ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

Transcript

1 ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Δρ. Νικόλας Φωκιαλάκης Επίκουρος Καθηγητής Τομέα Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων

2 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ

3

4 HPLC system

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΟΙΟΤΙΚΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

16

17 Ποσοτικοί προσδιορισμοί 1. Μέθοδος της καμπύλης αναφοράς 2. Τεχνική του ενός σημείου 3. Μέθοδος της γνωστής προσθήκης

18

19 Μέθοδος της καμπύλης αναφοράς Για την αξιολόγηση της γραμμικότητας μιας μεθόδου κατασκευάζεται καμπύλη αναφοράς με αναλύσεις τουλάχιστον 5 διαφορετικών συγκεντρώσεων. Η συσχέτιση μεταξύ του μετρούμενου σήματος (απορρόφηση) και της συγκέντρωσης γίνεται με εφαρμογή γραμμικής ανάλυσης Λαμβάνεται έτσι η γραμμική εξίσωση της καμπύλης αναφοράς που είναι της μορφής Υ= α + β*c, Όπου α = τομή και β= κλίση

20

21

22 ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ Πιστοποίηση μεθόδου είναι η διαδικασία που εξασφαλίζει την αξιοπιστία μιας μεθόδου κατά την καθημερινή της χρήση. Με άλλα λόγια είναι η «γραπτή απόδειξη» ότι η μέθοδος κάνει πραγματικά αυτό που θα έπρεπε να κάνει[3] Τρείς Διεθνείς Οργανισμοί παρέχουν τις γενικές γραμμές Πιστοποιήσης. FDA (US Food and Drug Administration) USP (US Pharmacopeia) ICH (International Conference on Harmonization) Τα κοινά σημεία τους είναι και τα βασικότερα κριτήρια που εξετάζονται κατά την Πιστοποίηση. [3]

23 Accuracy Ακρίβεια Precision Πιστότητα Reproducibility Επαναληψιμότητα Specificity (Selectivity)- Ειδικότητα (Εκλεκτικότητα) Linearity Γραμμικότητα Range Έυρος Τιμών (Περιοχή) Detection Limit Οριο ανίχνευσης Quantification Limit Οριο ποσοτικοποίησης Stability Σταθερότητα Robustness Ρυθμιστικότητα (ανθεκτικότητα) ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗΣ

24 ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

25 RSD=s/ẋ *100 s=τυπική απόκλιση Ν= αριθμός δειγμάτων Xi = Τιμή για κάθε μέτρηση ẋ = Μέση τιμή μετρήσεων Σχετική τυπική απόκλιση

26 Ακρίβεια (Accuracy) Εγγύτητα μετρούμενης-πραγματικής τιμής Τρόποι προσδιορισμού αληθινής τιμής : δ/τα αναφορας, spiked samples, πρότυπες προσθήκες, άλλη μέθοδος. [2] Ορθότητα (Όταν συγκρίνω τη μέση τιμή του προσδιορισμού με την αληθινή τιμή) Πιστότητα(Precision) Η απόκλιση από την πραγματική τιμή πολλών μετρήσεων του ίδιου ομογενούς και σταθερού δείγματος. Διακρίνεται σε : ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΟΡΓΑΝΟΥ, ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥ και ΔΙΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΚΡΙΒΕΙΑ (lab crossover). ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

27 Reproducibility Επαναληψιμότητα (το ίδιο άτομο στο ίδιο όργανο) - Ενδιάμεση πιστότητα (intermediate precision) (στο ίδιο εργαστήριο, άλλη μέρα, άλλο όργανο, άλλο άτομο) - Αναπαραγωγιμότητα (Reproducibility) (διαφορετικά εργαστήρια) ΓΡΑΜΜΙΚΟΤΗΤΑ (Linearity) Η παράμετρος που εξασφαλίζει οτι το εύρος των συγκεντρώσεων των προς ανάλυση δειγμάτων είναι τέτοια ωστε η απόκριση του αναλύτη να είναι γραμμικά ανάλογη της συγκέντρωσης του δείγματος. ΕΥΡΟΣ (Range) Το εύρος τιμών που μπορει να μετρήσει η μέθοδος μεσα στο οποίο εξασφαλίζεται η γραμμικότητα, η ορθότητα και η ακρίβεια των μετρήσεων. Η απόκλιση των μετρήσεων δεν θα πρέπει να δίνει RSD μεγαλύτερο του 3%[3] ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

