ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ. Υποβληθείσα στο Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών. Υπό ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ Κ. ΚΟΥΡΜΕΝΤΖΑ.

Transcript

1 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΟΛΥ-ΥΔΡΟΞΥΑΛΚΑΝΕΣΤΕΡΩΝ (PHAs) ΑΠΟ ΚΑΘΑΡΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΤΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΣΥΝΘΕΤΙΚΩΝ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΥΓΡΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΕΛΑΙΟΤΡΙΒΕΙΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβληθείσα στο Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών Υπό ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ Κ. ΚΟΥΡΜΕΝΤΖΑ Επιστήμων Υλικών Για την απόκτηση του τίτλου του Διδάκτορα του Πανεπιστημίου Πατρών Πάτρα, Δεκέμβριος 2012

2

3 PRODUCTION OF POLY-HYDROXYALKANOATES (PHAs) FROM PURE AND MIXED CULTURES OF MICROORGANISMS USING SYNTHETIC SUBSTRATES AND OLIVE OIL MILL WASTEWATER Dissertation Thesis Submitted to the Department of Chemical Engineering University of Patras by Constantina C. Kourmentza Material Scientist In fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Chemical Engineering Patras, December 2012

4

5 Αφιερωμένο στους γονείς μου, Κωνσταντίνο και Παναγιώτα και τον αδερφό μου, Χρήστο

6

7 . Κουρμέντζα Κωνσταντίνα Πτυχιούχος Επιστήμων Υλικών Πανεπιστημίου Πατρών Copyright Κουρμέντζα Κωνσταντίνα Με επιφύλαξη παντός δικαιώματος. All rights reserved. Απαγορεύεται η αντιγραφή, αποθήκευση και διανομή της παρούσας εργασίας, εξ ολοκλήρου ή τμήματος αυτής, για εμπορικό σκοπό. Επιτρέπεται η ανατύπωση, αποθήκευση και διανομή για σκοπό μη κερδοσκοπικό, εκπαιδευτικής ή ερευνητικής φύσης, υπό την προϋπόθεση να αναφέρεται η πηγή προέλευσης και να διατηρείται το παρόν μήνυμα. Ερωτήματα που αφορούν τη χρήση της εργασίας για κερδοσκοπικό σκοπό πρέπει να απευθύνονται προς την συγγραφέα. Οι απόψεις και τα συμπεράσματα που περιέχονται σε αυτό το έγγραφο εκφράζουν την συγγραφέα και δεν πρέπει να ερμηνευθεί ότι αντιπροσωπεύουν τις επίσημες θέσεις του Πανεπιστημίου Πατρών.

8

9 Ευχαριστίες Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχηµικής Μηχανικής & Τεχνολογίας Περιβάλλοντος του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά όλους όσους συνέβαλαν στην ολοκλήρωσή της. Συγκεκριμένα: τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Μιχαήλ Κορνάρο για την επιστημονική καθοδήγηση και αμέριστη υποστήριξή του στα πλαίσια της πολυετούς συνεργασίας μας, τον Καθηγητή του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Εθνικού Μετσόβιου Πολυτεχνείου κ. Γεράσιμο Λυμπεράτο τόσο για την φιλοξενία μου στο εργαστήριο του όσο και για την επιστημονική επίβλεψη και ουσιαστική συμβολή του κατά τα δύο πρώτα έτη διεξαγωγής της παρούσας διατριβής, τον Καθηγητή του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Σταύρο Παύλου, τον Καθηγητή του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Κωνσταντίνο Τσιτσιλιάνη, τον Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Γεώργιο Αγγελή, τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Ιωάννη Κούκο καθώς και τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Χριστάκη Παρασκευά για την ευγένεια και την προθυμία τους να συμμετάσχουν στην Εξεταστική Επιτροπή, όλους τους συνεργαζόμενους φοιτητές και ερευνητές του Εργαστηρίου Βιοχημικής Μηχανικής & Τεχνολογίας Περιβάλλοντος Αλέξανδρο Κοψαχείλη, Ανδρέα Ψάλτη, Θεόφιλο Βλάσση, Ελένη Κουτρούλη, Παναγιώτη Βλάχο, Κωνσταντίνα Πάκου, Αικατερίνη Σταματελάτου, Ekaterina Mitova, Nikoleta Stoyanova, Sveta Sienkevich, Γεώργιο Σαβογλίδη, Ασημίνα Τρεμούλη, Χρήστο Λύτρα, Γεωργία Αντωνοπούλου, Αργυρώ Κοντογιάννη, Βασίλειο Τσινταβή, Βασιλεία Πανούτσου, Πάρη Κατσίνα, Κωνσταντίνα Κουνάβη και Μαργαρίτα Βαρτζέλη για την ευχάριστη συνεργασία μας, iv

10 ιδιαίτερα δε τον διδάκτορα Νικόλαο Βενετσανέα για την βοήθεια, την υποστήριξη και τις ατελείωτες ώρες συζήτησης τόσο σε επιστημονικό όσο και σε φιλικό επίπεδο, την διδάκτορα Κωνσταντίνα Μαραζιώτη για την σημαντική βοήθεια και τις συμβουλές που μου προσέφερε στα πρώτα στάδια αυτής της διατριβής και την διδάκτορα Ιωάννα Ντάϊκου για την συνεργασία μας κατά τα δύο πρώτα έτη. Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ ανήκει τους γονείς µου, Κωνσταντίνο και Παναγιώτα και τον αδελφό µου Χρήστο για την υπομονή και την αµέριστη ηθική και ψυχολογική συμπαράσταση που έχουν επιδείξει όλα αυτά τα χρόνια, στον θείο μου Φώτη Νίκου, στους πολύ καλούς μου φίλους Ελένη Καραθανάση και Χρήστο Λυμπερόπουλο καθώς και στους Last Sparkle of Joy, Στάθη Σταθόπουλο, Μπάμπη Καρύδη, Γιάννη Σταθόπουλο και Μιχάλη Πελεκανάκη για την μουσική τους συντροφιά. v

11 Περίληψη Κατά την διάρκεια των τελευταίων χρόνων η εκτεταμένη χρήση των πλαστικών υλικών σε συνδυασμό με το γεγονός πως ακόμη και μετά την διάθεση τους τα υλικά αυτά παραμένουν στο περιβάλλον για πολλά χρόνια, έχει προκαλέσει ένα από τα σημαντικότερα περιβαλλοντικά προβλήματα σε παγκόσμια κλίμακα. Για τον λόγο αυτό ιδιαίτερη έμφαση έχει δοθεί στην ανάπτυξη υλικών τα οποία έχουν την ικανότητα να αποδομούνται από το περιβάλλον στο οποίο διατίθενται και ονομάζονται βιοδιασπώμενα πολυμερή. Μεταξύ των διαφόρων τύπων υλικών που επάγονται σε αυτή την κατηγορία μεγάλο ενδιαφέρον έχει προκαλέσει η ομάδα των πολύ-υδροξυαλκανεστέρων (Poly-hydroxyalkanoates: PHAs). Περισσότερα από 300 στελέχη μικροοργανισμών έχουν χαρακτηριστεί ως προς την ικανότητα τους να συνθέτουν και να συσσωρεύουν τα πολυμερή αυτά ως αποθήκη άνθρακα και ενέργειας. Η συσσώρευση των PHAs πραγματοποιείται με την μορφή ενδοκυτταρικών εγκλεισμάτων όταν ο μικροβιακός πληθυσμός καλείται να ανταπεξέλθει κάτω από δυναμικές συνθήκες οι οποίες έχουν να κάνουν με την έλλειψη ενός χρήσιμου για την μικροβιακή ανάπτυξη συστατικού. Τέτοιες συνθήκες επιτυγχάνονται με περιορισμό του θρεπτικού μέσου σε άζωτο, φωσφόρο, μαγνήσιο, θείο, οξυγόνο ενώ υπάρχει υπερεπάρκεια όσον αφορά την πηγή άνθρακα την οποία οι μικροοργανισμοί θα χρησιμοποιήσουν ως υπόστρωμα για την παραγωγή PHAs. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχτηκε μικτή καλλιέργεια μικροοργανισμών ικανών για παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας δραστική λάσπη ως πρώτη ύλη. Ο εμπλουτισμός της καλλιέργειας σε ΡΗΑ-συσσωρευτικά βακτήρια πραγματοποιήθηκε σε αντιδραστήρα περιοδικής πλήρωσης και απορροής (draw n fill reactor) ενώ η στρατηγική εμπλουτισμού που ακολουθήθηκε ήταν η εναλλαγή μεταξύ περιοριστικών υποστρωμάτων άνθρακα και αζώτου στο θρεπτικό μέσο. Η εμπλουτισμένη μικτή καλλιέργεια χαρακτηρίστηκε όσον αφορά τα κυρίαρχα στελέχη που την απαρτίζουν μέσω τεχνικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR). Έξι διαφορετικά στελέχη απομονώθηκαν τα οποία βρέθηκαν να ανήκουν στο γένος Pseudomonas. Κάθε ένα από αυτά μαζί με την μικτή καλλιέργεια μελετήθηκαν ως προς vi

12 την ικανότητα τους να παράγουν PHAs τόσο σε αερόβιες συνθήκες απουσίας αζώτου όσο και σε συνθήκες απουσίας αζώτου με ταυτόχρονο περιορισμό σε οξυγόνο. Στις παραπάνω περιπτώσεις ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε συνθετικό μίγμα πτητικών λιπαρών οξέων (οξικό, προπιονικό, βουτυρικό) καθώς επίσης και οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου (εκροή μεσόφιλου υδρογονοπαραγωγού αντιδραστήρα) πλούσιο σε πτητικά λιπαρά οξέα. Σύμφωνα με τα πειραματικά δεδομένα η μικτή καλλιέργεια έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα όσον αφορά τα ποσοστά συσσώρευσης και τους συντελεστές απόδοσης σε PHAs οπότε και προτιμήθηκε η χρήση και η περαιτέρω μελέτη της συμπεριφοράς της. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκαν πειράματα διαλείποντος έργου για την διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών παραγωγής PHAs από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια χρησιμοποιώντας συνθετικά υποστρώματα δηλαδή οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ. Συγκεκριμένα μελετήθηκε: (α) η επίδραση του αρχικού ph χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος (g/l 1:1:1), (β) η επίδραση της πηγής άνθρακα στην κατανομή των μεταβολικών προϊόντων χρησιμοποιώντας είτε οξικό είτε προπιονικό είτε βουτυρικό οξύ καθώς και τους πιθανούς συνδυασμούς αυτών και (γ) η επίδραση του λόγου C/N στο θρεπτικό μέσο χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος (g/l 1:1:1). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μελέτη της ανάπτυξης της κυτταρικής βιομάζας μέσω της κατανάλωσης των ενδοκυτταρικά συσσωρευμένων PHAs παρουσία εξωκυτταρικής πηγής αζώτου με ταυτόχρονη απουσία πηγής άνθρακα καθώς και η ενδοκυτταρική βιοαποδόμηση των PHAs για λόγους συντήρησης της βιομάζας. Κάνοντας χρήση του λογισμικού πακέτου MATLAB επιχειρήθηκε η πρόβλεψη τόσο της κατανάλωσης της πηγής άνθρακα όσο και της κατανομής των παραγόμενων PHAs στα πειράματα που αφορούν την παραγωγή των PHAs από διαφορετικές πηγές άνθρακα. Τέλος, σε μια προσπάθεια μείωσης του κόστους του υποστρώματος η οποία συνεπάγεται μείωση του κόστους των παραγόμενων PHAs, διερευνήθηκε η εκμετάλλευση οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου το οποίο ήταν προϊόν εκροής μεσόφιλου υδρογονοπαραγωγού αντιδραστήρα σε αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας τύπου SBR. vii

13 Abstract During the last years the widespread use of plastic materials combined with the fact that even after their disposal these materials remain in the environment for many years, has caused one of the major environmental problems worldwide. For this reason special emphasis has been given to the development of materials which have the ability to degrade in the environment in which they are disposed and are called biodegradable polymers. Among the various types of materials that are induced in this category the group of Polyhydroxyalkanoates (PHAs) attracts great interest. More than 300 strains of microorganisms have been characterized for their ability to synthesize and accumulate these polymers as carbon and energy storage. PHAs are accumulated in the form of intracellular inclusions (granules) when the microbial faces dynamic conditions which have to do with a lack of a useful for microbial growth component. Such conditions are achieved by providing a growth-limiting the medium in nitrogen, phosphorus, magnesium, sulfur, oxygen in the presence of excess carbon source which microorganisms use as precursor for PHAs production.. In the present thesis a mixed culture of microorganisms capable of producing PHAs was developed using activated sludge. The enrichment of the culture to PHAs forming bacteria took place in a draw n fill reactor and the culture was submitted to alternating cycling between limitation of carbon and nitrogen substrates. After several cycles of operation under the above-mentioned conditions, the behavior of the culture seemed to stabilize and the microbial consortium that represented the enriched culture was identified via real-time polymerase chain reaction (PCR). Six different strains were isolated which were found to belong to the Pseudomonas genus.. The isolated strains and the enriched culture were subsequently studied in terms of PHAs accumulation capacity under aerobic, nitrogen-limiting conditions as well as under dual nitrogen and oxygen limiting conditions. In these cases the carbon source used was a synthetic mixture of acetate, propionate and butyrate as well as acidified olive oil mill wastewater (outflow of mesophilic viii

14 reactor used for biohydrogen production) which was rich in volatile fatty acids. According to experimental data obtained, the enriched mixed culture gave the best results in terms of PHAs accumulation and yield and was consequently selected for further investigation. Subsequently, batch experiments were performed in order to investigate the optimal conditions for PHAs production by the enriched mixed culture using synthetic substrates i.e. acetic, propionic and butyric acid. Specifically, (a) the influence of the initial ph using as carbon source a mixture of acetic, propionic and butyric acid (g/l 1:1:1) was studied, (b) the effect of the carbon source in the distribution of metabolic products using either acetic or propionic or butyric acid and all possible combinations thereof was studied and (c) the effect of the ratio c / N in the medium using as carbon source a mixture of acetic, propionic and butyric acid (g/l 1:1:1) was studied. Furthermore, the microbial growth through consumption of intracellular accumulated PHAs using extracellular nitrogen source with simultaneous absence of a carbon source was investigated as well as the intracellular biodegradation of PHAs for biomass maintenance. By using the MATLAB software it was attempted to simulate and predict both the consumption of the carbon source and the distribution of PHAs produced in the experiments related to the production of PHAs from different carbon sources. Finally, in an effort to reduce the cost of the substrate which reduces the cost of produced PHAs, we investigated the use of acidified olive mill wastewater in a continuous SBR type reactor. ix

15 Η χρήση της ονοματολογίας που αφορά βιοχημικούς όρους πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το λεξικό: ELSEVIER S DICTIONARY OF MEDICINE AND BIOLOGY, PART I BASIC TABLE, G. Konstantinidis, Elsevier B.V., ISBN: , x

16 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΣΥΜΒΑΤΙΚΑ ΚΑΙ ΒΙΟΔΙΑΣΠΩΜΕΝΑ ΠΟΛΥΜΕΡΗ Ιστορική αναδρομή Παραγωγή και εφαρμογές συμβατικών πολυμερών Διαχείριση απορριφθέντων πλαστικών Βιοδιασπώμενα πολυμερή Η έννοια της βιοδιάσπασης Ταξινόμηση βιοδιασπώμενων πολυμερών Παραγωγή και εφαρμογές βιοδιασπώμενων πολυμερών 19 Βιβλιογραφία 1 ου κεφαλαίου..23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΠΟΛΥ-ΥΔΡΟΞΥΑΛΚΑΝΕΣΤΕΡΕΣ (PHAs) Ιστορική αναδρομή Ανίχνευση των PHAs Χημική δομή και ταξινόμηση των PHAs Ιδιότητες των PHAs Αποδόμηση των PHAs Ο κύκλος ζωής των PHAs Εφαρμογές των PHAs Βιομηχανική παραγωγή των PHAs Μελλοντικές προβλέψεις. 56 Βιβλιογραφία 2 ου κεφαλαίου..58 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΩΝ PHAs Γενική περιγραφή της βακτηριακής διεργασίας παραγωγής των PHAs Μικροοργανισμοί ικανοί να συσσωρεύουν PHAs Βιοσύνθεση και ενδοκυτταρική βιοαποδόμηση των PHAs PHA συνθάση/ πολυμεράση Μορφολογία και δομή PHA κοκκίων Μοντέλο σχηματισμού των ΡΗΑ κοκκίων Υποστρώματα Στρατηγικές ζύμωσης Διαχωρισμός και ανάκτηση των PHAs Η οικονομική πλευρά της διεργασίας. 90 Βιβλιογραφία 3 ου κεφαλαίου..96 xi

17 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΠΑΡΑΓΩΓΗ PHAs ΑΠΟ ΚΑΘΑΡΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Οδοί βιοσύνθεσης των PHAs σε καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών Παραγωγή PHAs από φυσικούς μικροοργανισμούς Παραγωγή PHAs από το βακτήριο Alcaligenes eutrophus Παραγωγή PHAs από τα βακτήρια Alcaligenes latus και Azotobacter vinelandii Παραγωγή PHAs από μεθυλότροφα βακτήρια Παραγωγή PHAs από βακτήρια του γένους Pseudomonas Παραγωγή PHAs από γενετικά ανασυνδυασμένα στελέχη μικροοργανισμών..112 Βιβλιογραφία 4 ου κεφαλαίου 115 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΠΑΡΑΓΩΓΗ PHAs ΑΠΟ ΜΙΚΤΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Οδοί βιοσύνθεσης των PHAs σε μικτές καλλιέργειες μικροοργανισμών Διεργασίες εμπλουτισμού μικτών καλλιεργειών με ΡΗΑ συσσωρευτές Αναερόβια αερόβια διεργασία (ή αλλιώς σύστημα PAO/ GAO) Μικροαεροφιλική αερόβια διεργασία Δυναμική αερόβια διεργασία (ή αλλιώς κύκλος υπερεπάρκειας έλλειψης υποστρώματος) Επίτευξη συσσώρευσης PHAs 132 Βιβλιογραφία 5 ου κεφαλαίου ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αναλυτικές μέθοδοι Μέτρηση ph Μέτρηση διαλυτού οξυγόνου D.O Προσδιορισμός ολικών και πτητικών αιωρούμενων στερεών Προσδιορισμός χημικά απαιτούμενου οξυγόνου Προσδιορισμός υδατανθράκων Προσδιορισμός ολικού αζώτου Προσδιορισμός αμμωνιακού αζώτου Προσδιορισμός νιτρικού αζώτου Προσδιορισμός νιτρώδους αζώτου Προσδιορισμός πτητικών λιπαρών οξέων Προσδιορισμός πολύ-υδροξυαλκανεστέρων Προσδιορισμός γλυκογόνου Απόσπαση ολικών πολύ-υδροξυαλκανεστέρων Υλικά Καλλιέργειες μικροοργανισμών Μικτή εμπλουτισμένη καλλιέργεια Στελέχη του γένους Pseudomonas που απομονώθηκαν από την xii

18 εμπλουτισμένη καλλιέργεια Αναβίωση και συντήρηση βακτηριακών στελεχών Υποστρώματα άνθρακα Συνθετικά υποστρώματα άνθρακα Οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου Πειραματικές διατάξεις Αντιδραστήρας εμπλουτισμού σε ΡΗΑ συσσωρευτές περιοδικής άντλησης πλήρωσης Αντιδραστήρας τύπου διαλείποντος έργου Αντιδραστήρας τύπου SBR Υπολογισμοί PHAs και βιομάζα SND και απομάκρυνση ολικού αζώτου Βιβλιογραφία 6 ου κεφαλαίου..169 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΠΑΡΑΓΩΓΗ PHAs ΑΠΌ ΤΗΝ ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΕΝΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΤΑ ΣΤΕΛΕΧΗ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ PSEUDOMONAS Υλικά και μέθοδοι Μικροοργανισμοί Υποστρώματα Πειραματική διάταξη και συνθήκες Παρουσίαση αποτελεσμάτων και συζήτηση Παραγωγή PHAs από συνθετικό θρεπτικό μέσο απουσία πηγής αζώτου Παραγωγή PHAs από συνθετικό θρεπτικό μέσο απουσία πηγής αζώτου και υπό συνθήκες περιορισμού οξυγόνου Παραγωγή PHAs από οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου απουσία πηγής αζώτου Παραγωγή PHAs από οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου απουσία πηγής αζώτου και υπό συνθήκες περιορισμού οξυγόνου Γενικά συμπεράσματα 192 Βιβλιογραφία 7 ου κεφαλαίου ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ΠΑΡΑΓΩΓΗ PHAs ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΕΝΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΝΟΝΤΑΣ ΧΡΗΣΗ ΣΥΝΘΕΤΙΚΩΝ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ Υλικά και μέθοδοι Μικροοργανισμοί Υποστρώματα Πειραματική διάταξη και συνθήκες Παρουσίαση αποτελεσμάτων και συζήτηση Επίδραση της τιμής του αρχικού ph xiii

19 ph = ph = ph = ph = Συμπεράσματα Επίδραση της πηγής άνθρακα Οξικό οξύ Προπιονικό οξύ Βουτυρικό οξύ Μίγμα οξικού και προπιονικού οξέος Μίγμα οξικού και βουτυρικού οξέος Μίγμα προπιονικού και βουτυρικού οξέος Μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος Γλυκόζη Συμπεράσματα Επίδραση του λόγου C/N Συνθήκες περίσσειας αζώτου C/Ν = 11 Cmmol/ Nmmol Συνθήκες περιορισμού σε άζωτο C/N = 22 Cmmol/ Nmmol Συνθήκες περιορισμού σε άζωτο C/N = 80 Cmmol/ Nmmol Συμπεράσματα Κατανάλωση ενδοκυτταρικά συσσωρευμένων PHAs Ανάπτυξη μέσω κατανάλωσης ΡΗΒ Ανάπτυξη μέσω κατανάλωσης ΡΗΒV Κατανάλωση ΡΗΒ για λόγους συντήρησης Κατανάλωση ΡΗΒV για λόγους συντήρησης Συμπεράσματα Γενικά συμπεράσματα.285 Βιβλιογραφία 8 ου κεφαλαίου ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΙΝΗΤΙΚΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΤΩΝ PHAs Μοντέλα περιγραφής της παραγωγής των PHAs Ανάπτυξη μαθηματικού μοντέλου Υλικά και μέθοδοι Λογισμικό πακέτο MATLAB Η μέθοδος αριθμητικής επίλυσης διαφορικών εξισώσεων ode23s Επίλυση προβλημάτων βελτιστοποίησης μέσω της συνάρτησης fmincon Εκτίμηση κινητικών παραμέτρων και υπολογισμός σφάλματος Παρουσίαση αποτελεσμάτων και συζήτηση Οξικό οξύ Βουτυρικό οξύ Προπιονικό οξύ Μίγμα οξικού και βουτυρικού οξέος xiv

20 Μίγμα οξικού και προπιονικού οξέος Μίγμα προπιονικού και βουτυρικού οξέος Μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος Γενικά συμπεράσματα Βιβλιογραφία 9 ου κεφαλαίου ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΡHAs ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΕΝΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΑΝΟΝΤΑΣ ΧΡΗΣΗ ΑΠΟΒΛΗΤΟΥ ΕΛΑΙΟΤΡΙΒΕΙΟΥ Υλικά και μέθοδοι Μικροοργανισμοί Υποστρώματα Πειραματική διάταξη και συνθήκες Προκαταρκτικά πειράματα Ανάπτυξη της εμπλουτισμένης καλλιέργειας σε οξυνισμένο απόβλητο Ελαιοτριβείου Συσσώρευση PHAs μέσω της εμπλουτισμένης καλλιέργειας από οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου Σχεδιασμός διεργασίας παραγωγής PHAs σε αντιδραστήρα τύπου SBR Παρουσίαση αποτελεσμάτων και συζήτηση Γενικά συμπεράσματα Βιβλιογραφία 10 ου κεφαλαίου ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι ΣΥΝΤΟΜΟ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ ΔΕΚΑΠΕΝΤΑΣΕΛΙΔΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ xv

21 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 2.1. Παρατήρηση ΡΗΑ κόκκων στο βακτήριο Wautersia eutropha H16 μέσω (α) μικροσκοπίου ΤΕΜ (Lee at al., 2000), (β) οπτικού μικροσκοπίου αντιθέσεως φάσεων (Tian et al., 2005), (γ) μικροσκοπίου φθορισμού έπειτα από χρώση με Nile Blue A (Rees et al., 1992)...30 Εικόνα 2.2. Βιοαποδόμηση των PHAs α) Ανάπτυξη μικροοργανισμού σε άγαρ χρησιμοποιώντας ΡΗΒ ως πηγή άνθρακα και ενέργειας αφού πρώτα το υδρολύσει σε ολιγομερή με την βοήθεια του ενζύμου ΡΗΒ-αποπολυμεράση (Jendrossek, 2001), β) αποδόμηση φιαλών Biopol έπειτα από 0, 2, 4, 6, 8 και 10 εβδομάδες από την παραμονή τους σε αερόβια λάσπη λυμάτων (Madison & Huisman, 1999)...44 Εικόνα 2.3. Διάφορες εφαρμογές των PHAs (Chen, 2009)...50 Εικόνα 6.1. Σχηματιζόμενες αποικίες μικροοργανισμών του γένους Pseudomonas σε τρυβλία Petri Εικόνα 6.2. Ο μικροοργανισμός Pseudomonas putida ( Εικόνα 6.3. Ο αντιδραστήρας εμπλουτισμού τύπου άντλησης-πλήρωσης. Σχηματική αναπαράσταση (επάνω) και γενική άποψη της διάταξης (κάτω) Εικόνα 6.4. Ο αντιδραστήρας διαλείποντος έργου περιοδικής λειτουργίας SBR. Σχηματική αναπαράσταση (επάνω) και γενική άποψη της διάταξης (κάτω) xvi

22 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 1.1. Παραγωγή πλαστικών υλικών κατά την περίοδο στην Ευρώπη και σε παγκόσμια κλίμακα (Συμπεριλαμβάνονται θερμοπλαστικά, θερμοσκληρυνόμενα και ελαστομερή υλικά, πολυουρεθάνες, ρητίνες, συγκολλητικά και υλικά επικάλυψης και στεγανοποίησης, καθώς και ίνες πολυπροπυλενίου. Εξαιρούνται PET-, PA- και πολυακρυλικές ίνες (Plastics-the Facts 2011)..7 Σχήμα 1.2. Παραγωγή πλαστικών υλικών κατά το έτος 2008 ανά χώρα (Plastics-the Facts 2011). 7 Σχήμα 1.3. Ζήτηση πλαστικών υλικών ανά κατηγορία στην Ευρώπη (Plastics-the Facts 2011). 8 Σχήμα 1.4. Τελικές εφαρμογές συνθετικών υλικών στην Ευρώπη (Plastics-the Facts 2011). 9 Σχήμα 1.5. Η πορεία της βιοδιάσπασης στα βιοδιασπώμενα πολυμερή (Smith, 2005) 13 Σχήμα 1.6. Ταξινόμηση βιοδιασπώμενων πολυμερών Σχήμα 2.1. Γενική χημική δομή των μονομερικών ομάδων PHAs (Chen, 2009).. 32 Σχήμα 2.2. Χημική δομή PHA-συμπολυμερών (Keshavarz & Roy, 2010) Σχήμα 2.3. Τα συνηθέστερα ΡΗΑ-μονομερή (Zhang at al., 2009) Σχήμα 2.4. Οι σχέσεις μεταξύ (α) κρυσταλλικότητας, (β) θερμοκρασίας τήξης και (γ) θερμοκρασίας υαλώδους μετάβασης με το ποσοστό της δεύτερης μονομερικής ομάδας για τυχαία συμπολυμερή R-(3HB) με διάφορες ομάδες HAs. Συγκεκριμένα για τα συμπολυμερή ( ) Ρ(3HB-co-3HV), ( ) P(3HB-co-3HHx), ( ) P(3HB-co-3 mcl-pha), ( ) P(3HB-co-3HP), ( ) P(3HBco-4HB) (Sudesh & Abe, 2010)...39 Σχήμα 2.5. Φυσικές καταστάσεις των PHAs (Jendrossek, 2001) Σχήμα 2.6. Ενζυμική υδρόλυση του μονοκρυστάλλου ΡΗΒ από το ένζυμο ΡΗΒ αποπολυμεράση (Sudesh et al., 2000) Σχήμα 2.7. Ο κύκλος ζωής των PHAs (Gross & Karla, 2002)...49 Σχήμα 3.1. Συνοπτική παρουσίαση της διαδικασίας παραγωγής PHAs (Kessler at al., 2001) 69 xvii

23 Σχήμα 3.2. Βιοσυνθετικό μονοπάτι του ΡΗΒ. Το ΡΗΒ συντίθεται από την διαδοχική δράση των ενζύμων β-κετοθειολάση (phba), αναγωγάση του AcCoA (phbb) και ΡΗΑ-πολυμεράση (phbc) σε μια διαδικασία τριών σταδίων. Τα γονίδια του οπερονίου phbcab κωδικοποιούν τα τρια ένζυμα. Ο προαγωγέας (Ρ) κινείται προς το phbc μεταγράφοντας ολόκληρο το οπερόνιο (Madison & Huisman, 1999).74 Σχήμα 3.3. Πορεία της βιοσύνθεσης και αποδόμησης του PHB στο βακτήριο Alcaligenes eutrophus. Τα ένζυμα που καταλύουν τις αντιδράσεις είναι: (1) β-κετοθειολάση, (2) NADPH αναγωγάση του ακετοξικού-coa, (3) PHA-πολυμεράση, (4) NADPH αφυδρογονάση του ακετοξικού-coa, (5) PHA-αποπολυμεράση, (6) (R)-3-υδροξυβουτυρική αποπολυμεράση, και (7) συνθετάση του ακετοξικού-coa (Steinbuchel & Lutke-Eversloh, 2003) Σχήμα 3.4. Σχηματική αναπαράσταση ΡΗΑ κοκκίου Σχήμα 3.5. Ομοιότητες μεταξύ ΡΗΑ συνθάσης (C) και λιπάσης (L). Η ΡΗΑ αποπολυμεράση (Z) δρα και αυτή στην επιφάνεια του κόκκου διασπώντας το πολυμερές σε μονομερή. 81 Σχήμα 3.6. Προτεινόμενος μηχανισμός για τον σχηματισμό ΡΗΑ κοκκίων...82 Σχήμα 4.1. Βιοσύνθεση PHAs από σάκχαρα στο βακτήριο Ralstonia eutropha (Μεταβολικό μονοπάτι Ι) (Cevallos et al., 1996) Σχήμα 4.2. Βιοσύνθεση PHAs από λιπαρά οξέα στο βακτήριο R. Rubrum (Μεταβολικό μονοπάτι ΙΙ) (Sudesh et al., 2000) Σχήμα 4.3. Βιοσύνθεση PHAs στα βακτήρια του γένους Pseudomonas της ομόλογης ομάδας ΙΙ (Μεταβολικό μονοπάτι IV) (Rehm et al., 2001) Σχήμα 5.1. Μεταβολικά μονοπάτια βιοσύνθεσης των PHAs στις μικτές καλλιέργειες (Serafim et al., 2004) Σχήμα 5.2. Διεργασία παραγωγής PHAs από μικτές καλλιέργειες μικροοργανισμών (Albuquerque et al., 2007) Σχήμα 5.3. Μεταβολισμός προς παραγωγή PHAs κατά το αναερόβιο στάδιο στο σύστημα PAO/GAO (Saito et al., 1995) Σχήμα 5.4. Παραγωγή PHAs σε συνθήκες υπερεπάρκειας/έλλειψης υποστρώματος: Το παράδειγμα της σύνθεσης (υπερεπάρκεια) και υποβάθμισης (έλλειψη) του PHB (Saito et al., 1998) Σχήμα 7.1. Παράμετροι ανά τύπο καλλιέργειας που χαρακτηρίζουν την παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας συνθετικό μέσο απουσία αζώτου: (α) ποσοστά ενδοκυτταρικής συσσώρευσης % PHAs (g PHAs/ g VSS), (β) συντελεστές απόδοσης Y PHAs/S (g PHAs/ g VFAs) και xviii

24 Y X/S (g VSS/ g VFAs) και (γ) ποσοστά παραγόμενης βιομάζας που οφείλονται σε συσσώρευση PHAs και συσσώρευση μακρομορίων πέραν των PHAs Σχήμα 7.2. Παράμετροι ανά τύπο καλλιέργειας που χαρακτηρίζουν την παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας συνθετικό μέσο απουσία αζώτου και υπό περιορισμό οξυγόνου: (α) ποσοστά ενδοκυτταρικής συσσώρευσης % PHAs (g PHAs/ g VSS), (β) συντελεστές απόδοσης Y PHAs/S (g PHAs/ g VFAs) και Y X/S (g VSS/ g VFAs) και (γ) ποσοστά παραγόμενης βιομάζας που οφείλονται σε συσσώρευση PHAs και συσσώρευση μακρομορίων πέραν των PHΑs Σχήμα 7.3. Παράμετροι ανά τύπο καλλιέργειας που χαρακτηρίζουν την παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου απουσία αζώτου: (α) ποσοστά ενδοκυτταρικής συσσώρευσης % PHAs (g PHAs/ g VSS), (β) συντελεστές απόδοσης Y PHAs/S (g PHAs/ g VFAs) και Y X/S (g VSS/ g VFAs) και (γ) ποσοστά παραγόμενης βιομάζας που οφείλονται σε συσσώρευση PHAs και συσσώρευση μακρομορίων πέραν των PHAs.187 Σχήμα 7.4. Παράμετροι ανά τύπο καλλιέργειας που χαρακτηρίζουν την παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου απουσία αζώτου και υπό περιορισμό οξυγόνου: (α) ποσοστά ενδοκυτταρικής συσσώρευσης % PHAs (g PHAs/ g VSS), (β) συντελεστές απόδοσης Y PHAs/S (g PHAs/ g VFAs) και Y X/S (g VSS/ g VFAs) και (γ) ποσοστά παραγόμενης βιομάζας που οφείλονται σε συσσώρευση PHAs και συσσώρευση μακρομορίων πέραν των PHΑs Σχήμα 7.5. Συνοπτικό διάγραμμα ποσοστών συσσώρευσης PHAs ανά τύπο καλλιέργειας 193 Σχήμα 8.1. ph Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης πτητικών λιπαρών οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύυδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα 8.2. Σχηματική αναπαράσταση της παραγωγής PHAs από οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ.206 Σχήμα 8.3. ph Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης πτητικών λιπαρών οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύυδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα 8.4. ph Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης πτητικών λιπαρών οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ- xix

25 υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα 8.5. ph Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης πτητικών λιπαρών οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύυδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα 8.6. Συγκεντρωτικά διαγράμματα (α) συγκέντρωσης του συνόλου των πτητικών λιπαρών οξέων, (β) συγκέντρωσης των συνολικά παραγόμενων πολυυδροξυαλκανεστέρων, (γ) ποσοστού συσσώρευσης PHAs, (δ) συντελεστή απόδοσης Y P/S, (ε) περιεχόμενου κλάσματος PHAs (fphas), μονάδων ΗΒ (fphb) και HV (fphv) στο κύτταρο και (στ) σύστασης PHAs (% mol) για κάθε διαφορετική τιμή ph Σχήμα 8.7. Οξικό οξύ - Πειραματικές τιμές συνατρήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξικού οξέος, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα 8.8. Προπιονικό οξύ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξικού οξέος, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα 8.9. Βουτυρικό οξύ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξικού οξέος, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα Οξικό και προπιονικο οξύ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύυδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα Οξικό και βουτυρικό οξύ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων xx

26 στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύυδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS..230 Σχήμα Προπιονικό και βουτυρικό οξύ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύυδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα Γλυκόζη - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης γλυκόζης, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS..234 Σχήμα Συγκεντρωτικά διαγράμματα (α) συγκέντρωσης υποστρώματος, (β) συγκέντρωσης συνολικά παραγόμενων PHAs και (γ) ποσοστού συσσώρευσης PHAs για κάθε πηγή άνθρακα συναρτήσει του χρόνου Σχήμα (α) Συντελεστές απόδοσης Y P/S, (β) τα κλάσματα των συνολικών PHAs (fphas), του ΡΗΒ (fphb) και του PHV (fphv) στο σύνολο της βιομάζας και (γ) το ποσοστό συσσώρευσης PHAs συναρτήσει της πηγής άνθρακα Σχήμα C/N = 11 Cmmol/ Nmmol παρουσία N-allylthiourea - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης αμμωνιακού (ΝΗ 4 + -Ν), νιτρικού (ΝΟ 3 - -Ν), νιτρώδους (ΝΟ 2 - -Ν) και ολικού αζώτου, (δ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (ε) σύσταση PHAs (%mol), (στ) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα C/N = 11 Cmmol/ Nmmol απουσία N-allylthiourea - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης αμμωνιακού (ΝΗ 4 + -Ν), νιτρικού (ΝΟ 3 - -Ν), νιτρώδους (ΝΟ 2 - -Ν) και ολικού αζώτου, (δ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i - VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (ε) σύσταση PHAs (%mol), (στ) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS..247 Σχήμα C/N = 22 Cmmol/ Nmmol παρουσία N-allylthiourea - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης αμμωνιακού xxi

27 (ΝΗ 4 + -Ν), νιτρικού (ΝΟ 3 - -Ν), νιτρώδους (ΝΟ 2 - -Ν) και ολικού αζώτου, (δ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (ε) σύσταση PHAs (%mol), (στ) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα C/N = 22 Cmmol/ Nmmol απουσία N-allylthiourea - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης αμμωνιακού (ΝΗ 4 + -Ν), νιτρικού (ΝΟ 3 - -Ν), νιτρώδους (ΝΟ 2 - -Ν) και ολικού αζώτου, (δ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i - VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (ε) σύσταση PHAs (%mol), (στ) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 251 Σχήμα C/N = 80 Cmmol/ Nmmol παρουσία N-allylthiourea - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης αμμωνιακού (ΝΗ 4 + -Ν), νιτρικού (ΝΟ 3 - -Ν), νιτρώδους (ΝΟ 2 - -Ν) και ολικού αζώτου, (δ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (ε) σύσταση PHAs (%mol), (στ) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα C/N = 80 Cmmol/ Nmmol απουσία N-allylthiourea - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης αμμωνιακού (ΝΗ 4 + -Ν), νιτρικού (ΝΟ 3 - -Ν), νιτρώδους (ΝΟ 2 - -Ν) και ολικού αζώτου, (δ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i - VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (ε) σύσταση PHAs (%mol), (στ) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS 255 Σχήμα Συγκεντρωτικά διαγράμματα (α) συγκέντρωσης του συνόλου των πτητικών λιπαρών οξέων, (β) συγκέντρωσης των συνολικά παραγόμενων πολυυδροξυαλκανεστέρων, (γ) ποσοστού συσσώρευσης PHAs, (δ) συντελεστών απόδοσης Y X/S και Y P/S, (ε) περιεχόμενου κλάσματος PHA (fphas), μονάδων ΗΒ (fphb) και HV (fphv) στο κύτταρο και (στ) σύστασης PHAs (% mol) για κάθε διαφορετική τιμή του λόγου C/N, παρουσία (+) ή απουσία (-) N- allylthiourea..261 Σχήμα Ανάπτυξη μέσω κατανάλωσης ΡΗΒ παρουσία N-allylthiourea - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης διαλυτού ΧΑΟ, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης αμμωνιακού (ΝΗ 4 + -Ν), νιτρικού (ΝΟ 3 - -Ν), νιτρώδους (ΝΟ 2 - -Ν) και ολικού αζώτου, (δ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών και πολύυδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), (ε) σύσταση PHAs (%mol), (στ) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS xxii

28 Σχήμα Ανάπτυξη μέσω κατανάλωσης ΡΗΒ απουσία N-allylthiourea - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης διαλυτού ΧΑΟ, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης αμμωνιακού (ΝΗ 4 + -Ν), νιτρικού (ΝΟ 3 - -Ν), νιτρώδους (ΝΟ 2 - -Ν) και ολικού αζώτου, (δ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών και πολύυδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), (ε) σύσταση PHAs (%mol), (στ) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα Ανάπτυξη μέσω κατανάλωσης ΡΗΒV παρουσία N-allylthiourea - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης διαλυτού ΧΑΟ, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης αμμωνιακού (ΝΗ 4 + -Ν), νιτρικού (ΝΟ 3 - -Ν), νιτρώδους (ΝΟ 2 - -Ν) και ολικού αζώτου, (δ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, πολύυδροξυβουτυρικού (ΡΗΒ), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (ε) σύσταση PHAs (%mol), (στ) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα Ανάπτυξη μέσω κατανάλωσης ΡΗΒV aπουσία N-allylthiourea - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης διαλυτού ΧΑΟ, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης αμμωνιακού (ΝΗ 4 + -Ν), νιτρικού (ΝΟ 3 - -Ν), νιτρώδους (ΝΟ 2 - -Ν) και ολικού αζώτου, (δ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, πολύυδροξυβουτυρικού (ΡΗΒ), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (ε) σύσταση PHAs (%mol), (στ) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα Συντήρηση μέσω κατανάλωσης ΡΗΒ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης διαλυτού ΧΑΟ, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών και πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (ΡΗΒ), (δ) κλάσματος fphb, (ε) σύστασης PHAs (%mol) και (στ) ποσοστού συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα Συντήρηση μέσω κατανάλωσης ΡΗΒV - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης διαλυτού ΧΑΟ, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, πολύ-υδροξυβουτυρικού (ΡΗΒ), πολύ-υδροξυβαλερικού (PHV) εστέρα και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS Σχήμα Οι συγκεντρώσεις των PHAs όταν αυτά καταναλώνονται είτε με σκοπό την ανάπτυξη της εμπλουτισμένης καλλιέργειας παρουσία (+) και απουσία (-) N-allylthiourea είτε για την συντήρηση της καλλιέργειας. (α) η συγκέντρωση του ομοπολυμερούς ΡΗΒ όταν αυτό χρησιμοποιείται ως πηγή άνθρακα, (β) η συγκέντρωση των συνολικών PHAs, (γ) η συγκέντρωση του ΡΗΒ και (δ) η συγκέντρωση του PHV όταν ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιείται συμπολυμερές PHBV συναρτήσει του χρόνου Σχήμα Το κλάσμα fphb στην βιομάζα κατά την κατανάλωση του ΡΗΒ (α) για την ανάπτυξη των βακτηριακών κυττάρων παρουσία N-allylthiourea, (β) για την ανάπτυξη των βακτηριακών xxiii

29 κυττάρων απουσία N-allylthiourea και (γ) για την συντήρηση των βακτηριακών κυττάρων συναρτήσει του χρόνου Σχήμα Το κλάσμα fphbv στην βιομάζα κατά την κατανάλωση του ΡΗΒ (α) για την ανάπτυξη των βακτηριακών κυττάρων παρουσία N-allylthiourea, (β) για την ανάπτυξη των βακτηριακών κυττάρων απουσία N-allylthiourea και (γ) για την συντήρηση των βακτηριακών κυττάρων συναρτήσει του χρόνου Σχήμα 9.1. Πειραματικά δεδομένα και προσαρμογή του μοντέλου στην περίπτωση κατανάλωσης οξικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου-συγκεντρώσεις (α) οξικού οξέος, (β) βιομάζας και (γ) πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα, ΡΗΒ Σχήμα 9.2. Πειραματικά δεδομένα και προσαρμογή του μοντέλου στην περίπτωση κατανάλωσης βουτυρικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου-συγκεντρώσεις (α) βουτυρικού οξέος, (β) βιομάζας και (γ) πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα, ΡΗΒ Σχήμα 9.3. Πειραματικά δεδομένα και προσαρμογή του μοντέλου που αφορά την αποδόμηση του κλάσματος του ενδοκυττατικού ΡHV (fphv) για λόγους συντήρησης Σχήμα 9.4. Πειραματικά δεδομένα και προσαρμογή του μοντέλου στην περίπτωση κατανάλωσης προπιονικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου-συγκεντρώσεις (α) βουτυρικού οξέος, (β) βιομάζας (γ) πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα, ΡΗΒ και (δ) πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα,phv Σχήμα 9.5. Πειραματικά δεδομένα και προσαρμογή του μοντέλου στην περίπτωση ταυτόχρονης κατανάλωσης οξικού και βουτυρικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου-συγκεντρώσεις (α) οξικού οξέος, (β) βουτυρικού οξέος, (γ) βιομάζας και (δ) πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα, ΡΗΒ Σχήμα 9.6. Πειραματικά δεδομένα και προσαρμογή του μοντέλου στην περίπτωση ταυτόχρονης κατανάλωσης οξικού και προπιονικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου-συγκεντρώσεις (α) οξικού οξέος, (β) προπιονικού οξέος, (γ) βιομάζας (δ) πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα, ΡΗΒ και (ε) πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα,phv Σχήμα 9.7. Πειραματικά δεδομένα και προσαρμογή του μοντέλου στην περίπτωση ταυτόχρονης κατανάλωσης προπιονικού και βουτυρικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου. Συγκεντρώσεις (α) παραγόμενου οξικού οξέος, (β) προπιονικού οξέος, (γ) βουτυρικού οξέος, (δ) βιομάζας (ε) πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα, ΡΗΒ και (στ) πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα,phv xxiv

30 Σχήμα 9.8. Πειραματικά δεδομένα και πρόβλεψη του μοντέλου στην περίπτωση ταυτόχρονης κατανάλωσης οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου. Συγκεντρώσεις (α) παραγόμενου οξικού οξέος βάση του μοντέλου, (β) οξικού οξέος, (γ) προπιονικού οξέος, (δ) βουτυρικού οξέος, (ε) βιομάζας (στ) πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα, ΡΗΒ και (ζ) πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα,phv Σχήμα (α) η τιμή του ph, (β) οι συγκεντρώσεις των ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, (γ) η συγκέντρωση του διαλυτού ΧΑΟ και (δ) η συγκέντρωση του αμμωνιακού αζώτου συναρτήσει του χρόνου κατά τα πειράματα της μελέτης ανάπτυξης της εμπλουτισμένης καλλιέργειας στο οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου Σχήμα (α) η τιμή του ph, (β) οι συγκεντρώσεις των ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, (γ) η συγκέντρωση του διαλυτού ΧΑΟ και (δ) η συγκέντρωση του αμμωνιακού αζώτου συναρτήσει του χρόνου κατά τα πειράματα της μελέτης συσσώρευσης PHAs μέσω της εμπλουτισμένης καλλιέργειας από το οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου Σχήμα Συγκέντρωση ολικών (TSS) και πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS) κατά τις φάσεις ανάπτυξης και συσσώρευσης στον αντιδραστήρα SBR Σχήμα Συγκέντρωση αμμωνιακού αζώτου (NH 4 + -N) κατά τις φάσεις ανάπτυξης και συσσώρευσης στον αντιδραστήρα SBR Σχήμα Συγκέντρωση διαλυτού χημικά απαιτούμενου οξυγόνου (ΧΑΟ) κατά τις φάσεις ανάπτυξης και συσσώρευσης στον αντιδραστήρα SBR Σχήμα Συγκέντρωση του συνόλου των πτητικών λιπαρών οξέων (VFAs) κατά τις φάσεις ανάπτυξης και συσσώρευσης στον αντιδραστήρα SBR Σχήμα Συγκέντρωση του οξικού οξέος κατά τις φάσεις ανάπτυξης και συσσώρευσης στον αντιδραστήρα SBR Σχήμα Συγκέντρωση του προπιονικού οξέος κατά τις φάσεις ανάπτυξης και συσσώρευσης στον αντιδραστήρα SBR Σχήμα Συγκέντρωση του βουτυρικού οξέος κατά τις φάσεις ανάπτυξης και συσσώρευσης στον αντιδραστήρα SBR Σχήμα Κατανάλωση διαλυτού ΧΑΟ, οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος κατά την διάρκεια της φάσης συσσώρευσης ενός συγκεκριμένου κύκλου λειτουργίας του SBR xxv

31 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1.1. Χρονολογική εξέλιξη εμπορικών πολυμερών (Carraher, 2006)....3 Πίνακας 1.2. Ιδιότητες βιοδιασπώμενων και συμβατικών πολυμερών...18 Πίνακας 1.3. Παγκόσμια παραγωγή βιοδιασπώμενων πολυμερών ανά κατηγορία σε τόνους (Shen et al., 2009) Πίνακας 1.4. Μέση τιμή πώλησης διαφόρων συμβατικών πλαστικών κατά την περίοδο στη Δυτική Ευρώπη (IBAW, 2005). 20 Πίνακας 1.5. Μερικές εφαρμογές των βιοδιασπώμενων πολυμερών (Platt D.K., 2006) Πίνακας 2.1. Αντιπροσωπευτικοί τύποι ΡΗΑ-ομοπολυμερών (Lee, 1996) Πίνακας 2.2. Αντιπροσωπευτικοί τύποι ΡΗΑ-συμπολυμερών (Poirier et al., 1995) Πίνακας 2.3. Οι κυριότερες ιδιότητες PHAs και συμβατικών πολυμερών (Sudesh et al., 2000) Πίνακας 2.4. Μικροοργανισμοί ικανοί να αποδομούν ΡΗΑs (Khanna & Shivastava, 2005) 47 Πίνακας 2.5. Εταιρείες έρευνας και παραγωγής PHAs (Chen, 2009; Chanprateep, 2010)..55 Πίνακας 3.1. Θρεπτικά συστατικά σε περιορισμό που προάγουν την παραγωγή των PHAs (Kim & Lenz, 2001)..72 Πίνακας 3.2. Γενικές κατηγορίες ΡΗΑ συνθάσης Πίνακας 3.3. Παραγωγή PHAs από φθηνές πηγές άνθρακα. 83 Πίνακας 3.4. Παράμετροι που χαρακτηρίζουν την ανάκτηση των PHAs χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους (Verlinden et al., 2007)...89 Πίνακας 3.5. Σύγκριση ετήσιου λειτουργικού κόστους της παραγωγής PHB ( τόνοι/έτος) από τους μικροοργανισμούς A. latus, το ανασυνδυασμένο E. Coli και M. Organophilum. Η ανάκτηση του ΡΗΒ πραγματοποιήθηκε μέσω της μεθόδου υποχλωριώδους άλατος και επιφανειοδραστικού (Choi & Lee, 1999) Πίνακας 3.6. Εμπορική τιμή υποστρωμάτων άνθρακα και εκτιμώμενο κόστος υποστρώματος xxvi

32 για την παραγωγή ΡΗΒ βάση της απόδοσης του (Chanprateep, 2010)...93 Πίνακας 5.1. Χαρακτηριστικές παράμετροι παραγωγής PHAs από μικτές καλλιέργειες επιλεγμένες υπό αναερόβιες/αερόβιες συνθήκες Πίνακας 5.2. Χαρακτηριστικές παράμετροι παραγωγής PHAs από μικτές καλλιέργειες επιλεγμένες υπό αερόβιες δυναμικές συνθήκες.137 Πίνακας 6.1. Ταυτοποίηση απομονωμένων στελεχών που αποτελούν την εμπλουτισμένη καλλιέργεια..156 Πίνακας 6.2. Σύσταση συνθετικών θρεπτικών μέσων για τον εμπλουτισμό της ενεργούς ιλύος σε ΡΗΑ συσσωρευτές σύμφωνα με την στρατηγική εναλλαγής περιοριστικών υποστρωμάτων. 160 Πίνακας 7.1. Τύπος και καλλιέργειες στελεχών που εξετάστηκαν ως προς την ικανότητα παραγωγής PHAs Πίνακας 7.2. Σύσταση και χαρακτηριστικά του συνθετικού θρεπτικού μέσου και του οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου τα οποία αποτέλεσαν υποστρώματα για την παραγωγή PHAs..174 Πίνακας 7.3. Κύρια χαρακτηριστικά της παραγωγής PHAs από συνθετικό μέσο σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου ανά καλλιέργεια/ στέλεχος Πίνακας 7.4. Κύρια χαρακτηριστικά της παραγωγής PHAs από συνθετικό μέσο σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου και περιορισμού οξυγόνου ανά καλλιέργεια/ στέλεχος Πίνακας 7.5. Κύρια χαρακτηριστικά της παραγωγής PHAs από οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου ανά καλλιέργεια/ στέλεχος..186 Πίνακας 7.6. Κύρια χαρακτηριστικά της παραγωγής PHAs από οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου και περιορισμού οξυγόνου ανά καλλιέργεια/ στέλεχος Πίνακας 8.1. Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος και τιμές ph που εξετάστηκαν Πίνακας 8.2. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs σε διαφορετικές τιμές ph Πίνακας 8.3. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs χρησιμοποιώντας διάφορα υποστρώματα άνθρακα Πίνακας 8.4. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs σε διαφορετικούς xxvii

33 λόγους C/N Πίνακας 8.5. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι ενδοκυτταρικής κατανάλωσης και αποδόμησης PHAs Πίνακας 9.1. Περιγραφή και τιμές των κινητικών παραμέτρων του μοντέλου για την παραγωγή PHB από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια κάνοντας χρήση οξικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου Πίνακας 9.2. Περιγραφή και τιμές των κινητικών παραμέτρων του μοντέλου για την παραγωγή PHB από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια κάνοντας χρήση βουτυρικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου Πίνακας 9.3. Περιγραφή και τιμές των κινητικών παραμέτρων του μοντέλου για την διάσπαση του PHV από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια για λόγους συντήρησης Πίνακας 9.4. Περιγραφή και τιμές των κινητικών παραμέτρων του μοντέλου για την παραγωγή PHB και PHVαπό την εμπλουτισμένη καλλιέργεια κάνοντας χρήση προπιονικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου Πίνακας 9.5. Περιγραφή και τιμές των κινητικών παραμέτρων του μοντέλου για την παραγωγή PHB από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια κάνοντας ταυτόχρονη χρήση οξικού και βουτυρικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου Πίνακας 9.6. Περιγραφή και τιμές των κινητικών παραμέτρων του μοντέλου για την παραγωγή PHB και PHV από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια κάνοντας ταυτόχρονη χρήση οξικού και προπιονικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου Πίνακας 9.7. Περιγραφή και τιμές των κινητικών παραμέτρων του μοντέλου για την παραγωγή PHB και PHV από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια κάνοντας ταυτόχρονη χρήση προπιονικού και βουτυρικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου Πίνακας Χαρακτηριστικές παράμετροι της απορροής του οξεογόνου μεσόφιλου αντιδραστήρα CSTR σε διάφορους υδραυλικούς χρόνους παραμονής (Κουτρούλη, 2008) Πίνακας Εκτιμώμενοι λόγοι κατανάλωσης κατά τις φάσεις ανάπτυξης και συσσώρευσης PHAs της εμπλουτισμένης καλλιέργειας χρησιμοποιώντας οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου Πίνακας Ποσοστά κατανάλωσης οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος κατά την φάση συσσώρευσης στον αντιδραστήρα SBR xxviii

34 Πίνακας Χαρακτηριστικά διεργασίας κατά τις φάσεις ανάπτυξης και συσσώρευσης στον αντιδραστήρα SBR xxix

35 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Συμβατικά και βιοδιασπώμενα πολυμερή Παρόλο που τα πολυμερή κατέχουν σημαντικό ρόλο στην ζωή του ανθρώπου εδώ και χιλιάδες χρόνια, αξιοποιώντας αυτά που παρέχονται σε αφθονία από την φύση και τα ζώα, η κατανόηση, η επιστημονική προσέγγιση της δομής τους καθώς και η συνθετική παραγωγή τους σε μεγάλη κλίμακα αποτελούν επιτεύγματα του 20 ου αιώνα. Για τον λόγο αυτό πολλοί επιστήμονες δεν διστάζουν να αποκαλούν τον 20 ο αιώνα ως αιώνα των πολυμερών. Τα πολυμερή ή αλλιώς συνθετικά μακρομόρια μας περιβάλλουν παντού σήμερα και η ανακάλυψη τους, περίπου στα μέσα του εικοστού αιώνα, συνέβαλε στην αναβάθμιση της ποιότητας ζωής, στην οικονομική ανάπτυξη των χωρών καθώς και στην ανάπτυξη καινοτομιών και τεχνολογιών αιχμής. Πριν από τα συνθετικά πολυμερή ο άνθρωπος είχε εφεύρει τρόπους επεξεργασίας και χρήσης φυσικών πολυμερικών υλικών όπως για παράδειγμα το μετάξι, το φυσικό καουτσούκ, το βαμβάκι, το μαλλί, το δέρμα, το ξύλο, το άμυλο, την κυτταρίνη κ.ά. για να εξυπηρετήσει τις βασικές του ανάγκες. Τα συνθετικά πολυμερή από την άλλη μεριά μπορούν να παραχθούν με χαμηλό κόστος ενώ οι ιδιότητες τους μπορούν να ελεχθούν σε βαθμό που πολλά να εμφανίζουν καλύτερες ιδιότητες σε σχέση με τα αντίστοιχα φυσικά. Για τον λόγο αυτό εξαρτήματα από υλικά όπως το μέταλλο, το ξύλο και το γυαλί έχουν αντικατασταθεί σε πολλές εφαρμογές από τα πολυμερή. Ανάμεσα στα πλεονεκτήματα που παρουσιάζουν είναι η εύκολη μορφοποίηση τους, η χαμηλή τους πυκνότητα, η διαύγεια, οι καλές και ποικίλες μηχανικές τους ιδιότητες οι οποίες είναι πολύπλοκα συνδεδεμένες με τα δομικά στοιχεία του υλικού. Παρόλα αυτά προκύπτουν από πεπερασμένους πόρους, ως επί το πλείστον το πετρέλαιο, που σημαίνει πως η τιμή τους είναι άμεσα συνδεδεμένη με εκείνη του πετρελαίου. Το γεγονός αυτό σε συνάρτηση με το πρόβλημα διαχείρισης που προκύπτει κατά την διάθεση των πλαστικών υλικών, καθώς εμφανίζουν μεγάλο κύκλο ζωής, είναι τα βασικά μειονεκτήματα τους. Κύριο δε όλων είναι πως 1

36 η υποβάθμιση τους είτε σε φυσικά περιβάλλοντα είτε μέσω καύσης ενδέχεται να προκαλέσει βλάβες στη δημόσια υγεία. Εναλλακτικοί τρόποι διαχείρισης των πλαστικών υλικών αποτελούν η ανακύκλωση και επαναχρησιμοποίηση τους, που συνοδεύεται από την δυσκολία στην ταξινόμηση και την σταδιακή υποβάθμιση των υλικών. Επίσης περιορίζεται η χρήση τους λόγω της παρουσίας προσθέτων όπως βαφές και στρώματα επικάλυψης. Σήμερα το επιστημονικό ενδιαφέρον έχει στραφεί προς την ανάπτυξη και εμπορευματοποίηση πολυμερών τα οποία μπορούν να προκύψουν είτε από ανανεώσιμους είτε από πεπερασμένους πόρους και έχουν την ιδιότητα να αποδομούνται από το περιβάλλον στο οποίο διατίθενται. Τα πολυμερή αυτά ονομάζονται βιοδιασπώμενα πολυμερή Ιστορική αναδρομή Πέραν των επιστημόνων των υλικών επιστήμονες όπως χημικοί, βιοχημικοί και χημικοί μηχανικοί έχουν εμπλακεί σε ένα βαθμό στο πεδίο της επιστήμης και τεχνολογίας των πολυμερών. Κάποιοι τείνουν να χαρακτηρίζουν την παρούσα περίοδο ως την εποχή των πολυμερών. Στην πραγματικότητα όμως ο άνθρωπος πάντα διένυε την εποχή αυτή. Οι αρχαίοι Έλληνες είχαν ταξινομήσει την ύλη σε ανόργανη, ζωικής και φυτικής προέλευσης. Οι αλχημιστές επεξεργάζονταν την ανόργανη ύλη ενώ οι τεχνίτες την ύλη που προερχόταν από ζώα και φυτά. Ο όρος πολυμερές προέρχεται από τις ελληνικές λέξεις πολύ και μέρος. Ο όρος επινοήθηκε το 1833 από τον Jöns Jakob Berzelius. Κάποιοι επιστήμονες προτιμούν να χρησιμοποιούν τον όρο μακρομόριο, ή αλλιώς μεγάλο μόριο αντί του όρου πολυμερές. Παρόλα αυτά οι ίδιες αρχές διέπουν όλα τα πολυμερή. Ανάλογα με την τελική εφαρμογή των πολυμερικών υλικών, συμπεριλαμβανομένων των πλαστικών, των ινωδών και των ελαστομερών, οι διαφορές μεταξύ τους εξαρτώνται από τις διαμοριακές δυνάμεις μεταξύ των μορίων καθώς και από τις ενδομοριακές δυνάμεις του μονομερούς, από τις παρούσες λειτουργικές μονάδες, και περισσότερο από το μέγεθός τους (μοριακό βάρος). Στην φύση υπάρχει μεγάλη αφθονία φυσικών ινών και ελαστομερών και λιγότερο πλαστικών υλικών. Για παράδειγμα οι πρωτεΐνες, οι οποίες θεωρούνται η βάση της ζωής, 2

37 αποτελούν πηγή αμινοξέων και ενέργειας. Οι αρχαίοι πολιτισμοί γνώριζαν πώς να επεξεργαστούν, να βάφουν και να υφαίνουν φυσικές πρωτεϊνικές ίνες μαλλιού και μεταξιού καθώς και υδατανθρακικές ίνες λιναριού και βαμβακιού. Επίσης είχαν αναπτύξει τεχνικές κατεργασίας των δερμάτων των ζώων και χρησιμοποιούσαν φυσικές πίσσες ως υλικά στεγανοποίησης. Οι Αζτέκοι και οι Μάγια εκμεταλλεύονταν το φυσικό καουτσούκ που προκύπτει από το δέντρο Hevea brasiliensis για την παρασκευή αδιάβροχων υφασμάτων και ελαστικών αντικειμένων. Έως ότου ο Wohler συνθέσει την ουρία από ανόργανες ενώσεις το 1828 υπήρχε μικρή ανάπτυξη στον τομέα της οργανικής χημείας αφού μέχρι τότε οι αλχημιστές έδιναν έμφαση στην μεταστοιχείωση κυρίων μετάλλων σε χρυσό. Παρά την σημαντική αυτή ανακάλυψη μικρή πρόοδος έγινε στην κατανόηση των οργανικών ενώσεων μέχρι το 1850 όπου ο Kekule ανέπτυξε μία μέχρι σήμερα ευρέως αποδεκτή τεχνική γραφής δομικών τύπων. Ωστόσο οι επιστήμονες των πολυμερών επέδειξαν ταλέντο όσον αφορά τις εμπειρικές ανακαλύψεις προτού εδραιωθεί και αναπτυχθεί η επιστήμη των πολυμερών. Μέχρι την περίοδο αυτή η επιστήμη των πολυμερών ήταν κυρίως εμπειρική. Διάφορα πολυμερή ήταν διαθέσιμα στο εμπόριο πριν τον πρώτο παγκόσμιο πόλεμο όπως το κολλόδιο, η γομολάστιχα, η καζεΐνη, ο βακελίτης, η οξική κυτταρίνη, το φυσικό καουτσούκ, το βαμβάκι, το μαλλί, ίνες τεχνητού μεταξιού, οι πίσσες και οι ρητίνες από πετρέλαιο. Χρονολογικά πριν τον δεύτερο παγκόσμιο πόλεμο υπήρξε μικρή πρόοδος στα πολυμερή λόγω της έλλειψης βασικών γνώσεων γεγονός το οποίο αντικατοπτρίζεται και στον πίνακα 1.1. Πίνακας 1.1. Χρονολογική εξέλιξη εμπορικών πολυμερών (Carraher, 2006). Πριν το 1800 Ίνες από βαμβάκι, λινάρι, μαλλί, χαρτί από κυτταρίνη, φυσικό καουτσούκ, βερνίκια κ.ά 1839 Βουλκανισμένα ελαστικά (Charles Goodyear) 1845 Εστέρες κυτταρίνης (Schonbein) 1846 Νίτρωση της κυτταρίνης (Schonbein) 1851 Εβονίτης (σκληρό ελαστικό, Nelson Goodyear) 3

38 1868 Κολλόδιο (πλαστικοποιημένη νιτρική κυτταρίνη, Hyatt) 1888 Ελαστικά αέρος (Dunlop) 1889 Φωτογραφικά φίλμ νιτρικής κυτταρίνης (Reinchenbach) 1890 Ίνες ρεγιόν κουπραμμωνίου (Despeisses) 1892 Ίνες ρεγιόν βισκόζης (Cross, Bevan και Beadle) 1897 Θειούχο πολυφαινυλένιο 1907 Ρητίνες φαινόλης-φορμαλδεΰδης (Βακελίτης, Baekland) 1908 Φωτογραφικές ίνες οξικής κυτταρίνης 1912 Σελοφάν 1913 Οξικό πολυβινύλιο (PVAc) 1920 Ρητίνες ουρίας-φορμαλδεΰδης 1926 Αλκυδικοί πολυεστέρες (Kienle) 1927 Καλύμματα τοίχου από πολυβινυλοχλωρίδιο PVC Ράβδοι και ελάσματα από οξική κυτταρίνη Εμβολιασμένα-ενοφθαλμισμένα συμπολυμερή 1928 Nylon (Carothers; Dupont) 1929 Πολυσουλφιδικά συνθετικά ελαστομερή (Thiokol; Patrick) 1930 Πολυαιθυλένιο (Friedrich/Marvel) 1931 Πολύμεθακρυλικός μεθυλεστέρας (PMMA) Ελαστομερή πολυχλωροπρένιου (Νεοπρέν; Carothers) 1934 Εποξικές ρητίνες (Schlack) 1935 Αιθυλική κυτταρίνη 1936 Πολυβινυλοβουτυράλη (PVB) 1937 Πολυστυρένιο (PS) Ελαστομερή συμπολυμερή στυρένιου-βουταδιένιου (Buna-S) και στυρένιουακρυλονιτρίλιου (Buna-N) 1939 Ρητίνες μελαμίνης-φορναλδεύδης (MF) Nylon-6 (Schlack) Νιτριλικό ελαστικό (NR) 4

39 1940 Ελαστομερές ισοβουτυλενίου-ισοπρενίου (Βουτυλικό ελαστικό; Sparks και Thomas) 1941 Χαμηλής πυκνότητας πολυαιθυλένιο (LDPE) Τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο (PET) 1942 Ακόρεστοι πολυεστέρες (Ellis και Rust) 1943 Ρητίνες φθορανθράκων, Σιλικόνες 1948 Συμπολυμερή ακρυλονιτρίλιου-βουταδιένιου-στυρένιου (ABS) 1949 Κυανοακρυλικά (Goodrich) 1950 Πολυεστερικές ίνες (Winfield και Dickson), Πολυακρυλονιτριλικές ίνες 1952 Αδρομερή συμπολυμερή ή συμπολυμερή κατά συστάδες 1953 Υψηλής αντοχής πολυστυρένιο (HIPS) Πολυανθρακικά πολυμερή (Whinfield και Dickson) 1956 Οξείδιο του πολυφαινυλενίου (PPO; General Electric) 1957 Υψηλής πυκνότητας πολυαιθυλένιο (HDPE) Πολυπροπυλένιο 1960 Ελαστομερή μονομερούς αιθυλενίου-προπυλενίου (EPM) 1961 Αρωματικά Nylons (Nomex; DuPont) 1962 Πολυιμιδικές ρητίνες 1964 Ιονομερή 1965 Πολυσουλφονικά πολυμερή Συμπολημερή στυρένιου-βουταδιένιου κατά συστάδες 1966 Υγροί κρύσταλλοι 1970 Τερεφθαλικό πολυβουτυλένιο 1974 Πολυακετυλένια 1982 Πολυαιθεριμίδια (General Electric) 1991 Νανοσωλήνες άνθρακα (Iijima; NEC Lab) 5

40 Ο δεύτερος παγκόσμιος πόλεμος υπήρξε καθοριστικός για το μέλλον των πολυμερών. Κατά την διάρκεια του πολέμου οι απαιτήσεις και οι ελλείψεις ενθάρρυναν τους επιστήμονες να αναζητήσουν υλικά τα οποία υπερείχαν των ήδη υπαρχόντων. Ολοένα και νέα υλικά αναπτύσσονταν σύμφωνα με τις επιταγές του στρατού και των βιομηχανιών τροφίμων, ηλεκτρονικών κ.ά. Η δημιουργία και παραγωγή νέων υλικών συνεχίζεται με επιταχυνόμενο ρυθμό λόγω της αναγκαιότητας υλικών με στοχευμένες ιδιότητες. Εν αντιθέσει με τους άλλους τομείς της χημείας, το μεγαλύτερο μέρος βασικής έρευνας έχει πραγματοποιηθεί στην βιομηχανία και για τον λόγο αυτό υπάρχει συχνά μικρό χρονικό διάστημα ανάμεσα στην ανακάλυψη και την εμπορευματοποίηση νέων υλικών Παραγωγή και εφαρμογές συνθετικών πολυμερών Λόγω του μεγάλου εύρους ιδιοτήτων που παρουσιάζουν σε συνδυασμό με την χαμηλή τους πυκνότητα η χρήση των πλαστικών υλικών αποτελεί μέρος της καθημερινότητας μας καθώς έχει ήδη αντικαταστήσει την χρήση άλλων υλικών όπως π.χ. το γυαλί και το χαρτί στον τομέα της συσκευασίας. Η εκτεταμένη χρήση των πλαστικών υλικών, η οποία είναι άμεσα συνδεδεμένη με την οικονομική ανάπτυξη και την καινοτομία, έχει οδηγήσει σύμφωνα με δεδομένα του έτους 2008 (PlasticsEurope, 2009) στην ετήσια παραγωγή 245 εκατομμυρίων τόνων παγκοσμίως η οποία χαρακτηρίζεται από ένα μέσο ρυθμό αύξησης περίπου 9 % τα τελευταία 60 χρόνια όπως παρατηρούμε παρακάτω στο σχήμα 1.1. Η Ευρώπη αντιπροσωπεύει το 25% της παγκόσμιας παραγωγής πλαστικών, περίπου 60 εκατομμύρια τόνοι σε ετήσια βάση, με την Γερμανία ως κύριο παραγωγό να κατέχει το ποσοστό του 7.5 %. Ακολουθούν η οικονομική ένωση των κρατών του Βελγίου, της Ολλανδίας και του Λουξεμβούργου (BeNeLux) με ποσοστό 4.5%, η Γαλλία με ποσοστό 3%, η Ιταλία 2% και τέλος η Μεγάλη Βρετανία και η Ισπανία με 1.5% (Σχήμα 1.2). 6

41 Εκατ. τόνοι Σε παγκόσμια κλίμακα Ευρώπη Σχήμα 1.1. Παραγωγή πλαστικών υλικών κατά την περίοδο στην Ευρώπη και σε παγκόσμια κλίμακα (Συμπεριλαμβάνονται θερμοπλαστικά, θερμοσκληρυνόμενα και ελαστομερή υλικά, πολυουρεθάνες, ρητίνες, συγκολλητικά και υλικά επικάλυψης και στεγανοποίησης, καθώς και ίνες πολυπροπυλενίου. Εξαιρούνται PET-, PA- και πολυακρυλικές ίνες (Plastics-the Facts 2011). Ευρώπη : 25 %, 60 εκατομμύρια τόνοι Υπόλοιπη Ασία 16.5 % Κίνα 15 % Ιαπωνία 5.5 % Γερμανία 7.5 % Λατινική Αμερική 4 % Ισπανία 1.5 % NAFTA 23 % Μεγάλη Βρετανία 1.5 % Ιταλία 2.0% Γαλλία 3 % BeNeLux 4.5 % Άλλες ευρωπαϊκές χώρες 5 % CIS 3 % Μέση ανατολή, Αφρική 8 % 245 εκατ. τόνοι Σχήμα 1.2. Παραγωγή πλαστικών υλικών κατά το έτος 2008 ανά χώρα (Plastics-the Facts 2011). 7

42 Στην κατηγορία των συνθετικών πλαστικών υλικών περιλαμβάνονται περίπου είκοσι διακριτές ομάδες/τύποι υλικών με ευρύ φάσμα ιδιοτήτων. Τα πολυμερή αυτά μπορούν να σχεδιαστούν και να μορφοποιηθούν κατάλληλα στοχεύοντας σε συγκεκριμένες ιδιότητες και εφαρμογές. Μερικές από τις ομάδες των πετροχημικών πολυμερών είναι το πολυαιθυλένιο (PE), το πολυπροπυλένιο (PP), το πολυβινυλοχλωρίδιο (PVC), το πολυστυρένιο (PS), η πολυουρεθάνη (PUR), το πολυτετραφθοροαιθυλένιο (Teflon), το πλέξιγκλας (PMMA), η σιλικόνη, τα πολυαμίδια (Nylon) και διάφορα άλλα. Παρά την μεγάλη ποικιλία των συνθετικών υλικών πέντε είναι οι κύριες κατηγορίες που παράγονται σε υψηλές ποσότητες όπως φαίνεται και στο σχήμα 1.3. Αυτά περιλαμβάνουν το πολυαιθυλένιο ( χαμηλής (LDPE), γραμμικά χαμηλής (LLDPE) και υψηλής πυκότητας (HDPE)), το πολυπροπυλένιο (PP), το πολυβινυλοχλωρίδιο (PVC), το πολυστυρένιο (συμπαγές (PS) και εκτεταμένο (EPS)) και το τετραφθαλικό πολυαιθυλένιο (PET). Η παραγωγή των ανωτέρω καλύπτει το 75% της ετήσιας παραγωγής του συνόλου των συνθετικών υλικών στο γεωγραφικό χώρο της Ευρώπης ενώ μόνο η παραγωγή των υλικών PE και PP αντιστοιχεί στο 48%. Το έτος 2008 αυτοί οι τύποι πολυμερών χαρακτηρίστηκαν από αύξηση του δείκτη ζήτησης κατά 3-8%. Διάφορα 20 % LDPE, LLDPE 17 % PUR 7 % PET 7 % HDPE 11 % PS, EPS 8 % PVC 12 % PP 18 % 49.5 εκατ. τόνοι (συμπεριλαμβάνοντας 5 εκατ. τόνους διαφόρων άλλων πλαστικών) Σχήμα 1.3. Ζήτηση πλαστικών υλικών ανά κατηγορία στην Ευρώπη (Plastics-the Facts 2011). 8

43 Η τελική χρήση των συνθετικών πολυμερών αφορά κυρίως την εφαρμογή τους ως υλικά συσκευασίας τροφίμων και άλλων αγαθών σε ποσοστό 38 %, στον τομέα των κατασκευών κτιρίων κατά 21 %, στην βιομηχανία του αυτοκινήτου και σε ηλεκτρικές και ηλεκτρονικές συσκευές σε ποσοστό 8 % και 6% αντίστοιχα. Τέλος χρησιμοποιούνται τόσο για ιατρικούς σκοπούς όσο και στην εξυπηρέτηση καθημερινών αναγκών, π.χ. πλαστικά ποτήρια μιας χρήσης, καθώς και σε διάφορους άλλους τομέις σε ποσοστό 28 % όπως παρατηρούμε και στο σχήμα 1.4. Η βιομηχανία των πλαστικών στην Ευρώπη απασχολεί περίπου 1.6 εκατομμύρια εργαζόμενους, αριθμός που αντιστοιχεί στα δύο τρίτα των εργαζομένων που απασχολούνται στον τομέα της αυτοκινητοβιομηχανίας, και έμμεσα πολλούς περισσότερους σε εταιρείες ή βιομηχανίες που εξαρτώνται και προάγονται από τα πλαστικά προϊόντα. Ιατρική και άλλες εφαρμογές 28 % Υλικά συσκευασίας 38 % Ηλεκτρικές και ηλεκτρονικές εφαρμογές 6 % Αυτοκινητοβιομηχανία 7 % Κατασκευές κτιρίων κ.ά. 21 % 49.5 εκατ. τόνοι (συμπεριλαμβάνοντας 5 εκατ. τόνους διαφόρων άλλων πλαστικών) Σχήμα 1.4. Τελικές εφαρμογές συνθετικών υλικών στην Ευρώπη (Plastics-the Facts 2011). 9

