ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ ΚΑΙ ΥΨΗΛΗΣ ΠΡΟΣΤΙΘΕΜΕΝΗΣ ΑΞΙΑΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΠΟ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΙΚΗ ΒΙΟΜΑΖΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΤΟΜΕΑΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ, ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ ΚΑΙ ΕΓΚΑΤΑΣΤΑΣΕΩΝ ΑΝΝΑ Α. ΚΑΡΑΠΑΤΣΙΑ Διπλωματούχος Χημικός Μηχανικός ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ ΚΑΙ ΥΨΗΛΗΣ ΠΡΟΣΤΙΘΕΜΕΝΗΣ ΑΞΙΑΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΠΟ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΙΚΗ ΒΙΟΜΑΖΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2015

2 ΑΝΝΑ Α. ΚΑΡΑΠΑΤΣΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΚΑΥΣΙΜΩΝ ΚΑΙ ΥΨΗΛΗΣ ΠΡΟΣΤΙΘΕΜΕΝΗΣ ΑΞΙΑΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΠΟ ΛΙΓΝΟΚΥΤΤΑΡΙΝΙΚΗ ΒΙΟΜΑΖΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Τομέας Ανάλυσης, Σχεδιασμού και Ρύθμισης των Χημικών Διεργασιών και Εγκαταστάσεων Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: 23 Ιουνίου 2015 ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Καθηγητής Κ. Κυπαρισσίδης, Επιβλέπων Καθηγήτρια Μ. Λιακοπούλου-Κυριακίδου, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Α. Κοκόσης, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγήτρια Α. Ζαμπανιώτου, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγήτρια Α. Λεμονίδου, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Ν. Καλογεράκης, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Δ. Κυριακίδης, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής

3 ΑΝΝΑ Α. ΚΑΡΑΠΑΤΣΙΑ Α.Π.Θ. «Πειραματική μελέτη παραγωγής βιοκαυσίμων και υψηλής προστιθέμενης αξίας βιοχημικών προϊόντων από λιγνοκυτταρινική βιομάζα» ISBN «Η έγκριση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν 5343/1932, άρθρο 202, παρ.2).

4 Κάθε επίτευγμα, κάθε βήμα προς τα εμπρός στη γνώση, προκύπτει από το θάρρος, από τη σκληρότητα απέναντι στον εαυτό μας, από την καθαρότητα απέναντι στον εαυτό μας. Φ. Νίτσε

5 Έκθεση Πρωτοτυπίας Έκθεση Πρωτοτυπίας Σ τα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε ολοκληρωμένη παραγωγή βιοκαυσίμων και βιοχημικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία παρήχθησαν σε συνδυασμό βιοαιθανόλη και ηλεκτρικό οξύ μέσω μικροβιακών καλλιέργειών που χρησιμοποίησαν ως πρώτη ύλη τα φυσικά σάκχαρα του φυτού Phalaris aquatica L. (φαλαρίδα). Η βιοαιθανόλη αποτελεί λύση στη γενικότερη εξάρτηση από τα ορυκτά καύσιμα, στο πρόβλημα του περιορισμού τους και ταυτόχρονα στη βλαβερή παραγωγή αεριών του θερμοκηπίου κατά τη χρήση τους. Τα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς προέρχονται από την πιο υποσχόμενη πηγή πρώτων υλών λόγω της αφθονίας των λιγνοκυτταρινικών υλικών στη φύση. Η πλούσια σύνθεση των δομικών συστατικών της λιγνοκυτταρίνης οδηγεί σε ένα ευρύ φάσμα προϊόντων και προτείνεται τα τελευταία χρόνια η ολοκληρωμένη επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας μέσω σύγχρονων βιοδιυλιστηρίων που στηρίζονται σε φιλικές τεχνολογίες προς το περιβάλλον. Η ιδέα ενός σύγχρονου βιοδιυλιστηρίου προωθεί τη συνδυασμένη παραγωγή ενός βιοκαυσίμου μεγάλης δυναμικότητας με την παραγωγή ενός τουλάχιστον βιοχημικού υλικού με πιθανότατα μικρότερο μερίδιο αγοράς, αλλά υψηλή προστιθέμενη αξία. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αξιοποιείται πλήρως για πρώτη φορά το λιγνοκυτταρινικό φυτό Phalaris aquatica (φαλαρίδα) που αποτελεί Μεσογειακό είδος με υψηλή παραγωγή βιομάζας και πλούσια πηγή φυσικών πολυσακχαριτών. Το πρώτο από τα βασικά στάδια της διεργασίας μετατροπής της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας σε βιοαιθανόλη και ηλεκτρικό οξύ είναι η αποτελεσματική προεπεξεργασία της βιομάζας, στοχεύοντας στην αλλαγή της δομικής της σύστασης, στην απομάκρυνση ή στη διαφοροποίηση των δεσμών της λιγνίνης και στην υδρόλυση των ημικυτταρινών. Το στάδιο σημείωσε σημαντική μετατροπή των ημικυτταρινών και υψηλή συγκέντρωση της ξυλόζης και των συνολικών σακχάρων. Η -i-

6 Έκθεση Πρωτοτυπίας στερεή βιομάζα που παραλαμβάνεται από τις βέλτιστες εφαρμοζόμενες συνθήκες της προεπεξεργασίας διαθέτει το χαμηλότερο βαθμό κρυσταλλικότητας και εφαρμόζεται για τη βελτιστοποίηση του δεύτερου κύριου σταδίου της διεργασίας, της ενζυμικής υδρόλυσης. Η στατιστική ανάλυση του πειραματικού σχεδιασμού οδηγεί σε υψηλές αποδόσεις του σταδίου και ικανοποιητική παραγωγή γλυκόζης. Επιπρόσθετα, η συγκέντρωση της γλυκόζης αυξήθηκε με εφαρμογή ημι-συνεχούς τροφοδοσίας στερεής βιομάζας και ταυτόχρονη τροφοδοσία ενζύμου με μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης του υδρολύματος. Εν συνεχεία, το ρεύμα εξόδου της ενζυμικής υδρόλυσης (υδρόλυμα), που διαθέτει αφθονία μονομερών σακχάρων (γλυκόζη), χρησιμοποιήθηκε στην παραγωγή του τελικού προϊόντος της αιθανόλης. Κατά τη ζύμωση από τον μικροοργανισμό S. cerevisiae, οι παράμετροι που επηρεάζουν τις συνθήκες του βιο-συστήματος μελετήθηκαν μέσω πειραματικού σχεδιασμού σε ασυνεχείς συνθήκες, καθώς και σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις σακχάρων. Ο πειραματικός στατιστικός σχεδιασμός μελέτησε την επίδραση του αερισμού, της πηγής αζώτου, του ph, του είδους του στελέχους και του μεγέθους του ενοφθαλμίσματος στη διαμόρφωση πλαισίου λειτουργίας για τη μεγιστοποίηση της απόδοσης σε αιθανόλη (%). Οι συνθήκες ημι-συνεχούς λειτουργίας, οι οποίες καταστρώθηκαν εμπειρικά με διαφορετικό ρυθμό τροφοδοσίας (σταθερό ή εκθετικό), επιτάχυναν την παραγωγή της βιοαιθανόλης μεγιστοποιώντας την παραγωγικότητα της μεθόδου σε σχέση με τις τιμές της βιβλιογραφίας. Η παρούσα μελέτη έθεσε ως στόχο την ταυτόχρονη παραγωγή ενός βιοκαυσίμου (βιοαιθανόλης) και ενός υλικού προστιθέμενης αξίας (ηλεκτρικού οξέος). Το υδρόλυμα που προέρχεται από την υδρόλυση των ημικυτταρινών ( ξυλόζη) και το υδρόλυμα που προέρχεται από την υδρόλυση της κυτταρίνης (γλυκόζη) χρησιμοποιούνται ως πηγές άνθρακα για το αναερόβιο βακτήριο A. succinogenes. Η συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος για το βέλτιστο συνδυασμό είναι ικανοποιητική και η μεταφορά των βέλτιστων συνθηκών της ζύμωσης στο βιοαντιδραστήρα με σύγκριση της διαφορετικής παροχής CO2, συνεχή και ασυνεχή κατά περίπτωση, αύξησε τη συγκέντρωση και την απόδοση. Ο συνδυασμός της παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος με ζύμωση των σακχάρων που προέρχονται από την κατεργασία της βιομάζας, θα μπορούσε να καταστήσει πιο οικονομικά εφικτό το εγχείρημα του βιοδιυλιστηρίου. Η τεχνοοικονομική μελέτη για την αποτίμηση της διεργασίας για δεδομένη διάρκεια ζωής της μονάδας για 20 χρόνια προέβλεψε μια σχετικά μικρή απόδοση -ii-

7 Έκθεση Πρωτοτυπίας του κεφαλαίου. Συνεπώς, η παραγωγή βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη βιοχημική κατεργασία της φαλαρίδας αποτελεί μία οριακά κερδοφόρα επένδυση, με υψηλό ρίσκο. Τα παραπάνω πρωτότυπα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής οδήγησαν στις παρακάτω δημοσιεύσεις σε επιστημονικά περιοδικά και σε ειδικές εκδόσεις επιστημονικών συνεδρίων: Karapatsia A., Penloglou G., Pappas I., Kiparissides C., 2014, Bioethanol production via the fermentation of Phalaris aquatica L. hydrolysate, Chemical Engineering Transactions, 37, Karapatsia A., Penloglou G., Chatzidoukas C., Kiparissides C., 2014, Development of a Macroscopic Model for the Production of Bioethanol with High Yield and Productivity via the Fermentation of Phalaris aquatica L. Hydrolysate, Computer Aided Process Engineering, accepted for publication. Karapatsia A., Penloglou G., Chatzidoukas C., Kiparissides C, 2014, Fed-batch Saccharomyces cerevisiae fermentation of hydrolysate sugars: A dynamic model-based approach for high yield bioethanol production, Biomass and Bioenergy, under review process. Karapatsia A., Penloglou G., Pappas I., Kotrotsiou O., Kiparissides C., 2014, Dilute acid pretreatment optimization of Phalaris aquatica L. lignocellulosic biomass towards bioethanol production, Renewable Energy,, under review process. Karapatsia A., Penloglou G., Pappas I., Kiparissides C., 2013, An Integrated Approach for the Production of Bioethanol and High Value Bio-Products From Lignocellulosic Biomass, Annual Meeting of American Institute of Chemical Engineers (AICHE), San Francisco, USA. Karapatsia A., Penloglou G., Pappas I.A. Kiparissides C, 2013, (Poster), Fermentation of Sugars from Phalaris aquatica L. Hydrolysate for Bioethanol Production, 21 st European Biomass Conference and Exhibition, Copenhagen, Denmark. Pappas I.A., Karapatsia A., Penloglou G., Kiparissides C, 2013, (Poster), Enzymatic conversion of Phalaris aquatica L. lignocellulosic biomass into fermentable sugars for bioethanol production, 21 st European Biomass Conference and Exhibition, Copenhagen, Denmark. -iii-

8 Έκθεση Πρωτοτυπίας Kαραπατσιά Α., Πενλόγλου Γ., Παππάς Ι.Α., Κυπαρισσίδης Κ., 2013, «Μελέτη και Βελτιστοποίηση της Παραγωγής Βιοαιθανόλης 2ης Γενιάς κατά την ολοκληρωμένη επεξεργασία της Λιγνοκυτταρινικής Βιομάζας του φυτού Phalaris aquatica L.», 9ο ΠΕΣΧΜ: Η Συμβολή της Χημικής Μηχανικής στην Αειφόρο Ανάπτυξη, Αθήνα, Ελλάδα. Karapatsia Α., Pappas Ι.Α., Penloglou G., Kiparissides C., 2012, On the bioconversion of Phalaris aquatica L. lignocellulosic biomass into biofuels and high added-value chemicals, Biofuels for Sustainable Development of Southern Europe (Bio4SuD), November 2012, Thessaloniki, Greece. -iv-

9 Ευχαριστίες Ευχαριστίες A ρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέπων μου καθηγητή Κωνσταντίνο Κυπαρισσίδη για την ευκαιρία που μου έδωσε πριν από τέσσερα χρόνια να συμμετάσχω στο δυναμικό του εργαστηρίου Χημικής Μηχανικής Β του τμήματος Χημικών Μηχανικών, του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου και του εργαστηρίου Μηχανικής Πολυμερών και Βιοχημικής του Εθνικού Κέντρου Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης. Η επίβλεψη και η καθοδήγηση του ήταν πάντα καίρια και καθοριστική και τον ευχαριστώ για την ηθική και οικονομική υποστήριξη που μου παρείχε όλα αυτά τα χρόνια. Στη συνέχεια, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της τριμελούς μου επιτροπής, την καθηγήτρια Μαρία Λιακοπούλου-Κυριακίδου για την καθοδήγηση της από τα φοιτητικά μου ακόμη χρόνια και τον καθηγητή Αντώνη Κοκόση για τις καθοριστικές του παρεμβάσεις. Η επιστημονική κατάρτιση των τριών καθηγητών της τριμελούς μου επιτροπής αποτέλεσε κίνητρο για την βέλτιστη απόδοση μου κατά τη διεξαγωγή της διδακτορικής μου διατριβής μου. Επίσης, η συνεργασία μου τον τελευταίο χρόνο με το λέκτορα Χρήστο Χατζηδούκα με εξέλιξε ως επιστήμονα χάρη στην πλήρη αφοσίωση που επιδεικνύει στη δουλειά του και τον ευχαριστώ για την άψογη συνεργασία μας. Η συνεισφορά του διδάκτορος Γιάννη Πενλόγλου στη διεξαγωγή της διδακτορικής μου διατριβής ήταν καθοριστική. Τον ευχαριστώ για την ανιδιοτελή του προσφορά γνώσεων και τεχνικών και την άψογη συνεργασία μας. Το κλίμα φιλίας που αναπτύχθηκε μεταξύ μας κατέστησε τη διεκπεραίωση των εργασιών μας πιο ευχάριστη. Επίσης, ευχαριστώ τον διδάκτορα Γιάννη Παππά για το ξεκίνημα της διδακτορικής μου διατριβής σε εξέλιξη

10 Ευχαριστίες της δικής του διατριβής. Οι πειραματικές απαιτήσεις αναλυτικών τεχνικών της εργασίας μου δε θα ολοκληρωνόταν χωρίς τη συνεισφορά της διδάκτορος Ολυμπίας Κοτρώτσιου, την οποία και ευχαριστώ. Φυσικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω το σύνολο του προσωπικού του εργαστηρίου Χημικής Μηχανικής Β για το υψηλό επιστημονικό επίπεδο και το ευχάριστο κλίμα εργασίας και ιδιαίτερα την Αλέκα Πλατίδου και Μαρία Μπλούτσου για τη διεκπεραίωση οποιονδήποτε διαδικαστικών θεμάτων. Τέλος, τη σημαντικότερη υποστήριξη σε κάθε επίπεδο μου προσέφεραν οι αγαπημένοι μου άνθρωποι και η οικογένεια μου με ιδιαίτερη αυτή του συντρόφου μου Σάββα Χαλναρίδη. Ευχαριστώ ακόμα, τις φίλες μου Jovana Milenkovic και Τζουλιάνα Κράια με τις οποίες δημιουργήσαμε μία ευχάριστη εργασιακή καθημερινότητα. Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του ερευνητικού έργου «Αειφόρος Παραγωγή Βιοκαυσίμων και Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Βιοχημικών Προϊόντων από Λιγνοκυτταρινική Βιομάζα ΛΙΓΝΟΦΟΣ», χρηματοδοτούμενου από τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας, Εθνικό Στρατηγικό Πλαίσιο Αναφοράς (ΕΣΠΑ) , Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα & Επιχειρηματικότητα (ΕΠΑΝ ΙΙ).

11 Περίληψη Περίληψη Η αειφόρος παραγωγή βιοαιθανόλης και βιοχημικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας από λιγνοκυτταρινική βιομάζα αποτελεί λύση στη γενικότερη εξάρτηση από τα ορυκτά καύσιμα, στο πρόβλημα του περιορισμού τους και ταυτόχρονα στη βλαβερή παραγωγή αεριών του θερμοκηπίου κατά τη χρήση τους. Η βιοαιθανόλη αποτελεί συμπληρωματικό βιοκαύσιμο της βενζίνης που καταλήγει σε καθαρότερη καύση της, ενώ η παραγωγή της από λιγνοκυτταρινούχα υλικά αποτελεί τη νέα τεχνολογία βιοκαυσίμων δεύτερης γενιάς. Τα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς προέρχονται από την πιο υποσχόμενη πηγή πρώτων υλών λόγω της αφθονίας των λιγνοκυτταρινικών υλικών στη φύση. Καθώς, η σύγχρονη τεχνολογία της παραγωγής βιοαιθανόλης και υψηλής αξίας βιοχημικών προϊόντων απαιτεί την εφαρμογή βιοτεχνολογικών μεθόδων κατά την επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, η αφθονία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας προσφέρει τη δυνατότητα της έστω μερικής αντικατάστασης των παραδοσιακών ορυκτών καυσίμων ως ανανεώσιμη πηγή ενέργειας και η πλούσια σύνθεση των δομικών συστατικών της οδηγεί σε ένα ευρύ φάσμα προϊόντων, προτείνεται τα τελευταία χρόνια η ολοκληρωμένη επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας μέσω σύγχρονων βιοδιυλιστηρίων που στηρίζονται σε φιλικές τεχνολογίες προς το περιβάλλον. Η ιδέα ενός σύγχρονου βιοδιυλιστηρίου προωθεί τη συνδυασμένη παραγωγή ενός βιοκαυσίμου μεγάλης δυναμικότητας με την παραγωγή ενός τουλάχιστον βιοχημικού υλικού με πιθανότατα μικρότερο μερίδιο αγοράς, αλλά υψηλή προστιθέμενη αξία. Για παράδειγμα, το ηλεκτρικό οξύ αποτελεί ένα σημαντικό ενδιάμεσο βιοχημικό προϊόν που παράγεται μικροβιακά, βρίσκει πληθώρα βιομηχανικών εφαρμογών -i-

12 Περίληψη και προσφέρει προστιθέμενη αξία στην ολοκληρωμένη επεξεργασία της βιομάζας. Η μελέτη της παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από λιγνοκυτταρινούχα φυτά είναι ένα σύνθετο αντικείμενο που απαιτεί εξειδικευμένη έρευνα στο κάθε στάδιο της συνολικής διεργασίας και των παραγόντων που διαμορφώνουν το αποτέλεσμα του. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αξιοποιείται πλήρως για πρώτη φορά το λιγνοκυτταρινικό φυτό Phalaris aquatica (φαλαρίδα) που αποτελεί Μεσογειακό είδος με υψηλή παραγωγή βιομάζας (6,3-11 tn/ha) και πλούσια πηγή φυσικών πολυσακχαριτών (σύνολο δομικών υδατανθράκων 698,31 g/kg ΞΜ). Η επεξεργασία του φυτού ακολούθησε ένα ολοκληρωμένο διάγραμμα ροής που μετατρέπει την ξηρή βιομάζα σε βιοαιθανόλη και ηλεκτρικό οξύ. Το πρώτο από τα βασικά στάδια της διεργασίας μετατροπής της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας σε βιοαιθανόλη και ηλεκτρικό οξύ είναι η αποτελεσματική προεπεξεργασία της βιομάζας, στοχεύοντας στην αλλαγή της δομικής της σύστασης, στην απομάκρυνση ή στη διαφοροποίηση των δεσμών της λιγνίνης και στην υδρόλυση των ημικυτταρινών. Ακολουθεί η χρήση των σακχαρολυτικών ενζύμων στο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης της κυτταρίνης, η οποία διαλυτοποιείται παράγοντας μονομερή σάκχαρα (γλυκόζη), τα οποία με τη σειρά τους ζυμώνονται από το σακχαρομύκητα S. cerevisiae προς το τελικό προϊόν της αιθανόλης. Επίσης, τα μονομερή σάκχαρα (κυρίως ξυλόζη), προερχόμενα από την υδρόλυση των ημικυτταρινών, χρησιμοποιούνται για τη μικροβιακή παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος μετά από ένα ενδιάμεσο στάδιο ουδετεροποίησης. Κατά τη μελέτη της ολοκληρωμένης βιοχημικής διεργασίας, βελτιστοποιήθηκαν τα επιμέρους στάδια της με τη χρήση στατιστικών εργαλείων. Το στάδιο της προεπεξεργασίας βελτιστοποιήθηκε ως προς τη συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης, τη μετατροπή των ημικυτταρινών και το βαθμό κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας ως αποτέλεσμα της προεπεξεργασίας στα δομικά χαρακτηριστικά της βιομάζας. Ο βέλτιστος σχεδιασμός της αποτελεσματικής αραιής όξινης υδρόλυσης πραγματοποιήθηκε μέσω στατιστικής ανάλυσης με εφαρμογή πειραματικού σχεδιασμού Taguchi, λαμβάνοντας υπόψη τις σημαντικότερες παραμέτρους της αντίδρασης (θερμοκρασία, περιεκτικότητα οξέος και χρόνος αντίδρασης). Επιπρόσθετα, το στάδιο της προεπεξεργασίας κρίθηκε μέσω του συνδυαστικού συντελεστή έντασης (CSF), ως προς την επίδραση της ένταση των συνθηκών του σταδίου, στη μετατροπή των ημικυτταρινών, στη συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης και στην αποικοδόμηση των μονομερών σακχάρων σε μικρότερες παρεμποδιστικές ενώσεις. -ii-

13 Περίληψη Οι βέλτιστες επιλεγμένες συνθήκες είναι 110 o C θερμοκρασία, 2% w/v περιεκτικότητα θειικού οξέος και 60 min χρόνος αντίδρασης, οι οποίες επέφεραν μετατροπή ημικυτταρινών 75,04%, ελάχιστα χαμηλότερη τιμή από τη μέγιστη που σημειώθηκε σε ιδιαίτερα ισχυρές συνθήκες υδρόλυσης (80,41%). Η συγκέντρωση της ξυλόζης στο βέλτιστο χειρισμό αντιστοιχεί σε τιμή 10,75 g/l και η συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων 20,04 g/l. Αντίστοιχα, η μέγιστη τιμή της παραγόμενης ξυλόζης που σημειώθηκε είναι 15,52 g/l και των συνολικών σακχάρων 21,47 g/l. Στη συνέχεια, η στερεή βιομάζα, η οποία προέρχεται από το βελτιστοποιημένο στάδιο της προεπεξεργασίας και περιλαμβάνει το σύνολο της κυτταρίνης, οδηγήθηκε στο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. Η στερεή βιομάζα που παραλαμβάνεται από τις βέλτιστες εφαρμοζόμενες συνθήκες της προεπεξεργασίας διαθέτει το χαμηλότερο βαθμό κρυσταλλικότητας (61,2%), χαρακτηριστικό που ευνοεί την αποτελεσματική υδρόλυση της κυτταρίνης. Ο πειραματικός σχεδιασμός Box Behnken χρησιμοποιήθηκε για τη βελτιστοποίηση του δεύτερου κύριου σταδίου της διεργασίας, βασισμένος σε τέσσερις ανεξάρτητες μεταβλητές της ενζυμικής υδρόλυσης (περιεκτικότητα στερεής βιομάζας, περιεκτικότητα ενζύμου, συγκέντρωση επιφανειοδραστικού συστατικού και χρόνος αντίδρασης), αξιολογώντας, μέσω στατιστικής ανάλυσης, την επίδραση τους στη μεγιστοποίηση της παραγόμενης γλυκόζης, που οδηγεί σε υψηλότερες αποδόσεις του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης. Οι επιλεγμένες συνθήκες της βελτιστοποίησης είναι 4% w/v η περιεκτικότητα προεπεξεργασμένης βιομάζας, 20 FPU/g βιομάζας η περιεκτικότητα του ενζύμου της κυτταρινάσης, 48 h χρόνος αντίδρασης και 0,04 g/g βιομάζας η συγκέντρωση επιφανειοδραστικού. Ο συνδυασμός των βελτιστοποιημένων παραγόντων κατέληξε σε παραγωγή γλυκόζης 12,3 g/l και απόδοση σε γλυκόζη 64,8%. Επιπρόσθετα, η συγκέντρωση της γλυκόζης αυξήθηκε με εφαρμογή ημι-συνεχούς τροφοδοσίας στερεής βιομάζας και ταυτόχρονη τροφοδοσία ενζύμου ανά διαστήματα των έξι ωρών. Η μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης γλυκόζης του υδρολύματος που σημειώθηκε ήταν 45,5 g/l με απόδοση γλυκόζης 67,9%. Επιπρόσθετα, το ρεύμα εξόδου της ενζυμικής υδρόλυσης (υδρόλυμα), που διαθέτει αφθονία μονομερών σακχάρων (γλυκόζη), χρησιμοποιήθηκε, χωρίς απαιτητικό ενδιάμεσο στάδιο για τη συμπύκνωση του, στην παραγωγή του τελικού προϊόντος της αιθανόλης. Κατά τη ζύμωση από τον μικροοργανισμό S. cerevisiae, οι παράμετροι που επηρεάζουν τις συνθήκες του βιο- -iii-

14 Περίληψη συστήματος μελετήθηκαν μέσω πειραματικού σχεδιασμού Taguchi σε ασυνεχείς συνθήκες, καθώς και οι παρεμποδιστικοί παράγοντες και οι περιορισμοί που θέτουν οι ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με υψηλές συγκεντρώσεις σακχάρων. Ο πειραματικός στατιστικός σχεδιασμός μελέτησε την επίδραση του αερισμού, της πηγής αζώτου, του ph, του είδους του στελέχους και του μεγέθους του ενοφθαλμίσματος στη διαμόρφωση πλαισίου λειτουργίας για τη μεγιστοποίηση της απόδοσης σε αιθανόλη (%). Η συνεισφορά του αζώτου στην καλλιέργεια του σακχαρομύκητα κρίθηκε ως σημαντικά υψηλή, καθώς και η επίδραση του ph και της προέλευσης του στελέχους του μικροοργανισμού αξιολογήθηκαν ως λιγότερο καθοριστικές στο τελικό αποτέλεσμα της απόδοσης σε αιθανόλη. Οι παράγοντες αερισμός και μέγεθος ενοφθαλμίσματος συμμετείχαν ελάχιστα στη διαμόρφωση του τελικού αποτελέσματος. Στη συνέχεια, η εφαρμογή μίας σειράς διαφορετικών πολιτικών τροφοδοσίας κατά τις συνθήκες ημι-συνεχούς λειτουργίας, οι οποίες καταστρώθηκαν εμπειρικά με διαφορετικό ρυθμό τροφοδοσίας (σταθερό ή εκθετικό), επιτάχυνε την παραγωγή της βιοαιθανόλης μεγιστοποιώντας την παραγωγικότητα της μεθόδου και την περιεκτικότητα του ρεύματος εξόδου σε βιοαιθανόλη (7,5% v/v). Η εκθετική πολιτική τροφοδοσίας με υψηλή συγκέντρωση αρχικών σακχάρων πέτυχε 59,1 g/l συγκέντρωση αιθανόλης με σημαντικά υψηλή παραγωγικότητα αιθανόλης (2,2 (g/(l h)). Οι σύγχρονες επιταγές της έρευνας και της αγοράς κατευθύνουν την παραγωγή των βιοκαυσίμων δεύτερης γενιάς από λιγνοκυτταρινική βιομάζα στο συνδυασμό διαφορετικών τελικών προϊόντων σύμφωνα με τις αρχές του σύγχρονου βιοδιυλιστηρίου. Η ιδέα αυτή υλοποιείται ήδη σε βιομηχανίες που μεταφέρουν τη διεργασία της συνδυασμένης παραγωγής ηλεκτρικού οξέος και αιθανόλης σε βιομηχανική κλίμακα. Η παρούσα μελέτη έθεσε ως στόχο την ταυτόχρονη παραγωγή ενός βιοκαυσίμου (βιοαιθανόλης) και ενός υλικού προστιθέμενης αξίας (ηλεκτρικού οξέος). Το υδρόλυμα που προέρχεται από την υδρόλυση των ημικυτταρινών με 21,4 g/l ξυλόζης και το υδρόλυμα που προέρχεται από την υδρόλυση της κυτταρίνης με παραγωγή ως και 45,5 g/l γλυκόζης χρησιμοποιούνται ως πηγές άνθρακα για το αναερόβιο βακτήριο A. succinogenes. Ιδιαίτερη βαρύτητα δόθηκε στη μελέτη της επίδρασης των παραγόντων του περιβάλλοντος (αναλογία σακχάρων, συγκέντρωση σακχάρων, συγκέντρωση ανθρακικού μαγνησίου, συγκέντρωση όξινου φωσφορικού καλίου και συγκέντρωση εκχυλίσματος μαγιάς) στην παραγόμενη συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος, μέσω πειραματικού σχεδιασμού Taguchi. Η πηγή αζώτου (εκχύλισμα μαγιάς) καθώς και η πηγή CO2 -iv-

15 Περίληψη (MgCO3) διαμορφώνουν σε μεγάλο βαθμό το αποτέλεσμα της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος. Η συνολική συγκέντρωση των σακχάρων δεν επιδρά στην απόδοση του ηλεκτρικού οξέος ενώ ο λόγος της γλυκόζης προς την ξυλόζη επιφέρει αλλαγές στη διαμόρφωση του αποτελέσματος. Η συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος για το βέλτιστο συνδυασμό είναι 5,99 g/l και η μεταφορά των βέλτιστων συνθηκών της ζύμωσης στο βιοαντιδραστήρα αύξησε τη συγκέντρωση σε 11,44 g/l και την απόδοση σε 57,2%. Η σύγκριση της ζύμωσης με διαφορετική παροχή CO2, συνεχή και ασυνεχή κατά περίπτωση, υπέδειξε ότι ο μικροοργανισμός μπορεί να δεσμεύσει το απαραίτητο για την ανάπτυξη του διοξείδιο του άνθρακα από διαφορετικές πηγές, όπως είναι το ανθρακικό ασβέστιο, χωρίς να αλλάζει ιδιαίτερα η παραγωγικότητα του. Ο συνδυασμός της παραγωγής βιοαιθανόλης με πηγή άνθρακα τη γλυκόζη της ενζυμικής υδρόλυσης και της παραγωγής ηλεκτρικού οξέος με ζύμωση των υπολοίπων σακχάρων που προέρχονται από την κατεργασία της βιομάζας, θα μπορούσε να καταστήσει πιο οικονομικά εφικτό το εγχείρημα του βιοδιυλιστηρίου. Η τεχνοοικονομική μελέτη για την αποτίμηση της διεργασίας για δεδομένη διάρκεια ζωής της μονάδας για 20 χρόνια προέβλεψε μια σχετικά μικρή απόδοση του κεφαλαίου. Συνεπώς, η παραγωγή βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη βιοχημική κατεργασία της φαλαρίδας αποτελεί μία οριακά κερδοφόρα επένδυση, με υψηλό ρίσκο, καθώς το εσωτερικό επιτόκιο υπολογίστηκε στο 10,4% ενώ ο δείκτης απόδοσης κεφαλαίου στο 1,04. Ανάμεσα σε πληθώρα μελετών πάνω στην παραγωγή της βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα, η παρούσα διατριβή παρουσιάζει το συνδυασμό της παραγωγής του βιοκαυσίμου με την παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος, ενός βιοχημικού υλικού υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η βελτιστοποίηση της υδρόλυσης της λιγνοκυτταρίνης, της διεργασίας σακχαροποίησης και τελικά της ζύμωσης των σακχάρων καταλήγει σε ένα πλούσιο ρεύμα αιθανόλης με υψηλές τιμές παραγωγικότητας, που προέρχεται από ένα επίσης πλούσιο ρεύμα σακχάρων. Επιπρόσθετα, η προτεινόμενη εκμετάλλευση των λοιπών σακχάρων με στόχο την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος είναι εφικτή, παρουσιάζοντας συγχρόνως περιθώρια βελτίωσης των αποδόσεων. Η ολοκληρωμένη βιοχημική διεργασία με το συνδυασμό της μικροβιακής παραγωγής της αιθανόλης και του ηλεκτρικού οξέος από λιγνοκυτταρινική βιομάζα μελετήθηκε και προτείνεται ως κατάλληλη για μεταφορά της σε μεγαλύτερη κλίμακα. -v-

16 Abstract Abstract Τ he sustainable bioethanol and high-added value biochemicals production from lignocellulosic biomass constitute a potential solution to address the global dependence on fossil fuels, their constant limitation and simultaneously the greenhouse gases reduction. Bioethanol is an additional to gasoline biofuel which results in cleaner combustion. Its production from lignocellulosic materials introduces the new technology of second generation biofuels. Second generation biofuels derive from lignocellulosic biomass, the most promising source of raw materials, due to its abundance in nature. As the modern technology of bioethanol and high added-value biochemicals production requires the application of biotechnological methods to the treatment of lignocellulosic biomass, the abundancy of lignocellulosic biomass tends to replace traditional fossil fuels as a renewable energy source, and the large variety of structural components of lignocellulose leads to a wide range of end products, an integrated lignocellulosic biomass treatment leans towards the application of modern and environmental friendly biorefineries. Thus, the idea of a bio-refinery is established on the combined production of large capacity biofuels with lower market share biochemicals which offer high added-value. In specific, succinic acid is an important intermediate product, microbially produced, which finds multitude of industrial applications and provides added-value to the integrated treatment of biomass. The experimental study of bioethanol and succinic acid production from lignocellulosic biomass represents a complex subject that requires specialized research at each stage of the overall process and the factors that affect the process efficiency. -vi-

17 Abstract In the present dissertation, Phalaris aquatica (Harding grass) is completely utilized as a lignocellulosic resource for the first time. Harding grass is a Mediterranean species with high biomass production ( tn/ha) and a rich source of natural polysaccharides (total structural carbohydrates g/kg DM). Biomass treatment is described by an integrated flowchart, which converts dry plant biomass into bioethanol and succinic acid. The main stages of the lignocellulosic biomass conversion process into bioethanol and succinic acid begin with the effective pretreatment process for the alteration of the lignocellulose structural composition, the removal or the transformation of the lignin bonds and the hemicellulose hydrolysis. Moreover, saccharolytic enzymes are used for the hydrolysis of cellulose at the stage of enzymatic hydrolysis, producing monomer sugars (glucose), which are further fermented by S. cerevisiae yeast into ethanol. Monomer hemicellulose sugars (primarily xylose), which are produced during the pretreatment stage, are exploited as well for the microbial production of succinic acid after an additional step of neutralization. During the study of the integrated biochemical process, the main steps were separately optimized with the aid of statistical tools. The pretreatment step was optimized with respect to the produced xylose concentration, the conversion of hemicellulose and the crystallinity index of the pretreated biomass which reflects the alteration of the structural characteristics of the biomass. The optimal design of an effective dilute acid hydrolysis process was implemented through a statistical study with an experimental Taguchi design, which took into account three significant reaction parameters (temperature, acid concentration and reaction time). Moreover, the pretreatment stage was evaluated, through a combined severity factor, for the effect of the severity of the stage parameters on the hemicellulose conversion, the xylose concentration and the degradation of monomeric sugars into smaller inhibitory compounds. The optimal conditions, which maximize the response parameters, are 110 o C temperature, 2% w / v sulfuric acid concentration and 60 min reaction time, which led to 75.04% hemicellulose conversion, a slightly lower value than the highest one measured (80.41%) under severe hydrolysis conditions. The optimal run yielded g/l xylose concentration and g/l total sugars concentration. The highest xylose and total sugars concentration were g/l and g/l, respectively. In addition, the solid biomass, coming from the optimized pretreatment stage, containing the entire available cellulose, is digested through an enzymatic hydrolysis step. The specific -vii-

18 Abstract pretreated biomass, exhibits the lowest crystallinity index (61.2%) in comparison to other pretreatment runs, which favors an efficient cellulose hydrolysis. The experimental Box Behnken design is utilized for the optimization of the second main process step through a statistical analysis, based on four independent variables of the enzymatic hydrolysis (solid biomass content, enzyme content, surfactant concentration and reaction time), evaluated for their effect on the maximization of the produced glucose concentration, which leads to higher enzymatic hydrolysis yields. The optimal conditions are 4% w/v pretreated biomass concentration, 20 FPU/g biomass cellulase content, 48 h reaction time and 0.04 g/g biomass surfactant concentration. The combination of optimized factors resulted in 12.3 g/l glucose concentration and 64.8% glucose yield. Furthermore, a fed-batch module was implemented to increase the glucose concentration by applying simultaneous feeding of biomass and enzyme loading every six hours. The maximum glucose concentration at the hydrolysate was 45.5 g/l and 67.9% glucose yield. Additionally, the enzymatic hydrolysate, which consists of abundant monomer sugars (glucose), was fermented to yield ethanol by the microorganism S. cerevisiae, without excruciating demands of intermediate concentration step. The parameters affecting the conditions of the bio-system were studied through an experimental Taguchi design in batch module and the inhibitory factors and constraints imposed by fed-batch operating conditions under high sugars concentration were also assessed. Thus, the experimental statistical design determined the effect of aeration, nitrogen source content, ph value, the strain type and the inoculum size to the operating framework for maximizing ethanol yield (%). The contribution of nitrogen to the yeast cultivation was considered significantly high and the effects of ph and microorganism strain were evaluated as less determining to the final performance on ethanol production. The aeration and the inoculum size contributed the least in the final result. Moreover, the implementation of different feeding policies for fed-batch conditions with different feeding rates (constant or exponential), which were empirically identified, enhanced the production of bioethanol and maximized the ethanol productivity and the content of the bioethanol output (7.5% v/v). The exponential feeding policy with high initial sugar concentration reached 59.1 g/l ethanol concentration with significantly high ethanol productivity (2.2 g/(l h)). -viii-

19 Abstract Modern research and market demands drive the production of second generation biofuels deriving from lignocellulosic biomass to the combination with different end-products. The exploitation of the different outputs of lignocellulosic biomass treatment and the by-products of the process apply the ideas of modern bio-refinery. The biorefinery project is already implemented by industries that upgrade the process of cogeneration of succinic acid and ethanol on an industrial scale. This study sets out the production of a biofuel (bioethanol) and a value added material (succinic acid) from lignocellulosic biomass of harding grass. The hydrolysate obtained from hemicellulose hydrolysis with 21.4 g/l xylose and the hydrolysate obtained from cellulose hydrolysis with 45.5 g/l glucose are used as the carbon sources for the anaerobic bacteria Actinobacillus succinogenes. Particular attention was given to the study of five environmental factors (sugar ratio, total sugars, magnesium carbonate, dipotassium phosphate and yeast extract concentration) that affect the output concentration of succinic acid, through an experimental Taguchi design. The nitrogen source (yeast extract) and the CO2 source (MgCO3) critically determines the result of the succinic acid concentration. The concentration of total sugars does not increase the yield of succinic acid, however the changes of glucose to xylose ratio resulted in significant effects. The concentration of succinic acid for the optimum combination is 5.99 g/l and the upscale of the fermentation conditions to the bioreactor increased the concentration to g/l and the succinic acid yield to 57.2%. The comparison of the two bioreactors with continuous and intermittent carbon dioxide supply indicated that the microorganism can bind essential carbon dioxide for its development from different sources, such as calcium carbonate, without significant losses of productivity. The combination of bioethanol production deriving from glucose and succinic acid production deriving from other monomer sugars is considered as more economically feasible option for a bio-refinery concept. The techno-economic study for a given unit lifetime of 20 years predicts a relatively small return of capital. Therefore, the production of bioethanol and succinic acid from the biochemical treatment of harding grass is a marginally profitable investment with high risk, since the internal rate of return is estimated at 10.4% while the profit index to Among various studies on the production of bioethanol from lignocellulosic biomass, the present thesis demonstrates the combination of the biofuel production with the production of succinic acid, a high added-value biochemical. Optimization of the lignocellulose pretreatment, the saccharification process and the sugars fermentation, resulted in a rich -ix-

20 Abstract ethanol stream with high productivity values, deriving from a rich sugars stream, as well. In addition, the proposed exploitation of the rest monomer sugars for the production of succinic acid seems feasible, while showing true potential for yields improvement. The integrated biochemical process of ethanol and succinic acid production from lignocellulosic biomass has been studied and proven suitable for expansion to a larger scale. -x-

21 Περιεχόμενα Πίνακας Περιεχομένων Περίληψη... i Abstract... vi Πίνακας Περιεχομένων... 1 Κατάλογος Πινάκων... 6 Κατάλογος Σχημάτων Κεφάλαιο 1 - Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα Βιοαιθανόλη δεύτερης γενιάς Εισαγωγή στα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας μέσω βιοδιυλιστηρίου Ηλεκτρικό Οξύ Λιγνοκυτταρινική βιομάζα Χαρακτηριστικά του Phalaris aquatιca Πειραματικός Σχεδιασμός Μέθοδος Επιφανειών Απόκρισης (Response Surface Methods, RSM) Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi Σκοπός της Διατριβής Βιβλιογραφία 1 ου Κεφαλαίου

22 Περιεχόμενα Κεφάλαιο 2 - Υλικά και Μέθοδοι Υλικά και Μέθοδοι για την Προεπεξεργασία Λιγνοκυτταρινική Βιομάζα Περιγραφή Πειραματικής διάταξης Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi Συνδυαστικός συντελεστής έντασης (CSF) Αναλυτικές Μέθοδοι Χαρακτηρισμός της βιομάζας Μέτρηση Σακχάρων Δομικά Χαρακτηριστικά της Βιομάζας Υλικά και Μέθοδοι για την Ενζυμική Υδρόλυση Περιγραφή Πειραματικής διάταξης Πειραματικός Σχεδιασμός Box-Behnken Αναλυτικές Μέθοδοι Υλικά και Μέθοδοι για την Καλλιέργεια των Μικροοργανισμών Καλλιέργεια Σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae Στέλεχος Μικροοργανισμού Διατήρηση Μικροοργανισμού Προκαλλιέργεια Μικροοργανισμού Ζύμωση Μικροοργανισμού Πειραματικός Σχεδιασμός Αποστείρωση του Θρεπτικού Μέσου Λειτουργία του Βιοαντιδραστήρα Ρύθμιση του ph κατά την Καλλιέργεια Ζύμωση σε Ημι-συνεχείς συνθήκες (fed-batch) Συμπύκνωση του Υδρολύματος Καλλιέργεια Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Στέλεχος Διατήρηση Στελέχους Προκαλλιέργεια του Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Ζύμωση του Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Πειραματικός Σχεδιασμός

23 Περιεχόμενα Λειτουργία του Βιοαντιδραστήρα Εξουδετέρωση του υδρολύματος Αναλυτικές Μέθοδοι του Σταδίου της Ζύμωσης Δειγματοληψία Μέτρηση της Κυτταρικής Αύξησης On line μετρήσεις Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης Μέτρηση O2 και CO Υπολογισμός Απόδοσης Σταδίου Βιβλιογραφία 2 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 3 - Προεπεξεργασία Εισαγωγή στην Προεπεξεργασία Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Προεπεξεργασίας Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi Αξιολόγηση ως προς το Συνδυαστικό Συντελεστή Έντασης Αλλαγές στα δομικά χαρακτηριστικά της βιομάζας Βιβλιογραφία 3 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 4 - Ενζυμική Υδρόλυση Εισαγωγή στην Ενζυμική Υδρόλυση Βιο-καταλύτες Κατανόηση του φαινομένου της ενζυμικής υδρόλυσης Τα επιφανειοδραστικά στην ενζυμική υδρόλυση Τεχνολογίες για μείωση του κόστους της Ενζυμικής Υδρόλυσης Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Ενζυμικής Υδρόλυσης Βελτιστοποίηση του σταδίου της Ενζυμικής Υδρόλυσης μέσω Παραγοντικού Πειραματικού Σχεδιασμού Box Βenhken Αύξηση τη ποσότητας του στερεού υποστρώματος Στρατηγική Ημι-συνεχούς τροφοδοσίας Βιβλιογραφία 4 ου Κεφαλαίου

24 Περιεχόμενα Κεφάλαιο 5 - Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Εισαγωγή στη Ζύμωση Γενική Περιγραφή Επίδραση διαφορετικών παραμέτρων στη Ζύμωση Ημισυνεχείς συνθήκες τροφοδοσίας Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Ζύμωσης Βελτιστοποίηση του σταδίου της Ζύμωσης μέσω Ορθογώνιου Πειραματικού Σχεδιασμού Taguchi Ζύμωση του Saccharomyces cerevisiae υπό ημι-συνεχείς συνθήκες Αύξηση της συγκέντρωσης αιθανόλης μέσω υψηλής συγκέντρωσης αρχικής τροφοδοσίας γλυκόζης Βιβλιογραφία 5 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 6 - Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του Actinobacillus succinogenes Εισαγωγή στη Ζύμωση Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Ζύμωσης Καλλιέργεια του βακτηρίου A. succinogenes σε κωνικές φιάλες Βελτιστοποίηση του σταδίου της Ζύμωσης μέσω Ορθογώνιου Πειραματικού Σχεδιασμού Taguchi Ζύμωση του Actinobacillus succinogenes σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα Βιβλιογραφία 6 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 7 - Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις Οικονομικά στοιχεία για την παραγωγή αιθανόλης Οικονομικά στοιχεία για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος Οικονομική αποτίμηση μιας ολοκληρωμένης μονάδας Παραδοχές για τη δυναμικότητα της μονάδας Καθορισμός της τιμής πώλησης των προϊόντων Εκτίμηση Κόστους Πάγιας Επένδυσης της μονάδας

25 Περιεχόμενα Εκτίμηση Λειτουργικού Κόστους Μονάδας Βασικά Οικονομικά Μεγέθη και Οικονομικοί Δείκτες Συμπεράσματα της διατριβής Προτάσεις Βιβλιογραφία 7 ου Κεφαλαίου Σύμβολα Συντομογραφίες Παράρτημα Α - Πειραματικός Σχεδιασμός Α.1 Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi A.1.1 Λόγος Σήματος προς Θόρυβο A.1.2 Κατάταξη παραμέτρων Α.2 Βασικές έννοιες στατιστικής ανάλυσης Α.3 Διαγράμματα Υπολειμμάτων Στατιστικής Ανάλυσης Βιβλιογραφία Παραρτήματος Α Παράρτημα Β - Αναλυτικές Μέθοδοι Προσδιορισμού Β.1 Μέθοδος Δινιτρο - σαλικυλικού οξέος Β.2 Μέθοδος Ενζυμικής Μέτρησης Αιθανόλης Β.3 Μέτρηση Βαθμού Κρυσταλλικότητας, XRD Βιβλιογραφία Παραρτήματος Β Παράρτημα Γ - Τεχνοοικονομική Ανάλυση Γ.1 Τεχνοοικονομικά ανάλυση Βιβλιογραφία Παραρτήματος Γ Παράρτημα Δ - Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης Δ.1 Φωτογραφίες Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης

26 Κατάλογος Πινάκων Κατάλογος Πινάκων Πίνακας 1.1. Σύσταση επί ξηρής βιομάζας σε ποσοστό % για διάφορα είδη λιγνοκυτταρινικής βιομάζας 39 Πίνακας 2.1. Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi (L9) για το στάδιο της Προεπεξεργασίας 60 Πίνακας 2.2. Πίνακας 2.3. Πειραματικός σχεδιασμός Box-Behnken τεσσάρων παραγόντων για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. 66 Σύσταση του θρεπτικού μέσου διατήρησης του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae. 69 Πίνακας 2.4. Σύσταση θρεπτικού μέσου προκαλλιέργειας του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae. 70 Πίνακας 2.5. Σύσταση του θρεπτικού μέσου ζύμωσης του σακχαρομύκητα S. cerevisiae.. 72 Πίνακας 2.6. Πίνακας 2.7. Πίνακας 2.8. Πίνακας 2.9. Σύσταση διαλύματος ιχνοστοιχείων του θρεπτικού μέσου της ζύμωσης του σακχαρομύκητα S. cerevisiae.. 73 Πειραματικός σχεδιασμός Taguchi για την καλλιέργεια του σακχαρομύκητα S. cerevisiae. 73 Πολιτική τροφοδοσίας της ζύμωσης σε ημισυνεχείς συνθήκες στην κωνική φιάλη 78 Διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας στον βιοαντιδραστήρα σε ημισυνεχείς συνθήκες λειτουργίας 78-6-

27 Κατάλογος Πινάκων Πίνακας Σύσταση του θρεπτικού μέσου διατήρησης του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. 80 Πίνακας Σύσταση θρεπτικού μέσου προκαλλιέργειας του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. 81 Πίνακας Πίνακας 3.1. Πίνακας 3.2. Πειραματικός σχεδιασμός Taguchi κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. 84 Διαφορετικές μέθοδοι προεπεξεργασίας λιγνοκυτταρινικής βιομάζας συγκρινόμενοι ως προς τα πλεονεκτήματα και τους περιορισμούς του 105 Ορθογώνιος Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi τριών παραγόντων σε τρία επίπεδα με τα πειραματικά αποτελέσματα για τη συγκέντρωση ξυλόζης, τη συγκέντρωση συνολικών σακχάρων και τη μετατροπή των ημικυτταρινών 109 Πίνακας 3.3. Κατάταξη των παραμέτρων σύμφωνα με τη μεγιστοποίηση δύο διαφορετικών κριτηρίων, (α) την απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού (συγκέντρωση ξυλόζης), (β) το λόγο Απόκρισης/Θορύβου (S/N) 111 Πίνακας 3.4. Πίνακας 4.1. Πίνακας 4.2. Πίνακας 4.3. Πίνακας 5.1. Συσχέτιση των τριών μεταβλητών θερμοκρασίας, περιεκτικότητα οξέος και χρόνος αντίδρασης με το βαθμό κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας της φαλαρίδας με αραιό θειικό οξύ. 122 Πειραματικός Σχεδιασμός Επιφανειών Απόκρισης Box Behnken τεσσάρων παραγόντων σε τρία επίπεδα με τα πειραματικά αποτελέσματα για τη συγκέντρωση γλυκόζης Ανάλυση Διακύμανσης για το γραμμικό μοντέλο παλινδρόμησης Box Behnken για τη συγκέντρωση γλυκόζης Μέγιστη συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) με βάση την άριστη λύση του εμπειρικού μοντέλου παλινδρόμησης Ορθογώνιος Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi πέντε παραγόντων σε μικτά επίπεδα με τα πειραματικά αποτελέσματα για την κυτταρική βιομάζα, τη συγκέντρωση και την απόδοση της αιθανόλης

28 Κατάλογος Πινάκων Πίνακας 5.2. Κατάταξη των παραμέτρων σύμφωνα με τη μεγιστοποίηση δύο διαφορετικών κριτηρίων, (α) την απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού (απόδοση αιθανόλης), (β) το λόγο Απόκρισης/Θορύβου (S/N) 182 Πίνακας 5.3. Συνθήκες ζύμωσης όπως βελτιστοποιήθηκαν από το στατιστικό σχεδιασμό Taguchi. 185 Πίνακας 5.4. Αποτελέσματα κυτταρικής βιομάζας, συγκέντρωσης αιθανόλης, παραγωγικότητας αιθανόλης και απόδοση για διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας 195 Πίνακας 5.5. Πίνακας 6.1. Πίνακας 6.2. Συγκεντρωτικά Αποτελέσματα για τις τρεις δοκιμές εκθετικής τροφοδοσίας του αντιδραστήρα για διαφορετική διάρκεια και ρυθμό τροφοδοσίας. 200 Σύσταση θρεπτικού μέσου ζύμωσης για πρωταρχικά πειράματα ανάπτυξης του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. 213 Πειραματικά αποτελέσματα του στατιστικού σχεδιασμού Taguchi για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος από τον μικροοργανισμό Actinobacillus succinogenes 218 Πίνακας 6.3. Κατάταξη των παραμέτρων σύμφωνα με τη μεγιστοποίηση δύο διαφορετικών κριτηρίων, (α) την απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού (συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος), (β) το λόγο Σήματος/Θορύβου (S/N) Πίνακας 6.4. Πίνακας 7.1. Συγκεντρωτικά αποτελέσματα για τις δύο καλλιέργειες του Actinobacillus succinogenes σε επίπεδο αντιδραστήρα με και χωρίς παροχή διοξειδίου του άνθρακα Υπάρχουσες και δοκιμαστικές μονάδες και επενδύσεις για την παραγωγή βιοαιθανόλης ανά τον κόσμο Πίνακας 7.2. Κατανομή πάγιου κόστους επένδυσης. 248 Πίνακας 7.3. Μεταβλητό Λειτουργικό Κόστος μονάδας παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. 249 Πίνακας 7.4. Βασικά Οικονομικά Μεγέθη της επένδυσης. 253 Πίνακας 7.5. Βασικοί Οικονομικοί Δείκτες της επένδυσης διάρκειας 20 χρόνων. 254 Πίνακας 7.6. Υπάρχουσες και μελλοντικές χρήσεις της λιγνίνης

29 Κατάλογος Πινάκων Πίνακας A.1. Μέθοδος Υπολογισμού των παραμέτρων της κατάταξης του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi. 277 Πίνακας Α.2. Πίνακας Ανάλυσης Διακύμανσης

30 Κατάλογος Σχημάτων Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 1.1. Η παραγωγή των βιοκαυσίμων στην Ευρώπη των 28 την περίοδο σε ktoe 23 Σχήμα 1.2. Σχήμα 1.3. Σχήμα 1.4. Σχήμα 1.5. Διαφορετικές οδοί για την παραγωγή βιοκαυσίμων πρώτης και δεύτερης γενιάς.. 24 Διάγραμμα Ροής της βιοτεχνολογικής παραγωγής βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα 29 Προτεινόμενη στρατηγική βιοδιυλιστηρίου βασισμένου στην επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας για την παραγωγή βιοαιθανόλης και ποικιλίας βιοχημικών υλικών και χημικών που προέρχονται από θερμοχημική διεργασία. 33 Διάφορα προϊόντα και χημικές ενώσεις που παρασκευάζονται από το ηλεκτρικό οξύ 35 Σχήμα 1.6. Το φυτό Phalaris aquatica στο σημείο καλλιέργειας σε ύψος 1,5 m. 41 Σχήμα 1.7. Διάφορα μέρη (ταξιανθία, σπόρος, ρίζα) του φυτού Phalaris aquatica L 42 Σχήμα 1.8. Πειραματικός σχεδιασμός Box Behnken τριών παραμέτρων.. 46 Σχήμα 1.9. Διάγραμμα παραμέτρων Taguchi 48 Σχήμα Διάγραμμα Ροής για τη συνολική διεργασία παραγωγής αιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα Phalaris aquatica

31 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 2.1. Σχήμα 2.2. Χρωματογράφημα (Χρόνος Έκλουσης Ένταση Σήματος) του Αναλυτή Δείκτη Διάθλασης κατά την Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης για μίγμα πρότυπων Σακχάρων με συγκέντρωση 20 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της Προεπεξεργασίας. 63 Χρωματογράφημα (Χρόνος Έκλουσης Ένταση Σήματος) του Αναλυτή Δείκτη Διάθλασης κατά την Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης για μίγμα πρότυπων Σακχάρων με συγκέντρωση 20 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της Ενζυμικής Υδρόλυσης. 67 Σχήμα 2.3. Τρυβλία διατήρησης μεμονωμένων αποικιών του Saccharomyces cerevisiae.. 69 Σχήμα 2.4. Δομή των παρεμποδιστικών ενώσεων που προέρχονται από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα 86 Σχήμα 2.5. Σχήμα 2.6. Σχήμα 2.7. Σχήμα 3.1. Σχήμα 3.2. Σχήμα 3.3. Καμπύλη γραμμικής συσχέτισης της οπτικής πυκνότητας (OD) των κυττάρων του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae με το βάρος της ξηρής βιομάζας (συγκέντρωση βιομάζας, DCW). 88 Εικόνα μικροσκοπίου (α) με οπτική πυκνότητα OD=15 και (β) με οπτική πυκνότητα OD= Χρωματογράφημα (Χρόνος Έκλουσης Ένταση Σήματος) του Αναλυτή Δείκτη Διάθλασης κατά την Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης για μίγμα πρότυπων Σακχάρων με συγκέντρωση 25 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της Ζύμωσης.. 90 Δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Οι ίνες της κυτταρίνης όπως περιβάλλονται από ημικυτταρίνες και λιγνίνη 97 Αλλαγή στη δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας με τη δράση της προεπεξεργασίας 99 Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi της προεπεξεργασίας

32 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 3.4. Σχήμα 3.5. Σχήμα 3.6. Σχήμα 3.7. Σχήμα 3.8. Ανάλυση Διακύμανσης (ANOVA) για τις τρεις ελεγχόμενες παραμέτρους κατά την προεπεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας της φαλαρίδας με αραιό θειικό οξύ 113 Διαγράμματα κύριων επιδράσεων των τριών παραγόντων θερμοκρασία, οξύ, χρόνος αντίδρασης στη συγκέντρωση της ξυλόζης κατά την προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica 114 Διαγράμματα κύριων επιδράσεων των τριών παραγόντων θερμοκρασία, οξύ, χρόνος αντίδρασης στη μετατροπή των ημικυτταρινών κατά την προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica. 115 Διάγραμμα Χωροσταθμικών Καμπυλών των συνθηκών της προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica: (α) Περιεκτικότητα Οξέος και (β) Θερμοκρασία για την παραγωγή της συγκέντρωσης Ξυλόζης 116 Σχηματική Απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού για τη συσχέτιση της συγκέντρωσης της ξυλόζης με τη θερμοκρασία, την περιεκτικότητα οξέος και το χρόνο της αντίδρασης, με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της προεπεξεργασίας 117 Σχήμα 3.9. Ραβδόγραμμα σχηματικής απεικόνισης των συντελεστών της κάθε παραμέτρου του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού για τη συσχέτιση της συγκέντρωσης της ξυλόζης με τη θερμοκρασία, την περιεκτικότητα οξέος και το χρόνο αντίδρασης της προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica Σχήμα Σχήμα Επίδραση του συνδυαστικού συντελεστή έντασης (CSF) στη μετατροπή των ημικυτταρινών, στη συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης και των λοιπών σακχάρων κατά την προεπεξεργασία της βιομάζας του Phalaris aquatica. 119 Επίδραση του συνδυαστικού συντελεστή έντασης (CSF) στο βαθμό κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας του φυτού Phalaris aquatica

33 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα 4.1. Σχήμα 4.2. Σχήμα 4.3. Βαθμός κρυσταλλικότητας σε σχέση με τα ποσοστά μετατροπής των ημικυτταρινών κατά τον πειραματικού σχεδιασμό Taguchi για την προεπεξεργασία της βιομάζας του Phalaris aquatica 124 Σχηματική Απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού για τη συσχέτιση του βαθμού κρυσταλλικότητας με τη θερμοκρασία, την περιεκτικότητα οξέος και το χρόνο της αντίδρασης, με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της προεπεξεργασίας. 125 Εικόνες Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης (SEM) με εμφανείς τις αλλαγές στη δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας 126 Σχηματική απεικόνιση της ενζυμικής δράσης κατά την προσρόφηση των ενζύμων πάνω στο αδιάλυτο υπόστρωμα της κυτταρίνης. 132 Σχηματική απεικόνιση της προσρόφησης του ενζύμου στο υπόστρωμα παρουσία παρεμποδιστικών ενώσεων. 133 Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Box Behnken στο στάδιο της Ενζυμικής υδρόλυσης 142 Σχήμα 4.4. Σχηματική απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Box Behnken σχεδιασμού για τη συσχέτιση της συγκέντρωσης της γλυκόζης με τη βιομάζα, την ποσότητα ενζύμου, τη συγκέντρωση PEG 4000 και το χρόνο της αντίδρασης, με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ενζυμικής υδρόλυσης Σχήμα 4.5. Συνεισφορά των τεσσάρων παραγόντων και των μεταξύ τους αλληλεπιδράσεων στη συγκέντρωση της γλυκόζης σύμφωνα με την Ανάλυση Διακύμανσης για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης Σχήμα 4.6. Διαγράμματα Επιφανειών Απόκρισης με τις αλληλεπιδράσεις δύο παραγόντων στη συγκέντρωση της γλυκόζης: (α) βιομάζας-χρόνου, (β) ενζύμου-βιομάζας, (γ) βιομάζα-επιφανειοδραστικού (δ) ενζύμου-χρόνου, (ε) επιφανειοδραστικού-χρόνου, (στ) ενζύμου-επιφανειοδραστικού

34 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 4.7. Σχήμα 4.8. Σχήμα 4.9. Σχήμα Σχήμα Συγκέντρωση της γλυκόζης για διαφορετικές αναλογίες μεταξύ των δύο εμπορικά διαθέσιμων ενζύμων κυτταρινάση και β - γλυκοσιδάση κατά την ενζυμική υδρόλυση 153 Επίδραση της αύξησης του περιεχόμενου στερεού στη συγκέντρωση της γλυκόζης σε συγκριτικά πειράματα ενζυμικής υδρόλυσης. 154 Συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) για δύο διαφορετικά διαστήματα τροφοδοσίας της ενζυμικής υδρόλυσης, 6 και 12 ωρών Απόδοση γλυκόζης (%) για δύο διαφορετικά διαστήματα τροφοδοσίας της ενζυμικής υδρόλυσης, 6 και 12 ωρών 156 Παραγωγικότητα γλυκόζης (g/(l h)) για δύο διαφορετικά διαστήματα τροφοδοσίας της ενζυμικής υδρόλυσης, 6 και 12 ωρών 157 Σχήμα Συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) για δύο διαφορετικά περιεχόμενα ενζύμων 20 και 30 FPU/g βιομάζας, κατά την ενζυμική υδρόλυση 158 Σχήμα Απόδοση γλυκόζης (%) για δύο διαφορετικά περιεχόμενα ενζύμων 20 και 30 FPU/g βιομάζας, κατά την ενζυμική υδρόλυση Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα 5.1. Σχήμα 5.2. Σχήμα 5.3. Παραγωγικότητα γλυκόζης (g/(l h)) για δύο διαφορετικά περιεχόμενα ενζύμων 20 και 30 FPU/g βιομάζας, κατά την ενζυμική υδρόλυση 159 Συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) για πολιτική ημι-συνεχούς τροφοδοσίας βιομάζας μέχρι την τελική τιμή 14% w/v, ενζύμου 20 FPU/g βιομάζας, κάθε 6 ώρες, κατά την ενζυμική υδρόλυση 161 Παραγωγικότητα γλυκόζης (g/(l h)) για πολιτική ημι-συνεχούς τροφοδοσίας βιομάζας μέχρι την τελική τιμή 14% w/v, ενζύμου 20 FPU/g βιομάζας, κάθε 6 ώρες, κατά την ενζυμική υδρόλυση 161 Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου του μικροοργανισμού S. cerevisiae κατά την αναπαραγωγική του φάση 168 Καμπύλη ανάπτυξης μικροοργανισμού. Τα στάδια που διακρίνονται είναι η λανθάνουσα φάση, η εκθετική φάση ανάπτυξης, η φάση επιβράδυνσης και η στατική φάση. 169 Σχηματική απεικόνιση του μεταβολισμού της γλυκόζης στον σακχαρομύκητα S. cerevisiae. Παρατηρούνται τρία βασικά στοιχεία της κινητικής του -14-

35 Κατάλογος Σχημάτων κυττάρου: ο περιορισμός της αναπνοής (αερόβια παραγωγή αιθανόλης), η αποθήκευση των συνολικών υδατανθράκων στο εσωτερικό του κυττάρου και τα λοιπά συστατικά της κυτταρικής βιομάζας (Fiechter & Seghezzi, 1992) Σχήμα 5.4. Σχήμα 5.5. Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi της ζύμωσης του Saccharomyces cerevisiae υπό ασυνεχείς συνθήκες 177 Σχηματική Απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ζύμωσης υπό ασυνεχείς συνθήκες του Saccharomyces cerevisiae 177 Σχήμα 5.6. Ραβδόγραμμα σχηματικής απεικόνισης των συντελεστών της κάθε παραμέτρου του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού για τη συσχέτιση της απόδοσης σε αιθανόλη με την περιεκτικότητα αζώτου, το είδος και το μέγεθος του ενοφθαλμίσματος, τον αερισμό και το ph κατά τη ζύμωση υπό ασυνεχείς συνθήκες του Saccharomyces cerevisiae Σχήμα 5.7. Σχήμα 5.8. Σχήμα 5.9. Σχήμα Σχήμα Συνεισφορά των πέντε παραγόντων στο γραμμικό μοντέλο της απόδοσης της αιθανόλης σύμφωνα με την Ανάλυση Διακύμανσης για το στάδιο της ζύμωσης του Saccharomyces cerevisiae 178 Κύριες επιδράσεις μελετούμενων παραγόντων: (α) αζώτου, (β) ph, (γ) συντελεστής αερισμού, ko, (δ) στέλεχος, (ε) ενοφθάλμισμα, στην απόδοση της αιθανόλης (%) για το στάδιο της ζύμωσης του S. cerevisiae. 184 Συγκέντρωση Αιθανόλης, Καταναλισκόμενων Σακχάρων και Κυτταρικής Βιομάζας κατά την καλλιέργεια του S. cerevisiae σε θρεπτικό μέσο με βελτιστοποιημένες συνθήκες. 186 Απόδοση (%) της αιθανόλης σε σχέση με τη θεωρητική τιμή και Συνολική Παραγωγικότητα (g/l h) αιθανόλης σε σχέση με το χρόνο της καλλιέργειας S. cerevisiae σε θρεπτικό μέσο με βελτιστοποιημένες συνθήκες. 186 Προφίλ τροφοδοσίας γλυκόζης για τη ζύμωση του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας σε κωνική φιάλη ως προς την οπτική πυκνότητα σε 600 nm

36 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας σε κωνική φιάλη. 188 Τροφοδοσία αντιδραστήρα με σταθερό ρυθμό ίσο με τη μέση τιμή του ρυθμού κατανάλωσης των σακχάρων 191 Τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό τροφοδοσίας των σακχάρων βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,23 h -1 ) 191 Τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό τροφοδοσίας των σακχάρων βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,35 h -1 ) 192 Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με τροφοδοσία αντιδραστήρα με σταθερό ρυθμό ίσο με τη μέση τιμή του ρυθμού κατανάλωσης των σακχάρων Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,23 h -1 ) του μικροοργανισμού 194 Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,35 h -1 ) του μικροοργανισμού. 195 Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae σε επίπεδο αντιδραστήρα με υψηλά αρχικά σάκχαρα και τροφοδοσία για 33 ώρες Σχήμα Παραλλαγές του εκθετικού ρυθμού τροφοδοσίας της γλυκόζης όπως εφαρμόστηκε σε καλλιέργεια χαμηλών (20 g/l) και υψηλών (100 g/l) αρχικών σακχάρων. Τρεις δοκιμές για διαφορετική διάρκεια και μέγιστη τιμή τροφοδοσίας γλυκόζης 199 Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae σε επίπεδο αντιδραστήρα με υψηλά αρχικά σάκχαρα και τροφοδοσία για 36 ώρες

37 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae σε επίπεδο αντιδραστήρα με υψηλά αρχικά σάκχαρα και τροφοδοσία για 33 ώρες που μειώνεται αντίστροφα 201 Σχήμα 6.1. Σχήμα 6.2. Σχήμα 6.3. Σχήμα 6.4. Σχήμα 6.5. Σχηματική απεικόνιση της μεταβολικής διαδρομής του σχηματισμού ηλεκτρικού οξέος από το βακτήριο Actinobacillus succinogenes 207 Οι δύο διαφορετικές μεταβολικές οδοί για τη μετατροπή του φωσφοενολοπυροσταφυλικού οξέος στα τελικά προϊόντα: ηλεκτρικό οξύ (C4), αιθανόλη και οξικό οξύ (C3) Καμπύλη ανάπτυξης του μικροοργανισμού A. succinogenes στο θρεπτικό μέσο της ζύμωσης 214 Παραγωγή ηλεκτρικού, μυρμηκικού και οξικού οξέος και η πορεία των καταναλισκόμενων σακχάρων σε σχέση με το χρόνο κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού A. succinogenes. 214 Σχηματική απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου της συσχέτισης της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος με το λόγο των σακχάρων, τη συνολική συγκέντρωση τους, την περιεκτικότητα MgCO3, K2HPO4 και εκχυλίσματος μαγιάς με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes Σχήμα 6.6. Ραβδόγραμμα σχηματικής απεικόνισης των συντελεστών της κάθε παραμέτρου του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού της συσχέτισης της συγκέντρωσης ηλεκτρικού οξέος με το λόγο των σακχάρων, τη συνολική συγκέντρωση τους, την περιεκτικότητα MgCO3, K2HPO4 και εκχυλίσματος μαγιάς με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes Σχήμα 6.7. Σχήμα 6.8. Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes Συνεισφορά των πέντε παραγόντων μαζί με τους συντελεστές p για το γραμμικό μοντέλο της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος σύμφωνα με την Ανάλυση Διακύμανσης για το στάδιο της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes

38 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 6.9. Διαγράμματα κύριων επιδράσεων των πέντε ελεγχόμενων μεταβλητών στον παράγοντα ελέγχου (συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος) 226 Σχήμα Παραγωγή ηλεκτρικού οξέος κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού A. succinogenes σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα με παράλληλη παροχή CO Σχήμα 7.1. Σχήμα 7.2. Σχήμα 7.3. Σχήμα 7.4. Σχήμα 7.5. Σχήμα Α.1. Σχήμα Α.2. Σχήμα Α.3. Κόστος παραγωγής αιθανόλης ως συνάρτηση των επιμέρους εξόδων: λειτουργικό κόστος, κόστος πρώτης ύλης, μεταβλητά λειτουργικά έξοδα, κεφαλαιακό κόστος 237 Ανάλυση Ευαισθησίας της συμμετοχής διαφορετικών παραμέτρων στο λειτουργικό κόστος της διεργασίας παραγωγής αιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. 238 Συσχέτιση της τιμής πώλησης της αιθανόλης σε σχέση με την ποσότητα του ηλεκτρικού οξέος που συμπαράγεται για βραχυπρόθεσμο και για μακροπρόθεσμο σενάριο Διάγραμμα Ροής με ισοζύγια μάζας για τη συνολική διεργασία παραγωγής αιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα (Βάση: 1000 g ξηρής βιομάζας) Κατανομή Λειτουργικού Κόστους μιας μονάδας παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από λιγνοκυτταρινική βιομάζα 251 Ιστόγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής της συγκέντρωσης της ξυλόζης πρόβλεψης από τα πειραματικά αποτελέσματα σε συνάρτηση με τη συχνότητα εμφάνισης τους, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της προεπεξεργασίας Διάγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης για τη συγκέντρωσης της ξυλόζης σε συνάρτηση με την τιμή του υπολείμματος από την πειραματική τιμή, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της προεπεξεργασίας Ιστόγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας από τα πειραματικά αποτελέσματα σε συνάρτηση με τη συχνότητα εμφάνισης τους, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της προεπεξεργασίας

39 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα Α.4. Σχήμα Α.5. Σχήμα Α.6. Σχήμα Α.7. Σχήμα Α.8. Σχήμα Α.9. Σχήμα Α.10. Σχήμα Β.1. Διάγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας σε συνάρτηση με την τιμή του υπολείμματος από την πειραματική τιμή, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της προεπεξεργασίας Ιστόγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της συγκέντρωσης της γλυκόζης από τα πειραματικά αποτελέσματα σε συνάρτηση με τη συχνότητα εμφάνισης τους, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Box Behnken, για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης 283 Διάγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της συγκέντρωσης της γλυκόζης σε συνάρτηση με την τιμή του υπολείμματος από την πειραματική τιμή, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Box Behnken, για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης 283 Ιστόγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της απόδοσης σε αιθανόλη από τα πειραματικά αποτελέσματα σε συνάρτηση με τη συχνότητα εμφάνισης τους, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της ζύμωσης του S. cerevisiae. 284 Διάγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της απόδοσης σε αιθανόλη σε συνάρτηση με την τιμή του υπολείμματος από την πειραματική τιμή, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της ζύμωσης του S. cerevisiae Ιστόγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της συγκέντρωσης ηλεκτρικού οξέος από τα πειραματικά αποτελέσματα σε συνάρτηση με τη συχνότητα εμφάνισης τους, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της ζύμωσης του Α. succinogenes. 285 Διάγραμμα Υπολειμμάτων της τιμής πρόβλεψης της συγκέντρωσης ηλεκτρικού οξέος σε συνάρτηση με την τιμή του υπολείμματος από την πειραματική τιμή, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, για το στάδιο της ζύμωσης του Α. succinogenes Διάγραμμα Φασματοσκοπίας Περίθλασης Ακτίνων Χ (XRD) για την ακατέργαστη βιομάζα

