ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΜΙΚΡΗΣ ΚΑΙ ΜΕΣΑΙΑΣ ΑΝΘΡΑΚΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙΔΑΣ ΠΟΛΥ(-ΥΔΡΟΞΥ ΑΛΚΑΝΟΪΚΏΝ) ΕΣΤΈΡΩΝ ΑΠΟ ΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ALCALIGENES LATUS ΚΑΙ PSEUDOMONAS PUTIDA

Transcript

1 ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΜΙΚΡΗΣ ΚΑΙ ΜΕΣΑΙΑΣ ΑΝΘΡΑΚΙΚΗΣ ΑΛΥΣΙΔΑΣ ΠΟΛΥ(-ΥΔΡΟΞΥ ΑΛΚΑΝΟΪΚΏΝ) ΕΣΤΈΡΩΝ ΑΠΟ ΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ALCALIGENES LATUS ΚΑΙ PSEUDOMONAS PUTIDA Ε. Κρέτζα 1,2, Γ. Πενλόγλου 1,2, Χ. Χατζηδούκας 1, Κ. Κυπαρισσίδης 1,2 1. Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 2. Ινστιτούτο Τεχνικής Χημικών Διεργασιών, Εθνικό Κέντρο Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στόχος της παρούσας εργασίας είναι να μελετηθεί ποιοτικά και ποσοτικά η επίδραση συγκεκριμένων παραμέτρων της διεργασίας βακτηριακής ζύμωσης στην παραγωγή mcl- και scl-phas, με χρήση των βακτηρίων Pseudomonas putida και Alcaligenes latus, αντίστοιχα. Τα δυο βακτηριακά στελέχη που μελετήθηκαν, σε συνθήκες ελεγχόμενης συγκέντρωσης των διατροφικών συστατικών (άνθρακα, αζώτου, φωσφόρου, μαγνησίου) παρήγαγαν 26 και 3 g/l ξηρή μάζα κυττάρων με ποσοστιαίο περιεχόμενο πολυμερούς 44 και 68 % κ.β. για τα βακτήρια P. putida και A. Latus, αντίστοιχα. Οι μοριακές ιδιότητες του πολυμερούς που παράγεται από τα δύο βακτηριακά στελέχη εμφάνισαν διαφορετική εξάρτηση από τα θρεπτικά συστατικά που παρέχονται στους μικροοργανισμούς, χωρίς ωστόσο να παρατηρηθεί κάποια επίδραση στις θερμικές ιδιότητες του πολυμερούς και για τις δυο διεργασίες. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ενόψει των αναρίθμητων εφαρμογών των πολυμερικών υλικών και λαμβάνοντας υπόψη ότι τα συνθετικά πολυμερή αποτελούν ένα σημαντικό ποσοστό των στερεών αποβλήτων, έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον εκδηλώνεται τα τελευταία χρόνια για τα βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή από ανανεώσιμες πρώτες ύλες [1,2]. Μια από τις κατηγορίες βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών είναι οι πολυ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs). Οι πολυ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες είναι φυσικοί γραμμικοί πολυεστερέρες των ύδροξυ αλκανοϊκών οξέων, οι οποίοι συντίθενται ενδοκυτταρικά από ένα μεγάλο αριθμό βακτηρίων σε συνθήκες ασταθούς ανάπτυξής τους και έλλειψης επιλεγμένων διατροφικών συστατικών. Πρόκειται για βιοαποικοδομήσιμα και βιοσυμβατά πολυμερή, που παράγονται από ανανεώσιμες πρώτες ύλες ή παραπροϊόντα βιομηχανικών/αγροτικών διεργασιών και ανταγωνίζονται τα συνθετικά πολυμερή σε πολλές εφαρμογές τους καθώς παρουσιάζουν ανάλογες μηχανικές ιδιότητες [1-4]. Τα ΡΗΑs, ανάλογα με τον αριθμό των ατόμων άνθρακα που διαθέτουν οι δομικές τους μονάδες, διακρίνονται κυρίως σε δύο κατηγορίες: τους πολυεστέρες μικρού μήκους (scl- PHAs) και μεσαίου μήκους (mcl-phas) ανθρακικής αλυσίδας μονομερών, που τους προσδίδουν διακριτές μοριακές ιδιότητες διευρύνοντας σημαντικά το πεδίο εφαρμογών του συνόλου των PHAs [5]. Τα scl-phas, τα οποία είναι γενικά σκληρά και εύθραυστα, βρίσκουν εφαρμογή στην παραγωγή συνθετικού χαρτού και ινών, αλλά και στην ιατρική ως εμφυτεύματα και για την ανάπλαση ιστών, όπως είναι αυτοί των οστών, όπου απαιτείται υψηλή μηχανική αντοχή[1-3]. Από την άλλη, τα mcl-phas, τα οποία είναι πιο ελαστικά, 1 of 12

2 καθώς είναι λιγότερο κρυσταλλικά, μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε συσκευασίες τροφίμων, μεμβράνες αλλά και ως φορείς μεταφοράς φαρμάκων και στην ανάπλαση άλλων ιστών (π.χ., καρδιοαγγειακών) [3,4]. Από το σύνολο των μικροοργανισμών, τα βακτήρια είναι οι πιο συνήθεις παραγωγοί των PHAs, ενώ στα πλαίσια της μελέτης αυτής τα βακτήρια Alcaligenes latus και Pseudomonas putida έχουν επιλεγεί ως αντιπροσωπευτικά βακτήρια για την παραγωγή scl- και mcl-phas, αντίστοιχα. Το βακτήριο Alcaligenes latus έχει την ικανότητα να παράγει ενδοκυτταρικά το πολύ(ύδροξυ βουτικρικό) εστέρα (ΡΗΒ), ενώ το βακτήριο Pseudomonas putida, ανάλογα με την πηγή άνθρακα που του παρέχεται παράγει και το αντίστοιχο ΡΗΑ, π.χ. με πηγή άνθρακα οκτανοϊκό οξύ παράγεται μίγμα πολύ(ύδροξυ οκτανοϊκού) εστέρα (ΡΗΟ) 9% κ.β. και πολύ(ύδροξυ εξανοϊκού) εστέρα (ΡΗΗ) 1% κ.β. [6-8]. Στην παρούσα εργασία, μελετάται η παραγωγή μικρής και μεσαίας ανθρακικής αλυσίδας PHAs από τα προαναφερθέντα βακτήρια. Σκοπός της μελέτης αυτής είναι ο προσδιορισμός και η αξιολόγηση σημαντικών λειτουργικών παραμέτρων (π.