44 Από τα παραπάνω στοιχεία γίνεται εύκολα αντιληπτό πως η βιομηχανία των πλαστικών υλικών επηρεάζει άμεσα την ανάπτυξη ενός βιώσιμου συστήματος σε περιβαλλοντικό, κοινωνικό καθώς και οικονομικό επίπεδο Διαχείριση απορριφθέντων πλαστικών Η συσσώρευση πλαστικών στο περιβάλλον αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα περιβαλλοντικά προβλήματα σε παγκόσμια κλίμακα λόγω της δύσκολης αποικοδόμησης τους καθώς έχουν σχεδιαστεί έτσι ώστε να είναι ανθεκτικά, σταθερά και να αντιστέκονται στις περιβαλλοντολογικές συνθήκες. Ειδικά τις τελευταίες δεκαετίες το πρόβλημα έχει οξυνθεί λόγω των μεγάλων όγκων πλαστικών που παράγονται και καταναλώνονται, όπως είδαμε και προηγουμένως, καθώς και λόγω έλλειψης χώρου απόθεσης των απορριμμάτων στον δυτικό κόσμο. Περίπου το 50 % των πλαστικών απορριμμάτων οφείλεται στην χρήση πλαστικών που χρησιμοποιούνται στον τομέα της συσκευασίας. Επίσης διάφορα άλλα πλαστικά υλικά που βρίσκουν εφαρμογή στον κατασκευαστικό τομέα ή τον τομέα αυτοκίνησης έχουν μεγάλη διάρκεια ζωής. Αν λάβουμε υπόψη το γεγονός αυτό στο μέλλον αναμένεται να εμφανιστούν μεγάλες ποσότητες πλαστικών απορριμμάτων των οποίων η χρήση ξεκίνησε πριν από δεκαετίες (Stevens, 2004). Οι λύσεις ως προς την διαχείριση των πλαστικών περιλαμβάνουν κυρίως τις διαδικασίες της καύσης και της ανακύκλωσης και λιγότερο βιο- ή φωτο-αποικοδόμηση, την επαναχρησιμοποίηση και την υγειονομική ταφή τους. Ωστόσο, μέσω αυτών των διεργασιών δημιουργούνται δευτερογενή προβλήματα. Για παράδειγμα, κατά την διάρκεια καύσης των πλαστικών απορριμμάτων, εκτός του ότι η καύση αποτελεί μια επικίνδυνη και δαπανηρή διεργασία, υπάρχει περίπτωση να σχηματιστούν υδροκυάνιο και άλλες ενώσεις (π.χ. διοξίνες και φουράνες), περισσότερο από ακρυλονιτριλικά πλαστικά, οι οποίες μπορεί να προκαλέσουν βλάβες στην δημόσια υγεία. Από την άλλη μεριά η ταξινόμηση της μεγάλης ποικιλίας απορριφθέντων πλαστικών υλικών είναι χρονοβόρα και δεν επιτρέπει την επαναχρησιμοποίηση των υλικών επ αόριστον καθώς αυτά υφίστανται γήρανση τόσο 10

45 φυσιολογικά όσο και εξαιτίας των διαφόρων διεργασιών επεξεργασίας. Επίσης, η παρουσία πολλών πρόσθετων όπως βαφές, επικαλυπτικά στρώματα περιορίζουν την χρήση των ανακυκλωμένων πλαστικών υλικών. Παράλληλα, πολλές βιομηχανίες μέσω βελτιστοποίησης του σχεδιασμού παραγωγής πλαστικών κάνουν προσπάθειες να μειώσουν την εισερχόμενη ποσότητα πλαστικών στην παραγωγή και την κατανάλωση πετυχαίνοντας ταυτόχρονα και μείωση του κόστους. Τα παραπάνω, σε συνδυασμό με την πετρελαϊκή κρίση στις αρχές του 1970 υποχρέωσαν την χημική βιομηχανία να στρέψει την έρευνα της στην σύνθεση και ανάπτυξη μιας ιδιαίτερης κατηγορίας πλαστικών υλικών, των βιοαποικοδομήσιμων/ βιοδιασπάσιμων πολυμερών και στην ανακάλυψη νέων μεθόδων ανακύκλωσης και επαναχρησιμοποίησής τους Βιοδιασπώμενα πολυμερή Εδώ και περίπου τέσσερις δεκαετίες τα βιοδιασπώμενα πολυμερή έχουν κάνει την εμφάνιση τους με σκοπό να συμβάλουν στην μείωση της παραγωγής των μεγάλων όγκων συνθετικών πολυμερών αποτελώντας εναλλακτική λύση. Εμφανίστηκαν στο εμπόριο τη δεκαετία του 1970 και οι πρώτες εφαρμογές αφορούσαν τον τομέα της ιατρικής και συγκεκριμένα εμφυτεύματα, βιο-απορροφήσιμα ράμματα και φάρμακα (Malafaya et al., 2007). Η ιδιότητά τους να βιοδιασπώνται in vivo από τον οργανισμό δημιούργησε τη δυνατότητα νέων εφαρμογών που πλεονεκτούσαν έναντι των ήδη γνωστών και διαδεδομένων μεθόδων. Για παράδειγμα μπορούν να σχεδιαστούν βιοδιασπώμενες πολυμερικές μήτρες για την απελευθέρωση ουσιών με ελεγχόμενο ρυθμό καθώς επίσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντικαταστάτες των μεταλλικών εμφυτευμάτων για την αποκατάσταση οστών αποφεύγοντας μια δεύτερη επέμβαση εξαγωγής τους (Nair & Laurencin, 2007; Pachence et al., 2007; Wang et al., 2009). Στους άλλους η παραγωγή των βιοδιασπώμενων πολυμερών προήχθη λόγω του προβλήματος της μόλυνσης του περιβάλλοντος και της έλλειψης χώρου διάθεσης των απορριμμάτων. Σήμερα λίγα μόνο βιοπολυμερή εμπορευματοποιούνται. Ο κύριος λόγος είναι το υψηλό τους κόστος το οποίο δεν είναι ακόμα ανταγωνιστικό. Το μέλλον του κάθε τύπου 11

46 βιοπολυμερούς εξαρτάται όχι μόνο από την ανταγωνιστικότητά του αλλά και από τη δυνατότητα της κοινωνίας να πληρώσει για αυτό. Για να βελτιωθούν οι ιδιότητες των βιοδιασπώμενων πολυμερών πολλές μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί, όπως τυχαίος ή κατά συστάδες συμπολυμερισμός. Αυτές οι μέθοδοι βελτιώνουν και το ποσοστό βιοδιάσπασης και τις μηχανικές ιδιότητες των τελικών προϊόντων. Ο φυσικός συνδυασμός είναι ένας άλλος τρόπος για να παραχθούν βιοδιασπάσιμα υλικά με τις διαφορετικές μορφολογίες και φυσικά χαρακτηριστικά Η έννοια της βιοδιάσπασης Η φύση είναι σε θέση να διασπά όλα όσα παράγει σε διοξείδιο του άνθρακα, νερό και βιομάζα με αποτέλεσμα να σχηματίζονται νέοι οργανισμοί από παλιούς. Στην φύση πραγματοποιείται ανακύκλωση των φυσικών πρώτων υλών καθώς όλοι οι έμβιοι οργανισμοί, είτε είναι φυτά είτε ζώα, αποδομούνται από το περιβάλλον. Ακόμα και το καθαρό πετρέλαιο μπορεί να αποδομηθεί στο κατάλληλο περιβάλλον. Η επιστήμη και η τεχνολογία έχουν γίνει εργαλείο στα χέρια της ανθρωπότητας. Έχουν αναπτυχθεί τεχνικές και διεργασίες οι οποίες μετασχηματίζουν τις φυσικές πρώτες ύλες όπως το πετρέλαιο σε ποικίλα και βελτιωμένα προϊόντα, για παράδειγμα σε διαφόρους τύπους πλαστικών υλικών. Τα προϊόντα αυτά παρόλο που προκύπτουν από το πετρέλαιο, που μπορεί να αποδομηθεί σε περιβάλλον με κατάλληλες συνθήκες, έχουν τροποποιηθεί σε τόσο μεγάλο βαθμό που όταν απορριφθούν στην φύση δεν αναγνωρίζονται από τους μικροοργανισμούς. Το γεγονός αυτό είναι απαγορευτικό για την βιοδιάσπαση τους, ενώ ταυτόχρονα τα καθιστά εστία ρύπανσης και διαταράσσει τον κύκλο ζωής των φυσικών προϊόντων. Όπως έχει ήδη αναφερθεί η έννοια της βιοδιάσπασης και κατ επέκταση η έννοια των βιοδιασπώμενων πολυμερών χρησιμοποιήθηκε για αρκετά χρόνια λανθασμένα καθώς δεν υπήρχαν νομοθεσίες και κανονισμοί που να τις διέπουν. Ως βιοδιασπώμενα χαρακτηρίστηκαν μίγματα φυσικών και συνθετικών πολυμερών τα οποία δεν ήταν στην πραγματικότητα βιοαποδομήσιμα αφού το κλάσμα του συνθετικού πλαστικού παραμένει στο περιβάλλον και δεν διασπάται όπως το κλάσμα του φυσικού. 12

47 Προκειμένου ένα υλικό να χαρακτηριστεί βιοδιασπώμενο θα πρέπει να πληρεί κάποιες προϋποθέσεις οι οποίες περιγράφονται από πιστοποιημένα πρότυπα διασφάλισης ποιότητας. Σύμφωνα με το πρότυπο ASTM D βιοδιασπώμενα, ή αλλιώς βιοαποικοδομήσιμα, πολυμερή ονομάζονται τα πλαστικά των οποίων η βιοδιάσπαση προκύπτει φυσικά στη βιόσφαιρα και είναι αποτέλεσμα της ενζυμικής δράσης έμβιων οργανισμών όπως βακτήρια, μύκητες και άλγη. Σχήμα 1.5. Η πορεία της βιοδιάσπασης στα βιοδιασπώμενα πολυμερή (Smith, 2005). Σε γενικές γραμμές η υποβάθμιση των βιοδιασπώμενων πολυμερών πραγματοποιείται σε δύο στάδια (Σχήμα 1.5.). Στο πρωταρχικό στάδιο διασπώνται οι πολυμερικές αλυσίδες σε μικρότερου μοριακού βάρους τμήματα, που ονομάζονται ολιγομερή, τα οποία μπορούν να αφομοιωθούν από τους μικροοργανισμούς. Η υποβάθμιση του μοριακού βάρους προκαλείται κυρίως μέσω υδρόλυσης ή οξειδωτικής διάσπασης της πολυμερικής αλυσίδας. Η υδρόλυση προκύπτει αξιοποιώντας το νερό που βρίσκεται στο περιβάλλον είτε με την βοήθεια ενζύμου/ων (βιοτική) είτε όχι (αβιοτική). Στην περίπτωση της αβιοτικής βιοδιάσπασης η αυτοκατάλυση, η θερμότητα ή καταλυτικά μέταλλα είναι συνήθως υπεύθυνα για την υδρόλυση. Οξειδωτική διάσπαση προκαλείται κυρίως από οξυγόνο, καταλυτικό μέταλλο, 13

48 ακτινοβολία UV ή ένζυμο. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί πως η πολυμερική αλυσίδα μπορεί να διασπαστεί μέσω άσκησης μηχανικής δύναμης όπως κάμψης, πίεσης ή επιμήκυνσης (Smith, 2005). Τα ολιγομερή που προκύπτουν κατά το πρωταρχικό στάδιο της βιοδιάσπασης αφομοιώνονται από μικροβιακά κύτταρα για να παραχθεί στην συνέχεια διοξείδιο του άνθρακα, νερό και μικροβιακά κύτταρα/μεταβολικά προϊόντα κάτω από αερόβιες συνθήκες. Σε αναερόβιες συνθήκες παράγεται μεθάνιο αντί του διοξειδίου του άνθρακα και του νερού. Τα βιοδιασπώμενα πολυμερή χαρακτηρίζονται από τον χρόνο και τον ρυθμό βιοδιάσπασης. Ο βαθμός βιοδιάσπασης καθορίζεται μέσω πιστοποιημένων τεστ και υπολογίζεται από την ποσότητα του άνθρακα που εκλύεται από τη βιοδιάσπαση. Επιπλέον θα πρέπει να καθορίζονται τα προϊόντα της βιοδιάσπασης καθώς και η τοξικότητά τους, που υπολογίζεται μέσω δοκιμών τοξικότητας στις οποίες χρησιμοποιούνται φυτά και ζώα ευαίσθητα σε τοξικές ουσίες (DEH, 2002). Ο ρυθμός βιοδιάσπασης εξαρτάται άμεσα από τη μορφή του προϊόντος, την ενεργή του επιφάνειά, το πορώδες του, το μικροβιακό πληθυσμό, την έκθεση σε ακτινοβολία, την θερμοκρασία και το ph του περιβάλλοντος. Η βιοδιάσπαση των πλαστικών εξαρτάται επίσης από την πρώτη ύλη παραγωγής τους, τη χημική δομή τους και την σύνθεσή τους. Για αυτό το λόγο τα βιοαποικοδομήσιμα πλαστικά μπορεί να προέρχονται από φυσικά ή από συνθετικά πολυμερή Ταξινόμηση βιοδιασπώμενων πολυμερών Μπορούμε να κατατάξουμε τα βιοδιασπώμενα πολυμερή που υπάρχουν σήμερα στο εμπόριο σε τρείς μεγάλες κατηγορίες ανάλογα με τον τρόπο παραγωγής και τις πρώτες ύλες από τις οποίες προέρχονται σε: Φυσικά βιοδιασπώμενα πολυμερή Τα φυσικά πολυμερή είναι πολυμερή που παράγονται στη φύση από έμβιους οργανισμούς. Η αντίδραση βιοδιάσπασής τους καταλύεται από ένζυμα και πραγματοποιείται σε υδατικά διαλύματα. Τα φυσικά μακρομόρια όπως οι πρωτεΐνες, η κυτταρίνη και το άμυλο περιέχουν εστερικούς δεσμούς οι οποίοι διασπώνται εύκολα λόγω της δράσης ενζύμων 14

49 υδρόλυσης. Για τον λόγο αυτό ο υδροφιλικός/υδροφοβικός χαρακτήρας των πολυμερών επηρεάζει σημαντικά την βιοαποδόμηση τους. Επίσης έχει μεγάλο αντίκτυπο στην απόδοση και αντοχή τους σε συνθήκες υγρασίας. Οι πολυσακχαρίτες, όπως το άμυλο, είναι τα κύρια φυσικά πολυμερή που διατίθενται στο εμπόριο. Επίσης οι αλειφατικοί πολυεστέρες όπως οι πολύ-υδροξυαλκανεστέρες (PHAs), αποτελούν μια οικογένεια βιοδιασπώμενων πολυμερών που απαντώνται στη φύση και βρίσκονται στην απαρχή της εμπορικής τους χρήσης. Τέλος, πρωτεΐνες όπως η ζελατίνη, το μαλλί, το μετάξι και η καζεΐνη χρησιμοποιούνται στον τομέα της ένδυσης και των τροφίμων αλλά και άλλα υλικά όπως το φυσικό καουτσούκ και η λιγνίνη. Συνθετικά βιοδιασπώμενα πολυμερή Ενώ τα φυσικά πολυμερή προκύπτουν από έμβιους οργανισμούς τα συνθετικά βιοδιασπώμενα πολυμερή παράγονται από τον άνθρωπο. Και στις δύο περιπτώσεις όμως ο μηχανισμός βιοδιάσπασης είναι ο ίδιος. Τα τελευταία χρόνια έχουν παρασκευασθεί πολλά είδη πολυμερών που βιοδιασπώνται με υδρόλυση. Η κύρια κατηγορία συνθετικών βιοδιασπώμενων πολυμερών περιλαμβάνει αλειφατικούς πολυεστέρες με δεσμούς ικανούς να υδρολυθούν κατά μήκος της πολυμερικής αλυσίδας όπως π.χ. το πολύ-γαλακτικό οξύ (PLA), το πολυγλυκολικό οξύ (PGA) και τα συμπολυμερή τους (VICRYL). Ευρέως διαθέσιμα είναι και τα συμπολυμερή αλειφατικών / αρωματικών πολυεστέρων. Επίσης τα συνθετικά βιοδιασπώμενα πολυμερή μπορούν να προκύψουν είτε από ανανεώσιμες πηγές, όπως αναφέραμε παραπάνω το παράδειγμα του PLA, είτε από μη ανανεώσιμες πηγές, όπως η πολύ-καπρολακτόνη (PCL). Τα μόνα συνθετικά πολυμερή που μπορoύν να βιοδιασπώνται είναι τα πολυμερή συμπύκνωσης. Τα συνθετικά πολυμερή συμπύκνωσης βιοδιασπώνται με ρυθμό που εξαρτάται από την ομάδα που περιλαμβάνουν στην αλυσίδα τους (εστέρες > αιθέρες > αμίδια ), τη μορφολογία (άμορφα > κρυσταλλικά), το μοριακό βάρος (χαμηλότερο > υψηλότερο), ενώ τα υδρόφιλα βιοαποικοδομούνται πιο γρήγορα από τα υδρόφοβα (Ashby & Johnson, 2006). Τα πολυμερή προσθήκης δεν βιοαποικοδομούνται. 15

50 Τροποποιημένα φυσικά βιοδιασπώμενα πολυμερή Τα τελευταία τριάντα χρόνια περίπου έχουν γίνει πολλές προσπάθειες για να βελτιωθεί η βιοαποδομησιμότητα των συνθετικών πολυμερών μέσω ενσωμάτωσης σε αυτά υλικών που προέρχονται από πολυσακχαρίτες. Τη δεκαετία του 1980 οι εταιρίες παραγωγής πλαστικών στη Βόρεια Αμερική άρχισαν να κατασκευάζουν την πρώτη γενιά βιοδιασπώμενων πολυμερών. Αυτή περιελάμβανε μίγματα φυσικών πολυμερών, όπως για παράδειγμα άμυλο, σε ποσοστό 5-20%, σε συνδυασμό με κάποιο συνθετικό πλαστικό, π.χ. πολυαιθυλένιο (PE) ή πολυπροπυλένιο (PP). Τα συμβατικά πλαστικά με προσθήκες αμύλου δεν θεωρούνται βιοδιασπώμενα διότι παρόλο που το κλάσμα του φυσικού πολυμερούς διασπάται από τους μικροοργανισμούς το μέρος του συνθετικού πλαστικού παραμένει, σε μικρότερους μεν όγκους, που συνεχίζουν δε να ρυπαίνουν το περιβάλλον. Η βιοδιάσπαση δεν είναι χαρακτηριστικό αυτής της γενιάς πλαστικών, αν και εσφαλμένα υιοθέτησαν αυτόν τον όρο, δημιουργώντας μια διαφορετική και όχι την πρέπουσα εικόνα για τα βιοδιασπώμενα πολυμερή. Προϊόντα που προέκυψαν από αυτή τη γενιά πλαστικών ήταν κυρίως προϊόντα μιας χρήσεως, όπως σακούλες απορριμμάτων. Στην δεύτερη γενιά βιοδιασπώμενων πολυμερών προκειμένου να βελτιωθούν οι μηχανικές ιδιότητες του τελικού προϊόντος αυξήθηκε το ποσοστό του φυσικού πολυμερούς στο 50-80% του συνόλου. Παρόλα αυτά το ποσοστό του συνθετικού πλαστικού παρέμενε υψηλό. Η τρίτη γενιά βιοδιασπώμενων πολυμερών δημιούργησε πραγματικά βιοδιασπώμενα πλαστικά. Προκειμένου να βελτιωθούν κάποιες ιδιότητες των πολυμερών αυτών, τα βιοδιασπώμενα πολυμερή υπόκεινται σε μετατροπές και επεξεργασίες, σύμφωνες πάντα με τους κανονισμούς καταλληλότητας (Chandra & Rustgi, 1998). Το πιο χαρακτηριστικό τροποποιημένο φυσικό βιοδιασπώμενο πολυμερές στο εμπόριο παράγεται από την εταιρεία Novamont είναι το υλικό Matter-Bi. Η Novamont παράγει διάφορα είδη Matter-Bi, τα οποία περιέχουν διάφορες ομάδες συνθετικών πολυμερών όπως PCL (Platt D.K., 2006). 16

51 Εναλλακτικά η ταξινόμηση των βιοδιασπώμενων πολυμερών μπορεί να πραγματοποιηθεί σύμφωνα με την πηγή προέλευσης τους στις εξής κατηγορίες: ζωικής προέλευσης, π.χ. κολλαγόνο, ζελατίνη φυτικής προέλευσης, π.χ. άμυλο θαλάσσιας προέλευσης, π.χ. χιτίνη οστρακοειδών και μαλακίων μικροβιακής προέλευσης, π.χ. πολυυδροξυαλκανεστέρες πετροχημικής προέλευσης, π.χ. πολυκαπρολακτόνη, πολυβινυλική αλκοόλη Σχήμα 1.6. Ταξινόμηση βιοδιασπώμενων πολυμερών. Τα σημαντικότερα είδη βιοδιασπώμενων πολυμερών που παρουσιάζουν το μεγαλύτερο ενδιαφέρον ως προς την χημική τους σύσταση, τις ιδιότητες, τις εφαρμογές τους και διατίθενται σήμερα εμπορικά είναι τα βιοδιασπώμενα πολυμερή με βάση το άμυλο (συμπεριλαμβανομένων των τροποποιημένων μιγμάτων αμύλου), τα PHAs, το PLA και συνθετικά βιοδιαπώμενοι αλειφατικοί και αρωματικοί πολυεστέρες και συμπολυμερή αυτών. Στον πίνακα 1.2 μπορούμε να παρατηρήσουμε ομοιότητες και διαφορές, όσον αφορά τις ιδιότητες, μεταξύ βιοδιασπώμενων και συμβατικών πολυμερών. 17

52 Πίνακας 1.2. Ιδιότητες βιοδιασπώμενων και συμβατικών πολυμερών. Ιδιότητα Πολυμερές T g ( o C) T m ( o C) Πυκνότητα (g/l) Αντοχή διαρροής (MPa) Επιμήκυνση κατά τη θραύση (%) Μέτρο ελαστικότητας (GPa) Βιοδιασπώμενα πολυμερή PHB PHBV -4 έως PLA PCL PGA PBS PBSA PBAT Mater-Bi Y101U Mater-Bi ZF 03U/A Mater-Bi NF01U Συμβατικά πολυμερή LDPE LLDPE HDPE PP PS

53 Παραγωγή και εφαρμογές βιοδιασπώμενων πολυμερών Τα βιοδιασπώμενα πολυμερή, πέραν του πλεονεκτήματος να διασπώνται βιολογικά, παρουσιάζουν καλές φυσικές και μηχανικές ιδιότητες και δύναται να αντικαταστήσουν τα συμβατικά πολυμερή σε συγκεκριμένες εφαρμογές. Ο κύριος λόγος που εμποδίζει την ευρύτερη παραγωγή και εμπορευματοποίηση τους είναι το υψηλό τους κόστος συγκριτικά με αυτό των συμβατικών. Η παγκόσμια παραγωγή των βιοδιασπώμενων πολυμερών έχει εκτιναχθεί από τα μέσα της δεκαετίας του 90. Το 1995 η παραγωγή κυρίως γινόταν σε πιλοτική κλίμακα με μέγιστη παραγωγή όχι μεγαλύτερη από 25-30,000 τόνους. Το 2005 η παραγωγή τους αυξήθηκε στους 360,000 τόνους εκ των οποίων 300,000 τόνοι ήταν βιοδιασπώμενα πολυμερή από ανανεώσιμους πόρους και οι υπόλοιποι 60,000 τόνοι συνθετικά βιοδιασπώμενα πολυμερή. Το 2008 η παραγωγή τους ανήλθε στους 600,000 τόνους ενώ για το 2010 προβλέπεται να φτάσει τους τόνους. Από το 2000 έως το 2010 η παγκόσμια παραγωγή των βιοδιασπώμενων πολυμερών χαρακτηρίζεται από ετήσιο ρυθμό αύξησης περίπου 18 % (Shen et al., 2009). Πίνακας 1.3. Παγκόσμια παραγωγή βιοδιασπώμενων πολυμερών ανά κατηγορία σε τόνους (Shen et al., 2009). Πολυμερές Έτος Με βάση το άμυλο PLA PHAs Συνθετικά ΣΥΝΟΛΟ Τα τελευταία χρόνια, και συγκεκριμένα από το έτος 2003, έχει παρατηρηθεί αύξηση στην τιμή των συμβατικών πολυμερών λόγω της αύξησης στην τιμή του πετρελαίου. Η αύξηση των τιμών κυμαίνεται από περίπου 18-35% ανάλογα με τον τύπο του πλαστικού όπως φαίνεται και 19

54 στον πίνακα 1.4. Παράλληλα, οι κλιματικές μεταβολές αποτελούν ανασταλτικούς παράγοντες για την περαιτέρω χρήση παραγώγων πετρελαίου για την παραγωγή συμβατικών πλαστικών. Συμφωνα με στοιχεία που προκύπτουν από Διεθνή Οργανισμό βιοαποικοδομήσιμων πλαστικών (IBAW) και αφορούν το έτος 2005 φαίνεται πως το ενδιαφέρον του κόσμου και των εταιριών για τα βιοπλαστικά έχει αυξηθεί, γεγονός που οφείλεται στη βελτιωμένη λειτουργικότητα των βιοδιασπώμενων πλαστικών και στην αναπτυσσόμενη αγορά (European Bioplastics). Πίνακας 1.4. Μέση τιμή πώλησης διαφόρων συμβατικών πλαστικών κατά την περίοδο στην Δυτική Ευρώπη (IBAW, 2005). Μέση τιμή πώλησης στην Δυτική Ευρώπη ( /τόνο) Πλαστικό % Αύξηση LDPE PP PS PET Την ίδια χρονική περίοδο η τιμή των βιοδιασπώμενων πολυμερών, όπως των μιγμάτων αμύλου-συνθετικών βιοδιασπώμενων, του PLA και των συμπολυμερών αλειφατικών και αρωματικών πολυεστέρων μειώνεται σημαντικά λόγω της αυξανόμενης ζήτησης. Αυτός ο συνδυασμός γεγονότων ευνόησε την περαιτέρω επέκτασή τους σε αρκετούς τομείς ευρείας κατανάλωσης. Ενδεικτικά αναφέρουμε πως η τιμή των βιοδιασπώμενων πολυμερών με βάση το άμυλο κατά το έτος 2003 ανέρχονταν στα 3-5 /κιλό ενώ το 2005 η τιμή του μειώθηκε στα /κιλό με μέση τιμή πώλησης στα 1.75 /κιλό. Παρομοίως η τιμή του PLA μειώθηκε από /κιλό το 2003 σε /κιλό το 2005 και τα συμπολυμερή των αλειφατικών και αρωματικών πολυεστέρων από /κιλό σε /κιλό (Platt D.K., 2006). Η διαφορά στην τιμή μεταξύ των πλαστικών που προέρχονται από ανανεώσιμες πρώτες ύλες και των κοινών πλαστικών έχει μειωθεί αισθητά και για το λόγο αυτό οι μακροπρόθεσμες 20

55 προοπτικές ανάπτυξης των βιοδιασπώμενων πολυμερών είναι πολλά υποσχόμενες. Συγχρόνως, η παγκόσμια παραγωγή τους αυξάνεται σε μεγάλο ποσοστό ετησίως, με το μεγαλύτερο ποσοστό να κατέχουν τα βιοπλαστικά από ανανεώσιμες πρώτες ύλες. Το αυξημένο ενδιαφέρον για τη συγκεκριμένη αγορά ενισχύεται και από τις τελευταίες εξελίξεις σε τεχνολογικό και επιστημονικό επίπεδο. Σε κάποιες σημαντικές περιοχές εφαρμογών τα βιοπλαστικά έχουν καταφέρει να φτάσουν τα κοινά πλαστικά σε ποιότητα εφαρμογής. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν εφαρμογές στον τομέα της ιατρικής, της συσκευασίας (Halley, 2002) και της γεωργίας (Leaversuch, 2002; Cheillini et al., 2003; Bucci et al., 2005; Briassoulis, 2007). Η βιομηχανία των βιοπλαστικών βρίσκεται στο ξεκίνημα μιας ανάπτυξης που θα εξαπλωθεί στις περιοχές των προϊόντων που προέρχονται από το πετρέλαιο. Οι ανανεώσιμες πρώτες ύλες αποτελούν μια καλή λύση αφού μπορούν να αναπτυχθούν και σε χώρες που δεν διαθέτουν πηγές πετρελαίου, δεν επιβαρύνουν το περιβάλλον και δεν ενισχύουν το φαινόμενο του θερμοκηπίου με υψηλές εκπομπές διοξειδίου του άνθρακα και άλλων βλαβερών, για το περιβάλλον και τον άνθρωπο, ουσιών (EPIC, 2000). Τα βιοδιασπάσιμα πολυμερή μπορούν να επεξεργαστούν σύμφωνα με τις περισσότερες συμβατικές τεχνικές επεξεργασίας πλαστικών με μερικές ρυθμίσεις των συνθηκών επεξεργασίας και τροποποιήσεις του μηχανολογικού εξοπλισμού. Η εξώθηση, η χύτευση με έγχύση, η ψυχρή μορφοποίηση με εμφύσηση, η θερμική συμπίεση είναι μερικές από τις τεχνικές επεξεργασίας που χρησιμοποιούνται. Τρεις είναι οι κύριοι τομείς που συναντούμε τα βιοδιασπάσιμα πολυμερή και περιλαμβάνουν την ιατρική, τη συσκευασία και τη γεωργία. Οι εφαρμογές των βιοδιασπάσιμων πολυμερών περιλαμβάνουν όχι μόνο τις φαρμακολογικές συσκευές, ως μήτρες για ακινητοποίηση ενζύμων και ελεγχόμενης απελευθέρωσης ουσιών (Zinn et al., 2001; Catro et al., 2008) αλλά και τις θεραπευτικές συσκευές, ως προσωρινά τεχνητά μέλη πορώδους δομής για την χρήση τους στην μηχανική ιστών. Δεδομένου ότι τα βιοπολυμερή παρουσιάζουν μικρή διαλυτότητα στο νερό και υψηλή αναρρόφηση νερού, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως απορροφητικά υλικά στην φυτοκομία, την υγειονομική περίθαλψη και τις γεωργικές εφαρμογές (Suda et al., 2000). Τα απόβλητα συσκευασίας έχουν προκαλέσει αυξανόμενες περιβαλλοντικές ανησυχίες. Η 21

56 ανάπτυξη βιοδιασπάσιμων πολυμερών ως υλικών συσκευασίας έχει προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον (Petersen et al., 1999). Στον πίνακα 1.5 παρουσιάζονται μερικά βιοδιασπάσμα υλικά και η χρήση τους. Πίνακας 1.5. Μερικές εφαρμογές των βιοδιασπώμενων πολυμερών (Platt D.K., 2006). Προϊόν Εταιρεία Σύσταση Εφαρμογές Mater-Bi Novamont (Ιταλία) Άμυλο και πολυεστέρας Τσάντες συλλογής πράσινων αποβλήτων, γεωργικές μεμβράνες, προϊόντα μίας χρήσεως Polynat Roverch (Γαλλία) Σίκαλη (80%) Προϊόντα μιας χρήσεως, γλάστρες Ecofoam AEC (Η.Π.Α.) Άμυλο Μεμβράνες περιτύλιξης Biopol Goodfellow (Μ. Βρετανία) PHB/PHV Ξυράφια, φιάλες Eco-pla Cargill Dow (Η.Π.Α.) PLA Προϊόντα υγιεινής, αθλητικά ενδύματα, συσκευασία, βιοϊατρική Bio-D Cirad (Γαλλία) Πρωτεΐνες από βαμβάκι Γεωργικές μεμβράνες Ecoflex BASF (Γερμανία) Συμπολυεστέρες Γεωργικές μεμβράνες Eastar Bio Eastman (Μ. Βρετανία) Συμπολυεστέρες Γεωργικές μεμβράνες Προϊόντα μιας χρήσεως, BAK 1095 Bayer (Γερμανία) Αμίδια πολυεστέρα γλάστρες 22

57 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ Ashby M. & Johnson K. Υλικά και σχεδιασμός. Εκδόσεις Κλειδάριθμος, Briassoulis D. Analysis of the mechanical and degradation performances of optimized agricultural biodegradable films. Polym. Degr. 92, pp , Bucci D.Z., Tavares L.B.B., Sell I. PHB packaging for the storage of food products. Polym. Testing, 24, pp , Carraher Charles E., Seymour/Carraher s Polymer Chemistry, 7 th Edition by Charles E. Carraher Jr., CRC Press, Florida Atlantic University, ISBN-13: , Catro G., Panilaitis B., Kaplan D. Emulsan tailorable biopolymer for controlled release. Bioresour.Technol. 99, pp , Chandra R. & Rustgi R. Biodegradable polymers. Progressive Polymer Science. 23, pp , Chiellini E., Chiellini F., Cinelli P., Ilieva V. Bio-based polymeric materials for agriculture applications. In Biodegradable polymers and plastics. Chiellini E., Solaro R., Eds.; Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, USA, pp , DEH-Australian Government, Biodegradable Plastics-Developments and Environmental Impacts, Nolan-ITU Pty Ltd, EPIC (environment and plastics industry council), Technical Report Biodegradable Polymers: A review, European Bioplastics, Halley P. Biodegradable packaging for the food industry. Packag. Bottling Int. 4 (4), pp 56-57, Food Industry, IBAW. Highlights in Bioplastics-An Ibaw Publication, Copyright IBAW e.v.,, January Leaversuch R. Biodegradable Polyesters: Packaging Goes Green. Plastics Technology 48, pp , Malafaya P.B., Silva G.A., Reis R.L. Natural origin polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell delivery in tissue engineering applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, pp ,

58 Nair L.S., Laurencin, C.T. Biodegradable polymers as biomaterials. Progr. Polym. Sci. 32, pp , Pachence J.M., Bohrer M.P., KohnNewly J. Biodegradable polymers. In Principles of Tissue Engineering, 3rd Ed.; Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J., Eds.; Elsevier: Amsterdam, Netherlands, Chapter 23, pp , PlasticsEurope, The Compelling Facts About Plastics 2009, A analysis of European plastics production, demand and recovery for Plastics, The material for the 21 st Century, Plastics-the Facts, An analysis of European plastics production, demand and recovery for Plastics. The material for the 21 st century, Platt D.K. Biodegradable Polymers Market Report. David K. Platt, Ed. Smithers Rapra Limited, Petersen K., Nielsen P.V., Bertelsen G., Lawther M., Olsen M.B., Nilsson N.H., Mortensen G. Potential of biobased materials for food packaging. Trends Food Sci. Technol. 10, pp , Shen L., Haufe J., Pate; M.K. Product overview and market projection of emerging bio-based plastics. PRO-BIP 2009, Final Report Revised in November 2009 commissioned by European Polysaccharide Network of Excellence (EPNOE) and European Bioplastics. Utrecht, The Netherlands. Smith R. Biodegradable polymers for industrial applications, Ed. Ray Smith, Woodhead Publishing Limited, Cambridge, England, Stevens E.S., Green Plastics Suda K., Wararuk C., Manit S. Radiation modification of water sorption of cassava starch by acrylic acid/acrylamide. Rad. Phys. Chem. 59, pp , Wang H., Ji J., Zhang W., Zhang Y., Jiang J., Wu Z., Pu S., Chu P.K..Biocompatibility and bioactivity of plasma treated biodegradable poly(butylene succinate). Acta Biomater. 5, pp , Zinn M., Witholt B., Egli T. Occurrence, synthesis and medical application of bacterial polyhydroxyalkanoate. Adv. Drug Deliv. Rev. 53, pp. 5-21,

59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Πολυ-υδροξυαλκανεστέρες (PHAs) Μεταξύ των διάφορων τύπων βιοδιασπώμενων πλαστικών οι πολυυδροξυαλκανεστέρες, (PHAs), ανήκουν σε αυτούς που είναι ευρύτερα γνωστοί. Τα πολυμερή αυτά έχουν αναγνωριστεί ως πλήρως βιοσυνθετικά και βιοδιασπάσιμα παράγοντας μηδενικά τοξικά απόβλητα ενώ ανακυκλώνονται 100% ως οργανικά απόβλητα. Είναι μικροβιακοί πολυεστέρες που παράγονται από ένα ευρύ φάσμα μικροοργανισμών, συνήθως ως ενδοκυτταρικές ενώσεις αποθήκευσης ενέργεια και άνθρακα. Τα PHAs είναι ανάμεσα στις πιο ενδιαφέρουσες και μεγαλύτερες ομάδες βιοπολυεστέρων περιλαμβάνοντας πάνω από 150 διαφορετικούς τύπους μονομερικών δομών που προσδίδουν διαφορετικές ιδιότητες και λειτουργίες. Οι ιδιότητές τους εκτείνονται σε ένα ευρύ φάσμα, συμπεριλαμβάνοντας υλικά που παρουσιάζουν θερμοπλαστικές ιδιότητες και άλλα που κατέχουν ιδιότητες ελαστομερών. Τα υλικά αυτά βρίσκουν εφαρμογή στην ιατρική, την γεωργία, την μηχανική ιστών, την παρασκευή σύνθετων υλικών κ.ά. Τα PHAs μπορούν να παραχθούν από ανανεώσιμες πρώτες ύλες υπό ελεγχόμενες συνθήκες μέσω βιοτεχνολογικών διεργασιών. Η ποικιλία των μονομερικών τους δομών, είτε στα ομοπολυμερή είτε στα συμπολυμερή, εξαρτάται από τον/τους μικροοργανισμό/ους, το/τα υπόστρωμα/τα και τις συνθήκες κάτω από τις οποίες πραγματοποιείται η διαδικασία παραγωγής τους. Γνωρίζοντας τις επιδράσεις του κάθε παράγοντα π.χ. τύπος καλλιέργειας, υπόστρωμα, συγκεντρώσεις θρεπτικών, ph, θερμοκρασία κ.ά. είναι δυνατή η σχεδίαση των επιθυμητών προϊόντων. Τα PHAs βιοδιασπώνται πλήρως στο περιβάλλον διότι πολλοί μικροοργανισμοί που βρίσκονται στο έδαφος είναι σε θέση να εκκρίνουν ΡΗΑ αποπολυμεράσες, ένζυμα που υδρολύουν τους εστερικούς δεσμούς του πολυμερούς σε υδροδιαλυτά μονομερή και ολιγομερή. Οι μικροοργανισμοί στη συνέχεια μεταβολίζουν αυτά τα προϊόντα υποβάθμισης σε νερό και διοξείδιο του άνθρακα. Σήμερα μόνο μερικοί τύποι PHAs παράγονται και είναι διαθέσιμα στο εμπόριο όπως ο πολύ-3-υδροξυβουτυρικός εστέρας, PHB, το συμπολυμερές 3-υδροξυβουτυρικού-3-25

60 υδροξυβαλερικού εστέρα, PHBV, και το συμπολυμερές 3-υδροξυβουτυρικού-3- υδροξυεξανοϊκού εστέρα, PHBH. Ο κύριος λόγος που αφορά στην παραγωγή μικρών ποσοτήτων αυτών των υλικών είναι το υψηλό κόστος το οποίή παρουσιάζει. Το κόστος αυτό μπορεί να μειωθεί μειώνοντας το κόστος του υποστρώματος άνθρακα, μειώνοντας το λειτουργικό κόστος και αυξάνοντας την παραγωγικότητα των βακτηριακών κυττάρων Ιστορική αναδρομή Τα PHAs αποθηκεύονται στη μορφή ενδοκυτταρικών κόκκων στα βακτήρια. Η παρατήρηση των κόκκων αυτών στα βακτηριακά κύτταρα μέσω μικροσκοπίου διάθλασης είναι γνωστή από τον Beijerinck το 1888 (Chowdhury, 1963). Ο πρώτος προσδιορισμός της δομής ενός πολυυδροξυαλκανεστέρα (PHA) πραγματοποιήθηκε το 1927 από τον Lemoigne (Lemoigne, 1927). Στο βακτήριο που απαντάται στο έδαφος Bacillus megaterium, η αναερόβια υποβάθμιση ενός άγνωστου υλικού οδήγησε στην έκκριση του 3-υδροξυβουτυρικού οξέος. Ο Lemoigne προσδιόρισε αυτό το υλικό ως ομοπολυεστέρα ενός υδροξυοξέος, τον 3- υδροξυβουτυρικό εστέρα ή αλλιώς πολυ-3-υδροξυβουτυρικό εστέρα (Ρ(3HB)), και με επιφύλαξη τον περιέγραψε ως υλικό αποθήκευσης. Μετά την πάροδο περίπου τριάντα ετών, το 1958, προήλθε από τους Macrae και Wilkinson μια πειστική πρόταση για τον λειτουργικό ρόλο του Ρ(3HB). Παρατήρησαν πως το βακτήριο Bacillus megaterium αποθήκευε αυτό το ομοπολυμερές όταν ο λόγος της πηγής γλυκόζης-αζώτου στο θρεπτικό μέσο ήταν υψηλός (Macrae & Wilkinson, 1958a), ενώ ακολουθούσε υποβάθμιση του σε συνθήκες απουσίας εξωγενούς άνθρακα και πηγής ενέργειας (Macrae & Wilkinson, 1958b). Έτσι κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το Ρ(3HB) ήταν ένα υλικό αποθήκευσης άνθρακα και ενέργειας που επιβράδυνε την λύση και τον θάνατο των κυττάρων και σωστά θεώρησαν πως τα σύμπλοκα του οξικού οξέος και του συνένζυμου Α εμπλέκονται στο βιοσυνθετικό μονοπάτι του Ρ(3HB). Τα επόμενα χρόνια το ενδιαφέρον για το Ρ(3HB) άρχισε να αυξάνεται εντυπωσιακά. Ακολούθησαν έρευνες οι οποίες πραγματεύονταν την ύπαρξη και σύνθεση του πολυμερούς αυτού και σε άλλα στελέχη βακτηρίων όπως βακτήρια του γένους Pseudomonas, Azotobacter, Hydrogenomonas, Chromatium κ.ά. Επίσης ακολούθησαν έρευνες που αφορούσαν τις 26

61 φυσικοχημικές ιδιότητες, τα μοριακά βάρη, τις μεθόδους ανάκτησης, την κρυσταλλική δομή, την μορφολογία των ενδοκυτταρικών κόκκων, τις μεθόδους ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης και το μεταβολικό μονοπάτι και την ενζυμολογία της σύνθεσης του Ρ(3ΗΒ). Ιδιαίτερης σημασίας είναι και η επίδραση του εξωκυτταρικού περιβάλλοντος στην βιοσύνθεση του Ρ(3HB). Οι συνθήκες που ευνοούν την συσσώρευση του Ρ(3HB) βρέθηκε πως είναι αυτές που οδηγούν σε υψηλές ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις NAD(Ρ)Η, ακετυλοσυνένζυμου A και χαμηλές συγκεντρώσεις σε ελεύθερα συνένζυμα Α (Dawes & Senior, 1973; Senior & Dawes, 1973). Οι συνθήκες αυτές ποικίλουν ανάλογα με το μικροοργανισμό, αλλά σε όλους υπήρχε παράγοντας ανάπτυξης σε περιορισμό που συνήθως ήταν η ανεπάρκεια αζώτου (Schlegel et al., 1961), καλίου, θείου (Wilkinson & Munro, 1967) ή οξυγόνου (Senior et al., 1972). Ο τομέας των PHAs αναπτύχθηκε αρκετά κοντά στο τέλος του 1973 αλλά το ενδιαφέρον για τα βιοπολυμερή αυτά παρέμενε σχεδόν αποκλειστικά στη φυσιολογική τους σημασία ως μικροβιολογικές ουσίες χωρίς να μελετηθεί η πιθανή χρήση τους ως υλικά. Η πιθανή εφαρμογή τους ως υλικά αναγνωρίστηκε το πρώτο μισό της δεκαετίας του '60 οπότε κατοχυρώθηκαν τα πρώτα διπλώματα ευρεσιτεχνίας σχετικά με την παραγωγή του Ρ(3HB) από βακτηριακές ζυμώσεις (Baptist, 1962a, Holmes & Co., 1982), την ανάκτησή τους από την βιομάζα (Baptist, 1962b), την πλαστικοποίηση τους με πρόσθετες ουσίες (Baptist, 1965) και την χρήση τους ως απορροφήσιμες μήτρες (Grace & Co., 1963). Από την άλλη μεριά τα πετροχημικά πλαστικά κατασκευάζονταν με μεγαλύτερη ευκολία και με πολύ χαμηλότερο κόστος γεγονός που απέτρεπε την ανάπτυξη της βιομηχανίας των φυσικών πλαστικών. Το 1976 η βιομηχανία Imperial Chemical Industries (ICI) στην Αγγλία ξεκίνησε να εξετάζει το ενδεχόμενο επικερδούς παραγωγής Ρ(3HB) μέσω βακτηριακής ζύμωσης από υδατανθρακικές πρώτες ύλες (Senior, 1984). Αποδείχτηκε πως όχι μόνο μπορούσε να παραχθεί Ρ(3HB) από ανανεώσιμους πόρους αλλά πως οι ιδιότητες του παραγόμενου πολυμερούς παρουσίαζαν ομοιότητες με εκείνες του πολυπροπυλένιου (Κing, 1982). Άλλα χαρακτηριστικά γνωρίσματα του Ρ(3HB) όπως η βιοδιασπασιμότητα, η βιοσυμβατότητα, οι πιεζοηλεκτρικές ιδιότητες και η δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν ως πηγή οπτικά ενεργών μορίων (Howell, 1982), αναγνωρίστηκαν από νωρίς ως προτερήματα και κράτησαν ζωντανό το ενδιαφέρον της ICI για το Ρ(3HB) όταν η κρίση του πετρελαίου είχε αρχίσει να περνάει. 27

62 Το Ρ(3HB) σαν υλικό είναι εύθραυστο και παρουσιάζει έκταση μέχρι το σημείο θραύσης (Κing, 1982). Το γεγονός αυτό περιόριζε το εύρος εφαρμογών και εάν υποθέσουμε πως το Ρ(3HB) ήταν ο μόνος πολυυδροξυαλκανεστέρας θα ήταν αμφίβολη η θέση του στην αγορά. Εντούτοις, οι Wallen και Davis το 1972 ανέφεραν την απομόνωση ενός πολυεστέρα, από δραστική λάσπη, που παρουσίαζε παρόμοιες αλλά όχι ταυτόσημες φυσικές και χημικές ιδιότητες με εκείνες του Ρ(3ΗΒ) (Wallen & Davis, 1972). Έπειτα από ανάλυση φάνηκε πως τα κύρια συστατικά ήταν 3-υδροξυβαλερικο και 3-υδροξυβουτυρικό οξύ ενώ σε πολύ μικρότερες συγκεντρώσεις το 3-υδροξυεξανοϊκό και 3-υδροξυεπτανοϊκό οξύ (Wallen & Rohwedder, 1974). Αυτή ήταν η πρώτη αναφορά ενός συμπολυμερικού PHA. Η σημασία της ύπαρξης διαφορετικών PHAs πέραν του ομοπολυμερούς Ρ(3HB) αναγνωρίστηκε αμέσως και έτσι η ICI προχώρησε στην παραγωγή συμπολυμερών Ρ(3HB) με διάφορα άλλα μονομερή, π.χ. 3HV μονάδων, από ποικίλα υποστρώματα, συμπεριλαμβανομένων υδατανθράκων όπως γλυκόζη, και οργανικών οξέων όπως προπϊονικό οξύ (Holmes et al., 1982). To ενδιαφέρον για τα συμπολυμερή, και ιδιαίτερα για το Ρ(3HBV), προέρχεται από το ότι παρουσιάζουν χαμηλότερα σημεία τήξης, είναι λιγότερο κρυσταλλικά, πιο όλκιμα, πιο σκληρά και μορφοποιούνται ευκολότερα από το Ρ(3HB) (Luzier, 1992) οπότε και θεωρούνται ως καλύτερα υποψηφια υλικά για τελικά προϊόντα. Επίσης η μεταβολή του ποσοστού του 3HV στο συμπολυμερές Ρ(3HBV) έχει ως αποτέλεσμα να ποικίλουν οι θερμομηχανικές του ιδιότητες ανάλογα με το ποσοστό αυτό. Συμπολυμερή Ρ(3HBV) με ποσοστό 0-24 mol% 3HV παρήχθησαν από το βακτήριο Ralstonia eutropha και πωλούνται με την εμπορική ονομασία BIOPOL από την Monsanto. Η Monsanto απέκτησε το προϊόν BIOPOL τον Απριλίου 1996 από την Zeneca Bio, μια επιχείρηση που προέκυψε από το μερικό διαχωρισμό της ICI τον Ιούνιο του Η δυνατότητα παραγωγής του είναι της τάξης των 800 τόνων ανά έτος (Braunegg et al., 1998). Με την πάροδο του χρόνου αρκετές βιομηχανίες ανέπτυξαν την παραγωγή των πολυμερών PHB, PHBV, PHBH και P(3HB-4HB) όπως οι Metabolix, Telles, P&G, Meredian στις Η.Π.Α., Biotec, Biomer Inc., BASF στην Γερμανία, Polyferm στον Καναδά, Asahi, Mitsubishi, Kaneka Corp. στην Ιαπωνία, Novamont στην Ιταλία κ.ά. (Reddy et al., 2003; Chanprateep, 2010). 28

63 2.2. Ανίχνευση των PHAs Τα ΡΗΑs συντίθενται από μεγάλο αριθμό βακτηρίων σαν ενδοκυτταρική αποθήκη πηγής άνθρακα και ενέργειας όταν τα βακτήρια βρίσκονται σε κατάσταση περιορισμού, δηλαδή όταν οι μικροοργανισμοί υφίστανται έλλειψη σε κάποιο από τα κύρια θρεπτικά συστατικά του μέσου ανάπτυξης όπως π.χ. οξυγόνο για τους αερόβιους οργανισμούς, άζωτο, ιχνοστοιχεία και ιόντα π.χ. θειικά, φωσφορικά, αμμωνιακά κ.ά. καθώς και διαφοροποίηση της κύριας πηγής άνθρακα (Hazenberg & Witholt, 1997; Lee et al., 2000). Τα ΡΗΑs συσσωρεύονται με τη μορφή κόκκων διαμέτρου μεταξύ μm στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Ο αριθμός και το μέγεθος των κόκκων ανά κύτταρο διαφέρει ανάλογα με τον μικροοργανισμό (Byrom, 1994). Στο βακτήριο Alcaligenes eutrophus συσσωρεύονται 8-13 κόκκοι ανά κύτταρο. Όταν η συγκέντρωση της εξωτερικής πηγής άνθρακα μειωθεί σημαντικά το αποθηκευμένο πολυμερές ξεκινά να αποδομείται μέσω κατάλληλων ενζύμων για να χρησιμοποιηθεί ως πηγή άνθρακα και ενέργειας. Οι κόκκοι ΡΗΑ μπορούν να παρατηρηθούν εύκολα μέσω ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διέλευσης (ΗΜΔ ή TEM) όπου φαίνονται ως ηλεκτρονιακά πυκνά σώματα. Μπορούν επίσης εύκολα να ανιχνευθούν κάνοντας χρήση οπτικού μικροσκοπίου αντιθέσεως φάσεων λόγω της υψηλής διαθλαστικότητας τους (μεγέθυνση 1000 ). Η λιπιδική φύση των PHAs επιτρέπει την χρώση τους με ουσίες της ομάδας Sudan οι οποίες χρησιμοποιούνται εκτενώς εδώ και πολλά χρόνια σαν ιστοχημική εξέταση παρουσίας λιπιδίων στα κύτταρα (Bartholomew, 1981). Οι χρωστικές αυτές εμφανίζουν μεγαλύτερη διαλυτότητα στα λιπιδικά μέρη των κυττάρων οπότε και είναι σε θέση να τα σημάνουν. Συγκεκριμένα η χρωστική Sudan Black B (Williamson & Wilkinson, 1958) χρησιμοποιήθηκε από νωρίς για να ανιχνεύσει κόκκους ΡΗΒ οι οποίοι δίνουν σκούρο μπλε ή ανοικτό ροζ χρώμα. Παρόλα αυτά δεν πραγματοποιείται καλή διάκριση μεταξύ των λιπιδικών ενδοκυτταρικών συστατικών. Πιο διακριτή φαίνεται να είναι η παρατήρηση των κόκκων όταν αντί της Sudan Black B χρησιμοποιείται η χρωστική Nile Blue A καθώς επιδεικνύει δυνατό φθορισμό χρώματος πορτοκαλί σε μήκος κύματος 460 nm (Ostle & Holt, 1982) ή 546 nm (Rees et al., 1992). Επίσης η χρωστική Nile Red χρησιμοποιείται για την απευθείας ανίχνευση ΡΗΑ κόκκων σε 29

64 αναπτυσσόμενες αποικίες βακτηρίων (Spiekermann et al., 1999). Η κυτταρική μεμβράνη καθώς και διάφορα άλλα λιπιδικά συστατικά δεν απορροφούν αρκετή χρωστική ουσία με αποτέλεσμα να μην είναι ανιχνεύσιμα. Επίσης δεν είναι δυνατή η χρώση άλλου τύπου βακτηριακών αποθεματικών υλικά όπως γλυκογόνο και πολυφωσφορικά. Ο φθορισμός των κόκκων γίνεται πιο έντονος όταν αυξάνεται η συγκέντρωση των ενδοκυτταρικών PHAs και δύναται να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της μεταβολής τους κατά την διάρκεια της διεργασίας της βακτηριακής τους παραγωγής. Εικόνα 2.1. Παρατήρηση ΡΗΑ κόκκων στο βακτήριο Wautersia eutropha H16 μέσω (α) μικροσκοπίου ΤΕΜ (Lee at al., 2000), (β) οπτικού μικροσκοπίου αντιθέσεως φάσεων (Tian et al., 2005), (γ) μικροσκοπίου φθορισμού έπειτα από χρώση με Nile Blue A (Rees et al., 1992). Παρόλο που οι μέθοδοι χρώσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να σημάνουν την παρουσία των PHAs απαιτείται χημική ανάλυση για τον προσδιορισμό των μονομερικών τους συνθέσεων. 30

65 2.3. Χημική δομή και ταξινόμηση των PHAs Τα PHAs είναι γραμμικά πολυμερή των υδροξυαλκανοϊκών εστέρων και συντίθενται τόσο από θετικά όσο και από αρνητικά κατά Gram βακτήρια. Μέχρι σήμερα περισσότερα από 300 στελέχη βακτηρίων από αερόβια και αναερόβια φυσικά περιβάλλοντα έχουν χαρακτηριστεί ως προς την ικανότητα τους να συνθέτουν αυτά τα πολυμερή. Ανάλογα με τον μικροοργανισμό, το θρεπτικό μέσο και τις συνθήκες κάτω από τις οποίες πραγματοποιείται η παραγωγή των PHAs προκύπτουν ομοπολυμερή ή συμπολυμερή υδροξυαλκανεστέρων με διάφορες μονομερικές ομάδες. Τα PHAs ταξινομούνται σε τρεις κατηγορίες ανάλογα με τον αριθμό των ατόμων άνθρακα που αποτελούν τα μονομερή τους και είναι οι εξής: scl PHAs (short chain length = μικρού μήκους αλυσίδας ΡΗΑ) Σε αυτή την κατηγορία ανήκουν τα PHAs που οι αλυσίδες των μονομερών τους συνίστανται από 3 έως 5 άτομα άνθρακα και τα οποία συντίθενται από βακτήρια όπως τα Cuprivadus necator και Alcaligenes latus. Τα πολυμερή αυτά είναι ψαθυρά, κρυσταλλικά, θερμοπλαστικά και παρουσιάζουν παρόμοιες ιδιότητες με το συμβατικό πολυπροπυλένιο. Τα πιο γνωστά scl PHAs που παράγονται σήμερα σε βιομηχανική κλίμακα είναι το ομοπολυμερές PHB και PHV. mcl PHAs (medium chain length = μεσαίου μήκους αλυσίδας ΡΗΑ) όπου το μονομερές αποτελείται από 6-14 άτομα άνθρακα και συνήθως παράγονται από βακτήρια του γένους Pseudomonas, όπως το στέλεχος Pseudomonas putida και Pseudomonas mendocina. Τα υλικά αυτά είναι υμικρυσταλλικά, θερμοπλαστικά ελαστομερή. Το PHHx είναι το μόνο μεσαίου μήκους ΡΗΑ το οποίο είναι εμπορικά διαθέσιμο στις μέρες μας. Συμπολυμερή scl-mcl PHAs των οποίων τα μονομερή αποτελούνται από δύο διαφορετικές ομάδες PHA, η μία ανήκει στην κατηγορία των scl PHAs και η δεύτερη στην κατηγορία των mcl PHAs. Τα πολυμερή αυτά παράγονται συνήθως από γενετικά ανασυνδυασμένους μικροοργανισμούς. Επίσης παρουσιάζουν μεγάλο εύρος φυσικών και μηχανικών 31

66 ιδιοτήτων που περιλαμβάνουν τις ιδιότητες τόσο των scl PHAs όσο και των mcl PHAs. Συγκεκριμένα τα υλικά αυτά είναι σε θέση να αντικαταστήσουν το LDPE. Η διάκριση αυτή οφείλεται στην ειδίκευση που επιδεικνύει το ένζυμο ΡΗΑ-πολυμεράση, ή ΡΗΑ-συνθάση, το οποίο είναι υπεύθυνο για τον πολυμερισμό των HΑs μονομερών με συγκεκριμένο αριθμό ατόμων άνθρακα. Για παράδειγμα, η PHA-πολυμεράση του Alcaligenes eutrophus μπορεί να πολυμερίσει HAs που συνίστανται από 3-5 άτομα άνθρακα αλλά όχι αυτά που συνίστανται από 6 και πλέον άτομα άνθρακα. Από την άλλη μεριά η PHA-συνθετάση του Pseudomonas oleovorans δρα μόνο σε 3-HAs των 6-14 ατόμων άνθρακα. Παρακάτω παρατηρούμε την γενική χημική δομή των ΡΗΑ μονομερών και συμπολυμερών καθώς και κάποιους από τους αντιπροσωπευτικούς τύπους των υλικών αυτών. Όταν R=CH 3 PHB N: μικρού μοριακού βάρους PHB MW ~12000 Da N: υψηλού μοριακού βάρους PHB MW: Da N> υπερυψηλού μοριακού βάρους PHB MW> Da Σχήμα 2.1. Γενική χημική δομή των μονομερικών ομάδων PHAs (Chen, 2009). Το ΡΗΒ είναι ο πρώτος τύπος PHA που αναγνωρίστηκε και το πλέον κοινό που είναι παρόν σε πολλούς μικροοργανισμούς στη φύση. Αναλόγως του μοριακού του βάρους διακρίνεται σε τρεις κατηγορίες: μικρού, μεγάλου και υπερυψηλού μοριακού βάρους. Το μικρού μοριακού βάρους ΡΗΒ (cphb) είναι ένα ευρέως διαδεδομένο σύμπλοκο που εμφανίζεται σε βακτήρια, αρχαία και ευκαρυώτες ενώ πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν την παρουσία τους στον ανθρώπινο οργανισμό (Reusch, 1992). Ανάλογα με τους δεσμούς που σχηματίζουν με άλλα μακρομόρια προκύπτουν τόσο διαλυτά όσο και αδιάλυτα σε χλωροφόρμιο cphb (Huang & 32

67 Reusch, 1996). Τα cphb που αναπτύσσουν ασθενή σύμπλοκα πολυφωσφορικών αλάτων είναι διαλυτά ενώ τα cphb τα αδιάλυτα σε χλωροφόρμιο σχηματίζουν ισχυρούς ομοιοπολικούς δεσμούς με πρωτεΐνες. Τα σύμπλοκα αυτά φαίνεται πως λειτουργούν ως κανάλια μεταφοράς ιόντων (Ca 2+ ) διαμήκους της κυτταρικής μεμβράνης καθώς και να διευκολύνουν την λήψη εξωκυττάριου DNA (Huang & Reusch, 1995; Reusch, 2000). Πίνακας 2.1. Αντιπροσωπευτικοί τύποι ΡΗΑ-ομοπολυμερών (Lee, 1996). Χ Ομάδα R Πολυεστέρας Συντομογραφία 1 H πολυ (3-υδροξυπροπιονικός) P(3HP) CH 3 πολυ (3-υδροξυβουτυρικός) P(3HB) C 2 H 5 πολυ (3-υδροξυβαλερικός) P(3HV) C 3 H 7 πολυ (3-υδροξυεξανοϊκός) P(3HHx) C 4 H 9 πολυ (3-υδροξυεπτανοϊκός) P(3HHp) C 5 H 11 πολυ (3-υδροξυοκτανοϊκός) P(3HO) C 6 H 13 πολυ (3-υδροξυεννεανικός) P(3HN) C 7 H 15 πολυ (3-υδροξυδεκανοϊκος) P(3HD) C 8 H 17 πολυ (3-υδροξυεντεκανοϊκος) P(3HUD) C 9 H 19 πολυ (3-υδροξυδωδεκανοϊκός) P(3HDD) 2 Η πολυ (4-υδροξυβουτυρικός) P(4HB) CH 3 πολυ (4-υδροξυβαλερικός) P(4HV) 3 Η πολυ (5-υδροξυβαλερικός) P(5HV) CH 3 πολυ (5-υδροξυεξανοϊκός) P(5HHx) 4 C 6 H 13 πολυ (6-υδροξυδωδεκανοϊκός) P(6HDD) Το υψηλού μοριακού βάρους ΡΗΒ συντίθενται από μικροοργανισμούς οι οποίοι απαντώνται στην φύση και το μοριακό τους βάρος εξαρτάται από τον μικροοργανισμό και τις συνθήκες ζύμωσης (Kusaka et al., 1997). Το υπερυψηλού μοριακού βάρους ΡΗΒ παράγεται από το ανασυνδυασμένο βακτήριο Escherichia coli ενώ καλλιεργείται σε συγκεκριμένες 33

68 συνθήκες. Σε αντίθεση με τα υψηλού μοριακού βάρους ΡΗΒ παρουσιάζουν βελτιωμένες ιδιότητες ενώ έχει βρεθεί πως αποσυντίθενται πλήρως σε υδατικό περιβάλλον θερμοκρασίας 25 o C μέσα σε τρεις εβδομάδες (Kusaka et al., 1999). Σχήμα 2.2. Χημική δομή PHA-συμπολυμερών (Keshavarz & Roy, 2010). Πίνακας 2.2. Αντιπροσωπευτικοί τύποι ΡΗΑ-συμπολυμερών (Poirier et al., 1995). X Ομάδα R1 Χ Ομάδα R2 Συμπολυμερές 1 CH 3 1 H P(3HP-co-3HB) 1 CH 3 1 C 2 H 5 P(3HB-co-3HV) 1 CH 3 2 H P(3HB-co-4HB) 1 CH 3 1 C 3 H 7 P(3HB-co-3HHx) 1 C 3 H 7 1 C 5 H 11 P(3HHx-co-3HO) 1 C 3 H 7 1 C 7 H 15 P(HHx-co-HD) 1 C 5 H 11 1 C 7 H 15 P(3HO-co-3HD) 1 C 7 H 15 1 C 9 H 19 P(3HD-co-3HDD) Η πλευρική ομάδα R μπορεί να ποικίλει από H, C1 - C13 ενώ το n = 1 4. Τα ΡΗΑ ομοπολυμερή ή συμπολυμερή που παράγονται εξαρτώνται από το υπόστρωμα ή τον συνδυασμό υποστρωμάτων άνθρακα που χρησιμοποιούνται από τον μικροοργανισμό ως πρόδρομες ουσίες για την ΡΗΑ βιοσύνθεση, το μεταβολικό μονοπάτι που ακολουθεί ο μικροοργανισμός καθώς τις συνθήκες καλλιέργειας του. Οι καρβοξυλικές ομάδες που καταλαμβάνουν την θέση R, R1, R2 στα ΡΗΑ μονομερή έχουν στερεοχημική R-διαμόρφωση 34

69 γεγονός που είναι σημαντικό όσον αφορά τις ιδιότητες της βιοδιάσπασης και της βιοσυμβατότητας (Zinn & Hany, 2005). Από έρευνες που έχουν γίνει μέχρι σήμερα περισσότερες από 150 ομάδες μονομερών έχουν αναγνωριστεί να ανήκουν στην οικογένεια των PHAs στα οποία συμπεριλαμβάνονται γραμμικά, διακλαδωμένα, κορεσμένα, ακόρεστα και αρωματικά μονομερή. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζεται σχετικά με τις λειτουργικές ομάδες που βρίσκονται στην πλευρική αλυσίδα και επιτρέπουν την περαιτέρω χημική τροποποίηση των πολυμερών όπως είναι για παράδειγμα τα αλογόνα, οι καρβοξυλικές και υδροξυλικές ομάδες καθώς και φαινύλια ή κυάνιο (Kessler & Witholt, 2001; Kim & Lenz, 2001). Το μήκος της πλευρικής αλυσίδας και οι λειτουργικές της ομάδες επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό τις φυσικές ιδιότητες των πολυμερών όπως την θερμοκρασία τήξης, την θερμοκρασία υαλώδους μετάβασης και την κρυσταλλικότητά τους. Η ποικιλία των διαφορετικών μονομερών είναι αυτή που καθιστά τα ΡΗΑ πολυμερή ιδανικά ως υλικά με μεγάλο εύρος εφαρμογών. Σχήμα 2.3. Τα συνηθέστερα ΡΗΑ-μονομερή (Zhang at al., 2009). 35

70 2.4. Ιδιότητες των PHAs Τα PHAs είναι μερικώς κρυσταλλικά πολυμερή με βαθμό κρυσταλλικότητας που κυμαίνεται από 60 έως 80%. Μέσα στο βακτηριακό κύτταρο υπάρχουν σαν άμορφα και υδατοδιαλυτά εγκλείσματα και κατά την διάσπαση των κυττάρων, όταν τα πολυμερή αποσπούνται, πραγματοποιείται γρήγορη κρυστάλλωση. Τα είδη των PHAs παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία μηχανικών ιδιοτήτων από σκληρά κρυσταλλικά έως ελαστικά. Αυτό εξαρτάται από την σύσταση των ομάδων των μονομερών. Τα scl-phas χαρακτηρίζονται ως θερμοπλαστικά υλικά ενώ τα mcl-phas είναι ημικρυσταλλικά ελαστομερή με χαμηλό σημείο τήξης, χαμηλή αντοχή σε εφελκυσμό, μεγάλη ολκιμότητα και μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν βιοαποικοδομήσιμα ελαστικά ύστερα από κατάλληλη μορφοποίηση. Επίσης όλα τα PHAs εμφανίζουν ιδιότητες όπως αντίσταση στην υγρασία καθώς επίσης χαρακτηρίζονται ως πιεζοηλεκτρικά, μη-τοξικά, βιοσυμβατά, οπτικά ενεργά, ισοτακτικά υλικά. Το PHB έχει μελετηθεί ευρέως. Το μοριακό του βάρος έχει τιμές από 1 x 10 4 έως 3 x 10 6 με πολυδιασπορά περίπου 2, η θερμοκρασία υαλώδους μετάβασης όπως έχει μετρηθεί μέσω θερμιδομετρικής ανάλυσης, είναι 180 ο C, η θερμοκρασία τήξης 4 ο C ενώ οι πυκνότητες κρυσταλλικού και άμορφου PHB είναι 1,26 και 1,18 g/cm 3 αντίστοιχα (Doi, 1990). Το PHB έχει μηχανικές ιδιότητες παρόμοιες με αυτές το ισοτακτικού πολυπροπυλενίου όπως το μέτρο του Υoung (3.5 GPa) και η αντοχή σε εφελκυσμό (43 MPa). Η πιο αξιοσημείωτη διαφορά ανάμεσα στα δύο υλικά αφορά την επιμήκυνση μέχρι την θραύση η οποία για το PHB είναι 5% ενώ για το PP 400%. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα το ΡΗΒ να χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερη ακαμψία και ψαθυρότητα συγκριτικά με το πολυπροπυλένιο. Αρκετές έρευνες έχουν πραγματοποιηθεί όσον αφορά την κατανόηση των λόγων στους οποίους οφείλεται η ψαθυρή φύση του PHB και τη βελτίωση των φυσικών του ιδιοτήτων. Έχει παρατηρηθεί ότι η ψαθυρότητα των PHB παρουσιάζεται κατά την διάρκεια της αποθήκευσής τους, έπειτα από την αρχική του κρυστάλλωση μετά από την τήξη. Η δεύτερη αυτή κρυστάλλωση έχει σαν αποτέλεσμα την αναδιοργάνωση των κρυστάλλων που δημιουργήθηκαν κατά το στάδιο της πρώτης κρυστάλλωσης και έτσι περιορίζεται το ποσοστό του άμορφου υλικού ανάμεσα στους κρυστάλλους. Αυτό μπορεί να προληφθεί και το PHB 36

71 μπορεί να σκληρυνθεί χρησιμοποιώντας μία απλή τεχνική αναδιάταξης ύστερα από την αρχική κρυστάλλωση. Δύο είναι τα μειονεκτήματα που εμποδίζουν την εμπορική χρήση του P(3HB). Το P(3HB) αποσυντίθεται στους 200 o C, θερμοκρασία που βρίσκεται κοντά στο σημείο τήξης, και γίνεται εύθραυστο έπειτα από μία περίοδο μερικών ημερών όταν αποθηκεύεται κάτω από συνθήκες περιβάλλοντος. Οι φυσικές και θερμικές ιδιότητες των ΡΗΑ συμπολυμερών μπορούν να ρυθμιστούν μεταβάλοντας την μοριακή τους δομή και την σύνθεση του συμπολυμερούς. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως το Ρ(3ΗΒ) είναι ένα σχετικά άκαμπτο και ψαθυρό υλικό. Όταν ομάδες άλλων HAs εισαχθούν στο ΡΗΒ σχηματίζοντας συμπολυμερή βελτιώνονται οι μηχανικές του ιδιότητες (Holmes, 1988). Ο συνδυασμός και το ποσοστό των ΡΗΑ μονομερών στα συμπολυμερή επηρεάζουν τις φυσικές ιδιότητες των πολυμερών όπως το ποσοστό κρυσταλλικότητας και τις θερμοκρασίες τήξης και υαλώδους μετάβασης καθώς και τις μηχανικές τους ιδιότητες. Στα σχήμα 2.4 μπορούμε να παρατηρήσουμε την επίδραση των διαφόρων τύπων 3ΗΑs μονομερών στο ποσοστό κρυσταλλικότητας και τις θερμοκρασίες τήξης και υαλώδους μετάβασης (Sudesh & Abe, 2010). Οι δομές και οι ιδιότητες των συμπολυμερών με διάφορα ποσοστά 3ΗΒ και 3ΗV έχουν ερευνηθεί εκτενώς. Τα P(3HB-co-3HV) παρουσιάζουν κατά προσέγγιση ίδιους βαθμούς κρυσταλλικότητας με τα ομοπολυμερή τους (50-70%). Το συμπολυμερές όμως γίνεται πιο σκληρό και πιο εύκαμπτο όταν το ποσοστό του 3HV αυξάνεται και επίσης αυξάνεται η ολκιμότητα του. Επιπρόσθετα, η μείωση του σημείου τήξης με αύξηση του ποσοστού του 3HV, χωρίς να επηρεάζει την θερμοκρασία υποβάθμισής του, επιτρέπει την θερμική επεξεργασία του συμπολυμερούς χωρίς να γίνεται θερμική υποβάθμιση. Στο συμπολυμερές P(3HB-co-3HHx) όταν το ποσοστό του κλάσματος του 3HHx αυξηθεί από 0 σε 25% η θερμοκρασία τήξης μειώνεται από 177 στους 52 o C, η θερμοκρασία τήξης μειώνεται από 4 σε -4 o C καθώς και η αντοχή σε εφελκυσμό από 43 σε 20 MPa. Αντιθέτως η επιμήκυνση μέχρι το σημείο θραύσης αυξάνεται από 5% σε 850%. Συνεπώς τα υλικά αυτά 37

72 γίνονται πιο μαλακά και εύκαμπτα όταν στο συμπολυμερές αυξάνεται το κλάσμα (R)-3HHx (Doi et al., 1995). Tm ( o C) Tg ( o C) Κρυσταλλικότητα % (α) % mol 3HAs (β) (γ) % mol 3HAs % mol 3HAs Σχήμα 2.4. Οι σχέσεις μεταξύ (α) κρυσταλλικότητας, (β) θερμοκρασίας τήξης και (γ) θερμοκρασίας υαλώδους μετάβασης με το ποσοστό της δεύτερης μονομερικής ομάδας για τυχαία συμπολυμερή R- (3HB) με διάφορες ομάδες HAs. Συγκεκριμένα για τα συμπολυμερή ( ) Ρ(3HB-co-3HV), ( ) P(3HB-co- 3HHx), ( ) P(3HB-co-3 mcl-pha), ( ) P(3HB-co-3HP), ( ) P(3HB-co-4HB) (Sudesh & Abe, 2010). 38

73 Παρομοίως στο συμπολυμερές P(3HB-co-4ΗΒ) το σημείο τήξης μειώνεται από 178 σε 130 o C. Η θερμοκρασία υαλώδους μετάβασης μειώνεται από 4 σε -48 o C όταν το κλάσμα του 4ΗΒ στο συμπολυμερές αυξάνεται από 0 σε 100%. Η αντοχή σε εφελκυσμό μειώνεται από 43 σε 26 MPa και η % επιμήκυνση μέχρι την θραύση αυξάνεται από 4 σε 444% όταν το κλάσμα του 4ΗΒ αυξάνεται από 0 σε 16%. Έχει υπολογιστεί πως η αντοχή σε εφελκυσμό του ομοπολυμερούς Ρ(4ΗΒ) μπορεί να φτάσει το 1GPa άρα τα συμπολυμερή P(3HB-co-4ΗΒ) καλύπτουν ένα ευρύ πεδίο ιδιοτήτων (Saito & Doi, 1994; Saito et al., 1996; Sudesh et al., 2000). Τέλος, βρέθηκε πως το γενετικά ανασυνδυασμένο βακτήριο Pseudomonas sp είναι σε θέση να συνθέτει τυχαία συμπολυμερή που αποτελούνται από ομάδες ΡΗΒ και mcl-3phas που συνίστανται από 6-12 άτομα άνθρακα χρησιμοποιώντας γλυκόζη ως υπόστρωμα (Kato et al., 1996). Στο συμπολυμερές Ρ(3ΗΒ-co-3ΗΑ) το κλάσμα του 3ΗΒ είναι 94% ενώ περιείχε επίσης 3% 3HD και 3% 3HDD. Η αντοχή σε εφελκυσμό στην περίπτωση αυτή είναι 17 MPa ενώ η επιμήκυνση μέχρι την θραύση αυξήθηκε στο 680% με το ποσοστό των mcl-phas να είναι μόλις 6%. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει πως τα συμπολυμερή από ομάδες 3ΗΒ και mcl-phas επιτυγχάνουν την μεγαλύτερη βελτίωση όσον αφορά την ευθραυστότητα του Ρ(3ΗΒ). Επίσης οι μηχανικές ιδιότητες αυτού του πολυμερούς φαίνονται να είναι παρόμοιες με αυτές του χαμηλής πυκνότητας πολυαιθυλενίου (Kato et al, 1996; Matsusaki et al., 2000). Από τα παραπάνω μπορούμε να συμπεράνουμε πως τα συμπολυμερή των PHAs έχουν μεγάλο εύρος ιδιοτήτων ανάλογα με την χημική δομή των μονομερικών ομάδων που το αποτελούν καθώς και το ποσοστό αυτών. Οι ιδιότητες τους επίσης είναι δυνατό να τροποποιηθούν ανάλογα με τις τεχνικές μορφοποίησης τις οποίες θα υποστούν. Προς το παρόν το P(3HB-co-3HV) είναι το μόνο συμπολυμερές που παράγεται σε μεγάλες ποσότητες. Θα πρέπει να αναπτυχθούν τεχνικές οικονομικής παραγωγής και άλλων PHAs έτσι ώστε να γίνει άμεση εφαρμογή αυτών των βιοαποικοδομήσιμων εστέρων. Στον παρακάτω πίνακα συνοψίζονται οι κυριότερες φυσικές και μηχανικές ιδιότητες διάφορων PHAs. Για λόγους σύγκρισης παρατίθενται επίσης οι αντίστοιχες ιδιότητες κάποιων εκ των συμβατικών πλαστικών που χρησιμοποιούνται κατά κόρον. 39

74 Πίνακας 2.3. Οι κυριότερες ιδιότητες PHAs και συμβατικών πολυμερών (Sudesh et al., 2000). Πολυμερές Tm ( o C) Tg ( o C) Μέτρο του Young (GPa) Αντοχή σε εφελκυσμό (MPa) Επιμήκυνση μέχρι την θραύση % PHAs P(3HB) P(3HB-co-3% 3HV) P(3HB-co-9% 3HV) P(3HB-co-14% 3HV) P(3HB-co-20% 3HV) P(3HB-co-25% 3HV) P(3HB-co-71% 3HV) P(3HB-co-67% 3HP) P(3HB-co-10% 3HHx) P(3HB-co-17% 3HHx) P(3HB-co-6% HA) a P(4HB) P(3HB-co-3% 4HB) P(3HB-co-10% 4HB) P(3HB-co-16% 4HB) P(3HB-co-64% 4HB) P(3HB-co-90% 4HB) P(3HO-co-11% 3HHx ) Συμβατικά πλαστικά PP PS LDPE HDPE a 6% HA: 3% mol 3ΗΗx και 3% mol 3HO. 40

