ΚΑΘΑΡΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΤΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΣΥΝΘΕΤΙΚΩΝ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΥΓΡΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΕΛΑΙΟΤΡΙΒΕΙΟΥ

Transcript

1 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΟΛΥ-ΥΔΡΟΞΥΑΛΚΑΝΕΣΤΕΡΩΝ (PHAs) ΑΠΟ ΚΑΘΑΡΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΤΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΣΥΝΘΕΤΙΚΩΝ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΥΓΡΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΕΛΑΙΟΤΡΙΒΕΙΟΥ Κωνσταντίνα. Κ. Κουρμέντζα Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα διατριβή αναπτύχτηκε μικτή καλλιέργεια μικροοργανισμών ικανών για παραγωγή PHAs χρησιμοποιώντας δραστική λάσπη. H διεργασία εμπλουτισμού της καλλιέργειας σε ΡΗΑ παραγωγούς πραγματοποιήθηκε σε αντιδραστήρα περιοδικής πλήρωσης και απορροής (draw n fill reactor) μέσω εναλλαγής περιοριστικών συνθηκών πηγής άνθρακα και αζώτου στο θρεπτικό μέσο. Η εμπλουτισμένη μικτή καλλιέργεια χαρακτηρίστηκε όσον αφορά τα κυρίαρχα στελέχη που την απαρτίζουν μέσω τεχνικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR). Έξι διαφορετικά στελέχη απομονώθηκαν τα οποία βρέθηκαν να ανήκουν στο γένος Pseudomonas. Κάθε ένα από αυτά μαζί με την μικτή καλλιέργεια μελετήθηκαν ως προς την ικανότητα τους να παράγουν PHAs τόσο σε αερόβιες συνθήκες απουσίας αζώτου όσο και σε μικροαεροφιλικές συνθήκες (περιορισμός σε οξυγόνο) απουσίας αζώτου. Στις παραπάνω περιπτώσεις ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε συνθετικό μίγμα πτητικών λιπαρών οξέων (οξικό, προπιονικό, βουτυρικό) καθώς επίσης και οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου (εκροή μεσόφιλου υδρογονοπαραγωγού αντιδραστήρα) πλούσιο σε πτητικά λιπαρά οξέα. Σύμφωνα με τα πειραματικά δεδομένα η μικτή καλλιέργεια έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα όσον αφορά τα ποσοστά συσσώρευσης και τους συντελεστές απόδοσης σε PHAs οπότε και προτιμήθηκε για περαιτέρω μελέτη. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκαν πειράματα διαλείποντος έργου για την διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών παραγωγής PHAs από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια χρησιμοποιώντας συνθετικά υποστρώματα δηλαδή οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ. Συγκεκριμένα μελετήθηκε: (α) η επίδραση του αρχικού ph χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος (g/l 1:1:1), (β) η επίδραση της πηγής άνθρακα στην κατανομή των μεταβολικών προϊόντων χρησιμοποιώντας είτε οξικό είτε προπιονικό είτε βουτυρικό οξύ καθώς και τους πιθανούς συνδυασμούς αυτών και (γ) η επίδραση του λόγου C/N στο θρεπτικό μέσο χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος (g/l 1:1:1). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μελέτη της ανάπτυξης της κυτταρικής βιομάζας μέσω της κατανάλωσης των ενδοκυτταρικά συσσωρευμένων PHAs παρουσία εξωκυτταρικής πηγής αζώτου με ταυτόχρονη απουσία πηγής άνθρακα καθώς και η ενδοκυτταρική βιοαποδόμηση των PHAs για λόγους συντήρησης της βιομάζας. Κάνοντας χρήση του λογισμικού πακέτου MATLAB επιχειρήθηκε η προσαρμογή και πρόβλεψη τόσο της κατανάλωσης της πηγής άνθρακα όσο και της κατανομής των παραγόμενων PHAs βάσει των πειραμάτων που αφορούν την παραγωγή των PHAs από διαφορετικές πηγές άνθρακα. Τέλος, σε μια προσπάθεια μείωσης του κόστους του υποστρώματος η οποία συνεπάγεται μείωση του κόστους των παραγόμενων PHAs, διερευνήθηκε η εκμετάλλευση οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου το οποίο ήταν προϊόν εκροής μεσόφιλου υδρογονοπαραγωγού αντιδραστήρα σε αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας τύπου SBR. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κατά την διάρκεια των τελευταίων χρόνων η εκτεταμένη χρήση των πλαστικών υλικών σε συνδυασμό με το γεγονός πως ακόμη και μετά την διάθεση τους τα υλικά αυτά παραμένουν στο περιβάλλον για πολλά χρόνια, έχει προκαλέσει ένα από τα σημαντικότερα περιβαλλοντικά προβλήματα σε παγκόσμια κλίμακα. Για τον λόγο αυτό ιδιαίτερη έμφαση έχει δοθεί στην ανάπτυξη υλικών τα οποία έχουν την ικανότητα να αποδομούνται από το περιβάλλον στο οποίο διατίθενται και ονομάζονται βιοδιασπώμενα πολυμερή. Μεταξύ των διαφόρων τύπων υλικών που επάγονται σε αυτή την κατηγορία μεγάλο ενδιαφέρον έχει προκαλέσει η ομάδα των πολύ-υδροξυαλκανεστέρων (Poly-hydroxyalkanoates: PHAs). Περισσότερα από 300 στελέχη μικροοργανισμών έχουν χαρακτηριστεί ως προς την ικανότητα τους να συσσωρεύουν PHAs ως αποθήκη άνθρακα και ενέργειας. Η συσσώρευση τους πραγματοποιείται με την μορφή ενδοκυτταρικών εγκλεισμάτων όταν ο μικροβιακός πληθυσμός καλείται να ανταπεξέλθει σε δυναμικές συνθήκες οι οποίες έχουν να κάνουν με την έλλειψη ενός χρήσιμου για την μικροβιακή

