ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΒΙΟ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΟΥ CROCUS sativus L. ΚΑΙ ΑΛΛΩΝ ΕΝ ΗΜΙΚΩΝ ΤΑΧΑ

Transcript

1 Πανε ιστήµιο Πατρών Σχολή Ε ιστηµών Υγείας Τµήµα Φαρµακευτικής Εργαστήριο Ενόργανης Φαρµακευτικής Ανάλυσης ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥ ΩΝ Φαρµακοχηµεία - Φυσικά Προϊόντα: Σχεδιασµός, Σύνθεση και Ανάλυση Βιοδραστικών ενώσεων ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΒΙΟ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΟΥ CROCUS sativus L. ΚΑΙ ΑΛΛΩΝ ΕΝ ΗΜΙΚΩΝ ΤΑΧΑ L. Crocus sativus ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΚΟΥΛΑΚΙΩΤΗ ΝΙΚΟΛΑΟΥ-ΣΤΑΥΡΟΥ (Α.Μ: 216) Χηµικού ΠΑΤΡΑ, ΙΟΥΝΙΟΣ 2009

2 Επιβλέπων καθηγητής Tσαρµπόπουλος Αντώνης (αναπληρωτής καθηγητής τµήµατος Φαρµακευτικής Πανεπιστηµίου Πατρών) Τριµελής Εξεταστική Επιτροπή Κορδοπάτης Παύλος (καθηγητής τµήµατος Φαρµακευτικής Πανεπιστηµίου Πατρών) Tσαρµπόπουλος Αντώνης (αναπληρωτής καθηγητής τµήµατος Φαρµακευτικής Πανεπιστηµίου Πατρών) Λάµαρη Φωτεινή (λέκτορας τµήµατος Φαρµακευτικής Πανεπιστηµίου Πατρών)

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Το πειραµατικό µέρος της παρούσας ερευνητικής εργασίας πραγµατοποιήθηκε στο εργαστήριο Ενόργανης Φαρµακευτικής Ανάλυσης του τµήµατος Φαρµακευτικής του Πανεπιστηµίου Πατρών στο χρονικό διάστηµα µεταξύ Οκτωβρίου 2006 και Μαΐου 2009, υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή Ενόργανης Φαρµακευτικής Ανάλυσης του τµήµατος Φαρµακευτικής του Πανεπιστηµίου Πατρών κ. Αντώνη Τσαρµπόπουλου. Η ερευνητική εργασία στα πλαίσια απόκτησης µεταπτυχιακού διπλώµατος ειδίκευσης είναι µια διαδικασία για την ολοκλήρωση της οποίας η µελέτη, η εργατικότητα και ο ενθουσιασµός δεν επαρκούν. παιτείται µεταξύ άλλων στωικότητα, υποµονή και συντονισµός διαφόρων ανθρώπων και παραµέτρων για την ολοκλήρωση της. Για το λόγο αυτό, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες µου σε ορισµένους ανθρώπους που στάθηκαν αρωγοί σε αυτή µου την προσπάθεια. Θέλω να αποδώσω ιδιαίτερες ευχαριστίες στον αναπληρωτή καθηγητή κ. Αντώνη Τσαρµπόπουλο, ο οποίος είχε την ευθύνη ανάθεσης του θέµατος και επίβλεψης της ερευνητικής εργασίας. Παρά τις αυξηµένες υποχρεώσεις του υπήρξε πάντοτε πρόθυµος να ακούσει τους προβληµατισµούς µου και να προτείνει εναλλακτικές, µεταδίδοντας παράλληλα την εµπιστοσύνη και την αισιοδοξία του. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον λέκτορα κ. Βαγγέλη Γκίκα ο οποίος πραγµατικά υπήρξε καταλύτης ώστε να πραγµατοποιηθεί αυτή η ερευνητική εργασία. Μου µετέδωσε την µεγάλη του θεωρητική και εργαστηριακή εµπειρία και υπήρξε πάντα δίπλα µου να ακούσει τους προβληµατισµούς µου και να µε συµβουλέψει κατάλληλα ώστε να ολοκληρωθεί αυτή η ερευνηυική εργασία. Ένα µέρος της ερευνητικής µου εργασίας πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Φαρµακογνωσίας και Χηµείας Φυσικών Προϊόντων και γι αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τόσο τον καθηγητή κ. Παύλο Κορδοπάτη όσο και την λέκτορα κ. Φωτεινή Λάµαρη, µέλη και οι δύο της εξεταστικής επιτροπής, για την ευγενική φιλοξενία στα εργαστήρια τους και την απλόχερη παραχώρηση των αναγκαίων µέσων για την απρόσκοπτη προώθηση της εργασίας. Με την λέκτορα κ. Φωτεινή Λάµαρη συνεργαστήκαµε στενά στην συγκεκριµένη διπλωµατική εργασία και πάντα υπήρξε πρόθυµη να ακούσει τα προβλήµατα µου και να προτείνει λύσεις οι οποίες ήταν καθοριστικές για την επίτευξη της. Ευχαριστώ επίσης τα µέλη της οµάδας του εργαστηρίου Φαρµακογνωσίας και Χηµείας Φυσικών Προϊόντων για την πρόθυµη συνεργασία τους και ιδιαίτερα την υποψήφια διδάκτωρ ήµητρα Χρυσάνθη µε την οποία συνεργάστηκα πολλές φορές για την συγκεκριµένη ερευνητική εργασία. Επίσης θα ήθελα να την ευχαριστήσω για την πολύτιµη εµπειρία που µου µετέδωσε καθώς και για την διαρκή της βοήθεια καθ όλη τη διάρκεια της ερευνητικής µου εργασίας.

4 Θα ήταν παράλειψη µου να µην ευχαριστήσω τον καθηγητή κ. Γρηγόριο Ιατρού, διευθυντή του τοµέα Βιολογίας Φυτών καθώς και ολόκληρη την επιστηµονική του οµάδα, που εργάστηκε σκληρά κάτω από αντίξοες συνθήκες για την απαιτητική διαδικασία της περισυλλογής κατά την περίοδο ανθοφορίας των φυτών, κατάταξης και διανοµής διάφορων στύλων των ενδηµικών taxa του γένους Crocus προς το εργαστήριο µας ώστε να καταστεί εφικτή η χηµική ανάλυση αυτών. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον υποψήφιο διδάκτωρ Γιάννη Καραµπά για την πρόθυµη και πολύτιµη βοήθεια του, ιδιαίτερα κατά τον εγκλιµατισµό µου στο εργαστήριο Ενόργανης Φαρµακευτικής Ανάλυσης, καθώς και όλα τα µέλη του εργαστηρίου που συνεργάστηκαν µαζί µου. Ευχαριστώ επίσης την οικογένεια µου, για τη διαρκή και πολύπλευρη στήριξη όλα αυτά τα χρόνια. Χωρίς τη δική τους συµπαράσταση και αρωγή, αυτή η διπλωµατική εργασία δε θα µπορούσε να είχε ολοκληρωθεί. Τέλος, προς την Επιτροπή Ερευνών του Πανεπιστηµίου Πατρών, εκφράζω τις ευχαριστίες µου για το οικονοµικό βοήθηµα που ελάµβανα στα πλαίσια του προγράµµατος Κ.Καραθεοδωρή Νικόλαος-Σταύρος Κουλακιώτης

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο Crocus sativus L.-Σαφράν Ιστορία - Μυθολογία Πιθανή ροέλευση του C. sativus Γένος Crocus Χηµική σύσταση Ανά τυξη του στύλου και συσσώρευση α οκαροτενοειδών Ξήρανση Χρήσεις του σαφράν Βαφική ύλη Άρτυµα Νοθείες Φαρµακευτικές ιδιότητες Τοξικότητα Νευρο ροστατευτική δράση Αντινεο λασµατική δράση Αντιοξειδωτική ικανότητα Οξυγόνωση Αντιλι ιδαιµική δράση.. 22 i

6 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ Εισαγωγή Ταξινόµηση των χρωµατογραφικών τεχνικών Χρωµατογραφία έκλουσης σε στήλη Ταχύτητες µετανάστευσης των διαλυµένων ουσιών Σταθερές κατανοµής Xρόνος κατακράτησης Ταχύτητα µετανάστευσης της διαλυµένης ουσίας: Παράγοντας κατακράτησης Σχετικές ταχύτητες µετανάστευσης: Παράγοντας εκλεκτικότητας Μέθοδοι για την εριγραφή της α οδοτικότητας της στήλης Θεωρία των λακών Εξίσωση van Deemter Όρος ολλα λότητας διαδροµών ροής (Α) Όρος διαµήκους διάχυσης (Β/u) Συντελεστές µεταφοράς µάζας ( CS και C M ) Ε ίδραση της ταχύτητας της κινητής φάσης στους όρους της εξίσωσης van Deemter Eφαρµογές της χρωµατογραφίας Ποιοτική ανάλυση Ποσοτική ανάλυση.. 46 ii