χ., διατροφικά συστατικά, ρυθμός τροφοδοσίας συστατικών, κ.ά.) ως προς την παραγωγικότητα και απόδοση της βακτηριακής καλλιέργειας και ως προς τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος. Τέλος, γίνεται σύγκριση της καλλιέργειας των δύο επιλεγμένων βακτηριακών στελεχών αναφορικά με τα παραπάνω κριτήρια. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Τα βακτηριακά στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα Pseudomonas putida (KT2442) και Alcaligenes latus (DSM1123) που τελευταία έχει μετονομαστεί σε Azohydromonas lata (DSM1123). Πρόκειται για δυο τυπικά μεσόφιλα βακτήρια που αναπτύσσονται στους 3 ο C και παράγουν μεσαίου και μικρού μήκους αλυσίδας PHAs, αντίστοιχα. Οι καλλιέργειες των δυο βακτηρίων μελετώνται σε κωνικές φιάλες (2L) ή σε γυάλινο βιοαντιδραστήρα (3L) με αρχικό όγκο μέσου ανάπτυξης 5ml και 1ml, αντίστοιχα και πηγή άνθρακα το οκτανοϊκό οξύ και τη σακχαρόζη για τα βακτήρια P. putida και A. latus, αντίστοιχα. Η θερμοκρασία κατά την διάρκεια της καλλιέργειας διατηρείται σταθερή (3 ο C). Στην περίπτωση του βιοαντιδραστήρα, η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου στο μέσο ανάπτυξης κατά την καλλιέργεια των βακτηρίων P. putida και A. latus ρυθμίζεται στο 25 και 2% της συγκέντρωσης κορεσμού αντίστοιχα, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Η ρύθμιση του διαλυμένου οξυγόνου γίνεται αυτόματα χρησιμοποιώντας την παροχή αέρα στην είσοδο του αντιδραστήρα και τη συχνότητα περιστροφής του αναδευτήρα ως μεταβλητές χειρισμού. Το μέσο ανάπτυξης (Β) που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη του βακτηρίου P. putida και την παραγωγή mcl-phas περιέχει [7]: 2.5 g/l (NH 4 ) 2 SO 4, 2.3 g/l KH 2 PO 4, 9 g/l Na 2 HPO 4.12H 2 O,.8 g/l MgSO 4.7H 2 O και 1 ml διάλυμα ιχνοστοιχείων, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Η μόνη πηγή άνθρακα που χρησιμοποιήθηκε είναι το οκτανοϊκό οξύ με αρχική συγκέντρωση 25 mm. Το διάλυμα ιχνοστοιχείων περιέχει σε ένα λίτρο διαλύματος 1N HCl: 1 g FeSO 4.7H 2 O, 3 g CaCl 2.2H 2 O, 2.2 g ZnSO 4.H 2 O,.5 g MnSO 4.4H 2 O,.3 g H 3 BO 3,.2 g CoCl 2.6H 2 O,.15 g Na 2 MoO 4.2H 2 O,.2 g NiCl 2.6H 2 O, και 1. g CuSO 4.5H 2 O. Το μέσο ανάπτυξης (AL) που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη του βακτηρίου A. latus και την παραγωγή PHB [9] περιέχει: 2 g/l σουκρόζη, 2 g/l (NH 4 ) 2 SO 4, 1.5 g/l KH 2 HPO 4, 9 g/l Na 2 HPO 4 12H 2 O, 1 g/l MgSO 4 7H 2 O,.1 g/l CaCl 2 2H 2 O,..1 g/l κιτρικό οξύ και 3ml διάλυμα ιχνοστοιχείων, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Το διάλυμα ιχνοστοιχείων περιέχει σε ένα λίτρο διαλύματος 1N HCl: 2 g FeSO 4.7H 2 O,.3 g H 3 BO 3,.2 g CoCl 2.6H 2 O,.3 g ZnSO 4.H 2 O,.3 g MnCl 2.4H 2 O,.3 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24.4H 2 O,.3 g NiSO 4.7H 2 O και.1 g CuSO 4.5H 2 O. Το μέσο τροφοδοσίας (AL * ) περιέχει: 6 g/l σακχαρόζης, g/l (NH 4 ) 2 SO 4, 2 of 12

3 26.66 g/l MgSO 4 7H 2 O, 2.66 g/l κιτρικό οξύ και ml διάλυμα ιχνοστοιχείων. Η ανάπτυξη των καλλιεργειών παρακολουθείται δυναμικά με τακτικές δειγματοληψίες και μέτρηση της οπτικής πυκνότητας της κυτταρικής καλλιέργειας στα 6 nm και της συγκέντρωσης επιλεγμένων θρεπτικών συστατικών (αμμωνιακά και φωσφορικά άλατα). Η μέτρηση της συγκέντρωσης της βιομάζας γίνεται με ζύγιση της ξηρής βιομάζας που λαμβάνεται από δείγματα καλλιέργειας όγκου 1ml αφού προηγουμένως υποστούν φυγοκέντριση και λυοφιλοποίηση. Η συγκέντρωση του ενδοκυττάρια παραγόμενου πολυμερούς προσδιορίζεται με συνδυασμό αέριας χρωματογραφίας (GC) και φασματοσκοπίας υπερύθρου (FTIR) [1]. Για τον ποιοτικό χαρακτηρισμό του προϊόντος, γίνεται ανάκτησή του με συνδυασμό μηχανικής διάρρηξης των κυττάρων με υπέρηχους, εκχύλισης του πολυμερούς με χλωροφόρμιο και σταδιακής καταβύθισης με κρύα μεθανόλη. Στην συνέχεια, πραγματοποιείται χαρακτηρισμός των ιδιοτήτων του πολυμερούς. Προσδιορίζονται οι μοριακές ιδιότητες (μέσο κατά αριθμό (M n ) και κατά βάρος (M w ) μοριακό βάρος, κατανομή μοριακών βαρών (MWD) και δείκτης πολυδιασποράς (PDI)) και οι θερμικές ιδιότητες (σημείο τήξης, σημείο κρυστάλλωσης και ποσοστιαίος βαθμός κρυσταλλικότητας) με χρωματογραφία διείσδυσης πηκτής (GPC) και διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC), αντίστοιχα. