ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ & ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ & ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ"

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ & ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΛΑΚΗΣ ΧΡΥΣΟΣΤΟΜΟΣ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ Α.Π.Θ. ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ/ΓΕΝΕΤΙΣΤΗΣ.Π.Θ. Msc ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ-ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Ε.Κ.Π.Α. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014 Ανάλυση πτητικών και φαινολικών ενώσεων του µύκητα Evernia Prunastri (Oak Moss). Έλεγχος της αντιοξειδωτικής ικανότητας των συστατικών του, και της ικανότητάς τους να αναστέλλουν την ALR2 και LOX ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΕΥΓΕΝΙΟΣ ΚΟΚΚΑΛΟΥ

2 Ευχαριστίες Η παρούσα µεταπτυχιακή διατριβή πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Φαρµακογνωσίας, του Τοµέα Φαρµακογνωσίας και Φαρµακολογίας, του Τµήµατος Φαρµακευτικής των Επιστηµών Υγείας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τους Καθηγητές µου: Τον επιβλέποντα Καθηγητή µου κ. Ευγένιο Κοκκάλου που µε δέχθηκε στον Τοµέα για την παρακολούθηση του συγκεκριµένου µεταπτυχιακού προγράµµατος, την διδασκαλία αλλά και την καθοδήγηση τόσο στην επιλογή του θέµατος και την ανεύρεση των πρώτων υλών, όσο και κατά την διάρκεια εκπόνησης της διπλωµατικής εργασίας. Την ρ. Χρυσή Γαβριέλη, µέλος του Εργαστηρίου Φαρµακογνωσίας για την συµπαράστασή της, την πολύτιµη καθοδήγησή της, την συµβολή της στην διευκρίνηση των φασµάτων ΝΜR και την επιµέλεια του κειµένου της διπλωµατικής και γενικά την άριστη συνεργασία µας όλο αυτόν τον καιρό. Την Καθηγήτρια κα. ήµητρα Χατζηπαύλου-Λίτινα, για τις γνώσεις, τις επισηµάνσεις της, όπως και για την πρόθυµη βοήθειά και συνεργασία της στα πειράµατα αξιολόγησης της δράσης αναστολής της Λιποξυγονάσης( LOX). Την Επίκουρη Καθηγήτρια κα. ιαµάντω Λάζαρη για τις γνώσεις, το ενδιαφέρον, τις επισηµάνσεις και την συνεισφορά της στην διδασκαλία του µεταπτυχιακού. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τους υπόλοιπους καθηγητές µου Καθηγητή κ. Ιωάννη Νιόπα και Καθηγητή κ. Βασίλειο ηµόπουλο για τις γνώσεις που µου προσέφεραν κατά την παρακολούθηση του συγκεκριµένου µεταπτυχιακού προγράµµατος. Σηµαντικότατη ήταν η καθοδήγηση και η βοήθεια στο εργαστηριακό τµήµα της διπλωµατικής εργασίας που έλαβα από την Υποψήφια ιδάκτορα του Τµήµατος Χριστίνα-Βασιλική Καρακούση την οποία και ευχαριστώ θερµά για αυτό. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τους µεταπτυχιακούς και διδακτορικούς φοιτητές του Τοµέα Φαρµακευτικής Χηµείας για την βοήθειά τους στα πειράµατα διερεύνησης των βιολογικών δράσεων του µύκητα Evernia Prunastri, την Μαρκέλλα Κωνσταντινίδου και την ρ. Μαρία Χατζοπούλου αντίστοιχα καθώς και τον ρ. Μιχαήλ Πλιούκα του Τοµέα Φαρµακογνωσίας- Φαρµακολογίας για τις πολύτιµες συµβουλές του. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τους συµφοιτητές µου Μαρία Χατζηστεφάνου και Κυριάκο Βαρνάβα, για την συνεργασία µας κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης του προγράµµατος και την εκπόνηση της διατριβής µου. Αισθάνοµαι την ανάγκη να ευχαριστήσω ολόψυχα την οικογένειά µου, την σύζυγό µου Μαρία και τα παιδιά µου Ελένη, Βασιλική και ηµήτριο για τις ατελείωτες ώρες που έλειψα από κοντά τους και για την υποµονή και την υποστήριξή τους καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. Περίληψη 5 2. Abstract 6 3. Θεωρητικό µέρος 3.1 Εισαγωγή Βιολογική περιγραφή Βιολογικές Ιδιότητες Τοξικότητα Χρήσεις Ανάλυση-σύσταση του µύκητα Αέρια Χρωµατογραφία Φαινολικές ουσίες Μέτρηση αντιοξειδωτικής δράσης Ταξινόµηση µεθόδων µέτρησης αντιοξειδωτικής ικανότητας Μέθοδος σάρωσης DPPH Μέτρηση αναστολής λιποξυγενάσης Μέτρηση αναστολής αναγωγάσης της αλδόζης Σκοπός διατριβής Πειραµατικό µέρος Ανάλυση µε GC-MS Προετοιµασία είγµατος Οργανολογία Συνθήκες Αέριας Χρωµατογραφίας Χρωµατογραφήµατα Φυτοχηµική ανάλυση του µύκητα της βαλανιδιάς Μέθοδοι και Υλικά 55 3