7 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Εισαγωγή Πεδίο εφαρµογών της ΗPLC Α οτελεσµατικότητα της στήλης στην υγρή χρωµατογραφία Η ε ίδραση του µεγέθους των σωµατιδίων του υλικού λήρωσης ιεύρυνση κορυφών στην υγρή χρωµατογραφία ου δεν οφείλεται στη στήλη Η ε ίδραση του µεγέθους του δείγµατος στην α όδοση της στήλης Οργανολογία υγρής χρωµατογραφίας οχεία κινητής φάσης και συστήµατα ε εξεργασίας διαλυτών Συστήµατα άντλησης Παλινδροµικές αντλίες Αντλίες εκτό ισης Πνευµατικές αντλίες Συστήµατα έγχυσης δείγµατος Στήλες υγρής χρωµατογραφίας Αναλυτικές στήλες Προστατευτικές στήλες Ανιχνευτές Τύ οι Ανιχνευτών Ανιχνευτές α ορρόφησης Ανιχνευτές α ορρόφησης µε φίλτρο στην υ εριώδη εριοχή Ανιχνευτές α ορρόφησης υ εριώδους µε µονοχρωµάτορες Ανιχνευτές α ορρόφησης υ ερύθρου Ανιχνευτές φθορισµού Ανιχνευτές φασµατοµετρίας µάζας 67 iii

8 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ Ε ΟΜΕΝΩΝ Αξιολόγηση αναλυτικών δεδοµένων Πληθυσµοί και δείγµατα Μέση τιµή ληθυσµού (µ) Τυ ική α όκλιση (σ) και µεταβλητότητα (σ 2 ) ληθυσµού Μέση τιµή δείγµατος ( x ) Σχετική τυ ική α όκλιση (RSD) και συντελεστής µεταβλητότητα (CV) Ε αναληψιµότητα Ακρίβεια Ευαισθησία Όριο ανίχνευσης υναµική εριοχή Βαθµονόµηση στις ενόργανες µεθόδους Καµ ύλες βαθµονόµησης Μέθοδοι γνωστής ροσθήκης Μέθοδος εσωτερικού ροτύ ου. 77 iv

9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΜΕΡΟΣ Σκο ός ι λωµατικής εργασίας Οργανολογία, Υλικά, Αντιδραστήρια Αντιδραστήρια ιαλύτες Οργανολογία Συλλογές Υ αίθρου Crocus biflorus ssp. Melantherus Crocus goulimyi Crocus laevigatus ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ανά τυξη Αναλυτικής Μεθοδολογίας Eισαγωγή Βελτιστο οίηση χρωµατογραφικών συνθηκών Eσωτερικό ρότυ ο Προκατεργασία των δειγµάτων ιαλύµατα Ανάλυση HPLC-DAD των στύλων του Crocus sativus L Ε ικύρωση της Μεθόδου Εισαγωγή Γραµµικότητα Ακρίβεια. 104 v

10 Όρια ανίχνευσης και Ποσοτικο οίησης Εφαρµογή Μεθόδου Στύλοι του Crocus sativus L. και η χρήση τους ως ρόφηµα Σύγκριση δεγµάτων εµ ορικού ελληνικού, συριακού και ισ ανικού saffron καθώς και κίτρινων στηµόνων του Crocus sativus L Ισ ανικό εµ ορικό σαφράν Συριακό εµ ορικό σαφράν Κίτρινοι στήµονες του Crocus sativus L Χηµική ανάλυση ενδηµικών taxa Eισαγωγή Crocus biflorus ssp. Melantherus Crocus goulimyi Crocus laevigatus ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 123 Βιβλιογραφικές αναφορές Βιογραφικό σηµείωµα vi

11 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο Kρόκος ο ήµερος (Crocus sativus Linneaus) ή ζαφορά ή σαφράνι, είναι ένα από τα σπάνια φαρµακευτικά, αρτυµατικά και µε µεγάλη χρωστική ικανότητα φυτά, που απαντάται από πολύ παλιά στην Ελλάδα. H δρόγη του Crocus sativus L. (saffron) είναι το υπέργειο µέρος του στύλου το οποίο έχει έντονη χρωστική ικανότητα και µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως βαφική ύλη, αποτελεί σηµαντικό άρτυµα και έχει φαρµακευτική δράση µε νευροπροστατευτικές, αντινεοπλασµατικές και αντιλιπιδαιµικές ιδιότητες. Το φυτό Crocus sativus L. (οικογένεια Iridaceae) σήµερα καλλιεργείται σε πολλές περιοχές του κόσµου όπως στην Ινδία, στο Ιράν, στην Κίνα στην Ισπανία, στην Ελλάδα κ.α Εδώ και περίπου 300 χρόνια ο Κρόκος Κοζάνης καλλιεργείται και αναπτύσσεται αποκλειστικά στο Νοµό Κοζάνης και κατατάσσεται στην πρώτη κατηγορία κρόκου βιολογικής καλλιέργειας στον κόσµο. Η υψηλή τιµή της δρόγης ευνοεί τη νοθεία της µε προσθήκη άλλων ειδών του γένους και µε ίνες από κολλώδιο και ζελατίνη που έχουν διασκευασθεί και χρωµατισθεί. Η νοθεία του κρόκου απασχόλησε και εξακολουθεί να απασχολεί σοβαρά το εµπόριο αυτού του προϊόντος. Έχει αναφερθεί ότι το 30 % του εµπορικού saffron δεν πληρεί τις προδιαγραφές ποιότητας κάνοντας επιτακτική την ανάγκη µιας αξιόπιστης αναλυτικής µεθοδολογίας για τον ποιοτικό έλεγχο των δειγµάτων του saffron. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη αναλυτικής µεθοδολογίας για τον προσδιορισµό και την ποσοτικοποίηση µερικών βιοδραστικών συστατικών του Crocus sativus L. (κροκίνες και πικροκροκίνη) των στύλων του Crocus sativus L. µε τη χρήση υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης µε ανιχνευτή υπεριώδουςορατού συστοιχίας φωτοδιόδων (Ηigh Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector, HPLC-DAD). Η αναπτυχθείσα αναλυτική µεθοδολογία περιελάµβανε τρία κύρια στάδια: 1. Προκατεργασία των δειγµάτων του Crocus sativus L. πριν την ανάλυση. 2. Κατασκευή καµπύλης βαθµονόµησης µε τη µέθοδο του εσωτερικού προτύπου (IS). 3. Επικύρωση της µεθόδου ( Method Validation) και συγκεκριµένα την εκτίµηση της γραµµικότητας (linearity), της ακρίβειας (precision), της ορθότητας (accuracy)και των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (Limit of Detection/Quantitation, LOD/LOQ). Η µεθοδολογία HPLC-DAD που αναπτύχθηκε επιτρέπει την αξιόπιστη ποσοτικοποίηση των υπό µελέτη βιοδραστικών συστατικών σε δείγµατα saffron. Η - 1 -

12 µέθοδος παρουσίασε καλή ευαισθησία, ακρίβεια, ορθότητα και γραµµικότητα για ευρεία δυναµική περιοχή καθώς και µικρό χρόνο ανάλυσης (περίπου 30 min) συγκρινόµενη µε παλιότερες δηµοσιευµένες µεθόδους. Από την εφαρµογή της µεθόδου για την µέτρηση δειγµάτων saffron συµπεράθηκε ότι οι ελληνικοί στύλοι του εµπορικού saffron (Cooperative De Safran, Kozani) είναι πλούσιοι στα υπό µελέτη βιοδραστικά συστατικά και περιείχαν µεγαλύτερες ποσότητες αυτών συγκρινόµενοι µε εµπορικά saffron από την Ισπανία και την Συρία. Επίσης χρησιµοποιήθηκε για την χαρτογράφηση βιοδραστικών συστατικών των στύλων σε άλλα ενδηµικά taxa του γένους Crocus και συνεπώς για την κατηγοροποίηση αυτών σύµφωνα µε την χηµική τους ανάλυση και σύγκριση τους ως προς το χηµικό περιεχόµενο των στύλων τους και των στύλων του καλλιεργούµενου Crocus. Sativus L. Συνεπώς η προτεινόµενη αναλυτική µέθοδος χρησιµοποιήθηκε για χαρτογράφηση και ποσοτικοποίηση των κύριων συστατικών του saffron και είναι ένα ιδανικό αναλυτικό εργαλείο για τον έλεγχο ποιότητας των δειγµάτων του saffron καθώς και για την χαρτογράφηση άλλων ενδηµικών taxa του γένους Crocus

13 ABSTRACT Crocus sativus L., a stemless perennial herb of the Iridaceae family, is cultivated in many areas of the Mediterranean region and South Asia (mainly in Iran, India, Greece, Morocco, Italy and Spain) for its red stigmas (style branches, commonly known as saffron) that are used for culinary purposes (spice, food colorant, and in alcoholic and non-alcoholic beverages) and are important ingredients in Mediterranean, Indian and Chinese diet. From ancient times saffron has been also used as a drug to treat various human health conditions. The worldwide saffron production is facing challenging tasks mainly due to the need for quality control and prevention of adulteration, which is especially important for human health. Chemical analysis of Crocus sativus L. styles has shown the presence of unusually polar carotenoids (crocins) that are mono-, di-, and triglycosydic esters of crocetin, a polyene dicarboxylic acid. Crocins (cis and trans glycosyl esters of crocetin) are the colouring components of saffron. The monoterpene aldehydes picrocrocin and its deglycosylated derivative, safranal formed in saffron during drying and storage by hydrolysis of the picrocrocin, are also important components of saffron, responsible of its bitter flavour and aroma, respectively. Saffron extract or its active constituents, crocetin and crocins, could be useful as a treatment for neurodegenative disorders accompanying memory impairment and it is a protective agent against chromosomal damage, a modulator of lipid peroxidation, and an antioxidant and detoxifying spice. Anticeptive and anti-inflammatory, as well as antiseizure, or reducing blood pressure effects have also been reported in animals. The aforementioned beneficial properties of Crocus sativus has made imperative the development of analytical methodologies for monitoring the quality control and batch adulteration, which is especially essential for human health. The goal of the research work was the development of a liquid chromatography diode array detector (HPLC-DAD) method for the quantification of bioactive substances (crocins and picrocrocin) from saffron samples. A simple, sensitive and specific high performance liquid chromatography (HPLC) has been developed in order to quantify simultaneously six major biologically active - 3 -