75 2.5. Αποδόμηση των PHAs Το PHAs έχουν κεντρίσει το ενδιαφέρον λόγω του ότι η παραγωγή τους πραγματοποιείται από ανανεώσιμους πόρους ενώ είναι επίσης φιλικά προς το περιβάλλον καθώς είναι πλήρως βιοαποικοδομήσιμα. Οι ομάδες των PHA μονομερών χαρακτηρίζονται από την R διαμόρφωση εξαιτίας της στερεοισομερικής ειδικότητας που εμφανίζουν οι τύποι των ενζύμων της ΡΗΑ πολυμεράσης. Το PHAs αποθηκεύεται από τα βακτήρια ως πηγή άνθρακα ούτως ώστε να χρησιμοποιηθούν σε περίπτωση που δεν είναι πλέον διαθέσιμη εξωκυτταρική πηγή άνθρακα. Υπάρχει ένας αποτελεσματικός και γρήγορος μηχανισμός μέσα στο κύτταρο που επιτρέπει την βιοαποδόμηση αυτού του υψηλού μοριακού βάρους πολυεστέρα σε απλές οργανικές ενώσεις (Lenz & Merchessault, 2005). Τα PHAs μπορούν γρήγορα να υδρολυθούν σε μονομερή μέσω ενδοκυτταρικών ή εξωκυτταρικών ενζύμων (αποπολυμεράσες) που εκκρίνονται από μια μεγάλη ποικιλία βακτηρίων και μυκήτων. Πολλοί διαφορετικοί τύποι ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών ΡΗΑ αποπολυμεράσης έχουν απομονωθεί τώρα και έχουν χαρακτηριστεί μέχρι σήμερα καθώς επίσης έχουν μελετηθεί και οι βιοχημικές ιδιότητες των ενζύμων αυτών (Jendrossek et al., 1996; Jendrossek & Handrick, 2002). Η διαφοροποίηση μεταξύ της εξωκυτταρικής και ενδοκυτταρικής αποδόμησης είναι απαραίτητη διότι τα PHAs εντός και εκτός ενός έμβιου οργανισμού παρουσιάζουν διαφορετικές βιοφυσικές καταστάσεις (Σχήμα 2.5.). Μέσα στο κύτταρο τα PHAs απαντώνται σε άμορφη κατάσταση (ιδιαίτερα κινητές αλυσίδες σε ατακτική διαμόρφωση) και καλύπτονται από πρωτεΐνες και μια επιφάνεια φωσφολιπιδίων. Κατά την απόσπαση τους από τα κύτταρα, οι πολυμερικές τους αλυσίδες τείνουν να υιοθετήσουν μια τακτική ελικοειδή δομή και τα πολυμερή αυτά γίνονται κρυσταλλικά (μετουσίωση των PHA). Εφόσον το PHA είναι ένα συμπαγές πολυμερές με μεγάλο μοριακό βάρος δεν μπορεί να μεταφερθεί μέσω των κυτταρικών τοιχωμάτων. Αρκετοί μικροοργανισμοί εκκρίνουν εξωκυτταρικά PHA-αποπολυμεράσες που υδρολύουν τα PHAs σε υδατικό διάλυμα μονομερών (Jendrossek, 1998). Συγκεκριμένα το ΡΗΒ υδρολύεται σε R-υδροξυβουτυρικό εστέρα ενώ το PHBV σε 3-υδροξυβουτυρικό και 3-υδροξυβαλερικό εστέρα. Τα μονομερή αυτά είναι ικανά να διαχυθούν παθητικά διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης και στη συνέχεια μεταβολίζονται μέσω της β-οξείδωσης και του κύκλου των τρικαρβοξυλικών οξέων. Όταν η αποδόμηση 41

76 πραγματοποιηθεί σε αερόβιες συνθήκες παράγεται διοξείδιο του άνθρακα και νερό (Scott, 1999) ενώ σε αναερόβιες συνθήκες παράγεται και μεθάνιο (Luzier, 1992). Σε γενικές γραμμές κατά την διάρκεια της αποδόμησης δεν παράγονται επιβλαβή για την δημόσια υγεία ενδιάμεσα ή υποπροϊόντα. Μάλιστα ο 3-υδροξυβουτυρικός εστέρας εμφανίζεται σε πολλά ζώα στο πλάσμα του αίματος (Lee, 1996) και για τον λόγο αυτό χρησιμοποιείται σε βιοιατρικές εφαρμογές. Σχήμα 2.5. Φυσικές καταστάσεις των PHAs (Jendrossek, 2001). Τα εξωκυτταρικά αυτά ένζυμα αποπολυμεράσης φαίνεται πώς αποτελούνται από ένα πεπτίδιο με μοριακό βάρος 37,000-60,000 (Saito et al., 1989; Jendrossek et al., 1993; Shinomiya et al., 1997, Jendrossek et al., 2001; 2002;). Η ανάλυση των δομικών γονιδίων τους 42

77 δείχνει ότι χαρακτηρίζονται από ένα αμινοτελικό άκρο (N-terminal domain), που αντιπροσωπεύει την καταλυτική περιοχή, από ένα καρβοξυτελικό άκρο (C-terminal domain), που λειτουργεί ως περιοχή δέσμευσης, και μια συνδετική περιοχή που συνδέει αυτές τις δύο. Η παρουσία και της καταλυτικής περιοχής και της περιοχής δέσμευσης έχει βρεθεί σε πολλά ένζυμα αποπολυμερισμού όπως οι κυτταρινάσες (Gilkes et al., 1991), οι ξυλανάσες (Kellet et al., 1990) και οι χιτινάσες (Watanabe et al., 1990), που υδρολύουν τους αδιάλυτους σε υδατικά διαλύματα πολυσακχαρίτες. Μια πρόσφατη μελέτη για την ενζυμική υδρόλυση των 3HB ολιγομερών από την PHB αποπολυμεράση κατέδειξε ότι η καταλυτική περιοχή του ενζύμου αναγνωρίζει τις τέσσερις διαδοχικά μονομερικές μονάδες ως υπόστρωμα για την υδρόλυση των δεσμών εστέρα σε μια πολυμερική αλυσίδα (Bachmann & Seebach, 1999). Ο ρυθμός της ενζυμικής υποβάθμισης του Ρ(3HB) από την PHB-αποπολυμεράση εξαρτάται έντονα από τη συγκέντρωση του ενζύμου. Παρουσιάζει ένα μέγιστο συναρτήσει της συγκέντρωσης του ενζύμου ενώ έπειτα χαρακτηρίζεται από μία βαθμιαία μείωση. Εικόνα 2.2. Βιοαποδόμηση των PHAs α) Ανάπτυξη μικροοργανισμού σε άγαρ χρησιμοποιώντας ΡΗΒ ως πηγή άνθρακα και ενέργειας αφού πρώτα το υδρολύσει σε ολιγομερή με την βοήθεια του ενζύμου ΡΗΒ-αποπολυμεράση (Jendrossek, 2001), β) αποδόμηση φιαλών Biopol έπειτα από 0, 2, 4, 6, 8 και 10 εβδομάδες από την παραμονή τους σε αερόβια λάσπη λυμάτων (Madison & Huisman, 1999). 43

78 Συγκεκριμένα έχουν ερευνηθεί οι ιδιότητες της εξωκυτταρικής PHB-αποπολυμεράσης του βακτηρίου Alcaligenes faecalis. Η ενζυμική υδρόλυση του PHB από την ΡΗΒ-αποπολυμεράση παράγει ένα 3ΗΒ διμερές σαν κύριο προϊόν και μικρές ποσότητες 3ΗΒ μονομερούς. Κατά την υδρόλυση παρατηρήθηκε πως το ένζυμο διαχωρίζει κυρίως τον δεύτερο και τον τρίτο εστερικό δεσμό από το υδροξυλικό άκρο (Liebergesell et al., 1993). Επίσης βρέθηκε ότι τα συμπολυμερή που αποτελούνται από 4ΗΒ μονομερή αποικοδομούνται πιο γρήγορα από το PHB ή το συμπολυμερές P(3HB-co-3HV). Το πολυμερές PHB είναι αδιάλυτο στο νερό, ενώ οι PHA-αποπολυμεράσες είναι διαλυτές οπότε η ενζυμική αποδόμηση είναι μία ετερογενής αντίδραση. Η αντίδραση αυτή πραγματοποιείται σε δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο η περιοχή πρόσδεσης του ενζύμου προσροφάται πάνω στην επιφάνεια του PHB υλικού και ονομάζεται απορρόφηση ενώ στο δεύτερο στάδιο που είναι η υδρόλυση υδρολύονται οι πολυμερικές αλυσίδες από το ενεργό μέρος του ενζύμου (καταλυτική περιοχή). Η ισόθερμη προσρόφησης της PHΒαποπολυμεράσης πάνω στην επιφάνεια του PHB εκφράζεται από την εξίσωση της ισόθερμης Langmuir (Lenz et al., 1992). Το στάδιο της υδρόλυσης λαμβάνει χώρα στην επιφάνεια του υλικού από την αντίδραση μεταξύ των προσροφημένων ενζύμων και των ελεύθερων θέσεων προσρόφησης στην επιφάνεια (Liebergesell et al., 1993). Έπειτα από μελέτες ερευνητές κατέληξαν στο συμπέρασμα πως σε μικρές συγκεντρώσεις ΡΗΒ-αποπολυμεράσης η πλειονότητα των καταλυτικών περιοχών των προσροφημένων ενζύμων υδρολύουν τις ΡΗΒ πολυμερικές αλυσίδες που βρίσκονται στην επιφάνεια του υλικού. Όταν η συγκέντρωση του ενζύμου είναι υψηλή ξεπερνώντας μία κρίσιμη τιμή οι καταλυτικές περιοχές του ενζύμου δεν είναι δυνατό να εισχωρήσουν στις ΡΗΒ πολυμερικές αλυσίδες της επιφάνειας λόγω συνωστισμού των περιοχών αυτών στην επιφάνεια. Παρόλο που οι ΡΗΑ-αποπολυμεράσες είναι ικανές να καταστρέφουν τους ΡΗΑ εστερικούς δεσμούς διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τις βιοχημικές τους ιδιότητες και την ικανότητα τους να προσδένονται στο πολυμερές (Volova, 2004). Οι πιο σημαντικοί παράγοντες που επηρεάζουν την ικανότητα βιοαποδόμησης των ΡΗΑ πολυμερών είναι οι εξής: 44

79 1. Η στερεοκανονικότητα του πολυμερούς. Μόνο τα μονομερή τα οποία περιέχουν εστερικούς δεσμούς (R)-διαμόρφωσης μπορούν να υδρολυθούν από τις ΡΗΑαποπολυμεράσες. 2. Η κρυσταλλικότητα του πολυμερούς. Η αποδόμηση ενός πολυεστέρα μειώνεται όταν το ποσοστό της κρυσταλλικής του περιοχής έναντι της άμορφης αυξάνεται. 3. Το μοριακό βάρος του πολυμερούς. Τα πολυμερή με μικρότερα μοριακά βάρη αποδομούνται πιο γρήγορα από αυτά με υψηλοτέρα μοριακά βάρη. 4. Η σύσταση των ΡHAs. (Kanewasa et al., 1994; Jendrossek et al., 1996; Abe & Doi, 1999). Σχήμα 2.6. Ενζυμική υδρόλυση του μονοκρυστάλλου ΡΗΒ από το ένζυμο ΡΗΒ αποπολυμεράση (Sudesh et al., 2000). Πολλοί φυσικοί μικροοργανισμοί έχουν την ικανότητα να εκκρίνουν ΡΗΑαποπολυμεράσες και να υδρολύουν στερεά ΡΗΒ υλικά. Αυτοί έχουν απομονωθεί από διάφορα περιβάλλοντα όπως το έδαφος (Delafield et al., 1965, Mergaert et al., 1993; Mukai et al., 1993), το θαλασσινό (Mukai et al., 1993; Kita et al., 1995; Mergaert et al., 1995) και το λιμναίο νερό (Mukai et al., 1994), οι θερμές πηγές (Takeda et al., 1998) και η λάσπη (Tanio et al., 1982). 45

80 Κάποιοι από αυτούς φαίνονται στον πίνακα 2.4 (The PHA Depolymerase Engineering Database, Πίνακας 2.4. Μικροοργανισμοί ικανοί να αποδομούν ΡΗΑs (Khanna & Shivastava, 2005). Τύπος ΡΗΑ υλικού Μικροοργανισμός Φυσικό περιβάλλον μικροοργανισμού scl-phas Pseudomonas lemoignei Έδαφος scl-phas Pseudomonas stutzeri Λιμναίο νερό scl-phas Pseudomonas picketti Έδαφος mcl-phas Pseudomonas fluorescens GK13 Δραστική λάσπη scl-phas Alcaligenes faecalis T1 Δραστική λάσπη scl-phas Alcaligenes faecalis AE122 Θαλασσινό νερό scl-phas Schlegelella thermodepolymerans Θερμή πηγή scl-phas Streptomyces sp. SNG9 Λιμναίο νερό scl/mcl-phas Streptomyces exfoliates K10 Έδαφος scl/mcl-phas Streptomyces hygroscopicus Έδαφος scl-phas Comamonas acidovorans Έδαφος scl-phas Comamonas testosterone Λιμναίο νερό scl-phas Delftia acidovorans Λύματα scl-phas Clostridium botulinum Λάσπη αναερόβιων λυμάτων scl-phas Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Λάσπη αναερόβιων λυμάτων scl-phas Caenibacterium thermophilum Λύματα scl-phas Leptothrix sp. Θερμή πηγή scl-phas Variovorax paradoxus Έδαφος Διάφορες δοκιμές και έλεγχοι έχουν πραγματοποιηθεί για να εκτιμηθεί η ικανότητα αποδόμησης των ΡΗΑ υλικών και αξιοποίησης των προϊόντων υποβάθμισης τους (OECD Test no. 301C). Για παράδειγμα σε υδατικά περιβάλλοντα παρακολουθούνται παράμετροι όπως η συγκέντρωση του βιοχημικά απαιτούμενου οξυγόνου (ΒΑΟ), η απώλεια μάζας (διάβρωση) του 46

81 δείγματος και ο διαλυτός οργανικός άνθρακας (DOC) μέσα στο διάλυμα για να επιβεβαιωθεί πως τα ΡΗΑ υλικά αποδομούνται πλήρως και πως τα ολιγομερή τους μεταβολίζονται από τους μικροοργανισμούς στο περιβάλλον αυτό Ο κύκλος ζωής των PHAs Πέραν της ικανότητας της βιολογικής διάσπασης που παρουσιάζουν τα PHAs εξίσου σημαντικό είναι και το γεγονός ότι η παραγωγή τους είναι βιολογική και βασίζεται σε ανανεώσιμους πόρους (Braunegg et al., 2004). Κατά την διαδικασία της ζυμωτικής παραγωγής των PHAs χρησιμοποιούνται πηγές άνθρακα και ενέργειας όπως σάκχαρα, λιπίδια και οργανικά οξέα τα οποία προκύπτουν από φυτική βιομάζα (Kadouri et al., 2005). Κατά συνέπεια η σύνθεση και βιοαποδόμηση των PHAs είναι πλήρως συμβατή με τον κύκλο του άνθρακα (σχήμα 2.7.). Για τον λόγο αυτό, παρόλο που σε μερικές εφαρμογές το χαρακτηριστικό της βιοδιάσπασης τους κρίνεται κρίσιμο, η παραγωγή των υλικών αυτών μελετάται εκτενώς εφόσον δεν βασίζεται στην αξιοποίηση πεπερασμένων πόρων όπως το πετρέλαιο (Gavrilescu & Chisti, 2005). Τα ΡΗΑ πολυμερή δεν επιβαρύνουν το περιβάλλον με επιπλέον εκπομπές αερίου διοξειδίου του άνθρακα καθώς το διοξείδιο του άνθρακα που προκύπτει κατά την αποδόμηση τους δεσμεύεται από την φυτική βιομάζα. Στην συνέχεια με την βοήθεια της ηλιακής ενέργειας πραγματοποιείται η φωτοσύνθεση για την ανάπτυξη της βιομάζας αυτής μέρος της οποίας μπορεί να αξιοποιηθεί ως ανανεώσιμη πηγή άνθρακα για την βακτηριακή ζύμωση και παραγωγή των PHAs. Συμπεραίνουμε λοιπόν πως ο κύκλος του άνθρακα για τα PHAs είναι μία αειφόρος διαδικασία. Μελέτες όμως που αφορούν τον κύκλο ζωής των PHAs δείχνουν πως η παραγωγή αυτών των βιοπολυμερών μάλλον δεν είναι πιο φιλική προς το περιβάλλον από αυτή των συμβατικών πλαστικών. Σύμφωνα με τις μελέτες αυτές θα χρειαζόταν περισσότερη ενέργεια κατά την διάρκεια του κύκλου ζωής των ΡΗΑ από τον κύκλο ζωής των συμβατικών πολυμερών. Ωστόσο, η διαδικασία παραγωγής των ΡΗΑ έχει ακόμα πολλά περιθώρια βελτιστοποίησης ενώ 47

82 παραγωγική διεργασία των πετροχημικών πλαστικών είναι ήδη πλήρως ανεπτυγμένη (Gross & Karla, 2002; Stevens, 2002; Kim & Dale, 2005). Σχήμα 2.7. Ο κύκλος ζωής των PHAs (Gross & Karla, 2002) Εφαρμογές των PHAs Οι περισσότερες εφαρμογές των PHAs αφορούν εκείνες στις οποίες μπορούν να αντικαταστήσουν τα συμβατικά πολυμερή. Τα ΡΗΑ παρουσιάζουν ποικιλία φυσικών ιδιοτήτων ενώ μέσω χημικών τροποποιήσεων τους ή ανάμιξης τους με άλλα υλικά μπορούν να προκύψουν υλικά με επιθυμητές ιδιότητες για συγκεκριμένες εφαρμογές. Κάποιες από τις εφαρμογές των PHAs οι οποίες συζητούνται παρακάτω περιλαμβάνουν τη χρήση τους στον 48

83 τομέα της συσκευασίας και ως προϊόντα μίας χρήσεως, της βιοιατρικής, της γεωργίας καθώς και την αξιοποίηση τους ως βιοκαύσιμα. Εικόνα 2.3. Διάφορες εφαρμογές των PHAs (Chen, 2009). Συσκευασία και προϊόντα μίας χρήσεως Τα PHAs χρησιμοποιήθηκαν αρχικά για την κατασκευή καθημερινών αντικειμένων όπως οι συσκευασίες σαμπουάν και διαφόρων καλλυντικών από την Wella (Γερμανία) (Weiner, 1997). Με την πάροδο του χρόνου αναπτύχθηκαν εφαρμογές όπως η χρήση των PHAs σε τσάντες αγορών, εμπορευματοκιβώτια, προϊόντα μίας χρήσεως όπως ξυράφια, αντικείμενα εστίασης, πάνες, γυναικεία προϊόντα υγιεινής καθώς επίσης και ιατρικά χειρουργικά ενδύματα, ταπετσαρίες και τάπητες από εταιρίες όπως η Procter & Gamble,η Biomer, η Metabolix (Clarinval & Halleux 2005; Mikova & Chodak 2006). Επειδή τα PHAs είναι αδιαπέρατα σε αέρια 49

84 μπορούν να χρησιμοποιηθούν στις συσκευασίες τροφίμων χωρίς να απαιτείται η προσθήκη αντιοξειδωτικών σε αυτά. Βιοϊατρικές εφαρμογές Μόνο μερικοί τύποι PHA, συμπεριλαμβανομένων του PHB, PHBV, P4HB, PHBHHx και του PHO είναι διαθέσιμοι σε επαρκείς ποσότητες για να πραγματοποιηθεί έρευνα ως προς τις εφαρμογές τους στον τομέα της βιοϊατρικής (Byrom 1992; Hrabak 1992; Chen et al. 2001). Για τον λόγο αυτό το μεγαλύτερο μέρος των ερευνών βασίζονται στα προαναφερθέντα PHAs. Είναι ιδιαίτερα σημαντικό το γεγονός ότι το προϊόν υποβάθμισης του P(3HB), το D( )-3- υδροξυβουτυρικό οξύ, είναι ένα συνηθισμένο προϊόν μεταβολισμού που απαντάται στους ανώτερους ζωικούς οργανισμούς. Επίσης ένα χαμηλού μοριακού βάρους P(3HB), που αποτελείται από μονομερικές μονάδες, συναντάται σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς και φαίνεται να λειτουργεί ως συστατικό ενός ιοντικού διαύλου διαμήκους των κυτταρικών μεμβρανών. Επίσης έχει ανιχνευθεί, σε σχετικά μεγάλες ποσότητες, στο πλάσμα του ανθρώπινου αίματος (Reusch, 1992). Τα παραπάνω έχουν σαν αποτέλεσμα η εμφύτευση P(3HB) σε ιστούς ανώτερων οργανισμών να μην είναι τοξική. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 20 χρόνων, τα PHAs και τα σύνθετα τους έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη βιοδιασπώμενων εμφυτευμάτων. Τα εμφυτεύματα αυτά συμπεριλαμβάνουν χειρουργικά ράμματα, συσκευές επανόρθωσης μηνίσκου, χόνδρου και τενόντων, εξαρτηματα όπως καρφιά, βίδες, συνδετήρες, πλάκες οστών που χρησιμοποιούνται στην ανάπλαση οστών, χειρουργικά πλέγματα, επιδέσμους, καρδιαγγειακά καλύμματα (Dai et al., 2009), δίαυλους διάνοιξης αρτηριών (stents), υποκατάστατα δέρματος, ικριώματα μυελού των οστών, μοσχεύματα οφθαλμικών κυττάρων και αιμοστατικά (Chen & Wu, 2005a). Οι μεταβαλλόμενες συνθέσεις και συστάσεις των PHAs επιτρέπουν την διαλογή υλικών με τις επιθυμητές μηχανικές ιδιότητες και χρόνους υποβάθμισης μέσα στα επιθυμητά χρονικά πλαίσια κάτω από συγκεκριμένες φυσιολογικές συνθήκες (Abe et al., 1995). Ομοπολυμερή και συμπολυμερή λακτικού και γλυκολικού οξέως χρησιμοποιούνται ευρέως σαν εμπορικά διαθέσιμα προϊόντα για την απελευθέρωση και παράδοση φαρμάκων. Ωστόσο τα υλικά αυτά υποβιβάζονται γρήγορα και ως εκ τούτου, η απελευθέρωση φαρμάκων δεν μπορεί να είναι πλήρως ελεγχόμενη (Pouton & Akhtar, 1996). Στις αρχές της δεκαετίας του 50

85 1990, τα PHAs μελετήθηκαν ως προς την χρήση τους σαν φορείς απελευθέρωσης φαρμακευτικών ουσιών εξαιτίας των ιδιοτήτων της βιοδιασπασιμότητάς και βιοσυμβατότητας τους καθώς και λόγω της υποβάθμισής τους μέσω διάβρωσης της επιφάνειας τους Ερευνήθηκε λοιπόν η δυνατότητα παραγωγής μητρών PHBV μέσω συμπίεσης και αποδείχτηκε ότι είναι μια απλούστερη διαδικασία έναντι εναλλακτικών τεχνολογιών απελευθέρωσης ουσιών (Gould et al., 1987). Επίσης βρέθηκε πως η αύξηση του μοριακού βάρους του πολυμερούς προκαλεί αύξηση του ρυθμού απελευθέρωσης ουσιών από ακανόνιστα διαμορφωμένα μικροσωματίδια PHB (Brophy & Deasy, 1986). Όταν συγκρίθηκε τεχνητά (in vitro) και εντός έμβιου οργανισμού (in vivo) η απελευθέρωση αντικαρκινικού παράγοντα χρησιμοποιώντας μικρόσφαιρες PHB και PLA ως φορείς διαπιστώθηκε ότι η ουσία απελευθερώθηκε γρηγορότερα από τις μικρόσφαιρες PHB (Bissery et al., 1985). Τέλος, η ενσωμάτωση αιθυλικών ή βουτυλικών εστέρων λιπαρών οξέων στις μικρόσφαιρες PHB βρέθηκε πως αυξάνει τον ρυθμό απελευθέρωσης φαρμάκων (Kubota et al., 1988). Γεωργικές εφαρμογές Τα PHAs έχουν χρησιμοποιηθεί ως προστατευτικά καλύμματα καθώς και ως μήτρες για την ελεγχόμενη απελευθέρωση φυτοφαρμάκων. Τα φυτοφάρμακα εμβαπτίζονται στις πολυμερικές μήτρες και φυτεύονται μαζί με τους σπόρους. Το φυτοφάρμακο απελευθερώνεται με ρυθμό ο οποίος σχετίζεται άμεσα με τον πληθυσμό των βακτηρίων που βρίσκονται στο έδαφος καθώς αυτά είναι υπεύθυνα για την αποδόμηση της πολυμερικής μήτρας. Τα PHAs ως βιοκαύσιμα Πρόσφατα, έρευνες έδειξαν (Zhang et al., 2009) ότι ο 3-υδροξυβουτυρικός μεθυλεστέρας (3HBME) και οι mcl 3-υδροξυαλκανοϊκοί μεθυλεστέρες (3HAME) που λαμβάνονται από την εστεροποίηση του PHB και των mcl-pha αντίστοιχα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοκαύσιμα. Διερευνήθηκαν οι θερμότητες καύσης του 3HBME, των 3HAME, της αιθανόλης, της ισοπροπανόλης, της ισοβουτανόλης, 0 # ντίζελ, 90 # βενζίνη, και μιγμάτων καυσίμων με βάση το 3HBMΕ και τα 3HAME. Διαπιστώθηκε ότι το 3HBME και 3HAME είχαν θερμότητες καύσης 20 και 30 kj g 1, αντίστοιχα, συγκριτικά με τις θερμότητες καύσης 27 kj g 1 της 51

86 αιθανόλης. Η προσθήκη 10% 3HBME ή 3HAME αύξησε τη θερμότητα καύσης της αιθανόλης σε 30 και 35 kj g 1, αντίστοιχα. Η προσθήκη 3HBME ή 3HAME στην ν-προπανόλη και την ν- βουτανόλη οδήγησε σε μια μικρή μείωση των θερμοτήτων καύσης τους. Οι θερμότητες καύσης των μιγμάτων καυσίμων 3HBME/ντίζελ ή 3HBME/βενζίνης και 3HAME/ντίζελ ή 3HAME/βενζίνης ήταν χαμηλότερες από αυτές του καθαρού ντίζελ ή της καθαρής βενζίνης. Υπολογίζεται πως το κατά προσέγγιση κόστος παραγωγής βιοκαυσίμων με βάση τα PHAs ανέρχεται γύρω στα $1,200/τόνο. Άλλες εφαρμογές Τα PHAs μπορούν να βρουν και διάφορες άλλες εφαρμογές. Χρησιμοποιούνται ως συμπληρώματα διατροφής, ως συγκολλητικές ουσίες οι οποίες είναι ευαίσθητες στην θερμοκρασία, ως γόμες καθώς επίσης και για να προσφέρουν ευρωστία σε μικροοργανισμούς που χρησιμοποιούνται στην βιομηχανία (Chen, 2010) Βιομηχανική παραγωγή των PHAs Παρά το γεγονός πως έχουν βρεθεί αρκετοί τύποι πολυυδροξυαλκανοϊκών εστέρων μόνο τέσσερις εξ αυτών παράγονται σε μεγάλη κλίμακα και είναι εμπορικά διαθέσιμοι. Αυτοί είναι το ομοπολυμερές PHB και τα συμπολυμερή P(3HB-co-3HV), P(3HB-co-4HB), P(3HB-co-3HHx). Σε μικρότερες ποσότητες παράγονται επίσης mcl-phas. Γενικά η παραγωγή των PHAs περιλαμβάνει διάφορα στάδια όπως την ζύμωση, τον διαχωρισμό της βιομάζας από το θρεπτικό μέσο, την ξήρανση της βιομάζας, την απόσπαση του ΡΗΑ, την ξήρανση του ΡΗΑ και τη μορφοποίση ή συσκευασία του και πολλά από αυτά επιδέχονται βελτιστοποίησης. Σε παγκόσμιο επίπεδο περίπου 24 είναι οι εταιρείες που ασχολήθηκαν με την έρευνα και την παραγωγή των ΡΗΑs ενώ κάποιες από αυτές σταμάτησαν την δραστηριότητα τους την δεκαετία του 1990 λόγω της μειωμένης τιμής του πετρελαίου. Μετά την αύξηση της τιμής του πετρελαίου στα $100/βαρέλι το 2003 και σε συνδυασμό με το γεγονός πως το πετρέλαιο είναι ένας πεπερασμένος πόρος επανήλθε το ενδιαφέρον για την παραγωγή των PHAs. Η παραγωγή και εφαρμογή των PHAs σχετίζεται με την πράσινη χημεία, την μείωση των εκπομπών CO 2, 52

87 την προστασία του περιβάλλοντος και την αειφόρο ανάπτυξη. Αυτός είναι και ο λόγος που εξηγεί το γιατί οι βιομηχανίες συνεχίζουν να παράγουν αυτά τα υλικά παρόλο που δεν είναι ακόμα ανταγωνιστικά ως προς την τιμή τους συγκριτικά με τα πετροχημικά πλαστικά. Η εταιρεία Metabolix είναι αυτή που δραστηριοποιείται στον τομέα των PHAs για το μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Η συγκεκριμένη εταιρεία έχει λάβει πληθώρα βραβείων από διάφορους οργανισμούς για την προσπάθεια που καταβάλει για την προστασία του περιβάλλοντος και έχει περισσότερες από 500 πατέντες και εφαρμογές παγκοσμίως. Παρακάτω μπορούμε να δούμε ποιες εταιρίες σχετίζονται με την έρευνα και την παραγωγή των PHAs καθώς και του τύπο PHA που εμπορεύονται. Ανάμεσα στα προϊόντα που εμπορεύεται η εταιρεία Metabolix είναι και το συμπολυμερές P(3HB-co-3HO). Το ελαστομερές αυτό έχει εγκριθεί για την χρήση του ως πρόσθετο στα τρόφιμα. Η παραγωγή του πραγματοποιείται από το ανασυνδυασμένο στέλεχος Escherichia coli K12 το οποίο συσσωρεύει περίπου 90% ΡΗΑ ανά ξηρό κυτταρικό βάρος μέσα σε 24 ώρες (Clarinval & Halleux, 2005). Η γερμανική εταιρεία Biomer παράγει ΡΗΒ σε μεγάλη κλίμακα μέσω του μικροοργανισμού Alcaligenes latus. Όταν ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται σε θρεπτικό μέσο το οποίο περιέχει σουκρόζη ως πηγή άνθρακα συσσωρεύει ΡΗΒ στο 90% του ξηρού κυτταρικού του βάρους. Το τελικό προϊόν είναι αρκετά σκληρό και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ένα εύρος θερμοκρασιών μεταξύ -30 έως 120 o C. Η βιομηχανική παραγωγή του P(3HB-co-3HHx) συμπολυμερούς πραγματοποιείται από το πανεπιστήμιο Tsinghua της Κίνας σε συνεργασία με το ινστιτούτο Guangdong Jiangmen της Κίνας, την εταιρεία KAIST της Κορέας και της εταιρείας Procter & Gamble των Η.Π.Α. Ο μικροοργανισμός που χρησιμοποιείται για την σύνθεση του πολυμερούς αυτού είναι ο Aeromonas hydrophila. Παρά τα πολλά πλεονεκτήματα που εμφανίζουν τα PHAs το κύριο μειονέκτημα που εμποδίζει την μαζική τους χρήση είναι το υψηλό τους κόστος. Το 2006 το κόστος του ΡΗΒ κυμαίνονταν μεταξύ 10-12/kg. Η τιμή αυτή ήταν αρκετά υψηλή σε σχέση με αυτή των πολυμερών με βάση το άμυλο και άλλων πολυεστέρων με βιολογική βάση. Η υψηλή τιμή των PHAs οφείλεται στο υψηλό κόστος των πρώτων υλών, τους μικρούς παραγόμενους όγκους και 53

88 το μεγάλο λειτουργικό κόστος. Εκτιμάται πως το κόστος των πρώτων υλών αντιστοιχεί περίπου στο 30-40% του συνολικού κόστους το οποίο μπορεί να μειωθεί σημαντικά εάν για την βακτηριακή ζύμωση χρησιμοποιηθούν φθηνά υποστρώματα ή αγροτοβιομηχανικά παραπροϊόντα. Η τελευταία εμπορική τιμή για το PHB ανακοινώθηκε για το προϊόν με την εμπορική ονομασία Mirel TM από την εταιρεία Telles των Η.Π.Α. περίπου στο 1.50 /kg (Plastics News, 2010). Αυτό το προϊόν συνδυάζει το πλεονέκτημα της βιοαποδόμησης με τιμή ανάλογη με αυτή των συμβατικών πολυμερών. Στον πίνακα 2.5. φαίνονται κάποιες από τις εταιρείες που παράγουν διάφορα είδη ΡΗΑ σήμερα καθώς και οι τιμές πώλησης των προϊόντων τους. Πίνακας 2.5. Εταιρείες έρευνας και παραγωγής PHAs (Chen, 2009; Chanprateep, 2010). Πολυμερές Εμπορική ονομασία Εταιρεία Παραγωγή (τόνους/έτος) Τιμή ( /kg) * ΡΗΒ Biogreen Mitsubishi (Ιαπωνία) ΡΗΒ Mirel TM Telles (Η.Π.Α.) ΡΗΒ Biocycle PHB Industrial Company (Βραζιλία) 50 A PHB, PHBV Biomer Biomer Inc. (Γερμανία) PHBV Enmat Tianan Biologic, Ningbo (Κίνα) PHBHHx Nodax TM P&G (Η.Π.Α.) PHBHHx Nodax TM Lianyi Biotech (Κίνα) PHBHHx Kaneka PHBHHx Kaneka Corporation (ιαπωνία) A P(3HB-co-4HB) Green Bio Tianjin Green Biosience Co/DSM (Κίνα) A PHA Meredian Meredian (Η.Π.Α.) ** A * Τιμή πώλησης κατά το έτος 2010, ** Αναμένεται το 2013, Α: άγνωστη τιμή πώλησης 54

89 Τα PHAs σύντομα θα εισβάλλουν στην αγορά ως αντικαταστάτες των πετροχημικών πολυμερών ευρείας χρήσεως. Το 2010 η παρουσία των βιοπλαστικών στην ευρωπαϊκή αγορά ανήλθε στους τόνους βρίσκοντας εφαρμογή κυρίως στον τομέα της συσκευασίας και της γεωργίας. Το 2020 προβλέπεται πως 2-5 εκατ. τόνοι θα είναι εμπορικά διαθέσιμοι ενώ οι εφαρμογές τους θα επεκταθούν και στην αυτοκινητοβιομηχανία, στην υφαντουργία και σε άλλα αγαθά μεγάλης διάρκειας (Shen et al., 2009; Chanprateep, 2010; Plastic News, 2010) Μελλοντικές προβλέψεις Όπως προαναφέρθηκε, τα μόνα πολυμερή που βρίσκονται στο στάδιο της εμπορικής ανάπτυξης είναι το P(3HB), το P(3HB-co-3HV), το P(3HB-co-3HHx) και το P(3HB-co-4HB). Η τιμή τους ακόμα και σήμερα είναι αρκετά υψηλή, για να χρησιμοποιηθούν μαζικά, αν την συγκρίνουμε με αυτήν των πετροχημικών πλαστικών. Τα διαγονιδιακά φυτά μπορούν να γίνουν στο μέλλον μία οικονομική και εναλλακτική πηγή παραγωγής PHAs. Ωστόσο, οι μικρές χώρες θα πρέπει να βασιστούν στην βακτηριακή PHA παραγωγή εξαιτίας του συσχετισμού της με τα πεδία ανάπτυξης αγροτικών προϊόντων. Οι στρατηγικές ζύμωσης για την παραγωγή PHA έχουν βελτιωθεί αρκετά τα τελευταία χρόνια. Αυτό που φαίνεται να είναι πιο σημαντικό είναι η απομόνωση και ανάπτυξη βακτηρίων που υπερπαράγουν PHA χρησιμοποιώντας φτηνά θρεπτικά υλικά. Για παράδειγμα το κόστος της παραγωγής του P(3HB-co-3HV) μειώνεται αρκετά χρησιμοποιώντας ένα στέλεχος βακτηρίου το οποίο αναπτύσσεται σε απλά υποστρώματα σακχάρων και δίνει μεγάλες παραγωγικότητες του συμπολυμερούς αντί να απαιτείται η χρήση ακριβών οργανικών οξέων στο θρεπτικό μέσο ανάπτυξης του (Philip et al., 2007). Η κλωνοποίηση και ο χαρακτηρισμός των γονιδίων που συμμετέχουν στην βιοσυνθετική πορεία των PHAs επιτρέπουν την δημιουργία ανασυνδυασμένων βακτηρίων που μπορούν να σχεδιαστούν έτσι ούτως ώστε να παρουσιάζουν πληθώρα πλεονεκτημάτων. Μερικά από αυτά είναι καλύτερες αποδόσεις σε PHAs, μεγαλύτεροι ρυθμοί ανάπτυξης τους και σύνθεσης PHAs σε μικρότερα χρονικά διαστήματα, η δημιουργία μεγάλων ΡΗΑ-κόκκων για τον ευκολότερο 55

90 διαχωρισμό τους καθώς και η ικανότητα να μην εμπεριέχουν ενδοκυτταρικές ΡΗΑαποπολυμεράσες ώστε να μην καταναλώνουν την αποθήκη των PHAs σε συνθήκες περιορισμού εξωκυτταρικής πηγής άνθρακα. Πολύπλοκα PHAs, όπως αυτά που έχουν ποικιλία πλευρικών ομάδων, είναι ακριβά λόγω του μεγάλου κόστους των ειδικών υποστρωμάτων που χρειάζονται για να επιτευχθούν οι δομές αυτές. Είναι επίσης δυνατή η χημική σύνθεση των PHAs και αποτελεί μια εναλλακτική και ανταγωνιστική μέθοδο έναντι της βακτηριακής ζύμωσης. Τέλος θα πρέπει να βελτιωθούν οι τεχνικές ανάκτησης των πολυμερών αυτών για να μειωθεί το κόστος παραγωγής όσο γίνεται περισσότερο. Την ίδια στιγμή θα πρέπει να αναπτυχθούν οι εφαρμογές τόσο μικρής όσο και μεγάλης προστιθέμενης αξίας. Για τις εφαρμογές μικρής προστιθέμενης αξίας τα PHAs χρησιμοποιούνται διότι είναι φιλικά προς το περιβάλλον. Για αυτές τις εφαρμογές όμως αυτές απαιτούνται μεγάλες ποσότητες PHAs. Ως εφαρμογές υψηλής προστιθέμενης αξίας τα PHAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν εμφυτεύματα, ικριώματα, συμπληρώματα διατροφής και ενέργειας τόσο για τα ζώα όσο και για τον άνθρωπο καθώς επίσης και σαν φάρμακα ή καθαρές χημικές ουσίες (Chen & Wu 2005b; Yao et al., 2008). 56

91 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 2 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ Abe H., Doi Y., Aoki H., Akehata T., Hori Y., Yamaguchi A. Physical properties and enzymatic degradability of copolymers of (R)-3-hydroxybutyric and 6-hydroxyhexanoic acids. Macromolecules 28, pp , Abe H. & Doi Y. Structural effects on enzymatic degradabilities for poly[(r)-3-hydroxybutyric acid] and its copolymers: mini-review. Int. J. Biol. Macromol. 25(1/3), pp , Bachmann B.M. & Seebach D. Investigation of the enzymatic cleavage of diasteromeric oligo(3- hydroxybutanoates) containing two to eight HB units. Macromolecules 32, pp , Baptist, J.N. Process for preparing poly-b-hydroxybutyric acid. US Patent No , 1962a. Baptist, J.N. Process for preparing poly-b-hydroxybutyric acid. US Patent No , 1962b. Baptist, J.N. Plasticized poly-b-hydroxybutyric acid and process. US Patent No , Bartholomew J.W. Stains for Microorganisms in Smears. In: Clark, G. (Ed.), Staining Procedures, 4th edn. Williams and Wilkins, Baltimore, pp , Bissery M.C., Valeriote F., Thies C. Therapeutic efficacy of CCNU-loaded microspheres prepared from poly(d,l)lactide (PLA) or poly-b-hydroxybutyrate (PHB) against Lewis lung (LL) carcinoma. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 26, pp , Braunegg G., Lefebvre G., Genser K.F. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects. J. Biotechnol. 65, pp , Braunegg G., Bona R., Koller M. Sustainable polymer production. Polym. Plast. Technol. 43, pp , Brophy M.R. & Deasy P.B. In vitro and in vivo studies on biodegradable polyester microparticles containing sulfamethizole. Int. J. Pharm. 29, pp , Byrom D. Production of poly-beta-hydroxybutyrate-poly-beta-hydroxyvalerate copolymers. FEMS Microbiol Rev 103, pp , Byrom D. In: Mobley D.P., editor. Plastics from microbes: microbial synthesis of polymers and polymer precursors. Munich: Hanser, pp. 5-33, Chanprattep S. Current trends in biodegradable polyhydroxyalkanoates. J. Biosci. Bioeng. 110, pp ,

92 Chen G.Q., Zhang G., Park S.J., Lee S.J. Industrial production of poly(hydroxybutyratecohydroxyhexanoate). Appl. Microbiol. Biotechnol. 57, pp , Chen G.Q. & Wu Q. The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials. Biomaterials 26, pp , 2005a. Chen G.Q. & Wu Q. Microbial production and applications of chiral hydroxyalkanoates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 67, pp , 2005b. Chen G.Q. A polyhydroxyalkanoates based bio- and materials industry. Chem. Soc. Rev. doi: /b812677c 38, pp , Chen G.Q. Plastics from Bacteria: Natural functions and applications, Microbiology Monographs 14, Series Editor: Alexander Steinduchel, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Chowdhury A. Bacteria and exoenzymes capable of degrading poly-β-hydroxybutyric acid. Arch. Microbiol. 47, pp , Clarinval A.M. & Halleux J. Classification of biodegradable polymers. In: Smithers Rapra Editions, Biodegradable polymers for industrial applications. CRC, Boca Raton, pp 3 56, Dai Z.W., Zou X.H., Chen G.Q. Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) as an injectable implant system for prevention of post-surgical tissue adhesion. Biomaterials 30, pp , Dawes E.A. & Senior P. J. The role and regulation of energy reserve polymers in microorganisms. Advances in Microbial Physiology 10, pp , Delafield F.P., Doudroff M.M., Palleroni N.J., Lusty C.J., Contopoulos R. Decomposition of polyb-hydroxybutyrate by Pseudomonads. J. Bacteriol. 90, pp , Doi Y., Abe C. Biosynthesis and characterization of a new bacterial copolyester of 3- hydroxyalkanoates and 3-hydroxy-ω-chloroalkanoates. Macromolecules 23, pp , Doi Y., Kitamura S., Abe H. Microbial synthesis and characterization of poly(3-hydroxybutyrateco-3-hydroxyhexanoate). Macromolecules 28, pp , Gavrilescu M. & Chisti Y. Biotechnology a sustainable alternative for chemical industry. Biotechnol. Adv. 23, pp ,

93 Gilkes N.R., Henrissat B., Kilburn D.G., Miller R.C.J., Warren R.A.J. Domains in microbial b-1,4 glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families. Microbiol. Rev. 55, pp , Gould P.L., Holland S.J., Tighe B.J. Polymers for biodegradable medical devices. 4- Hydroxybutyrate valerate copolymers as nondisintegrating matrices for controlledrelease oral dosage forms. Int. J. Pharm. 38, pp , Grace & Co., Absorbable prosthetic devices and surgical sutures. British Patent Specification No , Gross R.A. & Kalra B. Biodegradable polymers for the environment. Science 297, pp , Hazenberg W. & Witholt B. Efficient production of medium- chain-length poly(3- hydroxyalkanoates) from octane by Pseudomonas oleovorans: economic consideration. Appl Microbiol Biotechnol 48, pp , 1997.Hrabak O. Industrial production of poly-beta-hyrdoxybutyrate. FEMS Microbiol. Rev. 103, pp , Holmes P.A., Wright L.F., Collins, S.H. Copolyesters and process for their production. European Patent No , Holmes P.A. Biologically produced PHA polymers and copolymers. In: Developments in crystalline polymers, Bassett D.C. (ed), Elsevier, London 2: pp. 1-65, Howell E.R. Opportunities in biotechnology for the chemical industry. Chem. Ind. 8, pp , Huang R. & Reusch R.N. Genetic competence in Escherichia coli requires polyβhydroxybutyrate/calcium polyphosphate membrane complexes and certain divalent cations. J. Bacteriol. 177, pp , Huang R. & Reusch R.N. Poly(3-hydroxybutyrate) is associated with specific proteins in the cytoplasm and membranes of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 271(36), , Jendrossek D., Mueller B., Schlegel H.G. Cloning and characterization of the poly(hydroxyalkanoic acid) depolymerase gene locus, phazl, of Pseudomonas lemoignei and its gene product. Eur. J. Biochem. 218, pp ,

94 Jendrossek D., Schirmer A., Schlegel H.G. Biodegradation of polyhydroxyalkanoic acids. Appl. Microbiol. Biotechnol. 46(5/6):451-63, Jendrossek D. Extracellular PHA depolymerases: the key enzymes of PHA degradation. Biopolymers, Polyesters II, Properties and Chemical Synthesis, WILEY-VCH, Steinbuchel A, Doi Y eds. pp , Jendrossek D. & Handrick R. Microbial degradation of polyhydroxyalkanoates. Annu. Rev. Microbiol. 56, pp , Jendrossek D. Microbial degradation of polyesters: a review on extracellular poly(hydroxyalkanoic acid) depolymerases. Polym. Degrad. Stab. 59, pp , Kadouri D., Jurkevitch E., Okon Y., Castro-Sowinski S. Ecological and agricultural significance of bacterial polyhydroxyalkanoates. Crit. Rev. Microbiol. 31, pp , Kanesawa Y., Tanahashi N., Doi Y., Saito T. Enzymic degradation of microbial poly(3 hydroxyalkanoates). Polym. Degrad. Stab. 45, pp , Kato M., Bao H.J., Kang C.K., Fukui T., Doi Y. Production of a novel copolyester of 3- hydroxybutyric acids and medium chain length 3-hydroxyalkanoic acids by Pseudomonas sp from sugars. Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, pp , Kellet L.E., Poole D.M., Ferreira L.M.A., Durrant A.J., Hazlewood G.P., Gilbert H.J. Xylanase B and an arabinofuranosidase from Pseudomonas fluorescens subsp cellulosa contain identical cellulose-binding domains and are encoded by adjacent genes. Biochem. J. 272, pp , Keshavarz T. & Roy I. Polyhydroxyalkanoates: bioplastics with a green agenda. Curr. Opin. Microbiol. 13, pp , Kessler B. & Witholt B. Factors involved in the regulatory network of poly-hydroxyalkanoate metabolism. J. Biotechno.l 86, pp , Khanna S. & Srivastava A.K. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates. Process Biochem. 40, pp , Kim Y. B. & Lenz R. W. Polyesters from microorganisms, in: T. Scheper (Ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, vol. 71, Springer-Verlag Berlin Heideberg, Germany, pp ,

95 Kim S. & Dale B.E. Life cycle assessment study of biopolymers (Polyhydroxyalkanoates) derived from no-tilled corn. Int. J. LCA 10, pp , King P.P. Biotechnology, an industrial view. J. Chem. Technol. Biotechnol. 32, pp. 2 8, Kita K., Ishimaru K., Teraoka M., Yanase H., Kato N. Properties of poly(3-hydroxybutyrate) depolymerase from a marine bacterium Alcaligenes faecalis AE122. Appl. Environ. Microbiol. 61, pp , Kubota M., Nakano M., Juni K. Mechanism of enhancement of the release rate of aclarubicin from poly-beta-hydroxybutyric acid microspheres by fatty acid esters. Chem. Pharm. Bull. 36, pp , Kusaka S., Abe H., Lee S.Y., Doi Y. Molecular mass of poly[(r)-3-hydroxybutyric acid] produced in a recombinant Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 47, pp , Kusaka S., Iwata T., Doi Y. Properties and biodegradability of ultra-high-molecular-weight poly[(r)-3-hydroxybutyrate] produced by a recombinant Escherichia coli. Int. J. Biol. Macromol. 25, pp , Lee S.Y. Bacterial polyhydroxyalkanoates. Biotechnol. Bioeng. 49, pp. 1 14, Lee S.H., Oh D.H., Ahn W.S., Lee Y., Choi J.I., Lee S.Y. Production of poly(3-hydroxybutyrate-co- 3- hydroxyhexanoate) by high-cell-density cultivation of Aeromonas hydrophila. Biotechnol. Bioeng. 67, pp , Lemoigne M. Etudes sur l'autolyse microbienne. Origine de l'acide β-oxy-butyrique forme par autolyse. Ann. inst. pasteur 41, pp , Lenz R.W., Kim Y.B., Fuller R.C. Production of unusual bacterial polyesters by Pseudomonas oleonvorans through cometabolism. FEMS Microbiol.Rev. 103, pp , Lenz R. W. & Merchessault R. H. Bacterial polyesters: biosynthesis, biodegradable plastics and biotechnology, Biomacromolecules, 6, pp. 1 8, Liebergesell M., Mayer F., Steinbüchel A. Analysis of polyhydroxyalkanoic acid-biosynthesis genes of anoxygenic phototrophic bacteria reveals synthesis of a polyester exhibiting Luzier W.D. Materials derived from biomass: biodegradable materials. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, pp ,

96 Liebergesell M., Mayer F., Steinbuchel A. Analysis of polyhydroxyalkanoic acid-biosynthesis genes of anoxygenic phototrophic bacteria reveals synthesis of a polyester exhibiting an unusual composition. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, pp , Macrae R. M., Wiklinson J.F. Poly-3-hydroxybutyrate metabolism in washed suspensions of Bacillus cereus and Bacillus megaterium. J. Gen. Microbiol. 19, pp , 1958a. Macrae R. M., Wilkinson J.F. The influence of cultural conditions on poly-(3-hydroxybutyrate synthesis in Bacillus megaterium. Proc. Roy. Soc. Edinburgh 27, pp , 1958b. Matsusaki H., Abe H., Doi Y. Biosynthesis and properties of poly(3-hydroxybutyrate-co-3- hydroxyalkanoates) by recombinant strains of Pseudomonas sp Biomacromolecules 1, pp , Mergaert J., Webb A., Anderson C., Wouters A., Swings J. Microbial degradation of poly(3- hydroxybutyrate) and poly(3- hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) in soils. Appl. Environ. Microbiol. 59, pp , Mergaert J., Wouters A., Anderson C., Swings J. In situ biodegradation of poly(3- hydroxybutyrate) and poly(3 hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) in natural waters. Can. J. Microbiol. 41(1), pp , Mikova G. & Chodak I. Properties and modification of poly(3-hydroxybutanoate). Chem. Listy. 100, pp , Mukai K., Yamada K., Doi Y. Enzymatic degradation of poly(hydroxyalkanoates) by a marine bacterium. Polym. Degrad. Stab. 41, pp , Mukai K., Yamada K., Doi Y. Efficient hydrolysis of polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas stutzeri YM1414 isolated from lake water. Polym. Degrad. Stab. 43, pp , Ostle A.G. & Holt J.G. Nile blue A as a fluorescent stain for poly-b-hydroxybutyrate. Appl. Environ. Microbiol. 44, pp , Philip S., Keshavarz T., Roy I. Polyhydroxyalkanoates: biodegradable polymers with a range of applications. J Chem Technol Biotechnol 82, pp , Plastic News,

97 Poirier Y., Nawrath C., Somerville C. Production of polyhydroxyalkanoates, a family of biodegradable plastics and elastomers, in bacteria and plants, Nature Biotechnol. 13, pp , Pouton C.W. & Akhtar S. Biosynthetic polyhydroxyalkanoates and their potential in drug delivery. Adv. Drug. Deliv. Rev. 18, pp , Reddy C.S.K., Ghai R., Rashmi, Kalia V.C. Polyhydroxyalkanoates: an overview. Biores. Technol. 87, pp , Rees G.N., Vasiliadis G., May J.W., Bayly R.C. Differentiation of polyphosphate and polyhydroxybutyrate granules in Acinetobacter sp. isolated from activated sludge. FEMS Microbiol. Lett. 94, pp , Reusch R.N. Biological complexes of poly-b-hydroxybutyrate. FEMS Microbiol. Rev. 103, pp , Reusch R.N. Transmembrane ion transport by polyphosphate-poly-(r)-3-hydroxybutyrate complexes. Biochem. 65, pp English Translation, Saito T., Suzuki K., Yamamoto J., Fukui T., Miwa K., Tomita K., Nakanishi S., Odani S., Suzuki J., Ishikawa K. Cloning, nucleotide sequence, and expression in Escherichia coli of the gene for poly(3-hydroxybutyrate) depolymerase from Alcaligenes faecalis. J. Bacteriol. 171, pp , Saito Y. & Doi Y. Microbial synthesis and properties of poly(3-hydroxybutyrate-co-4- hydroxybutyrate) in Comamonas acidovorans. Int. J. Biol. Macromol. 16(2), , Saito Y., Nakamura S., Hiramitsu M., Doi Y. Microbial synthesis and properties of poly(3- hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate). Polym. Int. 39, pp , Schlegel H.G., Kaltwasser H., Gottschalk G. Ein Submersverfahren zur Kultur wasserstofoxidierender Bakterien: Wachstumsphysiologische Untersuchungen. Arch. Mikrobiol. 38, pp , Scott G. Polymers in modern life. Polymers and the environment. Royal Society of Chemistry, Cambridge,

98 Senior P.J., Beech G.A., Ritchie G.A.F., Dawes E. A. The role of oxygen limitation in the formation of poly-/3-hydroxybutyrate during batch and continuous culture of Azotobacter beijerinckii. Biochemical Journal 128, I I , Senior P. J. & Dawes E.A. The regulation of poly-3-hydroxybutyrate metabolism in Azotobacter beijerinckii. Biochemical Journal 134, pp , Senior P.G. Polyhydroxybutyrate, a specialty polymer of microbial origin. In: Dean, A.C.R., Ellwood, D.C., Evans, C.G.T. (Eds.), Continuous culture. Ellis Horwood, Chichester, UK, vol. 8, pp , Shen L., Haufe J., Patel M.K. Product overview and market projection of emerging biobased plastics (PROBIP 2009). Commissioned by European Polysaccharide Network of Excellence (EPNOE) and European Bioplastics. Group Science, Technology and Society (STS), Copernicus Institute for Sustainable Development and Innovation, Utrecht University, Utrecht, The Netherlands, June Report No: NWS-E , Shinomiya M., Iwata T., Kasuya K., Doi Y. Cloning of the gene for poly(3-hydroxybutyric acid) depolymerase of Comamonas testosteroni and functional analysis of its substratebinding domain. FEMS Microbiol. Lett. 154(1), pp , Spiekermann P., Rehm B.H.A., Kalscheuer R., Baumeister D., Steinbuchel A. A sensitive, viable colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds. Arch. Microbiol. 171, pp , Stevens E.S. How green are green plastics?. Biocycle, pp , Sudesh K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Prog Polym Sci 25, pp , Sudesh K. & Abe H. Practical guide to microbial Polyhydroxyalkanoates. Ed. Smithers Rapra, Takeda M., Koizumi J., Yabe K., Adachi K. Thermostable poly(3-hydroxybutyrate) depolymerase of a thermophilic strain of Lepotrix sp. isolated from a hot spring. J. Ferment. Bioeng. 85, pp ,

99 Tanio T., Fukui T., Shirakura Y., Saito T., Tomita K., Kaiho T., Masamune S. An extracellular poly(3 hydroxybutyrate) depolymerase from Alcaligenes faecalis. Eur. J. Biochem. 124, pp , The PHA Depolymerase Engineering Database, University of Stuttgart, Database developed by Michael Knoll and Thomas Hamm. Last updated on 06/02/2009. Tian J., Sinskey A.J., Stubbe J.A. Kinetic Studies of Polyhydroxybutyrate Granule Formation in Wautersia eutropha H16 by Transmission Electron Microscopy, J. Bacteriol. 187 (11), pp , Volova Tatiana, Polyhydroxyalkanoates, Plastic Materials of the 21 st Century. Nova Science Publishers Inc., Wallen, L.L. & Davis, E.N. Biopolymers of activated sludge. Environ. Sci. Technol. 6, pp , Wallen L.L. & Rohwedder W.K. Poly-b-hydroxyalkanoate from activated sludge. Environ. Sci. Technol. 8, pp , Watanabe T., Suzuki K., Oyanagi W., Ohnishi K., Tanaka H. Gene cloning of chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12 revealed its evolutionary relationship to Serratia chitinase and to the type III homology units of fibronectin. J. Biol. Chem. 265 (15), pp , Weiner R.M. Biopolymers from marine prokaryotes. Trends Biotechnol. 15, pp , Wilkinson J.F., Munro A.L.S. The influence of growth limiting conditions on the synthesis of possible carbon and energy storage polymers in Bacillus megaterium. In: Powell, E.O., Evans, C.G.T., Strange, R.E., Tempest, D.W. (Eds.), Microbial Physiology and Continuous Culture. H.M.S.O., London, pp , Williamson, D.H. & Wilkinson, J.F. The isolation and estimation of poly-h-hydroxybutyrate inclusions of Bacillus species. J. Gen. Microbiol. 19, , Yao Y.C., Zhan X.Y., Zou X.H., Wang Z.H., Xiong Y.C., Zhang J., Chen J., Chen G.Q. A specific drug targeting system based on polyhydroxyalkanoate granule binding protein PhaP fused with targeted cell ligands. Biomaterials 29, pp ,

100 Zinn M. & Hany R. Tailored material properties of polyhydroxyalkanoates through biosynthesis and chemical modification. Adv. Eng. Mater. 7, pp , Zhang X.J., Luo R.C., Wang Z., Deng Y., Chen G.Q. Applications of (R)-3-hydroxyalkanoate methyl esters derived from microbial polyhydroxyalkanoates as novel biofuel. Biomacromolecules 10, pp ,

101 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Παραγωγή των PHAs Η παραγωγή των PHAs μπορεί να επιτευχθεί με τρεις τρόπους: μέσω βιοσύνθεσης (in vivo) από μικροοργανισμούς μέσω φωτοσύνθεσης από διαγονιδιακά φυτά μέσω τεχνητής βιοσύνθεσης (in vitro) χρησιμοποιώντας κατάλληλα ένζυμα Στην παρούσα διατριβή θα εστιάσουμε στην παραγωγή των PHAs μέσω μικροοργανισμών. Ενδεικτικά να αναφέρουμε πως η βιοσύνθεση in vivo οδηγεί στην παραγωγή πολυμερών με μεγαλύτερα μοριακά βάρη συγκριτικά με αυτά που επιτυγχάνονται μέσω της βιοσύνθεσης in vitro. Από την άλλη μεριά παρόλο που η παραγωγή PHAs από διαγονιδιακά φυτά φαίνεται να είναι οικονομικά βιώσιμη η ανάπτυξή τους καταλαμβάνει τις εκτάσεις καλλιέργειας των αγροτικών προϊόντων γεγονός που καθιστά σχεδόν αδύνατη την παραγωγή τους σε μικρές χώρες. Περισσότερα από 300 στελέχη μικροοργανισμών είναι ικανά να συνθέτουν PHAs. Η βιολογική σύνθεση των PHAs όμως δεν επιτρέπει την ανθρώπινη παρέμβαση και τον έλεγχο των μονομερικών συνθέσεων και του μοριακού τους βάρους. Για τον λόγο αυτό πολλές έρευνες έχουν πραγματοποιηθεί στα πλαίσια της διερεύνησης των βιοχημικών αντιδράσεων που οδηγούν στην παραγωγή τους καθώς και των παραγόντων που τις επηρεάζουν. Αρκετοί τύποι PHAs μπορούν να συντεθούν χρησιμοποιώντας διαφορετικές πηγές άνθρακα. Ο τύπος και το μοριακό βάρος του τελικού προϊόντος εξαρτώνται κυρίως από τα ένζυμα που ελέγχουν το μεταβολικό μονοπάτι για την σύνθεση των PHAs στον κάθε μικροοργανισμό και από την πηγή άνθρακα η οποία μεταβολίζεται. Επίσης σημείο κλειδί για να επιτευχθούν υψηλές παραγωγικότητες σε PHAs είναι η επιλογή της κατάλληλης τεχνικής ζύμωσης και των βέλτιστων συνθηκών κάτω από τις οποίες πραγματοποιείται, παράμετροι που είναι συγκεκριμένες για τον κάθε μικροοργανισμό. Τέλος η μέθοδος ανάκτησης των PHAs 67

102 από τα βακτηριακά κύτταρα έχει βρεθεί πως επηρεάζει τις ιδιότητες του τελικού προϊόντος καθώς σε πολλές περιπτώσεις φαίνεται πως υποβαθμίζει το μοριακό βάρος και το ποσοστό ανάκτησης του. Το κεφάλαιο αυτό εστιάζει στην περιγραφή των σταδίων μιας ολοκληρωμένης διεργασίας παραγωγής PHAs από μικροοργανισμούς Γενική περιγραφή της βακτηριακής διεργασίας παραγωγής των PHAs Η διαδικασία παραγωγής των PHAs από τα βακτήρια περιλαμβάνει διάφορα στάδια όπως μπορούμε να διακρίνουμε στο σχήμα 3.1. Σχήμα 3.1. Συνοπτική παρουσίαση της διαδικασίας παραγωγής PHAs (Kessler at al., 2001). 68

103 Σε πρώτη φάση πριν το στάδιο της ζύμωσης γίνεται η επιλογή των πρώτων υλών. Οι πρώτες ύλες περιλαμβάνουν τον τύπο καλλιέργειας και την πηγή άνθρακα που θα χρησιμοποιηθούν. Η παραγωγή των PHAs μπορεί να προκύψει είτε από καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών, δηλαδή την καλλιέργεια ενός και μόνο βακτηριακού στελέχους είτε μέσω μικτών καλλιεργειών. Τα υποστρώματα άνθρακα που αποτελούν τις πρόδρομες ουσίες για την παραγωγή PHAs είναι συνήθως απλές οργανικές ενώσεις όπως σάκχαρα και αλκανοϊκά οξέα. Έχει βρεθεί πως η καταναλισκόμενη πηγή άνθρακα αντικατοπτρίζει το 40% του συνολικού κόστους της ΡΗΑ παραγωγής. Εναλλακτικά μπορούν να αξιοποιηθούν φθηνές πηγές άνθρακα όπως τα υγρά ρεύματα αγροτοβιομηχανικών παραπροϊόντων ή αποβλήτων όμως οι παραγωγικότητες στην περίπτωση αυτή είναι αρκετά μικρότερες. Σε δεύτερη φάση επιλέγεται η στρατηγική ζύμωσης και σχεδιάζεται κατάλληλα το θρεπτικό μέσο για την ανάπτυξη και την συσσώρευση των πολυμερών λαμβάνοντας υπόψη τον τύπο καλλιέργειας ή το βακτηριακό στέλεχος που χρησιμοποιείται. Επίσης προσδιορίζονται οι συνθήκες κάτω από τις οποίες θα λάβει χώρα η ζύμωση (θερμοκρασίας, ph κ.ά.) έτσι ώστε να οδηγηθούμε σε υψηλές ΡΗΑ παραγωγικότητες. Στην συνέχεια πραγματοποιείται η ζύμωση, η οποία συνήθως γίνεται σε δύο βήματα. Αρχικά ο μικροοργανισμός που θα χρησιμοποιηθεί αναπτύσσεται σε μεγάλες συγκεντρώσεις βιομάζας, ενώ στην συνέχεια ακολουθεί το στάδιο της συσσώρευσης όπου η βιομάζα αυτή αυξάνεται λόγω του σχηματισμού ενδοκυτταρικών κόκκων PHAs. Στο δεύτερο στάδιο εφόσον έχει τερματιστεί η ζύμωση πραγματοποιείται η ανάκτηση του πολυμερούς. Γίνεται διαχωρισμός και συλλογή της μικροβιακής βιομάζας από το υδατικό διάλυμα ενώ στην συνέχεια επιλέγεται η μέθοδος ανάκτησης και καθαρισμού του πολυμερούς. Τέλος, τα πολυμερή που έχουν ανακτηθεί υφίστανται την κατάλληλη επεξεργασία και μορφοποίηση ανάλογα με την τελική τους εφαρμογή. 69

104 3.2. Μικροοργανισμοί ικανοί να συσσωρεύουν PHAs Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή των PHAs μπορούν να χωριστούν σε δύο ομάδες ανάλογα με τις συνθήκες καλλιέργειας που απαιτούνται για την σύνθεση των PHA. Η πρώτη ομάδα βακτηρίων απαιτεί τον περιορισμό βασικών θρεπτικών συστατικών όπως αζώτου (Dawes & Senior, 1973; Repaske & Repaske, 1976), φωσφόρου, οξυγόνου (Ward et al., 1977), μαγνησίου ή θείου (Ryu et al., 1997) στο θρεπτικό μέσο για την σύνθεση PHAs από περίσσεια πηγής άνθρακα. Μερικά από τα βακτήρια που συμπεριλαμβάνονται σε αυτήν την ομάδα είναι τα: A. eutrophus, Protomonas extorquens, και Pseudomonas oleovorans. Η δεύτερη ομάδα βακτηρίων, η οποία περιλαμβάνει το βακτήριο Alcaligenes latus, ένα μεταλλαγμένο στέλεχος του Azotobacter vinelandii, και το ανασυνδυασμένο E. coli δεν απαιτούν τον περιορισμό κάποιας θρεπτικής ουσίας, όπως η πρώτη ομάδα, για την σύνθεση PHA και μπορούν να συσσωρεύουν πολυμερή κατά την διάρκεια της ανάπτυξης τους. Ακόμα και σε αυτή την κατηγορία βακτηρίων όμως φαίνεται πως προάγεται η παραγωγή των PHAs όταν κάποιο από τα βασικά θρεπτικά συστατικά βρίσκεται σε περιορισμό. Στον πίνακα 3.1 παρουσιάζονται τα θρεπτικά συστατικά που όταν βρίσκονται σε μικρές συγκεντρώσεις στο θρεπτικό μέσο προάγουν την παραγωγή των PHAs σε διάφορους μικροοργανισμούς (Kim & Lenz, 2001). Για πολλά βακτήρια, το πολυμερές μόλις συσσωρευτεί χρησιμεύει ως πηγή άνθρακα και πηγή ενέργειας κατά τη διάρκεια λιμού. Τα PHAs αποτελούν ένα ιδανικό αποθεματικό υλικό, λόγω της χαμηλής τους διαλυτότητας και του υψηλού μοριακού βάρους τους, διότι ασκούν αμελητέα ωσμωτική πίεση στο βακτηριακό κύτταρο (Sudesh & Abe, 2010). Παρά τον μεγάλο αριθμό μικροοργανισμών που δύναται να παράγουν PHAs μόνο λίγοι από αυτούς έχουν χρησιμοποιηθεί για την βιομηχανική παραγωγή PHAs. Το στέλεχος Ralstonia eutropha χρησιμοποιείται ευρέως για την βιοσύνθεση του ΡΗΒ (Linko & Vaheri, 1993), τα στελέχη Pseudomonas oleovorans και Pseudomonas putida χρησιμοποιούνται για την παραγωγή mcl-phas (Lageveen, 1988; Kudesh et al., 2000) ενώ όλα τα λειτουργικά γονίδια της ΡΗΑ-σύνθεσης έχουν κλωνοποιηθεί και έχουν εκφραστεί με επιτυχία στο E. coli. To E. coli θεωρείται ως ο καλύτερος εμπορικός PHA-παραγωγός διότι μπορεί να χρησιμοποιήσει μεγαλύτερο εύρος φθηνών πηγών άνθρακα για την παραγωγή πολυμερών και είναι σχετικά 70

105 εύκολη η διαδικασία ανάκτησης του πολυμερούς από τα κύτταρα του (Lee, 1997). Επιπλέον, το E. coli δεν περιέχει ενδοκυτταρικά το ένζυμο ΡΗΑ-αποπολυμεράση, εφόσον δεν είναι φυσικός ΡΗΑ-παραγωγός, και τα PHAs που παράγονται δεν υποβαθμίζονται μέσα στο κύτταρο. Αυτός είναι και ένας από τους λόγους που το ανασυνδυασμένο E. coli παράγει PHAs με πολύ υψηλά μοριακά βάρη (Sim et al., 1997). Πίνακας 3.1. Θρεπτικά συστατικά σε περιορισμό που προάγουν την παραγωγή των PHAs (Kim & Lenz, 2001). Συστατικό σε περιορισμό Αμμώνιο Μικροοργανισμοί Alcaligenes latus Pseudomonas oleovorans Pseudomonas cepacia Ralstonia eutrophus Rhodobacter sphaeroides Pseudomonas sp. K. Methylocystus oarvus Thiosphaera pantotropha Rhizobium ORS 571 Σίδηρος Pseudomonas sp. K. Μαγνήσιο Pseudomonas sp. K. Οξυγόνο Φωσφορικά άλατα Azotobacter vinelandii Azobacter beijerinckii Rhizobium ORS571 Rhodospirillum rubrum Rhodobacter sphaeroidis Caulobacter crescentus Pseudomonas oleovorans Θειικό κάλιο Bacillus thuringiensis Pseudomonas sp. K. Pseudomonas oleovorans Rhodospirillum rubrum Rhodobacter sphaeroids 71

106 Εναλλακτικά των καθαρών καλλιεργειών μπορούν να παραχθούν PHAs από μικτές καλλιέργειες μικροοργανισμών. Οι μικτές καλλιέργειες συνήθως χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία υγρών αποβλήτων. Η ενεργή ιλύς έχει την δυνατότητα να συσσωρεύει PHAs ως πηγή άνθρακα και ενέργειας κάτω από μη-ισορροπημένες συνθήκες. Ο μικροοργανισμοί της ενεργούς ιλύος υπόκεινται σε μεταβαλλόμενες συνθήκες διαθεσιμότητας θρεπτικών και προσαρμόζονται σε αυτές συσσωρεύοντας ενδοκυτταρική πηγή άνθρακα και ενέργειας. Τα ποσοστά συσσώρευσης όμως είναι μικρά σε σχέση με αυτά των καθαρών καλλιεργειών καθώς η ενεργός ιλύς συσσωρεύει περίπου 20% PHAs ανά ξηρό κυτταρικό βάρος κάτω από αναερόβιες συνθήκες ενώ οι καθαρές καλλιέργειες μπορούν να φτάσουν το 88%. Το ποσοστό παραγωγής PHAs της ενεργούς ιλύος μπορεί να αυξηθεί στο 62% εάν η διαδικασία πραγματοποιηθεί υπό μικροαεροφιλικές-αερόβιες συνθήκες (Salehizadeh & van Loosdrecht, 2004). Παρά τα μικρότερα ποσοστά συσσώρευσης που επιτυγχάνονται συγκριτικά με τις καθαρές καλλιέργειες η χρήση των μικτών καλλιεργειών έχει κεντρίσει το επιστημονικό ενδιαφέρον διότι οδηγεί στην μείωση του κόστους της παραγωγής των PHAs καθώς δεν απαιτεί άσηπτες συνθήκες λειτουργίας και είναι πιο απλός ο έλεγχος λειτουργίας κατά την διεργασία Βιοσύνθεση και ενδοκυτταρική βιοαποδόμηση των PHAs Η βιοσύνθεση των PHAs έχει μελετηθεί σε μεγάλο βαθμό κατά τη διάρκεια των περασμένων χρόνων ενώ μελετάται μέχρι και σήμερα. Φαίνεται πως στη φύση έχουν αναπτυχθεί αρκετά διαφορετικά μονοπάτια για τον σχηματισμό των PHAs ανάλογα με τον ρόλο του κάθε ΡΗΑ-μικροοργανισμού σε αυτή. Το ακετυλο-συνένζυμο Α, AcCoA, είναι το συστατικό κλειδί το οποίο παρέχει τα 3- υδροξυαλκανυλο-coa διαφορετικού μήκους ως υποστρώματα για τις PHA-πολυμεράσες. Επιπλέον τα 3-υδροξυαλκανυλο-CoA μπορούν επίσης να παρασχεθούν μέσω της β-οξείδωσης των λιπαρών οξέων με διαφορετικά μήκη αλυσίδων. Πολλά γονίδια που κωδικοποιούν τα διάφορα ένζυμα εμπλέκονται άμεσα ή έμμεσα στη PHA σύνθεση. 72

107 Αρκετά γονίδια που κωδικοποιούν τα ένζυμα που εμπλέκονται στην βιοσύνθεση και βιοαποδόμηση των ΡΗΑs από διάφορους μικροοργανισμούς έχουν κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί (Madison & Huisman, 1999). Τα μεταβολικά μονοπάτια σύνθεσης PHAs ποικίλουν ανάλογα με την πηγή άνθρακα που παρέχεται στην καλλιέργεια και τον μικροοργανισμό. Η μονομερική δομή που προκύπτει είναι άμεσα συνδεδεμένη με την ειδίκευση του ενζύμου ΡΗΑ-πολυμεράση να πολυμερίζει υποστρώματα που αποτελούνται από συγκεκριμένο αριθμό ατόμων άνθρακα. Η ΡΗΑπολυμεράση θεωρείται το ένζυμο κλειδί της βιοσυνθετικής πορείας για την παραγωγή των PHAs. Σχήμα 3.2. Βιοσυνθετικό μονοπάτι του ΡΗΒ. Το ΡΗΒ συντίθεται από την διαδοχική δράση των ενζύμων β-κετοθειολάση (phba), αναγωγάση του AcCoA (phbb) και ΡΗΑ-πολυμεράση (phbc) σε μια διαδικασία τριών σταδίων. Τα γονίδια του οπερονίου phbcab κωδικοποιούν τα τρια ένζυμα. Ο υποκινητής (Ρ) κινείται προς το phbc μεταγράφοντας ολόκληρο το οπερόνιο (Madison & Huisman, 1999). Από την πληθώρα των PHAs αυτό που έχει χαρακτηριστεί σε μεγάλο βαθμό είναι το ΡΗΒ καθώς είναι το πρώτο πολυμερές της οικογενείας αυτής που ανακαλύφθηκε. Το γενικό βιοχημικό μονοπάτι που οδηγεί στην παραγωγή του ΡΗΒ είναι διακλάδωση της κεντρικής μεταβολικής πορείας του ακετυλο-συνένζυμου Α (AcCoA), το οποίο μετασχηματίζεται σε PHB μέσω τριών αντιδράσεων οι οποίες καταλύονται από τρία ένζυμα τα οποία κωδικοποιούνται 73

108 από τα γονίδια του οπερονίου phbcab. Η πρώτη αντίδραση είναι η συμπύκνωση δύο μορίων AcCoA σε ακετοακέτυλο-coa μέσω της δράσης της β-κετοθειολάσης που κωδικοποιείται από το γονίδιο phaa. Στην δεύτερη αντίδραση πραγματοποιείται αναγωγή του ακετοακέτυλο-coa σε (R)-3-υδροξυβουτυρυλο-CoA μέσω μίας NADPH-εξαρτώμενης αναγωγάσης του ακετοακετυλο-coa η οποία κωδικοποιείται από το phab. Τέλος, τα μονομερή (R)-3- υδροξυβουτυρυλο-coa πολυμερίζονται σε ΡΗΒ με την δράση του ενζύμου ΡΗΒ-πολυμεράση που κωδικοποιείται από το phac. Όταν οι πηγές άνθρακα που χρησιμοποιούνται ως μέσο για την ανάπτυξη των βακτηρίων εξαντλούνται, το πολυμερές αποδομείται από την PHA-αποπολυμεράση και έτσι σχηματίζεται D-( )-υδροξυβουτυρικό οξύ. Η PHA-αποπολυμεράση είναι ένας τύπος υδρολυτικού ενζύμου. Το D-( )-υδροξυβουτυρικό οξύ έπειτα οξειδώνεται σε ακετοξικό οξύ από έναν ειδικό τύπο NAD-αφυδρογονάσης. Το ακετοξικό οξύ μετατρέπεται σε ακετοακέτυλο-coa από την συνθετάση του ακετοακέτυλο-coa. Συνεπώς το ακετοακέτυλο-coa είναι ένα ενδιάμεσο προιόν, κοινό, τόσο στην βιοσύνθεση όσο και στην αποικοδόμηση του PHB. Επίσης πρέπει να σημειωθεί ότι στην σειρά των αντιδράσεων που οδηγούν από το βουτυρικό οξύ ή την φρουκτόζη στο πολυ-3-υδροξυβουτυρικό οξύ, το (S)-3-υδροξυακετυλοσυνένζυμο-Α, που είναι μέσο για την πορεία της β-οξείδωσης των λιπαρών οξέων, είναι ανεστραμμένο για να σχηματίσει το πρόδρομο (R)-3-υδροξυακυλοσυνένζυμο-Α του πολυ-3-υδροξυβουτυρικού οξέος. Τα ένζυμα που συμμετέχουν στην βιοσύνθεση και αποικοδόμηση των PHAs είναι ομόλογα με αυτά που συμμετέχουν στο μεταβολισμό του PHB. Το σχήμα 3.3. απεικονίζει την μεταβολική πορεία στο βακτήριο Αlcaligenes eutrophus που παράγει PHB χρησιμοποιώντας ως θρεπτικό υλικό φρουκτόζη ή βουτυρικό οξύ. 74

109 Σχήμα 3.3. Πορεία της βιοσύνθεσης και αποδόμησης του PHB στο βακτήριο Alcaligenes eutrophus. Τα ένζυμα που καταλύουν τις αντιδράσεις είναι: (1) β-κετοθειολάση, (2) NADPH αναγωγάση του ακετοακέτυλο-coa, (3) PHA-πολυμεράση, (4) NADPH αφυδρογονάση του ακετοακέτυλο-coa, (5) PHAαποπολυμεράση, (6) (R)-3-υδροξυβουτυρική αποπολυμεράση, και (7) συνθετάση του ακετοακέτυλο- CoA (Steinbuchel & Lutke-Eversloh, 2003). 75