40 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα Β.2. Σχήμα Γ.1. Σχήμα Δ.1. Σχήμα Δ.2. Σχήμα Δ.3. Σχήμα Δ.4. Σχήμα Δ.5. Σχήμα Δ.6. Σχήμα Δ.7. Διάγραμμα Φασματοσκοπίας Περίθλασης Ακτίνων Χ (XRD) για την προεπεξεργασμένη βιομάζα στις συνθήκες 1,5 % H2SO4, χρόνος αντίδρασης 45 min και θερμοκρασία 120 o C Εξοπλισμός της μονάδας παραγωγής αιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα Phalaris aquatica Ακατέργαστη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί μόνο μηχανική κατεργασία για μείωση του μεγέθους των σωματιδίων σε 1mm, με μεγέθυνση 20 φορές. 296 Ακατέργαστη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί μόνο μηχανική κατεργασία για μείωση του μεγέθους των σωματιδίων σε 1mm, με μεγέθυνση 400 φορές Προεπεξεργασμένη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί αραιή όξινη υδρόλυση με 1,5% w/v Η2SO4 για 45 min στους 120 o C, με μεγέθυνση 150 φορές Προεπεξεργασμένη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί αραιή όξινη υδρόλυση με 1,5% w/v Η2SO4 για 45 min στους 120 o C, με μεγέθυνση 250 φορές Προεπεξεργασμένη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί αραιή όξινη υδρόλυση με 1,5% w/v Η2SO4 για 45 min στους 120 o C, με μεγέθυνση 600 φορές Προεπεξεργασμένη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί αραιή όξινη υδρόλυση με 1,5% w/v Η2SO4 για 45 min στους 120 o C, με μεγέθυνση φορές Προεπεξεργασμένη βιομάζα Phalaris aquatica που έχει υποστεί αραιή όξινη υδρόλυση με 1,5% w/v Η2SO4 για 45 min στους 120 o C, με μεγέθυνση φορές

41 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας 1.1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα Το ενδιαφέρον της παγκόσμιας κοινότητας έχει στραφεί προς την τεχνολογία των βιοκαυσίμων εδώ και δεκαετίες, με μεγάλη πρόοδο και συνεχώς μεγαλύτερο ποσοστό συμμετοχής των βιοκαυσίμων στη συνολική αγορά της ενέργειας των καυσίμων. Η ερευνητική δραστηριότητα προς αυτή την κατεύθυνση στηρίζεται από κρατικές πρωτοβουλίες. Το Ευρωπαϊκό Συμβούλιο έχει θέσει ως δεσμευτικό στόχο την προέλευση του ποσοστού 20% του συνόλου της Ευρωπαϊκής ενεργειακής κατανάλωσης από ανανεώσιμες πηγές ενέργειας, μέχρι το έτος Επιπρόσθετα, έχει τεθεί ως δεσμευτικός στόχος τα βιοκαύσιμα να συμμετέχουν με ελάχιστο ποσοστό 10% στη συνολική κατανάλωση καυσίμων κίνησης (πετρελαίου και βενζίνης) για όλα τα κράτη μέλη. Σύμφωνα με το Ερευνητικό Κέντρο της Ευρωπαϊκής Επιτροπής η συμμετοχή των ανανεώσιμων πηγών ενέργειας στις μονάδες παραγωγής ενέργειας που κατασκευάστηκαν το 2012, σημειώνει το υψηλό ποσοστό του 85% της καθαρής παραγόμενης ενέργειας (Acal et al., 2014). -21-

42 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Τα βιοκαύσιμα που καταναλώνονται στην Ευρώπη είναι κατά κύριο λόγο το βιοντήζελ, που αποτελεί το 76% του συνόλου των βιοκαυσίμων. Η βιο-βενζίνη (biogasoline) αποτελεί το 21% και ορίζεται ως το σύνολο της βιαοαιθανόλης, της βιομεθανόλης, του βιο-ετβε (αιθυλοτριτοταγής-βουτυλαιθέρας, ethyl tert-butyl ether) και βιο-μτβε (μεθυλο-τριτοταγής βουτυλαιθέρας, methyl tert-butyl ether). Το υπόλοιπο 3% αποτελείται από λοιπά βιοκαύσιμα. Οι χώρες με την υψηλότερη κατανάλωση βιοκαυσίμων στην Ευρωπαϊκή Ένωση (EU-27) είναι πρώτη στην κατάταξη η Γερμανία με 3,7 MToe που αποτελούν το 22% και ακολουθεί η Γαλλία που καταναλώνει το 17% της συνολικής ευρωπαϊκής κατανάλωσης βιοκαυσίμων. Οι υπόλοιπες χώρες στην κατάταξη (Ιταλία, Ισπανία και Μεγάλη Βρετανία) σημειώνουν κατανάλωση βιοκαυσίμων σε ποσοστό 8 με 12% (Eurostat, 2012). Η ανοδική πορεία στην παραγωγή των βιοκαυσίμων παρουσιάζεται στο Σχήμα 1.1 από το έτος 2000 και έπειτα (European Commission, 2014). Το μεγάλο ποσοστό της παραγωγής βιοντήζελ σε σχέση με τα προσθετικά βιοκαύσιμα της βενζίνης οφείλεται στην ήδη εγκατεστημένη τεχνολογία παραγωγής του, ενώ το πεδίο της τεχνολογίας παραγωγής της βιοαιθανόλης βρίσκεται ακόμα σε πρώιμο στάδιο μεταφοράς του σε βιομηχανική κλίμακα. Ο ορισμός του βιοκαυσίμου περιλαμβάνει κάθε καύσιμο προερχόμενο από βιομάζα, ζωντανούς οργανισμούς ή από παραπροϊόντα του μεταβολισμού τους. Τα βιοκαύσιμα διαχωρίζονται σε διαφορετικές γενιές ανάλογα με την τεχνολογία παραγωγής τους και το είδος της βιομάζας που χρησιμοποιείται ως πρώτη ύλη. Πρώτης γενιάς ονομάζονται τα βιοκαύσιμα που προέρχονται από εδώδιμους καρπούς και υπολείμματα τροφών. Η τεχνολογία τους είναι εγκατεστημένη και κυκλοφορούν σε μεγάλες ποσότητες στην αγορά. Τα κύρια βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς είναι το βιοντήζελ, η βιοαιθανόλη και το βιοαέριο. Η βιοαιθανόλη πρώτης γενιάς προέρχεται από ζυμώσιμα σάκχαρα κυρίως από αμυλούχα βιομάζα, καλαμπόκι και σακχαρότευτλο. Οι χρήσεις της αφορούν κατά κύριο λόγο την προσθήκη σε κινητήρες εσωτερικής καύσης, αναμειγνυόμενη με βενζίνη σε ποσοστό μέχρι και 10% χωρίς να υποστεί καμία μετατροπή ο κινητήρας, το γνωστό μίγμα Ε10. Με κατάλληλη μετατροπή του κινητήρα η αιθανόλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί και σε μίγμα με μεγαλύτερο ποσοστό εώς και 85% (Ε85). -22-

43 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.1. Η παραγωγή των βιοκαυσίμων στην Ευρώπη των 28 την περίοδο σε ktoe. Άλλα βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς είναι ο βουτυλαιθέρας (ΕΤΒΕ), ο οποίος συντίθεται από βιοαιθανόλη και ισοβουτυλένιο. Αναμειγνύεται επίσης με τη βενζίνη σε μεγαλύτερο ποσοστό μέχρι 15%. Ακόμα, το βιοντήζελ παράγεται από φυτικά έλαια σόγιας, ελαιοκράμβης, φοινικόδεντρων και από άλλα ενεργειακά φυτά μέσω της αντίδρασης των τριγλυκεριδίων με τη μεθανόλη (τρανσ-εστεροποίηση). Με τον ίδιο τρόπο όπως η βιοαιθανόλη, μπορεί να αναμιχθεί με πετρέλαιο κίνησης σε ποσοστό 5% είτε να χρησιμοποιηθεί σε καθαρή μορφή σε τροποποιημένους κινητήρες. Άλλο διαδεδομένο βιοκαύσιμο είναι το βιοαέριο, που προέρχεται από αναερόβια επεξεργασία των ζωικών απορριμμάτων καθώς και άλλων πηγών υγρής βιομάζας (απορρίμματα τροφίμων και αστικών αποβλήτων). Τα υλικά αυτά μετατρέπονται σε βιομεθάνιο, το οποίο αναμειγνύεται στο δίκτυο του φυσικού αερίου. H παραγωγή των βιοκαυσίμων πρώτης γενιάς βρίσκεται σε εμπορική εφαρμογή με δυναμικότητα περίπου 50 δισεκατομμύρια λίτρα βιοαιθανόλης και 5,4 εκατομμύρια τόνους βιοντήζελ να παράγονται παγκοσμίως μέσα στο

44 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.2. Διαφορετικές οδοί για την παραγωγή βιοκαυσίμων πρώτης και δεύτερης γενιάς Τα βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς παράγονται παγκοσμίως από ένα ευρύτερο πεδίο πρώτων υλών που προέρχονται κυρίως από μη εδώδιμους καρπούς. Η πηγή της βιομάζας προέρχεται από ολόκληρο το φυτό ή τα υπολείμματα του, που αποτελούνται κυρίως από κυτταρίνη και λιγνίνη, όπως το άχυρο, το χορτάρι και τα υπολείμματα ξύλου. Για την εκμετάλλευση αυτής της πηγής βιομάζας, δύο είναι οι μετατροπές που μπορούν να εφαρμοστούν για την παραγωγή βιοκαυσίμου. Η πρώτη είναι η βιολογική οδός που εμπεριέχει την υδρόλυση της βιομάζας με χρήση ενζύμων και τη παραγωγή βιοαιθανόλης με χρήση μικροοργανισμών που μετατρέπουν τα προερχόμενα από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα σάκχαρα σε αιθανόλη. Η δεύτερη οδός χρησιμοποιεί τη θερμοχημική μετατροπή της βιομάζας (πυρόλυση ή αεριοποίηση) σε βιοαέριο που αποτελεί την πηγή για την περαιτέρω παραγωγή του σύνθετου αερίου με βασικά συστατικά το μονοξείδιο του άνθρακα και το υδρογόνο. Από τα πιο διαδεδομένα αέρια συνθετικά βιοκαύσιμα είναι το βιομεθάνιο που με περαιτέρω επεξεργασία μπορεί να προκύψει υδρογόνο. Συγκεντρωμένα, τα είδη της βιομάζας και οι διαφορετικές οδοί της επεξεργασίας τους προς τα τελικά βιοκαύσιμα πρώτης και δεύτερης γενιάς απεικονίζονται στο Σχήμα

45 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Τα τελευταία χρόνια, το ερευνητικό πεδίο έχει διευρυνθεί προς τα τρίτης γενιάς βιοκαύσιμα, τα οποία αποτελούν τον κλάδο που βρίσκεται ακόμα σε ερευνητικό στάδιο με πολλά περιθώρια ανάπτυξης. Αυτός είναι και ο λόγος που πολλές διαφορετικές διεργασίες αποτελούν βιοκαύσιμα τρίτης γενιάς. Ο όρος αυτός χρησιμοποιείται για πρώτες ύλες βιομάζας που έχουν υποστεί γενετική μετατροπή όπως γενετικά μεταλλαγμένα φυτά με ασθενέστερα κυτταρικά τοιχώματα ώστε να είναι ευκολότερη η υδρόλυση τους. Επίσης οι διεργασίες που περιλαμβάνουν μια ολοκληρωμένη παραγωγή βιοκαυσίμου με παράλληλη παραγωγή ενζύμων από μικροοργανισμούς που διασπούν τη βιομάζα και συγχρόνως μεταβολίζουν τα σάκχαρα προς παραγωγή βιοαιθανόλης ονομάζονται διεργασίες τρίτης γενιάς βιοκαυσίμων διότι περιλαμβάνουν τροποποιημένους μικροοργανισμούς (Carere et al., 2008). Τέλος, η παραγωγή βιοκαυσίμων από βιομάζα προερχόμενη από άλγη αποτελεί διεργασία παραγωγής βιοκαυσίμων τρίτης γενιάς, που χαρακτηρίζεται από υψηλές αποδόσεις βιομάζας ανά μονάδα έκτασης (Singh, 2011) Βιοαιθανόλη δεύτερης γενιάς Η βιοαιθανόλη αποτελεί σημαντική πρόταση στην αντιμετώπιση του προβλήματος που θέτει ο περιορισμός των ενεργειακών αποθεμάτων του πλανήτη, ενώ συγχρόνως συντελεί στη μείωση των αεριών του θερμοκηπίου. Τα οφέλη της βιοαιθανόλης εντοπίζονται κατά την προσθήκη της βιοαιθανόλης στα συμβατικά καύσιμα κίνησης, που αυξάνει τα οκτάνια τους και μειώνει το μονοξείδιο του άνθρακα και τις πτητικές οργανικές ενώσεις στις εκπομπές των καυσαερίων (Hamelinck et al., 2005). Ο λόγος είναι ότι οι αλκοόλες αποτελούν οξυγονούχα καύσιμα καθώς διαθέτουν ένα επιπλέον άτομο οξυγόνου που ελαττώνει τη θερμοκρασία της καύσης. Πρακτικά όλες οι αλκοόλες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για καύσιμο αλλά στην πραγματικότητα ως καύσιμο κίνησης χρησιμοποιείται η μεθανόλη, η βιοαιθανόλη, η προπανόλη και η βουτανόλη. Παρόλα αυτά μόνο η αιθανόλη και η μεθανόλη μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε κινητήρες εσωτερικής καύσης (ICEs) (Balat, 2010). Επιπρόσθετα, η βιοαιθανόλη δεύτερης γενιάς παρουσιάζει πλεονεκτήματα στον κύκλο ανάλυσης ζωής. Οι εκπομπές αερίων του θερμοκηπίου κατά την καύση της βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα είναι μικρότερες σε σχέση με τις εκπομπές της βιοαιθανόλης πρώτης γενιάς. Επιπλέον, παρόλο που η νεότερη τεχνολογία παραγωγής δεύτερης γενιάς -25-

46 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας βιοκαυσίμων αποτελεί περισσότερο απαιτητική διαδικασία καθώς η επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας προηγείται της ζύμωσης των μονομερών σακχάρων, χρησιμοποιεί ως πρώτη ύλη καρπούς που δεν έχουν σημαντική διατροφική αξία και έχουν υψηλή περιεκτικότητα σακχάρων (δομικοί υδατάνθρακες) ανά εκτάριο. Επίσης, μπορούν να καλλιεργηθούν σε χαμηλής παραγωγικότητας εδάφη, όπου το κόστος της χαμηλότερης παραγωγής ανά εκτάριο αντισταθμίζεται από την αναγέννηση του εδάφους και την αποθήκευση άνθρακα, τη βελτιωμένη συγκράτηση νερού και την προστασία των εδαφών από διάβρωση (Menon & Rao 2012). Η αειφόρος αξία της βιοαιθανόλης δεύτερης γενιάς ενισχύεται με τη χρήση φιλικών προς το περιβάλλον ενζυμικών καταλυτών και μικροοργανισμών. Συγκεκριμένα, η παραγωγή της βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα περιλαμβάνει τη θερμοχημική ή τη βιολογική προεπεξεργασία της βιομάζας και τη χρήση ενζύμων κατά τη σακχαροποίηση ώστε να είναι δυνατή στη συνέχεια η ζύμωση των μονομερών σακχάρων από τους κατάλληλους μικροοργανισμούς. Η βελτιστοποίηση της διεργασίας περιλαμβάνει σημαντικά περιθώρια για τη μείωση του κόστους και την επίτευξη της βιωσιμότητας μιας τέτοιας επένδυσης, στο πεδίο των πρώτων υλών (χρήση μεγαλύτερης ποικιλίας λιγνοκυτταρινούχων φυτών), των διεργασιών (γενετικά τροποποιημένοι μικροοργανισμοί) και του κόστους (μελλοντική μείωση του κόστους των ενζύμων). Τα βασικά στάδια της μετατροπής της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας σε βιοαιθανόλη περιλαμβάνουν αρχικά την επιλογή του κατάλληλου φυτού προέλευσης της βιομάζας, την αποτελεσματική προεπεξεργασία του, την παραγωγή σακχαρολυτικών ενζύμων και τη χρήση τους στην υδρόλυση της παραγόμενης κυτταρίνης, την ακόλουθη ζύμωση των παραγόμενων μονομερών σακχάρων καθώς και τις διεργασίες διαχωρισμού και ανάκτησης των παραγόμενων προϊόντων. Η συνολική διεργασία της παραγωγής της βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα μέσω βιοτεχνολογικής οδού απεικονίζεται στο Σχήμα 1.3. Κάθε στάδιο έχει διαφορετικές απαιτήσεις βελτιστοποίησης ανάλογα με την παρούσα τεχνολογία και την τιμή των πρώτων υλών. Το πρώτο στάδιο της διεργασίας αποτελεί η προεπεξεργασία της βιομάζας που περιλαμβάνει τη μηχανική και τη χημική μετατροπή της λιγνοκυτταρίνης σε ευκολότερα προσβάσιμη από τα ένζυμα δομή. Η στερεή κυτταρίνη που παραλαμβάνεται από το στάδιο της προεπεξεργασίας οδηγείται για περαιτέρω επεξεργασία μέσω βιοτεχνολογικής οδού. Αρχικά, -26-

47 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας η μηχανική επεξεργασία στοχεύει στη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων της βιομάζας και στην ευκολότερη επεξεργασία της στα επόμενα στάδια. Ακολούθως, η υδρόλυση μέσω χημικής προεπεξεργασίας αλλάζει τη δομική κατασκευή της λιγνοκυτταρίνης απομακρύνοντας ή διαφοροποιώντας τους δεσμούς της λιγνίνης και υδρολύοντας τις ημικυτταρίνες. Η βιομάζα αποτελείται σε ποσοστό 40-50% από πολυσακχαρίτες της κυτταρίνης, 25-30% από πολυσακχαρίτες των ημικυτταρινών, 15-20% από λιγνίνη και σε πολύ μικρότερο ποσοστό από άλλα συστατικά (πρωτεΐνες, στάχτη κ.α.). Τα διαλυτά σάκχαρα των ημικυτταρινών που λαμβάνονται στο στάδιο της προεπεξεργασίας και περιλαμβάνονται στο υγρό ρεύμα εξόδου είναι η ξυλόζη σε μεγαλύτερο ποσοστό και η αραβινόζη σε μικρότερη ποσότητα που αποτελούν τις πεντόζες του υδρολύματος των μονομερών σακχάρων και η γαλακτόζη, η μαννόζη και η γλυκόζη που αποτελούν τις εξόζες. Αναφορικά με τη λιγνίνη που περιλαμβάνεται στο στερεό τμήμα της προεπεξεργασίας, αποτελεί ένα σύνθετο, υδροφοβικό αρωματικό πολυμερές που επηρεάζει το στάδιο της υδρόλυσης. Τα δομικά συστατικά της είναι μεγάλα φαινολικά μόρια και συγκεκριμένα η π-κουμαρική αλκοόλη, η κωνοφερυλική αλκοόλη και η σιναπυλική αλκοόλη που βρίσκουν ευρύ πεδίο εφαρμογών (Menon & Rao 2012). Συνεπώς, η προεπεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας παράγει δύο ρεύματα, το υγρό τμήμα όπου περιλαμβάνονται τα υδρολυμένα μονομερή σάκχαρα των ημικυτταρινών και το στερεό τμήμα όπου περιέχεται η αδιάλυτη κυτταρίνη και η λιγνίνη. Το επόμενο στάδιο της προεπεξεργασίας αποτελεί ο χειρισμός της διαθέσιμης πλέον κυτταρίνης μέσω ενζύμων που δρουν καταλυτικά στην υδρόλυση της κυτταρίνης για τη μετατροπή της σε μονομερή σάκχαρα που με τη σειρά τους θα αποτελέσουν πρώτη ύλη για τη ζύμωση. Το στάδιο ονομάζεται ενζυμική υδρόλυση, όπου η κυτταρίνη υδρολύεται στο δομικό μονομερές της σάκχαρο, τη γλυκόζη μέσω της στοιχειομετρικής εξίσωσης 1.1: (C6H10O5)n+n H2O n C6H12O6 (1.1) Παρόλο που η υδρόλυση θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί με τη χρήση οξέων, προτιμάται η υδρόλυση με τη χρήση βιολογικών καταλυτών καθώς τα ένζυμα είναι φιλικότερα στο περιβάλλον. Επιπλέον, η χρήση των ενζύμων καταλήγει σε καταλληλότερο υδρόλυμα για την περαιτέρω καλλιέργεια μικροοργανισμών προς παραγωγή αιθανόλης χωρίς την παρουσία παρεμποδιστικών ενώσεων (Wooley et al., 2007). -27-

48 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Η υδρόλυση καταλύεται από τα εξειδικευμένα ένζυμα, τις κυτταρινάσες (Alvira et al., 2010) που συνήθως λειτουργούν ως σύστημα ενζύμων των ενδογλυκανασών (ή 1,4-β-D-γλυκανό- 4-γλυκανουδρολάσες), των εξωγλυκανασών (ή 1,4-β-D-γλυκανό-γλυκανουδρολάσες), των κελλοβιοϋδρολασών (ή 1,4-β-D-γλυκανο-κελλοβιοϋδρολάσες) και των β-γλυκοσιδασών (Zhang & Lynd 2004). Η αποτελεσματική ενζυμική υδρόλυση καταλήγει σε υδρόλυμα μονομερών σακχάρων με υψηλές συγκεντρώσεις ζυμώσιμων σακχάρων και παράλληλα με μειωμένη παρουσία παρεμποδιστικών ενώσεων ώστε να πραγματοποιηθεί στη συνέχεια ζύμωση για την παραγωγή αιθανόλης από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Συγκεκριμένα, η υψηλή συγκέντρωση σακχάρων οδηγεί με τη σειρά της σε υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης που επιτρέπουν αποτελεσματικότερη ανάκτηση των τελικών προϊόντων. Οπότε, η μελέτη του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης προσανατολίζεται στη βελτιστοποίηση των συνθηκών της διεργασίας, στη σύνθεση του μίγματος των κυτταρινασών, στην ενίσχυση της δραστικότητας των χρησιμοποιούμενων ενζύμων, στην ανακύκλωση και επαναχρησιμοποίηση των ενζύμων ώστε να υπάρξει βελτίωση των αποδόσεων του σταδίου. Κρίσιμο σημείο της βελτιστοποίησης του σταδίου αποτελεί η αύξηση του αρχικού στερεού υποστρώματος που οδηγεί σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης. Η αρχική υψηλή συγκέντρωση στερεού έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του ιξώδους της αντίδρασης, χαρακτηριστικό που θέτει περιορισμούς στο όριο της αρχικής ποσότητας. Συνεπώς, η εφαρμογή τεχνικών ημι-συνεχούς τροφοδοσίας της βιομάζας αντιμετωπίζει τα εμπόδια μεταφοράς μάζας που προκύπτουν κατά τη χρήση υψηλών συγκεντρώσεων βιομάζας (Rosgaard et al.,2007). Παρόλο που οι τεχνικές της υδρόλυσης των πολυσακχαριτών με τη χρήση των ενζύμων μελετώνται εδώ και δεκαετίες, υπάρχει περιθώριο μελέτης της ενζυμικής υδρόλυσης της κυτταρίνης καθώς πρόκειται για διεργασία φιλικότερη προς το περιβάλλον που ολοκληρώνει την ιδέα των βιοκαυσίμων δεύτερης γενιάς. -28-

49 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.3. Διάγραμμα ροής της βιοτεχνολογικής παραγωγής βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα Το επόμενο στάδιο που ακολουθεί είναι η ζύμωση των φυσικών σακχάρων της βιομάζας από σακχαρομύκητες ή βακτήρια τα οποία χρησιμοποιούν ως πηγή άνθρακα τα μονομερή σάκχαρα (γλυκόζη) του ενζυμικού υδρολύματος καθώς και αυτά που προήλθαν από την υδρόλυση των ημικυτταρινών (κυρίως ξυλόζη). Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται κυρίως είναι οι Saccharomyces, Kluveryomyces, Debaryomyces, Pichia, Zymomonas καθώς και τα ανασυνδυασμένα στελέχη τους. Συγκεκριμένα, ο μικροοργανισμός Saccharomyces cerevisiae παρουσιάζεται κατάλληλος για τη ζύμωση της γλυκόζης καθώς χρησιμοποιείται παραδοσιακά σε τεχνολογίες αλκοολικής ζύμωσης. Επιπρόσθετα, εφαρμόζονται τεχνολογίες μεταβολικής μηχανικής ώστε να παρασκευαστούν ανασυνδυασμένα πλασμίδια που να περιλαμβάνουν γονίδια παραγωγής ξυλανασών ώστε να χρησιμοποιηθεί το στέλεχος αυτό σε ταυτόχρονη ζύμωση τόσο της γλυκόζης όσο και της ξυλόζης. Στη συνέχεια, η παραγωγή διαλύματος με υψηλή συγκέντρωση αιθανόλης στα όρια της ανοχής του μικροοργανισμού αποτελεί επίσης αντικείμενο ενδιαφέροντος καθώς και η ανοχή συγκεκριμένων στελεχών των μικροοργανισμών σε παρεμποδιστικές ενώσεις σε υψηλή συγκέντρωση από τα προηγούμενα στάδια της επεξεργασίας (Huang et al., 2011). Σημαντικό πεδίο μελέτης αποτελεί η ταυτόχρονη σακχαροποίηση και ζύμωση των παραγόμενων σακχάρων (SSF). Η SSF είναι μία διαφορετική τεχνολογία ζύμωσης σε σχέση με τη ξεχωριστή ενζυμική υδρόλυση και ζύμωση (SHF), που πραγματοποιείται στο ίδιο στάδιο τόσο η υδρόλυση της κυτταρίνης όσο και η ζύμωση των σακχάρων σε αιθανόλη. -29-

50 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Συγκεκριμένα, στη μέθοδο αυτή δίνεται προσοχή στις συνθήκες του ενιαίου σταδίου ώστε να είναι προσαρμοσμένες στη δράση τόσο των ενζύμων όσο και του μικροοργανισμού της ζύμωσης. Επίσης, σε ερευνητικό ακόμα επίπεδο, μελετάται η ολοκληρωμένη βιοχημική διεργασία (CBP) όπου στο ίδιο στάδιο παράγονται τα υδρολυτικά ένζυμα, δρουν προς τη σακχαροποίηση της κυτταρίνης και συγχρόνως ο μικροοργανισμός χρησιμοποιεί τα σάκχαρα προς παραγωγή αιθανόλης (Xu et al., 2009). Η CBP απαιτεί κατάλληλα τροποποιημένους μικροοργανισμούς ώστε να έχουν τριπλή εξειδικευμένη δράση. Τέλος, το στάδιο της ανάκτησης της βιοαιθανόλης περιλαμβάνει την απόσταξη και τη συμπύκνωση του ρεύματος εξόδου της ζύμωσης μέσω διαφόρων τεχνολογιών. Βασική αρχή του σχεδιασμού του σταδίου της ανάκτησης είναι η μείωση του κόστους της συνολικής διεργασίας. Καθώς, το στάδιο της απόσταξης μειώνει το κόστος του όσο αυξάνεται η περιεκτικότητα του ρεύματος εξόδου της ζύμωσης σε βιοαιθανόλη ( 5%) (Huang et al., 2011), η ζύμωση που οδηγεί σε πλούσιο ρεύμα αιθανόλης ευνοεί το ακόλουθο στάδιο της ανάκτησης. Το μειονέκτημα της απόσταξης είναι ότι οδηγεί στο αζεότροπο μίγμα νερού αιθανόλης 95%. Μία άλλη μέθοδος διαχωρισμού του υδατικού διαλύματος της αιθανόλης είναι η διεξάτμιση, η οποία αντικαθιστά την παραδοσιακή μέθοδο της απόσταξης ή την ακολουθεί σε σειρά συμπυκνώνοντας το υδατικό διάλυμα της αιθανόλης σημειώνοντας υψηλές αποδόσεις. Η διεξάτμιση αποτελεί μία λειτουργική μονάδα για το διαχωρισμό δύο συστατικών στην οποία συνδυάζονται δύο ιδιότητες, η διαφορά στην διαπερατότητα των δύο συστατικών μέσω μίας μη πορώδους ημιπερατής μεμβράνης και η εξατμιστική μέθοδος μέσω αλλαγής φάσης από υγρό σε αέριο (O Brien et al., 1996). -30-

51 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας 1.2 Εισαγωγή στα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας μέσω βιοδιυλιστηρίου Η ιδέα ενός σύγχρονου βιοδιυλιστηρίου στηρίζεται στο συνδυασμό της παραγωγή του βιοκαυσίμου μεγάλης δυναμικότητας αλλά με χαμηλότερη προστιθέμενη αξία, με την παραγωγή βιοχημικών χαμηλότερης δυναμικότητας μεν αλλά με υψηλότερη προστιθέμενη αξία. Η χαμηλότερη τιμή πώλησης της βιοαιθανόλης σε συνδυασμό με την πώληση υψηλής προστιθέμενης αξίας βιοχημικών αποτελεί καινοτομία που καθιστά οικονομικό το εγχείρημα της παραγωγής βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα (Fang et al., 2010). Μία μονάδα βιο-διυλιστηρίου παρουσιάζεται ως βιωσιμότερη επιλογή καθώς πραγματοποιείται συγχρόνως παραγωγή ηλεκτρισμού και θέρμανσης ώστε να καλύπτονται οι ίδιες ανάγκες της. Επιπρόσθετα, τα υλικά υψηλής προστιθέμενης αξίας προσθέτουν επιπλέον κέρδος στην επιχείρηση και τα βιοκαύσιμα καλύπτουν τις κρατικές ενεργειακές δεσμεύσεις που έχει θέσει η Ευρωπαϊκή Ένωση. Είναι η φύση της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, που αποτελεί μια σύνθετη πηγή διαφορετικών συστατικών, που την καθιστά συγκρίσιμη με το ακατέργαστο πετρέλαιο και δίνει τη δυνατότητα μιας ολοκληρωμένης μονάδας μετατροπής της βιομάζας σε βιοκαύσιμα, ενέργεια και βιοχημικά υλικά ανάλογη του συμβατικού διυλιστηρίου. Επιπλέον, η σύσταση της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας της δίνει ακόμα ένα συγκριτικό πλεονέκτημα σε σχέση με τα ορυκτά καύσιμα που έχουν περιορισμένα συστατικά καθώς αποτελείται από ετερογενή υλικά όπως είναι η κυτταρίνη, οι ημικυτταρίνες και η λιγνίνη. Η συγκεκριμένη λιγνοκυτταρινική φύση της βιομάζας απαιτεί συμβατικές θερμοχημικές διεργασίες σε συνδυασμό με τελευταίας τεχνολογίας βιοτεχνολογικές εφαρμογές για να παραχθούν βιοκαύσιμα σε συνδυασμό με υψηλής προστιθέμενης αξίας υλικά όπως ξυλιτόλη, ηλεκτρικό οξύ, γαλακτικό οξύ και άλλα, που αποτελούν ενδιάμεσα ή και τελικά χημικά προϊόντα. Στην περίπτωση επομένως του βιοδιυλιστηρίου, η εφαρμογή του μπορεί να γίνει ρεαλιστική εάν εκμεταλλευτεί όλο το φάσμα των δομικών συστατικών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας όπως οργανικά μακρομόρια (υδρογονάνθρακες, λιπίδια, πρωτεΐνες, λιγνίνη) καθώς και άλλα χημικά συστατικά (αντιοξειδωτικά, λειτουργικές πρωτεΐνες). Η πληθώρα των προϊόντων που μπορούν να προέλθουν από την επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας ποικίλει από εμπορεύματα χαμηλής προστιθέμενης αξίας όπως τα βιοκαύσιμα και τα βιοαποικοδομήσιμα πλαστικά σε ενδιάμεσα συστατικά υψηλής προστιθέμενης αξίας όπως είναι το ηλεκτρικό και το γαλακτικό οξύ καθώς και στοχευμένα χημικά για φαρμακευτικές -31-

52 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας εφαρμογές. Η ολοκληρωμένη εκμετάλλευση της βιομάζας θα οδηγήσει σε βελτίωση της οικονομικότητας της διεργασίας καθώς και σε ελαχιστοποίηση των αποβλήτων. Επίσης, η εφαρμογή των τεχνολογιών ενός βιοδιυλιστηρίου θα δώσει νέες δυνατότητες τόσο στη γεωργική παραγωγή όσο και στη χημική βιομηχανία για την παραγωγή υλικών, καυσίμων κίνησης και ενέργειας. Σαφέστατα, η ύπαρξη μειονεκτημάτων και εμποδίων είναι γνωστή, όπως για παράδειγμα η απαίτηση μεγάλων γεωργικών εκτάσεων για την υποστήριξη μεγάλων μονάδων παραγωγής βιοκαυσίμων και βιοενέργειας. Πάνω σε αυτά τα αντικείμενα στοχεύει η παγκόσμια έρευνα ωστε να υπερβεί εμπόδια όπως το χαμηλό ενεργειακό περιεχόμενο της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, η εποχικότητα της παραγωγής της και η γεωγραφική εκλεκτικότητα. Το Παράρτημα Ενέργειας των Ηνωμένων Πολιτειών (U.S. Energy Department, DOE) ταυτοποίησε τα υψηλής αξίας χρηστικά χημικά ώστε να κατευθύνει την παραγωγή τους με βάση τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Τα υλικά αυτά αποτελούν πρόδρομες ενώσεις για γνωστά χημικά ευρείας χρήσεως. Η αιθανόλη είναι το πιο διαδεδομένο προϊόν που προέρχεται από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα και ο συνδυασμός της παραγωγής της με ένα ευρύ πεδίο χημικών ενισχύει τις πιθανότητες βιομηχανικής εφαρμογής. Οι γενικές κατηγορίες υλικών που προκύπτουν από τους φυσικής προέλευσης υδρογονάνθρακες είναι τα φυσικά πολυμερή, τα λιπαρά οξέα και τα έλαια, τα τερπενοειδή, οι υδρογονάνθρακες και τα μικροβιακά παραγόμενα προϊόντα (Σχήμα 1.4). H παρούσα κατάσταση των βιομηχανιών που βασίζονται στη λινγοκυτταρίνη παρουσιάζει ανοδική πορεία. Η παγκόσμια παραγωγή της βιοαιθανόλης αυξήθηκε από 17,25 δισεκατομμύρια λίτρα το 2000 σε πάνω από 46 δισεκατομμύρια το 2007, μία αύξηση που αντιστοιχεί στο 4% των 1300 δισεκατομμυρίων λίτρων βενζίνης που παράγονται παγκοσμίως. Τα χρηματοδοτικά προγράμματα σε Ευρώπη, Ασία και Αμερική κατευθύνουν την έρευνα και την παραγωγή σε αύξηση της παραγωγής αιθανόλης και βιοϋλικών γενικώς. Ήδη λειτουργούν, ή έχει ξεκινήσει ο σχεδιασμός για τη λειτουργία τους, μονάδες στις Η.Π.Α. που χρησιμοποιούν το καλαμπόκι για την παραγωγή βιοαιθανόλης και γαλακτικού οξέος καθώς και για την παραγωγή πολύ (ύδροξυ-αλκανοϊκών) εστέρων (PHAs) και 1,3-προπανεδιόλης (Koutinas et al., 2007). H BetaRenewables (Chemtext) προετοιμάζει τη λειτουργία μελλοντικής μονάδας παραγωγής ποικίλων βιοχημικών υλικών προερχόμενων από την επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, όπως είναι η n-βουτανόλη, η ισοβουτανόλη, -32-

53 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας 1,4-βουτανεδιόλη, οι λιπαρές αλκοόλες, η αιθυλενογλυκόλη, τα οργανικά οξέα: γαλακτικό, ηλεκτρικό, ακρυλικό και αδιπικό οξύ καθώς και αρωματικές ενώσεις, τερεθφαλικό οξύ και φαινόλες προερχόμενες από την κατεργασία της λιγνίνης. Παρακάτω, απεικονίζονται συγκεντρωτικά οι ενώσεις που μπορούν να εξαχθούν κατά την επεξεργασία των δομικών συστατικών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας καθώς και οι περαιτέρω εφαρμογές τους (Σχήμα 1.4). Σχήμα 1.4. Προτεινόμενη στρατηγική βιοδιυλιστηρίου βασισμένου στην επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας για την παραγωγή βιοαιθανόλης και ποικιλίας βιοχημικών υλικών και χημικών που προέρχονται από θερμοχημική διεργασία. -33-

54 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Το Σχήμα 1.4 απεικονίζει μία προτεινόμενη στρατηγική που χρησιμοποιεί τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα ως μοναδική πρώτη ύλη και μέσα από μια σειρά θερμοχημικών και βιοτεχνολογικών διεργασιών καταλήγει σε ένα ευρύ φάσμα προϊόντων. Τα μονομερή σάκχαρα που προήλθαν από την υδρόλυση της κυτταρίνης αλλά και των ημικυτταρινών οδηγούνται σε χημικές επεξεργασίες για παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Μέσω διαφορετικών οδών και συγκεκριμένα μέσω βιολογικής κατεργασίας τα μονομερή σάκχαρα καταναλώνονται από διαφορετικούς μικροοργανισμούς. Τα παραγόμενα προϊόντα ποικίλουν περιλαμβάνοντας ένα ευρύ φάσμα από βιοαιθανόλη μέχρι πληθώρα βιοχημικών υλικών όπως γαλακτικό, ηλεκτρικό και προπιονικό οξύ καθώς και βιοπολυμερών. Η λιγνίνη με τη σειρά της επεξεργάζεται μέσω βιοτεχνολογικής οδού για περαιτέρω υλικά σημαντικής εμπορικής αξίας όπως φαινόλες και ρητίνες καθώς και για πελλέτες στερεών καυσίμων. Επίσης, τα υπολείμματα της ζύμωσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ανάκτηση πρωτεϊνών και διατροφικών συμπληρωμάτων. Κάτι τέτοιο θα μείωνε το κόστος θρεπτικών συμπληρωμάτων για τα στάδια της ζύμωσης (Fang et al., 2010). Οι εφαρμογές των συστατικών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας επεκτείνονται σε χρήσεις όπως καύσιμα, ξυλεία, πολτών και υφασμάτων. Η καθαρή κυτταρίνη χρησιμοποιείται για παραγωγή χαρτιού απαλλαγμένο από ξύλο, σελοφάν, φωτογραφικών φιλμ, μεμβρανών, εκρηκτικών, ινών υφάσματος, πολυμερών διαλυτών σε οργανικούς διαλύτες που χρησιμοποιούνται σε βαφές και βερνίκια. Στη συνέχεια, και πιο εξειδικευμένα υλικά μπορούν να παραχθούν από την ενζυμική υδρόλυση και τη ζύμωση. Για παράδειγμα το γλουταμινικό οξύ παράγεται μικροβιακά με παραγωγή 1,7 δις kg/χρόνο παγκοσμίως, το κιτρικό οξύ επίσης με παραγωγή 1,6 δις kg/χρόνο παγκοσμίως και η λυσίνη παράγεται επίσης μικροβιακά με παραγωγή 850 εκατομμύρια kg/χρόνο παγκοσμίως (Menon et al., 2012). -34-

55 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Ηλεκτρικό Οξύ Το ηλεκτρικό οξύ είναι ένα δικαρβοξυλικό οξύ με μοριακό τύπο C4H6O4. Μετά την πρώτη φορά που απομονώθηκε από τον Agricola το 1546, παράγεται μικροβιολογικά για χρήση στο γεωργικό, διατροφικό και φαρμακευτικό τομέα. Σήμερα, παράγεται κυρίως μέσω χημικής διεργασίας που χρησιμοποιεί ως πρώτη ύλη το υγροποιημένο αέριο πετρελαίου (LPG) ή το πετρέλαιο. Το ηλεκτρικό οξύ αποτελεί πρόδρομη ένωση για μια σειρά σημαντικών χημικών ενώσεων όπως είναι το αδιπικό οξύ, η 1,4-βουτανεδιόλη, η τετραϋδροφουράνη, η Ν-μεθυλο πυρρολιδινόνη, η 2-πυρρολιδινόνη, το άλας του ηλεκτρικού οξέος και η γ-βουτυρολακτόνη (Σχήμα 1.5). Επίσης χρησιμοποιείται για τη σύνθεση βιο-αποικοδομήσιμων πολυμερών όπως είναι οι πολύ (ηλεκτρικοί) βουτυλεστέρες (PBS) και τα πολυαμίδια (Nylon x,4). Σχήμα 1.5. Διάφορα προϊόντα και χημικές ενώσεις που παρασκευάζονται από το ηλεκτρικό οξύ. Σήμερα, η βασική παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος πραγματοποιείται μέσω της χημικής μετατροπής του μηλεϊνικού ανυδρίτη. Η τιμή πώλησης είναι $/kg και παρουσιάζεται υψηλή λόγω της υψηλής τιμής αντίστοιχα του μηλεϊνικού ανυδρίτη που οφείλεται στη -35-

56 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας δύσκολη διαδικασία ανάκτησης του. Το 2002, η τιμή πώλησης του μηλεϊνικού ανυδρίτη ήταν 0,977 $/kg και η θεωρητική απόδοση της μετατροπής του σε ηλεκτρικό οξύ είναι 95%. Συμπεραίνεται επομένως, ότι η τιμή της πρώτης ύλης επί της τιμής του προϊόντος είναι 1,027 $/kg ηλεκτρικού οξέος. Αν ληφθεί υπόψη ότι η τιμή πώλησης της γλυκόζης που παρασκευάζεται παγκοσμίως είναι περίπου 0,428 $/ kg, συμπεραίνεται ότι η βιολογική μετατροπή της σε ηλεκτρικό οξύ και συγκεκριμένα από λιγνοκυτταρινική βιομάζα μπορεί να γίνει ανταγωνιστική με τη χημική παρασκευή του οξέος. Επίσης, το ηλεκτρικό οξύ αποτελεί μία από τις σημαντικότερες δομικές χημικές ενώσεις που εξέδωσε το Παράρτημα Ενέργειας των Ηνωμένων Πολιτειών (FitzPatrick et al., 2010) που παράγεται με τη μέθοδο της ζύμωσης των σακχάρων από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Η ζύμωση της γλυκόζης και της ξυλόζης παράγει ηλεκτρικό οξύ με παράλληλη κατανάλωση CO2 του άνθρακα που την καθιστά πράσινη τεχνολογία. Το ηλεκτρικό οξύ χρησιμοποιείται ευρέως στη χημική βιομηχανία που ο βραβευμένος με Νόμπελ Robert Knock απέδειξε ότι η συγκέντρωση του στο ανθρώπινο σώμα δε προκαλεί καμία παρενέργεια. Οι μικροοργανισμοί που μεταβολίζουν τη γλυκόζη και την ξυλόζη για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος είναι τα βακτήρια Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Anaerobiospirillum succiniciproducens καθώς και κάποια ανασυνδυασμένα στελέχη του Escherichia coli. Τα άγρια στελέχη παράγουν μέσω αναερόβιας ζύμωσης το κύριο καταβολικό τους προϊόν που είναι το ηλεκτρικό οξύ μέσω του κύκλου του τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA). Η ζύμωση των σακχάρων από τον μικροοργανισμό ουδετεροποιείται παράλληλα με την παραγωγή του προϊόντος καθότι οι μικροοργανισμοί δεν παρουσιάζουν αντοχή σε όξινες συνθήκες. Η ανάκτηση του ηλεκτρικού οξέος από το διάλυμα της ζύμωσης όπου βρίσκονται τα άλατα του ηλεκτρικού οξέος γίνεται με διαλυτοποίηση των αλάτων σε όξινο διάλυμα (Carole et al., 2004, FitzPatrick et al., 2010). -36-

57 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας 1.3 Λιγνοκυτταρινική βιομάζα Η λιγνοκυτταρινική βιομάζα έχει αναγνωριστεί ως πιθανή οικονομικότερη πρώτη ύλη για παραγωγή βιοαιθανόλης από ζυμώσιμα σάκχαρα καθώς αποτελεί φθηνό και εύκολα διαθέσιμο υλικό. Στην κατηγορία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας περιλαμβάνονται τα δασικά υπολείμματα, τα αστικά στερεά υπολείμματα (χάρτινα απορρίμματα), τα αγροτικά υπολείμματα (άχυρο, υπολείμματα ρυζιού, κοτσάνια καλαμποκιού, βαγάσση ζαχαροκάλαμου) και τα ενεργειακά φυτά που δεν ανταγωνίζονται τα φυτά που χρησιμοποιούνται για τροφή όπως είναι τα ποώδη φυτά (switchgrass, Phalaris aquatica, Phalaris arundinacea). Το switchgrass και η υβριδική λεύκα αποτελούν το ήμισυ του 1,3 δισεκατομμυρίων τόνων βιομάζας που υπολογίζεται ότι θα είναι διαθέσιμη στα μέσα του 21 ου αιώνα (Perlack et al., 2005). Το υπόλειμμα ρυζιού είναι από τα πιο άφθονα λιγνοκυτταρινικά υλικά καθώς παράγονται ετησίως 731 εκατομμύρια τόνοι σε παγκόσμιο επίπεδο (Balat, 2010). Τα λιγνοκυτταρινούχα φυτά με τις υψηλότερες διαθέσιμες ποσότητες στην Ευρώπη είναι τα γεωργικά υπολείμματα, για παράδειγμα, το άχυρο με 132,59 εκατομμύρια τόνους ετησίως και το υπόλειμμα καλαμποκιού με 28,61 εκατομμύρια τόνους ετησίως (Sarkar et al., 2012). Τα γεωργικά υπολείμματα αποτελούν προτεινόμενη πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμων λόγω του υψηλού αποθέματος πρώτων υλών. Η χρήση των υπολειμμάτων σε άλλες εφαρμογές είναι πολύ χαμηλή και διαφοροποιείται ανά περιοχή. Συγκεκριμένα, υπάρχουν κάποιες εφαρμογές στο πεδίο των ζωοτροφών, στο οικιακό καύσιμο καθώς και στην καύση σε καυστήρες. Ωστόσο, το μεγαλύτερο ποσοστό τους απορρίπτεται χωρίς καμία εφαρμογή, αυξάνοντας το μέγεθος των απορριμμάτων και τη δημόσια υγεία σε περίπτωση καύσης ανοιχτού πεδίου. Πάνω από το 90% του υπολείμματος καλαμποκιού στις Ηνωμένες Πολιτείες αφήνεται στους αγρούς και λιγότερο από το 1% του άχυρου βρίσκει βιομηχανική εφαρμογή. Η χρήση των υλικών αυτών ως πρώτη ύλη για παραγωγή βιοαιθανόλης μπορεί να αυξήσει την παραγωγή κατά 205 δισεκατομμύρια λίτρα ετησίως (Sarkar et al., 2012). Η πρόκληση, που προκύπτει κατά την παραγωγή της βιοαιθανόλης από την λιγνοκυτταρινική βιομάζα, είναι το σπάσιμο της φυσικής προστασίας που έχουν αναπτύξει τα λιγνοκυτταρινούχα φυτά σε εξωτερικές επιρροές, ώστε να είναι οικονομικά βιώσιμη η εφαρμογή της τεχνολογίας παραγωγής. Τα φυτά διαθέτουν δομικά συστατικά που λειτουργούν ως προστασία για τους δομικούς πολυσακχαρίτες τους. Οι νέες τεχνολογίες -37-

58 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας στοχεύουν στην αποικοδόμηση των κυτταρικών τοιχωμάτων των φυτών χωρίς την εφαρμογή έντονων συνθηκών που θα οδηγήσουν σε παρεμπόδιση της ζύμωσης των παραγόμενων σακχάρων από τον μικροοργανισμό. Εφόσον αναπτυχθεί η τεχνολογία αποικοδόμησης, τα διαθέσιμα φυσικά σάκχαρα που προέρχονται από τους δομικούς πολυσακχαρίτες του φυτού είναι σε θέση να χρησιμοποιηθούν σε πληθώρα εφαρμογών όπως αναφέρθηκαν στις Παραγράφους 1.1 και 1.2. Κάποια από τα συχνότερα λιγνοκυτταρινικά φυτά που έχουν μελετηθεί για ολοκληρωμένη επεξεργασία προς παραγωγή ζυμώσιμων σακχάρων είναι τα ποώδη φυτά. Το 40-80% των φυτών αυτών αποτελούν τα κυτταρικά τοιχώματα με δομική μονάδα τους πολυσακχαρίτες (κυτταρίνη και ημικυτταρίνες). Η λιγνίνη, που λειτουργεί ως αντιμικροβιακή προστασία και προσφέρει ανθεκτικότητα στο φυτό, παρουσιάζεται αυξημένη σε μεγαλύτερα φυτά με ισχυρότερο σκελετό όπως τα ξυλώδη. Για παράδειγμα, το άχυρο είναι πλούσιο σε δομικούς υδατάνθρακες και συγκεκριμένα αποτελείται από 35-45% κυτταρίνη και 20-30% ημικυτταρίνες ενώ το υπόλοιπο 8-15 % είναι λιγνίνη, το 13,2% πρωτεΐνες και στάχτη. Κάποια από τα πιο διαδεδομένα λιγνοκυτταρινικά υλικά αναλύονται στον Πίνακα 1.1 για το ποσοστιαίο τους περιεχόμενο σε δομικούς πολυσακχαρίτες και λιγνίνη (Mosier et al., 2005). Το υψηλό ποσοστό δομικών πολυσακχαριτών είναι καθοριστικό για την επιλογή της υποψήφιας λιγνοκυτταρινικής βιομάζας ως κατάλληλη πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμου. Ενώ από την άλλη πλευρά, η λιγνίνη αποτελεί εμπόδιο για την παραλαβή των ζυμώσιμων μονομερών σακχάρων, που οι τεχνολογίες παραγωγής βιοκαυσίμων καλούνται να ξεπεράσουν. Η παραγωγή βιοκαυσίμων και βιοϋλικών υψηλής προστιθέμενης αξίας από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα συνδέεται άμεσα με τη δυνατότητα παραλαβής των μονομερών φυσικών σακχάρων της βιομάζας που αποτελούν τα δομικά της συστατικά. Κάθε μέθοδος που εφαρμόζεται στοχεύει στην παραλαβή των φυσικών σακχάρων με διαφορετικό τρόπο. Η ποικιλία των χειρισμών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας οφείλεται στη διαφοροποίηση των φαινομένων της αλληλεπίδρασης της βιομάζας με τα πρωτεϊνικά μακρομόρια των πρωτεϊνών κατά την ενζυμική υδρόλυση της βιομάζας. Ο στόχος της δράσης των ενζύμων είναι η αλλοίωση της επιφάνειας της βιομάζας προς παραγωγή μονομερών σακχάρων και ολιγοσακχαριτών. Τέλος, σημαντικό πεδίο στην εξέλιξη της τεχνολογίας παραγωγής βιοαιθανόλης και βιοχημικών από λιγνοκυτταρινική βιομάζα αποτελούν οι παράγοντες που -38-

59 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας επηρεάζουν την παραγωγικότητα του φυτού. Συγκεκριμένα, έμφαση δίνεται στην ικανότητα του φυτού να αποθηκεύει απόθεμα πολυσακχαριτών κατά την ανάπτυξη του. Τα ενεργειακά φυτά καλλιεργούνται σε οριακές εκτάσεις, μη παραγωγικές, οπότε είναι σημαντικά τα χαρακτηριστικά εκείνα του φυτού που το καθιστούν ανεκτικό σε ξηρασία, χαμηλές θερμοκρασίες και άλλες στρεσογόνες συνθήκες. Συνεπώς, την περισσότερη προσοχή έχουν συγκεντρώσει τα πολυετή φυτά, για τη χρήση τους ως ενεργειακά φυτά. Πίνακας 1.1. Σύσταση επί ξηρής βιομάζας σε ποσοστό % για διάφορα είδη Βιομάζα Κοτσάνια καλαμποκιού Ίνες καλαμποκιού λιγνοκυτταρινικής βιομάζας Γλυκάνες (Κυτταρίνη) Ξυλάνες (Ημικυτταρίνες) Λιγνίνη 37,5 22,4 17,6 14,3 16,8 8,4 Πεύκο 46,4 8,8 29,4 Λεύκα 49,9 17,4 18,1 Άχυρο 38,2 21,2 23,4 Switchgrass 31 20,4 17,6 Χαρτί 68,6 12,4 11, Χαρακτηριστικά του Phalaris aquatιca Η βιομάζα Phalaris aquatica L. αποτελεί ένα πολυετές φυτό, χαρακτηριστικό είδος της περιοχής της Μεσογείου. Η Phalaris aquaticα L., γνωστή και ως φαλαρίδα είναι ένα πολυετές αγρωστώδες φυτό που θεωρείται σημαντικά παραγωγικό και κατάλληλο για βοσκή. Ανήκει στην οικογένεια Poaceae και αναγνωρίζεται βοτανικά με τα ονόματα Phalaris commutata, Phalaris bulbosa, Phalaris stenoptera και Phalaris tuberosa (Anderson, 1961). Στις ΗΠΑ, η βασική κοινή ονομασία για τη φαλαρίδα είναι χόρτο του Harding σε αναγνώριση του Mr. Harding για τις προσπάθειές του για την αξιολόγηση και τη διανομή του φυτού. -39-

60 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Τα τελευταία χρόνια υπάρχει μεγάλο περιθώριο έρευνας σχετικά με τη χρήση των πολυετών φυτών ως πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Τα πολυετή φυτά διαθέτουν πλειοψηφία πλεονεκτημάτων σε σχέση με τα συμβατικά ετήσια φυτά. Αρχικά έχουν όριο ζωής περισσότερο από δέκα έτη και αυτός είναι ο λόγος που έχουν λιγότερες απαιτήσεις καλλιέργειας σε σχέση με τα συμβατικά φυτά. Συνεπώς είναι μειωμένες οι ανάγκες τους σε εντομοκτόνα, μικροβιοκτόνα και ζιζανιοκτόνα σε σχέση με τα συμβατικά φυτά. Επίσης, ο μηχανικός εξοπλισμός που απαιτούν κατά την καλλιέργεια τους είναι συνήθως για κάθε παραγωγό κοινός με τον εξοπλισμό για χορτάρι σε συγκεκριμένες καλλιέργειες. Σημαντικό επίσης πλεονέκτημα των πολυετών φυτών είναι οι μειωμένες ανάγκες τους σε θρεπτικά συστατικά καθώς τα διατροφικά τους συστατικά πραγματοποιούν κύκλο μέσα στα χρόνια. Ακόμα, έχουν ισχυρό ριζικό σύστημα με αποτέλεσμα να διατηρούν μεγάλες ποσότητες άνθρακα στο χώμα. Τα ποώδη πολυετή φυτά δεσμεύουν φορές περισσότερο διοξείδιο του άνθρακα σε σχέση με τις συμβατικές γραμμικές καλλιέργειες. Σε εύκρατα κλίματα όπως το μεσογειακό, η ετήσια παραγωγή βιομάζας των πολυετών καλλιεργειών μπορεί να είναι σημαντικά υψηλότερη από την παραγωγή των ετήσιων καλλιεργειών. Επίσης, το ενεργειακό τους περιεχόμενο είναι 6 με 18 φορές περισσότερο από την ενέργεια που απαιτούν για την καλλιέργεια και τη μεταφορά τους για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Η τιμή του βασικού αγροτικού προϊόντος παραμένει σχετικά σταθερή τα τελευταία είκοσι χρόνια σε αντίθεση με τα ορυκτά καύσιμα που η τιμή τους έχει αυξηθεί δραστικά τα τελευταία χρόνια. Η διαθέσιμη γη για καλλιέργεια ενεργειακών φυτών και συγκεκριμένα πολυετών για την παραγωγή βιοκαυσίμων υπολογίζεται σε 8,5 και 52,6 εκατομμύρια εκτάρια σε Καναδά και Η.Π.Α. (Wrobel et al., 2009). -40-

61 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.6. Το φυτό Phalaris aquatica στο σημείο καλλιέργειας σε ύψος 1,5 m. Η φαλαρίδα είναι ένα πολυετές αγρωστώδες φυτό που το ύψος του πλησιάζει το 1-1,5 μέτρο και διαθέτει χρόνο ζωής χρόνια (Munz & Keck, 1968). Τα φύλλα του έχουν μπλε - πράσινο χρώμα, είναι επίπεδα με μήκος cm και πλάτος 4-15 mm. Η ταξιανθία της φαλαρίδας είναι πυκνή κυλινδρική με μήκος 5-15 cm και πλάτος mm που φέρονται πάνω σε ψηλά και όρθια στελέχη (Σχήμα 1.6). Τα άνθη της φαλαρίδας (5,5 έως 6,5 mm) είναι μακριά, πλαγίως πεπλατυσμένα, όλα παρόμοια μεταξύ τους και κατά την πλήρη ωρίμανσή τους είναι προσκολλημένα πάνω σε βράκτια (Σχήμα 1.7). Η κύρια χρήση της φαλαρίδας στην παρούσα χρονική στιγμή είναι βόσκηση προβάτων (Oram et al., 1974). Στην περιοχή της Ουαλίας υπάρχουν περισσότερα από 1,6 εκατομμύρια εκτάρια βοσκοτόπων με φαλαρίδα. Στην Καλιφόρνια, η φαλαρίδα χρησιμοποιείται για καλλιέργεια σε περιοχές για αναβλάστηση μετά από πυρκαγιές καθώς και για ζωοτροφή. Τη φαλαρίδα τη συναντάει κανείς κατά μήκος των δρόμων, καθώς και σε ρέματα, διότι παρουσιάζει αντοχή στο υγρό κλίμα. Επίσης παρουσιάζει αντοχή στις ξηρές συνθήκες, χάρη στο βαθύ ριζικό της σύστημα και παραμένουν συνήθως αδρανή κατά την περιορισμένη θερινή υγρασία και σε αντίθεση με τα ετήσια φθινοπωρινά φυτά, μετά τις πρώτες βροχές του φθινοπώρου εμφανίζουν ενεργή ανάπτυξη (Kay, 1969). Κατά τη θερινή περίοδο, τα φυτά της φαλαρίδας παράγουν νέους σπόρους. Τα -41-

62 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας φυτά της φαλαρίδας μπορούν να ανεχτούν κάποια σκιά, είναι όμως καταλληλότερο το ανοικτό έδαφος. Το κύριο πλεονέκτημα της φαλαρίδας είναι η μεγαλύτερη περίοδος παραγωγής βιομάζας σε σχέση με τα ετήσια φυτά (σιτηρά, ψυχανθή). Παρατηρήθηκε σε μελέτη καλλιέργειας της συγκεκριμένης βιομάζας σε εδάφη διαφορετικού υψομέτρου, μεγαλύτερη απόδοση σε παραγωγή βιομάζας καθώς και σε λιγνοκυτταρινικό περιεχόμενο σε εδάφη χαμηλότερου υψομέτρου. Κατά τα χρόνια καλλιέργειας της φαλαρίδας, παρατηρήθηκε η υψηλότερη παραγωγή βιομάζας κατά το δεύτερο έτος ενώ μετά τη δεκαετία, η παραγωγή της βιομάζας μειώνεται σημαντικά (Παππάς, 2010). Σχήμα 1.7. Διάφορα μέρη (ταξιανθία, σπόρος, ρίζα) του φυτού Phalaris aquatica L. Το είδος Phalaris aquatica προτείνεται ως ενεργειακό φυτό λόγω της υψηλής παραγωγής βιομάζας (6,3-11 tn DM/ha) και του υψηλού λιγνοκυτταρινικού περιεχομένου του. Επιπρόσθετα, η εγκατάσταση του μέσω σπόρων και οι συμβατικές μέθοδοι για την καλλιέργεια και τη συγκομιδή του διευκολύνουν τα αγρονομικά χαρακτηριστικά του. Η Phalaris aquatica και η Phalaris arundinacea, που καλλιεργείται κυρίως στη βόρεια Ευρώπη, παρουσιάζουν παρόμοια συμπεριφορά στην ανάπτυξη ριζώματος (βαθύ ρίζωμα) και διαφέρουν στο μήκος του άγονου βρακτίου. Αναφέρθηκε από τους Wrobel et al. (2009) ότι η Phalaris arundinacea προσφέρει 130% μεγαλύτερη παραγωγή βιομάζας σε σχέση με άλλα -42-

63 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας ενεργειακά φυτά λόγω της δυνατότητας συγκομιδής της δύο φορές το χρόνο. Μία ανάλυση κόστους που πραγματοποιήθηκε από τους Brummer et al. (2001) συμπέρανε ότι για τη φαλαρίδα, όσο αυξάνεται η απόδοση της βιομάζας ανά εκτάριο γης τόσο μειώνεται το κόστος ανά τόνο βιομάζας. 1.4 Πειραματικός Σχεδιασμός Η κατανόηση ενός φυσικού συμβάντος εξαρτάται από τον αριθμό και την ακρίβεια των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν κατά τη μελέτη του. Ο πειραματικός σχεδιασμός είναι το απαραίτητο εργαλείο που περιορίζει τον πραγματικό πληθυσμό και καταλήγει στην παρατήρηση και τη μελέτη ενός κλάσματος του πραγματικού πληθυσμού με τη διεξαγωγή μικρότερου αριθμού πειραμάτων. Η εφαρμογή ενός πειραματικού σχεδιασμού προσφέρει εργαλεία που διερευνούν την επίδραση των αλλαγών στα εισερχόμενα ενός συστήματος στις μέσες τιμές των εξερχομένων του συστήματος (απόκριση). Η διαλογή των παραμέτρων του συστήματος στηρίζεται στην αρχή του περιορισμού μιας μακράς λίστας παραμέτρων σε όσους παράγοντες επηρεάζουν σημαντικά τη μέση τιμή της απόκρισης. Η διαλογή αυτή μειώνει το χρόνο και το κόστος ενός πειραματικού σχεδιασμού σε σχέση με τη μελέτη ενός παράγοντα τη φορά (Allen, 2006). Στη βιομηχανία, ο πειραματικός σχεδιασμός χρησιμοποιείται συστηματικά για να ανιχνεύσει τις παραμέτρους εκείνες της διεργασίας που επηρεάζουν την ποιότητα του προϊόντος. Εφόσον προσδιοριστούν οι συνθήκες της διεργασίας και τα χαρακτηριστικά του προϊόντος που επηρεάζουν την ποιότητα, ακολουθούν ενέργειες για τη βελτίωση της παραγωγικότητας, της αξιοπιστίας, της ποιότητας και της αποδοτικότητας της παραγωγής. Καθώς οι πόροι είναι πάντα περιορισμένοι, κάθε πείραμα έχει ως στόχο την εξαγωγή των μέγιστων συμπερασμάτων που μπορούν να προκύψουν από τη διεξαγωγή του. Όταν έχει πραγματοποιηθεί ο κατάλληλος σχεδιασμός για ένα πείραμα, προκύπτουν σημαντικά συμπεράσματα με λιγότερους χειρισμούς. Κάθε πειραματικός σχεδιασμός μελετά τις σημαντικές συνθήκες της διεργασίας που τις ονομάζει παραμέτρους σε διαφορετικές τιμές που ονομάζονται επίπεδα. Ο αριθμός των παραμέτρων και των επιπέδων που μελετάται η κάθε μία είναι το χαρακτηριστικό που διαφοροποιεί κάθε σχεδιασμό και καθορίζει τελικά τον αριθμό των πειραματικών χειρισμών (runs). -43-

64 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Ο πειραματικός σχεδιασμός περιλαμβάνει τα εξής στάδια κατά την κατάστρωση του: το στάδιο της μελέτης των πειραματικών χειρισμών της διεργασίας, τη διαλογή των σημαντικών μεταβλητών που επηρεάζουν την ποιότητα του προϊόντος, τη βελτιστοποίηση της διεργασίας και την επαλήθευση των προβλέψεων του πειραματικού σχεδιασμού Μέθοδος Επιφανειών Απόκρισης (Response Surface Methods, RSM) Η μέθοδος Επιφανειών Απόκρισης διαφοροποιείται από τους υπόλοιπους πειραματικούς σχεδιασμούς σε συγκεκριμένα σημεία. Αρχικά, οι συγκεκριμένοι πειραματικοί σχεδιασμοί μελετούν περισσότερους παράγοντες σε σχέση με τους κλασματικούς παραγοντικούς σχεδιασμούς διότι συνήθως από προηγούμενα πειράματα έχει εντοπιστεί η σημασία ορισμένων παραμέτρων. Επίσης, η RSM χαρακτηρίζεται από ακρίβεια της πρόβλεψης και βελτιστοποιεί σε βάθος το σύστημα που μελετάται. Η προσομοίωση της καμπυλότητας που προσφέρει η μέθοδος Επιφανειών Απόκρισης και απεικονίζεται σε διαγράμματα επιφάνειας τριών διαστάσεων, επιτρέπει την κατανόηση και την απεικόνιση μιας επιφάνειας απόκρισης. Επιπρόσθετα η μέθοδος δίνει τη δυνατότητα εξαγωγής ενός μοντέλου πρόβλεψης της επίδρασης που παρουσιάζουν οι αλλαγές των ελεγχόμενων μεταβλητών που εισέρχονται στο σύστημα στην απόκριση. Καθοριστική συνεισφορά του πειραματικού σχεδιασμού είναι η επιλογή των συνθηκών λειτουργίας του συστήματος που είναι σύμφωνες με τους επιθυμητούς στόχους. Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι σχεδιασμού επιφανειών απόκρισης: το σύστημα Κεντρικού Σημείου (Central Composite) και το σύστημα Box-Behnken. Συγκεκριμένα, ο σχεδιασμός Box Behnken (Box & Behnken, 1960) εφαρμόζει μία μήτρα πειραματικού σχεδιασμού τριών επιπέδων που έχουν τη δυνατότητα παρουσίασης σε διαγράμματα επιφάνειας τριών διαστάσεων. Από τον πειραματικό σχεδιασμό προκύπτει ένα προσαρμοσμένο μοντέλο στη διεργασία που μπορεί να είναι γραμμικό ή πολυωνιμικό που περιλαμβάνει τις παραμέτρους της διεργασίας καθώς και τις αλληλεπιδράσεις τους. Ο σχεδιασμός αυτός παράγει σχετικά ασφαλείς προβλέψεις γιατί μειώνει σημαντικά τα λάθη που προκύπτουν από ορισμένες παραδοχές. Σε περίπτωση που ο αριθμός των πειραμάτων -44-

65 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας είναι μεγάλος, υπάρχει ο κίνδυνος για την πραγματοποίηση τους κάτω από σταθερή κατάσταση να εισαχθεί μεγάλο σφάλμα. Για αυτό το λόγο ο πειραματικός σχεδιασμός Box Behnken χρησιμοποιεί τους παράγοντες κατηγορίας (block factors) ώστε να αξιολογηθούν ξεχωριστά οι συνθήκες του πειράματος από τις μη ελεγχόμενες συνθήκες. Για παράδειγμα ένας τέτοιος παράγοντας μπορεί να είναι η διαφορετική ημέρα πειραμάτων. Τα βήματα που ακολουθούνται κατά το σχεδιασμό διαφέρουν σε ένα βαθμό ανάλογα με τη φύση του πειράματος, στηρίζονται όμως σε βασικές αρχές. Ξεκινώντας, πρέπει να επιλεγούν οι παράγοντες που έχουν τη σημαντικότερη επίδραση και να περιληφθούν στον πειραματικό σχεδιασμό. Ανάλογα με τον αριθμό των παραμέτρων προκύπτει ο αριθμός των χειρισμών που θα πραγματοποιηθούν με δεδομένα τα τρία επίπεδα μελέτης (-1, 0, 1) για την κάθε παράμετρο. Στη συνέχεια ακολουθεί η πραγματοποίηση των πειραμάτων και η συλλογή των τιμών για την παράμετρο απόκρισης. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων περιλαμβάνει την κατάστρωση μοντέλου που προβλέπει την απόκριση για κάθε συνδυασμό παραμέτρων. Η επίδραση των αλληλεπιδράσεων των παραμέτρων απεικονίζεται σε ένα διάγραμμα επιφανειών (surface plots) ή σε ένα διάγραμμα περιγράμματος (contour plots). Επιπρόσθετα, τα αποτελέσματα των επιδράσεων των παραγόντων στην απόκριση επαναξιολογούνται βάση του κριτηρίου Προσαρμοσμένος Παράγοντας R 2, που υποδεικνύει το ποσοστό διακύμανσης που οφείλεται στις αλλαγές των τιμών της απόκρισης. Η αναμενόμενη τιμή για τον συντελεστή R 2 είναι ικανοποιητική όταν ξεπερνά το ποσοστό 50%. Σε άλλη περίπτωση, δημιουργούνται αμφιβολίες για την αξιοπιστία των τιμών της απόκρισης και για τη δυνατότητα ανίχνευσης και ελέγχου των σημαντικών παραγόντων του συστήματος (Allen, 2006). -45-

66 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.8. Πειραματικός σχεδιασμός Box Behnken τριών παραμέτρων Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi. Η μέθοδος Taguchi αναπτύχθηκε από τον Genichi Taguchi με στόχο την αύξηση της ποιότητας των παραγόμενων προϊόντων και πιο πρόσφατα χρησιμοποιήθηκε σε εφαρμογές στη μηχανική, τη βιοτεχνολογία, τη διαφήμιση και το μάρκετινγκ (Karna, 2012). Οι επαγγελματίες στατιστικολόγοι αναφέρονται στη διαφοροποίηση της μεθόδου στην ανάπτυξη σχεδιασμών για τη μελέτη της απόκλισης. Ο Taguchi εισήγαγε την έννοια των εξωτερικών επιδράσεων, το θόρυβο (Noise) και προσπάθησε να αναγνωρίσει τις επιδράσεις εκείνες που έχουν το σημαντικότερο αποτέλεσμα στις διακυμάνσεις του προϊόντος. Το αποτέλεσμα ήταν η εφαρμογή του σχεδιασμού από παραγωγούς ανά τον κόσμο που επιτυγχάνουν υψηλής ποιότητας διεργασίες παραγωγής σε χαμηλή τιμή κόστους. Ο βασικός στόχος είναι ο σχεδιασμός ικανών συστημάτων σχεδιασμού που είναι αξιόπιστα κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες (Taguchi, 1986). Η μέθοδος στοχεύει στην επιλογή των βέλτιστων επιπέδων των παραμέτρων ελέγχου, ώστε να προκύψει μια ισχυρή απόκριση που δε θα επηρεάζεται από τους παράγοντες θορύβου -46-

67 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας που δεν είναι δυνατό να ελεγχθούν. Η βελτιστοποίηση της διεργασίας βασίζεται στην αρχή της προσαρμογής της διεργασίας σε ένα σύνολο παραμέτρων στα πλαίσια των περιορισμών που θέτουν τα επίπεδα τους ενώ παράλληλα μία εκ των παραμέτρων, η απόκριση, μεγιστοποιείται (Σχήμα 1.9). Κοινός στόχος είναι συνήθως η ελαχιστοποίηση του κόστους, η μεγιστοποίηση της παραγωγής και της αποτελεσματικότητας. Οι τεχνικές σχεδιασμού διεργασιών Taguchi χρησιμοποιούνται ευρέως για το σχεδιασμό διεργασιών και περιλαμβάνουν σχεδιασμό του συστήματος, των παραμέτρων και της αντοχής της διεργασίας. Βασικό σημείο του σχεδιασμού είναι η επιλογή των κρίσιμων επιπέδων για τις παραμέτρους του συστήματος ώστε να αποδώσουν ποιοτικά χαρακτηριστικά στο σχεδιασμό με ελάχιστη διακύμανση. Η εφαρμογή ενός σχεδιασμού Taguchi απαιτεί συγκεκριμένες εφαρμοσμένες στατιστικές γνώσεις για αυτό και είναι δημοφιλείς στην επιστημονική κοινότητα και στην κοινότητα των μηχανικών. Διατυπώνονται τρεις καταστάσεις: Το μέγιστο είναι το καλύτερο, το ελάχιστο είναι το καλύτερο και το βέλτιστο (ελάχιστες διακυμάνσεις) είναι το καλύτερο. Ο σχεδιασμός Taguchi χρησιμοποιεί το λόγο Σήμα/ Θόρυβο (Signal/Noise) ως το ποιοτικό χαρακτηριστικό επιλογής. Ο λόγος S/N χρησιμοποιείται ως ποσοτική μεταβλητή αντί της σταθερής απόκλισης γιατί όσο μειώνεται η μέση τιμή αναλόγως μειώνεται και η σταθερή απόκλιση καθώς και το αντίστροφο. Οι εξισώσεις για τον υπολογισμό του λόγου S/N καθώς και άλλων στατιστικών αναλύσεων που λειτουργούν πίσω από τον πειραματικό σχεδιασμό Taguchi παρουσιάζονται στο Παράρτημα Α. -47-

