Διάγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης για τη συγκέντρωσης της ξυλόζης σε συνάρτηση με την τιμή του υπολείμματος από την πειραματική τιμή, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της προεπεξεργασίας Ιστόγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας από τα πειραματικά αποτελέσματα σε συνάρτηση με τη συχνότητα εμφάνισης τους, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της προεπεξεργασίας

39 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα Α.4. Σχήμα Α.5. Σχήμα Α.6. Σχήμα Α.7. Σχήμα Α.8. Σχήμα Α.9. Σχήμα Α.10. Σχήμα Β.1. Διάγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας σε συνάρτηση με την τιμή του υπολείμματος από την πειραματική τιμή, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της προεπεξεργασίας Ιστόγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της συγκέντρωσης της γλυκόζης από τα πειραματικά αποτελέσματα σε συνάρτηση με τη συχνότητα εμφάνισης τους, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Box Behnken, για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης 283 Διάγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της συγκέντρωσης της γλυκόζης σε συνάρτηση με την τιμή του υπολείμματος από την πειραματική τιμή, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Box Behnken, για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης 283 Ιστόγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της απόδοσης σε αιθανόλη από τα πειραματικά αποτελέσματα σε συνάρτηση με τη συχνότητα εμφάνισης τους, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της ζύμωσης του S. cerevisiae. 284 Διάγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της απόδοσης σε αιθανόλη σε συνάρτηση με την τιμή του υπολείμματος από την πειραματική τιμή, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της ζύμωσης του S. cerevisiae Ιστόγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της συγκέντρωσης ηλεκτρικού οξέος από τα πειραματικά αποτελέσματα σε συνάρτηση με τη συχνότητα εμφάνισης τους, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της ζύμωσης του Α. succinogenes. 285 Διάγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της συγκέντρωσης ηλεκτρικού οξέος σε συνάρτηση με την τιμή του υπολείμματος από την πειραματική τιμή, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της ζύμωσης του Α. succinogenes Διάγραμμα Φασματοσκοπίας Περίθλασης Ακτίνων Χ (XRD) για την ακατέργαστη βιομάζα

40 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα Β.2. Σχήμα Γ.1. Σχήμα Δ.1. Σχήμα Δ.2. Σχήμα Δ.3. Σχήμα Δ.4. Σχήμα Δ.5. Σχήμα Δ.6. Σχήμα Δ.7. Διάγραμμα Φασματοσκοπίας Περίθλασης Ακτίνων Χ (XRD) για την προεπεξεργασμένη βιομάζα στις συνθήκες 1,5 % H2SO4, χρόνος αντίδρασης 45 min και θερμοκρασία 120 o C Εξοπλισμός της μονάδας παραγωγής αιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα Phalaris aquatica Ακατέργαστη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί μόνο μηχανική κατεργασία για μείωση του μεγέθους των σωματιδίων σε 1mm, με μεγέθυνση 20 φορές. 296 Ακατέργαστη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί μόνο μηχανική κατεργασία για μείωση του μεγέθους των σωματιδίων σε 1mm, με μεγέθυνση 400 φορές Προεπεξεργασμένη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί αραιή όξινη υδρόλυση με 1,5% w/v Η2SO4 για 45 min στους 120 o C, με μεγέθυνση 150 φορές Προεπεξεργασμένη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί αραιή όξινη υδρόλυση με 1,5% w/v Η2SO4 για 45 min στους 120 o C, με μεγέθυνση 250 φορές Προεπεξεργασμένη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί αραιή όξινη υδρόλυση με 1,5% w/v Η2SO4 για 45 min στους 120 o C, με μεγέθυνση 600 φορές Προεπεξεργασμένη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί αραιή όξινη υδρόλυση με 1,5% w/v Η2SO4 για 45 min στους 120 o C, με μεγέθυνση φορές Προεπεξεργασμένη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί αραιή όξινη υδρόλυση με 1,5% w/v Η2SO4 για 45 min στους 120 o C, με μεγέθυνση φορές

41 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας 1.1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα Το ενδιαφέρον της παγκόσμιας κοινότητας έχει στραφεί προς την τεχνολογία των βιοκαυσίμων εδώ και δεκαετίες, με μεγάλη πρόοδο και συνεχώς μεγαλύτερο ποσοστό συμμετοχής των βιοκαυσίμων στη συνολική αγορά της ενέργειας των καυσίμων. Η ερευνητική δραστηριότητα προς αυτή την κατεύθυνση στηρίζεται από κρατικές πρωτοβουλίες. Το Ευρωπαϊκό Συμβούλιο έχει θέσει ως δεσμευτικό στόχο την προέλευση του ποσοστού 20% του συνόλου της Ευρωπαϊκής ενεργειακής κατανάλωσης από ανανεώσιμες πηγές ενέργειας, μέχρι το έτος Επιπρόσθετα, έχει τεθεί ως δεσμευτικός στόχος τα βιοκαύσιμα να συμμετέχουν με ελάχιστο ποσοστό 10% στη συνολική κατανάλωση καυσίμων κίνησης (πετρελαίου και βενζίνης) για όλα τα κράτη μέλη. Σύμφωνα με το Ερευνητικό Κέντρο της Ευρωπαϊκής Επιτροπής η συμμετοχή των ανανεώσιμων πηγών ενέργειας στις μονάδες παραγωγής ενέργειας που κατασκευάστηκαν το 2012, σημειώνει το υψηλό ποσοστό του 85% της καθαρής παραγόμενης ενέργειας (Acal et al., 2014). -21-

42 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Τα βιοκαύσιμα που καταναλώνονται στην Ευρώπη είναι κατά κύριο λόγο το βιοντήζελ, που αποτελεί το 76% του συνόλου των βιοκαυσίμων. Η βιο-βενζίνη (biogasoline) αποτελεί το 21% και ορίζεται ως το σύνολο της βιαοαιθανόλης, της βιομεθανόλης, του βιο-ετβε (αιθυλοτριτοταγής-βουτυλαιθέρας, ethyl tert-butyl ether) και βιο-μτβε (μεθυλο-τριτοταγής βουτυλαιθέρας, methyl tert-butyl ether). Το υπόλοιπο 3% αποτελείται από λοιπά βιοκαύσιμα. Οι χώρες με την υψηλότερη κατανάλωση βιοκαυσίμων στην Ευρωπαϊκή Ένωση (EU-27) είναι πρώτη στην κατάταξη η Γερμανία με 3,7 MToe που αποτελούν το 22% και ακολουθεί η Γαλλία που καταναλώνει το 17% της συνολικής ευρωπαϊκής κατανάλωσης βιοκαυσίμων. Οι υπόλοιπες χώρες στην κατάταξη (Ιταλία, Ισπανία και Μεγάλη Βρετανία) σημειώνουν κατανάλωση βιοκαυσίμων σε ποσοστό 8 με 12% (Eurostat, 2012). Η ανοδική πορεία στην παραγωγή των βιοκαυσίμων παρουσιάζεται στο Σχήμα 1.1 από το έτος 2000 και έπειτα (European Commission, 2014). Το μεγάλο ποσοστό της παραγωγής βιοντήζελ σε σχέση με τα προσθετικά βιοκαύσιμα της βενζίνης οφείλεται στην ήδη εγκατεστημένη τεχνολογία παραγωγής του, ενώ το πεδίο της τεχνολογίας παραγωγής της βιοαιθανόλης βρίσκεται ακόμα σε πρώιμο στάδιο μεταφοράς του σε βιομηχανική κλίμακα. Ο ορισμός του βιοκαυσίμου περιλαμβάνει κάθε καύσιμο προερχόμενο από βιομάζα, ζωντανούς οργανισμούς ή από παραπροϊόντα του μεταβολισμού τους. Τα βιοκαύσιμα διαχωρίζονται σε διαφορετικές γενιές ανάλογα με την τεχνολογία παραγωγής τους και το είδος της βιομάζας που χρησιμοποιείται ως πρώτη ύλη. Πρώτης γενιάς ονομάζονται τα βιοκαύσιμα που προέρχονται από εδώδιμους καρπούς και υπολείμματα τροφών. Η τεχνολογία τους είναι εγκατεστημένη και κυκλοφορούν σε μεγάλες ποσότητες στην αγορά. Τα κύρια βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς είναι το βιοντήζελ, η βιοαιθανόλη και το βιοαέριο. Η βιοαιθανόλη πρώτης γενιάς προέρχεται από ζυμώσιμα σάκχαρα κυρίως από αμυλούχα βιομάζα, καλαμπόκι και σακχαρότευτλο. Οι χρήσεις της αφορούν κατά κύριο λόγο την προσθήκη σε κινητήρες εσωτερικής καύσης, αναμειγνυόμενη με βενζίνη σε ποσοστό μέχρι και 10% χωρίς να υποστεί καμία μετατροπή ο κινητήρας, το γνωστό μίγμα Ε10. Με κατάλληλη μετατροπή του κινητήρα η αιθανόλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί και σε μίγμα με μεγαλύτερο ποσοστό εώς και 85% (Ε85). -22-

43 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.1. Η παραγωγή των βιοκαυσίμων στην Ευρώπη των 28 την περίοδο σε ktoe. Άλλα βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς είναι ο βουτυλαιθέρας (ΕΤΒΕ), ο οποίος συντίθεται από βιοαιθανόλη και ισοβουτυλένιο. Αναμειγνύεται επίσης με τη βενζίνη σε μεγαλύτερο ποσοστό μέχρι 15%. Ακόμα, το βιοντήζελ παράγεται από φυτικά έλαια σόγιας, ελαιοκράμβης, φοινικόδεντρων και από άλλα ενεργειακά φυτά μέσω της αντίδρασης των τριγλυκεριδίων με τη μεθανόλη (τρανσ-εστεροποίηση). Με τον ίδιο τρόπο όπως η βιοαιθανόλη, μπορεί να αναμιχθεί με πετρέλαιο κίνησης σε ποσοστό 5% είτε να χρησιμοποιηθεί σε καθαρή μορφή σε τροποποιημένους κινητήρες. Άλλο διαδεδομένο βιοκαύσιμο είναι το βιοαέριο, που προέρχεται από αναερόβια επεξεργασία των ζωικών απορριμμάτων καθώς και άλλων πηγών υγρής βιομάζας (απορρίμματα τροφίμων και αστικών αποβλήτων). Τα υλικά αυτά μετατρέπονται σε βιομεθάνιο, το οποίο αναμειγνύεται στο δίκτυο του φυσικού αερίου. H παραγωγή των βιοκαυσίμων πρώτης γενιάς βρίσκεται σε εμπορική εφαρμογή με δυναμικότητα περίπου 50 δισεκατομμύρια λίτρα βιοαιθανόλης και 5,4 εκατομμύρια τόνους βιοντήζελ να παράγονται παγκοσμίως μέσα στο

44 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.2. Διαφορετικές οδοί για την παραγωγή βιοκαυσίμων πρώτης και δεύτερης γενιάς Τα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς παράγονται παγκοσμίως από ένα ευρύτερο πεδίο πρώτων υλών που προέρχονται κυρίως από μη εδώδιμους καρπούς. Η πηγή της βιομάζας προέρχεται από ολόκληρο το φυτό ή τα υπολείμματα του, που αποτελούνται κυρίως από κυτταρίνη και λιγνίνη, όπως το άχυρο, το χορτάρι και τα υπολείμματα ξύλου. Για την εκμετάλλευση αυτής της πηγής βιομάζας, δύο είναι οι μετατροπές που μπορούν να εφαρμοστούν για την παραγωγή βιοκαυσίμου. Η πρώτη είναι η βιολογική οδός που εμπεριέχει την υδρόλυση της βιομάζας με χρήση ενζύμων και τη παραγωγή βιοαιθανόλης με χρήση μικροοργανισμών που μετατρέπουν τα προερχόμενα από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα σάκχαρα σε αιθανόλη. Η δεύτερη οδός χρησιμοποιεί τη θερμοχημική μετατροπή της βιομάζας (πυρόλυση ή αεριοποίηση) σε βιοαέριο που αποτελεί την πηγή για την περαιτέρω παραγωγή του σύνθετου αερίου με βασικά συστατικά το μονοξείδιο του άνθρακα και το υδρογόνο. Από τα πιο διαδεδομένα αέρια συνθετικά βιοκαύσιμα είναι το βιομεθάνιο που με περαιτέρω επεξεργασία μπορεί να προκύψει υδρογόνο. Συγκεντρωμένα, τα είδη της βιομάζας και οι διαφορετικές οδοί της επεξεργασίας τους προς τα τελικά βιοκαύσιμα πρώτης και δεύτερης γενιάς απεικονίζονται στο Σχήμα

45 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Τα τελευταία χρόνια, το ερευνητικό πεδίο έχει διευρυνθεί προς τα τρίτης γενιάς βιοκαύσιμα, τα οποία αποτελούν τον κλάδο που βρίσκεται ακόμα σε ερευνητικό στάδιο με πολλά περιθώρια ανάπτυξης. Αυτός είναι και ο λόγος που πολλές διαφορετικές διεργασίες αποτελούν βιοκαύσιμα τρίτης γενιάς. Ο όρος αυτός χρησιμοποιείται για πρώτες ύλες βιομάζας που έχουν υποστεί γενετική μετατροπή όπως γενετικά μεταλλαγμένα φυτά με ασθενέστερα κυτταρικά τοιχώματα ώστε να είναι ευκολότερη η υδρόλυση τους. Επίσης οι διεργασίες που περιλαμβάνουν μια ολοκληρωμένη παραγωγή βιοκαυσίμου με παράλληλη παραγωγή ενζύμων από μικροοργανισμούς που διασπούν τη βιομάζα και συγχρόνως μεταβολίζουν τα σάκχαρα προς παραγωγή βιοαιθανόλης ονομάζονται διεργασίες τρίτης γενιάς βιοκαυσίμων διότι περιλαμβάνουν τροποποιημένους μικροοργανισμούς (Carere et al., 2008). Τέλος, η παραγωγή βιοκαυσίμων από βιομάζα προερχόμενη από άλγη αποτελεί διεργασία παραγωγής βιοκαυσίμων τρίτης γενιάς, που χαρακτηρίζεται από υψηλές αποδόσεις βιομάζας ανά μονάδα έκτασης (Singh, 2011) Βιοαιθανόλη δεύτερης γενιάς Η βιοαιθανόλη αποτελεί σημαντική πρόταση στην αντιμετώπιση του προβλήματος που θέτει ο περιορισμός των ενεργειακών αποθεμάτων του πλανήτη, ενώ συγχρόνως συντελεί στη μείωση των αεριών του θερμοκηπίου. Τα οφέλη της βιοαιθανόλης εντοπίζονται κατά την προσθήκη της βιοαιθανόλης στα συμβατικά καύσιμα κίνησης, που αυξάνει τα οκτάνια τους και μειώνει το μονοξείδιο του άνθρακα και τις πτητικές οργανικές ενώσεις στις εκπομπές των καυσαερίων (Hamelinck et al., 2005). Ο λόγος είναι ότι οι αλκοόλες αποτελούν οξυγονούχα καύσιμα καθώς διαθέτουν ένα επιπλέον άτομο οξυγόνου που ελαττώνει τη θερμοκρασία της καύσης. Πρακτικά όλες οι αλκοόλες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για καύσιμο αλλά στην πραγματικότητα ως καύσιμο κίνησης χρησιμοποιείται η μεθανόλη, η βιοαιθανόλη, η προπανόλη και η βουτανόλη. Παρόλα αυτά μόνο η αιθανόλη και η μεθανόλη μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε κινητήρες εσωτερικής καύσης (ICEs) (Balat, 2010). Επιπρόσθετα, η βιοαιθανόλη δεύτερης γενιάς παρουσιάζει πλεονεκτήματα στον κύκλο ανάλυσης ζωής. Οι εκπομπές αερίων του θερμοκηπίου κατά την καύση της βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα είναι μικρότερες σε σχέση με τις εκπομπές της βιοαιθανόλης πρώτης γενιάς. Επιπλέον, παρόλο που η νεότερη τεχνολογία παραγωγής δεύτερης γενιάς -25-

46 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας βιοκαυσίμων αποτελεί περισσότερο απαιτητική διαδικασία καθώς η επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας προηγείται της ζύμωσης των μονομερών σακχάρων, χρησιμοποιεί ως πρώτη ύλη καρπούς που δεν έχουν σημαντική διατροφική αξία και έχουν υψηλή περιεκτικότητα σακχάρων (δομικοί υδατάνθρακες) ανά εκτάριο. Επίσης, μπορούν να καλλιεργηθούν σε χαμηλής παραγωγικότητας εδάφη, όπου το κόστος της χαμηλότερης παραγωγής ανά εκτάριο αντισταθμίζεται από την αναγέννηση του εδάφους και την αποθήκευση άνθρακα, τη βελτιωμένη συγκράτηση νερού και την προστασία των εδαφών από διάβρωση (Menon & Rao 2012). Η αειφόρος αξία της βιοαιθανόλης δεύτερης γενιάς ενισχύεται με τη χρήση φιλικών προς το περιβάλλον ενζυμικών καταλυτών και μικροοργανισμών. Συγκεκριμένα, η παραγωγή της βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα περιλαμβάνει τη θερμοχημική ή τη βιολογική προεπεξεργασία της βιομάζας και τη χρήση ενζύμων κατά τη σακχαροποίηση ώστε να είναι δυνατή στη συνέχεια η ζύμωση των μονομερών σακχάρων από τους κατάλληλους μικροοργανισμούς. Η βελτιστοποίηση της διεργασίας περιλαμβάνει σημαντικά περιθώρια για τη μείωση του κόστους και την επίτευξη της βιωσιμότητας μιας τέτοιας επένδυσης, στο πεδίο των πρώτων υλών (χρήση μεγαλύτερης ποικιλίας λιγνοκυτταρινούχων φυτών), των διεργασιών (γενετικά τροποποιημένοι μικροοργανισμοί) και του κόστους (μελλοντική μείωση του κόστους των ενζύμων). Τα βασικά στάδια της μετατροπής της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας σε βιοαιθανόλη περιλαμβάνουν αρχικά την επιλογή του κατάλληλου φυτού προέλευσης της βιομάζας, την αποτελεσματική προεπεξεργασία του, την παραγωγή σακχαρολυτικών ενζύμων και τη χρήση τους στην υδρόλυση της παραγόμενης κυτταρίνης, την ακόλουθη ζύμωση των παραγόμενων μονομερών σακχάρων καθώς και τις διεργασίες διαχωρισμού και ανάκτησης των παραγόμενων προϊόντων. Η συνολική διεργασία της παραγωγής της βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα μέσω βιοτεχνολογικής οδού απεικονίζεται στο Σχήμα 1.3. Κάθε στάδιο έχει διαφορετικές απαιτήσεις βελτιστοποίησης ανάλογα με την παρούσα τεχνολογία και την τιμή των πρώτων υλών. Το πρώτο στάδιο της διεργασίας αποτελεί η προεπεξεργασία της βιομάζας που περιλαμβάνει τη μηχανική και τη χημική μετατροπή της λιγνοκυτταρίνης σε ευκολότερα προσβάσιμη από τα ένζυμα δομή. Η στερεή κυτταρίνη που παραλαμβάνεται από το στάδιο της προεπεξεργασίας οδηγείται για περαιτέρω επεξεργασία μέσω βιοτεχνολογικής οδού. Αρχικά, -26-

47 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας η μηχανική επεξεργασία στοχεύει στη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων της βιομάζας και στην ευκολότερη επεξεργασία της στα επόμενα στάδια. Ακολούθως, η υδρόλυση μέσω χημικής προεπεξεργασίας αλλάζει τη δομική κατασκευή της λιγνοκυτταρίνης απομακρύνοντας ή διαφοροποιώντας τους δεσμούς της λιγνίνης και υδρολύοντας τις ημικυτταρίνες. Η βιομάζα αποτελείται σε ποσοστό 40-50% από πολυσακχαρίτες της κυτταρίνης, 25-30% από πολυσακχαρίτες των ημικυτταρινών, 15-20% από λιγνίνη και σε πολύ μικρότερο ποσοστό από άλλα συστατικά (πρωτεΐνες, στάχτη κ.α.). Τα διαλυτά σάκχαρα των ημικυτταρινών που λαμβάνονται στο στάδιο της προεπεξεργασίας και περιλαμβάνονται στο υγρό ρεύμα εξόδου είναι η ξυλόζη σε μεγαλύτερο ποσοστό και η αραβινόζη σε μικρότερη ποσότητα που αποτελούν τις πεντόζες του υδρολύματος των μονομερών σακχάρων και η γαλακτόζη, η μαννόζη και η γλυκόζη που αποτελούν τις εξόζες. Αναφορικά με τη λιγνίνη που περιλαμβάνεται στο στερεό τμήμα της προεπεξεργασίας, αποτελεί ένα σύνθετο, υδροφοβικό αρωματικό πολυμερές που επηρεάζει το στάδιο της υδρόλυσης. Τα δομικά συστατικά της είναι μεγάλα φαινολικά μόρια και συγκεκριμένα η π-κουμαρική αλκοόλη, η κωνοφερυλική αλκοόλη και η σιναπυλική αλκοόλη που βρίσκουν ευρύ πεδίο εφαρμογών (Menon & Rao 2012). Συνεπώς, η προεπεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας παράγει δύο ρεύματα, το υγρό τμήμα όπου περιλαμβάνονται τα υδρολυμένα μονομερή σάκχαρα των ημικυτταρινών και το στερεό τμήμα όπου περιέχεται η αδιάλυτη κυτταρίνη και η λιγνίνη. Το επόμενο στάδιο της προεπεξεργασίας αποτελεί ο χειρισμός της διαθέσιμης πλέον κυτταρίνης μέσω ενζύμων που δρουν καταλυτικά στην υδρόλυση της κυτταρίνης για τη μετατροπή της σε μονομερή σάκχαρα που με τη σειρά τους θα αποτελέσουν πρώτη ύλη για τη ζύμωση. Το στάδιο ονομάζεται ενζυμική υδρόλυση, όπου η κυτταρίνη υδρολύεται στο δομικό μονομερές της σάκχαρο, τη γλυκόζη μέσω της στοιχειομετρικής εξίσωσης 1.1: (C6H10O5)n+n H2O n C6H12O6 (1.1) Παρόλο που η υδρόλυση θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί με τη χρήση οξέων, προτιμάται η υδρόλυση με τη χρήση βιολογικών καταλυτών καθώς τα ένζυμα είναι φιλικότερα στο περιβάλλον. Επιπλέον, η χρήση των ενζύμων καταλήγει σε καταλληλότερο υδρόλυμα για την περαιτέρω καλλιέργεια μικροοργανισμών προς παραγωγή αιθανόλης χωρίς την παρουσία παρεμποδιστικών ενώσεων (Wooley et al., 2007). -27-

48 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Η υδρόλυση καταλύεται από τα εξειδικευμένα ένζυμα, τις κυτταρινάσες (Alvira et al., 2010) που συνήθως λειτουργούν ως σύστημα ενζύμων των ενδογλυκανασών (ή 1,4-β-D-γλυκανό- 4-γλυκανουδρολάσες), των εξωγλυκανασών (ή 1,4-β-D-γλυκανό-γλυκανουδρολάσες), των κελλοβιοϋδρολασών (ή 1,4-β-D-γλυκανο-κελλοβιοϋδρολάσες) και των β-γλυκοσιδασών (Zhang & Lynd 2004). Η αποτελεσματική ενζυμική υδρόλυση καταλήγει σε υδρόλυμα μονομερών σακχάρων με υψηλές συγκεντρώσεις ζυμώσιμων σακχάρων και παράλληλα με μειωμένη παρουσία παρεμποδιστικών ενώσεων ώστε να πραγματοποιηθεί στη συνέχεια ζύμωση για την παραγωγή αιθανόλης από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Συγκεκριμένα, η υψηλή συγκέντρωση σακχάρων οδηγεί με τη σειρά της σε υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης που επιτρέπουν αποτελεσματικότερη ανάκτηση των τελικών προϊόντων. Οπότε, η μελέτη του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης προσανατολίζεται στη βελτιστοποίηση των συνθηκών της διεργασίας, στη σύνθεση του μίγματος των κυτταρινασών, στην ενίσχυση της δραστικότητας των χρησιμοποιούμενων ενζύμων, στην ανακύκλωση και επαναχρησιμοποίηση των ενζύμων ώστε να υπάρξει βελτίωση των αποδόσεων του σταδίου. Κρίσιμο σημείο της βελτιστοποίησης του σταδίου αποτελεί η αύξηση του αρχικού στερεού υποστρώματος που οδηγεί σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης. Η αρχική υψηλή συγκέντρωση στερεού έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του ιξώδους της αντίδρασης, χαρακτηριστικό που θέτει περιορισμούς στο όριο της αρχικής ποσότητας. Συνεπώς, η εφαρμογή τεχνικών ημι-συνεχούς τροφοδοσίας της βιομάζας αντιμετωπίζει τα εμπόδια μεταφοράς μάζας που προκύπτουν κατά τη χρήση υψηλών συγκεντρώσεων βιομάζας (Rosgaard et al.,2007). Παρόλο που οι τεχνικές της υδρόλυσης των πολυσακχαριτών με τη χρήση των ενζύμων μελετώνται εδώ και δεκαετίες, υπάρχει περιθώριο μελέτης της ενζυμικής υδρόλυσης της κυτταρίνης καθώς πρόκειται για διεργασία φιλικότερη προς το περιβάλλον που ολοκληρώνει την ιδέα των βιοκαυσίμων δεύτερης γενιάς. -28-

49 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.3. Διάγραμμα ροής της βιοτεχνολογικής παραγωγής βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα Το επόμενο στάδιο που ακολουθεί είναι η ζύμωση των φυσικών σακχάρων της βιομάζας από σακχαρομύκητες ή βακτήρια τα οποία χρησιμοποιούν ως πηγή άνθρακα τα μονομερή σάκχαρα (γλυκόζη) του ενζυμικού υδρολύματος καθώς και αυτά που προήλθαν από την υδρόλυση των ημικυτταρινών (κυρίως ξυλόζη). Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται κυρίως είναι οι Saccharomyces, Kluveryomyces, Debaryomyces, Pichia, Zymomonas καθώς και τα ανασυνδυασμένα στελέχη τους. Συγκεκριμένα, ο μικροοργανισμός Saccharomyces cerevisiae παρουσιάζεται κατάλληλος για τη ζύμωση της γλυκόζης καθώς χρησιμοποιείται παραδοσιακά σε τεχνολογίες αλκοολικής ζύμωσης. Επιπρόσθετα, εφαρμόζονται τεχνολογίες μεταβολικής μηχανικής ώστε να παρασκευαστούν ανασυνδυασμένα πλασμίδια που να περιλαμβάνουν γονίδια παραγωγής ξυλανασών ώστε να χρησιμοποιηθεί το στέλεχος αυτό σε ταυτόχρονη ζύμωση τόσο της γλυκόζης όσο και της ξυλόζης. Στη συνέχεια, η παραγωγή διαλύματος με υψηλή συγκέντρωση αιθανόλης στα όρια της ανοχής του μικροοργανισμού αποτελεί επίσης αντικείμενο ενδιαφέροντος καθώς και η ανοχή συγκεκριμένων στελεχών των μικροοργανισμών σε παρεμποδιστικές ενώσεις σε υψηλή συγκέντρωση από τα προηγούμενα στάδια της επεξεργασίας (Huang et al., 2011). Σημαντικό πεδίο μελέτης αποτελεί η ταυτόχρονη σακχαροποίηση και ζύμωση των παραγόμενων σακχάρων (SSF). Η SSF είναι μία διαφορετική τεχνολογία ζύμωσης σε σχέση με τη ξεχωριστή ενζυμική υδρόλυση και ζύμωση (SHF), που πραγματοποιείται στο ίδιο στάδιο τόσο η υδρόλυση της κυτταρίνης όσο και η ζύμωση των σακχάρων σε αιθανόλη. -29-