2 ανάπτυξη συστατικού. Τέτοιες συνθήκες επιτυγχάνονται με περιορισμό του θρεπτικού μέσου σε άζωτο, φωσφόρο, μαγνήσιο, θείο, οξυγόνο ενώ υπάρχει υπερεπάρκεια όσον αφορά την πηγή άνθρακα την οποία οι μικροοργανισμοί θα χρησιμοποιήσουν ως υπόστρωμα για την παραγωγή PHAs. Τα PHAs μπορούν μελλοντικά να αντικαταστήσουν υλικά όπως το πολυαιθυλένιο (PE) και το πολυπροπυλένιο (PP). Ωστόσο, το υψηλό κόστος παραγωγής τους αποτελεί σημαντικό μειονέκτημα. Το υψηλό κόστος παραγωγής των PHAs οφείλεται κυρίως σε τρεις παράγοντες. Στην χρήση καθαρών καλλιεργειών που συνεπάγεται αύξηση του λειτουργικού κόστους, την χρήση υποστρωμάτων υψηλής καθαρότητας, δηλαδή, συνθετικών πηγών άνθρακα καθώς και την απαίτηση μεγάλων ποσοτήτων ενζύμων ή διαλυτών κατά το στάδιο της απόσπασης των PHAs από τα βακτηριακά κύτταρα. Για τους λόγους αυτούς έχει δοθεί ιδιαίτερη έμφαση στην χρήση μικτών καλλιεργειών και στην εκμετάλλευση εναλλακτικών πηγών άνθρακα όπως είναι τα υγρά κλάσματα αποβλήτων που χαρακτηρίζονται από υψηλό οργανικό φορτίο. Η διαχείριση και διάθεση των υγρών αποβλήτων ελαιοτριβείου αποτελεί σημαντικό περιβαλλοντικό πρόβλημα τόσο λόγω των υψηλών όγκων παραγωγής τους που ανέρχεται περίπου στους 30 εκατομμύρια τόνους το χρόνο στις μεσογειακές χώρες, αλλά και λόγω του υψηλού οργανικού φορτίο που φέρουν, περί g COD/l. Τα τελευταία χρόνια πολλοί ερευνητές έχουν αναφέρει βιολογικές καθώς και φυσικοχημικές μεθόδους για την επεξεργασία τους. Η μικροβιολογική επεξεργασία και αξιοποίηση των οξυνισμένων αυτών αποβλήτων για την παραγωγή PHAs έχει προταθεί αρχικά από τους Dionisi κ.ά. (Dionisi et al., 2005). Το πλούσιο οργανικό φορτίο αποτελεί πλεονέκτημα καθώς υπάρχει η δυνατότητα ζύμωσης των αποβλήτων αυτών σε υψηλούς ρυθμούς με αποτέλεσμα την παραγωγή πτητικών λιπαρών οξέων τα οποία αποτελούν τις πρόδρομες ενώσεις για τον σχηματισμό των PHAs. Το στάδιο της οξεογένεσης δεν παρεμποδίζεται σε μεγάλο βαθμό από την παρουσία των λιπιδικών και φαινολικών ενώσεων που αποτελούν μέρος των αποβλήτων ελαιοτριβείου, αλλά από την άλλη μεριά δρουν παρεμποδιστικά στο επόμενο στάδιο της μεθανογένεσης (Beccari et al., 2009). Το στάδιο της οξεογένεσης των αποβλήτων φαίνεται να θεωρείται απαραίτητο για την περαιτέρω χρήση τους προς παραγωγή PHAs καθώς παρουσία υδατανθράκων και σακχάρων ευνοείται ενεργειακά η συσσώρευση γλυκογόνου έναντι των βιοπολυμερών στις μικτές καλλιέργειες. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Αναλυτικές μέθοδοι Στην παρούσα εργασία προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις του χημικά απαιτούμενου οξυγόνου, των διαλυτών υδατανθράκων, των ολικών και πτητικών αιωρούμενων στερεών, του αμμωνιακού αζώτου και του νιτρικού αζώτου σύμφωνα με το Standard Methods for the examination of Water and Wastewaters (APHA). Επίσης πραγματοποιήθηκε ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των πτητικών λιπαρών οξέων σε χρωματογράφο αερίων (Varian CP-3800), εξοπλισμένο με ανιχνευτή φλόγας ιονισμού (FID) και τριχοειδή στήλη HP-FFAP (Agilent technologies INC. 30m 0.53mm I.D μm film) καθώς και των PHAs (ΡΗΒ και PHV) χρησιμοποιώντας τριχοειδή στήλη DB-5MS (Agilent technologies INC. 30 m 0.25 mm I.D μm film) (Oehmen et al., 2005). Ο προσδιορισμός του ολικού αζώτου καθώς και του νιτρικού αζώτου πραγματοποιήθηκε μέσω τεστ φιαλιδίων της εταιρείας HACH LANGE με κωδικό LCK238 και LCK339 αντίστοιχα. Η μέτρηση των υδατανθράκων έγινε σύμφωνα με την μέθοδο που περιγράφεται στην εργασία του Josefsson (Josefsson, 1983). Τέλος, ο προσδιορισμός τόσο του ph όσο και του DO πραγματοποιήθηκε με εμβάπτιση κατάλληλου ηλεκτροδίου, Hanna HI 8224 και Hanna DO 9146 αντίστοιχα, στο προς ανάλυση δείγμα. Καλλιέργειες μικροοργανισμών Μικτή εμπλουτισμένη καλλιέργεια Για τον εμπλουτισμό της ενεργού ιλύος, η οποία λήφθηκε από την αερόβια δεξαμενή επεξεργασίας λυμάτων της μονάδας του βιολογικού καθαρισμού της Πάτρας, σε ΡΗΑ συσσωρευτικά βακτήρια ακολουθήθηκε η στρατηγική αερόβιων δυναμικών συνθηκών. Οι δυναμικές συνθήκες επετεύχθησαν μέσω της εναλλαγής περιορισμού του θρεπτικού μέσου σε πηγή άνθρακα και πηγή αζώτου. Συγκεκριμένα, το θρεπτικό μέσο αποτελούνταν από: 0.2 g/l MgSO4 7H 2 O, g/l CaCl 2 2H 2 O, 5 g/l K 2 HPO 4, 3 g/l KH 2 PO 4 και 0.5 ml/l διαλύματος ιχνοστοιχείων ενώ ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκαν g/l CH 3 CH 2 COOH και g/l CH 3 COOH ενώ ως πηγή αζώτου g/l (NH 4 ) 2 SO 4. Το διάλυμα ιχνοστοιχείων είχε την εξής σύσταση: g/l CuSO 4 5H 2 O, 5 g/l FeSO 4 7H 2 O, g/l NaMoO 4 2H 2 O, 4.05 g/l NiCl 2 6H 2 O, g/l ZnSO 4 7H 2 O, g/l CoCl 2 6H 2 O, 0.75 g/l KI, 3 g/l H 3 BO 3, 5g/L MnCl 2 4H 2 O και 5 g/l EDTA. Η διεργασία έλαβε χώρα σε αντιδραστήρα άντλησης πλήρωσης (draw fill) συνεχούς λειτουργίας ενεργού όγκου 1 l, σε αερόβιες συνθήκες, θερμοκρασία περιβάλλοντος και ανάδευση 250 rpm. Η χρονική διάρκεια κάθε περιοριστικού κύκλου ανέρχονταν στις 24 ώρες.

3 Απομονωμένα στελέχη μικροοργανισμών Η ταυτοποίηση των βακτηριακών στελεχών πραγματοποιήθηκε μέσω της μεθόδου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction- PCR). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα τα έξι στελέχη που απομονώθηκαν από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια φαίνεται πως είναι 98- συναφή με στελέχη που ανήκουν στο γένος της Ψευδομονάδας (Pseudomonas sp.) και συγκεκριμένα κάποια από αυτά με στελέχη Pseudomonas putida όπως μπορούμε να παρατηρήσουμε στον πίνακα 1. Πίνακας 1. Ταυτοποίηση στελεχών που απομονώθηκαν από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια. Στέλεχος Ομοταξία/Γένος Πανομοιότυπα Στελέχη % ταυτοποίηση A B C D E F Γάμμα-πρωτεοβακτήρια/ Ψευδομοναδα Pseudomonas sp. ONBA Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas sp. HR 13 Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas sp. OCR7 Pseudomonas sp. K2 Pseudomonas sp. WBC-2 Pseudomonas sp. OCR7 Pseudomonas sp. K2 Pseudomonas sp. WBC-2 Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas putida ATCC Pseudomonas putida OW-27 Pseudomonas putida RW-26 Pseudomonas putida 5Asal 98% 98% 98% 98% 98% Υποστρώματα Συνθετικά υποστρώματα Στα πειράματα που έλαβαν χώρα για να διερευνηθεί η διαδικασία παραγωγής PHAs χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά υποστρώματα άνθρακα οξικού, προπιονικού, βουτυρικού νατρίου, όλοι οι συνδυασμοί των ανωτέρω καθώς και γλυκόζη. Τα υποστρώματα αυτά ήταν χημικές ουσίες υψηλής καθαρότητας των εταιριών Merck και SigmaAldrich. Οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου Για την παραγωγή των PHAs χρησιμοποιήθηκε επίσης ως πηγή άνθρακα το υγρό κλάσμα της απορροής μεσόφιλου υδρογονοπαραγωγού αντιδραστήρα CSTR ο οποίος τροφοδοτούταν με απόβλητο τριφασικού ελαιοτριβείου αραιωμένο 1:4 με νερό βρύσης. Η απορροή του αντιδραστήρα ήταν πλούσια σε πτητικά λιπαρά οξέα καθώς ήταν προϊόν διεργασίας αναερόβιας οξεογέννεσης. Αναλόγως του υδραυλικού χρόνου παραμονής του αντιδραστήρα τα χαρακτηριστικά της εκροής διέφεραν ως προς τις συγκεντρώσεις των πτητικών λιπαρών οξέων (Κουτρούλη Ελένη, 2008). Πειράματα σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου Πολλά από τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου (batch). Γενικά, πρόκειται για αερόβιους αντιδραστήρες, ενεργού όγκου 1 l, θερμοκρασίας 26 ± 2 ο C με συνεχή ανάδευση rpm. Κάθε φορά ως εμβόλιο χρησιμοποιούνταν 250 ml μικτής εμπλουτισμένης καλλιέργειας. Αντιδραστήρας τύπου SBR Ο αντιδραστήρας τύπου SBR που χρησιμοποιήθηκε για την συνεχή παραγωγή PHAs από οξινισμένο απόβλητο τριφασικού ελαιοτριβείου είναι κατασκευασμένος από πλεξιγκλάς, κυλινδρικού σχήματος συνολικού όγκου 2000 ml και ενεργού όγκου 750 ml. Σε ύψος που αντιστοιχεί στα 250 ml προσαρμόστηκε κυλινδρικός σωλήνας του οποίου το πάνω μέρος ήταν συνδεδεμένο με περισταλτική αντλία για να γίνεται απορροή κατά τις διάφορες φάσεις λειτουργίας του αντιδραστήρα. Ο αντιδραστήρας είναι τοποθετημένος σε μαγνητικό αναδευτήρα (Kartell) και με την βοήθεια μαγνητικής ράβδου πραγματοποιείται η ανάδευση του ανάμικτου υγρού στα 250 rpm. Το επάνω μέρος του κλείνει με πώμα από ανοξείδωτο χάλυβα το οποίο περιλαμβάνει υποδοχές απαραίτητες για την λειτουργία του. Συγκεκριμένα υπάρχουν δύο υποδοχές για την είσοδο και την έξοδο του υγροποιημένου αέρα μέσω αεραντλίας, μία για την λήψη υγρού δείγματος, μία για την εισροή της τροφοδοσίας και μια για την εκροή του υπερκείμενου υγρού. Ο αντιδραστήρας λειτουργούσε σε θερμοκρασία δωματίου 26 ± 2 ο C. Για την τροφοδοσία και την απορροή του αντιδραστήρα χρησιμοποιήθηκαν κωνικές φιάλες όγκου 2 l. Οι φιάλες τροφοδοσίας και το οξυνισμένο απόβλητο αποστειρώθηκαν, σε αυτόκλειστο στους 121 o C