68 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα 1.9. Διάγραμμα παραμέτρων Taguchi Τα βήματα που ακολουθούνται στη μεθοδολογία Taguchi είναι τα εξής: Αναγνώριση της βασικής λειτουργίας, των παρενεργειών και των σημείων αποτυχίας Καθορισμός των παραγόντων θορύβου, των συνθηκών που θα μελετηθούν και των ποιοτικών χαρακτηριστικών Αναγνώριση της λειτουργίας που θα βελτιστοποιηθεί Αναγνώριση των παραγόντων ελέγχου και των επιπέδων τους Επιλογή του ορθογώνιου πειραματικού σχεδιασμού Πραγματοποίηση του πειραματικού σχεδιασμού Ανάλυση των αποτελεσμάτων, πρόβλεψη των βέλτιστων επιπέδων Εκτέλεση πειράματος επιβεβαίωσης και σχεδιασμός μελλοντικής μεθοδολογίας Οι λόγοι που χρησιμοποιούνται στη μεθοδολογία Taguchi (Σήματος/Θορύβου) είναι λογαριθμικές εξισώσεις που βασίζονται σε ένα πείραμα ορθογώνιου σχεδιασμού που καταλήγει σε μειωμένες αποκλίσεις (errors) για το πείραμα και σε βέλτιστες συνθήκες για τις παραμέτρους ελέγχου. Μια σειρά περιορισμένων πειραμάτων συνδυάζεται με το επιθυμητό συμπέρασμα ώστε να είναι δυνατή η ανάλυση των δεδομένων και η μελλοντική πρόβλεψη των αποτελεσμάτων. -48-

69 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας 1.5 Σκοπός της Διατριβής Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην πειραματική μελέτη μιας ολοκληρωμένης τεχνολογίας μετατροπής της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας του φυτού Phalaris aquatica προς παραγωγή βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος ως ενδιάμεσο βιοχημικό προϊόν υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η ολοκληρωμένη διεργασία που προτείνεται περιγράφεται στο παρακάτω διάγραμμα ροής (Σχήμα 1.10). Αρχικά, η πειραματική μελέτη περιλαμβάνει την ενδελεχή ανάλυση και βελτιστοποίηση των επιμέρους σταδίων επεξεργασίας που εφαρμόζονται στο συγκεκριμένο είδος της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Το σημείο εκείνο που καθιστά σημαντική την παρούσα μελέτη εντοπίζεται στο γεγονός ότι στη βιβλιογραφία περιλαμβάνονται πλήθος επιστημονικών άρθρων με αντικείμενο την παραγωγή βιοαιθανόλης δεύτερης γενιάς από λιγνοκυτταρινική βιομάζα, ενώ δεν υπάρχει αρκετό υλικό για ένα μεσογειακό είδος όπως η φαλαρίδα (Phalaris aquatica L.). Το συγκεκριμένο φυτό αποτελεί μία ενδιαφέρουσα περίπτωση για περαιτέρω μελέτη καθώς προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα όπως το μέγεθος παραγωγής της φαλαρίδας ανά επιφάνεια (6,3-11 tn/ha), η προσαρμογή της σε οριακές περιοχές, το υψηλό περιεχόμενο δομικών πολυσακχαριτών και η χαμηλή περιεκτικότητα σε λιγνίνη. Συγκεκριμένα, οι δομικοί πολυσακχαρίτες του φυτού αποτελούν σημαντικό ποσοστό της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Σύμφωνα με το διάγραμμα ροής που προτείνεται για την εφαρμογή της ολοκληρωμένης διεργασίας, το οποίο περιλαμβάνει τη χημική σύσταση του φυτού Phalaris aquatica με πηγές από προκαταρκτικά πειράματα και βιβλιογραφικές αναφορές, το σύνολο των δομικών πολυσακχαριτών του φυτού αποτελεί το 71,8% (μέση τιμή των οριακών τιμών 69,4% και 74,2%). Συγχρόνως, εκτός από τις ημικυτταρίνες και την κυτταρίνη που αποτελούν σημαντικό ποσοστό του φυτού, η περιεκτικότητα της λιγνίνης είναι σημαντικά χαμηλή και σύμφωνα με το Σχήμα 1.10 ίση με 7,13% (μέση τιμή των οριακών τιμών 6,7% και 7,56%). Η βελτιστοποίηση της διεργασίας στοχεύει στη βελτιστοποίηση του κάθε σταδίου και θα ξεκινήσει από το στάδιο της προ-επεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας με τη μέθοδο της υδρόλυσης με αραιό θειικό οξύ, μέσω στατιστικού σχεδιασμού πάνω σε τρεις παραμέτρους της μεθόδου. Η περιγραφή και η μελέτη του σταδίου περιλαμβάνεται στο Κεφάλαιο 3. Η μεγιστοποίηση της διαλυτοποίησης των ημικυτταρινών, σε ποσοστά που πλησιάζουν τα ποσοστά της βιβλιογραφίας (μετατροπή των ημικυτταρινών=80%), και της -49-

70 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας συγκέντρωσης του μονομερούς σακχάρου της ξυλόζης στο υγρό τμήμα του ρεύματος εξόδου της προεπεξεργασίας αποτελεί τον στόχο του πρώτου σταδίου της διεργασίας. Εν συνεχεία, η μελέτη θα βασιστεί στην επιλογή και τη χρήση κατάλληλων ενζύμων για την υδρόλυση της κυτταρίνης, που περιλαμβάνεται στο στερεό τμήμα του ρεύματος εξόδου της προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Η βελτιστοποίηση του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης, μέσω στατιστικού σχεδιασμού βασισμένου σε τέσσερεις παραμέτρους της μεθόδου, αποτελεί τον επόμενο στόχο της διεργασίας και περιλαμβάνεται στο Κεφάλαιο 4. Η βέλτιστη λύση θα κριθεί ποσοτικά για τη μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της παραγόμενης γλυκόζης που περιλαμβάνεται στο υδρόλυμα της ενζυμικής υδρόλυσης. Ο στόχος της μετατροπής των μονομερών σακχάρων, προερχόμενων από την υδρόλυση τόσο των ημικυτταρινών όσο και της κυτταρίνης), που έχει τεθεί κατά την ολοκλήρωση του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης και της προεπεξεργασίας αντιστοιχεί σε ένα εύρος τιμών όπως προκύπτουν από βιβλιογραφικές μελέτες ίσο με 77,4% - 83,4 %. Στη συνέχεια, θα μελετηθεί η σύνθεση της βιοαιθανόλης όπου καταλήγει η ολοκληρωμένη βιοχημική επεξεργασία της βιομάζας. Η βελτιστοποίηση της ζύμωσης των σακχάρων του υδρολύματος της ενζυμικής υδρόλυσης με τη χρήση του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae θα πραγματοποιηθεί μέσω πειραματικού σχεδιασμού μελέτης πέντε διαφορετικών παραμέτρων που θα καθορίσουν τις συνθήκες της διεργασίας στο Κεφάλαιο 5. Η απόδοση του σταδίου της ζύμωσης των φυσικών σακχάρων της γλυκόζης προς αιθανόλη στοχεύει την τιμή 80%. Επιπρόσθετα, θα ακολουθήσει μελέτη για την εφαρμογή κατάλληλης πολιτικής ζύμωσης με στόχο τη μεγιστοποίηση της παραγωγικότητας της βιοαιθανόλης. Η αύξηση της συγκέντρωσης της βιοαιθανόλης του τελικού διαλύματος λειτουργεί ευνοϊκά για την οικονομικότερη ανάκτηση της καθαρής αιθανόλης από το ρεύμα εξόδου της ζύμωσης. Σύμφωνα με βιβλιογραφική προκαταρκτική έρευνα, ως τελικό προϊόν της ολοκληρωμένης βιοχημικής κατεργασίας της βιομάζας που θα προσφέρει υψηλή προστιθέμενη αξία στο συνολικό εγχείρημα, επιλέχθηκε το ηλεκτρικό οξύ. Ο επόμενος στόχος είναι η ανάπτυξη κατάλληλης πολιτικής ζύμωσης με τη χρήση του βακτηρίου Actinobacillus succinogenes για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Η περιγραφή και μελέτη του σταδίου περιλαμβάνεται στο Κεφάλαιο 6. Η ζύμωση των σακχάρων της γλυκόζης που περιλαμβάνονται στο υδρόλυμα της ενζυμικής υδρόλυσης καθώς και των σακχάρων της ξυλόζης που περιλαμβάνονται στο υγρό τμήμα της προεπεξεργασίας, θα μελετηθεί μέσω πειραματικού σχεδιασμού μελέτης -50-

71 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας τεσσάρων παραγόντων. Οι αποδόσεις της παραγωγής ηλεκτρικού οξέος από ζυμώσιμα φυσικά σάκχαρα που σημειώνονται στη βιβλιογραφία είναι χαμηλότερες από τις αποδόσεις της αιθανόλης και ίσες με την τιμή 70%. Από τη διεργασία θα προκύψουν δύο τελικά προϊόντα, ένα βιοκαύσιμο υψηλής δυναμικότητας και ένα βιοχημικό υλικό υψηλής προστιθέμενης αξίας που προσομοιάζουν τη λογική ενός ολοκληρωμένου βιοδιυλιστηρίου όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα Τα δεδομένα του διαγράμματος ροής και των θεωρητικώς αναμενόμενων αποδόσεων του κάθε σταδίου λαμβάνονται ως βάση για το σχεδιασμό της διεργασίας και προέρχονται από βιβλιογραφικές αναφορές (Chander et al., 2010, Saha & Cotta, 2007, Shi et al., 2009, Srilekha et al., 2011, Gupta et al., 2009). Τέλος, η τεχνοοικονομική ανάλυση της εφαρμογής των σταδίων της ολοκληρωμένης διεργασίας παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος, όπως παρουσιάζεται στο διάγραμμα ροής, σε βιομηχανική κλίμακα αποτελεί στόχο για την πλήρη μελέτη της προτεινόμενης τεχνολογίας και περιγράφεται στο Κεφάλαιο 7. Η εφαρμογή της συνολικής ιδέας του βιοδιυλιστηρίου έχει ως στόχο να μειώσει το τελικό κόστος δημιουργώντας τους κατάλληλους οικονομικούς δείκτες για τη βιωσιμότητα του εγχειρήματος. -51-

72 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Σχήμα Διάγραμμα Ροής για τη συνολική διεργασία παραγωγής αιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα Phalaris aquatica. -52-

73 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Βιβλιογραφία 1 ου Κεφαλαίου Αcal, A.R., Jaeger, W.A., Bocin, D.A.,Sigfusson, B.,Zubi, G., Magagna, D., Perez, F.M., Moss, R., Lazarou, S., Baxter, D., et al, Technology Map of the European Strategic Energy Technology Plan (SET Plan) Technology Descriptions. EUR - Scientific and Technical Research Reports. Allen, T.T., Intorduction to Engineering Statistics and Six Sigma: Statistical Quality Control and Design of Experiments and Systems. Springer. Alvira, P., Pejo, E.T., Ballesteros, M., Negro, M.J., Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology, 101, pp Anderson, D.H Taxonomy and distribution of the genus Phalaris. Iowa State Journal of Science, 36(1), pp.96. Balat, M., Production of bioethanol from lignocellulosic materials via the biochemical pathway: A review. Energy Conversion and Management, 52(2), pp Box, G.E.P. & Behnken, D.W., Some New Three Level Designs for the Study of Quantitative Variables. Technometrics, 2(4), pp Brummer, E.C., Burras, C.L., Duffy, M.D., Moore, K.J., Switchgrass production in Iowa: economic analysis, soil suitability, and varietal performance. Ames, IA, USA: Iowa State Press. Carere, C.R., Sparling, R., Cicek, N., Levin, D.B., Third Generation Biofuels via Direct Cellulose Fermentation. International Journal of Molecular Science, 9(7), pp Carole, T.M., Pellegrino, J., Paster, M.D., Opportunities in the industrial biobased products industry. Applied Biochemistry and Biotechnology - Part A Enzyme Engineering and Biotechnology, 115(1-3), pp European Commission, EU Energy in Figures, Statistical Pocketbook 2014, European Union, pp

74 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας FitzPatrick, M., Champagne, P., Cunningham, M., Whitney, R., A biorefinery processing perspective: treatment of lignocellulosic materials for the production of value-added products. Bioresource technology, 101(23), pp Gupta, R., Sharma, R.K., Kuhad, R.C., Separate hydrolysis and fermentation (SHF) of Prosopis juliflora, a woody substrate, for the production of cellulosic ethanol by Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis-ncim Bioresource Technology, 100(3), pp Hamelinck, C.N., Hooijdonk, G., Faaij, A.P., Ethanol from lignocellulosic biomass: technoeconomic performance in short-, middle- and long-term. Biomass and Bioenergy, 28, pp Huang, R., Su, R., Qi, W., He, Z., Bioconversion of Lignocellulose into Bioethanol: Process Intensification and Mechanism Research. Bioenergy Resources, 4, pp Karna, S.K., Singh, R.V., Sahai, R., Application of Taguchi Method in Indian Industry. International Journal of Emerging Technology and Advanced Engineering, 2(11), pp Kay, L., Burgess, L, Seeding, H., Foothill, S., Field, R., Hardinggrass and Annual Legume Production, Sierra Foothills. Koutinas, A.A., Wang, R.H., Webb, C., 2007, The Biochemurgist Bioconversion of agricultural raw materials for chemical production. Biofuels & Bioproducts Biorefining, 1, pp Kuhad, R.C., Gupta, R., Singh, A, Microbial Cellulases and Their Industrial Applications. Enzyme Research, 2011, , pp.10. Menon, V. & Rao, M., Trends in bioconversion of lignocellulose: Biofuels, platform chemicals & biorefinery concept. Progress in Energy and Combustion Science, 38(4), pp Mosier, N., Wyman, C., Dale, B., Elander, R., Lee, Y.Y., Holtzapple, M., Ladisch, M., Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource technology, 96(6), pp O Brien, D.J. & Craig, J.C. Jr, Ethanol production in a continuous fermentation/ membrane pervaporation system. Applied Microbial Biotechnology, 44, pp

75 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Oram, R.N., Ferreira, V., Culvenor, R.A., Hopkins, A.A. Stewart, A., The first century of Phalaris aquatica L. cultivation and genetic improvement. Crop Pasture Science, 60, pp Perlack, R.D., Wright, L.L., Turhollow, A.F., Graham, R.L., Stokes, B.J., Erbach, D.C., Opportunities in the industrial biobased products industry: The Technical Feasibility of a Billion-Ton Annual Supply. U.S. Department of Energy, Office of Scientific and Technical Information. Rosgaard, L., Andric, P., Dam-Johansen, K., Pedersen, S., Meyer, A.S., Effects of substrate loading on enzymatic hydrolysis and viscosity of pretreated barley straw. Applied Biochemistry and Biotechnology, 143(1), pp Saha, B.C., Cotta, M.A., Enzymatic hydrolysis and fermentation of lime pretreated wheat straw to ethanol. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 82(10), pp Sarkar, N., Ghosh, S.K., Bannerjee, S., Aikat, K., Bioethanol production from agricultural wastes: An overview. Renewable Energy, 37(1), pp Singh, A., Nigam, P.S., Murphy, J.D., Renewable fuels from algae: An answer to debatable land based fuels. Bioresource Technology, 102, pp Shi, J., Sharma-Shivappa, R.R., Chinn, M., Howell, N., Effect of microbial pretreatment on enzymatic hydrolysis and fermentation of cotton stalks for ethanol production. Biomass and bioenergy, 33(1), pp Srilekha, Y.K., Naseeruddin, S., Sai, P.G., Sateesh, L., Venkateswar, R.L., Bioethanol fermentation of concentrated rice straw hydrolysate using co-culture of Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis. Bioresource Technology, 102(11), pp Šturc, M., Renewable energy. Analysis of the latest data on energy from renewable sources. Environment and energy, Εurostat, Statistics in focus, 44. Taguchi, G., Subir, C., Wu, Y., Taguchi s Quality Engineering Handbook. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, Published simultaneously in Canada. Wooley, R., Ruth, M., Glassner, D., Sheehan, J., Process Design and Costing of Bioethanol Technology: A Tool for Determining the Status and Direction of Research and Development. Biotechnology Progress, 15, pp

76 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή στα Βιοκαύσιμα και τα Υλικά Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Wrobel, C., Coulman, B.E., Smith, D.L., The potential use of reed canary grass (Phalaris arundinacea L.) as a biofuel crop. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Plant Soil Science, 59(1), pp Xu, Q., Singh, A., Himmel, M.E., Perspectives and new directions for the production of bioethanol using consolidated bioprocessing of lignocellulose. Current opinion in biotechnology, 20(3), pp Zhang, Y.-H.P. & Lynd, L.R., Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose: noncomplexed cellulase systems. Biotechnology and bioengineering, 88(7), pp Παππάς, Ι.Α., Αξιολόγηση παραγωγικού δυναμικού λιβαδικών φυτών και αξιοποίησή τους για παραγωγή βιοενέργειας. Διδακτορική Διατριβή. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ). Σχολή Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος. doi /eadd/

77 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι 2.1 Υλικά και Μέθοδοι για την Προεπεξεργασία Λιγνοκυτταρινική Βιομάζα Η λιγνοκυτταρινική βιομάζα Phalaris aquatica προέρχεται από ξερική φυτεία εγκατεστημένη κατά το έτος 2007 (στην περιοχή του Πτελεού Μαγνησίας, γεωγραφικό πλάτος: 39 3' 0" Β, γεωγραφικό μήκος: 22 57' 0" Α). Η βιομάζα έχει συλλεγεί από τον αγρό κατά την περίοδο της ωρίμανσης στον πέμπτο χρόνο της φυτείας και ακολούθησε συγκέντρωση και ξήρανση της με φυσικό τρόπο. Στην ξηρή βιομάζα εφαρμόζεται μηχανική κατεργασία και τεμαχισμός των σωματιδίων με εργαστηριακό περιστροφικό μύλο (Cutting Mill SM 100, Retsch, Germany) και το μέγεθος των σωματιδίων μειώνεται σε 1 mm. Στη συνέχεια, η βιομάζα αποθηκεύεται σε χώρο απαλλαγμένο από υγρασία, σε θερμοκρασία δωματίου. Χρησιμοποιούνται επίσης ανακινούμενα κόσκινα της γερμανικής εταιρίας Retsch (Retsch AS200, Germany) τα οποία κατανέμουν τα σωματίδια σε διαφορετικές ομάδες μεγέθους σωματιδίων. Οι διαφορετικές τάξεις μεγέθους είναι οι , , και μm οι οποίες χρησιμοποιούνται για τα πειράματα μελέτης της επίδρασης του μεγέθους των σωματιδίων. -57-

78 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Περιγραφή Πειραματικής διάταξης Η πειραματική μελέτη της αραιής όξινης προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας πραγματοποιείται σε γυάλινα μπουκάλια, με αντοχή σε υψηλές θερμοκρασίες (pyrex), βιδωτό καπάκι και όγκο 100 ml, όπου ο συνολικός όγκος της αντίδρασης είναι 40 ml. Η περιεκτικότητα σε ακατέργαστη βιομάζα διατηρείται σταθερή κατά τις διάφορες πειραματικές δοκιμές με τιμή ίση με 10% w/v (Παππάς, 2011). Η επίδραση της θερμοκρασίας μελετάται σύμφωνα με πειραματικό σχεδιασμό. Η θερμοκρασία παραμένει αμετάβλητη, στην επιθυμητή τιμή κάθε φορά, καθώς η αντίδραση πραγματοποιείται σε λουτρό λαδιού, με συνεχή παρακολούθηση από θερμόμετρο υδραργύρου και ηλεκτρόδιο συνδεδεμένο στη θερμαντική πλάκα. Η ρύθμιση της θερμοκρασίας γίνεται αυτόματα από τη θερμαντική πλάκα σε περίπτωση μεταβολής από εξωτερικές συνθήκες καθώς πρόκειται για ανοιχτό σύστημα. Η διάρκεια της αντίδρασης αποτελεί επίσης παράγοντα πειραματικής μελέτης. Η έναρξη της αντίδρασης ορίζεται τη στιγμή που η θερμοκρασία έχει σημειώσει την επιθυμητή τιμή και ολοκληρώνεται με την ψύξη του γυάλινου μπουκαλιού. Στη συνέχεια, η υγρή φάση, όπου βρίσκονται διαλυτοποιημένα τα μονομερή σάκχαρα των ημικυτταρινών (κυρίως ξυλόζη), διαχωρίζεται από τη στερεή φάση που περιλαμβάνει την αδιάλυτη κυτταρίνη. Οι δύο φάσεις διαχωρίζονται με τη μέθοδο του φιλτραρίσματος υπό κενό και φυλάσσονται για περαιτέρω επεξεργασία. Το ph της υγρής φάσης εξαρτάται από την περιεκτικότητα του θειικού οξέος της αντίδρασης, που διαφοροποιείται ανάλογα με τις τιμές που ορίζονται σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό, για τη βελτιστοποίηση του σταδίου. Η στερεή βιομάζα οδηγείται σε πλύσεις με απεσταγμένο νερό ουδέτερου ph, που επαναλαμβάνονται τρεις φορές, ώστε να θεωρηθεί ότι απομάκρυναν τις όξινες χημικές ενώσεις από τη βιομάζα. Επίσης, λαμβάνεται ποσότητα των διαλυμένων ημικυτταρινών για τις αναλυτικές μεθόδους μέτρησης των μονομερών σακχάρων. Η ποσότητα αυτή επεξεργάζεται με μικρή ποσότητα βάσης (ΝaΟΗ) ώστε το ph του διαλύματος να σημειώσει τιμή και στη συνέχεια χρησιμοποιείται H2SO4 72% w/v ώστε το ph να επανέλθει στο (Παππάς, 2011). Ακολουθεί, φυγοκέντρηση του διαλύματος στις 5.800xg στροφές με τη συσκευή φυγοκέντρησης Heraus Biofuge primor της αμερικάνικης εταιρίας ThermoElectron Corp., Thermo Fisher Scientific Inc., για 10 min και φιλτράρισμα με φίλτρα 0,2 μm (Whatman Inc. (U.S.A.)) πριν τη μεταφορά των δειγμάτων στον υγρό χρωματογράφο. -58-

79 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi Ο Πειραματικός Σχεδιασμός (Design of Experiment (DOE)) βασίστηκε στη στατιστική θεωρία του Taguchi (Taguchi, 1986). Μέσω του σχεδιασμού του πειράματος μελετήθηκε η επίδραση τριών παραγόντων ελέγχου σε έναν παράγοντα απόκρισης. Ο πειραματικός σχεδιασμός προσφέρει σημαντικά εργαλεία τόσο για την πρόβλεψη των αποτελεσμάτων, καθώς εξάγει εμπειρικό μαθηματικό μοντέλο όσο και για τη βελτιστοποίηση του σταδίου καθώς εξάγει το συνδυασμό εκείνο των ελεγχόμενων παραμέτρων που μεγιστοποιούν τον παράγοντα απόκρισης, λαμβάνοντας υπόψη τις αποκλίσεις που υπεισέρχεται από τις μη ελεγχόμενες παραμέτρους. Ακολούθως, η Ανάλυση Διακύμανσης (ANOVA) των πειραματικών αποτελεσμάτων εξάγει συμπεράσματα για τη σημαντικότητα της επίδρασης της κάθε παραμέτρου στον παράγοντα απόκρισης, βασισμένα στο άθροισμα των τετραγώνων (SS) που υποδηλώνει τη συνεισφορά της κάθε παραμέτρου στο γραμμικό μοντέλο και στον παράγοντα p (p-factor). Επίσης, εξάγονται συμπεράσματα μέσω διαγραμμάτων κανονικότητας, ιστογραμμάτων και διαγραμμάτων υπολειμμάτων για την κανονικότητα της διασποράς των υπολοίπων, δηλαδή της διαφοράς των μετρούμενων από τα υπολογισθέντα δεδομένα (Παράρτημα Α). Η κανονικότητα των αποτελεσμάτων υποδεικνύει την στατιστική ασφάλεια των συμπερασμάτων που εξάγονται από το γραμμικό εμπειρικό μοντέλο. Στον πειραματικό σχεδιασμό της προεπεξεργασίας, ως παράγοντας απόκρισης επιλέχθηκε η συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης, που προέρχεται από τη διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών, το ποσοστό μετατροπής των ημικυτταρινών καθώς και ο βαθμός κρυσταλλικότητας του στερεού υπολείμματος της προεπεξεργασίας που οδηγείται προς σακχαροποίηση, το οποίο περιλαμβάνει την κυτταρίνη της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας που παρέμεινε αδιάλυτη. Ο πειραματικός σχεδιασμός Taguchi μελετά την επίδραση τριών παραγόντων: της θερμοκρασίας, της περιεκτικότητας του οξέος και του χρόνου της αντίδρασης, σε τρία διαφορετικά επίπεδα τιμών, στον παράγοντα απόκρισης που μελετάται κάθε φορά (Πίνακας 2.1). Το αποτέλεσμα του ορθογώνιου σχεδιασμού (orthogonal array) είναι μια σειρά 9 πειραμάτων (L9) που το καθένα πραγματοποιείται σε 2 επαναλήψεις. Η στατιστική ανάλυση εξάγει πληροφορίες για το λόγο «Σήματος προς Θόρυβο» ( Signal to Noise, S/N) που αποτελεί ένα από τα κριτήρια βελτιστοποίησης του σχεδιασμού Taguchi. Συγκεκριμένα, τέθηκε ως στόχος η μεγιστοποίηση του κριτηρίου S/N. Ο λόγος S/N περιλαμβάνει την -59-

80 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι επίδραση στον παράγοντα απόκρισης των ελεγχόμενων τριών μεταβλητών καθώς και των μη ελεγχόμενων μεταβλητών θορύβου, ώστε η μέγιστη τιμή του λόγου να ελαχιστοποιεί τη μεταβλητότητα που προέρχεται από τις μεταβλητές θορύβου. Η εξίσωση υπολογισμού του λόγου «Σήματος προς Θόρυβο» περιγράφεται στο Παράρτημα Α. Κατά το σχεδιασμό του πειράματος και τις στατιστικές αναλύσεις χρησιμοποιείται το λογισμικό Minitab 17, το οποίο δίνει τη δυνατότητα εξαγωγής εμπειρικών μοντέλων πρόβλεψης της διεργασίας. Το γραμμικό εμπειρικό μοντέλο που εξάγεται στα πλαίσια των τιμών του παρόντα πειραματικού σχεδιασμού συγκρίνεται με τα πειραματικά αποτελέσματα. Πίνακας 2.1. Πειραματικός σχεδιασμός Taguchi (L9) για το στάδιο της προεπεξεργασίας. Παράγοντες Επίπεδο 1 Επίπεδο 2 Επίπεδο 3 Θερμοκρασία ( o C) Περιεκτικότητα Θειικού Οξέος (% w/v) Χρόνος Αντίδρασης (min) Συνδυαστικός συντελεστής έντασης (CSF) Τα αποτελέσματα του σταδίου της προεπεξεργασίας μελετώνται σε σχέση με την ένταση των συνθηκών του σταδίου μέσω του συνδυαστικού συντελεστή έντασης της προεπεξεργασίας (CSF), ο οποίος συνδυάζει τους τρεις παράγοντες, θερμοκρασία, περιεκτικότητα οξέος και χρόνο, σε μία μεταβλητή μέσω της εξίσωσης (Lloyd & Wyman, 2005, Agbor et al., 2011): CSF = log10ro ph, Ro = log[t exp((tr Tb)/ω)] (2.1) -60-

81 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι, όπου t είναι ο χρόνος της αντίδρασης (min), Tb είναι η θερμοκρασία της αντίδρασης ( o C), TR η θερμοκρασία αναφοράς (TR = 100 o C) και ph είναι η οξύτητα του υδατικού διαλύματος που συνδέεται με την περιεκτικότητα του οξέος στην αντίδραση (Karapatsia et al., 2014) Αναλυτικές Μέθοδοι Χαρακτηρισμός της βιομάζας H αναλυτική μέθοδος που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της σύστασης των κυτταρικών τοιχωμάτων στα δείγματα της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας (φαλαρίδας) είναι η μέθοδος Van Soest για Ινώδεις Ουσίες (Van Soest et al., 1991). Η μέθοδος χρησιμοποιεί ουδέτερο απορρυπαντικό διάλυμα στο οποίο μένουν αδιάλυτες οι δομικές ενώσεις των φυτικών τοιχωμάτων (κυτταρίνη, ημικυτταρίνες και λιγνίνη) και ονομάζονται Ινώδεις Ουσίες Ουδέτερου Διαλύματος Απορρυπαντικών (Neutral Detergent Fiber - NDF). Ακολούθως, εφαρμόζεται η μέθοδος Όξινου Απορρυπαντικού Διαλύματος από όπου προκύπτει κλάσμα αδιάλυτων Ινωδών Ουσιών Όξινου Απορρυπαντικού Διαλύματος (Acid Detergent Fiber - ΑDF) που περιλαμβάνει την κυτταρίνη καθώς και τη λιγνίνη. Το κλάσμα αυτό στη συνέχεια επεξεργάζεται με θειικό οξύ H2SO4 από όπου προκύπτει αδιάλυτο μέρος που περιλαμβάνει τη λιγνίνη (Acid Detergent Lignin - ADL). Στη συνέχεια, ο υπολογισμός της κυτταρίνης πραγματοποιείται με αφαίρεση των τιμών της λιγνίνης από το σύνολο των Ινωδών Ουσιών Όξινου Απορρυπαντικού Διαλύματος (Κυτταρίνη = % ΑDF % ADL) και ο υπολογισμός των ημικυτταρινών πραγματοποιείται με αφαίρεση των τιμών των Ινωδών Ουσιών Όξινου Διαλύματος Απορρυπαντικών από το σύνολο Ινωδών Ουσιών Ουδέτερου Διαλύματος Απορρυπαντικών (Ημικυτταρίνες = % NDF % ADF) (Harris, 1970) Μέτρηση Σακχάρων Ο ποσοτικός προσδιορισμός των περιεχόμενων σακχάρων στο υδρόλυμα που προέρχεται από τη διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών πραγματοποιείται με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC). Τα μονομερή σάκχαρα που επιλέχθηκαν για ταυτοποίηση είναι η ξυλόζη, η αραβινόζη, η γλυκόζη, η μαννόζη, η γαλακτόζη και η φρουκτόζη σε μίγματα διαφορετικών συγκεντρώσεων. Κάθε ένωση παρουσιάζει διαφορετικό χρόνο έκλουσης στο -61-

82 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι φάσμα που προκύπτει από το HPLC (Σχήμα 2.1). Αρχικά, δημιουργούνται πρότυπες καμπύλες αναφοράς για το μίγμα των μονομερών σακχάρων που συσχετίζουν το εμβαδό της κορυφής που προκύπτει από τον υγρό χρωματογράφο με τη γνωστή συγκέντρωση των σακχάρων (Σχήμα 2.1). Οι συγκεντρώσεις του μίγματος των σακχάρων είναι: 0,1, 4, 10, 20, 25, 50 και 100 mg/ml. Συγκεκριμένα, ο υγρός χρωματογράφος που χρησιμοποιείται είναι το μοντέλο Agilent 1200 Series της γερμανικής εταιρίας Agilent Technologies, Inc., με Ανιχνευτή Δείκτη Διάθλασης (Refractive Index Detector, RID). Η στήλη ανάλυσης υδατανθράκων που χρησιμοποιήθηκε είναι η Zorbax Analysis column ( mm) με θερμοκρασία λειτουργίας τους 35 o C, με κινητή φάση το μίγμα ακετονιτρίλιο - νερό (75% -25%) και ροή 0,8 ml/min. Ο χρόνος έκλουσης των δειγμάτων είναι 15 min. Όλοι οι αναλυτικοί προσδιορισμοί πραγματοποιούνται δύο φορές και υπολογίζεται ως τελική τιμή η μέση τιμή των επαναλήψεων. Αποδεκτές είναι οι αποκλίσεις με ποσοστό μικρότερο από το 5%. Η μετατροπή των ημικυτταρινών (%) υπολογίζεται ως ο λόγος του αθροίσματος των μονομερών διαλυμένων σακχάρων (σε g) στο υγρό τμήμα του σταδίου της προεπεξεργασίας προς το αρχικό περιεχόμενο των ημικυτταρινών (σε g) στη λιγνοκυτταρινική βιομάζα, που υπολογίστηκε ίσο με 267,31 g/l: % Μετατροπή Ημικυτταρινών= 100 [(Συνολικά Σάκχαρα)/ (Περιεχόμενο Ημικυτταρινών)] (2.2) -62-

83 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Σχήμα 2.1. Χρωματογράφημα (χρόνος έκλουσης ένταση σήματος) του αναλυτή δείκτη διάθλασης κατά την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης για μίγμα πρότυπων σακχάρων με συγκέντρωση 20 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της προεπεξεργασίας Δομικά Χαρακτηριστικά της Βιομάζας Η λιγνοκυτταρινική βιομάζα μελετάται ως προς τις αλλαγές που συμβαίνουν στα δομικά της χαρακτηριστικά μέσω Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης (SEM) και Φασματοσκοπία Περίθλασης Ακτίνων Χ. Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο χρησιμοποιείται για την εξέταση της μικροδομής της ακατέργαστης και της προεπεξερεγασμένης βιομάζας, δίνοντας εικόνες υψηλού βαθμού διείσδυσης. Το όργανο που χρησιμοποιήθηκε είναι το μοντέλο JEOL JSM 6300 της εταιρίας SEMTech Solutions, με ανάλυση 1,5 nm (SEI) και 3 nm (BEI) στα 30 kv. Η σάρωση πραγματοποιείται πάνω σε δείγματα που έχουν επικαλυφθεί με αγώγιμο στρώμα χρυσού υπό κενό, όσο δυνατόν πιο λεπτό, για να αποφευχθεί η κάλυψη των λεπτομερειών (Singh et al., 2009). Οι φωτογραφίες που εξάγονται παρουσιάζονται με μεγέθυνση από 50 εώς φορές. Ο βαθμός κρυσταλλικότητας της ακατέργαστης και της επεξεργασμένης βιομάζας προσδιορίζεται μέσω του περιθλασιόμετρου PANalytical X-pert pro (The Netherlands) (Sindhu et al., 2011). Τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό του βαθμού κρυσταλλικότητας, του δείκτη κρυσταλλικότητας και του μεγέθους των -63-

84 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι κρυστάλλων βασίζονται στους Kumar et al. (2009) και Zhu et al. (2008). Το πεδίο της σάρωσης είναι μεταξύ των γωνιών 2θ=10 o - 30 o, με μέγεθος βήματος ίσο με 0,02 o. Ο χρόνος προσδιορισμού είναι ίσος με 1 s/ 0.02 o. Ο βαθμός κρυσταλλικότητας (Crystallinity Index, CI) ορίζεται ως ποσοστό του λόγου του κρυσταλλικού υλικού, σύμφωνα με τον Segal et al. (1959): CI = 100 [(I002 - Iam)/I002] (2.3), όπου I002 είναι η ένταση του σήματος του κρυσταλλικού τμήματος της βιομάζας (κυτταρίνη) που προκύπτει από την ένταση της μέγιστης κορυφής του φάσματος XRD σε γωνία περίπου 2θ=22.5 ο και Iam είναι η ένταση του σήματος της άμορφης περιοχής της βιομάζας (κυτταρίνη, ημικυτταρίνες και λιγνίνη) που προκύπτει από την ένταση της δεύτερης υψηλότερης κορυφής του φάσματος XRD σε γωνία περίπου 2θ=18,7 o. Οι τιμές των εντάσεων του σήματος προκύπτουν από τα XRD διαγράμματα που περιλαμβάνονται στο Παράρτημα Β. 2.2 Υλικά και Μέθοδοι για την Ενζυμική Υδρόλυση Περιγραφή Πειραματικής διάταξης Η πειραματική διαδικασία πραγματοποιείται σε κωνικές φιάλες τύπου Erlenmeyer conical flasks με συνολικό όγκο 500 ml και όγκο αντίδρασης 100 ml. Η θερμοκρασία της αντίδρασης διατηρείται σταθερή στους 50 ο C σε περιστροφικό επωαστήρα μοντέλο GFL3031 της γερμανικής εταιρίας GFL mbh, συνολικού όγκου 46 l. Η ταχύτητα ανάδευσης είναι ίση με 150 rpm ώστε να διευκολύνεται η μεταφορά μάζας στο αιώρημα στερεής βιομάζας και ενζύμων. Η αντίδραση πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέος με ph = 4.8. Επίσης, οι ενζυμικοί καταλύτες προέρχονται από μίγμα ενζύμων, την κυτταρινάση Celluclast 1.5L και τη β-γλυκοσιδάση Novozyme 188 (EC No ) που έχουν εκχυλιστεί από τον μύκητα Τrichoderma reseei και Αspergillus niger αντίστοιχα, με σταθερή αναλογία μεταξύ του FPU (Filter Paper Unit) και του CBU (Cellobiase Unit). Οι μονάδες FPU είναι οι μονάδες μέτρησης της δραστικότητας της κυτταρινάσης, όπου 1 FPU αντιστοιχεί σε δραστικότητα κυτταρινάσης που παράγει 1 μmol προϊόντος (γλυκόζης) σε 1 λεπτό υδρολύοντας την κυτταρίνη (Filter Paper Unit). Ομοίως, η μονάδα CBU είναι η μονάδα μέτρησης της δραστικότητας της κελλοβιάσης (β-γλυκοσιδάση) και αντιστοιχεί σε δραστικότητα ενζύμου -64-

85 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι που παράγει 2 μmol γλυκόζης υδρολύοντας την κελλοβιόζη. Η αναλογία μεταξύ των δύο ενζύμων μελετάται για 4 διαφορετικούς λόγους FPU : CBU και συγκεκριμένα για τους λόγους 1:1, 1:1.25, 1:1.5, 1:1.75 και 1:2, για δεδομένη ποσότητα κυτταρινάσης που αντιστοιχεί σε 15 και 20 FPU (Karapatsia et al., 2013) Πειραματικός Σχεδιασμός Box-Behnken Ο πειραματικός σχεδιασμός Box-Behnken επιλέχθηκε ανάμεσα σε άλλους σχεδιασμούς ως μία μέθοδος επιφανειών απόκρισης που βελτιστοποιεί τη μελέτη στου σταδίου περαιτέρω, δίνοντας τη δυνατότητα εξαγωγής τρισδιάστατων διαγραμμάτων για την επίδραση των παραγόντων στην παραγωγή της γλυκόζης. Επιπρόσθετα, η συγκεκριμένη μεθοδολογία δίνει τη δυνατότητα συσχέτισης των παραγόντων με την απόκριση του πειράματος μέσω εμπειρικού μοντέλου. Η σχέση μίας απόκρισης Y από τις παραμέτρους X1, X2, X3, X4 (Y = f (X1, X2, X3, X4)), μπορεί να εκφραστεί από το εμπειρικό (γραμμικό) μοντέλο: Y = a1x1+a2 X2+a3X3+a4X4 ή από το μη γραμμικό εμπειρικό μοντέλο Y=b1X1+b2X2+b3X3+b4X4+ b5x1x2+ b6x1x3+b7x1x4+b7x2x3+b8x2x4+b9x3x4. Οι συντελεστές b1, b2, b3, b4, b5, b6, b7, b8, b9 θα πρέπει να προσδιοριστούν κατά τη διαδικασία προσαρμογής του μοντέλου στα πειραματικά δεδομένα (Box & Behnken, 1960). Η ενζυμική υδρόλυση βασίστηκε σε πειραματικό σχεδιασμό Box-Behnken τεσσάρων παραγόντων μελετημένων σε δύο επίπεδα με μία επιπλέον ενδιάμεση τιμή. Το πλήθος των πειραμάτων που προκύπτουν από τον πειραματικό σχεδιασμό είναι 27. Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε σε επανάληψη. Οι μεταβλητές που μελετώνται στο συγκεκριμένο στάδιο είναι η περιεκτικότητα της προεπεξεργασμένης βιομάζας, 2 και 4% (w/v), η ποσότητα των ενζύμων, 10 και 20 FPU/g στερεής βιομάζας, ο χρόνος υδρόλυσης, 24 και 72 h καθώς και η ποσότητα επιφανειοδραστικού PEG 4000, 0.02 και 0.06 g/g στερεής βιομάζας. Επιπλέον, χρησιμοποιείται ένας ενδιάμεσος συνδυασμός με περιεκτικότητα βιομάζας 3% (w/v), ποσότητα ενζύμων 15 FPU/g στερεής βιομάζας, χρόνο υδρόλυσης 48 h και ποσότητα επιφανειοδραστικού 0,04 g/g στερεής βιομάζας. Ο πειραματικός σχεδιασμός του σταδίου απεικονίζεται συγκεντρωτικά στον Πίνακα 2.2. Η απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού ορίστηκε η συγκέντρωση της γλυκόζης που παράγεται κατά την υδρόλυση. -65-

86 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 2.2. Πειραματικός σχεδιασμός Box-Behnken τεσσάρων παραγόντων για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. Ανεξάρτητες Εύρος και επίπεδα τιμών Σύμβολο μεταβλητές Περιεκτικότητα βιομάζας (%w/v) X Ποσότητα ενζύμων (FPU/g biomass) X Επιφανειοδραστικό (g/g βιομάζας) Χ3 0,02 0,04 0,06 Χρόνος υδρόλυσης (h) X Αναλυτικές Μέθοδοι Ο ποσοτικός προσδιορισμός των περιεχόμενων σακχάρων στο υδρόλυμα της ενζυμικής υδρόλυσης πραγματοποιείται επίσης με τον Υγρό Χρωματογράφο Υψηλής Απόδοσης (HPLC, Agilent 1200 Series). Ο υγρός χρωματογράφος διαθέτει Ανιχνευτή Δείκτη Διάθλασης (Refractive Index Detector, RID) με στήλη ανάλυσης υδατανθράκων Zorbax Analysis column ( mm) με θερμοκρασία λειτουργίας τους 35 o C, με κινητή φάση το μίγμα ακετονιτρίλιο - νερό (75% -25%) και ροή 0,8 ml/min. Κατασκευάζονται καμπύλες βαθμονόμησης για τη γλυκόζη και την κελλοβιόζη, το δισακχαρίτη της γλυκόζης με βάση τα διαγράμματα των πρότυπων μιγμάτων (Σχήμα 2.2). Οι καμπύλες βαθμονόμησης συσχετίζουν το εμβαδό της κορυφής που προκύπτει από τον υγρό χρωματογράφο με γνωστές συγκεντρώσεις των σακχάρων. Οι συγκεντρώσεις του μίγματος των σακχάρων ήταν: 0,1, 4, 10, 20, 25, 50 και 100 mg/ml. Όλοι οι αναλυτικοί προσδιορισμοί πραγματοποιούνται δύο φορές και υπολογίζεται ως τελική τιμή η μέση τιμή των επαναλήψεων. Αποδεκτές είναι οι αποκλίσεις με ποσοστό μικρότερο από το 5%. Η απόδοση της γλυκόζης υπολογίζεται σύμφωνα με την παρακάτω εξίσωση (Singh & Bishnoi, 2012): Απόδοση Γλυκόζης (%) = Συγκέντρωση Γλυκόζης (g) x 100 / κυτταρινικό περιεχόμενο του υποστρώματος (g) x 0.9. (2.4) -66-

87 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι, όπου το κυτταρινικό περιεχόμενο της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας έχει υπολογιστεί (σε g), ίσο με 431 g/kg ΞΜ. Επίσης, να σημειωθεί ότι ο συντελεστής 0,9 αποτελεί διορθωτικό συντελεστή του περιεχομένου της κυτταρίνης σε γλυκόζη λόγω των απωλειών που μπορεί να υπάρξουν από μόρια νερού στην πολυσακχαριτική αλυσίδα της κυτταρίνης. Σχήμα 2.2. Χρωματογράφημα (χρόνος έκλουσης ένταση σήματος) του αναλυτή δείκτη διάθλασης κατά την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης για μίγμα πρότυπων σακχάρων με συγκέντρωση 20 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης Υλικά και Μέθοδοι για την Καλλιέργεια των Μικροοργανισμών Καλλιέργεια Σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae Στέλεχος Μικροοργανισμού Το στέλεχος του σακχαρομύκητα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διεργασία είναι το άγριο στέλεχος Saccharomyces cerevisiae Τύπος ΙΙ αγορασμένο από την εταιρία Sigma Aldrich καθώς και το στέλεχος DSM από τη γερμανική συλλογή μικροοργανισμών και κυττάρων DSMΖ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). Η θερμοκρασία ανάπτυξης του -67-

88 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι μικροοργανισμού είναι ο C (Lin et al., 2012) και τα όρια του ph είναι (Bracey et al., 1998) Διατήρηση Μικροοργανισμού Η διατήρηση του μικροοργανισμού πραγματοποιείται σε τρυβλία με σταθεροποιημένο θρεπτικό μέσο που ονομάζεται YPD. Συγκεκριμένα, αποτελείται από εκχύλισμα μαγιάς (Yeast extract), πεπτόνη (Peptone), γλυκόζη (D-glucose) και αγαρόζη (στερεό μέσο διατήρησης). Η ακριβής σύσταση του μέσου περιλαμβάνεται στον Πίνακα 2.3. Η διατήρηση του μικροοργανισμού στα τρυβλία προϋποθέτει ασηπτικές συνθήκες που επιτυγχάνονται με την αποστείρωση του μέσου στους 121 ο C για 20 min στον κλίβανο αποστείρωσης (Steam Sterilizer Raypa AES-75). Στη συνέχεια, το YPD μέσο τοποθετείται στο θάλαμο νηματικής ροής μέχρι να ελαττωθεί η θερμοκρασία (περίπου στους 50 ο C) και ακολουθεί ρύθμιση του ph σε τιμή 6. Το ΥPD θρεπτικό μέσο μεταφέρεται σε τρυβλίο προτού στερεοποιηθεί όπoυ δημιουργείται το κατάλληλο υπόστρωμα διατήρησης του μικροοργανισμού. Η διαδικασία παρασκευής υγρού θρεπτικού μέσου διατήρησης διαφέρει κατά ένα συστατικό καθώς δε προστίθεται αγαρόζη για σταθεροποίηση. Το μέσο διατηρείται σε κωνική φιάλη. Όσον αφορά το λόγο του ωφέλιμου όγκου της ζύμωσης προς τον όγκο της φιάλης, πρέπει να είναι τουλάχιστον 1:2,5. Επομένως στην κατάλληλη κωνική φιάλη με το υγρό μέσο διατήρησης, προστίθεται μικρή ποσότητα από τον μικροοργανισμό σε λυοφιλοποιημένη μορφή απευθείας από το εμπορικά διαθέσιμο απόθεμα. Στη συνέχεια, ο εμβολιασμός του σακχαρομύκητα στα τρυβλία πραγματοποιείται κατά τον δεκαπλασιασμό της οπτικής πυκνότητας του πληθυσμού στο υγρό θρεπτικό μέσο. Τα τρυβλία επωάζονται στους 30 ο C για 48 h, μέχρι την εμφανή δημιουργία μεμονωμένων αποικιών (Σχήμα 2.3). Τα τρυβλία, μετά την ανάπτυξη των κυττάρων του μικροοργανισμού, διατηρούνται στο ψυγείο (σε θερμοκρασία 4 o C) για διάρκεια ενός μήνα. Η διατήρηση του μικροοργανισμού παρέχει τη δυνατότητα, μέσω της διαδικασίας αναγέννησης του μικροοργανισμού, την εξασφάλιση της διατήρησης της βιωσιμότητας των αποικιών του μικροβιακού στελέχους και την απομάκρυνση πιθανοτήτων επιμόλυνσης. Η διαδικασία αναγέννησης του μικροοργανισμού πραγματοποιείται κάθε ένα μήνα είτε από ήδη προϋπάρχοντα τρυβλία είτε από τον εμπορικό μικροοργανισμό σε λυοφιλοποιημένη μορφή. -68-

89 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Σχήμα 2.3. Τρυβλία διατήρησης μεμονωμένων αποικιών του Saccharomyces cerevisiae Πίνακας 2.3. Σύσταση του θρεπτικού μέσου διατήρησης του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) 1 Γλυκόζη 20 2 Εκχύλισμα μαγιάς 10 3 Πεπτόνη 20 4 Αγαρόζη Προκαλλιέργεια Μικροοργανισμού Η καλλιέργεια του σακχαρομύκητα περιλαμβάνει δύο βασικά στάδια την προκαλλιέργεια και το βασικό στάδιο της ζύμωσης. Αρχικά, προηγείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού σε πλουσιότερο θρεπτικά μέσο, το αποκαλούμενο μέσο προκαλλιέργειας, με σκοπό την ταχεία ανάπτυξη και διαίρεση των κυττάρων του. Τα συστατικά του θρεπτικού μέσου, όπως παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.4, ζυγίζονται και αποστειρώνονται. Ακολουθεί η βασική καλλιέργεια όπου πραγματοποιείται η αλκοολική ζύμωση με στόχο την παραγωγή αιθανόλης με υψηλές παραγωγικότητες. -69-

90 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Η επιθυμητή ποσότητα του θρεπτικού μέσου προκαλλιέργειας τοποθετείται σε κωνική φιάλη όγκου 250 ml και ακολουθεί κλείσιμο του στομίου με υδρόφοβο βαμβάκι. Το θρεπτικό μέσο περιλαμβάνει γλυκόζη, εκχύλισμα μαγιάς, πρόσθετη πηγή αζώτου ((NH4)2SO4) και πηγές καλίου, μαγνησίου, φωσφόρου και άλλων θρεπτικών συστατικών. Μεταγενέστερα της αποστείρωσης του μέσου και της ελάττωσης της θερμοκρασία στους 30 o C μέσα στο θάλαμο νηματικής ροής, ρυθμίζεται το ph σε τιμή 6 προτού προστεθεί το ενοφθάλμισμα από μεμονωμένη αποικία κυττάρων του τρυβλίου. Η κωνική φιάλη τοποθετείται στον επωαστήρα στους 30 o C με συχνότητα ανάδευσης 150 rpm. Οι διαθέσιμοι επωαστήρες του εργαστηρίου είναι δύο, τα μοντέλα GFL3031 και GFL3033 της γερμανικής εταιρίας GFL mbh, συνολικού όγκου 46 l και 150 l αντίστοιχα. Πίνακας 2.4. Σύσταση θρεπτικού μέσου προκαλλιέργειας του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) 1 Γλυκόζη 30 2 Εκχύλισμα μαγιάς 5 3 (NH4)2SO KH2PO4 4,5 5 MgSO4.7H2O 1 6 ZnSO4.7H2O 0, Ζύμωση Μικροοργανισμού Η κύρια καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae, όπου παρασκευάζονται τα επιθυμητά προϊόντα, ονομάζεται ζύμωση. Το μέσο καλλιέργειας είναι χημικά καθορισμένο με κύριο συστατικό τη γλυκόζη, σε περιεκτικότητα κατάλληλη ώστε τα κύτταρα του σακχαρομύκητα να ακολουθούν τη μεταβολική οδό της αλκοολικής ζύμωσης. Τα θρεπτικά συστατικά του μέσου καλλιέργειας της ζύμωσης απεικονίζονται στον Πίνακα 2.5 και τα συστατικά του διαλύματος των ιχνοστοιχείων των μετάλλων στον Πίνακα 2.6. Το νερό που χρησιμοποιείται για την προετοιμασία των μέσων ανάπτυξης και του διαλύματος ιχνοστοιχείων είναι -70-

91 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι απεσταγμένο σε σύστημα απόσταξης της γερμανικής εταιρίας GLF mbh (μοντέλο 2002). Περίπου 10 ml δείγματος οδηγούνται στη φυγόκεντρο ( g, 10 min, 4 o C) και στη συνέχεια τόσο η στερεά ποσότητα των κυττάρων, μετά την ξήρανση της, όσο και η υγρή ποσότητα του υπερκείμενου μεταφέρονται για αναλύσεις Πειραματικός Σχεδιασμός O καθορισμός της σύστασης του θρεπτικού μέσου πραγματοποιείται μέσω πειραματικού σχεδιασμού Taguchi με μικτά επίπεδα. Ο σχεδιασμός ορθογώνιας παράταξης Taguchi βελτιστοποιεί τους παράγοντες του πειράματος με βάση τη μέγιστη τιμή του παράγοντα απόκρισης και το λόγο «Σήματος (Signal) προς θόρυβο (Noise)», (S/N) (Παράρτημα Α). Η απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού του σταδίου της ζύμωσης ορίστηκε η απόδοση της αιθανόλης (%) που αποτελεί το κύριο μελετώμενο προϊόν. Ο πειραματικός σχεδιασμός μικτών παραγόντων (4 επίπεδα x 2 παράγοντες, 2 επίπεδα x 3 παράγοντες) που αποτελούν τις ελεγχόμενες μεταβλητές που επιδρούν στην απόδοση της αιθανόλης, απεικονίζεται στον Πίνακα 2.7. Τα πειράματα που θα πραγματοποιηθούν είναι 16 (L16) σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό. Αναφορικά με τον παράγοντα απόκρισης, η απόδοση σε αιθανόλη (%) ορίζεται ως τα γραμμάρια της αιθανόλης που παράγονται προς τα γραμμάρια της γλυκόζης που καταναλώθηκαν και στη συνέχεια ο λόγος αυτός διαιρείται με το 0,51, που είναι η τιμή της θεωρητικής απόδοσης της αιθανόλης, εκφρασμένος ως ποσοστό επί της εκατό (Shrilekha Yadav et al., 2011). Ο στόχος του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi είναι η επιλογή των βέλτιστων συνθήκων της ζύμωσης και συγκεκριμένα θα πραγματοποιηθεί η επιλογή του κατάλληλου στελέχους του μικροοργανισμού, του μεγέθους του ενοφθαλμίσματος, της τιμής του ph, του συντελεστή αερισμού και της συγκέντρωσης του αζώτου. Αναφορικά με το συντελεστή αερισμού (ko), η τιμή του εξάγεται από το συνδυασμό δύο διαφορετικών μεγεθών, την ταχύτητα ανάδευσης και το λόγο του όγκου του θρεπτικού μέσου προς τον όγκο της κωνικής φιάλης, όπου λαμβάνει χώρα η αντίδραση. H εξίσωση υπολογισμού του συντελεστή αερισμού είναι η παρακάτω: k 0 Vw / V f ( V / V ) w f max A A max (2.5) -71-

92 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι, όπου Vw είναι ό όγκος του θρεπτικού μέσου, Vf είναι ο όγκος της κωνικής φιάλης, Α είναι η ταχύτητα ανάδευσης σε rpm, και Αmax και (Vw /Vf)max είναι οι μέγιστες τιμές των δύο μεγεθών. Επιπρόσθετα, η βέλτιστη ποσότητα περιεχόμενου αζώτου υπολογίστηκε με βάση την περιεκτικότητα στοιχειακού αζώτου στα θρεπτικά συστατικά: εκχύλισμα μαγιάς (YE) και θειικό αμμώνιο ((NH4)2SO4). Είναι γνωστό ότι στο εκχύλισμα μαγιάς το 10% αποτελεί το στοιχειακό άζωτο. Πίνακας 2.5. Σύσταση του θρεπτικού μέσου ζύμωσης του σακχαρομύκητα S. cerevisiae. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) Γλυκόζη 20 2 KH2PO4 3 3 Νa2HPO4 1 4 MgSO4.7H2O 1 5 CaCl2.2H2O 0,1 6 Διάλυμα ιχνοστοιχείων 1-2 ml/l -72-

93 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 2.6. Σύσταση διαλύματος ιχνοστοιχείων του θρεπτικού μέσου της ζύμωσης του σακχαρομύκητα S. cerevisiae. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) 1 ZnSO4.7H2O 0,9 2 FeSO4.7H2O 0,6 3 H3BO3 2,0 4 MnCl2.4H2O 1,5 5 Na2MoO4.2H2O 0,8 6 CoCl2.6H2O 0,8 7 CuSO4.5H2O 0,5 Πίνακας 2.7. Πειραματικός σχεδιασμός Taguchi για την καλλιέργεια του σακχαρομύκητα S. cerevisiae Παράγοντες Επίπεδο 1 Επίπεδο 2 Επίπεδο 3 Επίπεδο 4 Πηγή Αζώτου 0,28 0,37 0,56 1,12 Συντελεστής αερισμού, ko 0,300 0,375 0,500 0,600 Στέλεχος Type II DSM Μέγεθος ενοφθαλμίσματος 0, ph

94 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Αποστείρωση του Θρεπτικού Μέσου Η αποστείρωση των μέσων καλλιέργειας λαμβάνει χώρα σε κλίβανο αποστείρωσης με ατμό (Steam Sterilizer Raypa AES-75) της ισπανικής εταιρίας R. Espinal S.L. ή εναλλακτικά η αποστείρωση πραγματοποιείται με φιλτράρισμα με χρήση φίλτρων Whatman (Whatman Inc. (U.S.A.) TF) 0,2 μm με άνοιγμα που δεν επιτρέπει τη διέλευση μικροοργανισμών μεγαλύτερου μοριακού βάρους. Για την αποστείρωση των μέσων ανάπτυξης πραγματοποιούνται με τη σειρά τα εξής στάδια: (i) Η γλυκόζη, η ξυλόζη, το εκχύλισμα μαγιάς αποστειρώνονται ξεχωριστά στους 121 o C για 20 min σε συγκέντρωση μέχρι 300 g/l. (ii) Τα φωσφορικά άλατα (K2HPO4) αποστειρώνονται ξεχωριστά στους 121 o C για 20 min για την αποφυγή της καταβύθισης τους και προστίθενται τελευταία στο μέσο ώστε να είναι αραιωμένο το διάλυμα που τα υποδέχεται. (iii) Τα μεταλλικά άλατα αποστειρώνονται με φίλτρα αποστείρωσης βιολογικών διαλυμάτων Whatman Inc. (U.S.A.) TF 0,2 μm. Όλα τα θρεπτικά μέσα προετοιμάζονται στο θάλαμο νηματικής ροής (Herasafe KS-12 της αμερικανικής εταιρίας Thermo Electron Corp., Thermo Fisher Scientific Inc.), ο οποίος αποστειρώνεται με εφαρμογή υπεριώδους ακτινοβολίας για 30 min. Σε περίπτωση προετοιμασίας θρεπτικών μέσων ανάπτυξης με συγκέντρωση γλυκόζης μεγαλύτερη από 300 g/l τότε η αποστείρωση γίνεται με φίλτρα αποστείρωσης βιολογικών διαλυμάτων Nalgene της αμερικάνικης εταιρείας ThermoScientific με μέγεθος πόρων 75 mm συνολικού όγκου 500 ml προς αποφυγή της καραμέλωσης της γλυκόζης (Πενλόγλου, 2011) Λειτουργία του Βιοαντιδραστήρα Στη συνέχεια, η καλλιέργεια του σακχαρομύκητα μεταφέρεται από τις κωνικές φιάλες σε μεγαλύτερη κλίμακα και η ζύμωση πραγματοποιείται σε γυάλινο βιοαντιδραστήρα συνολικού όγκου 3 l (BioFlo 110 Bioreactor/Fermentor) της αμερικάνικης εταιρίας New Brunswick Scientific Co. Inc. Ο αερισμός της καλλιέργειας στο κλειστό σύστημα του αντιδραστήρα πραγματοποιείται με παροχή αέρα ώστε το επίπεδο του διαλυμένου οξυγόνου στο μέσο καλλιέργειας να παραμένει πάντα μεγαλύτερο από το 20% του κορεσμού του οξυγόνου σε αυτό. Το διαλυμένο οξυγόνο (D.O.) μετράται με ένα κατάλληλο ηλεκτρόδιο (InPro 6800 O2 Sensor 12/25 mm της ισπανικής εταιρίας Mettler Toledo Inc., -74-

95 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι βυθισμένο πάντοτε στην καλλιέργεια) και ρυθμίζεται αυτόματα με βάση τη συχνότητα περιστροφής του αναδευτήρα και χειροκίνητα από την παροχή εισόδου του αέρα/οξυγόνου. Συγκεκριμένα, η αρχική παροχή του αέρα πραγματοποιείται με ροή 1 vvm, ενώ κατά την πορεία των πειραμάτων ρυθμίζεται εξωτερικά από το χρήστη μέσω κατάλληλου ροομέτρου (Ki 0-5 l/min της αμερικάνικης εταιρίας Key Instruments Inc.), ενώ μπορεί να αυξηθεί ανάλογα με τις απαιτήσεις αερισμού. Το ροόμετρο είναι τοποθετημένο μετά το συμπιεστή αερίων (M37 της αμερικάνικης εταιρίας KnF Laboport Inc.) και πριν την είσοδο του βιοαντιδραστήρα. Η παροχή του αέρα/οξυγόνου εκτείνεται γενικά στην περιοχή 1-3 vvm (volumes of air per minute per volume of batch, 1-3 l/min για όγκο καλλιέργειας ίσο με 1 l). Ο αερισμός πραγματοποιείται από τον κατανεμητή (sparger) που βρίσκεται βυθισμένος στον κύριο όγκο της καλλιέργειας. Σχετικά με την αποστείρωση του εισερχόμενου αέρα, σημειώνεται ότι ο τροφοδοτούμενος αέρας εισέρχεται μέσω φίλτρων αποστείρωσης Whatman Inc. (U.S.A.) PTFE Filters 0,2 μm. Η χρήση του βιοαντιδραστήρα επιτρέπει τη δυνατότητα ταυτόχρονης μέτρησης και ρύθμισης του ph κατά την καλλιέργεια. Η μέτρηση του ph γίνεται με εγκατεστημένο ηλεκτρονικό σύστημα, το οποίο σε πιθανές μεταβολές του ph καθορίζει τη ρύθμιση του με προσθήκη εξωτερικών αποστειρωμένων διαλυμάτων. Επίσης, μέσω του εγκατεστημένου λογισμικού παρακολουθείται και ρυθμίζεται η ταχύτητα ανάδευσης του αναδευτήρα του συστήματος. Επιπλέον, ο αφρισμός του βιοαντιδραστήρα που εμφανίζεται λόγω του μεγάλου ρυθμού ανάπτυξης, εντοπίζεται αυτόματα από το κατάλληλο μετρητικό στάθμης και καταστέλλεται με την παροχή του αντι-αφριστικού διαλύματος Sigma Antifoam SE-15, σε συγκέντρωση υδατικού διαλύματος 0,5% v/v. Ο ωφέλιμος όγκος του αντιδραστήρα είναι 2 l και οι καλλιέργειες ημι-συνεχούς λειτουργίας που πραγματοποιήθηκαν, είχαν αρχικό όγκο ίσο με 800 ml. Το θρεπτικό μέσο είναι το ίδιο που αξιοποιήθηκε και στην περίπτωση των κωνικών φιαλών. Η διαφορά στην κλίμακα του βιοαντιδραστήρα εντοπίζεται κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων ημι-συνεχούς λειτουργίας, όπου τροφοδοτείται στον αρχικό όγκο του μέσου διάλυμα γλυκόζης με τιμή εντός της περιοχής g/l. Η παροχή του συμπυκνωμένου μέσου τροφοδοσίας πραγματοποιείται με τη βοήθεια περιστροφικής αντλίας με ρυθμό παροχής ίσο με 180 ml/h στη μέγιστη (100%) δυνατότητα λειτουργίας της. Ο ρυθμός τροφοδοσίας ορίζεται από τις διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας που μελετήθηκαν και ρυθμίζεται με διαφορετικό -75-

96 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι ποσοστό λειτουργίας της αντλίας χειροκίνητα ή μέσω του λογισμικού Brunswick BioCommand Plus. Το διάλυμα δεν αποστειρώνεται σε κλίβανο αλλά φιλτράρεται μέσω βιολογικών φίλτρων αποστείρωσης Whatman 0,4 μm. Κατά την πορεία λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα λαμβάνονται δείγματα των 5 ml σε τακτά χρονικά διαστήματα (1 ή 2 ώρες) για μέτρηση των υπολειπόμενων σακχάρων, της αιθανόλης και των υποπροϊόντων της ζύμωσης Ρύθμιση του ph κατά την Καλλιέργεια Η ρύθμιση του ph κατά τη ζύμωση ακολουθεί την αποστείρωση και τη σύνθεση του θρεπτικού μέσου ανάπτυξης. Για της καλλιέργειες σε κωνικές φιάλες χρησιμοποιούνται υδατικά διαλύματα NaOH 1 M και HCl 1 M που έχουν προηγουμένως αποστειρωθεί. Η ρύθμιση του ph πραγματοποιείται πριν την προσθήκη του ενοφθαλμίσματος. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του μικροοργανισμού το ph διαφοροποιείται σε μικρό βαθμό ώστε η βιωσιμότητα των κυττάρων να παραμένει ανεπηρέαστη. Κατά τη ζύμωση στο βιοαντιδραστήρα το ph ρυθμίζεται αυτόματα και παράλληλα με την εξέλιξη του φαινομένου, σύμφωνα με της μετρήσεις του βαθμονομημένου πεχαμέτρου, αξιοποιώντας τα επίσης προ-αποστειρωμένα ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 1 M και HCl 1 M. Η βαθμονόμηση του πεχαμέτρου του βιοαντιδραστήρα πραγματοποιείται πριν την αποστείρωση του στον κλίβανο αποστείρωσης με ατμό, αξιοποιώντας τρία πρότυπα διαλύματα της γερμανικής εταιρίας Merck KgaA, με τιμές ph: 4.01, 7 και 9.21 στους 20 ο C Ζύμωση σε Ημι-συνεχείς συνθήκες (fed-batch) Η καλλιέργεια του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae πραγματοποιείται σε ασυνεχείς (batch) καθώς και σε ημι-συνεχείς (fed-batch) συνθήκες (τροφοδοσίας). Τα συστατικά του θρεπτικού μέσου και οι συνθήκες της ζύμωσης που προέκυψαν από τη βελτιστοποίηση του σταδίου της ζύμωσης σε ασυνεχείς συνθήκες λειτουργίας με βάση το σχεδιασμό Taguchi μεταφέρθηκαν σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με στόχο την αύξηση της παραγωγικότητας και της συγκέντρωσης της αιθανόλης. Οι ημι-συνεχείς συνθήκες της ζύμωσης μελετήθηκαν αρχικά στο επίπεδο της κωνικής φιάλης και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεγαλύτερης κλίμακας πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο βιοαντιδραστήρα. -76-

97 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Η πολιτική της τροφοδοσίας στις κωνικές φιάλες βασίστηκε στο ρυθμό κατανάλωσης της γλυκόζης από τον μικροοργανισμό και πραγματοποιήθηκε σε παλμούς, πριν η περιεκτικότητα του μέσου σε γλυκόζη μηδενιστεί. Ο σακχαρομύκητας διαπιστώθηκε από τα πειράματα διαλείποντος έργου ότι καταναλώνει το σύνολο της διαθέσιμης γλυκόζης όταν η ανάπτυξη του σημειώσει οπτική πυκνότητα περίπου 8-9 (2,064 2,322 g/l DCW). Η καλλιέργεια παρακολουθείται με τη σύγχρονη μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (περιγραφή στην Παράγραφο ) και όπως περιγράφεται στον Πίνακα 2.8 οι παλμοί της τροφοδοσίας προστίθενται πριν την κατανάλωση των σακχάρων και κατά την ολοκλήρωση ενός κύκλου ανάπτυξης. Το μίγμα της ημισυνεχούς τροφοδοσίας έχει συγκέντρωση 200 g/l γλυκόζης και τα υπόλοιπα συστατικά του θρεπτικού μέσου προσαρμόστηκαν σε ανάλογη συμπύκνωση, κατά 10 φορές. Η κάθε δόση είχε όγκο 20 ml και ο τελικός όγκος του μέσου στο οποίο προστέθηκε ήταν 200 ml, ώστε να πραγματοποιείται αραίωση 10 φορές και η περιεκτικότητα της γλυκόζης σε κάθε παλμό τροφοδοσίας να είναι ίση με την αρχική συγκέντρωση γλυκόζης με τιμή 20 g/l. Στη συνέχεια, η καλλιέργεια του S. cerevisiae μεταφέρεται σε μεγαλύτερη κλίμακα σε γυάλινο βιοαντιδραστήρα όγκου 3 l. Ο ωφέλιμος όγκος του αντιδραστήρα είναι 2 l και οι καλλιέργειες ημι-συνεχούς λειτουργίας που πραγματοποιήθηκαν, είχαν αρχικό όγκο ίσο με 800 ml. Τα συστατικά του θρεπτικού μέσου είναι τα ίδια που αξιοποιήθηκαν κατά την καλλιέργεια σε επίπεδο κωνικών φιαλών. Το διάλυμα της ημισυνεχούς τροφοδοσίας περιλαμβάνει 300 g/l γλυκόζης, συμπυκνωμένο κατά 15 φορές σε σχέση με την αρχική συγκέντρωση της γλυκόζης. Τα υπόλοιπα θρεπτικά συστατικά περιλαμβάνονται επίσης στο μίγμα της τροφοδοσίας, με τιμή συμπύκνωσης 7,5 φορές. Η διαφορετική συμπύκνωση των συστατικών του μίγματος τροφοδοσίας ακολουθεί την παρατήρηση ότι ο μικροοργανισμός καταναλώνει με διαφορετικό ρυθμό τη γλυκόζη από τα υπόλοιπα θρεπτικά συστατικά του θρεπτικού μέσου. Η ημισυνεχής τροφοδοσία μελετήθηκε για διαφορετικές περιπτώσεις πολιτικών τροφοδοσίας (Karapatsia et al., 2014). Οι διάφορες πολιτικές ζύμωσης βασίζονται σε διαφορετικούς παράγοντες ρύθμισης όπως παρουσιάζονται στον Πίνακα

98 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 2.8. Πολιτική τροφοδοσίας της ζύμωσης σε ημισυνεχείς συνθήκες στην κωνική φιάλη. Στάδια 600nm Aσυνεχής λειτουργία η δόση 8 2 η δόση 16 3 η δόση 24 Πίνακας 2.9. Διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας στον βιοαντιδραστήρα σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας. Πολιτική Τροφοδοσίας Παράγοντας Προσδιορισμού 1 FFr (t) = Qs Qs = 10 (g/l)/h Σταθερή τροφοδοσία ίση με τη μέση τιμή του ρυθμού κατανάλωσης των σακχάρων (10 (g/l)/h). 2 FFr(t)=FFr0 μ exp(μ t) 3 FFr(t)=FFr0 μ exp(μ t) Εκθετική τροφοδοσία βασισμένη σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,23 h -1 ). Εκθετική τροφοδοσία βασισμένη σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,35 h -1 ) Συμπύκνωση του Υδρολύματος Η συμπύκνωση των υδρολυμάτων ακολουθεί τα δύο ρεύματα της αραιής όξινης προεπεξεργασίας και της ενζυμικής υδρόλυσης. Πραγματοποιείται με τη μέθοδο της εξάτμισης υπό κενό. Παράλληλα, η εξάτμιση είναι μία φυσική μέθοδος απομάκρυνσης των πτητικών παρεμποδιστικών ενώσεων που περιλαμβάνονται στα διαλύματα, όπως φουρφουράλες, οξικό οξύ και βανιλλίνη σύμφωνα με τους Wilson et al. (1989). Η διαδικασία διαρκεί 2 h, σε πλάκα ανάδευσης, στις 450 στροφές και ταυτόχρονη θέρμανση -78-