50 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Συγκεκριμένα, στη μέθοδο αυτή δίνεται προσοχή στις συνθήκες του ενιαίου σταδίου ώστε να είναι προσαρμοσμένες στη δράση τόσο των ενζύμων όσο και του μικροοργανισμού της ζύμωσης. Επίσης, σε ερευνητικό ακόμα επίπεδο, μελετάται η ολοκληρωμένη βιοχημική διεργασία (CBP) όπου στο ίδιο στάδιο παράγονται τα υδρολυτικά ένζυμα, δρουν προς τη σακχαροποίηση της κυτταρίνης και συγχρόνως ο μικροοργανισμός χρησιμοποιεί τα σάκχαρα προς παραγωγή αιθανόλης (Xu et al., 2009). Η CBP απαιτεί κατάλληλα τροποποιημένους μικροοργανισμούς ώστε να έχουν τριπλή εξειδικευμένη δράση. Τέλος, το στάδιο της ανάκτησης της βιοαιθανόλης περιλαμβάνει την απόσταξη και τη συμπύκνωση του ρεύματος εξόδου της ζύμωσης μέσω διαφόρων τεχνολογιών. Βασική αρχή του σχεδιασμού του σταδίου της ανάκτησης είναι η μείωση του κόστους της συνολικής διεργασίας. Καθώς, το στάδιο της απόσταξης μειώνει το κόστος του όσο αυξάνεται η περιεκτικότητα του ρεύματος εξόδου της ζύμωσης σε βιοαιθανόλη ( 5%) (Huang et al., 2011), η ζύμωση που οδηγεί σε πλούσιο ρεύμα αιθανόλης ευνοεί το ακόλουθο στάδιο της ανάκτησης. Το μειονέκτημα της απόσταξης είναι ότι οδηγεί στο αζεότροπο μίγμα νερού αιθανόλης 95%. Μία άλλη μέθοδος διαχωρισμού του υδατικού διαλύματος της αιθανόλης είναι η διεξάτμιση, η οποία αντικαθιστά την παραδοσιακή μέθοδο της απόσταξης ή την ακολουθεί σε σειρά συμπυκνώνοντας το υδατικό διάλυμα της αιθανόλης σημειώνοντας υψηλές αποδόσεις. Η διεξάτμιση αποτελεί μία λειτουργική μονάδα για το διαχωρισμό δύο συστατικών στην οποία συνδυάζονται δύο ιδιότητες, η διαφορά στην διαπερατότητα των δύο συστατικών μέσω μίας μη πορώδους ημιπερατής μεμβράνης και η εξατμιστική μέθοδος μέσω αλλαγής φάσης από υγρό σε αέριο (O Brien et al., 1996). -30-

51 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας 1.2 Εισαγωγή στα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας μέσω βιοδιυλιστηρίου Η ιδέα ενός σύγχρονου βιοδιυλιστηρίου στηρίζεται στο συνδυασμό της παραγωγή του βιοκαυσίμου μεγάλης δυναμικότητας αλλά με χαμηλότερη προστιθέμενη αξία, με την παραγωγή βιοχημικών χαμηλότερης δυναμικότητας μεν αλλά με υψηλότερη προστιθέμενη αξία. Η χαμηλότερη τιμή πώλησης της βιοαιθανόλης σε συνδυασμό με την πώληση υψηλής προστιθέμενης αξίας βιοχημικών αποτελεί καινοτομία που καθιστά οικονομικό το εγχείρημα της παραγωγής βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα (Fang et al., 2010). Μία μονάδα βιο-διυλιστηρίου παρουσιάζεται ως βιωσιμότερη επιλογή καθώς πραγματοποιείται συγχρόνως παραγωγή ηλεκτρισμού και θέρμανσης ώστε να καλύπτονται οι ίδιες ανάγκες της. Επιπρόσθετα, τα υλικά υψηλής προστιθέμενης αξίας προσθέτουν επιπλέον κέρδος στην επιχείρηση και τα βιοκαύσιμα καλύπτουν τις κρατικές ενεργειακές δεσμεύσεις που έχει θέσει η Ευρωπαϊκή Ένωση. Είναι η φύση της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, που αποτελεί μια σύνθετη πηγή διαφορετικών συστατικών, που την καθιστά συγκρίσιμη με το ακατέργαστο πετρέλαιο και δίνει τη δυνατότητα μιας ολοκληρωμένης μονάδας μετατροπής της βιομάζας σε βιοκαύσιμα, ενέργεια και βιοχημικά υλικά ανάλογη του συμβατικού διυλιστηρίου. Επιπλέον, η σύσταση της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας της δίνει ακόμα ένα συγκριτικό πλεονέκτημα σε σχέση με τα ορυκτά καύσιμα που έχουν περιορισμένα συστατικά καθώς αποτελείται από ετερογενή υλικά όπως είναι η κυτταρίνη, οι ημικυτταρίνες και η λιγνίνη. Η συγκεκριμένη λιγνοκυτταρινική φύση της βιομάζας απαιτεί συμβατικές θερμοχημικές διεργασίες σε συνδυασμό με τελευταίας τεχνολογίας βιοτεχνολογικές εφαρμογές για να παραχθούν βιοκαύσιμα σε συνδυασμό με υψηλής προστιθέμενης αξίας υλικά όπως ξυλιτόλη, ηλεκτρικό οξύ, γαλακτικό οξύ και άλλα, που αποτελούν ενδιάμεσα ή και τελικά χημικά προϊόντα. Στην περίπτωση επομένως του βιοδιυλιστηρίου, η εφαρμογή του μπορεί να γίνει ρεαλιστική εάν εκμεταλλευτεί όλο το φάσμα των δομικών συστατικών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας όπως οργανικά μακρομόρια (υδρογονάνθρακες, λιπίδια, πρωτεΐνες, λιγνίνη) καθώς και άλλα χημικά συστατικά (αντιοξειδωτικά, λειτουργικές πρωτεΐνες). Η πληθώρα των προϊόντων που μπορούν να προέλθουν από την επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας ποικίλει από εμπορεύματα χαμηλής προστιθέμενης αξίας όπως τα βιοκαύσιμα και τα βιοαποικοδομήσιμα πλαστικά σε ενδιάμεσα συστατικά υψηλής προστιθέμενης αξίας όπως είναι το ηλεκτρικό και το γαλακτικό οξύ καθώς και στοχευμένα χημικά για φαρμακευτικές -31-

52 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας εφαρμογές. Η ολοκληρωμένη εκμετάλλευση της βιομάζας θα οδηγήσει σε βελτίωση της οικονομικότητας της διεργασίας καθώς και σε ελαχιστοποίηση των αποβλήτων. Επίσης, η εφαρμογή των τεχνολογιών ενός βιοδιυλιστηρίου θα δώσει νέες δυνατότητες τόσο στη γεωργική παραγωγή όσο και στη χημική βιομηχανία για την παραγωγή υλικών, καυσίμων κίνησης και ενέργειας. Σαφέστατα, η ύπαρξη μειονεκτημάτων και εμποδίων είναι γνωστή, όπως για παράδειγμα η απαίτηση μεγάλων γεωργικών εκτάσεων για την υποστήριξη μεγάλων μονάδων παραγωγής βιοκαυσίμων και βιοενέργειας. Πάνω σε αυτά τα αντικείμενα στοχεύει η παγκόσμια έρευνα ωστε να υπερβεί εμπόδια όπως το χαμηλό ενεργειακό περιεχόμενο της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, η εποχικότητα της παραγωγής της και η γεωγραφική εκλεκτικότητα. Το Παράρτημα Ενέργειας των Ηνωμένων Πολιτειών (U.S. Energy Department, DOE) ταυτοποίησε τα υψηλής αξίας χρηστικά χημικά ώστε να κατευθύνει την παραγωγή τους με βάση τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Τα υλικά αυτά αποτελούν πρόδρομες ενώσεις για γνωστά χημικά ευρείας χρήσεως. Η αιθανόλη είναι το πιο διαδεδομένο προϊόν που προέρχεται από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα και ο συνδυασμός της παραγωγής της με ένα ευρύ πεδίο χημικών ενισχύει τις πιθανότητες βιομηχανικής εφαρμογής. Οι γενικές κατηγορίες υλικών που προκύπτουν από τους φυσικής προέλευσης υδρογονάνθρακες είναι τα φυσικά πολυμερή, τα λιπαρά οξέα και τα έλαια, τα τερπενοειδή, οι υδρογονάνθρακες και τα μικροβιακά παραγόμενα προϊόντα (Σχήμα 1.4). H παρούσα κατάσταση των βιομηχανιών που βασίζονται στη λινγοκυτταρίνη παρουσιάζει ανοδική πορεία. Η παγκόσμια παραγωγή της βιοαιθανόλης αυξήθηκε από 17,25 δισεκατομμύρια λίτρα το 2000 σε πάνω από 46 δισεκατομμύρια το 2007, μία αύξηση που αντιστοιχεί στο 4% των 1300 δισεκατομμυρίων λίτρων βενζίνης που παράγονται παγκοσμίως. Τα χρηματοδοτικά προγράμματα σε Ευρώπη, Ασία και Αμερική κατευθύνουν την έρευνα και την παραγωγή σε αύξηση της παραγωγής αιθανόλης και βιοϋλικών γενικώς. Ήδη λειτουργούν, ή έχει ξεκινήσει ο σχεδιασμός για τη λειτουργία τους, μονάδες στις Η.Π.Α. που χρησιμοποιούν το καλαμπόκι για την παραγωγή βιοαιθανόλης και γαλακτικού οξέος καθώς και για την παραγωγή πολύ (ύδροξυ-αλκανοϊκών) εστέρων (PHAs) και 1,3-προπανεδιόλης (Koutinas et al., 2007). H BetaRenewables (Chemtext) προετοιμάζει τη λειτουργία μελλοντικής μονάδας παραγωγής ποικίλων βιοχημικών υλικών προερχόμενων από την επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, όπως είναι η n-βουτανόλη, η ισοβουτανόλη, -32-

53 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας 1,4-βουτανεδιόλη, οι λιπαρές αλκοόλες, η αιθυλενογλυκόλη, τα οργανικά οξέα: γαλακτικό, ηλεκτρικό, ακρυλικό και αδιπικό οξύ καθώς και αρωματικές ενώσεις, τερεθφαλικό οξύ και φαινόλες προερχόμενες από την κατεργασία της λιγνίνης. Παρακάτω, απεικονίζονται συγκεντρωτικά οι ενώσεις που μπορούν να εξαχθούν κατά την επεξεργασία των δομικών συστατικών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας καθώς και οι περαιτέρω εφαρμογές τους (Σχήμα 1.4). Σχήμα 1.4. Προτεινόμενη στρατηγική βιοδιυλιστηρίου βασισμένου στην επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας για την παραγωγή βιοαιθανόλης και ποικιλίας βιοχημικών υλικών και χημικών που προέρχονται από θερμοχημική διεργασία. -33-

54 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Το Σχήμα 1.4 απεικονίζει μία προτεινόμενη στρατηγική που χρησιμοποιεί τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα ως μοναδική πρώτη ύλη και μέσα από μια σειρά θερμοχημικών και βιοτεχνολογικών διεργασιών καταλήγει σε ένα ευρύ φάσμα προϊόντων. Τα μονομερή σάκχαρα που προήλθαν από την υδρόλυση της κυτταρίνης αλλά και των ημικυτταρινών οδηγούνται σε χημικές επεξεργασίες για παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Μέσω διαφορετικών οδών και συγκεκριμένα μέσω βιολογικής κατεργασίας τα μονομερή σάκχαρα καταναλώνονται από διαφορετικούς μικροοργανισμούς. Τα παραγόμενα προϊόντα ποικίλουν περιλαμβάνοντας ένα ευρύ φάσμα από βιοαιθανόλη μέχρι πληθώρα βιοχημικών υλικών όπως γαλακτικό, ηλεκτρικό και προπιονικό οξύ καθώς και βιοπολυμερών. Η λιγνίνη με τη σειρά της επεξεργάζεται μέσω βιοτεχνολογικής οδού για περαιτέρω υλικά σημαντικής εμπορικής αξίας όπως φαινόλες και ρητίνες καθώς και για πελλέτες στερεών καυσίμων. Επίσης, τα υπολείμματα της ζύμωσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ανάκτηση πρωτεϊνών και διατροφικών συμπληρωμάτων. Κάτι τέτοιο θα μείωνε το κόστος θρεπτικών συμπληρωμάτων για τα στάδια της ζύμωσης (Fang et al., 2010). Οι εφαρμογές των συστατικών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας επεκτείνονται σε χρήσεις όπως καύσιμα, ξυλεία, πολτών και υφασμάτων. Η καθαρή κυτταρίνη χρησιμοποιείται για παραγωγή χαρτιού απαλλαγμένο από ξύλο, σελοφάν, φωτογραφικών φιλμ, μεμβρανών, εκρηκτικών, ινών υφάσματος, πολυμερών διαλυτών σε οργανικούς διαλύτες που χρησιμοποιούνται σε βαφές και βερνίκια. Στη συνέχεια, και πιο εξειδικευμένα υλικά μπορούν να παραχθούν από την ενζυμική υδρόλυση και τη ζύμωση. Για παράδειγμα το γλουταμινικό οξύ παράγεται μικροβιακά με παραγωγή 1,7 δις kg/χρόνο παγκοσμίως, το κιτρικό οξύ επίσης με παραγωγή 1,6 δις kg/χρόνο παγκοσμίως και η λυσίνη παράγεται επίσης μικροβιακά με παραγωγή 850 εκατομμύρια kg/χρόνο παγκοσμίως (Menon et al., 2012). -34-

55 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Ηλεκτρικό Οξύ Το ηλεκτρικό οξύ είναι ένα δικαρβοξυλικό οξύ με μοριακό τύπο C4H6O4. Μετά την πρώτη φορά που απομονώθηκε από τον Agricola το 1546, παράγεται μικροβιολογικά για χρήση στο γεωργικό, διατροφικό και φαρμακευτικό τομέα. Σήμερα, παράγεται κυρίως μέσω χημικής διεργασίας που χρησιμοποιεί ως πρώτη ύλη το υγροποιημένο αέριο πετρελαίου (LPG) ή το πετρέλαιο. Το ηλεκτρικό οξύ αποτελεί πρόδρομη ένωση για μια σειρά σημαντικών χημικών ενώσεων όπως είναι το αδιπικό οξύ, η 1,4-βουτανεδιόλη, η τετραϋδροφουράνη, η Ν-μεθυλο πυρρολιδινόνη, η 2-πυρρολιδινόνη, το άλας του ηλεκτρικού οξέος και η γ-βουτυρολακτόνη (Σχήμα 1.5). Επίσης χρησιμοποιείται για τη σύνθεση βιο-αποικοδομήσιμων πολυμερών όπως είναι οι πολύ (ηλεκτρικοί) βουτυλεστέρες (PBS) και τα πολυαμίδια (Nylon x,4). Σχήμα 1.5. Διάφορα προϊόντα και χημικές ενώσεις που παρασκευάζονται από το ηλεκτρικό οξύ. Σήμερα, η βασική παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος πραγματοποιείται μέσω της χημικής μετατροπής του μηλεϊνικού ανυδρίτη. Η τιμή πώλησης είναι $/kg και παρουσιάζεται υψηλή λόγω της υψηλής τιμής αντίστοιχα του μηλεϊνικού ανυδρίτη που οφείλεται στη -35-

56 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας δύσκολη διαδικασία ανάκτησης του. Το 2002, η τιμή πώλησης του μηλεϊνικού ανυδρίτη ήταν 0,977 $/kg και η θεωρητική απόδοση της μετατροπής του σε ηλεκτρικό οξύ είναι 95%. Συμπεραίνεται επομένως, ότι η τιμή της πρώτης ύλης επί της τιμής του προϊόντος είναι 1,027 $/kg ηλεκτρικού οξέος. Αν ληφθεί υπόψη ότι η τιμή πώλησης της γλυκόζης που παρασκευάζεται παγκοσμίως είναι περίπου 0,428 $/ kg, συμπεραίνεται ότι η βιολογική μετατροπή της σε ηλεκτρικό οξύ και συγκεκριμένα από λιγνοκυτταρινική βιομάζα μπορεί να γίνει ανταγωνιστική με τη χημική παρασκευή του οξέος. Επίσης, το ηλεκτρικό οξύ αποτελεί μία από τις σημαντικότερες δομικές χημικές ενώσεις που εξέδωσε το Παράρτημα Ενέργειας των Ηνωμένων Πολιτειών (FitzPatrick et al., 2010) που παράγεται με τη μέθοδο της ζύμωσης των σακχάρων από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Η ζύμωση της γλυκόζης και της ξυλόζης παράγει ηλεκτρικό οξύ με παράλληλη κατανάλωση CO2 του άνθρακα που την καθιστά πράσινη τεχνολογία. Το ηλεκτρικό οξύ χρησιμοποιείται ευρέως στη χημική βιομηχανία που ο βραβευμένος με Νόμπελ Robert Knock απέδειξε ότι η συγκέντρωση του στο ανθρώπινο σώμα δε προκαλεί καμία παρενέργεια. Οι μικροοργανισμοί που μεταβολίζουν τη γλυκόζη και την ξυλόζη για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος είναι τα βακτήρια Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Anaerobiospirillum succiniciproducens καθώς και κάποια ανασυνδυασμένα στελέχη του Escherichia coli. Τα άγρια στελέχη παράγουν μέσω αναερόβιας ζύμωσης το κύριο καταβολικό τους προϊόν που είναι το ηλεκτρικό οξύ μέσω του κύκλου του τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA). Η ζύμωση των σακχάρων από τον μικροοργανισμό ουδετεροποιείται παράλληλα με την παραγωγή του προϊόντος καθότι οι μικροοργανισμοί δεν παρουσιάζουν αντοχή σε όξινες συνθήκες. Η ανάκτηση του ηλεκτρικού οξέος από το διάλυμα της ζύμωσης όπου βρίσκονται τα άλατα του ηλεκτρικού οξέος γίνεται με διαλυτοποίηση των αλάτων σε όξινο διάλυμα (Carole et al., 2004, FitzPatrick et al., 2010). -36-

57 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας 1.3 Λιγνοκυτταρινική βιομάζα Η λιγνοκυτταρινική βιομάζα έχει αναγνωριστεί ως πιθανή οικονομικότερη πρώτη ύλη για παραγωγή βιοαιθανόλης από ζυμώσιμα σάκχαρα καθώς αποτελεί φθηνό και εύκολα διαθέσιμο υλικό. Στην κατηγορία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας περιλαμβάνονται τα δασικά υπολείμματα, τα αστικά στερεά υπολείμματα (χάρτινα απορρίμματα), τα αγροτικά υπολείμματα (άχυρο, υπολείμματα ρυζιού, κοτσάνια καλαμποκιού, βαγάσση ζαχαροκάλαμου) και τα ενεργειακά φυτά που δεν ανταγωνίζονται τα φυτά που χρησιμοποιούνται για τροφή όπως είναι τα ποώδη φυτά (switchgrass, Phalaris aquatica, Phalaris arundinacea). Το switchgrass και η υβριδική λεύκα αποτελούν το ήμισυ του 1,3 δισεκατομμυρίων τόνων βιομάζας που υπολογίζεται ότι θα είναι διαθέσιμη στα μέσα του 21 ου αιώνα (Perlack et al., 2005). Το υπόλειμμα ρυζιού είναι από τα πιο άφθονα λιγνοκυτταρινικά υλικά καθώς παράγονται ετησίως 731 εκατομμύρια τόνοι σε παγκόσμιο επίπεδο (Balat, 2010). Τα λιγνοκυτταρινούχα φυτά με τις υψηλότερες διαθέσιμες ποσότητες στην Ευρώπη είναι τα γεωργικά υπολείμματα, για παράδειγμα, το άχυρο με 132,59 εκατομμύρια τόνους ετησίως και το υπόλειμμα καλαμποκιού με 28,61 εκατομμύρια τόνους ετησίως (Sarkar et al., 2012). Τα γεωργικά υπολείμματα αποτελούν προτεινόμενη πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμων λόγω του υψηλού αποθέματος πρώτων υλών. Η χρήση των υπολειμμάτων σε άλλες εφαρμογές είναι πολύ χαμηλή και διαφοροποιείται ανά περιοχή. Συγκεκριμένα, υπάρχουν κάποιες εφαρμογές στο πεδίο των ζωοτροφών, στο οικιακό καύσιμο καθώς και στην καύση σε καυστήρες. Ωστόσο, το μεγαλύτερο ποσοστό τους απορρίπτεται χωρίς καμία εφαρμογή, αυξάνοντας το μέγεθος των απορριμμάτων και τη δημόσια υγεία σε περίπτωση καύσης ανοιχτού πεδίου. Πάνω από το 90% του υπολείμματος καλαμποκιού στις Ηνωμένες Πολιτείες αφήνεται στους αγρούς και λιγότερο από το 1% του άχυρου βρίσκει βιομηχανική εφαρμογή. Η χρήση των υλικών αυτών ως πρώτη ύλη για παραγωγή βιοαιθανόλης μπορεί να αυξήσει την παραγωγή κατά 205 δισεκατομμύρια λίτρα ετησίως (Sarkar et al., 2012). Η πρόκληση, που προκύπτει κατά την παραγωγή της βιοαιθανόλης από την λιγνοκυτταρινική βιομάζα, είναι το σπάσιμο της φυσικής προστασίας που έχουν αναπτύξει τα λιγνοκυτταρινούχα φυτά σε εξωτερικές επιρροές, ώστε να είναι οικονομικά βιώσιμη η εφαρμογή της τεχνολογίας παραγωγής. Τα φυτά διαθέτουν δομικά συστατικά που λειτουργούν ως προστασία για τους δομικούς πολυσακχαρίτες τους. Οι νέες τεχνολογίες -37-

58 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας στοχεύουν στην αποικοδόμηση των κυτταρικών τοιχωμάτων των φυτών χωρίς την εφαρμογή έντονων συνθηκών που θα οδηγήσουν σε παρεμπόδιση της ζύμωσης των παραγόμενων σακχάρων από τον μικροοργανισμό. Εφόσον αναπτυχθεί η τεχνολογία αποικοδόμησης, τα διαθέσιμα φυσικά σάκχαρα που προέρχονται από τους δομικούς πολυσακχαρίτες του φυτού είναι σε θέση να χρησιμοποιηθούν σε πληθώρα εφαρμογών όπως αναφέρθηκαν στις Παραγράφους 1.1 και 1.2. Κάποια από τα συχνότερα λιγνοκυτταρινικά φυτά που έχουν μελετηθεί για ολοκληρωμένη επεξεργασία προς παραγωγή ζυμώσιμων σακχάρων είναι τα ποώδη φυτά. Το 40-80% των φυτών αυτών αποτελούν τα κυτταρικά τοιχώματα με δομική μονάδα τους πολυσακχαρίτες (κυτταρίνη και ημικυτταρίνες). Η λιγνίνη, που λειτουργεί ως αντιμικροβιακή προστασία και προσφέρει ανθεκτικότητα στο φυτό, παρουσιάζεται αυξημένη σε μεγαλύτερα φυτά με ισχυρότερο σκελετό όπως τα ξυλώδη. Για παράδειγμα, το άχυρο είναι πλούσιο σε δομικούς υδατάνθρακες και συγκεκριμένα αποτελείται από 35-45% κυτταρίνη και 20-30% ημικυτταρίνες ενώ το υπόλοιπο 8-15 % είναι λιγνίνη, το 13,2% πρωτεΐνες και στάχτη. Κάποια από τα πιο διαδεδομένα λιγνοκυτταρινικά υλικά αναλύονται στον Πίνακα 1.1 για το ποσοστιαίο τους περιεχόμενο σε δομικούς πολυσακχαρίτες και λιγνίνη (Mosier et al., 2005). Το υψηλό ποσοστό δομικών πολυσακχαριτών είναι καθοριστικό για την επιλογή της υποψήφιας λιγνοκυτταρινικής βιομάζας ως κατάλληλη πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμου. Ενώ από την άλλη πλευρά, η λιγνίνη αποτελεί εμπόδιο για την παραλαβή των ζυμώσιμων μονομερών σακχάρων, που οι τεχνολογίες παραγωγής βιοκαυσίμων καλούνται να ξεπεράσουν. Η παραγωγή βιοκαυσίμων και βιοϋλικών υψηλής προστιθέμενης αξίας από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα συνδέεται άμεσα με τη δυνατότητα παραλαβής των μονομερών φυσικών σακχάρων της βιομάζας που αποτελούν τα δομικά της συστατικά. Κάθε μέθοδος που εφαρμόζεται στοχεύει στην παραλαβή των φυσικών σακχάρων με διαφορετικό τρόπο. Η ποικιλία των χειρισμών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας οφείλεται στη διαφοροποίηση των φαινομένων της αλληλεπίδρασης της βιομάζας με τα πρωτεϊνικά μακρομόρια των πρωτεϊνών κατά την ενζυμική υδρόλυση της βιομάζας. Ο στόχος της δράσης των ενζύμων είναι η αλλοίωση της επιφάνειας της βιομάζας προς παραγωγή μονομερών σακχάρων και ολιγοσακχαριτών. Τέλος, σημαντικό πεδίο στην εξέλιξη της τεχνολογίας παραγωγής βιοαιθανόλης και βιοχημικών από λιγνοκυτταρινική βιομάζα αποτελούν οι παράγοντες που -38-