4 για 15 min, ενώ η τροφοδοσία του θρεπτικού μέσου στον αντιδραστήρα γινόταν με την βοήθεια περισταλτικών αντλιών. Για να αποφευχθεί πιθανή επιμόλυνση οι τροφοδοσίες περνούσαν από θάλαμο UV πριν εισρεύσουν στον αντιδραστήρα. Ο θάλαμος UV αποτελείται από μια λυχνία υδραργύρου χαμηλής πίεσης, που εκπέμπει ακτινοβολία σε μήκος κύματος 254 nm και δύο ράβδους χαλαζία τοποθετημένες παράλληλα στη λυχνία από τις οποίες και διέρχονταν οι τροφοδοσίες. Η λειτουργία του αντιδραστήρα σύμφωνα με προκαταρκτικά πειράματα σχεδιάστηκε ως εξής: α) Φάση ανάπτυξης: αφού έχει προηγηθεί εμβολιασμός του αντιδραστήρα με 250 ml εμπλουτισμένης μικτής καλλιέργειας για την εκκίνηση του SBR, γίνεται τροφοδοσία 500 ml πλήρους θρεπτικού μέσου για να πραγματοποιηθεί ανάπτυξη του μικροβιακού φορτίου. Η τροφοδοσία στον αντιδραστήρα γίνεται με την βοήθεια περισταλτικής αντλίας και διαρκεί 10 min. Επειδή το οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου δεν περιέχει αμμωνιακό άζωτο γίνεται προσθήκη πηγής αζώτου με την μορφή (NH 4 ) 2 SO 4. Επίσης λόγω του χαμηλού ph του αποβλήτου, ph~5.0, γίνεται προσθήκη πυκνού ρυθμιστικού διαλύματος K 2 HPO 4 και KH 2 PO 4 για την ρύθμιση του ph στο εύρος Η φάση ανάπτυξης διαρκεί 47 ώρες, β) Φάση καθίζησης: κατά την φάση καθίζησης γίνεται παύση του αερισμού και της ανάδευσης για 50 min έτσι ώστε να πραγματοποιηθεί καθίζηση της βιομάζας. Με τον τρόπο αυτό η βιομάζα που έχει αναπτυχθεί κατακρατάτε στον αντιδραστήρα και συμμετέχει στις επόμενες φάσεις λειτουργίας, γ) Απορροή υπερκείμενου υγρού: τα επόμενα 10 min γίνεται απορροή 500 ml υπερκείμενου υγρού από τον αντιδραστήρα μέσω περισταλτικής αντλίας, δ) Στάσιμη φάση: στην στάσιμη φάση τα 250 ml ανάμικτου υγρού παραμένουν στον αντιδραστήρα για 12 ώρες σε αεργία απουσία ανάδευσης και αερισμού. Ο ρόλος της στάσιμης φάσης είναι κυρίως πρακτικός καθώς έτσι η διάρκεια ενός κύκλου λειτουργίας είναι 3.5 ημέρες δηλ. δύο λειτουργικοί κύκλοι ανά εβδομάδα, ε) Φάση συσσώρευσης: στην φάση συσσώρευσης τα πρώτα 10 min γίνεται τροφοδοσία οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου με την βοήθεια περισταλτικής αντλίας ενώ η συνολική διάρκεια της φάσης αυτής είναι 24 ώρες. Το απόβλητο στην περίπτωση αυτή έχει υποστεί μόνο ρύθμιση του ph~7.0 καθώς ο σκοπός της συγκεκριμένης φάσης είναι η συσσώρευση PHAs σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου, στ) Απορροή ανάμικτου υγρού: κατά το τέλος της φάσης συσσώρευσης, και για 10 min, γίνεται απορροή 500 ml ανάμικτου υγρού χωρίς να προηγηθεί καθίζηση έτσι έστω να συλλεχθεί η βιομάζα και να πραγματοποιηθεί απόσπαση των PHAs από τα κύτταρα. Η διάρκεια ενός πλήρους κύκλου λειτουργίας σύμφωνα με τον παραπάνω σχεδιασμό της διεργασίας είναι 3.5 ημέρες και συμπίπτει με τον χρόνο παραμονή της βιομάζας (SRT). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ A. Διερεύνηση της ικανότητας παραγωγής PHAs ανά τύπο καλλιέργειας σε συνθήκες περιορισμού Τόσο η εμπλουτισμένη καλλιέργεια όσο και τα απομονωμένα στελέχη μικροοργανισμών μελετήθηκαν ως προς την ικανότητα τους να συσσωρεύουν PHAs υπό συνθήκες περιορισμού. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν υπό αερόβιες συνθήκες απουσίας αζώτου και συνθήκες απουσίας αζώτου και περιορισμού οξυγόνου. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε τόσο συνθετικό μέσο όσο και οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου των οποίων τα χαρακτηριστικά παραθέτονται στον πίνακα 2. Πίνακας 2. Σύσταση και χαρακτηριστικά συνθετικού μέσου και οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου. Παράμετρος Συνθετικό θρεπτικό μέσο Οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου TSS (g/l) - - VSS (g/l) - - Οξικό οξύ (g/l) 0.8 ± ± 0.2 Προπιονικό οξύ (g/l) 0.8 ± ± 0.1 Βουτυρικό οξύ (g/l) 0.8 ± ± 0.1 Ισοβουτυρικό οξύ (g/l) ± 0.0 Βαλερικό οξύ (g/l) ± 0.0 Ισοβαλερικό οξύ (g/l) ± 0.0 Διαλυτοί υδατάνθρακες (g/l) ± 0.1 ph 6.9 ± ± 0.2 Αμμωνιακό άζωτο (mg/l) ± 0.3 Διάλυμα ιχνοστοιχείων (ml/l) 1 1 Στον πίνακα 3 διαφαίνονται τα κύρια χαρακτηριστικά της παραγωγής των PHAs ανά τύπο καλλιέργειας. Στην περίπτωση της εμπλουτισμένης καλλιέργειας, κάνοντας χρήση συνθετικού υποστρώματος σε συνθήκες απουσίας αζώτου, το ποσοστό ενδοκυτταρικής συσσώρευσης σε PHAs

5 ανέρχεται στο 66.4 % και χαρακτηρίζεται από τον υψηλότερο συντελεστή απόδοσης Υ PHAs/S = g VSS/ g VFAs και τον μεγαλύτερο ρυθμό παραγωγής r PHAs = 56.4 mg l -1 h -1. Στην συνέχεια, και με μεγάλη διαφορά, ακολουθεί το στέλεχος Α. Η διαφορά ανάμεσα στον συντελεστή απόδοσης βιομάζας Y X/S,t και στον συντελεστή Y PHAs/S ισούται με Y X/S. Εφόσον στο θρεπτικό μέσο δεν υπάρχει πηγή αζώτου ο συντελεστής Y X/S χαρακτηρίζει την ενδοκυτταρική συσσώρευση άλλων μεταβολικών προϊόντων πέραν των PHAs. Πίνακας 3. Κύρια χαρακτηριστικά παραγωγής PHAs ανά τύπο καλλιέργειας χρησιμοποιώντας συνθετικό μέσο και οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου. Καλλιέργεια/ Χρονική στέλεχος διάρκεια Υ Χ/S Υ Χ/S, t r X,t Y PHAs/S r PHAs % PHAs Συνθετικό μέσο Αερόβιες συνθήκες απουσίας αζώτου Μικτή Α Β C D E F Συνθήκες απουσίας αζώτου και περιορισμού σε οξυγόνο Μικτή Α Β C D E F Οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου Αερόβιες συνθήκες απουσίας αζώτου Μικτή Α Β C D E F Συνθήκες απουσίας αζώτου και περιορισμού σε οξυγόνο Μικτή Α Β C D E F * Χρονική διάρκεια: h, Y X/S = Y X/S,t Y PHAs/S : g VSS/ g VFAs, YPHAs/S: g PHAs/ g VFAs, r X,t : mg VSS l -1 h -1, r PHAs : mg PHAs l -1 h -1, % PHAs: (g PHAs/ g VSS) 100. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία έχει αναφερθεί η παραγωγή λιπιδίων από το στέλεχος Pseudomonas RRL-28 σε ποσοστό που ανέρχεται το 42.7 % g/ g ξηρού κυτταρικού βάρους χωρίς να έχει μελετηθεί αν υπάρχει ταυτόχρονη παραγωγή PHAs (Patnayak & Sree, 2005), ενώ σύμφωνα με τους Zevenhuizen και Ebbink (Zevenhuizen & Ebbink, 1974) όταν το στέλεχος Pseudomonas V-19 τροφοδοτήθηκε με οξικό νάτριο υπό περιοριστικές συνθήκες αζώτου παρήχθησαν 1.3 % γλυκογόνου, 1.3 % ΡΗΒ και 20.4 % λιπίδια g/ g ξηρού κυτταρικού βάρους ενώ όταν χρησιμοποιήθηκε υδροξυβουτυρικό νάτριο παρήχθησαν 9.45 % γλυκογόνο, 33.4 % ΡΗΒ και 24 % λιπίδια. Ο περιορισμός σε οξυγόνο φαίνεται να οδηγεί όλους τους τύπους καλλιεργειών σε μικρότερους ρυθμούς κατανάλωσης των οργανικών