99 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι στους 60 o C. Κατά την εξάτμιση συμπυκνώνονται και ανεπιθύμητες παρεμποδιστικές ενώσεις, συνεπώς η συμπύκνωση προηγείται πάντα της εξουδετέρωσης. Σε κάποιες περιπτώσεις μετά την εξάτμιση ακολουθεί χειρισμός του υδρολύματος με ενεργό άνθρακα 5% w/v. Οι πορώδεις ιδιότητες του ενεργού άνθρακα απομακρύνουν ποσότητα ανεπιθύμητων ενώσεων και συγχρόνως προκαλούν αποχρωματισμό του υδρολύματος. Το μίγμα έρχεται σε επαφή 30 min με τον ενεργό άνθρακα σε θερμοκρασία 45 o C Καλλιέργεια Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Στέλεχος Το βασικό στέλεχος του βακτηρίου Actinobacillus succinogenes DSM αγοράστηκε από την γερμανική συλλογή μικροοργανισμών και κυττάρων DSMΖ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). Η θερμοκρασία ανάπτυξης του μικροοργανισμού είναι ο C και τα όρια του ph είναι (Gunnarsson et al., 2013, Borges & Pereira 2011). Η φαινοτυπική του ανάλυση υπέδειξε ότι το βακτήριο είναι προαιρετικά αναερόβιο, μη κινούμενο, πλειόμορφο, ενίοτε νηματοειδές και αρνητικό κατά Gram (Song & Lee 2006) Διατήρηση Στελέχους To βακτήριο Actinobacillus succinogenes διατηρείται σε τρυβλία με σταθεροποιημένο θρεπτικό μέσο LB (Luria Broth) που αποτελείται από NaCl, εκχύλισμα μαγιάς, τρυπτόνη και αγαρόζη (στερεό μέσο διατήρησης). Η ακριβής σύσταση του μέσου μπορεί να φανεί στον Πίνακα Μετά την προετοιμασία του μέσου, ακολουθεί αποστείρωση του στους 121 ο C για 20 min (Παράγραφος ) και στη συνέχεια τοποθετείται στο θάλαμο νηματικής ροής μέχρι να ελαττωθεί η θερμοκρασία (περίπου στους 50 ο C) και ακολουθεί ρύθμιση του ph σε τιμή 7. Το μέσο μεταφέρεται σε τρυβλίο προτού στερεοποιηθεί. Τα συστατικά του υγρού μέσου διατήρησης είναι κοινά με στο σταθερό μέσο που περιέχουν τα τρυβλία με μοναδική διαφορά την προσθήκη του σταθεροποιητικού αγαρόζη. Το υγρό μέσο διατήρησης αναπτύσσεται σε δοκιμαστικό σωλήνα 15 ml με βιδωτό καπάκι αφού πρώτα έχει απομακρυνθεί ο αέρας και έχει αντικατασταθεί η υπερκείμενη ατμόσφαιρα από διοξείδιο του άνθρακα. Μικρή ποσότητα μικροοργανισμού προστίθεται στο υγρό μέσο -79-

100 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι διατήρησης σε λυοφιλοποιημένη μορφή απευθείας από τον εμπορικά διαθέσιμο μικροοργανισμό. Το ενοφθάλμισμα στα τρυβλία πραγματοποιείται μετά από 24 h επώασης στο επωαστήρα στους 37 o C με ταχύτητα ανάδευσης 150 rpm. Αφού ετοιμαστούν τα τρυβλία επωάζονται στους 37 ο C για 48 h, μέχρι την εμφανή δημιουργία μεμονωμένων αποικιών. Τα τρυβλία, μετά την ανάπτυξη των κυττάρων του μικροοργανισμού, διατηρούνται στο ψυγείο (σε θερμοκρασία 4 o C) για τέσσερις εβδομάδες μέσα σε αναερόβια κλεισμένα βάζα. Η διαδικασία αναγέννησης του μικροοργανισμού είτε από τρυβλία είτε από τον εμπορικά διαθέσιμο μικροοργανισμό σε λυοφιλοποιημένη μορφή, πραγματοποιείται κάθε ένα μήνα για την εξασφάλιση της διατήρησης της βιωσιμότητας των αποικιών του μικροβιακού στελέχους και την απομάκρυνση πιθανοτήτων επιμόλυνσης του. Πίνακας Σύσταση του θρεπτικού μέσου διατήρησης του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) 1 ΝaCl 10 2 Εκχύλισμα μαγιάς 5 3 Τρυπτόνη 10 4 Αγαρόζη Προκαλλιέργεια του Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Η καλλιέργεια του αναερόβιου βακτηρίου πραγματοποιείται σε δύο βασικά στάδια. Προηγείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού σε πλουσιότερο θρεπτικά μέσο, το αποκαλούμενο μέσο προκαλλιέργειας, με σκοπό την ταχεία ανάπτυξη και διαίρεση των κυττάρων του. Το στάδιο της προκαλλιέργειας χωρίζεται επίσης σε δύο στάδια ώστε να αναγεννηθεί πλήρως ο μικροοργανισμός. Επιτυγχάνεται έτσι ταχύτερη ανάπτυξη και επαναληψιμότητα στη συμπεριφορά των πειραμάτων. Τα συστατικά του θρεπτικού μέσου -80-

101 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι και η συγκέντρωση τους είναι κοινά για το πρώτο και το δεύτερο στάδιο της προκαλλιέργειας όπως αυτά παρουσιάζονται στον Πίνακα Το πρώτο στάδιο πραγματοποιείται σε δοκιμαστικό σωλήνα 15 ml που περιλαμβάνει 10 ml θρεπτικού μέσου. Καλύπτεται αρχικά με ελαστικό καπάκι (septa) και με τη βοήθεια σύριγγας απομακρύνεται ο αέρας από το εσωτερικό και προστίθεται στον υπερκείμενο χώρο CO2. Το ενοφθάλμισμα προέρχεται από απομονωμένη αποικία από τα τρυβλία που παρασκευάστηκαν τον τελευταίο μήνα. Το δεύτερο στάδιο της προκαλλιέργειας ξεκινάει μετά από το ενοφθάλμισμα με το πρώτο στάδιο της προκαλλιέργειας. Χρησιμοποιείται γυάλινο θερμοανθεκτικό μπουκάλι (pyrex) με βιδωτό καπάκι στο οποίο έχει απομακρυνθεί ο αέρας, μέσω ελαστικών πωμάτων και με τη βοήθεια καθετήρα, και έχει αντικατασταθεί από ατμόσφαιρα CO2. Όταν η οπτική πυκνότητα (OD) της καλλιέργειας περάσει την τιμή ένα και βρίσκεται στα όρια 1-1,3 όπου πρόκειται για τη μέση της εκθετικής φάσης ανάπτυξης των κυττάρων, λαμβάνεται 10% w/v ποσότητα ενοφθαλμίσματος και μετά από φυγοκέντρηση προστίθεται στο μέσο της ζύμωσης. H μέτρηση της οπτικής πυκνότητας αναφέρεται στην παράγραφο Πίνακας Σύσταση θρεπτικού μέσου προκαλλιέργειας του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) 1 Γλυκόζη 20 2 Εκχύλισμα μαγιάς 2 3 NaHCO K2HPO4 1,5 5 MgSO4.7H2O 1-81-

102 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Ζύμωση του Βακτηρίου Actinobacillus succinogenes Η καλλιέργεια του βακτηρίου Actinobacillus succinogenes DSM πραγματοποιείται σε ασυνεχείς (batch), αναερόβιες συνθήκες. Οι φιάλες που χρησιμοποιήθηκαν διέθεταν συνολικό όγκο 500 ml. Πρόκειται για γυάλινες φιάλες με θερμοανθεκτικά τοιχώματα και βιδωτό καπάκι. Το θρεπτικό μέσο περιλαμβάνει γλυκόζη και ξυλόζη ως πηγή άνθρακα, εκχύλισμα μαγιάς ως πηγή αζώτου, Κ2HPO4 ως πηγή φωσφόρου και MgCO3 ως πηγή CO2 αλλά συγχρόνως ως ρυθμιστικό του ph. Τα παραπάνω μελετήθηκαν μέσω πειραματικού σχεδιασμού για την βέλτιστη παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Επιπρόσθετα, το θρεπτικό μέσο της ζύμωσης περιλάμβανε ΝaCl 0,5 g/l, MgSO4 1 g/l και CaCl2 0,1 g/l. Τα ανθρακικά άλατα (MgCO3, NaHCO3) αποστειρώνονται ξεχωριστά στους 121 o C για 20 min σύμφωνα με τη διαδικασία της αποστείρωσης όπως περιγράφεται στην Παράγραφο Η αρχική ποσότητα ενοφθαλμίσματος υπολογίζεται στην τιμή 3% v/v μετά από 4-6 h του δεύτερου σταδίου προκαλλιέργειας. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται περίπου στο 7 κατά την έναρξη της ζύμωσης με τη χρήση αποστειρωμένων διαλυμάτων 1 Μ ΝaΟΗ και 1 Μ HCl. Η ζύμωση πραγματοποιείται στον περιστροφικό επωαστήρα στους 37 o C και με συχνότητα ανάδευσης καθορισμένη σε 150 rpm. Με στόχο τη μέτρηση του παραγόμενου ηλεκτρικού οξέος αλλά και της κατανάλωσης των αρχικών σακχάρων, τα δείγματα λαμβάνονται στις 24 h και κατά την ολοκλήρωση του πειράματος στις 48 h. Ακολούθως, τα δείγματα φυγοκεντρούνται και φιλτράρονται με φίλτρο Whatman 0,2 μm και οδηγούνται για ανάλυση με υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία (HPLC) Πειραματικός Σχεδιασμός Για τη μελέτη των συγκεντρώσεων των συστατικών του θρεπτικού μέσου επιλέχθηκε ο στατιστικός σχεδιασμός Taguchi σε μικτά επίπεδα. Η αναλογία του μίγματος των αρχικών σακχάρων γλυκόζη και ξυλόζη μελετάται σε έξι επίπεδα και οι υπόλοιποι τέσσερεις παράγοντες (συνολικά σάκχαρα, MgCO3, Εκχύλισμα μαγιάς, Κ2HPO4) σε τρία επίπεδα (6 επίπεδα x 2 παραμέτρους, 3 επίπεδα x 4 παραμέτρους). Τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν είναι 18 (L18). Αναλυτικά, ο πειραματικός σχεδιασμός Taguchi απεικονίζεται στον Πίνακα Στον παρόντα σχεδιασμό, ως παράγοντας απόκρισης επιλέγεται η συγκέντρωση του παραγόμενου ηλεκτρικού οξέος (g/l). Ο πειραματικός σχεδιασμός δίνει τη δυνατότητα μαθηματικής περιγραφής καθώς εξάγεται ένα εμπειρικό -82-

103 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι μαθηματικό μοντέλο που προβλέπει τη συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος σε σχέση με τους ελεγχόμενους παράγοντες, λαμβάνοντας υπόψη τις αποκλίσεις που υπεισέρχονται από τους μη ελεγχόμενους παράγοντες. Επίσης, πραγματοποιείται Ανάλυση Διακύμανσης (ANOVA) των πειραματικών αποτελεσμάτων που εξάγει συμπεράσματα για τη συνεισφορά της κάθε παραμέτρου στο γραμμικό μοντέλο βασισμένα στο άθροισμα των τετραγώνων (SS) και για τη σημαντικότητα της επίδρασης της κάθε παραμέτρου στον παράγοντα απόκρισης από τον παράγοντα p (pfactor). Περισσότερα στοιχεία προκύπτουν από την ανάλυση μέσω των διαγραμμάτων κανονικότητας και της διασποράς των υπολειμμάτων των μετρούμενων από τα υπολογισθέντα δεδομένα, που υποδεικνύουν τη στατιστική ασφάλεια των συμπερασμάτων που εξάγονται από το γραμμικό εμπειρικό μοντέλο (Παράρτημα Α). Ο πειραματικός σχεδιασμός που εφαρμόζεται μελετά την επίδραση πέντε παραγόντων, της αναλογίας των σακχάρων, της συνολικής συγκέντρωσης των σακχάρων, της περιεκτικότητας σε ανθρακικό μαγνήσιο, της περιεκτικότητας σε φωσφορικά άλατα και της περιεκτικότητας σε εκχύλισμα ζύμης που αποτελεί την πηγή αζώτου για τον μικροοργανισμό (Πίνακας 2.12). Το αποτέλεσμα του ορθογώνιου σχεδιασμού (orthogonal array) είναι μια σειρά 18 πειραμάτων (L18) που το καθένα πραγματοποιείται σε 2 επαναλήψεις. Η στατιστική ανάλυση εξάγει πληροφορίες για το λόγο «Σήματος προς Θόρυβο» ( Signal to Noise, S/N) που αποτελεί ένα από τα κριτήρια βελτιστοποίησης του σχεδιασμού Taguchi. Η εξίσωση υπολογισμού του λόγου «Σήματος προς Θόρυβο» περιγράφεται στο Παράρτημα Α. -83-

104 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας Πειραματικός σχεδιασμός Taguchi κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes Παράγοντες Επίπεδο 1 Επίπεδο 2 Επίπεδο 3 Επίπεδο 4 Επίπεδο 5 Επίπεδο 6 Αναλογία Σακχάρων (Γλυκόζη - Ξυλόζη %) Συνολικά Σάκχαρα MgCO3 (g/l) K2HPO4 (g/l) Εκχύλισμα μαγιάς (g/l) Λειτουργία του Βιοαντιδραστήρα Η καλλιέργεια του αναερόβιου βακτηρίου A. succinogenes μεταφέρεται από το επίπεδο της φιάλης σε μεγαλύτερη κλίμακα και η ζύμωση πραγματοποιείται σε γυάλινο βιοαντιδραστήρα όγκου 3 l (BioFlo 110 Bioreactor/Fermentor της αμερικάνικης εταιρίας New Brunswick Scientific Co. Inc.). Ο αέρας απομακρύνεται από το εσωτερικό του αντιδραστήρα με υψηλή παροχή CO2 από εξωτερική φιάλη 100% CO2. Στη συνέχεια, ανάλογα με το σχεδιασμό του πειράματος, η παροχή του CO2 είτε παραμένει σταθερή σε τιμή 0,5 vvm, μέσω κατάλληλου ροομέτρου (Ki 0-5 l/min της αμερικάνικης εταιρίας Key Instruments Inc.), ή διακόπτεται κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας και οι ανάγκες του μικροοργανισμού σε CO2 καλύπτονται μόνο από το MgCO3. To διαλυμένο οξυγόνο (D.O.) μετράται με ένα κατάλληλο ηλεκτρόδιο (InPro 6800 O2 Sensor 12/25 mm της ισπανικής εταιρίας Mettler Toledo Inc.), βυθισμένο πάντοτε στον κύριο όγκο της καλλιέργειας. Η παροχή CO2 πραγματοποιείται από έναν κατανεμητή που βρίσκεται στον κύριο όγκο της καλλιέργειας, ακριβώς κάτω από τη θέση του αναδευτήρα. Το τροφοδοτούμενο CO2 αποστειρώνεται μέσω φιλτραρίσματος με φίλτρα αποστείρωσης Whatman Inc. (U.S.A.) PTFE Filters 0,2 μm. Στη συνέχεια, η μέτρηση και ρύθμιση του ph γίνεται με εγκατεστημένο ηλεκτρονικό σύστημα και ρυθμίζεται με εξωτερικά διαλύματα 1 M NaOH και 1 M HCl σε περίπτωση που -84-

105 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι το MgCO3 δεν αρκεί για τη ρύθμιση του ph. Επιπρόσθετα, μέσω του εγκατεστημένου λογισμικού παρακολουθείται και ρυθμίζεται η ταχύτητα ανάδευσης για την οποία έχει οριστεί σταθερή τιμή ίση με 250 rpm. Ο αφρισμός του βιοαντιδραστήρα λόγω του μεγάλου ρυθμού ανάπτυξης, εντοπίζεται αυτόματα από το κατάλληλο μετρητικό και καταστέλλεται με την παροχή του αντι-αφριστικού Sigma Antifoam SE-15, σε συγκέντρωση υδατικού διαλύματος 1% v/v. Τέλος, ο ωφέλιμος όγκος του αντιδραστήρα είναι 2 l και οι καλλιέργειες που πραγματοποιήθηκαν, είχαν αρχικό όγκο ίσο με 1 l. Το θρεπτικό μέσο που αξιοποιήθηκε είναι το βέλτιστο που επιλέχθηκε από τα πειράματα σε επίπεδο φιαλών. Κατά την πορεία λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα λαμβάνονται δείγματα των 5 ml ανά 12 ώρες για μέτρηση των υπολειπόμενων σακχάρων, του ηλεκτρικού οξέος, της αιθανόλης, του μυρμηκικού και του οξικού οξέος Εξουδετέρωση του υδρολύματος Η αντίδραση της προεπεξεργασίας πραγματοποιείται σε διάλυμα θειικού οξέος 1,5 ή 2 % w/v. Το ph του υδρολύματος μετά το πέρας της αντίδρασης είναι περίπου Συνεπώς απαιτείται ουδετεροποίηση του ph πριν από τη χρήση των μονομερών σακχάρων για τη ζύμωση τους από τους μικροοργανισμούς καθώς και τη μέτρηση τους από τον υγρό χρωματογράφο. Παράλληλα, η μέθοδος της αραιής όξινης υδρόλυσης μπορεί να διαχωρίσει τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα με τέτοιο τρόπο ώστε να παραχθούν και ανεπιθύμητες παρεμποδιστικές ενώσεις για τους ζώντες μικροοργανισμούς. Οι ενώσεις αυτές προέρχονται είτε από την αποικοδόμηση των σακχάρων (φουρφουράλες, υδρομέθυλοφουρφουράλες) ή από την αποικοδόμηση της λιγνίνης (φαινόλες). Επίσης, οι φουρφουράλες σε ορισμένες περιπτώσεις αποικοδομούνται με τη σειρά τους σε οργανικά οξέα όπως μυρμηκικό και λεβουλινικό οξύ (Σχήμα 2.4). Η διαδικασία της εξουδετέρωσης του μίγματος απομακρύνει τις παρεμποδιστικές ενώσεις αφού τις καταβυθίσει ως ίζημα. Η ουδετεροποίηση του μίγματος πραγματοποιείται με τη χρήση βάσης (NaOH) ώσπου το ph να γίνει ιδιαίτερα βασικό (περίπου ph=11-12). Η αντίδραση διαρκεί 2 h υπό ανάδευση στους 60 o C. Στη συνέχεια το υδρόλυμα χειρίζεται με πυκνό θειικό οξύ (72% w/v H2SO4) ώστε το ph να γίνει ουδέτερο στην τελική τιμή 6.2 (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000). Κατά την εξουδετέρωση, δημιουργείται ίζημα που -85-

106 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι προέρχεται από τα άλατα της αντίδρασης των οξέων με τη βάση και καταβυθίζεται ώστε να υπάρχει η δυνατότητα απομάκρυνσης του με τη βοήθεια της φυγοκέντρησης. Το διάλυμα τοποθετείται στη φυγόκεντρο σε στροφές 5800xg για διάρκεια 10 min. Σχήμα 2.4. Δομή των παρεμποδιστικών ενώσεων που προέρχονται από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Η επίδραση των παρεμποδιστικών ενώσεων διαφέρει σε κάθε καλλιέργεια και εξαρτάται από το μέγεθος του ενοφθαλμίσματος, το ph, τον αερισμό και άλλους παράγοντες. Η απόδοση της παραγωγής των προϊόντων δεν αλλάζει σημαντικά με τη μεσολάβηση της ουδετεροποίησης, αλλά η βασική διαφορά σημειώνεται στην καθυστέρηση της ανάπτυξης του πληθυσμού. Οι παρεμποδιστικές ενώσεις διαπερνούν το κυτταρικό τοίχωμα του μικροοργανισμού προκαλώντας μεγάλης διάρκειας επώαση και χαμηλή παραγωγή μεταβολιτών. Συγκεκριμένα οι φουρφουράλες μειώνουν την παραγωγικότητα του μικροοργανισμού και τον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (Chandel et al., 2011). -86-

107 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Αναλυτικές Μέθοδοι του Σταδίου της Ζύμωσης Δειγματοληψία Κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειες πραγματοποιούνται δειγματοληψίες σε τακτά χρονικά διαστήματα τόσο σε επίπεδο κωνικών φιαλών όσο και σε επίπεδο βιοαντιδραστήρα. Τα δείγματα που λαμβάνονται έχουν συνήθως όγκο 5 ml και προορίζονται για τις αναλυτικές τεχνικές προσδιορισμού που εφαρμόζονται σε κάθε περίπτωση. Το κάθε δείγμα, που απομακρύνεται από την καλλιέργεια, φυγοκεντρείται άμεσα ώστε να διαχωριστούν τα κύτταρα που καταβυθίζονται από το υπερκείμενο διάλυμα που περιλαμβάνει τα διαλυμένα επιθυμητά προϊόντα. Στη συνέχεια καταψύχεται και διατηρείται στους -30 ο C. Η δειγματοληψία στις κωνικές φιάλες πραγματοποιείται υπό ασηπτικές συνθήκες μέσα στο θάλαμο νηματικής ροής. Στο βιοαντιδραστήρα η λήψη του δείγματος γίνεται ασηπτικά με χειροκίνητη αναρρόφηση της κατάλληλης ποσότητας. Μικρή ποσότητα από κάθε δείγμα οδηγείται για οπτική παρατήρηση των κυττάρων με τη βοήθεια του μικροσκοπίου Leica DM 4000B της γερμανικής εταιρίας Microsystems Wetzlar GmbH. Η δειγματοληψία πραγματοποιείται κάθε μία ή δύο ώρες για παρακολούθηση της παραγωγής της κυτταρικής βιομάζας, της αιθανόλης ή του ηλεκτρικού οξέος καθώς και της κατανάλωσης των σακχάρων. Στις περιπτώσεις του πειραματικού σχεδιασμού η δειγματοληψία πραγματοποιείται κατά την ολοκλήρωση του φαινομένου. Συγκεκριμένα κατά τη ζύμωση του Saccharomyces cerevisiae το δείγμα λαμβάνεται στις 8 και 12 ώρες και στη ζύμωση του Actinobacillus succinogenes το δείγμα λαμβάνεται στις 12 και 24 ώρες Μέτρηση της Κυτταρικής Αύξησης Για την παρακολούθηση του ρυθμού κυτταρικής αύξησης εφαρμόζεται η φασματοσκοπική μέθοδος μέτρησης της οπτικής πυκνότητας (θολερότητας) της καλλιέργειας. Το δείγμα τοποθετείται σε πλαστική κυψελίδα μίας χρήσης 3 ml απευθείας στο φασματοφωτόμετρο για τη μέτρηση της απορρόφησης του φωτός από το κυτταρικό αιώρημα με τυφλό δείγμα το νερό. Οι μετρήσεις πραγματοποιούνται στα 600 nm σε φασματοφωτόμετρο ορατού/υπεριώδους (U-1800 UV/vis Spectrophotometer της αμερικανικής εταιρίας Hitachi High Technologies Inc.). Το υπόλοιπο δείγμα, φυγοκεντρείται, διαχωρίζονται τα κύτταρα από το υπερκείμενο και διατηρούνται στην κατάψυξη στους -30 o C, αφού προηγηθεί -87-

108 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι ξήρανση τους μέσω λυοφιλοποίησης για περίπου 16 h. Η λυοφιλοποίηση πραγματοποιείται σε λυοφιλοποιητή (Freeze Dryer) ThermoMicroModulyo-230, ο οποίος είναι εξοπλισμένος με την αντλία κενού Thermo Savant VLP120 ValuPump της ίδιας εταιρίας. Στη συνέχεια τα λυοφιλοποιημένα κύτταρα ζυγίζονται ώστε να προσδιοριστεί η κυτταρική μάζα τους. Ακολουθεί συσχέτιση μεταξύ της οπτικής πυκνότητας και της ξηρής κυτταρική μάζας (σε όρους συγκέντρωσης βιομάζας). Η γραμμική αυτή απεικόνιση του Σχήματος 2.5 της σχέσης της οπτικής πυκνότητας και της βιομάζας επιτρέπει τη μετατροπή της απορρόφησης σε g/l ξηρής κυτταρικής βιομάζας σύμφωνα με τη σχέση: [DCW]=0,259 [OD]600nm (2.6), όπου [DCW] είναι η συγκέντρωση της ξηρής μάζας κυττάρων (συγκέντρωση βιομάζας) σε g/l, και [OD]600nm η οπτική απορρόφηση στα 600 nm. Ο συντελεστής R 2 της γραμμικής παλινδρόμησης προέκυψε αρκετά ικανοποιητικός και ίσος με 0,9676. Η σχέση αυτή ισχύει για οπτική πυκνότητα μέχρι τιμή 30. Σε μεγαλύτερες τιμές λόγω των βλαστών που δημιουργεί ο S. cerevisiae (Σχήμα 2.6) η συσχέτιση αλλάζει κλίση και προκύπτει η σχέση: [DCW]=0,344 [OD]600nm (2.7) Σχήμα 2.5. Καμπύλη γραμμικής συσχέτισης της οπτικής πυκνότητας (OD) των κυττάρων του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae με το βάρος της ξηρής βιομάζας (συγκέντρωση βιομάζας, DCW). -88-

109 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι (α) (β) Σχήμα 2.6. Εικόνα μικροσκοπίου (α) με οπτική πυκνότητα OD=15 και (β) με οπτική πυκνότητα OD= On line μετρήσεις Για τη συλλογή αποτελεσμάτων καθώς και για την παρακολούθηση της καλλιέργειας του μικροοργανισμού πραγματοποιούνται συνεχείς δειγματοληψίες και αναλύσεις, είτε παράλληλα με τη διαδικασία είτε συγκεντρωτικά αφού ολοκληρωθεί το στάδιο. Για σύγχρονη παρακολούθηση και έλεγχο της ζύμωσης χρησιμοποιήθηκαν: 1) ενζυμικά αντιδραστήρια για απλοποιημένη μέθοδο προσδιορισμού της αιθανόλης στο αιώρημα της καλλιέργειας με τη χρήση Φασματοφωτομετρίας Υπεριώδους/Ορατού (UV-method, No , Boehringer Mannheim της γερμανικής εταιρίας R-Biopharm), (Biener et al., 2012). 2) η μέθοδος προσδιορισμού της γλυκόζης με δίνιτρο-σαλυκιλικό οξύ (DNS method, Miller, 1959) και χρήση Φασματοφωτομετρίας Υπεριώδους/Ορατού Φάσματος. Τα αναγωγικά σάκχαρα και συγκεκριμένα η γλυκόζη, αντιδρά με το δίνιτρο-σαλικυλικό οξύ (DNS) προς το σχηματισμό του έγχρωμου (πορτοκαλί) παραγώγου άμινο-νίτρο-σαλυκιλικού οξέος. Το χρωματισμένο διάλυμα απορροφά στο ορατό, με την ένταση να εξαρτάται από τη συγκέντρωση του άμινο-νίτρο-σαλυκιλικού οξέος και αναλογικά από τη συγκέντρωση της γλυκόζης. Οι διαδικασίες υπολογισμού των σακχάρων με τη μέθοδο προσδιορισμού του δίνιτρο-σαλυκιλικού οξέος και της αιθανόλης με τα ενζυμικά αντιδραστήρια περιγράφονται στο Παράρτημα Β. -89-

110 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης Ο ποσοτικός προσδιορισμός των περιεχόμενων ενώσεων στο υπερκείμενο των δειγμάτων που προέρχονται από την καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε και με off-line μετρήσεις με τη χρήση συσκευής Υψηλής Απόδοσης Υγρής Χρωματογραφίας (HPLC). Τo μοντέλο της συσκευής είναι το Agilent 1200 της γερμανικής εταιρίας Agilent Technologies, με εγκατεστημένη στήλη ιοντοανταλλαγής Agilent, μοντέλου Hi-Plex H +, διαστάσεων 300 mm x 7,7 mm x 8 μm (PL ) και εγκατεστημένο ανιχνευτή Δείκτη Διάθλασης Model Infinity Ως κινητή φάση χρησιμοποιείται υδατικό διάλυμα H2SO4 0,005 Μ με ρυθμό ροής 0,6 ml/min. Τα δείγματα που προέρχονται από την καλλιέργεια του S. cerevisiae αφού φυγοκεντρήθηκαν, αναλύθηκαν για περιεκτικότητα σε αιθανόλη, γλυκόζη, οξικό οξύ, γλυκερόλη και μυρμηκικό οξύ. Τα δείγματα που προέρχονται από την καλλιέργεια του A. succinogenes, αναλύθηκαν για περιεκτικότητα σε ηλεκτρικό οξύ, αιθανόλη, γλυκόζη, ξυλόζη, οξικό και μυρμηκικό οξύ. Οι παραπάνω ενώσεις έχουν βαθμονομηθεί με πρότυπα μίγματα γνωστών συγκεντρώσεων και τα φάσματα τους παρουσιάζονται στο Σχήμα 2.7. Σχήμα 2.7. Χρωματογράφημα (χρόνος έκλουσης ένταση σήματος) του αναλυτή δείκτη Διάθλαση κατά την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης για μίγμα πρότυπων σακχάρων με συγκέντρωση 25 g/l, για τη βαθμονόμηση του οργάνου στο στάδιο της ζύμωσης. -90-

111 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Μέτρηση O2 και CO2 Η βαθμονόμηση του ηλεκτροδίου του διαλυμένου οξυγόνου βασίζεται σε δύο σημεία: (α) στη μέτρηση για 0% διαλυμένο οξυγόνο, όπου το μετρητικό όργανο είναι αποσυνδεδεμένο από τη μονάδα ελέγχου του βιοαντιδραστήρα, και (β) στη μέτρηση για 100% διαλυμένο οξυγόνο, όπου εξασφαλίζεται ο κορεσμός του μέσου ανάπτυξης με άφθονο αερισμό του, πριν την έναρξη της καλλιέργειας. Η σύσταση των απαερίων από τον αντιδραστήρα, σε όρους % μοριακής περιεκτικότητας, μετρήθηκε on-line με τη βοήθεια ενός αναλυτή αερίων 5200 Multi Purpose της αμερικάνικης εταιρίας Servomex Ltd. Ο αναλυτής χρησιμοποιεί παραμαγνητικούς μετρητές για τον προσδιορισμό του O2 σε περιεκτικότητες ως 100% mol/mol και μετρητές υπέρυθρου για τη μέτρηση του CO2 σε περιεκτικότητες ως 30% mol/mol του αέρα Υπολογισμός Απόδοσης Σταδίου Τα αποτελέσματα της συγκέντρωσης της αιθανόλης του σταδίου της ζύμωσης του Saccharomyces cerevisiae χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της απόδοσης του σταδίου αυτού για το βασικό προϊόν της αιθανόλης. Η απόδοση υπολογίζεται με βάση τη θεωρητική τιμή απόδοσης που βασίζεται στη στοιχειομετρία της αντίδρασης της παραγωγής αιθανόλης από τη γλυκόζη: C6H12O6 2C2H6O + 2CO2 (2.8) Η θεωρητική απόδοση προκύπτει ίση με 0,51 g αιθανόλης προερχόμενα από 1 g γλυκόζης. Επομένως η απόδοση του σταδίου της ζύμωσης ορίζεται ως: [Απόδοση Σταδίου] = ([Συγκέντρωση Παραγόμενης Αιθανόλης]/[Συγκέντρωση Καταναλισκόμενων Σακχάρων])/ 0,51 x 100 (2.9) Ακόμα, η πυκνότητα της αιθανόλης είναι ίση με 0,789 g/ml. Η τιμή της πυκνότητας είναι απαραίτητη για τη μετατροπή της συγκέντρωσης του διαλύματος της ζύμωσης του Saccharomyces cerevisiae σε περιεκτικότητα κατ όγκο (% v/v). -91-

112 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Βιβλιογραφία 2 ου Κεφαλαίου Agbor, V.B., Cicek, N., Sparling, R., Berlin, A., Levin, D.B., Biomass pretreatment: fundamentals toward application. Biotechnology advances, 29(6), pp Biener, R., Steinkämper, A., Horn, T., Calorimetric control of the specific growth rate during fed-batch cultures of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biotechnology, 160(3-4), pp Borges, E.R. & Pereira, N., Succinic acid production from sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate by Actinobacillus succinogenes. Journal of industrial microbiology & biotechnology, 38(8), pp Box, G.E.P. & Behnken, D.W., Some New Three Level Designs for the Study of Quantitative Variables. Technometrics, 2(4), pp Bracey, D., Holyoak, C.D., Caron, G.N., Coote, P.J., Methods Determination of the intracellular ph ( ph i ) of growing cells of Saccharomyces cerevisiae: the effect of reduced-expression of the membrane H + - ATPase. Journal of Microbiological Methods, 31, pp Chandel, A.K., Silvério, S., Singh, O. V, Detoxification of Lignocellulosic Hydrolysates for Improved Bioethanol Production. Biofuel Production Recent Developments and Prospects, pp Goering, H.K. & Van-Soest, P.J., Forage fibre analyses (apparatus, reagments, procedures and some applications). Agriculture Handbook No 379, Agric. Res. Serv., USDA Washinghton DC, USA, pp.20. Gunnarsson, I.B., Karakashev, D.B., Angelidaki. I., Succinic Acid Production from Jerusalem artichoke tubers. 21 st European Biomass Conference and Exhibition, Copenhagen, Denmark, pp

113 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Harris, L.E., 1970, Nutrition research techniques for domestic and wild animals, An International Record System and Procedures for analyzing samples, Vol. 1, Logan Utah, USA. Karapatsia, A., Penloglou, G., Pappas, I., Kiparissides, C., Bioethanol Production via the Fermentation of Phalaris aquatica L. Hydrolysate. Chemical Engineering Transactions, 37, pp Kumar, A., Singh, L.K., Ghosh, S., Bioconversion of lignocellulosic fraction of waterhyacinth (Eichhornia crassipes) hemicellulose acid hydrolysate to ethanol by Pichia stipitis. Bioresource Technology, 100(13), pp Lin, Y., Zhang, W., Li, C., Sakakibara, K., Tanaka, S., Kong, H., Factors affecting ethanol fermentation using Saccharomyces cerevisiae BY4742. Biomass and Bioenergy, 47, pp Lloyd, T. & Wyman, C.E., Combined sugar yields for dilute sulfuric acid pretreatment of corn stover followed by enzymatic hydrolysis of the remaining solids. Bioresource technology, 96(18), pp Miller, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 31(3), pp Palmqvist, E. & Hahn-Hägerdal, B., Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: Inhibitors and mechanisms of inhibition. Bioresource Technology, 74(1), pp Segal, L., Creely, J.J., Martin, A.E., Conrad, C.M., An Empirical method for estimating the degree of crystallinity of native cellulose using the X-ray diffractometer. Textile Research Journal, 29, pp Sindhu, R., Kuttiraja, M., Binod, P., Janu, K.U., Sukumaran, R.K., Pandey, A., Dilute acid pretreatment and enzymatic saccharification of sugarcane tops for bioethanol production. Bioresource Technology, 102(23), pp

114 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Singh, A. & Bishnoi, N.R., Enzymatic hydrolysis optimization of microwave alkali pretreated wheat straw and ethanol production by yeast. Bioresource Technology, 108, pp Singh, S., Simmons, B., Vogel, K.P., Visualization of biomass solubilization and cellulose regeneration during ionic liquid pretreatment of switchgrass. Biotechnology and bioengineering, 104(1), pp Song, H. & Lee, S.Y., Production of succinic acid by bacterial fermentation. Enzyme and Microbial Technology, 39(3), pp Srilekha Yadav, K., Naseeruddin, S., Sai Prashanthi, G., Sateesh, L., Venkateswar Rao, L., Bioethanol fermentation of concentrated rice straw hydrolysate using co-culture of Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis. Bioresource Technology, 102(11), pp Taguchi, G., Subir, C., Wu Y., Taguchi s Quality Engineering Handbook. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, Canada. Van Soest, P.J., Robertson, J.B., Lewis, B.A., 1991, Methods for dietary fiber, Neutral detergent fiber and non-starch polysaccharides in relation to animal nutrition. Journal of Dairy Science, 74(10), pp Wilson, J.J., Deschatelets, L., Nishikawa, N.K., Comparative fermentability of enzymatic and acid hydrolysates of steam-pretreated aspenwood hemicellulose by Pichia stipitis CBS Applied Microbiology and Biotechnology, 31(5-6), pp Zhu, L., O'Dwyer, J.P., Chang, V.S., Granda, C.B., Holtzapple, M.T., Structural features affecting biomass enzymatic digestibility. Bioresource technology, 99(9), pp Kαραπατσιά, A., Πενλόγλου, Γ., Παππάς, I.A., Κυπαρισσίδης, Κ., Μελετη και Βελτιστοποίηση της παραγωγής Βιοαιθανόλης 2 ης γενιάς κατά την ολοκληρωμένη επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας του φυτού Phalaris aquatica L.. 9 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Χημικής Μηχανικής, Αθήνα, pp

115 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Παππάς, Ι.Α., Αξιολόγηση παραγωγικού δυναμικού λιβαδικών φυτών και αξιοποίησή τους για παραγωγή βιοενέργειας. Διδακτορική Διατριβή. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ). Σχολή Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος. doi /eadd/ Πενλόγλου, Ι.Σ., 2010, Μικροβιακή Παραγωγή του βιοαποικοδομησιμου πολύ-(3-υδροξυ βουτυρικού) εστέρα (PHB) με στοχευμένες μοριακές ιδιότητες: Πειραματική βελτιστοποίηση και Μαθηματική μοντελοποίηση. Διδακτορική Διατριβή. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ). Πολυτεχνική Σχολή. Τμήμα Χημικών Μηχανικών. doi

116 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία 3.1 Εισαγωγή στην Προεπεξεργασία Η μέθοδος της προεπεξεργασίας αποτελεί το πρώτο στάδιο της συνολικής διεργασίας παραγωγής βιοαιθανόλης και αποτελεί σημαντικό στάδιο καθώς πραγματοποιείται η διαφοροποίηση της δομής της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας με τέτοιο τρόπο ώστε να είναι διαθέσιμη στην περαιτέρω επεξεργασία της. Για την κατανόηση της δράσης του σταδίου είναι απαραίτητη η γνώση της δομής της λιγνοκυτταρίνης. Η λιγνοκυτταρινική βιομάζα αποτελείται από τρία βασικά δομικά συστατικά την κυτταρίνη, τις ημικυτταρίνες και τη λιγνίνη (Σχήμα 3.1) (Burner et al., 2009). Η δράση της προεπεξεργασίας στοχεύει στη λύση των δεσμών μεταξύ των ημικυτταρινών, στην επίδραση της κρυσταλλικής δομής της κυτταρίνης και στην αλλαγή του περιεχομένου της λιγνίνης. Ανάλογα με την πηγή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας διαφοροποιούνται οι αναλογίες των δομικών συστατικών της και οι απαιτήσεις κατεργασίας από τη μέθοδο της προεπεξεργασίας. Αρχικά, η κυτταρίνη αποτελεί το βασικότερο συστατικό των φυτών καθώς καταλαμβάνει το μεγαλύτερο ποσοστό με τιμές που κυμαίνονται μεταξύ 40-50%. Από την άλλη, το περιεχόμενο σε ημικυτταρίνες κυμαίνεται συνήθως σε τιμές 20-40% και τέλος το περιεχόμενο των λιγνοκυτταρινούχων φυτών σε λιγνίνη βρίσκεται σε χαμηλότερο ποσοστό ανάλογα με την πηγή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Όσον αφορά την κυτταρίνη, οι στοιχειώδεις δομές της οργανώνονται σε μορφή ινών σχηματίζοντας συσσωμάτωμα 36 αλυσίδων γλυκάνης σε δομή εξαγώνου (Vidal et al., 2011). Η γλυκάνη είναι πολυσακχαρίτης -96-

117 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία της D-γλυκόζης, όπου τα μονομερή είναι συνδεδεμένα με β-γλυκοσιδικούς δεσμούς. Η γεωμετρία αυτή προσφέρει στην κυτταρίνη πυκνές κρυσταλλικές περιοχές που αποτελούν το 50-90% του συνόλου και το υπόλοιπο ποσοστό αποτελείται από λιγότερο οργανωμένες άμορφες περιοχές (Foyle et al., 2007). Η υδρόλυση της κυτταρίνης έχει ως προϊόν αποκλειστικά τη γλυκόζη. Καθώς, η κυτταρίνη βρίσκεται σε αφθονία στη φύση σε ποσοστό 40% της οργανικής ύλης (Παππάς, 2010), η λιγνοκυτταρινική βιομάζα αποτελεί πρώτης τάξης πηγή υδατανθράκων. Σχήμα 3.1. Δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Οι ίνες της κυτταρίνης όπως περιβάλλονται από ημικυτταρίνες και λιγνίνη. Οι επόμενες βασικές δομές της βιομάζας - οι ημικυτταρίνες - περιβάλλουν τις ίνες της κυτταρίνης δημιουργώντας ένα δίκτυο ομοιοπολικών και μη-ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ της κυτταρίνης και των ημικυτταρινών αυξάνοντας με αυτό τον τρόπο τη σταθερότητα του πλέγματος κυτταρίνης ημικυτταρινών λιγνίνης (Σχήμα 3.1). Η δομή των ημικυτταρινών διαφέρει ανάλογα με το είδος του φυτού καθώς αποτελεί ένα ετερογενές φυσικό -97-

118 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία πολυμερές με διαφορετική σύνθεση των πολυσακχαριτικών αλυσίδων του ανάλογα με την προέλευση του. Τα πιο συνηθισμένα δομικά μονομερή σάκχαρα των ημικυτταρινών στα αγρωστώδη φυτά είναι στην κατηγορία των πεντοζών: η ξυλόζη και η αραβινόζη και στην κατηγορία των εξοζών: η γλυκόζη, η γαλακτόζη και η μαννόζη (Foyle, 2007). Η τρίτη βασική δομική μονάδα του φυτού - η λιγνίνη - είναι βασικό δομικό συστατικό των φυτών και του ξύλου και αποτελεί το 15-40% w/w της ξηρής βιομάζας των ξυλωδών φυτών. Συγκεκριμένα, πρόκειται για μακρομόριο με βάση τη φαινυλική προπανοϊκή δομή (Doherty et al., 2011). Αποτελεί ένα υδροφοβικό υλικό που γεμίζει το χώρο γύρω από την κυτταρίνη διατηρώντας τη συνοχή της κρυσταλλικής της δομής, κρατώντας μακριά την υγρασία. Επίσης λειτουργεί προστατευτικά σε βιολογικές επιθέσεις διότι έχει αντιμικροβιακές ιδιότητες, το ίδιο και τα προϊόντα που προέρχονται από αυτήν. Οι ομοιοπολικοί δεσμοί της λιγνίνης που σχηματίζονται με άλλους πολυσακχαρίτες και κυρίως τις ημικυτταρίνες παρεμποδίζουν την προσβασιμότητα των ενζύμων που υδρολύουν τους πολυσακχαρίτες και αποτρέπει την εκχύλιση των υδατανθράκων σε υδατικούς διαλύτες. Σύμφωνα με την παραπάνω αναφερθείσα δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας προκύπτει η ανάγκη να υπερβούν οι δεσμοί μεταξύ των τριών αυτών δομικών συστατικών. Η απαίτηση να μεσολαβήσει ένα στάδιο θερμοχημικής διεργασίας της βιομάζας είναι φανερή, ώστε να ληφθεί η διαθέσιμη κυτταρίνη στο ακόλουθο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. Η προεπεξεργασία, ανάλογα με τη μέθοδο που εφαρμόζεται και τις αποδόσεις που παρουσιάζει η κάθε μία προσαρμοσμένη στις ανάγκες της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, επιτρέπει την ενίσχυση της απόδοσης σε γλυκόζη, του επόμενου σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης, εώς και 3 φορές (da Costa Sousa et al., 2009). Το στάδιο της προεπεξεργασίας έχει ως στόχο την απελευθέρωση των ημικυτταρινών από τη λιγνοκυτταρίνη, τη διαλυτοποίηση τους σε μονομερή σάκχαρα καθώς και την αύξηση της ειδικής επιφάνειας της κυτταρίνης, ώστε να ενισχυθεί η αποτελεσματικότητα της ενζυμικής υδρόλυσης (Σχήμα 3.2). Η σημαντικότητα της προεπεξεργασίας ορίζεται από τη δράση της στα βασικά χαρακτηριστικά της βιομάζας, ξεκινώντας από το βαθμό κρυσταλλικότητας του υλικού (Alvira et al., 2010). Ο βαθμός κρυσταλλικότητας επηρεάζεται με τον εξής τρόπο: η απομάκρυνση των άμορφων περιοχών της δομής της λιγνοκυτταρίνης, που αποτελούν πιο εύκολα διαθέσιμες περιοχές προς υδρόλυση, αυξάνει το βαθμό κρυσταλλικότητας. Η κρυσταλλικότητα δε συνδέεται απαραίτητα με τη διαθέσιμη επιφάνεια και το μέγεθος των -98-

119 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία σωματιδίων. Επιπρόσθετα, η προεπεξεργασία επεμβαίνει αλλάζοντας τόσο το βαθμό πολυμερισμού όσο και την κρυσταλλικότητα της βιομάζας, που αποτελούν σημαντικά χαρακτηριστικά του προεπεξεργασμένου υλικού για την αποτελεσματικότητα της ενζυμική της υδρόλυση. Η μείωση του βαθμού πολυμερισμού, που επιφέρει η προεπεξεργασία, επιτρέπει στη συνέχεια τις κατάλληλες κυτταρινάσες, που είναι επιλεκτικές στο εσωτερικό ή τα άκρα των πολυμερικών αλυσίδων, να διαθέτουν περισσότερες περιοχές για τη δημιουργία ενεργών συμπλόκων. Ακολούθως, το εμπόδιο της λιγνίνης αποτελεί τροχοπέδη κατά την επεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας προς παραγωγή βιοαιθανόλης. Η λιγνίνη είτε καταλαμβάνει διαθέσιμη επιφάνεια της κυτταρίνης είτε προσροφάται πάνω στα ένζυμα μειώνοντας τη δραστικότητα τους. Εδώ υπεισέρχεται η δράση της προεπεξεργασίας, η οποία στοχεύει στην υπέρβαση του εμποδίου της λιγνίνης με διαφορετικό τρόπο για κάθε μία εκ των μεθόδων. Μία αποτελεσματική μέθοδος προεπεξεργασίας κρίνεται από την υπέρβαση του εμποδίου της λιγνίνης είτε απομακρύνοντας την, είτε μετατοπίζοντας την. Σχήμα 3.2. Αλλαγή στη δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας με τη δράση της προεπεξεργασίας. -99-

120 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Επόμενο βασικό χαρακτηριστικό της βιομάζας στο οποίο επεμβαίνει η προεπεξεργασία είναι το περιεχόμενο σε ημικυτταρίνες, καθώς η διαλυτοποίηση τους αυξάνει το μέγεθος των πόρων του υλικού. Έτσι, προκύπτει ένα εμπλουτισμένο ρεύμα μονομερών σακχάρων που μπορεί να χρησιμοποιηθεί απευθείας για ζύμωση με μικροοργανισμούς. Η διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών κρίνεται αποτελεσματική όταν μεγάλο ποσοστό των ημικυτταρινών ανακτάται και δεν ακολουθείται από αποικοδόμηση των μονομερών σακχάρων. Το ρεύμα εξόδου της προεπεξεργασίας που περιλαμβάνει τα διαλυτοποιημένα μονομερή σάκχαρα των ημικυτταρινών μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε απευθείας ζύμωση εάν δε περιλαμβάνει παραπροϊόντα της προεπεξεργασίας που δρουν παρεμποδιστικά στη ζύμωση. Τα κριτήρια που πρέπει να πληροί μία επιτυχημένη μέθοδος προεπεξεργασίας είναι αρχικά η παραλαβή των σακχάρων ή η δημιουργία των κατάλληλων συνθηκών ώστε να ακολουθήσει σε επόμενο στάδιο επεξεργασίας η παραλαβή τους. Η ιδανική κατεργασία οφείλει να παράγει ένα στερεό υλικό ενυδατωμένο με σπασμένους δεσμούς που μπορεί εύκολα να υδρολυθεί χωρίς το σχηματισμό παρεμποδιστικών ενώσεων. Επομένως, είναι σημαντική η μεγιστοποίηση του συντελεστή μετατροπής κατά το επόμενο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης, ένας παράγοντας που εξαρτάται από το ποσοστό αποικοδόμησης των υδατανθράκων. Η αποικοδόμηση καταλήγει είτε στο σχηματισμό ανεπιθύμητων παραπροϊόντων ή παρεμποδιστικών ουσιών για τα επικείμενα στάδια της ενζυμικής υδρόλυσης και της ζύμωσης ή στην απώλεια ποσοστού των ζυμώσιμων σακχάρων. Τέλος, η αξιολόγηση της μεθόδου βασίζεται στην ελαχιστοποίηση του ποσού χρήσης ενέργειας, χημικών ουσιών και βιομάζας, καθώς η συγκράτηση αυτών των μεγεθών μειώνει το κόστος παραγωγής βιοενέργειας από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα και καθιστά συνολικά αποδοτικότερη τη διεργασία. Ένα επιπλέον κριτήριο που συνδέεται με την αξιολόγηση της μεθόδου προεπεξεργασίας είναι ο συνδυαστικός συντελεστής έντασης του σταδίου (CSF), που ορίζεται ως το συνδυαστικό αποτέλεσμα της θερμοκρασίας, του χρόνου αντίδρασης και της οξύτητας του υδρολύματος (Agbor et al., 2011). Οι μέθοδοι προεπεξεργασίας κατατάσσονται στις παρακάτω γενικές κατηγορίες: (α) φυσικές μέθοδοι (κονιορτοποίηση, άλεση), (β) φυσικοχημικές μέθοδοι (εκτόνωση υπ ατμόν, εκτόνωση με CO2, αποΐνωση με αμμωνία), (γ) χημικές μέθοδοι (υδρόλυση με -100-

121 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία συμπυκνωμένο οξύ, με αραιό οξύ, με οργανικούς διαλύτες, αλκαλική υδρόλυση), (δ) βιολογικές μέθοδοι, (ε) ηλεκτρικές μέθοδοι (Kumar P. et al., 2009). (α) Φυσικές Μέθοδοι: Μηχανική Άλεση. Το αρχικό στάδιο της άλεσης έχει στόχο τη μείωση του μεγέθους του υλικού της βιομάζας ώστε να είναι ευκολότερη η επεξεργασία του. Εφόσον μειώνεται ο λόγος της ελεύθερης επιφάνειας προς τον όγκο και ο βαθμός κρυσταλλικότητας της κυτταρίνης που περιέχεται στη βιομάζα διευκολύνεται η μετέπειτα δράση των ενζύμων κατά το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. Η επιλογή της μεθόδου μηχανικής επεξεργασίας ορίζεται από το επιθυμητό τελικό μέγεθος του υλικού της βιομάζας. Συγκεκριμένα, το μέγεθος της επεξεργασμένης βιομάζας είναι mm σε μορφή ρινίσματος και 0,2-2 mm μετά από τη χρήση μύλου ή άλεσμα (Sun & Cheng 2002). (β) Φυσικοχημική Προεπεξεργασία: β.1) Εκτόνωση με Ατμό. Η μέθοδος της εκτόνωσης με ατμό είναι μία από τις πιο διαδεδομένες μεθόδους προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Κατά τη διαδικασία αυτή, η βιομάζα χειρίζεται με κορεσμένο ατμό υψηλής πίεσης, στη συνέχεια η πίεση μειώνεται απότομα με συνέπεια η βιομάζα να υποστεί αποσυμπίεση με τη συνοδεία έκρηξης. Η πίεση που εφαρμόζεται κυμαίνεται μεταξύ 20 και 50 bar και η θερμοκρασία ανάμεσα στους 210 και 290 o C. Ο λόγος της ανάκτησης ξυλόζης/ σακχάρων κατά το στάδιο της εκτόνωσης με ατμό κυμαίνεται μεταξύ 45-65% (Hamenlick et al., 2005). Επίσης στη μέθοδο αυτή έχουν εφαρμοστεί διάφορες παραλλαγές με παρουσία ή όχι χημικών καταλυτών (π.χ. θειικό οξύ, διοξείδιο του θείου, υδροξείδιο του νατρίου και αμμωνία), πριν την εκτόνωση με ατμό (da Costa Sousa et al., 2009, Ewanick & Bura 2011). Μειονέκτημα της μεθόδου είναι η κατά τμήματα αποικοδόμηση των ημικυτταρινών που προκαλεί απώλειες μονομερών σακχάρων. (β.2) Αποΐνωση με Αμμωνία (AFEX-Αmmonia Fiber Explosion): Κατά τη μέθοδο της αποΐνωσης με αμμωνία η βιομάζα επεξεργάζεται με υγρή αμμωνία σε υψηλή θερμοκρασία ανάμεσα στους 70 και 200 o C και υψηλή πίεση μεταξύ των 6-28 bar ( psi) για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα και στη συνέχεια η πίεση μειώνεται απότομα. Η μέθοδος αυτή έχει σαν αποτέλεσμα την υδρόλυση των ημικυτταρινών, το σπάσιμο των κρυσταλλικών δεσμών της κυτταρίνης, το άνοιγμα των πόρων των κυτταρικών τοιχωμάτων και την απομάκρυνση της λιγνίνης. Συνεπώς αυξάνει την απόδοση της ενζυμικής υδρόλυσης. Η ανάκτηση της ξυλόζης που έχει παρατηρηθεί φτάνει το 70% (Bals et al., -101-

122 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία 2010). Μειονέκτημα της μεθόδου είναι η χρήση μεγάλης ποσότητας αμμωνίας και η ανάγκη για προσθήκη ρεύματος ανακύκλωσης της. (β.3) Αποσυμπίεση με Διοξείδιο του Άνθρακα: H μέθοδος της αποσυμπίεσης με CO2 είναι παρόμοια με την εκτόνωση με ατμό με τη διαφορά ότι αντικαθιστά το χειρισμό της βιομάζας με CO2 υψηλής πίεσης και επακόλουθη εκτόνωση. Η μέθοδος αυτή απαιτεί μεν χαμηλότερη θερμοκρασία από τον ατμό και χαμηλότερο κόστος από την αμμωνία, οδηγεί δε σε χαμηλότερα ποσοστά απελευθέρωσης γλυκόζης κατά το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. (γ) Χημική Επεξεργασία: (γ.1) Οζονόλυση. Η επεξεργασία με όζον μειώνει το περιεχόμενο της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας σε λιγνίνη. Συγκεκριμένα αυξάνει την προσβασιμότητα του υλικού στις κυτταρινάσες χωρίς να παράγει τοξικά παραπροϊόντα. Οι ημικυτταρίνες επηρεάζονται ελάχιστα και η κυτταρίνη καθόλου. Οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε θερμοκρασία δωματίου και σε συνθήκες κανονικής πίεσης. Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι η μεγάλη ποσότητα όζοντος που απαιτείται, γεγονός που καθιστά τη μέθοδο οικονομικά απαιτητική. (γ.2) Όξινη Υδρόλυση. (γ.2.1) Όξινη Υδρόλυση με Συμπυκνωμένο Οξύ. Τα συμπυκνωμένα οξέα όπως το θειικό οξύ (Η2SO4) και το υδροχλωρικό οξύ (ΗCl) χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία της βιομάζας και την υδρόλυση των γλυκοσιδικών δεσμών. Έχει αναφερθεί ότι παρουσιάζουν θετικό αποτέλεσμα τόσο κατά την υδρόλυση των ημικυτταρινών όσο και στο μετέπειτα στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας κατά το οποίο απελευθερώνεται μεγαλύτερο ποσοστό μονομερών σακχάρων της κυτταρίνης. Παράλληλα όμως, αναφέρονται σημαντικά μειονεκτήματα που αφορούν την παραγωγή παρεμποδιστικών χημικών ενώσεων που προέρχονται από την αποικοδόμηση των μονομερών σακχάρων, της λιγνίνης και των πολυσακχαριτών. Τέλος, οι ισχυροί χημικοί διαλύτες, σε μεγάλες συγκεντρώσεις, είναι διαβρωτικοί για τον εξοπλισμό που χρησιμοποιείται, τοξικοί για το υδρόλυμα και τις ακόλουθες βιοτεχνολογικές διεργασίες και έχουν υψηλό κόστος. (γ.2.2) Όξινη Υδρόλυση με Αραιό Οξύ. Η χρήση αραιού θειικού οξέος έχει ευρεία εφαρμογή δεδομένου ότι είναι πιο αποτελεσματική και οικονομική. Κύριος σκοπός της μεθόδου είναι η διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών σε μονομερή σάκχαρα (ξυλόζη, αραβινόζη, γαλακτόζη, γλυκόζη και μαννόζη) καθώς και άλλα ολιγομερή, βελτιώνοντας με αυτόν τον -102-

123 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία τρόπο την ενζυμική μετατροπή της κυτταρίνης. Το εύρος των παραγόντων που εφαρμόζονται κυμαίνεται μεταξύ ο C θερμοκρασία, 0,5-2,5% w/v περιεκτικότητα θειικού οξέος, min χρόνο υδρόλυσης και 5-10% περιεκτικότητα στερεού υλικού. Οι μέγιστες αποδόσεις μετατροπής ημικυτταρινών κυμαίνονται μεταξύ 70-94% (Mosier et al., 2005, Lloyd & Wyman, 2005). Η επίτευξη υψηλών αποδόσεων μετατροπής σε ξυλόζη είναι πολύ σημαντική διότι η ξυλόζη αποτελεί μεγάλο ποσοστό, περίπου το ένα τρίτο, των δομικών πολυσακχαριτών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας (Hinman et al., 1992). (γ.3) Αλκαλική Υδρόλυση. Ορισμένες βάσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την προκατεργασία λιγνοκυτταρινικών υλικών και το αποτέλεσμα της κατεργασίας εξαρτάται από το περιεχόμενο της βιομάζας σε λιγνίνη. Συγκεκριμένα η χρήση αλκαλίων έχει τη δυνατότητα να διαφοροποιεί τη σύσταση της λιγνίνης και ως αποτέλεσμα να αυξάνει την πεπτικότητα της βιομάζας. Η μέθοδος αυτή απαιτεί χαμηλότερες θερμοκρασίες και πιέσεις σε σχέση με άλλες μεθόδους προκατεργασίας, απομακρύνει περίπου το 33% της λιγνίνης και το 100% των ακετυλο-ομάδων. Επίσης, η αποικοδόμηση των πολυπεπτιδίων προς σάκχαρα αναμένεται μικρότερη από ότι με τη χρήση συμπυκνωμένων οξέων λόγω της ηπιότερης φύσης των αλκαλίων (Rabelo et al., 2009). Παρά τις ήπιες συνθήκες που επικρατούν σε αυτή την αντίδραση, οι χρόνοι που απαιτούνται είναι της τάξεως των ωρών και ημερών ακόμα, σε σχέση με τα δευτερόλεπτα ή τα λεπτά που απαιτεί η όξινη υδρόλυση. Η απόδοση σε ξυλόζη είναι 60-75% σύμφωνα με τους Reith et al (2002). (γ.4) Υδρόλυση με οργανικούς διαλύτες. Σε αυτή τη μέθοδο χρησιμοποιούνται οργανικοί διαλύτες ή υδατικά μίγματα οργανικών διαλυτών με ανόργανους οξικούς καταλύτες (ΗCl ή Η2SO4) ώστε να διασπάσουν τους εσωτερικούς δεσμούς της λιγνίνης με τις ημικυτταρίνες. Οι διαλύτες που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι η αιθανόλη, η μεθανόλη, η ακετόνη, η αιθυλενογλυκόλη, τριαιθυλενογλυκόλη και η τετραϋδροφουρφουράλη. Αντί των ανόργανων οξέων μπορούν να χρησιμοποιηθούν και οργανικά όπως το οξαλικό, το ακετυλοσαλικυλικό, και το σαλικυλικό οξύ (Li et al., 2010). (δ) Βιολογική Προεπεξεργασία. Η βιολογική προεπεξεργασία χρησιμοποιεί διαφόρων τύπων μύκητες που είναι φιλικοί προς το περιβάλλον. Δε καταναλώνει μεγάλα ποσά ενέργειας για την απομάκρυνση της λιγνίνης όπως οι φυσικές, φυσικοχημικές και οι χημικές μέθοδοι. Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται κατά κύριο λόγο είναι οι μύκητες λευκής και μαλακής σήψης που στοχεύουν στην κυτταρίνη και τη λιγνίνη καθώς και οι καφέ σήψης -103-

124 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία μύκητες που στοχεύουν κυρίως στην κυτταρίνη. Η βιολογική προεπεξεργασία αποτελεί σημαντικό πεδίο έρευνας. Συγκεκριμένα, μελετάται ο συνδυασμός της βιολογικής προεπεξεργασίας με άλλες μεθόδους προκατεργασίας όπως χημική και αλκαλική υδρόλυση. Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι ο χρόνος που απαιτείται για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών καθώς και απώλεια ποσοστού της κυτταρίνης την οποία χρησιμοποιεί ως πηγή άνθρακα ο μικροοργανισμός. (ε) Ηλεκτρική Προεπεξεργασία: Προεπεξεργασία με παλμικό ηλεκτρικό πεδίο. Η προκατεργασία αυτή περιλαμβάνει την εφαρμογή μίας σύντομης έκρηξης υψηλής τάσης σε δείγμα που τοποθετείται ανάμεσα σε δύο ηλεκτρόδια. Το ηλεκτρικό αυτό πεδίο επηρεάζει τη δομή των φυτικών ιστών, αυξάνοντας τη διαπερατότητα της μάζας. Στον Πίνακα 3.1 απεικονίζεται μία συγκεντρωτική σύγκριση των μεθόδων προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Από την αξιολόγηση των υπαρχόντων τεχνολογιών προεπεξεργασίας γίνεται φανερό ότι η προεπεξεργασία με αραιό οξύ συμβάλλει στην υψηλή διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών των διαφόρων τύπων λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Επίσης η όξινη προεπεξεργασία με ήπιες συνθήκες έχει τους λιγότερους παρεμποδιστικούς παράγοντες για τη ζύμωση και αυξάνει σημαντικά την περαιτέρω υδρόλυση της κυτταρίνης

125 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Πίνακας 3.1. Διαφορετικές μέθοδοι προεπεξεργασίας λιγνοκυτταρινικής βιομάζας συγκρινόμενοι ως προς τα πλεονεκτήματα και τους περιορισμούς τους. Μέθοδος Προεπεξεργασίας Πλεονεκτήματα Περιορισμοί Μηχανική κονιορτοποίηση Εκτόνωση με ατμό Αποΐνωση με αμμωνία (AFEX) Εκτόνωση με CO2 Οζονόλυση Όξινη υδρόλυση με συμπυκνωμένο οξύ Όξινη υδρόλυση με αραιό οξύ Μειώνει την κρυσταλλικότητα της κυτταρίνης. Προκαλεί την αποικοδόμηση της ημικυτταρίνης και τον μετασχηματισμό της λιγνίνης, οικονομικά αποδοτικό. Αυξάνει τη δραστική επιφάνεια, απομακρύνει ως ένα βαθμό τη λιγνίνη και τις ημικυτταρίνες, δεν παράγει παρεμποδιστικές ενώσεις. Αυξάνει τη δραστική επιφάνεια, οικονομικά αποδοτικό, δεν παράγει παρεμποδιστικές ενώσεις. Μειώνει το περιεχόμενο σε λιγνίνη, δεν παράγει τοξικά υπολείμματα. Υδρολύει την ημικυτταρίνη σε μονομερή σάκχαρα, αλλάζει τη δομή της λιγνίνης. Υψηλός βαθμός διαλυτοποίησης της ημικυτταρίνης σε μονομερή σάκχαρα, αλλάζει τη δομή της λιγνίνης. Η κατανάλωση ενέργειας είναι συνήθως υψηλότερη από την ενέργεια που θα παραχθεί από την βιομάζα. Καταστροφή ενός τμήματος των ημικυτταρινών, ατελές σπάσιμο των δεσμών της λιγνίνης με το πλέγμα των υδρογονανθράκων, παραγωγή παρεμποδιστικών ενώσεων. Δεν είναι αποτελεσματική μέθοδος για τη βιομάζα με υψηλή περιεκτικότητα λιγνίνης. Δεν τροποποιεί τη λιγνίνη και την ημικυτταρίνη. Απαιτείται μεγάλη ποσότητα όζοντος, δαπανηρή. Δαπανηρή, διάβρωση εξοπλισμού, σχηματισμός τοξικών ουσιών. Παραγωγή υπολείμματος γύψου κατά την ουδετεροποίηση του διαλύματος

126 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Μέθοδος Προεπεξεργασίας Πλεονεκτήματα Περιορισμοί Αλκαλική υδρόλυση Υδρόλυση με οργανικούς διαλύτες Παλμικό ηλεκτρικό πεδίο Βιολογική προεπεξεργασία Απομακρύνει τις ημικυτταρίνες και τη λιγνίνη, αυξάνει την δραστική επιφάνεια. Υδρολύει τη λιγνίνη και τις ημικυτταρίνες. Ήπιες συνθήκες, διασπά τα κύτταρα των φυτών, απλός εξοπλισμός. Αποικοδομεί τις ημικυτταρίνες και τη λιγνίνη, χαμηλές ενεργειακές απαιτήσεις. Μεγάλος χρόνος υδρόλυσης, σχηματισμός αλάτων, τα οποία ενσωματώνονται στη βιομάζα. Οι διαλύτες στραγγίζονται από τον αντιδραστήρα, εξατμίζονται, συμπυκνώνονται και ανακυκλώνονται, υψηλό κόστος. Απαραίτητη περαιτέρω έρευνα. Χαμηλός ρυθμός υδρόλυσης

127 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Η αραιή όξινη υδρόλυση παράγει σάκχαρα τα οποία είναι ζυμώσιμα (κυρίως ξυλόζη) από μικροοργανισμούς που καταναλώνουν πεντόζες ή από μηχανικά τροποποιημένες ζύμες προς παραγωγή βιοαιθανόλης και βιοχημικών υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η απόδοση του σταδίου αυτού σε ξυλόζη και μετατροπή ημικυτταρινών είναι υψηλή. Επιπρόσθετα, η κυτταρίνη που προκύπτει ως στερεό υπόλειμμα από την αραιή όξινη υδρόλυση είναι διαμορφωμένη κατάλληλα ώστε αποδίδει στη συνέχεια υψηλές αποδόσεις σε γλυκόζη κατά την ενζυμική υδρόλυση. Αναφορικά με την κρυσταλλικότητα και το βαθμό πολυμερισμού της βιομάζας, τα δομικά χαρακτηριστικά της αναδιαμορφώνονται ώστε να παραμένει περισσότερη διαθέσιμη επιφάνεια για την προσρόφηση των κυτταρινασών στην επιφάνεια της κυτταρίνης. Η λιγνίνη από την άλλη δεν απομακρύνεται στο διαλυτοποιημένο διάλυμα σακχάρων αλλά παραμένει σε χαμηλό ποσοστό στη στερεή κυτταρίνη. Για την αντιμετώπιση του εμποδίου της λιγνίνης γίνεται χρήση πρωτεϊνών ή επιφανειοδραστικών παράλληλα με τις κυτταρινάσες που στόχο έχουν την προσρόφηση της λιγνίνης μέσω των υδροφοβικών τους δεσμών (Zhang et al., 2011). Οι παρεμποδιστικές ενώσεις που μπορεί να δημιουργηθούν από το χειρισμό της βιομάζας με αραιό θειικό οξύ απομακρύνονται με πλύσιμο με νερό ή ουδετεροποίηση με χαμηλές ποσότητες βάσεων. Περαιτέρω, η συγκεκριμένη μέθοδος απαιτεί μέγεθος σωματιδίων για τη στερεή βιομάζα που επιτυγχάνεται με χαμηλό ενεργειακό κόστος μηχανικής επεξεργασίας. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η αραιή όξινη υδρόλυση μεταφέρει στο στερεό υπόλειμμα μόνο την κυτταρίνη οπότε υπάρχει απαίτηση μόνο ενζύμων που υδρολύουν την κυτταρίνη και όχι ξυλανασών. Τέλος, οι συνθήκες της αραιής όξινης υδρόλυσης είναι ήπιες, δε προκαλούν διάβρωση του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται και δεν καταναλώνονται μεγάλες ποσότητες ενέργειας. Συνεπώς, η μέθοδος αυτή αποτελεί μία εφαρμόσιμη και οικονομικά αποδοτική μέθοδο για την προεπεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας και κυρίως αγρωστωδών φυτών με χαμηλό περιεχόμενο λιγνίνης

128 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία 3.2 Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Προεπεξεργασίας Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi Η διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών και η αναδιάταξη της δομής της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας είναι ο στόχος του σταδίου της προεπεξεργασίας. Η μέθοδος προεπεξεργασίας που εφαρμόστηκε με βάση προκαταρκτικά πειράματα είναι η μέθοδος του αραιού θειικού οξέος (Παππάς, 2011). Η αραιή όξινη υδρόλυση για την προεπεξεργασία της φαλαρίδας βελτιστοποιήθηκε στην παρούσα διδακτορική διατριβή με κατάλληλα εργαλεία πειραματικού σχεδιασμού. Ο πειραματικός σχεδιασμός Taguchi επιλέχθηκε για το στάδιο αυτό καθώς με μία σύντομη σειρά πειραμάτων έχει τη δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων για τη σημαντικότητα των ελεγχόμενων μεταβλητών, το ποσοστό επίδρασης τους στο παράγοντα απόκρισης, τη στατιστική ασφάλεια των αποτελεσμάτων και την κανονικότητα της κατανομής. Επίσης ο σχεδιασμός Taguchi δίνει τη δυνατότητα εξαγωγής γραμμικού εμπειρικού μοντέλου που συσχετίζει τις ελεγχόμενες μεταβλητές με τον παράγοντα απόκρισης (Ranjit, 1990). Στον παρόντα πειραματικό σχεδιασμό καταστρώθηκαν 9 πειράματα με στόχο να μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας, της περιεκτικότητας του οξέος και του χρόνου της αντίδρασης στη συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης. Τα συγκεντρωμένα αποτελέσματα του ορθογώνιου σχεδιασμού (L9) απεικονίζονται στον Πίνακα 3.2, όπου για τον κάθε χειρισμό διαφορετικών συνθηκών του πειράματος αντιστοιχεί η συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης, τα συνολικά μονομερή σάκχαρα που προέρχονται από τη διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών και η μετατροπή των ημικυτταρινών. Η μετατροπή των ημικυτταρινών υπολογίζεται σύμφωνα με τα μονομερή σάκχαρα που βρίσκονται διαλυτοποιημένα στο υδρόλυμα της προεπεξεργασίας προς το περιεχόμενο σε ημικυτταρίνες της ξηρής βιομάζας (Εξίσωση 2.2, Παράγραφος )

129 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Πίνακας 3.2. Ορθογώνιος Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi τριών παραγόντων σε τρία επίπεδα με τα πειραματικά αποτελέσματα για τη συγκέντρωση ξυλόζης, τη συγκέντρωση συνολικών σακχάρων και τη μετατροπή των ημικυτταρινών. Χειρισμός Θερμοκρασία ( o C) Περιεκτικότητα Θειικού Οξέος (% w/v) Χρόνος Αντίδρασης (min) Συγκέντρωση Ξυλόζης (g/l) Συγκέντρωση Συνολικών Σακχάρων (g/l) Μετατροπή Ημικυτταρινών (%) ,45 ±0,82 8,53 ±1,46 31,93 ±2, ,5 45 5,40 ±1,22 14,82 ±0,22 55,51 ±2, ,75 ±0,92 20,04 ±0,31 75,04 ±4, ,07 ±1,23 16,6 ±3,21 62,17 ±3, , ,04 ±1,23 18,50 ±1,53 69,27 ±2, ,93 ±0,84 16,61 ±0,10 62,21 ±3, ,18 ±1,56 21,15 ±0 79,21 ±2, , ,38 ±1,07 19,04 ±0,31 71,31 ±1, ,52 ±1,19 21,47 ±1,25 80,41 ±2,