110 PHA συνθάση/ πολυμεράση Οι ΡΗΑ συνθάσες είναι τα ένζυμα κλειδιά της βιοσύνθεσης των PHAs. Χρησιμοποιούν ως υποστρώματα τους θειοεστέρες συνενζύμου Α (CoA) των υδροξυαλκανοικών οξέων (ΗΑ) και καταλύουν των πολυμερισμό αυτών των ΗΑs σε PHAs με ταυτόχρονη απελευθέρωση CoA. Μετά από την πρώτη κλωνοποίηση του οπερονίου της ΡΗΑ συνθάσης του μικροοργανισμόυ Ralstonia eutropha to 1988 (Schubert et al., 1988; Slater et al., 1988; Peoples & Sinskey, 1989) περίπου 59 διαφορετικά ένζυμα ΡΗΑ συνθάσης από συνολικά 45 μικροοργανισμούς έχουν κλωνοποιηθεί και μελετηθεί (Rehm B.H.A., 2003). Οι ΡΗΑ συνθάσες διακρίνονται σε τέσσερις μεγάλες κατηγορίες ανάλογα με την εξειδίκευση υποστρώματος που παρουσιάζουν και την δομή των υπομονάδων τους (Πίνακας 3.2). Η εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα που έχουν οι ΡΗΑ συνθάσες καθορίζουν την δομή των συντιθέμενων ΡΗΑ και επομένως επηρεάζουν τις φυσικοχημικές ιδιότητες του παραγόμενου ΡΗΑ. Οι ΡΗΑ συνθάσες που ανήκουν στην κατηγορία Ι και ΙΙ περιλαμβάνουν ένζυμα τα οποία αποτελούνται μόνο από έναν τύπο υπομονάδας (ΡhaC) με μοριακό βάρος μεταξύ 61 kda και 73 kda (Qi & Rehm, 2001). Σύμφωνα με την in vivo και in vitro εξειδίκευση υποστρώματος που επιδεικνύουν οι ΡΗΑ συνθάσες της κατηγορίας Ι (π.χ. Ralstonia eutropha) προτιμούν να χρησιμοποιούν θειοεστέρες CoA διαφόρων (R)-3-υδροξυ λιπαρών οξέων που αποτελούνται από 3 έως 5 άτομα άνθρακα ενώ οι ΡΗΑ συνθάσες της κατηγορίας ΙΙ (π.χ. Pseudomonas aeruginosa) ειδικεύονται στην χρήση θειοεστέρων CoA (R)-3-υδροξυ λιπαρών οξέων που αποτελούνται από 6 έως 14 άτομα άνθρακα (Schubert et al, 1988; Slater et al., 1988, 1992; Peoples & Sinskey, 1989; Amara & Rehm, 2003). Στην κατηγορία ΙΙΙ συναντάμε ΡΗΑ συνθάσες (π.χ. Allochromatium vinosum) που αποτελούνται από δύο διαφορετικούς τύπους υπομονάδων: (i) την υπομονάδα PhaC (μοριακό βάρος ~ 40 kda) που επιδεικνύει % ομοιότητα στην αλληλουχία των αμινοξέων με της ΡΗΑ συνθάσες των κατηγοριών Ι και ΙΙ και (ii) την υπομονάδα PhaE (μοριακό βάρος ~ 40 kda) η οποία δεν παρουσιάζει καμία ομοιότητα με άλλες ΡΗΑ συνθάσες. Αυτές οι ΡΗΑ συνθάσες προτιμούν θειοεστέρες CoA διαφόρων (R)-3- υδροξυ λιπαρών οξέων που αποτελούνται από 3 έως 5 άτομα άνθρακα (Liebergesell et al., 1992; Yuan et al., 2001). Τέλος, οι ΡΗΑ συνθάσες της IV κατηγορίας (π.χ. Bacillus megaterium) 76

111 είναι παρόμοιες με αυτές της κατηγορίας ΙΙΙ με την διαφορά πως η υπομονάδα PhaE αντικαθίσταται από την υπομονάδα PhaR (μοριακό βάρος ~ 20 kda) (McCool & Cannon, 2001). Πίνακας 3.2. Γενικές κατηγορίες ΡΗΑ συνθάσης. Κατηγορία Υπομονάδα Στέλεχος Υπόστρωμα I PhaC ~ kda Cupriavidus necator 3HA SCL -CoA (~C3-C5) 4HA SCL -CoA 5HA SCL -CoA 3HA SCL -CoA II PhaC Pseudomonas aeruginosa 3HA MCL -CoA (~ C5) ~ kda III PhaC PhaE ~ 40 kda ~ 40 kda Allochromatium vinosum 3HA MCL -CoA (3HA MCL -CoA [~C6-C8], 4HA-CoA, 5HA-CoA) IV PhaC PhaR Bacillus megaterium 3HA SCL -CoA ~ 40 kda ~ 22 kda Εξαίρεση, στην παραπάνω κατηγοριοποίηση, αποτελούν οι συνθάσες των μικροοργανισμών Thiocapsa pfennigii, Aeromonas punctata και Pseudomonas sp Σύμφωνα με μελέτες φαίνεται πως γενικά οι ΡΗΑ συνθάσες χαρακτηρίζονται από ευρεία εξειδίκευση υποστρώματος (Dennis et al., 1998; Antonio et al., 2000) ενώ σύγκριση μεταξύ 59 ΡΗΑ συνθάσεων που προήλθαν από διαφόρους μικροοργανισμούς κατέδειξε πως τα ένζυμα αυτά παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα, 8-96 % των αμινοξέων Μορφολογία και δομή των ΡΗΑ κοκκίων. Όπως έχει ήδη αναφερθεί τα PHAs συσσωρεύονται ενδοκυτταρικά με την μορφή κοκκίων (κόκκων) οι οποίοι είναι διακριτοί μέσω ηλεκτρονικού μικροσκοπίου συνήθως έπειτα από 77

112 χρώση. Ο αριθμός των κόκκων που σχηματίζονται διαφέρει ανάλογα με τον μικροοργανισμό που χρησιμοποιείται. Για παράδειγμα, στον μικροοργανισμό Ralstonia eutropha ή αλλιώς (Alcaligenes eutrophus) δημιουργούνται 8-12 κόκκοι ποικίλου μεγέθους, ενώ αντίθετα στον μικροοργανισμό Pseudomonas oleovorans δημιουργούνται 1-2 κόκκοι μεγάλου μεγέθους. ΡΗΑ αποπολυμεράση Δομική πρωτεΐνη ΡΗΑ συνθάση Ρυθμιστική πρωτεΐνη Φωσφολιπίδια Πολυεστερικός πυρήνας nm Σχήμα 3.4. Σχηματική αναπαράσταση ΡΗΑ κοκκίου. Σύμφωνα με τους Zinn κ.ά. (Zinn et al., 2001) φαίνεται πως τα scl-pha και τα mcl-pha παρουσιάζουν διαφορετική δομή. Σε κόκκους scl-pha που απομονώθηκαν από τον μικροοργανισμό Bacillus megaterium το εξωτερικό τους μέρος αποτελείται από φωσφολιπίδια (0.5 % w/w) και πρωτεΐνες (0.2 % w/w) ενώ δεν βρέθηκε κάποιο στοιχείο που να αποδεικνύει την ύπαρξη λιπιδίων ή πρωτεϊνών στο εσωτερικό μέρος του κόκκου. Αντιθέτως, οι κόκκοι των mcl-pha χαρακτηρίζονται από μεγαλύτερο μέγεθος ενώ βάσει παρατηρήσεων μέσω ηλεκτρονικού μικροσκοπίου φαίνεται πως περιβάλλονται από μονοστιβάδα φωσφολιπιδίων η οποία διαχωρίζει δύο πρωτεϊνικές περιοχές κρυσταλλικής δομής. 78

113 Και στους δύο τύπους ΡΗΑ κόκκων συναντάμε τέσσερις βασικές κατηγορίες πρωτεινών: (α) την ΡΗΑ συνθάση,(β) την ΡΗΑ αποπολυμεράση, (γ) δομικές πρωτεΐνες, των οποίων ο ρόλος τους είναι να σταθεροποιούν την δομή του κοκκίου, και (δ) ρυθμιστικές πρωτεΐνες καθώς και πιθανά ένζυμα τα οποία καταλύουν των αρχικό σχηματισμό των κοκκίων (Rehm B.H.A., 2006) Μοντέλο σχηματισμού των ΡΗΑ κοκκίων. Οι Gerngross και Martin (Gerngross & Martin, 1995) ήταν οι πρώτοι που περιέγραψαν την in vitro σύνθεση του ΡΗΒ και αυτοοργάνωση των κόκκων χρησιμοποιώντας μόνο καθαρή πολυεστερική συνθάση και υπόστρωμα. Μέσω της συγκεκριμένης μελέτης προέκυψε το συμπέρασμα πως η ΡΗΑ συνθάση εμπεριέχει τις χαρακτηριστικές πληροφορίες που αφορούν στην αυτοοργάνωση σε σφαιρικά κοκκία. Βάση της παραπάνω έρευνας πραγματοποιήθηκαν, για επαλήθευση, συνθέσεις ΡΗΑ χρησιμοποιώντας ΡΗΑ συνθάσες από διάφορους μικροοργανισμούς, π.χ. Cupriavidus necator, Allochromatium vinosum, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans (Jossek et al., 1998; Jossek & Steinbuchel, 1998; Muh et al., 1999; Qi et al., 2000; Rehm et al., 2001). Η ομοιότητα των ενεργών κέντρων μεταξύ των ΡΗΑ συνθάσων και των λιπασών βοήθησε στην μελέτη του μοντέλου σχηματισμού των ΡΗΑ κόκκων. Και τα δύο αυτά ένζυμα δρουν στους εστερικούς δεσμούς στην διεπιφάνεια του υδρόφοβου κόκκου και του υδατικού κυτταρολύματος. Η διαφορά μεταξύ τους αφορά την κατεύθυνση της αντίδρασης που καταλύουν. Η ΡΗΑ συνθάση ευθύνεται για τον σχηματισμό εστέρων ενώ η λιπάση για την εστερική υδρόλυση. Η ΡΗΑ συνθάση δρα στην επιφάνεια του κόκκου όπου διαλυτά μόρια πολυμερίζονται και αποθηκεύονται στο εσωτερικό υδρόφοβο περιβάλλον του κόκκου, ενώ η λιπάση διασπά τους εστερικούς δεσμούς στα τριγλυκερίδια απελευθερώνοντας οξέα στο υδατικό περιβάλλον (σχήμα 3.5). Στο υδατικό περιβάλλον του κυταρρολύματος ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός πως η ΡΗΑ συνθάση καταλύει την αντίδραση εστεροποίησης κάτω από μη ευνοϊκές υδατικές συνθήκες. 79

114 νερό νερό PHA TG Σχήμα 3.5. Ομοιότητες μεταξύ ΡΗΑ συνθάσης (C) και λιπάσης (L). Η ΡΗΑ αποπολυμεράση (Z) δρα και αυτή στην επιφάνεια του κόκκου διασπώντας το πολυμερές σε μονομερή. Σύμφωνα με το μοντέλο των Gerngross και Martin η διαλυτή αρχικά ΡΗΑ συνθάση αλληλεπιδρά με τις ολοένα αυξανόμενες συγκεντρώσεις του (R)-3-υδρόξυβουτύρυλο-CoA στο κυτταρόπλασμα. Το γεγονός αυτό ενεργοποιεί τον μηχανισμό πολυμερισμού με τρόπο που δεν είναι ακόμα γνωστός. Κατά την διάρκεια μιας αρχικής φάσης καθυστέρησης (lag phase) σχηματίζονται με αργό ρυθμό ολιγομερή ΗΒ τα οποία εκβάλλονται από το ένζυμο όπως περιγράφεται και από το σχήμα 3.6 (στάδιο 1). Έπειτα, καθώς τα ολιγομερή αυξάνονται σε μήκος και υδροφοβικότητα τα ΗΒ ολιγομερή σχηματίζουν μικκύλια, με το ένζυμο να βρίσκεται στην επιφάνεια, διαχωρίζοντας έτσι το πολυμερές από το κυτταροδιάλυμα (στάδιο 2). Η αντίδραση πολυμερισμού στο στάδιο αυτό επιταχύνεται επειδή το υδρόφοβο πολυμερές εκτείνεται στο εσωτερικό του υδρόφοβου περιβάλλοντος του μικκυλίου και όχι στο υδατικό περιβάλλον του κυτταρολύματος με αποτέλεσμα να σημειώνονται και γρηγορότεροι ρυθμοί πολυμερισμού. Στο σημείο αυτό τα μικκύλια παίρνουν την μορφή ενδοκυτταρικών κόκκων οι οποίοι είναι ορατοί μέσω μικροσκοπίου αντιθέσεως φάσεων (στάδιο 3). Καθώς αυξάνεται ο αριθμός των κοκκίων αυτά συνασπίζονται σε μεγάλα συσσωματώματα (στάδιο 4). 80

115 στάδιο 1 στάδιο 2 στάδιο 3 στάδιο 4 Σχήμα 3.6. Προτεινόμενος μηχανισμός για τον σχηματισμό ΡΗΑ κοκκίων. Μπορούμε να συναντήσουμε την ΡΗΑ συνθάση σε δύο μορφές: είτε διαλυτή στο κυτταρόπλασμα είτε δεσμευμένη στους κόκκους. Παρόλο που ο διαχωρισμός τους μπορεί να πραγματοποιηθεί εύκολα μέσω μιας απλής φυγοκέντρισης δύσκολη παραμένει η διευκρίνιση βασικών κινητικών παραμέτρων καθώς η διαλυτή συνθάση χαρακτηρίζεται από μικρότερη ενεργότητα από την συνθάση η οποία είναι δεσμευμένη στους κόκκους (Madison & Huisman, 1999). Σύμφωνα με in vitro πειράματα φαίνεται πως η φάση καθυστέρησης που παρατηρείται κατά τον σχηματισμό ολιγομερών ΗΒ οφείλεται στο γεγονός ότι η συνθάση που είναι ήδη δεσμευμένη στους κόκκους είναι αυτή που μετατρέπει την διαλυτή στην πλήρως δραστική μορφή της και πως ο χρόνος της φάσης καθυστέρησης εξαρτάται από το αρχικό στάδιο της αλκυλίωσης Υποστρώματα Τα PHAs θεωρούνται ως οι μελλοντικοί αντικαταστάτες των πετροχημικών πολυμερών λόγω της δυνατότητας παραγωγής τους από ανανεώσιμες πηγές και της ικανότητας βιοαποδόμησής τους. Ωστόσο, ο κύριος λόγος που εμποδίζει την εμπορευματοποίηση τους και την ευρύτερη εφαρμογή τους είναι το υψηλό κόστος παραγωγής τους, το οποίο είναι περίπου πέντε φορές μεγαλύτερο του κόστους συμβατικών πολυμερών όπως το πολυαιθυλένιο και το πολυπροπυλένιο (Khanna & Srivastava, 2005). Ένας από τους κύριους παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για την υψηλή τιμή πώλησής τους είναι το κόστος της πηγής άνθρακα που χρησιμοποιείται κατά την διάρκεια της ζύμωσης. Φαίνεται πως το κόστος του υποστρώματος αναλογεί περίπου στο 40 % του συνολικού κόστους παραγωγής των PHAs. 81

116 Μέχρι σήμερα οι περισσότερες έρευνες που αφορούν την παραγωγή PHAs από διάφορα στελέχη μικροοργανισμών ή μικτές καλλιέργειες μικροοργανισμών κάνουν χρήση καθαρών υποστρωμάτων άνθρακα όπως σάκχαρα, συνήθως γλυκόζη, φρουκτόζη και οργανικά οξέα όπως οξικό, προπιονικό, βουτυρικό, βαλερικό, οκτανοϊκό, δεκανοϊκό και άλλα. Πίνακας 3.3. Παραγωγή PHAs από φθηνές πηγές άνθρακα. Πηγή άνθρακα Μικροοργανισμός Δομή ΡΗΑ % PHAs Αναφορά Υδρολυμένο καλαμποκέλαιο P. putida mcl-phas 27.2 Shang et al., 2008 Τυρόγαλα P. hydrogenovora PHB - Koller et al., 2008 Μελάσες Alburquerque et al., Μικτή καλλιέργεια PHBV 30 σακχαροκάλαμου 2007 Απόβλητα Bengtsson et al., Μικτή καλλιέργεια PHBV 48.2 χαρτοβιομηχανίας 2008 Άμυλο αποβλήτων R. eutropha τομάτας NCIMB PHB 55 Haas et al., 2008 Ακατέργαστη Cupriavidus γλυκερόλη necator JMP 134 PHB 48 Mothes et al., 2007 Φοινικέλαιο Cupriavidus necator PHB-4 P(HB-HV-HHx) 79 Bhudalan et al., 2008 Φυτικά έλαια Cupriavidus necator H16 PHBV 80 Lee et al., 2008 Αστικά λύματα Μικτή καλλιέργεια PHBV 40 Coats et al., 2007 Απόβλητα ζυθοποιίας Μικτή καλλιέργεια - 38 Mato et al.,

117 Τα τελευταία χρόνια, σε μια προσπάθεια μείωσης του κόστους των PHAs, οι επιστήμονες έχουν εστιάσει στην παραγωγή PHAs μέσω φθηνών πηγών άνθρακα όπως είναι από φυτικά έλαια (Bhubalan et al., 2008; Kek et al., 2008; Lee et al., 2008; Shang et al., 2008), μελάσες (Solaiman et al., 2006; Albuquerque et al., 2007), άμυλο (Chen et al., 2006; Haas et al., 2008), τυρόγαλο (Koller et al., 2008), γλυκερόλη (Mothes et al., 2007) κ.ά. Στον πίνακα 3.3 παρατηρούμε τα ποσοστά PHAs τα οποία έχουν επιτευχτεί χρησιμοποιώντας φθηνές πηγές άνθρακα. Συγκριτικά με τα καθαρά υποστρώματα αυτές οι φθηνές πηγές άνθρακα οδηγούν σε μικρότερες συγκεντρώσεις, μικρότερους ρυθμούς παραγωγής και μειωμένα ποσοστά συσσώρευσης PHAs. Επίσης το μικρό ποσοστό των παραγόμενων PHAs καθιστά δύσκολο τον διαχωρισμό τους από το θρεπτικό μέσο. Απλές πηγές άνθρακα όπως τα σάκχαρα και το άμυλο μπορούν να χρησιμοποιηθούν όμως παράλληλα αυτά αποτελούν βασική πηγή τροφής για τον άνθρωπο και τα ζώα (Chanprateep, 2010). Η χρήση βιομηχανικών παραπροϊόντων ενδέχεται να επιφέρει πρόσθετο κόστος λόγω των σταδίων προεπεξεργασίας για την απομάκρυνση διαφόρων συστατικών τα οποία παρεμποδίζουν την μικροβιακή ανάπτυξη. Σε πολλές έρευνες αναφέρεται πως για να γίνει αξιοποίηση υγρών ρευμάτων αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων ως πηγής άνθρακα απαιτείται προηγουμένως η αναερόβια χώνευση/οξεογένεση τους. Κατά την αναερόβια χώνευση σύνθετα βιομόρια υδρολύονται σε διαλυτά τα οποία μετέπειτα μεταβολίζονται από αξεογόνους και οξικογόνους μικροοργανισμούς παράγοντας μικρού μήκους πτητικά λιπαρά οξέα. Τα οξέα αυτά αποτελούν τις πρόδρομες ενώσεις για την παραγωγή PHB και PHBV και πληθώρα μικροοργανισμών είναι σε θέση να παράγουν PHAs χρησιμοποιώντας τα ως υπόστρωμα άνθρακα όπως για παράδειγμα τα Cupriavidus necator, Bacillus megaterium, Pseudomonas oleovorans, Azotobacter beijerincki καθώς και μικτοί μικροβιακοί πληθυσμοί. Συγκεκριμένα, όσον αφορά τις μικτές καλλιέργειες θεωρείται πως η απευθείας χρήση ενός ακατέργαστου αποβλήτου προάγει την ανάπτυξη μικροοργανισμών που συσσωρεύουν ενδοκυτταρικά γλυκογόνο αντί των PHAs, οπότε και προτείνεται η οξεογένεση των αποβλήτων πριν από την αξιοποίηση τους ως ανθρακικά υποστρώματα (Dias et al., 2006; Serafim et al., 2008). 83

118 3.5. Στρατηγικές ζύμωσης Σε γενικές γραμμές, ο στόχος κατά την ζυμωτική διεργασία παραγωγής των PHAs είναι οι μικροοργανισμοί να συσσωρεύσουν ενδοκυτταρικά στην μορφή των PHAs όσο το δυνατό περισσότερο διαθέσιμο άνθρακα του θρεπτικού μέσου αντί να τον χρησιμοποιήσουν για να αναπτυχθούν. Για τον λόγο αυτό δυσανάλογες ποσότητες θρεπτικών συστατικών παρέχονται στους μικροοργανισμούς για να παρεμποδιστεί η ανάπτυξη τους. Ωστόσο η αρχική κυτταρική συγκέντρωση θα πρέπει να είναι αρκετά υψηλή έτσι ώστε να επιτευχθούν υψηλές παραγωγικότητες. Συνεπώς, η στρατηγική ζύμωσης που ακολουθείται περιλαμβάνει την αύξηση της κυτταρικής πυκνότητας παρέχοντας ένα πλήρες θρεπτικό μέσο, ενώ όταν η κυτταρική συγκέντρωση φτάσει στα επιθυμητά επίπεδα η καλλιέργεια τροφοδοτείται με νέο θρεπτικό μέσο το οποίο περιέχει κάποιο ή κάποια από τα συστατικά που είναι σημαντικά για την κυτταρική ανάπτυξη σε περιορισμό ενώ η πηγή άνθρακα βρίσκεται σε περίσσεια. Αυτές οι στρατηγικές ζύμωσης μπορούν να επιτευχθούν σε βιοαντιδραστήρες διαλείποντος, ημιδιαλείποντος έργου ή σε συνεχές σύστημα πολλαπλών σταδίων και η επιλογή των συστημάτων αυτών σχετίζεται άμεσα με τον τύπο της καλλιέργειας που χρησιμοποιείται καθώς και με το θρεπτικό μέσο (Kessler et al., 2001). Βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου Η παραγωγή των PHAs μπορεί να πραγματοποιηθεί σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου, δηλαδή ασυνεχούς λειτουργίας. Οι αντιδραστήρες αυτοί θεωρούνται κλειστά συστήματα καθώς κατά την διάρκεια της λειτουργίας τους δεν υπάρχουν εισερχόμενες ή εξερχόμενες ροές. Συνήθως οι αντιδραστήρες αυτοί εμβολιάζονται με κυτταρική βιομάζα, η οποία αναπτύσσεται και διατηρείται σε ξεχωριστό αντιδραστήρα οπότε σε αυτού του τύπου τους βιοαντιδραστήρες λαμβάνει χώρα μόνο η φάση της συσσώρευσης των PHAs παρέχοντας το κατάλληλο θρεπτικό μέσο. Η λειτουργία τέτοιων αντιδραστήρων απαιτεί λιγότερο έλεγχο και αποτελεί το τελευταίο στάδιο συνήθως για την παραγωγή των PHAs από μικτές καλλιέργειες. 84

119 Βιοαντιδραστήρες ημιδιαλείποντος έργου Οι αντιδραστήρες ημιδιαλείποντος είναι κάτι ενδιάμεσο μεταξύ των αντιδραστήρων διαλείποντος έργου και των αντιδραστήρων συνεχούς λειτουργίας. Όταν η παραγωγή των PHAs πραγματοποιείται σε αντιδραστήρες ημιδιαλείποντος έργου διακρίνεται σε δύο φάσεις. Στην πρώτη φάση πραγματοποιείται η κυτταρική ανάπτυξη ενώ στην συνέχεια ξεκινά η φάση της συσσώρευσης με συνεχή παροχή τροφοδοσίας στην οποία ένα βασικό θρεπτικό συστατικό βρίσκεται σε περιορισμό. Παράλληλα η συγκέντρωση της πηγής άνθρακα είναι υψηλή. Οι αντιδραστήρες ημιδιαλείποντος έργου είναι ανοιχτά συστήματα ενώ ελέγχονται μέσω της παρακολούθησης της συγκέντρωσης του διαλυτού οξυγόνου στον βιοαντιδραστήρα, το οποίο αποτελεί μέτρο του ρυθμού κατανάλωσης της πηγής άνθρακα. Επίσης από πλευράς ελέγχου μπορεί να χρησιμοποιηθεί σύστημα σταθεροποίησης του ph το οποίο συνδυάζει την διατήρηση του ph της καλλιέργειας στο βέλτιστο με την παροχή του θρεπτικού μέσου. Παρόλα τα παραπάνω, αυτά τα συστήματα ελέγχου είναι χρήσιμα όταν χρησιμοποιείται μία και μόνο πηγή άνθρακα και όχι μίγματα δύο ή παραπάνω πηγών άνθρακα π.χ. για την παραγωγή συμπολυμερών. Σε αυτή την περίπτωση απαιτείται ένα σύστημα ελέγχου με το οποίο θα ρυθμίζονται οι συγκεντρώσεις καθεμίας πηγής άνθρακα (Kellerhalls et al., 1999). Για την ασυνεχή λειτουργία των αντιδραστήρων ημιδιαλείποντος έργου παρέχεται συχνά θρεπτικό μέσο το οποίο χαρακτηρίζεται από υψηλό λόγο της πηγής άνθρακα ως προς την πηγή αζώτου, π.χ. 40 mol/mol. Μειώνοντας τον λόγο αυτό συνήθως αναστέλλεται αναλόγως η συσσώρευση των πολυμερών (Witholt & Kessler, 1999). Βιοαντιδραστήρες συνεχούς λειτουργίας Γενικά, οι φάσεις της ανάπτυξης της κυτταρικής βιομάζας και της συσσώρευσης των πολυμερών μπορούν να πραγματοποιηθούν σε πολλαπλά στάδια, τουλάχιστον δύο, σε έναν αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας. Στο πρώτο στάδιο η καλλιέργεια αναπτύσσεται με την παροχή ενός πλήρους θρεπτικού μέσου, ενώ στο δεύτερο πραγματοποιείται η συσσώρευση του πολυμερούς με περιορισμό σε κάποιο συστατικό πέραν του άνθρακα. Οι ρυθμοί ανάπτυξης και συσσώρευσης του πολυμερούς είναι πολύ συχνά διαφορετικοί και για τον λόγο αυτό υπάρχει διαφορά ανάμεσα στους χρόνους παραμονής του πρώτου και του δεύτερου 85

120 σταδίου στον αντιδραστήρα συνεπώς και στους ρυθμούς αραίωσης. Για παράδειγμα, η παραγωγή mcl-phas από το βακτήριο P. oleovorans έχει πραγματοποιηθεί σε συνεχές σύστημα δύο σταδίων και βρέθηκε πως οι τιμές αραίωσης κατά το πρώτο και το δεύτερο στάδιο ήταν 0.21 και 0.16 h -1 αντίστοιχα (Jung et al., 2001). Παρόλο που η λειτουργία ενός συνεχούς συστήματος μπορεί να οδηγήσει σε υψηλότερες παραγωγικότητες λόγω της συνεχούς παροχής υποστρώματος είναι συχνό το φαινόμενο ημιτελούς κατανάλωσης των θρεπτικών λόγο του υψηλού λόγου της πηγής άνθρακα προς την πηγή του αζώτου (Braunegg et al., 1998) Διαχωρισμός και ανάκτηση των PHAs Μετά την ζύμωση τα κύτταρα που περιέχουν τα PHAs διαχωρίζονται από το θρεπτικό μέσο μέσω κοινών τεχνικών όπως η φυγοκέντρηση και η διύλιση. Η ανάκτηση των PHAs από τα βακτηριακά κύτταρα μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω δύο διαφορετικών κατηγοριών μεθόδων. Η πρώτη κατηγορία μεθόδων περιλαμβάνει την ανάκτηση των πολυμερών από τα κύτταρα ενώ η δεύτερη την απομάκρυνση κυτταρικών συστατικών πέραν των PHAs. Εφόσον τα PHAs είναι αδιάλυτα στο νερό στην πρώτη κατηγορία χρησιμοποιούνται διαλύτες στους οποίους τα PHAs παρουσιάζουν υψηλή διαλυτότητα για την ανάκτηση των πολυμερών αφήνοντας τα κυτταρικά υπολείμματα στα υδατικά διαλύματα. Στην δεύτερη κατηγορία τα κύτταρα διασπώνται και τα αδιάλυτα PHAs ξεπλένονται για να διαχωριστούν από τα υπόλοιπα κυτταρικά συστατικά (Suriyamongkol et al., 2007). Ανάκτηση των PHAs με διαλύτες Διαλύτες όπως το χλωροφόρμιο, το διχλωροαιθάνιο, το διχλωρομεθάνιo κ.ά. χρησιμοποιούνται για την εξαγωγή των PHAs από τα μικροβιακά κύτταρα. Μεγάλες ποσότητες διαλύτη απαιτούνται για την ανάκτηση των πολυμερών αυτών καθώς παρουσιάζουν υψηλό ιξώδες. Περίπου 20 ml διαλύτη χρειάζονται για την εξαγωγή τους από 1 g ξηρής κυτταρικής βιομάζας. Το γεγονός αυτό καθιστά την μέθοδο αυτή οικονομικά απρόσιτη ακόμα και με ανακύκλωση του διαλύτη που χρησιμοποιείται. Διαλύματα υποχλωριώδους άλατος μπορούν 86

121 επίσης να χρησιμοποιηθούν για την απόσπαση των PHAs. Η μέθοδος αυτή είναι αποτελεσματική στην χώνευση κυτταρικών συστατικών εκτός των PHAs. Ωστόσο προκαλεί σημαντική υποβάθμιση των PHAs με αποτέλεσμα την μείωση του μοριακού βάρους τους κατά 50%. Τα μίγματα υποχλωριώδους άλατος και χλωροφορμίου οδηγούν σε μικρότερη υποβάθμιση του μοριακού βάρους των πολυμερών λόγω της άμεσης διάλυσης των PHAs από το χλωροφόρμιο αφού έχουν απομονωθεί με την βοήθεια του υποχλωριώδους άλατος. Γενικά επιτυγχάνεται καθαρότητα μεγαλύτερη του 95% με τη χρήση υποχλωριώδους άλατος. Απομάκρυνση κυτταρικών συστατικών Αυτή η κατηγορία μεθόδων έχει σχεδιαστεί έτσι ούτως ώστε να αποφευχθεί η χρήση οργανικών διαλυτών. Ένζυμα όπως η λυσοζύμη, οι πρωτεϊνάσες κ.ά. μπορούν να λύσουν τα κύτταρα διαχωρίζοντας τα PHAs. Με την μέθοδο αυτή τα περισσότερα κυτταρικά συστατικά διαλυτοποιούνται, όχι όμως και τα PHAs. Έπειτα από την χώνευση το πολυμερές ξεπλένεται με ανιονικές επιφανειοδραστικές ουσίες για την απομάκρυνση πρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων και των κυτταρικών τοιχωμάτων αφήνοντας ανέπαφα τα PHAs. Η επεξεργασία με NaOH ή ΝΗ 4 ΟΗ είναι κατάλληλη για κύτταρα που εμφανίζουν μεγάλα ενδοκυτταρικά ποσοστά ΡHAs καθώς η κυτταρική τους μεμβράνη γίνεται εύθραυστη, όταν εμφανίζουν υψηλή περιεκτικότητα σε PHAs. Φαίνεται λοιπόν πως η διαδικασία της ανάκτησης των PHAs συμβάλει και αυτή με την σειρά της στο υψηλό συνολικό κόστος παραγωγής των PHAs. Σε εργαστηριακή κλίμακα η ανάκτηση των PHAs πραγματοποιείται με οργανικούς διαλύτες, συνήθως χλωροφόρμιο ενώ ακολουθεί καταβύθιση σε μεθανόλη, διότι επιτυγχάνονται υψηλές καθαρότητες καθώς επίσης σχεδόν μηδενική είναι η υποβάθμιση των μοριακών βαρών των PHAs. Από την άλλη μεριά δεν είναι δυνατή η χρήση τους όταν πραγματοποιείται παραγωγή των PHAs σε μεγάλη κλίμακα λόγω των μεγάλων όγκων διαλυτών που απαιτούνται καθώς και του μη περιβαλλοντικά φιλικού προφίλ της μεθόδου. Εναλλακτικά μπορεί να γίνει χρήση ενός κοκτέιλ ενζύμων για την λύση των κυττάρων και επιφανειοδραστικών ουσιών για την χώνευση μη-ρηα συστατικών. Μέσω αυτού του τύπου μεθόδων επιτυγχάνονται ποσοστά ανάκτησης ανάλογα με αυτά της μεθόδου του 87

122 χλωροφορμίου αλλά υποβαθμίζεται σημαντικά το μοριακό βάρος του πολυμερούς. Επίσης, δεν έχει διευκρινιστεί ακόμα αν είναι εφικτή και οικονομικά βιώσιμη η εφαρμογή αυτής της μεθόδου σε μεγάλη κλίμακα. Συμπεραίνουμε λοιπόν πως, πέραν του οικονομικού κριτηρίου η μέθοδος ανάκτησης θα πρέπει να συνδυάζει υψηλές καθαρότητες PHAs και ελάχιστη υποβάθμιση των μοριακών τους βαρών. Στον πίνακα 3.4. παρουσιάζονται ενδεικτικά οι παράμετροι που χαρακτηρίζουν την αποτελεσματικότητα κάποιων εκ των πλέον αντιπροσωπευτικών και ευρέως χρησιμοποιούμενων μεθόδων ανάκτησης όπως αυτές εφαρμόστηκαν σε βακτηριακά κύτταρα του Ralstonia eutropha (Ryu et al., 2000; Kapritchkoff et al., 2006). Πίνακας 3.4. Παράμετροι που χαρακτηρίζουν την ανάκτηση των PHAs χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους (Verlinden et al., 2007). Χαρακτηριστικές παράμετροι Μέθοδος ανάκτησης των PHAs Χλωροφόρμιο Υποχλωριώδες άλας Λυσοζύμη Θεωρητικό % PHAs α Ανακτώμενο % PHAs α Ποσοστό ανάκτησης Μw ( 10 5 Da) Μn ( 10 5 Da) Πολυδιασπορά (Μw/Mn) % υποβάθμιση του Mw β % υποβάθμιση του Mn β α % PHAs: (g PHAs/g ξηρής κυτταρικής βιομάζας)*100 β % υποβάθμιση χρησιμοποιώντας ως σημείο αναφοράς τα μοριακά βάρη των PHAs που ανακτήθηκαν μέσω της μεθόδου απόσπασης με χλωροφόρμιο 88

123 3.7. Η οικονομική πλευρά της διεργασίας Έχοντας ως στόχο την ευρύτερη εμπορευματοποίηση των PHAs μεγάλη προσπάθεια καταβάλλεται για την μείωση τους κόστους παραγωγής τους μέσω της ανάπτυξης των κατάλληλων βακτηριακών στελεχών καθώς και της βελτιστοποίησης της ζυμωτικής διεργασίας και της διερεύνησης αποτελεσματικότερων μεθόδων ανάκτησης. Ωστόσο, η βελτιστοποίηση του κάθε σταδίου ξεχωριστά απαιτεί αξιοσημείωτη προσπάθεια και συνήθως καταλήγει σε λιγότερο ευνοϊκά αποτελέσματα. Η μείωση του κόστους παραγωγής των PHAs μπορεί να επιτευχθεί μελετώντας τη σχεδίαση και την πλήρη ανάλυση του συνόλου της διεργασίας και βασίζεται στην απόδοση της διεργασίας ζύμωσης, την πηγή άνθρακα που χρησιμοποιείται και την μέθοδο ανάκτησης (Hazenberg & Witholt, 1997; Lee & Choi, 1998; van Wegen et al., 1998). Παραγωγικότητα των PHAs κατά την διεργασία ζύμωσης Η παραγωγικότητα ορίζεται ως η ποσότητα των PHAs που παράγεται σε όγκο ενός λίτρου προς τον όγκο αυτό ανά ώρα. Για την παραγωγή της ίδιας ποσότητας PHAs ανά έτος η διεργασία που χαρακτηρίζεται από μικρότερη παραγωγικότητα απαιτεί μεγαλύτερο εξοπλισμό. Για παράδειγμα, έστω ότι έχει αναπτυχθεί μια ζυμωτική διεργασία κατά την οποία μπορούμε να παράγουμε 100 g/l σε 50 h, δηλαδή παραγωγικότητα 2 g PHA l -1 h -1. Εάν θελήσουμε να παράγουμε 10 τόνους PHAs σε 250 h θα χρειαζόμασταν έναν αντιδραστήρα λειτουργικού όγκου 20 m 3. Από την άλλη μεριά αν η παραγωγικότητα της καλλιέργειας ήταν η μισή, δηλαδή 1 g PHA l -1 h -1 για να επιτύχουμε τον ίδιο στόχο θα έπρεπε να χρησιμοποιηθεί αντιδραστήρας με τον διπλάσιο λειτουργικό όγκο (Lee & Choi, 1998). Εκτός του λειτουργικού κόστους του αντιδραστήρα, το στάδιο της ζύμωσης περιλαμβάνει επίσης το κόστος του αναλώσιμου εξοπλισμού και το κόστος του εργατικού δυναμικού, το οποίο αυξάνει με μείωση της παραγωγικότητας των PHAs. Η επίδραση της ΡΗΑπαραγωγικότητας στο κόστος παραγωγής τους φαίνεται και από τον πίνακα 3.5 όπου γίνεται σύγκριση δύο διεργασιών παραγωγής ΡΗΒ από το ανασυνδυασμένο E. Coli με διαφορετικές παραγωγικότητες. Όταν η ΡΗΒ παραγωγικότητα αυξάνεται από 1.98 σε 3.20 g l -1 h -1 το κόστος του PHB μειώθηκε από 5.37σε 4.91 $/kg PHB. Από την οικονομική ανάλυση φαίνεται πως το κόστος των πρώτων υλών είναι σχεδόν σταθερό όμως το λειτουργικό κόστος, το κόστος 89

124 εργασίας και το κόστος του εξοπλισμού και της συντήρησης μειώνονται με αύξηση της παραγωγικότητας (Wang & Lee, 1997). Ενδοκυτταρική περιεκτικότητα σε PHAs Το ποσοστό των PHAs που συσσωρεύεται ενδοκυτταρικά επηρεάζει την αποτελεσματικότητα της μεθόδου ανάκτησης των πολυμερών καθώς και την απόδοση των PHAs ως προς την πηγή άνθρακα. Η απόδοση και η καθαρότητα των PHAs που ανακτώνται εξαρτώνται από το ενδοκυτταρικό περιεχόμενο των κυττάρων σε PHAs. Μικρότεροι όγκοι διαλυτών ή άλλων χημικών ουσιών χρειάζονται για την ανάκτηση των PHAs όταν τα ποσοστά είναι υψηλά. Η παρατήρηση μικρών ποσοστών PHAs σημαίνει πως μεγάλο μέρος της πηγής άνθρακα δαπανάται σε άλλα κυτταρικά υλικά και/ή μεταβολίτες. Για παράδειγμα το βακτήριο A. latus μπορεί να συσσωρεύσει ενδοκυτταρικά 50% του ξηρού κυτταρικού του βάρους σε PHAs με απόδοση 0.17 g PHA/ g σουκρόζης δηλ. για να παραχθεί 1 kg ΡΗΒ πρέπει να καταναλωθούν 5.88 kg σουκρόζης. Ωστόσο το ποσοστό PHB μπορεί να αυξηθεί στο 88% του ξηρού κυτταρικού του βάρους εάν η ζύμωση πραγματοποιηθεί σε συνθήκες όπου υπάρχει περιορισμός σε άζωτο. Στην περίπτωση αυτή η απόδοση σε ΡΗΒ αυξάνεται από 0.17 σε 0.42 g PHB/ g σουκρόζης, οπότε για την παραγωγή 1 kg ΡΗΒ απαιτούνται 2.38 kg σουκρόζης (Choi & Lee, 1999). Επιπλέον, η οικονομική αποτίμηση της διαδικασίας η οποία σχεδιάστηκε στα παραπάνω αποτελέσματα έδειξε πως το κόστος της ανάκτησης των PHAs μειώνεται σημαντικά με αύξηση του ενδοκυτταρικού ποσοστού των PHAs. Στο παραπάνω παράδειγμα όταν η παραγωγή των PHAs ανέρχεται στο 50% το κόστος ανάκτησης φτάνει στα 4.8 $/kg PHB ενώ όταν αυτό αυξάνεται σε 88% το κόστος ανάκτησης μειώνεται σημαντικά σε 0.92 $/kg PHB (Choi & Lee, 1999). 90

125 Πίνακας 3.5. Σύγκριση ετήσιου λειτουργικού κόστους της παραγωγής PHB ( τόνοι/έτος) από τους μικροοργανισμούς A. latus, το ανασυνδυασμένο E. Coli και M. Organophilum. Η ανάκτηση του ΡΗΒ πραγματοποιήθηκε μέσω της μεθόδου υποχλωριώδους άλατος και επιφανειοδραστικού (Choi & Lee, 1999). Παράμετρος Α. latus α A. latus E. coli E. coli M. organophilum Απόδοση ζύμωσης Διάρκεια ζύμωσης (h) Κυτταρική συγκέντρωση (g/l) Συγκέντρωση ΡΗΒ (g/l) Περιεκτικότητα ΡΗΒ (%) Παραγωγικότητα ΡΗΒ (g l -1 h -1 ) Απόδοση ΡΗΒ (g PHB/g πηγής άνθρακα) Οικονομική ανάλυση Κόστος κεφαλαίου Εργατικό κόστος Γενικό κόστος διαχείρισης Κόστος πρώτων υλών Λειτουργικό κόστος Κόστος επεξεργασίας και διάθεσης αποβλήτων Συνολικό κόστος παραγωγής ΡΗΒ ($/kg PHB) α Πραγματοποιήθηκε εμβολιασμός μεγαλύτερης συγκέντρωσης κυτταρικής βιομάζας 91

126 Κόστος της πηγής άνθρακα και η απόδοση σε PHAs Το κόστος της πηγής άνθρακα συμβάλει σημαντικά στο συνολικό κόστος της παραγωγής των PHAs. Για παράδειγμα όταν η παραγωγή πραγματοποιείται από το ανασυνδυασμένο E. coli δίνοντας ως αποτέλεσμα συγκέντρωση ΡHB 157 g/l, ενδοκυτταρικό ποσοστό ΡΗΒ 77% και -1 ΡΗΒ-παραγωγικότητα 3.2 g l -1 h το κόστος της πηγής άνθρακα αντιστοιχεί στο 38% του συνολικού λειτουργικού κόστους. Η χρήση φθηνότερων πηγών άνθρακα μπορεί να μειώσει περαιτέρω το κόστος παραγωγής του ΡΗΒ. Εάν αντί για γλυκόζη, 0.41 $/kg, χρησιμοποιηθεί υδρολυμένο άμυλο καλαμποκιού, 0.22 $/kg, το κόστος παραγωγής μειώνεται από 3.1 $/kg ΡΗΒ σε 1.19 $/kg ΡΗΒ. Στον πίνακα 3.6 συνοψίζονται τα κόστη διαφόρων πηγών άνθρακα για την παραγωγή του ΡΗΒ βάση των θεωρητικών αποδόσεων που αναφέρονται στην βιβλιογραφία (Chanprateep, 2010). Λόγω της χαμηλής τους τιμής υποστρώματα όπως φυτικά έλαια, μελάσες σακχαροκάλαμων κ.ά. μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πηγές άνθρακα για την παραγωγή PHAs, ωστόσο οι αποδόσεις και τα ποσοστά που επιτυγχάνονται είναι αρκετά χαμηλότερα συγκριτικά με αυτά των καθαρών υποστρωμάτων άνθρακα. Πίνακας 3.6. Εμπορική τιμή υποστρωμάτων άνθρακα και εκτιμώμενο κόστος υποστρώματος για την παραγωγή ΡΗΒ βάση της απόδοσης του (Chanprateep, 2010). Πηγή άνθρακα Τιμή πηγής άνθρακα ( kg -1 ) Απόδοση σε ΡΗΒ (kg kg -1 ) Τελικό κόστος πηγής άνθρακα ( kg -1 ΡΗΑ) Σουκρόζη Γλυκόζη Αιθανόλη Μεθανόλη Οξικό νάτριο Φυτικό άμυλο Μελάσες σακχαροκάλαμου Φοινικέλαιο Έλαιο σόγιας

127 Άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν τα οικονομικά της παραγωγικής διαδικασίας ΡΗΑ Η παροχή επαρκούς ποσότητας οξυγόνου για να διατηρηθούν οι αερόβιες συνθήκες αποδεικνύεται οικονομικά δαπανηρή (van Wegen et al., 1998). Όταν η παραγωγή των PHAs πραγματοποιείται από καλλιέργειες υψηλής κυτταρικής πυκνότητας το διαλυτό οξυγόνο συχνά ενεργεί ως περιοριστικός παράγοντας (Lee, 1996). Για την αποφυγή του φαινομένου αυτού απαιτείται η εγκατάσταση ενός συμπιεστή ο οποίος είναι σε θέση να παρέχει ροή οξυγόνου με υψηλούς ρυθμούς. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του κόστους παραγωγής ειδικά σε βιομηχανικά συστήματα μεγάλης κλίμακας. Από την άλλη μεριά φαίνεται πως όταν καλλιέργειες του ανασυνδυασμένου E. coli χρησιμοποιούνται για την παραγωγή ΡΗΒ σε συνθήκες ανεπαρκούς παροχής οξυγόνου ενισχύθηκε η απόδοση, το ποσοστό και η παραγωγικότητα σε ΡΗΒ. Έχει αναφερθεί επίσης πως η παραγωγή των PHAs αυξάνεται όταν παρέχονται μικρές ποσότητες σύνθετων πηγών αζώτου όπως εκχύλισμα ζύμης, τρυπτόνη, πεπτόνη κ.ά. Η μείωση του κόστους που είναι άμεση συνάρτηση της αύξησης στην απόδοση των PHAs φαίνεται πως είναι μεγαλύτερη από το πρόσθετο κόστος των σύνθετων πηγών αζώτου, οπότε η διεργασία της παραγωγής των PHAs γίνεται ακόμα πιο οικονομική (Lee & Chang, 1995; Chanprateep, 2010). Μέθοδος ανάκτησης Πληθώρα μεθόδων που αφορούν την ανάκτηση των παραγόμενων PHAs έχει αναπτυχθεί. Η απόσπαση των PHAs χρησιμοποιώντας οργανικούς διαλύτες όπως διχλωροαιθάνιο και χλωροφόρμιο έχουν ως αποτέλεσμα την ανάκτηση PHAs μεγάλης καθαρότητας. Ωστόσο μεγάλοι όγκοι τοξικών και πτητικών διαλυτών απαιτούνται γεγονός το οποίο αυξάνει το συνολικό κόστος των PHAs ενώ παράλληλα η χρήση τους έχει μεγάλες περιβαλλοντικές επιπτώσεις. Ως εναλλακτική λύση έχει προταθεί η χώνευση μη-ρηα κυτταρικών υλικών κάνοντας χρήση υποχλωριώδους άλατος. Ο συνδυασμός της προεπεξεργασίας της κυτταρικής βιομάζας με επιφανειοδραστικές ουσίες και της χώνευσης με υποχλωριώδες άλας έχει ως αποτέλεσμα την ανάκτηση πολυμερών υψηλής καθαρότητας και την μικρότερη υποβάθμιση του μοριακού βάρους του πολυμερούς. Επίσης έχουν αναπτυχθεί μέθοδοι ενζυμικής χώνευσης 93

128 οι οποίες όμως απαιτούν την χρήση υψηλού κόστους χημικών ουσιών και πολύπλοκων διαδικασιών (Choi & Lee, 1999). Πιο αποτελεσματική και οικονομική φαίνεται να είναι μια απλή μέθοδος χώνευσης κάνοντας χρήση χημικών χαμηλού κόστους. 94

129 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 3 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ Albuquerque M.G.E., Eiroa M., Torres C., Nunes B.R., Reis M.A.M. Strategies for the development of a side stream process for polyhydroxyalkanoate (PHA) production from sugar cane molasses. J.Biotechnol. 130, pp , Amara A. A. & Rehm B. H. A. Replacement of the catalytic nucleophile Cys-296 by serine in class II polyhydroxyalkanoate synthase from Pseudomonas aeruginosa- mediated synthesis of a new polyester: Identification of catalytic residues, Biochem. J. 374, pp , Antonio R. V., Steinbuchel A., Rehm B. H.A. Analysis of in vivo substrate specificity of the PHA synthase from Ralstonia eutropha: formation of novel copolyesters in recombinant Escherichia coli, FEMS Microbiol. Lett. 182, pp , Bengtsson S., Werker A., Christensson M., Welander T. Production of polyhydroxyalkanoates by activated sludge treating a paper mill wastewater. Bioresour. Technol. 99, pp , Bhubalan K., Lee W.H., Loo C.Y., Yamamoto T., Tsuge T., Doi Y., Sudesh K. Controlled biosynthesis and characterizationof poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3- hydroxyhexanoate) from mixture of palm kernel oil and 3HV-precursors. Polym. Degrad. Stab. 93, pp , Braunegg G., Lefebvre G., Genser K.F. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects. J. Biotecnol. 64, pp , Chanprattep S. Current trends in biodegradable polyhydroxyalkanoates. J. Biosci. Bioeng. 110, pp , Chen C.W., Don T.M., Yen H.F. Enzymatic extruded starch as a carbon source for the production of poly(3-hydroxybutyrete-co-3-hydroxyvalerate) by Haloferax mediterranei. Proc. Biochem. 41., pp , Choi J. & Lee S.Y. Factors affecting the economics of polyhydroxyalkanoate production by bacterial fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, pp , Coats E.R., Loge F.J., Wolcott M.P., Englund K., McDonald A.G. Synthesis of polyhydroxyalkanoates in municipal wastewater treatment. Water Environ. Res. 79, pp ,

130 Dennis D., McCoy M., Stangl A., Valentin H. E., Wu Z. Formation of poly(3-hydroxybutyrate-co- 3-hydroxyhexanoate) by PHA synthase from Ralstonia eutropha, J.Biotechnol. 64, pp , Dias J.M.L., Lemos P.C., Serafim L.S., Oliveira C., Eiroa M., Albuquerque M.G.E., Ramos A.M., Oliveira R., Reis M.A.M. Recent advances in polyhydroxyalkanoate production by mixed aerobic cultures: from the substrate to the final product. Macromol. Biosci. 6, pp , Dawes E.A., Senior P.J. The role and regulation of energy reserve polymers in microorganisms. Adv. Microb. Physiol. 10, pp Gerngross T.U. & Martin D.P. Enzyme-catalyzed synthesis of poly[(r)-(-)-3-hydroxybutyrate]: formation of macroscopic granules in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, pp , Haas R., Jin B., Zepf F.T. Production of poly(3-hydroxybutyrate) from waste potato starch. Biosci. Biotechnol. Biochem. 72 (1), pp , Hazenberg W., Witholt B. Effcient production of medium- chain-length poly(3- hydroxyalkanoates) from octane by Pseudomonas oleovorans: economic consideration. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48, pp , Jung K., Hazenberg W., Prieto M., Witholt B. Two-stage continuous process development for the production of medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoates). Biotechnol. Bioeng. 72 (1), pp , Kapritchkoff F.M., Viotti A.P., Alli R.C., Zuccolo M., Pradella J.G., Maiorano A.E., Miranda E.A., Bonomi A. Enzymatic recovery and purification of polyhydroxybutyrate produced by Ralstonia eutropha. J Biotechnol. 122(4), pp , Kek Y.K., Lee W.H., Sudesh K. Efficient bioconversion of palm acid oil and palm kernel acid oil to poly(3-hydroxybutyrate) by Cupriavidus necator. Can. J. Chem. 86, pp , Kellerhals M.B., Kessler B., Witholt B. Closed-loop control of bacterial high-cell-density fedbatch cultures: Production of mcl-phas by Pseudomonas putida KT2442 under singlesubstrate and cofeeding conditions. Biotechnol. Bioeng. 65 (3), pp ,

131 Kessler B., Weusthuis R., Witholt B., Eggink G. Production of microbial polyesters: Fermentation and downstream processes. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 71, pp , Khanna, S., Srivastava, A.K. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates. Process Biochem 40, pp , Kim B.Y., Lenz R.W. Polyesters from microorganisms. Adv. Bioch. Eng. Biotechnol. 71, pp , Koller M., Bona R., Chiellini E., Fernandes E.G., Horvat P., Kutschera C., Hesse P., Braunegg G. Polyhydroxyalkanoate production from whey by Pseudomonas hydrogenovora. Bioresour. Tecnol. 99 (11), pp , Lageveen R.G., Huisman G.W., Preusting H., Ketelaar P., Eggink G., Witholt B. Formation of polyesters by Pseudomonas oleovorans: effect of substrates on formation and composition of poly-(r)-3-hydroxyalkanoates and poly-(r)-3-hydroxyalkenoates. Appl. Environ. Microbiol. 54, pp , Lee S.Y., Chang H.N. Production of poly(3-hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia coli strains: genetic and fermentation studies. Can. J. Microbiol. 41, pp , Lee S.Y. Bacterial polyhydroxyalkanoates. Biotechnol. Bioeng. 49 (1), pp. 1-14, Lee SY. E. coli moves into the plastic age. Nat. Biotechnol. 15(1), pp , Lee S.Y., Choi J. Effect of fermentation performance on the economics of poly(3- hydroxybutyrate) production by Alcaligenes latus. Polymer Degrad. Stabil. 59, pp , Lee W.H., Loo C.Y., Nomura C.T., Sudesh K. Biosynthesis of polyhydroxyalkanoate copolymers from mixtures of plant oils and 3-hydroxyvalerate precursors. Bioresour. Technol. 99, pp , Liebergesell M., Schmidt B. and Steinbuchel A. Isolation and identification of granule-associated proteins relevant for poly(3-hydroxyalkanoic acid) biosynthesis in Chromatium vinosum enzyme, FEMS Microbiol. Lett. 78, pp , Linko S., Vaheri H. Production poly-b-hydroxybutyrate on lactic acid by Alcaligenes eutrophus H16 in a 3-l bioreactor. Enzyme Microbiol. Technol. 15, pp ,

132 Madison L.I. & Huisman G.W. Metabolic engineering of Poly (3-Hydroxyalkanoates): From DNA to Plastic. Microbiol. Molec. Biol. Rev. 63 (1), pp , Mato T., Ben M., Kennes C., Veiga M.C. PHA production using brewery wastewater. Proceedings of 4 th IWA (SBR4), 7-10 April, Rome, Italy, pp , McCool G. J. & Cannon, M. C. PhaC and PhaR are required for polyhydroxyalkanoic acid synthase activity in Bacillus megaterium, J.Bacteriol. 183, pp , Mothes G., Schnorpfeil C., Ackermann J.U. Production of PHB from crude glycerol. Eng. Life Sci. 7 (5), pp , Peoples O. P. & Sinskey A. J. Poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) biosynthesis Alcaligenes eutrophus H16. Identification and characterization of the PHB polymerase gene (phbc),. J. Biol. Chem. 264, pp , Qi Q. & Rehm B. H. A. Polyhydroxybutyrate biosynthesis in Caulobacter crescentus: molecular characterization of the polyhydroxybutyrate synthase. Microbiology 147, pp , Rehm B.H.A. Polyester synthases: natural catalysts for plastics, Biochem. J. 376, pp , Rehm B.H.A. Genetics and biochemistry of polyhydroxyalkanoate granule self-assembly: The jey role of polyester synthases. Biotechnol. Lett. 28, pp , Repaske R., Repaske A.C. Quantitative requirements for exponential growth of Alcaligenes eutrophus. Appl. Environ. Microbiol 32, pp , Ryu H.W., Hahn S.K., Chang Y.K., Chang H.N. Production of poly(3-hydroxybutyrate) by high cell density fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with phosphate limitation. Biotechnol. Bioeng. 55 (1), pp , Ryu H.W., Cho K.S., Lee E.G., Chang Y.K. Recovery of poly(3-hydroxybutyrate) from coangulated Ralstonia eutropha using a chemical digestion method. Biotechnol. Prog. 16 (4), pp , Salehizadeh H., van Loosdrecht M.C.M. Productio of polyhydroxyalkanoates by mixed culture: recent trends and biotechnological importance. Biotechnol. Adv. 22, pp ,

133 Schubert P., Steinbuchel A., Schlegel H. G. Cloning of the Alcaligenes eutrophus genes for synthesis of poly-beta-hydroxybutyric acid (PHB) and synthesis of PHB in Escherichia coli, J.Bacteriol. 170, pp , Serafim L.S., Torres C., Reis M.A.M., Ramos A.M. The influence of process parameters on the characteristics of polyhydroxyalkanoates produced by mixed cultures. Macromol. Biosci., pp , Shang L., Jiang M., Yun Zh., Yan H.Q., Chang H.N. Mass production of medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoates) from hydrolyzed corn oil by fed-batch culture of Pseudomonas putida. World J. Microbiol. Biotechnol. 24 (12), pp , Sim S.J., Snell K.D., Hogan S.A., Stubbe J., Rha C., Sinskey A.J. PHA synthase activity controls the molecular weight and polydispersity of polyhydroxybutyrate in vivo. Nat. Biotechnol. 15, pp , Slater S., Voige W., Dennis D. Cloning and expression in Escherichia coli of the Alcaligenes eutrophus H16 poly-beta-hydroxybutyrate biosynthetic pathway, J. Bacteriol. 170, pp , Slater S., Gallaher T., Dennis D. Production of poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) in a recombinant Escherichia coli strain, Appl. Environ. Microbiol. 58, pp , Solaiman D., Ashby R., Hotchkiss A., Foglia T. Biosynthesis of medium-chain-length poly(hydroxyalkanoates) from soy molasses. Biotechnol. Lett. 28, pp , Steinbuchel A., Lutke-Eversloh T. Metabolic engineering and pathway construction for biotechnological production of relevant polyhydroxyalkanoates in microorganisms. Biochem. Bioeng. J. 16, pp , Sudesh K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Prog. Polym. Sci., pp., , Sudesh K., Abe H. Practical guide to microbial polyhydroxyalkanoates. Edited by Smithers, Rapra,2010. Suriyamongkol P., Weselake R., Narine S., Moloney M., Shah S. Biotechnological approaches for the production of polyhydroxyalkanoates in microorganisms and plants-a review. Biotechol. Adv. 25, pp ,

134 van Wegen R.J., Ling Y., Middelberg A.P.J. Industrial pro- duction of polyhydroxyalkanoates using Escherichia coli: an economic analysis. Trans. IChemE. 76, pp , Verlinden R.A.J., Hill D.J., Kenward M.A., Williams C.D., Radecka I. Bacterial synthesis of biodegradable polyhydroxyalkanoates. Appl. Microbiol. J. 102(6), pp , Wang F., Lee S.Y. Poly(3-hydroxybutyrate) production with high polymer content by fed-batch culture of filamentation-supressed recombinant Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 63, pp , Ward A.C., Rowley B.I., Dawes E.A. Effect of nitrogen and oxygen limitation on poly-bhydroxybutyrate biosynthesis in ammonium-grown Azotobacter beijerinckii. J. Gen. Microbiol. 102, pp , Witholt B., Kessler B. Perspectives of medium chain length poly(hydroxyalkanoates), a versatile set of bacterial bioplastics. Curr. Opin. Biotechnol. 10 (3), pp , Yuan W., Jia Y., Tian J., Snell K. D., Muh U., Sinskey A. J., Lambalot R. H., Walsh C. T., Stubbe, J. Class I and III polyhydroxyalkanoate synthases from Ralstonia eutropha and Allochromatium vinosum: characterization and substrate specificity studies, Arch. Biochem. Biophys. 394, pp , Zinn M., Witholt B., Egli T. Occurrence, synthesis and medical application of bacterial polyhydroxyalkanoate. Adv. Drug. Deliv. Rev. 53, pp. 5-21,

135 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Παραγωγή PHAs από καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών Έχει ήδη αναφερθεί πως οι μικροοργανισμοί με την ικανότητα να συσσωρεύουν PHAs διακρίνονται σε δύο κατηγορίες ανάλογα με τις συνθήκες της καλλιέργειας που απαιτούνται για την σύνθεση των PHA. Η πρώτη ομάδα βακτηρίων απαιτεί τον περιορισμό ουσιών όπως αζώτου, φωσφόρου, μαγνησίου ή θείου στο θρεπτικό μέσο για την σύνθεση του PHA από μία πλούσια πηγή άνθρακα ενώ η δεύτερη ομάδα βακτηρίων, δεν απαιτεί τον περιορισμό κάποιας θρεπτικής ουσίας, όπως η πρώτη ομάδα, για την σύνθεση PHA και συσσωρεύουν πολυμερή κατά την διάρκεια της ανάπτυξής τους. Αυτά τα χαρακτηριστικά θα πρέπει να ληφθούν υπόψη για την επιλογή της στρατηγικής που θα ακολουθηθεί για την παραγωγή PHAs. Υψηλή παραγωγικότητα PHA μπορεί να επιτευχθεί μέσω συνεχούς ζύμωσης ή ζύμωσης στην οποία ανά διαστήματα παρέχεται θρεπτικό υλικό (αντιδραστήρες ημιδιαλείποντος έργου). Σε καλλιέργειες βακτηρίων που ανήκουν στην πρώτη ομάδα μία μέθοδος καλλιέργειας δύο βημάτων χρησιμοποιείται πολύ συχνά. H επιθυμητή συγκέντρωση βιομάζας εξασφαλίζεται χωρίς περιορισμό θρεπτικού υλικού στο πρώτο στάδιο ενώ στο δεύτερο στάδιο το θρεπτικό υλικό υπάρχει σε περιορισμένη συγκέντρωση καθιστώντας έτσι ικανή την σύνθεση των PHAs. Κατά την διάρκεια του δεύτερου σταδίου (περιορισμός θρεπτικού υλικού), η υπόλοιπη συγκέντρωση του κυττάρου (που ορίζεται ως η συγκέντρωση του κυττάρου μείον την συγκέντρωση του PHA), παραμένει σχεδόν σταθερή και η κυτταρική συγκέντρωση αυξάνεται μόνο εξαιτίας της ενδοκυτταρικής συσσώρευσης του PHA. Το A. eutrophus συσσωρεύει μεγάλη ποσότητα πολυμερούς (πάνω από το 80% του ξηρού κυτταρικού βάρους) όταν το άζωτο ή ο φώσφορος εξαντλούνται εντελώς (Kim, 1994). Ωστόσο τα άλλα βακτήρια της πρώτης ομάδας παράγουν PHA πιο αποτελεσματικά όταν τα στοιχεία αυτά βρίσκονται σε μικρή συγκέντρωση στο θρεπτικό μέσο και όχι εντελώς απόντα. Για την καλλιέργεια τέτοιων βακτηρίων, ένα μίγμα από πηγή άνθρακα και ενός θρεπτικού υλικού που βρίσκεται υπό 101

136 περιορισμό θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κατάλληλο λόγο έτσι ώστε να επιτευχθεί μεγάλη παραγωγή PHA. Για την καλλιέργεια βακτηρίων που ανήκουν στην δεύτερη ομάδα, μία στρατηγική τροφοδοσίας θρεπτικού υλικού είναι σημαντική για να εξασφαλιστεί υψηλή απόδοση PHAs. Πολύπλοκες πηγές τέτοιων υλικών όπως εμποτισμένο καλαμπόκι σε υδατικά διαλύματα, εκχύλισμα ζύμης ή πεπτόνη ψαριού μπορούν να προστεθούν για να προάγουν την ανάπτυξη του κυττάρου καθώς και την συγκέντρωση των πολυμερών αφού η σύνθεση του PHA είναι ανεξάρτητη του περιορισμού θρεπτικού υλικού σε αυτά τα βακτήρια. Η κυτταρική ανάπτυξη και η συσσώρευση του PHA πρέπει να είναι ισορροπημένη για να αποφευχθεί ατελής συσσώρευση του PHA ή πρόωρος τερματισμός της ζύμωσης σε χαμηλή κυτταρική συγκέντρωση. Η επιλογή των μικροοργανισμών για την παραγωγή του PHA βασίζεται σε διάφορους παράγοντες συμπεριλαμβάνοντας την ικανότητα του κυττάρου να μην χρειάζεται ακριβές πηγές άνθρακα για την ανάπτυξη του, τον βαθμό και ρυθμό ανάπτυξης του, τον βαθμό πολυμερισμού, και την μέγιστη δυνατή ποσότητα συσσώρευσης του πολυμερούς. Προκαταρκτικός υπολογισμός για την πρόβλεψη της απόδοσης PHA μπορεί να γίνει με την βοήθεια εξισώσεων (Yamane, 1993) και μαθηματικών μοντέλων Οδοί βιοσύνθεσης των PHAs σε καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών σήμερα. Συνολικά τέσσερα διαφορετικά μονοπάτια για την σύνθεση των PHAs έχουν βρεθεί μέχρι Βιοσυνθετικό μονοπάτι στο βακτήριο Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) Στο βακτήριο Ralstonia eutropha ο μεταβολισμός των υδατανθράκων οδηγεί στην βιοσύνθεση των PHAs. Τα κύρια βήματα της σύνθεσης του PHA είναι τα εξής: η β-κετοθιολάση (ή αλλιώς 3-κετοθιολάση) επιτυγχάνει την συμπύκνωση δύο μορίων του AcCoA σε ακετοακέτυλο-coa. Έπειτα μία NADPH-εξαρτώμενη αφυδρογονάση ή αναγωγάση του ακετοακέτυλο-coa φέρνει σε πέρας την μετατροπή του σε 3-υδροξυβούτυρυλο-CoA. Το τρίτο 102

137 και τελευταίο βήμα είναι η πολυμερική αντίδραση που καταλύεται από το ένζυμο PHB πολυμεράση (σχήμα 4.1) (Anderson & Dawes, 1990). Σάκχαρα ΡΗΑ-σύνθεση ΡΗΑ-υποβάθμιση ακετυλο-coa 1 ακετο-accoa 2 (R)-3-υδροξυβουτυρυλο-CoA 3 Ρ(3ΗΒ) 4 7 ακετοξικό οξύ 6 (R)-3-υδροξυβουτυρικό 5 Ένζυμα που καταλύουν τις αντιδράσεις: 1. β-κετοθειολάση 2. ακετο-accoa αναγωγάση 3. ΡΗΑ πολυμεράση 4. ΡΗΑ αποπολυμεράση 5. διμερές υδρολάσης 6. (R)-3-υδροξυβουτυρική αφυδρογονάση 7. ακετο-accoa συνθετάση Σχήμα 4.1. Βιοσύνθεση PHAs από σάκχαρα στο βακτήριο Ralstonia eutropha (Μεταβολικό μονοπάτι Ι) (Cevallos et al., 1996). Βιοσυνθετικό μονοπάτι στο βακτήριο Rhodopseudomonas rubrum Αυτή είναι η δεύτερη μεταβολική οδός (σχήμα 4.2), η οποία παρατηρείται στον μικροοργανισμό Rhodopseudomonas rubrum. Στον μικροοργανισμό αυτό η β-οξείδωση των λιπαρών οξέων οδηγεί στην ΡΗΑ-βιοσύνθεση. Η πρώτη αντίδραση παραμένει η ίδια όπως στο στέλεχος Ralstonia eutropha και οδηγεί στον σχηματισμό του ακετοακέτυλο-coa μέσω συμπύκνωσης δύο μορίων AcCoA από το ένζυμο β-κετοθειολάση. Το δεύτερο αυτό μονοπάτι έπειτα διαφοροποιείται καθώς το ακετοακέτυλο-coa ανάγεται από μία NADPH-εξαρτώμενη αναγωγάση σε L-(+)-3-υδροξυβουτυρυλο-CoA. Το τελικό βήμα αφορά την μετατροπή του L-(+)- 3-υδροξυβουτυρυλο-CoA σε D-(-)-3-υδροξυβουτυρυλο-CoΑ μέσω της δράσης δύο μορίων ενοϋλο-coa υδατάσης. 103

138 Σχήμα 4.2. Βιοσύνθεση PHAs από λιπαρά οξέα στο βακτήριο R. rubrum (Μεταβολικό μονοπάτι ΙΙ) (Sudesh et al., 2000). Βιοσυνθετικό μονοπάτι στα βακτήρια του γένους Pseudomonas της ομόλογης ομάδας Ι Ένας τρίτος τύπος βιοσυνθετικής πορείας βρίσκεται στα περισσότερα στελέχη του γένους Pseudomonas που ανήκουν στην rrna ομόλογη ομάδα I. Για παράδειγμα τo P.oleovorans και κάποια άλλα είδη του Pseudomonas συσσωρεύουν PHA και ειδικά mcl-phas όταν τα κύτταρα καλλιεργούνται σε θρεπτικό μέσο που εμπεριέχει ως πηγή άνθρακα αλκάνια ή αλκανοϊκά οξέα μέσω της β-οξείδωσης (de Smet, 1983). Βιοσυνθετικό μονοπάτι στα βακτήρια του γένους Pseudomonas της ομόλογης ομάδας IΙ Ο τέταρτος τύπος της πορείας βιοσύνθεσης του PHA αφορά όλα σχεδόν τα είδη Pseudomonas που ανήκουν στην ομόλογη ομάδα rrna II. Η ΡΗΑ σύνθεση είναι αποτέλεσμα της σύνθεσης εκ νέου λιπαρών οξέων (de novo fatty acid synthesis) κατά την οποία παράγονται συμπολυμερή mcl-phas από το AcCoA (σχήμα 4.3.). 104

139 Σάκχαρα Γλυκόλυση ακετυλο-coa 1 μηλονυλο-coa Ένζυμα που καταλύουν τις αντιδράσεις: 2 μηλονυλο-acρ κετοακυλο-ACΡ 4 (R)-3-υδροξυακυλο-ACΡ 8 5 ακυλο-acρ 6 ενοϋλο-acρ 1. ακετυλο-coa καρβοξυλάση 2. μηλονυλο-acρ τρανσφεράση 3. 3-κετοακυλο-ACP συνθετάση 4. 3-κετοακυλο-ACΡ αναγωγάση 5. 3-υδροξυακυλο-ACΡ αναγωγάση 6. ενοϋλο-acρ αναγωγάση 7. 3-κετοακυλο-ACP συνθετάση 8. 3-υδροξυακυλο-ACP-CoA τρανσφεράση 9. ΡΗΒ πολυμεράση (R)-3-υδροξυακυλο-CοA 9 Ρ(3ΗΒ) Σχήμα 4.3. Βιοσύνθεση PHAs στα βακτήρια του γένους Pseudomonas της ομόλογης ομάδας ΙΙ (Μεταβολικό μονοπάτι IV) (Rehm et al., 2001) Παραγωγή PHAs από φυσικούς μικροοργανισμούς Παραγωγή PHAs από το βακτήριο Alcaligenes eutrophus Το Alcaligenes eutrophus ή αλλιώς Ralstonia eutropha το οποίο έχει τώρα μετονομαστεί σε Cupriavidus necator, είναι το βακτήριο που έχει μελετηθεί πιο πολύ από όλα λόγω της ικανότητας του να συσσωρεύει μεγάλες ποσότητες PHB από απλές πηγές άνθρακα όπως για παράδειγμα γλυκόζη, φρουκτόζη και οξικό οξύ. Αρκετές χημικές βιομηχανίες παράγουν PHB από γλυκόζη σε μεγάλη κλίμακα καθώς και το συμπολυμερές P(3HB-3HV) από μίγμα γλυκόζης και προπιονικού οξέος μέσω του βακτηρίου A. eutrophus σε αντιδραστήρες ημιδιαλείποντος έργου. Αρχικά τα κύτταρα αναπτύσσονται σε θρεπτικό μέσο γλυκόζης και αλάτων που περιέχουν συγκεκριμένες ποσότητες φωσφόρου έτσι ώστε να γίνει κυτταρική αύξηση στον επιθυμητό βαθμό. Έπειτα από 60 ώρες τα βακτήρια 105

140 αντιμετωπίζουν συνθήκες έλλειψης φωσφόρου και κατά την διάρκεια των επόμενων ωρών από την προμήθεια της γλυκόζης συσσωρεύεται PHB. Το P(3HB-co-3HV) παράγεται παρομοίως. Η μόνη διαφορά βρίσκεται στο ότι τόσο η γλυκόζη όσο και το προπιονικό οξύ παρέχονται στα κύτταρα κατά την φάση της συσσώρευσης των πολυμερών. Γενικά τέτοια συμπολυμερή περιέχουν από 0-30% 3-υδροξυβαλερικό εστέρα (3HV) και αυτό το ποσοστό μπορεί να ελεγχθεί γιατί εξαρτάται από τον λόγο γλυκόζης και προπιονικού οξέος που παρέχεται στην καλλιέργεια (Byrom, 1987; 1992). Συμπολυμερή με πάνω από 90% 3HV μπορούν να παραχθούν παρέχοντας βουτυρικά και πεντανικά οξέα σαν υπόστρωμα αλλά δεν έχει επιχειρηθεί παραγωγή σε βιομηχανική κλίμακα (Doi et al., 1987). Αρκετές στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί από ερευνητές για την αποτελεσματική παραγωγή PHA χρησιμοποιώντας το A. eutrophus. Ελέγχοντας την συγκέντρωση της γλυκόζης στα g/l κατά την διάρκεια του πειράματος, χρησιμοποιώντας αντιδραστήρα ημιδιαλείποντος έργου, η τελική κυτταρική μάζα, η συγκέντρωση του P(3HB) και το ποσοστό του P(3HB) παίρνουν τις τιμές 164 g/l, 121 g/l και 76% αντίστοιχα έπειτα από 50 ώρες. Αυτό έχει σαν απόρροια την μέγιστη παραγωγικότητα των 2.42 g P(3HB)/h l.με την ίδια στρατηγική καλλιέργειας παράγονται περισσότερα από 110 g/l P(3HB-co-3HV) με την βοήθεια γλυκόζης και προπιονικού οξέος (Kim et al., 1994). Επίσης διαφορετικές πηγές άνθρακα, εκτός της γλυκόζης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν υποστρώματα για την παραγωγή PHA στο A. eutrophus. Παρατηρήθηκε πως όταν αιθανόλη χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα για την δημιουργία P(3HB) από ένα μεταλλαγμένο στέλεχος A. eutrophus, η μέγιστη συγκέντρωση είναι 47 g/l (Alderete et al., 1993). P(3HB-co- 3HV) επίσης παράγεται από αιθανόλη, προπανόλη ή πεντανόλη. Ακόμα, έχει αναφερθεί παραγωγή 32.5 g PHB/L σε αντιδραστήρα ημιδιαλείποντος έργου μέσα σε 60 ώρες χρησιμοποιώντας έλαια φυτών (Eggink et al., 1993). PHB μπορεί να συσσωρευτεί στο στέλεχος A. eutrophus DSM11348 που καταναλώνει γλυκερίνη και προϊόντα υδρόλυσης σαν πηγές άνθρακα και αζώτου αντίστοιχα (Bormann & Roth, 1999). Επιπρόσθετα στα υποστρώματα που αναφέρθηκαν παραπάνω, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και πιο ειδικές πηγές άνθρακα όπως 4-υδροξυβουτυρικό οξύ, γ-βουτυρολακτικό οξύ και 1,4-βουτανοδιόλη με σκοπό να αυξηθεί το ποσοστό 4HB ομάδων σε σχέση τις 3HB ομάδες στο συμπολυμερές Ρ(3ΗΒ-co-4ΗΒ) (Doi κ.ά., 106

141 1990). Ακόμα είναι δυνατή η παραγωγή συμπολυμερούς που αποτελείται από τρείς μονομερικές ομάδες, του πολύ-(3-υδροξυβουτυρικού-3-υδροξυβαλερικού-3- υδροξυεπτανοϊκού) εστέρα Ρ(3HB-co-3HV-co-3HHp) από αλκανοϊκά οξέα με διαφορετικό αριθμό ατόμων άνθρακα από ανασυνδυασμένο στέλεχος του A. eutrophus το οποίο εμπεριέχει το γονίδιο της PHA-πολυμεράσης του βακτηρίου Aeromonas caviae (Fukui et al., 1987). Χρησιμοποιώντας το παραπάνω ανασυνδυασμένο βακτήριο και σογιέλαιο σαν πηγή άνθρακα επιτυγχάνεται μεγάλη παραγωγή του συμπολυμερούς P(3HB-co-5mol% 3HHx). Τα R. eutropha H16 και P. οleovorans είναι ικανά να χρησιμοποιούν έλαια που παραμένουν από την παραγωγή ραμνόζης ως κύρια πηγή άνθρακα για την ανάπτυξη και συσσώρευση PHAs. Περίπου το 20-25% από αυτά τα έλαια μετατρέπονται σε PHA. Οι αντίστοιχες αποδόσεις είναι 41.3 και 38.9% της ξηρής κυτταρικής τους μάζας (Fuechtenbusch et al., 2000). Ένα άλλο υπόστρωμα που έχει χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη του R.eutropha ATCC17697 είναι το μίγμα L-γαλακτικού και οξικού οξέος. Οι συγκεντρώσεις γαλακτικού και οξικού οξέος στο θρεπτικό μέσο ελέγχονταν γεγονός που αντικατοπτρίζεται στη μεταβολή των τιμών του ph στην καλλιέργεια. Μετά από 42 ώρες η συγκέντρωση του PHB στο κύτταρο είχε την τιμή 75 g/l και αποτελούσε το 73.1% του ξηρού κυτταρικού βάρους. Η μέγιστη παραγωγικότητα του ήταν 1.30 g/h l (Tsuje et al., 2001). PHB παράγεται επίσης από συν-καλλιέργειες βακτηρίων στις οποίες σάκχαρα όπως γλυκόζη μετατρέπονται σε γαλακτικό οξύ από το βακτήριο Lactobacillus delbrueckii IAM 1928 και με την σειρά του το γαλακτικό οξύ μετατρέπεται σε PHB από το βακτήριο R. eutropha Η16 στον ίδιο ζυμωτή (Tohyama et al., 1999; 2000). Μέχρι σήμερα έχουν προταθεί κάποια μαθηματικά μοντέλα για την περιγραφή της δυναμικής συμπεριφοράς των καλλιεργειών αυτών (Katoh et al., 1999). Αυτά τα μοντέλα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για σκοπούς όπως έλεγχο, διάκριση και κατανόηση των βασικών βιοχημικών διεργασιών κάτω από δυναμικές συνθήκες ανάπτυξης των καλλιεργειών. 107