6 υποστρωμάτων και συνεπώς σε μικρότερους ρυθμούς βιοσύνθεσης PHAs εφόσον η παραγωγική διεργασία επιμηκύνεται χρονικά. Επίσης, επηρεάζει αρνητικά την εμπλουτισμένη καλλιέργεια οδηγώντας σε μείωση του ποσοστού συσσώρευσης PHAs καθώς και του συντελεστή απόδοσης Y PHAs/S. Τα στελέχη Β,C,D,E,F δεν παρουσιάζουν μεγάλη διαφορά στα ποσοστά συσσώρευσης PHAs ενώ οι συντελεστές απόδοσης Y PHAs/S είναι αρκετά μικροί και παρόμοιοι με εκείνους όπου η παροχή οξυγόνου είναι επαρκής. Αντίθετα, στο στέλεχος Α ο περιορισμός οξυγόνου φαίνεται να επιδρά θετικά στο ποσοστό συσσώρευσης PHAs. Βέβαια το γεγονός αυτό πιθανότατα συμβαίνει διότι υπό τις συγκεκριμένες συνθήκες δεν πραγματοποιείται συσσώρευση ενδοκυτταρικών προϊόντων πέραν των PHAs. Όταν ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιείται οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου τόσο τα ποσοστά συσσώρευσης σε PHAs όσο και οι συντελεστές απόδοσης Y PHAs/S καθώς και οι ρυθμοί r PHAs που παρατηρούνται είναι μικρότερα σε σχέση με αυτά που παρατηρήθηκαν κάνοντας χρήση συνθετικού μέσου. Φαίνεται πως και πάλι η εμπλουτισμένη καλλιέργεια εμφανίζει υψηλότερο ποσοστό συσσώρευσης, 8.84 % g PHAs/ g VSS, καλύτερο συντελεστή απόδοσης Y PHAs/S = g PHAs/ g -1 VFAs και υψηλότερο ρυθμό παραγωγής r PHAs = 1.85 mg l -1 h συγκριτικά με τις υπόλοιπες καλλιέργειες. Επίσης, παρατηρούμε πως κάνοντας χρήση οξυνισμένου απόβλητου ελαιοτριβείου η εμπλουτισμένη καλλιέργεια συσσωρεύει και άλλα ενδοκυτταρικά προϊόντα εκτός των PHAs. Πιθανότατα λόγω της ελαιώδους φύσης του αποβλήτου, να πραγματοποιείται συσσώρευση λιπιδίων. Σύμφωνα με τους Ribera κ.ά (Ribera et al., 2001), οι οποίοι εξέτασαν το στέλεχος Pseudomonas putida KT2442, παρατήρησαν πως το βακτήριο αυτό είναι ικανό να συσσωρεύει 1.52 % g PHAs/ g ξηρής κυτταρικής μάζας με ρυθμό r PHAs = 0.56 mg l -1 h - 1. Παρόμοια επίσης είναι η συμπεριφορά της εμπλουτισμένης καλλιέργειας η οποία επιδεικνύει μικρότερο ποσοστό συσσώρευσης PHAs 3.25 % έναντι 8.84 % g PHAs/ g VSS σε συνθήκες απουσίας αζώτου και περιορισμού σε οξυγόνο. Τα στελέχη B, C, D, E και F δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερη διαφορά στα ποσοστά συσσώρευσης PHAs καθώς και στους συντελεστές απόδοσης Y PHAs/S όπως ακριβώς και κατά την χρήση του συνθετικού θρεπτικού μέσου στις ανάλογες συνθήκες. Εξαίρεση και εδώ, όπως και προηγουμένως, αποτελεί το στέλεχος Α το οποίο συσσωρεύει 11.5 % έναντι 6.2 % g PHAs/ g VSS σε συνθήκες επάρκειας οξυγόνου. Παρά το γεγονός πως το στέλεχος Α εμφανίζει την μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε PHAs στο σύνολο η συμπεριφορά της εμπλουτισμένης καλλιέργειας θεωρείται καλύτερη καθώς σε αυτή την χρονική διάρκεια (70 ώρες) εμφανίζει το καλύτερο ποσοστό PHAs εν αντιθέσει με το στέλεχος Α το οποίο χρειάζεται 296 ώρες. Β. Παραγωγή PHAs μέσω της εμπλουτισμένης καλλιέργειας κάνοντας χρήση συνθετικών υποστρωμάτων Β1. Επίδραση της τιμής του αρχικού ph Σκοπός αυτής της ενότητας είναι η μελέτη της επίδρασης της τιμής του ph, κατά το στάδιο της συσσώρευσης των PHAs, στον ρυθμό παραγωγής, την απόδοση και την σύσταση των παραγόμενων PHAs. Η τιμή του ph στα πειράματα δεν ήταν ελεγχόμενη αλλά αντιστοιχεί στην αρχική τιμή του ph στην καλλιέργεια. Η επιλογή αυτή έγινε με βάση τον σχεδιασμό μιας απλούστερης και οικονομικά πιο ανταγωνιστικής διεργασίας. Η ρύθμιση του αρχικού ph πραγματοποιήθηκε μέσω ρυθμιστικού διαλύματος K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4. Οι τιμές του ph που εξετάστηκαν καθώς και η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος φαίνονται στον πίνακα 4 ενώ στον πίνακα 5 συνοψίζονται οι κύριες κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι που χαρακτηρίζουν την παραγωγή των PHAs στις διάφορες αρχικές τιμές ph. Πίνακας 4. Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος και τιμές ph που εξετάστηκαν. ph Σύσταση ρυθμιστικού διαλύματος K 2 HPO 4 KH 2 PO g/l 10 g/l g/l g/l g/l 1.2 g/l g/l 0.5 g/l Όπως φαίνεται και από τα συγκεντρωτικά αποτελέσματα όταν η αρχική τιμή του ph είναι ίση με 6.90 επιτυγχάνεται το μεγαλύτερο ποσοστό συσσώρευσης, ο υψηλότερος συντελεστής απόδοσης Y P/S, ο υψηλότερος ειδικός ρυθμός παραγωγής PHAs, q P, και ο υψηλότερος ειδικός ρυθμός κατανάλωσης υποστρώματος, -q S. Επίσης, σε αυτή την τιμή παρατηρούμε ότι παράγεται συμπολυμερές PHBV, 81 % HB-19 % HV, με το υψηλότερο μοριακό βάρος. Ο συντελεστής πολυδιασποράς των συμπολυμερών που προκύπτουν κυμαίνεται από Στην τιμή 6.40 παρατηρείται το μέγιστό κλάσμα μονάδων HV στο παραγόμενο συμπολυμερές PHBV ενώ με αύξηση του ph φαίνεται η τάση μείωσης του κλάσματος HV μονάδων. Η παρατήρηση αυτή

7 έρχεται σε ασυμφωνία με την εργασία των Villano κ.ά. (Villano et al., 2010), όπου συμπέραναν πως η αύξηση της τιμής του ph, το οποίο ήταν ελεγχόμενο, αύξανε και το κλάσμα των μονάδων HV όταν ως υπόστρωμα χρησιμοποιούνταν μίγμα οξικού και προπιονικού οξέος. Συγκεκριμένα, το ph επηρέαζε τον σχετικό λόγο ρυθμού κατανάλωσης προπιονικού προς οξικό οξύ από 0.32 g COD/ g COD σε ph 7.5 σε 0.80 g COD/ g COD σε ph 8.5. Όταν στις καλλιέργειες παρέχονται μίγματα οξικού και προπιονικού οξέος σε ph 7.5 η καταβολική δραστηριότητα αναφέρεται να επιτυγχάνεται κυρίως μέσω της κατανάλωσης του οξικού οξέος και ο χαρακτηριστικός λόγος P/O υπερισχύει έναντι αυτού του προπιονικού οξέος (Dionisi et al., 2005). Σύμφωνα με τους Serafim κ.ά. (Serafim et al., 2004), όταν μελετήθηκε η παραγωγή PHB από οξικό οξύ σε τιμές ελεγχόμενου ph 7.0 κι 8.3 τα ποσοστά συσσώρευσης που επιτεύχθηκαν ήταν 27.5 % και 39.8 % αντίστοιχα τα οποία όμως ήταν μικρότερα σε σχέση με το ποσοστό συσσώρευσης 47.5 % που παρατηρήθηκε όταν το ph δεν ήταν ελεγχόμενο με αρχική τιμή 7.0. Ο συντελεστής απόδοσης Y P/S ήταν μεγαλύτερος όταν το ph δεν ήταν ελεγχόμενο, 0.72 Cmmol PHB/ Cmmol HAc, σε σχέση με όταν ήταν ελεγχόμενο στην τιμή 7.0 (0.40 Cmmol PHB/ Cmmol HAc) και 8.3 (0.64 Cmmol PHB/ Cmmol HAc). Επίσης παρατήρησαν πως όταν το ph ήταν ελεγχόμενο στην τιμή 7.0 το 44 % του υποστρώματος χρησιμοποιούταν ως ενέργεια για το κύτταρο ενώ το υπόλοιπο 56 % για κυτταρική ανάπτυξη και συσσώρευση πολυμερών. Από την άλλη μεριά, όταν το ph δεν ήταν ελεγχόμενο και είχε αρχική τιμή 7.0 μόλις 12 % του υποστρώματος χρησιμοποιούταν για ενεργειακούς σκοπούς και το υπόλοιπο 88 % για κυτταρική ανάπτυξη και παραγωγή πολυμερών. Πίνακας 5. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs σε διαφορετικές τιμές ph. Παράμετροι ph Χρονική διάρκεια S ± ± ± ± 0.6 Xi 44.9 ± ± ± ± 1.2 -q S, max q S, average q P,max q P,average Y P/S 0.73 ± ± ± ± 0.03 fphas 0.74 ± ± ± ± 0.02 fphb 0.47 ± ± ± ± 0.01 fphv 0.27 ± ± ± ± 0.01 % PHAs 64.7 ± ± ± ± 5.8 % mol HB-% mol HV Mn ( 10 5 Da) Mw ( 10 5 Da) P.I. (Mw/Mn) * Χρονική διάρκεια: h, S: αρχική συγκέντρωση υποστρώματος (Cmmol/l), Xi: αρχική συγκέντρωση βιομάζας (Cmmol/l), -q S : Cmmol S/Cmmol X h, q P : Cmmol PHAs/Cmmol X h, Y P/S : Cmmol PHAs/Cmmol S, fphas: Cmmol PHAs/Cmmol X, % PHAs: (g PHAs/g VSS) 100. Β2. Επίδραση της πηγής άνθρακα Το υπόστρωμα άνθρακα που έχει μελετηθεί περισσότερο από όλα για την παραγωγή PHAs είναι το οξικό οξύ το οποίο οδηγεί στην παραγωγή ομοπολυμερούς PHB (Serafim et al., 2004). Όμως το ΡΗΒ είναι ένα ψαθυρό υλικό με υψηλό βαθμό κρυσταλλικότητας. Η ενσωμάτωση διαφορετικών μονομερικών ομάδων όμως, όπως μονάδων ΗV, έχει ως αποτέλεσμα την δημιουργία συμπολυμερών με βελτιωμένες μηχανικές ιδιότητες. Τα πτητικά λιπαρά οξέα που χρησιμοποιήθηκαν είναι το οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ καθώς και όλοι οι πιθανοί συνδυασμοί τους με συγκέντρωση 1 g/l από το καθένα. Επίσης χρησιμοποιήθηκε και γλυκόζη ως εναλλακτική πηγή άνθρακα για να πιστοποιηθεί αν η εμπλουτισμένη καλλιέργεια παράγει γλυκογόνο, το οποίο προβλέπεται να παράγεται από υδατανθρακικά υποστρώματα σύμφωνα με την βιβλιογραφία. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στην βέλτιστη αρχική τιμή ph= Η γνώση της επίδρασης του τύπου και της σύστασης των πτητικών λιπαρών οξέων που παρέχονται ως πηγές άνθρακα είναι εξαιρετικής σημασίας καθώς μπορεί να γίνει πρόβλεψη της σύστασης των PHAs συναρτήσει της σύστασης των VFAs. Με τον τρόπο αυτό είναι ικανός ο σχεδιασμός της διεργασίας προς παραγωγή πολυμερών τα οποία εμφανίζουν τις επιθυμητές ιδιότητες.