130 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Ποσοστό (%) Υπολείμματα Σχήμα 3.3. Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi της προεπεξεργασίας. H στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του στατιστικού πακέτου Minitab 17. Η διασπορά των υπολειμμάτων της πειραματικής τιμής της απόκρισης σε σχέση με την προσαρμοσμένη τιμή του γραμμικού μοντέλου (πειραματικό σφάλμα) παρουσιάζει συμμετρική κατανομή γύρω από την τιμή μηδέν (Σχήμα 3.3). Ο πληθυσμός παρουσιάζει κανονική κατανομή γεγονός που καθιστά το γραμμικό μοντέλο κατάλληλο σε σχέση με τα πρωτογενή δεδομένα (Κομίλης, 2006). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.2, οι διαφορές στην απόκριση μεταξύ των διαφορετικών χειρισμών είναι σημαντικές. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων επιτρέπει την εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με τη σημαντικότητα της επίδρασης κάθε παράγοντα στην συγκέντρωση της ξυλόζης. Το επιπλέον εργαλείο του ορθογώνιου σχεδιασμού Taguchi είναι η αξιολόγηση των παραμέτρων σε σχέση με τη μεγιστοποίηση της τιμής S/N όπως περιγράφεται στο Παράρτημα Α. Ο λόγος S/N περιλαμβάνει την επίδραση στον παράγοντα απόκρισης των ελεγχόμενων τριών μεταβλητών καθώς και των μη ελεγχόμενων μεταβλητών θορύβου, ώστε η μέγιστη τιμή του λόγου να ελαχιστοποιεί τη μεταβλητότητα που προέρχεται από τις μεταβλητές θορύβου

131 S/N Λόγος Μέση Τιμή Απόκρισης Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Πίνακας 3.3. Κατάταξη των παραμέτρων σύμφωνα με τη μεγιστοποίηση δύο διαφορετικών κριτηρίων, (α) την απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού (συγκέντρωση ξυλόζης), (β) το λόγο Απόκρισης/Θορύβου (S/N). Επίπεδο Θερμοκρασία ( o C) Περιεκτικότητα Θειικού Οξέος (% w/v) Χρόνος Αντίδρασης (min) Κριτήριο 1 11,17 13,62 15, ,76 19,22 18, ,36 20,44 19,05 Δέλτα 11,19 6,82 4,01 Κατάταξη ,305 6,472 9, ,018 9,775 9, ,245 11,322 9,285 Δέλτα 8,94 4,85 0,283 Κατάταξη Οι ελεγχόμενοι παράγοντες κατατάσσονται με την ίδια σειρά σύμφωνα με την επίδραση τους σε δύο διαφορετικά κριτήρια (Πίνακας 3.3). Το πρώτο κριτήριο είναι η μεγιστοποίηση του παράγοντα απόκρισης, της συγκέντρωσης της γλυκόζης. Το δεύτερο κριτήριο είναι η μεγιστοποίηση του λόγου S/N. Η κατάταξη γίνεται με βάση την τιμή Δέλτα που προκύπτει σύμφωνα με τους υπολογισμούς που περιγράφονται στο Παράρτημα Α. Η θερμοκρασία -111-

132 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία είναι ο σημαντικότερος παράγοντας σύμφωνα με την αξιολόγηση του ορθογώνιου σχεδιασμού Taguchi, ένα αποτέλεσμα που βρίσκεται σε συμφωνία με όσα κατέγραψαν οι (Tan et al., 2011) κατά τη βελτιστοποίηση της προεπεξεργασίας της βιομάζας από φοινικόφυλλο μέσω ενός σχεδιασμού Κεντρικού Σημείου (Central Composite Design). Στην κατάταξη της σημαντικότητας των παραγόντων ακολουθεί η περιεκτικότητα του θειικού οξέος, καθώς το θειικό οξύ διαπερνά αποτελεσματικά τα τοιχώματα του φυτού και αποικοδομεί τους 1-4, γλυκοσιδικούς δεσμούς των αλυσίδων της κυτταρίνης και των ημικυτταρινών. Παρόμοια αποτελέσματα αναφέρθηκαν από τους Sasmal et al. (2011) μέσω ενός πειραματικού σχεδιασμού Taguchi κατά την προεπεξεργασία των ινών του φλοιού του καρυδιού areca. Επιπρόσθετα, οι Ballesteros et al. (2008) ανέφεραν τη σημαντικότητα της επίδρασης της θερμοκρασίας της αντίδρασης και της περιεκτικότητας σε θειικό οξύ μετά από πειραματικό σχεδιασμό κατά την προεπεξεργασία της αγριαγκινάρας. Τη μικρότερη επίδραση στη διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών και την παραγωγή ξυλόζης παρουσίασε ο χρόνος της αντίδρασης. Τα αποτελέσματα της Ανάλυσης Διακύμανσης (ΑNOVA) των τριών παραγόντων σε σχέση με τον παράγοντα συγκέντρωση ξυλόζης απεικονίζονται στο Σχήμα 3.4 όπου το ραβδόγραμμα περιγράφει τη συνεισφορά του κάθε παράγοντα. Η σημαντικότητα των παραμέτρων και ο βαθμός συνεισφοράς της κάθε μίας στην παραγωγή ξυλόζης υπολογίζεται από το άθροισμα των τετραγώνων (SS) που προκύπτουν από την ανάλυση διακύμανσης. Συγκεκριμένα, η θερμοκρασία συνεισφέρει σε ποσοστό 76,88% στη διαμόρφωση του αποτελέσματος. Η περιεκτικότητα οξέος είναι λιγότερο σημαντική από τη θερμοκρασία αλλά παραμένει ένα σημαντικός παράγοντας επίδρασης με ποσοστό συνεισφοράς 23,02% στην παραγωγή της ξυλόζης. Στην τελευταία θέση της κατάταξης των παραμέτρων τοποθετείται ο χρόνος της αντίδρασης, ο οποίος συμμετέχει στο μικρότερο ποσοστό (0,10%) στη διαμόρφωση του τελικού αποτελέσματος της συγκέντρωσης ξυλόζης. Ο πειραματικός σχεδιασμός στοχεύει στη βελτιστοποίηση του σταδίου και παραθέτει με μία σύντομη σειρά πειραμάτων το συνδυασμό συνθηκών που μεγιστοποιούν την παραγωγή της ξυλόζης. Στο Σχήμα 3.5 και 3.6 απεικονίζονται τα Διαγράμματα Κύριων Επιδράσεων του κάθε μελετώμενου παράγοντα στην πειραματική τιμή της συγκέντρωσης της ξυλόζης (Σχήμα 3.5) και της μετατροπής των ημικυτταρινών (Σχήμα 3.6). Η οριζόντια διακεκομμένη ευθεία αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή όλων των αποκρίσεων για το σύνολο των

133 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία πειραμάτων. Η έντονη κλίση της θερμοκρασίας και της περιεκτικότητας του οξέος υποδηλώνουν ότι οι αλλαγές των τιμών αυτών των παραγόντων επηρεάζουν τη συγκέντρωση της ξυλόζης, σε αντίθεση με τις διακυμάνσεις των τιμών του χρόνου της αντίδρασης. Από την άλλη πλευρά, οι μεταβολές και των τριών παραμέτρων επηρεάζουν σημαντικά τη μετατροπή των ημικυτταρινών. Σε κάθε ένα διάγραμμα, διακρίνεται το υψηλότερο επίπεδο από τα τρία που αντιστοιχεί στην υψηλότερη τιμή συγκέντρωσης ξυλόζης και μετατροπής ημικυτταρινών. Σχήμα 3.4. Ανάλυση Διακύμανσης (ANOVA) για τις τρεις ελεγχόμενες παραμέτρους κατά την προεπεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας της φαλαρίδας με αραιό θειικό οξύ. Με τη μέθοδο των Διαγραμμάτων Κύριων Επιδράσεων, προκύπτει ο βέλτιστος συνδυασμός συνθηκών για το στάδιο της προεπεξεργασίας που μεγιστοποιεί τόσο την τιμή απόκρισης όσο και το κριτήριο S/N, δηλαδή μειώνει τις αποκλίσεις που μπορεί να υπεισέλθουν από μη ελεγχόμενες παραμέτρους. Κατά συνέπεια, ο βέλτιστος συνδυασμός παραμέτρων που είναι: θερμοκρασία 130 o C, χρόνος αντίδρασης 45 min και περιεκτικότητα οξέος 2 % w/w, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση, ο οποίος έχει ως αποτέλεσμα την τελική ανάκτηση 15,52 g/l ξυλόζης, 21,47 g/l συγκέντρωσης συνολικών σακχάρων και 80,41% μετατροπή ημικυτταρινών. Τα συγκεκριμένα αποτελέσματα συγκρινόμενα με τις τιμές που -113-

134 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία αναφέρονται στη βιβλιογραφία είναι ικανοποιητικά. Οι Saha et al. (2005) εφάρμοσαν προεπεξεργασία με αραιό θειικό οξύ στους 121 ο C για μία ώρα αντίδρασης και ανέφεραν παραγωγή ξυλόζης 15,8 g/l. Συμπερασματικά, οι υψηλές θερμοκρασίες (120 και 130 o C) και οι υψηλές περιεκτικότητες οξέος (1,5% και 2% w/w) ευνοούν τόσο τη συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης όσο και την ποσοστιαία μετατροπή των ημικυτταρινών. Επιπρόσθετα, σημαντικό αποτέλεσμα έχουν οι αλληλεπιδράσεις των παραγόντων μεταξύ τους. Στο Σχήμα 3.7 απεικονίζεται ένα Διάγραμμα Χωροσταθμικών Καμπυλών για τις δύο σημαντικότερες παραμέτρους του πειράματος. Οι πέντε περιοχές συγκεντρώσεων ξυλόζης υποδεικνύουν ότι στο συνδυασμό υψηλού επιπέδου θερμοκρασίας και περιεκτικότητας οξέος αντιστοιχεί η υψηλότερη συγκέντρωση ξυλόζης. Συγκέντρωση Ξυλόζης (g/l) Συγκέντρωση Ξυλόζης Μέση τιμή Θερμοκρασία ( o C) Περιεκτικότητα Οξέος (% w/w) Χρόνος Αντίδρασης (min) Σχήμα 3.5. Διαγράμματα κύριων επιδράσεων των τριών παραγόντων θερμοκρασία, οξύ, χρόνος αντίδρασης στη συγκέντρωση της ξυλόζης κατά την προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica

135 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Μετατροπή Ημικυτταρινών Μέση τιμή Μετατροπή Ημικυτταρινών (%) Θερμοκρασία ( o C) Περιεκτικότητα Οξέος (% w/w) Χρόνος Αντίδρασης (min) Σχήμα 3.6. Διαγράμματα κύριων επιδράσεων των τριών παραγόντων θερμοκρασία, οξύ, χρόνος αντίδρασης στη μετατροπή των ημικυτταρινών κατά την προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica. Είναι φανερό ότι η συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης είναι εξίσου ικανοποιητική σε χαμηλότερα επίπεδα τιμών των μεταβλητών ελέγχου. Η παρατήρηση αυτή οδηγεί στη μελέτη των παραγόμενων σακχάρων και της μετατροπής των ημικυτταρινών σε χαμηλότερα επίπεδα έντασης των συνθηκών του πειράματος. Σύμφωνα με τα παραπάνω, αποφεύγεται επίσης η παραγωγή παρεμποδιστικών ενώσεων που πιθανώς να εμφανιστούν σε ισχυρότερες συνθήκες αντίδρασης λόγω αποικοδόμησης των μονομερών σακχάρων (Alvira et al. 2010). Επομένως, οι βέλτιστες συνθήκες αραιής όξινης προεπεξεργασίας στοχεύουν στη μεγιστοποίηση της παραγωγής ξυλόζης και μετατροπής των ημικυτταρινών καθώς και στην ελαχιστοποίηση των παρεμποδιστικών ενώσεων. Η στόχευση αυτή είναι απαραίτητα για τα επόμενα στάδια της ενζυμικής υδρόλυσης και της ζύμωσης

136 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Θερμοκρασία Xylose_1 < > Οξύ Σχήμα 3.7. Διάγραμμα Χωροσταθμικών Καμπυλών των συνθηκών της προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica: (α) Περιεκτικότητα Οξέος και (β) Θερμοκρασία για την παραγωγή της συγκέντρωσης Ξυλόζης. Το γραμμικό εμπειρικό μοντέλο που εξάγεται από το στατιστικό πακέτο Minitab 17 παρέχει τη δυνατότητα πρόβλεψης της παραγωγής ξυλόζης στα όρια των τιμών που έχουν τεθεί κατά τον πειραματικό σχεδιασμό για διαφορετικούς συνδυασμούς τιμών των τριών ελεγχόμενων μεταβλητών. Η απόκλιση των πειραματικών δεδομένων από το γραμμικό εμπειρικό μοντέλο του Minitab απεικονίζεται στο Σχήμα 3.8, όπου είναι σαφές ότι η απόκλιση είναι αμελητέα καθώς τα πειραματικά αποτελέσματα δεν αποκλείουν σημαντικά από τη γραμμική συσχέτιση. Το στοιχείο αυτό ενισχύεται από το Συντελεστή Προσδιορισμού R 2, όπου για το γραμμικό μοντέλο συσχέτισης των τριών παραγόντων με τη μέση τιμή των αποκρίσεων της συγκέντρωσης της ξυλόζης είναι 97,1%, μια τιμή που υποδηλώνει υψηλή στατιστική ασφάλεια και απουσία σημαντικών πειραματικών σφαλμάτων (Allen, 2006). Επίσης, οι συντελεστές των παραμέτρων που συμμετέχουν στο εμπειρικό μοντέλο απεικονίζονται ως ραβδόγραμμα (Σχήμα 3.9) όπου η κάθε ράβδος αντιστοιχεί στο συντελεστή της εκάστοτε παραμέτρου στο εκάστοτε επίπεδο. Οι ράβδοι αποκλίνουν από τη σταθερά 9,19 του γραμμικού μοντέλου ανάλογα με το θετικό ή αρνητικό πρόσημο τους. Το γραμμικό μοντέλο που προκύπτει από τον πειραματικό σχεδιασμό δίνει -116-

137 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία τη δυνατότητα πρόβλεψης με ασφάλεια συγκεντρώσεων ξυλόζης σε συνθήκες πειράματος διαφορετικές από τους εννιά πειραματικούς χειρισμούς, κάτι που το καθιστά χρήσιμο για τη μελέτη του σταδίου της αραιής όξινης προεπεξεργασίας. Συγκέντρωση Ξυλόζης Πειραματική (g/l) Πειραματικές Τιμές Τιμές Πρόβλεψης Συγκέντρωση Ξυλόζης Πρόβλεψης (g/l) Σχήμα 3.8. Σχηματική απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού για τη συσχέτιση της συγκέντρωσης της ξυλόζης με τη θερμοκρασία, την περιεκτικότητα οξέος και το χρόνο της αντίδρασης, με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της προεπεξεργασίας

138 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία 4 Συντελεστές Παραμέτρων Σταθερός Συντελεστής Θερμοκρασία Περιεκτικότητα Οξέος Χρόνος Αντίδρασης ( o C) (%) (min) Σχήμα 3.9. Ραβδόγραμμα σχηματικής απεικόνισης των συντελεστών της κάθε παραμέτρου του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού για τη συσχέτιση της συγκέντρωσης της ξυλόζης με τη θερμοκρασία, την περιεκτικότητα οξέος και το χρόνο αντίδρασης της προεπεξεργασίας της βιομάζας του Phalaris aquatica Αξιολόγηση ως προς το Συνδυαστικό Συντελεστή Έντασης Το στάδιο της προεπεξεργασίας εκτός από τη διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών κρίνεται για τη μη αποικοδόμηση σημαντικών δομικών πολυσακχαριτών από την αδιάλυτη κυτταρίνη και για τη μη παρουσία παρεμποδιστικών ενώσεων που θα αναχαιτίσουν στα παρακάτω στάδια τη δράση των μικροοργανισμών και των ενζύμων. Οι έντονες συνθήκες προεπεξεργασίας που προέκυψαν από τη βελτιστοποίηση με βάση τον πειραματικό σχεδιασμό συνοδεύονται σε κάποιες περιπτώσεις από παρεμποδιστικές ενώσεις που προέρχονται από την αποικοδόμηση των μονομερών σακχάρων (Alvira et al. 2010). Η αναγνώριση ηπιότερων συνθηκών προεπεξεργασίας που θα συνδυάζουν την παραγωγή ικανοποιητικής συγκέντρωσης ξυλόζης και την απουσία παρεμποδιστικών ενώσεων για τα ακόλουθα στάδια σακχαροποίησης και ζύμωσης είναι προαπαιτούμενο. Ο συνδυαστικός συντελεστής έντασης της προεπεξεργασίας, ο υπολογισμός του οποίου περιγράφηκε στην -118-

139 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία παράγραφο , χρησιμοποιήθηκε διότι ενσωματώνει το αποτέλεσμα τριών διαφορετικών παραμέτρων της διαδικασίας σε ένα συντελεστή (Lloyd & Wyman 2005). Στο Σχήμα 3.10 απεικονίζεται ο συσχετισμός μεταξύ του συνδυαστικού συντελεστή έντασης (CSF) του σταδίου της προεπεξεργασίας με τη συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης, τη συγκέντρωση των λοιπών σακχάρων (αραβινόζη, γαλακτόζη, μαννόζη και γλυκόζη) και της μετατροπής των ημικυτταρινών. Συγκέντρωση Σακχάρων (g/l) Ξυλόζη Λοιπά Σάκχαρα Μετατροπή Ημικυτταρινών 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 Συνδυαστικός Συντελεστής Έντασης (CSF) Σχήμα Επίδραση του συνδυαστικού συντελεστή έντασης (CSF) στη μετατροπή των ημικυτταρινών, στη συγκέντρωση της παραγόμενης ξυλόζης και των λοιπών σακχάρων κατά την προεπεξεργασία της βιομάζας του Phalaris aquatica Μετατροπή Ημικυτταρινών (%) Όπως γίνεται φανερό από το Σχήμα 3.10, η μετατροπή των ημικυτταρινών και η συγκέντρωση της ξυλόζης ακολουθούν ένα σταθερό αυξητικό ρυθμό σε χαμηλής και ήπιας έντασης συνθήκες. Καθώς οι συνθήκες του σταδίου της προεπεξεργασίας γίνονται εντονότερες (CSF>0.8), η μετατροπή των ημικυτταρινών εισέρχεται σε μία στατική φάση χωρίς να παρουσιάζει σημαντική αύξηση. Από την άλλη μεριά, η συγκέντρωση των λοιπών σακχάρων του υδρολύματος της προεπεξεργασίας, μετά από μία αυξητική πορεία, -119-

140 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία εμφανίζει πτωτική τάση. Η μείωση των μονομερών σακχάρων οφείλεται στην αποικοδόμηση των σακχάρων των ημικυτταρινών προς παρεμποδιστικές χημικές ενώσεις όπως οι φουρφουράλες και οι υδροξυμεθυλοφουρφουράλες (HMF). Στο σημείο αυτό, θα πρέπει να σημειωθεί ότι η αποικοδόμηση ξεκινά από τα εξωτερικά τοιχώματα του φυτού όπου βρίσκονται οι πολυσακχαρίτες της μαννόζης, γαλακτόζης και αραβινόζης. Σύμφωνα με τους Sun et al. (2011), οι πολυσακχαρίτες της αραβινόζης και της μαννόζης (π.χ. γαλακτόμαννόζες και αραβινοξυλάνες) απαντώνται κατά κύριο λόγο στα κυτταρικά τοιχώματα ή στα πρωταρχικά κυτταρικά τοιχώματα και συνδέονται με τις ξυλάνες στην εσωτερική δομή. Ανάλογες αναφορές, για την παρουσία τους στο στάδιο της προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, υπάρχουν για τις γλυκουρονοξυλάνες καθώς και για μικρή ποσότητα από γλυκομαννάνες (Jiang et al., 2014). Οι πολυσακχαρίτες των κυτταρικών και πρωταρχικών τοιχωμάτων εκχυλίζονται ευκολότερα από τους υπόλοιπους λόγω της διάταξης τους στη δομή των ημικυτταρινών. H απελευθέρωση των λοιπών σακχάρων είναι ευθύ αποτέλεσμα του χρόνου υδρόλυσης της βιομάζας από το αραιό θειικό οξύ. Αντίθετα, οι ξυλάνες (πολυσακχαρίτες με δομική μονάδα την ξυλόζη) δημιουργούν εσωτερικούς και ενδιάμεσους ισχυρούς δεσμούς, ώστε η διάρρηξη τους να απαιτεί πιο έντονες συνθήκες σε σχέση με τους δεσμούς που σχηματίζουν οι υπόλοιπες δομικές μονάδες των ημικυτταρινών (Girio et al., 2010). Συνεπώς, η ξυλόζη σε σχέση με τα υπόλοιπα δομικά μονομερή σάκχαρα που απελευθερώνονται κατά την υδρόλυση των ημικυτταρινών απαιτεί περισσότερο χρόνο και εντονότερες συνθήκες γιατί βρίσκεται στο εσωτερικό της δομής των ημικυτταρινικών αλυσίδων σε μεγάλο ποσοστό. Συγκεκριμένα, το ποσοστό της ξυλόζης στη δομή των ημικυτταρινών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας του φυτού P. aquatica είναι σημαντικά υψηλό (περίπου 65%) όπως στα περισσότερα πολυετή αγρωστώδη (Sun et al., 2011). Με βάση τα αποτελέσματα του Πίνακα 3.2 καθώς και στη σχηματική απεικόνιση του Σχήματος 3.10, προκύπτουν οι βέλτιστες συνθήκες για το στάδιο της προεπεξεργασίας του φυτού P. aquatica (θερμοκρασία 110 o C, 2% w/v περιεκτικότητα θειικού οξέος και 60 min χρόνος αντίδρασης). Οι επιλεγόμενες συνθήκες αντιστοιχούν σε τιμή συνδυαστικού συντελεστή έντασης 0,76. Οι ηπιότερες αυτές συνθήκες προεπεξεργασίας εξασφαλίζουν μετατροπή ημικυτταρινών ίση με 75,04% με μικρή αποικοδόμηση των σακχάρων (Jeong & Oh 2011). Η συγκέντρωση της ξυλόζης στο χειρισμό αυτό αντιστοιχεί σε τιμή 10,75 g/l και η συγκέντρωση των συνολικών σακχάρων 20,04 g/l. Η εφαρμογή των συνθηκών αυτών δεν -120-

141 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία απαιτεί εξονυχιστικά στάδια ουδετεροποίησης του υδρολύματος πριν τη ζύμωση των μονομερών της ξυλόζης ή παρουσίας παρεμποδιστικών ενώσεων στο στερεό υπόλειμμα της κυτταρίνης που οδηγείται στην ενζυμική υδρόλυση (Banerji et al. 2013). Η επιλογή των συνθηκών λαμβάνει υπόψη το είδος της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας, καθώς για κάθε είδος προκύπτουν διαφορετικές ανάγκες έντασης των συνθηκών προεπεξεργασίας ώστε να μεγιστοποιήσουν τη διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών χωρίς απώλεια σακχάρων ή παραγωγή παρεμποδιστικών ενώσεων. Οι επιλεγόμενες συνθήκες εφαρμόζονται από δω και στο εξής στα πειράματα της προεπεξεργασίας Αλλαγές στα δομικά χαρακτηριστικά της βιομάζας Η προεπεξεργασία της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας στοχεύει στην αλλαγή της δομής των συστατικών της. Το αποτέλεσμα του χειρισμού της βιομάζας με αραιό θειικό οξύ είναι εμφανές τόσο κατά την υδρόλυση των ημικυτταρινών και την ανάκτηση των μονομερών σακχάρων όσο και στην αλλαγή της κρυσταλλικής δομής της στερεής βιομάζας. Ο βαθμός κρυσταλλικότητας του συνόλου της βιομάζας διαμορφώνεται από τις κρυσταλλικές δομές της κυτταρίνης καθώς και από τις άμορφες περιοχές της κυτταρίνης, των ημικυτταρινών και των υπόλοιπων συστατικών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας (λιγνίνη, πρωτεΐνες, άλλα ανόργανα συστατικά). Η αλλαγή του βαθμού κρυσταλλικότητας αποτελεί μία ένδειξη της αναδιάταξης της βιομάζας κατά το στάδιο της προεπεξεργασίας. Συγκεκριμένα, οι μέθοδοι της προεπεξεργασίας αλλάζουν την κρυσταλλική δομή της βιομάζας, διαφοροποιώντας το λόγο μεταξύ των άμορφων και των κρυσταλλικών περιοχών της πολυπεπτιδικής αλυσίδας (Li et al. 2010) και η αλλαγή του λόγου επιδρά στην αποτελεσματικότητα του ακόλουθου σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης (Zhang & Lynd 2004). Οι διαφορετικοί χειρισμοί του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi μελετήθηκαν για την επίδραση στο βαθμό κρυσταλλικότητας και τα αποτελέσματα περιλαμβάνονται στον Πίνακα 3.4. Σε κάθε περίπτωση συνδυασμού συνθηκών, ο βαθμός κρυσταλλικότητας είναι μεγαλύτερος από τον βαθμό κρυσταλλικότητας της αρχικής βιομάζας. Το φαινόμενο αυτό οφείλεται στην απομάκρυνση των άμορφων περιοχών της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας που αποτελούνται συνήθως από τις ημικυτταρίνες και τη λιγνίνη που εμφανίζουν πιο χαλαρούς δεσμούς (Binod et al., 2012). Συγκεκριμένα, ο βαθμός κρυσταλλικότητας της ακατέργαστης -121-

142 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία βιομάζας υπολογίζεται 49,51 ενώ η προεπεξεργασμένη βιομάζα που αποτελείται κυρίως από κυτταρίνη κυμαίνεται σε εύρος τιμών μεταξύ 57,1 67,47. Η συσχέτιση του βαθμού κρυσταλλικότητας με τον συνδυαστικό συντελεστή έντασης (CSF) επιδεικνύει αυξητική τάση της κρυσταλλικότητας καθώς αυξάνει η ένταση των συνθηκών της προεπεξεργασίας, καθώς ο ρυθμός αποικοδόμησης των άμορφων ημικυτταρινών είναι μεγαλύτερος από την αποικοδόμηση της κρυσταλλικής κυτταρίνης (Σχήμα 3.11). Αυτός είναι ο λόγος που επιλέγεται η μέθοδος αραιής όξινης υδρόλυσης για την προεπεξεργασία του φυτού P. aquatica καθώς επιτυγχάνεται η ανάκτηση των συστατικών των άμορφων ημικυτταρινών. Ενώ, οι έσω- και ενδιάμεσοι δεσμοί υδρογόνου της κυτταρινικής δομής αποτελούν το στόχο της σακχαροποίησης στο επόμενο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. Πίνακας 3.4. Συσχέτιση των τριών μεταβλητών θερμοκρασίας, περιεκτικότητα οξέος και χρόνος αντίδρασης με το βαθμό κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας της Χειρισμός Θερμοκρασία ( o C) φαλαρίδας με αραιό θειικό οξύ. Θειικό Οξύ (% w/v) Χρόνος Αντίδρασης (min) CSF Βαθμός Κρυσταλλικότητας (%) ,13 57,10 ±2, ,5 45 0,56 59,98 ±1, ,76 61,20 ±3, ,62 60,44 ±1, ,5 60 0,89 63,41 ±4, ,67 62,00 ±3, ,99 66,70 ±2, ,5 30 0,87 66,67 ±3, ,07 67,47 ±4,

143 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Βαθμός Κρυσταλλικότητας (%) ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 Συνδυαστικός Συντελεστής Έντασης (CSF) Σχήμα Επίδραση του συνδυαστικού συντελεστή έντασης (CSF) στο βαθμό κρυσταλλικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας του φυτού Phalaris aquatica. Οι βέλτιστες συνθήκες που επιλέχθηκαν (110 o C θερμοκρασία, 2% w/v περιεκτικότητα θειικού οξέος και 60 min χρόνος αντίδρασης), σύμφωνα με τον συνδυασμό που αποδίδει ικανοποιητικά υψηλό ποσοστό μετατροπής των ημικυτταρινών (75,04%), αντιστοιχούν σε βαθμό κρυσταλλικότητας 61,2% (Πίνακας 3.4), που είναι χαμηλότερο από άλλες εντονότερες συνθήκες που έχουν απομακρύνει μεν τα άμορφα τμήματα της βιομάζας, δεν έχουν αλλάξει δε την αναλογία άμορφων κρυσταλλικών περιοχών στην κυτταρίνη. Η επιλογή του συνδυασμού ενισχύεται με τον σχετικά χαμηλό βαθμό κρυσταλλικότητας καθώς διευκολύνει την προσβασιμότητα των ενζύμων στην επιφάνεια του υποστρώματος της κυτταρίνης κατά την ενζυμική υδρόλυση (Kumar P. et al., 2009). H διαφορά της κρυσταλλικότητας του βέλτιστου συνδυασμού ανάμεσα σε άλλους χειρισμούς που παρουσίασαν παρόμοια αποτελέσματα μετατροπής ημικυτταρινών σε υψηλά επίπεδα διακρίνεται στο Σχήμα 3.12 όπου συσχετίζεται η μετατροπή ημικυτταρινών του κάθε χειρισμού με τον αντίστοιχο βαθμό κρυσταλλικότητας

144 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Σχήμα Βαθμός κρυσταλλικότητας(%) σε σχέση με τα ποσοστά μετατροπής των ημικυτταρινών κατά τον πειραματικού σχεδιασμό Taguchi για την προεπεξεργασία της βιομάζας του Phalaris aquatica. Οι μελετώμενοι παράμετροι του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi αναλύθηκαν για την απόκριση τους στο βαθμό κρυσταλλικότητας όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.4. Κατά την ανάλυση με το στατιστικό πακέτο Minitab 17 πραγματοποιήθηκε συσχέτιση των τριών μεταβλητών σε γραμμικό εμπειρικό μοντέλο με υψηλό συντελεστή προσδιορισμού (R 2 = 99.7%). Ο παράγοντας p κατά την ανάλυση διακύμανσης (ΑNOVA) του γραμμικού εμπειρικού μοντέλου είναι και για τις τρεις παραμέτρους κάτω από 0,05 που υποδηλώνει τη στατιστική ασφάλεια των αποτελεσμάτων και πόσο σημαντικοί είναι και οι τρεις παράγοντες στη διαμόρφωση του εμπειρικού μοντέλου. Ο παράγοντας p για τη θερμοκρασία, την περιεκτικότητα οξέος και το χρόνο της αντίδρασης είναι ίσος με 0,001, 0,010 και 0,015, αντίστοιχα

145 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Πειραματικές Τιμές Τιμές Προβλέψης 66 Πειραματικός Βαθμός Κρυσταλλικότητας (%) Βαθμός Κρυσταλλικότητας Πρόβλεψης(%) Σχήμα Σχηματική Απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού για τη συσχέτιση του βαθμού κρυσταλλικότητας με τη θερμοκρασία, την περιεκτικότητα οξέος και το χρόνο της αντίδρασης, με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της προεπεξεργασίας. Η θερμοκρασία αποτελεί το σημαντικότερο παράγοντα επίδρασης στο βαθμό κρυσταλλικότητας με συνεισφορά 86,59% στο γραμμικό μοντέλο σύμφωνα με την αξιολόγηση του ορθογώνιου σχεδιασμού Taguchi. Στην κατάταξη της σημαντικότητας των παραγόντων ακολουθεί η περιεκτικότητα του θειικού οξέος, με συνεισφορά στο γραμμικό μοντέλο 8,28%. Τη μικρότερη επίδραση στην κρυσταλλικότητα της βιομάζας παρουσίασε ο χρόνος της αντίδρασης (συνεισφορά: 5,13%). Η απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου που προκύπτει από το σχεδιασμό και προβλέπει το βαθμό κρυσταλλικότητας για διάφορους πειραματικούς χειρισμούς μέσα στο εύρος των πειραματικών τιμών απεικονίζεται στο Σχήμα 3.13 με σύγκριση των πειραματικών αποτελεσμάτων. Ακολουθούν φωτογραφίες του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (SEM) που υποδεικνύουν οπτικά τις αλλαγές που επήλθαν στη δομή της βιομάζας κατά το στάδιο της προεπεξεργασίας (Σχήμα 3.14) σε μεγέθυνση x200 και x600 φορές. Οι φωτογραφίες (α) και (β) ελήφθησαν πριν το χειρισμό της βιομάζας με αραιό θειικό οξύ. Η οργάνωση της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας σε -125-

146 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία ράβδους διαταράσσεται κατά την προεπεξεργασία καθώς τα τοιχώματα διαρρηγνύονται και η ειδική επιφάνεια αυξάνεται. Οι φωτογραφίες επιτρέπουν την οπτική απεικόνιση του φαινομένου της αλλαγής της δομής της βιομάζας μέσω της αραιή όξινης υδρόλυσης. Συγκεκριμένα, οι ίνες της κυτταρίνης έχουν επηρεαστεί φανερά από τη δράση του θειικού οξέος. Οι σταγόνες στην επιφάνεια του υλικού θα μπορούσαν να αποδοθούν σε παρουσία λιγνίνης σύμφωνα με τους R. Kumar et al. (2009). Επίσης, οι κοιλότητες που εμφανίζονται αποδίδονται στην απομάκρυνση των ημικυτταρινών. Σημαντικό αποτέλεσμα της αραιής όξινης υδρόλυσης είναι η μείωση του μήκους των ινών που παραμένουν στην παραλλαγμένη πλέον μορφή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας. Περισσότερες φωτογραφίες Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης περιλαμβάνονται στο Παράρτημα Δ. Σχήμα Εικόνες Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης (SEM) με εμφανείς τις αλλαγές στη δομή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας

147 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Βιβλιογραφία 3 ου Κεφαλαίου Agbor, V.B., Cicek, N., Sparling, R., Berlin, A., Levin, D.B, Biomass pretreatment: fundamentals toward application. Biotechnology advances, 29(6), pp Alvira, P., Tomás-Pejó, E., Ballesteros, M., Negro, M.J., Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource technology, 101(13), pp Ballesteros, I. Ballesteros, M., Manzanares, P., Negro, M.J., Oliva, J.M., Sáez, F., Dilute sulfuric acid pretreatment of cardoon for ethanol production. Biochemical Engineering Journal, 42(1), pp Bals, B., Rogers, C., Jin, M., Balan, V., Dale, B., Evaluation of ammonia fibre expansion (AFEX) pretreatment for enzymatic hydrolysis of switchgrass harvested in different seasons and locations. Biotechnology for biofuels, 3(1), p.1. Banerji, A., Balakrishnan, M. & Kishore, V.V.N., Low severity dilute-acid hydrolysis of sweet sorghum bagasse. Applied Energy, 104, pp Burner, D.M., Tew, T.L., Harvey, J.J., Belesky, D.P., Dry matter partitioning and quality of Miscanthus, Panicum, and Saccharum genotypes in Arkansas, USA. Biomass and Bioenergy, 33(4), pp Da Costa Sousa, L., Chundawat, S.P.S., Balan, V., Dale, B.E., Cradle-to-grave assessment of existing lignocellulose pretreatment technologies. Current opinion in biotechnology, 20(3), pp Doherty, W.O.S., Mousavioun, P. & Fellows, C.M., Value-adding to cellulosic ethanol: Lignin polymers. Industrial Crops and Products, 33(2), pp Ewanick, S. & Bura, R., The effect of biomass moisture content on bioethanol yields from steam pretreated switchgrass and sugarcane bagasse. Bioresource Technology, 102(3), pp

148 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Foyle, T., Jennings, L. & Mulcahy, P., Compositional analysis of lignocellulosic materials: evaluation of methods used for sugar analysis of waste paper and straw. Bioresource technology, 98(16), pp Jeong, T.S. & Oh, K.K., Optimization of fermentable sugar production from rape straw through hydrothermal acid pretreatment. Bioresource technology, 102(19), pp Jiang, H., Chen, Q., Ge, J., Zhang, Y., Efficient extraction and characterization of polymeric hemicelluloses from hybrid poplar. Carbohydrate polymers, 101, pp Kumar, P., Barrett, D.M., Delwiche, M.J., Stroeve, P., Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production. Industrial & Engineering Chemistry Research, 48(8), pp Kumar, R., Mago, G., Balan, V., Wyman, C.E., Physical and chemical characterizations of corn stover and poplar solids resulting from leading pretreatment technologies. Bioresource technology, 100(17), pp Li, C., Knierim, B., Manisseri, C., Arora, R., Scheller, H.V., Auer, M., Vogel, K.P., Simmons, B., Singh, S., Comparison of dilute acid and ionic liquid pretreatment of switchgrass: Biomass recalcitrance, delignification and enzymatic saccharification. Bioresource technology, 101(13), pp Lloyd, T. & Wyman, C.E., Combined sugar yields for dilute sulfuric acid pretreatment of corn stover followed by enzymatic hydrolysis of the remaining solids. Bioresource technology, 96(18), pp Mosier, N., Wyman, C., Dale, B., Elander, R., Lee, Y.Y., Holtzapple, M., Ladisch, M., Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource technology, 96(6), pp Rabelo, S.C., Maciel Filho, R., Costa, A.C., Lime pretreatment of sugarcane bagasse for bioethanol production. Applied biochemistry and biotechnology, 153(1-3), pp

149 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Saha, B.C., Iten, L.B., Cotta, M., Wu, Y.V., Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol. Process Biochemistry, 40(12), pp Sasmal, S., Goud, V.V., Mohanty, K., Optimisation of the acid catalysed pretreatment of areca nut husk fibre using the Taguchi design method. Biosystems Engineering, 110(4), pp Sun, X.F., Jing, Z., Fowler, P., Wu, Y., Rajaratnam, M., Structural characterization and isolation of lignin and hemicelluloses from barley straw. Industrial Crops and Products, 33(3), pp Sun, Y. & Cheng, J., Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource Technology, 83(1), pp Tan, H.T., Lee, K.T., Mohamed, A.R., Pretreatment of lignocellulosic palm biomass using a solvent-ionic liquid [BMIM]Cl for glucose recovery: An optimisation study using response surface methodology. Carbohydrate Polymers, 83(4), pp Vidal, B.C., Dien, B.S., Ting, K.C., Singh, V., Influence of feedstock particle size on lignocellulose conversion-a review. Applied biochemistry and biotechnology, 164(8), pp Zhang, Y., Zhang, Y., Tang, L., Effect of PEG4000 on cellulase catalysis in the lignocellulose saccharification processes. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 86(1), pp Zhang, Y.-H.P. & Lynd, L.R., Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose: noncomplexed cellulase systems. Biotechnology and bioengineering, 88(7), pp Kομίλης, Δ.Π., Πειραματικός Σχεδιασμός και Στατιστική Ανάλυση. Δημοκρίτειο πανεπιστήμιο Θράκης, Πολυτεχνική Σχολή, Τμήμα Μηχανικών Περιβάλλοντος, Ξάνθη

150 Κεφάλαιο 3 Προεπεξεργασία Παππάς, Ι.Α., Αξιολόγηση παραγωγικού δυναμικού λιβαδικών φυτών και αξιοποίησή τους για παραγωγή βιοενέργειας. Διδακτορική Διατριβή. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ). Σχολή Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος. DOI /eadd/

151 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση 4.1 Εισαγωγή στην Ενζυμική Υδρόλυση Βιο-καταλύτες Η μετατροπή των κυτταρινικών αλυσίδων σε μονομερή μόρια της γλυκόζης με τη χρήση ενζύμων είναι μια πολύ ελπιδοφόρα εφαρμογή σύμφωνη με τις σύγχρονες επιταγές της πράσινης ανάπτυξης και της αειφορίας. Τα ένζυμα πραγματοποιούν μια πληθώρα χημικών αντιδράσεων με μεγάλη σημασία για την έμβια ύλη. Οι εφαρμογές τους στη βιομηχανία ως εναλλακτικοί καταλύτες είναι πολλές και κυρίως συναντώνται στη φαρμακευτική βιομηχανία, στην παραγωγή γεωργικών φαρμάκων, λιπασμάτων και εντομοκτόνων. Η σύγκριση με τους χημικούς καταλύτες κλείνει υπέρ των ενζύμων χάρη στην εκλεκτικότητα της δράσης τους, την υψηλή αποτελεσματικότητα, τις ήπιες συνθήκες των αντιδράσεων τους και τη φιλικότητα προς το περιβάλλον. Σύμφωνα με τα παραπάνω, οι προσπάθειες που γίνονται ώστε οι βιοκαταλύτες να ανταποκρίνονται στις προσταγές της αγοράς και των κυβερνητικών οδηγιών είναι μεγάλες (Yang & Ding, 2014) Κατανόηση του φαινομένου της ενζυμικής υδρόλυσης Η δράση του μίγματος των ενζύμων που παρουσιάζεται στο Σχήμα 4.1 είναι πολλαπλή σε διαφορετικά σημεία της κυτταρινικής αλυσίδας. Οι ενδογλυκανάσες, που αποτελούν περίπου το 15% του εκχυλισμένου πρωτεϊνικού μίγματος (Merino & Cherry, 2007), δρουν -131-

152 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση στο εσωτερικό της κυτταρινικής αλυσίδας σπάζοντας το μακρομόριο σε μικρότερα κομμάτια. Η δράση τους στοχεύει στη λύση των β-1,4-γλυκοσιδικών δεσμών, δημιουργώντας έτσι αναγωγικά και μη-αναγωγικά άκρα όπου στοχεύουν στη συνέχεια οι κελλοβιοϋδρολάσες (CBH I, CBH II). Οι εξωγλυκανάσες (κελλοβιουδρολάσες) συνδέονται στην εξωτερική πλευρά της πολυμερικής αλυσίδας στα αναγωγικά (CBH I) και μη-αναγωγικά (CBH II) άκρα της σχηματίζοντας ένα δισακχαρίτη της γλυκόζης την κελλοβιόζη. Τέλος, η β- γλυκοσιδάση δρα διαλυτοποιώντας το δισακχαρίτη κελλοβιόζη και παράγοντας το τελικό μονομερές της γλυκόζης. Σχήμα 4.1. Σχηματική απεικόνιση της ενζυμικής δράσης κατά την προσρόφηση των ενζύμων σε έξι διαφορετικά σημεία πάνω στο αδιάλυτο υπόστρωμα της κυτταρίνης κατά την ενζυμική υδρόλυση. Η παρακολούθηση της πορείας που ακολουθεί ένα ένζυμο κατά την προσρόφηση του στην επιφάνεια του υποστρώματος βοηθά στην κατανόηση του φαινομένου της ενζυμικής υδρόλυσης και των εμποδίων που εμφανίζονται. Το ένζυμο διαχέεται στο ενζυμικό υδρόλυμα και προσροφάται στη διεπιφάνεια υγρού υποστρώματος. Σχηματίζεται το -132-

153 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση ενεργό σύμπλοκο ενζύμου υποστρώματος το οποίο ορίζει την έναρξη της αντίδρασης που καταλύεται από το ένζυμο. Ακολουθεί η εκρόφηση του ενζύμου και η επαναπροσρόφηση του σε άλλο σημείο του υποστρώματος. Η πορεία της ενζυμικής αντίδρασης μπορεί να αντιμετωπίσει διαφορετικά εμπόδια όπως είναι ο μη σχηματισμός ενεργού συμπλόκου ενζύμου υποστρώματος. Το ένζυμο δηλαδή, καθώς παρουσιάζει την εκλεκτικότητα να προσροφάται σε διεπιφάνειες υγρού στερεού, όταν βρίσκεται σε διαθέσιμες επιφάνειες, μη αποτελεσματικές για την υδρόλυση των δεσμών, μπορεί να δεσμευτεί με αποτέλεσμα την απενεργοποίηση του. Η απώλεια της δραστικότητας του ενζύμου μπορεί να επέλθει σε τυχαία χρονική στιγμή κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Επίσης, η απενεργοποίηση του ενζύμου μπορεί να συμβεί λόγω κατάληψης της ενεργού περιοχής του από κάποια παρεμποδιστική ένωση όπως είναι τα προϊόντα της αντίδρασης (Σχήμα 4.2). Σχήμα 4.2. Σχηματική απεικόνιση της προσρόφησης του ενζύμου στο υπόστρωμα παρουσία παρεμποδιστικών ενώσεων. Η αποτελεσματικότητα του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης καθορίζεται από διαφορετικούς παράγοντες όπως αυτοί αναλύονται παρακάτω: Τα φυσικά χαρακτηριστικά του υποστρώματος, δηλαδή, ο βαθμός κρυσταλλικότητας της βιομάζας, ο βαθμός πολυμερισμού, η κατανομή του μεγέθους των σωματιδίων, το περιεχόμενο της βιομάζας σε λιγνίνη, ο τύπος της λιγνίνης και η κατανομή της, καθώς και οι αδιάλυτες ημικυτταρίνες

154 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του υποστρώματος όπως είναι το ph, η θερμοκρασία, η παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος, η ταχύτητα ανάδευσης και ο χρόνος της ενζυμικής αντίδρασης. Η προέλευση των ενζύμων καθώς και η συνέργεια μεταξύ τους εφόσον πρόκειται για μίγμα. Τα χαρακτηριστικά της μεταφοράς μάζας που καθορίζουν την προσρόφηση των ενζύμων στην επιφάνεια της κυτταρίνης και τη διάχυση τους στους πόρους. Οι περιοριστικοί παράγοντες που μπορεί να επέλθουν κατά την ενζυμική υδρόλυση είναι, κατ αρχάς, η παρεμπόδιση των ενζύμων από τα προϊόντα της υδρόλυσης της κυτταρίνης, συγκεκριμένα τη γλυκόζη και την κελλοβιόζη. Επιπρόσθετα, η διφασική κυτταρινική αλυσίδα που αποτελείται από κρυσταλλικές και άμορφες περιοχές μπορεί να μειώσει την αποτελεσματικότητα των ενζύμων σε περίπτωση που η αναλογία των κρυσταλλικών περιοχών υπερισχύει των άμορφων. Και αυτό γιατί οι άμορφες περιοχές αποτελούν καταλληλότερο υπόστρωμα για την πρόσδεση των ενζύμων στην επιφάνεια τους σε σχέση με τις κρυσταλλικές περιοχές που έχουν ισχυρότερους δεσμούς τους οποίους υδρολύουν τα ένζυμα δυσκολότερα. Επίσης, ο συνωστισμός είτε των ενζύμων του ενζυμικού μίγματος είτε του υποστρώματος πιθανόν να μειώσουν την απόδοση της ενζυμικής υδρόλυσης, από το οποίο προκύπτει ότι η αναλογία του μίγματος των ενζύμων σε σχέση με την ποσότητα του υποστρώματος είναι σημαντική. Ακόμα, η διατμητική τάση που επιφέρει η ταχύτητα ανάδευσης της ενζυμικής υδρόλυσης είναι δυνατόν να προκαλέσει μείωση της δραστικότητας των ενζύμων, σε περίπτωση έντονης ανάδευσης (Hanley, 2008). Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η συνέργια των ενζύμων είναι σημαντική διότι η δράση του κάθε ενζύμου είναι εξειδικευμένη αλλά και αλληλένδετη με τη δράση των υπολοίπων ενζύμων του μίγματος. Οπότε, η μείωση της συνέργιας αυτής αποτελεί περιοριστικό παράγοντα για την αποτελεσματικότητα του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης. Τέλος η παρουσία της λιγνίνης έχει παρατηρηθεί ότι παρεμποδίζει τη δράση των ενζύμων (Haven & Jørgensen, 2013), γι αυτό και αναφέρεται ως το εμπόδιο της λιγνίνης. Η λιγνίνη επικάθεται στην επιφάνεια της αδιάλυτης κυτταρίνης μειώνοντας την προσβάσιμη επιφάνεια της, καθώς επίσης σχηματίζει μη ενεργά σύμπλοκα με τα ένζυμα απενεργοποιώντας τα λόγω της υδρόφοβης φύσης της (Yang et al., 2009)

155 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Τα επιφανειοδραστικά στην ενζυμική υδρόλυση Η αντιμετώπιση του εμποδίου της λιγνίνης έχει γίνει αντικείμενο μελέτης πολλών ερευνητών. Η προσθήκη διαφόρων συστατικών αναφέρεται ότι αυξάνει την αποτελεσματική πρόσδεση των ενζύμων καθώς αντιμετωπίζει τη μη αποτελεσματική προσρόφηση τους στην επιφάνεια της λιγνίνης (Jorgensen, 2007). Τα υλικά που χρησιμοποιούνται συχνά είναι διάφορα επιφανειοδραστικά και πρωτεΐνες με παρόμοιες ιδιότητες ώστε να αναχαιτίσουν την παρεμπόδιση των ενζύμων από τη λιγνίνη (Sipos et al., 2011). Η προσθήκη μη ιοντικών επιφανειοδραστικών ή πολυμερών μειώνει τους δεσμούς των ενεργών περιοχών των ενζύμων με τη λιγνίνη επιτυγχάνοντας μεγαλύτερους ρυθμούς υδρόλυσης σε μικρότερες δόσεις ενζύμων. Εχει αναφερθεί ότι τα επιφανειοδραστικά εμποδίζουν την απενεργοποίηση των ενζύμων σε διεπιφάνειες διαφορετικές από αυτές διαλύματος - υποστρώματος. Συγκεκριμένα, τα επιφανειοδραστικά πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG) σχηματίζουν υδρόφοβους δεσμούς και δεσμούς υδρογόνου με τη λιγνίνη, επιτρέποντας τη διάχυση των ενζύμων σε μεγαλύτερα τμήματα της κυτταρίνης. Οι αναφορές αυτές έχουν γίνει για στερεή προεπεξεργασμένη κυτταρίνη που περιέχει ποσοστό λιγνίνης μεγαλύτερο από 15%. Οι Eriksson et al. (2002) ανέφεραν ότι η χρήση επιφανειοδραστικού κατά την υδρόλυση προεπεξεργασμένου ξύλου ελάτου υπ ατμόν επέφερε αύξηση της μετατροπής της κυτταρίνης. Επίσης, οι Tu et al., (2007) ανέφεραν τη βελτίωση της απόδοσης σε γλυκόζη κατά την ενζυμική υδρόλυση προεπεξεργασμένης βιομάζας πεύκου με προσθήκη επιφανειοδραστικών. Η επίδραση των επιφανειοδραστικών στη δράση των κυτταρινασών σε υδρόλυση καθαρής κυτταρίνης δε σημειώθηκε. Τα επιφανειοδραστικά που χρησιμοποιούνται κατα κύριο λόγο είναι το PEG 4000 (polyethyleneglycol), το Tween 40 και 80 και η πρωτεΐνη BSA (bovine serum alboumin) τα οποία έχουν εκλεκτικότητα για τη λιγνίνη αλλά όχι για την κυτταρίνη (Zheng et al., 2009). Οι Kristensen et al. (2007) μελέτησαν την επίδραση διαφορετικών επιφανειοδραστικών ουσιών στην ενζυμική υδρόλυση της επεξεργασμένης βιομάζας με διαφορετικές μεθόδους προεπεξεργασίας. Η σημαντικότερη αύξηση της μετατροπής της κυτταρίνης σημειώθηκε σε βιομάζα που προήλθε από την προεπεξεργασία με αραιό θειικό οξύ

156 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Τεχνολογίες για μείωση του κόστους της Ενζυμικής Υδρόλυσης Η ενζυμική υδρόλυση αποτελεί το 40% του συνολικού κόστους της διεργασίας παραγωγής βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Οι προτάσεις για μείωση του κόστους του σταδίου αυτού περιλαμβάνουν την βιοτεχνολογική μετατροπή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας ώστε νά έχει λιγότερες ανάγκες σε καταλυτικά ένζυμα, την καθήλωση των ενζύμων ώστε να είναι δυνατή η ακινητοποίηση τους και η επαναχρησιμοποίηση τους, η διεργασία της ενζυμικής υδρόλυσης σε συνεχή λειτουργία με αντιδραστήρες μεμβρανών που επιτρέπουν την ανακύκλωση των ενζύμων καθώς και η ημι-συνεχής λειτουργία που επιτρέπει την αύξηση της αρχικής βιομάζας και της τελικής γλυκόζης σε μικρότερου όγκου αντιδραστήρες. Τα ένζυμα παραμένουν δραστικά σε ένα ποσοστό μετά το τέλος της υδρόλυσης του στερεού. Η καθήλωση τους επιτρέπει την επαναχρησιμοποίηση τους αλλά οφείλει να ξεπεράσει προβλήματα διάχυσης των ενζύμων στο υδρόλυμα. Οι κυτταρινάσες που στοχέυουν στην προσρόφηση στην επιφάνεια της κυτταρινικής αλυσίδας δεν είναι δυνατό να καθηλωθούν διοτί μειώνεται η δυνατότητα διάχυση τους ώστε να βρουν την προσβάσιμη επιφάνεια για να δημιουργήσουν το ενεργό τους σύμπλοκο, καθώς η διάχυση της κυτταρίνης δεν είναι δυνατή λόγω μεγάλου μοριακού βάρους. Από την άλλη, οι κελλοβιάσες στοχεύουν σε διαλυτοποιημένους δισακχαρίτες οπότε τα φαινόμενα μεταφοράς μάζας δεν εμποδίζουν το ένζυμο παρότι καθηλωμένο να υδρολύσει τους δεσμούς της κελλοβιόζης. Συνήθως στη διεργασία της ενζυμικής υδρόλυσης η καθήλωση πραγματοποιείται στη β-γλυκοσιδάση (κελλοβιάση). Οι Das et al. (2011) αναφέρουν τον εγκλεισμό της κελλοβιάσης σε πορώδες μέσο οξειδίου του πυριτίου με διατήρηση της δραστικότητας του ενζύμου σε δέκα κύκλους αντιδράσεων. Ακολούθως, η συνεχής λειτουργίας της ενζυμικής υδρόλυσης έχει δοκιμαστεί με στόχο τη μείωση του κόστους, σε μονάδα υπερδιήθησης τοποθετημένη σε σειρά με την ενζυμική υδρόλυση. Η μεμβράνη της υπερδιήθησης συγκρατεί τα ένζυμα και στο διαπερατό τμήμα της μεμβράνης περιλαμβάνονται τα προϊόντα (Qi et al., 2011). Η μεμβράνη υπερδιήθησης έχει πορώδες με κατάλληλο μέγεθος πόρων ώστε να είναι περατό για τις μικρού μοριακού βάρους ενώσεις, όπως η γλυκόζη με μοριακό βάρος 180 g/mol, ενώ από την άλλη, συγκρατούνται οι μεγαλύτερου μοριακού βάρους ενώσεις όπως είναι τα ένζυμα με μοριακό -136-

157 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση βάρος ~ g/mol (κυτταρινάσες) (S. Yang et al., 2009). Οι αντιδραστήρες μεμβρανών λειτουργούν με την ίδια αρχή, απομακρύνοντας το προϊόν και διατηρώντας τα ένζυμα στο εσωτερικό του αντιδραστήρα. Χαρακτηριστικό των αντιδραστήρων με μεμβράνες είναι η απαίτηση συστηματικού καθαρισμού των μεμβρανών ώστε να αποφεύγεται το μπλοκάρισμα των πόρων της μεμβράνης (Andrić et al., 2010). Η συνεχής λειτουργία της αντίδρασης της ενζυμικής υδρόλυσης παρέχει διπλό όφελος καθώς πραγματοποιείται επαναχρησιμοποίηση των ενζύμων που παραμένουν δραστικά για αρκετούς κύκλους της υδρόλυσης και συγχρόνως απομακρύνεται η γλυκόζη που σε μεγάλες συγκεντρώσεις αποτελεί παρεμποδιστική ένωση στη δράση των κυτταρινασών. Οι μεμβράνες που έχουν αναφερθεί σε αντιδραστήρες μεμβρανών, όπου λαμβάνει χώρα η ενζυμική υδρόλυση, είναι οι μεμβράνες υπερδιήθησης και νανοδιήθησης μέσω συνθηκών πίεσης. Οι μεμβράνες υπερδιήθησης μπορούν να συγκρατήσουν μακρομόρια με μοριακό βάρος που ποικίλει ανάμεσα σε με g/mol και χρησιμοποιούνται ευρέως σε διαχωρισμό πρωτεϊνών. Οι μεμβράνες νανοδιήθησης έχουν όριο μοριακού βάρους g/mol επιτρέποντας τη συγκράτηση διαλυτών συστατικών με μοριακό βάρος g/mol. Χρησιμοποιούνται για τη συμπύκνωση ρεύματος σακχάρων και μέσων ζύμωσης μικροοργανισμών (Qi et al., 2011). Η εφαρμογή τεχνολογιών ημι-συνεχούς τροφοδοσίας της αντίδρασης αποτελεί μέθοδο μείωσης του κόστους του σταδίου μέσω της σωστής πολιτικής τροφοδοσίας βιομάζας και ενζύμου. Η ημι-συνεχής τροφοδοσία παρέχει αύξηση της συγκέντρωσης του στερεού υποστρώματος σταδιακά με αποτέλεσμα την αύξηση της απόδοσης του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης. H σακχαροποίηση με μεγάλη πυκνότητα στερεής βιομάζας, σε ασυνεχείς συνθήκες, προκαλεί αύξηση του ιξώδους του υδρολύματος, μεγαλύτερες ενεργειακές απαιτήσεις για ανάδευση, πιθανότητα απενεργοποίησης των ενζύμων λόγω διατμητικής τάσης και χαμηλή μεταφορά θερμότητας λόγω των ρεολογικών ιδιοτήτων του ινώδους υδρολύματος (Gupta et al., 2012). Η λειτουργία αντιδραστήρα ενζυμικής υδρόλυσης με περιεκτικότητα στερεού πάνω από 10% w/v αυξάνει απαγορευτικά το ιξώδες κυρίως λόγω αδιάλυτων στερεών μεγάλου μεγέθους. Συνεπώς, οι κατάλληλες ποσότητες βιομάζας και ενζύμων τροφοδοτούνται σε δόσεις ώστε να αυξάνεται η τελική συγκέντρωση των προϊόντων χωρίς να υπάρχει παρεμπόδιση από προβλήματα συνωστισμού στερεού υποστρώματος ή ενζύμων. Η σύγκριση τριών τεχνολογιών ενζυμικής υδρόλυσης -137-

158 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση (ασυνεχούς, ημισυνεχούς με προσθήκη μόνο βιομάζας και ημισυνεχούς με προσθήκη και επιπλέον ενζύμου) από τους Knutsen & Davis (2004) υπέδειξε ως την οικονομικότερη μέθοδο ενζυμικής υδρόλυσης, που μεγιστοποιεί την παραγωγή γλυκόζης, την ημι-συνεχή λειτουργία με τροφοδοσία βιομάζας και σύγχρονης προσθήκης επιπλέον ενζύμου. Οι τεχνολογίες ημι-συνεχούς τροφοδοσίας έχουν πολλαπλά πλεονεκτήματα σχετικά με τη μείωση του κόστους του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης. Αρχικά, οι αντιδραστήρες αυτών των συνθηκών απαιτούν μικρότερο όγκο οπότε προκύπτει χαμηλότερο κόστος κεφαλαίου. Επίσης, το κόστος των διεργασιών ανάκτησης και περαιτέρω χρήσης του υδρολύματος μειώνεται καθώς πρόκειται για εμπλουτισμένο σε σάκχαρα διάλυμα. Η αποτελεσματική αύξηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης σε αυτό το στάδιο έχει όφελος και στο συνολικό κόστος της διεργασίας καθώς το ρεύμα των σακχάρων που οδηγείται προς ζύμωση έχει υψηλή συγκέντρωση σακχάρων, και κατ επέκταση οι ανάγκες συμπύκνωσης της τροφοδοτούμενης γλυκόζης για την παραγωγή αιθανόλης μειώνονται. 4.2 Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Ενζυμικής Υδρόλυσης Βελτιστοποίηση του σταδίου της Ενζυμικής Υδρόλυσης μέσω Παραγοντικού Πειραματικού Σχεδιασμού Box Βenhken Ο στόχος της ενζυμικής υδρόλυσης είναι η επεξεργασία της προκατεργασμένης στερεής βιομάζας, πλούσιας σε κυτταρίνη, με μίγμα ενζύμων προς παραγωγή μονομερών σακχάρων της γλυκόζης. Η αύξηση της τελικής συγκέντρωσης της γλυκόζης μελετάται μέσα από σειρά πειραμάτων που στόχο έχουν τη βελτιστοποίηση του σταδίου. Έχουν πραγματοποιηθεί προκαταρκτικές πειραματικές μελέτες με χαμηλής περιεκτικότητας προεπεξεργασμένη βιομάζα (2% w/v) και υψηλή περιεκτικότητα ενζύμων (40 FPU/g στερεής βιομάζας), οι οποίες απέδωσαν υψηλό βαθμό συνολικής μετατρεψιμότητας της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας σε μονομερή σάκχαρα, που προέρχονται τόσο από την διαλυτοποίηση των ημικυτταρινών όσο και από τη διαλυτοποίηση της κυτταρίνης (Παππάς, 2011). Τα επόμενα σημεία έρευνας είναι η αύξηση της περιεκτικότητας της προεπεξεργασμένης βιομάζας, η μείωση της περιεκτικότητας των ενζύμων και η προσθήκη επιφανειοδραστικών (Παράγραφος 4.1.3), τα οποία θα μελετηθούν με τη χρήση πειραματικού σχεδιασμού. Για -138-

159 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση τη βελτιστοποίηση του σταδίου, με βάση τα παραπάνω σημεία, λαμβάνονται υπόψη μια σειρά βιβλιογραφικών αναφορών όπως αυτή των Silverstein et al. (2007), σύμφωνα με τους οποίους, η υψηλότερη ποσότητα στερεού υλικού και ενζύμου οδηγεί σε υψηλότερη συγκέντρωση σακχάρων, καθώς περιλαμβάνονται στην ακατέργαστη βιομάζα περισσότερα σάκχαρα και συνεπώς μεγαλύτερη ποσότητα ενζύμων προσροφάται στην επιφάνεια της κυτταρίνης. Παρόμοια αποτελέσματα αναφέρουν οι Xu et al. (2007) σε στελέχη σόγιας, οι Mussatto et al. (2008) σε λιγνοκυτταρινικά υπολείμματα ζυθοποιίας και οι Zheng et al. (2009) κατά την ενζυμική υδρόλυση πολυετών αγρωστωδών ειδών (Αgropyron elognatum, Leymus triticoides). Ο πειραματικός σχεδιασμός που επιλέχθηκε είναι ο Σχεδιασμός Επιφανειών Απόκρισης, ο οποίος περιγράφεται αναλυτικά στην Παράγραφο Ο Σχεδιασμός Επιφανειών Απόκρισης εφαρμόζεται με στόχο τη μελέτη περισσότερων παραγόντων σε σχέση με τους κλασματικούς παραγοντικούς σχεδιασμούς καθώς βελτιστοποιεί σε βάθος το σύστημα που μελετάται. Συγκεκριμένα, εφαρμόστηκε ο σχεδιασμός του Box - Behnken με τέσσερεις μεταβλητές (Πίνακας 4.1), στις οποίες περιλαμβάνεται η περιεκτικότητα στερεής βιομάζας, η περιεκτικότητα των ενζύμων, ο χρόνος της αντίδρασης και η χρήση της επιφανειοδραστικής ουσίας πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG 4000). Η επιφανειοδραστική ουσία PEG 4000, που επιλέχθηκε, είναι ένα πολυμερές με μοριακό βάρος (Μw) Κάθε μεταβλητή ελέγχου μελετάται σε τρία επίπεδα, δύο ακραία και ένα τρίτο ενδιάμεσο (-1, 0 +1). Ο σχεδιασμός αυτός δίνει τη δυνατότητα σχηματικής απεικόνισης των αλληλεπιδράσεων σε ζεύγη των παραγόντων, μέσω τρισδιάστατων διαγραμμάτων επιφανειών απόκρισης

160 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Πίνακας 4.1. Πειραματικός Σχεδιασμός Επιφανειών Απόκρισης Box Behnken τεσσάρων παραγόντων σε τρία επίπεδα με τα πειραματικά Χειρισμός Βιομάζα (% w/v) αποτελέσματα για τη συγκέντρωση γλυκόζης. Περιεκτικότητα Ενζύμου (FPU/g στερεής βιομάζας) PEG 4000 (g/g στερεής βιομάζας) Χρόνος (h) Γλυκόζη (g/l) , ,15±0, , ,71±0, , ,42±0, , ,41±0, , ,69±0, , ,57±0, , ,27±0, , ,86±0, , ,41±0, , ,39±0, , ,29±0, , ,79±0, , ,08±0, , ,24±0, , ,58±0,

161 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Χειρισμός Βιομάζα (% w/v) Περιεκτικότητα Ενζύμου (FPU/g στερεής βιομάζας) PEG 4000 (g/g στερεής βιομάζας) Χρόνος (h) Γλυκόζη (g/l) , ,22±0, , ,84±0, , ,67±0, , ,18±0, , ,48±0, , ,11±0, , ,25±0, , ,42±0, , ,67±0, , ,08±0, , ,89±0, , ,30±0,

162 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Τα αποτελέσματα του πειραματικού σχεδιασμού επεξεργάστηκαν με το στατιστικό πακέτο Minitab Η ανάλυση του στατιστικού σχεδιασμού παρέχει μια σειρά εμπειρικών μοντέλων πρόβλεψης (γραμμικού και δεύτερης τάξης), της εξαρτημένης μεταβλητής που είναι η συγκέντρωση της γλυκόζης με βάση τους ανεξάρτητους παράγοντες του Πίνακα 4.1. Η διασπορά των υπολειμμάτων της πειραματικής τιμής της απόκρισης σε σχέση με την προσαρμοσμένη τιμή του γραμμικού μοντέλου (πειραματικό σφάλμα residual) παρουσιάζει κανονική κατανομή (Σχήμα 4.3). Το Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων των πειραματικών τιμών από τις τιμές πρόβλεψης αποτελεί ένδειξη ότι το γραμμικό μοντέλο παρουσιάζει πολύ καλή προσαρμογή σε σχέση με τα πρωτογενή δεδομένα όπως διαφαίνεται στο Σχήμα 4.3. Επιπρόσθετα, η Aνάλυση Διακύμανσης δίνει τη δυνατότητα αξιολόγησης και του δεύτερης τάξης εμπειρικού μοντέλου (square). Συγκεκριμένα από την Aνάλυση Διακύμανσης, προκύπτει ότι μόνο το μοντέλο της γραμμικής παλινδρόμησης είναι στατιστικά σημαντικό, με παράγοντα p<0.05 (p=0) για την πρόβλεψη της εξαρτημένης μεταβλητής (παραγωγή γλυκόζης). Αντιθέτως το μοντέλο δεύτερης τάξης εμφανίζει παράγοντα p>0.05 (p=0,261). Επομένως, το εμπειρικό μοντέλο που προτιμάται για την πρόβλεψη των τιμών της συγκέντρωσης της γλυκόζης στο εύρος τιμών που μελετήθηκαν κατά των πειραματικό σχεδιασμό είναι το γραμμικό. Το γραμμικό μοντέλο παλινδρόμησης περιλαμβάνει μόνο τους στατιστικά σημαντικούς παράγοντες καθώς και τις αλληλεπιδράσεις τους και η εξίσωση του όπως προκύπτει από την Ανάλυση Επιφανειών του πειραματικού σχεδιασμού Box Behnken είναι η εξίσωση 4.1 όπως ακολουθεί παρακάτω: [Glucose] (g/l) = 8,14-0,55 [Biomass] - 0,138 [Enzyme] + 38,9 [PEG 4000] - 0,1596 [Time] + 0,1215 [Biomass] [Enzyme] - 6,6 [Biomass] [PEG 4000] + 0,0262 [Biomass] [Time] - 3,80 [Enzyme] [PEG 4000] + 0,0023 [Enzyme] [Time] 0,888 [PEG 4000] [Time] (4.1) Το αρχικό γραμμικό μοντέλο διαθέτει συντελεστή προσδιορισμού R 2 93,38% και προσαρμοσμένο συντελεστή προσδιορισμού 85,66%, καθώς περιλαμβάνει το σύνολο των αλληλεπιδράσεων των ανεξάρτητων μεταβλητών. Σύμφωνα με την Ανάλυση Διακύμανσης του γραμμικού μοντέλου παλινδρόμησης, υπάρχουν αλληλεπιδράσεις που επιδεικνύουν -142-

163 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση χαμηλής σημασίας στατιστικό αποτέλεσμα. Η συμμετοχή των παραμέτρων αυτών στη διαμόρφωση του αποτελέσματος δε παρουσιάζει χρησιμότητα. Επομένως, το γραμμικό μοντέλο επαναπροσδιορίζεται με νέους συντελεστές και περιορίζεται σε αυτούς που παρουσιάζουν σημαντικότερο στατιστικό αποτέλεσμα. Το νέο γραμμικό μοντέλο παλινδρόμησης διαθέτει συντελεστή προσδιορισμού R 2 90,06% και προσαρμοσμένο συντελεστή προσδιορισμού 83,84%. Ο Πίνακας 4.2 περιλαμβάνει τους συντελεστές p της Ανάλυσης Διακύμανσης (ANOVA) για κάθε μεταβλητή του γραμμικού εμπειρικού μοντέλου. Ο συντελεστής παλινδρόμησης του γραμμικού μοντέλου είναι υψηλός στοιχείο που υποδεικνύει τη συμφωνία των πειραματικών αποτελεσμάτων με τις θεωρητικές τιμές που προκύπτουν από το μοντέλο πρόβλεψης. Το παραπάνω συμπέρασμα έρχεται σε συμφωνία με τη διασπορά των πειραματικών τιμών γύρω από την καμπύλη του γραμμικού μοντέλου πρόβλεψης (Σχήμα 4.4). Σχήμα 4.3. Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Box Behnken στο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης

164 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Πίνακας 4.2. Ανάλυση Διακύμανσης για το γραμμικό μοντέλο παλινδρόμησης Box Behnken για τη συγκέντρωση γλυκόζης. Όρος Τιμή T Παράγοντας P Σταθερά 55,79 0 Βιομάζα 10,72 0 Ένζυμο 4,41 0 PEG ,44 0,668 Χρόνος Αντίδρασης -1,23 0,236 Βιομάζα x Ένζυμο 1,66 0,116 Βιομάζα x PEG ,36 0,722 Βιομάζα x Χρόνος 1,72 0,105 Ένζυμο x PEG ,04 0,314 Ένζυμο x Χρόνος 0,76 0,459 PEG 4000 x Χρόνος 1,17 0,261 Επιπρόσθετα, η Ανάλυση Διακύμανσης (ANOVA) αξιολογεί τους παράγοντες ελέγχου για την επίδραση τους στην παραγωγή της γλυκόζης, και η αξιολόγηση αυτή οπτικοποιείται στο Σχήμα 4.5, το οποίο παρουσιάζει την ποσοστιαία συνεισφορά των παραγόντων στη διαμόρφωση του γραμμικού μοντέλου. Συγκεκριμένα, η περιεκτικότητα της στερεής βιομάζας και η ποσότητα των ενζύμων αποτελούν τους σημαντικότερους παράγοντες επίδρασης με τιμή συνεισφοράς 77,16% και 13,13% αντίστοιχα. Ενώ, ο χρόνος της υδρόλυσης και η συγκέντρωση της επιφανειοδραστικής ουσίας (PEG 4000) έχουν σημαντικά χαμηλότερη συνεισφορά στην παραγωγή της γλυκόζης και συγκεκριμένα 0,13% και 1,13% αντίστοιχα. Στη συνέχεια, οι αλληλεπιδράσεις των παραγόντων μεταξύ τους δε παρουσιάζουν σημαντικές τιμές με εξαίρεση την αλληλεπίδραση της βιομάζας με το χρόνο (2%) γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η συμμετοχή τους στο γραμμικό μοντέλο θα -144-