4 Ουσίες που αποµονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν µε Φάσµατα πυρηνικού µαγνητικού συντονισµού (NMR) 60 Ουσία 1 60 Ουσία 2 68 Ουσία 3 76 Ουσία 4 85 Ουσία Μέτρηση Βιολογικών δράσεων Evernia prunastri Μέτρηση αντιοξειδωτικής δράσης Μέτρηση αναστολής αναγωγάσης της αλδόζης Μέτρηση της αναστολής της λιποξυγονάσης Συµπεράσµατα Βιβλιογραφία 114 4

5 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Είναι αδιαµφισβήτητη στην εποχή µας, η τάση για ανακάλυψη και διερεύνηση των φυσικών εκείνων φυτικών συστατικών που παρουσιάζουν πληθώρα δράσεων στον ανθρώπινο οργανισµό, συχνά χωρίς τις παρενέργειες που συνοδεύουν τα συνθετικά χηµικά φάρµακα. Έτσι έχει αρχίσει να µελετάται µεταξύ άλλων και ένας µύκητας που αναπτύσσεται στον κορµό βαλανιδιάς (oak moss), και έχει αποδειχθεί ότι ο µύκητας παρουσιάζει αντιµικροβιακή, (1-5) αντιοξειδωτική (6-10) και αντιπολλαπλασιαστική δράση. (4,11-13) Ο µύκητας αυτός χρησιµοποιείται ευρέως στην κοσµητολογία ως αρωµατικό αλλά κυρίως ως στερεωτικό αρωµάτων (14) που όµως δυστυχώς παρουσιάζει αλλεργιογόνους δράσεις. (15-48) Συχνά εφαρµόστηκε και ως βιολογικός δείκτης για µελέτες ραδιενεργού ή λοιπής οικολογικής µόλυνσης, φυσικής αλλά και τεχνητής προέλευσης. (49-75) Στην παρούσα διατριβή πραγµατοποιήθηκε ανάλυση των πτητικών ενώσεων του µύκητα της βελανιδιάς µε αέρια χρωµατογραφία-φασµατοµετρία µάζης (GC-MS) µε χρήση πολικής στήλης η οποία κατέδειξε την παρουσία πληθώρας πτητικών συστατικών ουσιών. Αναλύθηκε ποιοτικά το εκχύλισµα µε διχλωροµεθάνιο του µύκητα, µε τη λήψη φασµάτων πυρηνικού µαγνητικού συντονισµού και επιβεβαιώθηκε η έντονη παρουσία φαινολικών ενώσεων και δεψιδίων. Παράλληλα στην διατριβή αυτή διερευνήθηκε φυτοχηµικά ο µύκητας και ελέγχθηκαν οι βιολογικές δράσεις των εκχυλισµάτων αυτού. Συγκεκριµένα η αντιοξειδωτική δράση του µε την µέθοδο σάρωσης της ρίζας DPPH*, η ικανότητα αναστολής του ενζύµου αναγωγάση της αλδόζης και του ενζύµου λιποξυγονάση. Ο µήκυτας Evernia Prunastri εµφανίζει αξιοσηµείωτη αντιοξειδωτική δράση ενώ η µελέτη της ικανότητας αναστολής των ενζύµων αναγωγάση της αλδόζης και λιποξυγονάσης κατέληξε σε ικανοποιητικότατα αποτελέσµατα και ως εκ τούτου χρήζει περαιτέρω διερεύνησης για την αποµόνωση και ταυτοποίηση περισσότερων ενώσεων του Ε. prunastri και µελέτη της ικανότητάς τους να αναστέλλουν τα ένζυµα αυτά. 5