59 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας επηρεάζουν την παραγωγικότητα του φυτού. Συγκεκριμένα, έμφαση δίνεται στην ικανότητα του φυτού να αποθηκεύει απόθεμα πολυσακχαριτών κατά την ανάπτυξη του. Τα ενεργειακά φυτά καλλιεργούνται σε οριακές εκτάσεις, μη παραγωγικές, οπότε είναι σημαντικά τα χαρακτηριστικά εκείνα του φυτού που το καθιστούν ανεκτικό σε ξηρασία, χαμηλές θερμοκρασίες και άλλες στρεσογόνες συνθήκες. Συνεπώς, την περισσότερη προσοχή έχουν συγκεντρώσει τα πολυετή φυτά, για τη χρήση τους ως ενεργειακά φυτά. Πίνακας 1.1. Σύσταση επί ξηρής βιομάζας σε ποσοστό % για διάφορα είδη Βιομάζα Κοτσάνια καλαμποκιού Ίνες καλαμποκιού λιγνοκυτταρινικής βιομάζας Γλυκάνες (Κυτταρίνη) Ξυλάνες (Ημικυτταρίνες) Λιγνίνη 37,5 22,4 17,6 14,3 16,8 8,4 Πεύκο 46,4 8,8 29,4 Λεύκα 49,9 17,4 18,1 Άχυρο 38,2 21,2 23,4 Switchgrass 31 20,4 17,6 Χαρτί 68,6 12,4 11, Χαρακτηριστικά του Phalaris aquatιca Η βιομάζα Phalaris aquatica L. αποτελεί ένα πολυετές φυτό, χαρακτηριστικό είδος της περιοχής της Μεσογείου. Η Phalaris aquaticα L., γνωστή και ως φαλαρίδα είναι ένα πολυετές αγρωστώδες φυτό που θεωρείται σημαντικά παραγωγικό και κατάλληλο για βοσκή. Ανήκει στην οικογένεια Poaceae και αναγνωρίζεται βοτανικά με τα ονόματα Phalaris commutata, Phalaris bulbosa, Phalaris stenoptera και Phalaris tuberosa (Anderson, 1961). Στις ΗΠΑ, η βασική κοινή ονομασία για τη φαλαρίδα είναι χόρτο του Harding σε αναγνώριση του Mr. Harding για τις προσπάθειές του για την αξιολόγηση και τη διανομή του φυτού. -39-

60 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Τα τελευταία χρόνια υπάρχει μεγάλο περιθώριο έρευνας σχετικά με τη χρήση των πολυετών φυτών ως πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Τα πολυετή φυτά διαθέτουν πλειοψηφία πλεονεκτημάτων σε σχέση με τα συμβατικά ετήσια φυτά. Αρχικά έχουν όριο ζωής περισσότερο από δέκα έτη και αυτός είναι ο λόγος που έχουν λιγότερες απαιτήσεις καλλιέργειας σε σχέση με τα συμβατικά φυτά. Συνεπώς είναι μειωμένες οι ανάγκες τους σε εντομοκτόνα, μικροβιοκτόνα και ζιζανιοκτόνα σε σχέση με τα συμβατικά φυτά. Επίσης, ο μηχανικός εξοπλισμός που απαιτούν κατά την καλλιέργεια τους είναι συνήθως για κάθε παραγωγό κοινός με τον εξοπλισμό για χορτάρι σε συγκεκριμένες καλλιέργειες. Σημαντικό επίσης πλεονέκτημα των πολυετών φυτών είναι οι μειωμένες ανάγκες τους σε θρεπτικά συστατικά καθώς τα διατροφικά τους συστατικά πραγματοποιούν κύκλο μέσα στα χρόνια. Ακόμα, έχουν ισχυρό ριζικό σύστημα με αποτέλεσμα να διατηρούν μεγάλες ποσότητες άνθρακα στο χώμα. Τα ποώδη πολυετή φυτά δεσμεύουν φορές περισσότερο διοξείδιο του άνθρακα σε σχέση με τις συμβατικές γραμμικές καλλιέργειες. Σε εύκρατα κλίματα όπως το μεσογειακό, η ετήσια παραγωγή βιομάζας των πολυετών καλλιεργειών μπορεί να είναι σημαντικά υψηλότερη από την παραγωγή των ετήσιων καλλιεργειών. Επίσης, το ενεργειακό τους περιεχόμενο είναι 6 με 18 φορές περισσότερο από την ενέργεια που απαιτούν για την καλλιέργεια και τη μεταφορά τους για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Η τιμή του βασικού αγροτικού προϊόντος παραμένει σχετικά σταθερή τα τελευταία είκοσι χρόνια σε αντίθεση με τα ορυκτά καύσιμα που η τιμή τους έχει αυξηθεί δραστικά τα τελευταία χρόνια. Η διαθέσιμη γη για καλλιέργεια ενεργειακών φυτών και συγκεκριμένα πολυετών για την παραγωγή βιοκαυσίμων υπολογίζεται σε 8,5 και 52,6 εκατομμύρια εκτάρια σε Καναδά και Η.Π.Α. (Wrobel et al., 2009). -40-

61 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.6. Το φυτό Phalaris aquatica στο σημείο καλλιέργειας σε ύψος 1,5 m. Η φαλαρίδα είναι ένα πολυετές αγρωστώδες φυτό που το ύψος του πλησιάζει το 1-1,5 μέτρο και διαθέτει χρόνο ζωής χρόνια (Munz & Keck, 1968). Τα φύλλα του έχουν μπλε - πράσινο χρώμα, είναι επίπεδα με μήκος cm και πλάτος 4-15 mm. Η ταξιανθία της φαλαρίδας είναι πυκνή κυλινδρική με μήκος 5-15 cm και πλάτος mm που φέρονται πάνω σε ψηλά και όρθια στελέχη (Σχήμα 1.6). Τα άνθη της φαλαρίδας (5,5 έως 6,5 mm) είναι μακριά, πλαγίως πεπλατυσμένα, όλα παρόμοια μεταξύ τους και κατά την πλήρη ωρίμανσή τους είναι προσκολλημένα πάνω σε βράκτια (Σχήμα 1.7). Η κύρια χρήση της φαλαρίδας στην παρούσα χρονική στιγμή είναι βόσκηση προβάτων (Oram et al., 1974). Στην περιοχή της Ουαλίας υπάρχουν περισσότερα από 1,6 εκατομμύρια εκτάρια βοσκοτόπων με φαλαρίδα. Στην Καλιφόρνια, η φαλαρίδα χρησιμοποιείται για καλλιέργεια σε περιοχές για αναβλάστηση μετά από πυρκαγιές καθώς και για ζωοτροφή. Τη φαλαρίδα τη συναντάει κανείς κατά μήκος των δρόμων, καθώς και σε ρέματα, διότι παρουσιάζει αντοχή στο υγρό κλίμα. Επίσης παρουσιάζει αντοχή στις ξηρές συνθήκες, χάρη στο βαθύ ριζικό της σύστημα και παραμένουν συνήθως αδρανή κατά την περιορισμένη θερινή υγρασία και σε αντίθεση με τα ετήσια φθινοπωρινά φυτά, μετά τις πρώτες βροχές του φθινοπώρου εμφανίζουν ενεργή ανάπτυξη (Kay, 1969). Κατά τη θερινή περίοδο, τα φυτά της φαλαρίδας παράγουν νέους σπόρους. Τα -41-

62 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας φυτά της φαλαρίδας μπορούν να ανεχτούν κάποια σκιά, είναι όμως καταλληλότερο το ανοικτό έδαφος. Το κύριο πλεονέκτημα της φαλαρίδας είναι η μεγαλύτερη περίοδος παραγωγής βιομάζας σε σχέση με τα ετήσια φυτά (σιτηρά, ψυχανθή). Παρατηρήθηκε σε μελέτη καλλιέργειας της συγκεκριμένης βιομάζας σε εδάφη διαφορετικού υψομέτρου, μεγαλύτερη απόδοση σε παραγωγή βιομάζας καθώς και σε λιγνοκυτταρινικό περιεχόμενο σε εδάφη χαμηλότερου υψομέτρου. Κατά τα χρόνια καλλιέργειας της φαλαρίδας, παρατηρήθηκε η υψηλότερη παραγωγή βιομάζας κατά το δεύτερο έτος ενώ μετά τη δεκαετία, η παραγωγή της βιομάζας μειώνεται σημαντικά (Παππάς, 2010). Σχήμα 1.7. Διάφορα μέρη (ταξιανθία, σπόρος, ρίζα) του φυτού Phalaris aquatica L. Το είδος Phalaris aquatica προτείνεται ως ενεργειακό φυτό λόγω της υψηλής παραγωγής βιομάζας (6,3-11 tn DM/ha) και του υψηλού λιγνοκυτταρινικού περιεχομένου του. Επιπρόσθετα, η εγκατάσταση του μέσω σπόρων και οι συμβατικές μέθοδοι για την καλλιέργεια και τη συγκομιδή του διευκολύνουν τα αγρονομικά χαρακτηριστικά του. Η Phalaris aquatica και η Phalaris arundinacea, που καλλιεργείται κυρίως στη βόρεια Ευρώπη, παρουσιάζουν παρόμοια συμπεριφορά στην ανάπτυξη ριζώματος (βαθύ ρίζωμα) και διαφέρουν στο μήκος του άγονου βρακτίου. Αναφέρθηκε από τους Wrobel et al. (2009) ότι η Phalaris arundinacea προσφέρει 130% μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας σε σχέση με άλλα -42-

63 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας ενεργειακά φυτά λόγω της δυνατότητας συγκομιδής της δύο φορές το χρόνο. Μία ανάλυση κόστους που πραγματοποιήθηκε από τους Brummer et al. (2001) συμπέρανε ότι για τη φαλαρίδα, όσο αυξάνεται η απόδοση της βιομάζας ανά εκτάριο γης τόσο μειώνεται το κόστος ανά τόνο βιομάζας. 1.4 Πειραματικός Σχεδιασμός Η κατανόηση ενός φυσικού συμβάντος εξαρτάται από τον αριθμό και την ακρίβεια των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν κατά τη μελέτη του. Ο πειραματικός σχεδιασμός είναι το απαραίτητο εργαλείο που περιορίζει τον πραγματικό πληθυσμό και καταλήγει στην παρατήρηση και τη μελέτη ενός κλάσματος του πραγματικού πληθυσμού με τη διεξαγωγή μικρότερου αριθμού πειραμάτων. Η εφαρμογή ενός πειραματικού σχεδιασμού προσφέρει εργαλεία που διερευνούν την επίδραση των αλλαγών στα εισερχόμενα ενός συστήματος στις μέσες τιμές των εξερχομένων του συστήματος (απόκριση). Η διαλογή των παραμέτρων του συστήματος στηρίζεται στην αρχή του περιορισμού μιας μακράς λίστας παραμέτρων σε όσους παράγοντες επηρεάζουν σημαντικά τη μέση τιμή της απόκρισης. Η διαλογή αυτή μειώνει το χρόνο και το κόστος ενός πειραματικού σχεδιασμού σε σχέση με τη μελέτη ενός παράγοντα τη φορά (Allen, 2006). Στη βιομηχανία, ο πειραματικός σχεδιασμός χρησιμοποιείται συστηματικά για να ανιχνεύσει τις παραμέτρους εκείνες της διεργασίας που επηρεάζουν την ποιότητα του προϊόντος. Εφόσον προσδιοριστούν οι συνθήκες της διεργασίας και τα χαρακτηριστικά του προϊόντος που επηρεάζουν την ποιότητα, ακολουθούν ενέργειες για τη βελτίωση της παραγωγικότητας, της αξιοπιστίας, της ποιότητας και της αποδοτικότητας της παραγωγής. Καθώς οι πόροι είναι πάντα περιορισμένοι, κάθε πείραμα έχει ως στόχο την εξαγωγή των μέγιστων συμπερασμάτων που μπορούν να προκύψουν από τη διεξαγωγή του. Όταν έχει πραγματοποιηθεί ο κατάλληλος σχεδιασμός για ένα πείραμα, προκύπτουν σημαντικά συμπεράσματα με λιγότερους χειρισμούς. Κάθε πειραματικός σχεδιασμός μελετά τις σημαντικές συνθήκες της διεργασίας που τις ονομάζει παραμέτρους σε διαφορετικές τιμές που ονομάζονται επίπεδα. Ο αριθμός των παραμέτρων και των επιπέδων που μελετάται η κάθε μία είναι το χαρακτηριστικό που διαφοροποιεί κάθε σχεδιασμό και καθορίζει τελικά τον αριθμό των πειραματικών χειρισμών (runs). -43-

64 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Ο πειραματικός σχεδιασμός περιλαμβάνει τα εξής στάδια κατά την κατάστρωση του: το στάδιο της μελέτης των πειραματικών χειρισμών της διεργασίας, τη διαλογή των σημαντικών μεταβλητών που επηρεάζουν την ποιότητα του προϊόντος, τη βελτιστοποίηση της διεργασίας και την επαλήθευση των προβλέψεων του πειραματικού σχεδιασμού Μέθοδος Επιφανειών Απόκρισης (Response Surface Methods, RSM) Η μέθοδος Επιφανειών Απόκρισης διαφοροποιείται από τους υπόλοιπους πειραματικούς σχεδιασμούς σε συγκεκριμένα σημεία. Αρχικά, οι συγκεκριμένοι πειραματικοί σχεδιασμοί μελετούν περισσότερους παράγοντες σε σχέση με τους κλασματικούς παραγοντικούς σχεδιασμούς διότι συνήθως από προηγούμενα πειράματα έχει εντοπιστεί η σημασία ορισμένων παραμέτρων. Επίσης, η RSM χαρακτηρίζεται από ακρίβεια της πρόβλεψης και βελτιστοποιεί σε βάθος το σύστημα που μελετάται. Η προσομοίωση της καμπυλότητας που προσφέρει η μέθοδος Επιφανειών Απόκρισης και απεικονίζεται σε διαγράμματα επιφάνειας τριών διαστάσεων, επιτρέπει την κατανόηση και την απεικόνιση μιας επιφάνειας απόκρισης. Επιπρόσθετα η μέθοδος δίνει τη δυνατότητα εξαγωγής ενός μοντέλου πρόβλεψης της επίδρασης που παρουσιάζουν οι αλλαγές των ελεγχόμενων μεταβλητών που εισέρχονται στο σύστημα στην απόκριση. Καθοριστική συνεισφορά του πειραματικού σχεδιασμού είναι η επιλογή των συνθηκών λειτουργίας του συστήματος που είναι σύμφωνες με τους επιθυμητούς στόχους. Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι σχεδιασμού επιφανειών απόκρισης: το σύστημα Κεντρικού Σημείου (Central Composite) και το σύστημα Box-Behnken. Συγκεκριμένα, ο σχεδιασμός Box Behnken (Box & Behnken, 1960) εφαρμόζει μία μήτρα πειραματικού σχεδιασμού τριών επιπέδων που έχουν τη δυνατότητα παρουσίασης σε διαγράμματα επιφάνειας τριών διαστάσεων. Από τον πειραματικό σχεδιασμό προκύπτει ένα προσαρμοσμένο μοντέλο στη διεργασία που μπορεί να είναι γραμμικό ή πολυωνιμικό που περιλαμβάνει τις παραμέτρους της διεργασίας καθώς και τις αλληλεπιδράσεις τους. Ο σχεδιασμός αυτός παράγει σχετικά ασφαλείς προβλέψεις γιατί μειώνει σημαντικά τα λάθη που προκύπτουν από ορισμένες παραδοχές. Σε περίπτωση που ο αριθμός των πειραμάτων -44-

65 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας είναι μεγάλος, υπάρχει ο κίνδυνος για την πραγματοποίηση τους κάτω από σταθερή κατάσταση να εισαχθεί μεγάλο σφάλμα. Για αυτό το λόγο ο πειραματικός σχεδιασμός Box Behnken χρησιμοποιεί τους παράγοντες κατηγορίας (block factors) ώστε να αξιολογηθούν ξεχωριστά οι συνθήκες του πειράματος από τις μη ελεγχόμενες συνθήκες. Για παράδειγμα ένας τέτοιος παράγοντας μπορεί να είναι η διαφορετική ημέρα πειραμάτων. Τα βήματα που ακολουθούνται κατά το σχεδιασμό διαφέρουν σε ένα βαθμό ανάλογα με τη φύση του πειράματος, στηρίζονται όμως σε βασικές αρχές. Ξεκινώντας, πρέπει να επιλεγούν οι παράγοντες που έχουν τη σημαντικότερη επίδραση και να περιληφθούν στον πειραματικό σχεδιασμό. Ανάλογα με τον αριθμό των παραμέτρων προκύπτει ο αριθμός των χειρισμών που θα πραγματοποιηθούν με δεδομένα τα τρία επίπεδα μελέτης (-1, 0, 1) για την κάθε παράμετρο. Στη συνέχεια ακολουθεί η πραγματοποίηση των πειραμάτων και η συλλογή των τιμών για την παράμετρο απόκρισης. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων περιλαμβάνει την κατάστρωση μοντέλου που προβλέπει την απόκριση για κάθε συνδυασμό παραμέτρων. Η επίδραση των αλληλεπιδράσεων των παραμέτρων απεικονίζεται σε ένα διάγραμμα επιφανειών (surface plots) ή σε ένα διάγραμμα περιγράμματος (contour plots). Επιπρόσθετα, τα αποτελέσματα των επιδράσεων των παραγόντων στην απόκριση επαναξιολογούνται βάση του κριτηρίου Προσαρμοσμένος Παράγοντας R 2, που υποδεικνύει το ποσοστό διακύμανσης που οφείλεται στις αλλαγές των τιμών της απόκρισης. Η αναμενόμενη τιμή για τον συντελεστή R 2 είναι ικανοποιητική όταν ξεπερνά το ποσοστό 50%. Σε άλλη περίπτωση, δημιουργούνται αμφιβολίες για την αξιοπιστία των τιμών της απόκρισης και για τη δυνατότητα ανίχνευσης και ελέγχου των σημαντικών παραγόντων του συστήματος (Allen, 2006). -45-

66 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.8. Πειραματικός σχεδιασμός Box Behnken τριών παραμέτρων Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi. Η μέθοδος Taguchi αναπτύχθηκε από τον Genichi Taguchi με στόχο την αύξηση της ποιότητας των παραγόμενων προϊόντων και πιο πρόσφατα χρησιμοποιήθηκε σε εφαρμογές στη μηχανική, τη βιοτεχνολογία, τη διαφήμιση και το μάρκετινγκ (Karna, 2012). Οι επαγγελματίες στατιστικολόγοι αναφέρονται στη διαφοροποίηση της μεθόδου στην ανάπτυξη σχεδιασμών για τη μελέτη της απόκλισης. Ο Taguchi εισήγαγε την έννοια των εξωτερικών επιδράσεων, το θόρυβο (Noise) και προσπάθησε να αναγνωρίσει τις επιδράσεις εκείνες που έχουν το σημαντικότερο αποτέλεσμα στις διακυμάνσεις του προϊόντος. Το αποτέλεσμα ήταν η εφαρμογή του σχεδιασμού από παραγωγούς ανά τον κόσμο που επιτυγχάνουν υψηλής ποιότητας διεργασίες παραγωγής σε χαμηλή τιμή κόστους. Ο βασικός στόχος είναι ο σχεδιασμός ικανών συστημάτων σχεδιασμού που είναι αξιόπιστα κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες (Taguchi, 1986). Η μέθοδος στοχεύει στην επιλογή των βέλτιστων επιπέδων των παραμέτρων ελέγχου, ώστε να προκύψει μια ισχυρή απόκριση που δε θα επηρεάζεται από τους παράγοντες θορύβου -46-

67 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας που δεν είναι δυνατό να ελεγχθούν. Η βελτιστοποίηση της διεργασίας βασίζεται στην αρχή της προσαρμογής της διεργασίας σε ένα σύνολο παραμέτρων στα πλαίσια των περιορισμών που θέτουν τα επίπεδα τους ενώ παράλληλα μία εκ των παραμέτρων, η απόκριση, μεγιστοποιείται (Σχήμα 1.9). Κοινός στόχος είναι συνήθως η ελαχιστοποίηση του κόστους, η μεγιστοποίηση της παραγωγής και της αποτελεσματικότητας. Οι τεχνικές σχεδιασμού διεργασιών Taguchi χρησιμοποιούνται ευρέως για το σχεδιασμό διεργασιών και περιλαμβάνουν σχεδιασμό του συστήματος, των παραμέτρων και της αντοχής της διεργασίας. Βασικό σημείο του σχεδιασμού είναι η επιλογή των κρίσιμων επιπέδων για τις παραμέτρους του συστήματος ώστε να αποδώσουν ποιοτικά χαρακτηριστικά στο σχεδιασμό με ελάχιστη διακύμανση. Η εφαρμογή ενός σχεδιασμού Taguchi απαιτεί συγκεκριμένες εφαρμοσμένες στατιστικές γνώσεις για αυτό και είναι δημοφιλείς στην επιστημονική κοινότητα και στην κοινότητα των μηχανικών. Διατυπώνονται τρεις καταστάσεις: Το μέγιστο είναι το καλύτερο, το ελάχιστο είναι το καλύτερο και το βέλτιστο (ελάχιστες διακυμάνσεις) είναι το καλύτερο. Ο σχεδιασμός Taguchi χρησιμοποιεί το λόγο Σήμα/ Θόρυβο (Signal/Noise) ως το ποιοτικό χαρακτηριστικό επιλογής. Ο λόγος S/N χρησιμοποιείται ως ποσοτική μεταβλητή αντί της σταθερής απόκλισης γιατί όσο μειώνεται η μέση τιμή αναλόγως μειώνεται και η σταθερή απόκλιση καθώς και το αντίστροφο. Οι εξισώσεις για τον υπολογισμό του λόγου S/N καθώς και άλλων στατιστικών αναλύσεων που λειτουργούν πίσω από τον πειραματικό σχεδιασμό Taguchi παρουσιάζονται στο Παράρτημα Α. -47-

68 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.9. Διάγραμμα παραμέτρων Taguchi Τα βήματα που ακολουθούνται στη μεθοδολογία Taguchi είναι τα εξής: Αναγνώριση της βασικής λειτουργίας, των παρενεργειών και των σημείων αποτυχίας Καθορισμός των παραγόντων θορύβου, των συνθηκών που θα μελετηθούν και των ποιοτικών χαρακτηριστικών Αναγνώριση της λειτουργίας που θα βελτιστοποιηθεί Αναγνώριση των παραγόντων ελέγχου και των επιπέδων τους Επιλογή του ορθογώνιου πειραματικού σχεδιασμού Πραγματοποίηση του πειραματικού σχεδιασμού Ανάλυση των αποτελεσμάτων, πρόβλεψη των βέλτιστων επιπέδων Εκτέλεση πειράματος επιβεβαίωσης και σχεδιασμός μελλοντικής μεθοδολογίας Οι λόγοι που χρησιμοποιούνται στη μεθοδολογία Taguchi (Σήματος/Θορύβου) είναι λογαριθμικές εξισώσεις που βασίζονται σε ένα πείραμα ορθογώνιου σχεδιασμού που καταλήγει σε μειωμένες αποκλίσεις (errors) για το πείραμα και σε βέλτιστες συνθήκες για τις παραμέτρους ελέγχου. Μια σειρά περιορισμένων πειραμάτων συνδυάζεται με το επιθυμητό συμπέρασμα ώστε να είναι δυνατή η ανάλυση των δεδομένων και η μελλοντική πρόβλεψη των αποτελεσμάτων. -48-

69 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας 1.5 Σκοπός της Διατριβής Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην πειραματική μελέτη μιας ολοκληρωμένης τεχνολογίας μετατροπής της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας του φυτού Phalaris aquatica προς παραγωγή βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος ως ενδιάμεσο βιοχημικό προϊόν υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η ολοκληρωμένη διεργασία που προτείνεται περιγράφεται στο παρακάτω διάγραμμα ροής (Σχήμα 1.10). Αρχικά, η πειραματική μελέτη περιλαμβάνει την ενδελεχή ανάλυση και βελτιστοποίηση των επιμέρους σταδίων επεξεργασίας που εφαρμόζονται στο συγκεκριμένο είδος της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Το σημείο εκείνο που καθιστά σημαντική την παρούσα μελέτη εντοπίζεται στο γεγονός ότι στη βιβλιογραφία περιλαμβάνονται πλήθος επιστημονικών άρθρων με αντικείμενο την παραγωγή βιοαιθανόλης δεύτερης γενιάς από λιγνοκυτταρινική βιομάζα, ενώ δεν υπάρχει αρκετό υλικό για ένα μεσογειακό είδος όπως η φαλαρίδα (Phalaris aquatica L.). Το συγκεκριμένο φυτό αποτελεί μία ενδιαφέρουσα περίπτωση για περαιτέρω μελέτη καθώς προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα όπως το μέγεθος παραγωγής της φαλαρίδας ανά επιφάνεια (6,3-11 tn/ha), η προσαρμογή της σε οριακές περιοχές, το υψηλό περιεχόμενο δομικών πολυσακχαριτών και η χαμηλή περιεκτικότητα σε λιγνίνη. Συγκεκριμένα, οι δομικοί πολυσακχαρίτες του φυτού αποτελούν σημαντικό ποσοστό της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Σύμφωνα με το διάγραμμα ροής που προτείνεται για την εφαρμογή της ολοκληρωμένης διεργασίας, το οποίο περιλαμβάνει τη χημική σύσταση του φυτού Phalaris aquatica με πηγές από προκαταρκτικά πειράματα και βιβλιογραφικές αναφορές, το σύνολο των δομικών πολυσακχαριτών του φυτού αποτελεί το 71,8% (μέση τιμή των οριακών τιμών 69,4% και 74,2%). Συγχρόνως, εκτός από τις ημικυτταρίνες και την κυτταρίνη που αποτελούν σημαντικό ποσοστό του φυτού, η περιεκτικότητα της λιγνίνης είναι σημαντικά χαμηλή και σύμφωνα με το Σχήμα 1.10 ίση με 7,13% (μέση τιμή των οριακών τιμών 6,7% και 7,56%). Η βελτιστοποίηση της διεργασίας στοχεύει στη βελτιστοποίηση του κάθε σταδίου και θα ξεκινήσει από το στάδιο της προ-επεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας με τη μέθοδο της υδρόλυσης με αραιό θειικό οξύ, μέσω στατιστικού σχεδιασμού πάνω σε τρεις παραμέτρους της μεθόδου. Η περιγραφή και η μελέτη του σταδίου περιλαμβάνεται στο Κεφάλαιο 3. Η μεγιστοποίηση της διαλυτοποίησης των ημικυτταρινών, σε ποσοστά που πλησιάζουν τα ποσοστά της βιβλιογραφίας (μετατροπή των ημικυτταρινών=80%), και της -49-