165 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση μπορούσε να παραληφθεί. Ακόμα, μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις των ίδιων των παραγόντων στον εαυτό τους και το αποτέλεσμα δεν ήταν στατιστικά σημαντικό. Όσον αφορά την επίδραση της επιφανειοδραστικής ουσίας (PEG 4000) που ήταν στατιστικά μη σημαντική, γίνεται σαφές ότι η χρήση των επιφανειοδραστικών ουσιών δε βελτιώνει την απόδοση της ενζυμικής υδρόλυσης. Το γεγονός αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στο είδος της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας και ειδικότερα στο πολύ χαμηλό ποσοστό λιγνίνης (<10%) του συγκεκριμένου είδους της φαλαρίδας, η οποία αποτελεί ένα πολυετές ποώδες φυτό (αγρωστώδες), σε αντίθεση με άλλα ετήσια και πολυετή αλλά και ξυλώδη είδη (δένδρα, θάμνοι) που εμφανίζουν μεγάλα ποσοστά λιγνίνης (20-25% Ξ.Μ.). Τα ίδια δεδομένα εξηγούν και τη χαμηλή συνεισφορά των αλληλεπιδράσεων της επιφανειακής ουσίας με τον εαυτό της και με τους υπόλοιπους παράγοντες. Συγκέντρωση Γλυκόζης Πειραματική (g/l) Πειραματικές Τιμές Τιμές Πρόβλεψης Συγκέντρωση Γλυκόζης Πρόβλεψης (g/l) Σχήμα 4.4. Σχηματική απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Box Behnken σχεδιασμού για τη συσχέτιση της συγκέντρωσης της γλυκόζης με τη βιομάζα, την ποσότητα ενζύμου, τη συγκέντρωση PEG 4000 και το χρόνο της αντίδρασης, με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ενζυμικής υδρόλυσης

166 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση PEG 4000 * Χρόνος Ένζυμο * Χρόνος Ένζυμο * PEG 4000 Βιομάζα * Χρόνος Βιομάζα * PEG 4000 Βιομάζα * Ένζυμο Χρόνος * Χρόνος PEG 4000 * PEG 4000 Ένζυμο * Ένζυμο Βιομάζα * Βιομάζα Χρόνος PEG 4000 Ένζυμο Βιομάζα 0.92% 0.39% 0.73% 2.00% 0.09% 1.08% 1.08% 0.01% 0.58% 1.07% 1.03% 0.13% 13.13% 77.76% 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% Ποσοστό Συνεισφοράς Σχήμα 4.5. Συνεισφορά των τεσσάρων παραγόντων και των μεταξύ τους αλληλεπιδράσεων στη συγκέντρωση της γλυκόζης σύμφωνα με την Ανάλυση Διακύμανσης για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης. Οι περισσότερες ερευνητικές προσπάθειες στη σύγχρονη βιβλιογραφία που μελέτησαν την επίδραση των επιφανειοδραστικών ουσιών στη βελτιστοποίηση της ενζυμικής υδρόλυσης χρησιμοποίησαν διαφόρους τύπους λιγνοκυτταρινικής βιομάζας με υψηλό ποσοστά λιγνίνης ανά μονάδα ξηρού βάρους. Συγκεκριμένα, οι Zhang et al. (2011) χρησιμοποιήσαν στελέχη καλαμποκιού με 24,3% λιγνίνη και οι Seo et al. (2011) χρησιμοποίησαν τεμαχίδια ξύλου πεύκης με 27,99% λιγνίνη. Αντίθετα οι Yang et al. (2011) που χρησιμοποίησαν ως πρώτη ύλη της ενζυμικής υδρόλυσης διηθητικό χαρτί, το οποίο αποτελείται από καθαρή κυτταρίνη, συμπέραναν ότι η προσθήκη επιφανειοδραστικών ουσιών είχε πολύ μικρή επίδραση στην παραγωγή γλυκόζης, χρησιμοποιώντας τα ίδια εμπορικά ένζυμα σε χαμηλές ταχύτητες ανάδευσης (0-100 στροφές ανά λεπτό). Παρόμοια αποτελέσματα παρουσίασαν οι Ferreira et al., (2009) οι οποίοι μελέτησαν δύο φυτά με διαφορετική περιεκτικότητα σε λιγνίνη (cistus ladanifer 34.2% και cytisus striatus 24.7%) για τα οποία η στατιστική ανάλυση υπέδειξε ότι η σημαντικότητα της επίδρασης των επιφανειοδραστικών ουσιών είναι πολύ χαμηλότερη για το φυτό με τη μικρότερη περιεκτικότητα λιγνίνης

167 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Η εξάρτηση του παράγοντα απόκρισης με τις παραμέτρους ελέγχου του πειραματικού σχεδιασμού οπτικοποιείται μέσω των Διαγραμμάτων Επιφανειών. Τα διαγράμματα του Σχήματος 4.6 παρουσιάζουν τη μεταβολή της συγκέντρωσης της γλυκόζης (g/l) ανά ζεύγος ανεξάρτητων μεταβλητών του πειραματικού σχεδιασμού Βox Denken με τις υπόλοιπες ανεξάρτητες μεταβλητές σταθερές στο ενδιάμεσο επίπεδο. Αρχικά, στο διάγραμμα (α) παρατηρείται ότι σε ενδιάμεσες (3%) και υψηλές (4%) περιεκτικότητες βιομάζας ακόμη και σε χαμηλούς χρόνους υδρόλυσης (24 h) παρατηρούνται υψηλές τιμές συγκέντρωσης γλυκόζης (10-12 g/l), ενώ οι μέγιστες τιμές (>12,5 g/l) εμφανίζονται στους ενδιάμεσους χρόνους υδρόλυσης. Ο συνδυασμός υψηλής περιεκτικότητας βιομάζας με ενδιάμεσο χρόνο υδρόλυσης παρουσιάζει τη μέγιστη τιμή γλυκόζης. Επίσης, οι έντονες διακυμάνσεις του Διαγράμματος Επιφανειών αντιστοιχούν στη σημαντική επίδραση που έχουν οι δύο παράγοντες στη διαμόρφωση του αποτελέσματος Στη συνέχεια, στο διάγραμμα (β) παρατηρείται ότι οι μέγιστες συγκεντρώσεις γλυκόζης παράγονται με υψηλή περιεκτικότητα της προεπεξεργασμένης βιομάζας ακόμα και σε χαμηλότερα επίπεδα περιεκτικότητας ενζύμου. Ο συνδυασμός μέγιστης βιομάζας 4% w/v και συγκέντρωσης ενζύμων 20 FPU/g βιομάζας παράγει τη μέγιστη ποσότητα γλυκόζης. Τα συμπέρασμα των (α) και (β) διαγραμμάτων βρίσκονται σε συμφωνία με τα παραπάνω αποτελέσματα της ποσοστιαίας συνεισφοράς των μεταβλητών. Οι σημαντικότερες μεταβλητές είναι η βιομάζα και τα ένζυμα καθώς και οι αλληλεπιδράσει της βιομάζας με το χρόνο και της βιομάζας με το ένζυμο. Στη συνέχεια, το διάγραμμα (γ) παρουσιάζει υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης σε ενδιάμεσες (0,04 g) ποσότητες επιφανειοδραστικής ουσίας (PEG 4000) με σταθερά την αυξημένη βιομάζα να ευνοεί το αποτέλεσμα. Με τον ίδιο τρόπο όπως και στα παραπάνω διαγράμματα, το Διάγραμμα Επιφανειών παρουσιάζει σημαντικές αλλαγές καμπυλότητας που συνδέονται με τη συμμετοχή των δύο ανεξάρτητων παραγόντων και της μεταξύ τους αλληλεπίδρασης στη διαμόρφωση του αποτελέσματος. Σε αντίθεση, τα διαγράμματα (δ), (ε) και (στ) παρουσιάζουν μικρή αλλαγή κλίσεων στην επιφάνεια των καμπυλών. Από την Ανάλυση Διακύμανσης έχει προκύψει ότι τη μικρότερη επίδραση στη διαμόρφωση του αποτελέσματος κατά την παραγωγή της γλυκόζης, την έχουν οι αλληλεπιδράσεις ενζύμου χρόνου, επιφανειοδραστικού χρόνου και ενζύμου επιφανειοδραστικού. Τα διαγράμματα επιφανειών των αλληλεπιδράσεων επιβεβαιώνουν -147-

168 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση την ποσοστιαία συνεισφορά των αλληλεπιδράσεων στην παραγωγή της γλυκόζης, σε συνέχεια των παραπάνω αποτελεσμάτων. Η μέγιστη τιμή της γλυκόζης που προκύπτει από τη σύγκριση ων πειραματικών χειρισμών του σχεδιασμού Box Behnken είναι ίση με την τιμή 12,3 g/l. Η θεωρητική τιμή που προκύπτει από την επίλυση του γραμμικού μοντέλου παλινδρόμησης της εξίσωσης 4.1, είναι 13,4 g/l. Η τιμή πρόβλεψης βρίσκεται σε συμφωνία με την πειραματική τιμή της βελτιστοποίησης του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης. Οι βέλτιστες συνθήκες που προκύπτουν για το στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης περιλαμβάνονται στον Πίνακα 4.3, όπου υπολογίζεται η απόδοση του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης ίση με 64,8%. Τα αποτελέσματα του σταδίου της παρούσας μελέτης βρίσκονται σε συμφωνία με τα πειραματικά αποτελέσματα βιβλιογραφικών αναφορών ενισχύοντας τη σημασία του μοντέλου πρόβλεψης. Οι Lu et al. (2007), οι οποίοι χρησιμοποίησαν συγκέντρωση ενζύμων 20 και 25 FPU/g στερεής βιομάζας, παρουσίασαν βέλτιστη τιμή ποσότητας ενζύμων για μέγιστη απόδοση γλυκόζης την ενδιάμεση τιμή 22 FPU/g στερεής βιομάζας. Η χρήση χαμηλής ποσότητας ενζύμων προσφέρει οικονομικό πλεονέκτημα στη διεργασία καθώς οι αναφορές συνήθως περιλαμβάνουν συγκέντρωση ενζύμων σημαντικά υψηλότερη. Συγκεκριμένα, οι Ferreira et al. (2009) μελέτησαν την ενζυμική υδρόλυση του φυτού λαδανιά με στόχο τη βελτιστοποίηση μέσω πειραματικού σχεδιασμού και κατέληξαν σε βέλτιστη συγκέντρωση ενζύμων με τιμή 72 FPU/g στερεής βιομάζας. Η απόδοση του σταδίου σε γλυκόζη ήταν 42,8%. Οι Ruangmee & Sangwichien (2013) εφάρμοσαν στρατηγική ενζυμικής υδρόλυσης που τους απέδωσε γλυκόζη σε ποσοστό 75,6% για το φυτό τύφα της οικογένειας Typhaceae

169 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση (α) (β) -149-

170 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση (γ) (δ) -150-

171 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση (ε) (στ) Σχήμα 4.6: Διαγράμματα Επιφανειών Απόκρισης με τις αλληλεπιδράσεις δύο παραγόντων στη συγκέντρωση της γλυκόζης: (α) βιομάζας χρόνου, (β) ενζύμου βιομάζας, (γ) βιομάζα επιφανειοδραστικού (δ) ενζύμου χρόνου, (ε) επιφανειοδραστικού χρόνου, (στ) ενζύμου επιφανειοδραστικού

172 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Εν συνεχεία, εφόσον βελτιστοποιήθηκαν οι συνθήκες του σταδίου της ενζυμικής υδρόλυσης, μελετήθηκε η αναλογία μεταξύ της κυτταρινάσης και της β-γλυκοσιδάσης. Η δεύτερη βρίσκεται σε περίσσεια για να καλύψει τις ανάγκες υδρόλυσης της κελλοβιόζης, του δισακχαρίτη της γλυκόζης που προκύπτει από την υδρόλυση της κυτταρίνης. Ο πειραματικός σχεδιασμός Box Behnken πραγματοποιήθηκε με αναλογία μεταξύ κυτταρινάσης και β γλυκοσιδάσης 1 : 1,75 (Yang & Wyman, 2006). Η αναλογία που διερευνήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιεί μικρότερη και μεγαλύτερη ποσότητα β- γλυκοσιδάσης. Σύμφωνα με το Σχήμα 4.7, ίση ποσότητα των δύο εμπορικά διαθέσιμων ενζύμων δεν ευνοεί την παραγωγή γλυκόζης. Η αναλογία 1:2 βελτιώνει την συγκέντρωση της παραγόμενης γλυκόζης σε προχωρημένο χρόνο αντίδρασης (πάνω από 48 ώρες). Πίνακας 4.3. Μέγιστη συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) με βάση την άριστη λύση του εμπειρικού μοντέλου παλινδρόμησης. Μεταβλητές Τιμή Περιεκτικότητα βιομάζας (%w/v) 4 Ποσότητα ενζύμων (FPU/g βιομάζας) 20 Χρόνος υδρόλυσης (h) 48 Επιφανειοδραστικό, PEG 4000 (g/g βιομάζας) 0,04 Συγκέντρωση γλυκόζης πρόβλεψης (g/l) 13,4 Συγκέντρωση γλυκόζης πειραματική (g/l) 12,41±0,29 Απόδοση σταδίου ενζυμικής υδρόλυσης 64,8% -152-

173 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση 8 7 Συγκέντρωση Γλυκόζης (g/l) Χρόνος Υδρόλυσης (h) Αναλογία Ενζύμων 1:1 Αναλογία Ενζύμων 1:1,25 Αναλογία Ενζύμων 1:1,5 Αναλογία Ενζύμων 1:1,75 Αναλογία Ενζύμων 1:2 Σχήμα 4.7. Συγκέντρωση της γλυκόζης για διαφορετικές αναλογίες μεταξύ των δύο εμπορικά διαθέσιμων ενζύμων κυτταρινάση και β - γλυκοσιδάση κατά την ενζυμική υδρόλυση Αύξηση τη ποσότητας του στερεού υποστρώματος Η αυξημένη παραγωγή γλυκόζης στο στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης οδηγεί σε αποδοτικότερη διεργασία συνολικά καθώς αυξάνονται τα παραγόμενα τελικά προϊόντα και μειώνεται το κόστος ανάκτησης τους. Η βελτιστοποίηση του σταδίου μέσω πειραματικού σχεδιασμού Επιφανειών Απόκρισης συμπέρανε ότι η μέγιστη παραγωγή γλυκόζης προκύπτει με περιεκτικότητα στερεού 4% w/v. Σύμφωνα με τους Rosgaard et al. (2007), η συγκέντρωση του στερεού υποστρώματος στην ενζυμική υδρόλυση περιλαμβάνει περιορισμούς λόγω αύξησης του ιξώδους του υδρολύματος που οδηγεί σε μείωση της δραστικότητας των ενζύμων. Συγκεκριμένα, είναι πολύ δύσκολο να πραγματοποιηθεί η αντίδραση της ενζυμικής υδρόλυσης με περιεκτικότητα προεπεξεργασμένης λιγνοκυτταρινικής βιομάζας μεγαλύτερη από 10% w/v (Varga et al., 2004). Συνεπώς, προέκυψε η ανάγκη μελέτης της περιεκτικότητας της στερεής προεπεξεργασμένης βιομάζας σε υψηλότερα επίπεδα με ασυνεχείς συνθήκες. Η αύξηση της ποσότητας της στερεής προεπεξεργασμένης βιομάζας στο 6% w/v συγκρίνεται με χαμηλότερη περιεκτικότητα στο -153-

174 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση υδρόλυμα της ενζυμικής υδρόλυσης. Τα αποτελέσματα που απεικονίζονται στο Σχήμα 4.8, υποδεικνύουν ότι η βιομάζα μπορεί να αυξηθεί σε περιεκτικότητα 6% w/v χωρίς να παρουσιαστούν προβλήματα ρεολογίας και ανάμειξης. Η συγκέντρωση της παραγόμενης γλυκόζης αυξήθηκε στην τιμή 18,8 g/l καθώς η βιομάζα αυξήθηκε κατά 2% στο συνολικό 6% w/v. Το φαινόμενο παρακολουθήθηκε για 72 ώρες αλλά λαμβάνεται το μεγαλύτερο ποσοστό της τελικής συγκέντρωσης της γλυκόζης ήδη από τις 48 ώρες. Σύμφωνα με τους Chen et al., (2007) η αύξηση της βιομάζας μπορεί να αυξήσει τη συγκέντρωση της παραγόμενης γλυκόζης στο υδρόλυμα, συγχρόνως όμως πάνω από ένα σημείο θα προκαλέσει παρεμπόδιση στη μεταφορά μάζας, όπου τα ένζυμα δε θα μπορούν να αναμιχθούν σωστά ώστε να βρίσκουν τις κατάλληλες επιφάνειες για τη δημιουργία συμπλόκων. Η περαιτέρω αύξηση της περιεκτικότητας της βιομάζας σε ασυνεχείς συνθήκες δεν ενδείκνυται. Στη συνέχεια, εφαρμόζεται η στρατηγική της ημι-συνεχούς τροφοδοσίας της στερεής προεπεξεργασμένης βιομάζας που επιτρέπει την αύξηση της περιεκτικότητας του στερεού υποστρώματος σε ποσοστό μέχρι 15% w/v (Rudolf et al., 2005) Συγκέντρωση Γλυκόζης (g/l) Βιομάζα 2% w/v Βιομάζα 4% w/v Βιομάζα 6% w/v Χρόνος (h) Σχήμα 4.8. Επίδραση της αύξησης του περιεχόμενου στερεού στη συγκέντρωση της γλυκόζης σε συγκριτικά πειράματα ενζυμικής υδρόλυσης

175 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Στρατηγική Ημι-συνεχούς τροφοδοσίας Αρχικά μελετήθηκε η στρατηγική τροφοδοσίας σε δύο διαφορετικά χρονικά διαστήματα, κάθε 6 ώρες (πολιτική Α) και κάθε 12 ώρες (πολιτική Β). Η αρχική βιομάζα της ενζυμικής υδρόλυσης ήταν 6% w/v και οι δόσεις της τροφοδοσίας έφτασαν σε τελική βιομάζα 10% w/v. Η ποσότητα των ενζύμων και στις δύο περιπτώσεις ήταν 30 FPU/g βιομάζας με αναλογία ενζύμων 1:2. Η ημι-συνεχής τροφοδοσία και για τις δύο περιπτώσεις επέτρεψε συνολικά την προσθήκη 10% w/v προεπεξεργασμένης βιομάζας στην αντίδραση της ενζυμικής υδρόλυσης. Η τελική συγκέντρωση της παραγόμενης γλυκόζης ήταν παρόμοια και για τις δύο περιπτώσεις, 29,75 και 29,14 g/l για το διάστημα των 6 και 12 ωρών, αντίστοιχα. Η τροφοδοσία σε διαστήματα, έδινε τον απαραίτητο χρόνο υδρόλυσης της αρχικής κυτταρίνης ώστε η προσθήκη του νέου στερεού να μη δημιουργεί συνωστισμό στερεού και ενζύμου. Οι δύο διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας με 6 και 12 ωρών διαστήματα τροφοδοσίας είχαν διαφορετική συμπεριφορά στην παραγωγικότητα της γλυκόζης (Σχήμα 4.9). Συγκεκριμένα, η τροφοδοσία σε μικρότερα χρονικά διαστήματα (κάθε 6 ώρες) παρήγαγε μεγαλύτερη συγκέντρωση γλυκόζης σε συντομότερο χρονικό διάστημα, συνεπώς η παραγωγικότητα της συγκεκριμένης στρατηγικής τροφοδοσίας ήταν ίση με 0,94 g/(l h) και μεγαλύτερη από την στρατηγική των 12 ωρών (0,81 g/(l h)) (Σχήμα 4.11). Η απόδοση σε γλυκόζη, στο Σχήμα 4.10, παρουσιάζεται υψηλότερη για την τροφοδοσία Β στο διάστημα ωρών διότι έχουν προστεθεί στην αντίδραση λιγότερα σάκχαρα σε σχέση με την πολιτική Α και όχι γιατί έχει συνολικά καλύτερες αποδόσεις. Η τροφοδοσία στην πολιτική Α ολοκληρώνεται στις 30 ώρες ενώ η τροφοδοσία στην πολιτική Β ολοκληρώνεται στις 48 ώρες. Από τα παραπάνω επιλέγεται η πολιτική τροφοδοσίας Α ως η βέλτιστη τροφοδοσία

176 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Τροφοδοσία κάθε 6 h Tροφοδοσία κάθε 12 h Συγκέντρωση Γλυκόζης (g/l) Χρόνος (h) Σχήμα 4.9. Συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) για δύο διαφορετικά διαστήματα της ενζυμικής υδρόλυσης, τροφοδοσίας 6 και 12 ωρών Απόδοση Γλυκόζης (%) Χρόνος (h) Τροφοδοσία κάθε 6 h Τροφοδοσία κάθε 12 h Σχήμα Απόδοση γλυκόζης (%) για δύο διαφορετικά διαστήματα της ενζυμικής υδρόλυσης, τροφοδοσίας 6 και 12 ωρών

177 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Παραγωγικότητα Γλυκόζης (g/(lh)) Χρόνος (h) Τροφοδοσία κάθε 6 h Τροφοδοσία κάθε 12 h Σχήμα Παραγωγικότητα γλυκόζης (g/(l h)) για δύο διαφορετικά διαστήματα τροφοδοσίας της ενζυμικής υδρόλυσης, 6 και 12 ωρών. Στα χρονικά σημεία όπου προστίθεται βιομάζα στην αντίδραση γίνεται παράλληλη προσθήκη ενζύμου. Η πολιτική που ευνοεί περισσότερο την παραγωγή γλυκόζης μελετήθηκε για διαφορετική προσθήκη ποσότητας ενζύμου. Συγκεκριμένα, συγκρίθηκαν η πολιτική Γ με προσθήκη 20 FPU/g στερεής προεπεξεργασμένης βιομάζας και η πολιτική Δ με προσθήκη 30 FPU/g στερεής προεπεξεργασμένης βιομάζας. Η τροφοδοσία πραγματοποιήθηκε σε διαστήματα των 6 ωρών και η συνολική ποσότητα βιομάζας σημείωσε την τιμή 11% w/v. Η πολιτική Γ (Σχήμα 4.12) διακρίνεται καταλληλότερη διότι η ποσότητα του ενζύμου με τιμή 20 FPU/g βιομάζας μεγιστοποιεί τη συγκέντρωση της γλυκόζης καθώς και την απόδοση της. Συγκεκριμένα, οι τιμές της συγκέντρωσης (44,62 g/l) εμφανίζονται υψηλότερες από τις 12 ώρες και εξής σε σχέση με την πολιτική τροφοδοσίας Δ. Το φαινόμενο αυτό οφείλεται στην ανάγκη ύπαρξης ενός βέλτιστου συνδυασμού ποσότητας βιομάζας και ποσότητας ενζύμου. Η παρουσία μεγαλύτερης ποσότητας ενζύμου προκαλεί συνωστισμό των ενζύμων στην επιφάνεια της βιομάζας για την εύρεση των κατάλληλων θέσεων επαφής, γνωστό ως φαινόμενο συνωστισμού (jamming) που μειώνει τη δραστικότητα των ενζύμων καθώς και την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης (Bansal -157-

178 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση et al., 2009). Η απόδοση της παραγωγής γλυκόζης όταν η αναλογία βιομάζας και ενζύμου είναι η κατάλληλη (Πολιτική Γ) είναι μεγαλύτερη από την περίπτωση εμφάνισης του φαινομένου συνωστισμού (Πολιτική Δ) όπως περιγράφεται και στο Σχήμα Στο Σχήμα 4.14 απεικονίζεται η παραγωγικότητα της γλυκόζης για τις δύο διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας όπου διακρίνεται ότι η παραγωγικότητα της πολιτικής Γ διατηρείται σχεδόν σταθερή για μεγάλο διάστημα σε σχέση με την παραγωγικότητα της πολιτικής Δ που είναι συνεχώς πτωτική. Oι Hodge et al. (2009) ανέφεραν ότι με τελικό ποσοστό περιεκτικότητας βιομάζας 15% παραμένει περίπου 12-15% τμήμα αδιάλυτων σωματιδίων βιομάζας. Η μετατροπή της κυτταρίνης παρουσιάζει μέγιστη τιμή στο 80% υπολογίζοντας σε αυτή την τιμή την παραγωγή τόσο της γλυκόζης όσο και της κελλοβιόζης FPU/g 20 FPU/g Συκέντρωση Γλυκόζης (g/l) Χρόνος (h) Σχήμα Συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) για δύο διαφορετικά περιεχόμενα ενζύμων 20 και 30 FPU/g βιομάζας, κατά την ενζυμική υδρόλυση

179 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση FPU/g 20 FPU/g 80 Απόδοση Γλυκόζης (%) Χρόνος (h) Σχήμα Απόδοση γλυκόζης (%) για δύο διαφορετικά περιεχόμενα ενζύμων 20 και 30 FPU/g βιομάζας, κατά την ενζυμική υδρόλυση. Παραγωγικότητα Γλυκόζης (g/(lh)) FPU/g 20 FPU/g Χρόνος (h) Σχήμα Παραγωγικότητα γλυκόζης (g/(l h)) για δύο διαφορετικά περιεχόμενα ενζύμων 20 και 30 FPU/g βιομάζας, κατά την ενζυμική υδρόλυση

180 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Τελικά, η βέλτιστη ημι-συνεχής λειτουργία της ενζυμικής υδρόλυσης εφαρμόστηκε με τροφοδοσία σε διαστήματα 6 ωρών, με παράλληλη προσθήκη ενζύμων 20 FPU/g βιομάζας. Η πειραματική μελέτη έχει σα στόχο την αύξηση της τελικής ποσότητας βιομάζας που δύναται να προστεθεί στο διάλυμα με συνεπακόλουθη μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης. Οι βιβλιογραφικές πηγές αναφέρουν τελική ποσότητα βιομάζας με τιμή 15% (Modenbach & Nokes 2013). Οι συνθήκες του πειράματος που μεγιστοποίησε την παραγωγή της γλυκόζης είναι: τελική ποσότητα βιομάζας με τιμή 14% w/v και σύγχρονη προσθήκη ενζύμου 20 FPU/g βιομάζας, σε διαστήματα τροφοδοσίας 6 ωρών. Η μέγιστη συγκέντρωση της παραγόμενης γλυκόζης είναι 45,5 g/l σε διάρκεια ενζυμικής υδρόλυσης 48 h. Η κινητική της αντίδρασης περιγράφεται στο Σχήμα Οι Rosgaard et al. (2007) αναφέρουν διεργασία ενζυμικής υδρόλυσης, με υψηλή συγκέντρωση σακχάρων σε ημισυνεχείς συνθήκες τροφοδοσίας, με τελική τιμή περιεκτικότητας βιομάζας 15% και τιμή παραγόμενης γλυκόζης 62 g/l. Επιπρόσθετα, η απόδοση της γλυκόζης της παρούσας μελέτης είναι 81,54 % ήδη στις 30 ώρες για συγκέντρωση γλυκόζης 34,98 g/l, τιμή επίσης σημαντικά υψηλή και η τιμή της απόδοσης που αντιστοιχεί στα 45,5 g/l είναι 67,87%. Επίσης, η παραγωγικότητα του σταδίου παρουσιάζει υψηλές τιμές όπως απεικονίζεται στο Σχήμα Συγκεκριμένα, η παραγωγικότητα της γλυκόζης διατηρείται σταθερή για μεγάλο διάστημα και η τιμή της είναι 1,5 (g/(l h)). Η συγκέντρωση της γλυκόζης της παρούσας διατριβής σε συνδυασμό με την υψηλή τιμή παραγωγικότητας αποτελεί σημαντική περιεκτικότητα του υδρολύματος για την περαιτέρω χρήση του στο στάδιο της ζύμωσης χωρίς σημαντικές απαιτήσεις για συμπύκνωση του προϊόντος -160-

181 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Συγκέντρωση Γλυκόζης (g/l) Χρόνος (h) Σχήμα Συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) για πολιτική ημι-συνεχούς τροφοδοσίας βιομάζας μέχρι την τελική τιμή 14% w/v, ενζύμου 20 FPU/g βιομάζας, κάθε 6 ώρες. 3.0 Παραγωγικότητα Γλυκόζης (g/(l*h)) Xρόνος (h) Σχήμα Παραγωγικότητα γλυκόζης (g/(l h)) για πολιτική ημι-συνεχούς τροφοδοσίας βιομάζας μέχρι την τελική τιμή 14% w/v και ενζύμου 20 FPU/g βιομάζας, κάθε 6 ώρες

182 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Βιβλιογραφία 4 ου Κεφαλαίου Andrić, P., Meyer, A.S., Jensen, P., Dam-Johansen, K., Effect and modeling of glucose inhibition and in situ glucose removal during enzymatic hydrolysis of pretreated wheat straw. Applied Biochemistry and Biotechnology, 160(1), pp Bansal, P., Bansal, P., Hall, M., Realff, M.J., Lee, J.H., Bommarius, A.S., Modeling cellulase kinetics on lignocellulosic substrates. Biotechnology Advances, 27(6), pp Chen, M., Xia, L. & Xue, P., Enzymatic hydrolysis of corncob and ethanol production from cellulosic hydrolysate. International Biodeterioration and Biodegradation, 59(2), pp Das, S. Berke-Schlessel, D., Ji, H.F., McDonough, J., Wei, Y., Enzymatic hydrolysis of biomass with recyclable use of cellobiase enzyme immobilized in sol-gel routed mesoporous silica. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 70(1-2), pp Eriksson, T., Börjesson, J. & Tjerneld, F., Mechanism of surfactant effect in enzymatic hydrolysis of lignocellulose. Enzyme and Microbial Technology, 31, pp Ferreira, S., Duarte, A.P., Ribeiro, M.H.L., Queiroz, J., Domingues, F.C., Response surface optimization of enzymatic hydrolysis of Cistus ladanifer and Cytisus striatus for bioethanol production. Biochemical Engineering Journal, 45(3), pp Gupta, R., Sharma, K.K., Kuhad, R.C., Kinetic study of batch and fed-batch enzymatic saccharification of pretreated substrate and subsequent fermentation to ethanol. Biotechnology for Biofuels, 5(1), p.16. Hanley, T.R., High-Solid Enzymatic Hydrolysis and Fermentation of Solka Floc into Ethanol., 18, pp Haven, M.Ø. & Jørgensen, H., Adsorption of β -glucosidases in two commercial preparations onto pretreated biomass and lignin., pp Hodge, D.B., Karim, M.N., Schell, D.J., McMillan, J.D., Model-based fed-batch for highsolids enzymatic cellulose hydrolysis. Applied Biochemistry and Biotechnology, 152(1), pp

183 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Knutsen, J.S., Davis, R.H., Cellulase retention and sugar removal by membrane ultrafiltration during lignocellulosic biomass hydrolysis. Applied Biochemistry and Biotechnology, , pp Kristensen, J.B., Börjesson, J., Bruun, M.H., Tjerneld, F., Jørgensen, H., Use of surface active additives in enzymatic hydrolysis of wheat straw lignocellulose. Enzyme and Microbial Technology, 40(4), pp Lu, X.B., Zhang, Y. M., Yang, J., Liang, Y., Enzymatic Hydrolysis of Corn Stover after Pretreatment with Dilute Sulfuric Acid. Chemical Engineering & Technology, 30(7), pp Merino, S.T. & Cherry, J., Progress and challenges in enzyme development for biomass utilization. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 108(June), pp Modenbach, A. & Nokes, S.E., Enzymatic hydrolysis of biomass at high-solids loadings - A review. Biomass and Bioenergy, 56, pp Mussatto, S.I., Fernandes, M., Milagres, A.M.F., Roberto, I.C., Effect of hemicellulose and lignin on enzymatic hydrolysis of cellulose from brewer s spent grain. Enzyme and Microbial Technology, 43(2), pp Qi, B., Chen, X., Su, Y., Wan, Y., Enzyme adsorption and recycling during hydrolysis of wheat straw lignocellulose. Bioresource Technology, 102(3), pp Rosgaard, L., Andric, P., Dam-Johansen, K., Pedersen, S., Meyer, A.S., Effects of Substrate Loading on Enzymatic Hydrolysis and Viscosity of Pretreated Barley Straw. Applied Biochemistry and Biotechnology, 143(1), pp Ruangmee, A. & Sangwichien, C., Response surface optimization of enzymatic hydrolysis of narrow-leaf cattail for bioethanol production. Energy Conversion and Management, 73, pp Rudolf, A., Alkasrawi, M., Zacchi, G., Lidén, G., A comparison between batch and fedbatch simultaneous saccharification and fermentation of steam pretreated spruce. Enzyme and Microbial Technology, 37(2), pp Seo, D.-J., Fujita, H. & Sakoda, A., Effects of a non-ionic surfactant, Tween 20, on adsorption/desorption of saccharification enzymes onto/from lignocelluloses and saccharification rate. Adsorption, 17(5), pp

184 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Silverstein, R.A., Chen, Y., Sharma-Shivappa, R.R., Boyette, M.D., Osborne, J., A comparison of chemical pre-treatment methods for improving saccharification of cotton stalks. Bioresource Technology, 98, Sipos, B., Szilágyi, M., Sebestyén, Z., Perazzini, R., Dienes, D., Jakab, E., Crestini, C., Réczey, K., Mechanism of the positive effect of poly(ethylene glycol) addition in enzymatic hydrolysis of steam pretreated lignocelluloses. Comptes Rendus - Biologies, 334(11), pp Tu, M., Chandra, R.P., Saddler, J.N., Recycling Cellulases during the Hydrolysis of Steam Exploded Ethanol Pretreated Lodgepole Pine. Biotechnology progress, 23, pp Varga, E., Klinke, H.B., Réczey, K., Thomsen, A.B., High solid simultaneous saccharification and fermentation of wet oxidized corn stover to ethanol. Biotechnology and Bioengineering, 88, pp Xu, Z., Wang, Q., Jiang, Z., Yang, X., Ji, Y., Enzymatic hydrolysis of pretreated soybean straw. Biomass and Bioenergy, 31(2-3), pp Yang, G. & Ding Y., Recent advances in biocatalyst discovery, development and applications. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 22(20), pp Yang, M., Zhang, A., Liu, B., Li, W., Xing, J., Improvement of cellulose conversion caused by the protection of Tween-80 on the adsorbed cellulase. Biochemical Engineering Journal, 56(3), pp Yang, S., Ding, W. & Chen, H., Enzymatic hydrolysis of corn stalk in a hollow fiber ultrafiltration membrane reactor. Biomass and Bioenergy, 33(2), pp Available at: [Accessed December 9, 2014]. Yang, Y., Sharma-Shivappa, R.R., Burns, J.C., Cheng, J., Saccharification and fermentation of dilute-acid-pretreated freeze-dried switchgrass. Energy and Fuels, 23(11), pp Yang, B., Wyman, C.E., BSA treatment to enhance enzymatic hydrolysis of cellulose in lignin containing substrates. Biotechnology and Bioengineering, 94(4), pp

185 Κεφάλαιο 4 Ενζυμική Υδρόλυση Zhang, Y., Zhang, Y. & Tang, L., Effect of PEG4000 on cellulase catalysis in the lignocellulose saccharification processes. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 86(1), pp Zheng, Y., Pan, Z., Zhang, R., Wang, D., Enzymatic saccharification of dilute acid pretreated saline crops for fermentable sugar production. Applied Energy, 86(11), pp Παππάς, Ι.Α., Αξιολόγηση παραγωγικού δυναμικού λιβαδικών φυτών και αξιοποίησή τους για παραγωγή βιοενέργειας. Διδακτορική Διατριβή. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ). Σχολή Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος. DOI /eadd/

186 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae 5.1 Εισαγωγή στη Ζύμωση Γενική Περιγραφή Η ζύμωση αποτελεί μια διεργασία για την παραγωγή ενέργειας από τον μικροοργανισμό μέσω κατανάλωσης οργανικών ενώσεων όπως είναι οι υδατάνθρακες, προς παραγωγή προϊόντων όπως είναι τα οργανικά οξέα και οι αλκοόλες μέσω της ανάπτυξης της καλλιέργειας του μικροοργανισμού. Η ζύμωση πιο συγκεκριμένα μπορεί να αναφέρεται στη μετατροπή ενός σακχάρου σε αλκοόλη από τους ζυμομύκητες ή στη μετατροπή ενός σακχάρου σε οργανικά οξέα όπως το γαλακτικό οξύ ή σε αέρια, από τα βακτήρια. Επιπλέον, ο όρος ζύμωση αναφέρεται γενικότερα στις αντιδράσεις που πραγματοποιούνται στο εσωτερικό των βιοαντιδραστήρων και έχουν ως στόχο την παραγωγή κάποιου χημικού προϊόντος μέσω της ανάπτυξης συγκεκριμένου μικροοργανισμού σε καθορισμένο θρεπτικό μέσο και χρησιμοποιείται ευρέως ως όρος της βιοτεχνολογίας. Η ζύμωση λαμβάνει χώρα όταν, κατά την έλλειψη οξυγόνου, αποτελέσει τη βασική οδό παραγωγής τριφωσφορικής -166-

187 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae αδενοσίνης (ΑTP) για το κύτταρο. Μετατρέπει το νικοτιναμίδο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο, δότη ηλεκτρονίων (NADH) και το πυροσταφυλικό οξύ που παράγονται κατά τη γλυκόλυση σε νικοτιναμίδο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο, δέκτη ηλεκτρονίων (NAD+) και διάφορα άλλα μικρότερα μόρια ανάλογα με τον τύπο της ζύμωσης. Παρουσία O2, το NADH και το πυροσταφυλικό οξύ χρησιμοποιούνται για την παραγωγή ΑΤP κατά τη διαδικασία της αναπνοής. Οι μικροοργανισμοί που πραγματοποιούν τη ζύμωση είναι οι διαδεδομένοι ζυμομύκητες ή σακχαρομύκητες. Οι ζυμοκύκητες είναι σχετικά μικροί (5-10 μm) μονοκύτταροι οργανισμοί και αναφορικά με τα μορφολογικά τους χαρακτηριστικά είναι σφαιρικοί (Σχήμα 5.1). Αναπαράγονται με τη μέθοδο της εκβλάστησης (budding), σχηματίζοντας τα χαρακτηριστικά συσσωματώματα που εμφανίζονται στην εικόνα του μικροσκοπίου του Σχήματος 5.1. Σπανιότερα, παρατηρείται η αναπαραγωγή ενός ζυμομύκητα με τη μέθοδο της διχοτόμησης ή αμφιγονικά με τη δημιουργία ενός ζυγώτη κατά την ένωση δύο απλοειδών κυττάρων (haploid cells), από τα οποία το κάθε ένα διαθέτει ένα σετ χρωματοσωμάτων (Madigan et al., 2005). Οι ζυμομύκητες έχουν δύο συζευκτικούς τύπους που αποτελούν τα απλοειδή κύτταρα. Τα απλοειδή κύτταρα αποτελούνται από δύο διαφορετικούς γαμέτες, ενώ η σύζευξη δύο απλοειδών κυττάρων δημιουργεί ένα διπλοειδές που αποτελείται από τέσσερεις διαφορετικούς γαμέτες. Ο πυρήνας του διπλοειδούς κυττάρου διχοτομείται πολλές φορές και έτσι δημιουργούνται τα ασκοσπόρια (ascospores). Το κάθε ασκοσπόριο γίνεται τελικά ένα καινούργιο απλοειδές κύτταρο που μπορεί να αναπαράγεται τελικά με εκβλάστηση, διχοτόμηση ή αμφιγονικά. Το κύτταρο μέσα στο οποίο βρίσκονται οι γαμέτες ονομάζεται ασκός και τα απλοειδή κύτταρα που προκύπτουν από τον ασκό ονομάζονται ασκοσπόρια. Ο πλέον δημοφιλής ζυμομύκητας είναι ο Saccharomyces cerevisiae (baker s yeast), που χρησιμοποιείται ευρέως για την παραγωγή αλκοολούχων ποτών (αναερόβια ζύμωση) ή για την παρασκευή του ψωμιού (αερόβια ζύμωση). Τα γονίδια του Saccharomyces cerevisiae είναι ρυθμιστικά γονίδια, τα οποία ρυθμίζουν την παραγωγή των ορμονών που διαμορφώνουν την κυτταρική επιφάνεια κατάλληλα ώστε να επιτραπεί η σύντηξη των κυττάρων. Από το διπλοειδές κύτταρο που δημιουργείται κατά τη σύντηξη, εκβλαστάνει ο απλός βλαστικός τύπος και ολοκληρώνεται ο κύκλος ζωής του Saccharomyces cerevisiae (Madigan et al., 2005)

188 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Σχήμα 5.1. Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου του μικροοργανισμού S. cerevisiae κατά την αναπαραγωγική του φάση. Τα στάδια ανάπτυξης ενός μικροοργανισμού απεικονίζονται σε μία καμπύλη ανάπτυξης (growth curve) που περιλαμβάνει τα τρία κοινά στάδια για όλα τα είδη των κυττάρων. Όταν ένας μικροοργανισμός εισάγεται στο θρεπτικό περιβάλλον που θα αποτελέσει το μέσο ανάπτυξης του, δεν παρουσιάζει ανάπτυξη για συγκεκριμένη χρονική περίοδο καθώς βρίσκεται στη λανθάνουσα φάση (Σχήμα 5.2). Στη συνέχεια, ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων σταδιακά αυξάνεται και ο μικροοργανισμός εισέρχεται στην εκθετική φάση ανάπτυξης όπου ο ρυθμός ανάπτυξης του είναι σταθερός και ακολουθεί την παρακάτω εξίσωση: μ=dx/dt, όπου μ είναι ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων (h -1 ), x είναι η συγκέντρωση της κυτταρικής βιομάζας (g/l) και t είναι ο χρόνος επώασης των κυττάρων (h). Όταν τα θρεπτικά συστατικά βρεθούν σε έλλειψη και αυξηθεί η συγκέντρωση των τοξικών προϊόντων, η ανάπτυξη των κυττάρων σταματάει και τα κύτταρα εισέρχονται στη στατική φάση. Σε μεγαλύτερο χρονικό διάστημα τα κύτταρα εισέρχονται στη φάση θανάτου και αρχίζει ο αριθμός τους να μειώνεται (Λιακοπούλου-Κυριακίδου, 2004). Αυτή η τυπική πορεία της ανάπτυξης ενός μικροοργανισμού παρουσιάζεται στο Σχήμα

189 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Σχήμα 5.2. Καμπύλη ανάπτυξης μικροοργανισμού. Τα στάδια που διακρίνονται είναι η λανθάνουσα φάση, η εκθετική φάση ανάπτυξης, η φάση επιβράδυνσης και η στατική φάση. Ο ρόλος της γλυκόζης στο μηχανισμό της παραγωγής ενέργειας των κυττάρων είναι καθοριστικός, καθώς η αποικοδόμηση της γλυκόζης παράγει τις απαραίτητες ενώσεις για τη λειτουργία του κυττάρου. Οι ζυμομύκητες στην οικογένεια των οποίων ανήκει ο Saccharomyces cerevisiae διαχωρίζονται σε ευαίσθητους και μη στην παρουσία της γλυκόζης. Ο Saccharomyces cerevisiae παράγει αιθανόλη σε αερόβιο περιβάλλον όταν υπάρχει περίσσεια γλυκόζης (Fiechter & Seghezzi, 1992). Ο μηχανισμός που χρησιμοποιεί ο Saccharomyces cerevisiae για την παραγωγή βιοαιθανόλης μέσω αερόβιων συνθηκών συνδέεται με την αντίδραση «υπερχείλισης» (glucose superflow) της γλυκολιτικής μεταβολικής οδού (respiratory metabolism) κατά την υπέρβαση της αναπνευστικής ικανότητας των κυττάρων που είναι περιορισμένη (limited respiratory capacity) (Σχήμα 5.3). Η παρουσία της γλυκόζης στο υπόστρωμα πάνω από το σημείο κορεσμού, υπερβαίνει τη χρήση της στην αναπνευστική οδό (respiratory bottleneck) και ενεργοποιεί την παραγωγή αιθανόλης η οποία απελευθερώνεται στο μέσο της καλλιέργειας. Επομένως η γλυκόζη σε -169-

190 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae αερόβιες συνθήκες κάτω από μία κρίσιμη τιμή μεταβολίζεται αναπνευστικά (respiratevily metabolized). Η γλυκόλυση της γλυκόζης παράγει πυροσταφυλικό οξύ και δύο μόρια ATP ανά μόριο γλυκόζης. Το πυροσταφυλικό οξύ οξειδώνεται στη συνέχεια σε διοξείδιο του άνθρακα και νερό μέσω του κύκλου του κιτρικού οξέος και της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Αυτή η μεταβολική οδός παράγει σημαντική ποσότητα ενέργειας για τον μικροοργανισμό, συγκεκριμένα, μόρια ATP ανά μόριο γλυκόζης. Σχήμα 5.3. Σχηματική απεικόνιση του μεταβολισμού της γλυκόζης στον σακχαρομύκητα S. cerevisiae. Παρατηρούνται τρία βασικά στοιχεία της κινητικής του κυττάρου: ο περιορισμός της αναπνοής (αερόβια παραγωγή αιθανόλης), η αποθήκευση των συνολικών υδατανθράκων στο εσωτερικό του κυττάρου και τα λοιπά συστατικά της κυτταρικής βιομάζας (Fiechter & Seghezzi, 1992) -170-

191 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Ο σακχαρομύκητας έχει τη δυνατότητα να μεταβολίζει τη γλυκόζη οξειδωτικά και αναγωγικά ανάλογα με τις συνθήκες της ανάπτυξης του. Ο οξειδωτικός μεταβολισμός πραγματοποιείται μέχρι μία συγκεκριμένη τιμή ροής γλυκόζης, η οποία μόλις ξεπεραστεί ξεκινάει ο αναγωγικός μεταβολισμός της γλυκόζης που παράγει αιθανόλη και την εκκρίνει στο μέσο. Αυτή η μεταβολική οδός συνδέεται με μία αντίδραση υπερχείλισης που οφείλεται στην περιορισμένη αναπνευστική ικανότητα των κυττάρων. Η αντίδραση υπερχείλισης είναι η πρώτη απόκριση των κυττάρων στην περίσσεια γλυκόζης. Ακολουθεί μία πιο αργή απόκριση στο φαινόμενο, η καταστολή καταβολιτών όπου επέρχεται μείωση της ενζυμικής δραστικότητας των ενζύμων που συμμετέχουν στον κύκλο του τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA cycle) και στην αναπνευστική αλυσίδα. Ο αναγωγικός μεταβολισμός της γλυκόζης που οδηγεί στην παραγωγή αιθανόλης ανταγωνίζεται την κυτταρική ανάπτυξη λόγω περιορισμού της δράσης ετερόλογων πρωτεϊνών. Η ρύθμιση του μεταβολισμού της γλυκόζης αποτελεί σημαντικό σημείο στο σχεδιασμό της καλλιέργειας του σακχαρομύκητα για μεγάλη παραγωγή αιθανόλης σε αερόβιες συνθήκες (Fiechter, 1992). Η αυξημένη ροή της γλυκόζης διατηρεί τα κύτταρα σε καταστολή οπότε καταλήγει η καλλιέργεια σε χαμηλές τιμές κυτταρικής βιομάζας και με αυτό τον τρόπο η πλειοψηφία της ενέργειας χρησιμοποιείται στην παραγωγή του προϊόντος Επίδραση διαφορετικών παραμέτρων στη Ζύμωση Η ανάπτυξη του μικροοργανισμού είναι ένα συνδυαστικό αποτέλεσμα στη διαμόρφωση του οποίου συμμετέχουν διαφορετικοί παράγοντες ανάλογα με το είδος του μικροοργανισμού. Ο αερισμός των μικροβιακών καλλιεργειών είναι βασική παράμετρος που επηρεάζει την ανάπτυξη του μικροοργανισμού σε υγρό υπόστρωμα. Καθώς ο αερισμός συνδέεται με την ανάμειξη της καλλιέργειας, η ανάπτυξη σε κωνικές φιάλες πραγματοποιείται υπό ανάδευση και οι καλλιέργειες σε επίπεδο βιοαντιδραστήρα περιέχουν αναδευτήρα. Η ανάδευση επιτρέπει στον αερόβιο μικροοργανισμό να αναπτύσσεται σε υψηλή κυτταρική πυκνότητα παραμένοντας σε ομοιογενές περιβάλλον (Pirt, 1975). Η ομοιογένεια αφορά τις χημικές και φυσικές συνθήκες, τη διασπορά της βιομάζας, της θερμότητας, του αερισμού καθώς και της τροφοδοσίας εάν υπάρχει

192 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Επιπρόσθετα, πολύ σημαντικό μερίδιο συμμετοχής καταλαμβάνει το θρεπτικό μέσο στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού και στη μεταβολική οδό που θα ακολουθήσει. Τα θρεπτικά συστατικά που είναι απαραίτητα στη ζύμωση κατηγοριοποιούνται σε ομάδες: (α) κύρια στοιχειακά συστατικά που είναι ο άνθρακας, το άζωτο, το υδρογόνο και το οξυγόνο, (β) δευτερεύοντα στοιχειακά συστατικά όπως ο φώσφορος, το κάλιο, το μαγνήσιο, (γ) βιταμίνες και (δ) ιχνοστοιχεία όπως κάποια μέταλλα (Λιακοπούλου-Κυριακίδου, 2004). Το άζωτο βρίσκεται διαθέσιμο σε οργανικά και ανόργανα συστατικά και είναι σημαντικό καθώς μεταβολίζεται από τον μικροοργανισμό για την παραγωγή πρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων και πολυμερών του κυτταρικού τοιχώματος. Το ενδοκυττάριο άζωτο των μυκήτων αποτελεί το 10% της ξηρής βιομάζας. Το πρωτεϊνικό περιεχόμενο των κυττάρων μειώνεται σε περιβάλλον έλλειψης αζώτου περισσότερο από ότι σε περιβάλλον έλλειψης άνθρακα. Συγκεκριμένα κατά την έλλειψη πηγής άνθρακα ο μικροοργανισμός δημιουργεί αποθήκες ενέργειας όπως το γλυκογόνο στη βιομάζα (Light, 1972). Η επίδραση των ιόντων υδρογόνου στις βιολογικές δραστηριότητες του μικροοργανισμού είναι βασικής σημασίας για την καλλιέργεια για αυτό το λόγο το ph του μέσου ρυθμίζεται με εξωτερικά διαλύματα οξέος/βάσης είτε με ρυθμιστικό διάλυμα στο θρεπτικό μέσο. Πολλές φυσικές ζυμώσεις πάνω σε σάκχαρα εξαρτώνται από το ph αλλάζοντας το τελικό προϊόν. Συγκεκριμένα οι σακχαρομύκητες σε περισσότερο όξινο περιβάλλον παράγουν αιθανόλη ενώ όταν το ph γίνεται περισσότερο βασικό εμφανίζονται παραπροϊόντα, τα οποία είναι η γλυκερόλη και το οξικό οξύ (Pirt, 1975) Ημισυνεχείς συνθήκες τροφοδοσίας Όπως προαναφέρθηκε, η στασιμότητα της ανάπτυξης μιας ασυνεχούς καλλιέργειας πιθανόν να οφείλεται στην εξάντληση των θρεπτικών συστατικών ή στην υπερσυγκέντρωση του προϊόντος που δημιουργεί τοξικές συνθήκες. Δεδομένου, ότι ο σχεδιασμός της καλλιέργειας έχει γίνει με κατάλληλο θρεπτικό μέσο τέτοιο ώστε όταν εξαντλούνται τα θρεπτικά συστατικά να σταματάει η ανάπτυξη του μικροοργανισμού, συμπεραίνεται ότι η προσθήκη φρέσκου θρεπτικού μέσου στο δοχείο καλλιέργειας θα συντηρούσε την ανάπτυξη των κυττάρων

193 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Η ημισυνεχής καλλιέργεια εφαρμόστηκε πρώτη φορά σε βιομηχανικό επίπεδο για την παραγωγή του ζυμομύκητα baker s yeast (Reed, & Nagodawithana, 1990). Πρόκειται για τις αρχές του 1915 όπου παρατηρήθηκε πως η προσθήκη περίσσειας βύνης κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας προκάλεσε αύξηση στο ρυθμό παραγωγής βιομάζας και ο αερισμός της καλλιέργειας δεν ήταν ικανοποιητικός. Οι παραπάνω συνθήκες οδήγησαν στη δημιουργία αναερόβιου περιβάλλοντος και στο σχηματισμό αιθανόλης εις βάρος της παραγωγής βιομάζας. Η λύση που εφαρμόστηκε ήταν η ανάπτυξη του σακχαρομύκητα αρχικά σε ασθενέστερο μέσο και η προσθήκη θρεπτικών σε ρυθμό χαμηλότερο από τη δυνατότητα του οργανισμού να καταναλώνει. Επομένως, ο συσχετισμός υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης με τον περιορισμό της αναπνευστικής ικανότητας του μικροοργανισμού προσανατολίζει τις μονάδες που στοχεύουν σε υψηλή παραγωγή βιομάζας να εφαρμόζουν σταθερό έλεγχο της τροφοδοσίας των θρεπτικών υδατανθράκων. Συγκεκριμένα, σημείο ελέγχου αποτελεί η παρουσία αιθανόλης στα προϊόντα και κινητοποιεί αλλαγή στο ρυθμό τροφοδοσίας σε χαμηλότερες τιμές (Stanbury & Whitaker, 1984). Συνεπώς, όταν ο στόχος της παραγωγής είναι η αιθανόλη, θα πρέπει να μελετηθεί με ποιο τρόπο η τροφοδοσία μεγιστοποιεί την παραγωγή αιθανόλης χωρίς να υπάρχει ανταγωνισμός με την παραγωγή βιομάζας. Η ζύμωση υπό ημισυνεχείς συνθήκες (fed-batch) παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα συγκριτικά με τη ζύμωση διαλείποντος έργου (batch). Συγκεκριμένα, υποστηρίζεται (Lima- Costa et al., 2012) ότι επιμηκύνει την εκθετική φάση ανάπτυξης των κυττάρων μειώνοντας την πιθανότητα περιοριστικών επιδράσεων προερχόμενων από την υπερσυγκέντρωση του θρεπτικού μέσου. Χρησιμοποιείται για διάφορες εφαρμογές στη βιοτεχνολογία όπως για παράδειγμα στην παραγωγή πενικιλίνης ή στην παραγωγή μαγιάς, ως αποτελεσματική μέθοδος για να ξεπεραστεί το πρόβλημα της παρεμπόδισης της υπερσυγκέντρωσης του θρεπτικού υποστρώματος κατά την έναρξη της ζύμωσης (Gomes et al., 2012). Συνήθως, η συγκέντρωση αρχικών σακχάρων στο θρεπτικό μέσο πάνω από 20% (w/v) δεν έχει βιομηχανική εφαρμογή διότι προκαλεί καθυστέρηση στην ανάπτυξη των κυττάρων και τελικά οριστικό τέλος της καλλιέργειας (Alfenore et al., 2003). Πολλοί είναι αυτοί που έχουν αναφερθεί επίσης στη θετική επίδραση των υπολοίπων θρεπτικών συστατικών στην ανάπτυξη των κυττάρων, όπως επίσης στην προστασία τους και στη βιωσιμότητα τους που ενισχύει κατ επέκταση την παραγωγή αιθανόλης (Dombek & Ingram, 1986, Alfenore et al., -173-

194 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae 2003). Επομένως, αλλάζοντας τις συνθήκες της ζύμωσης του S. cerevisiae από ασυνεχείς σε ημισυνεχείς καθώς αλλάζοντας και την πολιτική τροφοδοσίας των σακχάρων και των υπολοίπων θρεπτικών συστατικών, έχει παρατηρηθεί αύξηση της παραγωγής αιθανόλης σε συγκέντρωση μέχρι 85 g/l σε 125 h (Panchal & Stewart, 1981). Η πολιτική τροφοδοσίας που εφαρμόζεται είναι καθοριστικής σημασίας καθώς η προσφορά θρεπτικού υποστρώματος και κυρίως πηγής άνθρακα (γλυκόζης) δε θα πρέπει να υπερβαίνει τις ανάγκες του μικροοργανισμού ενώ συγχρόνως δε θα πρέπει να περιορίζει την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Θέτοντας ως κύριο στόχο τη μεγιστοποίηση της παραγωγής αιθανόλης, η συγκέντρωση της γλυκόζης οφείλει να είναι υψηλή αλλά να μην ξεπερνά το όριο που παρεμποδίζει την ανάπτυξη του σακχαρομύκητα, το οποίο υπολογίζεται περίπου σε τιμή 100 g/l. Η τροφοδοσία της γλυκόζης αποτελεί συνδέεται τόσο με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού όσο και με τη συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η παρουσία της γλυκόζης προκαλεί αλλαγή της μεταβολικής τους οδού σε κάποια στελέχη του S. cerevisiae, τα οποία καταναλώνουν τη γλυκόζη οξειδοαναγωγικά. Η μεταβολική οδός επηρεάζεται τόσο από τη συγκέντρωση γλυκόζης στο θρεπτικό μέσο όσο και από τη συγκέντρωση των υπολοίπων θρεπτικών συστατικών καθώς και από την παροχή οξυγόνου (Hantelmann et al., 2006). 5.2 Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Ζύμωσης Βελτιστοποίηση του σταδίου της Ζύμωσης μέσω Ορθογώνιου Πειραματικού Σχεδιασμού Taguchi Η ζύμωση των μονομερών σακχάρων που προήλθαν από την σακχαροποίηση της κυτταρίνης είναι ο στόχος του τελευταίου σταδίου της συνολικής διεργασίας. Η χρήση του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae στοχεύει στη ζύμωση της γλυκόζης συγκεκριμένα προς παραγωγή αιθανόλης. Η πειραματική μελέτη αποσκοπεί στον εντοπισμό των βέλτιστων συνθηκών αρχικά σε ασυνεχή λειτουργία ώστε να αυξηθεί η απόδοση της παραγωγής της αιθανόλης. Η βελτιστοποίηση των συνθηκών πραγματοποιείται μέσω πειραματικού σχεδιασμού και στατιστικής ανάλυσης των αποτελεσμάτων με το στατιστικό πακέτο Minitab 17. Οι συνθήκες που επιλέχθηκαν να -174-

195 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae μελετηθούν βασίζονται σε παρατηρήσεις προκαταρκτικών πειραμάτων και είναι η περιεκτικότητα του θρεπτικού μέσου σε άζωτο, που προέρχεται από το εκχύλισμα μαγιάς (YE) και το θειικό αμμώνιο ((NH4)2SO4), ο αερισμός της καλλιέργειας, το στέλεχος του μικροοργανισμού, το ph και το μέγεθος του ενοφθαλμίσματος (Παράγραφος 5.1.2). Ο πειραματικός σχεδιασμός Taguchi επιλέχθηκε για το στάδιο αυτό καθώς με μία σύντομη σειρά πειραμάτων προσφέρει τη δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων για την σημαντικότητα των ελεγχόμενων μεταβλητών, το ποσοστό επίδρασης τους στον παράγοντα απόκρισης, τη στατιστική ασφάλεια των αποτελεσμάτων σύμφωνα με το κριτήριο του συντελεστή p (p 0,05) ώστε να θεωρηθεί στατιστικά σημαντικός ένας παράγοντας και την κανονικότητα της κατανομής. Επιπρόσθετα, ο ορθογώνιος πειραματικός σχεδιασμός Taguchi επιτρέπει την κατάστρωση εμπειρικού γραμμικού μοντέλου συσχέτισης των πέντε παραγόντων με τον παράγοντα απόκρισης, ο οποίος καθορίστηκε να είναι η απόδοση σε αιθανόλη (%) (Ranjit, 1990). Στον Πίνακα 5.1 που ακολουθεί συγκεντρώνονται οι διαφορετικοί χειρισμοί του πειραματικού σχεδιασμού (L16) με τις τιμές της κυτταρικής βιομάζας, της συγκέντρωσης αιθανόλης και της απόδοσης της αιθανόλης για τον κάθε ένα χειρισμό. Επίσης, στον Πίνακα 5.1 περιλαμβάνονται οι λόγοι του σήματος προς θόρυβο (S/N) για τον κάθε συνδυασμό παραμέτρων, καθώς αποτελεί κριτήριο αξιολόγησης, που έχει ως στόχο τη μεγιστοποίηση του εφόσον συνδέεται με την επιλογή εκείνων των παραμέτρων για το σύστημα που ελαχιστοποιούν τη διακύμανση από μη ελεγχόμενους παράγοντες. Η διασπορά των υπολειμμάτων της πειραματικής τιμής της απόδοσης της παραγωγής της αιθανόλης σε σχέση με την προσαρμοσμένη τιμή του γραμμικού μοντέλου (πειραματικό σφάλμα) παρουσιάζει συμμετρική κατανομή γύρω από την τιμή μηδέν (Σχήμα 5.4). Ο πληθυσμός παρουσιάζει κανονική κατανομή γεγονός που καθιστά το γραμμικό μοντέλο κατάλληλο σε σχέση με τα πρωτογενή δεδομένα (Κομίλης, 2006). Το τετράγωνο της γραμμικής παλινδρόμησης (R 2 ) για το γραμμικό μοντέλο είναι 94,4%. Η τιμή του επιπέδου εμπιστοσύνης ώστε να προβλέπει σωστά ένα μοντέλο, στα εύρη τιμών που ορίστηκαν κατά τον πειραματικό σχεδιασμό, είναι 95%. Οπότε το R 2 πλησιάζει στο 100% και αποτελεί πολύ καλή προσαρμογή των πειραματικών τιμών στα δεδομένα του εμπειρικού γραμμικού μοντέλου. Η κατανομή των πειραματικών αποτελεσμάτων σε σχέση με τις τιμές που προβλέπει το γραμμικό μοντέλο συσχέτισης παρουσιάζεται στο Σχήμα 5.5, όπου -175-

196 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae διακρίνεται η ικανοποιητική απόκλιση των πειραματικών από τις θεωρητικές τιμές. Παρακάτω, στο Σχήμα 5.6, παρουσιάζεται ραβδόγραμμα των συντελεστών του γραμμικού μοντέλου με αναφορά το συντελεστή της σταθεράς. Η ανάλυση διακύμανσης που ακολουθεί την εξαγωγή του γραμμικού μοντέλου κρίνει τη σημαντικότητα της κάθε παραμέτρου σε σχέση με τη διαμόρφωση του γραμμικού πειράματος. Ο συντελεστής p (p-factor) για τη συγκέντρωση του περιεχόμενου αζώτου στο θρεπτικό μέσο ισούται με 0,001, τιμή σημαντικά ασφαλή για τη συμμετοχή της παραμέτρου στο μοντέλο. Αντίστοιχα στατιστικά ασφαλής είναι η παράμετρος του ph (p=0,021) και οριακά ασφαλής η παράμετρος του στελέχους (p=0,08). O αερισμός και το ενοφθάλμισμα έχουν υψηλές τιμές p. Επιπρόσθετα, η συνεισφορά της κάθε παραμέτρου στο εμπειρικό μοντέλο απεικονίζεται στο Σχήμα 5.7. Το άζωτο αποτελεί το σημαντικότερο παράγοντα (78,35% ποσοστό συνεισφοράς) στη διαμόρφωση του αποτελέσματος. Ακολουθεί το ph (9,1%), το στέλεχος (4,15%) ο αερισμός (2,21%) και το ενοφθάλμισμα (0,58%)

197 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Σχήμα 5.4. Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi της ζύμωσης υπό ασυνεχείς συνθήκες. 100 Πειραματικές τιμές Γραμμικό μοντέλο Πειραματικές τιμές Απόδοσης Αιθανόλης (%)) Τιμές πρόβλεψης Απόδοσης Αιθανόλης (%)) Σχήμα 5.5. Σχηματική απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ζύμωσης υπό ασυνεχείς συνθήκες

198 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae 10 5 Συντελεστής Παραμέτρων ,56 Συντελεστής Σταθεράς -15 0,28 0,37 0,56 1,12 0,3 0,38 0,5 0,6 0,5 4 DSM T II Άζωτο Αερισμός Ενοφθάλ. Στέλεχος ph Σχήμα 5.6. Ραβδόγραμμα σχηματικής απεικόνισης των συντελεστών της κάθε παραμέτρου του γραμμικού μοντέλου για τη συσχέτιση της απόδοσης σε αιθανόλη με τους παράγοντες της ζύμωσης υπό ασυνεχείς συνθήκες του S. cerevisiae. Σχήμα 5.7. Συνεισφορά των πέντε παραγόντων στο γραμμικό μοντέλο της απόδοσης της αιθανόλης σύμφωνα με την Ανάλυση Διακύμανσης για το στάδιο της ζύμωσης του Saccharomyces cerevisiae

199 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae A.A. Πίνακας 5.1. Ορθογώνιος Πειραματικός Σχεδιασμός Taguchi πέντε παραγόντων σε μικτά επίπεδα με τα πειραματικά αποτελέσματα Άζωτο (g/l N + ) Συντελεστής αερισμού, Ko για την κυτταρική βιομάζα, τη συγκέντρωση και την απόδοση της αιθανόλης. Ενοφθάλμισμα (OD600) Στέλεχος ph Κυτταρική Βιομάζα (g/l) Αιθανόλη (g/l) Απόδοση Αιθανόλης (%) 1 1,12 0,3 0,5 DSM 6,5 5,57 8,1±0,61 79,45 38,00 2 1,12 0,375 0,5 DSM 6,5 5,32 7,65±0, ,50 3 1,12 0,5 4 TYPEII 5,5 5,55 8,2±0,74 83,64 38,45 4 1,12 0,6 4 TYPEII 5,5 5,65 8,75±0,63 85,8 38,67 5 0,56 0,3 0,5 TYPEII 5,5 3,99 10,51±0,41 98,1 39,83 6 0,56 0,375 0,5 TYPEII 5,5 3,36 9,7±0,39 95,1 39,56 7 0,56 0,5 4 DSM 6,5 5,8 8,2±0,90 80,4 38,10 8 0,56 0,6 4 DSM 6,5 5,86 8,75±0,81 88,94 38,98 9 0,368 0,3 4 DSM 5,5 5,96 8,67±0,41 85,3 38, ,368 0,375 4 DSM 5,5 5,96 8,9±0, , ,368 0,5 0,5 TYPEII 6,5 4,7 10,05±0,62 88,04 38, ,368 0,6 0,5 TYPEII 6,5 3,87 9,84±0,56 83,9 38, ,28 0,3 4 TYPEII 6,5 4,25 7,28±0,74 71,4 37,07 Λόγος S/N -179-

200 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae A.A. Άζωτο (g/l N + ) Συντελεστής αερισμού, Ko Ενοφθάλμισμα (OD600) Στέλεχος ph Κυτταρική Βιομάζα (g/l) Αιθανόλη (g/l) Απόδοση Αιθανόλης (%) 14 0,28 0,375 4 TYPEII 6,5 4,63 6,34±0,82 62,16 35, ,28 0,5 0,5 DSM 5,5 4,2 6,7±0,39 68,34 36, ,28 0,6 0,5 DSM 5,5 4,07 6,9±0,28 70,4 36,95 Λόγος S/N -180-

201 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Στη συνέχεια, πραγματοποιείται αξιολόγηση των παραμέτρων σχετικά με την επίδραση τους στη μεγιστοποίηση των κριτηρίων που θέτει ο ορθογώνιος σχεδιασμός Taguchi. Αναφορικά με τη μεγιστοποίηση της απόδοσης σε αιθανόλη, τα αποτελέσματα της αξιολόγησης περιγράφονται στον Πίνακα 5.2. Η συγκέντρωση του αζώτου έχει την υψηλότερη κατάταξη σύμφωνα με το συντελεστή Δέλτα που υπολογίζεται από το λογισμικό Minitab 17 σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό. Παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρείται κατά την αξιολόγηση βάσει του κριτηρίου S/N όπου η περιεκτικότητα του αζώτου είναι ο πρώτος παράγοντας στην κατάταξη και βρίσκεται σε συμφωνία με την αξιολόγηση βάσει της συνεισφοράς των παραγόντων στο γραμμικό μοντέλο. Παρόμοια συμπεράσματα καταγράφονται και στη βιβλιογραφία (Malherbe et al., 2004). Όπως απεικονίζεται στον Πίνακα 5.2, η αξιολόγηση των κριτηρίων ταυτίζεται στο σημαντικότερο (συγκέντρωση αζώτου), στο δεύτερο σημαντικότερο (ph) και στο λιγότερο σημαντικό παράγοντα (ενοφθάλμισμα). Οι μόνες διαφοροποιήσεις που παρατηρούνται στην επίδραση των παραγόντων στη μεγιστοποίηση των δύο κριτηρίων είναι για τους παράγοντες αερισμός και στέλεχος. Οι διαφορές της τιμής Δ που καθορίζει την κατάταξη των παραγόντων ως προς τη μεγιστοποίηση της μέσης τιμής και του λόγου S/N είναι μικρές. Επίσης, η κατάταξη σύμφωνα με τη μεγιστοποίηση της απόδοσης της αιθανόλης (Πίνακας 2) συμπίπτει με τη συνεισφορά των πέντε μελετώμενων παραγόντων στο γραμμικό μοντέλο (Σχήμα 5.7). Η διαδικασία υπολογισμού του συντελεστή δέλτα περιγράφεται στο Παράρτημα Α. Ο συντελεστής p πρέπει να είναι μικρότερος από την κρίσιμη τιμή 0,05 ώστε το αποτέλεσμα της στατιστικής ανάλυσης να είναι σημαντικό καθώς βρίσκεται μέσα στο διάστημα εμπιστοσύνης (95% διάστημα εμπιστοσύνης). Η πηγή του αζώτου και το ph της καλλιέργειας του σακχαρομύκητα βρίσκονται μέσα σε αυτά τα όρια (0,001 και 0,021 αντίστοιχα)

202 S/N Λόγος Μέση Τιμή Απόκρισης Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Πίνακας 5.2. Κατάταξη των παραμέτρων σύμφωνα με τη μεγιστοποίηση δύο διαφορετικών κριτηρίων, (α) την απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού (απόδοση αιθανόλης), (β) το λόγο Απόκρισης/Θορύβου (S/N). Επίπεδο Άζωτο (g/l) Συντελεστής αερισμού, Ko Ενοφθάλμισμα Στέλεχος ph Κριτήριο 1 36,65 38,38 38,24 37,98 38, ,74 37,98 38,09 38,35 37, ,12 38, ,16 38, Δέλτα 2,47 0,40 0,14 0,37 0,61 Κατάταξη ,08 83,56 82,29 79,60 84, ,56 80,31 80,83 83,52 83, ,64 80, ,97 82, Δέλτα 22,56 3,46 1,46 3,91 5,80 Κατάταξη

203 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Επιπρόσθετα, σύμφωνα με τα 16 πειράματα που πραγματοποιήθηκαν έγιναν διαγράμματα κύριων επιδράσεων για κάθε παράγοντα στην απόδοση του κάθε χειρισμού σε αιθανόλη (%) (Σχήμα 5.8). Τα διαγράμματα κύριων επιδράσεων εξάγουν συμπεράσματα για την επίδραση των ελεγχόμενων μεταβλητών στον παράγοντα απόκρισης, υποδεικνύοντας το συνδυασμό των βέλτιστων τιμών που μεγιστοποιούν την απόδοση σε αιθανόλη (%). Αναφορικά με την πηγή του αζώτου, η βέλτιστη τιμή είναι 0,560 g/l που αντιστοιχεί σε συγκέντρωση 3 g/l εκχύλισμα μαγιάς, το οποίο αποτελείται από άζωτο κατά 10% και συγκέντρωση 5 g/l (ΝΗ4)2SO4 με αναλογία στοιχειακού αζώτου 14/132,14. Σχετικά με τον παράγοντα αερισμού, η βέλτιστη τιμή είναι το 0,3 που αντιστοιχεί σε 150 rpm και 1:5 λόγο ωφέλιμου όγκου προς όγκο κωνικής φιάλης. Η βέλτιστη τιμή ενοφθαλμίσματος αντιστοιχεί σε αρχική οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας 0,5 μονάδες απορρόφησης στα 600 nm. Το στέλεχος του μικροοργανισμού που βελτιστοποιεί την απόδοση σε αιθανόλη είναι το Type II της Sigma Aldrich και η βέλτιστη τιμή ph είναι 5.5. Τα παραπάνω αποτελέσματα είναι σύμφωνα με τη βιβλιογραφία καθώς η πηγή αζώτου αν είναι πολύ χαμηλή δεν επιτρέπει την ανάπτυξη του σακχαρομύκητα και από την άλλη πλευρά αν είναι σε υψηλά επίπεδα ο μικροοργανισμός παρουσιάζει υψηλούς ρυθμούς ανάπτυξης με αποτέλεσμα τα θρεπτικά συστατικά να εξαντληθούν πριν παραχθεί η μέγιστη τιμή αιθανόλης (Malherbe et al., 2004). Τα αποτελέσματα φανερώνουν γενικά ότι τα κύτταρα του σακχαρομύκητα απαιτούν επαρκή ποσότητα πηγής αζώτου τόσο για την ανάπτυξη τους, όσο και για τη βιωσιμότητα του μικροοργανισμού κατά την παραγωγή αιθανόλης (Mullins & NeSmith, 1988). Η συνολική ποσότητα των 8 g/l (αθροιστικά από τις δύο διαφορετικές πηγές) θεωρείται ως η κατάλληλη περιεκτικότητα, εφόσον σε μικρότερη αρχική συγκέντρωση η οπτική πυκνότητα που επετεύχθη είναι σημαντικά μικρότερη. Αξίζει να σημειωθεί πως ανάλογα αποτελέσματα έχει και ο στατιστικός σχεδιασμός με παράμετρο μελέτης το άζωτο των Singh & Bishnoi (2012). Ακόμα, το μέγεθος του ενοφθαλμίσματος επηρεάζει την παραγωγικότητα της αιθανόλης (g/(l h)) και όχι στον ίδιο βαθμό την απόδοση της (g αιθανόλης/g γλυκόζης) διότι ο μικροοργανισμός παράγει ταχύτερα την αιθανόλη καθώς παρουσιάζει μικρότερη φάση υστέρησης. Η ταχύτητα ανάδευσης συνδέεται με τη διασπορά και τη μεταφορά μάζας του οξυγόνου στο σύνολο του όγκου του θρεπτικού μέσου. Η παρουσία οξυγόνου πρέπει να διατηρείται σε επίπεδα που επιτρέπουν την αναπνευστική καταστολή του S. cerevisiae, η -183-