8 Στον πίνακα 6 συνοψίζονται οι κύριες κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι που χαρακτηρίζουν την παραγωγή των PHAs χρησιμοποιώντας διαφορετικές πηγές άνθρακα. Τα ποσοστά συσσώρευσης PHAs είναι αρκετά υψηλά σε όλες τις περιπτώσεις. Παρατηρούμε πως οι μέγιστοι συντελεστές απόδοσης που έχουν επιτευχθεί είναι 0.89 και 0.90 Cmmol PHAs/ Cmmol S και αφορά την χρήση του βουτυρικού οξέος και μίγματος προπιονικού και βουτυρικού οξέος αντίστοιχα. Λόγω της συνάφειας της δομής του βουτυρικού οξέως με την δομή του ΡΗΒ εκτός του υψηλού συντελεστή απόδοσης Y P/S η παρουσία του βουτυρικού οξέος οδηγεί και σε μεγαλύτερα ποσοστά συσσώρευσης PHAs. Όταν ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε γλυκόζη, από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια, δεν παρατηρήθηκε η παραγωγή γλυκογόνου αλλά μόνο PHAs ενώ σημειώθηκε ο χαμηλότερος συντελεστής απόδοσης Y P/S = 0.53 Cmmol PHAs/ Cmmol S. Β3. Επίδραση του λόγου C/N Οι συνθήκες περιορισμού σε άζωτο ή σε κάποιο άλλο βασικό για την κυτταρική ανάπτυξη συστατικό μπορεί να είναι δύσκολο να επιτευχθούν όταν ως εναλλακτικές πηγές άνθρακα χρησιμοποιηθούν υγρά απόβλητα. Πρόσφατες έρευνες υποδεικνύουν πως η παρουσία θρεπτικών συστατικών σε πλεόνασμα μπορεί να έχει αρνητική επίδραση στην ενδοκυτταρική συσσώρευση των PHAs (Johnson et al., 2010). Η διευκρίνιση τέτοιων φαινομένων είναι πολύ σημαντική για τον σχεδιασμό και την βελτιστοποίηση της διεργασίας παραγωγής PHAs. Αυτή η κατηγορία πειραμάτων έχει ως στόχο την λεπτομερή μελέτη της επίδρασης της παρουσίας πηγής αζώτου στο θρεπτικό μέσο που χορηγείται στην εμπλουτισμένη καλλιέργεια για την παραγωγή των PHAs. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος, από 1 g/l το καθένα. Έχει ήδη παρατηρηθεί από προηγούμενα πειράματα η συμπεριφορά της εμπλουτισμένης καλλιέργειας σε συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου, C/N. Επιπρόσθετα λοιπόν μελετάται η συμπεριφορά της σε συνθήκες περιορισμού αζώτου, C/N = 80 Cmmol/ Nmmol, C/N = 22 Cmmol/ Nmmol και περίσσειας αζώτου C/N = 11 Cmmol/ Nmmol τόσο παρουσία όσο και απουσία N- allylthiourea. Η χημική ένωση Ν-allylthiourea καταστέλλει την νιτροποίηση, δηλαδή την μετατροπή της αμμωνίας σε νιτρικά ιόντα. Επίσης κατά την διάρκεια των πειραμάτων καταγράφονταν τόσο οι συγκεντρώσεις του αμμωνιακού, νιτρικού, νιτρώδους αλλά και ολικού αζώτου. Στον πίνακα 7 συνοψίζονται οι κυριότερες κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι που περιγράφουν την παραγωγή PHAs σε διαφορετικούς λόγους C/N παρουσία (+) και απουσία (-) N-allylthiourea. Η απουσία N-allylthiourea στο θρεπτικό μέσο φαίνεται να οδηγεί σε μεγαλύτερα ποσοστά συσσώρευσης PHAs, μεγαλύτερους συντελεστές απόδοσης Y P/S και μικρότερους συντελεστές απόδοσης Y X/S συγκριτικά με τα αντίστοιχα πειράματα παρουσία N-allylthiourea. Αυτό το φαινόμενο οφείλεται στο ότι ένα μέρος της συγκέντρωσης του αμμωνιακού αζώτου οξειδώνεται προς παραγωγή νιτρικών και νιτρωδών ιόντων οπότε και δεν συμβάλει στην παραγωγή νέας βιομάζας. Φαίνεται πως ο περιορισμός πηγής αζώτου στο θρεπτικό μέσο που παρέχεται στην συγκεκριμένη καλλιέργεια ευνοεί τον σχηματισμό των PHAs και αυτό διαφαίνεται και από τα ποσοστά συσσώρευσης PHAs τα οποία αυξάνονται με την μείωση της συγκέντρωσης του αμμωνιακού αζώτου. Η μέγιστη παρατηρούμενη τιμή του ποσοστού συσσώρευσης σε PHAs αφορά τον λόγο C/N = και ανέρχεται σε 66.4 % g. Η μέγιστη τιμή του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης μ max παρατηρείται όταν στο θρεπτικό μέσο ο λόγος C/N ισούται με 22 τόσο παρουσία όσο και απουσία N-allythiourea. Οι τιμές που σημειώθηκαν είναι h -1 και h -1 αντίστοιχα. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία, ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μικτών καλλιεργειών που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή PHAs αγγίζει την τιμή 0.19 h -1 (Serafim et al., 2004). Β4. Ανάπτυξη και συντήρηση βιομάζας μέσω κατανάλωσης των ενδοκυτταρικών PHAs Σκοπός των πειραμάτων της συγκεκριμένης ενότητας είναι η μελέτη της συμπεριφοράς της εμπλουτισμένης καλλιέργειας όταν αναπτύσσεται καταναλώνοντας παράλληλα τα αποθηκευμένα PHAs και το εξωκυτταρικά παρεχόμενο άζωτο. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η κατανάλωση του ΡΗΒ και του PHBV παρουσία αμμωνιακού αζώτου με παράλληλη παρουσία αλλά και απουσία N-allylthoiurea στο θρεπτικό μέσο. Επίσης μελετήθηκε η κατανάλωση του ΡΗΒ και του PHBV από τα μικροβιακά κύτταρα για λόγους συντήρησης, δηλαδή υπό συνθήκες απουσίας πηγής αζώτου στο θρεπτικό μέσο. Στον πίνακα 8 συνοψίζονται οι κυριότερες κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι που περιγράφουν κατανάλωση των ενδοκυτταρικά συσσωρευμένων PHAs τόσο για λόγους ανάπτυξης της βιομάζας όσο και για λόγους συντήρησης της. Όπως είχε παρατηρηθεί και στα προηγούμενα πειράματα με διαφορετικούς λόγους C/N απουσία N-allylthiourea πραγματοποιείται πρώτα η οξείδωση του αμμωνιακού αζώτου και μετέπειτα η αφομοίωση του από την βιομάζα για ανάπτυξη νέων κυττάρων. Για τον λόγο αυτό το μέγιστο ποσοστό SND παρατηρείται κατά τις πρώτες ώρες των πειραμάτων. Παρουσία N-allylthioyrea η παραγωγή νέας βιομάζας πραγματοποιείται από την αρχή του πειράματος.