70 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας συγκέντρωσης του μονομερούς σακχάρου της ξυλόζης στο υγρό τμήμα του ρεύματος εξόδου της προεπεξεργασίας αποτελεί τον στόχο του πρώτου σταδίου της διεργασίας. Εν συνεχεία, η μελέτη θα βασιστεί στην επιλογή και τη χρήση κατάλληλων ενζύμων για την υδρόλυση της κυτταρίνης, που περιλαμβάνεται στο στερεό τμήμα του ρεύματος εξόδου της προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Η βελτιστοποίηση του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης, μέσω στατιστικού σχεδιασμού βασισμένου σε τέσσερεις παραμέτρους της μεθόδου, αποτελεί τον επόμενο στόχο της διεργασίας και περιλαμβάνεται στο Κεφάλαιο 4. Η βέλτιστη λύση θα κριθεί ποσοτικά για τη μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της παραγόμενης γλυκόζης που περιλαμβάνεται στο υδρόλυμα της ενζυμικής υδρόλυσης. Ο στόχος της μετατροπής των μονομερών σακχάρων, προερχόμενων από την υδρόλυση τόσο των ημικυτταρινών όσο και της κυτταρίνης), που έχει τεθεί κατά την ολοκλήρωση του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης και της προεπεξεργασίας αντιστοιχεί σε ένα εύρος τιμών όπως προκύπτουν από βιβλιογραφικές μελέτες ίσο με 77,4% - 83,4 %. Στη συνέχεια, θα μελετηθεί η σύνθεση της βιοαιθανόλης όπου καταλήγει η ολοκληρωμένη βιοχημική επεξεργασία της βιομάζας. Η βελτιστοποίηση της ζύμωσης των σακχάρων του υδρολύματος της ενζυμικής υδρόλυσης με τη χρήση του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae θα πραγματοποιηθεί μέσω πειραματικού σχεδιασμού μελέτης πέντε διαφορετικών παραμέτρων που θα καθορίσουν τις συνθήκες της διεργασίας στο Κεφάλαιο 5. Η απόδοση του σταδίου της ζύμωσης των φυσικών σακχάρων της γλυκόζης προς αιθανόλη στοχεύει την τιμή 80%. Επιπρόσθετα, θα ακολουθήσει μελέτη για την εφαρμογή κατάλληλης πολιτικής ζύμωσης με στόχο τη μεγιστοποίηση της παραγωγικότητας της βιοαιθανόλης. Η αύξηση της συγκέντρωσης της βιοαιθανόλης του τελικού διαλύματος λειτουργεί ευνοϊκά για την οικονομικότερη ανάκτηση της καθαρής αιθανόλης από το ρεύμα εξόδου της ζύμωσης. Σύμφωνα με βιβλιογραφική προκαταρκτική έρευνα, ως τελικό προϊόν της ολοκληρωμένης βιοχημικής κατεργασίας της βιομάζας που θα προσφέρει υψηλή προστιθέμενη αξία στο συνολικό εγχείρημα, επιλέχθηκε το ηλεκτρικό οξύ. Ο επόμενος στόχος είναι η ανάπτυξη κατάλληλης πολιτικής ζύμωσης με τη χρήση του βακτηρίου Actinobacillus succinogenes για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Η περιγραφή και μελέτη του σταδίου περιλαμβάνεται στο Κεφάλαιο 6. Η ζύμωση των σακχάρων της γλυκόζης που περιλαμβάνονται στο υδρόλυμα της ενζυμικής υδρόλυσης καθώς και των σακχάρων της ξυλόζης που περιλαμβάνονται στο υγρό τμήμα της προεπεξεργασίας, θα μελετηθεί μέσω πειραματικού σχεδιασμού μελέτης -50-

71 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας τεσσάρων παραγόντων. Οι αποδόσεις της παραγωγής ηλεκτρικού οξέος από ζυμώσιμα φυσικά σάκχαρα που σημειώνονται στη βιβλιογραφία είναι χαμηλότερες από τις αποδόσεις της αιθανόλης και ίσες με την τιμή 70%. Από τη διεργασία θα προκύψουν δύο τελικά προϊόντα, ένα βιοκαύσιμο υψηλής δυναμικότητας και ένα βιοχημικό υλικό υψηλής προστιθέμενης αξίας που προσομοιάζουν τη λογική ενός ολοκληρωμένου βιοδιυλιστηρίου όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα Τα δεδομένα του διαγράμματος ροής και των θεωρητικώς αναμενόμενων αποδόσεων του κάθε σταδίου λαμβάνονται ως βάση για το σχεδιασμό της διεργασίας και προέρχονται από βιβλιογραφικές αναφορές (Chander et al., 2010, Saha & Cotta, 2007, Shi et al., 2009, Srilekha et al., 2011, Gupta et al., 2009). Τέλος, η τεχνοοικονομική ανάλυση της εφαρμογής των σταδίων της ολοκληρωμένης διεργασίας παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος, όπως παρουσιάζεται στο διάγραμμα ροής, σε βιομηχανική κλίμακα αποτελεί στόχο για την πλήρη μελέτη της προτεινόμενης τεχνολογίας και περιγράφεται στο Κεφάλαιο 7. Η εφαρμογή της συνολικής ιδέας του βιοδιυλιστηρίου έχει ως στόχο να μειώσει το τελικό κόστος δημιουργώντας τους κατάλληλους οικονομικούς δείκτες για τη βιωσιμότητα του εγχειρήματος. -51-

72 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα Διάγραμμα Ροής για τη συνολική διεργασία παραγωγής αιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα Phalaris aquatica. -52-

73 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Βιβλιογραφία 1 ου Κεφαλαίου Αcal, A.R., Jaeger, W.A., Bocin, D.A.,Sigfusson, B.,Zubi, G., Magagna, D., Perez, F.M., Moss, R., Lazarou, S., Baxter, D., et al, Technology Map of the European Strategic Energy Technology Plan (SET Plan) Technology Descriptions. EUR - Scientific and Technical Research Reports. Allen, T.T., Intorduction to Engineering Statistics and Six Sigma: Statistical Quality Control and Design of Experiments and Systems. Springer. Alvira, P., Pejo, E.T., Ballesteros, M., Negro, M.J., Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology, 101, pp Anderson, D.H Taxonomy and distribution of the genus Phalaris. Iowa State Journal of Science, 36(1), pp.96. Balat, M., Production of bioethanol from lignocellulosic materials via the biochemical pathway: A review. Energy Conversion and Management, 52(2), pp Box, G.E.P. & Behnken, D.W., Some New Three Level Designs for the Study of Quantitative Variables. Technometrics, 2(4), pp Brummer, E.C., Burras, C.L., Duffy, M.D., Moore, K.J., Switchgrass production in Iowa: economic analysis, soil suitability, and varietal performance. Ames, IA, USA: Iowa State Press. Carere, C.R., Sparling, R., Cicek, N., Levin, D.B., Third Generation Biofuels via Direct Cellulose Fermentation. International Journal of Molecular Science, 9(7), pp Carole, T.M., Pellegrino, J., Paster, M.D., Opportunities in the industrial biobased products industry. Applied Biochemistry and Biotechnology - Part A Enzyme Engineering and Biotechnology, 115(1-3), pp European Commission, EU Energy in Figures, Statistical Pocketbook 2014, European Union, pp

74 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας FitzPatrick, M., Champagne, P., Cunningham, M., Whitney, R., A biorefinery processing perspective: treatment of lignocellulosic materials for the production of value-added products. Bioresource technology, 101(23), pp Gupta, R., Sharma, R.K., Kuhad, R.C., Separate hydrolysis and fermentation (SHF) of Prosopis juliflora, a woody substrate, for the production of cellulosic ethanol by Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis-ncim Bioresource Technology, 100(3), pp Hamelinck, C.N., Hooijdonk, G., Faaij, A.P., Ethanol from lignocellulosic biomass: technoeconomic performance in short-, middle- and long-term. Biomass and Bioenergy, 28, pp Huang, R., Su, R., Qi, W., He, Z., Bioconversion of Lignocellulose into Bioethanol: Process Intensification and Mechanism Research. Bioenergy Resources, 4, pp Karna, S.K., Singh, R.V., Sahai, R., Application of Taguchi Method in Indian Industry. International Journal of Emerging Technology and Advanced Engineering, 2(11), pp Kay, L., Burgess, L, Seeding, H., Foothill, S., Field, R., Hardinggrass and Annual Legume Production, Sierra Foothills. Koutinas, A.A., Wang, R.H., Webb, C., 2007, The Biochemurgist Bioconversion of agricultural raw materials for chemical production. Biofuels & Bioproducts Biorefining, 1, pp Kuhad, R.C., Gupta, R., Singh, A, Microbial Cellulases and Their Industrial Applications. Enzyme Research, 2011, , pp.10. Menon, V. & Rao, M., Trends in bioconversion of lignocellulose: Biofuels, platform chemicals & biorefinery concept. Progress in Energy and Combustion Science, 38(4), pp Mosier, N., Wyman, C., Dale, B., Elander, R., Lee, Y.Y., Holtzapple, M., Ladisch, M., Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource technology, 96(6), pp O Brien, D.J. & Craig, J.C. Jr, Ethanol production in a continuous fermentation/ membrane pervaporation system. Applied Microbial Biotechnology, 44, pp

75 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Oram, R.N., Ferreira, V., Culvenor, R.A., Hopkins, A.A. Stewart, A., The first century of Phalaris aquatica L. cultivation and genetic improvement. Crop Pasture Science, 60, pp Perlack, R.D., Wright, L.L., Turhollow, A.F., Graham, R.L., Stokes, B.J., Erbach, D.C., Opportunities in the industrial biobased products industry: The Technical Feasibility of a Billion-Ton Annual Supply. U.S. Department of Energy, Office of Scientific and Technical Information. Rosgaard, L., Andric, P., Dam-Johansen, K., Pedersen, S., Meyer, A.S., Effects of substrate loading on enzymatic hydrolysis and viscosity of pretreated barley straw. Applied Biochemistry and Biotechnology, 143(1), pp Saha, B.C., Cotta, M.A., Enzymatic hydrolysis and fermentation of lime pretreated wheat straw to ethanol. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 82(10), pp Sarkar, N., Ghosh, S.K., Bannerjee, S., Aikat, K., Bioethanol production from agricultural wastes: An overview. Renewable Energy, 37(1), pp Singh, A., Nigam, P.S., Murphy, J.D., Renewable fuels from algae: An answer to debatable land based fuels. Bioresource Technology, 102, pp Shi, J., Sharma-Shivappa, R.R., Chinn, M., Howell, N., Effect of microbial pretreatment on enzymatic hydrolysis and fermentation of cotton stalks for ethanol production. Biomass and bioenergy, 33(1), pp Srilekha, Y.K., Naseeruddin, S., Sai, P.G., Sateesh, L., Venkateswar, R.L., Bioethanol fermentation of concentrated rice straw hydrolysate using co-culture of Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis. Bioresource Technology, 102(11), pp Šturc, M., Renewable energy. Analysis of the latest data on energy from renewable sources. Environment and energy, Εurostat, Statistics in focus, 44. Taguchi, G., Subir, C., Wu, Y., Taguchi s Quality Engineering Handbook. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, Published simultaneously in Canada. Wooley, R., Ruth, M., Glassner, D., Sheehan, J., Process Design and Costing of Bioethanol Technology: A Tool for Determining the Status and Direction of Research and Development. Biotechnology Progress, 15, pp

76 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Wrobel, C., Coulman, B.E., Smith, D.L., The potential use of reed canary grass (Phalaris arundinacea L.) as a biofuel crop. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Plant Soil Science, 59(1), pp Xu, Q., Singh, A., Himmel, M.E., Perspectives and new directions for the production of bioethanol using consolidated bioprocessing of lignocellulose. Current opinion in biotechnology, 20(3), pp Zhang, Y.-H.P. & Lynd, L.R., Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose: noncomplexed cellulase systems. Biotechnology and bioengineering, 88(7), pp Παππάς, Ι.Α., Αξιολόγηση παραγωγικού δυναμικού λιβαδικών φυτών και αξιοποίησή τους για παραγωγή βιοενέργειας. Διδακτορική Διατριβή. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ). Σχολή Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος. doi /eadd/

77 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι 2.1 Υλικά και Μέθοδοι για την Προεπεξεργασία Λιγνοκυτταρινική Βιομάζα Η λιγνοκυτταρινική βιομάζα Phalaris aquatica προέρχεται από ξερική φυτεία εγκατεστημένη κατά το έτος 2007 (στην περιοχή του Πτελεού Μαγνησίας, γεωγραφικό πλάτος: 39 3' 0" Β, γεωγραφικό μήκος: 22 57' 0" Α). Η βιομάζα έχει συλλεγεί από τον αγρό κατά την περίοδο της ωρίμανσης στον πέμπτο χρόνο της φυτείας και ακολούθησε συγκέντρωση και ξήρανση της με φυσικό τρόπο. Στην ξηρή βιομάζα εφαρμόζεται μηχανική κατεργασία και τεμαχισμός των σωματιδίων με εργαστηριακό περιστροφικό μύλο (Cutting Mill SM 100, Retsch, Germany) και το μέγεθος των σωματιδίων μειώνεται σε 1 mm. Στη συνέχεια, η βιομάζα αποθηκεύεται σε χώρο απαλλαγμένο από υγρασία, σε θερμοκρασία δωματίου. Χρησιμοποιούνται επίσης ανακινούμενα κόσκινα της γερμανικής εταιρίας Retsch (Retsch AS200, Germany) τα οποία κατανέμουν τα σωματίδια σε διαφορετικές ομάδες μεγέθους σωματιδίων. Οι διαφορετικές τάξεις μεγέθους είναι οι , , και μm οι οποίες χρησιμοποιούνται για τα πειράματα μελέτης της επίδρασης του μεγέθους των σωματιδίων. -57-

78 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Περιγραφή Πειραματικής διάταξης Η πειραματική μελέτη της αραιής όξινης προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας πραγματοποιείται σε γυάλινα μπουκάλια, με αντοχή σε υψηλές θερμοκρασίες (pyrex), βιδωτό καπάκι και όγκο 100 ml, όπου ο συνολικός όγκος της αντίδρασης είναι 40 ml. Η περιεκτικότητα σε ακατέργαστη βιομάζα διατηρείται σταθερή κατά τις διάφορες πειραματικές δοκιμές με τιμή ίση με 10% w/v (Παππάς, 2011). Η επίδραση της θερμοκρασίας μελετάται σύμφωνα με πειραματικό σχεδιασμό. Η θερμοκρασία παραμένει αμετάβλητη, στην επιθυμητή τιμή κάθε φορά, καθώς η αντίδραση πραγματοποιείται σε λουτρό λαδιού, με συνεχή παρακολούθηση από θερμόμετρο υδραργύρου και ηλεκτρόδιο συνδεδεμένο στη θερμαντική πλάκα. Η ρύθμιση της θερμοκρασίας γίνεται αυτόματα από τη θερμαντική πλάκα σε περίπτωση μεταβολής από εξωτερικές συνθήκες καθώς πρόκειται για ανοιχτό σύστημα. Η διάρκεια της αντίδρασης αποτελεί επίσης παράγοντα πειραματικής μελέτης. Η έναρξη της αντίδρασης ορίζεται τη στιγμή που η θερμοκρασία έχει σημειώσει την επιθυμητή τιμή και ολοκληρώνεται με την ψύξη του γυάλινου μπουκαλιού. Στη συνέχεια, η υγρή φάση, όπου βρίσκονται διαλυτοποιημένα τα μονομερή σάκχαρα των ημικυτταρινών (κυρίως ξυλόζη), διαχωρίζεται από τη στερεή φάση που περιλαμβάνει την αδιάλυτη κυτταρίνη. Οι δύο φάσεις διαχωρίζονται με τη μέθοδο του φιλτραρίσματος υπό κενό και φυλάσσονται για περαιτέρω επεξεργασία. Το ph της υγρής φάσης εξαρτάται από την περιεκτικότητα του θειικού οξέος της αντίδρασης, που διαφοροποιείται ανάλογα με τις τιμές που ορίζονται σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό, για τη βελτιστοποίηση του σταδίου. Η στερεή βιομάζα οδηγείται σε πλύσεις με απεσταγμένο νερό ουδέτερου ph, που επαναλαμβάνονται τρεις φορές, ώστε να θεωρηθεί ότι απομάκρυναν τις όξινες χημικές ενώσεις από τη βιομάζα. Επίσης, λαμβάνεται ποσότητα των διαλυμένων ημικυτταρινών για τις αναλυτικές μεθόδους μέτρησης των μονομερών σακχάρων. Η ποσότητα αυτή επεξεργάζεται με μικρή ποσότητα βάσης (ΝaΟΗ) ώστε το ph του διαλύματος να σημειώσει τιμή και στη συνέχεια χρησιμοποιείται H2SO4 72% w/v ώστε το ph να επανέλθει στο (Παππάς, 2011). Ακολουθεί, φυγοκέντρηση του διαλύματος στις 5.800xg στροφές με τη συσκευή φυγοκέντρησης Heraus Biofuge primor της αμερικάνικης εταιρίας ThermoElectron Corp., Thermo Fisher Scientific Inc., για 10 min και φιλτράρισμα με φίλτρα 0,2 μm (Whatman Inc. (U.S.A.)) πριν τη μεταφορά των δειγμάτων στον υγρό χρωματογράφο. -58-

79 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi Ο Πειραματικός Σχεδιασμός (Design of Experiment (DOE)) βασίστηκε στη στατιστική θεωρία του Taguchi (Taguchi, 1986). Μέσω του σχεδιασμού του πειράματος μελετήθηκε η επίδραση τριών παραγόντων ελέγχου σε έναν παράγοντα απόκρισης. Ο πειραματικός σχεδιασμός προσφέρει σημαντικά εργαλεία τόσο για την πρόβλεψη των αποτελεσμάτων, καθώς εξάγει εμπειρικό μαθηματικό μοντέλο όσο και για τη βελτιστοποίηση του σταδίου καθώς εξάγει το συνδυασμό εκείνο των ελεγχόμενων παραμέτρων που μεγιστοποιούν τον παράγοντα απόκρισης, λαμβάνοντας υπόψη τις αποκλίσεις που υπεισέρχεται από τις μη ελεγχόμενες παραμέτρους. Ακολούθως, η Ανάλυση Διακύμανσης (ANOVA) των πειραματικών αποτελεσμάτων εξάγει συμπεράσματα για τη σημαντικότητα της επίδρασης της κάθε παραμέτρου στον παράγοντα απόκρισης, βασισμένα στο άθροισμα των τετραγώνων (SS) που υποδηλώνει τη συνεισφορά της κάθε παραμέτρου στο γραμμικό μοντέλο και στον παράγοντα p (p-factor). Επίσης, εξάγονται συμπεράσματα μέσω διαγραμμάτων κανονικότητας, ιστογραμμάτων και διαγραμμάτων υπολειμμάτων για την κανονικότητα της διασποράς των υπολοίπων, δηλαδή της διαφοράς των μετρούμενων από τα υπολογισθέντα δεδομένα (Παράρτημα Α). Η κανονικότητα των αποτελεσμάτων υποδεικνύει την στατιστική ασφάλεια των συμπερασμάτων που εξάγονται από το γραμμικό εμπειρικό μοντέλο. Στον πειραματικό σχεδιασμό της προεπεξεργασίας, ως παράγοντας απόκρισης επιλέχθηκε η συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης, που προέρχεται από τη διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών, το ποσοστό μετατροπής των ημικυτταρινών καθώς και ο βαθμός κρυσταλλικότητας του στερεού υπολείμματος της προεπεξεργασίας που οδηγείται προς σακχαροποίηση, το οποίο περιλαμβάνει την κυτταρίνη της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας που παρέμεινε αδιάλυτη. Ο πειραματικός σχεδιασμός Taguchi μελετά την επίδραση τριών παραγόντων: της θερμοκρασίας, της περιεκτικότητας του οξέος και του χρόνου της αντίδρασης, σε τρία διαφορετικά επίπεδα τιμών, στον παράγοντα απόκρισης που μελετάται κάθε φορά (Πίνακας 2.1). Το αποτέλεσμα του ορθογώνιου σχεδιασμού (orthogonal array) είναι μια σειρά 9 πειραμάτων (L9) που το καθένα πραγματοποιείται σε 2 επαναλήψεις. Η στατιστική ανάλυση εξάγει πληροφορίες για το λόγο «Σήματος προς Θόρυβο» ( Signal to Noise, S/N) που αποτελεί ένα από τα κριτήρια βελτιστοποίησης του σχεδιασμού Taguchi. Συγκεκριμένα, τέθηκε ως στόχος η μεγιστοποίηση του κριτηρίου S/N. Ο λόγος S/N περιλαμβάνει την -59-

80 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι επίδραση στον παράγοντα απόκρισης των ελεγχόμενων τριών μεταβλητών καθώς και των μη ελεγχόμενων μεταβλητών θορύβου, ώστε η μέγιστη τιμή του λόγου να ελαχιστοποιεί τη μεταβλητότητα που προέρχεται από τις μεταβλητές θορύβου. Η εξίσωση υπολογισμού του λόγου «Σήματος προς Θόρυβο» περιγράφεται στο Παράρτημα Α. Κατά το σχεδιασμό του πειράματος και τις στατιστικές αναλύσεις χρησιμοποιείται το λογισμικό Minitab 17, το οποίο δίνει τη δυνατότητα εξαγωγής εμπειρικών μοντέλων πρόβλεψης της διεργασίας. Το γραμμικό εμπειρικό μοντέλο που εξάγεται στα πλαίσια των τιμών του παρόντα πειραματικού σχεδιασμού συγκρίνεται με τα πειραματικά αποτελέσματα. Πίνακας 2.1. Πειραματικός σχεδιασμός Taguchi (L9) για το στάδιο της προεπεξεργασίας. Παράγοντες Επίπεδο 1 Επίπεδο 2 Επίπεδο 3 Θερμοκρασία ( o C) Περιεκτικότητα Θειικού Οξέος (% w/v) Χρόνος Αντίδρασης (min) Συνδυαστικός συντελεστής έντασης (CSF) Τα αποτελέσματα του σταδίου της προεπεξεργασίας μελετώνται σε σχέση με την ένταση των συνθηκών του σταδίου μέσω του συνδυαστικού συντελεστή έντασης της προεπεξεργασίας (CSF), ο οποίος συνδυάζει τους τρεις παράγοντες, θερμοκρασία, περιεκτικότητα οξέος και χρόνο, σε μία μεταβλητή μέσω της εξίσωσης (Lloyd & Wyman, 2005, Agbor et al., 2011): CSF = log10ro ph, Ro = log[t exp((tr Tb)/ω)] (2.1) -60-

81 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι, όπου t είναι ο χρόνος της αντίδρασης (min), Tb είναι η θερμοκρασία της αντίδρασης ( o C), TR η θερμοκρασία αναφοράς (TR = 100 o C) και ph είναι η οξύτητα του υδατικού διαλύματος που συνδέεται με την περιεκτικότητα του οξέος στην αντίδραση (Karapatsia et al., 2014) Αναλυτικές Μέθοδοι Χαρακτηρισμός της βιομάζας H αναλυτική μέθοδος που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της σύστασης των κυτταρικών τοιχωμάτων στα δείγματα της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας (φαλαρίδας) είναι η μέθοδος Van Soest για Ινώδεις Ουσίες (Van Soest et al., 1991). Η μέθοδος χρησιμοποιεί ουδέτερο απορρυπαντικό διάλυμα στο οποίο μένουν αδιάλυτες οι δομικές ενώσεις των φυτικών τοιχωμάτων (κυτταρίνη, ημικυτταρίνες και λιγνίνη) και ονομάζονται Ινώδεις Ουσίες Ουδέτερου Διαλύματος Απορρυπαντικών (Neutral Detergent Fiber - NDF). Ακολούθως, εφαρμόζεται η μέθοδος Όξινου Απορρυπαντικού Διαλύματος από όπου προκύπτει κλάσμα αδιάλυτων Ινωδών Ουσιών Όξινου Απορρυπαντικού Διαλύματος (Acid Detergent Fiber - ΑDF) που περιλαμβάνει την κυτταρίνη καθώς και τη λιγνίνη. Το κλάσμα αυτό στη συνέχεια επεξεργάζεται με θειικό οξύ H2SO4 από όπου προκύπτει αδιάλυτο μέρος που περιλαμβάνει τη λιγνίνη (Acid Detergent Lignin - ADL). Στη συνέχεια, ο υπολογισμός της κυτταρίνης πραγματοποιείται με αφαίρεση των τιμών της λιγνίνης από το σύνολο των Ινωδών Ουσιών Όξινου Απορρυπαντικού Διαλύματος (Κυτταρίνη = % ΑDF % ADL) και ο υπολογισμός των ημικυτταρινών πραγματοποιείται με αφαίρεση των τιμών των Ινωδών Ουσιών Όξινου Διαλύματος Απορρυπαντικών από το σύνολο Ινωδών Ουσιών Ουδέτερου Διαλύματος Απορρυπαντικών (Ημικυτταρίνες = % NDF % ADF) (Harris, 1970) Μέτρηση Σακχάρων Ο ποσοτικός προσδιορισμός των περιεχόμενων σακχάρων στο υδρόλυμα που προέρχεται από τη διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών πραγματοποιείται με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC). Τα μονομερή σάκχαρα που επιλέχθηκαν για ταυτοποίηση είναι η ξυλόζη, η αραβινόζη, η γλυκόζη, η μαννόζη, η γαλακτόζη και η φρουκτόζη σε μίγματα διαφορετικών συγκεντρώσεων. Κάθε ένωση παρουσιάζει διαφορετικό χρόνο έκλουσης στο -61-

82 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι φάσμα που προκύπτει από το HPLC (Σχήμα 2.1). Αρχικά, δημιουργούνται πρότυπες καμπύλες αναφοράς για το μίγμα των μονομερών σακχάρων που συσχετίζουν το εμβαδό της κορυφής που προκύπτει από τον υγρό χρωματογράφο με τη γνωστή συγκέντρωση των σακχάρων (Σχήμα 2.1). Οι συγκεντρώσεις του μίγματος των σακχάρων είναι: 0,1, 4, 10, 20, 25, 50 και 100 mg/ml. Συγκεκριμένα, ο υγρός χρωματογράφος που χρησιμοποιείται είναι το μοντέλο Agilent 1200 Series της γερμανικής εταιρίας Agilent Technologies, Inc., με Ανιχνευτή Δείκτη Διάθλασης (Refractive Index Detector, RID). Η στήλη ανάλυσης υδατανθράκων που χρησιμοποιήθηκε είναι η Zorbax Analysis column ( mm) με θερμοκρασία λειτουργίας τους 35 o C, με κινητή φάση το μίγμα ακετονιτρίλιο - νερό (75% -25%) και ροή 0,8 ml/min. Ο χρόνος έκλουσης των δειγμάτων είναι 15 min. Όλοι οι αναλυτικοί προσδιορισμοί πραγματοποιούνται δύο φορές και υπολογίζεται ως τελική τιμή η μέση τιμή των επαναλήψεων. Αποδεκτές είναι οι αποκλίσεις με ποσοστό μικρότερο από το 5%. Η μετατροπή των ημικυτταρινών (%) υπολογίζεται ως ο λόγος του αθροίσματος των μονομερών διαλυμένων σακχάρων (σε g) στο υγρό τμήμα του σταδίου της προεπεξεργασίας προς το αρχικό περιεχόμενο των ημικυτταρινών (σε g) στη λιγνοκυτταρινική βιομάζα, που υπολογίστηκε ίσο με 267,31 g/l: % Μετατροπή Ημικυτταρινών= 100 [(Συνολικά Σάκχαρα)/ (Περιεχόμενο Ημικυτταρινών)] (2.2) -62-