14 ingredients of Crocus sativus L. (saffron) namely trans-crocin-4, trans-crocin-3, trans-crocin-2, cis-crocin-4, cis-crocin-3 and picrocrocin. In addition, other extracts of styles of other Crocus taxa, endemic in Greece were analyzed and characterized using the aforementioned developed methodology. The developed analytical methodology included three main stages: 1. Pretreament of styles of Crocus sativus L. prior to analysis. 2. Construction of calibration curves with the method of internal standard (IS). 3.Method Validation) and particularly estimation of linearity, precision, accuracy and Limits of Detection/Quantitation, LOD/LOQ). The above chromatographic method demonstrated a high separation capability, high sensitivity, precision, accuracy and short analysis time (less than 30 min), compared to previously published methods. The proposed method could be used for monitoring and quantification of the major saffron components. It is an ideal analytical tool for quality control of saffron batches as well as the screening of styles of other Crocus taxa

15 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Crocus sativus L. -Σαφράν Το είδος Crocus sativus είναι γνωστό ως καλλιεργούµενο φυτό, το οποίο καλλιεργείται σε αρκετές ευρωπαϊκές και ασιατικές χώρες (Σχήµα 1 και 2). Η κύρια καλλιέργειά του γίνεται στη µεσογειακή περιοχή, συγκεκριµένα στην Ελλάδα, την Ισπανία, την Ιταλία και το Μαρόκο καθώς και στην Ινδία, το Ιράν, το Κασµίρ και το Αφγανιστάν. Η δρόγη του C. sativus, το γνωστό σαφράν, saffron, ζαφορά, είναι το υπέργειο µέρος του στύλου, το οποίο συνήθως είναι έντονα χρωµατισµένο, ενώ λανθασµένα µέχρι σήµερα αναφερόταν ως στίγµατα του στύλου. Το σαφράν διατίθεται στο εµπόριο σε αποξηραµένη µορφή µε τη µεγαλύτερη παραγωγή να πραγµατοποιείται στο Ιράν, την Ισπανία, την Ινδία και την Ελλάδα [1]. Το C. sativus είναι ένα φθινοπωρινό είδος και ένα τριπλοειδές στείρο φυτό µε χρωµοσωµατικό αριθµό 2n=3x=24. Μοιάζει µορφολογικά µε το C. cartwrightianus (2n=16) και η κύρια διαφορά τους βρίσκεται στο µέγεθος των ανθικών µερών. Το τριπλοειδές C. sativus έχει τέπαλα µήκους 3,5-5 cm και διακλαδώσεις του στύλου µήκους 2,5-3,2 cm, ενώ το C. cartwrightianus έχει τέπαλα µήκους 1,4-3,2 cm και διακλαδώσεις του στύλου µήκους (0,7-)1-2,7 cm. Στη φύση σχεδόν πάντα οι πολυπλοειδείς µορφές είναι µεγαλύτερες από τις διπλοειδείς Σχήµα 1. C. sativus L. Σχήµα 2. Άνθος του C. sativus L

16 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν 1.1 Ιστορία - Μυθολογία Ο Κρόκος σύµφωνα µε την ελληνική µυθολογία ήταν φίλος του θεού Ερµή. Μια µέρα καθώς έπαιζαν, ο Ερµής χτύπησε κατά λάθος τον φίλο του θανάσιµα στο κεφάλι. Τρεις σταγόνες αίµατος από τον άτυχο νέο έπεσαν στο κέντρο του λουλουδιού και δηµιούργησαν τους στύλους του φυτού που από τότε ονοµάστηκε κρόκος. Ο κρόκος αποτελούσε πολύτιµο φυτό κατά την αρχαιότητα, γεγονός που πιστοποιείται από αρχαιολογικά τεκµήρια. Οι πρώτες αναφορές για το φυτό προέρχονται από τη µινωική εποχή. Μια από τις ανάγλυφες αναφορές είναι η τοιχογραφία του «κροκοσυλλέκτη πίθηκου» που σκύβει για να προσφέρει λουλούδια κρόκου στη µινωίτισσα θεά. Η τοιχογραφία αυτή βρέθηκε στο βορειοδυτικό τµήµα του ανακτόρου της Κνωσού, στην «Οικία των τοιχογραφιών» και χρονολογείται περίπου στο 1500 π.χ. (Σχήµα 3). Επίσης δύο τοιχογραφίες στην «Ξέστη 3» του Ακρωτηρίου στη Θήρα είναι άλλη µια χειροπιαστή απόδειξη της θέσης του κρόκου στις θρησκευτικές δοξασίες και τις ντόπιες πρακτικές (Σχήµα 4). Η πρώτη απεικονίζει τρεις γυναίκες σε αγρό µε ανθισµένους κρόκους και ένα βωµό και η δεύτερη γυναίκες που µαζεύουν κρόκους και τους προσφέρουν σε καθιστή θεότητα πλαισιωµένη από πίθηκο και γύπα. Σχήµα 3. Απόσπασµα τοιχογραφίας από την "Οικία των Τοιχογραφιών" της Κνωσού π.χ. (Αρχαιολογικό Μουσείο Ηρακλείου) Σχήµα 4. Απόσπασµα τοιχογραφίας των κροκοσυλλεκτριών από το Ακρωτήρι.16 ος αιώνας π.χ. (Αρχαιολογικό Μουσείο Θήρας) - 6 -

17 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν Το µάζεµα του κρόκου δεν ήταν µια οποιαδήποτε καθηµερινή ασχολία. Ήταν γιορτή, προφανώς θεσµοθετηµένη στο επίσηµο εορτολόγιο και δρώµενο τελετουργικού και πιθανότατα µυητικού χαρακτήρα για τα νεαρά µέλη της κοινότητας. Η συλλογή του κρόκου στο προϊστορικό Ακρωτήρι ανατίθονταν αποκλειστικά σε γυναικεία χέρια και συνδεόταν µε το τελετουργικό πέρασµα από την παιδική ζωή στην ενηλικίωση των κοριτσιών. Στους µυκηναϊκούς χρόνους έχουµε αδιάψευστες µαρτυρίες της χρήσης και εµπορίας του φυτού από πήλινες πινακίδες Γραµµικής Β γραφής από το ανάκτορο της Κνωσού (σχήµα 5). Σ αυτές αναγράφονται ζυγισµένες ποσότητες κρόκου και συγκεκριµένα των στύλων του φυτού. Οι µικρές σχετικά καταγραφόµενες ποσότητες (3,6-500 g) δείχνουν την πολυτιµότητα των κόκκινων στύλων. Σχήµα 5. Σχεδιαστική απόδοση αποτµηµάτων πήλινων µυκηναϊκών πινακίδων µε επιγραφές Γραµµικής Β στις οποίες καταγράφονται ζυγισµένες ποσότητες κρόκου. (Αρχ. Μουσ. Ηρακλείου) 1.2 Πιθανή προέλευση του C. sativus Το C. sativus είναι ένα είδος που καλλιεργείται πάρα πολλά χρόνια. Η προέλευση του αποτελεί ένα θέµα που απασχολεί τους επιστήµονες χωρίς να υπάρχουν σαφή δεδοµένα γι αυτήν. Μελέτες συγκριτικής µορφολογίας, κυτταρολογίας και φαινολογίας [2,3] καταλήγουν στην υπόθεση ότι ο πιο πιθανός πρόγονος του C. sativus είναι το C. cartwrightianus Herb. ή το C. thomasii Ten. Η υπόθεση ότι το C. sativus προήλθε από το C. cartwrightianus τεκµηριώνεται από σύγχρονα δεδοµένα κυτοφθορισµοµετρικής ανάλυσης (flow cytometric analysis) του DNA [4] και ποσοτικής και ποιοτικής ανάλυσης DNA αποµονωµένου πυρήνα [5]