6 2. ABSTRACT It is indisputable in our time, the trend for discovery and investigation of those natural herbal ingredients that present multiple actions in the body, often without the common adverse effects that follows chemical drugs. Thus, has been studied among others, a moss that grows on the oak trunk (oak moss), and it has been shown to exhibit antimicrobial, (1-5) antioxidant (6-10) and antiproliferative activity. (4, 11-13) This moss is widely used in cosmetology as aromatic and and mainly as aromatic fixative agent (14) but unfortunately showing allergic actions. (15-48) Furthermore it was applied as a biomarker in studies of natural or artificial environmental radioactive contamination. (49-75) In the present study were analyzed the volatile compounds of oak moss by gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) with the use of a polar column and discovered plurality of substances. Simultaneously oak moss extracts, were investigated phytochemically and for biological actions. Specifically we investigated the antioxidant action by DPPH* technique, the inhibition ability of E.prunastri to aldose anagogase enzyme and lipoxygenase enzyme. Also, it was investigated the dichloro methane oak moss extract, by NMR analysis and the phenolic and depsides compounds presence was confirmed once more. Oak moss (Evernia Prunastri) exhibits remarkable antioxidant action. Furthermore the investigation of enzymes (aldose anagogase and lipoxygenase) inhibition concluded in satisfactory results and therefore appeared the necessity for more efforts towards the isolation and identification of Evernia prunastri compounds and their ability to inhibit these enzymes. 6

7 3. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.1.Εισαγωγή Ο µύκητας Evernia prunastri, βρίσκεται στα ορεινά εύκρατα δάση σε όλο το βόρειο ηµισφαίριο. Ονοµάζεται και Βρύο της βελανιδιάς (Oak moss), και όπως υποδηλώνει το όνοµά του, αναπτύσσεται συνήθως σε κλαδιά και κορµούς δένδρων βελανιδιάς, αν και απαντάται ακόµη και σε άλλα δέντρα, φυλλοβόλα και κωνοφόρα. Αυτός ο λειχήνας είναι πολύ µικρός, επίπεδος και διαθέτει θαλλό που οµοιάζει µε το σχήµα των κεράτων των ελαφιών. Το βρύο της βελανιδιάς παρουσιάζει ποικιλία στο χρώµα, πράσινο ή σχεδόν λευκό όταν ξηραίνεται ακόµη και κιτρινωπό όταν είναι βρεγµένο. Το βρύο της βελανιδιάς είναι µια από τα πιο συχνά χρησιµοποιούµενες πρώτες ύλες αρωµάτων. Συχνά χρησιµοποιείται ως στερεωτικό, καθώς όχι µόνο βελτιώνει τη διάρκεια της σύνθεσης, αλλά προσδίδει και ένα λεπτό, πλούσιο, γήινο άρωµα δάσους στην αρωµατική σύνθεση, αφήνοντας φυσική, υγρή και κρεµώδη επικάλυψη. Αυτή η πρώτη ύλη συνήθως καλλιεργείται για εµπορική εκµετάλλευση στη Νότια και Κεντρική Ευρώπη και εξάγεται στη Grasse της Γαλλίας, η οποία διαθέτει σηµαντική αρωµατοποιοία. Το καθαρό εκχύλισµα του Βρύου της βελανιδιάς µπορεί να ληφθεί µε εκχύλιση µε διαλύτη ή µε απόσταξη κενού. 7