83 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Σχήμα 2.1. Χρωματογράφημα (χρόνος έκλουσης ένταση σήματος) του αναλυτή δείκτη διάθλασης κατά την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης για μίγμα πρότυπων σακχάρων με συγκέντρωση 20 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της προεπεξεργασίας Δομικά Χαρακτηριστικά της Βιομάζας Η λιγνοκυτταρινική βιομάζα μελετάται ως προς τις αλλαγές που συμβαίνουν στα δομικά της χαρακτηριστικά μέσω Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης (SEM) και Φασματοσκοπία Περίθλασης Ακτίνων Χ. Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο χρησιμοποιείται για την εξέταση της μικροδομής της ακατέργαστης και της προεπεξερεγασμένης βιομάζας, δίνοντας εικόνες υψηλού βαθμού διείσδυσης. Το όργανο που χρησιμοποιήθηκε είναι το μοντέλο JEOL JSM 6300 της εταιρίας SEMTech Solutions, με ανάλυση 1,5 nm (SEI) και 3 nm (BEI) στα 30 kv. Η σάρωση πραγματοποιείται πάνω σε δείγματα που έχουν επικαλυφθεί με αγώγιμο στρώμα χρυσού υπό κενό, όσο δυνατόν πιο λεπτό, για να αποφευχθεί η κάλυψη των λεπτομερειών (Singh et al., 2009). Οι φωτογραφίες που εξάγονται παρουσιάζονται με μεγέθυνση από 50 εώς φορές. Ο βαθμός κρυσταλλικότητας της ακατέργαστης και της επεξεργασμένης βιομάζας προσδιορίζεται μέσω του περιθλασιόμετρου PANalytical X-pert pro (The Netherlands) (Sindhu et al., 2011). Τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό του βαθμού κρυσταλλικότητας, του δείκτη κρυσταλλικότητας και του μεγέθους των -63-

84 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι κρυστάλλων βασίζονται στους Kumar et al. (2009) και Zhu et al. (2008). Το πεδίο της σάρωσης είναι μεταξύ των γωνιών 2θ=10 o - 30 o, με μέγεθος βήματος ίσο με 0,02 o. Ο χρόνος προσδιορισμού είναι ίσος με 1 s/ 0.02 o. Ο βαθμός κρυσταλλικότητας (Crystallinity Index, CI) ορίζεται ως ποσοστό του λόγου του κρυσταλλικού υλικού, σύμφωνα με τον Segal et al. (1959): CI = 100 [(I002 - Iam)/I002] (2.3), όπου I002 είναι η ένταση του σήματος του κρυσταλλικού τμήματος της βιομάζας (κυτταρίνη) που προκύπτει από την ένταση της μέγιστης κορυφής του φάσματος XRD σε γωνία περίπου 2θ=22.5 ο και Iam είναι η ένταση του σήματος της άμορφης περιοχής της βιομάζας (κυτταρίνη, ημικυτταρίνες και λιγνίνη) που προκύπτει από την ένταση της δεύτερης υψηλότερης κορυφής του φάσματος XRD σε γωνία περίπου 2θ=18,7 o. Οι τιμές των εντάσεων του σήματος προκύπτουν από τα XRD διαγράμματα που περιλαμβάνονται στο Παράρτημα Β. 2.2 Υλικά και Μέθοδοι για την Ενζυμική Υδρόλυση Περιγραφή Πειραματικής διάταξης Η πειραματική διαδικασία πραγματοποιείται σε κωνικές φιάλες τύπου Erlenmeyer conical flasks με συνολικό όγκο 500 ml και όγκο αντίδρασης 100 ml. Η θερμοκρασία της αντίδρασης διατηρείται σταθερή στους 50 ο C σε περιστροφικό επωαστήρα μοντέλο GFL3031 της γερμανικής εταιρίας GFL mbh, συνολικού όγκου 46 l. Η ταχύτητα ανάδευσης είναι ίση με 150 rpm ώστε να διευκολύνεται η μεταφορά μάζας στο αιώρημα στερεής βιομάζας και ενζύμων. Η αντίδραση πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέος με ph = 4.8. Επίσης, οι ενζυμικοί καταλύτες προέρχονται από μίγμα ενζύμων, την κυτταρινάση Celluclast 1.5L και τη β-γλυκοσιδάση Novozyme 188 (EC No ) που έχουν εκχυλιστεί από τον μύκητα Τrichoderma reseei και Αspergillus niger αντίστοιχα, με σταθερή αναλογία μεταξύ του FPU (Filter Paper Unit) και του CBU (Cellobiase Unit). Οι μονάδες FPU είναι οι μονάδες μέτρησης της δραστικότητας της κυτταρινάσης, όπου 1 FPU αντιστοιχεί σε δραστικότητα κυτταρινάσης που παράγει 1 μmol προϊόντος (γλυκόζης) σε 1 λεπτό υδρολύοντας την κυτταρίνη (Filter Paper Unit). Ομοίως, η μονάδα CBU είναι η μονάδα μέτρησης της δραστικότητας της κελλοβιάσης (β-γλυκοσιδάση) και αντιστοιχεί σε δραστικότητα ενζύμου -64-

85 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι που παράγει 2 μmol γλυκόζης υδρολύοντας την κελλοβιόζη. Η αναλογία μεταξύ των δύο ενζύμων μελετάται για 4 διαφορετικούς λόγους FPU : CBU και συγκεκριμένα για τους λόγους 1:1, 1:1.25, 1:1.5, 1:1.75 και 1:2, για δεδομένη ποσότητα κυτταρινάσης που αντιστοιχεί σε 15 και 20 FPU (Karapatsia et al., 2013) Πειραματικός Σχεδιασμός Box-Behnken Ο πειραματικός σχεδιασμός Box-Behnken επιλέχθηκε ανάμεσα σε άλλους σχεδιασμούς ως μία μέθοδος επιφανειών απόκρισης που βελτιστοποιεί τη μελέτη στου σταδίου περαιτέρω, δίνοντας τη δυνατότητα εξαγωγής τρισδιάστατων διαγραμμάτων για την επίδραση των παραγόντων στην παραγωγή της γλυκόζης. Επιπρόσθετα, η συγκεκριμένη μεθοδολογία δίνει τη δυνατότητα συσχέτισης των παραγόντων με την απόκριση του πειράματος μέσω εμπειρικού μοντέλου. Η σχέση μίας απόκρισης Y από τις παραμέτρους X1, X2, X3, X4 (Y = f (X1, X2, X3, X4)), μπορεί να εκφραστεί από το εμπειρικό (γραμμικό) μοντέλο: Y = a1x1+a2 X2+a3X3+a4X4 ή από το μη γραμμικό εμπειρικό μοντέλο Y=b1X1+b2X2+b3X3+b4X4+ b5x1x2+ b6x1x3+b7x1x4+b7x2x3+b8x2x4+b9x3x4. Οι συντελεστές b1, b2, b3, b4, b5, b6, b7, b8, b9 θα πρέπει να προσδιοριστούν κατά τη διαδικασία προσαρμογής του μοντέλου στα πειραματικά δεδομένα (Box & Behnken, 1960). Η ενζυμική υδρόλυση βασίστηκε σε πειραματικό σχεδιασμό Box-Behnken τεσσάρων παραγόντων μελετημένων σε δύο επίπεδα με μία επιπλέον ενδιάμεση τιμή. Το πλήθος των πειραμάτων που προκύπτουν από τον πειραματικό σχεδιασμό είναι 27. Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε σε επανάληψη. Οι μεταβλητές που μελετώνται στο συγκεκριμένο στάδιο είναι η περιεκτικότητα της προεπεξεργασμένης βιομάζας, 2 και 4% (w/v), η ποσότητα των ενζύμων, 10 και 20 FPU/g στερεής βιομάζας, ο χρόνος υδρόλυσης, 24 και 72 h καθώς και η ποσότητα επιφανειοδραστικού PEG 4000, 0.02 και 0.06 g/g στερεής βιομάζας. Επιπλέον, χρησιμοποιείται ένας ενδιάμεσος συνδυασμός με περιεκτικότητα βιομάζας 3% (w/v), ποσότητα ενζύμων 15 FPU/g στερεής βιομάζας, χρόνο υδρόλυσης 48 h και ποσότητα επιφανειοδραστικού 0,04 g/g στερεής βιομάζας. Ο πειραματικός σχεδιασμός του σταδίου απεικονίζεται συγκεντρωτικά στον Πίνακα 2.2. Η απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού ορίστηκε η συγκέντρωση της γλυκόζης που παράγεται κατά την υδρόλυση. -65-

86 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 2.2. Πειραματικός σχεδιασμός Box-Behnken τεσσάρων παραγόντων για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. Ανεξάρτητες Εύρος και επίπεδα τιμών Σύμβολο μεταβλητές Περιεκτικότητα βιομάζας (%w/v) X Ποσότητα ενζύμων (FPU/g biomass) X Επιφανειοδραστικό (g/g βιομάζας) Χ3 0,02 0,04 0,06 Χρόνος υδρόλυσης (h) X Αναλυτικές Μέθοδοι Ο ποσοτικός προσδιορισμός των περιεχόμενων σακχάρων στο υδρόλυμα της ενζυμικής υδρόλυσης πραγματοποιείται επίσης με τον Υγρό Χρωματογράφο Υψηλής Απόδοσης (HPLC, Agilent 1200 Series). Ο υγρός χρωματογράφος διαθέτει Ανιχνευτή Δείκτη Διάθλασης (Refractive Index Detector, RID) με στήλη ανάλυσης υδατανθράκων Zorbax Analysis column ( mm) με θερμοκρασία λειτουργίας τους 35 o C, με κινητή φάση το μίγμα ακετονιτρίλιο - νερό (75% -25%) και ροή 0,8 ml/min. Κατασκευάζονται καμπύλες βαθμονόμησης για τη γλυκόζη και την κελλοβιόζη, το δισακχαρίτη της γλυκόζης με βάση τα διαγράμματα των πρότυπων μιγμάτων (Σχήμα 2.2). Οι καμπύλες βαθμονόμησης συσχετίζουν το εμβαδό της κορυφής που προκύπτει από τον υγρό χρωματογράφο με γνωστές συγκεντρώσεις των σακχάρων. Οι συγκεντρώσεις του μίγματος των σακχάρων ήταν: 0,1, 4, 10, 20, 25, 50 και 100 mg/ml. Όλοι οι αναλυτικοί προσδιορισμοί πραγματοποιούνται δύο φορές και υπολογίζεται ως τελική τιμή η μέση τιμή των επαναλήψεων. Αποδεκτές είναι οι αποκλίσεις με ποσοστό μικρότερο από το 5%. Η απόδοση της γλυκόζης υπολογίζεται σύμφωνα με την παρακάτω εξίσωση (Singh & Bishnoi, 2012): Απόδοση Γλυκόζης (%) = Συγκέντρωση Γλυκόζης (g) x 100 / κυτταρινικό περιεχόμενο του υποστρώματος (g) x 0.9. (2.4) -66-

87 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι, όπου το κυτταρινικό περιεχόμενο της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας έχει υπολογιστεί (σε g), ίσο με 431 g/kg ΞΜ. Επίσης, να σημειωθεί ότι ο συντελεστής 0,9 αποτελεί διορθωτικό συντελεστή του περιεχομένου της κυτταρίνης σε γλυκόζη λόγω των απωλειών που μπορεί να υπάρξουν από μόρια νερού στην πολυσακχαριτική αλυσίδα της κυτταρίνης. Σχήμα 2.2. Χρωματογράφημα (χρόνος έκλουσης ένταση σήματος) του αναλυτή δείκτη διάθλασης κατά την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης για μίγμα πρότυπων σακχάρων με συγκέντρωση 20 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης Υλικά και Μέθοδοι για την Καλλιέργεια των Μικροοργανισμών Καλλιέργεια Σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae Στέλεχος Μικροοργανισμού Το στέλεχος του σακχαρομύκητα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διεργασία είναι το άγριο στέλεχος Saccharomyces cerevisiae Τύπος ΙΙ αγορασμένο από την εταιρία Sigma Aldrich καθώς και το στέλεχος DSM από τη γερμανική συλλογή μικροοργανισμών και κυττάρων DSMΖ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). Η θερμοκρασία ανάπτυξης του -67-

88 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι μικροοργανισμού είναι ο C (Lin et al., 2012) και τα όρια του ph είναι (Bracey et al., 1998) Διατήρηση Μικροοργανισμού Η διατήρηση του μικροοργανισμού πραγματοποιείται σε τρυβλία με σταθεροποιημένο θρεπτικό μέσο που ονομάζεται YPD. Συγκεκριμένα, αποτελείται από εκχύλισμα μαγιάς (Yeast extract), πεπτόνη (Peptone), γλυκόζη (D-glucose) και αγαρόζη (στερεό μέσο διατήρησης). Η ακριβής σύσταση του μέσου περιλαμβάνεται στον Πίνακα 2.3. Η διατήρηση του μικροοργανισμού στα τρυβλία προϋποθέτει ασηπτικές συνθήκες που επιτυγχάνονται με την αποστείρωση του μέσου στους 121 ο C για 20 min στον κλίβανο αποστείρωσης (Steam Sterilizer Raypa AES-75). Στη συνέχεια, το YPD μέσο τοποθετείται στο θάλαμο νηματικής ροής μέχρι να ελαττωθεί η θερμοκρασία (περίπου στους 50 ο C) και ακολουθεί ρύθμιση του ph σε τιμή 6. Το ΥPD θρεπτικό μέσο μεταφέρεται σε τρυβλίο προτού στερεοποιηθεί όπoυ δημιουργείται το κατάλληλο υπόστρωμα διατήρησης του μικροοργανισμού. Η διαδικασία παρασκευής υγρού θρεπτικού μέσου διατήρησης διαφέρει κατά ένα συστατικό καθώς δε προστίθεται αγαρόζη για σταθεροποίηση. Το μέσο διατηρείται σε κωνική φιάλη. Όσον αφορά το λόγο του ωφέλιμου όγκου της ζύμωσης προς τον όγκο της φιάλης, πρέπει να είναι τουλάχιστον 1:2,5. Επομένως στην κατάλληλη κωνική φιάλη με το υγρό μέσο διατήρησης, προστίθεται μικρή ποσότητα από τον μικροοργανισμό σε λυοφιλοποιημένη μορφή απευθείας από το εμπορικά διαθέσιμο απόθεμα. Στη συνέχεια, ο εμβολιασμός του σακχαρομύκητα στα τρυβλία πραγματοποιείται κατά τον δεκαπλασιασμό της οπτικής πυκνότητας του πληθυσμού στο υγρό θρεπτικό μέσο. Τα τρυβλία επωάζονται στους 30 ο C για 48 h, μέχρι την εμφανή δημιουργία μεμονωμένων αποικιών (Σχήμα 2.3). Τα τρυβλία, μετά την ανάπτυξη των κυττάρων του μικροοργανισμού, διατηρούνται στο ψυγείο (σε θερμοκρασία 4 o C) για διάρκεια ενός μήνα. Η διατήρηση του μικροοργανισμού παρέχει τη δυνατότητα, μέσω της διαδικασίας αναγέννησης του μικροοργανισμού, την εξασφάλιση της διατήρησης της βιωσιμότητας των αποικιών του μικροβιακού στελέχους και την απομάκρυνση πιθανοτήτων επιμόλυνσης. Η διαδικασία αναγέννησης του μικροοργανισμού πραγματοποιείται κάθε ένα μήνα είτε από ήδη προϋπάρχοντα τρυβλία είτε από τον εμπορικό μικροοργανισμό σε λυοφιλοποιημένη μορφή. -68-

89 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Σχήμα 2.3. Τρυβλία διατήρησης μεμονωμένων αποικιών του Saccharomyces cerevisiae Πίνακας 2.3. Σύσταση του θρεπτικού μέσου διατήρησης του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) 1 Γλυκόζη 20 2 Εκχύλισμα μαγιάς 10 3 Πεπτόνη 20 4 Αγαρόζη Προκαλλιέργεια Μικροοργανισμού Η καλλιέργεια του σακχαρομύκητα περιλαμβάνει δύο βασικά στάδια την προκαλλιέργεια και το βασικό στάδιο της ζύμωσης. Αρχικά, προηγείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού σε πλουσιότερο θρεπτικά μέσο, το αποκαλούμενο μέσο προκαλλιέργειας, με σκοπό την ταχεία ανάπτυξη και διαίρεση των κυττάρων του. Τα συστατικά του θρεπτικού μέσου, όπως παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.4, ζυγίζονται και αποστειρώνονται. Ακολουθεί η βασική καλλιέργεια όπου πραγματοποιείται η αλκοολική ζύμωση με στόχο την παραγωγή αιθανόλης με υψηλές παραγωγικότητες. -69-

90 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Η επιθυμητή ποσότητα του θρεπτικού μέσου προκαλλιέργειας τοποθετείται σε κωνική φιάλη όγκου 250 ml και ακολουθεί κλείσιμο του στομίου με υδρόφοβο βαμβάκι. Το θρεπτικό μέσο περιλαμβάνει γλυκόζη, εκχύλισμα μαγιάς, πρόσθετη πηγή αζώτου ((NH4)2SO4) και πηγές καλίου, μαγνησίου, φωσφόρου και άλλων θρεπτικών συστατικών. Μεταγενέστερα της αποστείρωσης του μέσου και της ελάττωσης της θερμοκρασία στους 30 o C μέσα στο θάλαμο νηματικής ροής, ρυθμίζεται το ph σε τιμή 6 προτού προστεθεί το ενοφθάλμισμα από μεμονωμένη αποικία κυττάρων του τρυβλίου. Η κωνική φιάλη τοποθετείται στον επωαστήρα στους 30 o C με συχνότητα ανάδευσης 150 rpm. Οι διαθέσιμοι επωαστήρες του εργαστηρίου είναι δύο, τα μοντέλα GFL3031 και GFL3033 της γερμανικής εταιρίας GFL mbh, συνολικού όγκου 46 l και 150 l αντίστοιχα. Πίνακας 2.4. Σύσταση θρεπτικού μέσου προκαλλιέργειας του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) 1 Γλυκόζη 30 2 Εκχύλισμα μαγιάς 5 3 (NH4)2SO KH2PO4 4,5 5 MgSO4.7H2O 1 6 ZnSO4.7H2O 0, Ζύμωση Μικροοργανισμού Η κύρια καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae, όπου παρασκευάζονται τα επιθυμητά προϊόντα, ονομάζεται ζύμωση. Το μέσο καλλιέργειας είναι χημικά καθορισμένο με κύριο συστατικό τη γλυκόζη, σε περιεκτικότητα κατάλληλη ώστε τα κύτταρα του σακχαρομύκητα να ακολουθούν τη μεταβολική οδό της αλκοολικής ζύμωσης. Τα θρεπτικά συστατικά του μέσου καλλιέργειας της ζύμωσης απεικονίζονται στον Πίνακα 2.5 και τα συστατικά του διαλύματος των ιχνοστοιχείων των μετάλλων στον Πίνακα 2.6. Το νερό που χρησιμοποιείται για την προετοιμασία των μέσων ανάπτυξης και του διαλύματος ιχνοστοιχείων είναι -70-

91 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι απεσταγμένο σε σύστημα απόσταξης της γερμανικής εταιρίας GLF mbh (μοντέλο 2002). Περίπου 10 ml δείγματος οδηγούνται στη φυγόκεντρο ( g, 10 min, 4 o C) και στη συνέχεια τόσο η στερεά ποσότητα των κυττάρων, μετά την ξήρανση της, όσο και η υγρή ποσότητα του υπερκείμενου μεταφέρονται για αναλύσεις Πειραματικός Σχεδιασμός O καθορισμός της σύστασης του θρεπτικού μέσου πραγματοποιείται μέσω πειραματικού σχεδιασμού Taguchi με μικτά επίπεδα. Ο σχεδιασμός ορθογώνιας παράταξης Taguchi βελτιστοποιεί τους παράγοντες του πειράματος με βάση τη μέγιστη τιμή του παράγοντα απόκρισης και το λόγο «Σήματος (Signal) προς θόρυβο (Noise)», (S/N) (Παράρτημα Α). Η απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού του σταδίου της ζύμωσης ορίστηκε η απόδοση της αιθανόλης (%) που αποτελεί το κύριο μελετώμενο προϊόν. Ο πειραματικός σχεδιασμός μικτών παραγόντων (4 επίπεδα x 2 παράγοντες, 2 επίπεδα x 3 παράγοντες) που αποτελούν τις ελεγχόμενες μεταβλητές που επιδρούν στην απόδοση της αιθανόλης, απεικονίζεται στον Πίνακα 2.7. Τα πειράματα που θα πραγματοποιηθούν είναι 16 (L16) σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό. Αναφορικά με τον παράγοντα απόκρισης, η απόδοση σε αιθανόλη (%) ορίζεται ως τα γραμμάρια της αιθανόλης που παράγονται προς τα γραμμάρια της γλυκόζης που καταναλώθηκαν και στη συνέχεια ο λόγος αυτός διαιρείται με το 0,51, που είναι η τιμή της θεωρητικής απόδοσης της αιθανόλης, εκφρασμένος ως ποσοστό επί της εκατό (Shrilekha Yadav et al., 2011). Ο στόχος του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi είναι η επιλογή των βέλτιστων συνθήκων της ζύμωσης και συγκεκριμένα θα πραγματοποιηθεί η επιλογή του κατάλληλου στελέχους του μικροοργανισμού, του μεγέθους του ενοφθαλμίσματος, της τιμής του ph, του συντελεστή αερισμού και της συγκέντρωσης του αζώτου. Αναφορικά με το συντελεστή αερισμού (ko), η τιμή του εξάγεται από το συνδυασμό δύο διαφορετικών μεγεθών, την ταχύτητα ανάδευσης και το λόγο του όγκου του θρεπτικού μέσου προς τον όγκο της κωνικής φιάλης, όπου λαμβάνει χώρα η αντίδραση. H εξίσωση υπολογισμού του συντελεστή αερισμού είναι η παρακάτω: k 0 Vw / V f ( V / V ) w f max A A max (2.5) -71-

92 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι, όπου Vw είναι ό όγκος του θρεπτικού μέσου, Vf είναι ο όγκος της κωνικής φιάλης, Α είναι η ταχύτητα ανάδευσης σε rpm, και Αmax και (Vw /Vf)max είναι οι μέγιστες τιμές των δύο μεγεθών. Επιπρόσθετα, η βέλτιστη ποσότητα περιεχόμενου αζώτου υπολογίστηκε με βάση την περιεκτικότητα στοιχειακού αζώτου στα θρεπτικά συστατικά: εκχύλισμα μαγιάς (YE) και θειικό αμμώνιο ((NH4)2SO4). Είναι γνωστό ότι στο εκχύλισμα μαγιάς το 10% αποτελεί το στοιχειακό άζωτο. Πίνακας 2.5. Σύσταση του θρεπτικού μέσου ζύμωσης του σακχαρομύκητα S. cerevisiae. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) Γλυκόζη 20 2 KH2PO4 3 3 Νa2HPO4 1 4 MgSO4.7H2O 1 5 CaCl2.2H2O 0,1 6 Διάλυμα ιχνοστοιχείων 1-2 ml/l -72-

93 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 2.6. Σύσταση διαλύματος ιχνοστοιχείων του θρεπτικού μέσου της ζύμωσης του σακχαρομύκητα S. cerevisiae. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) 1 ZnSO4.7H2O 0,9 2 FeSO4.7H2O 0,6 3 H3BO3 2,0 4 MnCl2.4H2O 1,5 5 Na2MoO4.2H2O 0,8 6 CoCl2.6H2O 0,8 7 CuSO4.5H2O 0,5 Πίνακας 2.7. Πειραματικός σχεδιασμός Taguchi για την καλλιέργεια του σακχαρομύκητα S. cerevisiae Παράγοντες Επίπεδο 1 Επίπεδο 2 Επίπεδο 3 Επίπεδο 4 Πηγή Αζώτου 0,28 0,37 0,56 1,12 Συντελεστής αερισμού, ko 0,300 0,375 0,500 0,600 Στέλεχος Type II DSM Μέγεθος ενοφθαλμίσματος 0, ph

94 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Αποστείρωση του Θρεπτικού Μέσου Η αποστείρωση των μέσων καλλιέργειας λαμβάνει χώρα σε κλίβανο αποστείρωσης με ατμό (Steam Sterilizer Raypa AES-75) της ισπανικής εταιρίας R. Espinal S.L. ή εναλλακτικά η αποστείρωση πραγματοποιείται με φιλτράρισμα με χρήση φίλτρων Whatman (Whatman Inc. (U.S.A.) TF) 0,2 μm με άνοιγμα που δεν επιτρέπει τη διέλευση μικροοργανισμών μεγαλύτερου μοριακού βάρους. Για την αποστείρωση των μέσων ανάπτυξης πραγματοποιούνται με τη σειρά τα εξής στάδια: (i) Η γλυκόζη, η ξυλόζη, το εκχύλισμα μαγιάς αποστειρώνονται ξεχωριστά στους 121 o C για 20 min σε συγκέντρωση μέχρι 300 g/l. (ii) Τα φωσφορικά άλατα (K2HPO4) αποστειρώνονται ξεχωριστά στους 121 o C για 20 min για την αποφυγή της καταβύθισης τους και προστίθενται τελευταία στο μέσο ώστε να είναι αραιωμένο το διάλυμα που τα υποδέχεται. (iii) Τα μεταλλικά άλατα αποστειρώνονται με φίλτρα αποστείρωσης βιολογικών διαλυμάτων Whatman Inc. (U.S.A.) TF 0,2 μm. Όλα τα θρεπτικά μέσα προετοιμάζονται στο θάλαμο νηματικής ροής (Herasafe KS-12 της αμερικανικής εταιρίας Thermo Electron Corp., Thermo Fisher Scientific Inc.), ο οποίος αποστειρώνεται με εφαρμογή υπεριώδους ακτινοβολίας για 30 min. Σε περίπτωση προετοιμασίας θρεπτικών μέσων ανάπτυξης με συγκέντρωση γλυκόζης μεγαλύτερη από 300 g/l τότε η αποστείρωση γίνεται με φίλτρα αποστείρωσης βιολογικών διαλυμάτων Nalgene της αμερικάνικης εταιρείας ThermoScientific με μέγεθος πόρων 75 mm συνολικού όγκου 500 ml προς αποφυγή της καραμέλωσης της γλυκόζης (Πενλόγλου, 2011) Λειτουργία του Βιοαντιδραστήρα Στη συνέχεια, η καλλιέργεια του σακχαρομύκητα μεταφέρεται από τις κωνικές φιάλες σε μεγαλύτερη κλίμακα και η ζύμωση πραγματοποιείται σε γυάλινο βιοαντιδραστήρα συνολικού όγκου 3 l (BioFlo 110 Bioreactor/Fermentor) της αμερικάνικης εταιρίας New Brunswick Scientific Co. Inc. Ο αερισμός της καλλιέργειας στο κλειστό σύστημα του αντιδραστήρα πραγματοποιείται με παροχή αέρα ώστε το επίπεδο του διαλυμένου οξυγόνου στο μέσο καλλιέργειας να παραμένει πάντα μεγαλύτερο από το 20% του κορεσμού του οξυγόνου σε αυτό. Το διαλυμένο οξυγόνο (D.O.) μετράται με ένα κατάλληλο ηλεκτρόδιο (InPro 6800 O2 Sensor 12/25 mm της ισπανικής εταιρίας Mettler Toledo Inc., -74-