9 Πίνακας 6. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs χρησιμοποιώντας διάφορα υποστρώματα άνθρακα. Παράμετροι Οξικό οξύ Προπιονικό Βουτυρικό Οξικό και Οξικό και Προπιονικό και Οξικό, προπιονικό οξύ οξύ προπιονικό οξύ βουτυρικό οξύ βουτυρικό οξύ και βουτυρικό οξύ Γλυκόζη Χρονική διάρκεια S 32.8 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.2 Xi 27.4 ± ± ± ± ± ± ± ± 1.7 -q S, max q S, average q P,max q P,average Y P/S 0.72 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.01 fphas 0.49 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.01 fphb 0.49 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.01 fphv 0.00 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.00 % PHAs 43.1 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.1 % mol HB-% mol HV Πίνακας 7. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs σε διαφορετικούς λόγους C/N. Παράμετροι Περίσσεια αζώτου Περιορισμός αζώτου Περιορισμός αζώτου Απουσία αζώτου C/N= 11 C/N= 22 C/N= 80 C/N= Ν-allylthiourea Χρονική διάρκεια S ± ± ± ± ± ± ± 0.6 Xi 22.4 ± ± ± ± ± ± ± Ν-ΝΗ ± ± ± ± ± ± q S, max q S, average q P,max q P,average μ max μ average q Ν,max q Ν,average % απομάκρυνση Ν 86.7 ± ± ± ± ± ± % SND ± ± ± 0.5 -

10 Πίνακας 7. (Συνέχεια) Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι παραγωγής PHAs σε διαφορετικούς λόγους C/N. Παράμετροι Περίσσεια αζώτου Περιορισμός αζώτου Περιορισμός αζώτου Απουσία αζώτου C/N= 11 C/N= 22 C/N= 80 C/N= R SND Y X/S 0.26 ± ± ± ± ± ± Y P/S 0.13 ± ± ± ± ± ± ± 0.01 fphb 0.20 ± ± ± ± ± ± ± 0.02 fphv 0.03 ± ± ± ± ± ± ± 0.01 % PHAs 20.2 ± ± ± ± ± ± ± 1.3 % mol HB-% mol HV Πίνακας 8. Κινητικές και στοιχειομετρικές παράμετροι ενδοκυτταρικής κατανάλωσης και αποδόμησης PHAs. Κατανάλωση ενδοκυτταρικού ΡΗΒ Κατανάλωση ενδοκυτταρικού PΗΒV Ανάπτυξη Συντήρηση Ανάπτυξη Συντήρηση N-allylthiourea Χρονική διάρκεια S 26.2 ± ± ± ± ± ± 0.1 % mol HB-% mol HV Xi 47.6 ± ± ± ± ± ± Ν-ΝΗ ± ± ± ± q PHAs,max q PHAs,average μ max μ average q Ν,max q Ν,average Y X/S 0.70 ± ± ± ± 0.02 % απομάκρυνση Ν 58.4 ± ± ± ± % SND ± ± R SND kphb kphv * Χρονική διάρκεια: h, S: αρχική συγκέντρωση υποστρώματος (Cmmol/l), Xi: αρχική συγκέντρωση βιομάζας (Cmmol/l), N-NH + 4 : αρχική συγκέντρωση αμμωνιακού αζώτου (Nmmol/l), -q S : Cmmol S/Cmmol X h, q P : Cmmol PHAs/Cmmol X h, q N : Nmmol/Cmmol X h, μ: h -1, Y P/S : Cmmol PHAs/Cmmol S, Y X/S : Cmmol X/Cmmol S, fphas: Cmmol PHAs/Cmmol X, kphas: h -1, RSND: Nmmol/Cmmol X h, % PHAs: (g PHAs/g VSS) 100.

11 Παρατηρώντας τις τιμές των ειδικών ρυθμών κατανάλωσης υποστρώματος, που έχουν παρατηρηθεί σε προηγούμενα πειράματα (πίνακες 5, 6, 7), και συγκρίνοντας αυτές με τις τιμές του πίνακα 8 συμπεραίνουμε πως δεν υπάρχει ιδιαίτερη διαφορά μεταξύ της κατανάλωσης εξωκυτταρικής και ενδοκυτταρικής πηγής άνθρακα. Επίσης παρατηρούμε πως οι συντελεστές απόδοσης Y X/S είναι σχετικά υψηλοί και κυμαίνονται μεταξύ Cmmol X/ Cmmol PHAs, με τις υψηλότερες τιμές να σημειώνονται στην περίπτωση παρουσίας N-allylthiourea. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία ο μέσος συντελεστής ανάπτυξης των ετερότροφων μικροοργανισμών ισούται με ~ 0.5 Cmmol X/ Cmmol S (Third et al., 2003). Οι μικροοργανισμοί που επιδεικνύουν παρόμοιους ρυθμούς κατανάλωσης και συντελεστές απόδοσης κάνοντας χρήση είτε εξωκυτταρικής είτε ενδοκυτταρικής πηγής άνθρακα, χαρακτηρίζονται από ανταγωνιστικό πλεονέκτημα έναντι των υπολοίπων και κυριαρχούν στη μικτή καλλιέργεια. Ο ρυθμός κατανάλωσης των ενδοκυτταρικών PHAs είναι άμεσα συνδεδεμένος με το κλάσμα των PHAs στην βιομάζα, fphas και περιγράφεται από την παρακάτω εξίσωση πρώτης τάξης: dfphas kphas fphas dt Βάση των πειραμάτων υπολογίστηκαν οι τιμές του k που περιγράφει την αποδόμηση για λόγους ανάπτυξης του συνόλου των PHAs, kphas, κυμαίνονται μεταξύ h -1 ενώ οι τιμές του kphas για λόγους συντήρησης της βιομάζας διαφέρουν κατά μια τάξη μεγέθους, h -1. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία οι τιμές των kphas των συγκεκριμένων πειραμάτων είναι χαμηλότερες από αυτές που έχουν παρατηρηθεί (Beun et al., 2002). Όσον αφορά την περίπτωση κατανάλωσης ΡΗΒ και PHBV για λόγους συντήρησης της βιομάζας, οι τιμές των k είναι ακόμα χαμηλότερες λόγω της έλλειψης πηγής αζώτου. Ενδεχομένως οι μικροοργανισμοί να καταναλώνουν τα ενδοκυτταρικά συσσωρευμένα πολυμερή απουσία εξωκυτταρικού υποστρώματος για άλλες μεταβολικές διεργασίες πέραν την ανάπτυξης και της συντήρησης. Έχει αναφερθεί πως ο μικροοργανισμός Azotobacter vinelandii παράγει άλατα αλγινικού οξέος (Page et al., 2001) ενώ ο μικροοργανισμός Zooglea ramigera παράγει τον εξωπολυσακχαρίτη Zooglan (Lee et al., 1996). Η παραγωγή εξωπολυσακχαριτών από PHAs είναι πιθανή σε μικτές καλλιέργειες που υποβάλλονται σε αερόβιες δυναμικές συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο. Θα πρέπει να επισημανθεί πως κατά την κατανάλωση PHBV για λόγους ανάπτυξης παρουσία N- allylthiourea η αποδόμηση του HV κλάσματος φαίνεται να πραγματοποιείται με γρηγορότερο ρυθμό, k = h -1, έναντι του ΗΒ κλάσματος, k = h -1. Παρουσία N-allylthiourea οι αντίστοιχες τιμές των k που παρατηρούνται είναι σχεδόν ίσες. Ο ρυθμός κατανάλωσης του PHV έναντι του ΡΗΒ διαφοροποιείται πιθανότητα διότι απουσία N-allylthiourea το PHV προτιμάται ως πιο αποδοτικός δότης ηλεκτρονίων για ταυτόχρονης νιτροποίησης απονιτροποίησης. Γ. Ανάπτυξη μαθηματικού μοντέλου για την πρόβλεψη της παραγωγής των PHAs Με την βοήθεια του πακέτου λογισμικού MATLAB επιχειρήθηκε η ανάπτυξη ενός μαθηματικού μοντέλου το οποίο περιγράψει τις σχέσεις που συνδέουν την κατανάλωση και τον μετασχηματισμό των ανθρακικών υποστρωμάτων με την παραγωγή των PHAs. Ως δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν τα πειράματα που αφορούν την ενότητα Β2. Σκοπός του κινητικού μοντέλου είναι η σωστή διατύπωση των εκφράσεων τόσο της κατανάλωσης υποστρώματος όσο και της παραγωγής των PHB και PHV από το κάθε υπόστρωμα ξεχωριστά, δηλ. από το οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ. Μέσα από τις θεωρούμενες εκφράσεις και την μαθηματική προσομοίωση υπολογίζονται οι κύριες παράμετροι οι οποίες στην συνέχεια εφαρμόζονται για να περιγράψουν την συμπεριφορά της καλλιέργειας στα πειράματα όπου γίνεται ταυτόχρονη χρήση οξικού και βουτυρικού οξέος, οξικού και προπιονικού οξέος καθώς και προπιονικού και βουτυρικού οξέος. Τέλος, χρησιμοποιώντας το σύνολο των εκφράσεων και των παραμέτρων που έχουν προκύψει βάση του κινητικού μοντέλου, πραγματοποιείται πρόβλεψη όταν στην καλλιέργεια παρέχονται ταυτόχρονα και τα τρία οξέα. Το σύνολο των εκφράσεων που χρησιμοποιήθηκαν για την περιγραφή του μαθηματικού μοντέλου παρατίθενται παρακάτω: dsbu Sbu dqbu qbu x abu ( qbu, max qbu) dt Kbu Sbu dt (1) (2) dspr Spr Ks5 qpr, max x dt Kpr S pr Ks5 S dkdphv akd ( K ' dphv, max KdPHV, max) ac, prod. dt (3) (4) dsac Sac dqac Kac, bu Kac, pr qac x aac ( q' ac, max qac, max) dt Kac Sac dt Kac, bu S bu Kac, pr S pr (5) (6)