28 ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ (Specificity) Προσδιορισμός μόνο της ενδιαφερόμενης ουσίας (αναλύτης) Σύγκριση δ/των αναλύτη-μίγματος Έλεγχος καθαρότητας [2] ΟΡΙΟ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ Η ελάχιστη συγκέντρωση-τιμή που μπορεί να ανιχνεύσει η μέθοδος πάνω από το επίπεδο του θορύβου. Τυπικά αναφέρεται ως το τριπλάσιο του επιπέδου του ΘΟΡΥΒΟΥ. ΟΡΙΟ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ Η ελάχιστη συγκέντρωση που μπορεί να ανιχνεύσει η μέθοδος με ΑΚΡΙΒΕΙΑ και ΟΡΘΟΤΗΤΑ. Απαραίτητο κριτήριο για ανίχνευση προσμίξεων.[3] ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

29 ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ Γίνεται έλεγχος των αντιδραστηρίων, της κινητής φάσης, προτύπων και των δειγμάτων. Η σύσταση τους πρέπει να παραμένει αναλλοίωτη για τουλάχιστον 48h. Εξασφαλίζει την αξιοπιστία της μεθόδου σε περίπτωση βλάβης ή οποιασδήποτε καθυστέρησης. ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟΤΗΤΑ Η ικανότητα της μεθόδου να παραμένει αξιόπιστη και ανεπηρέαστη από, εντός συγκεκριμένων ορίων, αλλαγές στο ph και τη συσταση της κινητής φάσης, στη συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος, στη θερμοκρασία και τον όγκο του δείγματος.[3] ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

30 ΠΡΟ-ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ[3] Σχεδιασμός Συντήρηση Βαθμονόμηση Έλεγχος λειτουργίας ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΘΟΔΟΥ[3] Α. ΕΠΙΠΕΔΟ I Ποσοτική ανάλυση Β. ΕΠΙΠΕΔΟ II Ποιοτική ανάλυση Ταυτοποίηση ΣΧΕΔΙΑΖΟΝΤΑΣ ΤΗΝ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ

31 Η Πιστοποίηση μιας μεθόδου θα πρέπει να γίνεται παράλληλα με την ανάπτυξη του πρωτοκόλλου της μεθόδου ώστε το τελικό αποτέλεσμα να είναι μία πιστοποιημένη μέθοδος έτοιμη προς εφαρμογή![3] Μια σε βάθος διαδικασία πιστοποίησης μπορεί να είναι αρκετά επίπονη αλλά μας γλυτώνει από περιττή σπατάλη χρόνου, κόπου και χρημάτων!![2] SOP (STANDARD OPERATIONAL PROCEDURE)

32 1. Identification, quantitation, and method validation for flavan-3-ols in fermented ready-to-drink teas from the Italian market using HPLC-UV/DAD and LC-MS/MS. (2009)[Chiara Cordero, ( Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco, Universita` degli Studi di Torino, Italy)Francesca Canale, ( Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco, Universita` degli Studi di Torino, Italy)Daniele Del Rio, (Dipartimento di Sanita` Pubblica, Universita` degli Studi di Parma, Italy)Carlo Bicchi, ( Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco, Universita` degli Studi di Torino, Italy)] J.Sep.Sci.2009, 32, J.Mark Green,A practical guide to Analytical Method Validation, Analytical Chemistry News and Features,May 1,1996, A 3. Ghulam A.Shabir, Validation of high-performance liquid chromatography methods for pharmaceutical analysis-understanding the differences and similarities between validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and the International Conference on Harmonization, Journal of Chromatography A,987(2003) Bronner, W. E., Beecher, G. R., J. Chromatogr. A 1998, 805, CITAC/Eurachem Guide. Guide to Quality in Analytical Chemistry: An Aid to Accreditation, ICH International Conference on Harmonization. Quality Guidelines Q2(R1): Validation of Analytical Procedures :Text and Methodology, ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