95 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι βυθισμένο πάντοτε στην καλλιέργεια) και ρυθμίζεται αυτόματα με βάση τη συχνότητα περιστροφής του αναδευτήρα και χειροκίνητα από την παροχή εισόδου του αέρα/οξυγόνου. Συγκεκριμένα, η αρχική παροχή του αέρα πραγματοποιείται με ροή 1 vvm, ενώ κατά την πορεία των πειραμάτων ρυθμίζεται εξωτερικά από το χρήστη μέσω κατάλληλου ροομέτρου (Ki 0-5 l/min της αμερικάνικης εταιρίας Key Instruments Inc.), ενώ μπορεί να αυξηθεί ανάλογα με τις απαιτήσεις αερισμού. Το ροόμετρο είναι τοποθετημένο μετά το συμπιεστή αερίων (M37 της αμερικάνικης εταιρίας KnF Laboport Inc.) και πριν την είσοδο του βιοαντιδραστήρα. Η παροχή του αέρα/οξυγόνου εκτείνεται γενικά στην περιοχή 1-3 vvm (volumes of air per minute per volume of batch, 1-3 l/min για όγκο καλλιέργειας ίσο με 1 l). Ο αερισμός πραγματοποιείται από τον κατανεμητή (sparger) που βρίσκεται βυθισμένος στον κύριο όγκο της καλλιέργειας. Σχετικά με την αποστείρωση του εισερχόμενου αέρα, σημειώνεται ότι ο τροφοδοτούμενος αέρας εισέρχεται μέσω φίλτρων αποστείρωσης Whatman Inc. (U.S.A.) PTFE Filters 0,2 μm. Η χρήση του βιοαντιδραστήρα επιτρέπει τη δυνατότητα ταυτόχρονης μέτρησης και ρύθμισης του ph κατά την καλλιέργεια. Η μέτρηση του ph γίνεται με εγκατεστημένο ηλεκτρονικό σύστημα, το οποίο σε πιθανές μεταβολές του ph καθορίζει τη ρύθμιση του με προσθήκη εξωτερικών αποστειρωμένων διαλυμάτων. Επίσης, μέσω του εγκατεστημένου λογισμικού παρακολουθείται και ρυθμίζεται η ταχύτητα ανάδευσης του αναδευτήρα του συστήματος. Επιπλέον, ο αφρισμός του βιοαντιδραστήρα που εμφανίζεται λόγω του μεγάλου ρυθμού ανάπτυξης, εντοπίζεται αυτόματα από το κατάλληλο μετρητικό στάθμης και καταστέλλεται με την παροχή του αντι-αφριστικού διαλύματος Sigma Antifoam SE-15, σε συγκέντρωση υδατικού διαλύματος 0,5% v/v. Ο ωφέλιμος όγκος του αντιδραστήρα είναι 2 l και οι καλλιέργειες ημι-συνεχούς λειτουργίας που πραγματοποιήθηκαν, είχαν αρχικό όγκο ίσο με 800 ml. Το θρεπτικό μέσο είναι το ίδιο που αξιοποιήθηκε και στην περίπτωση των κωνικών φιαλών. Η διαφορά στην κλίμακα του βιοαντιδραστήρα εντοπίζεται κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων ημι-συνεχούς λειτουργίας, όπου τροφοδοτείται στον αρχικό όγκο του μέσου διάλυμα γλυκόζης με τιμή εντός της περιοχής g/l. Η παροχή του συμπυκνωμένου μέσου τροφοδοσίας πραγματοποιείται με τη βοήθεια περιστροφικής αντλίας με ρυθμό παροχής ίσο με 180 ml/h στη μέγιστη (100%) δυνατότητα λειτουργίας της. Ο ρυθμός τροφοδοσίας ορίζεται από τις διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας που μελετήθηκαν και ρυθμίζεται με διαφορετικό -75-

96 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι ποσοστό λειτουργίας της αντλίας χειροκίνητα ή μέσω του λογισμικού Brunswick BioCommand Plus. Το διάλυμα δεν αποστειρώνεται σε κλίβανο αλλά φιλτράρεται μέσω βιολογικών φίλτρων αποστείρωσης Whatman 0,4 μm. Κατά την πορεία λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα λαμβάνονται δείγματα των 5 ml σε τακτά χρονικά διαστήματα (1 ή 2 ώρες) για μέτρηση των υπολειπόμενων σακχάρων, της αιθανόλης και των υποπροϊόντων της ζύμωσης Ρύθμιση του ph κατά την Καλλιέργεια Η ρύθμιση του ph κατά τη ζύμωση ακολουθεί την αποστείρωση και τη σύνθεση του θρεπτικού μέσου ανάπτυξης. Για της καλλιέργειες σε κωνικές φιάλες χρησιμοποιούνται υδατικά διαλύματα NaOH 1 M και HCl 1 M που έχουν προηγουμένως αποστειρωθεί. Η ρύθμιση του ph πραγματοποιείται πριν την προσθήκη του ενοφθαλμίσματος. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του μικροοργανισμού το ph διαφοροποιείται σε μικρό βαθμό ώστε η βιωσιμότητα των κυττάρων να παραμένει ανεπηρέαστη. Κατά τη ζύμωση στο βιοαντιδραστήρα το ph ρυθμίζεται αυτόματα και παράλληλα με την εξέλιξη του φαινομένου, σύμφωνα με της μετρήσεις του βαθμονομημένου πεχαμέτρου, αξιοποιώντας τα επίσης προ-αποστειρωμένα ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 1 M και HCl 1 M. Η βαθμονόμηση του πεχαμέτρου του βιοαντιδραστήρα πραγματοποιείται πριν την αποστείρωση του στον κλίβανο αποστείρωσης με ατμό, αξιοποιώντας τρία πρότυπα διαλύματα της γερμανικής εταιρίας Merck KgaA, με τιμές ph: 4.01, 7 και 9.21 στους 20 ο C Ζύμωση σε Ημι-συνεχείς συνθήκες (fed-batch) Η καλλιέργεια του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae πραγματοποιείται σε ασυνεχείς (batch) καθώς και σε ημι-συνεχείς (fed-batch) συνθήκες (τροφοδοσίας). Τα συστατικά του θρεπτικού μέσου και οι συνθήκες της ζύμωσης που προέκυψαν από τη βελτιστοποίηση του σταδίου της ζύμωσης σε ασυνεχείς συνθήκες λειτουργίας με βάση το σχεδιασμό Taguchi μεταφέρθηκαν σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με στόχο την αύξηση της παραγωγικότητας και της συγκέντρωσης της αιθανόλης. Οι ημι-συνεχείς συνθήκες της ζύμωσης μελετήθηκαν αρχικά στο επίπεδο της κωνικής φιάλης και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεγαλύτερης κλίμακας πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο βιοαντιδραστήρα. -76-

97 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Η πολιτική της τροφοδοσίας στις κωνικές φιάλες βασίστηκε στο ρυθμό κατανάλωσης της γλυκόζης από τον μικροοργανισμό και πραγματοποιήθηκε σε παλμούς, πριν η περιεκτικότητα του μέσου σε γλυκόζη μηδενιστεί. Ο σακχαρομύκητας διαπιστώθηκε από τα πειράματα διαλείποντος έργου ότι καταναλώνει το σύνολο της διαθέσιμης γλυκόζης όταν η ανάπτυξη του σημειώσει οπτική πυκνότητα περίπου 8-9 (2,064 2,322 g/l DCW). Η καλλιέργεια παρακολουθείται με τη σύγχρονη μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (περιγραφή στην Παράγραφο ) και όπως περιγράφεται στον Πίνακα 2.8 οι παλμοί της τροφοδοσίας προστίθενται πριν την κατανάλωση των σακχάρων και κατά την ολοκλήρωση ενός κύκλου ανάπτυξης. Το μίγμα της ημισυνεχούς τροφοδοσίας έχει συγκέντρωση 200 g/l γλυκόζης και τα υπόλοιπα συστατικά του θρεπτικού μέσου προσαρμόστηκαν σε ανάλογη συμπύκνωση, κατά 10 φορές. Η κάθε δόση είχε όγκο 20 ml και ο τελικός όγκος του μέσου στο οποίο προστέθηκε ήταν 200 ml, ώστε να πραγματοποιείται αραίωση 10 φορές και η περιεκτικότητα της γλυκόζης σε κάθε παλμό τροφοδοσίας να είναι ίση με την αρχική συγκέντρωση γλυκόζης με τιμή 20 g/l. Στη συνέχεια, η καλλιέργεια του S. cerevisiae μεταφέρεται σε μεγαλύτερη κλίμακα σε γυάλινο βιοαντιδραστήρα όγκου 3 l. Ο ωφέλιμος όγκος του αντιδραστήρα είναι 2 l και οι καλλιέργειες ημι-συνεχούς λειτουργίας που πραγματοποιήθηκαν, είχαν αρχικό όγκο ίσο με 800 ml. Τα συστατικά του θρεπτικού μέσου είναι τα ίδια που αξιοποιήθηκαν κατά την καλλιέργεια σε επίπεδο κωνικών φιαλών. Το διάλυμα της ημισυνεχούς τροφοδοσίας περιλαμβάνει 300 g/l γλυκόζης, συμπυκνωμένο κατά 15 φορές σε σχέση με την αρχική συγκέντρωση της γλυκόζης. Τα υπόλοιπα θρεπτικά συστατικά περιλαμβάνονται επίσης στο μίγμα της τροφοδοσίας, με τιμή συμπύκνωσης 7,5 φορές. Η διαφορετική συμπύκνωση των συστατικών του μίγματος τροφοδοσίας ακολουθεί την παρατήρηση ότι ο μικροοργανισμός καταναλώνει με διαφορετικό ρυθμό τη γλυκόζη από τα υπόλοιπα θρεπτικά συστατικά του θρεπτικού μέσου. Η ημισυνεχής τροφοδοσία μελετήθηκε για διαφορετικές περιπτώσεις πολιτικών τροφοδοσίας (Karapatsia et al., 2014). Οι διάφορες πολιτικές ζύμωσης βασίζονται σε διαφορετικούς παράγοντες ρύθμισης όπως παρουσιάζονται στον Πίνακα

98 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 2.8. Πολιτική τροφοδοσίας της ζύμωσης σε ημισυνεχείς συνθήκες στην κωνική φιάλη. Στάδια 600nm Aσυνεχής λειτουργία η δόση 8 2 η δόση 16 3 η δόση 24 Πίνακας 2.9. Διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας στον βιοαντιδραστήρα σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας. Πολιτική Τροφοδοσίας Παράγοντας Προσδιορισμού 1 FFr (t) = Qs Qs = 10 (g/l)/h Σταθερή τροφοδοσία ίση με τη μέση τιμή του ρυθμού κατανάλωσης των σακχάρων (10 (g/l)/h). 2 FFr(t)=FFr0 μ exp(μ t) 3 FFr(t)=FFr0 μ exp(μ t) Εκθετική τροφοδοσία βασισμένη σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,23 h -1 ). Εκθετική τροφοδοσία βασισμένη σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,35 h -1 ) Συμπύκνωση του Υδρολύματος Η συμπύκνωση των υδρολυμάτων ακολουθεί τα δύο ρεύματα της αραιής όξινης προεπεξεργασίας και της ενζυμικής υδρόλυσης. Πραγματοποιείται με τη μέθοδο της εξάτμισης υπό κενό. Παράλληλα, η εξάτμιση είναι μία φυσική μέθοδος απομάκρυνσης των πτητικών παρεμποδιστικών ενώσεων που περιλαμβάνονται στα διαλύματα, όπως φουρφουράλες, οξικό οξύ και βανιλλίνη σύμφωνα με τους Wilson et al. (1989). Η διαδικασία διαρκεί 2 h, σε πλάκα ανάδευσης, στις 450 στροφές και ταυτόχρονη θέρμανση -78-

99 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι στους 60 o C. Κατά την εξάτμιση συμπυκνώνονται και ανεπιθύμητες παρεμποδιστικές ενώσεις, συνεπώς η συμπύκνωση προηγείται πάντα της εξουδετέρωσης. Σε κάποιες περιπτώσεις μετά την εξάτμιση ακολουθεί χειρισμός του υδρολύματος με ενεργό άνθρακα 5% w/v. Οι πορώδεις ιδιότητες του ενεργού άνθρακα απομακρύνουν ποσότητα ανεπιθύμητων ενώσεων και συγχρόνως προκαλούν αποχρωματισμό του υδρολύματος. Το μίγμα έρχεται σε επαφή 30 min με τον ενεργό άνθρακα σε θερμοκρασία 45 o C Καλλιέργεια Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Στέλεχος Το βασικό στέλεχος του βακτηρίου Actinobacillus succinogenes DSM αγοράστηκε από την γερμανική συλλογή μικροοργανισμών και κυττάρων DSMΖ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). Η θερμοκρασία ανάπτυξης του μικροοργανισμού είναι ο C και τα όρια του ph είναι (Gunnarsson et al., 2013, Borges & Pereira 2011). Η φαινοτυπική του ανάλυση υπέδειξε ότι το βακτήριο είναι προαιρετικά αναερόβιο, μη κινούμενο, πλειόμορφο, ενίοτε νηματοειδές και αρνητικό κατά Gram (Song & Lee 2006) Διατήρηση Στελέχους To βακτήριο Actinobacillus succinogenes διατηρείται σε τρυβλία με σταθεροποιημένο θρεπτικό μέσο LB (Luria Broth) που αποτελείται από NaCl, εκχύλισμα μαγιάς, τρυπτόνη και αγαρόζη (στερεό μέσο διατήρησης). Η ακριβής σύσταση του μέσου μπορεί να φανεί στον Πίνακα Μετά την προετοιμασία του μέσου, ακολουθεί αποστείρωση του στους 121 ο C για 20 min (Παράγραφος ) και στη συνέχεια τοποθετείται στο θάλαμο νηματικής ροής μέχρι να ελαττωθεί η θερμοκρασία (περίπου στους 50 ο C) και ακολουθεί ρύθμιση του ph σε τιμή 7. Το μέσο μεταφέρεται σε τρυβλίο προτού στερεοποιηθεί. Τα συστατικά του υγρού μέσου διατήρησης είναι κοινά με στο σταθερό μέσο που περιέχουν τα τρυβλία με μοναδική διαφορά την προσθήκη του σταθεροποιητικού αγαρόζη. Το υγρό μέσο διατήρησης αναπτύσσεται σε δοκιμαστικό σωλήνα 15 ml με βιδωτό καπάκι αφού πρώτα έχει απομακρυνθεί ο αέρας και έχει αντικατασταθεί η υπερκείμενη ατμόσφαιρα από διοξείδιο του άνθρακα. Μικρή ποσότητα μικροοργανισμού προστίθεται στο υγρό μέσο -79-

100 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι διατήρησης σε λυοφιλοποιημένη μορφή απευθείας από τον εμπορικά διαθέσιμο μικροοργανισμό. Το ενοφθάλμισμα στα τρυβλία πραγματοποιείται μετά από 24 h επώασης στο επωαστήρα στους 37 o C με ταχύτητα ανάδευσης 150 rpm. Αφού ετοιμαστούν τα τρυβλία επωάζονται στους 37 ο C για 48 h, μέχρι την εμφανή δημιουργία μεμονωμένων αποικιών. Τα τρυβλία, μετά την ανάπτυξη των κυττάρων του μικροοργανισμού, διατηρούνται στο ψυγείο (σε θερμοκρασία 4 o C) για τέσσερις εβδομάδες μέσα σε αναερόβια κλεισμένα βάζα. Η διαδικασία αναγέννησης του μικροοργανισμού είτε από τρυβλία είτε από τον εμπορικά διαθέσιμο μικροοργανισμό σε λυοφιλοποιημένη μορφή, πραγματοποιείται κάθε ένα μήνα για την εξασφάλιση της διατήρησης της βιωσιμότητας των αποικιών του μικροβιακού στελέχους και την απομάκρυνση πιθανοτήτων επιμόλυνσης του. Πίνακας Σύσταση του θρεπτικού μέσου διατήρησης του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) 1 ΝaCl 10 2 Εκχύλισμα μαγιάς 5 3 Τρυπτόνη 10 4 Αγαρόζη Προκαλλιέργεια του Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Η καλλιέργεια του αναερόβιου βακτηρίου πραγματοποιείται σε δύο βασικά στάδια. Προηγείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού σε πλουσιότερο θρεπτικά μέσο, το αποκαλούμενο μέσο προκαλλιέργειας, με σκοπό την ταχεία ανάπτυξη και διαίρεση των κυττάρων του. Το στάδιο της προκαλλιέργειας χωρίζεται επίσης σε δύο στάδια ώστε να αναγεννηθεί πλήρως ο μικροοργανισμός. Επιτυγχάνεται έτσι ταχύτερη ανάπτυξη και επαναληψιμότητα στη συμπεριφορά των πειραμάτων. Τα συστατικά του θρεπτικού μέσου -80-

101 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι και η συγκέντρωση τους είναι κοινά για το πρώτο και το δεύτερο στάδιο της προκαλλιέργειας όπως αυτά παρουσιάζονται στον Πίνακα Το πρώτο στάδιο πραγματοποιείται σε δοκιμαστικό σωλήνα 15 ml που περιλαμβάνει 10 ml θρεπτικού μέσου. Καλύπτεται αρχικά με ελαστικό καπάκι (septa) και με τη βοήθεια σύριγγας απομακρύνεται ο αέρας από το εσωτερικό και προστίθεται στον υπερκείμενο χώρο CO2. Το ενοφθάλμισμα προέρχεται από απομονωμένη αποικία από τα τρυβλία που παρασκευάστηκαν τον τελευταίο μήνα. Το δεύτερο στάδιο της προκαλλιέργειας ξεκινάει μετά από το ενοφθάλμισμα με το πρώτο στάδιο της προκαλλιέργειας. Χρησιμοποιείται γυάλινο θερμοανθεκτικό μπουκάλι (pyrex) με βιδωτό καπάκι στο οποίο έχει απομακρυνθεί ο αέρας, μέσω ελαστικών πωμάτων και με τη βοήθεια καθετήρα, και έχει αντικατασταθεί από ατμόσφαιρα CO2. Όταν η οπτική πυκνότητα (OD) της καλλιέργειας περάσει την τιμή ένα και βρίσκεται στα όρια 1-1,3 όπου πρόκειται για τη μέση της εκθετικής φάσης ανάπτυξης των κυττάρων, λαμβάνεται 10% w/v ποσότητα ενοφθαλμίσματος και μετά από φυγοκέντρηση προστίθεται στο μέσο της ζύμωσης. H μέτρηση της οπτικής πυκνότητας αναφέρεται στην παράγραφο Πίνακας Σύσταση θρεπτικού μέσου προκαλλιέργειας του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) 1 Γλυκόζη 20 2 Εκχύλισμα μαγιάς 2 3 NaHCO K2HPO4 1,5 5 MgSO4.7H2O 1-81-

102 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Ζύμωση του Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Η καλλιέργεια του βακτηρίου Actinobacillus succinogenes DSM πραγματοποιείται σε ασυνεχείς (batch), αναερόβιες συνθήκες. Οι φιάλες που χρησιμοποιήθηκαν διέθεταν συνολικό όγκο 500 ml. Πρόκειται για γυάλινες φιάλες με θερμοανθεκτικά τοιχώματα και βιδωτό καπάκι. Το θρεπτικό μέσο περιλαμβάνει γλυκόζη και ξυλόζη ως πηγή άνθρακα, εκχύλισμα μαγιάς ως πηγή αζώτου, Κ2HPO4 ως πηγή φωσφόρου και MgCO3 ως πηγή CO2 αλλά συγχρόνως ως ρυθμιστικό του ph. Τα παραπάνω μελετήθηκαν μέσω πειραματικού σχεδιασμού για την βέλτιστη παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Επιπρόσθετα, το θρεπτικό μέσο της ζύμωσης περιλάμβανε ΝaCl 0,5 g/l, MgSO4 1 g/l και CaCl2 0,1 g/l. Τα ανθρακικά άλατα (MgCO3, NaHCO3) αποστειρώνονται ξεχωριστά στους 121 o C για 20 min σύμφωνα με τη διαδικασία της αποστείρωσης όπως περιγράφεται στην Παράγραφο Η αρχική ποσότητα ενοφθαλμίσματος υπολογίζεται στην τιμή 3% v/v μετά από 4-6 h του δεύτερου σταδίου προκαλλιέργειας. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται περίπου στο 7 κατά την έναρξη της ζύμωσης με τη χρήση αποστειρωμένων διαλυμάτων 1 Μ ΝaΟΗ και 1 Μ HCl. Η ζύμωση πραγματοποιείται στον περιστροφικό επωαστήρα στους 37 o C και με συχνότητα ανάδευσης καθορισμένη σε 150 rpm. Με στόχο τη μέτρηση του παραγόμενου ηλεκτρικού οξέος αλλά και της κατανάλωσης των αρχικών σακχάρων, τα δείγματα λαμβάνονται στις 24 h και κατά την ολοκλήρωση του πειράματος στις 48 h. Ακολούθως, τα δείγματα φυγοκεντρούνται και φιλτράρονται με φίλτρο Whatman 0,2 μm και οδηγούνται για ανάλυση με υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία (HPLC) Πειραματικός Σχεδιασμός Για τη μελέτη των συγκεντρώσεων των συστατικών του θρεπτικού μέσου επιλέχθηκε ο στατιστικός σχεδιασμός Taguchi σε μικτά επίπεδα. Η αναλογία του μίγματος των αρχικών σακχάρων γλυκόζη και ξυλόζη μελετάται σε έξι επίπεδα και οι υπόλοιποι τέσσερεις παράγοντες (συνολικά σάκχαρα, MgCO3, Εκχύλισμα μαγιάς, Κ2HPO4) σε τρία επίπεδα (6 επίπεδα x 2 παραμέτρους, 3 επίπεδα x 4 παραμέτρους). Τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν είναι 18 (L18). Αναλυτικά, ο πειραματικός σχεδιασμός Taguchi απεικονίζεται στον Πίνακα Στον παρόντα σχεδιασμό, ως παράγοντας απόκρισης επιλέγεται η συγκέντρωση του παραγόμενου ηλεκτρικού οξέος (g/l). Ο πειραματικός σχεδιασμός δίνει τη δυνατότητα μαθηματικής περιγραφής καθώς εξάγεται ένα εμπειρικό -82-

103 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι μαθηματικό μοντέλο που προβλέπει τη συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος σε σχέση με τους ελεγχόμενους παράγοντες, λαμβάνοντας υπόψη τις αποκλίσεις που υπεισέρχονται από τους μη ελεγχόμενους παράγοντες. Επίσης, πραγματοποιείται Ανάλυση Διακύμανσης (ANOVA) των πειραματικών αποτελεσμάτων που εξάγει συμπεράσματα για τη συνεισφορά της κάθε παραμέτρου στο γραμμικό μοντέλο βασισμένα στο άθροισμα των τετραγώνων (SS) και για τη σημαντικότητα της επίδρασης της κάθε παραμέτρου στον παράγοντα απόκρισης από τον παράγοντα p (pfactor). Περισσότερα στοιχεία προκύπτουν από την ανάλυση μέσω των διαγραμμάτων κανονικότητας και της διασποράς των υπολειμμάτων των μετρούμενων από τα υπολογισθέντα δεδομένα, που υποδεικνύουν τη στατιστική ασφάλεια των συμπερασμάτων που εξάγονται από το γραμμικό εμπειρικό μοντέλο (Παράρτημα Α). Ο πειραματικός σχεδιασμός που εφαρμόζεται μελετά την επίδραση πέντε παραγόντων, της αναλογίας των σακχάρων, της συνολικής συγκέντρωσης των σακχάρων, της περιεκτικότητας σε ανθρακικό μαγνήσιο, της περιεκτικότητας σε φωσφορικά άλατα και της περιεκτικότητας σε εκχύλισμα ζύμης που αποτελεί την πηγή αζώτου για τον μικροοργανισμό (Πίνακας 2.12). Το αποτέλεσμα του ορθογώνιου σχεδιασμού (orthogonal array) είναι μια σειρά 18 πειραμάτων (L18) που το καθένα πραγματοποιείται σε 2 επαναλήψεις. Η στατιστική ανάλυση εξάγει πληροφορίες για το λόγο «Σήματος προς Θόρυβο» ( Signal to Noise, S/N) που αποτελεί ένα από τα κριτήρια βελτιστοποίησης του σχεδιασμού Taguchi. Η εξίσωση υπολογισμού του λόγου «Σήματος προς Θόρυβο» περιγράφεται στο Παράρτημα Α. -83-

104 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας Πειραματικός σχεδιασμός Taguchi κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes Παράγοντες Επίπεδο 1 Επίπεδο 2 Επίπεδο 3 Επίπεδο 4 Επίπεδο 5 Επίπεδο 6 Αναλογία Σακχάρων (Γλυκόζη - Ξυλόζη %) Συνολικά Σάκχαρα MgCO3 (g/l) K2HPO4 (g/l) Εκχύλισμα μαγιάς (g/l) Λειτουργία του Βιοαντιδραστήρα Η καλλιέργεια του αναερόβιου βακτηρίου A. succinogenes μεταφέρεται από το επίπεδο της φιάλης σε μεγαλύτερη κλίμακα και η ζύμωση πραγματοποιείται σε γυάλινο βιοαντιδραστήρα όγκου 3 l (BioFlo 110 Bioreactor/Fermentor της αμερικάνικης εταιρίας New Brunswick Scientific Co. Inc.). Ο αέρας απομακρύνεται από το εσωτερικό του αντιδραστήρα με υψηλή παροχή CO2 από εξωτερική φιάλη 100% CO2. Στη συνέχεια, ανάλογα με το σχεδιασμό του πειράματος, η παροχή του CO2 είτε παραμένει σταθερή σε τιμή 0,5 vvm, μέσω κατάλληλου ροομέτρου (Ki 0-5 l/min της αμερικάνικης εταιρίας Key Instruments Inc.), ή διακόπτεται κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας και οι ανάγκες του μικροοργανισμού σε CO2 καλύπτονται μόνο από το MgCO3. To διαλυμένο οξυγόνο (D.O.) μετράται με ένα κατάλληλο ηλεκτρόδιο (InPro 6800 O2 Sensor 12/25 mm της ισπανικής εταιρίας Mettler Toledo Inc.), βυθισμένο πάντοτε στον κύριο όγκο της καλλιέργειας. Η παροχή CO2 πραγματοποιείται από έναν κατανεμητή που βρίσκεται στον κύριο όγκο της καλλιέργειας, ακριβώς κάτω από τη θέση του αναδευτήρα. Το τροφοδοτούμενο CO2 αποστειρώνεται μέσω φιλτραρίσματος με φίλτρα αποστείρωσης Whatman Inc. (U.S.A.) PTFE Filters 0,2 μm. Στη συνέχεια, η μέτρηση και ρύθμιση του ph γίνεται με εγκατεστημένο ηλεκτρονικό σύστημα και ρυθμίζεται με εξωτερικά διαλύματα 1 M NaOH και 1 M HCl σε περίπτωση που -84-