18 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν Οι Agayev (2002) και Castillo et al. (2005) [6,7] υποστηρίζουν την υπόθεση της αλλοπολυπλοειδικής προέλευσης του C. sativus. Σύµφωνα µε αυτή, το C. sativus έχει προέλθει αυθόρµητα στη φύση µέσω διασταύρωσης δύο στενά συγγενών ειδών µε n και 2n γαµέτες. Η υπόθεση αυτή υποστηρίζει τη διασταύρωση µεταξύ C. oreocreticus και C. cartwrightianus ή µεταξύ C. cartwrightianus και C. hadriaticus, τα οποία φύονται σε κοινές γεωγραφικές περιοχές ή µεταξύ C. pallasii ssp. pallasii και C. thomasii. Σύµφωνα όµως µε τους Frizzi et al. (2007) [8], η πιθανότητα να ισχύει αυτή η υπόθεση δεν είναι πολύ µεγάλη διότι και η καρυοτυπική ανάλυση και η χρωµοσωµική συµπεριφορά κατά τη διάρκεια της µείωσης οδηγούν στο συµπέρασµα ότι το C. sativus είναι πιο πιθανό να είναι ένα αυτοπολυπλοειδές παρά ένα αλλοπολυπλοειδές είδος. Επιπλέον, δεδοµένου του χρωµοσωµατικού αριθµού του C. pallasii ssp. pallasii (n=7), η διασταύρωσή του µε το C. thomasii (n=8) δε θα έδινε γένεση, µέσω της αλλοπολυπλοειδίας, σε τριπλοειδή άτοµα µε 24 χρωµοσώµατα. Τέλος, οι Frizzi et al. (2007) [8] θεωρούν ότι το στείρο τριπλοειδές C. sativus πιθανώς να προήλθε από αυτοπολυπλοειδία από υποτιθέµενο προγονικό είδος µε 2n=16. Το είδος αυτό φαίνεται να είναι το C. cartwrightianus, καθώς όλοι οι γενότυποι του C. sativus που µελετήθηκαν από τους Frizzi et al. (2007) µπορούν να προέλθουν από αυτοπολυπλοειδία από τους αντίστοιχους γενετικούς τόπους του C. cartwrightianus. 1.3 Γένος Crocus Το γένος Crocus (Iridaceae) εξαπλώνεται από τη Πορτογαλία και το Μαρόκο µέχρι τη υτική Κίνα και περιλαµβάνει περίπου 80 είδη. Η πλειονότητα, όµως, των ειδών είναι συγκεντρωµένη στη Βαλκανική χερσόνησο και στην Τουρκία, και µάλιστα στη βορειοανατολική Μεσόγειο. Το γένος είναι προσαρµοσµένο στα ξηρά καλοκαίρια και στους υγρούς χειµώνες που χαρακτηρίζουν το κλίµα της περιοχής [9]. Ένα χαρακτηριστικό που είναι σταθερό για τον προσδιορισµό των ειδών του κρόκου είναι τα 3 πεπλατυσµένα στίγµατα, τα οποία µπορεί να είναι ακέραια, οδοντωτά, δισχιδή ή πολυσχιδή (έως και 30 ή και 40 βραχίονες). Υπάρχουν ενδείξεις ότι τα τελευταία αποτελούν τους χρωµοπλάστες [10]

19 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν Άλλα στοιχεία που βοηθούν στον προσδιορισµό ενός κρόκου είναι: η περίοδος άνθησης (φθινόπωρο ή άνοιξη), ο χρόνος εµφάνισης των φύλλων (πριν, συγχρόνως ή µετά την εµφάνιση του άνθους), ο αριθµός τους, το µέγεθος, το σχήµα της διατοµής, η υφή των βολβών και άλλα ανατοµικά χαρακτηριστικά του φυτού. Κάποιες παράµετροι που λαµβάνονται υπόψη στην ποιότητα του φυτού είναι µεταξύ άλλων το µήκος και η ποσότητα των στιγµάτων, το περιεχόµενο υγρασίας στους 40 0 και C καθώς και το ποσοστό των πτητικών συστατικών [11]. 1.4 Χηµική σύσταση Οι αποξηραµένοι στύλοι του C. sativus (σαφράν) περιέχουν πικροκροκίνη (C 16 H 26 O 7 ), η οποία είναι ένας άχρωµος γλυκοζίτης της σαφρανάλης που αποτελείται από µονάδα D-γλυκόζης και το άγλυκο µόριο HTCC (2,6,6- τριµεθυλ-4-υδροξυ-1- καρβοξυ-αλδεϋδο-1-κυκλοεξάνιο). Η πικροκροκίνη (Σχήµα 9) είναι υπεύθυνη για την πικρή γεύση των στύλων του κρόκου. Ένα άλλο συστατικό του σαφράν είναι η σαφρανάλη (C 10 H 14 O), µια µονοτερπενική αλδεϋδη (Σχήµα 9), η οποία πιστεύεται ότι σχηµατίζεται κατά τη διάρκεια της ξηράνσεως των στύλων από την πικροκροκίνη [12] µε ενζυµατική ή όξινη υδρόλυση [13,14] (σχήµα 6). Αποτελεί το κύριο συστατικό του αιθέριου ελαίου, στο οποίο οφείλεται το χαρακτηριστικό άρωµα του σαφράν [15]. Στο αιθέριο έλαιο του σαφράν απαντώνται ακόµα η ιζοφορόνη και άλλα τερπενοειδή [15]. Σχήµα 6. Σχηµατισµός σαφρανάλης. (Lozano et al. 1999) - 9 -

20 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν Το σαφράν περιέχει επίσης σηµαντικές ποσότητες φλαβονοειδών, όπως η καιµπφερόλη (kaempferol) [16,17] (σχήµα 7) και η κερσετίνη (quercetin) (σχήµα 8). Σχήµα 7. Χηµικός τύπος καιµπφερόλης Σχήµα 8. Χηµικός τύπος κερσετίνης Tα κύρια συστατικά των στιγµάτων του Crocus sativus είναι οι cis και trans κροκίνες (Σχήµα 9), οι οποίες είναι γλυκοζιτικοί εστέρες του 8,8' διαποκαροτενιο- 8,8'- διοικoύ οξέος (diapocarotene-8,8'-dioic acid) ή αλλιώς κροκετίνης (crocetin). Η κροκετίνη (C 20 H 24 O 4 ) αποτελείται από 16 άτοµα άνθρακα C ενώ στις θέσεις C-2, C-6, και C-11, C-15 υπάρχουν διακλαδώσεις µε µεθύλια ( CH 3 ). Η εστεροποίηση της κροκετίνης (C 20 H 24 O 4 ) γίνεται είτε µε β-d-γλυκόζη, είτε µε β-d-γεντιοβιόζη. H κροκετίνη έχει είτε cis- είτε trans- διάταξη ανάλογα µε την αναστροφή του µορίου στη θέση C-8 (Σχήµα 9). Oι κροκίνες είναι ασυνήθιστα υδατοδιαλυτά καροτενοειδή ενώ αποτελούν τις σηµαντικές χρωστικές των στιγµάτων (4-6%) [18,19]. Το βασικό συστατικό είναι ο διγεντιοβιοζυλεστέρας της κροκετίνης (κροκίνη-4 ή α-crocin C 44 H 64 O 24 ). Οι κροκίνες είναι ασυνήθιστα υδατοδιαλυτά καροτενοειδή, λόγω της παρουσίας σακχάρων στο µόριό τους, οι οποίες εκτός από τους στύλους του C. sativus απαντώνται και στον καρπό του Gardenia jasminoides Ellis (οικογένεια Rubiaceae) [20-23]. Η δε κροκετίνη απαντάται και στα taxa Buddleja [24], Jacquinia angustifolia [25] και Coleus forskolii [26]

21 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν CH 3 CH 3 O OR 1 All trans OR O CH 3 CH 3 (Ι) CH 3 4 CH 3 O HOH 2 C 3 5 O OR 9 HO 1 8 CH 3 HO O OH 15 CH 13cis 12 3 CH 2 O O HO R 2 O HO O OH Z HO CH 2 O HO OH HOH 2 C O HO HO O OH CH 2 HO X HO HOH 2 C HO HO O OH Y O OH Χηµική δοµή κροκινών(crcs): γλυκοζυλεστέρες της κροκετίνης (Tarantilis et al. 1995) κροκίνη-5:r 1 =τρειςβ-d-γλυκοζυλ(ζ),r 2 =β-d-γεντιοβιοζυλ(χ) κροκίνη-4:r 1 =R2=β-D-γεντιοβιοζυλ(Χ) κροκίνη-3:r 1 =β-d-γεντιοβιοζυλ(χ),r 2 =β-d-γλυκοζυλ(ζ) κροκίνη-2:r 1 =β-d-γεντιοβιοζυλ(χ),r 2 =H κροκίνη-2':r 1 =R2=β-D-γλυκοζυλ(Ζ) κροκίνη-1:r 1 =β-d-γλυκοζυλ(ζ),r 2 =H κροκετίνη(crt):r 1 =R 2 =Η HO HOH 2 C O H 3 C CH 3 O H 3 C CH 3 O HO OH O Picrocrocin (ΙΙ) CH 3 CH 3 Safranal (ΙΙΙ) Σχήµα 9. Κύρια συστατικά του saffron (κροκίνες (Ι),, πικροκροκίνη (ΙΙ), σαφρανάλη (ΙΙΙ)). Τα νούµερα αριθµούν τις θέσεις των ατόµων του C στην σκελετική δοµή της κροκετίνης.η κροκετίνη (C 20 H 24 O 4 ) αποτελείται από 16 άτοµα άνθρακα C ενώ στις θέσεις C-2, C-6, C-11 και C-15 υπάρχουν διακλαδώσεις µε µεθύλια ( CH 3 ). H κροκετίνη έχει είτε cis- είτε trans-διάταξη ανάλογα µε την αναστροφή του µορίου στη θέση C