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Οι ρυθμοί ανάπτυξης της μικροβιακής καλλιέργειας και ενδοκυττάριας συσσώρευσης του πολυμερούς μελετήθηκαν αρχικά σε κωνικές φιάλες με σκοπό την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών για τις μέγιστες αποδόσεις παραγωγής ΡΗΑ. Στη συνέχεια, τα αποτελέσματα από τις μελέτες σε κωνικές φιάλες χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα σε βιοαντιδραστήρα, όπου είναι εφικτός ο καλύτερος έλεγχος των συνθηκών λειτουργίας, προκειμένου να γίνει κλιμάκωση των διεργασιών. Παραγωγή mcl-phas από το βακτήριο Pseudomonas putida Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε κωνικές φιάλες για την παραγωγή mcl-ρηα από το βακτήριο Pseudomonas putida για την μελέτη της επίδρασης των πηγών άνθρακα (οκτανοϊκό οξύ) και αζώτου ((NH 4 ) 2 SO 4 ) διαπιστώθηκε ότι ενώ η αρχική του συγκέντρωση της πηγής του αζώτου δεν επηρεάζει την παραγωγή του πολυμερούς, το ίδιο δεν ισχύει για το επίπεδο συγκέντρωσης της πηγής άνθρακα. Παρατηρήθηκε ότι συγκέντρωση του οκτανοϊκού οξέος στο μέσο ανάπτυξης της καλλιέργειας μεγαλύτερη ή ίση των 3 mm, σε οποιοδήποτε στάδιο ανάπτυξης της καλλιέργειας, είναι τοξική για το βακτήριο, και δρα παρεμποδιστικά στην περαιτέρω ανάπτυξη της καλλιέργειας και κατ επέκταση στη συσσώρευση του πολυμερούς. Επιπλέον, η έλλειψη της πηγής αζώτου κατά την διάρκεια της καλλιέργειας είναι επίσης αποτρεπτική της περαιτέρω ανάπτυξής της και της παραγωγής του PHA. Επομένως, για την ανάπτυξη υψηλής πυκνότητας καλλιέργειας και την ταυτόχρονη συσσώρευση πολυμερούς πρέπει κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας να πραγματοποιούνται προσθήκες οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου για τη διατήρηση της συγκέντρωσής τους εντός στενού εύρους τιμών. Για την κατανόηση της σχέσης μεταξύ του ρυθμού τροφοδοσίας και του ρυθμού κατανάλωσης των πηγών άνθρακα και αζώτου σε διάφορα στάδια ανάπτυξης της καλλιέργειας, πραγματοποιήθηκαν πειράματα αρχικά σε κωνικές φιάλες, όπου σε διάφορες χρονικές στιγμές, προστέθηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου. Από τις καλλιέργειες που διεξήχθησαν σε κωνικές φιάλες διαπιστώθηκε ότι για την επίτευξη της μέγιστης ανάπτυξης του βακτηρίου P. putida και της μέγιστης δυνατής 3 of 12

4 παραγωγής του ΡΗΑ ο ρυθμός τροφοδοσίας των πηγών άνθρακα και αζώτου, πρέπει να πραγματοποιείται ανάλογα με τους ρυθμούς κατανάλωσής τους. Ακόμα διαπιστώθηκε ότι έντονες διακυμάνσεις της συγκέντρωσης του οκτανοϊκού οξέος πάνω από τα 5 mm, προκαλεί μια προσωρινή παύση της ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Επίσης, μεγάλη μεταβολή της συγκέντρωσης του θειικού αζώτου στο μέσο ανάπτυξης της καλλιέργειας, αλλάζει το μονοπάτι μεταβολισμού του άνθρακα μέσα στο βακτήριο ευνοώντας την παραγωγή βιομάζας εις βάρος του πολυμερούς, και οδηγεί στη μείωση του συσσωρευμένου πολυμερούς στο εσωτερικό των κυττάρων. Συνεπώς, η προσθήκη των πηγών άνθρακα και αζώτου πρέπει να γίνεται ελεγχόμενα βάσει των υπαρχόντων συγκεντρώσεων οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου στο μέσο ανάπτυξης της καλλιέργειας, ώστε να εξισορροπείται ο αντίστοιχος ρυθμός κατανάλωσής τους και να παραμένουν σταθερές σε ένα στενό εύρος τιμών. Πρέπει να σημειωθεί ότι σε όλες της περιπτώσεις, με και χωρίς την προσθήκη των διατροφικών συστατικών, τα τελικά κατά βάρος και κατ αριθμό μοριακά βάρη του ΡΗΑ ήταν της τάξης των ~15, g/mol και ~1, g/mol, αντίστοιχα, με δείκτη πολυδιασποράς, PDI=~1.5. Με βάση τα πειραματικά αποτελέσματα σε κωνικές φιάλες, πραγματοποιήθηκε μεταφορά της διεργασίας σε γυάλινο βιοαντιδραστήρα 3 L. Το ph του αντιδραστήρα ελέγχεται στην τιμή 7 με δύο ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 3M και HCl 3% κ.ό. Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας υπήρχε συνεχής τροφοδοσία οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου. Ο ρυθμός τροφοδοσίας των πηγών άνθρακα και αζώτου αναπροσαρμόζονταν με τέτοιο τρόπο ώστε οι συγκεντρώσεις του οκτανοϊκού οξέος και του θειικού αμμωνίου στο μέσο ανάπτυξης να μη ξεπεράσουν τα 5 mm και το 1 g/l, αντίστοιχα. Η τροφοδοσία των δύο θρεπτικών συστατικών άρχισε ταυτόχρονα, όταν η αρχική ποσότητα του οκτανοϊκού οξέος είχε σχεδόν καταναλωθεί (O.D. ~8) προς αποφυγή συσσώρευσης της πηγής άνθρακα και παρεμπόδισης της ανάπτυξης της καλλιέργειας. Εφαρμόζοντας αυτό το ρυθμό τροφοδοσίας των πηγών άνθρακα και αζώτου και χωρίς να δημιουργηθεί έλλειψη κάποιου θρεπτικού συστατικού (άνθρακα, αζώτου και φωσφόρου) καθόλη τη διάρκεια της καλλιέργειας, η συγκέντρωση της τελικής βιομάζας αυξήθηκε στα 2 g/l (από 7 g/l που καταμετρήθηκε σε επίπεδο κωνικής φιάλης) ενώ το ποσοστό του συσσωρευμένου ΡΗΑ έφτασε το 5% κ.