142 Παραγωγή PHAs από τα βακτήρια Alcaligenes latus και Azotobacter vinelandii Το βακτήριο A. latus παράγει PHB από φθηνές πηγές άνθρακα, όπως γλυκόζη και σακχαρόζη. Για παράδειγμα τo A. latus DSM 1123 είναι ικανό να αναπτυχθεί και να συσσωρεύσει PHB στους 35 ο C. Αυτό το στέλεχος χρειάζεται μόνο 5 ώρες για να συσσωρεύσει ενδοκυτταρικά PHB σε ποσοστό 80% επί της ξηρής κυτταρικής μάζας. Η συγκέντρωση PHB γίνεται ταυτόχρονα με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού, σε αντιδραστήρα ημιδιαλείποντος έργου, και αυξάνεται από 50 σε 87% εξαιτίας του περιορισμού θρεπτικού υλικού. Στελέχη του βακτηρίου A. latus μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να παράγουν PHB από μελάσες ή από εκχύλισμα σακχάρων. Σε αντιδραστήρα ημιδιαλείποντος έργου καλλιέργεια του βακτηρίου A. latus ATCC παράγει PHB σε ποσοστό 63% έπειτα από 93 ώρες. Ο συντελεστής μέσης απόδοσης βιομάζας προς γλυκόζη ήταν περίπου 0.4 Kg/Kg. Τέσσερις πηγές θρεπτικού υλικού χλωριούχο αμμώνιο, θειικό αμμώνιο, νιτρικό αμμώνιο και ουρία χρησιμοποιήθηκαν και βρέθηκε ότι μόνο τα πρώτα δύο ήταν υπεύθυνα για την ανάπτυξη των κυττάρων και την παραγωγή PHB. Η ζύμωση με το ίδιο βακτήριο είχε σαν αποτέλεσμα μεγαλύτερο ρυθμό ανάπτυξης, h -1, σε σύγκριση με την τιμή h -1 κάτω από συνθήκες σταθερού ph σε αντιδραστήρα ημιδιαλείποντος έργου (Grothe, 2000). Η μέγιστη παραγωγικότητα σε PHB ήταν 1.15 g/h l. Ένα μεταλλαγμένο στέλεχος του A. vinelandii, που ονομάζεται A. vinelandii UWD, θεωρείται καλός παραγωγός P(3HB) αφού σε αυτό το στέλεχος το πολυμερές συσσωρεύεται σε ποσοστό 75% επί της ξηρής κυτταρικής μάζας του κατά την διάρκεια της ανάπτυξής του. Ακόμα έχει ερευνηθεί η περίπτωση χρήσης διαφόρων πολύπλοκων υποστρωμάτων για την σύνθεση P(3HB). Χρησιμοποιώντας αυτά παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση P(3HB) ήταν 25 φορές μεγαλύτερη από εκείνη που επιτυγχάνεται με υπόστρωμα γλυκόζης. Περίπου 32 g/l P(3HB) παράχθηκαν μετά από 42 ώρες χρησιμοποιώντας αντιδραστήρα ημιδιαλείποντος έργου με σχετικά καλή απόδοση της τάξεως των 0.34 g P(3HB)/g γλυκόζης. 108

143 Παραγωγή PHAs από μεθυλότροφα βακτήρια Το κόστος της παραγωγής των βιοαποικοδομήσιμων πλαστικών μπορεί να μειωθεί εάν χρησιμοποιηθεί μεθανόλη ως θρεπτικό υλικό για την ανάπτυξη και την παραγωγή PHB. Η μεθανόλη είναι ένα από τα πιο φτηνά υποστρώματα που υπάρχουν. Ωστόσο το ποσοστό συγκέντρωσης του PHB δεν είναι ικανοποιητικό και το γεγονός αυτό κάνει την διαδικασία της ανάκτησης δύσκολη. Έτσι οι εταιρίες έχουν εγκαταλείψει αυτή τη μέθοδο παραγωγής. Από την άλλη μεριά οι ερευνητές προσπαθούν να αναπτύξουν μεθόδους παραγωγής όπου θα χρησιμοποιείται μεθανόλη ούτως ώστε να επιτευχθεί μια αρκετά οικονομική διαδικασία παραγωγής. Βρέθηκε ότι μία πολύ υψηλή συγκέντρωση (149 g/l) P(3HB) επιτεύχθηκε μέσω μίας εντελώς αυτόματης διεργασίας σε αντιδραστήρα ημιδιαλείποντος έργου χρησιμοποιώντας το βακτήριο Protomonas extorquens και μεθανόλη ως πηγή άνθρακα. Για να επιτευχθεί όμως αυτή η συγκέντρωση πέρασαν 170 ώρες και αυτό είχε σαν αποτέλεσμα την χαμηλή παραγωγικότητα των 0.88 g P(3HB)/L-h (Suzuki et al., 1986). Με τον συνδυασμό μεθανόλης και n-αμυλικής αλκοόλης παράγεται το συμπολυμερές P(3HB-co-3HV). Γενικά, τα ποσοστά PHAs στα μεθυλότροφα βακτήρια κυμαίνονται στο 50-60% της ξηρής κυτταρικής τους μάζας, το οποίο πρέπει να αυξηθεί για να είναι αποδοτική η ανάκτηση των πολυμερών. Τέλος το προνόμιο παραγωγής PHAs από φτηνά υποστρώματα μεθανόλης θα ληφθεί υπ όψιν όταν η παραγωγικότητα αυξηθεί τουλάχιστον στο διπλάσιο Παραγωγή PHAs από βακτήρια του γένους Pseudomonas Τα mcl-phas συντίθενται στο P. οleovorans από mcl-αλκάνια και αλκανοϊκά οξέα. Έχει ερευνηθεί η παραγωγή mcl-phas από συνεχή και ημι-διαλείποντος έργου καλλιέργεια για να επιτευχθούν υψηλές συγκεντρώσεις βιομάζας και υψηλές παραγωγικότητες σε PHAs. Ελέγχοντας τις συνθήκες καλλιέργειας, τιμές κυτταρικής συγκέντρωσης 11.6 g/l και παραγωγικότητας P(3HHx-co-3HO) 0.58 g/h l επιτεύχθηκαν με συνεχή καλλιέργεια (Preusting et al., 1993a). Χρησιμοποιώντας βιοαντιδραστήρα ημιδιαλείποντος έργου που είναι ειδικά σχεδιασμένος για μεταφορά υψηλής ποσότητας οξυγόνου η κυτταρική μάζα, η συγκέντρωση P(3HHx-co-3HO) και η παραγωγικότητα του PHA παίρνουν τις τιμές 37.1 g/l, 12.1 g/l και 0.32 g 109

144 PHA/L-h αντίστοιχα οι οποίες παρατηρήθηκαν μετά από 38 ώρες καλλιέργειας. Για οικονομική παραγωγή mcl-phas από το P. οleovorans απαιτείται βελτίωση των μεθόδων. Η συνεχής καλλιέργεια είναι μία καλή στρατηγική για υψηλή παραγωγικότητα mcl-phas. Το P. οleovorans NRRL B-778 συγκεντρώνει στα κύτταρα του PHB και mcl-phas όταν αναπτύσσεται σε γλυκόζη και οκτανοϊκό οξύ ενώ το συμπολυμερές P(3HB-3HV) παράγεται κατά την διάρκεια ανάπτυξης του κυττάρου σε εννεανοϊκό οξύ (Ashby et al., 2002). Ο σχηματισμός ενδοκυτταρικών PHA στο P. oleovorans γίνεται μέσω n-αλκανοϊκών οξέων. Όμως σε αυτήν την περίπτωση παραγωγή PHA παρατηρήθηκε μόνο για εξανοϊκά και περισσοτέρων ανθράκων n-αλκανοϊκά οξέα [Brandl et al., 1988]. Η ίδια καλλιέργεια έχει αναφερθεί ότι μπορεί να κάνει χρήση χημικά ετερογενών, χαμηλού βαθμού υγροποίησης, προϊόντων σαν πηγή άνθρακα και έτσι παράγονται ποικίλα PHAs όπως 3-υδροξυεξανοϊκοί (P3HHx), 3-υδροξυδεκανοϊκοί P(3HD) και 3- υδροξυδωδεκανοϊκοί Ρ(3HDd) εστέρες. Tο στέλεχος Pseudomonas stutzeri 1317 φαίνεται να συνθέτει ποικίλα PHAs με την βοήθεια γλυκόζης και/ή λιπαρών οξέων (He et al., 1998). Επίσης βρέθηκε ότι η δομή της μονομερικής ομάδας στα PHAs εξαρτάται από τις δομές των λιπαρών οξέων που χρησιμοποιούνται. Συνεπώς ελέγχοντας τον τύπο και την ποσότητα των λιπαρών οξέων που δίνονται ως πηγή άνθρακα στους μικροοργανισμούς γίνεται δυνατή η παραγωγή PHAs με τις επιθυμητές δομές. Τα γονίδια που κωδικοποιούν την αναγωγάση του AcCoA και την PHA-πολυμεράση στο βακτήριο R. eutropha εκφράστηκαν στο E. coli και στα βακτήρια Pseudomonas putida. Στο E.coli με ανάπτυξη σε λιπαρά οξέα συσσωρεύτηκε PHB. Στο P. putida συσσωρεύεται το πολυμερές πολυ-(3-υδροξυβουτυρικό-3-υδροξυεξανικό οξύ) [P(3HB-co-3HΗx)] όταν σαν πηγή άνθρακα παρέχονται λιπαρά οξέα που αποτελούνται από άτομα άνθρακα μονού αριθμού και P(3HB-co-3HV) όταν παρέχονται λιπαρά οξέα με ζυγό αριθμό ατόμων άνθρακα. 110

145 4.3. Παραγωγή PHAs από γενετικά ανασυνδυασμένα στελέχη μικροοργανισμών Τα φυσικά βακτήρια που παράγουν ΡHAs χαρακτηρίζονται από μεγάλους χρόνους ζωής και σχετικά χαμηλή βέλτιστη θερμοκρασία αύξησης. Αυτά τα βακτήρια είναι συχνά δύσκολο να λυθούν ενώ, επιπλέον λειτουργούν με βάση μεταβολικά μονοπάτια τα οποία περιλαμβάνουν και υποβάθμιση των PHAs. Βακτήρια όπως το Ε. coli δεν έχουν την ικανότητα να συνθέτουν ή να αποδομούν PHAs. Ωστόσο το Ε. coli αναπτύσσεται γρήγορα, ακόμη και σε υψηλές θερμοκρασίες και είναι εύκολο να λυθεί. Η γρήγορη ανάπτυξη θα του επέτρεπε την συσσώρευση PHAs σε μεγάλες ποσότητες. Επίσης η εύκολη λύση των κυττάρων θα μείωνε αρκετά το κόστος κατά το στάδιο της ανάκτησης των κόκκων PHA (Steinbcuchel & Schlegel, 1991; Wang & Bakken, 1998; Madison & Huisman, 1999). Έρευνες πραγματοποιούνται για την εισαγωγή νέων μεταβολικών οδών ούτως ώστε να διευρυνθούν οι τύποι των υποστρωμάτων, για να ενισχυθεί η σύνθεση και η παραγωγή νέων PHAs. Ανασυνδυασμένα στελέχη του Ε. coli τα οποία περιέχουν τα βιοσυνθετικά PHA γονίδια έχουν αναπτυχθεί και έχουν χρησιμοποιηθεί για να επιτευχθεί υψηλή παραγωγικότητα σε PHAs (Lee et al., 1994; Zhang et al., 1994). Δεδομένου ότι το Ε. coli μπορεί να χρησιμοποιήσει διάφορες πηγές άνθρακα όπως γλυκόζη, σακχαρόζη, λακτόζη και ξυλόζη το επόμενο βήμα για μείωση του κόστους παραγωγής των PHAs είναι η χρήση φτηνών υποστρωμάτων όπως μελάσες, ορρός τυρογάλακτος και υδρόλυμα ημικυτταρίνης (Lee et al., 1995). Αυτή η τεχνική μπορεί να επεκταθεί ουσιαστικά σε οποιοδήποτε μικροοργανισμό εάν παρουσιάζει μεταβολικά πλεονεκτήματα συγκριτικά με τους μικροοργανισμούς εκείνους που χρησιμοποιούνται σήμερα. Η έκφραση των βιοσυνθετικών PHA γονιδίων του Α. eutrophus στο Ρseudomonas oleovorans (που συνθέτει μόνο mcl-phas), έχει επιτρέψει την παραγωγή ενός μίγματος P(3HB) και mcl-phas (Preusting et al., 1993b). Δύο μέθοδοι μπορούν να υιοθετηθούν για την ανάπτυξη βακτηριακών στελεχών που παράγουν PHAs από φθηνά υποστρώματα άνθρακα. Καταρχήν τα γονίδια αξιοποίησης υποστρωμάτων μπορούν να εισαχθούν στους PHA-παραγωγούς και δεύτερον, τα βιοσυνθετικά PHA γονίδια μπορούν να εισαχθούν σε μη-pha παραγωγούς, που μπορούν να 111

146 χρησιμοποιήσουν τα φτηνά υποστρώματα. Προς το παρόν, η δεύτερη προσέγγιση φαίνεται να είναι περισσότερο υποσχόμενη (Khanna & Srivastava, 2005). Η σύνθεση PHB στο ανασυνδυασμένο E. coli δεν απαιτεί περιορισμό συγκεκριμένου θρεπτικού συστατικού αλλά εξαρτάται από την ποσότητα του AcCoΑ που είναι διαθέσιμη. Στα πλεονεκτήματα της χρήσης του E. coli για την παραγωγή PHAs περιλαμβάνονται η γρήγορη ανάπτυξη, η υψηλή κυτταρική πυκνότητα, η ικανότητα τροφοδοσίας του με φτηνές πηγές άνθρακα και η εύκολη ανάκτηση των παραγόμενων πολυμερών. Το E. coli θα συνεχίσει να κατέχει σημαντικό ρόλο στον καθορισμό των μηχανισμών σύνθεσης PHAs λόγω του μεγάλου εύρους πληροφοριών σχετικά με την γενετική του και την μεταβολική πορεία της σύνθεσης των PHAs. Η παραγωγή PHA από το ανασυνδυασμένο E. coli, το οποίο εμπεριέχει τα γονίδια βιοσύνθεσης PHA του A. eutrophus, έχει ερευνηθεί (Kim et al., 1992). Η συγκέντρωση PHB σε αυτό μπορεί να φτάσει το 80-90% επί της ξηρής κυτταρικής μάζας στο τέλος της ζύμωσης. Συγκέντρωση πάνω από 80 g/l και παραγωγικότητα μεγαλύτερη από 2 g/h l επιτυγχάνεται με καλλιέργεια του ανασυνδυασμένου E. Coli σε αντιδραστήρα ημιδιαλείποντος έργου. Ωστόσο αποτελεί πρόβλημα η απαίτηση υψηλής ποσότητας οξυγόνου κατά την διάρκεια της ζύμωσης και αυτό θα πρέπει να διευθετηθεί έτσι ώστε αυτή η μέθοδος να είναι πιο οικονομική και να αντικαταστήσει αυτές που ήδη χρησιμοποιούνται. Τέλος, ένας σημαντικός παράγοντας για να είναι ικανοποιητικό το ποσοστό παραγωγής PHA είναι η εκλογή του κατάλληλου στελέχους E. coli το οποίο θα φιλοξενήσει τα γονίδια διαφόρων άλλων βακτηρίων. Ως πηγές άνθρακα μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν μελάσες για την παραγωγή PHB από το ανασυνδυασμένο στέλεχος E. coli HMS174/pTZ18u-PHB που περιέχει το πλασμίδιο TZ18u-PHB (το οποίο μεταφέρει τα PHB βιοσυνθετικά γονίδια του βακτηρίου Α. eutrophus). Το τελικό ξηρό κυτταρικό βάρος και το ποσοστό του PHB έχουν τις τιμές 39.5 g/l και 80% (w/w) έπειτα από 35 ώρες ζύμωσης. Το ανασυνδυασμένο στέλεχος E. coli XL1-Blue, στο οποίο έχει εισαχθεί το πλασμίδιο pksse5.3, παράγει Ρ(4ΗΒ) κάνοντας χρήση γλυκόζης (Song, 1999). Έπειτα από 60 ώρες ζύμωσης σε αντιδραστήρα ημιδιαλείποντος έργου και συνθήκες σταθερού ph οι τιμές ξηρού κυτταρικού βάρους και συγκέντρωσης P(4HB) είναι 12.6 και 4.4 g/l αντίστοιχα. Ένα ακόμα ανασυνδυασμένο στέλεχος E. coli το οποίο περιέχει τα PHA 112

147 βιοσυνθετικά γονίδια του Aeromonas παράγει ένα συμπολυμερές που αποτελείται από τρείς μονομερικές ομάδες, το P(3HB-co-3HV-co-3HHx) καταναλώνοντας δωδεκανοϊκό οξύ και λιπαρά οξέα με μονό αριθμό ανθράκων. Έχει επίσης αναφερθεί ότι ένα ανασυνδυασμένο E. coli παράγει P(3HB-co-4HB) από μίγματα υποστρωμάτων που περιέχουν γλυκόζη. Αυτό επιτεύχθηκε εισάγοντας στο E. coli DH5a ξεχωριστά πλασμίδια που εμπερικλείουν τα γονίδια της PHA βιοσύνθεσης από το R. eutropha και τα γονίδια αποικοδόμησης από το Clostridium kluyveri. Με τον τρόπο αυτό συσσωρεύτηκε P(3HB-co-4HB) σε ποσοστό περίπου 50% επί του ξηρού κυτταρικού βάρους και περιείχε πάνω από 2.8 mol% 4-υδροξυβουτυρικό οξύ (4HB). Η ανάπτυξη του ανασυνδυασμένου E. coli για την παραγωγή P(3HB) από σακχαρόζη είναι επίσης δυνατή. Το συμπολυμερές P(3HB-co-3HV) που αποτελείται από 40 mol% 3-υδροξυβαλερικό οξύ μπορεί να παραχθεί από γλυκόζη και προπιονικό οξύ χρησιμοποιώντας ένα μεταλλαγμένο στέλεχος του E. coli. Ωστόσο δεν έχει παρατηρηθεί μεγάλη συγκέντρωση συμπολυμερούς μέσω του E. Coli σε αντιδραστήρα διαλείποντος έργου. Επιπρόσθετα, πέραν των προαναφερθέντων μικροοργανισμών η παραγωγή ΡΗΒ έχει επιτευχθεί και μέσω των ανασυνδυασμένων βακτηρίων Thiosphaera pantotropha, Caulobacter crescentus DSM 4727, Azotobacter sp. FA8, Synechococcus sp. MA19, Synechocystis sp. PCC6803, Rhodopseudomonas palustris 42OL, Bacillus cereus UW85, Zoogloea sp. Z5-GII, M. extorquens P14, Methylobacterium rhodesianum MB 126, Bacillus mycoides RLJ B-017, Azospirillum brasilense, Americoccus kaplicenses. Ωστόσο για κανέναν από τους μικροοργανισμούς αυτούς δεν έχει αναφερθεί παραγωγή ΡΗΒ σε μεγάλη κλίμακα (Khanna & Srivastava, 2005). 113

148 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 4 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ Alderete J.E, Karl D.W., Park C.H., Production of poly-(hydroxybutyrate) homopolymer and copolymer from ethanol and propanol in a fed batch culture, Biotechnol. Prog. 9, pp , Anderson A.J., Dawes E.A. Occurrence, metabolism, metabolic role and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiol. Rev. 54 (4), pp , Ashby R.D., Solaiman D.K.Y., Foglia T.A., The synthesis of short and medium-chain-length poly(hydroxyalkanoates) mixtures from glucose- or alkanoic acid-growth Pseudomonas oleovorans. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28, pp , Bormann E., Roth M., The production of polyhydroxy-butyrate by Methylobacterium rhodesianum and Ralstonia eutropha in media containing glycerol and casein hydrolysates. Biotechnol. Lett. 21, pp , Brandl H., Lenz R.W., Cross R.A., Fuller R.C., Pseudomonas oleovorans as a source of poly(βhydroxyalkanoates) for potential applications as biodegradable polyesters, Appl. Environ. Microbiol. 54, pp , Byrom D., Polymer synthesis by microorganisms: technology and economics, TIBTECH 5, pp , Byrom D., Production of poly-β-hydroxybutyrate: poly-β-hydroxyvalerate copolymers, FEMS Microbiol. Rev. 103, pp , Cevallos M.A., Encarnacion S., Keija A., Mora J. Genetic and physiological characterization of a Rhizobium etli mutant strain unable to synthesize poly-beta-hydroxybutyrate. J. Bacteriol. 178 (6), pp , de Smet M.J., Eggink G., Witholt B., Kingma J., Wynberg H. Characterization of intracellular inclusions formed by Pseudomonas oleovorans during growth on octane. J. Bacteriol. 154 (2), pp , Doi, Y., Kunioka, M., Nakamura, Y., Soga, K., Biosynthesis of copolyesters in Alcaligenes eutrophus H16 from 13C-Lebeled acetate and propionate. Macromolecules 20, pp ,

149 Doi, Y., Segawa, A., Nakamura, S., and Kunioka, M., Production of biodegradable Copolymers by Alcaligenes eutrophus. In: Novel Biodegradable Microbial Polymers, Dawes, E. A. (ed.), Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, pp , Eggink G., van der Wal H., Huijberts G.N.M., de Waard P., Oleic acid as a substrate for poly-3- hydroxybutyrate formation in Alcaligenes eutrophus and Pseudomonas putida. Ind. Crops Prod. 1, pp , Fukui T., Ito M., Tomita K., Purification and characterization of NADP-linked acetoacetyl-coa reductase from Zoogloea ramigera I-16-M. Biochim. Biophys. Acta 917, pp , Fuechtenbusch B., Wullbrandt D., Steinbuechel A., Production of polyhydroxyalkanoic acids by Ralstonia eutropha and Pseudomonas oleovorans from oil remaining from biotechnological rhamnose production, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, pp , Grothe E., Chisti Y., Poly(β-hydroxybutyric acid) thermoplastic production by Alcaligenes latus: behavior of fed-batch cultures. Bioprocess Eng. 22, pp , He W., Tian W., Zhang G., Chen G.Q., Zhang Z., Production of novel polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas stutzeri 1317 from glucose and soybean oil. FEMS Microbiology Letters, 169, pp , Katoh T., Yuguchi D., Yoshii H., Shi H., Shimizu K., Dynamics and modeling on fermentative production of poly(β-hydroxybutyric acid) from sugars via lactate by a mixed culture of Lactobacillus delbrueckii and Alcaligenes eutrophus. J. Biotechnol. 67, pp , Khanna S., Srivastava A.K. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates. Process Biochem. 40, pp , Kim B.S., Lee S.Y., Chang H.N. Production of poly-β-hydroxybutyrate by fed-batch culture of recombinant Escherichia coli.biotechnol. Lett. 14, pp , Kim B.S., Lee S.C., Lee S.Y.,Chang Y.K., Woo S.I., Production of poly(3-hydroxybutyric acid) by fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with glucose concentration control. Biotechnol. Bioeng. 43, pp ,

150 Lee S.Y., Yim K.S., Chang H.N., Chang Y.K. Construction of plasmids, estimation of plasmid stability and use of stable plasmids for the production of poly(3-hydroxybutyric) acid by recombinant Escherichia coli. J. Biotechnol. 32, pp , Lee E.Y., Jendrossek D., Schirmer A., Choi Y., Steinbuchel A. Biosynthesis of copolyester consisting of 3-hydroxybutyric acid and medium-chain-length 3-hydroxyalkanoic acids from 1,3- butanediol or from 3-hydroxybutyrate by Pseudomonas sp. A33. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, pp , Madison L.L. & Huisman G.W. Metabolic engineering of poly(3-hydroxyalkanoates): from DNA to plastic. Microbiol. Mol.Biol. Rev. 63 (1), pp , Preusting H., Van Houten R., Hoefs A., Van Langenberghe E.K., Favre-Bulle O., Withlot B., High cell density cultivation of Pseudomonas oleovorans: Growth and production of poly(3- hydroxyalkanoates) in two-liquid phase batch and fed-batch systems. Biotechnol. Bioeng. 41, pp , 1993a. Preusting H., Kingma J., Huisman G., Steinbuchel A., Witholt B. Formation of polyester blends by a recombinant strain of Pseudomonas oleovorans: different poly(3-hydroxyalkanoates) are stored in separate granules. J. Environ. Polym. Degrad. 1, pp , 1993b. Rehm B.H., Timothy A.M., Steinbuchel A. Role of fatty acid de novo biosynthesis in polyhydroxyalkanoic acid (PHA) and rhamnolipid synthesis by Pseudomonads: Establishment of the transacylase (PhaG)-mediated pathway for PHA biosynthesis in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67(7), pp , Song S.S., Hein S., Steinbuchel, A. Production of poly(4- hydroxybutyric acid) by fed-batch cultures of recombinant strains of Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 21, pp , Steinbuchel A. & Schlegel H. F. Physiology and molecular genetics of poly(beta-hydroxyalkanoic acid) synthesis in Alcaligene eutrophus. Mol Microbiol 5, , Sudesh K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Prog. Pol. Sci. 25(10), pp ,

151 Suzuki T., Yamane T., Shimizu S., Mass production of poly-β-hydroxybutyric acid by fed-batch culture with controlled carbon/nitrogen feeding. Appl. Microbiol. Biotechnol. 24, pp , Tohyama M. & Shimizu K. Control of a mixed culture of Lactobacillus delbrueckii and Ralstonia eutropha for the production of PHB from glucose via lactate. Biochem. Eng. J. 4, pp , Tohyama M., Takegi S., Shimizu K., Effect of controlling lactate concentration and periodic change in DO concentration on fermentation characteristics of a mixed culture of Lactobacillus delbrueckii and Ralstonia eutropha for PHB production. J. Ferment. Bioeng. 98, pp , Tsuje T., Tanaka K., Ishizaki A., Development of novel method for feeding a mixture of l-lactic acid and acetic acid in fed-batch culture of Ralstonia eutropha for poly-d-3- hydroxybutyrate production. J. Ferment. Bioeng. 91, pp , Wang J.G. & Bakken L.R. Screening of soil bacteria for poly-beta-hydroxybutyric acid production and its role in the survival of starvation. Microb. Ecol. 35, pp , Yamane T. Yield of poly-d-( )-3-hydroxybutyrate from various carbon sources: A theoretical study. Biotechnol Bioeng 41, pp , Zhang, H., Obias, V., Gonyer, K., Dennis, D. Production of polyhydroxyalkanoates in sucroseutilizing recombinant Escherichia coli and Klebsiella strains. Appl. Environ. Microbiol. 60, pp ,

152 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Παραγωγή PHAs από μικτές καλλιέργειες μικροοργανισμών Πέραν της χρήσης καθαρών καλλιεργειών η παραγωγή των PHAs μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί μέσω μικτών καλλιεργειών. Εκτός από την περίπτωση συν-καλλιέργειας καθαρών στελεχών (συνήθως δύο σε αριθμό) ως μικτή καλλιέργεια χρησιμοποιείται δραστική λάσπη από μονάδες επεξεργασίας λυμάτων. Επειδή η δραστική λάσπη είναι πλούσια σε διάφορους μικροοργανισμούς πραγματοποιείται εμπλουτισμός σε βακτήρια ικανά να αποθηκεύουν PHAs με διάφορες τεχνικές, οι οποίες περιγράφονται παρακάτω σε αυτό το κεφάλαιο Οδοί βιοσύνθεσης των PHAs σε μικτές καλλιέργειες μικροοργανισμών Ο μεταβολισμός των PHAs έχει μελετηθεί αρκετά στις περιπτώσεις των καθαρών καλλιεργειών ενώ λίγες έρευνες έχουν αναφερθεί που να αφορούν τον μεταβολισμό των μικτών καλλιεργειών (Pereira et al., 1996; Lemos et al., 2004; 2008). Έχει γίνει η υπόθεση πως ο ΡΗΑ μεταβολισμός στις μικτές καλλιέργειες είναι παρόμοιος με εκείνον των καθαρών καλλιεργειών όταν μεταβολίζεται το ίδιο υπόστρωμα άνθρακα. Η γνώση των μεταβολικών οδών που εμπλέκονται στην σύνθεση των PHAs επιτρέπει την πρόβλεψη της σύστασης των παραγόμενων πολυμερών από την οποία και εξαρτώνται οι φυσικοχημικές και μηχανικές ιδιότητες αυτών καθώς και οι τελικές τους εφαρμογές. Με βάση την γνώση αυτή μεταβολικά μοντέλα για την παραγωγή των PHAs από μικτές καλλιέργειες έχουν αναπτυχθεί για τις αναερόβιες/αερόβιες (Oehmen et al., 2007) και αερόβιες διεργασίες (Dias et al., 2006; 2008). Τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή των PHAs είναι συνήθως πλούσια σε οργανικά οξέα και/ή υδατανθρακικά συστατικά. Τα οργανικά οξέα μεταφέρονται διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης και ενεργοποιούνται μέσω του αντίστοιχου ακυλοσυνένζυμου Α (ακυλο-coa). Η γλυκόζη υποβαθμίζεται σε ακετυλο-coa μέσω της γλυκόλυσης. 118

153 Το πιο απλό μονοπάτι για την παραγωγή PHAs είναι το παράδειγμα για την σύνθεση στο βακτήριο Cupriavidus necator (μέχρι πρόσφατα ονομαζόμενο Ralstonia eutropha). Χρησιμοποιώντας οξικό οξύ δύο μόρια ακετυλο-coa (AcCoA) συμπυκνώνονται σε ακετοακέτυλο-coa από το ένζυμο β-κετοθειολάση. Το ακετοακέτυλο-coa μετατρέπεται στην συνέχεια σε 3-υδροξυβουτυρυλο-CoA μέσω της αναγωγάσης του ακετοακέτυλο-coa με δαπάνη ενέργειας λόγω της μετατροπής NADPH σε NADP +. Το μονομερές αυτό είναι ο πρόδρομος της σύνθεσης του ΡΗΒ. Από το προπιονικό οξύ μπορούν να προκύψουν τρείς διαφορετικές πρόδρομες ενώσεις. Εάν δύο μόρια προπιονυλο-coa συμπυκνωθούν θα σχηματίσουν 3-υδροξυ-2-μεθυλοβαλερυλο-CoA και θα παραχθεί πολύ-3-υδροξυμεθυλοβαλερικός εστέρας Ρ(3H2MV). Εάν το ακετυλο-coa είναι παρόν ή εάν προκύψει από την διάσπαση του προπιονυλο-coa (στην περίπτωση όπου παρέχονται μίγματα υποστρωμάτων) η συνένωση των δύο αυτών μορίων οδηγεί στην σύνθεση πολύ-3- υδροξυβαλερικού εστέρα, Ρ(3HV), ή πολύ-3-υδροξυ-2-μεθυλοβουτυρικού εστέρα, Ρ(3Η2ΜΒ). Το βουτυρικό οξύ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να παραχθεί Ρ(3ΗΒ) ενώ το βαλερικό οξύ για να παραχθεί P(3HV) είτε απευθείας είτε μέσω της β-οξείδωσης. Τα τέσσερα πολυμερή που αναφέρθηκαν παραπάνω είναι τα συνηθέστερα μικρού μήκους PHAs (scl-phas). Όταν στην καλλιέργεια παρέχεται μίγμα υποστρωμάτων η σύσταση των πολυμερών αντικατοπτρίζει τον συνδυασμό των διαφορετικών υποστρωμάτων. Για την παραγωγή scl-phas τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται κυρίως είναι μικρού μήκους πτητικά λιπαρά οξέα (VFAs) όπως οξικό, προπιονικό, βουτυρικό, βαλερικό οξύ και/ή σάκχαρα π.χ. γλυκόζη. Η ειδίκευση του ενζύμου ΡΗΑ πολυμεράση, το οποίο είναι σε θέση να πολυμερίζει τις πρόδρομες ενώσεις, καθορίζει τον τύπο του ΡΗΑ που παράγεται, είτε scl-phas ή mcl-phas (Rehm, 2003). Δύο ακόμα μεταβολικά μονοπάτια είναι ικανά να αποδώσουν mcl-phas. Μεγαλύτερου μήκους αλυσίδας λιπαρά οξέα μπορούν να διασπαστούν μέσω της β-οξείδωσης ώστε να προκύψουν τα πολυμερή αυτά. Παρόλο που κανένα από τα υποστρώματα που εμπλέκονται σε αυτό το μεταβολικό μονοπάτι δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν απευθείας για να συνθέσουν PHAs, η μετατροπή του ενοϋλο-coa (από την υδατάση), του (S)-3-υδροξυακυλο-CoA (από την επιμεράση) ή του (R)-3-κετοακυλο- CoA (από την αναγωγάση) στα αντίστοιχα (R)-3-119

154 υδροξυακυλο-coa καθιστούν δυνατή την σύνθεση των PHAs. Ένα άλλο βιοσυνθετικό μονοπάτι, η εκ νέου σύνθεση λιπαρών οξέων, μπορεί να παράγει ενδιάμεσα για την παραγωγή των PHAs. Σάκχαρα όπως η γλυκόζη, μετά την γλυκόλυση μπορούν να συμβάλουν στην παραγωγή μηλονυκής ακυλοφέρουσας πρωτεΐνης (ACP), ένας τρόπος εισαγωγής άνθρακα στην σύνθεση λιπαρών οξέων. Και πάλι εάν το ενδιάμεσο (R)-υδροξυακυλο-ACP μετατραπεί στο αντίστοιχο (R)-υδροξυακυλο-CoA μονομερές (μέσω του ενζύμου τρανσακυλάσης) μπορεί να λάβει χώρα η σύνθεση των PHAs. Επίσης, το ενδιάμεσο ενοϋλο-acp μπορεί να μετατραπεί στο αντίστοιχο λιπαρό οξύ (από την θειοεστεράση) και έπειτα να οξειδωθεί μέσω της β-οξείδωσης για την παραγωγή PHAs. Αρκετοί 3, 4, 5 ή 6-υδροξυεστέρες μπορούν να εμπλακούν στην σύνθεση των PHAs καθώς επίσης και κάποιοι θειοεστέρες. Για την παραγωγή των PHAs χρειάζεται τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP), για την ενεργοποίηση των οξέων, καθώς και αναγωγικά ισοδύναμα, NADPH, για την μετατροπή των υδροξυακυλο-coa. Κάτω από αερόβιες συνθήκες αυτά μπορούν να προέρθουν μέσω μερικής οξείδωσης του υποστρώματος. Σε αναερόβιες συνθήκες, και συγκεκριμένα όσον αφορά τους μικροοργανισμούς με την ικανότητα να συσσωρεύουν γλυκογόνο (GAOs), ATP και αναγωγικά ισοδύναμα προκύπτουν από τον καταβολισμό του γλυκογόνου μέσω της γλυκόλυσης. Το γλυκογόνο είναι επίσης μία σημαντική πηγή πρόδρομων ενώσεων, ακετυλο-coa και προπιονυλο-coa, τα οποία χρησιμοποιούνται κατά την ΡΗΑσύνθεση. Συγκεκριμένα, η παραγωγή των πρόδρομων αυτών ουσιών από το γλυκογόνο είναι στενά συνδεδεμένη με την ισορροπία οξειδοαναγωγής του κυττάρου. Το τελευταίο στάδιο της γλυκόλυσης είναι η παραγωγή του ακετυλο-coa. Όταν οι μικροοργανισμοί έρχονται αντιμέτωποι με περίσσεια αναγωγικών ισοδυνάμων, το πυροσταφυλικό οξύ, που είναι ενδιάμεσο της γλυκόλυσης, μπορεί να οδηγηθεί προς την παραγωγή προπιονυλο-coa. Στην περίπτωση αυτή το πυροσταφυλικό οξύ θα γίνει οξαλοξικό οξύ που θα μετατραπεί σε ηλεκτρυλο-coa, ακολουθώντας τις αντίστροφες αντιδράσεις της αριστερής διακλάδωσης του κύκλου του τρικαρβοξυλικού οξέος, όπου καταναλώνονται τα αναγωγικά ισοδύναμα. Μέσω της οδού του μεθυλομηλονυλο-coa το ηλεκτρυλο-coa θα παράγει προπιονυλο-coa. Όσον αφορά τους GAOs, εφόσον το γλυκογόνο είναι η μόνη πηγή ενέργειας, μεγαλύτερη ποσότητα γλυκογόνου θα καταναλωθεί και έτσι μεγαλύτερη ποσότητα 120

155 προπιονυλο-coa αναμένεται σε σύγκριση με τους PAOs για να διατηρηθεί η ισορροπία οξειδοαναγωγής (Oehmen et al., 2007). Σάκχαρα Οξικό ακετυλο-coa 2 phaa (3HB) ακετο-accoa phab NADPH + H + NADP + (R)-3-υδροξυβουτυρυλο-CoA phac phac ΡΗΑ Γλυκογόνο CO (3Η2ΜΒ) (3ΗV) (R)-3-υδροξυακυλο-CoA 1 (3HB) (3HV) 2 (3H2MV) Βουτυρικό Βαλερικό Προπιονικό β-οξείδωση Λιπαρά οξέα fadd ακετυλο-coa NAD ακυλο-coa + fada fade CoASH NADH + H + προπιονυλο-coa (R)-3-κετοακυλο-CoA ενοϋλο-coa phab, fabb NAD + H + fadβ fadb phaj, fadb NAD + (S)-3-υδροξυακυλο-CoA Σάκχαρα fadb NADP + (R)-3-υδροξυακυλο-ACP faba fabg NADPH + H + fabz (R)-3-κετοακυλο-ACP ενοϋλο-acp fabg fabh fabb NADPH + H + fabl fabf NADP ακυλο-acp + (R)-3-κετοακυλο-CoA CoASH ακετυλο-coa ακετυλο-coa μηλονυκό-acp fadd CoASH ACPSH μηλονυλο-coa Βιοσύνθεση λιπαρών οξέων Ένζυμα που καταλύουν τις αντιδράσεις: phaa: β-κετοθειολάση phab: ακετο-accoa αναγωγάση phac: ΡΗΑ-πολυμεράση phaj: R-ενοϋλο-CoA υδατάση fada: 3-κετοακυλο-CoA θειολάση fadb: σύμπλοκο ενοϋλο-coa υδατάσης και 3-υδροξυακυλο-CoA αφυδρογονάσης fadd: 3-υδροξυακυλο-ACP-CoA τρανσφεράση fade: μηλονυλο-coa-acp τρανσακυλάση faba: 3-υδροξυακυλο-ACP υδατάση fabb: β-κετοακυλο-acp συνθάση Ι fabf: β-κετοακυλο-acp συνθετάση ΙΙ fabg: 3-κετοακυλο-ACP αναγωγάση fabh: β-κετοακυλο-acp συνθετάση ΙΙΙ fabl: ενοϋλο-acp αναγωγάση fabz: β-υδροξυακυλο-acp αφυδράση Σχήμα 5.1. Μεταβολικά μονοπάτια βιοσύνθεσης των PHAs στις μικτές καλλιέργειες (Serafim et al., 2004). 121

156 5.2. Διεργασίες εμπλουτισμού μικτών καλλιεργειών με ΡΗΑ συσσωρευτές Το ενδιαφέρον της χρήσης των μικτών καλλιεργειών για την παραγωγή PHAs έχει αυξηθεί τα τελευταία χρόνια. Γενικά, οι μικτές καλλιέργειες είναι μικροβιακοί πληθυσμοί άγνωστης σύστασης που είναι ικανοί να εκτελούν συγκεκριμένες ενδοκυτταρικές και εξωκυτταρικές αντιδράσεις ενώ επιλέγονται και εμπλουτίζονται βάσει των συνθηκών λειτουργίας στις οποίες υποβάλλονται. Οι καλλιέργειες που επιλέγονται για την παραγωγή PHAs μπορούν να παρουσιάσουν μεγάλα ποσοστά ενδοκυτταρικής συσσώρευσης σε PHAs όταν οι συνθήκες λειτουργίας περιορίζουν τον πρωτογενή τους μεταβολισμό. Η επιλογή μιας καλλιέργειας με υψηλή ικανότητα παραγωγής PHAs είναι το σημαντικότερο βήμα. Σκοπός είναι να επιτευχθεί μικροβιακός εμπλουτισμός όπου αν όχι όλοι, οι περισσότεροι μικροοργανισμοί που αποτελούν την μικτή καλλιέργεια έχουν μεγάλη δυναμικότητα παραγωγής PHAs. Εάν οι μικροοργανισμοί που έχουν επιλεγεί παρουσιάζουν μεγάλη ετερογένεια ως προς την ικανότητα συσσώρευσης PHAs αυτό θα έχει αρνητικό αντίκτυπο κατά τη διεργασία παραγωγής διότι θα τείνουν να μειώνουν την μέση τιμή του ενδοκυτταρικού PHA της όλης καλλιέργειας. Η διεργασία για την παραγωγή PHAs από μικτές καλλιέργειες συνήθως περιλαμβάνει δύο ή τρία στάδια ανάλογα με τον τύπο του υποστρώματος που χρησιμοποιείται ως θρεπτικό υλικό (Dias et al., 2006). Η διεργασία δύο σταδίων εμπεριέχει την διαδικασία επιλογής των ΡΗΑ-παραγωγών (συνήθως μέσω εναλλασσομένων αναερόβιων-αερόβιων, μικροαεροφιλικών-αερόβιων και δυναμικών αερόβιων συνθηκών), ενώ στην συνέχεια ακολουθεί το στάδιο της συσσώρευσης των PHAs κατά το οποίο μεγιστοποιείται η συσσώρευση των PHAs από τους επιλεγόμενους μικροοργανισμούς. Η διάκριση των σταδίων εμπλουτισμού σε ΡΗΑ-παραγωγούς και της παραγωγής των PHAs επιτρέπει την βελτιστοποίηση της διεργασίας καθώς διαφορετικές βέλτιστες συνθήκες φαίνεται πως απαιτούνται σε κάθε στάδιο (Albuquerque et al., 2007). Τα PHAs που παράγονται κατά την φάση της συσσώρευσης οδηγούνται έπειτα προς την τη διαδικασία ανάκτησης. Η διεργασία δύο σταδίων εφαρμόζεται κυρίως όταν ως πηγές άνθρακα για την παραγωγή PHAs χρησιμοποιούνται οργανικά οξέα, όπως για παράδειγμα οξικό, προπιονικό, βουτυρικό, βαλερικό ή γαλακτικό οξύ (Beccari et al., 1998; Beun et al., 2002; Dionisi et al., 2004; Serafim et 122

157 al., 2004; Lemos et al., 2006). Ωστόσο, ένα από τα πλεονεκτήματα που αφορούν την χρήση των μικτών καλλιεργειών είναι η δυνατότητα εκμετάλλευσης των υγρών κλασμάτων αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων τα οποία είναι πλούσια σε υδατανθρακικό φορτίο. Οι μικτές καλλιέργειες οι οποίες έχουν επιλεχθεί βάσει της λογικής των αερόβιων δυναμικών συνθηκών συχνά αναφέρονται ως ανίκανες να καταναλώσουν υδατανθρακικά υποστρώματα για να συσσωρεύσουν PHAs (Carta et al., 2001). Για τον λόγο αυτό όταν ως τροφοδοτικό μέσο χρησιμοποιείται κάποιο ρεύμα υγρών αποβλήτων πλούσιο σε σάκχαρα απαιτείται ένα επιπλέον στάδιο κατά το οποίο οι υδατάνθρακες αυτοί μετατρέπονται σε πτητικά λιπαρά οξέα ή άλλα καρβοξυλικά οξέα. Αυτό το επεξεργασμένο πλέον ρεύμα μπορεί μετέπειτα να χρησιμοποιηθεί κατά τα στάδια επιλογής ΡΗΑ-συσσωρευτών και συσσώρευσης PHAs με αποτέλεσμα η συνολική διεργασία να αποτελείται από τρία στάδια (Dionisi et al., 2005α; Albuquerque et al., 2007). Η διάταξη που χρησιμοποιείται περισσότερο για την παραγωγή PHAs από μικτές καλλιέργειες είναι ο αντιδραστήρας διαλείποντος λειτουργίας (SBR) (Beun et al.,2002; Serafim et al., 2004; Dionisi et al., 2005α). Οι αντιδραστήρες διαλείποντος λειτουργίας είναι συστήματα όπου πλήρεις κύκλοι, για παράδειγμα αερόβιων δυναμικών συνθηκών (υπερεπάρκειας/έλλειψης υποστρώματος), μπορούν να λειτουργήσουν σε έναν μόνο αντιδραστήρα ενώ η διάρκεια της κάθε φάσης μπορεί να ποικίλει διατηρώντας τον ίδιο χρόνο παραμονής της ιλύος (SRT) και την οργανική φόρτιση. Εναλλακτικά της χρήσης των SBR αντιδραστήρων, συνεχείς αντιδραστήρες έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή PHAs στην λογική των αερόβιων δυναμικών συνθηκών. Οι Bengtsson κ.ά. (Bengtsson et al., 2008a) παρήγαγαν PHAs από επεξεργασμένα απόβλητα χαρτοβιομηχανίας μέσω αντιδραστήρων συνεχούς λειτουργίας. Το σύστημα που χρησιμοποίησαν προσομοίαζε την διάταξη των εγκαταστάσεων επεξεργασίας υγρών αποβλήτων αφού αποτελούταν από δύο σειριακούς αντιδραστήρες συνεχούς λειτουργίας και μία δεξαμενή καθίζησης. Ο πρώτος αντιδραστήρας αντιστοιχούσε στην φάση υπερεπάρκειας υποστρώματος και ο υδραυλικός χρόνος παραμονής ρυθμίστηκε έτσι ώστε να μην υπάρξει μεταφορά καμίας πηγής άνθρακα στον δεύτερο αντιδραστήρα. Στον δεύτερο αντιδραστήρα, που λάμβανε χώρα η φάση έλλειψης υποστρώματος, ο χρόνος παραμονής της ιλύος ήταν τέτοιος ώστε όλη η ποσότητα 123

158 των ενδοκυτταρικά συσσωρευμένων PHAs καταναλωνόνταν για την κυτταρική ανάπτυξη και συντήρηση. Οι Bengtsson κ.ά. (Bengtsson et al., 2010) χρησιμοποίησαν αντιδραστήρα τύπου διαλείποντος λειτουργίας για την επιλογή ΡΗΑ-παραγωγών χρησιμοποιώντας επεξεργασμένο ρεύμα πλούσιο σε μελάσες για να συγκρίνουν τις αποδόσεις με εκείνες που επιτεύχθηκαν μέσω ενός συνεχούς συστήματος (Albuquerque et al., 2008). Το ποσοστό PHAs επί της ξηρής κυτταρικής μάζας, η απόδοση των PHAs ως προς το υπόστρωμα άνθρακα και η PHA παραγωγικότητα φάνηκαν να είναι παρόμοια αντιστοιχώντας στις τιμές 48 %, 0.11 g PHAs/g COD και C-mol/C-mol h. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν πως είναι δυνατή η χρήση εγκαταστάσεων, οι οποίες ήδη υπάρχουν, όπως είναι οι συμβατικές εγκαταστάσεις επεξεργασίας υγρών αποβλήτων για την παραγωγή PHAs από βιομηχανικά ή αστικά ρεύματα υγρών αποβλήτων (Serafim et al., 2008). Στο παρακάτω σχήμα απεικονίζονται οι προσεγγίσεις που αφορούν στην διαδικασία παραγωγής PHAs από μικτές καλλιέργειες ΡΗΑ-συσσωρευτών κάνοντας χρήση είτε συνθετικών πηγών άνθρακα (Α), είτε υγρών ρευμάτων αγροτοβιομηχανικών/αστικών αποβλήτων (Β) κάτω από αερόβιες και αναερόβιες/αερόβιες δυναμικές συνθήκες. Το τελικό βήμα της παραγωγής PHAs πραγματοποιείται σε αντιδραστήρες τύπου διαλείποντος ή ημιδιαλείποντος έργου χρησιμοποιώντας τις εμπλουτισμένες καλλιέργειες που προκύπτουν κατά το δεύτερο στάδιο και την πηγή άνθρακα του πρώτου σταδίου (σχήμα 5.2). 124

159 Σχήμα 5.2. Διεργασία παραγωγής PHAs από μικτές καλλιέργειες μικροοργανισμών (Albuquerque et al., 2007) Αναερόβια - αερόβια διεργασία (ή αλλιώς σύστημα PAO/ GAO) Η συσσώρευση ενδοκυτταρικών πολυμερών από τις μικτές καλλιέργειες παρατηρείται σε συστήματα επεξεργασίας αποβλήτων για την απομάκρυνση φωσφόρου (EBPR) όπου επικρατούν εναλλασσόμενες αναερόβιες-αερόβιες συνθήκες. Το PHA κατέχει σημαντικό ρόλο στις μικτές καλλιέργειες, ιδιαίτερα κατά τις αναερόβιεςαερόβιες διεργασίες όπου διαφοροποιείται η διαθεσιμότητα του δότη και αποδέκτη ηλεκτρονίων. Υπάρχουν δύο τύποι μικροοργανισμών που είναι ικανοί να αποθηκεύουν άνθρακα αναερόβια στις μικτές καλλιέργειες: (i) οι οργανισμοί που συσσωρεύουν πολυφωσφορικά άλατα (PAOs) και (ii) οι μικροοργανισμοί που συσσωρεύουν γλυκογόνο (GAOs). Οι PAOs είναι ευρέως αναγνωρισμένοι ως οργανισμοί που συσσωρεύουν πολυμερή όπως PHA, γλυκογόνο και πολυφωσφορικά άλατα. Το μεγάλο τους πλεονέκτημα είναι η ικανότητα να χρησιμοποιούν την ενέργεια που έχει αποθηκευτεί ως πολυφωσφορικό άλας για να 125

160 συσσωρεύσουν εξωγενές υπόστρωμα στην μορφή των PHAs όταν δεν υπάρχει οξυγόνο ή νιτρικό άλας διαθέσιμο για την παραγωγή ενέργειας. Οι GAOs θεωρούνται ανταγωνιστές των PAOs. Ουσιαστικά, αυτοί οι οργανισμοί βασίζονται σε υποστρώματα τα οποία μπορούν να ζυμωθούν (π.χ. γλυκόζη) και αποθηκεύουν τα προϊόντα της ζύμωσης μέσα στο κύτταρο αντί να τα απεκκρίνουν. Επίσης είναι δυνατή η κατανάλωση του εσωτερικά αποθηκευμένου γλυκογόνου για παραγωγή PHB. Η ενέργεια που αποδεσμεύεται κατά την διαδικασία της γλυκόλυσης στη συνέχεια χρησιμοποιείται για την συσσώρευση των προϊόντων ζύμωσης (π.χ. οξικού οξέος) στην μορφή του PHB. Οι PAOs και οι GAOs αναπτύσσονται ραγδαία σε συστήματα όπου υπάρχει επάρκεια θρεπτικού υλικού ενώ απουσιάζει το οξυγόνο (Chech & Hartmann, 1993). Και οι δύο ομάδες μικροοργανισμών μπορούν να καταναλώσουν οξικό οξύ (ως πρότυπο υπόστρωμα για μεταβολικές μελέτες) και να το ενεργοποιήσουν σε AcCoA. Έπειτα το συνένζυμο αυτό καταναλώνεται για την σύνθεση του PHB εφόσον δύο μόρια του συμπυκνώνονται για την απόδοση ενός μορίου ακετοακέτυλο-coa, το οποίο μετατρέπεται σε υδροξυβουτυρυλο-coα και τέλος αυτό πολυμερίζεται σε PHB (σχήμα 5.3.). Δύο μεταβολικά μοντέλα έχουν προταθεί για την διαδικασία της βιολογικής απομάκρυνσης του φωσφόρου (EBPR) (Comeau et al., 1986; Mino et al., 1987; 1996). Τα μοντέλα αυτά αποσαφηνίζουν την αλληλεπίδραση μεταξύ της απελευθέρωσης φωσφόρου κάτω από αναερόβιες συνθήκες και της πρόσληψης και αποθήκευσης μικρού μήκους λιπαρών οξέων. Η κύρια διαφορά ανάμεσα στα μοντέλα αυτά είναι η πηγή των ηλεκτρονίων για τον σχηματισμό του PHA. Οι Comeau κ.ά. (Comeau et al., 1986) πρότειναν την οξείδωση του υποστρώματος μέσω του κύκλου ΤCA. Οι Mino κ.ά. (Mino et al., 1998) μέτρησαν την αναερόβια μείωση των ενδοκυτταρικά συσσωρευμένων υδατανθράκων και υπέδειξαν πως η μετατροπή του γλυκογόνου σε AcCoΑ παρείχε την απαραίτητη ενέργεια αναγωγής για τον σχηματισμό των PHAs. Σύμφωνα με τους Mino κ.ά., ο αναερόβιος μεταβολισμός των GAOs είναι παρόμοιος με τον μεταβολισμό των PAOs μόνο που δεν υπάρχει εμπλοκή πολυφωσφορικών. Στους GAOs η γλυκόλυση του συσσωρευμένου γλυκογόνου και η μετατροπή του υποστρώματος σε PHAs πραγματοποιείται μέσω είτε του AcCoA είτε του προπιονυλο-coa ενώ η παραγωγή του προπιονυλο-coa γίνεται μέσω του δικτύου ηλεκτρικού-προπιονικού οξέος). Οι PAOs και οι GAOs μετατρέπουν το 126

161 γλυκογόνο σε PHA για να παραχθεί ATP (τριφωσφορική αδενοσίνη) και NADH. Στους PAOs η μετατροπή αυτή γίνεται κυρίως για να παραχθεί ενέργεια αναγωγής, ενώ στους GAOs, για να παραχθεί ΑΤΡ. Στους GAOs η υδρόλυση του γλυκογόνου γίνεται μέσω του δικτύου ΕΜΡ (Embden-Meyerhoff-Parnas ή αλλιώς γλυκόλυση) (Filipe et al., 2001) ενώ στους PAOs μέσω του μεταβολικού δικτύου ED (Entner-Doudoroff) (Maurer et al., 1997; Hesselmann et al., 2000). Η παρουσία και η αναλογία διαφορετικών ΡΗΑs εξαρτάται από τον τύπο της πηγής άνθρακα που είναι διαθέσιμη. Διαφορετικά πολυμερή σχηματίζονται έτσι ώστε να επιτραπεί στα κύτταρα να εξισορροπήσουν τα ισοδύναμα οξειδοαναγωγής που παράγονται και χρειάζονται για την μετατροπή του υποστρώματος σε ΡΗΑ. Έτσι σχηματίζονται PHAs που περιέχουν μονομερικές ομάδες ΗV, 3H2MB (3-υδροξυ-2-μεθυλοβουτυρικό οξύ), και 3H2MV (3- υδροξυ-2-μεθυλοβαλερικό οξύ). Η ύπαρξη HV στους GAOs εξηγείται ως εξής: σύμφωνα με την HV ζύμωση το γλυκογόνο μετασχηματίζεται σε ΡΗΑ μέσω του προπιονυλο-coα για να γίνει η εξισορρόπηση των ισοδύναμων οξειδοαναγωγής. Εξαιτίας του ότι οι μικροοργανισμοί είναι ευάλωτοι σε ταχείες μεταβολές ανάμεσα σε αερόβιες και αναερόβιες συνθήκες, τα ένζυμα του ενδιάμεσου κυτταρικού μεταβολισμού συνεχίζουν να είναι ενεργά κάτω από αναερόβιες συνθήκες. Αυτό οδηγεί στον σχηματισμό PHV στους ΡΑΟs ακόμα και όταν το οξικό οξύ είναι το μόνο υπόστρωμα (Periera, 1996). Σύμφωνα με τη μελέτη των Ueno κ.ά. (Ueno et al., 1993) και Saito κ.ά. (Saito et al., 1995), οι οποίοι χρησιμοποίησαν οξικό οξύ για εργαστηριακά-εγκλιματισμένη αναερόβια-αερόβια βιομάζα, κάτω από αερόβιες συνθήκες συσσωρεύτηκε μεγαλύτερο ποσοστό ΡΗΒ (36%) απ ότι κάτω από αναερόβιες συνθήκες (17%). Η αιτία της αύξησης αποδίδεται στην διαφορά της διαθεσιμότητας ενέργειας για την συσσώρευση ΡΗΑ. Η αναερόβια πρόσληψη υποστρώματος σταματάει όταν το απόθεμα ενέργειας, όπως πολυ-ρ και/ή γλυκόζη, εξαντλείται, ενώ, επιπλέον ενέργεια μπορεί να παραχθεί από την οξειδωτική υποβάθμιση των υποστρωμάτων κατά τις αερόβιες συνθήκες. 127

162 Σύστημα PAO/GAO (αναερόβια φάση) ATP Οξικό ADP OH - OH - H 2 PO - 4 H 2 PO - 4 M + M + H + H + Πολυ-P n PAO NADH NAD + ATP TCA CO 2 ADP ATP NADH NAD + Οξικό Πυροσταφυλικό Γλυκογόνο ATP CO ATP ADP 2 NAD + AMP NADH NADH EMP: 3 ATP ακετυλο-coa (Α) ADP NAD + ED: 2 ATP NADH NAD + υδροξυακυλο-coa ATP προπιονυλο-coa (P) P(3HB) (A+A) P(3HB-co-3HV) (A+P) P(3H2MB) (A+P) P (3H2MV) (P+P) Πολυ-P n-1 ADP ΡΗΑ Σχήμα 5.3. Μεταβολισμός προς παραγωγή PHAs κατά το αναερόβιο στάδιο στο σύστημα PAO/GAO (Saito et al., 1995) Μικροαεροφιλική - αερόβια διεργασία Παρόλο που δραστική λάσπη εγκλιματισμένη σε μεταβαλλόμενες αναερόβιες-αερόβιες συνθήκες είναι σε θέση να συσσωρεύει PHAs δεν υπάρχει καμία εγγύηση πως ο συγκεκριμένος τρόπος λειτουργίας είναι ο καλύτερος για τον εμπλουτισμό της βιομάζας αυτής σε ΡΗΑ-παραγωγούς. Όπως έχει αναφερθεί παραπάνω η συσσώρευση των PHAs κατά την αερόβια φάση είναι μεγαλύτερη απ ότι στην αναερόβια φάση. Ο Satoh και οι συνεργάτες του, (Satoh et al., 1998) πρότειναν την μικροαεροφιλική-αερόβια διεργασία όπου περιορισμένη ποσότητα οξυγόνου παρέχεται κατά την αναερόβια φάση της αναερόβιας-αερόβιας διεργασίας. Σε αυτές τις συνθήκες οι μικροοργανισμοί μπορούν να καταναλώσουν οργανικά υποστρώματα λαμβάνοντας ενέργεια μέσω της οξειδωτικής υποβάθμισης μέρους των οργανικών υποστρωμάτων. Αν η παροχή του οξυγόνου είναι επαρκής ο μικροοργανισμός μπορεί να είναι ικανός να αφομοιώσει αρκετή ενέργεια και έτσι να προβεί σε δραστηριότητες όπως η παραγωγή πρωτεΐνών, γλυκογόνου και άλλων κυτταρικών συστατικών με ταυτόχρονη 128

163 κατανάλωση οργανικών υποστρωμάτων. Ωστόσο εάν η παροχή του οξυγόνου είναι ελεγχόμενη οι δραστηριότητες αυτές παρεμποδίζονται και ο μικροοργανισμός είναι σε θέση να συσσωρεύσει PHAs. Κάτω από αυτές τις συνθήκες επιλέγονται και εμπλουτίζονται οι ΡΗΑσυσσωρευτές ανεξάρτητα από την ικανότητα του μικροοργανισμού να συσσωρεύει πολυφωσφορικά ή γλυκογόνο και οι ΡΗΑ-συσσωρευτές έχουν μικρότερη τάση να συσσωρεύουν γλυκογόνο. Ο αερόβιος μεταβολισμός για τον σχηματισμό του ΡΗΒ φαίνεται στο σχήμα 5.4. Το μεταβολικό μοντέλο περιέχει τις ακόλουθες αντιδράσεις: σύνθεση του AcCoA από οξικό οξύ, αντιδράσεις αναβολισμού, αντιδράσεις καταβολισμού, φωσφορυλίωση μέσω μεταφοράς ηλεκτρονίων, σύνθεση ΡΗΒ από το AcCoA και σύνθεση του AcCoA από ΡΗΒ (Beun et al., 2000; Salehizadeh & van Loosdrecht, 2004).Χρησιμοποιώντας βιομάζα εγκλιματισμένη σε αυτό το μικροαεροφιλικό-αερόβιο σύστημα επιτεύχθηκε 62% ΡΗΑ σε 30 ώρες τροφοδοτώντας την με οξικό οξύ Δυναμική αερόβια διεργασία (ή αλλιώς κύκλος υπερεπάρκειας- έλλειψης υποστρώματος) Ιλύς με σημαντικά ενδοκυτταρικά ποσοστά συσσώρευσης PHAs έχει επίσης παρατηρηθεί στα αερόβια συστήματα επεξεργασίας υγρών αποβλήτων (Majone et al., 1996). Κατά την διεργασία αυτή το σύστημα υποβάλλεται σε εναλλασσόμενες περιόδους όπου υπάρχει περίσσεια άνθρακα (στον αντιδραστήρα διαλογής) με περιόδους περιορισμού υποστρώματος (κύριος αντιδραστήρας). Οι συνθήκες αυτές ευνοούν την επικράτηση των μικροοργανισμών με μεγάλη δυναμικότητα αποθήκευσης PHAs. Για να γίνουν κατανοητοί οι μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την δυναμικότητα συσσώρευσης PHAs της εμπλουτισμένης μικτής καλλιέργειας στα συστήματα αυτά οι εναλλασσόμενες συνθήκες υπερεπάρκειας και έλλειψης άνθρακα έχουν προσομοιωθεί σε αντιδραστήρες εργαστηριακής κλίμακας. Η μεγάλη δυναμικότητα συσσώρευσης PHAs κάτω από τις συγκεκριμένες συνθήκες επιβεβαιώθηκε και διατυπώθηκαν υποθέσεις που εξηγούν το φαινόμενο αυτό. Φαίνεται πως η απουσία εξωτερικής πηγής άνθρακα για σημαντικό χρονικό διάστημα προκαλεί μείωση στην ποσότητα των ενδοκυτταρικών συστατικών (RNA και ενζύμων) που απαιτούνται για την κυτταρική ανάπτυξη. 129

164 Έπειτα από αυτή την περίοδο πενίας αν η μικτή καλλιέργεια τροφοδοτηθεί με πλούσιο σε πηγή άνθρακα θρεπτικό μέσο η ποσότητα των διαθέσιμων ενζύμων στα κύτταρα είναι μικρότερη αυτής που απαιτείται για να επιτευχθεί ο μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης της βιομάζας και ως αποτέλεσμα επικρατεί το φαινόμενο της συσσώρευσης του άνθρακα στην μορφή των PHAs (Daiger & Grady, 1982). Η ανάγκη φυσιολογικής προσαρμογής λόγω της έλλειψης επαρκούς ποσότητας ενζύμων ή RNA που απαιτείται για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών θεωρείται ο πιθανότερος μηχανισμός για την συσσώρευση των PHAs από μικτές καλλιέργειες μικροοργανισμών οι οποίες υποβάλλονται σε αερόβιες συνθήκες υπερεπάρκειας/έλλειψης υποστρώματος (Anderson & Dawes, 1990; Krishna & van Loosdrecht, 1999). Η ιδέα της χρήσης αερόβιων συνθηκών υπερεπάρκειας/έλλειψης υποστρώματος προτάθηκε αρχικά από τους Majone κ.ά. (Majone et al., 1996). Την τελευταία δεκαετία σε αρκετές έρευνες έχουν χρησιμοποιηθεί αντιδραστήρες διαλείποντος λειτουργίας που προσομοιάζουν τις συγκεκριμένες συνθήκες (Dionisi et al., 2001; Beun et al., 2002; Serafim et al., 2004). Διαπιστώθηκε πως κατά την διάρκεια της περιόδου υπερεπάρκειας υποστρώματος οι πηγές αμμωνίας και άνθρακα καταναλώνονται με σκοπό την ανάπτυξη της κυτταρικής βιομάζας και σε δεύτερη φάση την σύνθεση PHAs. Έπειτα από την εξάντληση της εξωτερικής πηγής άνθρακα τα συσσωρευμένα PHAs καταναλώνονται ταυτόχρονα με την αμμωνία υποδεικνύοντας πως οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται χρησιμοποιώντας την ενδοκυτταρική πηγή άνθρακα (PHAs) και την εξωτερική πηγή αμμωνίας. Ανάμεσα στα συστήματα που αναφέρονται για την βιομηχανική παραγωγή PHAs η στρατηγική υπερεπάρκειας/έλλειψης υποστρώματος φαίνεται να είναι η πιο ελπιδοφόρα λόγω της μεγάλης συσσώρευσης ΡΗΑ που μπορεί να φτάσει το 65% επί του ξηρού κυτταρικού βάρους (Dias et al., 2006; Serafim et al., 2008). Η προσέγγιση αυτή προάγει την μετατροπή των ανθρακικών υποστρωμάτων σε ΡΗΑ και όχι σε γλυκογόνο ή άλλα ενδοκυτταρικά υλικά. 130

165 Υπερεπάρκεια/έλλειψη υποστρώματος (Αερόβια διεργασία) Οξικό ATP Οξικό ATP CoA AMP ADP H + + e - NADH NAD + TCA ADP ATP ακετυλο-coa ακετυλο-coa CoA CoA CO 2 NADH NAD + ακετοξικό ATP CoA AMP ακετο-accoa NADPH NADP + D-(-)-υδροξυβουτυρυλο-CoA P(3HB) n D-(-)-3-υδροξυβουτυρικό P(3HB) n+1 P(3HB) n Συσσώρευση Κυτταρική ανάπτυξη (υπερεπάρκεια) Κυτταρική ανάπτυξη (έλλειψη) Σχήμα 5.4. Παραγωγή PHAs σε συνθήκες υπερεπάρκειας/έλλειψης υποστρώματος: Το παράδειγμα της σύνθεσης (υπερεπάρκεια) και υποβάθμισης (έλλειψη) του PHB (Saito et al., 1998) Επίτευξη συσσώρευσης PHAs Όπως και κατά την επιλογή του μικροβιακού πληθυσμού, η εκτίμηση της μέγιστης δυναμικότητας αποθήκευσης PHAs, στις περισσότερες μελέτες, πραγματοποιείται με χρήση καθαρών υποστρωμάτων. Πρόσφατα, υγρά ρεύματα αποβλήτων χρησιμοποιήθηκαν για να 131

166 αξιολογηθεί η ικανότητα παραγωγής PHAs από μικτές καλλιέργειες που έχουν επιλεχθεί. Στους πίνακες 5.1. και 5.2. συνοψίζονται τα αποτελέσματα που αναφέρονται στη βιβλιογραφία σχετικά με το στάδιο της συσσώρευσης των PHAs χρησιμοποιώντας ως υποστρώματα υγρά ρεύματα αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων και μικροβιακούς πληθυσμούς που έχουν επιλεγεί κάτω από αερόβιες δυναμικές συνθήκες ή αναερόβιες/αερόβιες συνθήκες αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα που έχουν επιτευχθεί καταναλώνοντας οξικό οξύ παρουσιάζονται ως τιμές αναφοράς. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η απόδοση συσσώρευσης PHA που παρατηρείται (περιεκτικότητα των PHAs στα κύτταρα, η απόδοση του πολυμερούς που παράγεται ως προς το υπόστρωμα που καταναλώνεται και οι ειδικές και ογκομετρικές παραγωγικότητες) αντανακλά από τη μια τη μεγάλη χωρητικότητα της επιλεγμένης καλλιέργειας (που είναι η αποδοτικότητα των χρησιμοποιούμενων στρατηγικών επιλογής) και από την άλλη την βελτιστοποίηση του ίδιου του βήματος της συσσώρευσης. Στη διαδικασία αναερόβιων/αερόβιων συνθηκών, το στάδιο της συσσώρευσης πραγματοποιείται σε αντιδραστήρα ο οποίος μπορεί να λειτουργεί σε αναερόβιες ή αερόβιες συνθήκες. Έχει παρατηρηθεί ότι, σε αναερόβιες συνθήκες, η αποθήκευση του PHA λαμβάνει χώρα μέχρι ένα δεδομένο επίπεδο εσωτερικού περιορισμού γλυκογόνου, ανεξάρτητα από την ποσότητα του εξωτερικού υποστρώματος με το οποίο τροφοδοτείται (Dai et al., 2007; Bengtsson et al., 2008b). Οι Dai και λοιποί, παρατήρησαν πως η μέγιστη περιεκτικότητα PHAs υπό αναερόβιες συνθήκες ήταν 28%, ενώ σε αερόβιες συνθήκες έφτασε το 41%. Κατά τη διάρκεια της αεροβίωσης, κάποια ποσότητα γλυκογόνου καταναλώθηκε, ενώ προσλαμβάνονταν πτητικά λιπαρά οξέα (VFAs). Οι Bengtsson κ.ά. επίσης μελέτησαν σε αερόβιες συνθήκες μικροβιακό πληθυσμό που είχε επιλεγεί με εφαρμογή της στρατηγικής των αναερόβιων/αερόβιων συνθηκών (AN/AE). Ωστόσο, η καλλιέργεια παρήγαγε γλυκογόνο και PHAs ταυτόχρονα. Λαμβάνοντας υπόψη το παραπάνω γεγονός εισήγαγαν ένα επιπλέον επόμενο αναερόβιο στάδιο, έτσι ώστε το γλυκογόνο που είχε παραχθεί από τα VFAs κατά τη διάρκεια του αερόβιου σταδίου να μπορέσει να καταναλωθεί κατά τη διάρκεια της επόμενης τροφοδοσίας VFAs σε νέες αναερόβιες συνθήκες (Bengtsson et al., 2008b). Οι μικροβιακοί πληθυσμοί που επιλέχτηκαν στα συστήματα των Bengtsson κ.ά. και Dai κ.ά. δεν μπορούν να δικαιολογήσουν αυτήν την διαφορά στη συμπεριφορά γλυκογόνου, καθώς και στα δύο αυτά 132

167 συστήματα βρέθηκε πως επικρατούσαν τα βακτήρια Candidatus Competibacter phosphatis και D. vanus σε διαφορετικές ωστόσο αναλογίες. Μόνο αυτές οι δύο έρευνες πραγματεύονται το μεταβολικό ρόλο του γλυκογόνου για μικροοργανισμούς που επιλέγονται τροφοδοτούμενοι με απόβλητα πολύπλοκης σύστασης. Οι αποδόσεις συσσώρευσης των καλλιεργειών που επιλέγονται κάτω από αερόβιες δυναμικές συνθήκες χρησιμοποιώντας διάφορα υποστρώματα αναφέρονται στον πίνακα 5.2. Ανεξάρτητα από τον τύπο του υποστρώματος που χρησιμοποιείται κατά το στάδιο της παραγωγής των PHAs, οι καλλιέργειες που έχουν επιλεγεί μέσω αερόβιων δυναμικών συνθηκών πάντα παράγουν συμπολυμερή των 3HB και 3HV μονομερών (με την εξαίρεση της εργασίας των Liu κ.ά., (Liu et al., 2008). Ένα τρίτο μονομερές, το 3HHx ή 3H2MV, παράγεται από πληθυσμούς επιλεγμένος κάτω από AN/AE συνθήκες (πίνακας 5.1.). Ο σχηματισμός μονομερών εκτός από το 3HB, το οποίο είναι ένα άμεσο αποτέλεσμα της ποικιλομορφίας των VFAs και άλλων ενώσεων παρόντων στο τροφοδοτικό μέσο ή/και του γλυκογόνου, είναι ένα πλεονέκτημα της χρήσης των σύνθετων αποβλήτων. Συνήθως συμπολυμερή που αποτελούνται από τρείς μονομερικές ομάδες, ειδικά αυτά που περιέχουν mcl μονομερή όπως το 3HHx, παρουσιάζουν βελτιωμένες μηχανικές ιδιότητες σε σύγκριση με το Ρ(3HB) ή το Ρ(3HB-co-3HV) (Fukui & Doi 1997). H σταθερότητα της σύνθεσης του πολυμερούς είναι ένα σημαντικό σημείο στην παραγωγή των PHAs από σύνθετα απόβλητα και μικτές καλλιέργειες. Αυτό είναι το κρίσιμο σημείο στη βιομηχανική παραγωγή των PHAs δεδομένου ότι τα ρεύματα αποβλήτων είναι συχνά ευαίσθητα σε εποχιακές και διαδικαστικές διακυμάνσεις. Κατά την διεργασία τριών σταδίων, αυτό το πρόβλημα μπορεί να λυθεί με το χειρισμό των λειτουργικών παραμέτρων στο στάδιο της οξεογένεσης (Albuquerque et al., 2007). 133

168 Πίνακας 5.1. Χαρακτηριστικές παράμετροι παραγωγής PHAs από μικτές καλλιέργειες επιλεγμένες υπό αναερόβιες/αερόβιες συνθήκες. Στάδιο επιλογής μικροβιακού πληθυσμού Σύστημα Υπόστρωμα Σύστημα Υπόστρωμα AN/AE AN/AE AN/AE Οξικό Μίγμα οξικού, προπιονικού, εκχυλίσματος ζύμης και πεπτόνης Επεξεργασμένες μελάσες ΑΕ Οξικό Στάδιο συσσώρευσης PHAs Διαλυτό ΧΑΟ (g/l) Υ P/S r PHAs/X % PHAs ΑΝ/ΑΕ/ΑΝ ΑΝ ΑΕ Επεξεργασμένα υπολείμματα τροφών Επεξεργασμένες μελάσες Σύσταση ΡΗΑs 3HB/3HV 93:7 3HB/3HV 70:30 3HB/3HV 77:23 3HB/3HV/3HHx 56:43:1 Αναφορά Dias et al., 2007 Rhu et al., 2003 Pisco et al., 2008 AN/AE Επεξεργασμένα απόβλητα χατροβιομηχανίας ΑΕ Επεξεργασμένα απόβλητα χατροβιομηχανίας HB/3HV/3HMV 62:29:9 Bengtsson 3HB/3HV/3HMV 33:51:16 et al., 2008b AN/AE Επεξεργασμένο αστικό απόβλητο ΑΕ Επεξεργασμένο αστικό απόβλητο HB/3HV 50:50 Coats et al., 2007 Y P/S : g COD PHAs/g COD πηγής άνθρακα, r PHAs/X : g COD PHAs/g COD ξηρής κυτταρικής βιομάζας h, % PHAs: (g PHAs/g ξηρής κυτταρικής βιομάζας)*100, Σύσταση PHAs: % mol 134

169 Οι αποδόσεις σε PHAs που λαμβάνονται από μικτές καλλιέργειες που επιλέγονται κάτω από αερόβιες δυναμικές συνθήκες στις περισσότερες περιπτώσεις κυμαίνονται μεταξύ g COD PHA/g διαλυτού ΧΑΟ. Μια μεγαλύτερη απόδοση της τάξεως των 1.00 g COD PHA/g διαλυτού COD αναφέρθηκε από τους Dionisi κ.ά. (Dionisi et al., 2005b), στον υπολογισμό της οποίας όμως δεν συμπεριλήφθηκε ο συνολικός άνθρακας που καταναλώθηκε, εκτός των VFAs. Επίσης, στην εργασία των Gurieff κ.ά. (Gurieff et al., 2007) οι υψηλές αποδόσεις που ελήφθησαν, 0.83 και 0.84 g COD PHA/g διαλυτού COD, προέκυψαν με τη συμβολή και άλλων πηγών άνθρακα πέραν των VFAs. Οι χαμηλότερες ΡΗΑ αποδόσεις, και 0.14 g COD PHA/g διαλυτού COD, παρατηρήθηκαν αντίστοιχα με χρήση βιομηχανικών αποβλήτων (Dionisi et al., 2006a) και υγρών αποβλήτων κονσερβοποιείων ντομάτας (Liu et al., 2008). Οι διαφορές στις τιμές των ΡΗΑ αποδόσεων μπορούν να συσχετιστούν με τη σύσταση του θρεπτικού μέσου διότι στις παραπάνω έρευνες χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές συστάσεις και συγκεντρώσεις VFAs. Οι ΡΗΑ αποδόσεις που έχουν επιτευχθεί, με εξαίρεση εκείνη που αναφέρεται από τους Dionisi κ.ά. (Dionisi et al., 2005b), ήταν χαμηλότερες εκείνων που λήφθηκαν από τους Serafim κ.ά., (Serafim et al., 2004) χρησιμοποιώντας οξικό οξύ, 0.87 g COD PHA/g διαλυτού COD. Αυτή η διαφορά είναι αναμενόμενη καθώς τα επεξεργασμένα υποστρώματα περιέχουν, εκτός από το οξικό οξύ, άλλα μεγαλύτερου μήκους VFAs, τα οποία αντίθετα με το οξικό οξύ, μπορούν να αποκαρβοξυλιωθούν στο μονοπάτι της σύνθεσης των PHAs με αποτέλεσμα την μικρότερη παραγωγή πολυμερούς ανά μονάδα άνθρακα που προσλαμβάνεται. Οι ΡΗΑ αποδόσεις που επιτυγχάνονται από καλλιέργειες που επιλέγονται κάτω από AN/AE συνθήκες κυμαίνονται από g COD PHA/g διαλυτού COD ανάλογα με το υπόστρωμα και τις συνθήκες που χρησιμοποιούνται. Εξαιρουμένης της εργασίας των Coats κ.ά. (Coats et al., 2007), οι τιμές των αποδόσεων ήταν χαμηλότερες από εκείνη που αναφέρθηκε από τους Dai κ.ά. (Dai et al., 2007) χρησιμοποιώντας οξικό οξύ που ήταν 0.85 g COD PHA/g διαλυτού COD. Επιπλέον, δεδομένου ότι το γλυκογόνο χρησιμοποιείται ως ενδοκυτταρικό υπόστρωμα για τη σύνθεση των PHAs, αναμενόταν ότι οι αποδόσεις που λαμβάνονται από τις καλλιέργειες που επιλέγονται υπό AN/AE συνθήκες θα έπρεπε να είναι πολύ υψηλότερες από αυτές που λαμβάνονται από τις καλλιέργειες που έχουν υποβληθεί σε αερόβιες δυναμικές συνθήκες, κάτι το οποίο δεν παρατηρήθηκε. 135