12 VSS (Cmmol/ l) PHB (Cmmol/ l) PHV (Cmmol/ l) Παραγόμενο οξικό οξύ (Cmmol/ l) Οξικό οξύ (Cmmol/ l) Προπιονικό οξύ (Cmmol/ l) Βουτυρικό οξύ (Cmmol/ l) dsacprod dqac Sacprod dqacprod dspr dqacprod Sbu x alpha3 ( qacprod max qacprod) dt dt Kac Sacprod dt dt dt Kbu Sbu (7) (8) SPHV dsphb Spr prod PHV Sbu Sac Sac YPHB / PHV akd S x x YPHB / bu qbu x YPHB / ac qac YPHB / acprod qacprod dt Kpr Spr SPHV Kbu Sbu Kac Sac Kac Sacprod KPHV SPHV x (9) SPHV dsphv Spr Spr PHV Sac Spr YPHV / pr qpr, max x akd S x x YPHV / ac pr, max qac qpr, max x dt Kpr Spr Kpr Spr SPHV ac ac pr pr KPHV K S K S SPHV x Sacprod Spr YPHV / acprod pr, max qacprod qpr, max x Kac Sacprod Kpr Spr (10) q' K' Y Y Όπου: Ks1 Ks3 q K S K S ac, max ac, max K dphv, max dphv, max Y PHB / ac PHB / ac, max Y PHV / pr PHB / pr, max s1 bu s3 pr K Kd, ac S d, ac K 3 K3 S pr K 4 K S acprod 4 acprod (11) (13) (15) (17) q' Y Y Ks2 Ks4 q K S K S bu, max bu, max Y PHB / bu PHB / bu, max Y PHB / PHV PHB / PHV, max s2 ac s4 pr K 2 K2 S ac K 3 K3 S pr (12) (14) (16) Βάση των εκφράσεων και των τιμών των εκτιμώμενων παραμέτρων που έχει προκύψει μέσω προσομοίωσης των πειραμάτων παραγωγής PHAs από οξικό, προπιονικό, βουτυρικό οξύ και τα μίγματα οξικού και βουτυρικού, οξικού και προπιονικού και τέλος προπιονικού και βουτυρικού οξέος έγινε πρόβλεψη της παραγωγής των PHAs από την εμπλουτισμένη καλλιέργεια χρησιμοποιώντας μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος. Τόσο τα πειραματικά αποτελέσματα όσο και η πρόβλεψη του μοντέλου απεικονίζονται στο σχήμα (α) Πρόβλεψη μοντέλου (β) Πειραματικά δεδομένα Πρόβλεψη μοντέλου (γ) Πειραματικά δεδομένα Πρόβλεψη μοντέλου (δ) Πειραματικά δεδομένα Πρόβλεψη μοντέλου Χρόνος (h) Χρόνος (h) Χρόνος (h) Χρόνος (h) Πειραματικά δεδομένα Πρόβλεψη μοντέλου (ε) Χρόνος (h) Πειραματικά δεδομένα Πρόβλεψη μοντέλου Χρόνος (h) Χρόνος (h) Σχήμα 1. Πειραματικά δεδομένα και πρόβλεψη του μοντέλου στην περίπτωση ταυτόχρονης κατανάλωσης οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος σε περιοριστικές για την ανάπτυξη συνθήκες λόγω απουσίας αζώτου. Συγκεντρώσεις (α) παραγόμενου οξικού οξέος βάση του μοντέλου, (β) οξικού οξέος, (γ) προπιονικού οξέος, (δ) βουτυρικού οξέος, (ε) βιομάζας (στ) πολύ-υδροξυβουτυρικού εστέρα, ΡΗΒ και (ζ) πολύ-υδροξυβαλερικού εστέρα,phv. Σύμφωνα με την προσομοίωση του κινητικού μοντέλου περιγράφονται ιδιαίτερα ικανοποιητικά τα προφίλ κατανάλωσης του βουτυρικού οξέος, η αύξηση της βιομάζας και η παραγωγή του PHV. (στ) Πειραματικά δεδομένα Πρόβλεψη μοντέλου (ζ)

13 Παρόλο που το προφίλ κατανάλωσης του προπιονικού οξέος υποδεικνύει πως πραγματοποιείται σε δύο φάσεις, μία από την αρχή έως την 15 η ώρα όπου και εξαντλείται το βουτυρικό οξύ και μία από το σημείο αυτό έως το τέλος του πειράματος με μεγαλύτερο ρυθμό, η πρόβλεψη γίνεται βάση ενός ενιαίου ρυθμού που παρουσιάζει μικρές σχετικά αποκλίσεις. Κατά την πρόβλεψη όμως τόσο της συγκέντρωσης του οξικού οξέος όσο και της συγκέντρωσης του παραγόμενου PHB δημιουργούνται προβλήματα. Παρά το γεγονός του ότι η πρόβλεψη διακρίνει την τάση της παραγωγής του ΡΗΒ οι πειραματικές μετρήσεις είναι μεγαλύτερες από τις συγκεντρώσεις που προβλέπει το μοντέλο. Η πρόβλεψη της συγκέντρωσης του ΡΗΒ κατά το τέλος του πειράματος σύμφωνα με το μοντέλο είναι περίπου 56 Cmmol/ l ενώ η αντίστοιχη πειραματική τιμή ανέρχεται στα 70 Cmmol/ l, εμφανίζοντας σφάλμα κατά 20 %. Στην περίπτωση της κατανάλωσης του οξικού οξέος παρόλο που είναι δυνατή η πρόβλεψη των αρχικών και τελικών πειραματικών σημείων, γεγονός το οποίο είναι αρκετά σημαντικό, η κατανάλωση του οξικού οξέος προβλέπεται πως πραγματοποιείται μέσω ενός σταθερού ρυθμού κατανάλωσης. Το συνολικό σφάλμα κατά την πρόβλεψη υπολογίζεται ως το άθροισμα των σφαλμάτων κατά την προσομοίωση του οξικού οξέος, του προπιονικού οξέος, του βουτυρικού οξέος, της βιομάζας, του ΡΗΒ και του ΡHV και στα δύο πειράματα και στην συγκεκριμένη περίπτωση ισούται με Δ. Παραγωγή PHAs από οξυνισμένου αποβλήτου ελαιοτριβείου μέσω αντιδραστήρα SBR Το υψηλό κόστος παραγωγής των PHAs οφείλεται κατά ένα μέρος στην χρήση υποστρωμάτων υψηλής καθαρότητας. Εάν οι συνθετικές πηγές άνθρακα αντικατασταθούν με υγρά κλάσματα αποβλήτων πλούσια σε οργανικό φορτίο το συνολικό κόστος παραγωγής των PHAs μπορεί να μειωθεί κατά %. Για την συνεχή παραγωγή των PHAs χρησιμοποιήθηκε αντιδραστήρας τύπου SBR όπως περιγράφτηκε στο πειραματικό μέρος. Κατά την λειτουργία του αντιδραστήρα SBR παρακολουθούνταν οι συγκεντρώσεις των ολικών (TSS) και πτητικών (VSS) αιωρούμενων στερεών, του αμμωνιακού αζώτου, του διαλυτού ΧΑΟ, των πτητικών λιπαρών οξέων (VFAs) και των ολικών (TSS) και πτητικών αιωρούμενων στερεών (VSS) στην αρχή και το τέλος των φάσεων ανάπτυξης και συσσώρευσης. Στον πίνακα 9 παρατηρούμε τα κύρια χαρακτηριστικά της διεργασίας. Τα ποσοστά συσσώρευσης που επετεύχθησαν κατά την διάρκεια της λειτουργίας του SBR αντιδραστήρα κυμαίνονταν από % g PHAs/ g VSS. Λόγω του σχηματισμού βιοφίλμ στον αντιδραστήρα εκτιμάται πως τα ποσοστά και οι αποδόσεις σε PHAs είναι μικρότερα από τα πραγματικά καθώς μέρος της βιομάζας που συμμετέχει στην συσσώρευση παραμένει προσκολλημένη στα τοιχώματα του αντιδραστήρα. Το μέγιστο ποσοστό συσσώρευσης, 8.94 % g PHAs/ g VSS, το οποίο παρατηρήθηκε κατά την φάση συσσώρευσης στον αντιδραστήρα SBR έρχεται σε συμφωνία με το αντίστοιχο ποσοστό, 8.84 % g PHAs/ g VSS, το οποίο επετεύχθη κατά την διάρκεια πειραμάτων διαλείποντος έργου χρησιμοποιώντας την εμπλουτισμένη καλλιέργεια και οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου. Η μόνη διαφορά έγκειται στην χρονική διάρκεια της διεργασίας η οποία στα πειράματα διαλείποντος έργου πραγματοποιήθηκε μέσα σε 60 ώρες ενώ στον αντιδραστήρα SBR σε 24 ώρες. Πίνακας 9. Χαρακτηριστικά της διεργασίας παραγωγής PHAs στον αντιδραστήρα SBR. Φάση ανάπτυξης Φάση συσσώρευσης % απομάκρυνση διαλυτού ΧΑΟ 47.8 ± ± 8.20 % κατανάλωση οξικού οξέος ± ± % κατανάλωση προπιονικού οξέος ± ± % κατανάλωση βουτυρικού οξέος ± ± % PHAs (g PHAs/ g VSS) Y PHAs/S (g ΧΑΟ/g ΧΑΟ) Κλάσμα HV (% mol) Τα ποσοστά συσσώρευσης που επετεύχθησαν κατά την διάρκεια της λειτουργίας του SBR αντιδραστήρα κυμαίνονταν από % g PHAs/ g VSS. Λόγω του σχηματισμού βιοφίλμ στον αντιδραστήρα εκτιμάται πως τα ποσοστά και οι αποδόσεις σε PHAs είναι μικρότερα από τα πραγματικά καθώς μέρος της βιομάζας που συμμετέχει στην συσσώρευση παραμένει προσκολλημένη στα τοιχώματα του αντιδραστήρα. Το μέγιστο ποσοστό συσσώρευσης, 8.94 % g PHAs/ g VSS, το οποίο παρατηρήθηκε κατά την φάση συσσώρευσης στον αντιδραστήρα SBR έρχεται σε συμφωνία με το αντίστοιχο ποσοστό, 8.84 % g PHAs/ g VSS, το οποίο επετεύχθη κατά την διάρκεια πειραμάτων διαλείποντος έργου χρησιμοποιώντας την εμπλουτισμένη καλλιέργεια και οξυνισμένο απόβλητο ελαιοτριβείου. Η μόνη διαφορά έγκειται στην χρονική διάρκεια της διεργασίας η οποία στα πειράματα διαλείποντος έργου πραγματοποιήθηκε μέσα σε 60 ώρες ενώ στον αντιδραστήρα SBR σε 24 ώρες.