8 3.2 Βιολογική περιγραφή Η ταξινόµηση του µύκητα της βαλανιδιάς διαφαίνεται στον Πίνακα 1. Πίνακας 1. Ταξινόµηση του µύκητα Evernia Prunastri (Oak Moss) Kingdom Fungi Division Ascomycota/Bryophyta Class Lecanoromycetes Order Lecanorales Suborder Lecanorineae Family Parmeliaceae Genus Evernia Species E. prunastri Υπάρχουν διάφορα είδη του µύκητα Evernia prunastri τα κυριότερα εκ των οποίων είναι: 8

9 Πίνακας 2. Είδη Evernia (76) EVERNIA PRUNASTRI EVERNIA FURFURACEA EVERNIA VULPINA EVERNIA THAMNODES/MESOMORPHA EVERNIA DIVARICATA Καθώς η βελανιδιά είναι γηγενής στην Ευρώπη και τη Βόρεια Αµερική. Ο µύκητας συλλέγεται σε όλη την κεντρική και νότια Ευρώπη, ιδιαίτερα στη Γαλλία, την πρώην Γιουγκοσλαβία, Ουγγαρία, Ελλάδα, και επίσης το Μαρόκο και την Αλγερία ενώ τον συναντάµε και στα ορεινά δάση του Βορείου Ηµισφαιρίου, Γαλλίας, Πορτογαλίας, Ισπανίας, Σερβίας, Βόρειας και Κεντρικής Αµερικής καθώς και της Κεντρικής Ευρώπης.Τα πιο γνωστά είδη του λειχήνα Evernia στον Ελληνικό χώρο είναι τα E.prunastri και E. Furfuracea. Τα αρωµατικά υλικά παρασκευάζονται κυρίως στη Γαλλία, αλλά και στις ΗΠΑ, τη Βουλγαρία και την πρώην Γιουγκοσλαβία. 9