170 Πίνακας 5.2. Χαρακτηριστικές παράμετροι παραγωγής PHAs από μικτές καλλιέργειες επιλεγμένες υπό αερόβιες δυναμικές συνθήκες. Στάδιο επιλογής μικροβιακού πληθυσμού Σύστημα Υπόστρωμα Σύστημα Υπόστρωμα Στάδιο συσσώρευσης PHAs Διαλυτό ΧΑΟ (g/l) Υ P/S r PHAs/X % PHAs Σύσταση ΡΗΑs AE Οξικό ΑΕ Οξικό HB ΑΕ AΕ (SBR) AE (Συνεχές) AE Μίγμα οξικού, προπιονικού και γαλακτικού Επεξεργασμένες μελάσες Επεξεργασμένα απόβλητα χατροβιομηχανίας ΑΕ ΑΕ ΑΕ Επεξεργασμένα απόβλητα ελαιοτριβείου Επεξεργασμένες μελάσες Επεξεργασμένα απόβλητα χατροβιομηχανίας ΑΕ Αστικό απόβλητο ΑΕ Αστικό απόβλητο AE ΑΕ Απόβλητο κονσερβοποιίας τομάτας Επεξεργασμένα απόβλητα ζυθοποιίας ΑΕ ΑΕ Απόβλητο κονσερβοποιίας τομάτας Επεξεργασμένα απόβλητα ζυθοποιίας HB/3HV 89:11 3HB/3HV 83:17 3HB/3HV 84:16 3HB/3HV 39:61 3HB/3HV 83: Αναφορά Serafim et al., 2004 Dionisi et al., 2005b Albuquerque et al., 2008 Bengtsson et al., 2008a Dionisi et al., 2006a Liu et al., 2008 Mato et al., 2008 Y P/S : g COD PHAs/g COD πηγής άνθρακα, r PHAs/X : g COD PHAs/g COD ξηρής κυτταρικής βιομάζας h, % PHAs: (g PHAs/g ξηρής κυτταρικής βιομάζας)*100, Σύσταση PHAs: % mol 136

171 Με εξαίρεση τις εργασίες των Dionisi κ.ά. (Dionisi et al., 2005b, 2006a) και Liu κ.ά. (Liu et al., 2008), οι τιμές των αποδόσεων σε PHAs που λήφθηκαν κάτω από AN/AE ήταν λίγο μεγαλύτερες από εκείνες που επιτεύχθηκαν κάτω από αερόβιες δυναμικές συνθήκες. Οι ειδικοί ρυθμοί παραγωγής που λαμβάνονται από καλλιέργειες επιλεγμένες υπό AN/AE συνθήκες με χρήση επεξεργασμένων αποβλήτων ως υποστρώματα παίρνουν τις τιμές g COD PHA/g COD X.h. Εξαίρεση αποτελεί η εργασία των Bengtsson κ.ά. (Bengtsson et al., 2008b) όπου χρησιμοποιώντας οξικό οξύ επιτεύχθηκε παραγωγικότητα 0.25 g COD PHA/g COD X.h. Ωστόσο, καμία εκ των καλλιεργειών, που επιλέχθηκαν υπό αερόβιες δυναμικές συνθήκες και τροφοδοτήθηκαν με επεξεργασμένα απόβλητα, δεν παρουσίασε ειδικό ρυθμό παραγωγής ανάλογο με εκείνον που επιτεύχθηκε όταν χρησιμοποιήθηκε οξικό οξύ ( g COD PHA/g COD X.h έναντι 0.72 g COD PHA/g COD X.h) (Serafim et al., 2004). Οι Dionisi κ.ά. (Dionisi et al., 2005b) ανέφεραν την υψηλότερη ΡΗΑ απόδοση χρησιμοποιώντας απόβλητα, 0.42 g COD PHA/g COD X h, η οποία αντιστοιχεί σχεδόν στο ήμισυ της απόδοσης που επιτεύχθηκε με το οξικό οξύ. Παρά του υψηλούς ρυθμούς παραγωγής PHAs που λαμβάνονται από τις μικτές καλλιέργειες, οι ογκομετρικές παραγωγικότητες είναι χαμηλότερες σε σύγκριση με αυτές των καθαρών καλλιεργειών γεγονός το οποίο οφείλεται στις χαμηλές συγκεντρώσεις βιομάζας που επιτυγχάνονται κατά τις διαδικασίες των μικτών καλλιεργειών. Η μέγιστη συγκέντρωση κυτταρικής βιομάζας που έχει αναφερθεί όταν χρησιμοποιούνται συστήματα αερόβιων δυναμικών συνθηκών είναι 6.1 g/l (Dionisi et al., 2006b) και είναι κατά πολύ χαμηλότερη από την συγκέντρωση της κυτταρικής βιομάζας των καθαρών καλλιεργειών που συνήθως είναι πάνω από 80 g/l (Lee et al., 1999). Οι Dias κ.ά. (Dias et al., 2006), βασισμένοι σε μοντέλο που ανέπτυξαν για την παραγωγή των PHAs από οξικό οξύ, κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η συγκέντρωση κυτταρικής βιομάζας επάνω από 10 g/l σε συστήματα αερόβιων δυναμικών συνθηκών είναι αρκετή για να καταστήσει συγκρίσιμες τις ογκομετρικές παραγωγικότητες μικτών και καθαρών καλλιεργειών. Η αύξηση της συγκέντρωσης της κυτταρικής βιομάζας θα ήταν δυνατή εάν οι μικροβιακοί πληθυσμοί που επιλέγονται έχουν και υψηλό ρυθμό ανάπτυξης και μεγάλη δυναμικότητα συσσώρευσης PHAs. Ωστόσο οι συνθήκες κάτω από τις 137

172 οποίες μπορούν ταυτόχρονα να επιτευχθούν αυτοί οι στόχοι δεν έχουν διευκρινιστεί για τις διεργασίες μικτών καλλιεργειών. Εκτός από τις ειδικές και τις ογκομετρικές παραγωγικότητες, η περιεκτικότητα PHA στα κύτταρα είναι μια από τις σημαντικότερες παραμέτρους που βοηθά στην αξιολόγηση της αποδοτικότητας και του πρακτικού ενδιαφέροντος της διεργασίας. Η περιεκτικότητα σε PHAs έχει άμεση επίδραση στο κόστος της διεργασίας. Όσο χαμηλότερη είναι η περιεκτικότητα σε PHAs τόσο μεγαλύτερο είναι το κόστος ανάκτησής τους. Έρευνες που αφορούν τη βελτιστοποίηση της περιεκτικότητας των PHAs έχουν πραγματοποιηθεί μεταβάλλοντας τις παραμέτρους λειτουργίας του αντιδραστήρα όπως: το καθεστώς τροφοδοσίας (Alburquerque et al., 2008; Pisco et al., 2008), το λόγο της πηγής άνθρακα ως προς την πηγή αμμωνίας ή το λόγο της πηγής άνθρακα ως προς την πηγή φωσφόρου (Serafim et al., 2004; Din et al., 2006; Bengtsson et al., 2008a; Mato et al., 2008), το ρυθμό οργανικής φόρτισης (Dionisi et al., 2005a, 2006b, 2007), το ph (Serafim et al., 2004; Majone et al., 2008), ή τη θερμοκρασία (Krishna & van Loosdrecht, 1999). Για συνθετικό υπόστρωμα, οι αντιδραστήρες διαλείποντος έργου (παροχή θρεπτικού μέσου σε παλμούς) τροφοδοτούμενοι με θρεπτικό μέσο με χαμηλή περιεκτικότητα σε αμμωνία φαίνεται πως δίνουν την μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε PHAs αφού επιτυγχάνεται ποσοστό 65% g PHAs/g ξηρής κυτταρικής μάζας (Serafim et al., 2004). Οι Dionisi κ.ά. (Dionisi et al., 2006b) εξέτασαν ένα εύρος ρυθμών οργανικής φόρτισης που κυμαίνονταν μεταξύ 8.5 και g COD/l d -1 λαμβάνοντας την μέγιστη κυτταρική ΡΗΑ περιεκτικότητα με οργανική φόρτιση 20 g COD/l d -1 (45.8%). Επιπλέον, η σύνθεση του θρεπτικού μέσου (τύπος και ποσότητα του κάθε πτητικού λιπαρού οξέος) παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην περιεκτικότητα σε PHA καθώς επίσης και στην δομή του πολυμερούς. Η προσπάθεια σύγκρισης των ποσοστών συσσώρευσης PHAs στις μικτές καλλιέργειες που τροφοδοτούνται με διάφορα σύνθετα υποστρώματα δεν είναι δυνατή από την στιγμή που η σύσταση και η ποσότητα των πηγών άνθρακα, στο θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιήθηκε σε κάθε μελέτη, ήταν διαφορετικές. 138

173 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 5 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ Albuquerque M.G.E., Torres C., Bengtsson S., Werker A., Reis M.A.M. Strategies for culture selection in a three-stage PHA production process from sugar cane molasses. Proceedings II of 4th IWA (SBR4), 7 10 April, Rome, Italy, pp. 2 4, Albuquerque M.G.E., Eiroa M., Torres C., Nunes B.R., Reis M.A.M. Strategies for the development of a side stream process for polyhydroxyalkanoate (PHA) production from sugar cane molasses. J.Biotechnol. 130, pp , Anderson A.J. & Dawes E.A. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microb. Rev. 54, pp , Beccari M., Majone M., Masanisso P., Ramadori R. A bulking sludge with high storage response selected under intermittent feeding. Water Res. 32, pp , Bengtsson S., Werker A., Christensson M., Welander T. Production of polyhydroxyalkanoates by activated sludge treating a paper mill wastewater. Biores. Technol. 99, pp , 2008a. Bengtsson S., Werker A., Welander T. Production of polyhydroxyalkanoates by glycogen accumulating organisms treating a paper mill wastewater. Proceedings of 4th IWA (SBR4), 7 10 April, Rome, Italy, pp , 2008b. Bengtsson S., Pisco A.R., Reis M.A.M., Lemos P.C Production of polyhydroxyalkanoates from fermented sugar cane molasses by a mixed culture enriched in glycogen accumulating organisms, J. Biotechnol. 145, pp , Beun J.J., Paletta F., van Loosdrecht M.C.M., Heijen J.J. Stoichiometry and kinetics of polyhydroxybutyrate metabolism in aerobic, slow growing, activated sludge cultures. Biotechnol. Bioeng. 67, pp , Beun J.J., Dirks K., van Loosdrecht M.C.M., Heijnen J.J. Poly-(hydroxybutyrate) metabolism in dynamically fed mixed microbial cultures. Water Res. 36, pp , Carta F, Beun J.J., van Loosdrecht M.C.M., Heijnen J.J. Simultaneous storage and degradation of PHB and glycogen in activated sludge cultures. Water Res. 35, pp ,

174 Chech J.S. & Hartmann P. Competition between polyphosphate and polysaccharide accumulating bacteria in enhanced biological phosphate removal systems. Water Res. 27, pp , Coats E.R., Loge F.J., Wolcott M.P., Englund K., McDonald A.G. Synthesis of polyhydroxyalkanoates in municipal wastewater treatment. Water Environ. Res. 79, pp , Comeau Y., Hal K.J., Huncok R.E.W., Oldham W.R. Biochemical model for enhanced biological phosphorus removal. Water Res. 20, pp , Dai Y., Yuan Z., Jack K., Keller J. Production of targeted poly(3- hydroxyalkanoates) copolymers by glycogen accumulating organisms using acetate as sole carbon source. J. Biotechnol. 129, pp , Daiger G.T. & Grady P.L. The dynamics of microbial growth on soluble substrates: a unifying theory. Water Res. 16, pp , Dias J.M.L., Lemos P.C., Serafim L.S., Oliveira C., Eiroa M., Albuquerque M.G.E., Ramos A.M., Oliveira R., Reis M.A.M. Recent advances in polyhydroxyalkanoate production by mixed aerobic cultures: from the substrate to the final product. Macromol. Biosci. 6, pp , Dias J.M.L., Oehmen A., Serafim L.S., Lemos P.C., Reis M.A.M., Oliveira R. Metabolic modeling of polyhydroxyalkanoate copolymers production by mixed microbial cultures. BMC Syst. Biol. 2:59, Din M.F.M., Ujang Z., van Loosdrecht M.C.M., Ahmad A., Sairan M.F. Optimisation of nitrogen and phosphorus limitation for better biodegradable plastic production and organic removal using single fed-batch mixed cultures and renewable resources. Water Sci. Technol. 53, pp , Dionisi D., Majone M., Papa V., Beccari M. Biodegradable polymers from organic acids by using activated sludge enriched by aerobic periodic feeding. Biotechnol. Bioeng. 85, pp , Dionisi D., Beccari M., Di Gregorio S., Majone M., Petrangeli Papini M., Vallini G. Storage of biodegradable polymers by an enriched microbial community in a sequencing batch 140

175 reactor operated at high organic loading rate. J Chem. Tech. Biotech. 80, pp , 2005a. Dionisi D., Carucci G., Papini M.P., Riccardi C, Majone M., Carrasco F. Olive oil mill effluents as a feedstock for production of biodegradable polymers. Water Res. 39, pp , 2005b. Dionisi D., Majone M., Levantesi C., Bellani A., Fuoco A. Effect of feed length on settleability, substrate uptake and storage in a sequencing batch reactor treating an industrial wastewater. Environ. Technol. 27, pp , 2006a. Dionisi D., Majone M., Vallini G., Di Gregorio S., Beccari M. Effect of applied organic load rate on biodegradable polymer production by mixed microbial cultures in a sequencing batch reactor. Biotechnol. Bioeng. 93, pp , 2006b. Filipe C.D.M., Daigger G.T., Leslie Grady C.P. A metabolic model for acetate uptake under anaerobic condition by glycogen accumulating organisms: stoichiometry, kinetics, and the effect of ph. Biotechnol. Bioeng. 76, pp , Fukui T., Doi Y. Cloning and Analysis of the Poly(3- Hydroxybutyrate-co-3-Hydroxyhexanoate) Biosynthesis Genes of Aeromonas caviae. J. Bacteriol. 179, pp , Gurieff N.B. Production of biodegradable polyhydroxyalkanoate polymers using advanced biological wastewater treatment process technology. Doctoral thesis (University of Queensland), Hesselmann R.P.X., van Rammell R., Resnick S.M., Hany R., Zehnder A.J.B. Anaerobic metabolism of bacteria performing enhanced biological phosphate removal. Water Res. 34, pp , Krishna C. & van Loosdrecht M.C.M. Effect of temperature on storage polymers and settleability of activated sludge. Water Res. 33, pp , Lee S.Y., Choi J., Wong H.H. Recent advances in polyhydroxyalkanoate production by bacterial fermentation: mini-review. Int. J. Biol. Macromol. 25, pp , Lemos P.C., Serafim L.S., Santos M.M., Reis M.A.M., Santos H. Metabolic pathway for propionate utilization by phosphorus accumulating organisms in activated sludge: 13 C labeling and in vivo NMR. Appl. Env. Microbiol 69, pp ,

176 Lemos P.C., Serafim L.S., Reis M.A.M. Synthesis of polyhydroxyalkanoates from different shortchain fatty acids by mixed cultures submitted to aerobic dynamic feeding. J. Biotechnol. 122, pp , Lemos P.C., Dai Y., Yuan Z., Santos H., Keller J., Reis M.A.M. Metabolism of glycogenaccumulating organisms (GAO) revealed by in vivo 13C nuclear magnetic resonance. Enviro. Microbiol. 9, pp , Liu H.Y., Hall P.V., Darby J.L., Coats E.R., Green P.G., Thompson D.E., Loge F.J. Production of polyhydroxyalkanoate during treatment of tomato cannery wastewater. Water Environ. Res. 80, pp , Majone M., Masanisso P., Carucci A., Lindrea K., Tandoi V. Influence of storage on kinetic selection to control aerobic filamentous bulking. Water Sci. Techol. 34, pp , Majone M., Dionisi D., Villano M., Beccari M. Proceedings of 4th IWA (SBR4), 7 10 April, Rome, Italy, pp , Mato T., Ben M., Kennes C., Veiga M.C. PHA production using brewery wastewater. Proceedings of 4th IWA (SBR4), 7 10 April, Rome, Italy, pp , Maurer M., Gujer W., Hang R., Bachman S. Intracellular carbon flow in phosphorus accumulating organisms from sludge systems. Water Res. 31, pp , Mino T., Tsuzuki Y., Matsuo T. Effect of phosphorus accumulation on acetate metabolism in biological phosphorus removal process. In: Ramadori R, editor. Proceedings IAWPRC Int. Conf. on biological phosphate removal from wastewaters. Adv. Wat. Pollut. Cont. London: Pergamon pp , Mino T., Liu W.T., Satoh H., Matsuo T. Possible metabolism of polyphosphate accumulating organisms (PAOs) and glycogen non accumulating organisms (GAOs) in enhanced biological phosphate removal process. Proceedings 10th Forum Appl. Biotechnol. Brugge, Belgium, pp , Mino T., van Loosdrecht M.C.M., Heijnen J.J. Microbiology and biochemistry of enhanced biological phosphate removal process. Water Res. 32, pp ,

177 Oehmen A., Lemos P.C., Carvalho G., Yuan Z., Keller J., Blackall L.L., Reis M.A.M. Advances in enhanced biological phosphorus removal: from micro to macro scale. Water Res. 30, pp , Pereira H., Lemos P.C., Carrondo M.J.T., Crespo J.P.S.G., Reis M.A.M., Santos H. Model for carbon metabolism in biological phosphorus removal processes based on in vivo 13C- NMR labeling experiments. Water res 30, pp , Pisco A.R., Bengtsson S., Werker A., Reis M.A.M., Lemos P.C. Use of industrial By-products for polyhydroxyalkanoates production by glycogen-accumulating organisms. Proceedings of the 5th IWA, 1 4 June, Zurich, Switzerland, Rehm B.H.A. Polyester synthases: natural catalysts for plastics. Biochem. J. 376, pp , Rhu D.H., Lee W.H., Kim J.Y., Choi E. Polyhydroxyalkanoate (PHA) production from waste. Water Sci. Technol. 48, pp , Saito Y., Soejima T., Tomozawa T., Doi Y., Kiya F. Production of biodegradable plastics from volatile acids using activated sludge. Environ. Systems Eng. 52, pp , Salehizadeh H. & van Loosdrecht M.C.M. Production of polyhydroxyalkanoates: recent trends and biotechnological importance. Biotechnol. Adv. 22, pp , Satoh H., Iwamoto Y., Mino T., Matsuo T. Activated sludge as a possible source of biodegradable plastic. Water Sci. Technol. 38, pp , Serafim L.S., Lemos P.C., Oliveira R.F., Reis M.A.M. Optimisation of polyhydroxybutyrate production by mixed cultures submitted to aerobic dynamic feeding conditions. Biotechol. Bioeng. 87, pp , Serafim L.S., Torres C., Reis M.A.M., Ramos A.M. The influence of process parameters on the characteristics of polyhydroxyalkanoates produced by mixed cultures. Macromol. Biosci., pp , Ueno T., Satoh H., Mino T., Matsuo T. Production of biodegradable plastics. Polym. Preprint. 42, pp , Yamane T. Yield of poly-d(-)-3-hydroxybutyrate from various carbon sources: a theoretical study. Biotechnol. Bioeng. 41, pp ,

178 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Υλικά και μέθοδοι Σε αυτό το κεφάλαιο παρατίθενται οι αναλυτικές μέθοδοι, οι πειραματικές διατάξεις και τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την διεξαγωγή των πειραμάτων που αφορούν την παραγωγή πολυ-υδροξυαλκανεστέρων. Επίσης περιγράφεται η διαδικασία εμπλουτισμού ενεργού ιλύος σε ΡΗΑ συσσωρευτές, τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιήθηκαν καθώς και η διαδικασία απομόνωσης στελεχών που αποτελούν την εμπλουτισμένη σε ΡΗΑ συσσωρευτές καλλιέργεια Αναλυτικές μέθοδοι Μέτρηση ph Η μέτρηση του ph πραγματοποιήθηκε ποτενσιομετρικά, με εμβάπτιση κατάλληλου ηλεκτροδίου φορητού πεχαμέτρου της εταιρίας Hanna HI 8224 στο προς ανάλυση δείγμα Μέτρηση διαλυτού οξυγόνου D.O. Η μέτρηση της συγκέντρωσης του διαλυτού οξυγόνου πραγματοποιήθηκε εμβαπτίζοντας ηλεκτρόδιο φορητού οξυγονόμετρου της εταιρείας Hanna DO 9146 στο προς ανάλυση δείγμα Προσδιορισμός ολικών και πτητικών αιωρούμενων στερεών Ο προσδιορισμός των ολικών και των πτητικών αιωρούμενων στερεών πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις μεθόδους 2540 D και 2540 E, αντίστοιχα, όπως περιγράφονται στο εγχειρίδιο Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater (APHA, 1995). 144

179 Τα ολικά αιωρούμενα στερεά (TSS) είναι το κλάσμα των μη διηθούμενων ολικών στερεών. Ένα καλά ομογενοποιημένο δείγμα διηθείται σε προζυγισμένο ηθμό ινών ύαλου (Glass Fiber Filters-GFF της εταιρείας Whatman) και το στερεό υπόλειμμα που κατακρατείται στον ηθμό ξηραίνεται μέχρι σταθερού βάρους στους ο C. Η αύξηση του βάρους του ηθμού εκφράζει τα ολικά αιωρούμενα στερεά. Τα πτητικά αιωρούμενα στερεά (VSS) είναι το κλάσμα των ολικών αιωρούμενων στερεών που πτητικοποιείται στους 550 ο C. Ο προσδιορισμός των πτητικών αιωρούμενων στερεών ενός δείγματος λαμβάνει χώρα με πύρωση του ηθμού, στον οποίο έχουν κατακρατηθεί τα ολικά αιωρούμενα στερεά, μέχρι σταθερού βάρους στους 550 ο C. Η ελάττωση του βάρους του ηθμού εκφράζει τα πτητικά αιωρούμενα στερεά Προσδιορισμός χημικά απαιτούμενου οξυγόνου Ως χημικά απαιτούμενο οξυγόνο (COD) ορίζεται η ισοδύναμη ποσότητα οξυγόνου σε ένα ισχυρό οξειδωτικό μέσο που απαιτείται για την πλήρη χημική οξείδωση των οργανικών συστατικών ενός δείγματος. Η οξείδωση του οργανικού υλικού ενός δείγματος γίνεται από περίσσεια διχρωμικού καλίου (K 2 Cr 2 O 7 ) με θέρμανση (148 ο C) σε ισχυρά όξινες συνθήκες (πυκνό H 2 SO 4 ) παρουσία καταλύτη (AgSO 4 ). Για να αποφευχθεί η δέσμευση των ιόντων αργύρου από χλωριούχα, βρωμιούχα και ιωδιούχα ιόντα, που συνήθως υπάρχουν στα διάφορα απόβλητα, λαμβάνει χώρα προσθήκη ιόντων υδραργύρου (HgSO 4 ), τα οποία συμπλοκοποιούνται με τα ανιόντα αλογόνων, σχηματίζοντας ίζημα. Η γενική αντίδραση οξείδωσης του οργανικού υλικού από τα διχρωμικά ιόντα περιγράφεται από την ακόλουθη εξίσωση: C n H a O b N c + dcr 2 O (8d+c)H + nco 2 + a 8d 3c H 2 O + cnh dCr 3+ (εξ. 6.1) 2 όπου d= 2 n a b c

180 Ο προσδιορισμός του χημικά απαιτούμενου οξυγόνου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις μεθόδους 5220 Β και 5220 D που περιγράφονται στο εγχειρίδιο Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater (APHA, 1995). Πιο συγκεκριμένα, για τον προσδιορισμό του διαλυτού χημικά απαιτούμενου οξυγόνου εφαρμόζεται η μέθοδος της κλειστής επαναρροής με φωτομέτρηση στα 600 nm των παραγόμενων ιόντων Cr 3+ (5220 D), κατά την οξείδωση διηθήματος οργανικού δείγματος. Τέλος, η μέθοδος της ανοιχτής επαναρροής με τιτλοδότηση των εναπομείνοντων ιόντων Cr 6+ (5220 Β), χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του ολικού χημικά απαιτούμενου οξυγόνου Προσδιορισμός υδατανθράκων Ο προσδιορισμός των υδατανθράκων βασίζεται στη διάσπαση των πολυσακχαριτών σε μονομερή, η οποία λαμβάνει χώρα σε όξινες συνθήκες (διάλυμα L-τρυπτοφάνης, βορικού οξέος και θειικού οξέος) και σε υψηλές θερμοκρασίες (χώνευση των δειγμάτων σε υδατόλουτρο στους 100 ο C για 20 min), και στη δημιουργία έγχρωμων συμπλόκων του αμινοξέος της L-τρυπτοφάνης με τα μονομερή, τα οποία προσδιορίζονται με φωτομέτρηση στα 520 nm (Josefsson, 1983; Eberlein & Schutt, 1986). Σύμφωνα με τη μέθοδο, το αμινοξύ L- τρυπτοφάνη μπορεί να σχηματίζει σύμπλοκα με αρκετά διαφορετικά μονομερή. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των υδατανθράκων (ολικών και διαλυτών) έγινε με χρήση πρότυπης καμπύλης οπτικής απορρόφησης συναρτήσει της συγκέντρωσης πρότυπων διαλυμάτων D-γλυκόζης Προσδιορισμός ολικού αζώτου Ο προσδιορισμός του ολικού αζώτου στα προς ανάλυση δείγματα πραγματοποιήθηκε κάνοντας χρήση τεστ φιαλιδίων της εταιρείας HACH LANGE με κωδικό LCK238 με εύρος συγκεντρώσεων 5-40 mg/l. Βάση της μεθόδου αυτής τόσο το ανόργανο όσο και το οργανικά συνδεδεμένο άζωτο οξειδώνεται σε νιτρικά μέσω χώνευσης με υπεροξοδιθειικό άλας. Τα νιτρικά ιόντα σε συνέχεια αντιδρούν με την 2,6-διμεθυλοφαινόλη σε ένα διάλυμα θειικού και 146

181 φωσφορικού οξέος σχηματίζοντας νιτροφαινόλη. Τέλος τα δείγματα φωτομετρούνται σε φασματοφωτόμετρο ορατού HACH LANGE DR2800 και μήκος κύματος 345 nm Προσδιορισμός αμμωνιακού αζώτου Για τον προσδιορισμό του αμμωνιακού αζώτου χρησιμοποιήθηκε η φασματοφωτομετρική μέθοδος της φαινόλης 4500-ΝΗ 3 D σύμφωνα με το Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, 1995). Η μέθοδος αυτή βασίζεται στον σχηματισμό της κυανόχρωμης ένωσης ινδοφαινόλης που προκύπτει από την αντίδραση του αμμωνιακού αζώτου, του υποχλωριώδους ιόντος και της φαινόλης η οποία καταλύεται από άλας μαγγανίου. Στη συνέχεια το προς ανάλυση δείγμα φωτομετράται σε μήκος κύματος 640 nm Προσδιορισμός νιτρικού αζώτου Ο προσδιορισμός του νιτρικού αζώτου, ΝΟ - 3 -Ν, έγινε με δύο τρόπους. Είτε - χρησιμοποιώντας την μέθοδο 4500-ΝΟ 3 Β σύμφωνα με το Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, 1995) είτε με την χρήση τεστ φιαλιδίων της εταιρείας HACH LANGE με κωδικό LCK339 και εύρος συγκεντρώσεων mg/l. Ο λόγος που χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικές μέθοδοί οφείλεται στον περιορισμό της μεθόδου ΝΟ 3 Β να παρέχει σωστές αναλύσεις σε δείγματα τα οποία χαρακτηρίζονται από υψηλό οργανικό φορτίο. - Σύμφωνα με την μέθοδο 4500-ΝΟ 3 Β τα δείγματα οξυνίζονται με την προσθήκη 1Ν υδροχλωρικού οξέος. Στην συνέχεια τα δείγματα φωτομετρούνται σε μήκος κύματος 220 nm. Επειδή όμως το διαλυτό οργανικό φορτίο αλλοιώνει την απορρόφηση στα 220 nm ενώ τα νιτρικά δεν απορροφούν στα 275 nm ακολουθεί και δεύτερη φωτομέτρηση στα 275 nm για να γίνει τυχόν διόρθωση στην τελική συγκέντρωση των νιτρικών. Εάν η τυπική απόκλιση μεταξύ των δύο τιμών στα 220 και 275 nm είναι μεγαλύτερη του 10% η συγκεκριμένη μέθοδος δεν ενδείκνυται. Όταν χρησιμοποιείται η μέθοδος των τεστ φιαλιδίων HACH LANGE LCK339 τα νιτρικά ιόντα αντιδρούν με την 2,6-διμεθυλοφαινόλη σε διάλυμα που περιέχει θειικό και φωσφορικό οξύ 147

182 σχηματίζοντας την 4-νίτρο-2,6-διμεθυλοφαινόλη. Τέλος τα δείγματα φωτομετρούνται σε φασματοφωτόμετρο ορατού HACH LANGE DR2800 και μήκος κύματος 345 nm Προσδιορισμός νιτρώδους αζώτου - Για τον υπολογισμό των νιτρωδών χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος 4500-ΝΟ 2 Β του εγχειριδίου Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, 1995). Η μέθοδος βασίζεται στον σχηματισμό ενός φούξια (κοκκινωπού μωβ) αζωτοχρώματος, το οποίο παράγεται σε ph από την σύζευξη διαζωνισμένου σουλφανιλαμιδίου με διυδροχλωρική Ν-(1-ναφθυλο)-αιθυλενοδιαμίνη. Τέλος τα προς ανάλυση δείγματα φωτομετρούνται σε μήκος κύματος 543 nm Προσδιορισμός πτητικών λιπαρών οξέων Πτητικά λιπαρά οξέα όπως το οξικό οξύ, το προπιονικό οξύ, το ισοβουτυρικό οξύ, το βουτυρικό οξύ, το ισοβαλερικό οξύ και το βαλερικό οξύ προσδιορίστηκαν ποιοτικά και ποσοτικά σε χρωματογράφο αερίων (Varian CP-3800), εξοπλισμένο με ανιχνευτή φλόγας ιονισμού (FID) και τριχοειδή στήλη HP-FFAP (Agilent technologies INC. 30m 0.53mm I.D μm film). Συνοπτικά, τα διηθημένα δείγματα (όγκου 1 ml) οξυνίζονται με προσθήκη διαλύματος 20% κατ όγκο H 2 SO 4 (30 μl). Στη συνέχεια, 1 μl οξυνισμένου δείγματος εγχέεται με μικροσύριγγα Hamilton στον εισαγωγέα δείγματος του χρωματογράφου σε θερμοκρασία 175 ο C. Το θερμοκρασιακό πρόγραμμα για τον προσδιορισμό των πτητικών λιπαρών οξέων είναι το ακόλουθο: η θερμοκρασία του φούρνου αυξάνεται από τους 105 ο C στους 160 ο C με ρυθμό 15 ο C/min και στη συνέχεια αυξάνεται στους 235 ο C με ρυθμό 20 ο C/min, όπου παραμένει για 3 min. Η θερμοκρασία του ανιχνευτή παραμένει σταθερή στους 225 ο C και το φέρον αέριο είναι He υψηλής καθαρότητας % κατ όγκο (15 ml/min). 148

183 Προσδιορισμός πολύ-υδροξυαλκανεστέρων Πολυυδροξυαλκανεστέρες όπως ο πολύ-3-υδροξυβουτυρικός Ρ(3ΗΒ), ο πολύ-3- υδροξυβαλερικός Ρ(3HV) και ο πολύ-3-υδροξυ-2-μεθυλοβαλερικός εστέρας P(3H2MV) προσδιορίστηκαν ποιοτικά και ποσοτικά σε χρωματογράφο αερίων (Varian CP-3800), εξοπλισμένο με ανιχνευτή φλόγας ιονισμού (FID) και τριχοειδή στήλη DB-5MS (Agilent technologies INC. 30 m 0.25 mm I.D μm film). Για τον προσδιορισμό τους χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα (R)-3-υδροξυβουτυρικού οξέος, συμπολυμερές (R)-3- υδροξυβουτυρικού και (R)-3-υδροξυβαλερικού οξέος αναλογίας 3:1. Για την ποσοτικοποίηση του P(3H2MV) λόγω της μη εμπορικής διαθεσιμότητας του χρησιμοποιήθηκε το 2- υδροξυκαπροικό οξύ (2-HHx) μιας και αυτό το μόριο είναι ισομερές του 3H2MV. Η μέθοδος που ακολουθήθηκε ήταν αυτή που περιγράφεται από τους Oehmen κ.ά. (Oehmen et al., 2005) με κάποιες μικρές παραλλαγές.. Τα πρότυπα αγοράστηκαν από τη εταιρεία Fluka Biochemika. Τα δείγματα της κυτταρικής βιομάζας πριν υποστούν την παρακάτω διαδικασία συλλέγονταν από τον αντιδραστήρα και διαχωρίζονταν από το υγρό κλάσμα μέσω φυγοκέντρησης, ψύχονταν για τουλάχιστον δύο ώρες στους -20 o C ενώ στην συνέχεια απομακρύνονταν η υγρασία των δειγμάτων μέσω μονάδας Freeze Dryer Telstar Cryodos 45 (κρυοξήρανση σε θερμοκρασία 45 ο C και πίεση 0.06 mbar). Τόσο τα πρότυπα όσο και η ξηρή κυτταρική βιομάζα τοποθετούνταν σε φιαλίδια πυρέξ όγκου 10 ml. Στην συνέχεια γινόταν προσθήκη 2 ml χλωροφορμίου και 2 ml οξινισμένης μεθανόλης (3% v/v πυκνού H 2 SO 4 ) η οποία εμπεριείχε 100 mg/l βενζοϊκό οξύ ως εσωτερικό πρότυπο. Έπειτα τα δείγματα οδηγούνταν προς χώνευση για 4 h στους 100 o C. Στην συνέχεια 1 ml απιονισμένου νερού εισαγόταν στα δείγματα και ακολουθούσε ανάμιξη έτσι ώστε να απομακρυνθούν κυτταρικά συστατικά από την φάση του χλωροφορμίου παραμένοντας στην διεπιφάνεια. Μετά την ανάμιξη τα δείγματα αφήνονταν σε ηρεμία για να πραγματοποιηθεί ο διαχωρισμός των φάσεων και στην συνέχεια συλλέγονταν η φάση του χλωροφορμίου στην οποία γινόταν προσθήκη Na 2 SO 4 για την απομάκρυνση τυχόν υγρασίας. Τέλος, 1 μl δείγματος εισάγονταν με μικροσύριγγα Hamilton στον εισαγωγέα δείγματος του χρωματογράφου σε θερμοκρασία 250 o C. Το θερμοκρασιακό πρόγραμμα για τον προσδιορισμό των PHAs είναι το εξής: η θερμοκρασία του φούρνου παραμένει στους 60 ο C για 1 min, έπειτα αυξάνεται στους 149

184 120 ο C με ρυθμό 10 ο C/min και τέλος στους 270 ο C με ρυθμό 45 ο C/min, όπου παραμένει για 5 min. Η θερμοκρασία του ανιχνευτή παραμένει σταθερή στους 300 ο C και το φέρον αέριο είναι He υψηλής καθαρότητας, % κατ όγκο, με ροή 1.5 ml/min Προσδιορισμός γλυκογόνου Το γλυκογόνο ανήκει στην κατηγορία των πολυσακχαριτών και είναι στην ουσία αποταμιευμένη μορφή (πολυμερές) της γλυκόζης. Για τον προσδιορισμό του γλυκογόνου στα μικροβιακά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν περίπου 20 mg ξηρής βιομάζας. Στα δείγματα γινόταν προσθήκη 1 ml HCl 0.6 M και στην συνέχεια τοποθετούνταν σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 100 ο C για 1 h για να γίνει διάσπαση των κυττάρων. Αφού η θερμοκρασία των δειγμάτων επανερχόταν σε θερμοκρασία δωματίου, γινόταν φυγοκέντρηση και 0.1 ml δείγματος χρησιμοποιούταν για τον προσδιορισμό της γλυκόζης. Ο προσδιορισμός της γλυκόζης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το εγχειρίδιο D-Glucose Assay Procedure (GOPOD-FORMAT) της εταιρείας Megazyme Απόσπαση ολικών πολύ-υδροξυαλκανεστέρων Για να γίνει η ανάκτηση των συνολικά παραγόμενων PHAs ακολουθείται μέθοδος που περιλαμβάνει την ανάκτηση του πολυμερούς από το κύτταρο με την βοήθεια διαλύτη και συγκεκριμένα χρησιμοποιώντας χλωροφόρμιο. Κατά το τέλος της πειραματικής διαδικασίας, δηλαδή στο χρονικό σημείο που αντιστοιχεί στην πλήρη κατανάλωση των οργανικών υποστρωμάτων, η κυτταρική βιομάζα συλλέγεται και διαχωρίζεται από το υγρό κλάσμα μέσω φυγοκέντρησης. Στην συνέχεια τα δείγματα ψύχονται στους -20 o C για τουλάχιστον δύο ώρες και ξηραίνονται μέσω μονάδας λυοφιλοποίησης για να απομακρυνθεί η υγρασία. Η ξηρή πλέον κυτταρική βιομάζα τοποθετείται σε συσκευή εκχύλισης Soxhlet SER 144 προσθέτοντας χλωροφόρμιο σε αναλογία 50 ml/g ξηρής κυτταρικής βιομάζας. Το διάλυμα αφήνεται σε βρασμό στους 100 ο C για 4 h ενώ στην συνέχεια αφού επανέλθει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος διηθείται για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα με την βοήθεια 150

185 ηθμού ινών ύαλου (Glass Fiber Filters-GFF της εταιρείας Whatman). Στο διηθημένο κλάσμα του χλωροφορμίου εμπεριέχονται τα αποσπώμενα πολυμερή. Στη συνέχεια πραγματοποιείται καταβύθιση σε μεθανόλη προσθέτοντας μεθανόλη στο διάλυμα του χλωροφορμίου σε αναλογία 9:1 (μεθανόλη:χλωροφόρμιο) ώστε να πραγματοποιηθεί περαιτέρω καθαρισμός των PHAs. Τέλος το διάλυμα διηθείται ξανά και τα PHAs ανακτώνται στην μορφή λεπτού υμενίου μετά από εξάτμιση του διαλύτη στους 60 o C Υλικά Καλλιέργειες μικροοργανισμών Μικτή εμπλουτισμένη καλλιέργεια Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε ως εμβόλιο ενεργός ιλύς από την αερόβια δεξαμενή της μονάδας Βιολογικού Καθαρισμού της πόλης των Πατρών. Ο εμπλουτισμός της μικτής αυτής καλλιέργειας σε ΡΗΑ συσσωρευτές πραγματοποιήθηκε υπό εναλλασσόμενες αερόβιες δυναμικές συνθήκες. Ο εμπλουτισμός μικτών καλλιεργειών σε ΡΗΑ συσσωρευτές που λαμβάνει χώρα υπό αερόβιες δυναμικές συνθήκες μπορεί να περιγραφεί ως εξής: θρεπτικό μέσο πλούσιο τόσο σε πηγή άνθρακα όσο και σε πηγή αζώτου παρέχεται στον αντιδραστήρα στην αρχή κάθε αερόβιου κύκλου. Οι μικροοργανισμοί είναι σε θέση να αναπτυχθούν ή και να συσσωρεύσουν ενδοκυτταρικά πηγή άνθρακα και ενέργειας στην μορφή των PHAs μέχρις εξαντλήσεως του εξωκυτταρικά παρεχόμενου άνθρακα. Αυτή η φάση ονομάζεται φάση υπερεπάρκειας υποστρώματος. Εφόσον λοιπόν η πηγή άνθρακα έχει εξαντληθεί ακολουθεί η φάση έλλειψης / πενίας πηγής άνθρακα κατά την οποία τα βακτήρια όπου προηγουμένως έχουν αποθηκεύσει κάποιο μέρος της πηγής άνθρακα σε PHAs έχουν την ικανότητα να συνεχίσουν την ανάπτυξη τους καταναλώνοντας την υπολειπόμενη πηγή αζώτου ενώ τα βακτήρια που δεν έχουν την ικανότητα να συσσωρεύουν PHAs λιμοκτονούν. Αυτή η διαδικασία εμπλουτισμού αν επαναληφθεί με συνεχή τρόπο οι μικροοργανισμοί που είναι σε θέση να αποθηκεύσουν PHA 151

186 θα εμπλουτιστούν δεδομένου ότι έχουν ανταγωνιστικό πλεονέκτημα σε ένα τέτοιο σύστημα. Οι PHA-συσσωρευτές καταναλώνουν την πηγή άνθρακα πολύ γρήγορα ενώ συνεχίζουν να αναπτύσσονται στη μακρόχρονη φάση πενίας. Οι ΡΗΑ-συσσωρευτές καταναλώνουν τον παρεχόμενο άνθρακα με γρήγορο ρυθμό και τον αποθηκεύουν ως PHAs εξασφαλίζοντας με τον τρόπο αυτό μεγαλύτερη ποσότητα υποστρώματος και συνεπώς μπορούν να παράγουν μεγαλύτερες ποσότητες βιομάζας. Σε ένα τέτοιο σύστημα λοιπόν ο ανταγωνισμός των βακτηρίων βασίζεται στον ρυθμό κατανάλωσης υποστρώματος και όχι στον ρυθμό ανάπτυξης. Η στρατηγική που επιλέχθηκε για τον εμπλουτισμό της ενεργούς ιλύος σε ΡΗΑσυσσωρευτές στην παρούσα εργασία είναι ένας εναλλακτικός τρόπος υποβολής των μικροοργανισμών σε αερόβιες δυναμικές συνθήκες. Συγκεκριμένα, αρχικά στην μικτή καλλιέργεια παρέχεται υπόστρωμα πλούσιο σε άνθρακα και άλλα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά, όπως φαίνεται στον πίνακα 7.1., απουσία πηγής αζώτου. Σε αυτό το στάδιο δεν μπορεί να σημειωθεί ανάπτυξη των μικροοργανισμών παρά μόνο ενδοκυτταρική συσσώρευση των PHAs από μικροοργανισμούς που έχουν αυτή την ικανότητα, ενώ οι μη επιθυμητοί μικροοργανισμοί λιμοκτονούν. Στην συνέχεια, εφόσον έχει εξαντληθεί η πηγή άνθρακα, πραγματοποιείται καθίζηση και απομάκρυνση του υπερκείμενου υγρού για να γίνει πλήρωση του αντιδραστήρα με νέο θρεπτικό μέσο πλούσιο σε άζωτο και απαραίτητα θρεπτικά στοιχεία απουσία πηγής άνθρακα. Σε αυτή την φάση οι μικροοργανισμοί που προηγουμένως είχαν συσσωρεύσει PHAs χρησιμοποιούν αυτή την αποθήκη άνθρακα με ταυτόχρονη κατανάλωση της εξωτερικής πηγής αζώτου για να αναπτυχθούν. Σε ένα τέτοιο σύστημα η συμπεριφορά των μικροοργανισμών που κρίνει την επιτυχία της διαδικασίας εμπλουτισμού είναι αυτή που οδηγεί στην παραγωγή νέας βιομάζας κατά την διάρκεια ενός κύκλου λειτουργίας Στελέχη του γένους Pseudomonas που απομονώθηκαν από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια. Για την απομόνωση των μικροβιακών στελεχών που απαρτίζουν την εμπλουτισμένη μικτή καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε αραιωμένο δείγμα (10-4 με 10-8 ) από την εμπλουτισμένη 152

187 καλλιέργεια για την ανάπτυξη αποικιών σε τρυβλία Petri. Η επίστρωση των τρυβλίων Petri πραγματοποιήθηκε υπό ασηπτικές συνθήκες με αποστειρωμένο θρεπτικό μέσο που περιείχε άγαρ (15 g/l) και οξέα (όπως αυτό περιγράφεται στον πίνακα 6.1 παρουσία πηγής αζώτου). Δείγματα από κάθε αραίωση εμβολιάστηκαν στα τρυβλία Petri με την τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης ενώ στην συνέχεια επωάστηκαν στους 30 ο C για 40 ώρες. Εικόνα 6.1. Σχηματιζόμενες αποικίες μικροοργανισμών του γένους Pseudomonas σε τρυβλία Petri Η ταυτοποίηση των βακτηριακών στελεχών πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με το Πανεπιστήμιο της Γρανάδα (Institute of Water Research, Environmental Microbiology Research Group) στα πλαίσια του ευρωπαϊκού προγράμματος POLYVER COOP-CT Η τεχνική που ακολουθήθηκε ήταν αυτή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction-PCR), ενώ λεπτομέρειες που αφορούν την διαδικασία παρατίθενται στο Παράρτημα Ι. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα τα έξι στελέχη που απομονώθηκαν από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια φαίνεται πως είναι 98-99% συναφή με στελέχη που ανήκουν στο γένος της Ψευδομονάδας (Pseudomonas sp.) και συγκεκριμένα κάποια από αυτά με στελέχη Pseudomonas putida, όπως μπορούμε να παρατηρήσουμε στον πίνακα 6.2. Τα γενικά χαρακτηριστικά των στελεχών που ανήκουν στο γένος της Ψευδομονάδας είναι πως παρουσιάζουν μεταβολισμό αερόβιας ή/και ανοξικής αναπνοής, είναι αρνητικά κατά τη χρώση Gram, ραβδόμορφα, μη-σποριογόνα, κινούνται με την βοήθεια πολικών μαστιγίων ενώ 153

188 μπορεί να είναι παθογόνα ή μη. Τα στελέχη που απομονώθηκαν στην συγκεκριμένη εργασία δεν είναι παθογόνα ( Εικόνα 6.2. Ο μικροοργανισμός Pseudomonas putida ( Τα περισσότερα βακτήρια που ανήκουν στο γένος αυτό είναι σαπροφυτικοί οργανισμοί που ζουν ελεύθερα στο έδαφος ή στο νερό και παίζουν σημαντικό ρόλο όσον αφορά την αποσύνθεση, βιοδιάσπαση και τους κύκλους άνθρακα και αζώτου. Λόγω αυτού του τρόπου ζωής, οι ψευδομονάδες χαρακτηρίζονται από τη μεγάλη μεταβολική ποικιλομορφία και είναι σε θέση να χρησιμοποιούν ένα ευρύ φάσμα πηγών άνθρακα, συμπεριλαμβανομένων και μορίων όπου ελάχιστα βακτήρια που ανήκουν σε διαφορετικό γένος μπορούν να διασπάσουν ( 154

189 Πίνακας 6.1. Ταυτοποίηση απομονωμένων στελεχών που αποτελούν την εμπλουτισμένη καλλιέργεια. Στέλεχος Ομοταξία/Γένος Πανομοιότυπα Στελέχη % ταυτοποίηση A Pseudomonas sp. ONBA Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas sp. HR 13 99% 99% 99% B Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas putida ATCC % 99% C D Γάμμαπρωτεοβακτήρια/ Ψευδομονάδα Pseudomonas sp. OCR7 Pseudomonas sp. K2 Pseudomonas sp. WBC-2 Pseudomonas sp. OCR7 Pseudomonas sp. K2 Pseudomonas sp. WBC-2 99% 99% 99% 98% 98% 98% E Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas putida OW-27 99% 99% 99% F Pseudomonas putida RW-26 Pseudomonas putida 5Asal 98% 98% Τα περισσότερα βακτήρια που ανήκουν στο γένος αυτό είναι σαπροφυτικοί οργανισμοί που ζουν ελεύθερα στο έδαφος ή στο νερό και παίζουν σημαντικό ρόλο όσον αφορά την αποσύνθεση, βιοδιάσπαση και τους κύκλους άνθρακα και αζώτου. Λόγω αυτού του τρόπου ζωής, οι ψευδομονάδες χαρακτηρίζονται από τη μεγάλη μεταβολική ποικιλομορφία και είναι σε θέση να χρησιμοποιούν ένα ευρύ φάσμα πηγών άνθρακα, συμπεριλαμβανομένων και μορίων όπου ελάχιστα βακτήρια που ανήκουν σε διαφορετικό γένος μπορούν να διασπάσουν ( Τα βακτηρίδια Pseudomonas putida εγκαθίστανται στην ριζόσφαιρα (επιφάνεια ριζών) των φυτών όπου και αναπτύσσονται ενώ παράλληλα την προστατεύουν από άλλα παθογόνα βακτηρίδια προάγοντας έτσι την υγιεινή των φυτών. Για τον λόγο αυτό χρησιμοποιούνται ευρέως στον τομέα της βιοτεχνολογίας για την έρευνα βιολογικών μικροβιοκτόνων. Επίσης είναι το μοναδικό είδος βακτηρίου που τα περισσότερα γονίδια του εμπλέκονται στην 155

190 διάσπαση βλαβερών χημικών ουσιών όπως π.χ. αλειφατικών ή αρωματικών υδρογονανθράκων Αναβίωση και συντήρηση βακτηριακών στελεχών Έπειτα από την απομόνωση τα βακτηριακά στελέχη ανακτήθηκαν σε μορφή ξηρής κυτταρικής πελέτας. Για την διεξαγωγή των πειραμάτων γινόταν αρχικά διάλυση της πελέτας σε μικρό όγκο θρεπτικού μέσου υπό άσηπτες αερόβιες συνθήκες. Το θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιήθηκε για την αναβίωση αποτελούνταν από 5 g/l οξικό νάτριο, 5 g/l προπιονικό νάτριο, 5 g/l βουτυρικό νάτριο, 5 g/l K 2 HPO 4, 3 g/l KH 2 PO 4, 0.4 g MgSO 4 2H 2 O, 1.2 g/l (NH 4 ) 2 SO 4, g/l CaCl 2 2H 2 O και 1ml/l διαλύματος ιχνοστοιχείων σύστασης όπως φαίνεται στον πίνακα 6.2. Μέρος του εναιωρήματος χρησιμοποιούταν για την συντήρηση και διατήρηση της συγκεκριμένης καλλιέργειας έτσι ώστε να χρησιμοποιηθεί ως εμβόλιο για επανακαλλιέργεια της σε μελλοντικά πειράματα. Όσον αφορά την διαδικασία της συντήρησης μέρος της καλλιέργειας τοποθετούνταν σε αποστειρωμένα φιαλίδια και αναμιγνύονταν με αποστειρωμένο διάλυμα που αποτελούταν από 10% w/v σκόνης ημι-αποβουτυρωμένου γάλακτος (Skim Milk Powder, Fluka BioChemika). Στην συνέχεια τα δείγματα οδηγούνταν προς λυοφιλοποίηση και συνεπώς αποκτούσαν την μορφή ξηρής πελέτας και σφραγίζονταν χρησιμοποιώντας αποστειρωμένα πώματα. Τα δείγματα αποθηκεύονταν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και ξηρό και σκοτεινό μέρος Υποστρώματα άνθρακα Συνθετικά υποστρώματα άνθρακα Στα πειράματα που έλαβαν χώρα για να διερευνηθεί η διαδικασία παραγωγής PHAs χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά υποστρώματα άνθρακα οξικού, προπιονικού, βουτυρικού νατρίου, όλοι οι συνδυασμοί των ανωτέρω καθώς και γλυκόζη. Τα υποστρώματα αυτά ήταν χημικές ουσίες υψηλής καθαρότητας των εταιριών Merck και SigmaAldrich. 156

191 Οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου Πέραν των συνθετικών πηγών άνθρακα στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε επίσης το υγρό κλάσμα της απορροής υδρογονοπαραγωγού αντιδραστήρα ο οποίος τροφοδοτούταν με απόβλητο τριφασικού ελαιοτριβείου αραιωμένο 1:4 με νερό βρύσης. Η απορροή του αντιδραστήρα ήταν πλούσια σε πτητικά λιπαρά οξέα καθώς ήταν προϊόν διεργασίας αναερόβιας χώνευσης/οξεογέννεσης κατά την οποία σύνθετα μακρομόρια υδρολύονται σε διαλυτά, τα οποία με τη σειρά τους μεταβολίζονται από οξεογόνους και οξικογόνους μικροοργανισμούς παράγοντας μικρού μήκους πτητικά λιπαρά οξέα. Τα οξέα αυτά αποτελούν τις πρόδρομες ενώσεις για την παραγωγή PHB και PHBV και πληθώρα μικροοργανισμών παράγουν PHAs χρησιμοποιώντας αυτά τα ανθρακικά υποστρώματα. Τα απόβλητα ελαιοτριβείου χαρακτηρίζονται από υψηλό οργανικό φορτίο στο οποίο εμπεριέχονται μεγάλες ποσότητες πρωτεϊνών, λιπιδίων και πολυσακχαριτών. Επίσης περιέχει φυτοτοξικά συστατικά, όπως είναι οι φαινολικές ενώσεις και εμφανίζει υψηλό λόγο C/N. Το απόβλητο που χρησιμοποιήθηκε αρχικά για την αναερόβια παραγωγή υδρογόνου προήλθε από τριφασικό ελαιοτριβείο με έδρα την Πάτρα και την επωνυμία ΠΑΝΙΤΣΑΣ Α.Ε. Πληροφορίες που αφορούν στα χαρακτηριστικά του αποβλήτου που χρησιμοποιήθηκε ως πρώτη ύλη καθώς και τα χαρακτηριστικά της απορροής του υδρογονοπαραγωγού αντιδραστήρα σε διαφορετικούς υδραυλικούς χρόνους παραμονής μπορούν να φανούν με λεπτομέρεια στην διδακτορική διατριβή της κ. Ελένης Κουτρούλη (Ελένη Κουτρούλη, Διδακτορική διατριβή 2008). Κατά την διάρκεια της εργασίας υπήρχε εναλλαγή του υδραυλικού χρόνου παραμονής του υδρογονοπαραγωγού αντιδραστήρα και για τον λόγο αυτό τα χαρακτηριστικά της απορροής, η οποία στη συνέχεια χρησιμοποιούταν ως τροφοδοσία για τα πειράματα παραγωγής PHAs, παρουσιάζουν διακυμάνσεις. Έτσι, θεωρείται σκόπιμο τα χαρακτηριστικά του οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου να παρουσιάζονται στα αντίστοιχα κεφάλαια ανάλυσης και σχολιασμού των αποτελεσμάτων. 157

192 6.3. Πειραματικές διατάξεις Αντιδραστήρας εμπλουτισμού σε ΡΗΑ συσσωρευτές περιοδικής άντλησης πλήρωσης Για την έναρξη της διαδικασίας εμπλουτισμού μικτής καλλιέργειας σε ΡΗΑ συσσωρευτές χρησιμοποιήθηκε ως εμβόλιο ενεργός ιλύς όπως περιγράφεται στην παράγραφο Η διεργασία έλαβε χώρα σε αντιδραστήρα άντλησης πλήρωσης (draw fill) συνεχούς λειτουργίας ενεργού όγκου 1 l, σε αερόβιες συνθήκες, θερμοκρασία περιβάλλοντος και ανάδευση 250 rpm. Η στρατηγική που ακολουθήθηκε για τον εμπλουτισμό σε ΡΗΑ συσσωρευτές ήταν η εναλλαγή μεταξύ περιοριστικών υποστρωμάτων αζώτου (κύκλος άνθρακα) και περιοριστικών υποστρωμάτων άνθρακα (κύκλος αζώτου). Συγκεκριμένα οι φάσεις λειτουργίας του αντιδραστήρα ήταν οι εξής: αρχικά στα 250 ml ενεργού ιλύος που εμβολιάστηκαν στον αντιδραστήρα έγινε παροχή, σε πρώτη φάση, 750 ml συνθετικού θρεπτικού μέσου απουσία πηγής αζώτου υπό ανάδευση. Η λειτουργία του αντιδραστήρα γινόταν υπό αερόβιες συνθήκες ενώ μετά το πέρας 23 ωρών πραγματοποιούταν παύση του αερισμού και της ανάδευσης για 50 min ούτως ώστε να καθιζάνει η βιομάζα, στα επόμενα 5 min γινόταν άντληση 750 ml υπερκείμενου υγρού, ενώ στην συνέχεια ξεκινούσε η επόμενη φάση λειτουργίας με την πλήρωση του αντιδραστήρα με 750 ml φρέσκου θρεπτικού μέσου απουσία πηγής άνθρακα υπό ανάδευση ακολουθώντας την παραπάνω λογική. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα οξικού (CH 3 COONa) και προπιονικού νατρίου (CH 3 CH 2 COONa) συγκέντρωσης 500 mg O 2 /l και ως πηγή αζώτου θειικό αμμώνιο ((NH 4 ) 2 SO 4 ) συγκέντρωσης 60 mg NH + 4 -Ν/l στην τροφοδοσία. Επίσης τόσο σαν πηγή φωσφόρου όσο και για την ρύθμιση του αρχικού ph κοντά στο 7 χρησιμοποιήθηκε K 2 HPO 4 και KH 2 PO 4. Η ακριβής σύσταση των συνθετικών θρεπτικών μέσων που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθεται στον πίνακα 6.2. Η σχηματική αναπαράσταση και άποψη του αντιδραστήρα εμπλουτισμού φαίνονται στη εικόνα

193 Πίνακας 6.2. Σύσταση συνθετικών θρεπτικών μέσων για τον εμπλουτισμό της ενεργούς ιλύος σε ΡΗΑ συσσωρευτές σύμφωνα με την στρατηγική εναλλαγής περιοριστικών υποστρωμάτων. Συστατικό Περιοριστικό υπόστρωμα σε άζωτο Συγκέντρωση Περιοριστικό υπόστρωμα σε άνθρακα CH 3 COONa g/l - CH 3 CH 2 COONa g/l - (NH 4 ) 2 SO g/l MgSO 4 2H 2 O 0.2 g/l 0.2 g/l CaCl 2 2H 2 O g/l g/l K 2 HPO 4 5 g/l 5 g/l KH 2 PO 4 3 g/l 3 g/l Διάλυμα ιχνοστοιχείων 1 ml/l 1ml/l Σύσταση Ιχνοστοιχείων CuSO 4 5H 2 O FeSO 4 7H 2 O NaMoO 4 2H 2 O NiCl 2 6H 2 O ZnSO 4 7H 2 O CoCl 2 6H 2 O KI H 3 BO 3 MnCl 2 4H 2 O EDTA g/l 5 g/l g/l 4.05 g/l g/l g/l 0.75 g/l 3 g/l 5 g/l 5 g/l 159

194 Εικόνα 6.3. Ο αντιδραστήρας εμπλουτισμού τύπου άντλησης-πλήρωσης. Σχηματική αναπαράσταση (επάνω) και γενική άποψη της διάταξης (κάτω). 160

195 Αντιδραστήρας τύπου διαλείποντος έργου Τα περισσότερα πειράματα που διεξήχθησαν κατά την εκπόνηση της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκαν σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου (batch). Οι συνθήκες διεξαγωγής των πειραμάτων και τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιήθηκαν ποικίλουν οπότε και η περιγραφή τους δίνεται στα αντίστοιχα κεφάλαια στα οποία παρατίθενται τα πειραματικά αποτελέσματα. Γενικά, πρόκειται για αερόβιους αντιδραστήρες, ενεργού όγκου 1 l, θερμοκρασίας 26 ± 2 ο C με συνεχή ανάδευση. Κάθε φορά ως εμβόλιο χρησιμοποιούνταν 250 ml μικτής καλλιέργειας από τον αντιδραστήρα εμπλουτισμού Αντιδραστήρας τύπου SBR Ο αντιδραστήρας τύπου SBR που χρησιμοποιήθηκε για την συνεχή παραγωγή PHAs από οξινισμένο απόβλητο τριφασικού ελαιοτριβείου είναι κατασκευασμένος από πλεξιγκλάς, κυλινδρικού σχήματος συνολικού όγκου 2000 ml και ενεργού όγκου 750 ml. Σε ύψος που αντιστοιχεί στα 250 ml προσαρμόστηκε κυλινδρικός σωλήνας του οποίου το πάνω μέρος ήταν συνδεδεμένο με περισταλτική αντλία για να γίνεται απορροή κατά τις διάφορες φάσεις λειτουργίας του αντιδραστήρα. Ο αντιδραστήρας ήταν τοποθετημένος σε μαγνητικό αναδευτήρα (Kartell) και με την βοήθεια μαγνητικής ράβδου πραγματοποιούταν ανάδευση του ανάμικτου υγρού στα 250 rpm. Το επάνω μέρος του σφραγίζοταν με πώμα από ανοξείδωτο χάλυβα το οποίο περιελάμβανε υποδοχές απαραίτητες για την λειτουργία του. Συγκεκριμένα υπήρχαν δύο υποδοχές για την είσοδο και την έξοδο του υγροποιημένου αέρα μέσω αεραντλίας, μία για την λήψη υγρού δείγματος, μία για την εισροή της τροφοδοσίας και μια για την εκροή του υπερκείμενου υγρού. Ο αντιδραστήρας λειτουργούσε σε θερμοκρασία δωματίου 26 ± 2 ο C. Για την τροφοδοσία και την απορροή του αντιδραστήρα χρησιμοποιήθηκαν κωνικές φιάλες όγκου 2 l. Οι φιάλες τροφοδοσίας και το οξυνισμένο απόβλητο ήταν αποστειρωμένα, σε αυτόκλειστο στους 121 o C για 15 min, ενώ η εισροή του θρεπτικού μέσου στον αντιδραστήρα γινόταν με την βοήθεια περισταλτικών αντλιών. Για να αποφευχθεί πιθανή 161

196 επιμόλυνση οι τροφοδοσίες περνούσαν από θάλαμο UV πριν εισρεύσουν στον αντιδραστήρα. Ο θάλαμος UV αποτελείται από μια λυχνία υδραργύρου χαμηλής πίεσης, που εκπέμπει ακτινοβολία σε μήκος κύματος 254 nm και δύο ράβδους χαλαζία τοποθετημένες παράλληλα στη λυχνία από τις οποίες και διέρχονταν οι τροφοδοσίες. Εικόνα 6.4. Ο αντιδραστήρας διαλείποντος έργου περιοδικής λειτουργίας SBR. Σχηματική αναπαράσταση (επάνω) και γενική άποψη της διάταξης (κάτω). 162

197 Η λειτουργία του αντιδραστήρα σύμφωνα με προκαταρκτικά πειράματα, όπως αυτά περιγράφονται στην συνέχεια στο 10 ο κεφάλαιο, σχεδιάστηκε να περιλαμβάνει τις εξής φάσεις: α) Φάση ανάπτυξης Αφού είχε προηγηθεί εμβολιασμός του αντιδραστήρα με 250 ml εμπλουτισμένης μικτής καλλιέργειας από τον αντιδραστήρα εμπλουτισμού άντλησης-πλήρωσης για την εκκίνηση του SBR, γινόταν τροφοδοσία 500 ml πλήρους θρεπτικού μέσου για να πραγματοποιηθεί ανάπτυξη του μικροβιακού φορτίου. Η τροφοδοσία στον αντιδραστήρα πραγματοποιούταν με την βοήθεια περισταλτικής αντλίας και διαρκούσε 10 min. Επειδή το οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου δεν περιείχε αμμωνιακό άζωτο γινόταν προσθήκη πηγής αζώτου με την μορφή (NH 4 ) 2 SO 4. Επίσης λόγω του χαμηλού ph του αποβλήτου, ph~5.0, γινόταν προσθήκη πυκνού ρυθμιστικού διαλύματος K 2 HPO 4 και KH 2 PO 4 για την ρύθμιση του ph στο εύρος Η φάση ανάπτυξης διαρκούσε 47 ώρες. β) Φάση καθίζησης Κατά την φάση καθίζησης γινόταν παύση του αερισμού και της ανάδευσης για 50 min έτσι ώστε να πραγματοποιηθεί καθίζηση της βιομάζας. Με τον τρόπο αυτό η βιομάζα που είχε αναπτυχθεί παρέμενε στον αντιδραστήρα και συμμετείχε στις επόμενες φάσεις λειτουργίας. γ) Απορροή υπερκείμενου υγρού Τα επόμενα 10 min γινόταν απορροή 500 ml υπερκείμενου υγρού από τον αντιδραστήρα μέσω περισταλτικής αντλίας. δ) Στάσιμη φάση Στην στάσιμη φάση τα 250 ml ανάμικτου υγρού παρέμεναν στον αντιδραστήρα για 12 ώρες σε αεργία απουσία ανάδευσης και αερισμού. Ο ρόλος της στάσιμης φάσης είναι κυρίως πρακτικός καθώς έτσι η διάρκεια ενός κύκλου λειτουργίας ήταν 3.5 ημέρες δηλ. δύο λειτουργικοί κύκλοι ανά εβδομάδα. 163

198 ε) Φάση συσσώρευσης Στην φάση συσσώρευσης τα πρώτα 10 min γινόταν τροφοδοσία οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου με την βοήθεια περισταλτικής αντλίας ενώ η συνολική διάρκεια της φάσης αυτής ήταν 24 ώρες. Το απόβλητο στην περίπτωση αυτή είχε υποστεί μόνο ρύθμιση του ph~7.0 καθώς ο σκοπός της συγκεκριμένης φάσης είναι η συσσώρευση PHAs σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου. Υπό αυτές τις συνθήκες προάγεται η παραγωγή PHAs καθώς μεγαλύτερο ποσοστό άνθρακα των οργανικών υποστρωμάτων οδηγείται προς πολυμερισμό. στ) Απορροή ανάμικτου υγρού Κατά το τέλος της φάσης συσσώρευσης, και για 10 min, γινόταν απορροή 500 ml ανάμικτου υγρού χωρίς να προηγηθεί καθίζηση έτσι έστω να συλλεχθεί η βιομάζα και να πραγματοποιηθεί ανάκτηση των PHAs από τα κύτταρα. Η διάρκεια ενός πλήρους κύκλου λειτουργίας σύμφωνα με τον παραπάνω σχεδιασμό της διεργασίας ήταν 3.5 ημέρες και συμπίπτει με τον χρόνο παραμονή της βιομάζας (SRT) Υπολογισμοί PHAs και βιομάζα Η συγκέντρωση της βιομάζας μετρήθηκε ως συγκέντρωση πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS). Η παράμετρος VSSdiff. Χρησιμοποιείται για να δηλώσει τη διαφορά μεταξύ της αρχικής συγκέντρωσης της βιομάζας με την συγκέντρωση της βιομάζας στο χρονικό σημείο j. Όταν τα πειράματα λαμβάνουν χώρα σε συνθήκες απουσίας αζώτου η παράμετρος VSSdiff. θα πρέπει να είναι ίση με την συγκέντρωση των συνολικά παραγόμενων PHAs εάν δεν πραγματοποιείται ταυτόχρονα η συσσώρευση κάποιου άλλου ενδοκυτταρικού μεταβολικού προϊόντος όπως π.χ. το γλυκογόνο. VSSdiff. = VSS αρχική -VSS j (εξ. 6.2) 164

199 Το κλάσμα του PHB, του PHV και του συνόλου των PHAs στην βιομάζα, fphb, fphv και fphas αντίστοιχα υπολογίζεται ως: f PHB( Cmmol / Cmmol) f PHV( Cmmol / Cmmol) f PHAs( Cmmol / Cmmol) X X PHB PHB ή PHV PHV ή X PHAs PHAs ή (εξ. 6.3α) (εξ. 6.3β) (εξ. 6.3γ) Η μετατροπή της βιομάζας από g/l σε Cmol/l πραγματοποιήθηκε κάνοντας την παραδοχή ότι η σύσταση της βιομάζας είναι CH 1.8 O 0.5 N 0.2 οπότε και προκύπτει η αναλογία 24.6 g/cmol (Beun et al., 2002; Johnson et al., 2010). Y Y Οι συντελεστές απόδοσης υπολογίστηκαν ως εξής: X / S( Cmmol / Cmmol ) P / S( Cmmol / Cmmol) ( X. X. ) PHA. (εξ. 6.4) S. PHA. (εξ. 6.5) S. Στο μεγαλύτερο μέρος της παρούσας εργασίας οι συντελεστές απόδοσης υπολογίζονται ως Cmmol/ Cmmol. Εξαίρεση αποτελούν τα κεφάλαια 7 και 10 λόγω της βαρομετρικής μεθόδου προσδιορισμού των PHAs που χρησιμοποιήθηκε (βλ. παράγραφο ). Στα κεφάλαια αυτά οι συντελεστές απόδοσης Y X/S και Y P/S υπολογίζονται και εκφράζονται ως g VSS/ g VFAs και g PHAs/ g VFAs αντίστοιχα. Οι ρυθμοί παραγωγής υπολογίστηκαν ως: 1 1 X. X. rx mg l h (εξ. 6.6) h 1 1 PHA. PHA. rphas mg l h (εξ. 6.7) h 165

200 Το ποσοστό παραγωγής % PHAs υπολογίστηκε ως: gphas PHA PHA % PHAs g SS TSS TSS είτε ως.... gphas PHA PHA % PHAs gvss VSS VSS.... (εξ. 6.8α) (εξ. 6.8β) SND και απομάκρυνση ολικού αζώτου Η συγκέντρωση του αζώτου που απομακρύνεται λόγω του φαινομένου της ταυτόχρονης νιτροποίησης-απονιτροποίησης (Simultaneous Nitrification Denitrification-SND) υπολογίστηκε ως η συγκέντρωση της αμμωνίας η οποία δεν μετατράπηκε σε νιτρικά και νιτρώδη ιόντα κατά την φάση οξείδωσης της αμμωνίας. Το φαινόμενο SND λαμβάνει χώρα σε φάσεις όπου υπάρχει παρουσία αμμωνίας και ορίζεται ως: NOX. % SND NH 4. (εξ. 6.9) - όπου ΝΟ Χ παραγ. είναι το άθροισμα των συγκεντρώσεων των νιτρικών και νιτρωδών ιόντων + (mm) και NH 4 οξειδ. η συγκέντρωση της αμμωνίας που οξειδώνεται κατά την διάρκεια του αερόβιου κύκλου του αζώτου και ορίζεται ως η διαφορά μεταξύ του συνολικά καταναλισκόμενου αμμωνιακού αζώτου και του αμμωνιακού αζώτου το οποίο έχει αφομοιωθεί για την ανάπτυξη νέας βιομάζας (mm). Η συγκέντρωση του αμμωνιακού αζώτου το οποίο έχει αφομοιωθεί υπολογίζεται από την διαφορά μεταξύ των συγκεντρώσεων των PHAs κάνοντας την παραδοχή πως η απόδοση της ετερότροφης βιομάζας ισούται με 0.5 Cmmol X/ Cmmol PHA. Αν υποθέσουμε πως η βιομάζα έχει τον μοριακό τύπο CH 1.8 O 0.5 N mm NH + 4 καταναλώνονται ανά Cmmol X, δηλαδή 0.1 mm NH + 4 /Cmmol PHA. Η απόδοση της αυτότροφης βιομάζας θεωρείται αμελητέα (Third K., 2003). NH 4.( mm ) 0.1 PHA ti PHA t (εξ. 6.10) 0 166

201 - Ο ρυθμός του φαινομένου SND υπολογίστηκε ως η συγκέντρωση των ΝΟ Χ που + απονιτροποιήθηκαν ταυτόχρονα κατά το τέλος της χρονικής περιόδου οξείδωσης της NH 4 ως προς τον χρόνο που απαιτήθηκε για την απομάκρυνση του αμμωνιακού αζώτου (σε ώρες): RSND( Nmmol CmmolX h ) 1 1 NH 4. NOX. X h (εξ. 6.11) Το ποσοστό της απομάκρυνσης του ολικού αζώτου υπολογίστηκε από την συγκέντρωση του ολικού αζώτου στο τέλος της διεργασίας (Ν i ) και την αρχική συγκέντρωση του ολικού αζώτου (Ν αρχ. ): Ni % N N (εξ. 6.12) όπου ολικό άζωτο ορίζεται ως το άθροισμα του αμμωνιακού αζώτου, των νιτρικών και των νιτρωδών ιόντων. 167

202 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 6 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ APHA, AWWA, WEF, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 19 th Edition, Washington, D.C., Beun J.J., Dirks K., van Loosdrecht M.C.M., Heijnen J.J. Poly-(hydroxybutyrate) metabolism in dynamically fed mixed microbial cultures. Water Res. 36, pp , Eberlein, K. & Schutt, M., Automatic methods for the determination of total dissolved and particulate carbohydrates in the marine environment Anal. Bioanal. Chem. 323, pp , Johnson K., Kleerebezem R., van Loosdrecht M.C.M. Influence of ammonium on the accumulation of polyhydroxybutyrate (PHB) in aerobic mixed cultures. J. Biotechnol. 147(2), pp , Josefsson B., Rapid spectrophotometric determination of total carbohydrates In: Methods of seawater analysis, Grasshoff K., Ehrhardt M. and Kremling Editions, Verlag Chemie GmbH, pp , Oehmen A., Keller-Lehmann B., Zeng R.J., Yuan Z., Keller J., Optimisation of poly-βhydroxyalkanoate analysis using gas chromatography for enhanced biological phosphorus removal systems J. Chromat. A 1070, pp , Third K., PhD Thesis, Oxygen management for optimization of nitrogen removal in a sequencing batch reactor, School of Biological Sciences and Biotechnology, Murdoch University, Western Australia, Κουτρούλη Ελένη, Βιοτεχνολογική αξιοποίηση αποβλήτων ελαιοτριβείων για παραγωγή υδρογόνου, Διαδακτορική διατριβή, Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών,

203 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Παραγωγή PHAs από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια και τα στελέχη του γένους Pseudomonas Μέχρι σήμερα ελάχιστες είναι οι εργασίες που κάνουν αναφορά στην μικροβιακή σύσταση μικτών εμπλουτισμένων καλλιεργειών που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή PHAs. Οι Bengtsson κ.ά. (Bengtsson et al., 2008) και Pisco κ.ά. (Pisco et al., 2009) εμπλούτισαν μικτές καλλιέργειες υπό εναλλαγή αναερόβιων/αερόβιων συνθηκών και μέσω της τεχνικής φθορίζοντος επιτόπιου υβριδισμού (FISH/Fluorescent in situ hybridization) αποφάνθηκαν πως τα κυρίαρχα στελέχη που αποτελούσαν την εμπλουτισμένη καλλιέργεια ήταν το Defluviicoccus vanus και Candidatus competibacter phosphatis αντίστοιχα. Επίσης, οι Lemos κ.ά. (Lemos et al., 2008) κατάφεραν να εμπλουτίσουν κάποιες μικτές καλλιέργειες σε ΡΗΑ συσσωρευτές υπό συνθήκες αερόβιας υπερεπάρκειας/έλλειψης υποστρώματος. Στην συνέχεια χαρακτήρισαν την μικροβιακή σύσταση χρησιμοποιώντας τεχνική αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR/Reverse transcription-polymerase chain reaction) και παρατήρησαν πως τα κυριότερα βακτήρια ανήκαν στα γένη Azoarcus, Amaricoccus και Thauera. Αντίστοιχα οι Dionisi κ.ά. (Dionisi et al., 2005a, 2005b, 2007) πραγματοποίησαν εμπλουτισμό υπό συνθήκες αερόβιας υπερεπάρκειας/έλλειψης υποστρώματος. Για την διερεύνηση της μικροβιακής σύστασης χρησιμοποίησαν την τεχνική ηλεκτροφόρησης σε αποδιατακτικά πηκτώματα διαβάθμισης (DGGE/Denaturing gradient gel electrophoresis) που επιτρέπει λεπτομερέστερη ανάλυση. Πολλά γένη βακτηρίων, συμπεριλαμβάνοντας ακόμα και μικρούς πληθυσμούς, βρέθηκαν να συνθέτουν την μικτή αυτή καλλιέργεια όπως π.χ. στελέχη του γένους Thauera, Alcaligenes, Comamonas, Achromobacter, Xanthobacter, Curtobacterium, Kluyvera, Pseudomonas, Acinetobacter, Methylobacteriaceae bacterium, Flavobacterium, Candidatus meganema perideroedes. 169