β. ξηρής βιομάζας, μετά από 27 ώρες καλλιέργειας. Το τελικό μέσο κατ αριθμό (M n ) και κατά βάρος (M w ) μοριακό βάρος του παραγόμενου πολυμερούς ήταν 84,9 και 131,2 g/mol, αντίστοιχα, με δείκτη πολυδιασποράς, PDI=1.54. Βιβλιογράφικα είναι γνωστό ότι, πολλά είδη βακτηρίων όταν καλλιεργούνται σε μέσο ανάπτυξης με συγκέντρωση της πηγής άνθρακα σε περίσσεια και με ταυτόχρονη έλλειψη κάποιου διατροφικού συστατικού (οξυγόνου, αζώτου, θείου, φωσφόρου ή μαγνησίου), ευνοείται η παραγωγή του ΡΗΑ [11-13]. Με στόχο την αύξηση της απόδοσης της καλλιέργειας σε ΡΗΑ με ανάλογη αύξηση της ενδοκυττάριας συσσώρευσής του, μελετήθηκε η συμπεριφορά του βακτηρίου σε συνθήκες έλλειψης φωσφόρου. Τρεις καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε βιοαντιδραστήρα όπου οι συνθήκες έλλειψης φωσφόρου δημιουργήθηκαν κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας μειώνοντας την αρχική συγκέντρωση των φωσφορικών αλάτων στο μέσο ανάπτυξης από 11 g/l στην πρώτη καλλιέργεια σε 2.2 g/l στη δεύτερη και 1.1 g/l στην τρίτη. Κατά τη διάρκεια και των τριών καλλιεργειών υπήρχε συνεχόμενη τροφοδοσία οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου. Συγκρίνοντας τις τρείς καλλιέργειες παρατηρήθηκε ότι με τη μείωση της αρχικής συγκέντρωσης της πηγής φωσφόρου μειώνεται ο ρυθμός ανάπτυξης της καλλιέργειας καθώς και η τελική παραγόμενη μάζα κυττάρων. Στην πρώτη καλλιέργεια (αρχική συγκέντρωση των φωσφορικών αλάτων ίση με 11 g/l) η συγκέντρωση ξηρής βιομάζας έφτασε τα 2 g/l μέσα σε 4 of 12

5 27 ώρες. Στη δεύτερη καλλιέργεια η αντίστοιχη τελική συγκέντρωση ξηρής βιομάζας ήταν 16 g/l στο ίδιο χρονικό διάστημα, ενώ στην τρίτη καλλιέργεια (αρχική συγκέντρωση των φωσφορικών αλάτων ίση με 1.1 g/l) η τελική συγκέντρωση ξηρής βιομάζας έφτασε τα 14 g/l μετά από χρονικό διάστημα 3 ωρών (Σχήμα 1α). Όπως παρατηρείται από το Σχήμα 1β, η ενδοκυττάρια συσσώρευση του ΡΗΑ κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας δεν επηρεάστηκε από τις συνθήκες έλλειψης φώσφορου. Κατά συνέπεια, καθώς δεν μεταβλήθηκε το ποσοστό του ενδοκυττάριου ΡΗΑ, ο ρυθμός παραγωγής του πολυμερούς είναι ανάλογος του ρυθμού αύξησης της βιομάζας (Σχήμα 1 γ). (α) Ξηρή Μάζα Κυττάρων (g/l) g/l 2.2 g/l 1.1 g/l (β) % Περιεχόμενο ΡΗΑ (g/gdcw) g/l 2.2 g/l 1.1 g/l (γ) Ρυθμός Παραγωγής ΡΗΑ (g/l/h) g/l 2.2 g/l 1.1 g/l 6 (δ) Κατανάλωση Φωσφόρου (g/l) g/l 2.2 g/l 1.1 g/l Χρόνος καλλιέργειας (h) Ξηρή Μάζα Κυττάρων (g/l) Σχήμα 1: Σύγκριση των καλλιεργειών του βακτηρίου P. Putida σε βιοαντιδραστήρα ημισυνεχούς λειτουργίας, με αρχικές συγκεντρώσεις φωσφορικών αλάτων 11 g/l, 2.2 g/l και 1.1 g/l, ως προς την συγκέντρωση ξηρής μάζας των κυττάρων (α), το % κ.β. περιεχόμενο PHA (β), to ρυθμό παραγωγής του ΡΗΑ (γ), καθώς και την κατανάλωση των φωσφορικών αλάτων (δ). Από την παραπάνω μελέτη, παρατηρήθηκε ότι ο ρυθμός κατανάλωσης του φωσφόρου σχετίζεται με την αρχική συγκέντρωση των συνολικών φωσφορικών αλάτων στο μέσο ανάπτυξης της καλλιέργειας. Όπως διαπιστώνεται από το Σχήμα 1δ, για τις τρείς διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις των φωσφορικών αλάτων, κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας το βακτήριο P. putida χρειάστηκε να καταναλώσει διαφορετική ποσότητα φωσφόρου για την παραγωγή ίδιας ποσότητας βιομάζας. Για την παραγωγή 1 g/l ξηρής μάζας κυττάρων καταναλώθηκαν.9 g/l, 1.5 g/l και 2.5 g/l φωσφόρου στις τρεις καλλιέργειες με αρχική συγκέντρωση φωσφορικών αλάτων 1.1 g/l, 2.2 g/l και 11 g/l, αντίστοιχα. Με δεδομένο ότι η περιεκτικότητα των κυττάρων σε PHA ελάχιστα μπορεί να βελτιωθεί, μελετήθηκε η δυνατότητα αύξησης του παραγόμενου πολυμερούς αυξάνοντας την πυκνότητα της καλλιέργειας χωρίς όμως να γίνεται εις βάρος της συσσώρευσης του πολυμερούς. Για το 5 of 12