204 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae οποία παρουσία κατάλληλης ποσότητας γλυκόζης και σε πλήρως αερόβιες συνθήκες, οδηγεί στην παραγωγή αιθανόλης (Barford & Hall, 1979). Ο Πίνακας 5.3 παρουσιάζει συγκεντρωτικά τα βελτιστοποιημένα αποτελέσματα του στατιστικού σχεδιασμού. Σχήμα 5.8. Κύριες επιδράσεις μελετούμενων παραγόντων: (α) αζώτου, (β) ph, (γ) συντελεστής αερισμού, ko, (δ) στέλεχος, (ε) ενοφθάλμισμα, στην απόδοση της αιθανόλης (%) για το στάδιο της ζύμωσης του S. cerevisiae. Ακολούθησε επαλήθευση των βέλτιστων συνθηκών που επιλέχθηκαν από τον πειραματικό σχεδιασμό Taguchi σε επίπεδο κωνικών φιαλών σε επωαστήρα. Η ζύμωση του σακχαρομύκητα στις συνθήκες του Πίνακα 5.3 πραγματοποιήθηκε με παράλληλη κινητική μελέτη της διεργασίας (Σχήμα 5.9). Οι μετρήσεις ελήφθησαν κάθε 2 ώρες σε διάρκεια ζύμωσης 20 ωρών και υπάρχουν αποτελέσματα τόσο για την παραγωγή της αιθανόλης (σε τιμές συγκέντρωσης), όσο και για την κατανάλωση των σακχάρων (γλυκόζης). Η κινητική μελέτη της ζύμωσης έδωσε τη δυνατότητα υπολογισμού της απόδοσης του σταδίου και της παραγωγικότητα της αιθανόλης κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας του μικροοργανισμού. Στο Σχήμα 5.9 παρατηρείται ότι η κατανάλωση των συνολικών σακχάρων συμπίπτει με τη μεγιστοποίηση της παραγωγής της αιθανόλης. Σε περίπου 8-10 ώρες, η διεργασία της ζύμωσης διαλείποντος έργου με αρχικά σάκχαρα 21 g/l και αρχική κυτταρική βιομάζα 0,

205 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae g/l έχει αποδώσει τη μέγιστη τιμή της ίση με 10,51 g/l. Το συμπέρασμα αυτό ενισχύεται από τη σχηματική απεικόνιση της παραγωγικότητας και της απόδοσης του σταδίου της ζύμωσης (Σχήμα 5.10). Η συνολική παραγωγικότητα της αιθανόλης στο σημείο της μέγιστης τιμής της αιθανόλης είναι 1,05 g/l h και η απόδοση της ζύμωσης είναι 98,13%. Πίνακας 5.3. Συνθήκες ζύμωσης όπως βελτιστοποιήθηκαν από το στατιστικό σχεδιασμό Taguchi Συνθήκες Eκχύλισμα Mαγιάς (YE) Θειικό Αμμώνιο ((NH4)2SO4) 3 g/l 5 g/l ph 5.5 Vw:Vf 1:5 Συχνότητα ανάδευσης Στέλεχος Αρχική οπτική πυκνότητα ενοφθαλμίσματος 150 rpm Type II 0,5 (σε εκθετική φάση της προκαλλιέργειας) Επιπρόσθετα, στο Σχήμα 5.9 παρατηρείται ότι ο μικροοργανισμός εφόσον διαθέτει θρεπτικά συστατικά συνεχίζει να αναπτύσσεται για χρονικό διάστημα παρατεταμένο σε σχέση με το χρόνο παραγωγής της αιθανόλης. Συγκεκριμένα, όταν ο σακχαρομύκητας καταναλώσει τα διαθέσιμα σάκχαρα που διαθέτει ως πηγή άνθρακα, λαμβάνει την ποσότητα άνθρακα που χρειάζεται από την αιθανόλη. Επομένως, σε συγκεκριμένο χρονικό σημείο η αιθανόλη από προϊόν του μεταβολισμού γίνεται θρεπτικό συστατικό. Η παρατήρηση αυτή έχει γίνει και από τους Biener et al. (2012)

206 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae 20 Συγκέντρωση Γλυκόζης, Αιθανόλης (g/l) Συγκέντρωση Γλυκόζης Συγκέντρωση Αιθανόλης Κυτταρική Βιομάζα 1 0,1 Κυτταρική Βιομάζα (g/l) Χρόνος (h) Σχήμα 5.9. Συγκέντρωση Αιθανόλης, Καταναλισκόμενων Σακχάρων και Κυτταρικής Βιομάζας κατά την καλλιέργεια του S. cerevisiae σε θρεπτικό μέσο με βελτιστοποιημένες συνθήκες. Σχήμα Απόδοση (%) της αιθανόλης σε σχέση με τη θεωρητική τιμή και Συνολική Παραγωγικότητα (g/l h) αιθανόλης σε σχέση με το χρόνο της καλλιέργειας S. cerevisiae σε θρεπτικό μέσο με βελτιστοποιημένες συνθήκες

207 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Ζύμωση του Saccharomyces cerevisiae υπό ημι-συνεχείς συνθήκες Μετά την μελέτη για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών της ασυνεχούς ζύμωσης, που επετεύχθη 98,1% απόδοση, ο στόχος είναι η βελτιστοποίηση της ζύμωσης ημισυνεχών συνθηκών. Ο στόχος της υψηλής απόδοση της ζύμωσης διαλείποντος έργου αντικαθίσταται από το στόχο για υψηλή συγκέντρωση και παραγωγικότητα αιθανόλης με την εφαρμογή ημισυνεχών συνθηκών. Η αύξηση της τελικής συγκέντρωσης της αιθανόλης, ώστε να παραχθεί πλούσιο ρεύμα εξόδου αιθανόλης για την τροφοδοσία της διεργασίας διαχωρισμού της αιθανόλης, τέθηκε ως στόχος για τη συνέχεια της πειραματικής μελέτης. Η αύξηση της συγκέντρωσης της αιθανόλης και ταυτόχρονα του ρυθμού παραγωγής της μέσω ζύμωσης υπό ημι-συνεχείς συνθήκες μελετήθηκε υπό διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας. Η λειτουργία αυτή παρουσιάζει γενικά προτερήματα σε σχέση με την ασυνεχή λειτουργία της ζύμωσης, και προτιμάται σε καλλιέργειες μεγαλύτερου όγκου. Σημαντικό πλεονέκτημα είναι η αποφυγή της συσσώρευσης γλυκόζης από την έναρξη της καλλιέργειας που θα οδηγήσει σε παρεμπόδιση του μικροοργανισμού λόγω ωσμωτικού στρες (Amillastre et al., 2012). Επιπρόσθετα, κατά την ανάκτηση της αιθανόλης όσο πυκνότερο είναι το αλκοολικό διάλυμα τόσο χαμηλότερο κόστος έχει η απόσταξη. Συγκεκριμένα, αν διπλασιαστεί η συγκέντρωση της αιθανόλης στο διάλυμα, η ενέργεια που απαιτείται και συνεπώς το συνολικό κόστος για την απόσταξη του διαλύματος μειώνεται κατά 33% (Gupta et al., 2012). Αρχικά, οι συνθήκες ημι-συνεχούς καλλιέργειας μελετήθηκαν σε επίπεδο κωνικής φιάλης συνολικού ωφέλιμου όγκου 200 ml. Η τροφοδοσία στην κωνική φιάλη πραγματοποιήθηκε σε δόσεις που αντιστοιχούν σε συγκέντρωση σακχάρων ίση με 20 g/l όπως περιεγράφηκε στην Παράγραφο Ζύμωση σε Ημι-συνεχείς συνθήκες (fed-batch). Η πρώτη δόση ξεκινάει λίγο πριν την ολοκλήρωση της ζύμωσης διαλείποντος έργου όπου καταναλώνονται όλα τα αρχικά διαθέσιμα σάκχαρα (20 g/l). Κάθε επόμενη δόση πραγματοποιείται ανάλογα με την οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας που υποδεικνύει το χρόνο διπλασιασμού του μικροοργανισμού όπως περιγράφεται στο Σχήμα

208 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Συγκέντρωση Γλυκόζης (g/l) Γλυκόζη Οπτική Πυκνότητα 1 Οπτική Πυκνότητα Χρόνος (h) Σχήμα Προφίλ τροφοδοσίας γλυκόζης για τη ζύμωση του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας σε κωνική φιάλη ως προς την οπτική πυκνότητα σε 600 nm. 20 Γλυκόζη Αιθανόλη Βιομάζα Συγκέντρωση Γλυκόζης, ) Αιθανόλης (g/l) Κυτταρική Βιομάζα (g/l) Χρόνος (h) Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας σε κωνική φιάλη

209 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Η ημι-συνεχής τροφοδοσία αύξησε τη συγκέντρωση της αιθανόλης σε 17,05 g/l όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.11 και η συγκέντρωση αυτή επιτυγχάνεται στις 27 ώρες καλλιέργειας. Αξίζει να σημειωθεί, ότι η συγκέντρωση της αιθανόλης στις ημι-συνεχείς συνθήκες αυξήθηκε σε σχέση με τις τιμές που παρατηρήθηκαν στα πειράματα διαλείποντος έργου, ενώ η παραγωγικότητα της μειώθηκε στην τιμή 0,632 g/l h και η απόδοση της αιθανόλης μειώθηκε επίσης, λόγω της υψηλής τροφοδοσίας σε σάκχαρα, στην τιμή 41,8%. Παρόλα αυτά η ημισυνεχής τροφοδοσία σε συνθήκες κωνικής φιάλης παρέχει μία αρχική ένδειξη ότι με κατάλληλη πολιτική τροφοδοσίας μπορεί να αυξηθεί η συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης χωρίς να ανακύψουν προβλήματα παρεμπόδισης, είτε από την αυξημένη πηγή άνθρακα, είτε από την υψηλότερη συγκέντρωση προϊόντος. Εφόσον η ζύμωση σε ημισυνεχείς συνθήκες τροφοδοσίας σε κωνική φιάλη, οδήγησε σε αύξηση της κυτταρικής βιομάζας που συνοδεύτηκε από αύξηση της συγκέντρωσης της αιθανόλης στο διάλυμα, οι συνθήκες αυτές μεταφέρθηκαν σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα για βελτιστοποίηση της διαδικασίας με στόχο την αύξηση της συγκέντρωσης και της παραγωγικότητας της αιθανόλης. Η εφαρμογή διαφορετικών πολιτικών τροφοδοσίας όπως αυτές περιγράφονται στην Παράγραφο Ζύμωση σε Ημι-συνεχείς συνθήκες (fedbatch) μελετήθηκε για την επίδραση τους στην παραγωγή βιομάζας και αιθανόλης (Σχήμα ). Η πρώτη πολιτική τροφοδοσίας ακολουθεί σταθερό ρυθμό τροφοδοσίας του συμπυκνωμένου θρεπτικού μέσου από την έναρξη της ζύμωσης. Η τροφοδοσία είναι σταθερή και ίση με τη μέση τιμή του ρυθμού κατανάλωσης των σακχάρων από το σακχαρομύκητα (Σχήμα 5.13). Η τιμή του ρυθμού κατανάλωσης είναι ίση με 10 (g/l)/h και υπολογίστηκε με βάση την κατανάλωση των σακχάρων των προηγούμενων πειραμάτων σε ασυνεχείς συνθήκες και είναι ανάλογες με τις τιμές της βιβλιογραφίας (Amillastre et al, 2012). Η πολιτική σταθερής τροφοδοσίας σημείωσε υψηλές τιμές κυτταρικής πυκνότητας όπως απεικονίζεται στο Σχήμα H οπτική πυκνότητα του μέσου της ζύμωσης είναι ίση με 88 σε μήκος κύματος 600 nm που αντιστοιχεί σε κυτταρική βιομάζα 30,27 g/l. Η υψηλή κυτταρική βιομάζα υποδεικνύει ότι σημαντικό τμήμα των θρεπτικών συστατικών του μέσου και της γλυκόζης χρησιμοποιήθηκε από το μικροοργανισμό για την ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Υπάρχει μία μεταβολική οδός για τον σακχαρομύκητα όπου η κυτταρική βιομάζα αυξάνεται σε μέγιστο επίπεδο ενώ η παραγωγή αιθανόλης -189-

210 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae περιορίζεται. Η μεταβολική οδός φαίνεται να συνδέεται με την ελεγχόμενη τροφοδοσία γλυκόζης σε επίπεδο κάτω από μία κρίσιμη τιμή (Fiechter & Seghezzi, 1992). Η συγκέντρωση της αιθανόλης μετρήθηκε 23,54 g/l σε 24 ώρες καλλιέργεια με 0,98 g/(l h) συνολική παραγωγικότητα. Ο μικροοργανισμός κατανάλωνε το σύνολο των τροφοδοτούμενων σακχάρων με αποτέλεσμα το υπόλοιπο της γλυκόζης στο θρεπτικό μέσο να είναι πάντα μηδενικό, μετά την ολοκλήρωση της εκθετικής φάσης ανάπτυξης του (Σχήμα 5.16). Οι παρατηρήσεις αυτές οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι ο Saccharomyces cerevisiae μετά την εκθετική φάση ανάπτυξης έχει μεγαλύτερες απαιτήσεις σε σάκχαρα ώστε ο μεταβολισμός να στραφεί στην παραγωγή αιθανόλης. Η απόδοση της αιθανόλης ως προς τα σάκχαρα που καταναλώθηκαν είναι 24,9%. Για τους παραπάνω λόγους ακολούθησε δεύτερη πολιτική τροφοδοσίας (Σχήμα 5.14). Η επόμενη πολιτική τροφοδοσίας ακολουθεί εκθετικό ρυθμό τροφοδοσίας σύμφωνα με μία κρίσιμη τιμή του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων που ακολουθεί τον τύπο: FFr(t)=FFr0 μ exp(μ t) (5.1), όπου FFr είναι ο ρυθμός τροφοδοσίας της γλυκόζης (feeding flow rate), μ είναι ο κρίσιμος ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων, στην προκειμένη ίσος με 0,23 h -1, t είναι ο χρόνος της καλλιέργειας και FFr0 είναι ένας σταθερός ρυθμός τροφοδοσίας που καθορίζεται από διαφορετικούς παράγοντες: το μέγεθος της αρχικής κυτταρικής βιομάζας (g/l), τoν αρχικό όγκο της καλλιέργειας (ml), τη συγκέντρωση της τροφοδοτούμενης γλυκόζης (g/l) και τη μέση απόδοση της βιομάζας ανά γλυκόζη (0,5). Η τροφοδοσία του αντιδραστήρα σχεδιάζεται ανάλογα ώστε η τιμή FFr0 να κυμαίνεται περίπου στην τιμή 0,005. Ανάλογες πολιτικές τροφοδοσίας εφαρμόστηκαν από τους (Cot et al., 2007) και τους (Kana, 2007). Ο ρυθμός τροφοδοσίας που προκύπτει απεικονίζεται στο Σχήμα 5.14 όπου η εκθετική παλινδρόμηση έχει υψηλή τιμή προσδιορισμού ίση με R 2 = 90,29. Η συγκεκριμένη πολιτική είχε σαν αποτέλεσμα η κατανάλωση της γλυκόζης να γίνεται με πιο αργό ρυθμό για το μεγαλύτερο χρονικό διάστημα της καλλιέργειας, όπως διακρίνεται στο Σχήμα Η τιμή της συγκέντρωσης της αιθανόλης είναι 29 g/l για 20 ώρες καλλιέργειας και η συνολική παραγωγικότητα υπολογίστηκε στην τιμή 1,45 g/(l h)

211 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Ρυθμός τροφοδοσίας (l/h) Χρόνος (h) Σχήμα Τροφοδοσία αντιδραστήρα με σταθερό ρυθμό ίσο με τη μέση τιμή του ρυθμού κατανάλωσης των σακχάρων Ρυθμός τροφοδοσίας (l/h) Χρόνος (h) Σχήμα Τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό τροφοδοσίας των σακχάρων βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,23 h -1 )

212 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae 0,8 Ρυθμός τροφοδοσίας (l/h) 0,6 0,4 0,2 0, Χρόνος (h) Σχήμα Τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό τροφοδοσίας των σακχάρων βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,35 h -1 ). Στη συνέχεια, ακολουθήθηκε μια τρίτη πολιτική τροφοδοσίας για την οποία ο ρυθμός τροφοδοσίας των σακχάρων συνδέθηκε επίσης μέσω της εκθετικής εξίσωσης (1) με τον ρυθμό ανάπτυξης (μ) των κυττάρων ώστε να μεγιστοποιηθεί η συγκέντρωση της αιθανόλης. Η κρίσιμη τιμή του ρυθμού ανάπτυξης που επιλέχθηκε ήταν 0,35 h -1, βασισμένη στη μέση τιμή του ρυθμού ανάπτυξης των πειραμάτων σε ασυνεχείς συνθήκες. Στο Σχήμα 5.15 απεικονίζεται ο ρυθμός τροφοδοσίας των σακχάρων που αυξάνεται εκθετικά. Η τροφοδοσία έγινε σε διαστήματα με αυξανόμενο ρυθμό. Η ευθεία που διέρχεται από τα σημεία είναι εκθετική με υψηλή τιμή προσδιορισμού ίση με R 2 = 91,89. Η εκθετική τροφοδοσία της τρίτης πολιτικής αύξησε σημαντικά τη συγκέντρωση της αιθανόλης στο μέσο της ζύμωσης καθώς και την παραγωγικότητα της αιθανόλης. Η συγκέντρωση της αιθανόλης καθώς και η κατανάλωση των σακχάρων παράλληλα με την κυτταρική ανάπτυξη περιλαμβάνονται στο Σχήμα Η τιμή των σακχάρων στο διάλυμα διατηρήθηκε πάνω από 2,5 g/l, ώστε να μην βρεθεί ο σακχαρομύκητας σε συνθήκες έλλειψης γλυκόζης. Το αποτέλεσμα ήταν η αιθανόλη να αυξάνεται συνεχώς σε όλη τη διάρκεια της καλλιέργειας επιτυγχάνοντας σημαντικά υψηλές τιμές συνολικής παραγωγικότητας. Η κυτταρική βιομάζα σημείωσε τη μέγιστη τιμή ξηρής κυτταρικής -192-

213 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae βιομάζας ίση με 7,9 g/l. Η τιμή αυτή είναι σχετικά χαμηλή συγκριτικά με την ποσότητα γλυκόζης που τροφοδοτήθηκε στο μέσο, γεγονός που υποδεικνύει ότι τα θρεπτικά συστατικά χρησιμοποιήθηκαν από τον μικροοργανισμό για τη μεταβολική οδό της παραγωγής αιθανόλης (Fiechter & Seghezzi, 1992). Σύμφωνα με τις βιβλιογραφικές τιμές, η τιμή 2,27 g/(l h) είναι από τα υψηλότερα επίπεδα ρυθμού παραγωγής αιθανόλης. Οι Laopaiboon et al. (2007) αναφέρουν παραγωγικότητα 1,68 g/(l h) και οι Dehkhoda et al. (2009) επίσης σημειώνουν παραγωγικότητα αιθανόλης στα ίδια επίπεδα (1,6 g/(l h)). Ακολουθούν συγκεντρωτικά αποτελέσματα για τις τρεις καλύτερες πολιτικές τροφοδοσίας στον Πίνακα 5.4, όπου η σταθερή πολιτική τροφοδοσίας χαρακτηρίζεται από υψηλές τιμές κυτταρικής βιομάζας, η εκθετική πολιτική τροφοδοσίας που βασίζεται σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων του μικροοργανισμού (μ = 0,23 h -1 ) αυξάνει τη συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης και την παραγωγικότητα της σημαντικά. Επίσης αυξάνονται οι τιμές της απόδοσης του σταδίου. Η τρίτη πολιτική τροφοδοσίας που βασίζεται σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων του μικροοργανισμού (μ = 0,35 h -1 ) αύξησε σημαντικά περισσότερο τη συγκέντρωση της αιθανόλης στο μίγμα εξόδου καθώς και την παραγωγικότητα της αιθανόλης. Η υψηλή παραγωγικότητα είναι ζητούμενο για την εφαρμογή της παρούσας διεργασίας σε μεγαλύτερη κλίμακα γιατί επιτρέπει μικρότερους χρόνους λειτουργίας για την παραγωγή της ίδιας ποσότητας αιθανόλης. Το μέγεθος των αντιδραστήρων συνδέεται με την οικονομική αποτίμηση της διεργασίας που είναι οφείλει να είναι επίσης στόχος της συνολικής ερευνητικής στόχευσης. Τέλος, παρουσιάστηκε αύξηση στην απόδοση της αιθανόλης. Τα πειραματικά αποτελέσματα που σημειώθηκαν για την τρίτη πολιτική τροφοδοσίας που καθορίζεται από μία κρίσιμη τιμή ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,35 h -1 ) είναι υψηλά σε σχέση με τη βιβλιογραφία και καθώς είναι η στρατηγική που επιτυγχάνει τη μέγιστη συγκέντρωση αιθανόλης στο συντομότερο χρόνο θα ακολουθήσει περαιτέρω βελτιστοποίηση

214 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Συγκέντρωση Γλυκόζης, Αιθανόλης (g/l) Γλυκόζη Αιθανόλη Κυτταρική Βιομάζα 10 1 Κυτταρική Βιομάζα (g/l) Χρόνος (h) 0.1 Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με τροφοδοσία αντιδραστήρα με σταθερό ρυθμό ίσο με τη μέση τιμή του ρυθμού κατανάλωσης των σακχάρων Γλυκόζη Αιθανόλη Κυτταρική Βιομάζα 10 Συγκέντρωση Γλυκόζης, Αιθανόλης (g/l) Κυτταρική Βιομάζα (g/l) Χρόνος (h) Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,23 h -1 ) του μικροοργανισμού

215 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Γλυκόζη Αιθανόλη Κυτταρική Βιομάζα 10 Συγκέντρωση Γλυκόζης, Αιθανόλης (g/l) Κυτταρική Βιομάζα (g/l) Χρόνος (h) Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά τη ζύμωση του μικροοργανισμού σε ημι-συνεχείς συνθήκες λειτουργίας με τροφοδοσία αντιδραστήρα με εκθετικό ρυθμό βασισμένο σε κρίσιμο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (μ = 0,35 h -1 ) του μικροοργανισμού. Πίνακας 5.4. Αποτελέσματα κυτταρικής βιομάζας, συγκέντρωσης αιθανόλης, παραγωγικότητας αιθανόλης και απόδοση για διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας Πολιτική Παράγοντας Προσδιορισμού του Ρυθμού Τροφοδοσίας Κυτταρική Βιομάζα (g/l) Αιθανόλη (g/l) Συν. Παραγωγικότητα g/(l h) Απόδοση Αιθανόλης (%) 1 Σταθερή 2 Εκθετική 3 Εκθετική Μέση τιμή κατανάλωσης Σακχάρων 10 (g/l)/h Ρυθμός Ανάπτυξης Κυττάρων μ = 0,23 h -1 Ρυθμός Ανάπτυξης Κυττάρων μ = 0,35 h -1 30, ,98 24,9 8, ,45 42,67 7,9 36,35 2,27 54,

216 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Αύξηση της συγκέντρωσης αιθανόλης μέσω υψηλής συγκέντρωσης αρχικής τροφοδοσίας γλυκόζης Η παραγωγικότητα της αιθανόλης σημείωσε υψηλές τιμές με την εφαρμογή ημι-συνεχούς τροφοδοσίας. Η πολιτική που εφαρμόστηκε διατηρήθηκε ώστε να επαναληφθούν οι τιμές της παραγωγικότητας ή ακόμα και να αυξηθούν. Επόμενος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η αύξηση της συγκέντρωσης της αιθανόλης με ρεύμα εξόδου πλουσιότερο του 6% v/v. Όπως έχει σημειωθεί στη βιβλιογραφία, η ανάκτηση της αιθανόλης μέσω της απόσταξης έχει χαμηλότερο κόστος όσο πυκνότερο είναι το αλκοολικό διάλυμα. Συγκεκριμένα, αν διπλασιαστεί η συγκέντρωση της αιθανόλης στο διάλυμα, η ενέργεια που απαιτείται και συνεπώς το συνολικό κόστος για την απόσταξη του διαλύματος μειώνεται κατά 33% (Gupta et al., 2012). Μετά την επιλογή της κατάλληλης στρατηγικής ζύμωσης υπό ημι-συνεχείς συνθήκες, εφαρμόστηκε διαφορετική συγκέντρωση αρχικών σακχάρων ώστε να επιτευχθεί η ίδια παραγωγικότητα σε υψηλότερες τιμές συγκέντρωσης αιθανόλης. H συγκέντρωση που επιλέχθηκε ήταν 100 g/l γλυκόζης, όπου χρησιμοποιήθηκε σαν όριο πέραν του οποίου το συστατικό προκαλεί παρεμπόδιση στον μικροοργανισμό και μείωση της παραγωγικότητας της αιθανόλης. Η αύξηση της αρχικής γλυκόζης, σε συγκέντρωση μεγαλύτερη των 100 g/l, αποφεύχθηκε βάσει των αποτελεσμάτων των (Seo et al., 2009a) που αναφέρουν μειωμένη ανάπτυξη κυττάρων και κατανάλωση σακχάρων σε καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae με περιεχόμενο υψηλότερο των 100 g/l. Η ζύμωση με εφαρμογή της εκθετικής τροφοδοσίας που βασίζεται σε κρίσιμη τιμή ρυθμού ανάπτυξης 0,35 h -1 (Πολιτική Τροφοδοσίας 3) συνδυάστηκε με υψηλή αρχική συγκέντρωση σακχάρων ίση με 100 g/l. H ανάπτυξη των κυττάρων εισέρχεται στην εκθετική φάση αργότερα από ότι η ζύμωση με χαμηλά αρχικά σάκχαρα. Προφανώς ο μικροοργανισμός χρειάζεται κάποιο χρόνο προσαρμογής στις νέες συνθήκες πλούσιου θρεπτικού μέσου σε πηγή άνθρακα. Η δεύτερη παρατήρηση είναι ότι ενώ η παραγωγή της αιθανόλης ακολουθεί την ανάπτυξη των κυττάρων, υπάρχει ένα σημείο που εμφανίζεται το φαινόμενο της μη ακολουθίας της παραγωγής αιθανόλης και κυτταρικής βιομάζας. Η πορεία της καλλιέργειας πραγματοποιείται σε δύο φάσεις, η πρώτη χαρακτηρίζεται από παράλληλη άνοδο της βιομάζας των κυττάρων και της παραγωγής της αιθανόλης ενώ στη συνέχεια τα δύο φαινόμενα αυτά διαχωρίζονται όπως φαίνεται στο Σχήμα Το φαινόμενο αυτό -196-

217 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae αναφέρθηκε από τους (Cot et al., 2007) ως ένα μεταβολικό ερέθισμα όπου τα κύτταρα εισέρχονται σε μία μεταβολική φάση κατά την οποία η κυτταρική βιομάζα παραμένει σταθερή ενώ η αιθανόλη συνεχίζει να παράγεται. Το φαινόμενο αυτό προηγείται της μίτωσης των κυττάρων και καταλήγει σε υψηλότερες αποδόσεις σε αιθανόλη. Παρατηρείται λοιπόν ότι υπάρχει περιθώριο βελτιστοποίησης του σταδίου καθώς οι τιμές που αναφέρθηκαν είναι 26,3 g/l συγκέντρωση αιθανόλης, 1,2 g/(l h) παραγωγικότητα και 39,33% απόδοση αιθανόλης. Είναι φανερό ότι η τροφοδοσία των σακχάρων μετά από ένα σημείο προκαλεί παρεμπόδιση γιατί υπερκαλύπτει τις ανάγκες του μικροοργανισμού σε σάκχαρα. Στόχος της πολιτικής τροφοδοσίας είναι ο ρυθμός τροφοδοσίας να ξεπεράσει το ρυθμό κατανάλωσης των σακχάρων, προκαλώντας συσσώρευση της γλυκόζης στο θρεπτικό μέσο. Πάνω από ένα βαθμό συσσώρευσης όμως διαπιστώνεται παρεμπόδιση της λειτουργίας του κυττάρου το οποίο δεν είναι σε θέση να αυξήσει την κυτταρική βιομάζα καθώς και να συνεχίσει την παραγωγή της αιθανόλης. Η παρατήρηση καθώς και η μη ικανοποιητική παραγωγή της αιθανόλης οδήγησε στη μελέτη της διάρκειας της βέλτιστης εκθετικής τροφοδοσίας. Στη συνέχεια, δοκιμάστηκαν διαφορετικοί αντιδραστήρες και σε κάθε επόμενη δοκιμή μειωνόταν η διάρκεια της τροφοδοσίας. Τα αποτελέσματα της σύγκρισης παρατίθενται στο Σχήμα Οι συνθήκες που εφαρμόστηκαν για τους αντιδραστήρες των πειραμάτων είναι όμοιες με διαφορά τη διάρκεια της εκθετικής τροφοδοσίας. Επίσης οι αντιδραστήρες με υψηλότερα αρχικά σάκχαρα παρουσιάζουν μία καθυστέρηση της έναρξης της εκθετικής φάσης οπότε η τροφοδοσία της γλυκόζης παρέχεται στο θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας με κάποιες ώρες διαφορά σε σχέση με τον αντιδραστήρα με 20 g/l αρχικά σάκχαρα. Κάθε τροφοδοσία μετά από ένα χρονικό όριο ακολούθησε την αντίστροφη πορεία των παλμών τροφοδοσίας γλυκόζης. Η αντίστροφη αυτή πορεία δεν παρουσιάζεται στο Σχήμα Αποτελεί συντήρηση του μικροοργανισμού. Η 1 η δοκιμή της διάρκειας της εκθετικής τροφοδοσίας, αυξάνει το ρυθμό σε υψηλές τιμές με μεγαλύτερη κλίση και τα αποτελέσματα της καλλιέργειας αναφορικά με την τιμή της αιθανόλης, της γλυκόζης και της κυτταρικής βιομάζας απεικονίζονται στο Σχήμα Στη συνέχεια, η 2 η δοκιμή πλησιάζει υψηλές τιμές παροχής γλυκόζης μέσω πιο συντηρητικών δόσεων κατά τη διάρκεια της τροφοδοσίας. Τα αποτελέσματα της καλλιέργειας απεικονίζονται στο Σχήμα Παρατηρείται εντονότερα το φαινόμενο διαχωρισμού της -197-

218 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae παραγωγής αιθανόλης από την παραγωγή βιομάζας. Ενώ η τελευταία παραμένει σταθερή η συγκέντρωση της αιθανόλης ολοένα και αυξάνεται. Επίσης, είναι φανερό ότι ο μικροοργανισμός καταναλώνει με πιο αργούς ρυθμούς τη γλυκόζης προκαλώντας υπερσυγκέντρωση της. Η παρουσία αιθανόλης προφανώς εμποδίζει το μεταβολισμό της γλυκόζης με τους ίδιους ρυθμούς. Η τρίτη δοκιμή της στρατηγικής τροφοδοσίας δεν αυξάνει τόσο τις τιμές του ρυθμού τροφοδοσίας αλλά προλαβαίνει εγκαίρως τις ανάγκες του μικροοργανισμού. Η διάρκεια της συμπίπτει με τη διάρκεια της ανάπτυξης των κυττάρων του σακχαρομύκητα. Η συγκεκριμένη πολιτική τροφοδοσίας κατέληξε σε μίγμα με το υψηλότερο περιεχόμενο αιθανόλης και χαρακτηρίστηκε ως η βέλτιστη. Η καλλιέργεια με το βέλτιστο ρυθμό τροφοδοσίας παρουσιάζεται στο Σχήμα Τελικά η τροφοδοσία σε χαμηλότερο επίπεδο για λιγότερο χρόνο αποδείχθηκε η πιο αποτελεσματική σύμφωνα με τα ποσοτικά κριτήρια της παραγωγικότητας (2,19 g/(l h), της συγκέντρωσης της αιθανόλης (59,1 g/l) και της απόδοσης (46,92%). Παρατηρείται ότι ο εκθετικός ρυθμός τροφοδοσίας, ενώ αρχικά αυξάνει την παραγωγικότητα της αιθανόλης μετά από μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή υπάρχει υπερσυγκέντρωση γλυκόζης στο θρεπτικό μέσο που οδηγεί σε παρεμπόδιση του σακχαρομύκητα και της λειτουργίας της παραγωγής αιθανόλης. Όταν ο πληθυσμός των κυττάρων σημειώσει τη μέγιστη τιμή ανάπτυξης και περάσει στη στατική φάση, οι απαιτήσεις σε πηγή άνθρακα μειώνονται και ο ρυθμός τροφοδοσίας ακολουθεί αντίστοιχα αντίστροφη πορεία και μειώνεται

219 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Συγκέντρωση Γλυκόζης, Αιθανόλης (g/l) Αιθανόλη Γλυκόζη Κυτταρική Βιομάζα Χρόνος (h) 10 1 Κυτταρική Βιομάζα (g/l) 0.1 Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae σε επίπεδο αντιδραστήρα με υψηλά αρχικά σάκχαρα και τροφοδοσία για 33 ώρες. Ρυθμός Τροφοδοσίας (l/h) 0,14 20 g/l Γλυκόζη 100 g/l Γλυκόζη-1 η δοκιμή 100 g/l Γλυκόζη-2 η δοκιμή 0, g/l Γλυκόζη-3 η δοκιμή 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0, Χρόνος (h) Σχήμα Παραλλαγές του εκθετικού ρυθμού τροφοδοσίας της γλυκόζης όπως εφαρμόστηκε σε καλλιέργεια χαμηλών (20 g/l) και υψηλών (100 g/l) αρχικών σακχάρων. Τρεις δοκιμές για διαφορετική διάρκεια και μέγιστη τιμή τροφοδοσίας γλυκόζης

220 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae H ικανοποιητική προς χαμηλή απόδοση σε αιθανόλη οφείλεται στην παρακάτω παρατήρηση. Στην καλλιέργεια με εκθετική τροφοδοσία μέχρι τις 30 ώρες και αρχικά σάκχαρα 100 g/l ότι από ένα σημείο και μετά ενώ προστίθεται γλυκόζη στο θρεπτικό μέσο, η συγκέντρωση της αιθανόλης διατηρείται σε σταθερό σχετικά επίπεδο. Η παρατήρηση αυτή πιθανά να οφείλεται σε παρεμπόδιση που προκαλείται αυτή τη φορά από το προϊόν της ζύμωσης, καθώς πλησιάζουν τα όρια ανοχής του μικροοργανισμού. Η υπερσυγκέντρωση της αιθανόλης στο μέσο της καλλιέργειας προκαλεί ωσμωτικό στρες στα κύτταρα (Maiorella et al., 1983). Η τιμή της παραγωγικότητας είναι η υψηλότερη που σημειώθηκε σε σχέση με τα συγκριτικά πειράματα για διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας και διάρκειας τροφοδοσίας. Είναι επίσης από τις υψηλές τιμές που αναφέρονται στη βιβλιογραφία (Chang et al., 2012). Η υψηλή παραγωγικότητα της στρατηγικής ζύμωσης που βελτιστοποιήθηκε, διατηρήθηκε σε υψηλές τιμές. Επίσης υπήρχε σημαντική άνοδος της γλυκερίνης στην παρούσα πολιτική τροφοδοσίας που πιθανότατα να οφείλεται στην έλλειψη ικανοποιητικής ποσότητας οξυγόνου στην καλλιέργεια κατά τη στατική φάση των κυττάρων. Παρόμοια αποτελέσματα παρατήρησαν και οι Alfenore et al. (2004). Τα κύτταρα παρουσία υψηλής συγκέντρωσης αιθανόλης παράγουν γλυκερόλη ώστε να προστατευθούν από τo υδατικό στρες που προκαλούν στο εσωτερικό των κυττάρων οι αλληλεπιδράσεις της αιθανόλης με το διαθέσιμο νερό (Hallsworth, 1998). Συγκεντρωτικά αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.5. Πίνακας 5.5. Συγκεντρωτικά Αποτελέσματα για τις τρεις δοκιμές εκθετικής τροφοδοσίας του αντιδραστήρα για διαφορετική διάρκεια και ρυθμό τροφοδοσίας. Ρυθμός Τροφοδοσίας (l/h) Μέγιστη Αιθανόλη (g/l) Παραγωγικότητα (g/(l h)) Απόδοση (%) 1 η δοκιμή 0,100 26,3 1,2 39,33 2 η δοκιμή 0,083 47,23 1,52 43,89 3 η δοκιμή 0,050 59,1 2,19 46,

221 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Συγκέντρωση Γλυκόζης, Αιθανόλης, Γλυκερίνης (g/l) Αιθανόλη Γλυκόζη Γλυκερίνη Οπτική Πυκνότητα Χρόνος (h) 1 Κυτταρική Βιομάζα (g/l) 0.1 Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae σε επίπεδο αντιδραστήρα με υψηλά αρχικά σάκχαρα και τροφοδοσία για 36 ώρες. Συγκέντρωση Γλυκόζης, Αιθανόλης, Γλυκερίνης (g/l) Χρόνος (h) Συγκέντρωση Σακχάρων Συγκέντρωση Αιθανόλης Συγκέντρωση Γλυκερίνης Κυτταρική Βιομάζα Κυτταρική Βιομάζα (g/l) Σχήμα Παραγωγή αιθανόλης κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού Saccharomyces cerevisiae σε επίπεδο αντιδραστήρα με υψηλά αρχικά σάκχαρα και τροφοδοσία για 33 ώρες που μειώνεται αντίστροφα

222 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Βιβλιογραφία 5 ου Κεφαλαίου Alfenore, S. Cameleyre, X., Benbadis, L., Bideaux, C., Uribelarrea, J.L., Goma, G., Aeration strategy: A need for very high ethanol performance in Saccharomyces cerevisiae fed-batch process. Applied Microbiology and Biotechnology, 63(5), pp Alfenore, S. Molina-Jouve, C., Guillouet, S.E., Uribelarrea, J.L., Goma, G., Benbadis, L., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process. Applied Microbiology and Biotechnology, 60(1-2), pp Amillastre, E. Aceves-Lara, C.A., Uribelarrea, J.L., Alfenore, S., Guillouet, S.E., Dynamic model of temperature impact on cell viability and major product formation during fedbatch and continuous ethanolic fermentation in Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology, 117, pp Barford, J.P. & Hall, R.J., An Examination of the Crabtree Effect in Saccharomyces cerevisiae: the Role of Respiratory Adaptation. Journal of General Microbiology, 114(2), pp Biener, R., Steinkämper, A., Horn, T., Calorimetric control of the specific growth rate during fed-batch cultures of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biotechnology, 160(3-4), pp Chang, Y.H., Chang, K.S., Huang, C.W., Hsu, C.L., Jang, H.D., Comparison of batch and fed-batch fermentations using corncob hydrolysate for bioethanol production. Fuel, 97, pp Cot, M., Loret, M.O., François, J., Benbadis, L., Physiological behaviour of Saccharomyces cerevisiae in aerated fed-batch fermentation for high level production of bioethanol. FEMS Yeast Research, 7(1), pp

223 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Dehkhoda, A., Brandberg, T., Taherzadeh, M., Comparison of vacuum and high pressure evaporated wood hydrolysate for ethanol production by repeated fed-batch using flocculating Saccharomyces cerevisiae. BioResources 4(1), pp Dombek, K.M. & Ingram, L.O., Magnesium limitation and its role in apparent toxicity of ethanol during yeast fermentation. Applied and Environmental Microbiology, 52(5), pp Fiechter, A. & Seghezzi, W., Regulation of glucose metabolism in growing yeast cells., 27, pp Gomes, N., Teixeira, J., Belo, I., Fed-batch versus batch cultures of Yarrowia lipolytica for decalactone production from methyl ricinoleate. Biotechnology Letters, 34(4), pp Gupta, R., Kumar, S., Gomes, J., Kuhad, R.C., Kinetic study of batch and fed-batch enzymatic saccharification of pretreated substrate and subsequent fermentation to ethanol. Biotechnology for Biofuels, 5(1), p.16. Hallsworth, J.E., Ethanol-induced water stress in yeast. Journal of Fermentation and Bioengineering, 85(2), pp Hantelmann, K., Kollecker, M., Hüll, D., Hitzmann, B., Scheper, T., Two-dimensional fluorescence spectroscopy: A novel approach for controlling fed-batch cultivations. Journal of Biotechnology, 121, pp Kana, G., Novel feeding strategies for Saccharomyces cerevisiae DS2155, using glucose limited exponential fed batch cultures with variable specific growth rates ( µ ). African Journal of Biotechnology, 6(9), pp Laopaiboon, L., Thanonkeo, P., Jaisil, P., Laopaiboon, P., Ethanol production from sweet sorghum juice in batch and fed-batch fermentations by Saccharomyces cerevisiae. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 23(10), pp

224 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae Light, P.A., Influence of Environment on Mitochondrial Function in Yeast. Journal of Applied Chemistry and Biotechnology, 22, pp Lima-Costa, M.E. Tavares, C., Raposo, S., Rodrigues, B., Peinado, J.M., Kinetics of sugars consumption and ethanol inhibition in carob pulp fermentation by Saccharomyces cerevisiae in batch and fedbatch cultures. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 39(5), pp Madigan, M.T., Μartinko, J.M., Parker, J., Βιολογία των Μικροοργανισμών. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο. σελ.630. Maiorella, B., Blanch, H.W. & Charles, R., By-product Inhibition Effects on Ethanolic Fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology and Bioengineering, XXV, pp Malherbe, S., Fromion, V., Hilgert, N., Sablayrolles, J.M., Modeling the Effects of Assimilable Nitrogen and Temperature on Fermentation Kinetics in Enological Conditions. Biotechnology and Bioengineering, 86(3), pp Mullins, J.T. & NeSmith, C., Nitrogen levels and yeast viability during ethanol fermentation of grain sorghum containing condensed tannins. Biomass, 16(2), pp Panchal, C.J., Stewart, G.G., Current Developments in Yeast Research, Pergamon Press. Toronto. pp. 9. Pirt, J.S., Principles of microbe and cell cultivation. John Wiley & Sons, London. pp.274. Ranjit R., A primer on the Tagychi method, Van Nostrand Reinhold, USA. pp Reed, G. & Nagodawithana, T.W., Yeast Technology. Van Nostrand Reinhold, New York. pp Seo, H.B., Kim, S.S., Lee, H.Y., Jung, K.H., High-level production of ethanol during fedbatch ethanol fermentation with a controlled aeration rate and non-sterile glucose -204-

225 Κεφάλαιο 5 Παραγωγή βιοαιθανόλης κατά την καλλιέργεια του Saccharomyces cerevisiae powder feeding of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 14(5), pp Singh, A. & Bishnoi, N.R., Optimization of ethanol production from microwave alkali pretreated rice straw using statistical experimental designs by Saccharomyces cerevisiae. Industrial Crops and Products, 37(1), pp Stanbury, P.S., Whitaker A., Principles of fermentation technology, Oxford : Pergamon. pp Kομίλης, Δ.Π., Πειραματικός Σχεδιασμός και Στατιστική Ανάλυση. Δημοκρίτειο πανεπιστήμιο Θράκης, Πολυτεχνική Σχολή, Τμήμα Μηχανικών Περιβάλλοντος, Ξάνθη. Λιακοπούλου Κυριακίδου, Μ., Βιοτεχνολογία με στοιχεία Βιοχημικής Μηχανικής. Εκδόσεις Ζήτη, Θεσσαλονίκη. σελ

226 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του Actinobacillus succinogenes 6.1 Εισαγωγή στη Ζύμωση Η παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος (SA) πραγματοποιείται από αναερόβια κατά gramαρνητικά βακτήρια ως καταβολικό προϊόν της δράσης της φωσφοενολοπυροσταφυλικής (PEP) καρβοξυκινάσης. Τα βακτήρια μεταβολίζουν τους υδρογονάνθρακες παράγοντας ένα μίγμα οργανικών οξέων. Το κύριο ενδιάμεσο προϊόν της μεταβολικής δράσης των βακτηρίων είναι το φωσφοενολικό πυροσταφυλικό οξύ. Μετατρέπεται σε πυροσταφυλικό από το οποίο προέρχονται τα προϊόντα της ζύμωσης γαλακτικό, μυρμηκικό, οξικό οξύ και αιθανόλη. Η άλλη μεταβολική οδός είναι η μετατροπή του φωσφοενολικού πυροσταφυλικού οξέος σε οξαλοξικό οξύ (ΟΑΑ) από το οποίο προκύπτουν το ηλεκτρικό οξύ και προπιονικά άλατα (der Werf et al. 1997) όπως φαίνεται στο Σχήμα 6.1. Η χημική αντίδραση της μετατροπής της γλυκόζης σε ηλεκτρικό οξύ είναι η παρακάτω: C6H12O6 + 2CO2 + 4[H] 2C4H6O4 + 2H2O (6.1) -206-

227 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Το θεωρητικό μέγιστο της απόδοσης της παραγωγής ηλεκτρικού οξέος από την γλυκόζη με βάση τη θεωρητική στοιχειομετρία της αντίδρασης είναι 1,71 mol SA ανά mol γλυκόζης (1,12 g/g) αν παραληφθούν οι ανάγκες παραγωγής της βιομάζας (van Heerden & Nicol 2013). Από τη χημική εξίσωση γίνεται φανερό ότι χωρίς την απαραίτητη ποσότητα διοξειδίου και δοτών ηλεκτρονίων η ομοζυμωτική παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος δεν είναι δυνατή. Σχήμα 6.1. Σχηματική απεικόνιση της μεταβολικής διαδρομής του σχηματισμού ηλεκτρικού οξέος από το βακτήριο Actinobacillus succinogenes. Ο μικροοργανισμός Actinobacillus succinogenes μετατρέπει το PEP μέσω της καρβοξυλίωσης σε οξαλοξικό οξύ (ΟΑΑ) με τη χρήση της PEP καρβοξυκινάσης. Στη συνέχεια, το οξαλοξικό οξύ (OAA) μετατρέπεται σε μηλεϊνικό οξύ. Ακολουθεί, η τελική σύνθεση του προϊόντος κατά τη μετατροπή του μηλεϊνικού οξέος στο ηλεκτρικό οξύ, μέσω της αναγωγικής οδού του τρικαρβοξυλικού οξέος. Η αναγωγική μεταβολική οδός ονομάζεται -207-

228 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes και C4 κατά τους Mckinlay et al. (2005). Η μεταβολική οδός, που μετατρέπει το PEP σε αιθανόλη και οξικό οξύ, ονομάζεται C3 όπως φαίνεται στο Σχήμα 6.2. Χαρακτηριστικό σημείο μελέτης του μεταβολισμού του Actinobacillus succinogenes είναι η κατανομή των τελικών προϊόντων και οι παράγοντες που την επηρεάζουν. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε από τους Guettler et al. (1999) ότι οι αλλαγές του ph παρουσιάζουν μικρή επίδραση στην κατανομή των προϊόντων του Actinobacillus succinogenes. Σχετικά με την επίδραση της συγκέντρωσης του CO2 και του H2, θεωρείται ότι εφόσον το διοξείδιο του άνθρακα καθώς και τα αναγωγικά ιόντα αποτελούν υπόστρωμα για την παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος από το φωσφοενολοπυροσταφυλικό οξύ, η αύξηση στα συστατικά αυτά θα συνδέεται με την ενίσχυση αυτής της μεταβολικής οδού. Ωστόσο, σύμφωνα με τους der Werf et al. (1997), η κατανομή μεταξύ των μεταβολικών οδών C4 και C3 για τον Actinobacillus succinogenes εξαρτάται επίσης από τη δραστικότητα των ενζύμων που μετατρέπουν τα ενδιάμεσα προϊόντα όπως το μηλεϊνικό ένζυμο και η OAA αποκαρβοξυλάση. Ακολούθως, η παροχή Η2 έχει παρατηρηθεί ότι μειώνει τη δράση των πυροσταφυλικών και/ή των μυρμηκικών δεϋδρογενασών (McKinlay et al., 2007), οπότε οδηγεί το μεταβολισμό προς τη C4 οδό. Σχήμα 6.2. Οι δύο διαφορετικές μεταβολικές οδοί για τη μετατροπή του φωσφοενολο-πυροσταφυλικού οξέος στα τελικά προϊόντα: ηλεκτρικό οξύ (C4), αιθανόλη και οξικό οξύ (C3)

229 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Επιπρόσθετα, το βακτήριο A. succinogenes δεν παρουσιάζει παρεμπόδιση από το θρεπτικό υπόστρωμα της γλυκόζης σε συγκεντρώσεις μέχρι 160 g/l (Guettler et al., 1999). Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι σε θρεπτικό μέσο με κύρια πηγή άνθρακα τα υπολείμματα της επεξεργασίας του καλαμποκιού ο A. succinogenes παρήγαγε 80 g/l άλατα ηλεκτρικού οξέος. Επίσης, το βακτήριο δεν παρουσιάζει παρεμπόδιση κατά την παρουσία υψηλής συγκέντρωσης του προϊόντος του στο θρεπτικό μέσο, το ηλεκτρικό οξύ επομένως δεν παρεμποδίζει τη δράση του βακτηρίου. Η ζύμωση πραγματοποιείται κανονικά για τιμές συγκεντρώσεων εώς και 96 g/l ηλεκτρικού δινάτριου ή 130 g/l ηλεκτρικού μαγνήσιου. Επίσης έχουν αναφερθεί (Urbance et al., 2003, Urbance et al., 2004) μελέτες για παραγωγή ηλεκτρικού οξέος σε καλλιέργεια μεγάλης κυτταρικής πυκνότητας A. succinogenes σε βιοαντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας με μεμβράνη ανακύκλωσης των κυττάρων του μικροοργανισμού. Αξίζει βέβαια να σημειωθεί ότι σε πολύ υψηλές τιμές κυτταρικής πυκνότητας, η ειδική παραγωγικότητα σε ηλεκτρικό οξύ ήταν χαμηλή. Ο μικροοργανισμός Actinobacillus succinogenes απομονώθηκε από τον προστόμαχο θηλαστικών και συγκεκριμένα βοδιού. Συνδέεται ως είδος με διάφορα παθογόνα είδη όπως είναι τα A. pleuropneumoniae, η Haemophilus influenza και η Pasteurella multocida. Το γεγονός αυτό καθιστά τη βιομηχανική εφαρμογή του συγκεκριμένου βακτηρίου δύσκολη σε μεγάλη κλίμακα. Παρόλα αυτά, δεν έχει αναφερθεί πουθενά για τον συγκεκριμένο μικροοργανισμό, η πρόκληση ασθένειας στους ανθρώπους καθώς τα γονίδια των συγγενικών του ειδών που προκαλούν ασθένειες στα κύτταρα των θηλαστικών λείπουν από τον A. succinogenes (McKinlay et al., 2010). Μια τυπική διαδικασία παραγωγής ηλεκτρικού οξέος μέσω μικροβιακής ζύμωσης περιλαμβάνει την προκαλλιέργεια των κυττάρων, τη ζύμωση και την ανάκτηση του προϊόντος, που ακολουθείται συνήθως από συμπύκνωση του και καθαρισμό. Ο διαχωρισμός από τα υπόλοιπα προϊόντα της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes, όπως είναι το οξικό, το μυρμηκικό, το γαλακτικό και το πυροσταφυλικό οξύ, που μπορεί να βρίσκονται στο τελικό διάλυμα της ζύμωσης, είναι πρωταρχικής σημασίας και επιβαρύνει σημαντικά το κόστος της παραγωγής του ηλεκτρικού οξέος (Song & Lee, 2006). Το ηλεκτρικό οξύ συνήθως βρίσκεται διαλυμένο στο μέσο της ζύμωσης σε μορφή ιονισμένων αλάτων. Τα υπόλοιπα συστατικά όπως πρωτεΐνες, αμινοξέα και υδατάνθρακες βρίσκονται μη ιονισμένα στο διάλυμα και για αυτό το λόγο, σα μέθοδος διαχωρισμού χρησιμοποιείται συχνά η -209-

230 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes ηλεκτροδιάλυση. Η ηλεκτροδιάλυση αποτελεί την πιο διαδεδομένη μέθοδο διαχωρισμού ιονισμένων συστατικών, τα οποία διαχωρίζονται από τα μη ιονισμένα μέσω μεμβρανών ιοντοανταλλαγής. Το ηλεκτρικό οξύ χρησιμοποιείται για τις περισσότερες εφαρμογές του στην μορφή του ελεύθερου οξέος παρά στη μορφή άλατος. Συνεπώς, η δημιουργία καθαρού ρεύματος οξέος κατά την ανάκτηση του επιθυμητού προϊόντος μπορεί να αυξήσει τη συγκέντρωση σε ηλεκτρικό οξύ περίπου κατά 20% (Song & Lee 2006). Άλλες μέθοδοι διαχωρισμού των ηλεκτρικών αλάτων είναι η καθίζηση με διοξείδιο του ασβεστίου που αυξάνει τη συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος περίπου 40%, η εκχύλιση με υδρόφοβες αμίνες που σε συνδυασμό με απόσταξη και κρυσταλλοποίηση καταλήγει σε ρεύμα 99,7% καθαρότητας σε ηλεκτρικό οξύ

231 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes 6.2 Αποτελέσματα Πειραματικού Σχεδιασμού Ζύμωσης Καλλιέργεια του βακτηρίου Actinobacillus succinogenes σε κωνικές φιάλες Η ανάπτυξη του βακτηρίου Actinobacillus succinogenes απαιτεί προκαταρκτικά στάδια ανάπτυξης του μικροοργανισμού επιταχύνοντας στα επόμενα στάδια την είσοδο στην εκθετική φάση ανάπτυξης. Ο μικροοργανισμός Actinobacillus succinogenes διαφέρει σε σχέση με τον σακχαρομύκητα στους χρόνους ανάπτυξης και διπλασιασμού. Επίσης οι βιβλιογραφικές πηγές της ανάπτυξης του βακτηρίου είναι λιγότερες σε σχέση με τη ζύμη με αποτέλεσμα να χρειάζεται μεγαλύτερη μελέτη στα προκαταρκτικά στάδια της ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Το πρώτο στάδιο της μελέτης περιλάμβανε την παρατήρηση της καλλιέργειας του μικροοργανισμού σε πολύ μικρό όγκο με αρχικό ενοφθάλμισμα (loop) από το τρυβλίο της καλλιέργειας που διατηρείται αεροστεγώς σε θερμοκρασία 4 ο C. Συγκρίθηκαν διαφορετικά περιβάλλοντα ανάπτυξης 10 ml αρχικού όγκου καλλιέργειας, που ποικίλουν ανάμεσα σε κωνικές φιάλες διαφορετικού όγκου και δοκιμαστικούς σωλήνες. Προέκυψε ότι το δοχείο καλλιέργειας που επιτρέπει την ανάπτυξη του μικροοργανισμού στο συντομότερο χρονικό διάστημα είναι ο δοκιμαστικός γυάλινος σωλήνας συνολικού όγκου 15 ml. Το θρεπτικό μέσο καλύπτει μεγάλο τμήμα του όγκου, επιτρέποντας μικρό χρόνο επαφής και επιφάνεια επαφής με την υπερκείμενη ατμόσφαιρα που στην προκειμένη είναι περιβάλλον CO2. Επίσης, τα τοιχώματα του δοκιμαστικού σωλήνα επιτρέπουν την καλύτερη ανάδευση του μέσου. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο χρόνος διπλασιασμού των κυττάρων και καταρτίστηκαν αρχικές καμπύλες ανάπτυξης του βακτηρίου για ένα πλούσιο θρεπτικό μέσο σε σάκχαρα, εκχύλισμα μαγιάς και φωσφορικά άλατα, όπως περιγράφεται στον Πίνακα 6.1. Το συγκεκριμένο θρεπτικό μέσο διαθέτει MgCO3 κατάλληλης συγκέντρωσης ώστε να αποτελεί αποκλειστική πηγή CO2. Η λανθάνουσα φάση της καλλιέργειας σε αυτή την κλίμακα είναι σύντομη. Παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα του μικροοργανισμού εισέρχονται άμεσα στην εκθετική φάση ανάπτυξης όπου ο ρυθμός ανάπτυξης σημειώνει την τιμή 0,29 h -1. Η μέγιστη τιμή οπτικής πυκνότητας στα 600 nm (4,26) καταγράφεται σε διάρκεια καλλιέργειας 16 ωρών και στη συνέχεια ο μικροοργανισμός εισέρχεται στη στατική φάση. Επιπρόσθετα, η οπτική πυκνότητα της βακτηριακής καλλιέργειας παρουσιάζει μία ελαφριά μείωση όπως -211-

232 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes απεικονίζεται στο Σχήμα 6.3. Η συμπεριφορά αυτή πιθανά να οφείλεται στη φυσιολογία των κυττάρων του βακτηρίου Actinobacillus succinogenes. Παρόμοια συμπεριφορά παρατήρησαν οι Zheng et al. (2009) όπου ο πληθυσμός τους σημείωσε τη μέγιστη τιμή οπτικής πυκνότητας (7,9) σε διάρκεια καλλιέργειας 12 ωρών και στη συνέχεια η οπτική πυκνότητα μειωνόταν με αργό ρυθμό. Η ζύμωση του Actinobacillus succinogenes παρήγαγε ένα μίγμα οργανικών οξέων και συγκεκριμένα ηλεκτρικό, μυρμηκικό, οξικό οξύ καθώς και σχεδόν αμελητέα ποσότητα αιθανόλης. Το κύριο προϊόν της ζύμωσης αποτελεί το ηλεκτρικό οξύ με τα υπόλοιπα οργανικά οξέα να παράγονται σε σημαντικά χαμηλότερες ποσότητες. Η παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος ακολούθησε μια αυξητική συμπεριφορά που συνεχίστηκε για 40 ώρες καλλιέργειας (Σχήμα 6.4). Η μέγιστη συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος που σημειώθηκε ήταν 3,6 g/l σε διάστημα καλλιέργειας 40 ωρών. Η ποσότητα των προϊόντων παρέμενε σταθερή παρά την παρουσία σακχάρων στο θρεπτικό μέσο. Η συνολική κατανάλωση των σακχάρων ήταν 6,68 g/l από τα 20 g/l των αρχικών σακχάρων που προστέθηκαν στο μίγμα. Η παραγωγή του οξικού οξέος ήταν χαμηλή με τιμή 0,45 g/l, και του μυρμηκικού οξέος παρουσίασε παρόμοια συμπεριφορά καταγράφοντας την τιμή 0,6 g/l. Οι Corona-González et al., (2008) ανέφεραν ότι κατά την καλλιέργεια του βακτηριακού στελέχους Actinobacillus succinogenes ATCC και για αρχική συγκέντρωση γλυκόζης στο θρεπτικό μέσο 20 g/l, παρήγαγαν ηλεκτρικό οξύ σε συγκέντρωση 10,6 g/l, οξικό οξύ σε συγκέντρωση 4,4 g/l και τέλος μυρμηκικό οξύ σε συγκέντρωση 3,9 g/l. Οι δύο σημαντικές παρατηρήσεις που προέκυψαν από την πειραματική έρευνα σε σχέση με τις βιβλιογραφικές αναφορές ήταν πρώτον η αδυναμία κατανάλωσης του συνόλου των παρεχόμενων σακχάρων από τον μικροοργανισμό. Δεδομένης της χαμηλής δυνατότητας μεταβολισμού των σακχάρων προς παραγωγή ηλεκτρικού οξέος, συμπεραίνεται ότι το βακτήριο δε βρέθηκε σε συνθήκες που να ευνοούν την ανάπτυξη των κυττάρων του. Οι συνθήκες αυτές πιθανά να συνδέονται με την απαίτηση επιπλέον ποσότητας CO2, φωσφορικών αλάτων ή αμμωνιακών αλάτων που περιέχονται στο θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας. Επίσης, η δεύτερη παρατήρηση αφορά τις ποσότητες των λοιπών οργανικών οξέων, που όπως και στις βιβλιογραφικές αναφορές, είναι σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με το κύριο προϊόν. Η σύγκριση των αποτελεσμάτων της προκαταρκτικής ζύμωσης των σακχάρων από τον Actinobacillus succinogenes, με τις βιβλιογραφικές -212-

233 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes αναφορές, επισημαίνει την ανάγκη εφαρμογής ενός πειραματικού σχεδιασμού που θα βελτιστοποιήσει τις συνθήκες τις ζύμωσης με αποτέλεσμα την αύξηση της παραγωγής του ηλεκτρικού οξέος. Πίνακας 6.1. Σύσταση θρεπτικού μέσου ζύμωσης για πρωταρχικά πειράματα ανάπτυξης του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes. Συστατικά Θρεπτικού μέσου Συγκέντρωση (g/l) 1 γλυκόζη 20 2 YE 5 3 K2HPO4 5 4 MgCO NaCl 0,5 6 MgSO

234 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Οπτική Πυκνότητα (@600 nm) Xρόνος (h) Σχήμα 6.3. Καμπύλη ανάπτυξης του μικροοργανισμού A. succinogenes στο θρεπτικό μέσο της ζύμωσης Συγκέντρωση (g/l) Ηλεκτρικό Οξύ Μυρμηκικό Οξύ Οξικό Οξύ Καταναλισκόμενα Σάκχαρα Χρόνος (h) Σχήμα 6.4. Παραγωγή ηλεκτρικού, μυρμηκικού και οξικού οξέος και η πορεία των καταναλισκόμενων σακχάρων σε σχέση με το χρόνο κατά την καλλιέργεια του μικροοργανισμού A. succinogenes

235 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Βελτιστοποίηση του σταδίου της Ζύμωσης μέσω Ορθογώνιου Πειραματικού Σχεδιασμού Taguchi Η πηγή άνθρακα για το βακτήριο Actinobacillus succinogenes μπορεί να προέρχεται τόσο από εξόζες και πεντόζες, το οποίο αποτελεί στοιχείο διαφοροποίησης σε σχέση με τον σακχαρομύκητα που μελετήθηκε στο Κεφάλαιο 5. Η τροφοδοσία του μικροοργανισμού είναι δυνατόν να προέρχεται από το πλούσιο σε γλυκόζη ρεύμα εξόδου της ενζυμικής υδρόλυσης και από το πλούσιο σε ξυλόζη ρεύμα εξόδου της όξινης προεπεξεργασίας. Στην παρούσα διατριβή, η παράμετρος του συνδυασμού των δύο σακχάρων ενσωματώθηκε στον πειραματικό σχεδιασμό. Αρχικά, επιλέχθηκε η εφαρμογή του ορθογώνιου σχεδιασμού πειραμάτων Taguchi για την αξιολόγηση της επίδρασης των παραμέτρων της ζύμωσης στη παραγόμενη συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος. Μέσω μιας σειράς 18 πειραμάτων μελετήθηκε με διάφορους συνδυασμούς η επίδραση της συνολικής αρχικής συγκέντρωσης σακχάρων στο θρεπτικό μέσο (άθροισμα γλυκόζης και ξυλόζης σε g/l), η επίδραση της αναλογίας της γλυκόζης προς την ξυλόζη στο μίγμα πηγής άνθρακα, η συγκέντρωση του ανθρακικού μαγνησίου, που αποτελεί πηγή CO2 για το βακτήριο, η συγκέντρωση του φωσφορικού καλίου ως πηγή φωσφόρου για τον μικροοργανισμό καθώς και η περιεκτικότητα του εκχυλίσματος μαγιάς που είναι η βασική πηγή αζώτου και βιταμινών για το βακτήριο, στην παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Επιπλέον η παρουσία του ανθρακικού μαγνησίου στο μέσο της καλλιέργειας λειτουργεί ως ρυθμιστικό του ph. Συγκεκριμένα, το ph της καλλιέργειας διατηρήθηκε σταθερό στην τιμή 7. Το χαμηλότερο ph επηρεάζει την παραγωγή της βιομάζας, συγκεκριμένα έχει αρνητική επίπτωση στην ανάπτυξη των κυττάρων, λόγω μεγαλύτερων απαιτήσεων για διατήρηση (Van der Werf et al., 1997). Επιπρόσθετα κάθε χειρισμός του πειραματικού σχεδιασμού είχε επιπλέον παροχή CO2 μέσω ειδικής διάταξης που κατασκευάστηκε για τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Η διάταξη των φιαλών επέτρεπε την έξοδο του διοξειδίου της μίας φιάλης να αποτελεί την είσοδο για την επόμενη φιάλη μέσω αποστειρωμένων σωλήνων σιλικόνης. Ο αναλυτικός πειραματικός σχεδιασμός που περιλαμβάνει τη μελέτη πέντε ελεγχόμενων μεταβλητών σε τρία επίπεδα τιμών για τις τέσσερεις παραμέτρους και έξι επίπεδα τιμών για τη μία, καθώς και τα αποτελέσματα των πειραμάτων περιλαμβάνονται στον Πίνακα 6.2. Παρατηρείται ότι ο συνδυασμός υψηλού αθροίσματος σακχάρων και υψηλής περιεκτικότητας ανθρακικού άλατος δεν ευνοεί την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Η πηγή άνθρακα είναι πολύ πλούσια σε -215-

236 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes αντίθεση με τα υπόλοιπα θρεπτικά που βρίσκονται σε χαμηλότερα επίπεδα. Σύμφωνα με τα παραπάνω, προκύπτει ότι σε υψηλές τιμές συνολικών σακχάρων, τα ανθρακικά άλατα μπορούν να διατηρούνται σε χαμηλότερα επίπεδα. Επίσης, τα αποτελέσματα των πειραμάτων επιβεβαιώνουν τη δυνατότητα αξιοποίησης τόσο της γλυκόζης όσο και της ξυλόζης ως προέλευση πηγής άνθρακα για τον μικροοργανισμό. Στον Πίνακα 6.2 περιλαμβάνονται οι λόγοι του σήματος προς θόρυβο (S/N) για τον κάθε συνδυασμό παραμέτρων, καθώς αποτελεί κριτήριο αξιολόγησης, που έχει ως στόχο τη μεγιστοποίηση του εφόσον συνδέεται με την επιλογή εκείνων των παραμέτρων για το σύστημα που ελαχιστοποιούν τη διακύμανση από μη ελεγχόμενους παράγοντες. Η ανάλυση της ορθογώνιας παράταξης Taguchi έγινε με τη χρήση του στατιστικού πακέτου Μinitab 17. Η απόκριση του ορθογώνιου πειραματικού σχεδιασμού αποτέλεσε το παραγόμενο ηλεκτρικό οξύ και σύμφωνα με τη μεγιστοποίηση του κρίθηκαν οι ελεγχόμενοι παράγοντες. Το στατιστικό πακέτο, με βάση τη θεωρία του σχεδιασμού κατά Taguchi, αξιολόγησε τις πέντε παραμέτρους βάσει των παρακάτω κριτηρίων: α) της μεγιστοποίηση της μέσης τιμής των πειραματικών δεδομένων για τη συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος, β) της μεγιστοποίηση της τιμής του λόγου S/N, γ) του συντελεστή p της ανάλυσης διακύμανσης της συνεισφοράς των πέντε παραμέτρων στο γραμμικό μοντέλο συσχέτισης της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος με τις ελεγχόμενους παράγοντες. Αναφορικά με τη μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης του παραγόμενου ηλεκτρικού οξέος, κάθε παράμετρος συμμετέχει στο αποτέλεσμα με διαφορετική βαρύτητα. Συγκεκριμένα, όπως περιγράφεται στον Πίνακα 6.3, η πηγή του αζώτου αποτελεί το σημαντικότερο παράγοντα για τη μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης του προϊόντος καθώς και τη μεγιστοποίηση του λόγου S/N, που υποδηλώνει μικρές διακυμάνσεις του συστήματος από παράγοντες θορύβου. Η κατάταξη των παραμέτρων είναι η ίδια και για τα δύο κριτήρια που τέθηκαν ως στόχος. Επόμενο στην κατάταξη ακολουθώντας το εκχύλισμα μαγιάς, είναι το MgCO3 που λειτουργεί ως πηγή CO2 για την καλλιέργεια. Ακολούθως, η αξιολόγηση χαρακτηρίζει το λόγο των συγκεντρώσεων των δύο σακχάρων ως λιγότερο σημαντικό στη διαμόρφωση των αποτελεσμάτων, καθώς και το σύνολο των σακχάρων. Τελευταίος παράγοντας στην κατάταξη και με σημαντική διαφορά της τιμής δέλτα είναι η πηγή φωσφορικών αλάτων (K2HPO4). Ανάλογα συμπεράσματα έχουν παρατηρηθεί στη βιβλιογραφία από τους Borges & Pereira (2011), οι οποίοι μετά από παραγοντικό στατιστικό -216-

237 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes σχεδιασμό και ανάλυση διακύμανσης,, υπέδειξαν ότι το NaHCO3 αποτελεί το σημαντικότερο παράγοντα για την παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος και το εκχύλισμα μαγιάς ως το δεύτερο σημαντικότερο σε σχέση με τις πηγές φωσφόρου που έχουν φανερά μικρότερη επίδραση στη συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος

238 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Πίνακας 6.2. Πειραματικά αποτελέσματα του στατιστικού σχεδιασμού Taguchi για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος από τον μικροοργανισμό Actinobacillus succinogenes. No. Λόγος Γλυκόζη/ Ξυλόζη Συνολικά Σάκχαρα MgCO3 K2HPO4 Εκχύλισμα μαγιάς Ηλεκτρικό Οξύ Λόγος S/N 1 1: ,20 10,10 2 1: ,99 15,55 3 1: ,89 13,79 4 4: ,19 12,44 5 4: ,40 14,65 6 4: ,02 12,09 7 3: ,76 13,55 8 3: ,79 11,57 9 3: ,50 13, : ,03 12, : ,60 11,

239 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes No. Λόγος Γλυκόζη/ Ξυλόζη Συνολικά Σάκχαρα MgCO3 K2HPO4 Εκχύλισμα μαγιάς Ηλεκτρικό Οξύ Λόγος S/N 12 2: ,50 10, : ,54 10, : ,41 12, : ,90 11, : ,68 11, : ,20 10, : ,55 14,

240 S/N Λόγος Μέση Τιμή Απόκρισης Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Πίνακας 6.3. Κατάταξη των παραμέτρων σύμφωνα με τη μεγιστοποίηση δύο διαφορετικών κριτηρίων, (α) την απόκριση του πειραματικού σχεδιασμού (συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος), (β) το λόγο Σήματος/Θορύβου (S/N). Επίπεδο Λόγος Γλυκόζη/ Ξυλόζη Συνολικά Σάκχαρα MgCO3 K2HPO4 Εκχύλισμα μαγιάς Κριτήριο 1 13,15 11,75 11,44 12,44 10, ,06 12,65 13,42 12,26 13, ,73 12,75 12,29 12,45 12, , , , Δέλτα 1,77 1 1,97 0,18 2,54 Κατάταξη ,69 3,90 3,77 4,26 3,54 2 4,54 4,40 4,79 4,18 4,78 3 4,35 4,39 4,14 4,26 4,37 4 3, , , Δέλτα 0,98 0,50 1,03 0,09 1,24 Κατάταξη