204 Γενικά, οι μικτές καλλιέργειες από τις οποίες παράγονται PHAs έχουν προηγουμένως εμπλουτιστεί μέσω είτε εναλλαγής αναερόβιων/αερόβιων συνθηκών ή μικροαεροφιλικών/αερόβιων συνθηκών είτε σε διαδοχικούς κύκλους αερόβιας υπερεπάρκειας/έλλειψης υποστρώματος. Πέραν των παραπάνω στρατηγικών εμπλουτισμού, άλλοι λειτουργικοί παράγοντες όπως ο χρόνος παραμονής/ηλικία των μικροοργανισμών (SRT), ο λόγος C/N στο θρεπτικό μέσο, η οργανική φόρτιση (OLR), η χρονική διάρκεια κάθε κύκλου, το ph και η θερμοκρασία είναι επίσης σημαντικοί για τον εμπλουτισμό της καλλιέργειας με βακτήρια ικανά να παράγουν PHAs. Οι παράγοντες αυτοί επηρεάζουν την μικροβιακή σύσταση η οποία με την σειρά της καθορίζει τα ποσοστά συσσώρευσης PHAs της καλλιέργειας. Παρόλα αυτά, δεν είναι ακόμα ξεκάθαρο ποιοι είναι οι κρίσιμοι παράγοντες κατά την διεργασία εμπλουτισμού. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε εμπλουτισμένη καλλιέργεια σε ΡΗΑ συσσωρευτές ενώ επίσης απομονώθηκαν έξι στελέχη μικροοργανισμών. Η εμπλουτισμένη καλλιέργεια προέκυψε υποβάλλοντας εμβόλιο ενεργού ιλύος της μονάδας του Βιολογικού Καθαρισμού της πόλης των Πατρών σε αερόβιες συνθήκες, δυναμικές ως προς την εναλλαγή μεταξύ υποστρωμάτων άνθρακα και αζώτου (Η λεπτομερής περιγραφή της διεργασίας εμπλουτισμού αναφέρεται στην παράγραφο του 6 ου κεφαλαίου). Στη συνέχεια για να εξεταστεί η μικροβιακή σύσταση της εμπλουτισμένης καλλιέργειας έγινε χρήση της τεχνικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Συνολικά απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν έξι στελέχη μικροοργανισμών τα οποία ανήκουν στο γένος Pseudomonas ενώ κάποια από αυτά αναγνωρίστηκαν ως στελέχη Pseudomonas putida. Πρωταρχικός μας στόχος ήταν η επιλογή του τύπου της καλλιέργειας/μικροοργανισμού που θα χρησιμοποιηθεί για την διεξαγωγή περαιτέρω πειραμάτων τα οποία θα αφορούν την συμπεριφορά του επιλεγόμενου μικροβιακού πληθυσμού κατά την διεργασία της παραγωγής PHAs. Κύρια κριτήρια για την επιλογή αυτή είναι η μέγιστη περιεκτικότητα των κυττάρων του κάθε βακτηρίου σε PHAs, ο συντελεστής απόδοσης g PHAs/ g πηγής άνθρακα που χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα και ο ρυθμός παραγωγής PHAs. 170

205 7.1. Υλικά και μέθοδοι Μικροοργανισμοί Τόσο η μικτή εμπλουτισμένη καλλιέργεια όσο και τα απομονωμένα στελέχη, όπως φαίνεται και στον πίνακα 7.1, χρησιμοποιήθηκαν έτσι ώστε να διερευνηθεί η ικανότητα παραγωγής τους σε PHAs. Καλλιέργεια /Στέλεχος Πίνακας 7.1. Τύπος και καλλιέργειες στελεχών που εξετάστηκαν ως προς την ικανότητα παραγωγής PHAs. Ομοταξία/Γένος Πανομοιότυπα Στελέχη % ταυτοποίηση Μικτή Α B C D E γαμμαπρωτεοβακτήρια/ Ψευδομονάδα Pseudomonas sp. ONBA Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas sp. HR 13 Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas sp. OCR7 Pseudomonas sp. K2 Pseudomonas sp. WBC-2 Pseudomonas sp. OCR7 Pseudomonas sp. K2 Pseudomonas sp. WBC-2 Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas putida OW-27 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 99% 98% 98% 98% 99% 99% 99% F Pseudomonas putida RW-26 Pseudomonas putida 5Asal 98% 98% 171

206 Υποστρώματα Τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή PHAs εμπεριείχαν ως πηγή άνθρακα μίγμα μικρού μήκους πτητικών λιπαρών οξέων (VFAs) και συγκεκριμένα οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ. Στην εργασία χρησιμοποιήθηκαν τόσο συνθετικό θρεπτικό μέσο όσο και υγρό κλάσμα αποβλήτων ελαιοτριβείου. Το υγρό κλάσμα των αποβλήτων ελαιοτριβείου είχε προηγουμένως υποστεί αναερόβια χώνευση. Κατά την αναερόβια χώνευση πραγματοποιείται υδρόλυση των σύνθετων οργανικών ενώσεων προς διαλυτά πολυμερή και στη συνέχεια προς διμερή ή μονομερή, τα οποία μπορούν πλέον να εισέλθουν στο κύτταρο με την βοήθεια ειδικών ενζύμων και να μεταβολιστούν. Έπειτα ακολουθεί το στάδιο της οξεογένεσης στο οποίο το διαλυτό οργανικό υλικό βιοαποδομείται προς απλούστερες οργανικές ενώσεις και κυρίως προς πτητικά λιπαρά οξέα και αλκοόλες με ταυτόχρονη παραγωγή υδρογόνου και διοξειδίου του άνθρακα. Τα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου που χρησιμοποιήθηκαν ως υπόστρωμα για την αναερόβια χώνευση προέρχονταν από τριφασικό ελαιοτριβείο που εδρεύει στην Πάτρα με την επωνυμία ΠΑΝΙΤΣΑΣ Α.Ε.. Η αναερόβια χώνευση έλαβε χώρα σε μεσόφιλο αντιδραστήρα (35 o C) τύπου CSTR ενώ το απόβλητο με το οποίο τροφοδοτούνταν ο αντιδραστήρας είχε υποστεί αραίωση 1:4 με νερό βρύσης για πρακτικούς λόγους. Η διεργασία της αναερόβιας χώνευσης/παραγωγής υδρογόνου πραγματοποιήθηκε από την διδάκτορα Κουτρούλη Ελένη στα πλαίσια της διδακτορικής της διατριβής (Κουτρούλη Ελένη, Διδακτορική διατριβή, 2008). Στα πλαίσια της συγκεκριμένης διατριβής η εκροή του οξεογόνου αντιδραστήρα CSTR, δηλαδή το οξυνισμένο πλέον απόβλητο, χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια ως θρεπτικό μέσο για την διαδικασία παραγωγής PHAs αφού προηγουμένως είχε γίνει απομάκρυνση των στερεών, μέσω φυγοκέντρησης και διήθησης, και αποστείρωση σε αυτόκλειστο στους 121 o C για 20 min. Επιπρόσθετα, γινόταν προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος KH 2 PO 4 /K 2 HPO 4 για την προσαρμογή του pη κοντά στο 7. Στον παρακάτω πίνακα παρατίθενται τα χαρακτηριστικά των θρεπτικών μέσων που χρησιμοποιήθηκαν για την διερεύνηση παραγωγής PHAs τόσο από την μικτή καλλιέργεια όσο και από τα απομονωμένα στελέχη. 172

207 Πίνακας 7.2. Σύσταση και χαρακτηριστικά του συνθετικού θρεπτικού μέσου και του οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου τα οποία αποτέλεσαν υποστρώματα για την παραγωγή PHAs. Παράμετρος Συνθετικό θρεπτικό μέσο Οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου TSS (g/l) - - VSS (g/l) - - Οξικό οξύ (g/l) 0.8 ± ± 0.2 Προπιονικό οξύ (g/l) 0.8 ± ± 0.1 Βουτυρικό οξύ (g/l) 0.8 ± ± 0.1 Ισοβουτυρικό οξύ (g/l) ± 0.0 Βαλερικό οξύ (g/l) ± 0.0 Ισοβαλερικό οξύ (g/l) ± 0.0 Διαλυτοί υδατάνθρακες (g/l) ± 0.1 ph 6.9 ± ± 0.2 Αμμωνιακό άζωτο (mg/l) ± 0.3 Διάλυμα ιχνοστοιχείων * (ml/l) 1 1 * Η σύσταση του διαλύματος ιχνοστοιχείων δίνεται στον πίνακα 6.1 του κεφαλαίου 6 Το συνθετικό θρεπτικό μέσο παρομοιάζει την σύσταση του οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου όσον αφορά τις συγκεντρώσεις των πτητικών λιπαρών οξέων. Η συγκέντρωση των διαλυτών υδατανθράκων στο οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου ενδέχεται να περιέχει μικρό ποσοστό σφάλματος λόγω του σκούρου χρώματος του αποβλήτου, το οποίο συνεισφέρει (ως θετική παρεμβολή) στο μετρούμενο χρώμα καθώς η μέθοδος που χρησιμοποιείται για των προσδιορισμό υδατανθράκων είναι φωτομετρική Πειραματική διάταξη και συνθήκες Τα πειράματα έλαβαν χώρα σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου λειτουργικού όγκου 1 l όπως αυτοί περιγράφονται στην παράγραφο του κεφαλαίου 6. Για την εκκίνηση του κάθε αντιδραστήρα χρησιμοποιούνταν 250 ml εμβόλιο από την κάθε καλλιέργεια/βακτηριακό στέλεχος και 750 ml θρεπτικό μέσο. Πριν οι αντιδραστήρες εμβολιαστούν με κάποιο από τα απομονωμένα στελέχη μικροοργανισμών γινόταν αναβίωση των στελεχών σε συνθετικό θρεπτικό μέσο πλούσιο σε πηγή αζώτου με την μορφή (NH 4 ) 2 SO 4 και άνθρακα με την μορφή μίγματος οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος (βλ. 173

208 παράγραφο ). Στην περίπτωση της μικτής καλλιέργειας το εμβόλιο λαμβάνεται μετά το τέλος του κύκλου του αζώτου, οπότε η περιεκτικότητα των κυττάρων σε PHAs είναι αρκετά μικρή αν όχι μηδαμινή. Οι συνθήκες κάτω από τις οποίες πραγματοποιήθηκαν αυτά τα πρωταρχικά πειράματα ήσαν παρόμοιες με τις συνθήκες κάτω από τις οποίες έλαβε χώρα η διεργασία εμπλουτισμού της ενεργού ιλύος σε ΡΗΑ συσσωρευτές. Σίγουρα οι συνθήκες αυτές επιδέχονται βελτιστοποίηση όμως από την άλλη μεριά αποτελούν την καλύτερη βάση σύγκρισης καθώς τόσο η εμπλουτισμένη καλλιέργεια όσο και τα στελέχη που απομονώθηκαν και φαίνεται να την συστήνουν έχουν εγκλιματιστεί στις συγκεκριμένες περιβαλλοντικές και λειτουργικές συνθήκες. Οπότε, τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν υπό αερόβιες συνθήκες με την βοήθεια αεραντλίας δυναμικότητας 1 l/min, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 26 ± 2 o C, αρχικό και μη ρυθμιζόμενο ph~7.0, σε θρεπτικά μέσα στα οποία δεν υπήρχε παρουσία πηγής αζώτου και υπό ανάδευση rpm. Πέραν της απουσίας των θρεπτικών μέσων σε άζωτο εφαρμόστηκε επίσης επιπλέον περιορισμός αυτή την φορά σε σχέση με το οξυγόνο. Συγκεκριμένα η παροχή υγροποιημένου αέρα στην καλλιέργεια μειώθηκε σημαντικά και ήταν περίπου ίση με 0.1 l/min Παρουσίαση αποτελεσμάτων και συζήτηση Παραγωγή PHAs από συνθετικό θρεπτικό μέσο απουσία πηγής αζώτου Στον πίνακα 7.3 μπορούμε να παρατηρήσουμε και να συγκρίνουμε τις κυριότερες παραμέτρους που χαρακτηρίζουν την διαδικασία παραγωγής των PHAs από τις εξεταζόμενες καλλιέργειες τροφοδοτώντας ως πηγή άνθρακα συνθετικό μίγμα πτητικών λιπαρών οξέων και συνθήκες απουσίας αζώτου. Φαίνεται πως η εμπλουτισμένη μικτή καλλιέργεια σε σύγκριση με τα στελέχη του γένους Pseudomonas εμφανίζει μεγαλύτερη ενδοκυτταρική περιεκτικότητα σε PHAs, δίνει καλύτερο συντελεστή απόδοσης YPHAs/S, δηλαδή μεγαλύτερο μέρος της οργανικής ύλης που παρέχεται μετατρέπεται σε βιοπολυμερή και επίσης παρουσιάζει υψηλότερο ρυθμό παραγωγής. 174

209 Πίνακας 7.3. Κύρια χαρακτηριστικά της παραγωγής PHAs από συνθετικό μέσο σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου ανά καλλιέργεια/ στέλεχος. Καλλιέργεια/ στέλεχος Χρονική διάρκεια Υ Χ/S Υ Χ/S, t r X,t Y PHAs/S r PHAs % PHAs Μικτή Α Β C D E F Χρονική διάρκεια [=] h, Y X/S = Y X/S,t Y PHAs/S [=] g VSS/ g VFAs, YPHAs/S [=] g PHAs/ g VFAs, r X,t [=] mg VSS l -1 h -1, rphas [=]mg PHAs l -1 h -1, % PHAs [=] (g PHAs/ g VSS) 100 Στην περίπτωση της εμπλουτισμένης καλλιέργειας το ποσοστό ενδοκυτταρικής συσσώρευσης σε PHAs ανέρχεται στο 66.4 % και χαρακτηρίζεται από τον υψηλότερο συντελεστή απόδοσης Υ PHAs/S = g PHAs/ g VFAs και τον μεγαλύτερο ρυθμό παραγωγής r PHAs = 56.4 mg l -1 h -1. Στην συνέχεια, και με μεγάλη διαφορά, ακολουθεί το στέλεχος Α το οποίο αντιπροσωπεύει ένα από τα στελέχη Pseudomonas sp. ONBA, Pseudomonas putida ATCC 17390, Pseudomonas sp. HR 13. Το ποσοστό συσσώρευσης στην περίπτωση αυτή είναι σχεδόν τρεις φορές μικρότερο από εκείνο της εμπλουτισμένης καλλιέργειας ενώ τόσο ο συντελεστής απόδοσης Υ PHAs/S όσο και ο ρυθμός παραγωγής r PHAs είναι περίπου δέκα φορές μικρότεροι. Γενικά, φαίνεται πως τα στελέχη μικροοργανισμών που απομονώθηκαν εμφανίζουν χαμηλά ποσοστά συσσώρευσης, συγκριτικά με την μικτή καλλιέργεια, τα οποία κυμαίνονται από % g PHAs/ g ξηρής κυτταρικής μάζας. Παρόλο που δεν υπάρχει μέχρι σήμερα κάποια αναφορά που να πραγματεύεται την παραγωγή PHAs κάνοντας χρήση μίγματος μικρού μήκους πτητικών λιπαρών οξέων από στελέχη του γένους Pseudomonas και στελέχη 175

210 Pseudomonas putida φαίνεται πως οι μικροοργανισμοί αυτοί εμφανίζουν υψηλές περιεκτικότητες σε PHAs. Για παράδειγμα το στέλεχος Pseudomonas putida BM01 παράγει έως και 79.8 % g PHAs/g ξηρής κυτταρικής μάζας όταν ως πηγή άνθρακα παρέχεται οκτανοϊκό οξύ σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου (Kim et al., 1997). Επίσης έχει αναφερθεί παραγωγή PHAs κάνοντας χρήση βουτυρικού οξέος σε μη περιοριστικές συνθήκες από το στέλεχος Pseudomonas putida CA-3. Το ποσοστό συσσώρευσης στην περίπτωση αυτή είναι 15 ± 1 % g PHAs/ g ξηρής κυτταρικής βιομάζας, ενώ ο συντελεστής απόδοσης Υ PHAs/S ισούται με 0.10 g PHAs/ g βουτυρικού οξέος (Ward & O Connor, 2005). Στην ίδια εργασία χρησιμοποιήθηκαν ως πηγές άνθρακα και αλκανοϊκά οξέα μήκους 5-10 ατόμων άνθρακα και η αποδοτικότερη πηγή άνθρακα φάνηκε να είναι το επτανοϊκό και οκτανοϊκό οξύ. Τα ποσοστά συσσώρευσης ανήλθαν στο 59 ± 4 % και στις δύο περιπτώσεις, ενώ ο συντελεστής απόδοσης ήταν Y PHAs/S = 0.64 g PHAs/ g επτανοϊκού οξέος και Y PHAs/S = 0.57 g PHAs/ g οκτανοϊκού οξέος. Σύμφωνα με τους Madison και Huisman (Madison & Huisman, 1999) ο βιοσυνθετικός μηχανισμός των μικροοργανισμών που ανήκουν στο γένος Pseudomonas είναι περισσότερο ενεργός προς μονομερή που αποτελούνται από ανθρακική αλυσίδα 8-10 ατόμων άνθρακα. Για τον λόγο αυτό, οι συνηθέστερες πηγές άνθρακα που αναφέρονται στην βιβλιογραφία, πέραν της γλυκόζης και άλλων υδατανθράκων, είναι αλκανοϊκά οξέα μήκους 8-12 ατόμων άνθρακα καθώς και ολεϊκό οξύ. Στο διάγραμμα 7.1 παρουσιάζονται σε μορφή ιστογράμματος τα αποτελέσματα του πίνακα 7.3. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον επιδεικνύει το διάγραμμα 7.1γ και αυτό διότι αναμένεται πως υπό συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου οποιαδήποτε αύξηση της βιομάζας οφείλεται στην παραγωγή ενδοκυτταρικών προϊόντων και όχι σε ανάπτυξη νέων κυττάρων. Στην περίπτωση που η αύξηση της βιομάζας οφείλονταν ολοκληρωτικά στην ενδοκυτταρική συσσώρευση των PHAs θα έπρεπε ο συντελεστής απόδοσης Y X/S,t να ισούται με τον συντελεστή απόδοσης Y PHAs/S. Κάτι τέτοιο παρατηρείται μόνο όσον αφορά την εμπλουτισμένη καλλιέργεια όπου οι παραπάνω συντελεστές ισούνται με Η διαφορά μεταξύ των συντελεστών αυτών ορίζεται ως ο συντελεστής Y X/S και χαρακτηρίζει την αύξηση της βιομάζας η οποία οφείλεται στην συσσώρευση άλλων μακρομορίων πέραν των PHAs όπως φαίνεται και στο διάγραμμα 7.1γ. 176

211 (α) (β) Μικτή A B C D E F Ποσοστά παραγωγής πολύ-υδροξυαλκανεστέρων % PHAs (g PHAs/ g VSS) ανά τύπο καλλιέργειας Μικτή A B C D E F Y PHAs/S (g PHAs/g VFAs) Y X/S (g VSS/g VFAs) (γ) Μικτή A B C D E F Ποσοστό αύξησης της βιομάζας που αντιστοιχεί στην συσσώρευση PHAs Ποσοστό αύξησης της βιομάζας που αντιστοιχεί στην συσσώρευση άλλων μακρομορίων Σχήμα 7.1. Παράμετροι ανά τύπο καλλιέργειας που χαρακτηρίζουν την παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας συνθετικό μέσο απουσία αζώτου: (α) ποσοστά ενδοκυτταρικής συσσώρευσης % PHAs (g PHAs/ g VSS), (β) συντελεστές απόδοσης YPHAs/S (g PHAs/ g VFAs) και YX/S (g VSS/ g VFAs) και (γ) ποσοστά αύξησης της βιομάζας που οφείλονται σε συσσώρευση PHAs και συσσώρευση μακρομορίων πέραν των PHAs. 177

212 Από την άλλη μεριά, στις καθαρές καλλιέργειες φαίνεται πως η αύξηση της βιομάζας δεν μπορεί να αποδοθεί ολοκληρωτικά στον σχηματισμό των PHAs καθώς η διαφορά βάρους της βιομάζας δεν συμπίπτει με το βάρος των παραγόμενων πολυμερών. Στο διάγραμμα 7.1γ μπορούμε να παρατηρήσουμε το ποσοστό της αύξησης της βιομάζας που αντιστοιχεί στην συσσώρευση πολυμερών ενώ το υπόλοιπο, εφόσον δεν μπορεί να δικαιολογηθεί μέσω της κυτταρικής ανάπτυξης, πιθανότατα οφείλεται στην παραγωγή διαφόρων άλλων προϊόντων/ μακρομορίων. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία φαίνεται πως τα μικροβιακά κύτταρα είναι ικανά να παράγουν διάφορα ενδοκυτταρικά προϊόντα. Για παράδειγμα άλλες μορφές αποθήκης άνθρακα και ενέργειας αποτελούν ο πολυσακχαρίτης γλυκογόνο και τα πολυφωσφορικά άλατα. Από αυτά τα δύο μόνο το γλυκογόνο συνδράμει στην αύξηση του βάρους των πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS) καθώς τα πολυφωσφορικά άλατα είναι ανόργανες ενώσεις. Επίσης πρόσφατα ανακαλύφθηκε πως το στέλεχος Pseudomonas spp. RRL-28 έχει την ικανότητα να συσσωρεύει ενδοκυτταρικά λιπίδια χρησιμοποιώντας γλυκόζη σε ποσοστό 42.7 % ανά ξηρό κυτταρικό βάρος (Patnayak & Sree, 2005). Ο μικροοργανισμός αυτός είναι ένας από τους λίγους αρνητικούς κατά Gram που χαρακτηρίζονται ως ελαιογόνοι όπως οι Acinetobacter sp. 211, Alkanivorax borkumensis SK2 και Pseudomonas aeruginosa 44T1 (Alvarez & Steinbuchel, 2002; Kosa & Ragauskas, 2010; Manilla-Perez et al., 2010). Συνήθως η παραγωγή μικροβιακών ελαίων γίνεται κάνοντας χρήση μυκήτων. Τα λιπίδια αυτά, ή αλλιώς έλαια μονοκύτταρων οργανισμών (Single Cell Oils/SCOs), αποτελούνται περίπου από % w/w τριγλυκερίδια και παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην χημική και φαρμακευτική βιομηχανία, την κλινική διατροφή και στην βιομηχανία τροφίμων. Ο σχηματισμός λιπιδίων προάγεται όταν κάποια από τα βασικά θρεπτικά συστατικά βρίσκεται σε περιορισμό, συνήθως το άζωτο. Με τον τρόπο αυτό μεγαλύτερο μέρος της πηγής άνθρακα μετασχηματίζεται σε λιπίδια (Ratledge & Wynn, 2002). Όπως και κατά την βιοσύνθεση των PHAs έτσι και για την σύνθεση των λιπαρών οξέων χρησιμοποιείται ως πρόδρομη ένωση το ακετυλοσυνένζυμο Α (Κρητικού Μαριάννα, Μεταπτυχιακή εργασία, 2010). 178

213 Παρόλο που στα πειράματα μας δεν πιστοποιήθηκε μέσω ποιοτικής ή ποσοτικής ανάλυσης η παρουσία γλυκογόνου ή λιπιδίων υπάρχουν ενδείξεις πως τα στελέχη Α-F του γένους Pseudomonas συσσωρεύουν ενδοκυτταρικά εκτός των PHAs, γλυκογόνο και/ή λιπίδια και εκεί οφείλεται και η διαφορά σους συντελεστές απόδοσης Y X/S και Y PHAs/S. Μέχρι και σήμερα τρείς είναι οι εργασίες που κάνουν αναφορά στην παραγωγή λιπιδίων από στελέχη του γένους Pseudomonas ενώ μόνο μια περιγράφει την σχέση ανάμεσα στο γλυκογόνο, τα PHAs και τα λιπίδια κατά την διάρκεια της συσσώρευσης από το Pseudomonas V-19. Σύμφωνα με τους Zevenhuizen και Ebbink (Zevenhuizen & Ebbink, 1974), το γλυκογόνο, το PHB και τα λιπίδια μπορούν να θεωρηθούν ως αποθεματικά υλικά λόγω των εξής ιδιοτήτων: α) η συσσώρευση τους παρατηρείται όταν αναστέλλεται η ανάπτυξη των κυττάρων λόγω περιορισμού πηγής αζώτου ενώ ταυτόχρονα υπάρχει περίσσεια πηγής άνθρακα, β) τα κύτταρα που εμπεριέχουν αυτά τα αποθέματα τα χρησιμοποιούν για να συντηρηθούν όταν εξαντληθούν τα θρεπτικά συστατικά του μέσου και γ) αυτές οι αποθήκες άνθρακα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την σύνθεση των απαραίτητων κυτταρικών συστατικών. Επίσης χρησιμοποίησαν διάφορες πηγές άνθρακα, ανάμεσα τους το οξικό και υδροξυβουτυρικό νάτριο. Στην περίπτωση του οξικού νατρίου παρήχθησαν 1.3 % γλυκογόνου, 1.3 % ΡΗΒ και 20.4 % λιπίδια g/ g ξηρού κυτταρικού βάρους ενώ όταν χρησιμοποιήθηκε υδροξυβουτυρικό νάτριο παρήχθησαν 9.45 % γλυκογόνο, 33.4 % ΡΗΒ και 24 % λιπίδια. Στην συγκεκριμένη εργασία στόχος μας ήταν η διερεύνηση της ικανότητας παραγωγής των PHAs και για τον λόγο αυτό δεν εστιάσαμε στην μέτρηση άλλων ενδοκυτταρικών προϊόντων. Τέλος, παρόλο που η εργασία των Zevenhuizen και Ebbink είναι γνωστή από το 1974 είναι η μόνη που πραγματεύεται την σχέση μεταξύ γλυκογόνου, ΡΗΒ και λιπιδίων. Οι περισσότερες έρευνες αφορούν την παραγωγή των παραπάνω ξεχωριστά ή την παραγωγή γλυκογόνου-phas ή την παραγωγή γλυκογόνου-λιπιδίων, ενώ επίσης οι αναφορές που αφορούν την συσσώρευση λιπιδίων από τα στελέχη Pseudomonas είναι μόλις τρείς. 179

214 Παραγωγή PHAs από συνθετικό θρεπτικό μέσο απουσία πηγής αζώτου και υπό συνθήκες περιορισμού οξυγόνου Οι χαμηλές συγκεντρώσεις διαλυτού οξυγόνου (DO) καταστέλλουν τον σχηματισμό πρωτεϊνών που είναι απαραίτητες για την μικροβιακή ανάπτυξη (Salehizadeh & van Loosdrecht, 2004). Σε αυτές τις συνθήκες οι μικροοργανισμοί είναι ικανοί να καταναλώσουν οργανικά υποστρώματα προμηθεύοντας ενέργεια από την οξειδωτική αποικοδόμηση μέρους των οργανικών αυτών υποστρωμάτων. Αν η παροχή οξυγόνου είναι επαρκής ο μικροοργανισμός είναι ικανός να λάβει αρκετή ενέργεια για την παραγωγή πρωτεϊνών, γλυκογόνου και άλλων κυτταρικών συστατικών με ταυτόχρονη κατανάλωση οργανικών υποστρωμάτων (Satoh et al., 1998). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε, εκτός της απουσίας πηγής αζώτου, η επίδραση του περιορισμού σε οξυγόνο στην διαδικασία παραγωγής των PHAs. Σε κάποια στελέχη μικροοργανισμών όπως το Azotobacter beijerinckii, ο περιορισμός οξυγόνου φαίνεται να είναι σημαντικός και να αυξάνει την παραγωγή σε ΡΗΒ (Bormann et al., 1998). Στον πίνακα 7.4 και το διάγραμμα 7.2 παρουσιάζονται οι παράμετροι που περιγράφουν την παραγωγή PHAs υπό συνθήκες απουσίας αζώτου και ταυτόχρονου περιορισμού σε οξυγόνο. Αρχικά φαίνεται πως ο περιορισμός σε οξυγόνο οδηγεί όλους τους τύπους καλλιεργειών σε μικρότερους ρυθμούς κατανάλωσης των οργανικών υποστρωμάτων και συνεπώς σε μικρότερους ρυθμούς βιοσύνθεσης PHAs εφόσον η παραγωγική διεργασία επιμηκύνεται χρονικά. Το φαινόμενο αυτό έχει επίσης παρατηρηθεί στο στέλεχος Alcaligenes eutrophus από τους Lefebvre κ.ά. (Lefebvre et al., 1997). Στην περίπτωση της εμπλουτισμένης καλλιέργειας βλέπουμε πως ο περιορισμός οξυγόνου οδηγεί στην παραγωγή ενδοκυτταρικών προϊόντων εκτός των PHAs κάτι το οποίο δεν παρατηρήθηκε σε συνθήκες όπου η παροχή οξυγόνου ήταν επαρκής. Επίσης, το ποσοστό συσσώρευσης σε PHAs είναι αρκετά μικρότερο σε αυτές τις συνθήκες, 18.2 % έναντι 66.4 % g PHAs/ g VSS. 180

215 Στα στελέχη B, C, D, E και F, δεν υπάρχει μεγάλη διαφορά ανάμεσα στα ποσοστά συσσώρευσης PHAs που παρατηρούνται σε συνθήκες επάρκειας και περιορισμού σε οξυγόνο. Ωστόσο, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, η παραγωγή PHAs υπό περιορισμό οξυγόνου χαρακτηρίζεται από μικρότερους ρυθμούς κατανάλωσης πηγής άνθρακα και άρα μικρότερους ρυθμούς βιοσύνθεσης PHAs. Επιπλέον, όπως και σε συνθήκες επάρκειας οξυγόνου, βλέπουμε πως και εδώ παράγονται ενδοκυτταρικά προϊόντα πέραν των PHAs. Στα συγκεκριμένα πειράματα μόνο το στέλεχος Α αποτελεί εξαίρεση. Είναι το μόνο όπου υπό συνθήκες περιορισμού οξυγόνου ευνοείται η ικανότητα συσσώρευσης PHAs καθώς το ποσοστό συσσώρευσης αυξάνεται σε % από % g PHAs/ g VSS. Επίσης, οι συντελεστές απόδοσης Y X/S,t και Y PHAs/S δεν παρουσιάζουν ουσιαστική διαφορά μεταξύ τους, g VSS/ g VFAs και g PHAs/ g VFAs αντίστοιχα. Αυτό δηλώνει πως η αύξηση της βιομάζας αντιστοιχεί σχεδόν αποκλειστικά στην παραγωγή των PHAs όπως μπορούμε να δούμε και στο διάγραμμα 7.2γ. Πίνακας 7.4. Κύρια χαρακτηριστικά της παραγωγής PHAs από συνθετικό μέσο σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου και περιορισμού οξυγόνου ανά καλλιέργεια/ στέλεχος. Καλλιέργεια/ στέλεχος Χρονική διάρκεια Υ Χ/S Υ Χ/S,t r X,t Y PHAs/S r PHAs % PHAs Μικτή Α Β C D E F Χρονική διάρκεια [=] h, Y X/S = Y X/S,t Y PHAs/S [=] g VSS/ g VFAs, YPHAs/S [=] g PHAs/ g VFAs, r X,t [=] mg VSS l -1 h -1, rphas [=]mg PHAs l -1 h -1, % PHAs [=] (g PHAs/ g VSS)

216 Μικτή A B C D E F 4.60 (α) (β) Μικτή A B C D E F Ποσοστά παραγωγής πολύ-υδροξυαλκανεστέρων % PHAs (g PHAs/ g VSS) ανά τύπο καλλιέργειας Y PHAs/S (g PHAs/g VFAs) Y X/S (g VSS/g VFAs) Μικτή A B C D E F Ποσοστό αύξησης της βιομάζας που αντιστοιχεί στην συσσώρευση PHAs Ποσοστό αύξησης της βιομάζας που αντιστοιχεί στην συσσώρευση άλλων μακρομορίων (γ) Σχήμα 7.2. Παράμετροι ανά τύπο καλλιέργειας που χαρακτηρίζουν την παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας συνθετικό μέσο απουσία αζώτου και υπό περιορισμό οξυγόνου: (α) ποσοστά ενδοκυτταρικής συσσώρευσης % PHAs (g PHAs/ g VSS), (β) συντελεστές απόδοσης YPHAs/S (g PHAs/ g VFAs) και YX/S (g VSS/ g VFAs) και (γ) ποσοστά αύξησης της βιομάζας που οφείλονται σε συσσώρευση PHAs και συσσώρευση μακρομορίων πέραν των PHΑs. 182

217 Ακόμη μία διαφορά αφορά την συμπεριφορά του στελέχους Ε το οποίο υπό περιορισμό οξυγόνου φαίνεται να ευνοείται περισσότερο η συσσώρευση των PHAs έναντι των άλλων ενδοκυτταρικών προϊόντων όπως φαίνεται και στο διάγραμμα 7.2γ. Οι περισσότερες έρευνες για την επίδραση της συγκέντρωσης του διαλυτού οξυγόνου αφορούν τον μικροοργανισμό Azotobacter beijerinckii (Senior & Dawes, 1971, 1973; Jackson & Dawes, 1976). Στην παραγωγή βιοπολυμερών σημαντικό ρόλο παίζει το ακετυλο-coa, το οποίο μπορεί είτε να οξειδωθεί μέσω του κύκλου TCA, είτε να χρησιμοποιηθεί για την βιοσύνθεση των PHAs. Το προς τα πού θα στραφεί το ακετυλο-coa εξαρτάται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες και ειδικά από τον περιορισμό σε οξυγόνο διότι τότε ο λόγος NADH/NAD αυξάνεται. Η δράση της κιτρικής συνθετάσης και της ισοκιτρικής αφυδρογονάσης αναστέλλονται από το NADH με αποτέλεσμα το ακετυλο-coa να μην συμμετέχει στον ίδιο βαθμό στον κύκλο TCA αλλά να μετατρέπεται σε ακετοακέτυλο-coa, από την 3-κετοθιολάση, το οποίο αποτελεί και το πρώτο ένζυμο για την βιοσύνθεση των PHAs. Λόγω της μεγάλης σημασίας της επίδρασης του περιορισμού σε οξυγόνο και της ύπαρξης μηχανισμού αναπνευστικής προστασίας το μοντέλο που περιγράφει την επίδραση του οξυγόνου στα στελέχη του γένους Azotobacter πιθανόν δεν είναι ευρέως εφαρμόσιμο για την ρύθμιση της βιοσύνθεσης των PHAs. Για παράδειγμα, ο περιορισμός οξυγόνου στο στέλεχος Pseudomonas sp. K δεν οδήγησε σε συσσώρευση PHAs (Suzuki et al., 1986). Το στέλεχος Alcaligenes eutrophus H16 φαίνεται πως είναι ικανό να συσσωρεύει ΡΗΒ υπό συνθήκες περιορισμού οξυγόνου αλλά χαρακτηρίζεται από χαμηλότερο ρυθμό βιοσύνθεσης έναντι άλλων περιοριστικών συνθηκών (Steinbuchel & Schlegel, 1989). Φαίνεται λοιπόν πως η επίδραση της παροχής οξυγόνου δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως καθώς δεν λαμβάνει κάποια κοινώς αποδεκτή εξήγηση (ιδιαίτερα σε βιοχημική βάση) και διαφέρει ανάλογα με το γένος το οποίο ανήκει το υπό εξέταση στέλεχος. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τα πειράματα μας ο περιορισμός οξυγόνου επηρεάζει αρνητικά την εμπλουτισμένη καλλιέργεια οδηγώντας σε μείωση του ποσοστού παραγωγής PHAs καθώς και του συντελεστή απόδοσης Y PHAs/S. Τα στελέχη Β,C,D,E,F δεν παρουσιάζουν μεγάλη διαφορά στα ποσοστά συσσώρευσης PHAs ενώ οι συντελεστές απόδοσης Y PHAs/S είναι αρκετά μικροί και παρόμοιοι με εκείνους όπου η παροχή οξυγόνου είναι επαρκής. Αντίθετα, 183

218 στο στέλεχος Α ο περιορισμός οξυγόνου φαίνεται να επιδρά θετικά στο ποσοστό συσσώρευσης PHAs καθώς αυτό αυξάνεται σημαντικά. Βέβαια αυτό πιθανότατα συμβαίνει όχι λόγω αύξησης της ικανότητας του μικροοργανισμού να συσσωρεύει μεγαλύτερες ποσότητες ενδοκυτταρικών προϊόντων αλλά διότι υπό τις συγκεκριμένες συνθήκες η συσσώρευση ενδοκυτταρικών προϊόντων πέραν των PHAs είναι σχεδόν μηδαμινή Παραγωγή PHAs από οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου απουσία πηγής αζώτου Πέραν των συνθετικών θρεπτικών για την παραγωγή των PHAs, είναι δυνατόν να αξιοποιηθούν ανανεώσιμες πηγές άνθρακα, όπως το πλούσιο σε υδατάνθρακες εκχύλισμα διαφόρων ενεργειακών φυτών, ή υγρά ρεύματα αποβλήτων πλούσια σε οργανικό φορτίο. Μέσω αυτής της αντικατάστασης της πηγής άνθρακα το κόστος παραγωγής των PHAs μπορεί να μειωθεί έως και 50 %. Επιπλέον, βελτιστοποιώντας την παραγωγική διεργασία είναι δυνατή μια αειφόρος ανάπτυξη καθώς ο σχεδιασμός εναλλακτικών τρόπων διαχείρισης αποβλήτων οδηγεί στην παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας κάτι που σήμερα είναι γνωστό υπό τον όρο βιοδιυλιστήριο (Biorefinery). Όπως και στην περίπτωση που γίνεται χρήση διαφόρων τύπων αποβλήτων για την παραγωγή βιοϋδρογόνου, κιτρικού οξέος, μικροβιακού λίπους και διαφόρων άλλων προϊόντων έτσι και στην περίπτωση των PHAs οι ερευνητές εξερευνούν διάφορους τύπους αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων ως πηγές άνθρακα. Στην παρούσα εργασία επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου και αυτό διότι θέλαμε να αναπτύξουμε μια διεργασία βιοδιυλιστηρίου δύο σταδίων. Στο πρώτο στάδιο θα γινόταν παραγωγή βιοϋδρογόνου με ταυτόχρονη μετατροπή των υδατανθράκων σε μικρού μήκους πτητικά λιπαρά οξέα, ενώ στο δεύτερο στάδιο η απορροή αυτή θα χρησιμοποιούταν ως θρεπτικό υλικό για την διεργασία παραγωγής των PHAs. Πρωταρχικός μας στόχος όμως είναι, όπως και προηγουμένως, να εξετάσουμε την απόδοση της κάθε καλλιέργειας σε PHAs όταν παρέχεται ως υπόστρωμα οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου. 184

219 Τόσο στον πίνακα 7.5 όσο και στο διάγραμμα 7.3 παρατηρούμε τις παραμέτρους που χαρακτηρίζουν την παραγωγή των PHAs ανά τύπο καλλιέργειας Πίνακας 7.5. Κύρια χαρακτηριστικά της παραγωγής PHAs από οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου ανά καλλιέργεια/ στέλεχος. Καλλιέργεια/ στέλεχος Χρονική διάρκεια Υ Χ/S Υ Χ/S,t r X,t Y PHAs/S r PHAs % PHAs Μικτή Α Β C D E F Χρονική διάρκεια [=] h, Y X/S = Y X/S,t Y PHAs/S [=] g VSS/ g VFAs, YPHAs/S [=] g PHAs/ g VFAs, r X,t [=] mg VSS l -1 h -1, rphas [=]mg PHAs l -1 h -1, % PHAs [=] (g PHAs/ g VSS) 100 Φαίνεται πως και πάλι η εμπλουτισμένη καλλιέργεια εμφανίζει υψηλότερο ποσοστό συσσώρευσης, 8.84 % g PHAs/ g VSS, καλύτερο συντελεστή απόδοσης (μετατροπή των VFAs σε -1 PHAs) Y PHAs/S = g PHAs/ g VFAs και υψηλότερο ρυθμό παραγωγής r PHAs = 1.85 mg l -1 h συγκριτικά με τις υπόλοιπες καλλιέργειες κάτι το οποίο παρατηρήθηκε και στην περίπτωση του συνθετικού θρεπτικού μέσου. Ωστόσο, τα μεγέθη αυτά είναι αρκετά μικρότερα σε αυτή την περίπτωση. Επίσης χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου παρατηρούμε πως η εμπλουτισμένη καλλιέργεια συσσωρεύει και άλλα ενδοκυτταρικά προϊόντα εκτός των PHAs λόγω της διαφοράς μεταξύ των συντελεστών απόδοσης Y X/S,t και Y PHAs/S, δηλαδή ο συντελεστής Y X/S δεν ισούται με μηδέν. Είναι πιθανόν, λόγω της ελαιώδους φύσης του αποβλήτου, να πραγματοποιείται συσσώρευση λιπιδίων. 185

220 (α) (β) Μικτή A B C D E F 0.90 Ποσοστά παραγωγής πολύ-υδροξυαλκανεστέρων % PHAs (g PHAs/ g VSS) ανά τύπο καλλιέργειας Μικτή A B C D E F Y PHAs/S (g PHAs/g VFAs) Y X/S (g VSS/g VFAs) (γ) Μικτή A B C D E F Ποσοστό αύξησης της βιομάζας που αντιστοιχεί στην συσσώρευση PHAs Ποσοστό αύξησης της βιομάζας που αντιστοιχεί στην συσσώρευση άλλων μακρομορίων Σχήμα 7.3. Παράμετροι ανά τύπο καλλιέργειας που χαρακτηρίζουν την παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου απουσία αζώτου: (α) ποσοστά ενδοκυτταρικής συσσώρευσης % PHAs (g PHAs/ g VSS), (β) συντελεστές απόδοσης YPHAs/S (g PHAs/ g VFAs) και YX/S (g VSS/ g VFAs) και (γ) ποσοστά αύξησης της βιομάζας που οφείλονται σε συσσώρευση PHAs και συσσώρευση μακρομορίων πέραν των PHAs. 186

221 Σύμφωνα με τους Ribera κ.ά (Ribera et al., 2001), οι οποίοι εξέτασαν το στέλεχος Pseudomonas putida KT2442, παρατήρησαν πως το βακτήριο αυτό είναι ικανό να συσσωρεύει 1.52 % g PHAs/ g ξηρής κυτταρικής μάζας με ρυθμό r PHAs = 0.56 mg l -1 h - 1. Η εργασία αυτή αποτελεί και την μόνη αναφορά που πραγματεύεται την παραγωγή PHAs σε βακτήριο του γένους Pseudomonas από απόβλητο ελαιοτριβείου. Από την άλλη μεριά όταν το συγκεκριμένο στέλεχος αναπτύχθηκε σε ολεϊκό οξύ το ποσοστό συσσώρευσης PHAs ήταν 23 % (Huijberts & Eggink, 1996). Από τα παραπάνω αποτελέσματα φαίνεται πως η πολύπλοκη φύση του αποβλήτου που χρησιμοποιείται ως πηγή άνθρακα συνεπάγεται μεγάλη διαφορά ανάμεσα στα χαρακτηριστικά της παραγωγικής διεργασίας σε σχέση με το συνθετικό θρεπτικό μέσο. Ωστόσο, κάτι τέτοιο δεν έρχεται σε συμφωνία με τα συμπεράσματα των Dionisi κ.ά. (Dionisi et al., 2005c). Στην περίπτωση που παρείχαν οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου, έναντι συνθετικού μέσου, σε μικτή καλλιέργεια, δεν παρατηρήθηκε διαφορά στο ποσοστό συσσώρευσης των PHAs (0.54 g PHAs/ g VSS) ενώ επίσης κατέληξαν πως εκτός των VFAs η καλλιέργεια καταναλώνει και άλλα υποστρώματα άνθρακα, π.χ. αλκοόλες Παραγωγή PHAs από οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου απουσία πηγής αζώτου και υπό συνθήκες περιορισμού οξυγόνου. Παρά το γεγονός πως από τα συμπεράσματα στα οποία έχουμε καταλήξει μέχρι στιγμής αναμένουμε η επίδραση οξυγόνου να έχει αρνητικό αντίκτυπο, ως επί το πλείστον, στην παραγωγή των PHAs, μελετήθηκε η επίδραση αυτού του παράγοντα όταν χρησιμοποιείται οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου από τις καλλιέργειες ως πηγή άνθρακα με ταυτόχρονη έλλειψη αζώτου. Στον πίνακα 7.6 και το διάγραμμα 7.4 παρατηρούμε τις κύριες παραμέτρους που χαρακτηρίζουν την συσσώρευση των PHAs υπό τις προαναφερθείσες συνθήκες. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν είναι παρόμοια με εκείνα που αφορούν την χρήση του συνθετικού θρεπτικού μέσου υπό περιορισμό οξυγόνου. Στην προηγούμενη παράγραφο αναφέρθηκε πως η επίδραση του περιορισμού σε οξυγόνο οδηγεί σε μικρότερους ρυθμούς 187

222 βιοσύνθεσης των PHAs σε όλους τους τύπους καλλιεργειών, ενώ επιπλέον οι συντελεστές απόδοσης Y PHAs/S δεν διαφέρουν σημαντικά σε σύγκριση με αυτούς που ανακτήθηκαν σε συνθήκες επάρκειας οξυγόνου. Επίσης αναμένονταν ποσοστά συσσώρευσης PHAs ανάλογα με αυτά της χρήσης του οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου, δηλαδή αρκετά μικρότερα συγκριτικά με αυτά που λήφθηκαν χρησιμοποιώντας συνθετικό θρεπτικό μέσο. Πίνακας 7.6. Κύρια χαρακτηριστικά της παραγωγής PHAs από οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου και περιορισμού οξυγόνου ανά καλλιέργεια/ στέλεχος. Καλλιέργεια/ στέλεχος Χρονική διάρκεια Υ Χ/S Υ Χ/S,t r X,t Y PHAs/S r PHAs % PHAs Μικτή Α Β C D E F Χρονική διάρκεια [=] h, Y X/S = Y X/S,t Y PHAs/S [=] g VSS/ g VFAs, YPHAs/S [=] g PHAs/ g VFAs, r X,t [=] mg VSS l -1 h -1, rphas [=]mg PHAs l -1 h -1, % PHAs [=] (g PHAs/ g VSS) 100 Παρόμοια επίσης είναι η συμπεριφορά της εμπλουτισμένης καλλιέργειας η οποία επιδεικνύει μικρότερο ποσοστό συσσώρευσης PHAs 3.25 % έναντι 8.84 % g PHAs/ g VSS στην περίπτωση που χρησιμοποιείται οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου. Τα στελέχη B, C, D, E και F δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερη διαφορά στα ποσοστά συσσώρευσης PHAs καθώς και στους συντελεστές απόδοσης Y PHAs/S όπως ακριβώς και κατά την χρήση του συνθετικού θρεπτικού μέσου στις ανάλογες συνθήκες. Εξαίρεση και εδώ, όπως ακριβώς και στην παράγραφο 7.2.2, αποτελεί το στέλεχος Α το οποίο φαίνεται να ανταποκρίνεται θετικά στη χαμηλή συγκέντρωση 188

223 οξυγόνου συσσωρεύοντας 11.5 % έναντι 6.2 % g PHAs/ g VSS σε συνθήκες επάρκειας οξυγόνου. Ταυτόχρονα παρατηρείται μεγαλύτερος συντελεστής Y PHAs/S καθώς αυξάνεται σημαντικά η προτίμηση του μικροοργανισμού να συσσωρεύει PHAs έναντι άλλων ενδοκυτταρικών προϊόντων. Παρά το γεγονός πως το στέλεχος Α εμφανίζει την μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε PHAs στο σύνολο η συμπεριφορά της εμπλουτισμένης καλλιέργειας θεωρείται καλύτερη όλων των υπολοίπων καθώς σε αυτή την χρονική διάρκεια (70 ώρες) εμφανίζει το καλύτερο ποσοστό PHAs εν αντιθέσει για παράδειγμα με το στέλεχος Α το οποίο χρειάζεται 296 ώρες. Αν συγκρίνουμε τα διαγράμματα 7.3 και 7.4 θα δούμε πως ενώ στην περίπτωση επάρκειας οξυγόνου το 12.4 % της αύξησης της βιομάζας στο στέλεχος Α αντιστοιχούσε στην συσσώρευση των PHAs στην περίπτωση που το οξυγόνο είναι ο περιοριστικός παράγοντας το ποσοστό αυτό αυξάνεται σε %. Τέλος, όπως και στην περίπτωση του συνθετικού μέσου, φαίνεται να ευνοείται η παραγωγή PHAs έναντι άλλων ενδοκυτταρικών μακρομορίων και στο στέλεχος Ε. Παρατηρούμε πως ενώ στην περίπτωση επάρκειας οξυγόνου η αύξηση της βιομάζας του στελέχους Ε οφείλονταν κατά 11.4 % στην συσσώρευση PHAs το ποσοστό αυτό σε συνθήκες περιορισμού οξυγόνου αυξάνεται σε 18.2 %. Αυτό όμως δεν αντιστοιχεί σε αύξηση του ενδοκυτταρικού ποσοστού συσσώρευσης PHAs που σημαίνει πως προτιμάται σε μεγαλύτερο ποσοστό η παραγωγή PHAs έναντι άλλων προϊόντων στις συγκεκριμένες συνθήκες. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει κάποια αναφορά που να πραγματεύεται την παραγωγή PHAs από οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου υπό συνθήκες απουσίας αζώτου και ταυτόχρονου περιορισμού σε οξυγόνο. Ωστόσο τα αποτελέσματα μας έρχονται σε συμφωνία με τα συμπεράσματα στα οποία καταλήξαμε στο σύνολο των πειραμάτων για όλους τους τύπους καλλιέργειας. 189

224 Μικτή A B C D E F Ποσοτά παραγωγής πολύ-υδοξυαλκανεστέρων % PHAs (g PHAs/ g VSS) ανά τύπο καλλιεργειας 0.60 (α) (β) Μικτή A B C D E F Y PHAs/S (g PHAs/g VFAs) Y X/S (g VSS/g VFAs) (γ) Μικτή A B C D E F Ποσοστό αύξησης της βιομάζας που αντιστοιχεί στην συσσώρευση PHAs Ποσοστό αύξησης της βιομάζας που αντιστοιχεί στην συσσώρευση άλλων μακρομορίων Σχήμα 7.4. Παράμετροι ανά τύπο καλλιέργειας που χαρακτηρίζουν την παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου απουσία αζώτου και υπό περιορισμό οξυγόνου: (α) ποσοστά ενδοκυτταρικής συσσώρευσης % PHAs (g PHAs/ g VSS), (β) συντελεστές απόδοσης YPHAs/S (g PHAs/ g VFAs) και YX/S (g VSS/ g VFAs) και (γ) ποσοστά αύξησης της βιομάζας που οφείλονται σε συσσώρευση PHAs και συσσώρευση μακρομορίων πέραν των PHΑs. 190

225 7.3. Γενικά συμπεράσματα Όπως έχει προαναφερθεί υπάρχουν λίγες εργασίες οι οποίες αφορούν τη μελέτη της μικροβιακής σύστασης μικτών καλλιεργειών που έχουν εμπλουτιστεί για να προαχθεί η παραγωγή των PHAs. Οι μικτές αυτές καλλιέργειες είναι ικανές να εμφανίσουν υψηλά ποσοστά συσσώρευσης PHAs όπως και οι καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών. Ωστόσο, από αυτές τις αναφορές δεν υπάρχει κάποια η οποία να συγκρίνει τόσο την μικτή καλλιέργεια όσο και τα στελέχη που έχουν ταυτοποιηθεί πως την συστήνουν όσον αφορά την ικανότητα παραγωγής PHAs. Οι συνθήκες που επιλέχθηκαν για την παραγωγή των PHAs ήταν πανομοιότυπες με τις συνθήκες κάτω από τις οποίες εμπλουτίστηκε η ενεργός ιλύ σε ΡΗΑ-συσσωρευτές. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν υπό απουσία πηγής αζώτου, θερμοκρασία περιβάλλοντος 26 ± 2 o C και μη ελεγχόμενο αρχικό ph~7.0. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε συνθετικό μίγμα VFAs και οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου το οποίο περιείχε VFAs στην ίδια αναλογία με το συνθετικό μέσο. Αρχικά εξετάστηκε η ικανότητα παραγωγής όλων των τύπων καλλιεργειών παρέχοντας επαρκή ποσότητα οξυγόνου, 1l/ min ενώ στην συνέχεια εξετάστηκε επίσης και η επίδραση του περιορισμού της καλλιέργειας σε οξυγόνο, δηλ. παροχή 0.1l/min (DO<2 ppm). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα διαπιστώθηκε πως η εμπλουτισμένη καλλιέργεια που αναπτύξαμε υπερισχύει των στελεχών του γένους Pseudomonas, τα οποία απομονώθηκαν από αυτή, στην παραγωγή PHAs. Στο διάγραμμα 7.5 συνοψίζονται τα ποσοστά συσσώρευσης PHAs που επιτεύχθηκαν σε κάθε περίπτωση. Κατά την διάρκεια της παραγωγής PHAs, τόσο από συνθετικό μίγμα VFAs όσο και από οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου, παρατηρήθηκε μια σημαντική διαφορά στην συμπεριφορά μεταξύ της εμπλουτισμένης καλλιέργειας και των απομονωμένων στελεχών. Η διαφορά αυτή έχει να κάνει με το διαφορετικό προφίλ όσον αφορά την σειρά προτίμησης κατανάλωσης των VFAs. Ενώ η εμπλουτισμένη καλλιέργεια προτιμά να καταναλώνει πρώτα το βουτυρικό και έπειτα το προπιονικό και οξικό οξύ τα απομονωμένα στελέχη καταναλώνουν πρώτα το οξικό, έπειτα το προπιονικό και τέλος το βουτυρικό οξύ. Μία εξίσου σημαντική διαφορά είναι πως στην περίπτωση της εμπλουτισμένης καλλιέργειας όταν χρησιμοποιείται 191

226 συνθετικό μέσο δεν υπάρχει παραγωγή διαφορετικών ενδοκυτταρικών προϊόντων πέραν των PHAs κάτι το οποίο δεν συμβαίνει και με τα απομονωμένα στελέχη. Ποσοστά συσσώρευσης PHAs Συνθετικό μέσο Συνθετικό μέσο + Περιορισμός οξυγόνου ΟΑΕ ΟΑΕ + Περιορισμός οξυγόνου Μικτή A B C D E F *ΟΑΕ: Οξυνισμένο Απόβλητο Ελαιοτριβείου Σχήμα 7.5. Συνοπτικό διάγραμμα ποσοστών συσσώρευσης PHAs ανά τύπο καλλιέργειας. Σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου είναι αδύνατη η σύνθεση νέων κυττάρων. Ο λόγος για τον οποίο εφαρμόστηκε αυτή η συνθήκη ήταν για να προσανατολίσουμε την πηγή άνθρακα προς σχηματισμό PHAs έτσι ώστε να λάβουμε όσο το δυνατόν καλύτερους συντελεστές απόδοσης Y PHAs/S. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία, οι συνθήκες αυτές είναι ικανές 192

227 να προάγουν την συσσώρευση, εκτός των PHAs, γλυκογόνου και λιπιδίων. Όλα τα απομονωμένα στελέχη υποδεικνύουν την παραγωγή επιπλέον ενδοκυτταρικών προϊόντων πέραν των PHAs. Στην περίπτωση της εμπλουτισμένης καλλιέργειας παράγονται και άλλα ενδοκυτταρικά προϊόντα όταν χρησιμοποιείται οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου καθώς και όταν υπάρχει περιορισμός σε οξυγόνο ανεξαρτήτως υποστρώματος. Ο περιορισμός οξυγόνου φαίνεται πως επιβραδύνει τον ρυθμό βιοσύνθεσης των PHAs λόγω του χαμηλότερου ρυθμού κατανάλωσης της πηγής άνθρακα τόσο στην εμπλουτισμένη καλλιέργεια όσο και στα απομονωμένα στελέχη. Ωστόσο, το ποσοστό συσσώρευσης επηρεάζεται αρνητικά όταν χρησιμοποιείται η εμπλουτισμένη καλλιέργεια. Τα στελέχη Β, C, D, E, F δεν επηρεάζονται ιδιαίτερα καθώς τα ποσοστά συσσώρευσης PHAs τόσο σε επάρκεια όσο και σε έλλειψη οξυγόνου είναι παρόμοια, ενώ στο στέλεχος Α φαίνεται πως ο περιορισμός οξυγόνου οδηγεί σε αύξηση του ποσοστού συσσώρευσης PHAs. Τα παραπάνω συμπεράσματα σε συνδυασμό με το γεγονός ότι κανένα από τα απομονωμένα στελέχη δεν επέδειξε μεγαλύτερα ή εξίσου μεγάλα ποσοστά συσσώρευσης PHAs με την εμπλουτισμένη καλλιέργεια υποδηλώνει πως πιθανότατα δεν κατέστη εφικτή η απομόνωση του/των μικροοργανισμού/ών που αντιπροσωπεύουν την μικτή αυτή καλλιέργεια. Βέβαια, υπάρχει και η πιθανότητα οι μικροοργανισμοί αυτοί να συμπεριφέρονται διαφορετικά όταν λειτουργούν συνεργαστικά. Ωστόσο, δεν ήταν εφικτή η απομόνωση κάποιων στελεχών με αυξημένη ικανότητα συσσώρευσης PHAs τα οποία θεωρητικά αυξάνουν τον μέσο όρο ποσοστού παραγωγής PHAs σε αυτή την εμπλουτισμένη καλλιέργεια. Γνωρίζοντας τα παραπάνω επιλέξαμε την μικτή εμπλουτισμένη καλλιέργεια για την συνέχεια των πειραμάτων της παρούσας διατριβής καθώς φαίνεται να είναι αποδοτικότερη από τα στελέχη του γένους Pseudomonas που απομονώθηκαν. Επιπρόσθετα, η χρήση μικτών έναντι καθαρών καλλιεργειών για την παραγωγή PHAs μειώνει σημαντικά το κόστος της διεργασίας καθώς απαιτείται λιγότερος λειτουργικός έλεγχος και μη άσηπτες συνθήκες για την παραγωγή τους. 193

228 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 7 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ Alvarez H.M. & Steinbuchel A. Triacylglycerols in prokaryotic microorganisms. Appl. Microbiol.Biotechnol. 60, pp , Bengtsson S., Werker A., Welander T. Production of polyhydroxyalkanoates by glycogen accumulating organisms treating a paper mill wastewater. Wat. Sci. Technol. 58(2), pp , Bormann E.J., Leissner M., Beer B. Growth-associated production of poly(hydroxybutyric acid) by Azotobacter beijerinckii from organic nitrogen substrates. Appl. Microbiol. Biotechnol., 49(1), pp.84-88, Dionisi D., Majone M., Papa V., Beccari M. Biodegradable polymers from organic acids by using activated sludge enriched by aerobic periodic feeding. Biotechnol. Bioengin. 85(6), pp , 2005a. Dionisi D., Beccari M., Di Gregorio S., Majone M., Papini M.P., Vallini G. Storage of biodegradable polymers by an enriched microbial community in a sequencing batch reactor operated at high organic load rate. J. Chem. Technol. Biotechnol. 80(11), pp , 2005b. Dionisi D., Caruzzi G., Petrangeli Papini M., Riccardi C., Majone M., Carrasco F. Olive oil mill effluents as a feedstock for production of biodegradable polymers. Wat. Resear. 39, pp , 2005c. Dionisi D., Majone M., Vallini G., Di Gregorio S., Beccari M. Effect of the length of the cycle on biodegradable polymer production and microbial community selection in a sequencing batch reactor. Biotechnol. Progr. 23, pp , Huiberts G.N.M. & Eggink G. Production of poly(3-hydroxyalkanoates) by Pseudomonas putida KT2442 in continuous cultures. Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, pp , Jackson F.A. & Dawes E.A. Regulation of the tricarboxylic acid cycle and poly-β-hydroxybutyrate metabolism in Azotobacter beijerinckii grown under nitrogen or oxygen limitation. J. Gen. Microbiol. 97, pp , Kim G.J., Lee I.Y., Yoon S.C., Shin Y.C., Park Y.H. Enhanced yield and a high production of medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoates) in a two-step fed-batch cultivation of 194

229 Pseudomonas putida by combined use of glucose and octanoate. Enz. Microb. Technol. 20, pp , Kosa M. & Ragauskas A.J. Lipids from heterotrophic microbes: advances in metabolism research. Trends in Biotechnol. 29(2), pp , Lefebvre G., Rocher M., Braunegg G. Effects of Low Dissolved-Oxygen concentrations on Poly- (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) production by Alcaligenes eutrophus. Appl. Environ. Microbiol. 63(3), pp , Lemos P.C., Levantesi C., Serafim L.S., Rossetti S., Reis M.A.M., Tandoi V. Microbial characterisation of polyhydroxyalkanoates storing populations selected under different operating conditions using a cell-sorting RT-PCR approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 78(2), pp , Madison L.L. & Huisman G.W. Metabolic engineering of poly(3-hydroxylakanoates): From DNA to plastic. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63(1), pp , Manilla-Perez E., Lange A.B., Hetzler S., Steinbuchel A. Occurence, production and export of lipophilic compounds by hydrocarbonoclastic marine bacteria and their potential use to produce bulk chemicals from hydrocarbons. Appl. Microbiol. Biotechnol. 86, pp , Patnayak S. & Sree A. Screening of bacterial associates of marine sponges for single cell oil and PUFA. Lett. Appl. Microbiol. 40, pp , Pisco A.R., Bengtsson S., Werker A., Reis M.A.M., Lemos P.C. Community structure evolution and enrichment of glycogen-accumulating organisms producing polyhydroxyalkanoates from fermented molasses. Appl. Environ.Microbiol. 75(14), pp , Ratledge C. & Wynn J.P. The biochemistry and biotechnology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms. Adv. Appl. Microbiol. 51, pp. 1-51, Ribera R.G., Monteoliva-Sanchez M., Ramos-Cormenzana A. Production of polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas putida KT2442 harboring psk2665 in wastewater from olive oil mills (alpechin). EJB Electronic Journal of Biotechnology 4(2),

230 Salehizadeh H. & van Loosdrecht M.C.M. Production of polyhydroxyalkanoates by mixed culture: recent trends and biotechnological importance. Biotechnol. Adv. (22), pp , Satoh H., Iwamoto Y., Mino T., Matsuo T. Activated sludge as a possible source of biodegradable plastic. Water Sci. Technol. 38, pp , Senior P.J. & Dawes E.A. Poly-β-hydroxybutyrate biosynthesis and the regulation of glucose metabolism in Azotobacter beijerinckii. Biochem. J. 125, pp , Senior P.J. & Dawes E.A. The regulation of poly-β-hydroxybutyrate in Azotobacter beijerinckii. Biochem. J. 134, pp , Steinbuchel A. & Schlegel H.G. Excretion of pyruvate by mutants of Alcaligenes eutrophus, which are impaired in the accumulation of poly(β-hydroxybutyric acid) (PHB), under conditions permitting synthesis of PHB. Appl. Microbiol. Biotecnol. 31, pp , Suzuki T., Yamane T., Shimizu S. Mass production of poly-β-hydroxybutyric acid by fully automatic fed-batch culture of methylotroph. Appl. Microbiol. Biotechol. 23, pp , Ward P.G. & O Connor K.E. Bacterial synthesis of polyhydroxyalkanoates containing aromatic and aliphatic monomers by Pseudomonas putida CA-3. Int. Jour. Biol. Macromol. 35, pp , Zevenhuizen L.P.T.M. & Ebbink A.G. Interrelations between glycogen, poly-β-hydroxybutyric acid and lipids during accumulation and subsequent utilization in a Pseudomonas. Antonie van Leeuwenhoek 40, pp , Κρητικού Μαριάννα, Μεταπτυχιακή εργασία Αξιοποίηση αμυλούχων βιομηχανικών αποβλήτων για την παραγωγή μικροβιακού λίπους από τον μύκητα Mortierella isabellina. Γεωπονικό πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα, Κουτρούλη Ελένη, Διδακτορική διατριβή Βιοτεχνολογική αξιοποίηση αποβλήτων ελαιοτριβείων για παραγωγή υδρογόνου. Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα

231 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Παραγωγή PHAs από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια κάνοντας χρήση συνθετικών υποστρωμάτων Η παραγωγή των PHAs από μικτές καλλιέργειες έχει ερευνηθεί στο παρελθόν. Ωστόσο, τα περισσότερα παραδείγματα παραγωγής PHAs που αναφέρονται συσχετίζονται ως επί το πλείστον με την παρουσία τους κατά την επεξεργασία υγρών λυμάτων παρά με μια ενδεχόμενη εντατική διεργασία παραγωγής τους (van Loosdrecht et al., 1997). Τα τελευταία χρόνια η βελτιστοποίηση της διεργασίας παραγωγής PHAs φαίνεται πως έχει ως αποτέλεσμα την ενδοκυτταρική συσσώρευση των PHAs σε ποσοστά που ανέρχονται στο 65 % g PHAs/g ξηρής κυτταρικής βιομάζας (Dias et al., 2006; Serafim et al., 2008a). Τα βέλτιστα ποσοστά που επιτυγχάνονται είναι ακόμα χαμηλά συγκριτικά με τα ποσοστά που προκύπτουν από καθαρές καλλιέργειες κάποιων φυσικών, π.χ. Cupriavidus necator, και ανασυνδυασμένων μικροοργανισμών, π.χ. E.coli, τα οποία αγγίζουν το 80-90% g PHAs/ g ξηρής κυτταρικής βιομάζας. Για την εμπορική παραγωγή των PHAs, οι γενετικά τροποποιημένοι μικροοργανισμοί θεωρούνται ανώτεροι των φυσικών PHA-παραγωγών, καθώς παράγουν 100 g/l PHAs σε 40 ώρες από καθαρά υποστρώματα όπως σάκχαρα συσσωρεύοντας περίπου 90 % PHAs. Συνήθως οι βιοτεχνολογικές διαδικασίες, οι οποίες περιλαμβάνουν την χρήση καθαρών καλλιεργειών, απαιτούν υποστρώματα υψηλής καθαρότητας και άσηπτες συνθήκες. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του κόστους των υποστρωμάτων, του εξοπλισμού και της κατανάλωσης ενέργειας καθιστώντας την βιομηχανική βιοτεχνολογία, η οποία βασίζεται σε καθαρές καλλιέργειες, μη ευνοϊκή για την παραγωγή βιοχημικών ουσιών και βιοπροϊόντων σε μεγάλη κλίμακα(reis at al., 2003; Serafim et al., 2008b). Μια εναλλακτική προσέγγιση για την παραγωγή βιοχημικών ουσιών και βιοπροϊόντων μπορεί να είναι η εφαρμογή της οικο-βιοτεχνολογίας. Η οικο-βιοτεχνολογία έχει ως σκοπό την παραγωγή προϊόντων μέσω διεργασιών οι οποίες κάνουν χρήση και διαλογή μικτών 197

232 καλλιεργειών με βάση οικολογικές αρχές, συνδυάζοντας με τον τρόπο αυτό την περιβαλλοντική βιοτεχνολογία με την βιομηχανική βιοτεχνολογία. Οι μικτές καλλιέργειες μέχρι πρόσφατα έβρισκαν εφαρμογή μόνο στην επεξεργασία αποβλήτων και κατά ένα μέρος στην παραγωγή βιοαερίου ή την ζύμωση τροφίμων αλλά όχι στην παραγωγή βιοχημικών ουσιών και προϊόντων. Η αρχή της οικο-βιοτεχνολογίας βασίζεται στην φυσική επιλογή και τον ανταγωνισμό των μικροοργανισμών και όχι στην γενετική ή μεταβολική τροποποίηση τους (Kleerebezem & van Loosdrecht, 2007). Οι συνθήκες που εφαρμόζονται για την επιλογή του επιθυμητού μεταβολισμού μιας μικτής καλλιέργειας αφορούν το υπόστρωμα και τις λειτουργικές συνθήκες του βιοαντιδραστήρα. Για παράδειγμα, όταν χρησιμοποιείται μικτή καλλιέργεια κατά την αναερόβια χώνευση η ζύμωση αυτή μπορεί να οδηγήσει προς διαφορετικά προϊόντα ανάλογα με την επιλογή του ph (Temudo et al., 2007). Εφόσον τα PHAs είναι προϊόντα τα οποία παράγονται φυσικά από πολλούς μικροοργανισμούς κάτω από δυναμικές συνθήκες, η εφαρμογή της μεθόδου υπερεπάρκειας/έλλειψης υποστρώματος είναι επιτυχής για τον σχηματισμό μικροβιακού πληθυσμού ικανού για την παραγωγή PHAs. Επίσης κατάλληλα υποστρώματα για την παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας μικτές καλλιέργειες θεωρούνται τα πτητικά λιπαρά οξέα τα οποία με την σειρά τους παράγονται μέσω ζύμωσης από μικτές καλλιέργειες. Στην παρούσα διατριβή γίνεται χρήση της εμπλουτισμένης καλλιέργειας για την παραγωγή PHAs από συνθετικές πηγές άνθρακα. Συγκεκριμένα, επιλέχθηκε η χρήση μίγματος μικρού μήκους πτητικών λιπαρών οξέων, δηλ. οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ. Στην συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση του αρχικού ph στην διεργασία παραγωγής PHAs. Μετέπειτα, εφόσον έγινε επιλογή της βέλτιστης τιμής του ph, εξετάστηκαν οι πιθανοί συνδυασμοί των πηγών άνθρακα, ενώ τέλος εξετάστηκε η επίδραση του λόγου C/N. Επίσης, εφόσον ο εμπλουτισμός της μικτής καλλιέργειας σε PHA-συσσωρευτές πραγματοποιήθηκε υπό εναλλασσόμενες συνθήκες παροχής πηγής άνθρακα και πηγής αζώτου, μελετήθηκε η ενδοκυτταρική αποδόμηση του ομοπολυμερούς ΡΗΒ και του συμπολυμερούς PHBV κατά τον κύκλο του αζώτου καθώς και η περίπτωση στην οποία δεν παρέχεται πηγή αζώτου, οπότε τα ενδοκυτταρικά αποθέματα σε μορφή PHAs χρησιμοποιούνται για συντήρηση των κυττάρων. Σε 198

233 όλες τις περιπτώσεις όπου υπήρχε πηγή αζώτου τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με προσθήκη ή όχι N-allylthiourea η οποία χρησιμοποιείται για την παρεμπόδιση της νιτροποίησης Υλικά και μέθοδοι Μικροοργανισμοί Σε όλα τα πειράματα χρησιμοποιήθηκε 25 % v/v εμβόλιο εμπλουτισμένης καλλιέργειας από τον αντιδραστήρα περιοδικής πλήρωσης και απορροής. Στα πειράματα που έχουν ως σκοπό την διερεύνηση παραγωγής PHAs υπό διαφορετικές τιμές αρχικού ph, διαφορετικούς λόγους C/N και διαφορετικές πηγές άνθρακα το εμβόλιο λήφθηκε μετά το τέλος του κύκλου του αζώτου. Στις περιπτώσεις όπου μελετήθηκε η ενδοκυτταρική κατανάλωση των PHAs (100% PHB και 50 % PHB-50 % PHV) για λόγους ανάπτυξης και συντήρησης των κυττάρων το εμβόλιο λήφθηκε μετά το τέλος του κύκλου του άνθρακα ώστε να διαθέτει ικανοποιητική ποσότητα αποθεμάτων (PHAs) Υποστρώματα Στα πειράματα τα οποία αφορούν την μελέτη της επίδρασης του αρχικού ph και του λόγου C/N ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος συγκέντρωσης 1 g/l από το καθένα. Όταν εξετάζονται οι διαφορετικές πηγές άνθρακα και οι συνδυασμοί τους και πάλι η αρχική συγκέντρωση του κάθε οξέος αντιστοιχεί σε 1g/l. Ως πηγή αζώτου στα πειράματα διαφορετικού λόγου C/N και κατά την ενδοκυτταρική αποδόμηση των PHAs χρησιμοποιήθηκε θειικό αμμώνιο, (ΝΗ 4 ) 2 SO 4. Τα πειράματα αυτά πραγματοποιήθηκαν είτε με προσθήκη είτε χωρίς προσθήκη της χημικής ένωσης N- allylthiourea, η οποία παρεμποδίζει την νιτροποίηση. Το συνθετικό θρεπτικό μέσο περιείχε επίσης (g/l): Κ 2 ΗPO , KH 2 PO , MgSO 4 2H 2 O 0.2, CaCl 2 2H 2 O και διάλυμα ιχνοστοιχείων 1ml/l σύστασης όπως αυτή περιγράφεται στον πίνακα 6.1. Στην περίπτωση που διερευνάται η επίδραση του αρχικού ph η 199

234 σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 διέφερε χωρίς όμως να μεταβληθεί η τελική συγκέντρωση και των δύο από τα 12 g/l (βλ. πίνακα 8.1) Πειραματική διάταξη και συνθήκες Τα πειράματα έλαβαν χώρα εις διπλούν σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου λειτουργικού όγκου 1 l, όπως αυτοί περιγράφονται στην παράγραφο του κεφαλαίου 6. Για την εκκίνηση του κάθε αντιδραστήρα χρησιμοποιούνταν 250 ml εμβόλιο από την κάθε καλλιέργεια/βακτηριακό στέλεχος και 750 ml θρεπτικό μέσο. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν υπό αερόβιες συνθήκες με την βοήθεια αεραντλίας δυναμικότητας 1 l/min, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 26 ± 2 o C και υπό ανάδευση 250 rpm. Κατά την διάρκεια των πειραμάτων παρακολουθούνταν οι εξής παράμετροι: η συγκέντρωση των πτητικών λιπαρών οξέων, των ολικών και πτητικών αιωρούμενων στερεών, του πολύ-υδροξυβουτυρικού και πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα, το ph, καθώς επίσης και οι συγκεντρώσεις του αζώτου, του ολικού, αμμωνιακού, νιτρικού και νιτρώδους αζώτου, του γλυκογόνου και του χημικά απαιτούμενου οξυγόνου, όπου αυτό ήταν απαραίτητο Παρουσίαση αποτελεσμάτων και συζήτηση Επίδραση της τιμής του αρχικού ph Η χρήση των μικτών καλλιεργειών και ο εμπλουτισμός τους υπό δυναμικές συνθήκες καθιστά πιθανή την αντικατάσταση καθαρών συνθετικών υποστρωμάτων, π.χ. Ν-ελλιπή μίγματα γλυκόζης και VFAs, με χαμηλού κόστους οργανικά απόβλητα ως ανανεώσιμα υποστρώματα για την παραγωγή PHAs. Το γεγονός αυτό έχει οδηγήσει πρόσφατα τους ερευνητές στην μελέτη υποστρωμάτων όπως μελάσες σακχαροκάλαμου (Alburquerque et al., 2007), απόβλητα της παραγωγής φοινικέλαιου (Hassan et al., 1997a,b), απόβλητα της παραγωγής ελαιολάδου (Beccari et al., 2009) και απόβλητα της παραγωγής χάρτου (Bengtsson et al., 2008) για την παραγωγή PHAs. 200

235 Για τον μετασχηματισμό των οργανικών αποβλήτων σε PHAs έχει προταθεί μία διεργασία τριών σταδίων. Στο πρώτο στάδιο, μέσω της αναερόβιας χώνευσης, πραγματοποιείται μετατροπή του βιοαποδομήσιμου φορτίου του αποβλήτου σε ένα μίγμα με υψηλή συγκέντρωση VFAs. Στο δεύτερο στάδιο πραγματοποιείται εμπλουτισμός της ενεργού ιλύος σε ΡΗΑ-συσσωρευτές για τον σχηματισμό μικτής καλλιέργειας με την ικανότητα να παράγει υψηλά ποσοστά συσσώρευσης PHAs. Στο τρίτο και τελευταίο στάδιο πραγματοποιείται αερόβια η συσσώρευση των PHAs σε αντιδραστήρα διαλείποντος έργου υπό τις βέλτιστες συνθήκες για να επιτευχθούν τα μεγαλύτερα ποσοστά συσσώρευσης σε PHAs. Το σύνολο της παραπάνω διεργασίας επηρεάζεται από διάφορους λειτουργικούς παράγοντες όπως είναι η τιμή του ph. Η αναερόβια χώνευση πραγματοποιείται συνήθως σε όξινο περιβάλλον, ph , για να ευνοηθεί η δράση των οξεογόνων μικροοργανισμών και αντίστοιχα να παρεμποδιστεί αυτή των μεθανογόνων. Αρκετές έρευνες έχουν εξετάσει την επίδραση του ph στην σύσταση των παραγόμενων VFAs. Η σύσταση αυτού του μίγματος επηρεάζει στα επόμενα στάδια την σύσταση των παραγόμενων PHAs (Horiuchi et al., 2002; Bengtsson et al., 2008b). Όσον αφορά το στάδιο της συσσώρευσης των PHAs δεν υπάρχει αρκετή πληροφορία για την επίδραση του ph. Όταν επιλέγεται η τιμή του pη πρέπει να λαμβάνεται υπόψη το γεγονός πως τα περισσότερα μη-εξτρεμόφιλα βακτήρια αναπτύσσονται σε ένα μεγάλο εύρος εξωτερικού ph, , διατηρώντας το κυταροπλασματικό ph στο , στο οποίο οι περισσότερες πρωτεΐνες και τα πιο σημαντικά βιολογικά μόρια που συνδέονται με την κυτταρική ανάπτυξη επιδεικνύουν την βέλτιστη ενεργότητα (Padan et al., 1981; Booth, 1985). Λίγες είναι οι αναφορές στην βιβλιογραφία που περιγράφουν την επίδραση του ph στον ρυθμό και την απόδοση της διαδικασίας παραγωγής PHAs (Suzuki et al., 1995; Chua et al., 2003; Serafim et al., 2004). Σύμφωνα με αυτές, φαίνεται πως επιτυγχάνονται υψηλότεροι ρυθμοί παραγωγής PHAs όταν η τιμή του ph ελέγχεται σε εύρος έναντι των τιμών Επίσης σύμφωνα με τους Dionisi κ.ά. (Dionisi et al., 2005) διαπιστώθηκε πως η μεταβολή της τιμής του ph από το δεύτερο στο τρίτο στάδιο της διεργασίας επηρέαζε σημαντικά τον ρυθμό παραγωγής καθώς και την σύσταση των PHAs. Συγκεκριμένα παρατήρησαν πως υψηλότερο ρυθμό παραγωγής και μεγαλύτερη σύσταση μονομερών HV σε τιμές ph