6 σκοπό αυτό, ταυτόχρονα με την τροφοδοσία άνθρακα και αζώτου κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, μελετήθηκε και η προσθήκη πηγής μαγνησίου (MgSO 4.7H 2 O) ως απαραίτητου θρεπτικού συστατικού του οποίου η έλλειψη προκαλεί παύση της ανάπτυξη της καλλιέργειας. Με σκοπό να ερευνηθεί ο βέλτιστος τρόπος τροφοδοσίας (παλμικός ή συνεχής) του μαγνησίου στη μικροβιακή παραγωγή του ΡΗΑ από το βακτήριο Pseudomonas putida, διεξήχθησαν πειράματα σε βιοαντιδραστήρα, όπου κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας είτε έγινε παλμική τροφοδοσία.4 g/l MgSO 4, είτε συνεχής τροφοδοσία του μαγνησίου μαζί με το οκτανοϊκό οξύ και το θειικό αμμώνιο. Στην πρώτη περίπτωση που μελετήθηκε,.4 g/l θειικού μαγνησίου προστέθηκαν όταν η αρχική ποσότητα του μαγνησίου είχε σχεδόν καταναλωθεί. Ωστόσο, η προσθήκη του μαγνησίου είχε ανασταλτική δράση στην καλλιέργεια (αποτελέσματα δεν παρουσιάζονται), καθώς, ύστερα από την προσθήκη του θειικού μαγνησίου στην εκθετικά αναπτυσσόμενη καλλιέργεια, η ανάπτυξη σταμάτησε και το ποσοστό του περιεχόμενου ΡΗΑ άρχισε να μειώνεται. Παρατηρώντας ότι μια απότομη μεταβολή της συγκέντρωσης του θειικού μαγνησίου κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας είναι ανεπιθύμητη από το βακτήριο, μελετήθηκε η επίδραση της συνεχούς τροφοδοσίας του μαγνησίου κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας. Η προσθήκη του μαγνησίου ήταν ανάλογη με το ρυθμό προσθήκης της πηγής άνθρακα (.3 g θειικού μαγνησίου / g οκτανοϊκού οξέος). Η τροφοδοσία των θρεπτικών συστατικών (οκτανοϊκού οξέος, θειικού αμμωνίου και θειικού μαγνησίου) ξεκίνησε μετά την 18 η ώρα της καλλιέργειας. Οπτική Πυκνότητα Α6nm DCW % PHA O.D. Συγκέντρωση PHA MgSO Ξηρή Μάζα Κυττάρων (DCW) (g/l) % Περιεχόμενο PHA (gpha/gdcw) Συγκέντρωση PHA (g/l) Συγκέντρωση Θειικού Μαγνησίου (g/l) Σχήμα 2: Δυναμική μεταβολή της οπτικής πυκνότητας, της συγκέντρωσης της ξηρής μάζας των κυττάρων, του % κ.β. περιεχομένου PHA, και της συγκέντρωσης του παραγόμενου ΡΗΑ και του θειικού μαγνησίου, κατά την καλλιέργεια του βακτηρίου P. putida σε βιοαντιδραστήρα (συνεχείς τροφοδοσία οκτανοϊκού οξέος, θειικού αμμωνίου και θειικού μαγνησίου). Όπως παρατηρείται στο Σχήμα 2, η συνεχής προσθήκη του μαγνησίου, δεν παρεμπόδισε την ανάπτυξη της καλλιέργειας. Αντίθετα, βοήθησε στην αύξηση της συγκέντρωσης ξηρής βιομάζας από τα 2 g/l (χωρίς προσθήκη μαγνησίου) στα 26 g/l μέσα σε 3 ώρες καλλιέργειας. Η ενδοκυττάρια συσσώρευση ΡΗΑ εξελίχθηκε καθόλη τη διάρκεια της καλλιέργειας και η μέγιστη τιμή του ποσοστού περιεκτικότητας των κυττάρων σε PHA ήταν 5% κ.β. ξηρής βιομάζας. Ωστόσο, προς το τέλος της καλλιέργειας, παρατηρείται μια μείωση του συσσωρευμένου ΡΗΑ στα κύτταρα του βακτηρίου η οποία οφείλεται στην αύξηση της 6 of 12

7 συγκέντρωσης του μαγνησίου. Η τελική συγκέντρωση και ο μέσος ρυθμός παραγωγής του ΡΗΑ ήταν 11.5 g/l και.384 g/l/h, αντίστοιχα. Το τελικό μέσο κατ αριθμό (M n ) και κατά βάρος (M w ) μοριακό βάρος του παραγόμενου πολυμερούς ήταν 83, και 145, (g/mol), αντίστοιχα, με δείκτη πολυδιασποράς, PDI=1.74. Από τα πειράματα που διεξήχθησαν για τη μελέτη της επίδρασης των θρεπτικών συστατικών του βακτηρίου P. putida στην ανάπτυξη του και την παραγωγή του ΡΗΑ, διαπιστώθηκε ότι η εξέλιξη του μοριακού βάρους του παραγόμενου πολυμερούς σχετίζεται με την υπάρχουσα συγκέντρωση του οκτανοϊκού οξέος στο μέσο ανάπτυξης. Όπως διαπιστώνεται και από το Σχήμα 3α, όταν η συγκέντρωση του οκτανοϊκού οξέος στο μέσο ανάπτυξης μειώνεται, μένει σταθερή ή αυξάνεται, το μοριακό βάρος του PHA επηρεάζεται αναλόγως. Ωστόσο, στην περίπτωση όπου μαζί με την πηγή άνθρακα η καλλιέργεια τροφοδοτείται και με μαγνήσιο, η αύξηση της συγκέντρωσης του θειικού μαγνησίου στο μέσο ανάπτυξης, αντισταθμίζει την επίδραση της αυξανόμενης συγκέντρωσης του οκτανοϊκού οξέος στο μοριακό βάρος του ΡΗΑ και τελικά το μοριακό βάρος παραμένει σταθερό (Σχήμα 3β). (α) Συγκέντρωση Οκτανοϊκού Οξέος (g/l) Οκτανοϊκό οξύ M w M n Μοριακό Βαρός 1 3 (g/mol) (β) Μοριακό Βάρος 1 3 (g/mol) Mw Mn Οκτανοϊκό Οξύ MgSO Συγκέντρωση Οκτανοϊκού Οξέος (g/l) Συγκέντρωση Θειικού Μαγνησίου (g/l) Σχήμα 3: Συσχέτιση συγκεντρώσεων οκτανοϊκού οξέος (α) και θειικού μαγνησίου (β) με την εξέλιξη του μοριακού βάρους του παραγόμενου ΡΗΑ. Οι θερμικές ιδιότητες του πολυμερούς προσδιορίζονται με Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης (DSC). Η ανάλυση των θερμικών ιδιοτήτων του παραγόμενου ΡΗΑ πραγματοποιήθηκε στη περιοχή θερμοκρασιών -75 έως 7 ο C, με ρυθμό μεταβολής της θερμοκρασίας 1 ο C/λεπτό. Το προφίλ της σάρωσης που ακολουθείται αποτελείται από δυο κύκλους θέρμανσης ψύξης. Ο ρυθμός αύξησης και ελάττωσης της θερμοκρασίας για τους δυο κύκλους θέρμανσης και ψύξης είναι ο ακόλουθος: αρχικά το δείγμα ψύχεται μέχρι τους -75 ο C και στη συνέχεια θερμαίνεται μέχρι τους 7 ο C. Αφού ψυχθεί μέχρι τους 1 ο C με ρυθμό 1 ο C/λεπτό, κατόπιν θερμαίνεται ξανά μέχρι τους 7 ο C με ρυθμό θέρμανσης 1 ο C/λεπτό. Οι θερμοκρασίες υαλώδους μετάβασης (T