241 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Στη συνέχεια, ο πειραματικός σχεδιασμός Taguchi έδωσε τη δυνατότητα κατάστρωσης ενός γραμμικού εμπειρικού μοντέλου που συσχετίζει τις τιμές των πέντε ελεγχόμενων μεταβλητών με τη μία μεταβλητή απόκρισης που είναι η συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος. Το γραμμικό μοντέλο παρουσιάζεται στο Σχήμα 6.5 όπου περιλαμβάνεται η διασπορά των αποκλίσεων των 18 πειραματικών χειρισμών της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes σε σχέση με τις τιμές πρόβλεψης του γραμμικού μοντέλου. Οι πειραματικές τιμές παρουσιάζουν ικανοποιητική διασπορά σε σχέση με την καμπύλη του γραμμικού μοντέλου πρόβλεψης. Οι συντελεστές για τον κάθε παράγοντα παρουσιάζονται σε μορφή ραβδογράμματος με τιμή αναφοράς το συντελεστή σταθεράς (Σχήμα 6.6). Στη συνέχεια, το διάγραμμα Κανονικότητας παρουσιάζει τη διασπορά των υπολειμμάτων της πειραματικής τιμής της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος σε σχέση με την προσαρμοσμένη τιμή του γραμμικού μοντέλου (πειραματικό σφάλμα). Η κατανομή είναι συμμετρική γύρω από την τιμή μηδέν (Σχήμα 6.7), το οποίο υποδεικνύει ότι ο πληθυσμός παρουσιάζει κανονική κατανομή. Το συμπέρασμα αυτό καθιστά το γραμμικό μοντέλο κατάλληλο σε σχέση με τα πρωτογενή δεδομένα (Κομίλης, 2006). Το τετράγωνο της γραμμικής παλινδρόμησης (R 2 ) για το γραμμικό μοντέλο είναι 98,2%, μία τιμή πολύ κοντά στο 100, γεγονός που καθιστά το μοντέλο πολύ ακριβές. Αναφορικά με το ποσοστό της συνεισφοράς των πέντε παραμέτρων στο γραμμικό μοντέλο συσχέτισης, η ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) προσφέρει τις πληροφορίες που είναι απαραίτητες για την αξιολόγηση. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται στο Σχήμα 6.8, όπου το μήκος των ράβδων αντιστοιχεί στο ποσοστό συνεισφοράς της κάθε παραμέτρου στο εμπειρικό μοντέλο συσχέτισης. Το ίδιο αποτέλεσμα υποδεικνύει και η τιμή του συντελεστή p για κάθε παράμετρο. Αυτός είναι ο λόγος που παρουσιάζονται παράλληλα με τη συνεισφορά της κάθε παραμέτρου ενισχύοντας τη σημαντικότητα του κάθε παράγοντα. Ο συντελεστής p για τους τέσσερεις από τους πέντε παράγοντες είναι χαμηλότερος του 0,05 οπότε η κατανομή του πληθυσμού βρίσκεται εντός του επιθυμητού επιπέδου εμπιστοσύνης εκτός από τον παράγοντα που αφορά τη συγκέντρωση του K2HPO4. Η συνεισφορά του εκχυλίσματος μαγιάς είναι η μεγαλύτερη στο γραμμικό μοντέλο με ποσοστό 42,38%. Ακολουθεί με επίσης σημαντική τιμή συνεισφοράς, ο παράγοντας ανθρακικό μαγνήσιο με τιμή συνεισφοράς 28,72%. Ο λόγος των δύο σακχάρων του θρεπτικού μέσου συμμετέχει στη διαμόρφωση του μοντέλου συσχέτισης του ηλεκτρικού οξέος με ποσοστό 18,12%. 221

242 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Όπως παρατηρείται στο Σχήμα 6.8, η συνεισφορά του αθροίσματος των σακχάρων παρουσιάζεται μειωμένη σε σχέση με την επίδραση των παραπάνω σημαντικότερων παραμέτρων. Η συγκεκριμένη συνεισφορά ισούται με 8,74%. Το φαινόμενο αυτό παρατηρείται συνήθως καθώς η συγκέντρωση της πηγής άνθρακα είναι ως επί το πλείστων ανάλογη με το προϊόν του μεταβολισμού του μικροοργανισμού μέχρι κάποια κρίσιμη τιμή. Το μικρότερο ποσοστό συνεισφοράς στη διαμόρφωση του μοντέλου πρόβλεψης παρουσιάζει η πηγή φωσφορικών αλάτων και ισούται με 0,25%. Παρατηρείται ότι η κατανομή του ποσοστού συνεισφοράς των πέντε παραμέτρων συμπίπτει με την κατάταξη των παραμέτρων βάσει της μεγιστοποίησης των δύο κριτηρίων αξιολόγησης ου σχεδιασμού Taguchi, της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος και του λόγου S/N. 8 Πειραματικές τιμές Τιμές πρόβλεψης Πειραματικές τιμές Συγκέντρωσης Ηλ. Οξέος (g/l)) Τιμές πρόβλεψης Συγκέντρωσης Ηλ. Οξέος (g/l)) Σχήμα 6.5. Σχηματική απεικόνιση του γραμμικού μοντέλου της συσχέτισης της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος με το λόγο των σακχάρων, τη συνολική συγκέντρωση τους, την περιεκτικότητα MgCO3, K2HPO4 και εκχυλίσματος μαγιάς με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes. 222

243 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes 0,6 0,4 Συντελεστής Παραμέτρων 0,2 0,0-0,2-0,4-0,6 Συντελεστής Σταθεράς 1:0 4:1 3:2 2:3 1:4 0: Αναλογία Σακχάρων Συνολικά MgCO 3 K 2 HPO 4 Εκχύλισμα Σάκχαρα Μαγιάς Σχήμα 6.6. Ραβδόγραμμα σχηματικής απεικόνισης των συντελεστών της κάθε παραμέτρου του γραμμικού μοντέλου του Taguchi σχεδιασμού της συσχέτισης της συγκέντρωσης ηλεκτρικού οξέος με το λόγο των σακχάρων, τη συνολική συγκέντρωση τους, την περιεκτικότητα MgCO3, K2HPO4 και εκχυλίσματος μαγιάς με παράλληλη απεικόνιση των πειραματικών αποτελεσμάτων της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes. Επιπρόσθετα, ο πειραματικός σχεδιασμός επιτρέπει τη βελτιστοποίηση της μελετώμενης διεργασίας εξάγοντας το συνδυασμό των παραμέτρων που μεγιστοποιούν τη συγκέντρωση του παραγόμενου προϊόντος. Ο συνδυασμός των βέλτιστων τιμών οπτικοποιείται στο Διάγραμμα Κύριων Επιδράσεων του Σχήματος 6.9 για τον οποίο η τιμή του ηλεκτρικού οξέος κατά την ολοκλήρωση της βακτηριακής καλλιέργειας αντιστοιχεί στη μέγιστη. Η βέλτιστη τιμή του λόγου των δύο σακχάρων γλυκόζη : ξυλόζη εντοπίζεται για διάλυμα σακχάρων με 100% γλυκόζη. Στη συνέχεια το άθροισμα της γλυκόζης και της ξυλόζης στο διάλυμα των σακχάρων αποδίδει παρόμοια τιμή ηλεκτρικού οξέος για την τιμή 30 g/l και την τιμή 40 g/l. Η βέλτιστη τιμή για τη συγκέντρωση του αθροίσματος των σακχάρων που επιλέγεται αντιστοιχεί στη μικρότερη τιμή, ίση με 30 g/l, ικανοποιώντας συγχρόνως το 223

244 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes κριτήριο του μειωμένου κόστους. Αναφορικά με την πηγή ανόργανου C από το άλας του MgCO3 του θρεπτικού μέσου, η βέλτιστη τιμή που επιλέγεται ισούται με 12 g/l όπως διαφαίνεται με σαφήνεια από το διάγραμμα κύριων επιδράσεων. Η λιγότερο σημαντική παράμετρος, η οποία είναι το K2HPO4, παρουσιάζει μικρή αυξομείωση στη συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος κατά τις διακυμάνσεις των τιμών της. Επιλέγεται ως βέλτιστη η μικρότερη τιμή ανάμεσα στα 5 και 15 g/l που αντιστοιχούν στην υψηλότερη τιμή του παράγοντα απόκρισης. Τέλος, το εκχύλισμα μαγιάς, εμφανίζοντας σημαντικές διακυμάνσεις στο παραγόμενο ηλεκτρικό οξύ για κάθε αλλαγή των τιμών του στα διαφορετικά μελετώμενα επίπεδα, παρουσιάζει βέλτιστη τιμή το επίπεδο 5 g/l. Η εξήγηση των παραπάνω αποτελεσμάτων σε ορισμένες περιπτώσεις όπως αυτή της ξυλόζης μπορεί να αποδοθεί στο ότι η συγκεκριμένη πεντόζη δεν ευνοείται τόσο ως πηγή άνθρακα στην παραγωγή ηλεκτρικού οξέος γιατί ο μικροοργανισμός χρειάζεται ένα στάδιο ακόμα στο μεταβολισμό του για τη μετατροπή της πεντόζης σε εξόζη πριν τη διαδικασία της γλυκόλυσης. O Actinobacillus succinogenes μετατρέπει τη γλυκόζη σε φωσφοενολοπυροσταφυλικό οξύ (PEP) μέσω της PEP καρβοξυκινάσης, ενώ την ξυλόζη μέσω της οδού της φωσφορικής πεντόζης με τη δράση της ξυλουλοκινάσης, για να καταλήξουν και οι δύο μέσω της οδού Embden Meyerhof Parnas στην PEP (Mckinlay et al., 2005). Παρόμοια αποτελέσματα που δείχνουν διαφορετικές αποδόσεις μεταξύ τροφοδοσίας γλυκόζης και ξυλόζης παρουσιάζουν και οι (Gunnarsson et al., 2013). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με παροχή CO2 και αυτός είναι ο λόγος που ο μικροοργανισμός δε χρειάστηκε θρεπτικό μέσο που να περιλαμβάνει την ίδια ποσότητα πηγής άνθρακα και MgCO3 όπως αναφέρουν οι (Li et al., 2010). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα του βακτηρίου Actinobacillus succinogenes έχουν χαμηλές απαιτήσεις τόσο από την ποσότητα φωσφορικών αλάτων όσο και από την πηγή αζώτου. 224

245 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Ποσοστό (%) ,3-0,2-0,1 0,0 Υπόλειμμα 0,1 0,2 0,3 Σχήμα 6.7. Διάγραμμα Κανονικής Πιθανότητας των υπολειμμάτων του πληθυσμού για κάθε χειρισμό του πειραματικού σχεδιασμού Taguchi της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes. Σχήμα 6.8. Συνεισφορά των πέντε παραγόντων μαζί με τους συντελεστές p για το γραμμικό μοντέλο της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος σύμφωνα με την Ανάλυση Διακύμανσης για το στάδιο της ζύμωσης του Actinobacillus succinogenes. 225

246 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Ηλεκτρικό Οξύ (g/l) (β) Συνολικά Σάκχαρα (g/l) Ηλεκτρικό Οξύ (g/l) MgCO 3 (g/l) Ηλεκτρικό Οξύ (g/l) Ηλεκτρικό Οξύ (g/l) Κ 2 ΗPO 4 (g/l) Εκχύλισμα Μαγιάς (g/l) 4.75 Ηλεκτρικό Οξύ Γραμμή Αναφοράς Ηλεκτρικό Οξύ (g/l) :0 4:2 3:2 2:3 1:4 0:1 Λόγος Γλυκόζη:Ξυλόζη Σχήμα 6.9. Διαγράμματα κύριων επιδράσεων των πέντε ελεγχόμενων μεταβλητών στον παράγοντα ελέγχου (συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος) Ζύμωση του Actinobacillus succinogenes σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα Η ζύμωση των υδρολυμάτων μεταφέρθηκε σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα και η σύσταση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας βασίστηκε στο βέλτιστο συνδυασμό παραγόντων που επιλέχθηκε από το στατιστικό σχεδιασμό Τaguchi της παραγράφου Η μόνη διαφορά είναι η πηγή άνθρακα, για την οποία επιλέχθηκε η τιμή 20 g/l γλυκόζης, διότι η αύξηση της συγκέντρωσης της πηγής άνθρακα αυξάνει τη συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος χωρίς να αυξάνει συγχρόνως την απόδοση, οπότε η μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη χαμηλότερη συγκέντρωση σακχάρου. Επίσης, η κλίμακα του βιοαντιδραστήρα εφαρμόστηκε με στόχο τόσο την επαλήθευση των αποτελεσμάτων του πειραματικού σχεδιασμού όσο και την μελέτη ενός ακόμα παράγοντα, της παροχής του CO2. Η πειραματική μελέτη επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη δύο καλλιεργειών σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα με ακριβώς ίδιες συνθήκες, 226

247 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes με μοναδική διαφορά την παροχή του CO2. Ο πρώτος αντιδραστήρας (αντιδραστήρας Ι) λειτούργησε με παροχή CO2 στην έναρξη της καλλιέργειας ώστε να δημιουργηθεί ατμόσφαιρα διοξειδίου στην αέρια φάση καθώς και να διαλυθεί όσο περισσότερη ποσότητα διοξειδίου επιτρέπει η ισορροπία του μέσου και στη συνέχεια σταμάτησε. Ο δεύτερος (αντιδραστήρας ΙΙ) λειτούργησε με συνεχή παροχή CO2 0,1 l/min. Η συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος για τον αντιδραστήρα Ι (χωρίς συνεχή παροχή CO2) σημείωσε την τιμή 11,44 g/l σε διάρκεια καλλιέργειας 24 ωρών με απόδοση 0,572 g ηλεκτρικού οξέος/ g γλυκόζης. Από την άλλη πλευρά, ο αντιδραστήρας με συνεχή παροχή CO2 (αντιδραστήρας ΙΙ) σημείωσε 11,01 g/l ηλεκτρικού οξέος σε διάρκεια καλλιέργειας 17,5 ωρών. Η απόδοση υπολογίστηκε 0,55 g ηλεκτρικού οξέος/ g γλυκόζης. Η διαφορά των τιμών της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος είναι σχεδόν αμελητέα. Παρατηρείται όμως διαφορά στις παραγωγικότητες που καταγράφηκαν για κάθε καλλιέργεια. Συγκεκριμένα, η παραγωγικότητα του αντιδραστήρα Ι σημείωσε την τιμή 0,477 g/l h και αντίστοιχα του αντιδραστήρα ΙΙ 0,629 g/l h. Η περίσσεια CO2 παρουσιάζει ενίσχυση της παραγωγικότητας του ηλεκτρικού οξέος. Αναφορικά με την κυτταρική βιομάζα των δύο καλλιέργειών, σημειώνονται επίσης σημαντικές διαφορές. Στον αντιδραστήρα Ι, ο μικροοργανισμός αναπτύχθηκε σε τιμές οπτικής πυκνότητας 3,749 ενώ στον αντιδραστήρα ΙΙ, η οπτική πυκνότητα που καταγράφηκε ήταν 6,401. Συμπεραίνεται επομένως, ότι η πηγή άνθρακα του αντιδραστήρα που προέρχεται από τη συνεχή παροχή διοξειδίου χρησιμοποιείται προς παραγωγή βιομάζας από το μικροοργανισμό χωρίς να ενισχύεται η παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος. Επιπρόσθετα, η παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος συνοδεύτηκε από την παραγωγή μυρμηκικού και οξικού οξέος σε χαμηλά επίπεδα από τις πρώτες ώρες της καλλιέργειας. Ο αντιδραστήρας Ι παρήγαγε 2,7 g/l μυρμηκικού και 4,7 g/l οξικού οξέος, ενώ ο αντιδραστήρας ΙΙ παρήγαγε 1,43 g/l μυρμηκικού και 3,82 g/l οξικού οξέος. Οι τιμές των πειραμάτων σύγκρισης παρουσιάζονται συγκεντρωτικά στον Πίνακα

248 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Πίνακας 6.4. Συγκεντρωτικά αποτελέσματα για τις δύο καλλιέργειες του Actinobacillus succinogenes σε επίπεδο αντιδραστήρα με και χωρίς παροχή διοξειδίου του άνθρακα. Αποτελέσματα Αντιδραστήρας Ι (χωρίς παροχή CO2) Αντιδραστήρας IΙ (με παροχή CO2) Συγκέντρωση Ηλεκτρικού οξέος (g/l) Παραγωγικότητα (g/l h) Απόδοση (%) Συγκέντρωση Μυρμηκικού οξέος (g/l) Συγκέντρωση Οξικού οξέος (g/l) Διάρκεια καλλιέργειας (h) Οπτική πυκνότητα (@600 nm) 11,44±0,31 11,01±0,28 0,477 0,629 57±0,25 55±0,5 2,70±0,08 1,43±0,09 4,70±0,3 3,82±0, ,5 3,75 6,41 Οι τιμές των συγκεντρώσεων του ηλεκτρικού οξέος που σημειώθηκαν συμφωνούν με τις τιμές με πειράματα σύγκρισης που έχουν παρουσιαστεί στη βιβλιογραφία και συγκεκριμένα στη μελέτη των Borges & Pereira (2011) όπου παρουσίασαν 14,22 g/l παραγωγή ηλεκτρικού οξέος για συνεχή παροχή διοξειδίου και 13,5 g/l για αντιδραστήρα χωρίς παροχή διοξειδίου. Επίσης, οι Zheng et al. (2009) ανέφεραν σε μία καλλιέργεια με 20 g/l αρχικών σακχάρων γλυκόζης παραγωγή 13,8 g/l ηλεκτρικού οξέος που συνοδεύτηκε από 5,9 g/l άθροισμα συγκέντρωσης οξικού και μυρμηκικού οξέος. Επιπρόσθετα, οι αποδόσεις καλλιεργειών του ίδιου ή παρόμοιου είδους βακτηρίου που αναφέρονται στη βιβλιογραφία έχουν παρόμοιες τιμές όπως αναφέρεται από τους Kim et al. (2004) παραγωγή 11,7 g/l ηλεκτρικού οξέος με απόδοση 56% (η τιμή των g ηλεκτρικού οξέος ανά g γλυκόζης ανηγμένη σε ποσοστό επί τοις εκατό). Υπάρχουν βέβαια και αναφορές υψηλότερων αποδόσεων στη βιβλιογραφία (0,71 g ηλεκτρικού οξέος/ g γλυκόζης) από τους Zheng et al. (2009), οι οποίοες υποδεικνύουν το 228

249 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes περιθώριο αύξησης των τιμών. Η αναερόβια ζύμωση απαιτεί ιδιαίτερο σχεδιασμό που θα μπορούσε να μελετηθεί περαιτέρω για μια σειρά διαφορετικών προφίλ αερισμού και παροχής CO2. Όπως έχει αναφερθεί στην Παράγραφο 6.1, το διοξειδίου του άνθρακα συμμετέχει στο μεταβολισμό του μικροοργανισμού για την παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος. Γεγονός που οδήγησε στη σύγκριση της ζύμωσης παρουσία και απουσία συνεχής ροής διοξειδίου ώστε να ελεγχθεί αυτός ο συσχετισμός. Σε κάθε περίπτωση, η καλλιέργεια διαθέτει πηγή διοξειδίου του άνθρακα προερχόμενη από το διαλυμένο στο θρεπτικό μέσο ανθρακικό μαγνήσιο. Ακόμα, ως πηγή διοξειδίου θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν και άλλες ενώσεις όπως το NaHCO3 που λειτουργούν επίσης ως πηγή διοξειδίου και συγχρόνως ως ρυθμιστικές ενώσεις του ph. Επίσης το NaHCO3 προτιμάται σε κάποιες περιπτώσεις γιατί δε δημιουργεί ίζημα και είναι ευκολότερη η παρακολούθηση της οπτικής πυκνότητας της καλλιέργειας μέσω φωτομετρίας. Η περίσσεια διοξειδίου του άνθρακα μελετήθηκε για την επίδραση της στην παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος και συμπεραίνεται ότι ο μεταβολισμός του μικροοργανισμού λειτούργησε προς τη μεταβολική οδό της παραγωγής των οργανικών οξέων ηλεκτρικό, μυρμηκικό και οξικό οξύ. Η έλλειψη διοξειδίου οδηγεί το μεταβολισμό του βακτηρίου σε άλλη μεταβολική οδό με τελικό προϊόν την αιθανόλη, η οποία παρουσιάστηκε σε αμελητέα μόνο ποσότητα στους δύο αντιδραστήρες, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι ο μικροοργανισμός δε βρέθηκε σε συνθήκες έλλειψης διοξειδίου σε κάποιο σημείο της καλλιέργειας. Η υψηλότερη παραγωγικότητα ηλεκτρικού οξέος επιτεύχθηκε στον Αντιδραστήρα ΙΙ όπου το διοξειδίο του άνθρακα παρέχονταν συνεχώς στο θρεπτικό μέσο με ρυθμό 0,5 vvm. Η πορεία της ανάπτυξης του μικροοργανισμού και της παραγωγής των προϊόντων της ζύμωσης απεικονίζονται στο Σχήμα Η καλλιέργεια παρακολουθήθηκε για διάστημα 40 ωρών. Η κυτταρική βιομάζα στον αντιδραστήρα (6,4 οπτική πυκνότητα στα 600 nm) αυξήθηκε περισσότερο από τις καλλιέργειες σε επίπεδο κωνικών φιαλών (3,3 οπτική πυκνότητα στα 600 nm) λόγω καλύτερης ανάδευσης και διασποράς του διοξειδίου. Η μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης του ηλεκτρικού οξέος σημειώθηκε στις 17,5 ώρες οπότε και καταναλώθηκε το σύνολο των διαθέσιμων σακχάρων. Καταγράφηκαν οι τιμές για μεγαλύτερο διάστημα καλλιέργειας, ώστε να διαπιστωθεί η επίδραση του προϊόντος στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Η οπτική πυκνότητα παραμένει σταθερή, ενώ το ηλεκτρικό οξύ μειώνεται με 229

250 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes πολύ αργό ρυθμό, σημάδι ότι μπορεί να καταναλώνεται από το βακτήριο απλώς για διατήρηση της βιομάζας του. Συγκέντρωση Οργανικών Οξέων (g/l) Χρόνος (h) Ηλεκτρικό Οξύ Μυρμηκικό Οξύ Οξικό Οξύ Οπτ. Πυκνότητα Σχήμα Παραγωγή ηλεκτρικού οξέος κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού A. succinogenes σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα με παράλληλη παροχή CO Οπτική 600 nm 230

251 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Βιβλιογραφία 6 ου Κεφαλαίου Borges, E.R. & Pereira, N., Succinic acid production from sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate by Actinobacillus succinogenes. Journal of industrial microbiology & biotechnology, 38(8), pp Corona-González, R.I., Bories, A., González-Álvarez, V., Pelayo-Ortiz, C., Kinetic study of succinic acid production by Actinobacillus succinogenes ZT-130. Process Biochemistry, 43(10), pp Guettler, M.V, Rumler, D., Jainf, M.K., Actinobacillus succinogenes sp. nov, a novel succinic-acid-producing strain from the bovine rumen, International Journal of Systematic Bacteriology, 49, pp Van Heerden, C.D. & Nicol, W., Continuous succinic acid fermentation by Actinobacillus succinogenes. Biochemical Engineering Journal, 73, pp Gunnarsson, I.B., Karakashev, D.B., Angelidaki, I., Succinic acid production from Jerusalem artichoke tubers. 21 st European Biomass Conference and Exhibition, 3-7 June, Copenhagen, Denmark, pp Kim, D.Y., Yim, S.C., Lee, P.C., Lee, W.G., Lee, S.Y., Chang, H.N., Batch and continuous fermentation of succinic acid from wood hydrolysate by Mannheimia succiniciproducens MBEL55E. Enzyme and Microbial Technology, 35(6-7), pp Knutsen, J.S., Davis, R.H., Cellulase retention and sugar removal by membrane ultrafiltration during lignocellulosic biomass hydrolysis. Applied Biochemistry and Biotechnology, , pp Li, Q., Yang, M., Wang, D., Li, W., Wu, Y., Zhang, Y., Xing, J., Su, Z., Efficient conversion of crop stalk wastes into succinic acid production by Actinobacillus succinogenes. Bioresource technology, 101(9), pp

252 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes McKinlay, J.B., Laivenieks, M., Schindler, B.D., McKinlay, A., Siddaramappa, S., Challacombe, J.F, Lowry, S.R., Clum, A., Lapidus, A.L, A genomic perspective on the potential of Actinobacillus succinogenes for industrial succinate production. BMC genomics, 11(1), p.680. McKinlay, J.B., Vieille, C., Zeikus, J.G., Prospects for a bio-based succinate industry. Applied microbiology and biotechnology, 76(4), pp Mckinlay, J.B., Zeikus, J.G., Vieille, C., Insights into Actinobacillus succinogenes Fermentative Metabolism in a Chemically Defined Growth Medium Insights into Actinobacillus succinogenes Fermentative Metabolism in a Chemically Defined Growth Medium. Applied and Environmental Microbiology, 71(11), pp Qi, B., Chen, X., Su, Y., Wan, Y., Enzyme adsorption and recycling during hydrolysis of wheat straw lignocellulose. Bioresource Technology, 102(3), pp Silverstein, R.A., Chen, Y., Sharma-Shivappa, R.R., Boyette, M.D., Osborne, J., A comparison of chemical pre-treatment methods for improving saccharification of cotton stalks. Bioresource Technology, 98, Song, H. & Lee, S.Y., Production of succinic acid by bacterial fermentation. Enzyme and Microbial Technology, 39(3), pp Tu, M., Chandra, R.P., Saddler, J.N., Recycling Cellulases during the Hydrolysis of Steam Exploded Ethanol Pretreated Lodgepole Pine. Biotechnology progress, 23, pp Urbance, S.E., Pometto III, A.L., DiSpirito, A.A., Demirci, A Medium evaluation and plastic composite support ingredient selection for biofilm formation and succinic acid production by Actinobacillus succinogenes. Food Biotechnology, 17(1), pp Urbance, S.E., Pometto III, A.L., DiSpirito, A.A., Denli, Y., Evaluation of succinic acid continuous and repeat-batch biofilm fermentation by Actinobacillus succinogenes using plastic composite support bioreactors. Applied Microbiology and Biotechnology, 65(6), pp

253 Κεφάλαιο 6 Παραγωγή Ηλεκτρικού οξέος κατά την καλλιέργεια του A. succinogenes Van Der Werf, M.J., Guettler, M.V., Jain, M.K., Zeikus, J.G., Environmental and physiological factors affecting the succinate product ratio during carbohydrate fermentation by Actinobacillus sp. 130Z. Archives of Microbiology, 167(6), pp Yang, G. & Ding Y., Recent advances in biocatalyst discovery, development and applications. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 22(20), pp Zheng, P., Dong, J.J., Sun, Z.H., Ni, Y., Fang, L., Fermentative production of succinic acid from straw hydrolysate by Actinobacillus succinogenes. Bioresource Technology, 100(8), pp Kομίλης, Δ.Π., Πειραματικός Σχεδιασμός και Στατιστική Ανάλυση. Δημοκρίτειο πανεπιστήμιο Θράκης, Πολυτεχνική Σχολή, Τμήμα Μηχανικών Περιβάλλοντος, Ξάνθη. 233

254 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις 7.1 Οικονομικά στοιχεία για την παραγωγή αιθανόλης Τα λιγνοκυτταρινούχα υλικά αποτελούν την πιο υποσχόμενη πηγή πρώτων υλών που δύναται να αντικαταστήσουν τα παραδοσιακά ορυκτά καύσιμα, καθώς βρίσκονται σε αφθονία και αποτελούν ανανεώσιμη πηγή ενέργειας. Η αυξανόμενη τιμή των ορυκτών καυσίμων και οι εκπομπές τους, που επιβαρύνουν την ατμόσφαιρα με αέρια του θερμοκηπίου (GHG), έχουν δημιουργήσει την ανάγκη αναζήτησης νέων πηγών ενέργειας, που προσφέρουν πιο βιώσιμη οπτική σε οικονομικούς και περιβαλλοντικούς όρους. Οι τεχνοοικονομικές μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί τις τελευταίες δεκαετίες για τη βιωσιμότητα της αιθανόλης από λιγνοκυτταρινικά υλικά (Wrobel et al., 2009) είναι πολλές και εμπεριστατωμένες. Οι βασικότεροι παράγοντες πάνω στους οποίους στηρίζονται οι μελέτες αυτές για τον καθορισμό της βιωσιμότητας μιας μονάδας παραγωγής βιοαιθανόλης, είναι η προέλευση της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας και η δυναμικότητα της μονάδας. Τα δύο παραπάνω στοιχεία, σύμφωνα με τον Gnansounou (2010), είναι οι δύο κρίσιμοι παράγοντες ώστε μία τεχνοοικονομική ανάλυση να περιέχει ικανοποιητικές -234-

255 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις αποδοχές και αποτελέσματα. Οι τεχνοοικονομικές μελέτες της βιβλιογραφίας παρουσιάζουν διαφορές μεταξύ τους καθώς περιλαμβάνουν διαφορετικές παραδοχές, βασίζονται στο σχεδιασμό μονάδων διαφορετικής δυναμικότητας, αναφέρονται σε διαφορετικές τοποθεσίες εγκατάστασης της μονάδας παραγωγής, χρησιμοποιούν διαφορετική πηγή πρώτης ύλης και τέλος αξιολογούν την οικονομική βιωσιμότητα του ολοκληρωμένου σχεδιασμού βάση της τιμής του τρέχοντος έτους. Παρόλα αυτά, τα αποτελέσματα κινούνται σε μία κοινή πορεία περαιτέρω έρευνας της παραγωγής βιοκαυσίμων και βιοϋλικών από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Έχει πραγματοποιηθεί πλήθος μελετών τόσο στην Αμερική όσο και σε Ευρωπαϊκό επίπεδο, με τις διάφορες οικονομοτεχνικές μελέτες να χρησιμοποιούν τον όρο IRR (εσωτερικό επιτόκιο) για τον μετέπειτα υπολογισμό της σχετικής τιμής πώλησης της βιοαιθανόλης ανά λίτρο, με τέτοιο τρόπο ώστε να πληρείται από τον κάθε μελετητή το κριτήριο που έχει τεθεί για το εσωτερικό επιτόκιο. Το εσωτερικό επιτόκιο (IRR) ή εσωτερικός βαθμός απόδοσης ονομάζεται ο συντελεστής προεξόφλησης στον οποίο μηδενίζεται η καθαρά παρούσα αξία. Το εσωτερικό επιτόκιο είναι το εργαλείο με το οποίο κρίνεται η αποδοτικότητα του κεφαλαίου. Αποτελεί ένα από τα βασικά οικονομικά κριτήρια που χρησιμοποιούνται για την αποδοχή ή απόρριψη μιας επένδυσης. Ο ορισμός ενός αποδεκτού βαθμού εσωτερικής απόδοσης κεφαλαίου είναι πολύπλοκο ζήτημα και εξαρτάται από τις στρατηγικές της κάθε εταιρείας. Θα μπορούσε όμως να ειπωθεί ότι ο βαθμός απόδοσης με τιμή τουλάχιστον 10% είναι προαπαιτούμενο για μία ελκυστική επένδυση, ενώ τιμές άνω του 15% μπορούν να χαρακτηρίσουν μία επένδυση ασφαλή. Αρχικά, το Εθνικό Εργαστήριο Ανανεώσιμων Πηγών Ενέργειας των ΗΠΑ (NREL) πραγματοποίησε μελέτη το 1987 όπου η τιμή πώλησης της αιθανόλης υπολογίστηκε ανάμεσα σε ένα εύρος τιμών 0,32-0,43 $/l, ώστε ο δείκτης IRR να ισούται με 15% (Antonopoulos & Wene, 1987). Η επόμενη μελέτη (Stone & Webster Engineering Corp., 1987) καθορίζει για μία μονάδα παραγωγής 15 εκατομμυρίων γαλονιών το χρόνο (57 Μl/y), την τιμή πώλησης της αιθανόλης ίση με 0,80-0,92 $/l, ώστε ο δείκτης IRR με τη σειρά του να σημειώνει την τιμή 15%. Σύμφωνα με τα βασικά κριτήρια αξιολόγησης μιας μονάδας που αναφέρθηκαν παραπάνω, ο παράγοντας που αφορά τη δυναμικότητα της μονάδας, παρατηρήθηκε ότι όσο αυξάνεται προσφέρει τη δυνατότητα μείωσης της καθορισμένης τιμής πώλησης της αιθανόλης. Συγκεκριμένα, μία μονάδα δυναμικότητας 52,2-235-

256 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις εκατομμύριων γαλονιών το χρόνο (198 Μl/y) (Wooley et al., 1999, Aden et al., 2002), που εφαρμόζει την τεχνολογία της ταυτόχρονης σακχαροποίησης και ζύμωσης, υπολογίζεται ότι καθορίζει την τιμή πώλησης της αιθανόλης σε 0,27 $/l. Το σενάριο αφορά μία μονάδα παραγωγής που θεωρείται πως θα είχε σχεδιαστεί το έτος Οι στόχοι που έχουν τεθεί από το Υπουργείο Ενέργειας των ΗΠΑ το 2002 στα πλαίσια του προγράμματος εκμετάλλευσης της βιομάζας είναι στρατηγικοί και υπολογίζουν ότι οι δημόσιες υπηρεσίες των ΗΠΑ θα μειώσουν την κατανάλωση βενζίνης κατά 20% μέχρι το Επίσης, η παραγωγή ανανεώσιμων και εναλλακτικών πηγών ενέργειας θα φτάσει τα 35 δισεκατομμύρια λίτρα μέχρι το Αυτοί οι στόχοι συστηματοποιούνται για το σύνολο του πλανήτη, μέσω του προγράμματος Παγκόσμιος Στόχος Κόστους Αιθανόλης που υπολογίζει την τιμή πώλησης της αιθανόλης ίση με 0,46 $/l και με τάση για μείωση στα επόμενα χρόνια. Το Υπουργείο Γεωργίας των ΗΠΑ πραγματοποίησε έρευνα που υποδεικνύει ότι ο αγροτικός τομέας των ΗΠΑ μπορεί να παράγει 570 δις λίτρα αιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα προερχόμενη από 1,3 δις τόνους ξηρής φυτικής βιομάζας, χωρίς να αποτελεί πρόκληση για την βιωσιμότητα των αγροτικών και δασικών περιοχών. Η παραγωγή 570 δις λίτρα βιοαιθανόλης, που ισοδυναμούν ενεργειακά με 380 δις λίτρα βενζίνης, μπορούν να μειώσουν τις εισαγωγές καυσίμων κατά 80%. Αναφορικά με τις έρευνες σε ευρωπαϊκό επίπεδο, το Σεπτέμβριο του 2010, ένα τεχνικό δελτίο από τη Bloomberg υπολόγισε την τιμή της αιθανόλης 0,51 /l. Προτείνεται επίσης να εφαρμοστούν οι επιδοτήσεις που εφαρμόζει το αμερικάνικο κράτος, οι οποίες υπολογίζονται σε $50 ανά τόνο ξηρής βιομάζας, και σε ευρωπαϊκό επίπεδο. Η σύγκριση του κόστους παραγωγής με τα βιοκαύσιμα πρώτης γενιάς είναι υπέρ της αιθανόλης από καλαμπόκι, που υπολογίζεται σε 0,26-0,79 $/λίτρων ετήσιας δυναμικότητας, ενώ το κόστος παραγωγής της βιοαιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα υπολογίζεται σε 0,55-0,77 $/λίτρο ανάλογα με την πηγή της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας (Gnansounou, 2010). Η βιοαιθανόλη δεύτερης γενιάς βέβαια έχει πολύ λιγότερες εκπομπές αερίων του θερμοκηπίου και η πρώτη ύλη δεν ανταγωνίζεται φυτά που συμμετέχουν στη διατροφική αλυσίδα. Το κόστος παραγωγής της βιοαιθανόλης δεύτερης γενιάς περιγράφεται με βάση την ανάλυση ευαισθησίας στο παρακάτω διάγραμμα (Σχήμα 7.1). Το κόστος παραγωγής είναι αποτέλεσμα συνδυασμού πολλαπλών παραγόντων: α) κόστος πρώτων υλών, β) λειτουργικό κόστος, γ) κόστος κεφαλαίου και δ) κυμαινόμενο λειτουργικό κόστος

257 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις Σχήμα 7.1. Κόστος παραγωγής αιθανόλης ως συνάρτηση των επιμέρους εξόδων: λειτουργικό κόστος, κόστος πρώτης ύλης, μεταβλητά λειτουργικά έξοδα, κεφαλαιακό κόστος. Σημαντικό παράγοντα διαμόρφωσης του κόστους της διεργασίας αποτελεί η τιμή των ενζύμων, η προεπεξεργασία και η ζύμωση, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 7.2. Σύμφωνα με τα συγκεκριμένα συμπεράσματα, θέτονται οι στόχοι της μελέτης της βελτιστοποίησης των παραπάνω σημείων της διεργασίας. Ωστόσο, η επιλογή του είδους της λιγνοκυτταρινικής βιομάζας που θα αποδίδει υψηλότερο περιεχόμενο υδατανθράκων μπορεί επίσης να βελτιώσει την τιμή κόστους της παραγωγής αιθανόλης (Gonzalez et al., 2011). H αύξηση των υδατανθράκων της βιομάζας από 64,4% σε 66,31% και στη συνέχεια σε 70,3% αυξάνει με ανάλογο τρόπο το δείκτη IRR από 10,9% σε 11,9% και 13,6%, αντίστοιχα. Επίσης, η εγκατάσταση μιας μονάδας παραγωγής αιθανόλης 2 ης γενιάς είναι πιθανόν να μην παρουσιάζεται βιώσιμη χωρίς κρατική επιδότηση, λόγω των παρόντων τιμών πώλησης της αιθανόλης και της δεδομένης τιμής του κόστους παραγωγής. Υπάρχουν όμως μελλοντικές προβλέψεις για την τιμή των ενζύμων που καθιστούν την τιμή πώλησης πολύ χαμηλότερη καθώς μειώνουν σημαντικά το λειτουργικό κόστος της μονάδας. Επιπρόσθετα, σημαντική συνεισφορά στη διαμόρφωση της τιμής πώλησης παρέχει η επεξεργασία του συνόλου των -237-

258 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις υδατανθράκων για παραγωγή αιθανόλης ή άλλων προϊόντων. Συνεπώς, η χρήση διαφορετικών μικροοργανισμών που εκμεταλλεύονται πεντόζες και ξυλόζες προς παραγωγή χημικών προϊόντων που προσθέτουν υψηλή αξία στο τελικό εγχείρημα, είναι απαραίτητη. Με γνώμονα τα παραπάνω δεδομένα, θεμελιώνεται η κεντρική ιδέα του βιοδιυλιστηρίου, που χρησιμοποιεί το σύνολο των δομικών συστατικών της βιομάζας για την παραγωγή, τόσο βιοκαυσίμων σε μεγάλες ποσότητες, όσο και βιοϋλικών υψηλής προστιθέμενης αξίας με πιο περιορισμένη δυναμικότητα της μονάδας. Σχήμα 7.2. Ανάλυση Ευαισθησίας της συμμετοχής διαφορετικών παραμέτρων στο λειτουργικό κόστος της διεργασίας παραγωγής αιθανόλης από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Πληθώρα εταιριών έχουν εφαρμόσει ή σχεδιάζουν την εφαρμογή των αποτελεσμάτων των τεχνικοοικονομικών μελετών πάνω στην παραγωγή της αιθανόλης σε πραγματικής κλίμακας μονάδες ή δοκιμαστικές μονάδες λίγο πριν την παραγωγή σε βιομηχανική κλίμακα. Παραδείγματα τέτοιων εταιριών είναι: η Iogen στον Καναδά που κατασκεύασε μονάδα με δυναμικότητα 1,5 εκατομμύριο λίτρα αιθανόλης το χρόνο, η POET στην Αιόβα των ΗΠΑ, η Abengoa (ABBK) η οποία κατασκευάζει νέα μονάδα στο Hugoton του Κάνσας (τέλος του 2014) με 94,625 εκατομμύρια λίτρα δυναμικότητας προερχόμενα από τόνους -238-

259 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις βιομάζας ετησίως. Ενώ, εταιρίες βιοτεχνολογικών εφαρμογών όπως είναι: η Genencor, η Diversa, η Novozymes και η Dyadic, βελτιώνουν την παραγωγή των ενζύμων, μειώνοντας το κόστος τους ώστε να μειωθεί περαιτέρω το συνολικό κόστος παραγωγής της αιθανόλης. Σε ευρωπαϊκό έδαφος, η BetaRenewables στην Ιταλία, παράγει από το 2013, τόνους βιοαιθανόλης δεύτερης γενιάς ετησίως, προερχόμενους από τόνους βιομάζας. Η ΒetaRenewables σε συνεργασία με την BioChemtext προετοιμάζουν την Energochemica SE στη Σλοβακία, που αποτελεί μία νέα μονάδα παραγωγής βιοαιθανόλης με δυναμικότητα τόνους αιθανόλης ετησίως. Καθώς άλλες τρεις μονάδες παραγωγής βιοαιθανόλης ετοιμάζονται στην Ιταλία. Επίσης, η DuPont κατασκευάζει μία μονάδα παραγωγής βιοδιυλιστηρίου, στην Πρώην Γιουγκοσλαβική Δημοκρατία της Μακεδονίας (FYROM), από λιγνοκυτταρινική βιομάζα με δυναμικότητα 100 εκατομμυρίων λίτρων που θα ξεκινήσει τις εργασίες κατασκευής της το 2016 και θα ολοκληρωθεί σε 2 χρόνια, μετά από κρατική συμφωνία για προσφορά πρώτων υλών. Οι παραπάνω ολοκληρωμένες βιομηχανικές εγκαταστάσεις καθώς και τα επενδυτικά σχέδια που θα ολοκληρωθούν στο μέλλον περιλαμβάνονται στον Πίνακα 7.1. Η διαφοροποίηση από τις πρώτες ύλες των βιοκαυσίμων 1 ης γενιάς που χρησιμοποιούσαν για την παραγωγή βιοκαυσίμων καρπούς που συμμετέχουν στη διατροφική αλυσίδα, σε παραγωγή βιοκαυσίμων 2 ης γενιάς από αγροτικά υπολείμματα και λιγνοκυτταρινούχα φυτά ενδημικά της κάθε περιοχής, προσφέρει ένα σημαντικό πεδίο συμμετοχής και δράσης στον αγροτικό τομέα, σε βιοτεχνολογικές μονάδες και σε επενδυτικές πρωτοβουλίες. Αυτό το ευρύ φάσμα δραστηριότητας έχει προκαλέσει το ενδιαφέρον της Ευρωπαϊκή Ένωσης, με εντοπισμένη τη μεγαλύτερη δραστηριότητα στην περιοχή της Ιταλίας. Η ιταλική κυβέρνηση έθεσε ως στόχο: η ανάμιξη της αιθανόλης δεύτερης γενιάς με τη βενζίνη να γίνει υποχρεωτική μέχρι το 2018 σε ποσοστό 0,6% και το ποσοστό αυτό να αυξηθεί στο 1% μέχρι το

260 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις Πίνακας 7.1. Υπάρχουσες και δοκιμαστικές μονάδες και επενδύσεις για την παραγωγή βιοαιθανόλης ανά τον κόσμο. Α/ Α Εταιρία Χώρα Δυναμικότητα Μονάδας (l/y) Τόνοι Βιομάζας (tn/y) 1 Iogen Καναδάς Poet 3 4 Αbengoa, Bioenergy Bioenergy Center, INEOS Αϊόβα, ΗΠΑ Κάνσας, ΗΠΑ Φλόριντα, ΗΠΑ DuPont FYROM Beta - Renewable s Energo - chemica Sunliquid, Clariant SA 9 SEKAB Ιταλία Σλοβακία Γερμανία Σουηδία, Πολωνία 10 Τotal Γαλλία Είδος Βιομάζας Άχυρο, Βαγάσση, Κοτσάνια Καλαμποκιού Κυτταρινούχα Βιομάζα Φύλλα, μίσχοι, στελέχη Γεωργικά και Αστικά Απόβλητα Ενεργειακά φυτά Κυτταρινούχα Βιομάζα Κυτταρινούχα Βιομάζα Άχυρο, Βαγάσση, Κοτσάνια Καλαμποκιού Σιτηρά / Maabjerg Δανία Γεωργικά και Δασικά υπολείμματα Κυτταρινούχα Βιομάζα Κατάσταση Δοκιμαστική Μονάδα Εμπορική Μονάδα Εμπορική Μονάδα Μελλοντική Επένδυση Μελλοντική Επένδυση (2016) Εμπορική Μονάδα Μελλοντική Επένδυση (2017) Εμπορική Μονάδα Εμπορική Μονάδα Πιλοτική Μονάδα/ Μελλοντική Επένδυση (2016) Μελλοντική Επένδυση (2017) -240-

261 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις 7.2 Οικονομικά στοιχεία για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος Η αφθονία των λιγνοκυτταρινικών υλικών και η πλούσια τους σύσταση επιτρέπει τη χρήση τους ως πρώτη ύλη τόσο για βιοκαύσιμα όσο και για βιοϋλικά υψηλής προστιθέμενης αξίας. Συγκεκριμένα, η παραγωγή βιοχημικών προϊόντων μπορεί να προέρχεται, τόσο από ρεύμα παραπροϊόντων των κύριων μονάδων παραγωγής (ζύμωση) και των μονάδων διαχωρισμού (απόσταξη down-streaming process), όσο και από το κύριο στάδιο επεξεργασίας ή ζύμωσης των σακχάρων, στα πλαίσια μιας μονάδας παραγωγής βιοαιθανόλης. Οι Adsul et al. (2011) ανέφεραν τη χρήση μικροοργανισμών για την παραγωγή από λιγνοκυτταρινική βιομάζα ενδιάμεσων προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας όπως γαλακτικό οξύ, ηλεκτρικό οξύ κ.α. Η οικονομική αγορά στην οποία απευθύνονται τα υλικά υψηλής προστιθέμενης αξίας δεν αποτελεί πολύ μεγάλο μερίδιο ώστε να μπορεί να στηρίξει μία αποκλειστική μονάδα παραγωγής. Ακόμα και αν η αγορά αυξανόταν τόσο ώστε να μπορεί να στηρίξει μία αποκλειστική μονάδα παραγωγής, το προϊόν θα έχανε την υψηλή προστιθέμενη αξία του, έχοντας γίνει πλέον βασικό προϊόν. Για παράδειγμα, οι ετήσιες πωλήσεις του ηλεκτρικού οξέος στις ΗΠΑ βρίσκονται πλέον σε περίσσεια σε ποσό τόνων ανά χρόνο. Η τιμή πώλησης του ηλεκτρικού οξέος στις ΗΠΑ κυμαίνεται ανάμεσα σε 5,96-8,89 $/kg προϊόντος σύμφωνα με την εταιρία παραγωγής Myriant σε συνεργασία με τη BASF (van Heerden & Nicol, 2013). Το ηλεκτρικό οξύ, στην παρούσα φάση, παράγεται κυρίως από μηλεϊνικό ανυδρίτη που και αυτός με τη σειρά του παράγεται πετροχημικά από το βουτάνιο. Πολύ μικρότερες ποσότητες ηλεκτρικού οξέος παράγονται μικροβιακά, μέσω ζύμωσης, και πωλούνται ως προσθετικό σε τρόφιμα. Το ηλεκτρικό οξύ βρίσκει εφαρμογή στην παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων, επιφανειοδραστικών, απορρυπαντικών και συστατικών που ενισχύουν την ανάπτυξη των ζώων και των φυτών. Επίσης, το ηλεκτρικό οξύ μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ενδιάμεσο προϊόν για την παραγωγή άλλων προϊόντων όπως είναι το αδιπικό οξύ, η 1,4- βουτανεδιόλη, η γ-βουτυρολακτόνη και η n-μεθυλοπυρρολιδόνη (Lynd et al., 2005). Το κόστος παραγωγής του άλατος του ηλεκτρικού οξέος που παράγεται μέσω της ζύμωσης υπολογίζεται περίπου 0,55 1,10 $/κιλό. Είναι φανερό ότι με αυτό το κόστος -241-

262 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις παραγωγής, το άλας του ηλεκτρικού οξέος προερχόμενο από μικροβιακή ζύμωση είναι ανταγωνιστικό με το άλας που παράγεται πετροχημικά (Paster et al. 2004). Όπως για τη βιοαιθανόλη, έτσι και για το ηλεκτρικό οξύ, υπάρχουν εταιρίες που σχεδιάζουν την εφαρμογή των αποτελεσμάτων της τεχνοοικονομικής μελέτης για μια μονάδα παραγωγής ηλεκτρικού οξέος. Συγκεκριμένα, η εταιρία Mitsubishi Chemical (Ιαπωνία) σχεδιάζει την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος σε μία μονάδα δυναμικότητας Mt/έτος, με τελικό προϊόν της παραγωγής το βιοαποικοδομήσιμο πολυμερές ηλεκτρικό πολυβουτυλένιο (PBB) (Wood, 2003). Ενώ, η κατασκευή ολοκληρωμένου βιοδιυλιστηρίου έχει ήδη ξεκινήσει στη Salamanca, με ενσωματωμένη παραγωγή ηλεκτρικού οξέος ως τμήμα μίας ήδη υπάρχουσας μονάδας παραγωγής βιοαιθανόλης με δυναμικότητα 5 εκατομμύρια λίτρα αιθανόλης/ χρόνο προερχόμενης από τόνους άχυρο (Bakker et al., 2010). Για τη μεταφορά της διεργασίας της συνδυασμένης παραγωγής ηλεκτρικού οξέος και αιθανόλης, σε μεγάλης κλίμακας βιομηχανική εφαρμογή, προτείνεται η μικροβιακή παραγωγή αιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος στην ίδια μονάδα ώστε να είναι εκμεταλλεύσιμα τα παραπροϊόντα της οδού παραγωγής του ενός προϊόντος από την παραγωγική οδό του άλλου. Συγκεκριμένα, το απαέριο της ζύμωσης του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae, θα μπορούσε να χρησιμοποιείται ως πηγή CO2 για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος υπό αναερόβια βακτηριακή ζύμωση από τον Actinobacillus succinogenes (Zeikus et al., 1999). Η τιμή της αιθανόλης σε μία τέτοια περίπτωση διαμορφώνεται ως συνάρτηση του ηλεκτρικού οξέος που παράγεται παράλληλα, σε μεγάλης κλίμακας βιοδιυλιστήριο. Για βραχυπρόθεσμες προβλέψεις σε μονάδα δυναμικότητας και τόνους ξηρής βιομάζας/μέρα και παραγωγή αιθανόλης 1135,623 MMl/y, η τιμή της αιθανόλης θα μπορούσε να παρουσιάσει μείωση της τάξης των 0,17 $/kg αν συνδυαζόταν με την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος δυναμικότητας 22 MMkg/y που θα χρησιμοποιούσε τμήμα της βιομάζας σε ποσοστό 0,5%. To διάγραμμα του Σχήματος 7.3 απεικονίζει αυτή τη συσχέτιση της τιμής πώλησης της αιθανόλης με την ποσότητα του ηλεκτρικού οξέος που συμπαράγεται

263 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις Σχήμα 7.3. Συσχέτιση της τιμής πώλησης της αιθανόλης σε σχέση με την ποσότητα του ηλεκτρικού οξέος που συμπαράγεται για βραχυπρόθεσμο και για μακροπρόθεσμο σενάριο. 7.3 Οικονομική αποτίμηση μιας ολοκληρωμένης μονάδας Παραδοχές για τη δυναμικότητα της μονάδας Στο σημείο αυτό θα πραγματοποιηθεί παρουσίαση των οικονομικών δεδομένων που αναμένεται να προκύψουν από μια επένδυση σε υπό μελέτη βιοχημική διεργασία λιγνοκυτταρινικής βιομάζας προς παραγωγή βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέως. Η τεχνοοικονομική ανάλυση θεωρεί ως βάση μονάδα με συγκεκριμένη δυναμικότητα ( τόνων/ έτος) και περιλαμβάνει την ανάλυση και την αποτίμηση των αναμενόμενων οικονομικών δεδομένων της επένδυσης. Το κύριο προϊόν της υπό μελέτης μονάδας είναι η βιοαιθανόλη. Το προϊόν αυτό μπορεί να έχει διάφορες χρήσεις, αλλά η κύρια χρήση του τα τελευταία χρόνια, για την οποία γίνονται προσπάθειες ώστε να καταστεί βιωσιμότερη η παραγωγή του, είναι ως βιοκαύσιμο. Συνεπώς, η βιοαιθανόλη λόγω των φυσικοχημικών της ιδιοτήτων μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε κινητήρες εσωτερικής καύσης (ICEs) οι οποίοι -243-

264 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις καταναλώνουν βενζίνη, δηλαδή το κύριο καύσιμο που χρησιμοποιείται στις ιδιωτικές μεταφορές στην Ελλάδα. Τα τελευταία χρόνια στη χώρα μας η κατανάλωση της βενζίνης έχει μια πτωτική πορεία με ποσότητα τόνων/χρόνο. Η ποσότητα αυτή θα χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της εγχώριας ζήτησης της βιοαιθανόλης για τα επόμενα χρόνια. Με βάση την ευρωπαϊκή οδηγία 2009/28/EC (2009) οι χώρες μέλη της Ε.Ε. πρέπει να καλύπτουν τουλάχιστον το 10% των αναγκών τους για καύσιμα κίνησης με εναλλακτικά καύσιμα εώς το έτος Δεδομένης της κατανάλωσης βενζίνης στην Ελλάδα, η ζήτηση για βιοαιθανόλη θα μπορούσε να διαμορφωθεί σε τόνους το χρόνο για τα επόμενα χρόνια. Επιπρόσθετα, τη δεδομένη χρονική στιγμή στη χώρα μας το μοναδικό βιοκαύσιμο που παράγεται είναι το βιοντiζελ, το οποίο αναμιγνύεται με το ντίζελ κίνησης. Συνεπώς, δεν έχει τεθεί σε λειτουργία καμία μονάδα παραγωγής βιοαιθανόλης (πρώτης ή δεύτερης γενιάς), οπότε η εκτίμηση ότι η υπό μελέτη μονάδα θα μπορούσε να καλύψει το 30% της αναμενόμενης συνολικής ζήτησης για βιοαιθανόλη θεωρείται ασφαλής. Επομένως, με βάση όλα τα παραπάνω δεδομένα και παραδοχές ορίσθηκε η υπό μελέτη μονάδα βιοαιθανόλης να έχει μια δυναμικότητα τόνων/ έτος. Η ζήτηση του ηλεκτρικού οξέος όπως αναφέρεται στην Παράγραφο 7.2 δε μπορεί να εκτιμηθεί λόγω των διευρυμένων εφαρμογών του, καθώς η ζήτηση του εξαρτάται από την τιμή διάθεσης του. Η παραγωγή ηλεκτρικού οξέος υπολογίζεται ίση με το 10% της παραγωγής της μονάδας σε βιοαιθανόλης, δηλαδή τόνους/έτος και η παραδοχή αυτή αποτελεί μια μονάδα δυναμικότητας που καλύπτει το 1,3% της εκτιμώμενης παραγωγικής δυναμικότητας παγκοσμίως σε ηλεκτρικό οξύ για το Συνεπώς είναι μια ποσότητα που αναμένεται να απορροφηθεί από την παγκόσμια αγορά. Για την παραγωγή τόνων/ έτος βιοαιθανόλης και τόνων/ έτος ηλεκτρικού οξέος απαιτούνται τόνοι ξηρής βιομάζας / έτος λειτουργίας και αντίστοιχα εκτάρια γης για την καλλιέργεια αυτής. Οι υπολογισμοί από αυτό το σημείο και έπειτα σχετικά με την τεχνοοικονομική ανάλυση της μονάδας βασίζονται στις αποδόσεις, την παραγωγικότητα και τις συγκεντρώσεις που προέκυψαν από την πειραματική μελέτη με ένα αισιόδοξο σενάριο όπως παρουσιάζονται στο διάγραμμα ροής που ακολουθεί (Σχήμα 7.4)

265 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας Συμπεράσματα και Προτάσεις Γλυκόζη 280,15 g/kg ΞΜ Κυτταρίνη 431 g/kg ΞΜ Αιθανόλη 128,6 g/kg ΞΜ Απόδοση Γλυκόζης 65 % Ημικυτταρίνες 55,1 g/kg ΞΜ Συνολική μετατροπή 70,7 % Απόδοση Αιθανόλης 80 % Λιγνίνη 75,6 g/kg ΞΜ μονομερών σακχάρων Σάκχαρα (C5, C6) ημικυτταρινών 214,7 g/kg ΞΜ Ηλεκτρικό Οξύ 139,6 g/kg ΞΜ Μετατροπή Ημικυτταρινών 80,41 % Απόδοση Ηλ. Οξέος 65 % Σχήμα 7.4. Διάγραμμα Ροής με ισοζύγια μάζας για τη συνολική διεργασία παραγωγής αιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από τη λιγνοκυτταρινική βιομάζα (Βάση: 1000 g ξηρής βιομάζας)

266 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας - Συμπεράσματα και Προτάσεις Καθορισμός της τιμής πώλησης των προϊόντων Εφ όσον το προϊόν το οποίο προορίζεται να υποκαταστήσει η παραγόμενη βιοαιθανόλη είναι η βενζίνη, η εκτίμηση της τιμής πώλησης της βιοαιθανόλης πρέπει να στηριχτεί στις εκτιμήσεις για την τιμή της βενζίνης, θεωρώντας δεδομένο ότι δεν θα υπάρξει κάποιου είδους επιδότηση στη χρήση της βιοαιθανόλης ως καύσιμο κίνησης. H πορεία της τιμής της βενζίνης στην Ελλάδα κατά την τελευταία τριετία χωρίς την προσθήκη των φόρων παρουσιάζει μία σταθεροποιητική τάση με μία ίσως ελαφρά αύξηση. Η μέση τιμή της τιμής την τελευταία τριετία ήταν 0,68 / λίτρο, χωρίς τους τεράστιους φορολογικούς συντελεστές που της επιβάλλονται. Θεωρώντας δεδομένο ότι θα υπάρξει μια αύξηση στις τιμές, λόγω και της αυξητικής τάσης των τιμών πετρελαίου, για την παρούσα μελέτη επιλέχθηκε η τιμή του 0,8 /λίτρο ως αρχική για το πρώτο έτος λειτουργίας της μονάδας. Η τιμή αυτή πρέπει να διορθωθεί με βάση το ενεργειακό περιεχόμενο της βιοαιθανόλης. Ένα λίτρο βενζίνης είναι ισοδύναμο ενεργειακά με 1,48 λίτρα βιοαιθανόλης. Χρησιμοποιώντας την αναλογία αυτή προκύπτει η επιθυμητή τιμή πώλησης της βιοαιθανόλης 0,540 /λίτρο ή 0,683 /kg, που συμφωνεί και με τις βιβλιογραφικές πηγές της Παραγράφου 7.1. Η τιμή στην παρούσα φάση του πετροχημικά παραγόμενου ηλεκτρικού οξέος, σε ένα συντηρητικό σενάριο κυμαίνεται στα $/τόνο ενώ η τιμή του μικροβιακά παραγόμενου ηλεκτρικού οξέος βρίσκεται μεταξύ $/τόνο. Επομένως, εκτιμάται ότι η τιμή του μικροβιακά παραγόμενου ηλεκτρικού οξέος θα φτάσει στα αμέσως επόμενα χρόνια τα $/ τόνο. Οι κύριοι παραγωγοί ηλεκτρικού οξέος θεωρούν ότι εφ όσον όλες οι μονάδες παραγωγής ηλεκτρικού οξέος από βιομάζα τεθούν σε λειτουργία και συνεπώς η ετήσια παραγωγή του αυξηθεί, τότε η τιμή του μπορεί να συνεχίσει την πτωτική πορεία. Δεδομένου ότι η παραγωγή μέσω της πετροχημικής οδού αναμένεται να γίνεται όλο και ακριβότερη, δεν θεωρείται ότι το ηλεκτρικό οξύ που παράγεται από βιομάζα θα εμφανίσει σημαντικά χαμηλότερη τιμή σε σχέση με την τιμή του πετροχημικά παραγόμενου προϊόντος (Weastra, 2012). Για την υπό μελέτη μονάδα επιλέχθηκε ως αρχική τιμή πώλησης του ηλεκτρικού οξέος η τιμή των 2400 $/ τόνο, η οποία εκτιμώντας ότι η αναλογία δολαρίου / ευρώ θα βρίσκεται στα επίπεδα του 1,35 μας δίνει μια τιμή 1,78 / kg

267 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας - Συμπεράσματα και Προτάσεις Εκτίμηση Κόστους Πάγιας Επένδυσης της μονάδας H εκτίμηση του κόστους της πάγιας επένδυσης πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του ερευνητικού προγράμματος «Λιγνοφός» (ΕΣΠΑ ). Οι δυναμικότητες των δύο προϊόντων όπως αναφέρθηκαν στην παράγραφο ισούται με τόνους αιθανόλης/έτος και τόνους ηλεκτρικού οξέος/έτος. Με βάση αντίστοιχες μονάδες παραγωγής από βιβλιογραφικές αναφορές με παρόμοιας πολυπλοκότητας διεργασίες (Aden et al., 2002, Lynd et al., 2005, Peters et al., 2006), o υπολογισμός της επένδυσης κεφαλαίου (πάγια επένδυση) πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο εκθετικού συντελεστή που εφαρμόζεται στην αναλογία μονάδας/ δυναμικότητας όπως περιγράφεται αναλυτικά στο Παράρτημα Γ. Η επένδυση κεφαλαίου (πάγια επένδυση) υπολογίστηκε στα 166,8 εκατομμύρια. Όσον αφορά το κόστος του εξοπλισμού της μονάδας παραγωγής, αναφέρεται στον εξοπλισμό της μονάδας παραγωγής αιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος, όπως περιλαμβάνεται στο διάγραμμα του Παραρτήματος Γ. Το πάγιο κόστος αφορά το σύνολο του πάγιου κεφαλαίου που απαιτείται για την κατασκευή της μονάδας παραγωγής, συνεπώς στο κόστος αυτό πρέπει να προστεθεί το κόστος που απαιτείται για την καλλιέργεια και παραγωγή της βιομάζας. Το κόστος αυτό έχει εκτιμηθεί σε 900 /εκτάριο. Επομένως, δεδομένου ότι θα απαιτηθούν εκτάρια για την παραγωγή της απαιτούμενης βιομάζας τότε το κόστος πάγιας επένδυσης για την παραγωγή βιομάζας προσδιορίζεται σε 27 εκατομμύρια. Έτσι το συνολικό απαιτούμενο πάγιο κεφάλαιο που απαιτείται να επενδυθεί ανέρχεται στα 193,82 εκατομμύρια. Το συνολικό πάγιο κεφάλαιο περιλαμβάνει το κόστος του εγκατεστημένου εξοπλισμού, το κόστος των αποθηκευτικών χώρων, τη διαμόρφωση του οικοπέδου, το εργολαβικό κόστος, το κατασκευαστικό κόστος, τα απρόβλεπτα κόστη και άλλα διάφορα κόστη. Η κατανομή σε ποσοστό επί τοις εκατό παρουσιάζεται στον Πίνακα 7.2 και βασίστηκε σε συντελεστές που σχετίζονται με το ολικό κόστος εγκατάστασης της μονάδας σύμφωνα με τις βιβλιογραφικές πηγές για τις χημικές βιομηχανίες από τους Peters et al. (2006). Τα διάφορα άλλα κόστη περιλαμβάνουν τα κόστη παράδοσης του έργου και της έναρξης λειτουργίας της μονάδας, αδειοδοτήσεις, μελέτες, παράβολα, υπερωρίες κατά την κατασκευή, ασφάλιση οικοπέδου, μεταφορικά εξοπλισμού καθώς και άλλα επιμέρους κόστη που δεν ανήκουν σε καμία από τις υπόλοιπες κατηγορίες

268 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας - Συμπεράσματα και Προτάσεις Πίνακας 7.2. Κατανομή πάγιου κόστους επένδυσης. Ποσοστό Επί Ολικού Κόστους Εγκατεστημένου Εξοπλισμού Ποσό [ ] Ολικό Κόστος Εγκατεστημένου Εξοπλισμού Κόστος Αποθηκευτικών χώρων 100% ,2% Διαμόρφωση Οικοπέδου 9,0% Εργολαβικό Κόστος 15,0% Κατασκευαστικό Κόστος 25,0% Απρόβλεπτα 10,0% Διάφορα άλλα κόστη 10,0% Σύνολο Πάγιας Επένδυση Μονάδας 170,2% Πάγιο κόστος πρώτης ύλης ΟΛΙΚΟ ΠΑΓΙΟ ΚΟΣΤΟΣ ΕΠΕΝΔΥΣΗΣ Εκτίμηση Λειτουργικού Κόστους Μονάδας Το μεταβλητό λειτουργικό κόστος της μονάδας υφίσταται μόνο εφ όσον η μονάδα είναι σε λειτουργία και περιλαμβάνει το κόστος πρώτων και βοηθητικών υλών, διαχείρισης τυχόν αποβλήτων καθώς και οποιοδήποτε κέρδος από την παραγωγή παραπροϊόντων. Με βάση την πειραματική διαδικασία και τις απαιτήσεις σε πρώτες και βοηθητικές ύλες, καταστρώθηκε ο Πίνακας 7.3 για την εκτίμηση του μεταβλητού λειτουργικού κόστους της μονάδας

269 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας - Συμπεράσματα και Προτάσεις Πίνακας 7.3. Μεταβλητό Λειτουργικό Κόστος μονάδας παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. kg/ kg βιομάζας Τιμή Μονάδας ( / ΜΤ) Κόστος / έτος ( / έτος) Οξύ (H2SO4) 0, Βάση (Ca(OH)2) 0, Νερό 0,102 1, Θρεπτικά 1, Ένζυμα 0, Παραγωγή Βιομάζας 56, Διαχείριση Στερεών 0, Λιγνίνη, γύψος (Ενέργεια) 0, ΟΛΙΚΟ ΜΕΤΑΒΛΗΤΟ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟ ΚΟΣΤΟΣ Οι τιμές των χημικών βοηθητικών πρώτων υλών (οξύ και βάση) καθώς και οι τιμές του νερού, θρεπτικών συστατικών και ενζύμων για τις ζυμώσεις έχουν εκτιμηθεί με βάση τις τρέχουσες βιομηχανικές τιμές προμήθειας αυτών στην Ελλάδα. Οι ποσότητες ανά κιλό βιομάζας έχουν εκτιμηθεί με βάση την πειραματική διεργασία όπως περιγράφεται στο διάγραμμα ροής του Σχήματος 7.4. Στο Σχήμα 7.5 παρουσιάζεται η συνεισφορά των επιμέρους κατηγοριών στο λειτουργικό κόστος της μονάδας. Σημαντικό τμήμα του κόστους καταλαμβάνει η παραγωγή της βιομάζας (39,6%) και τα θρεπτικά συστατικά της ζύμωσης όλων των σακχάρων καθώς και της καλλιέργειας της βιομάζας (45,3%). Αναφορικά με την υψηλή ποσότητα των θρεπτικών συστατικών της ζύμωσης που αποτελεί σημαντικό ποσοστό του λειτουργικού κόστους, πρέπει να σημειωθεί ότι σε επίπεδο βιομηχανικής κλίμακας πολλά από τα θρεπτικά μπορούν να αντικατασταθούν από παραπροϊόντα της διεργασίας όπως για παράδειγμα η πηγή του αζώτου θα μπορούσε να προέρχεται από κύτταρα του σακχαρομύκητα ανακυκλούμενα που δε χρησιμοποιούνται. Επιπρόσθετα, -249-

270 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας - Συμπεράσματα και Προτάσεις δεδομένου ότι τα θρεπτικά συστατικά της καλλιέργειας της φαλαρίδας είναι μια παράμετρος η οποία εξαρτάται από εξωγενείς παράγοντες, μια κατά το δυνατόν ορθότερη διαχείριση της όλης εφοδιαστικής αλυσίδας από το χωράφι ως τη μονάδα, θα μπορούσε να βελτιώσει σημαντικά στα οικονομικά μεγέθη της μονάδας. Το ενεργειακό κόστος εμφανίζεται αρνητικό, γεγονός που υποδεικνύει ότι η μονάδα έχει έσοδα κατά τη λειτουργία της από την πώληση παραπροϊόντων τα οποία έχουν μια θερμιδική αξία και συνεπώς μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως καύσιμα. Ουσιαστικά πρόκειται κατά κύριο λόγο για το περιεχόμενο σε λιγνίνη της βιομάζας το οποίο δεν μεταβολίζεται εντός της βιοχημικής επεξεργασίας προς παραγωγή βιοαιθανόλης ή ηλεκτρικού οξέως. Οι ενεργειακές ανάγκες τις μονάδας εκτιμήθηκαν ως εξής: ηλεκτρισμός 3,74 kj/kg βιομάζας και ατμός 0,468 kj/kg βιομάζας. Οι συνολικές δηλαδή ενεργειακές ανάγκες της μονάδας ανέρχονται σε 4,208 kj/kg βιομάζας. Οι προαναφερθείσες ανάγκες καλύπτονται με ιδιοπαραγωγή ηλεκτρισμού και ατμού από μονάδα συμπαραγωγής η οποία έχει συμπεριληφθεί στο πάγιο κόστος. Η μονάδα θα παράγει προϊόντα με ενεργειακό περιεχόμενο 12,285 kj/kg βιομάζας. Συνεπώς, το πλεόνασμα ενέργειας ανέρχεται σε 8,078 kj/kg τα οποία προέρχονται από 0,076 kg λιγνίνης/ kg βιομάζας και 0,002 kg γύψου/ kg βιομάζας. Θεωρώντας ότι οι ποσότητες περίσσειας σε λιγνίνη δε χρησιμοποιούνται στη μονάδα αλλά πωλούνται ως καύσιμο, προστίθεται ουσιαστικά ένα έσοδο από την πώληση ενεργειακών παραπροϊόντων της μονάδας. Συγκεκριμένα, η τιμή πώλησης που λαμβάνεται για τη λιγνίνη είναι της τάξης των 200 /τόνο, που αντιστοιχεί στο 1/3 περίπου της τιμή πώλησης του μαζούτ (ενός καύσιμου αναφοράς στην βιομηχανία για παραγωγή κυρίως ατμού), που θεωρείται ελκυστική τιμή για την πώληση ενός καυσίμου

271 Κεφάλαιο 7 Τεχνοοικονομική αποτίμηση της διεργασίας - Συμπεράσματα και Προτάσεις Σχήμα 7.5. Κατανομή Λειτουργικού Κόστους μιας μονάδας παραγωγής βιοαιθανόλης και ηλεκτρικού οξέος από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Το πάγιο λειτουργικό κόστος, σε αντιδιαστολή με το μεταβλητό, επιβαρύνει τη μονάδα είτε αυτή βρίσκεται σε πλήρη λειτουργία, είτε για οποιοδήποτε λόγο η παραγωγή έχει σταματήσει. Το πάγιο κόστος περιλαμβάνει τα μισθολογικά έξοδα και διάφορα άλλα κόστη, όπως τα έξοδα συντήρησης και ασφάλισης της μονάδας. Για την εκτίμηση του πάγιου λειτουργικού κόστους θεωρήθηκε ότι το εργοστάσιο θα λειτουργεί 7 ημέρες την εβδομάδα και επομένως θα χρειαστούν 4 βάρδιες προσωπικού (χειριστές της μονάδας). Η κάθε βάρδια εκτιμήθηκε ότι θα απαιτεί 4 χειριστές, έναν συντηρητή και ένα αποθηκάριο. Το συνολικά απασχολούμενο προσωπικό της μονάδας, μαζί με το διοικητικό προσωπικό, ανέρχεται σε 33 άτομα και το μισθολογικό κόστος / έτος (Παραδοτέα Προγράμματος Λιγνοφός, 2013)