236 Σκοπός αυτής της ενότητας είναι η μελέτη της επίδρασης της τιμής του ph, κατά το στάδιο της συσσώρευσης των PHAs, στον ρυθμό παραγωγής, την απόδοση και τη σύσταση των παραγόμενων PHAs. Η τιμή του ph στα πειράματα δεν ήταν ελεγχόμενη αλλά αντιστοιχεί στην αρχική τιμή του ph στην καλλιέργεια. Η επιλογή να μην υπάρχει παρουσία συστήματος ελέγχου του ph έγινε με βάση τον σχεδιασμό μιας απλούστερης και οικονομικά πιο ανταγωνιστικής διεργασίας. Η ρύθμιση του αρχικού ph πραγματοποιήθηκε κάνοντας χρήση ρυθμιστικού διαλύματος K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 χωρίς την προσθήκη κάποιας άλλης χημικής ένωσης. Οι τιμές του ph που εξετάστηκαν καθώς και η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος φαίνονται στον πίνακα 8.1. Πίνακας 8.1. Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος και τιμές ph που εξετάστηκαν. ph Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος K 2 HPO 4 KH 2 PO g/l 10 g/l g/l g/l g/l 1.2 g/l g/l 0.5 g/l ph = 6.40 Στο σχήμα 8.1 παρακολουθούμε την πορεία των πειραματικών τιμών του ph, των συγκεντρώσεων των υποστρωμάτων, των ολικών και πτητικών αιωρούμενων στερεών, του πολύ-υδροξυβουτυρικού, του πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα και των συνολικών PHAs, της σύστασης των PHAs καθώς και του ποσοστού συσσώρευσης των PHAs κατά την διάρκεια του πειράματος με αρχική τιμή ph=

237 Σύσταση PHAs (% mol) Ποσοστό συσσώρευσης PHAs g/l ph [log H + ] g/l οξικό οξύ προπιονικό οξύ βουτυρικό οξυ άθροισμα πτητικών λιπαρών οξέων VSSdiff. PHB (α) (β) (γ) TSS PHV VSS PHAs % HB % HV (δ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) % PHAs (g PHAs/ g TSS) (ε) Σχήμα 8.1. ph Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης πτητικών λιπαρών οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 203

238 Όπως είχαμε υποδείξει και στο προηγούμενο κεφάλαιο, όταν στην εμπλουτισμένη καλλιέργεια παρέχεται μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος τα κύτταρα προτιμούν να καταναλώνουν πρώτα το βουτυρικό και στην συνέχεια το προπιονικό και το οξικό οξύ. Στην περίπτωση που το ph ήταν 6.4 παρατηρούμε από το διάγραμμα 8.1α πως το βουτυρικό οξύ καταναλώνεται μέσα σε 40 ώρες και χαρακτηρίζεται από μέσο ρυθμό κατανάλωσης ~ 27 mg/h (49 mg COD/h). Μέχρι αυτό το χρονικό σημείο η συγκεντρώσεις του οξικού και προπιονικού οξέος δεν διαφέρουν πολύ από τις αρχικές τους συγκεντρώσεις και οι μέσοι ρυθμοί κατανάλωσης ισούνται με 4.5 mg/h (4.8 mg COD/h) και 9.7 mg/h (14.6 mg COD/l) αντίστοιχα. Μετά την απομάκρυνση του βουτυρικού οξέος τα υπόλοιπα οξέα καταναλώνονται πολύ πιο γρήγορα και οι ρυθμοί αυτοί αυξάνονται σε 61 mg/h (65 mg COD/h) για το οξικό και 53 mg/h (80 mg COD/h) για το προπιονικό οξύ. Στα υπόλοιπα διαγράμματα φαίνεται η τάση της μεταβολής που προκαλείται από την αλλαγή στον ρυθμό κατανάλωσης των οργανικών υποστρωμάτων. Για παράδειγμα από το διάγραμμα 8.1γ μπορούμε δούμε πως ο μέσος ρυθμός παραγωγής PHAs μέχρι τις 40 ώρες είναι 45 mg COD/h ενώ από την 40 η ώρα μέχρι το τέλος σχεδόν τριπλασιάζεται και ισούται με 122 mg COD/h. Επίσης στο διάγραμμα 8.1δ παρατηρείται παραγωγή ΡΗΒ και PHV και το περιεχόμενο των PHAs σε PHV αυξάνει μετά την 40 η ώρα. Αυτό είναι άμεσο αποτέλεσμα της κατανάλωσης των αντίστοιχων υποστρωμάτων. Αρχικά, μέχρι την 40 η ώρα παράγονται PHAs τα οποία συνίστανται από % HV λόγω της μικρής κατανάλωσης του προπιονικού οξέος. Στην συνέχεια το κλάσμα του HV αυξάνει μέχρι 35 % όταν καταναλώνονται το οξικό και το προπιονικό οξύ. Γενικά, οι μικτές καλλιέργειες που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή PHAs και οι οποίες εμπλουτίζονται καταναλώνοντας ως πηγή άνθρακα μικρού μήκους πτητικά λιπαρά οξέα συσσωρεύουν scl-phas. Παρατηρούμε στο σχήμα 8.2 πως το οξικό οξύ οδηγεί σε σχηματισμό ΡΗΒ έπειτα από την συνένωση δύο μορίων ακετυλο-coa με την βοήθεια του ενζύμου β- κετοθειολάση. Το βουτυρικό οξύ είναι η πρόδρομη ένωση για τον σχηματισμό PHB. Το προπιονικό οξύ αν χρησιμοποιηθεί από το κύτταρο ως μοναδικό υπόστρωμα οδηγεί στην παραγωγή PHB, PHV ή πολύ-3,υδροξυ-2,βαλερικού εστέρα P(3H2MV) το οποίο είναι ισομερές του πολύ-υδροξυεξανοικού εστέρα, PHHx. Εάν το προπιονικό οξύ χορηγηθεί σε συνδυασμό με 204

239 οξικό οξύ μπορεί να παραχθεί PHB, PHV ή το ισομερές του PHV, P(3H2MB). Η παραγωγή ΗV και H2MB μονομερών προκύπτει από τον συνδυασμό ενός μορίου ακετυλο-coa με ένα μόριο προπιονυλο-coa από τα οποία και παράγεται το υδροξυβαλερυλο-coa, πρόδρομη ένωση του υδροξυβαλερικού εστέρα. Για την παραγωγή HV είναι υποχρεωτική η σύνθεση ακετυλο-coa. Η παραγωγή ακετυλο-coa από το προπιονικό οξύ μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω πέντε διαφορετικών μεταβολικών οδών: της οδού του μεθυλομηλόνυλο-coa, της οδού του α- υδροξυγλουταρικού, της οδού του κιτρομηλικού, της οδού του ακρυλουλο-coa και της οδού του 2-μεθυλοκιτρικού οξέος (Horswill & Escalante-Semerena, 1999; Lemos et al., 2003). Παρόλο που η παραγωγή υδροξυβαλερικού εστέρα είναι η κύρια οδός για την μετατροπή του προπιονικού οξέος, δεν αποκλείεται ο ενδεχόμενος σχηματισμός μορίων υδροξυβουτυρυλο- CoA, πρόδρομη ένωση των μονομερικών ομάδων ΗΒ, από την συμπύκνωση δύο μορίων ακετυλο-coa. Οξικό οξύ Προπιονικό οξύ NADPH + H + ακετοακέτυλο-coa αναγωγάση NADP + Βουτυρικό οξύ β-κετοθιολάση ακετυλο-coa ακετοακέτυλο-coa (R)-3-υδροξυακυλοCoA (R)-3-υδροξυβουτυρυλο-CoA ΡΗΑ-πολυμεράση ΡΗΒ CO PHV P(3H2MB) προπιονυλο-coa 2 P(3H2MV) Σχήμα 8.2. Σχηματική αναπαράσταση της παραγωγής PHAs από οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ. Στα πειράματα μας γίνεται παραγωγή συμπολυμερών που αποτελούνται από υδροξυβουτυρικό και υδροξυβαλερικό εστέρα, δηλ. PHBV. Δεν παρατηρήθηκε η παραγωγή P(3H2MV). Επίσης αν παρατηρήσουμε το σχήμα 8.1γ θα δούμε ότι η αύξηση της βιομάζας οφείλεται αποκλειστικά στην παραγωγή των PHAs καθώς συμπίπτουν οι τιμές των συνολικά 205

240 παραγόμενων PHAs, σε g, με την διαφορά της αύξησης της βιομάζας δηλαδή με τις τιμές των VSSdiff., σε g. Τα πειράματα πραγματοποιούνται απουσία πηγής αζώτου οπότε δεν έχουμε κυτταρική ανάπτυξη και δεν παράγεται γλυκογόνο (ή κάποιο άλλο ενδοκυτταρικό απόθεμα), κάτι το οποίο παρατηρήσαμε και στο προηγούμενο κεφάλαιο στην παράγραφο Στο σχήμα 8.1ε παρατηρούμε το ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφρασμένο τόσο ανά TSS όσο και ανά VSS. Η έκφραση και με τους δυο αυτούς τρόπους έγινε για λόγους σύγκρισης με την βιβλιογραφία. Φαίνεται λοιπόν πως στο τέλος του πειράματος, μετά δηλαδή την ολοκληρωτική απομάκρυνση των οργανικών υποστρωμάτων το ποσοστό συσσώρευσης ανέρχεται σε 64 % g PHAs/ g VSS ή αλλιώς 39 % g PHAs/ g TSS. Επίσης δεν είναι εμφανές κάποιο σημάδι κορεσμού της περιεκτικότητας των κυττάρων σε PHAs αφού η πορεία του ποσοστού συσσώρευσης μέχρι το τέλος της διαδικασίας είναι σχεδόν γραμμική. Στο σχήμα 8.1β παρατηρείται σταδιακή αύξηση του ph από 6.4 σε 7.1 λόγω της κατανάλωσης των οργανικών οξέων ph = 6.90 Στο σχήμα 8.3 διαφαίνεται η πορεία της παραγωγής PHAs υπό συνθήκες αρχικού ph= Όπως και προηγουμένως έτσι και εδώ παρατηρείται η προτίμηση της εμπλουτισμένης καλλιέργειας να καταναλώνει πρωτίστως το βουτυρικό οξύ. Το βουτυρικό οξύ καταναλώνεται πλήρως μέσα σε 16 ώρες με μέσο ρυθμό κατανάλωσης ~ 66 mg/h (120 mg COD/h) ενώ μέχρι αυτό το συγκεκριμένο χρονικό σημείο οι μέσοι ρυθμοί κατανάλωσης του οξικού και προπιονικού οξέος ισούνται με 12 mg/h (12.8 mg COD/h) και 24 mg/h (26 mg COD/h) αντίστοιχα. Έπειτα φαίνεται να προτιμάται η κατανάλωση του προπιονικού έναντι του οξικού οξέος εφόσον το προπιονικό οξύ απομακρύνεται πλήρως στις 32 ώρες. Στο χρονικό διάστημα μεταξύ ωρών ο μέσος ρυθμός κατανάλωσης του προπιονικού οξέος αυξάνεται σε 34 mg/h (51 mg COD/h) ενώ ο ρυθμός κατανάλωσης του οξικού οξέος παραμένει σχεδόν σταθερός. Τέλος, μετά και την απομάκρυνση του προπιονικού οξέος, το οξικό οξύ είναι η μοναδική πηγή άνθρακα με αποτέλεσμα την αύξηση του μέσου ρυθμού κατανάλωσης σε 60 mg/h (64 mg COD/h) στο χρονικό διάστημα μεταξύ ωρών. 206

241 Η αύξηση του ρυθμού κατανάλωσης του προπιονικού οξέος στο χρονικό διάστημα ωρών έχει ως άμεσο αποτέλεσμα την αύξηση του κλάσματος των μονάδων HV στα παραγόμενα PHAs, κάτι το οποίο φαίνεται πιο ξεκάθαρα στο σχήμα 8.3δ καθώς το περιεχόμενο σε HV αυξάνεται από 15 στο 25 %. Ο μέσος ρυθμός παραγωγής PHAs στα χρονικά διαστήματα 0-16, και ώρες είναι 84 mg/h (143 mg COD/h, HB: 69 mg/h ή 116 mg COD/h, HV: 14 mg/h ή 27 mg COD/h), 35 mg/h (61 mg COD/h, HB: 22 mg/h ή 37 mg COD/h, HV: 12 mg/h ή 24 mg COD/h) και 47.5 mg/h (82 mg COD/h, HB: 46 mg/h ή 78 mg COD/h, HV: 2 mg/h ή 4 mg COD/h). Από τα παραπάνω παρατηρούμε ότι η αύξηση των μονάδων HV στο κλάσμα των PHAs δεν είναι αποτέλεσμα της αύξησης του ρυθμού παραγωγής του υδροξυβαλερικού εστέρα αλλά αποτέλεσμα της μείωσης του ρυθμού παραγωγής των μονάδων ΗΒ. Επίσης, από το σχήμα 8.3ε προκύπτει πως το μέγιστο ποσοστό συσσώρευσης PHAs αντιστοιχεί σε 66.4 % g PHAs/ g VSS ή αλλιώς σε 41.1 % g PHAs/ g TSS. Την 16 η και 32 η ώρα τα ποσοστά αυτά ανέρχονταν σε 54 % g PHAs/ g VSS ή 31 % g PHAs/ g TSS και 63 % g PHAs/ g VSS ή 39 % g PHAs/ g TSS αντίστοιχα. Μετά την κατανάλωση του βουτυρικού οξέος την 16 η ώρα φαίνεται πως μειώνεται ο ρυθμός συσσώρευσης των PHAs καθώς στις επόμενες 22.5 ώρες το ποσοστό συσσώρευσης μεταβάλλεται από 54 σε 66 % g PHAs/ g VSS. Σε αυτό το διάγραμμα φαίνεται ότι η περιεκτικότητα της βιομάζας σε PHAs δεν μπορεί να μεταβληθεί σημαντικά πέραν του 66.4 % g PHAs/ g VSS καθώς υπάρχουν σημάδια κορεσμού. Κάτι ανάλογο δεν παρατηρήθηκε όταν το αρχικό ph ήταν 6.40 διότι σε αυτή την τιμή του ph δεν ήταν τόσο εύκολη η πρόσληψη των οργανικών υποστρωμάτων καθώς η απομάκρυνση του συνόλου των πτητικών λιπαρών οξέων χρειάστηκε 52 ώρες έναντι 38.5 ωρών σε πιο ουδέτερο ph=6.90. Ενδεχομένως στην διάρκεια αυτή τα κύτταρα να χρησιμοποιούν και ένα μέρος από τα παραγόμενα PHAs για συντήρηση λόγω της απουσίας αζώτου. Επίσης σημαντικό ρόλο παίζει η κατανάλωση του βουτυρικού οξέος. Όταν αυτό προσλαμβάνεται από τα κύτταρα το ποσοστό συσσώρευσης ανέρχεται περίπου στο 50 % g PHAs/ g VSS. Η τιμή του ph στο συγκεκριμένο πείραμα αυξήθηκε από 6.9 σε 7.9 λόγω της κατανάλωσης των οργανικών οξέων. Και σε αυτό το πείραμα η αύξηση της βιομάζας οφείλεται αποκλειστικά στην ενδοκυτταρική συσσώρευση PHAs καθώς PHAs=VSS diff. =VSS τελ. -VSS αρχ.. 207

242 Σύσταση PHAs (% mol) Ποσοστό συσσώρευσης PHAs g/l ph [log H + ] g/l οξικό οξύ προπιονικό οξύ βουτυρικό οξύ αθροισμα πτητικών λιπαρών οξέων (α) (β) VSSdiff. (γ) TSS PHV VSS PHB PHAs % HB % HV (δ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) % PHAs (g PHAS/ g TSS) (ε) Σχήμα 8.3. ph Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης πτητικών λιπαρών οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 208

243 ph = 7.25 Στο σχήμα 8.4 παρατηρούμε την συμπεριφορά της εμπλουτισμένης καλλιέργειας υπό συνθήκες αρχικού ph = Σε αυτό το πείραμα η κατανάλωση του βουτυρικού οξέος προτιμάται ξανά και πραγματοποιείται μέσα στις πρώτες 16 ώρες. Στην συνέχεια το προπιονικό οξύ καταναλώνεται με γρηγορότερο ρυθμό ενώ ο ρυθμός κατανάλωσης του οξικού οξέος αυξάνεται μόνο όταν η συγκέντρωση του προπιονικού οξέος είναι αρκετά χαμηλή, δηλαδή μετά την 50 η ώρα. Το βουτυρικό οξύ καταναλώνεται με μέσο ρυθμό κατανάλωσης 60 mg/h (110 mg COD/h) ενώ μέχρι την 16 η ώρα οι μέσοι ρυθμοί κατανάλωσης οξικού και προπιονικού οξέος ισούνται με 6.8 mg/h (7.3 mg COD/h) και 22 mg/h (33 mg COD/h) αντίστοιχα. Από την 16 η έως την 50 η ώρα οι μέσοι ρυθμοί κατανάλωσης οξικού και προπιονικού οξέος μειώνονται σε 3 mg/h (3 mg COD/h) και 17 mg/h (25 mg COD/h) αντίστοιχα. Μετά το πέρας των 50 ωρών το οξικό οξύ απομακρύνεται με ρυθμό 18 mg/h (19 mg COD/h). Η μείωση του ρυθμού κατανάλωσης τα χρονικά διαστήματα 0-16, 16-50, ώρες από 150 σε 28 και 19 mg COD/h αντίστοιχα οφείλεται σε μια φαινομενική παρεμπόδιση της συσσώρευσης PHAs λόγω της έλλειψης χωρητικότητας των κυττάρων (εμφάνιση φαινομένου κορεσμού) καθώς την 16 η και 50ή ώρα τα ποσοστά συσσώρευσης PHAs ανέρχονται σε 53 % g PHAs/ g VSS (32 % g PHAs/ g TSS) και 67 % g PHAs/ g VSS (41 % g PHAs/g TSS) αντίστοιχα (σχήμα 8.4ε). Στις 83.5 ώρες, όταν όλα τα οργανικά οξέα έχουν καταναλωθεί το ποσοστό συσσώρευσης μειώνεται ελάχιστα και καταλήγει στο 65 % g PHAs/ g VSS (36 % g PHAs/ g TSS). Εφόσον φαίνεται πως το μέγιστο ποσοστό συσσώρευσης επιτυγχάνεται στις 50 ώρες το υπολειπόμενο οξικό οξύ πιθανότατα αφομοιώνεται από τα κύτταρα για λόγους συντήρησης. Αναμενόμενη από τα παραπάνω είναι η παρατήρηση της μείωσης του ρυθμού παραγωγής των PHAs από το διάστημα 0-16 στο χρονικό διάστημα ώρες και από την 50 η ώρα μέχρι το τέλος του πειράματος. Συγκεκριμένα, οι μέσοι ρυθμοί παραγωγής για τα παραπάνω χρονικά διαστήματα ισούνται με 68 mg/h (116 mg COD/h, HB; 59 mg/h ή 99 mg COD/h, HV: 9 mg/h ή 17 mg COD/h) σε 16 mg/h (27 mg COD/h, HB: 11 mg/h ή 18 mg COD/h, HV: 5 mg/h ή 9 mg COD/h) και τέλος σε 5 mg/h (8 mg COD/h, HB: 5 mg/h ή 8 mg COD/h, HV: 0 mg/h ή 0 mg COD/h). 209

244 Σύσταση PHAs (% mol) Ποσοστό συσσώρευσης PHAs g/l ph [log H + ] g/l οξικό οξύ προπιονικό οξύ βουτυρικό οξύ άθροισμα πτητικών λιπαρών οξέων Xρόνος (h) 10.0 VSSdiff. (α) 9.6 (β) (γ) TSS PHV VSS PHB PHAs % HB % HV (δ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) % PHAs (g PHAs/ g TSS) (ε) Σχήμα 8.4. ph Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης πτητικών λιπαρών οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 210

245 Όπως και στην τιμή ph = 6.90 έτσι και εδώ παρατηρούμε την γρήγορη κατανάλωση του βουτυρικού οξέος με αποτέλεσμα το ποσοστό συσσώρευσης PHAs να αγγίζει το 53 % g PHAs/ g VSS. Από εκεί και πέρα έχουμε μικρή αύξηση έως το %. Έτσι, οι ρυθμοί κατανάλωσης των υπολοίπων οξέων και ρυθμοί παραγωγής των PHAs μειώνονται σημαντικά. Η σύσταση των PHAs την 16 η, 50 η ώρα και στο τέλος του πειράματος είναι 87 % ΗΒ-13 % ΗV, 81 % HB-19 % HV και 86 % HB-14 % HV αντίστοιχα. Φαίνεται πως η κατανάλωση του προπιονικού οξέος δεν αυξάνει σημαντικά την παραγωγή και σύσταση των PHAs σε HV μονομερή και αυτό συμβαίνει για δύο λόγους. Πρώτον, τα κύτταρα είναι κοντά στα όρια της μέγιστης ενδοκυτταρικής τους χωρητικότητας και δεν μπορούν να συσσωρεύσουν μεγάλη ποσότητα σε PHAs. Η μεγαλύτερη κατανάλωση του προπιονικού οξέος που οδηγεί στον σχηματισμό HV μονομερών συμβαίνει εκείνο ακριβώς το διάστημα όπου υπάρχει παρεμπόδιση παραγωγής PHAs εξαιτίας του παραπάνω λόγου. Επειδή προφανώς τα κύτταρα δεν μπορούν να χρησιμοποιήσουν μεγάλο ποσοστό της υπολειπόμενης συγκέντρωσης του προπιονικού οξέος για τον σχηματισμό πολυμερών την εκμεταλλεύονται για λόγους συντήρησης. Επίσης, ένας δεύτερος λόγος είναι πως ακόμα και η κατανάλωση του προπιονικού οξέος να συνέβαινε αρχικά, ένα μέρος του προπιονικού οξέος χρησιμοποιείται για να παράγει εκτός των HV και ΗΒ μονομερή όπως είδαμε και στο σχήμα 8.2. Όπως και στα προηγούμενα πειράματα έτσι και εδώ η αύξηση της βιομάζας οφείλεται πλήρως στην παραγωγή των PHAs και δεν υπάρχει παραγωγή κάποιου άλλου ενδοκυτταρικού προϊόντος όπως είχαμε δει στο 7 ο κεφάλαιο. Τέλος, στο σχήμα 8.4β βλέπουμε την πορεία του ph συναρτήσει του χρόνου, η τιμή του οποίου αυξάνεται από 7.25 σε ph = 7.50 Στο σχήμα 8.5 παρατηρούμε την πορεία των κυρίων παραμέτρων που χαρακτηρίζουν την παραγωγή PHAs σε συνθήκες αρχικού ph = 7.50 συναρτήσει του χρόνου. Κατά την διάρκεια των πειραμάτων παρατηρήθηκαν, κατά διαστήματα, αποκλίσεις στις τιμές μεταξύ των δύο πειραμάτων που πραγματοποιούνταν παράλληλα στις ίδιες ακριβώς συνθήκες και με την ίδια αρχική συγκέντρωση σε βιομάζα. Η συμπεριφορά της καλλιέργειας κάτω από την 211

246 συγκεκριμένη αρχική τιμή του ph θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ασταθής. Όπως έχει παρατηρηθεί μέχρι στιγμής, έτσι και εδώ, το βουτυρικό οξύ είναι αυτό που καταναλώνεται πρώτο μέσα σε 26 ώρες. Στην συνέχεια προτιμάται το προπιονικό ενώ μετά την εξάντληση του προπιονικού οξέος, την 94 η ώρα, καταναλώνεται το οξικό οξύ. Ο ρυθμός κατανάλωσης του βουτυρικού οξέος το χρονικό διάστημα 0-26 ώρες ισούται με 41 mg/h (74 mg COD/h) ενώ οι αντίστοιχοι ρυθμοί για το οξικό και προπιονικό οξύ ανέρχονται σε 4 mg/h (4 mg COD/h) και 15 mg/h (23 mg COD/h). Από την 26 η έως την 94 η ώρα οι ρυθμοί οξικού και προπιονικού οξέος ισούνται με 5 mg/h (5.4 mg COD/h) και 9 mg/h (14 mg COD/h). Από την 94 η ώρα έως το τέλος παραμένει μόνο το οξικό οξύ το οποίο απομακρύνεται με ρυθμό 13 mg/h (14 mg COD/h). Ως αποτέλεσμα ο ρυθμός παραγωγής των PHAs τα χρονικά διαστήματα 0-26, και ανέρχεται σε 30 mg/h (51 mg COD/h, HB; 26 mg/h ή 44 mg COD/h, HV: 4 mg/h ή 7 mg COD/h), σε 2.3 g/h (4.2 mg COD/h, HB: 1.5 mg/h ή 2.5 mg COD/h, HV: 0.9 mg/h ή 1.7 mg COD/h) και σε 7.7 mg/h (13 mg COD/h, HB: 6.7 mg/h ή 11.1 mg COD/h, HV: 1 mg/h ή 1.9 mg COD/h) αντίστοιχα. Το ποσοστό συσσώρευσης μετά την κατανάλωση του βουτυρικού οξέος (26 η ώρα) ανέρχεται περίπου στο 60 % g PHAs/ g VSS (30 % g PHAs/ g TSS) το οποίο είναι και το μέγιστο παρατηρούμενο ποσοστό σε όλη την χρονική διάρκεια του πειράματος. Έπειτα το ποσοστό συσσώρευσης μειώνεται με αργό ρυθμό μέχρι το 52 % g PHAs/ g VSS (29 % g PHAs/ g TSS). Είναι φανερό πως σε αυτή την τιμή του ph η παραγωγή των PHAs παρεμποδίζεται καθώς, πρώτον, δεν επιτυγχάνεται η μέγιστη περιεκτικότητα σε PHAs και, δεύτερον, παρατηρείται κάποια αυξομείωση στην συγκέντρωση των PHAs παρουσία εξωκυτταρικής πηγής άνθρακα. Πιθανότατα οι παρατηρούμενες διακυμάνσεις στη συσσώρευση των PHAs να οφείλονται σε ταυτόχρονη ενδοκυτταρική συσσώρευση και αποδόμηση των PHAs. Η σύσταση των PHAs κατά την διάρκεια του πειράματος κυμαίνεται κυρίως από % HV μονάδων με εξαίρεση το χρονικό σημείο κοντά στις 70 ώρες όπου το κλάσμα των μονάδων HV αυξάνεται στο 25 %. Η αύξηση της βιομάζας οφείλεται και εδώ αποκλειστικά στην παραγωγή PHAs, ενώ η τιμή του ph κατά την διάρκεια του πειράματος αυξάνεται από 7.50 σε

247 Σύσταση PHAs (% mol) Ποσοστό συσσώρευσης PHAs g/l ph [log H + ] g/l οξικό οξύ προπιονικό οξύ βουτυρικό οξύ άθροισμα πτητικών λιπαρών οξέων Xρόνος (h) 10.0 VSSdiff. PHB (α) (β) (γ) TSS PHV VSS PHAs % HB % HV (δ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) % PHAs (g PHAs/ g TSS) (ε) Σχήμα 8.5. ph Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης πτητικών λιπαρών οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 213

248 Συμπεράσματα Στον πίνακα 8.2 συνοψίζονται οι κύριες κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι που χαρακτηρίζουν την παραγωγή των PHAs στις διάφορες αρχικές τιμές ph, ενώ στο σχήμα 8.6 παρουσιάζονται συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα για κάθε διαφορετική τιμή ph. Όπως φαίνεται και από τα συγκεντρωτικά αποτελέσματα όταν η αρχική τιμή του ph είναι ίση με 6.90 επιτυγχάνεται το μεγαλύτερο ποσοστό συσσώρευσης, ο υψηλότερος συντελεστής απόδοσης Y P/S, ο υψηλότερος ειδικός ρυθμός παραγωγής PHAs, q P, και ο υψηλότερος ειδικός ρυθμός κατανάλωσης υποστρώματος, -q S. Επίσης, σε αυτή την τιμή παρατηρούμε ότι παράγεται συμπολυμερές PHBV, 81 % HB-19 % HV, με το υψηλότερο μοριακό βάρος. Ο συντελεστής πολυδιασποράς των συμπολυμερών που προκύπτουν κυμαίνεται από Ο συντελεστής αυτός χρησιμοποιείται ως μέτρο της ανομοιογένειας μεταξύ των μεγεθών των μακρομορίων (Mn και Μw) και εξαρτάται από την μέθοδο παρασκευής του πολυμερούς. Βιολογικής προέλευσης πολυμερή όπως οι πρωτεΐνες χαρακτηρίζονται ως μονοδιάσπαρτα, δηλαδή ομοιογενή πολυμερή, διότι ο συντελεστής πολυδιασποράς τους ισούται με την μονάδα (Ντόντος, 2002). Έτσι και στην περίπτωση μας μπορούμε να πούμε πως τα παραγόμενα ΡΗΑ πολυμερή τείνουν να χαρακτηριστούν μονοδιάσπαρτα. Σε όλα τα πειράματα φαίνεται ξεκάθαρα η προτίμηση της εμπλουτισμένης καλλιέργειας να καταναλώνει αρχικά το βουτυρικό οξύ για να παράγει ΡΗΒ ενώ στην συνέχεια καταναλώνονται το οξικό και το προπιονικό οξύ προς παραγωγή τόσο ΗΒ όσο και HV μονάδων. Στην τιμή 6.40 παρατηρείται το μέγιστο κλάσμα μονάδων HV στο παραγόμενο συμπολυμερές PHBV ενώ με αύξηση του ph φαίνεται η τάση μείωσης του κλάσματος HV μονάδων. Η παρατήρηση αυτή έρχεται σε ασυμφωνία με την εργασία των Villano κ.ά. (Villano et al., 2010), οι οποίοι συμπέραναν πως η αύξηση της τιμής του ph, το οποίο ήταν ελεγχόμενο, αύξανε και το κλάσμα των μονάδων HV όταν ως υπόστρωμα χρησιμοποιούνταν μίγμα οξικού και προπιονικού οξέος. Συγκεκριμένα, το ph επηρέαζε τον σχετικό λόγο ρυθμού κατανάλωσης προπιονικού προς οξικό οξύ από 0.32 g COD/ g COD σε ph =7.5 σε 0.80 g COD/ g COD σε ph =8.5. Όταν στις καλλιέργειες παρέχονται μίγματα οξικού και προπιονικού οξέος σε ph =7.5 η καταβολική δραστηριότητα αναφέρεται να επιτυγχάνεται κυρίως μέσω της κατανάλωσης του 214

249 οξικού οξέος και ο χαρακτηριστικός λόγος P/O υπερισχύει έναντι αυτού του προπιονικού οξέος (Dionisi et al., 2004; Dias et al., 2008). Πίνακας 8.2. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs σε διαφορετικές τιμές ph. Παράμετροι ph Χρονική διάρκεια (h) Αρχική συγκέντρωση υποστρώματος S ± ± ± ± 0.6 (Cmmol/l) Αρχική συγκέντρωση βιομάζας Xi (Cmmol/l) 44.9 ± ± ± ± 1.2 -q S, max (Cmmol S/ Cmmol X h) -q S, average (Cmmol S/ Cmmol X h) q P,max (Cmmol PHAs/ Cmmol X h) q P,average (Cmmol PHAs/ Cmmol X h) Y P/S (Cmmol PHAs/Cmmol S) fphas (Cmmol PHAs/ Cmmol X) fphb (Cmmol PHB/ Cmmol X) 0.73 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.01 fphv (Cmmol PHV/ Cmmol X) 0.27 ± ± ± ± 0.01 % PHAs (g PHAs/ g VSS) 64.7 ± ± ± ± 5.8 % mol HB-% mol HV Mn ( 10 5 Da) Mw ( 10 5 Da) P.I. (Mw/Mn)

250 YP/S (Cmmol/Cmmol) fphas (Cmmol HAs/ Cmmol X) Σύσταση PHAs (% mol) Συγκέντρωση οξέων (Cmmol/l) Συγκέντρωση PHAs (Cmmol/l) % PHAs (g PHAs/ g VSS) (α) (β) ph= 6.40 (γ) ph= 6.40 ph= 6.90 ph= 7.25 ph= ph= 6.90 ph= 7.25 ph= ph= 6.40 ph= 6.90 ph= 7.25 ph= (δ) ph [log H + ] (ε) ph [log H + ] Σχήμα 8.6. Συγκεντρωτικά διαγράμματα (α) συγκέντρωσης του συνόλου των πτητικών λιπαρών οξέων, (β) συγκέντρωσης των συνολικά παραγόμενων πολυυδροξυαλκανεστέρων, (γ) ποσοστού συσσώρευσης PHAs, (δ) συντελεστή απόδοσης Y P/S, (ε) περιεχόμενου κλάσματος PHAs (fphas), μονάδων ΗΒ (fphb) και HV (fphv) στο κύτταρο και (στ) σύστασης PHAs (% mol) για κάθε διαφορετική τιμή ph. fphas fphb fphv (στ) ph [log H + ] % HB % HV 216

251 Η συμπεριφορά αυτή μπορεί να εξηγηθεί αν λάβουμε υπόψη την ενέργεια που απαιτείται για την σύνθεση νέας βιομάζας από το ακετυλο-coa και το προπιονυλο-coa, 1.70 mol και 1.38 mol αντίστοιχα (Gommers et al., 1988; Zeng et al., 2003). Υπό αυτές τις συνθήκες το ακετυλο-coa χρησιμοποιείται περισσότερο για την παραγωγή ενέργειας και βιομάζας παρά για την παραγωγή ΡΗΒ και φαίνεται να ευνοείται η σύνθεση των πρόδρομων ενώσεων για την παραγωγή PHAs από τη συμπύκνωση μορίων ακετυλο-coa και προπιονυλο-coa. Στην περίπτωση μας δεν παρατηρείται κάτι τέτοιο διότι κατά πρώτον γίνεται χρήση μίγματος οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος. Όπως έχουμε παρατηρήσει το βουτυρικό οξύ παίζει κυρίαρχο ρόλο καθώς καταναλώνεται πρώτο οδηγώντας σε υψηλά ποσοστά συσσώρευσης PHAs έως 50 % αφήνοντας μικρότερα περιθώρια χωρητικότητας στο κύτταρο (μέγιστο ποσοστό συσσώρευσης περίπου 67 %). Επιπρόσθετα το βουτυρικό οξύ είναι η πρόδρομη ένωση για τον σχηματισμό PHB, οπότε το μεγαλύτερο κλάσμα του κυττάρου εμπεριέχει μονάδες ΗΒ. Σε ph = 6.40 παρατηρούμε πως η παραγωγή των PHAs χαρακτηρίζεται από μια γραμμικότητα χωρίς κανένα σημάδι κορεσμού όπως έχει παρατηρηθεί στις υπόλοιπες τιμές ph διότι η κατανάλωση του βουτυρικού οξέος διαρκεί 40 ώρες έναντι 16, 16 και 26 ωρών στις τιμές ph 6.90, 7,25 και 7.50 αντίστοιχα. Όταν η συγκέντρωση του βουτυρικού οξέος μειώνεται σημαντικά περί την 35 η ώρα το οξικό και προπιονικό οξύ αρχίζουν να καταναλώνονται ταυτόχρονα αυξάνοντας το κλάσμα των ΗV μονάδων από 20 % σε 35 %. Στα υπόλοιπα πειράματα έπειτα από την κατανάλωση του βουτυρικού οξέος αρχίζουν να φαίνονται τα πρώτα σημάδια κορεσμού και έτσι η κατανάλωση του προπιονικού ή οξικού οξέος δεν οδηγούν σε μεγαλύτερα κλάσματα HV ή HB μονάδων αντίστοιχα καθώς μεγαλύτερο μέρος του υποστρώματος χρησιμοποιείται ως ενέργεια και ένα μικρότερο προς παραγωγή πολυμερών. Επιπλέον θα μπορούσαμε να θεωρήσουμε πως το κύτταρο αντλεί ενέργεια από την ενδοκυτταρική αποθήκη άνθρακα στην μορφή των PHAs και πραγματοποιεί ταυτόχρονα της διεργασίες ενδοκυτταρικής αποδόμησης και συσσώρευσης των PHAs προκαλώντας έτσι μια μικρή μεταβολή του κλάσματος των μονάδων HV και ΗΒ (Ren et al., 2009). Το ομοπολυμερές ΡΗΒ χαρακτηρίζεται ως ψαθυρό υλικό και είναι δύσκολο να επεξεργαστεί διότι αποσυντίθεται απότομα 10 o C πάνω από το σημείο τήξης (177 o C). Η παρουσία HV μονάδων στο πολυμερές οδηγεί σε βελτίωση την φυσικοχημικών και μηχανικών 217

252 ιδιοτήτων του παραγόμενου πολυμερούς. Συγκεκριμένα στα συμπολυμερή PHBV η αύξηση της σύστασης σε μονάδες HV έχει ως αποτέλεσμα την μείωση των θερμοκρασιών τήξης και υαλώδους μετάβασης, έτσι το πολυμερές μπορεί να επεξεργαστεί θερμικά χωρίς να υποβαθμιστεί, μείωση της κρυσταλλικότητας και αύξηση της ελαστικότητας και της ανθεκτικότητας. Κάποιες από τις ιδιότητες που εμφανίζουν τα συμπολυμερή PHBV προσομοιάζουν τις ιδιότητες του πολυπροπυλένιου και του πολυαιθυλένιου (Sudesh & Abe, 2010). Σύμφωνα με τους Serafim κ.ά. (Serafim et al., 2004), όταν μελετήθηκε η παραγωγή PHB από οξικό οξύ σε τιμές ελεγχόμενου ph 7.0 κι 8.3 τα ποσοστά συσσώρευσης που επιτεύχθηκαν ήταν 27.5 % και 39.8 % αντίστοιχα τα οποία όμως ήταν μικρότερα σε σχέση με το ποσοστό συσσώρευσης 47.5 % που παρατηρήθηκε όταν το ph δεν ήταν ελεγχόμενο με αρχική τιμή 7.0. Ο συντελεστής απόδοσης Y P/S ήταν μεγαλύτερος όταν το ph δεν ήταν ελεγχόμενο, 0.72 Cmmol PHB/ Cmmol HAc, σε σχέση με όταν ήταν ελεγχόμενο στην τιμή 7.0 (0.40 Cmmol PHB/ Cmmol HAc) και 8.3 (0.64 Cmmol PHB/ Cmmol HAc). Επίσης παρατήρησαν πως όταν το ph ήταν ελεγχόμενο στην τιμή 7.0 το 44 % του υποστρώματος χρησιμοποιούταν ως ενέργεια για το κύτταρο ενώ το υπόλοιπο 56 % για κυτταρική ανάπτυξη και συσσώρευση πολυμερών. Από την άλλη μεριά, όταν το ph δεν ήταν ελεγχόμενο και είχε αρχική τιμή 7.0 μόλις 12 % του υποστρώματος χρησιμοποιούταν για ενεργειακούς σκοπούς και το υπόλοιπο 88 % για κυτταρική ανάπτυξη και παραγωγή πολυμερών. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται συνήθως η παραγωγή PHAs τόσο από μικτές όσο και από καθαρές καλλιέργειες σε εύρος τιμών ph Οι Chua κ.ά. (Chua et al., 2003) μελέτησαν την επίδραση του ph στην παραγωγή PHAs από δραστική λάσπη και παρατήρησαν υψηλότερα ποσοστά παραγωγής PHB από οξικό οξύ όταν το ph ήταν ελεγχόμενο στην τιμή 8.0 ή 9.0, 25 % και 32 % αντίστοιχα. Όταν το ph ήταν ελεγχόμενο στην τιμή 6 ή 7 τα ποσοστά συσσώρευσης ήταν μικρότερα από 5 %. Συμπερασματικά μπορούμε να πούμε πως σύμφωνα με τα πειράματα μας φαίνεται πως στην τιμή ph = 6.90 επιτυγχάνονται τα βέλτιστα αποτελέσματα τα οποία έρχονται σε συμφωνία και με την εργασία των Serafim κ.ά. όταν η τιμή του ph δεν είναι ελεγχόμενη. 218

253 Επίδραση της πηγής άνθρακα Όπως έχει αναφερθεί, το κύριο πλεονέκτημα της χρήσης των μικτών έναντι των καθαρών καλλιεργειών για την παραγωγή PHAs είναι η σημαντική μείωση του λειτουργικού κόστους εφόσον αποφεύγονται οι άσηπτες συνθήκες λειτουργίας του αντιδραστήρα και απαιτείται λιγότερος έλεγχος της διεργασίας. Το κόστος της παραγωγής των PHAs μπορεί να μειωθεί ακόμα περισσότερο εάν χρησιμοποιηθούν ως υποστρώματα απόβλητα πλούσια σε οργανικό φορτίο. Τα υπολείμματα τα οποία είναι πλούσια σε υδατάνθρακες δεν προτιμούνται για την παραγωγή PHAs καθώς οι μικτές καλλιέργειες προτιμούν να τα μετατρέπουν σε γλυκογόνο αντί PHAs (Carta et al., 2001; Dirks et al., 2001). Παρόλα αυτά το υδατανθρακικό φορτίο μέσω αναερόβιας χώνευσης μπορεί να μετατραπεί σε πτητικά λιπαρά οξέα, πρόδρομες ενώσεις για την παραγωγή των PHAs. Ανάλογα με την σύσταση και τον τύπο των πτητικών λιπαρών οξέων που παρέχονται στην μικτή καλλιέργεια ως υποστρώματα άνθρακα για την παραγωγή των PHAs ποικίλει και η σύσταση των παραγόμενων πολυμερών (Reis et al., 2003; Lemos et al., 2006). Η σύσταση των PHAs προσδιορίζει με τη σειρά της την βιομηχανική τους εφαρμογή καθώς οι φυσικοχημικές και μηχανικές τους ιδιότητες ποικίλουν. Το υπόστρωμα άνθρακα που έχει μελετηθεί περισσότερο από όλα για την παραγωγή PHAs είναι το οξικό οξύ, το οποίο οδηγεί στην παραγωγή ομοπολυμερούς PHB (Beun et al., 2000; Dionisi et al., 2001; Serafim et al., 2004; Johnson et al., 2009). Όμως το ΡΗΒ είναι ένα ψαθυρό υλικό με υψηλό βαθμό κρυσταλλικότητας. Η ενσωμάτωση διαφορετικών μονομερικών ομάδων όμως έχει ως αποτέλεσμα την δημιουργία συμπολυμερών με βελτιωμένες ιδιότητες. Για τον λόγο αυτό ερευνούνται διαφορετικά πτητικά λιπαρά οξέα τα οποία προάγουν την σύνθεση διαφορετικών μονομερικών ομάδων. Βάσει του ενδιαφέροντος που υπάρχει για την χρήση των πτητικών λιπαρών οξέων ως υποστρώματα άνθρακα, τα οποία προκύπτουν από την αναερόβια χώνευση αποβλήτων πλούσιων σε υδατάνθρακες, μελετήθηκε η επίδραση του τύπου λιπαρού οξέος στην απόδοση και τη σύσταση των PHAs. Τα πτητικά λιπαρά οξέα που χρησιμοποιήθηκαν είναι το οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ καθώς και όλοι οι πιθανοί συνδυασμοί τους με συγκέντρωση 1 g/l από το καθένα. Επίσης χρησιμοποιήθηκε και γλυκόζη ως εναλλακτική πηγή άνθρακα για να 219

254 πιστοποιηθεί το κατά πόσο η εμπλουτισμένη καλλιέργεια που αναπτύξαμε είναι ικανή να παράγει PHAs έναντι του γλυκογόνου, το οποίο προβλέπεται να παράγεται από υδατανθρακικά υποστρώματα σύμφωνα με την βιβλιογραφία. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στην βέλτιστη αρχική τιμή ph= Η γνώση της επίδρασης του τύπου και της σύστασης των πτητικών λιπαρών οξέων που παρέχονται ως πηγές άνθρακα είναι εξαιρετικής σημασίας καθώς μπορεί να γίνει πρόβλεψη της σύστασης των PHAs συναρτήσει της σύστασης των VFAs. Με τον τρόπο αυτό είναι ικανός ο σχεδιασμός της διεργασίας προς παραγωγή πολυμερών τα οποία να εμφανίζουν επιθυμητές ιδιότητες Οξικό οξύ Αναφέρθηκε και προηγουμένως πως το οξικό οξύ είναι το συνηθέστερο υπόστρωμα που χρησιμοποιείται για παραγωγή ΡΗΒ. Στο σχήμα 8.7 φαίνεται η πορεία παραγωγής PHAs κάνοντας χρήση οξικού οξέος από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια. Παρατηρούμε πως η κατανάλωση 1 g/l (33 Cmmol/l) οξικού οξέος από 0.7 g/l βιομάζα διαρκεί 10 ώρες, ενώ οδηγεί σε παραγωγή ΡΗΒ ομοπολυμερούς. Το ποσοστό συσσώρευσης σε αυτή την περίπτωση ανέρχεται στο 43 ± 0.5 % g PHAs/ g VSS (ή αλλιώς 22 ± 0.2 % g PHAs/ g TSS). Ο συντελεστής απόδοσης Y P/S ισούται με 0.72 Cmmol HΒ/ Cmmol HAc. Στην εργασία των Serafim κ.ά. (Serafim et al., 2004; Lemos et al., 2006) ο συντελεστή απόδοσης Y P/S ισούται με 0.58 Cmmol HΒ/ Cmmol HAc όταν η κατανάλωση 1 g/l οξικού οξέος πραγματοποιείται παρουσία αζώτου 1.4 Nmmol και αυξάνεται σε 0.72 Cmmol HΒ/ Cmmol HAc όταν η πηγή αζώτου μειώνεται σε 0.7 Νmmol ενώ παίρνει την μέγιστη τιμή 0.83 Cmmol HΒ/ Cmmol HAc όταν δεν υπάρχει παρουσία αζώτου. Γενικά οι μέγιστοι συντελεστές συσσώρευσης ΡΗΒ από οξικό οξύ που αναφέρονται βιβλιογραφικά κυμαίνονται μεταξύ Cmmol PHB/ Cmmol HAc (Krisha & van Loosdrecht, 1999; Beun et al., 2000; Carta et al., 2001; Dionisi et al., 2001; Beun et al., 2002; Johnson et al., 2009). 220

255 Σύσταση PHAs (% mol) Ποσοστό συσσώρευσης PHAs g/l ph [log H + ] g/l TSS VSS VSSdiff. PHB PHV PHAs (α) (β) (γ) % HB % HV (δ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) % PHAs (g PHAs/ g TSS) (ε) Σχήμα 8.7. Οξικό οξύ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξικού οξέος, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 221

256 Προπιονικό οξύ Η χρήση του προπιονικού οξέος ως υπόστρωμα για την παραγωγή πολυμερών μπορεί να οδηγήσει στον σχηματισμό μονάδων ΗΒ και HV. Από το προπιονικό οξύ προκύπτει το προπιονυλο-coa. Από την στιγμή που δεν υπάρχει κάποιο άλλο υπόστρωμα, από το οποίο να προκύπτει το ακετυλο-coa το προπιονικό οξύ μπορεί να παράγει ακετυλο-coa μέσω αποκαρβοξυλίωσης. Από την συμπύκνωση του ακετυλο-coa και του προπιονυλο-coa προκύπτει το υδροξυβαλερυλο-coa που είναι η πρόδρομη ένωση για τον σχηματισμό PHV. Συνεπώς η σύνθεση του ακετυλο-coa είναι υποχρεωτική για την παραγωγή μονάδων HV και επιπλέον μέσω της συμπύκνωσης δύο μορίων ακετυλο-coa παράγεται το υδροξυβουτυρυλο- CoA το οποίο οδηγεί στην παραγωγή μονάδων ΗΒ. Στο σχήμα 8.8 μπορούμε να παρατηρήσουμε τις πειραματικές τιμές που περιγράφουν την παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας προπιονικό οξύ. Η κατανάλωση 1 g/l (41 Cmmol/l) προπιονικού οξέος διαρκεί περίπου 25 ώρες όταν η αρχική συγκέντρωση βιομάζας είναι 0.7 g/l. Αν παρατηρήσουμε προσεκτικά το σχήμα 8.8δ θα δούμε για τις πρώτες 10 ώρες υπάρχει η τάση να παράγονται HV μονάδες ενώ στην συνέχεια, και μέχρι το τέλος του πειράματος, φαίνεται να παράγονται και ΗΒ μονομερικές ομάδες οδηγώντας τελικά στον σχηματισμό συμπολυμερούς PHBV σύστασης 34 % ΗΒ-66 % HV. Στο συγκεκριμένο πείραμα δεν παρατηρήθηκε παραγωγή ΗΜV μονάδων όπως αναφέρεται από τους Lemos κ.ά. (Lemos et al., 2006). Το ποσοστό συσσώρευσης ανέρχεται στο 48 % g PHAs/ g VSS (ή αλλιώς σε 25 % g PHAs/ g TSS) ενώ ο συντελεστής απόδοσης Y P/S ισούται με 0.73 Cmmol PHAs/ Cmmol HPr. Το ποσοστό συσσώρευσης που παρατηρείται στην περίπτωση του προπιονικού οξέος είναι μεγαλύτερο σε σχέση με εκείνο που επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας οξικό οξύ διότι το προπιονικό οξύ χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερη συγκέντρωση Cmmol/l. Οι συντελεστές απόδοσης Y P/S που αναφέρονται στην βιβλιογραφία κάνοντας χρήση προπιονικού οξέος κυμαίνονται από Cmmol PHV/ Cmmol S (Dionisi et al., 2004; Lemos et al., 2006). Στην περίπτωση μας ο αντίστοιχος συντελεστής Y PHV/S ισούται με 0.43 Cmmol PHV/ Cmmol HPr. Επίσης στην εργασία τους οι Dionisi κ.ά. ανέφεραν την παραγωγή ομοπολυμερούς PHV κάτι το οποίο δεν συνέβη ούτε στην περίπτωση μας αλλά ούτε και στους Serafim κ.ά. προφανώς λόγω της διαφορετικής μικροβιακής σύστασης της καλλιέργειας. 222

257 Σύσταση PHAs (% mol) Ποσοστό συσσώρευσης PHAs g/l ph [log H + ] g/l TSS VSS VSSdiff. PHB PHV PHAs (α) (β) (γ) % HB % HV (δ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) % PHAs (g PHAs/ g TSS) (ε) Σχήμα 8.8. Προπιονικό οξύ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξικού οξέος, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 223

258 Βουτυρικό οξύ Πέραν του οξικού και του προπιονικού οξέος το βουτυρικό οξύ είναι επίσης ένα κύριο προϊόν της ζύμωσης των υδατανθράκων. Από το βουτυρικό οξύ προκύπτει το βουτυρυλο-coa το οποίο με την σειρά του μετατρέπεται σε υδροξυβουτυρυλο-coa που αποτελεί την πρόδρομη ένωση για τον σχηματισμό ΡΗΒ ενώ παρουσία πηγής αζώτου το υδροξυβουτυρυλο- CoA προάγει τον σχηματισμό δύο μορίων ακετυλο-coa που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για κυτταρική ανάπτυξη και συντήρηση. Στο σχήμα 8.9 παρατηρούμε την πορεία των χαρακτηριστικών παραμέτρων παραγωγής PHAs από βουτυρικό οξύ. Από το σχήμα 8.9α φαίνεται πως η κατανάλωση 1 g/l (46 Cmmol/l) από περίπου 0.8 g/l βιομάζα διαρκεί 12 ώρες. Επίσης παρατηρούμε πως από την 8 η ώρα και μέχρι το τέλος υπάρχει μικρή παραγωγή οξικού και ισοβουτυρικού οξέος με τελικές συγκεντρώσεις 36 και 12 mg/l αντίστοιχα. Οι συγκεντρώσεις αυτές είναι αρκετά μικρές αλλά δεν οφείλονται σε κάποιο αναλυτικό σφάλμα διότι εμφανίζονται και στις δύο επαναλήψεις του ίδιου πειράματος. Όπως αναμενόταν η χρήση του βουτυρικού οξέος οδηγεί στην παραγωγή ομοπολυμερούς PHB ενώ το ποσοστό συσσώρευσης είναι αρκετά υψηλό και φτάνει το 63 % g PHAs/ g VSS (ή αλλιώς 39 g PHAs/ g TSS). Ο συντελεστής απόδοσης Y P/S είναι και αυτός πολύ υψηλός και ισούται με 0.89 Cmmol PHB/ Cmmol HBu και είναι με διαφορά ο υψηλότερος σε σχέση με την βιβλιογραφία. Οι Lemos κ.ά. (Lemos et al., 2006) αναφέρουν Y P/S ίσο με 0.45 Cmmol PHB/ Cmmol S. Επίσης στην εργασία των Lemos κ.ά. (Lemos et al., 1998) έχει αναφερθεί υψηλός συντελεστης, 0.97 Cmmol HA/ Cmmol S, στην περίπτωση που χρησιμοποιείται οξικό οξύ για την παραγωγή PHB από μικτή καλλιέργεια πλούσια σε μικροοργανισμούς PAOs. Συγκρίνοντας τους συντελεστές απόδοσης που προέκυψαν από την χρήση οξικού (0.72), προπιονικού (0.73) και βουτυρικού (0.89) οξέος φαίνεται πως η εμπλουτισμένη καλλιέργεια που αναπτύξαμε, παρόλο που δεν είναι εγκλιματισμένη στην χρήση βουτυρικού οξέος, προτιμά το βουτυρικό οξύ το οποίο θεωρείται το ιδανικότερο υπόστρωμα καθώς δίνει τα καλύτερα αποτελέσματα για την παραγωγή PHAs. 224

259 Σύσταση PHAs (% mol) Ποσοστό συσσώρευσης PHAs g/l ph [log H + ] g/l βουτυρικό οξύ οξικό οξύ ισοβουτυρικό οξύ άθροισμα TSS VSSdiff. PHV (α) (β) (γ) VSS PHB PHAs % HB % HV (δ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) % PHAs (g PHAs/ g TSS) (ε) Σχήμα 8.9. Βουτυρικό οξύ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξικού οξέος, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 225

260 Μίγμα οξικού και προπιονικού οξέος Σύμφωνα με όσα έχουν αναφερθεί και παρατηρηθεί μέχρι στιγμής αναμένεται η χρήση του μίγματος οξικού και προπιονικού οξέος να οδηγεί, αν όχι στον σχηματισμό ομοπολυμερούς PHV, στον σχηματισμό συμπολυμερούς PHBV με υψηλή σύσταση σε HV μονάδες. Στο σχήμα 8.10 παρατηρούμε την σχέση μεταξύ της κατανάλωσης του μίγματος οξικού και προπιονικού οξέος και της παραγωγής PHAs. Η κατανάλωση 1 g/l (33 Cmmol/l) οξικού και 1 g/l (41 Cmmol/l) προπιονικού οξέος είναι σχεδόν ταυτόχρονη και πραγματοποιείται μέσα σε 26 ώρες από περίπου 0.7 g/l βιομάζα. Όπως αναμενόταν, ενώ στην αρχή είναι κυρίαρχη η παραγωγή μονάδων HV στην συνέχεια υπάρχει και παραγωγή ΗΒ μονάδων με αποτέλεσμα ως τελικό προϊόν να προκύπτει το συμπολυμερές PHBV σύστασης 33% ΗΒ-67 % ΗV. Το ποσοστό παραγωγής PHAs στην περίπτωση αυτή ανέρχεται στο 63 % g PHAs/ g VSS (ή αλλιώς 38 % g PHAs/ g TSS) και ο συντελεστής απόδοσης Y P/S ισούται με 0.85 Cmmol PHAs/ Cmmol S. Το ακετυλο-coa παράγεται απευθείας από το οξικό οξύ και μπορεί να συμπυκνωθεί είτε με ένα ακόμα μόριο ακετυλο-coa προς τον σχηματισμό ΗΒ ομάδων, είτε με το προπιονυλο- CoA που παράγεται από το προπιονικό οξύ και οδηγεί στον σχηματισμό HV ομάδων. Η σύσταση του τελικού προϊόντος δεν διαφέρει σε σχέση με την σύσταση του συμπολυμερούς που προκύπτει όταν γίνεται χρήση προπιονικού οξέος. Αν λάβουμε υπόψη μας τους συντελεστές απόδοσης Y PHB/S = 0.27 Cmmol PHB/ Cmmol S και Y PHV/S = 0.58 Cmmol PHV/ Cmmol YPHB / S S ( 0.47) και τους συγκρίνουμε με τους αντίστοιχους συντελεστές στην περίπτωση που YPHV / S γίνεται χρήση προπιονικού οξέος, Y PHB/S = 0.24 Cmmol PHB/ Cmmol S και Y PHV/S = 0.50 Cmmol YPHB / S PHV/ Cmmol S ( 0.48), παρατηρούμε ότι η τάση παραγωγής HB και HV μονάδων YPHV / S παραμένει η ίδια και δεν επηρεάζεται από την παρουσία του οξικού οξέος. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία οι συντελεστές απόδοσης Y P/S χρησιμοποιώντας μίγμα οξικού και προπιονικού οξέος κυμαίνονται μεταξύ Cmmol HA/ Cmmol S (Dionisi et al., 2004; Lemos et al., 2006) οι οποίοι είναι μικρότεροι διότι λόγω της παρουσίας πηγής αζώτου ένα μέρος του υποστρώματος χρησιμοποιείται και για κυτταρική ανάπτυξη. 226

261 Σύσταση PHAs (% mol) Ποσοστό συσσώρευσης PHAs g/l ph [logh + ] g/l 2.0 οξικό οξύ προπιονικό οξύ άθροισμα 8.2 (α) (β) PHV PHAs (γ) TSS VSS VSSdiff. PHB % HB % HV (δ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) % PHAs (g PHAs/ g TSS) (ε) Σχήμα Οξικό και προπιονικο οξύ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 227

262 Μίγμα οξικού και βουτυρικού οξέος Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως η χρήση του οξικού και βουτυρικού οξέος ξεχωριστά οδηγούν στον σχηματισμό ομοπολυμερών PHB. Επίσης, σύμφωνα με τα αποτελέσματα φαίνεται ότι η κατανάλωση του βουτυρικού οξέος προτιμάται από την μικτή εμπλουτισμένη καλλιέργεια και χαρακτηρίζεται από τον υψηλότερο συντελεστή απόδοσης Y P/S =0.89 Cmmol PHB/ Cmmol HBu. Από την άλλη μεριά το οξικό οξύ χαρακτηρίζεται από τον μικρότερο συντελεστή απόδοσης Υ P/S =0.72 Cmmol PHB/ Cmmol HAc σε σχέση με το προπιονικό και βουτυρικό οξύ. Στο σχήμα 8.11 παρατηρούμε την πορεία κατανάλωσης του οξικού και βουτυρικού οξέος καθώς και τις παραμέτρους που αφορούν την παραγωγή PHAs από το συγκεκριμένο μίγμα. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε 1 g/l (33 Cmmol/l) οξικό οξύ και 1 g/l (46 Cmmol/l) βουτυρικό οξύ. Η κατανάλωση του μίγματος των οξέων διαρκεί 28 ώρες όταν η αρχική συγκέντρωση βιομάζας ανέρχεται στο 0.7 g/l. Για ακόμη μία φορά φαίνεται η προτίμηση της μικτής καλλιέργειας να καταναλώνει αρχικά το βουτυρικό οξύ και ύστερα το οξικό οξύ. Επίσης, όπως παρατηρήθηκε και στην περίπτωση που ως μοναδική πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε το βουτυρικό οξύ, φαίνεται να υπάρχει παραγωγή ισοβουτυρικού οξέος σε συγκέντρωση 32 mg/l (έναντι 12 mg/l στην περίπτωση του βουτυρικού οξέος). Με την χρήση μίγματος οξικού και βουτυρικού οξέος επιτυγχάνεται η παραγωγή ομοπολυμερούς ΡΗΒ ενώ το ποσοστό συσσώρευσης ανέρχεται στο 63 % g PHAs/ g VSS (ή αλλιώς 38 % g PHAs/ g TSS). Το ποσοστό αυτό φτάνει στο μέγιστο την 21 η ώρα και παραμένει σε αυτή την τιμή περίπου επιδεικνύοντας φαινόμενο παρεμπόδισης παραγωγής PHAs λόγω έλλειψης χωρητικότητας της βιομάζας. Ο συντελεστής απόδοσης ισούται με 0.71 Cmmol PHB/ Cmmol S αλλά θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ψευδής καθώς ένα μέρος του άνθρακα δεν συμβάλει στην παραγωγή PHAs αλλά στην συντήρηση των κυττάρων. Αν θεωρήσουμε ως βέλτιστο χρονικό σημείο την 21 η ώρα, όπου μεγιστοποιείται το ποσοστό συσσώρευσης PHAs ο συντελεστής απόδοσης Y P/S στο συγκεκριμένο χρονικό σημείο ισούται με 0.91 Cmmol ΗΒ/ Cmmol S με κατανάλωση περίπου 0.67 g/l (22.3 Cmmol/l) οξικού και 0.91 g/l (41.4 Cmmol/l) βουτυρικού οξέος. 228

263 Σύσταση PHAs (% mol) Ποσοστό συσσώρευσης PHAs g/l ph [log H + ] g/l οξικό οξύ ισοβουτυρικό οξύ βουτυρικό οξύ άθροισμα 8.2 (α) (β) PHV PHAs (γ) TSS VSS VSSdiff. PHB % HB % HV (δ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) % PHAs (g PHAs/ g TSS) (ε) Σχήμα Οξικό και βουτυρικό οξύ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 229

264 Μίγμα προπιονικού και βουτυρικού οξέος Σύμφωνα με τα αποτελέσματα το προπιονικό οξύ οδηγεί στην παραγωγή συμπολυμερών PHBV σύστασης 34 % HB- 66 % HV ενώ το βουτυρικό οξύ σε ομοπολυμερές PHB. Επίσης η χρήση του μίγματος οξικού και προπιονικού οξέος παράγει συμπολυμερούς PHBV περίπου ίδιας σύστασης με το προπιονικό οξύ, 33 % ΗΒ-67 % HV. Όπως είχαμε αναφέρει και προηγουμένως η παραγωγή των HV μονάδων επιτυγχάνεται με την συμπύκνωση ενός μορίου ακετυλο-coa και ενός μορίου προπιονυλο-coa. Από το προπιονικό οξύ προκύπτει το προπιονυλο-coa ενώ από το βουτυρικό οξύ προκύπτει το βουτυρυλο-coa το οποίο μετατρέπεται σε υδροξυβουτυρυλο-coa και μπορεί να διασπαστεί σε δύο μόρια ακετυλο-coa. Στο σχήμα 8.12 παρατηρείται η κατανάλωση του μίγματος προπιονικού και βουτυρικού οξέος καθώς και η πορεία παραγωγής των PHAs. Η αρχική συγκέντρωση βιομάζας και σε αυτό το πείραμα ισούται με 0.7 g/l. Και σε αυτή την περίπτωση το βουτυρικό οξύ προτιμάται και καταναλώνεται μέσα σε 25 περίπου ώρες ενώ το προπιονικό οξύ εξαντλείται στις 70 ώρες. Σημαντική είναι η παρατήρηση πως από την 10 η ώρα και μέχρι την 30 η ώρα υπάρχει παραγωγή οξικού οξέος με μέγιστη συγκέντρωση g/l η οποία παραμένει σταθερή μέχρι εξαντλήσεως του προπιονικού οξέος. Η πιθανότερη εξήγηση για το φαινόμενο αυτό είναι πως από την στιγμή που η χωρητικότητα της βιομάζας σε PHAs φτάνει το μέγιστο στις 10 ώρες ξεκινά η διαδικασία ταυτόχρονης παραγωγής αλλά και αποδόμησης των ήδη αποθηκευμένων PHAs με την μορφή του οξικού οξέος. Το ποσοστό συσσώρευσης στο συγκεκριμένο πείραμα αγγίζει το 66 % g PHAs/ g VSS (ή αλλιώς 39 % g PHAs/ g TSS). Η χρήση του μίγματος προπιονικού και βουτυρικού οξέος οδηγεί στην παραγωγή συμπολυμερούς PHBV με τελική σύσταση 80 % ΗΒ-20 % HV ενώ ο συντελεστής απόδοσης Y P/S ισούται με 0.90 Cmmol PHAs/ Cmmol S. Όπως και στην περίπτωση χρήσης μίγματος οξικού και βουτυρικού οξέος έτσι και εδώ η παρουσία του βουτυρικού οξέος συμβάλλει θετικά στην διεργασία παραγωγής PHAs καθώς συνεπάγεται την αύξηση του συντελεστή απόδοσης Y P/S. 230

265 Σύσταση PHAs (% mol) Ποσοστό συσσώρευσης PHAs g/l ph [log H + ] g/l οξικό οξύ προπιονικό οξύ βουτυρικό οξύ άθροισμα VSSdiff. (α) (β) 4.5 (γ) TSS PHV VSS PHB PHAs % HB % HV (δ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) % PHAs (g PHAs/ g TSS) (ε) Σχήμα Προπιονικό και βουτυρικό οξύ - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης οξέων, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύυδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 231

266 Μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος Στην ενότητα παρουσιάστηκαν τα αποτελέσματα που αφορούν στην παραγωγή PHAs από μίγμα 1 g/l (33 Cmmol/l) οξικού, 1 g/l (41 Cmmol/l) προπιονικού και 1 g/l (46 Cmmol/l) βουτυρικού οξέος σε διαφορετικές τιμές αρχικού ph. Εφόσον επιλέχθηκε η τιμή αρχικού ph= 6.90 (βλ. παράγραφο ) τα πειράματα που αφορούν την επίδραση της πηγής άνθρακα στην παραγωγή των PHAs πραγματοποιήθηκαν σε συνθήκες αρχικού ph Σύμφωνα με αυτά που είχαμε παρατηρήσει το ποσοστό συσσώρευσης στην περίπτωση αυτή ανέρχεται περίπου στο 66 % g PHAs /g VSS (ή αλλιώς 41% g PHAs/ g TSS). Και στην περίπτωση αυτή καταναλώνεται αρχικά το βουτυρικό οξύ ενώ ακολουθούν το προπιονικό και τέλος το οξικό οξύ (διάγραμμα 8.2). Αυτό το προφίλ κατανάλωσης των οργανικών υποστρωμάτων οδηγεί τελικά στην παραγωγή συμπολυμερούς PHBV σύστασης 81 % ΗΒ-19 % HV ενώ ο συντελεστής απόδοσης Y P/S ισούται με 0.81 Cmmol PHAs/ Cmmol S Γλυκόζη Παρόλο που αν κάποιος ανατρέξει στην βιβλιογραφία θα βρει αρκετές εργασίες που κάνουν αναφορά στην χρήση υδατανθράκων, και συνήθως γλυκόζης, από καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών τα υποστρώματα αυτά αποφεύγονται στην περίπτωση των μικτών καλλιεργειών διότι θεωρείται πως προάγουν τον σχηματισμό γλυκογόνου έναντι των PHAs. Σκοπός του συγκεκριμένου πειράματος είναι να διαπιστώσουμε κατά πόσο η μικτή καλλιέργεια που αναπτύξαμε είναι ικανή να παράγει PHAs από γλυκόζη. Από το σχήμα 8.13 παρατηρούμε πως κάνοντας χρήση περίπου 1.5 g/l (50 Cmmol/l) γλυκόζης επιτυγχάνεται η παραγωγή ομοπολυμερούς ΡΗΒ. Η κατανάλωση της γλυκόζης διαρκεί περίπου 30 ώρες όταν η αρχική συγκέντρωση βιομάζας ισούται με 0.9 g/l. Κατά την πορεία του πειράματος δεν παρατηρήθηκε παραγωγή γλυκογόνου καθώς η αύξηση του βάρους της βιομάζας αντιστοιχεί στο βάρος των παραγόμενων PHAs. 232

267 Σύσταση PHAs (% mol) Ποσοστό συσσώρευσης PHAs g/l ph [log H + ] g/l (α) (β) PHV PHAs (γ) TSS VSS VSSdiff. PHB % HB % HV (δ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) % PHAs (g PHAs/ g TSS) (ε) Σχήμα Γλυκόζη - Πειραματικές τιμές συναρτήσει του χρόνου: (α) συγκέντρωσης γλυκόζης, (β) ph, (γ) συγκέντρωσης ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, παραγόμενων πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS diff. = VSS i -VSS αρχ. ), πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB), πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα (PHV) και συνολικών PHAs, (δ) σύσταση PHAs (%mol), (ε) ποσοστό συσσώρευσης PHAs εκφραζόμενο ανά TSS και VSS. 233

268 Το ποσοστό συσσώρευσης ανέρχεται σε 39 % g PHAs/ g VSS (ή αλλιώς 21 % g PHAs/ g TSS) το οποίο είναι και το χαμηλότερο που έχει παρατηρηθεί σε αυτή την ομάδα πειραμάτων. Επίσης ο συντελεστής απόδοσης είναι και αυτός χαμηλός και ισούται με 0.53 Cmmol PHB/ Cmmol S. Θεωρητικά, από την γλυκόζη προκύπτουν τρία μόρια ακετυλο-coa τα οποία στην συνέχεια μπορούν να συμπυκνωθούν ανά δύο και να μετατραπούν σε υδροξυβουτυρυλο-coa για να σχηματίσουν τελικά ΡΗΒ. Παρόλο που δεν υπάρχει κάποια αναφορά που να αφορά την χρήση γλυκόζης ως πηγή άνθρακα για την παραγωγή PHAs από μικτές καλλιέργειες θα συγκρίνουμε τα αποτελέσματα που επετεύχθησαν με αυτά των καθαρών καλλιεργειών. Η παροχή γλυκόζης ως μοναδική πηγή άνθρακα από τον μικροοργανισμό Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, σε μη περιοριστικές συνθήκες αζώτου, οδηγεί στην παραγωγή συμπολυμερούς P(HO-HD-HDd) και ποσοστό συσσώρευσης 10.8 % g PHAs/ g ξηρής κυτταρικής μάζας (Rojas-Rosas et al., 2007). Επίσης μεγάλα ποσοστά συσσώρευσης έχουν επιτευχθεί από τον μικροοργανισμό Alcaligenes eutrophus τα οποία αγγίζουν το 80 % όταν γίνεται χρήση γλυκόζης σε περιοριστικές συνθήκες αζώτου και φωσφόρου (Doi et al., 1992; Kim et al., 1994) Συμπεράσματα Στον πίνακα 8.3 συνοψίζονται οι κύριες κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι που χαρακτηρίζουν την παραγωγή των PHAs χρησιμοποιώντας διαφορετικές πηγές άνθρακα. Στα σχήματα 8.14 και 8.15 παρουσιάζονται συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα για κάθε διαφορετικό συνδυασμό των πτητικών λιπαρών οξέων καθώς και για την γλυκόζη. Παρατηρούμε πως οι μέγιστοι συντελεστές απόδοσης που έχουν επιτευχθεί είναι 0.89 και 0.90 Cmmol PHAs/ Cmmol S και αφορά την χρήση του βουτυρικού οξέος και μίγματος προπιονικού και βουτυρικού οξέος αντίστοιχα. Λόγω της συνάφειας της δομής του βουτυρικού οξέος με την δομή του ΡΗΒ εκτός του υψηλού συντελεστή απόδοσης Y P/S η παρουσία του βουτυρικού οξέος οδηγεί και σε μεγαλύτερα ποσοστά συσσώρευσης PHAs. Όπως έχουμε επανειλημμένως διαπιστώσει μέχρι στιγμής η μικτή καλλιέργεια προτιμά την κατανάλωση του βουτυρικού οξέος έναντι των υπολοίπων οξέων παρά το γεγονός πως για τον εμπλουτισμό της 234

269 μικτής καλλιέργειας που αναπτύξαμε σε ΡΗΑ-συσσωρευτές χρησιμοποιήθηκε μίγμα οξικού και προπιονικού οξέος. Τα ποσοστά συσσώρευσης PHAs είναι αρκετά υψηλά σε όλες τις περιπτώσεις. Όταν ως μοναδική πηγή άνθρακα χρησιμοποιείται το οξικό, το προπιονικό, το βουτυρικό οξύ, η γλυκόζη και το μίγμα οξικού και προπιονικού οξέος δεν παρατηρήθηκε κορεσμός της χωρητικότητας της βιομάζας σε PHAs. Στις περιπτώσεις όπου γίνεται χρήση μίγματος οξικού και βουτυρικού, προπιονικού και βουτυρικού και οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος παρατηρείται το φαινόμενο του κορεσμού. Παρόλο που η βιομάζα αγγίζει το μέγιστο ποσοστό παραγωγή PHAs φαίνεται πως η σύσταση των αποθηκευμένων ΗΒ και HV μονάδων διαφοροποιείται με την πάροδο του χρόνου κάτι που υποδεικνύει την ταυτόχρονη παραγωγή και αποδόμηση των ήδη αποθηκευμένων PHAs είτε για λόγους συντήρησης είτε για λόγους εξυπνότερης διαχείρισης των ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών πηγών άνθρακα. Οι Doi κ.ά., Uchino κ.ά. και Ren κ.ά. (Doi et al., 1990; Uchino et al., 2007; Ren et al., 2009) μελέτησαν την ενεργότητα των τριών καταλυτικών πρωτεϊνών ΡΗΑ-πολυμεράση, ΡΗΑαποπολυμεράση και ακυλο-coa συνθετάση, οι οποίες είναι συνδεδεμένες πάνω στα PHA συσσωματώματα (PHA granules) στα στελέχη Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha και Pseudomonas putida GPo1 αντίστοιχα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα τους κατέληξαν στο γεγονός πως ακόμα και κατά την διάρκεια της συσσώρευσης των ΡΗΑs το ένζυμο ΡΗΑαποπολυμεράση είναι ενεργό αποδεικνύοντας πως η σύνθεση και η αποδόμηση των PHAs είναι μια ταυτόχρονη διαδικασία. Συγκεκριμένα, φαίνεται πως η ενεργότητα του ενζύμου ΡΗΑπολυμεράση εξαρτάται από τον λόγο [R-3-υδροξυακυλο-CoA]/[CoA], στον οποίο το ελεύθερο συνένζυμο Α (CoA) αποτελεί ήπιο παράγοντα παρεμπόδισης, ενώ η οξείδωση των λιπαρών οξέων ρυθμίζεται από τους λόγους [ακετυλο-coa]/[coa] και [NADH]/[NAD]. Οι υψηλοί λόγοι οδηγούν στην συσσώρευση PHAs και οι χαμηλοί λόγοι έχουν ως αποτέλεσμα την γρήγορη οξείδωση του R-3-υδροξυακυλο-CoA. Η ισορροπία λοιπόν ανάμεσα στην σύνθεση των PHAs και την οξείδωση των λιπαρών οξέων ελέγχεται κυρίως από τους λόγους [ακετυλο-coa]/[coa] και [NADH]/[NAD] στα βακτηριακά κύτταρα. 235

270 Πίνακας 8.3. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs χρησιμοποιώντας διάφορα υποστρώματα άνθρακα. Παράμετροι Οξικό οξύ Προπιονικό οξύ Βουτυρικό οξύ Οξικό και προπιονικό οξύ Πηγή άνθρακα Οξικό και βουτυρικό οξύ Προπιονικό και βουτυρικό οξύ Οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ Γλυκόζη Χρονική διάρκεια (h) Αρχική συγκέντρωση υποστρώματος S 32.8 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.2 (Cmmol/l) Αρχική συγκέντρωση βιομάζας Xi (Cmmol/l) 27.4 ± ± ± ± ± ± ± ± 1.7 -q S, max (Cmmol S/ Cmmol X h) -q S, average (Cmmol S/ Cmmol X h) q P,max (Cmmol PHAs/ Cmmol X h) q P,average (Cmmol PHAs/ Cmmol X h) Y P/S (Cmmol PHAs/Cmmol S) 0.72 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.01 fphas (Cmmol PHAs/ Cmmol X) 0.49 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.01 fphb (Cmmol PHB/ Cmmol X) 0.49 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.01 fphv (Cmmol PHV/ Cmmol X) 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.00 % PHAs (g PHAs/ g VSS) 43.1 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.1 % mol HB-% mol HV

271 Ποσοστό συσσώρευσης PHAs (g PHAs/ g VSS) Συγκέντρωση οξέων (Cmmol/l) Συγκέντρωση PHAs (Cmmol/l) (α) οξικό προπιονικό βουτυρικό γλυκόζη οξικό και προπιονικό οξικό και βουτυρικό προπιονικό και βουτυρικό οξικό, προπιονικό και βουτυρικό (β) οξικό προπιονικό βουτυρικό γλυκόζη οξικό και προπιονικό οξικό και βουτυρικό προπιονικό και βουτυρικό οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξικό προπιονικό βουτυρικό γλυκόζη οξικό και προπιονικό οξικό και βουτυρικό προπιονικό και βουτυρικό οξικό, προπιονικό και βουτυρικό Σχήμα Συγκεντρωτικά διαγράμματα (α) συγκέντρωσης υποστρώματος, (β) συγκέντρωσης συνολικά παραγόμενων PHAs και (γ) ποσοστού συσσώρευσης PHAs για κάθε πηγή άνθρακα συναρτήσει του χρόνου. (γ)

272 (α) (β) Y P/S (Cmmol HAs/ Cmmol S) fphas fphb fphv (Cmmol HAs/ Cmmol X) 100 (γ) % PHAs (g PHAs/ g VSS) Σχήμα (α) Συντελεστές απόδοσης Y P/S, (β) τα κλάσματα των συνολικών PHAs (fphas), του ΡΗΒ (fphb) και του PHV (fphv) στο σύνολο της βιομάζας και (γ) το ποσοστό συσσώρευσης PHAs συναρτήσει της πηγής άνθρακα. 238