14 Πέραν της λειτουργίας του συγκεκριμένου συστήματος για την παραγωγή PHAs η οποία αγγίζει περίπου το 9 % g PHAs/ g VSS παρατηρούμε, όπως είναι αναμενόμενο, μείωση του οργανικού φορτίου του αποβλήτου. Κατά την φάση της ανάπτυξης φαίνεται πως η απομάκρυνση του διαλυτού ΧΑΟ κυμαίνεται από 36.8 έως 58.8 % ενώ κατά την φάση της συσσώρευσης των PHAs κυμαίνεται από 24 έως περίπου 40 %. Πέραν των πτητικών λιπαρών οξέων, όπου όπως φαίνεται από την φάση ανάπτυξης εάν καταναλωθούν πλήρως οδηγούν στην απομάκρυνση του σχεδόν % του οργανικού φορτίου, στο απόβλητό περιέχεται επίσης ένα κλάσμα αλκοολών και διαλυτών υδατανθράκων τα οποία δεν φαίνεται να προτιμούνται προς κατανάλωση από την καλλιέργεια. Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα μας με την εργασία των Beccari κ.ά. (Beccari et al., 2009) βλέπουμε πως η τιμές τόσο του συντελεστή απόδοσης Y PHAs/S όσο και της % απομάκρυνση του ΧΑΟ είναι σχεδόν διπλάσιες. Εάν στην περίπτωση μας δεν υπήρχε σχηματισμός βιοφίλμ θα αναμένονταν καλύτερα αποτελέσματα τόσο όσον αφορά τον συντελεστή απόδοσης Y PHAs/S όσο και την % απομάκρυνση του ΧΑΟ. Βέβαια, το γεγονός αυτό δεν θα αναμένεται να δημιουργήσει πρόβλημα σε αντιδραστήρα πιλοτικής κλίμακας. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε μικτή καλλιέργεια εμπλουτισμένη σε ΡΗΑ συσσωρευτές χρησιμοποιώντας δραστική λάσπη. Στην συνέχεια, η εμπλουτισμένη καλλιέργεια χαρακτηρίστηκε ως προς τα κυρίαρχα στελέχη που την αποτελούν μέσω της τεχνικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR). Έξι διαφορετικά στελέχη απομονώθηκαν τα οποία βρέθηκαν να ανήκουν στο γένος Pseudomonas. Βάση προκαταρκτικών πειραμάτων κάτω από περιοριστικές συνθήκες η εμπλουτισμένη καλλιέργεια επιλέχθηκε έναντι των απομονωμένων στελεχών για την διεξαγωγή περαιτέρω πειραμάτων καθώς έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα σχετικά με την παραγωγή των PHAs. Τα περαιτέρω πειράματα που πραγματοποιήθηκαν αποσκοπούσαν στην μελέτη των βέλτιστων συνθηκών κάτω από την οποίες μεγιστοποιείται το ποσοστό συσσώρευσης σε PHAs, ο συντελεστής απόδοσης Y P/S, ο ειδικός ρυθμός κατανάλωσης υποστρώματος, q S και ο ειδικός ρυθμός παραγωγής PHAs, q P. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η επίδραση της τιμής του αρχικού ph, του τύπου της πηγής άνθρακα στην κατανομή και συσσώρευση των μεταβολικών προϊόντων καθώς και του λόγου C/N στο θρεπτικό μέσο. Παρατηρήθηκε πως, κάτω από συνθήκες C/N =, ph = 6.90 λαμβάνονται τα καλύτερα αποτελέσματα όταν χρησιμοποιείται μίγμα οξικού, προπιονικού και βουτυρικού οξέος, ενώ τα υποστρώματα που δίνουν τον μέγιστο συντελεστή απόδοσης Y P/S είναι το βουτυρικό οξύ και το μίγμα προπιονικού και βουτυρικού οξέος. Επίσης μελετήθηκε η ενδοκυτταρική κατανάλωση του PHB και του PHBV για λόγους είτε ανάπτυξης της βιομάζας είτε συντήρησης αυτής. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, οι τιμές των ειδικών ρυθμών κατανάλωσης υποστρώματος δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερη διαφορά μεταξύ της κατανάλωσης εξωκυτταρικής και ενδοκυτταρικής πηγής άνθρακα.επίσης παρατηρήθηκε πως οι συντελεστές απόδοσης Y X/S είναι σχετικά υψηλοί και κυμαίνονται μεταξύ Cmmol X/ Cmmol PHAs, με τις υψηλότερες τιμές να σημειώνονται στην περίπτωση παρουσίας N-allylthiourea. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία ο μέσος συντελεστής ανάπτυξης των ετερότροφων μικροοργανισμών ισούται με ~ 0.5 Cmmol X/ Cmmol S. Τα αποτελέσματα κρίνονται θετικά καθώς όταν οι μικροοργανισμοί επιδεικνύουν παρόμοιους ρυθμούς κατανάλωσης και συντελεστές απόδοσης κάνοντας χρήση είτε εξωκυτταρικής είτε ενδοκυτταρικής πηγής άνθρακα, χαρακτηρίζονται από ανταγωνιστικό πλεονέκτημα έναντι των υπολοίπων μικροοργανισμών και κυριαρχούν σε μια μικτή καλλιέργεια. Αυτό υποδεικνύει πως η μικτή καλλιέργεια είναι όντως εμπλουτισμένη με ΡΗΑ συσσωρευτές. Στην συνέχεια επιχειρήθηκε η ανάπτυξη μαθηματικού μοντέλου, με την βοήθεια του λογισμικού πακέτου MATLAB, το οποίο θα προβλέπει την κατανομή των ενδοκυτταρικών μεταβολικών προϊόντων (PHAs) καθώς και της κυριότερες παραμέτρους της διεργασίας παραγωγής των PHAs. Η μελέτη της επίδρασης της πηγής άνθρακα στην παραγωγή των PHAs είναι σημαντική διότι αναλόγως του τύπου του υποστρώματος που χρησιμοποιείται παράγονται συγκεκριμένες χημικές δομές PHAs. Τα πτητικά λιπαρά οξέα όπως το οξικό, προπιονικό και βουτυρικό οξύ αποτελούν τα κύρια προϊόντα της αναερόβιας χώνευσης υγρών αποβλήτων τα οποία είναι πλούσια σε οργανικό φορτίο με την μορφή υδατανθράκων. Τα απόβλητα αυτά μπορούν να αξιοποιηθούν έτσι ώστε σε πρώτο στάδιο να μετατραπούν σε πτητικά λιπαρά οξέα με ταυτόχρονη παραγωγή βιουδρογόνου και σε δεύτερο στάδιο το μίγμα των πτητικών λιπαρών οξέων μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα για την παραγωγή των PHAs. Ελέγχοντας παραμέτρους όπως η θερμοκρασία, το ph, τον υδραυλικό χρόνο παραμονής κ.ά. μπορούμε στο πρώτο στάδιο να προβλέψουμε την σύσταση των πτητικών λιπαρών οξέων ούτως ώστε στην συνέχεια να οδηγηθούμε στην παραγωγή PHAs που να εμφανίζουν τις επιθυμητές ιδιότητες. Το μοντέλο που αναπτύχθηκε φαίνεται να προβλέπει ιδιαίτερα ικανοποιητικά την πλειονότητα των πειραματικών δεδομένων παρουσιάζοντας κάποιες αποκλίσεις οι οποίες οφείλονται