105 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι το MgCO3 δεν αρκεί για τη ρύθμιση του ph. Επιπρόσθετα, μέσω του εγκατεστημένου λογισμικού παρακολουθείται και ρυθμίζεται η ταχύτητα ανάδευσης για την οποία έχει οριστεί σταθερή τιμή ίση με 250 rpm. Ο αφρισμός του βιοαντιδραστήρα λόγω του μεγάλου ρυθμού ανάπτυξης, εντοπίζεται αυτόματα από το κατάλληλο μετρητικό και καταστέλλεται με την παροχή του αντι-αφριστικού Sigma Antifoam SE-15, σε συγκέντρωση υδατικού διαλύματος 1% v/v. Τέλος, ο ωφέλιμος όγκος του αντιδραστήρα είναι 2 l και οι καλλιέργειες που πραγματοποιήθηκαν, είχαν αρχικό όγκο ίσο με 1 l. Το θρεπτικό μέσο που αξιοποιήθηκε είναι το βέλτιστο που επιλέχθηκε από τα πειράματα σε επίπεδο φιαλών. Κατά την πορεία λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα λαμβάνονται δείγματα των 5 ml ανά 12 ώρες για μέτρηση των υπολειπόμενων σακχάρων, του ηλεκτρικού οξέος, της αιθανόλης, του μυρμηκικού και του οξικού οξέος Εξουδετέρωση του υδρολύματος Η αντίδραση της προεπεξεργασίας πραγματοποιείται σε διάλυμα θειικού οξέος 1,5 ή 2 % w/v. Το ph του υδρολύματος μετά το πέρας της αντίδρασης είναι περίπου Συνεπώς απαιτείται ουδετεροποίηση του ph πριν από τη χρήση των μονομερών σακχάρων για τη ζύμωση τους από τους μικροοργανισμούς καθώς και τη μέτρηση τους από τον υγρό χρωματογράφο. Παράλληλα, η μέθοδος της αραιής όξινης υδρόλυσης μπορεί να διαχωρίσει τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα με τέτοιο τρόπο ώστε να παραχθούν και ανεπιθύμητες παρεμποδιστικές ενώσεις για τους ζώντες μικροοργανισμούς. Οι ενώσεις αυτές προέρχονται είτε από την αποικοδόμηση των σακχάρων (φουρφουράλες, υδρομέθυλοφουρφουράλες) ή από την αποικοδόμηση της λιγνίνης (φαινόλες). Επίσης, οι φουρφουράλες σε ορισμένες περιπτώσεις αποικοδομούνται με τη σειρά τους σε οργανικά οξέα όπως μυρμηκικό και λεβουλινικό οξύ (Σχήμα 2.4). Η διαδικασία της εξουδετέρωσης του μίγματος απομακρύνει τις παρεμποδιστικές ενώσεις αφού τις καταβυθίσει ως ίζημα. Η ουδετεροποίηση του μίγματος πραγματοποιείται με τη χρήση βάσης (NaOH) ώσπου το ph να γίνει ιδιαίτερα βασικό (περίπου ph=11-12). Η αντίδραση διαρκεί 2 h υπό ανάδευση στους 60 o C. Στη συνέχεια το υδρόλυμα χειρίζεται με πυκνό θειικό οξύ (72% w/v H2SO4) ώστε το ph να γίνει ουδέτερο στην τελική τιμή 6.2 (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000). Κατά την εξουδετέρωση, δημιουργείται ίζημα που -85-

106 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι προέρχεται από τα άλατα της αντίδρασης των οξέων με τη βάση και καταβυθίζεται ώστε να υπάρχει η δυνατότητα απομάκρυνσης του με τη βοήθεια της φυγοκέντρησης. Το διάλυμα τοποθετείται στη φυγόκεντρο σε στροφές 5800xg για διάρκεια 10 min. Σχήμα 2.4. Δομή των παρεμποδιστικών ενώσεων που προέρχονται από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Η επίδραση των παρεμποδιστικών ενώσεων διαφέρει σε κάθε καλλιέργεια και εξαρτάται από το μέγεθος του ενοφθαλμίσματος, το ph, τον αερισμό και άλλους παράγοντες. Η απόδοση της παραγωγής των προϊόντων δεν αλλάζει σημαντικά με τη μεσολάβηση της ουδετεροποίησης, αλλά η βασική διαφορά σημειώνεται στην καθυστέρηση της ανάπτυξης του πληθυσμού. Οι παρεμποδιστικές ενώσεις διαπερνούν το κυτταρικό τοίχωμα του μικροοργανισμού προκαλώντας μεγάλης διάρκειας επώαση και χαμηλή παραγωγή μεταβολιτών. Συγκεκριμένα οι φουρφουράλες μειώνουν την παραγωγικότητα του μικροοργανισμού και τον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (Chandel et al., 2011). -86-

107 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Αναλυτικές Μέθοδοι του Σταδίου της Ζύμωσης Δειγματοληψία Κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειες πραγματοποιούνται δειγματοληψίες σε τακτά χρονικά διαστήματα τόσο σε επίπεδο κωνικών φιαλών όσο και σε επίπεδο βιοαντιδραστήρα. Τα δείγματα που λαμβάνονται έχουν συνήθως όγκο 5 ml και προορίζονται για τις αναλυτικές τεχνικές προσδιορισμού που εφαρμόζονται σε κάθε περίπτωση. Το κάθε δείγμα, που απομακρύνεται από την καλλιέργεια, φυγοκεντρείται άμεσα ώστε να διαχωριστούν τα κύτταρα που καταβυθίζονται από το υπερκείμενο διάλυμα που περιλαμβάνει τα διαλυμένα επιθυμητά προϊόντα. Στη συνέχεια καταψύχεται και διατηρείται στους -30 ο C. Η δειγματοληψία στις κωνικές φιάλες πραγματοποιείται υπό ασηπτικές συνθήκες μέσα στο θάλαμο νηματικής ροής. Στο βιοαντιδραστήρα η λήψη του δείγματος γίνεται ασηπτικά με χειροκίνητη αναρρόφηση της κατάλληλης ποσότητας. Μικρή ποσότητα από κάθε δείγμα οδηγείται για οπτική παρατήρηση των κυττάρων με τη βοήθεια του μικροσκοπίου Leica DM 4000B της γερμανικής εταιρίας Microsystems Wetzlar GmbH. Η δειγματοληψία πραγματοποιείται κάθε μία ή δύο ώρες για παρακολούθηση της παραγωγής της κυτταρικής βιομάζας, της αιθανόλης ή του ηλεκτρικού οξέος καθώς και της κατανάλωσης των σακχάρων. Στις περιπτώσεις του πειραματικού σχεδιασμού η δειγματοληψία πραγματοποιείται κατά την ολοκλήρωση του φαινομένου. Συγκεκριμένα κατά τη ζύμωση του Saccharomyces cerevisiae το δείγμα λαμβάνεται στις 8 και 12 ώρες και στη ζύμωση του Actinobacillus succinogenes το δείγμα λαμβάνεται στις 12 και 24 ώρες Μέτρηση της Κυτταρικής Αύξησης Για την παρακολούθηση του ρυθμού κυτταρικής αύξησης εφαρμόζεται η φασματοσκοπική μέθοδος μέτρησης της οπτικής πυκνότητας (θολερότητας) της καλλιέργειας. Το δείγμα τοποθετείται σε πλαστική κυψελίδα μίας χρήσης 3 ml απευθείας στο φασματοφωτόμετρο για τη μέτρηση της απορρόφησης του φωτός από το κυτταρικό αιώρημα με τυφλό δείγμα το νερό. Οι μετρήσεις πραγματοποιούνται στα 600 nm σε φασματοφωτόμετρο ορατού/υπεριώδους (U-1800 UV/vis Spectrophotometer της αμερικανικής εταιρίας Hitachi High Technologies Inc.). Το υπόλοιπο δείγμα, φυγοκεντρείται, διαχωρίζονται τα κύτταρα από το υπερκείμενο και διατηρούνται στην κατάψυξη στους -30 o C, αφού προηγηθεί -87-

108 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι ξήρανση τους μέσω λυοφιλοποίησης για περίπου 16 h. Η λυοφιλοποίηση πραγματοποιείται σε λυοφιλοποιητή (Freeze Dryer) ThermoMicroModulyo-230, ο οποίος είναι εξοπλισμένος με την αντλία κενού Thermo Savant VLP120 ValuPump της ίδιας εταιρίας. Στη συνέχεια τα λυοφιλοποιημένα κύτταρα ζυγίζονται ώστε να προσδιοριστεί η κυτταρική μάζα τους. Ακολουθεί συσχέτιση μεταξύ της οπτικής πυκνότητας και της ξηρής κυτταρική μάζας (σε όρους συγκέντρωσης βιομάζας). Η γραμμική αυτή απεικόνιση του Σχήματος 2.5 της σχέσης της οπτικής πυκνότητας και της βιομάζας επιτρέπει τη μετατροπή της απορρόφησης σε g/l ξηρής κυτταρικής βιομάζας σύμφωνα με τη σχέση: [DCW]=0,259 [OD]600nm (2.6), όπου [DCW] είναι η συγκέντρωση της ξηρής μάζας κυττάρων (συγκέντρωση βιομάζας) σε g/l, και [OD]600nm η οπτική απορρόφηση στα 600 nm. Ο συντελεστής R 2 της γραμμικής παλινδρόμησης προέκυψε αρκετά ικανοποιητικός και ίσος με 0,9676. Η σχέση αυτή ισχύει για οπτική πυκνότητα μέχρι τιμή 30. Σε μεγαλύτερες τιμές λόγω των βλαστών που δημιουργεί ο S. cerevisiae (Σχήμα 2.6) η συσχέτιση αλλάζει κλίση και προκύπτει η σχέση: [DCW]=0,344 [OD]600nm (2.7) Σχήμα 2.5. Καμπύλη γραμμικής συσχέτισης της οπτικής πυκνότητας (OD) των κυττάρων του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae με το βάρος της ξηρής βιομάζας (συγκέντρωση βιομάζας, DCW). -88-

109 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι (α) (β) Σχήμα 2.6. Εικόνα μικροσκοπίου (α) με οπτική πυκνότητα OD=15 και (β) με οπτική πυκνότητα OD= On line μετρήσεις Για τη συλλογή αποτελεσμάτων καθώς και για την παρακολούθηση της καλλιέργειας του μικροοργανισμού πραγματοποιούνται συνεχείς δειγματοληψίες και αναλύσεις, είτε παράλληλα με τη διαδικασία είτε συγκεντρωτικά αφού ολοκληρωθεί το στάδιο. Για σύγχρονη παρακολούθηση και έλεγχο της ζύμωσης χρησιμοποιήθηκαν: 1) ενζυμικά αντιδραστήρια για απλοποιημένη μέθοδο προσδιορισμού της αιθανόλης στο αιώρημα της καλλιέργειας με τη χρήση Φασματοφωτομετρίας Υπεριώδους/Ορατού (UV-method, No , Boehringer Mannheim της γερμανικής εταιρίας R-Biopharm), (Biener et al., 2012). 2) η μέθοδος προσδιορισμού της γλυκόζης με δίνιτρο-σαλυκιλικό οξύ (DNS method, Miller, 1959) και χρήση Φασματοφωτομετρίας Υπεριώδους/Ορατού Φάσματος. Τα αναγωγικά σάκχαρα και συγκεκριμένα η γλυκόζη, αντιδρά με το δίνιτρο-σαλικυλικό οξύ (DNS) προς το σχηματισμό του έγχρωμου (πορτοκαλί) παραγώγου άμινο-νίτρο-σαλυκιλικού οξέος. Το χρωματισμένο διάλυμα απορροφά στο ορατό, με την ένταση να εξαρτάται από τη συγκέντρωση του άμινο-νίτρο-σαλυκιλικού οξέος και αναλογικά από τη συγκέντρωση της γλυκόζης. Οι διαδικασίες υπολογισμού των σακχάρων με τη μέθοδο προσδιορισμού του δίνιτρο-σαλυκιλικού οξέος και της αιθανόλης με τα ενζυμικά αντιδραστήρια περιγράφονται στο Παράρτημα Β. -89-

110 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης Ο ποσοτικός προσδιορισμός των περιεχόμενων ενώσεων στο υπερκείμενο των δειγμάτων που προέρχονται από την καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε και με off-line μετρήσεις με τη χρήση συσκευής Υψηλής Απόδοσης Υγρής Χρωματογραφίας (HPLC). Τo μοντέλο της συσκευής είναι το Agilent 1200 της γερμανικής εταιρίας Agilent Technologies, με εγκατεστημένη στήλη ιοντοανταλλαγής Agilent, μοντέλου Hi-Plex H +, διαστάσεων 300 mm x 7,7 mm x 8 μm (PL ) και εγκατεστημένο ανιχνευτή Δείκτη Διάθλασης Model Infinity Ως κινητή φάση χρησιμοποιείται υδατικό διάλυμα H2SO4 0,005 Μ με ρυθμό ροής 0,6 ml/min. Τα δείγματα που προέρχονται από την καλλιέργεια του S. cerevisiae αφού φυγοκεντρήθηκαν, αναλύθηκαν για περιεκτικότητα σε αιθανόλη, γλυκόζη, οξικό οξύ, γλυκερόλη και μυρμηκικό οξύ. Τα δείγματα που προέρχονται από την καλλιέργεια του A. succinogenes, αναλύθηκαν για περιεκτικότητα σε ηλεκτρικό οξύ, αιθανόλη, γλυκόζη, ξυλόζη, οξικό και μυρμηκικό οξύ. Οι παραπάνω ενώσεις έχουν βαθμονομηθεί με πρότυπα μίγματα γνωστών συγκεντρώσεων και τα φάσματα τους παρουσιάζονται στο Σχήμα 2.7. Σχήμα 2.7. Χρωματογράφημα (χρόνος έκλουσης ένταση σήματος) του αναλυτή δείκτη Διάθλαση κατά την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης για μίγμα πρότυπων σακχάρων με συγκέντρωση 25 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της ζύμωσης. -90-

111 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Μέτρηση O2 και CO2 Η βαθμονόμηση του ηλεκτροδίου του διαλυμένου οξυγόνου βασίζεται σε δύο σημεία: (α) στη μέτρηση για 0% διαλυμένο οξυγόνο, όπου το μετρητικό όργανο είναι αποσυνδεδεμένο από τη μονάδα ελέγχου του βιοαντιδραστήρα, και (β) στη μέτρηση για 100% διαλυμένο οξυγόνο, όπου εξασφαλίζεται ο κορεσμός του μέσου ανάπτυξης με άφθονο αερισμό του, πριν την έναρξη της καλλιέργειας. Η σύσταση των απαερίων από τον αντιδραστήρα, σε όρους % μοριακής περιεκτικότητας, μετρήθηκε on-line με τη βοήθεια ενός αναλυτή αερίων 5200 Multi Purpose της αμερικάνικης εταιρίας Servomex Ltd. Ο αναλυτής χρησιμοποιεί παραμαγνητικούς μετρητές για τον προσδιορισμό του O2 σε περιεκτικότητες ως 100% mol/mol και μετρητές υπέρυθρου για τη μέτρηση του CO2 σε περιεκτικότητες ως 30% mol/mol του αέρα Υπολογισμός Απόδοσης Σταδίου Τα αποτελέσματα της συγκέντρωσης της αιθανόλης του σταδίου της ζύμωσης του Saccharomyces cerevisiae χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της απόδοσης του σταδίου αυτού για το βασικό προϊόν της αιθανόλης. Η απόδοση υπολογίζεται με βάση τη θεωρητική τιμή απόδοσης που βασίζεται στη στοιχειομετρία της αντίδρασης της παραγωγής αιθανόλης από τη γλυκόζη: C6H12O6 2C2H6O + 2CO2 (2.8) Η θεωρητική απόδοση προκύπτει ίση με 0,51 g αιθανόλης προερχόμενα από 1 g γλυκόζης. Επομένως η απόδοση του σταδίου της ζύμωσης ορίζεται ως: [Απόδοση Σταδίου] = ([Συγκέντρωση Παραγόμενης Αιθανόλης]/[Συγκέντρωση Καταναλισκόμενων Σακχάρων])/ 0,51 x 100 (2.9) Ακόμα, η πυκνότητα της αιθανόλης είναι ίση με 0,789 g/ml. Η τιμή της πυκνότητας είναι απαραίτητη για τη μετατροπή της συγκέντρωσης του διαλύματος της ζύμωσης του Saccharomyces cerevisiae σε περιεκτικότητα κατ όγκο (% v/v). -91-

112 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Βιβλιογραφία 2 ου Κεφαλαίου Agbor, V.B., Cicek, N., Sparling, R., Berlin, A., Levin, D.B., Biomass pretreatment: fundamentals toward application. Biotechnology advances, 29(6), pp Biener, R., Steinkämper, A., Horn, T., Calorimetric control of the specific growth rate during fed-batch cultures of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biotechnology, 160(3-4), pp Borges, E.R. & Pereira, N., Succinic acid production from sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate by Actinobacillus succinogenes. Journal of industrial microbiology & biotechnology, 38(8), pp Box, G.E.P. & Behnken, D.W., Some New Three Level Designs for the Study of Quantitative Variables. Technometrics, 2(4), pp Bracey, D., Holyoak, C.D., Caron, G.N., Coote, P.J., Methods Determination of the intracellular ph ( ph i ) of growing cells of Saccharomyces cerevisiae: the effect of reduced-expression of the membrane H + - ATPase. Journal of Microbiological Methods, 31, pp Chandel, A.K., Silvério, S., Singh, O. V, Detoxification of Lignocellulosic Hydrolysates for Improved Bioethanol Production. Biofuel Production Recent Developments and Prospects, pp Goering, H.K. & Van-Soest, P.J., Forage fibre analyses (apparatus, reagments, procedures and some applications). Agriculture Handbook No 379, Agric. Res. Serv., USDA Washinghton DC, USA, pp.20. Gunnarsson, I.B., Karakashev, D.B., Angelidaki. I., Succinic Acid Production from Jerusalem artichoke tubers. 21 st European Biomass Conference and Exhibition, Copenhagen, Denmark, pp

113 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Harris, L.E., 1970, Nutrition research techniques for domestic and wild animals, An International Record System and Procedures for analyzing samples, Vol. 1, Logan Utah, USA. Karapatsia, A., Penloglou, G., Pappas, I., Kiparissides, C., Bioethanol Production via the Fermentation of Phalaris aquatica L. Hydrolysate. Chemical Engineering Transactions, 37, pp Kumar, A., Singh, L.K., Ghosh, S., Bioconversion of lignocellulosic fraction of waterhyacinth (Eichhornia crassipes) hemicellulose acid hydrolysate to ethanol by Pichia stipitis. Bioresource Technology, 100(13), pp Lin, Y., Zhang, W., Li, C., Sakakibara, K., Tanaka, S., Kong, H., Factors affecting ethanol fermentation using Saccharomyces cerevisiae BY4742. Biomass and Bioenergy, 47, pp Lloyd, T. & Wyman, C.E., Combined sugar yields for dilute sulfuric acid pretreatment of corn stover followed by enzymatic hydrolysis of the remaining solids. Bioresource technology, 96(18), pp Miller, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 31(3), pp Palmqvist, E. & Hahn-Hägerdal, B., Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: Inhibitors and mechanisms of inhibition. Bioresource Technology, 74(1), pp Segal, L., Creely, J.J., Martin, A.E., Conrad, C.M., An Empirical method for estimating the degree of crystallinity of native cellulose using the X-ray diffractometer. Textile Research Journal, 29, pp Sindhu, R., Kuttiraja, M., Binod, P., Janu, K.U., Sukumaran, R.K., Pandey, A., Dilute acid pretreatment and enzymatic saccharification of sugarcane tops for bioethanol production. Bioresource Technology, 102(23), pp

114 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Singh, A. & Bishnoi, N.R., Enzymatic hydrolysis optimization of microwave alkali pretreated wheat straw and ethanol production by yeast. Bioresource Technology, 108, pp Singh, S., Simmons, B., Vogel, K.P., Visualization of biomass solubilization and cellulose regeneration during ionic liquid pretreatment of switchgrass. Biotechnology and bioengineering, 104(1), pp Song, H. & Lee, S.Y., Production of succinic acid by bacterial fermentation. Enzyme and Microbial Technology, 39(3), pp Srilekha Yadav, K., Naseeruddin, S., Sai Prashanthi, G., Sateesh, L., Venkateswar Rao, L., Bioethanol fermentation of concentrated rice straw hydrolysate using co-culture of Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis. Bioresource Technology, 102(11), pp Taguchi, G., Subir, C., Wu Y., Taguchi s Quality Engineering Handbook. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, Canada. Van Soest, P.J., Robertson, J.B., Lewis, B.A., 1991, Methods for dietary fiber, Neutral detergent fiber and non-starch polysaccharides in relation to animal nutrition. Journal of Dairy Science, 74(10), pp Wilson, J.J., Deschatelets, L., Nishikawa, N.K., Comparative fermentability of enzymatic and acid hydrolysates of steam-pretreated aspenwood hemicellulose by Pichia stipitis CBS Applied Microbiology and Biotechnology, 31(5-6), pp Zhu, L., O'Dwyer, J.P., Chang, V.S., Granda, C.B., Holtzapple, M.T., Structural features affecting biomass enzymatic digestibility. Bioresource technology, 99(9), pp Kαραπατσιά, A., Πενλόγλου, Γ., Παππάς, I.A., Κυπαρισσίδης, Κ., Μελετη και Βελτιστοποίηση της παραγωγής Βιοαιθανόλης 2 ης γενιάς κατά την ολοκληρωμένη επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας του φυτού Phalaris aquatica L.. 9 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Χημικής Μηχανικής, Αθήνα, pp

115 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Παππάς, Ι.Α., Αξιολόγηση παραγωγικού δυναμικού λιβαδικών φυτών και αξιοποίησή τους για παραγωγή βιοενέργειας. Διδακτορική Διατριβή. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ). Σχολή Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος. doi /eadd/ Πενλόγλου, Ι.Σ., 2010, Μικροβιακή Παραγωγή του βιοαποικοδομησιμου πολύ-(3-υδροξυ βουτυρικού) εστέρα (PHB) με στοχευμένες μοριακές ιδιότητες: Πειραματική βελτιστοποίηση και Μαθηματική μοντελοποίηση. Διδακτορική Διατριβή. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ). Πολυτεχνική Σχολή. Τμήμα Χημικών Μηχανικών. doi -95-

116 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία 3.1 Εισαγωγή στην Προεπεξεργασία Η μέθοδος της προεπεξεργασίας αποτελεί το πρώτο στάδιο της συνολικής διεργασίας παραγωγής βιοαιθανόλης και αποτελεί σημαντικό στάδιο καθώς πραγματοποιείται η διαφοροποίηση της δομής της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας με τέτοιο τρόπο ώστε να είναι διαθέσιμη στην περαιτέρω επεξεργασία της. Για την κατανόηση της δράσης του σταδίου είναι απαραίτητη η γνώση της δομής της λιγνοκυτταρίνης. Η λιγνοκυτταρινική βιομάζα αποτελείται από τρία βασικά δομικά συστατικά την κυτταρίνη, τις ημικυτταρίνες και τη λιγνίνη (Σχήμα 3.1) (Burner et al., 2009). Η δράση της προεπεξεργασίας στοχεύει στη λύση των δεσμών μεταξύ των ημικυτταρινών, στην επίδραση της κρυσταλλικής δομής της κυτταρίνης και στην αλλαγή του περιεχομένου της λιγνίνης. Ανάλογα με την πηγή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας διαφοροποιούνται οι αναλογίες των δομικών συστατικών της και οι απαιτήσεις κατεργασίας από τη μέθοδο της προεπεξεργασίας. Αρχικά, η κυτταρίνη αποτελεί το βασικότερο συστατικό των φυτών καθώς καταλαμβάνει το μεγαλύτερο ποσοστό με τιμές που κυμαίνονται μεταξύ 40-50%. Από την άλλη, το περιεχόμενο σε ημικυτταρίνες κυμαίνεται συνήθως σε τιμές 20-40% και τέλος το περιεχόμενο των λιγνοκυτταρινούχων φυτών σε λιγνίνη βρίσκεται σε χαμηλότερο ποσοστό ανάλογα με την πηγή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Όσον αφορά την κυτταρίνη, οι στοιχειώδεις δομές της οργανώνονται σε μορφή ινών σχηματίζοντας συσσωμάτωμα 36 αλυσίδων γλυκάνης σε δομή εξαγώνου (Vidal et al., 2011). Η γλυκάνη είναι πολυσακχαρίτης -96-

117 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία της D-γλυκόζης, όπου τα μονομερή είναι συνδεδεμένα με β-γλυκοσιδικούς δεσμούς. Η γεωμετρία αυτή προσφέρει στην κυτταρίνη πυκνές κρυσταλλικές περιοχές που αποτελούν το 50-90% του συνόλου και το υπόλοιπο ποσοστό αποτελείται από λιγότερο οργανωμένες άμορφες περιοχές (Foyle et al., 2007). Η υδρόλυση της κυτταρίνης έχει ως προϊόν αποκλειστικά τη γλυκόζη. Καθώς, η κυτταρίνη βρίσκεται σε αφθονία στη φύση σε ποσοστό 40% της οργανικής ύλης (Παππάς, 2010), η λιγνοκυτταρινική βιομάζα αποτελεί πρώτης τάξης πηγή υδατανθράκων. Σχήμα 3.1. Δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Οι ίνες της κυτταρίνης όπως περιβάλλονται από ημικυτταρίνες και λιγνίνη. Οι επόμενες βασικές δομές της βιομάζας - οι ημικυτταρίνες - περιβάλλουν τις ίνες της κυτταρίνης δημιουργώντας ένα δίκτυο ομοιοπολικών και μη-ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ της κυτταρίνης και των ημικυτταρινών αυξάνοντας με αυτό τον τρόπο τη σταθερότητα του πλέγματος κυτταρίνης ημικυτταρινών λιγνίνης (Σχήμα 3.1). Η δομή των ημικυτταρινών διαφέρει ανάλογα με το είδος του φυτού καθώς αποτελεί ένα ετερογενές φυσικό -97-