22 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν Οι στύλοι του κρόκου περιέχουν και άλλα καροτενοειδή όπως α-, β- και γ- καροτένια, ζεαξανθίνη και λυκοπένιο. Τα καροτενοειδή είναι έγχρωµες ενώσεις που απαντώνται στα ζωικό και φυτικό βασίλειο. Συντίθενται από φυτά και µικροοργανισµούς, ενώ τα ζώα και ο άνθρωπος τα λαµβάνουν µέσω της τροφής τους. Αποτελούν µαζί µε τις χλωροφύλλες τις επικρατέστερες χρωστικές στα φύλλα, ενώ απαντούν και στους χρωµοπλάστες και έτσι δίνουν στους καρπούς και τα άνθη κίτρινο και ερυθρό χρώµα. Τα καροτενοειδή χρησιµεύουν ως βοηθητικές χρωστικές στη φωτοσύνθεση. Απορροφούν ισχυρά στην κυανή περιοχή του φάσµατος ( nm) και λιγότερο στην πράσινη ( nm). Το φάσµα απορρόφησης τους έχει συνήθως 3 κορυφές και η θέση των µεγίστων εξαρτάται βασικά από την παρουσία πολλών συζυγιακών δεσµών. Τα καροτενοειδή των χλωροπλαστών έχουν διττό ρόλο στη φωτοσύνθεση, διότι αφ ενός απορροφούν φως και µεταβιβάζουν τη διέγερση στη χλωροφύλλη και αφ ετέρου προστατεύουν τη χλωροφύλλη από φωτοοξείδωση σε συνθήκες έντονου φωτισµού. Χηµικώς, τα καροτενοειδή είναι πολυένια µε 40 άτοµα άνθρακα. Η ανθρακική τους αλυσίδα αποτελείται από οκτώ µονάδες ισοπρενίου [CH 2 =C(CH 3 )-CH=CH 2 ]. Υποδιαιρούνται σε δύο κατηγορίες: τα καροτένια, τα οποία είναι καθαροί υδρογονάνθρακες (αποτελούνται µόνο από C και Η) και τις ξανθοφύλλες, οι οποίες είναι οξειδωµένες µορφές καροτενίων. Το κυριότερο καροτένιο των ανώτερων φυτών είναι το β-καροτένιο και οι πιο συχνές ξανθοφύλλες είναι η λουτείνη, η βιολαξανθίνη και η νεοξανθίνη. Τα καροτενοειδή είναι κατά κύριο λόγο λιποδιαλυτές ενώσεις. ιαλύονται σε οργανικούς διαλύτες όπως η ακετόνη, οι αλκοόλες, οι αιθέρες, το χλωροφόρµιο και ο οξικός αιθυλεστέρας. Απαντώνται κυρίως µε την trans διάταξη, η οποία θεωρείται σταθερότερη. Τα αποκαροτενοειδή (µεταβολίτες παράγωγων καροτενοειδών, carotenoidderived metabolites) συνιστούν µια σηµαντική οµάδα δευτερογενών µεταβολιτών και απαντώνται στους καρπούς και σε άλλα µέρη των φυτών ως γλυκοζίτες [27]. Τα αποκαροτενοειδή του σαφράν (κροκίνη, κροκετίνη και πικροκροκίνη) σχηµατίζονται από την αποικοδόµηση της ζεαξανθίνης [28]. Πρόσφατα αποµονώθηκαν δύο ένζυµα που εµπλέκονται στο σχηµατισµό αυτό: η διοξυγενάση κατάτµισης της ζεαξανθίνης του Crocus στις θέσεις 7,8(7,8 ) (crocus zeaxanthin 7,8(7,8 )-cleavage dioxygenase (CsZCD)), ένζυµο το οποίο ξεκινά τη βιογένεση της κροκετίνης και της

23 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν πικροκροκίνης [29] και το UDP-γλυκοζυλοτρανσφεράση από το Crocus sativus 2 (UDP-glucosyl transferase from Crocus sativus 2 (UGTCs2)), ένζυµο το οποίο µεταφέρει µόρια γλυκόζης (Glc) στην κροκετίνη [27]. Το ένζυµο διοξυγενάση κατάτµισης των καροτενοειδών του Crocus στις θέσεις 9,10(9,10 ) (crocus carotenoid 9,10(9,10 )-cleavage dioxygenase (CsCCD)) εµπλέκεται στη σύνθεση αρκετών µεταβολιτών παράγωγων καροτενοειδών [29]. 1.5 Ανάπτυξη του στύλου και συσσώρευση αποκαροτενοειδών Σύµφωνα µε τους Himeno & Sano (1987) [12], η συσσώρευση των αποκαροτενοειδών (κροκετίνη, κροκίνη, πικροκροκίνη) ακολουθεί την ανάπτυξη του στύλου του C. sativus. Στο αναπτυξιακό στάδιο Ι (άχρωµος στύλος) δεν εντοπίζονται οι δευτερογενείς µεταβολίτες κροκίνη, πικροκροκίνη, σαφρανάλη και HTCC. Στο αναπτυξιακό στάδιο ΙΙ (απαλός κίτρινος στύλος) εντοπίζονται µικρές ποσότητες κροκίνης και πικροκροκίνης. Από το αναπτυξιακό στάδιο ΙΙΙ προς το V που ο στύλος γίνεται βαθύ πορτοκαλί από κίτρινο, οι ποσότητες των κροκινών και της πικροκροκίνης αυξάνονται ταχέως. Στη συνέχεια από το στάδιο V στο VΙΙ (πορφυρός στύλος) οι ρυθµοί αύξησης των κροκινών και της πικροκροκίνης γίνονται αργοί. Ο λόγος της κροκίνης προς την πικροκροκίνη παραµένει σχεδόν σταθερός κατά τη διάρκεια των αναπτυξιακών σταδίων του στύλου. Επίσης, το β-καροτένιο και η ζεαξανθίνη αυξάνονται κατά 60,5% και 85%, αντίστοιχα, από το στάδιο ΙV στο στάδιο VII [7]. Από την άλλη πλευρά, η σαφρανάλη και το HTCC δεν ανιχνεύονται σ αυτά τα στάδια. Κατά την άνθηση (στάδιο VIII) σηµαντικές ποσότητες σαφρανάλης και HTCC εντοπίζονται, ενώ συγχρόνως µειώνεται η πικροκροκίνη. Οι δευτερογενείς αυτοί µεταβολίτες είναι οργανοειδικοί και δεν εντοπίζονται σε άλλα όργανα όπως φύλλα, ρίζες, κόρµοι, στήµονες και τέπαλα. Τα αποκαροτενοειδή του C. sativus φθάνουν τα µέγιστα επίπεδα λίγο πριν την άνθηση. Στο στάδιο αυτό, τα κύρια κατοτενοειδή που απαντώνται στο εκχύλισµα του στύλου είναι το β-καροτένιο και η ζεαξανθίνη. Ωστόσο, τα επίπεδα των καροτενοειδών στον αναπτυγµένο στύλο είναι κατά πολύ µικρότερα σε σχέση µε αυτά των αποκαροτενοειδών, γεγονός που υποδεικνύει µεγάλο ποσοστό µεταβολής στο µονοπάτι των καροτενοειδών. Ανάλυση σε στύλους των ειδών C. hadriaticus, C. cartwrightianus, C. imperati, C. goulimyi και C. sativus έδειξε ότι η συσσώρευση αποκαροτενοειδών