g ), και τήξεως (T m ) είναι -36 ο C και 62 ο C αντιστοίχως. Πρέπει να σημειωθεί ότι οι τιμές αυτές λήφθηκαν από τον πρώτο κύκλο ψύξης θέρμανσης, καθώς στο δεύτερο δεν εμφανίστηκε στο θερμογράφημα του DSC σημείο τήξης, κάτι που μας δηλώνει ότι το παραγόμενο PHA είναι άμορφο. Πρέπει να σημειωθεί ότι σε όλες τις περιπτώσεις που μελετήθηκαν, το πολυμερές εμφάνισε παρόμοιες θερμικές ιδιότητες. Παραγωγή scl-phas από το βακτήριο Alcaligenes latus Η μελέτη της παραγωγής scl-pha (ΡΗΒ) από το βακτήριο Alcaligenes latus αρχικά πραγματοποιήθηκε σε κωνική φιάλη για την εύρεση των βέλτιστων αρχικών συγκεντρώσεων των θρεπτικών συστατικών (αζώτου και φωσφόρου). Η συγκέντρωση των θρεπτικών 7 of 12

8 συστατικών των αλάτων του αζώτου και του φωσφόρου μελετήθηκε για σταθερή αρχική συγκέντρωση της πηγής άνθρακα (σακχαρόζη) και ίση με 2 g/l, έτσι ώστε να διαφοροποιείται ο αρχικός λόγος μαζών (C/N) και (C/P). Από τις καλλιέργειες που πραγματοποιήθηκαν παρατηρήθηκε ισχυρή εξάρτηση της συγκέντρωσης του πολυμερούς και του % κ.β. περιεχόμενου ΡΗΒ (g πολυμερούς/g ξηρής βιομάζας) από τον αρχικό λόγο (C/N) στο μέσο ανάπτυξης. Η βέλτιστη τιμή του λόγου μαζών (C/N) για την οποία καταμετρήθηκε η μέγιστη ανάπτυξη της καλλιέργειας και % κ.β. συσσώρευση του πολυμερούς ήταν ίση με 1 g/g. Σημαντική αλλά λιγότερο έντονη ήταν και η επίδραση του αρχικού λόγου μαζών (C/P) στην εξέλιξη της καλλιέργειας. Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις φωσφόρου στο μέσο ανάπτυξης, η βέλτιστη τιμή του λόγου μαζών (C/P) για την οποία καταμετρήθηκε η μέγιστη τιμή συγκέντρωσης και το μέγιστο ποσοστό του περιεχόμενου PHB ήταν ίση με 1.9. Αναφορικά με τις μοριακές ιδιότητες του πολυμερούς, η εξάρτηση από τους αρχικούς λόγους μαζών (C/N) και (C/P) είναι διαφορετική σε σχέση με αυτή της ανάπτυξης της καλλιέργειας και παραγωγής του πολυμερούς. Κατά την αύξηση των δύο αυτών λόγων παρουσιάστηκε μια συνεχής αύξηση των μέσων μοριακών βαρών (κατά αριθμό, M n και κατά βάρος, M w ). Προκειμένου να βελτιστοποιηθεί η καλλιέργεια του βακτηρίου Alcaligenes latus ως προς την παραγωγικότητα σε PHB μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης του διαλυμένου οξυγόνου (D.O.) στην εξέλιξη της καλλιέργειας. Για το σκοπό αυτό διεξήχθησαν μια σειρά πειραμάτων σε γυάλινο βιοαντιδραστήρα 3 L. Σε όλα τα πειράματα εφαρμόστηκαν οι ίδιες αρχικές συνθήκες και ή ίδια σύσταση του μέσου ανάπτυξης με βάση τις βέλτιστες τιμές που υπολογίσθηκαν από τη μελέτη σε κωνικές φιάλες. Η μόνη διαφοροποίηση μεταξύ των πειραμάτων στο βιοαντιδραστήρα αφορούσε το επίπεδο του διαλυμένου οξυγόνου στο μέσο ανάπτυξης, το οποίο ρυθμίστηκε στις εξής τιμές: 2, 5, 15, 2 και 3% της αντίστοιχης συγκέντρωσης κορεσμού του. Το ph της καλλιέργειας ρυθμίζονταν στην τιμή 7 με δύο ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 5M και HCl 3% κ.ό.. (α) Συγκεντρώσεις Βιομάζας (DCW ) και PHB (g/l) DCW PHB (β) Μοριακό Βάρος (1 3 g/mol) Mn Mw 2% 5% 15% 2% 3% Επίπεδο Διαλυμένου Οξυγόνου, D.O. 2% 5% 15% 2% 3% Επίπεδο Διαλυμένου Οξυγόνου, D.O. Σχήμα 4: Επίδραση του επιπέδου του διαλυμένου οξυγόνου στην συγκέντρωση της ξηρής βιομάζας, του πολυμερούς (α) και στα μέσα κατά αριθμό και κατά βάρος μοριακά βάρη του παραγόμενου ΡΗΒ (β), κατά την καλλιέργεια του A.latus σε βιοαντιδραστήρα ασυνεχούς λειτουργίας. Στο Σχήμα 4α παρουσιάζεται η επίδραση της τιμής του D.O. στις συγκεντρώσεις της 8 of 12

9 συνολικής βιομάζας και του βιοπολυμερούς. Όπως είναι φανερό, η τιμή της συγκέντρωσης του διαλυμένου οξυγόνου στην οποία μεγιστοποιείται η συγκέντρωση του συσσωρευμένου ΡΗΒ είναι 2% της αντίστοιχης συγκέντρωσης κορεσμού του στο μέσο ανάπτυξης. Η μέγιστη αυτή συγκέντρωση PHB αντιστοιχεί σε ενδοκυττάριο περιεχόμενο πολυμερούς ίσο με 56% κ.β. ξηρής βιομάζας. Για τιμές του διαλυμένου οξυγόνου μεγαλύτερες από 2% είναι φανερό πως οι συνθήκες ευνοούν περισσότερο την ταχεία παραγωγή της υπολειπόμενης βιομάζας και όχι τη συσσώρευση του βιοπολυμερούς. Αντίθετα με την παραγωγή του ΡΗΒ, τα μέσα μοριακά βάρη εμφανίζουν μονότονη μεταβολή με την αύξηση του διαλυμένου οξυγόνου (Σχήμα 4β). Σε συνθήκες μικρής αύξησης της βιομάζας (μικρές τιμές D.O.) οι τιμές των μοριακών βαρών είναι ιδιαίτερα υψηλές, M n = 1,2, και M w =2,135, g/mol, με δείκτη πολυδιασποράς, PDI=2.13. Από την άλλη πλευρά, όταν το D.O. αυξάνει τα μοριακά βάρη μειώνονται αισθητά. Στην τιμή της μέγιστης συγκέντρωσης βιομάζας (D.O.