118 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία πολυμερές με διαφορετική σύνθεση των πολυσακχαριτικών αλυσίδων του ανάλογα με την προέλευση του. Τα πιο συνηθισμένα δομικά μονομερή σάκχαρα των ημικυτταρινών στα αγρωστώδη φυτά είναι στην κατηγορία των πεντοζών: η ξυλόζη και η αραβινόζη και στην κατηγορία των εξοζών: η γλυκόζη, η γαλακτόζη και η μαννόζη (Foyle, 2007). Η τρίτη βασική δομική μονάδα του φυτού - η λιγνίνη - είναι βασικό δομικό συστατικό των φυτών και του ξύλου και αποτελεί το 15-40% w/w της ξηρής βιομάζας των ξυλωδών φυτών. Συγκεκριμένα, πρόκειται για μακρομόριο με βάση τη φαινυλική προπανοϊκή δομή (Doherty et al., 2011). Αποτελεί ένα υδροφοβικό υλικό που γεμίζει το χώρο γύρω από την κυτταρίνη διατηρώντας τη συνοχή της κρυσταλλικής της δομής, κρατώντας μακριά την υγρασία. Επίσης λειτουργεί προστατευτικά σε βιολογικές επιθέσεις διότι έχει αντιμικροβιακές ιδιότητες, το ίδιο και τα προϊόντα που προέρχονται από αυτήν. Οι ομοιοπολικοί δεσμοί της λιγνίνης που σχηματίζονται με άλλους πολυσακχαρίτες και κυρίως τις ημικυτταρίνες παρεμποδίζουν την προσβασιμότητα των ενζύμων που υδρολύουν τους πολυσακχαρίτες και αποτρέπει την εκχύλιση των υδατανθράκων σε υδατικούς διαλύτες. Σύμφωνα με την παραπάνω αναφερθείσα δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας προκύπτει η ανάγκη να υπερβούν οι δεσμοί μεταξύ των τριών αυτών δομικών συστατικών. Η απαίτηση να μεσολαβήσει ένα στάδιο θερμοχημικής διεργασίας της βιομάζας είναι φανερή, ώστε να ληφθεί η διαθέσιμη κυτταρίνη στο ακόλουθο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. Η προεπεξεργασία, ανάλογα με τη μέθοδο που εφαρμόζεται και τις αποδόσεις που παρουσιάζει η κάθε μία προσαρμοσμένη στις ανάγκες της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, επιτρέπει την ενίσχυση της απόδοσης σε γλυκόζη, του επόμενου σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης, εώς και 3 φορές (da Costa Sousa et al., 2009). Το στάδιο της προεπεξεργασίας έχει ως στόχο την απελευθέρωση των ημικυτταρινών από τη λιγνοκυτταρίνη, τη διαλυτοποίηση τους σε μονομερή σάκχαρα καθώς και την αύξηση της ειδικής επιφάνειας της κυτταρίνης, ώστε να ενισχυθεί η αποτελεσματικότητα της ενζυμικής υδρόλυσης (Σχήμα 3.2). Η σημαντικότητα της προεπεξεργασίας ορίζεται από τη δράση της στα βασικά χαρακτηριστικά της βιομάζας, ξεκινώντας από το βαθμό κρυσταλλικότητας του υλικού (Alvira et al., 2010). Ο βαθμός κρυσταλλικότητας επηρεάζεται με τον εξής τρόπο: η απομάκρυνση των άμορφων περιοχών της δομής της λιγνοκυτταρίνης, που αποτελούν πιο εύκολα διαθέσιμες περιοχές προς υδρόλυση, αυξάνει το βαθμό κρυσταλλικότητας. Η κρυσταλλικότητα δε συνδέεται απαραίτητα με τη διαθέσιμη επιφάνεια και το μέγεθος των -98-

119 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία σωματιδίων. Επιπρόσθετα, η προεπεξεργασία επεμβαίνει αλλάζοντας τόσο το βαθμό πολυμερισμού όσο και την κρυσταλλικότητα της βιομάζας, που αποτελούν σημαντικά χαρακτηριστικά του προεπεξεργασμένου υλικού για την αποτελεσματικότητα της ενζυμική της υδρόλυση. Η μείωση του βαθμού πολυμερισμού, που επιφέρει η προεπεξεργασία, επιτρέπει στη συνέχεια τις κατάλληλες κυτταρινάσες, που είναι επιλεκτικές στο εσωτερικό ή τα άκρα των πολυμερικών αλυσίδων, να διαθέτουν περισσότερες περιοχές για τη δημιουργία ενεργών συμπλόκων. Ακολούθως, το εμπόδιο της λιγνίνης αποτελεί τροχοπέδη κατά την επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας προς παραγωγή βιοαιθανόλης. Η λιγνίνη είτε καταλαμβάνει διαθέσιμη επιφάνεια της κυτταρίνης είτε προσροφάται πάνω στα ένζυμα μειώνοντας τη δραστικότητα τους. Εδώ υπεισέρχεται η δράση της προεπεξεργασίας, η οποία στοχεύει στην υπέρβαση του εμποδίου της λιγνίνης με διαφορετικό τρόπο για κάθε μία εκ των μεθόδων. Μία αποτελεσματική μέθοδος προεπεξεργασίας κρίνεται από την υπέρβαση του εμποδίου της λιγνίνης είτε απομακρύνοντας την, είτε μετατοπίζοντας την. Σχήμα 3.2. Αλλαγή στη δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας με τη δράση της προεπεξεργασίας. -99-

120 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Επόμενο βασικό χαρακτηριστικό της βιομάζας στο οποίο επεμβαίνει η προεπεξεργασία είναι το περιεχόμενο σε ημικυτταρίνες, καθώς η διαλυτοποίηση τους αυξάνει το μέγεθος των πόρων του υλικού. Έτσι, προκύπτει ένα εμπλουτισμένο ρεύμα μονομερών σακχάρων που μπορεί να χρησιμοποιηθεί απευθείας για ζύμωση με μικροοργανισμούς. Η διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών κρίνεται αποτελεσματική όταν μεγάλο ποσοστό των ημικυτταρινών ανακτάται και δεν ακολουθείται από αποικοδόμηση των μονομερών σακχάρων. Το ρεύμα εξόδου της προεπεξεργασίας που περιλαμβάνει τα διαλυτοποιημένα μονομερή σάκχαρα των ημικυτταρινών μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε απευθείας ζύμωση εάν δε περιλαμβάνει παραπροϊόντα της προεπεξεργασίας που δρουν παρεμποδιστικά στη ζύμωση. Τα κριτήρια που πρέπει να πληροί μία επιτυχημένη μέθοδος προεπεξεργασίας είναι αρχικά η παραλαβή των σακχάρων ή η δημιουργία των κατάλληλων συνθηκών ώστε να ακολουθήσει σε επόμενο στάδιο επεξεργασίας η παραλαβή τους. Η ιδανική κατεργασία οφείλει να παράγει ένα στερεό υλικό ενυδατωμένο με σπασμένους δεσμούς που μπορεί εύκολα να υδρολυθεί χωρίς το σχηματισμό παρεμποδιστικών ενώσεων. Επομένως, είναι σημαντική η μεγιστοποίηση του συντελεστή μετατροπής κατά το επόμενο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης, ένας παράγοντας που εξαρτάται από το ποσοστό αποικοδόμησης των υδατανθράκων. Η αποικοδόμηση καταλήγει είτε στο σχηματισμό ανεπιθύμητων παραπροϊόντων ή παρεμποδιστικών ουσιών για τα επικείμενα στάδια της ενζυμικής υδρόλυσης και της ζύμωσης ή στην απώλεια ποσοστού των ζυμώσιμων σακχάρων. Τέλος, η αξιολόγηση της μεθόδου βασίζεται στην ελαχιστοποίηση του ποσού χρήσης ενέργειας, χημικών ουσιών και βιομάζας, καθώς η συγκράτηση αυτών των μεγεθών μειώνει το κόστος παραγωγής βιοενέργειας από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα και καθιστά συνολικά αποδοτικότερη τη διεργασία. Ένα επιπλέον κριτήριο που συνδέεται με την αξιολόγηση της μεθόδου προεπεξεργασίας είναι ο συνδυαστικός συντελεστής έντασης του σταδίου (CSF), που ορίζεται ως το συνδυαστικό αποτέλεσμα της θερμοκρασίας, του χρόνου αντίδρασης και της οξύτητας του υδρολύματος (Agbor et al., 2011). Οι μέθοδοι προεπεξεργασίας κατατάσσονται στις παρακάτω γενικές κατηγορίες: (α) φυσικές μέθοδοι (κονιορτοποίηση, άλεση), (β) φυσικοχημικές μέθοδοι (εκτόνωση υπ ατμόν, εκτόνωση με CO2, αποΐνωση με αμμωνία), (γ) χημικές μέθοδοι (υδρόλυση με -100-

121 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία συμπυκνωμένο οξύ, με αραιό οξύ, με οργανικούς διαλύτες, αλκαλική υδρόλυση), (δ) βιολογικές μέθοδοι, (ε) ηλεκτρικές μέθοδοι (Kumar P. et al., 2009). (α) Φυσικές Μέθοδοι: Μηχανική Άλεση. Το αρχικό στάδιο της άλεσης έχει στόχο τη μείωση του μεγέθους του υλικού της βιομάζας ώστε να είναι ευκολότερη η επεξεργασία του. Εφόσον μειώνεται ο λόγος της ελεύθερης επιφάνειας προς τον όγκο και ο βαθμός κρυσταλλικότητας της κυτταρίνης που περιέχεται στη βιομάζα διευκολύνεται η μετέπειτα δράση των ενζύμων κατά το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. Η επιλογή της μεθόδου μηχανικής επεξεργασίας ορίζεται από το επιθυμητό τελικό μέγεθος του υλικού της βιομάζας. Συγκεκριμένα, το μέγεθος της επεξεργασμένης βιομάζας είναι mm σε μορφή ρινίσματος και 0,2-2 mm μετά από τη χρήση μύλου ή άλεσμα (Sun & Cheng 2002). (β) Φυσικοχημική Προεπεξεργασία: β.1) Εκτόνωση με Ατμό. Η μέθοδος της εκτόνωσης με ατμό είναι μία από τις πιο διαδεδομένες μεθόδους προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Κατά τη διαδικασία αυτή, η βιομάζα χειρίζεται με κορεσμένο ατμό υψηλής πίεσης, στη συνέχεια η πίεση μειώνεται απότομα με συνέπεια η βιομάζα να υποστεί αποσυμπίεση με τη συνοδεία έκρηξης. Η πίεση που εφαρμόζεται κυμαίνεται μεταξύ 20 και 50 bar και η θερμοκρασία ανάμεσα στους 210 και 290 o C. Ο λόγος της ανάκτησης ξυλόζης/ σακχάρων κατά το στάδιο της εκτόνωσης με ατμό κυμαίνεται μεταξύ 45-65% (Hamenlick et al., 2005). Επίσης στη μέθοδο αυτή έχουν εφαρμοστεί διάφορες παραλλαγές με παρουσία ή όχι χημικών καταλυτών (π.χ. θειικό οξύ, διοξείδιο του θείου, υδροξείδιο του νατρίου και αμμωνία), πριν την εκτόνωση με ατμό (da Costa Sousa et al., 2009, Ewanick & Bura 2011). Μειονέκτημα της μεθόδου είναι η κατά τμήματα αποικοδόμηση των ημικυτταρινών που προκαλεί απώλειες μονομερών σακχάρων. (β.2) Αποΐνωση με Αμμωνία (AFEX-Αmmonia Fiber Explosion): Κατά τη μέθοδο της αποΐνωσης με αμμωνία η βιομάζα επεξεργάζεται με υγρή αμμωνία σε υψηλή θερμοκρασία ανάμεσα στους 70 και 200 o C και υψηλή πίεση μεταξύ των 6-28 bar ( psi) για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα και στη συνέχεια η πίεση μειώνεται απότομα. Η μέθοδος αυτή έχει σαν αποτέλεσμα την υδρόλυση των ημικυτταρινών, το σπάσιμο των κρυσταλλικών δεσμών της κυτταρίνης, το άνοιγμα των πόρων των κυτταρικών τοιχωμάτων και την απομάκρυνση της λιγνίνης. Συνεπώς αυξάνει την απόδοση της ενζυμικής υδρόλυσης. Η ανάκτηση της ξυλόζης που έχει παρατηρηθεί φτάνει το 70% (Bals et al., -101-

122 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία 2010). Μειονέκτημα της μεθόδου είναι η χρήση μεγάλης ποσότητας αμμωνίας και η ανάγκη για προσθήκη ρεύματος ανακύκλωσης της. (β.3) Αποσυμπίεση με Διοξείδιο του Άνθρακα: H μέθοδος της αποσυμπίεσης με CO2 είναι παρόμοια με την εκτόνωση με ατμό με τη διαφορά ότι αντικαθιστά το χειρισμό της βιομάζας με CO2 υψηλής πίεσης και επακόλουθη εκτόνωση. Η μέθοδος αυτή απαιτεί μεν χαμηλότερη θερμοκρασία από τον ατμό και χαμηλότερο κόστος από την αμμωνία, οδηγεί δε σε χαμηλότερα ποσοστά απελευθέρωσης γλυκόζης κατά το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. (γ) Χημική Επεξεργασία: (γ.1) Οζονόλυση. Η επεξεργασία με όζον μειώνει το περιεχόμενο της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας σε λιγνίνη. Συγκεκριμένα αυξάνει την προσβασιμότητα του υλικού στις κυτταρινάσες χωρίς να παράγει τοξικά παραπροϊόντα. Οι ημικυτταρίνες επηρεάζονται ελάχιστα και η κυτταρίνη καθόλου. Οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε θερμοκρασία δωματίου και σε συνθήκες κανονικής πίεσης. Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι η μεγάλη ποσότητα όζοντος που απαιτείται, γεγονός που καθιστά τη μέθοδο οικονομικά απαιτητική. (γ.2) Όξινη Υδρόλυση. (γ.2.1) Όξινη Υδρόλυση με Συμπυκνωμένο Οξύ. Τα συμπυκνωμένα οξέα όπως το θειικό οξύ (Η2SO4) και το υδροχλωρικό οξύ (ΗCl) χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία της βιομάζας και την υδρόλυση των γλυκοσιδικών δεσμών. Έχει αναφερθεί ότι παρουσιάζουν θετικό αποτέλεσμα τόσο κατά την υδρόλυση των ημικυτταρινών όσο και στο μετέπειτα στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας κατά το οποίο απελευθερώνεται μεγαλύτερο ποσοστό μονομερών σακχάρων της κυτταρίνης. Παράλληλα όμως, αναφέρονται σημαντικά μειονεκτήματα που αφορούν την παραγωγή παρεμποδιστικών χημικών ενώσεων που προέρχονται από την αποικοδόμηση των μονομερών σακχάρων, της λιγνίνης και των πολυσακχαριτών. Τέλος, οι ισχυροί χημικοί διαλύτες, σε μεγάλες συγκεντρώσεις, είναι διαβρωτικοί για τον εξοπλισμό που χρησιμοποιείται, τοξικοί για το υδρόλυμα και τις ακόλουθες βιοτεχνολογικές διεργασίες και έχουν υψηλό κόστος. (γ.2.2) Όξινη Υδρόλυση με Αραιό Οξύ. Η χρήση αραιού θειικού οξέος έχει ευρεία εφαρμογή δεδομένου ότι είναι πιο αποτελεσματική και οικονομική. Κύριος σκοπός της μεθόδου είναι η διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών σε μονομερή σάκχαρα (ξυλόζη, αραβινόζη, γαλακτόζη, γλυκόζη και μαννόζη) καθώς και άλλα ολιγομερή, βελτιώνοντας με αυτόν τον -102-

123 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία τρόπο την ενζυμική μετατροπή της κυτταρίνης. Το εύρος των παραγόντων που εφαρμόζονται κυμαίνεται μεταξύ ο C θερμοκρασία, 0,5-2,5% w/v περιεκτικότητα θειικού οξέος, min χρόνο υδρόλυσης και 5-10% περιεκτικότητα στερεού υλικού. Οι μέγιστες αποδόσεις μετατροπής ημικυτταρινών κυμαίνονται μεταξύ 70-94% (Mosier et al., 2005, Lloyd & Wyman, 2005). Η επίτευξη υψηλών αποδόσεων μετατροπής σε ξυλόζη είναι πολύ σημαντική διότι η ξυλόζη αποτελεί μεγάλο ποσοστό, περίπου το ένα τρίτο, των δομικών πολυσακχαριτών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας (Hinman et al., 1992). (γ.3) Αλκαλική Υδρόλυση. Ορισμένες βάσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την προκατεργασία λιγνοκυτταρινικών υλικών και το αποτέλεσμα της κατεργασίας εξαρτάται από το περιεχόμενο της βιομάζας σε λιγνίνη. Συγκεκριμένα η χρήση αλκαλίων έχει τη δυνατότητα να διαφοροποιεί τη σύσταση της λιγνίνης και ως αποτέλεσμα να αυξάνει την πεπτικότητα της βιομάζας. Η μέθοδος αυτή απαιτεί χαμηλότερες θερμοκρασίες και πιέσεις σε σχέση με άλλες μεθόδους προκατεργασίας, απομακρύνει περίπου το 33% της λιγνίνης και το 100% των ακετυλο-ομάδων. Επίσης, η αποικοδόμηση των πολυπεπτιδίων προς σάκχαρα αναμένεται μικρότερη από ότι με τη χρήση συμπυκνωμένων οξέων λόγω της ηπιότερης φύσης των αλκαλίων (Rabelo et al., 2009). Παρά τις ήπιες συνθήκες που επικρατούν σε αυτή την αντίδραση, οι χρόνοι που απαιτούνται είναι της τάξεως των ωρών και ημερών ακόμα, σε σχέση με τα δευτερόλεπτα ή τα λεπτά που απαιτεί η όξινη υδρόλυση. Η απόδοση σε ξυλόζη είναι 60-75% σύμφωνα με τους Reith et al (2002). (γ.4) Υδρόλυση με οργανικούς διαλύτες. Σε αυτή τη μέθοδο χρησιμοποιούνται οργανικοί διαλύτες ή υδατικά μίγματα οργανικών διαλυτών με ανόργανους οξικούς καταλύτες (ΗCl ή Η2SO4) ώστε να διασπάσουν τους εσωτερικούς δεσμούς της λιγνίνης με τις ημικυτταρίνες. Οι διαλύτες που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι η αιθανόλη, η μεθανόλη, η ακετόνη, η αιθυλενογλυκόλη, τριαιθυλενογλυκόλη και η τετραϋδροφουρφουράλη. Αντί των ανόργανων οξέων μπορούν να χρησιμοποιηθούν και οργανικά όπως το οξαλικό, το ακετυλοσαλικυλικό, και το σαλικυλικό οξύ (Li et al., 2010). (δ) Βιολογική Προεπεξεργασία. Η βιολογική προεπεξεργασία χρησιμοποιεί διαφόρων τύπων μύκητες που είναι φιλικοί προς το περιβάλλον. Δε καταναλώνει μεγάλα ποσά ενέργειας για την απομάκρυνση της λιγνίνης όπως οι φυσικές, φυσικοχημικές και οι χημικές μέθοδοι. Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται κατά κύριο λόγο είναι οι μύκητες λευκής και μαλακής σήψης που στοχεύουν στην κυτταρίνη και τη λιγνίνη καθώς και οι καφέ σήψης -103-

124 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία μύκητες που στοχεύουν κυρίως στην κυτταρίνη. Η βιολογική προεπεξεργασία αποτελεί σημαντικό πεδίο έρευνας. Συγκεκριμένα, μελετάται ο συνδυασμός της βιολογικής προεπεξεργασίας με άλλες μεθόδους προκατεργασίας όπως χημική και αλκαλική υδρόλυση. Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι ο χρόνος που απαιτείται για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών καθώς και απώλεια ποσοστού της κυτταρίνης την οποία χρησιμοποιεί ως πηγή άνθρακα ο μικροοργανισμός. (ε) Ηλεκτρική Προεπεξεργασία: Προεπεξεργασία με παλμικό ηλεκτρικό πεδίο. Η προκατεργασία αυτή περιλαμβάνει την εφαρμογή μίας σύντομης έκρηξης υψηλής τάσης σε δείγμα που τοποθετείται ανάμεσα σε δύο ηλεκτρόδια. Το ηλεκτρικό αυτό πεδίο επηρεάζει τη δομή των φυτικών ιστών, αυξάνοντας τη διαπερατότητα της μάζας. Στον Πίνακα 3.1 απεικονίζεται μία συγκεντρωτική σύγκριση των μεθόδων προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Από την αξιολόγηση των υπαρχόντων τεχνολογιών προεπεξεργασίας γίνεται φανερό ότι η προεπεξεργασία με αραιό οξύ συμβάλλει στην υψηλή διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών των διαφόρων τύπων λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Επίσης η όξινη προεπεξεργασία με ήπιες συνθήκες έχει τους λιγότερους παρεμποδιστικούς παράγοντες για τη ζύμωση και αυξάνει σημαντικά την περαιτέρω υδρόλυση της κυτταρίνης

125 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Πίνακας 3.1. Διαφορετικές μέθοδοι προεπεξεργασίας λιγνοκυτταρινικής βιομάζας συγκρινόμενοι ως προς τα πλεονεκτήματα και τους περιορισμούς τους. Μέθοδος Προεπεξεργασίας Πλεονεκτήματα Περιορισμοί Μηχανική κονιορτοποίηση Εκτόνωση με ατμό Αποΐνωση με αμμωνία (AFEX) Εκτόνωση με CO2 Οζονόλυση Όξινη υδρόλυση με συμπυκνωμένο οξύ Όξινη υδρόλυση με αραιό οξύ Μειώνει την κρυσταλλικότητα της κυτταρίνης. Προκαλεί την αποικοδόμηση της ημικυτταρίνης και τον μετασχηματισμό της λιγνίνης, οικονομικά αποδοτικό. Αυξάνει τη δραστική επιφάνεια, απομακρύνει ως ένα βαθμό τη λιγνίνη και τις ημικυτταρίνες, δεν παράγει παρεμποδιστικές ενώσεις. Αυξάνει τη δραστική επιφάνεια, οικονομικά αποδοτικό, δεν παράγει παρεμποδιστικές ενώσεις. Μειώνει το περιεχόμενο σε λιγνίνη, δεν παράγει τοξικά υπολείμματα. Υδρολύει την ημικυτταρίνη σε μονομερή σάκχαρα, αλλάζει τη δομή της λιγνίνης. Υψηλός βαθμός διαλυτοποίησης της ημικυτταρίνης σε μονομερή σάκχαρα, αλλάζει τη δομή της λιγνίνης. Η κατανάλωση ενέργειας είναι συνήθως υψηλότερη από την ενέργεια που θα παραχθεί από την βιομάζα. Καταστροφή ενός τμήματος των ημικυτταρινών, ατελές σπάσιμο των δεσμών της λιγνίνης με το πλέγμα των υδρογονανθράκων, παραγωγή παρεμποδιστικών ενώσεων. Δεν είναι αποτελεσματική μέθοδος για τη βιομάζα με υψηλή περιεκτικότητα λιγνίνης. Δεν τροποποιεί τη λιγνίνη και την ημικυτταρίνη. Απαιτείται μεγάλη ποσότητα όζοντος, δαπανηρή. Δαπανηρή, διάβρωση εξοπλισμού, σχηματισμός τοξικών ουσιών. Παραγωγή υπολείμματος γύψου κατά την ουδετεροποίηση του διαλύματος

126 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Μέθοδος Προεπεξεργασίας Πλεονεκτήματα Περιορισμοί Αλκαλική υδρόλυση Υδρόλυση με οργανικούς διαλύτες Παλμικό ηλεκτρικό πεδίο Βιολογική προεπεξεργασία Απομακρύνει τις ημικυτταρίνες και τη λιγνίνη, αυξάνει την δραστική επιφάνεια. Υδρολύει τη λιγνίνη και τις ημικυτταρίνες. Ήπιες συνθήκες, διασπά τα κύτταρα των φυτών, απλός εξοπλισμός. Αποικοδομεί τις ημικυτταρίνες και τη λιγνίνη, χαμηλές ενεργειακές απαιτήσεις. Μεγάλος χρόνος υδρόλυσης, σχηματισμός αλάτων, τα οποία ενσωματώνονται στη βιομάζα. Οι διαλύτες στραγγίζονται από τον αντιδραστήρα, εξατμίζονται, συμπυκνώνονται και ανακυκλώνονται, υψηλό κόστος. Απαραίτητη περαιτέρω έρευνα. Χαμηλός ρυθμός υδρόλυσης

127 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Η αραιή όξινη υδρόλυση παράγει σάκχαρα τα οποία είναι ζυμώσιμα (κυρίως ξυλόζη) από μικροοργανισμούς που καταναλώνουν πεντόζες ή από μηχανικά τροποποιημένες ζύμες προς παραγωγή βιοαιθανόλης και βιοχημικών υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η απόδοση του σταδίου αυτού σε ξυλόζη και μετατροπή ημικυτταρινών είναι υψηλή. Επιπρόσθετα, η κυτταρίνη που προκύπτει ως στερεό υπόλειμμα από την αραιή όξινη υδρόλυση είναι διαμορφωμένη κατάλληλα ώστε αποδίδει στη συνέχεια υψηλές αποδόσεις σε γλυκόζη κατά την ενζυμική υδρόλυση. Αναφορικά με την κρυσταλλικότητα και το βαθμό πολυμερισμού της βιομάζας, τα δομικά χαρακτηριστικά της αναδιαμορφώνονται ώστε να παραμένει περισσότερη διαθέσιμη επιφάνεια για την προσρόφηση των κυτταρινασών στην επιφάνεια της κυτταρίνης. Η λιγνίνη από την άλλη δεν απομακρύνεται στο διαλυτοποιημένο διάλυμα σακχάρων αλλά παραμένει σε χαμηλό ποσοστό στη στερεή κυτταρίνη. Για την αντιμετώπιση του εμποδίου της λιγνίνης γίνεται χρήση πρωτεϊνών ή επιφανειοδραστικών παράλληλα με τις κυτταρινάσες που στόχο έχουν την προσρόφηση της λιγνίνης μέσω των υδροφοβικών τους δεσμών (Zhang et al., 2011). Οι παρεμποδιστικές ενώσεις που μπορεί να δημιουργηθούν από το χειρισμό της βιομάζας με αραιό θειικό οξύ απομακρύνονται με πλύσιμο με νερό ή ουδετεροποίηση με χαμηλές ποσότητες βάσεων. Περαιτέρω, η συγκεκριμένη μέθοδος απαιτεί μέγεθος σωματιδίων για τη στερεή βιομάζα που επιτυγχάνεται με χαμηλό ενεργειακό κόστος μηχανικής επεξεργασίας. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η αραιή όξινη υδρόλυση μεταφέρει στο στερεό υπόλειμμα μόνο την κυτταρίνη οπότε υπάρχει απαίτηση μόνο ενζύμων που υδρολύουν την κυτταρίνη και όχι ξυλανασών. Τέλος, οι συνθήκες της αραιής όξινης υδρόλυσης είναι ήπιες, δε προκαλούν διάβρωση του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται και δεν κατανα&l