24 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν ακολουθεί την αύξηση της έκφρασης των γονιδίων CsCCD και CsZCD και ότι η ποσοτική και ποιοτική αλλαγή στα περιεχόµενα καροτενοειδή σχετίζεται µε τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου CsBCH1 (το ένζυµο CsBCH είναι υπεύθυνο για τη µετατροπή του β-καροτενίου σε ζεαξανθίνη) [7]. Τα επίπεδα έκφρασης του CsBCH1 στα τέπαλα, τους στήµονες και τις ρίζες των ειδών αυτών είναι αρκετά χαµηλά [7]. 1.6 Ξήρανση Τα ποιοτικά χαρακτηριστικά των αρτυµάτων, όπως και του σαφράν, έχουν άµεση σχέση µε τον τρόπο επεξεργασίας και αποθήκευσης µέχρι την τελική τους χρήση. Η επεξεργασία των αρτυµάτων είναι συχνά ατελής γι αυτό περιέχουν υψηλά επίπεδα µικροοργανισµών, επικίνδυνων για την πρόκληση τροφικών δηλητηριάσεων. Η σωστή ξήρανση ωστόσο των αρτυµάτων επιδρά σηµαντικά στην ποιότητά τους. Σύµφωνα µε τις οδηγίες του FAO (Fellows et al. 1995) [30], όσο µικρότερος είναι ο χρόνος ξήρανσης τόσο καλύτερη είναι η τελική ποιότητα του αρτύµατος. Η θερµοκρασία όµως δε µπορεί να είναι πολύ υψηλή καθώς προκαλεί αλλοιώσεις στο ξεχωριστό άρωµα και χρώµα των αρτυµάτων. Έτσι η ξήρανση πρέπει να γίνεται έως εκείνο το επίπεδο υγρασίας που δεν ευνοεί την ανάπτυξη µικροοργανισµών. Στη συνέχεια ο τύπος συσκευασίας εξαρτάται από το προϊόν, την αγορά για την οποία προορίζεται και τις κλιµατολογικές συνθήκες στις οποίες θα εκτεθεί. Στην περίπτωση του σαφράν ο τρόπος ξήρανσης ποικίλει από χώρα σε χώρα. Στην Ελλάδα, τα άνθη τοποθετούνται σε ειδικό τραπέζι που µε τη δηµιουργία αέρα από ηλεκτροκίνητους ανεµιστήρες διαχωρίζονται τα τέπαλα από τους στήµονες και τους στύλους [31]. Στη συνέχεια διαχωρίζονται οι εναποµείναντες στύλοι από τους στήµονες µε τα χέρια και ακολουθεί η ξήρανσή τους που αποτελεί την πιο βασική εργασία και απαιτεί πείρα, µεγάλη προσοχή και τέχνη. Η ξήρανση γίνεται µε την τοποθέτηση των νωπών στύλων σε λεπτά στρώµατα πάνω σε τελάρα µε δικτυωτή, συρµάτινη ή µεταξωτή βάση. Τα τελάρα µεταφέρονται σε θερµαινόµενα, σκοτεινά δωµάτια που θερµαίνονται µε θερµάστρες πετρελαίου, ξύλου ή κάρβουνου. Εκεί µε προοδευτικά ανερχόµενη θερµοκρασία έως 40 ο C οι στύλοι στεγνώνουν σε 8-12 h. Την επόµενη ηµέρα συσκευάζονται µέσα σε τενεκέδες ή πλαστικές σακούλες. Μετά την ξήρανση οι στύλοι (σαφράν) καθαρίζονται ακόµα µια φορά από τις ξένες ύλες. Ο καθαρισµός γίνεται από τους ίδιους τους παραγωγούς και διαρκεί ένα µε δύο µήνες. Το καθαρισµένο άρτυµα παραδίδεται στον Αναγκαστικό Συνεταιρισµό των

25 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν Κροκοπαραγωγών (Cooperative De Safran, Kozani, ιδρύθηκε το 1971) που αναλαµβάνει την αποθήκευση και εµπορία του προϊόντος. Στην Ινδία, το Ιράν και το Μαρόκο οι στύλοι ξηραίνονται στον ήλιο µε αποτέλεσµα να µειώνεται η χρωστική ικανότητα και να υποβαθµίζεται το προϊόν. Συγκεκριµένα, στην Ινδία οι στύλοι ξηραίνονται στον ήλιο για 3-5 ηµέρες µέχρι η σχετική υγρασία να µειωθεί στο 8-10% και στο Μαρόκο απλώνονται πάνω σ ένα κοµµάτι ύφασµα και ξηραίνονται στον ήλιο για 2 h ή στη σκιά για 7-10 ηµέρες και το τελικό προϊόν έχει υγρασία 5-20% [32]. Στην Ισπανία οι στύλοι τοποθετούνται σε λεπτές στιβάδες των 2-3 cm και στην Ιταλία σε σήτες µήκους 20 cm και ξηραίνονται πάνω από φωτιά µε ξυλοκάρβουνα [33]. Με την ξήρανση γίνονται εκείνες οι φυσικές, βιοχηµικές και χηµικές αλλαγές που οδηγούν στα επιθυµητά χαρακτηριστικά του σαφράν. To HTCC και η σαφρανάλη υπάρχουν σε µικρές συγκεντρώσεις στους νωπούς στύλους και ο βαθµός της συγκέντρωσής τους στο σαφράν εξαρτάται άµεσα από τις διαδικασίες ξήρανσης και αποθήκευσης [34]. Η διαδικασία της ξήρανσης παίζει σηµαντικό ρόλο και στην προστασία του αρτύµατος. Χαµηλές τιµές σχετικής υγρασίας, τουλάχιστον κάτω από 12%, τιµή σύµφωνα µε τον Inernational Standard ISO 3632 (1993) [35], διατηρούν την ποιότητα του σαφράν για µεγαλύτερο διάστηµα. Η µεγαλύτερη χρωστική ικανότητα του σαφράν παρατηρείται σε υψηλές θερµοκρασίες και χαµηλούς χρόνους [36,37]. Σύµφωνα µε τους Gregory et al. (2005) [36] µια µικρή αρχική περίοδος (20 min) ξήρανσης µε σχετικά υψηλή θερµοκρασία (µεταξύ ο C) που ακολουθείται από χαµηλότερη θερµοκρασία (43 ο C), δίνει σαφράν µε περιεκτικότητα σαφρανάλης 25 φορές µεγαλύτερη από ξήρανση σε χαµηλότερες θερµοκρασίες. Αυτές οι αυξήσεις στη συγκέντρωση της σαφρανάλης ενδεχοµένως να οφείλονται στην άµεση θερµική µετατροπή της πικροκροκίνης σε σαφρανάλη σ αυτές τις θερµοκρασίες (80-92 ο C), ενώ αντιτίθενται στο µονοπάτι της ενζυµικής µετατροπής µέσω του HTCC, καθώς, τα ένζυµα, όπως οι β-γλυκοσυδάσες αδρανοποιούνται στα φυτά όταν η θερµοκρασία ξεπεράσει τους 60 ο C και µετουσιώνονται στους 80 ο C. Επίσης, οι παραπάνω διαδικασίες ξήρανσης µε υψηλές θερµοκρασίες οδηγούν σε µεγαλύτερη διατήρηση των κροκινών απ ότι ξήρανση σε µέτριες θερµοκρασίες (46-58 ο C) [36]. Όσο µεγαλύτερη είναι η θερµοκρασία της διαδικασίας ξήρανσης για µικρό χρονικό διάστηµα, τόσο µεγαλύτερη είναι η αναλογία της trans-κροκίνης 4, ενώ µειώνονται οι trans-κροκίνη 3 και 2 [37]. Το γεγονός αυτό έρχεται σε συµφωνία µε την βιοσυνθετική υπόθεση που προτείνεται για το Gardenia jasmoides, σύµφωνα µε την οποία η trans-κροκίνη 2 και 2' και η cis

26 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν κροκίνη 2 είναι ενδιάµεσοι πρόδροµοι της κροκίνης 4 [38]. Εν αντιθέσει, η υπόθεση για το σαφράν προϋποθέτει ότι πρώτα βιοσυντίθεται η trans-κροκίνη 4 και οι υπόλοιπες κροκίνες προκύπτουν από την απώλεια ενός µορίου γλυκόζης ή γεντοβιόζης [39]. Οι Carmona et al. (2005) [37], εισάγουν µια νέα υπόθεση προκειµένου να εξηγήσουν την αύξηση των κροκινών και συγκεκριµένα της trans-κροκίνης 4 µε την αύξηση της θερµοκρασίας. Βάσει αυτής, τα καροτενοειδή βρίσκονται πιθανώς στον χρωµοπλάστη και η δοµή του, η οποία απαντάται µε διάφορες µορφές, καθορίζει την έκφραση και την ποιότητα του χρώµατος καθώς και την ευκολία µε την οποία απελευθερώνονται τα καροτενοειδή. Στο σαφράν ένα µεγάλο µέρος από δευτερογενείς µεταβολίτες (~20%) εντοπίζονται σ αυτούς τους χρωµοπλάστες, γι αυτό και οι υψηλές θερµοκρασίες που εφαρµόζονται κατά την ξήρανση µπορούν να διευκολύνουν την απελευθέρωση κροκινών και µάλιστα της trans-κροκίνης 4, η οποία εµφανίζει το µεγαλύτερο βαθµό γλυκοζυλίωσης και συµµετρίας. Σύµφωνα µε τους Caballero-Ortega et al. (2007) [40], οι οποίοι έκαναν ανάλυση HPLC για τα ενεργά συστατικά του σαφράν από 11 περιοχές, το ελληνικό σαφράν έχει τη µεγαλύτερη συγκέντρωση συστατικών (94,06 mg/g στύλου) και ακολούθως έρχονται τα σαφράν από την Ινδία, τη Νέα Ζηλανδία, την Ισπανία, τη Γαλλία, το Αζερµπαϊτζάν, την Ιταλία, την Τουρκία και το Ιράν. Βάσει της ίδιας µελέτης, το ελληνικό σαφράν έχει τις υψηλότερες συγκεντρώσεις των trans-κροκίνη 2, 2, cis-κροκίνη 4 και σαφρανάλης, το σαφράν της Νέα Ζηλανδίας έχει τις υψηλότερες συγκέντρωσεις των trans-κροκίνη 4 και 3, το σαφράν της Ινδίας έχει τη µεγαλύτερη συγκέντρωση της cis-κροκίνη 2 και το σαφράν της Τουρκίας τη µεγαλύτερη συγκέντρωση HTCC. Οι διαφορές αυτές στη χηµική σύσταση αντανακλούν το διαφορετικό τρόπο καλλιέργειας, ξήρανσης και αποθήκευσης του σαφράν σε κάθε χώρα καθώς και περιβαλλοντικές και γενετικές διαφορές. Τα δεδοµένα των Caballero-Ortega et al. (2007) [40] δε συµφωνούν µε τους Gregory et al. (2005) [36] και Carmona et al. (2005) [37], καθώς το ελληνικό σαφράν ενώ ξηραίνεται µε ανερχόµενη θερµοκρασία µέχρι 40 ο C (µέτρια θερµοκρασία) για 8-12 h (µεγάλος χρόνος) έχει τη µεγαλύτερη συγκέντρωση ενεργών συστατικών