=3%) οι τιμές των μοριακών βαρών είναι: M n =38, και M w =654, g/mol, ενώ ο δείκτης πολυδιασποράς μένει αμετάβλητος, PDI=2.12. Για την ενίσχυση του ρυθμού ανάπτυξης της βιομάζας και την αύξηση της πυκνότητας της καλλιέργειας, πραγματοποιήθηκαν πειράματα συνεχούς τροφοδοσία του μέσου ανάπτυξης ΑL * σε βιοαντιδραστήρα. Ο ρυθμός τροφοδοσίας μεταβάλλονταν ανάλογα με την πρόοδο της καλλιέργειας. Αξίζει να σημειωθεί πως το μέσο ανάπτυξης ΑL * έχει υψηλές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών (θειικό αμμώνιο, θειικό μαγνήσιο, κιτρικό οξύ και ιχνοστοιχεία), με αποτέλεσμα κατά την τροφοδοσία του στο βιοαντιδραστήρα να μην επιτρέπεται έλλειψη κάποιου συστατικού (π.χ., του αζώτου) καθόλη τη διάρκεια της καλλιέργειας. H τροφοδοσία του μέσου ανάπτυξης ΑL * ξεκινά μετά την 13 η ώρα της καλλιέργειας. Η πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας μέσω της οπτικής πυκνότητας της συγκέντρωσης της υπολειπόμενης και συνολικής ξηρής μάζας κυττάρων παρουσιάζεται στο Σχήμα 5α. Είναι φανερή η συνεχής ανάπτυξη, τόσο της υπολειπόμενης, όσο και της συνολικής βιομάζας, καθόλη τη διάρκεια της καλλιέργειας, και οι μέγιστες τιμές που επιτυγχάνονται είναι 9.5 και 3 g/l, αντίστοιχα. Η οπτική πυκνότητα αυξάνει με σταθερό ρυθμό μέχρι την 18 η ώρα της καλλιέργειας, από όπου ξεκινά η στατική φάση των κυττάρων. Η οπτική πυκνότητα παραμένει στη μέγιστη τιμή της (Ο.D.=15) για 3 ώρες περίπου και η καλλιέργεια διακόπτεται. DCW & Υπολειπόμενη Βιομάζα (g/l) (α) DCW Υπολειπόμενη Βιομάζα O.D Οπτική 6nm Συγκέν. PHB (g/l) & Ρυθμός Παραγωγής (g/(l h)) Συγκέντρωση PHB Ρυθμός Παραγωγής PHB Περιεχόμενο PHB Σχήμα 5: Δυναμική μεταβολή της συγκέντρωσης της υπολειπόμενης και συνολικής βιομάζας, της οπτικής πυκνότητας (α), του ρυθμού παραγωγής, της συγκέντρωσης και του ποσοστού του περιεχομένου ΡΗΒ (β) κατά την καλλιέργεια του A. latus σε βιοαντιδραστήρα συνεχούς τροφοδοσίας θρεπτικών συστατικών. (β) Στο σχήμα 5β παρουσιάζεται η κινητική της συσσώρευσης του πολυμερούς αναφορικά Περιεχόμενο PHB (% g/g DCW) 9 of 12

10 με την συγκέντρωση PHB, το ποσοστό του περιεχόμενου PHB στα κύτταρα και του ρυθμού παραγωγής του. Στο χρονικό διάστημα πριν την τροφοδοσία του μέσου AL * η συγκέντρωση του βιοπολυμερούς αυξάνει με μικρό ρυθμό, όπως ακριβώς συμβαίνει και με την ξηρή μάζα κυττάρων. Από την έναρξη της τροφοδοσίας και έπειτα τα βακτήρια εισέρχονται σε κατάσταση ταυτόχρονης ταχείας ανάπτυξης της υπολειπόμενης βιομάζας και συσσώρευσης πολυμερούς. Η τελική τιμή της συγκέντρωσης του ΡΗΒ είναι 2.5 g/l. Το ποσοστιαίο ενδοκυττάριο ΡΗΒ παρουσιάζει γενικά πιο ομοιόμορφη δυναμική συμπεριφορά πριν και μετά την τροφοδοσία. Ο ρυθμός συσσώρευσης στα δύο αυτά διαστήματα είναι πρακτικά σταθερός και ελαττώνεται μόνο προς το τέλος της ανάπτυξης, όταν τα κύτταρα έχουν εισέλθει στη στατική φάση. Η μέγιστη τιμή του ποσοστού του περιεχόμενου ΡΗΒ ανά μάζα ξηρής βιομάζας είναι 68% g. Ο ρυθμός παραγωγής παραμένει σταθερός σε μικρές τιμές μέχρι την έναρξη της τροφοδοσίας. Από εκείνη την στιγμή κι έπειτα ο ρυθμός αυξάνεται σημαντικά μέχρι την μέγιστη τιμή του (4.5 g/(l h). Πρέπει να σημειωθεί ότι κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας δεν δημιουργήθηκε έλλειψη σε κανένα από τα διατροφικά συστατικά. Στο Σχήμα 6 παρουσιάζεται η δυναμική μεταβολή των μέσων κατά αριθμό και κατά βάρος μοριακών βαρών, καθώς και του δείκτη πολυδιασποράς του παραγόμενου ΡΗΒ που ανακτήθηκε από τέσσερα δείγματα που συλλέχθηκαν σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης της καλλιέργειας. Είναι σημαντικό να τονιστεί πως οι μοριακές ιδιότητες μετρήθηκαν μόνο σε δείγματα που ελήφθησαν μετά την έναρξη της τροφοδοσίας, δηλαδή από την 13 η ώρα και έπειτα, όταν και η πυκνότητα των κυττάρων ήταν επαρκής για την καταβύθιση της απαραίτητης ποσότητας ΡΗΒ. Τόσο το μέσο κατά αριθμό, όσο και το μέσο κατά βάρος μοριακό βάρος παρουσιάζουν συνεχή αύξηση κατά την πρόοδο της καλλιέργειας, ενώ αντίθετα ο δείκτης πολυδιασποράς συνεχώς μειώνεται. Οι τελικές τιμές των μοριακών ιδιοτήτων στην παρούσα καλλιέργεια ήταν: M n =432, g/mol, M w =88, g/mol, και PDI=1.87. Μοριακό Βάρος (g/mol) 1 6 9x1 5 8x1 5 7x1 5 6x1 5 5x1 5 4x1 5 3x1 5 2x1 5 M w M n PDI Δείκτης Πολυδιασποράς Σχήμα 6: Δυναμική μεταβολή των μέσων κατά αριθμό και κατά βάρος μοριακών βαρών και του δείκτη πολυδιασποράς του παραγόμενου ΡΗΒ, κατά την καλλιέργεια του βακτηρίου A. latus σε βιοαντιδραστήρα συνεχούς τροφοδοσίας θρεπτικών συστατικών.. Οι θερμικές ιδιότητες του πολυμερούς προσδιορίζονται με Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης (DSC). Δείγματα καθαρού πολυμερούς επεξεργάζονται ως εξής: αρχικά το θερμοκρασιακό περιβάλλον στο οποίο υποβάλλονται τα πολυμερή ρυθμίζεται στους 2 ο C και το σύστημα αφήνεται να ισορροπήσει. Έπειτα πραγματοποιείται αύξηση της θερμοκρασίας με ρυθμό 1 ο C το λεπτό μέχρι τους 185 ο C. Το δείγμα παραμένει σε αυτή τη θερμοκρασία για 5 1 of 12