27 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν 1.7 Χρήσεις του σαφράν Το σαφράν έχει έντονη χρωστική ικανότητα και µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως βαφική ύλη, αποτελεί σηµαντικό άρτυµα και έχει φαρµακευτική δράση µε νευροπροστατευτικές, αντινεοπλασµατικές και αντιλιπιδαιµικές ιδιότητες Βαφική ύλη Το σαφράν αν και κόκκινο συγκαταλέγεται στις κίτρινες χρωστικές διότι στις συγκεντρώσεις που συνήθως χρησιµοποιείται στα τρόφιµα δίνει τέτοια απόχρωση. Συνήθως 1 g της χρωστικής που περιέχει αρκεί για να µετατρέψει σε κίτρινη βαφή 100 kg νερό. Το χρησιµοποιούν για να βάφουν υφάσµατα και χαλιά, σε πολλές αγιογραφίες για να πετυχαίνουν ένα λαµπερό κίτρινο χρώµα καθώς και στις βιοµηχανίες σε µεγάλες ποσότητες για το βάψιµο και αρωµατισµό διαφόρων τροφίµων όπως τυροκοµικά προϊόντα, παρασκευάσµατα ζυµαρικών, κ.ά Άρτυµα Το σαφράν έχει επίσης αρτυµατική χρήση. Ανήκει στην κατηγορία των αρτυµάτων µε χρωστική ικανότητα µαζί µε τον κουρκουµά (Curcuma longa) και την πάπρικα (Capsicum annuum). Είναι ακριβό µπαχαρικό µε πικρή γεύση και χρησιµοποιείται σε µικρές ποσότητες, 2-3 ίνες. Για 1 kg σαφράν χρειάζονται άνθη. Στην Ελλάδα καλλιεργούνται περίπου 800 ha µε C. sativus, η µέση ετήσια παραγωγή σαφράν ανά ha είναι περίπου 8 kg/ha και η συνολική ετήσια παραγωγή είναι περίπου 6400 kg [31]. Χρησιµοποιείται πολύ λίγο στην ελληνική κουζίνα, ενώ είναι ευρύτατα γνωστό στον ευρωπαϊκό χώρο. Το µεγαλύτερο µέρος της παραγωγής του προϊόντος εξάγεται από την Ελλάδα, αποκοµίζοντας σηµαντικό συνάλλαγµα για τη χώρα Νοθείες Η υψηλή τιµή της δρόγης ευνοεί τη νοθεία της. Νοθεύεται µε προσθήκη άλλων ειδών του γένους και µε ίνες από κολλώδιο και ζελατίνη που έχουν διασκευασθεί και χρωµατισθεί. Μέσα που προσαυξάνουν το βάρος όπως νερό, σάκχαρα και άλατα είναι δύσκολο να εντοπισθούν. Επίσης απαραίτητος είναι ο

28 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν προσδιορισµός της υγρασίας (έως 12%), της περιεκτικότητας σε τέφρα (5-6,5%) και της χρωστικής ικανότητας (0,01 g πρέπει να χρωµατίζουν σαφώς 3 L νερού) [42]. 1.8 Φαρµακευτικές ιδιότητες Οι στύλοι του C. sativus χρησιµοποιούνται και ως θεραπευτικό µέσο. Η λαϊκή κρητική θεραπευτική χρησιµοποιούσε τα άνθη του φυτού σε µατζούνια µε αφροδισιακές, καρδιοτονωτικές και ευστοµαχικές ιδιότητες. Ο µέγας φαρµακογνώστης ιοσκουρίδης στο Περί Ύλης Ιατρικής (1 ος αιώνας) [43] γράφει: «έχει δυνατότητες πεπτικές, µαλακτικές, προκλητικές κάπως στυφής γεύσης, διουρητικές δίνει καλό χρώµα και προλαµβάνει τη ναυτία, αν πίνεται µε γλυκό, και σταµατάει τον κατάρρου οφθαλµών, αν αλείφεται σε συνδυασµό µε γάλα γυναικείο. Ανακατώνεται και µε όσα πίνουµε µε χρήσιµο τρόπο και µε αλοιφές και καταπλάσµατα στη µήτρα και στον «δακτύλιο». Βοηθάει και τις σεξουαλικές σχέσεις και µε επάλειψη καταπραΰνει τις ερυσιπελατώδεις φλεγµονές και είναι χρήσιµος για παθήσεις των αυτιών. Λεν ότι κάνει και ζηµιά, αν πίνεται µε νερό ποσότητα τριών «δραχµών». Για να τρίβεται εύκολα, πρέπει να ξεραίνεται στον ήλιο µέσα σε πήλινο καινούργιο ζεστό αγγείο και πρέπει γρήγορα να το γυρίζουµε. Η ρίζα του, αν την πίνουµε µε γλυκό, είναι ουροποιητική». Κατά το Μεσαίωνα είχε εκδοθεί βιβλίο 300 σελίδων το Crocologia, το οποίο έδινε οδηγίες για την αντιµετώπιση ασθενειών µέσω του σαφράν [44] Τοξικότητα Ο βαθµός τοξικότητας του κρόκου θεωρείται χαµηλός. Οι Nair et al. (1991) [45] αναφέρουν ότι το LD 50 εκχυλίσµατος σαφράν (χορηγούµενο ως αφέψηµα) σε ποντίκια ήταν µεγαλύτερο από 600 mg/kg βάρους σώµατος. Η χρήση δε εκχυλίσµατος σαφράν από το στόµα σε δόσεις από 0,1 έως 5 g/kg απεδείχθη µη τοξική για τα ποντίκια [18] Νευροπροστατευτική δράση Τα τελευταία χρόνια έχει αυξηθεί ο αριθµός των βιβλιογραφικών αναφορών για τη δράση των συστατικών του C. sativus σε νευροεκφυλιστικές νόσους

29 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν Πειράµατα σε ποντίκια έδειξαν ότι το σαφράν αντιστρέφει τις διαταραχές µνήµης και µάθησης που προκαλούνται από τη λήψη αιθανόλης [46, 47] Πειράµατα σε κυτταρικές καλλιέργειες έδειξαν ότι αναστέλλει τον θάνατο των νευρώνων όταν αυτός προκαλείται από συγκεκριµένα ερεθίσµατα. Το σαφράν εµποδίζει την παρακινούµενη από το TNF-α απόπτωση των κυττάρων PC12 που έχουν διαφοροποιηθεί σε νευρώνες [48] και προστατεύει τους νευρώνες από την νευροτοξική δράση του 6-hydroxydopamine [49]. Πειράµατα σε ποντίκια έδειξαν ότι η κροκετίνη προστατεύει τους νευρώνες από οξειδωτική βλάβη που εµφανίζεται στη νόσο του Parkinson [49]. Κλινικές µελέτες τονίζουν ότι το σαφράν ίσως µπορεί να χρησιµοποιηθεί στην θεραπεία της ήπιας έως µέτριας κατάθλιψης [50]. Τέλος, το σαφράν µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την αντιµετώπιση της νόσου του Alzheimer. Σύµφωνα µε τους Papandreou et al. (2006) [51], το εκχύλισµα των στύλων του C. sativus παρουσίασε υψηλή αντιοξειδωτική δράση καθώς και σηµαντική δοσο- και χρονο-εξαρτώµενη ανασταλτική επίδραση στη δηµιουργία ινιδίων της Αβ (~80% σε συγκεντρώσεις 0,1 mg ξηρό βάρος εκχυλίσµατος/ml). Την ανασταλτική ικανότητα στη συσσωµάτωση της Αβ τη διατηρεί και η trans-κροκίνη 4 και η διµεθυλοκροκετίνη. Ωστόσο, η trans-κροκίνη 4, προκαλεί αναστολή της συσσωµάτωσης της Αβ ακόµα και σε χαµηλότερες συγκεντρώσεις (0,015 mg/ml) από αυτές της διµεθυλο-κροκετίνης, δηλώνοντας έτσι ότι η δράση των καροτενοειδών ενισχύεται από την παρουσία σακχάρων Αντινεοπλασµατική δράση Η δράση τόσο του ολικού εκχυλίσµατος του σαφράν όσο και των µεµονωµένων συστατικών του έχει µελετηθεί σε διάφορους τύπου καρκίνου [52]. Η πρώτη αναφορά για την αντικαρκινική δράση του εκχυλίσµατος σαφράν δηµοσιεύθηκε το 1991 (Nair et al. 1991) [45]. Η µελέτη αυτή έδειξε ότι η χορήγηση εκχυλίσµατος σαφράν από το στόµα σε ποντίκια προκαλεί µια δοσο-εξαρτώµενη αναστολή της ενδοπεριτονιακής αύξησης από ασκίτη από σάρκωµα-180 (S-180), ασκίτη από καρκίνωµα του Ehrlich (EAC) και ασκίτη από λέµφωµα Dalton (DLA). Στις ανθρώπινες καρκινικές σειρές HeLa (καρκίνωµα του τραχήλου της µήτρας) και Α549 (καρκίνωµα του πνεύµονα) (Πίνακας 1) η κροκετίνη παρουσίασε

30 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν µια δοσο-εξαρτώµενη ανασταλτική δράση στη σύνθεση DNΑ, RNA και πρωτεϊνών και κατέστειλε τη δράση της RNΑ πολυµεράσης ΙΙ [53]. Οι Tarantilis et al. (1994a) έδειξαν ότι τα καροτενοειδή του σαφράν αναστέλλουν τον πολλαπλασιασµό αλλά ταυτόχρονα προάγουν τη διαφοροποίηση των καρκινικών κυττάρων HL-60 (Πίνακας 1), τα οποία ελήφθησαν από ασθενή µε χρόνια προµυελογενή λευχαιµία. Οι Chryssanthi et al. (2007) [54] µελέτησαν τη δράση τόσο του ολικού εκχυλίσµατος των στύλων του C. sativus και των ελληνικών ενδηµικών taxa C. boryi ssp. tournefortii, C. boryi ssp. boryi και C. niveus όσο και των µεµονωµένων συστατικών των στύλων του C. sativus στα καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα του µαστού MCF-7 και MDA-MB-231. Η επώαση των κυττάρων µε το ολικό εκχύλισµα των taxa έδειξε µια δοσο-εξαρτώµενη ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασµό τους. Συγκεκριµένα, τη µεγαλύτερη ανασταλτική δράση παρουσίασε το taxon C. boryi ssp. boryi και για τους δύο τύπους κυττάρων. Ως προς τα MDA-MB-231 κύτταρα, το εκχύλισµα των στύλων του C. sativus εµφάνισε τη µικρότερη ανασταλτική δράση. Ακολούθως και η επώαση των κυττάρων µε trans-κροκίνη 4 (~10% του ολικού εκχυλίσµατος του σαφράν) έδειξε µια δοσο-εξαρτώµενη ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασµό τους. Η ανασταλτική δράση του εκχυλίσµατος των στύλων του C. sativus δεν οφείλεται µόνο σ ένα καροτενοειδές, αλλά µάλλον αποδίδεται στη συνεργιστική δράση όλων των περιεχόµενων φυτοχηµικών συστατικών. Ο ακριβής µηχανισµός της αντικαρκινικής δράσης του σαφράν δεν είναι ακόµα γνωστός. Έχουν προταθεί διαφορετικές υποθέσεις σχετικά µε τις ιδιότητες του σαφράν και των συστατικών του που σχετίζονται µε την καρκινογένεση και τη δηµιουργία όγκων. Κάποιες απ αυτές τις υποθέσεις [18] αφορούν α) την περιοριστική επίδραση στη σύνθεση κυτταρικού DNA και RNA, β) την περιοριστική επίδραση στις αλυσιδωτές αντιδράσεις των ελεύθερων ριζών, γ) τη µεταβολική αλλαγή φυσικών καροτενοειδών σε ρετινοειδή, αν και πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η µετατροπή των καροτενοειδών σε βιταµίνη Α δεν είναι προϋπόθεση για αντικαρκινική δράση και δ) την αλληλεπίδραση των καροτενοειδών µε την τοποϊσοµεράση ΙΙ, ένα ένζυµο που σχετίζεται µε την κυτταρική αλληλεπίδραση DNA-πρωτεϊνών. Τα καροτενοειδή, τα οποία είναι γνωστά ως προβιταµίνες Α παρουσιάζουν τις ίδιες αντιοξειδωτικές ιδιότητες µε τη βιταµίνη Α, έχοντας και τα ίδια προβλήµατα

31 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν τοξικότητας. Η βιταµίνη Α και τα ρετινοειδή παράγωγά της αν και υπάρχουν σε µικρές ποσότητες στα φυσικά συστατικά της διατροφής µας, παρουσιάζουν µια ξεκάθαρη αντικαρκινική δράση. Το µεγάλο πρόβληµα της βιταµίνης Α και των παραγώγων της είναι η τοξικότητά τους, όταν χρησιµοποιούνται σε µεγάλες ποσότητες. Επειδή είναι λιπόφιλες ενώσεις συσσωρεύονται στο ήπαρ και προκαλούν παρενέργειες. Το all-trans και το 13-cis ρετινοϊκό οξύ, τα οποία είναι σύνθετα παράγωγα της βιταµίνης Α, δεσµεύονται κατά τρόπο µη ειδικό, γι αυτό και η περίσσειά τους δε δηµιουργεί µεγάλα προβλήµατα τοξικότητας. Αναµένεται όπως και στην περίπτωση του all-trans και 13-cis ρετινοϊκού οξέος, τα παράγωγα των γλυκοζυλεστέρων της κροκετίνης να εµφανίζουν µειωµένη τάση συσσώρευσης στο ήπαρ, χωρίς να χάνουν καθόλου από τις αντικαρκινικές και διαφοροποιητικές τους ιδιότητες [55]. Πίνακας 1: Κυτταροτοξική (IC 50 ) επίδραση του saffron και των συστατικών του σε κυτταρικές σειρές in vitro. Πηγή: Abdullaev FI Cancer Chemopreventive and Tumoricidal Properties of Saffron (Crocus sativus L.), Exp Biol Med (Maywood), 227(1):20-5, Jan 2002 Ουσίες Κυτταρικές σειρές IC 50 * Ολικό εκχύλισµα S-180, EAC, DLA, P388, οστεοσάρκωµα, σάρκωµα των ωοθηκών 7-30 µg/ml Ολικό εκχύλισµα HeLa, A549, WI-38VA µg/ml Ολικό εκχύλισµα A-204, HepG-2, SW µg/ml Ολικό εκχύλισµα HeLa 2.3 mg/ml Κροκετίνη HL-60, K562 2 µm ιµεθυλoκροκετίνη HL-60, K µm Κροκίνη HL-60, K562, HeLa, HT-29 2 µm, 3 mm, 0.4 mm και 1 mm αντίστοιχα Σαφρανάλη HeLa 0.8 mm Πικροκροκίνη HeLa 3 mm * IC 50 = ποσότητα που προκαλεί το 50% της αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασµού

32 Κεφάλαιο 1 C. sativus L. - Σαφράν Αντιοξειδωτική ικανότητα Το οξειδωτικό στρες είναι µια από τις κύριες αιτίες για την γήρανση και την ανάπτυξη πολλών νευροεκφυλιστικών ασθενειών όπως η νόσος Alzheimer. Επίσης έχει θεωρηθεί ότι εµπλέκεται στην αθηροσκλύρυνση καθώς και σε διάφορους τύπους νεοπλασµατικών ασθενειών. Για το λόγο αυτό υπάρχει αυξανόµενο ενδιαφέρον για τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες αρκετών φυτών, εκχυλισµάτων και διατροφικών συµπληρωµάτων. Ιδιαίτερη αναφορά γίνεται στις αντιοξειδωτικές ικανότητες του εκχυλίσµατος των στιγµάτων του C. sativus. Έρευνες έχουν οδηγήσει στο συµπέρασµα ότι µετά από χορήγηση του τελευταίου τα κύτταρα προστατεύονται από πιθανό οξειδωτικό στρες [56]. Ύστερα από πειράµατα που έγιναν σε ηπατοκύτταρα αρουραίων, η προστασία αυτή των κυττάρων και η αντιοξειδωτική δράση αποδόθηκε στην κροκετίνη [57]. Συγκεκριµένη µελέτη η οποία έγινε σε 20 άτοµα τα οποία κατανάλωναν δύο φορές ηµερησίως 50 mg saffron διαλυµένα σε 100 ml γάλα, έδειξε σηµαντική µείωση της οξείδωσης των λιποπρωτεϊνών [58] Οξυγόνωση In vitro και in vivo πειράµατα έδειξαν ότι η κροκετίνη προωθεί τη διείσδυση του οξυγόνου σε διάφορα είδη ιστών και βοηθά στην διαδικασία οξυγόνωσης. Συγκεκριµένα παρατηρήθηκε αύξηση της οξυγόνωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών αγγείων, των µυών και του φλοιού του εγκεφάλου καθώς και σηµαντική βελτίωση σε πειραµατόζωα τα οποία είχαν πάθει αιµορραγικό shock ή έπασχαν από εµφύσηµα [59]. In vivo πειράµατα που έγιναν σε αρουραίους, έδειξαν ότι πιθανότατα η δράση αυτή οφείλεται στην κροκετίνη η οποία βελτιώνει την διάχυση του οξυγόνου µέσω των υγρών του οργανισµού, όπως το πλάσµα [57] Αντιλιπιδαιµική δράση Έρευνες που διεξήχθησαν από διάφορες ερευνητικές οµάδες, απέδειξαν ότι το εκχύλισµα του σαφράν έχει αντιλιπιδαιµική δράση [57, 61], η οποία µπορεί να βοηθήσει στην πρόληψη της αρτηριοσκλήρωσης. Υπεύθυνο συστατικό για το φαινόµενο αυτό βρέθηκε ότι είναι η κροκετίνη. Κάνοντας ενδοµυϊκές ενέσεις διαλύµατος κροκετίνης σε κουνέλια τα οποία διατρέφονταν µε τροφή εµπλουτισµένη µε χολιστερίνη παρατηρήθηκε σηµαντική µείωση των επιπέδων χοληστερίνης στο πλάσµα. Επίσης, ο σχηµατισµός