11 λεπτά, ενώ ακολουθεί ψύξη μέχρι την αρχική θερμοκρασία με τον ίδιο ρυθμό. Ο ίδιος κύκλος επαναλαμβάνεται και δεύτερη φορά. Από τον πρώτο κύκλο πηγάζουν πληροφορίες για τη θερμική ιστορία του δείγματος, ενώ από το δεύτερο προκύπτουν οι θερμικές ιδιότητες του προϊόντος. Οι ιδιότητες που προέκυψαν από την θερμική ανάλυση ήταν παρόμοιες σε όλες τις περιπτώσεις που μελετήθηκαν για την παραγωγή scl-pha από το βακτήριο Alcaligenes latus και είναι: σημείο τήξεως, ~178 ο C, σημείο Κρυστάλλωσης, ~118 ο C, και βαθμός κρυσταλλικότητας, ~58%. Ο βαθμός κρυσταλλικότητας υπολογίζεται από τη θερμότητα τήξης, η οποία για θεωρητικά 1% κρυσταλλικό πολυμερές είναι 146 J/g. Πίνακας 1: Σύγκριση των δυο καλλιεργειών των βακτηρίων P. putida και A. latus σε βιοαντιδραστήρα συνεχούς τροφοδοσίας θρεπτικών συστατικών, για την παραγωγή mcl- και scl-ρηα, αντίστοιχα. P. putida (mcl-pha) A. latus (scl-pha) Ξηρή μάζα κυττάρων (g/l) Συγκέντρωση ΡΗΑ (g/l) Περιεχόμενο PHA (% g/g DCW) Μέγιστος ρυθμός παραγωγής ΡΗΑ (g/l/h) Κατανάλωση πηγής άνθρακα προς βιομάζα Υ X/S (g/g) Κατανάλωση πηγής άνθρακα προς PHA Υ P/S (g/g) Μοριακό βάρος (Μ w ) (1 3 g/mol) Μοριακό βάρος (Μ n ) (1 3 g/mol) Δείκτης Πολυδιασποράς PDI Σημείο Υαλώδους Μετάπτωσης Τ g ( ο C) Σημείο Κρυστάλλωσης Τ c ( o C) Σημείο Τήξης Τ m ( ο C) Βαθμός Κρυσταλλικότητας (%) - 58 Στον πίνακα 1 γίνεται σύγκριση των δυο καλλιεργειών παραγωγής mcl- και scl-ρηα από τα βακτήρια P. putida και A. latus, αντίστοιχα, σε βιοαντιδραστήρα υπό συνθήκες συνεχούς τροφοδοσίας θρεπτικών συστατικών. Όπως παρατηρείται, οι τελικές συγκεντρώσεις της συνολικής βιομάζας στις δύο καλλιέργειες έχουν μικρή διαφορά. Ωστόσο, καθώς στην περίπτωση της καλλιέργειας του βακτηρίου Α. latus το ποσοστό του περιεχόμενου ΡΗΑ είναι υψηλότερο σε σχέση με αυτό του βακτηρίου P. putida, η συγκέντρωση του τελικώς παραγόμενου πολυμερούς είναι διπλάσια. Επίσης, ο ρυθμός παραγωγής ΡΗΑ είναι πολύ μεγαλύτερος στην περίπτωση του βακτηρίου Α. latus. Τέλος τα μοριακά βάρη και το σημείο τήξεως του παραγόμενου πολυμερούς από το βακτήριο Α. latus είναι εμφανώς υψηλότερα από τα αντίστοιχα του παραγόμενου πολυμερούς από το βακτήριο P. putida, ενώ το πρώτο είναι ένα κρυσταλλικό πολυμερές σε αντίθεση με το δεύτερο που είναι άμορφο. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα δύο βακτηριακά συστήματα παραγωγής mcl- και scl-ρηαs έχουν την ικανότητα να συσσωρεύουν ενδοκυτταρικά μια ικανοποιητική ποσότητα πολυμερούς, με το βακτήριο A. latus ωστόσο να εμφανίζει σημαντικά καλύτερες αποδώσεις. Οι μοριακές ιδιότητες του ανακτώμενου πολυμερούς από τα δυο βακτήρια που μελετήθηκαν, παρουσίασαν ισχυρή 11 of 12

12 εξάρτηση από συγκεκριμένες παραμέτρους των δύο παραγωγικών συστημάτων. Οι θερμικές ιδιότητες ωστόσο των παραγόμενων πολυμερών δεν επηρεάστηκαν από τις παραμέτρους των συστημάτων που μελετήθηκαν. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Reddy C.S.K., Ghai R., Rashmi and Kalia V.C., Biochemical Journal, 376, 15, (23). [2] Verlinder R.A.J., Hill D.J., Kenward M.A., Williamw C.D., Radecka I., Journal of Applied Microbiology, 12, , (27). [3] Madison L.L., Huisman G.W., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 63, 21, (1999). [4] Sudesh K, Abe H, Doi Y. Prog. Polym. Sci.; 25(1): , (2). [5] Akaraonye E., Keshavarz T., Roy I., J. Chem. Technol. Biotechnol., 85, , (21). [6] Lee S.Y., Choi J., Wong H.H., International Journal of Biological Macromolecules, 25: 31, (1999). [7] Sun Z., Ramsay A. J., Guay M., Ramsay B., Journal of Biotechnology, 132, 28, (27). [8] Zinn M., Hany R., Adv Eng Mater, 7, , (25) [9] Wang F, Lee SY. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63(9): [1] Randriamahefa S., Renard E., Guerin P., Lanlois V., Biomacromolecules, 4, 192, (23). [11] Anderson A.J., Dawes E.A., Microbiol. Rev., 54, , (199). [12] Lee S.Y., Trends Biotechnol, 14, , (1996). [13] Lee S.Y., Wong H.H., Choi J., Lee S.H., Lee S.C. Han C.S., Biotechnology and Bioengineering, 68, 466, (2). 12 of 12