10 3.3 Βιολογικές Ιδιότητες Σε µελέτη που πραγµατοποιήθηκε στα είδη λειχήνας Parmelia sulcata, Flavoparmelia caperata, Evernia prunastri, Hypogymnia physodes και Cladonia foliacea το συνολικό φαινολικό περιεχόµενο των δοκιµαζόµενων εκχυλισµάτων κυµαίνεται από 78,12 έως 141,59 mg γαλλικού οξέος ισοδύναµου (GA) / g του εκχυλίσµατος και το συνολικό περιεχόµενο φλαβονοειδών από 20,14 έως 44,43 mg ρουτίνης (Ru) / g υπολείµµατος. [6] Οι αντιοξειδωτικές, αντιµικροβιακές και αντιπολλαπλασιαστικές ιδιότητες των µεθανολικών εκχυλισµάτων από τα είδη αυτά της Σερβίας προσδιορίστηκαναπό τη µελέτη µε ρίζα 2,2-διφαινυλ- 1-πικρυλ-υδραζιλίου (DPPH), σε µέθοδο µικροαραιώσεως µε 29 µικροοργανισµούς, συµπεριλαµβανοµένων 15 στελεχών βακτηρίων, 10 ειδών νηµατοειδών µυκήτων και 4 ειδών ζυµοµυκήτων, µε µια δοκιµασία βιωσιµότητας σε καρκίνο του παχέος εντέρου, της κυτταρική γραµµής αδενοκαρκινώµατος HCT-116 από ΜΤΤ (3 - [4,5-διµεθυλοθειαζολ-2-υλο] -2,5- διφαινυλοτετραζόλιο βρωµίδιο) και πορτοκαλί της ακριδίνης / χρώση µε βρωµιούχο αιθίδιο αντίστοιχα. [6] Η συγκέντρωση των αντιοξειδωτικών παρουσιάζει διακυµάνσεις αναλόγως των περιβαλλοντικών συνθηκών. Ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες (υψηλή θερµοκρασία, υψηλός φωτισµός, αποξήρανση, ατµοσφαιρική ρύπανση) µειώνει τη σύνθεση αντιοξειδωτικών στους λειχήνες και ως εκ τούτου µειώνει την αντιοξειδωτική τους ικανότητα [7-9]. Η αντιµικροβιακή ικανότητα των εκχυλισµάτων λειχηνών υπολογίστηκε µε την µεθοδο της µικροδιύλησης µε ρεσαζουρίνη [1] Τρία είδη λειχηνών ( Evernia prunastri, Hypogymnia physodes και Cladonia foliacea) επέδειξαν την σηµαντικότερη αντιµικροβιακή δράση έναντι µικροβίων όπως εσκερίχια κόλι, σταφυλόκκοκο, βάκιλο, εντερόκοκκο, πρωτέα, σαλµονέλλα, ψευδοµονάδα. Η Evernia prunastri επέδειξε το καλύτερο αποτέλεσµα έναντι των ζυµών και καλά αποτελέσµατα έναντι νηµατοειδών µυκήτων, ειδικά για τον Aspergillus niger. Εκχυλίσµατα της Evernia prunastri επέδειξαν µείωση στην κυτταρική βιωσιµότητα µε δοσοεξαρτώµενο τρόπο. Για µεγαλύτερη διάρκεια θεραπείας (72 h), παρατηρείται υψηλότερη κυτταρική ευαισθησία, αλλά χαµηλότερες συγκεντρώσεις των εκχυλισµάτων δεν θεωρούνται κυτταροτοξικές. [6] Οι Ranković και συνεργάτες παρατήρησαν την εξάρτηση της έντασης της αντιµικροβιακής δράσης των ίδιων ειδών λειχηνών και του διαλύτη που χρησιµοποιήθηκε για την εκχύλιση. [2] Απέδειξαν την εντονότερη αντιµικροβιακή δράση των µεθανολικών εκχυλισµάτων συγκρινόµενων µε τα 10

11 εκχυλίσµατα άλλων διαλυτών. Αυτό έρχεται σε συµφωνία µε την παρατήρηση των Bezivin et al. ότι τα πολικά συστατικά των λειχηνών, βρίσκονται κυρίως σε µεθανολικά εκχυλίσµατα [3]. Οι αντιπολλαπλασιαστικές ιδιότητες των µεθανολικών εκχυλισµάτων των Parmelia sulcata, Flavoparmelia caperata, Evernia prunastri, Hypogymnia physodes και Cladonia foliacea υπολογίστηκαν µε εκτίµηση της βιωσιµότητας MTT και µε διπλή χρώση πορτοκαλι ακριδίνης και βρωµιούχου αιθιδίου (AO/EB) [11,12] Οι Bezivin και συνεργάτες διερεύνησαν την κυτταροτοξικότητα των 8 γαλλικών ειδών λειχήνας, συµπεριλαµβανοµένης της Parmelia caperata και της Evernia prunastri. Η Evernia prunastri επέδειξε κυτταροτοξικότητα επί των DU145 κυττάρων και τα µεθανολικά της εκχυλίσµατα επί των κυττάρων 3LL. Οι Bezivin et al. κατέληξαν ότι το ουσνικό οξύ αποτελεί το σηµαντικότερο συστατικό του κλάσµατος του κανονικού εξανίου των προαναφερθέντων λειχηνών που παρουσιάζουν κυτταροτοξική δράση σε καρκινικές κυτταρικές σειρές [3]. Ο µύκητας E.prunastri παρουσιάζει αντιβιοτική, ενζυµοανασταλτική και αντικαρκινική/πολλαπλασιαστική δράση [13]. Τα εκχυλίσµατα µε βενζόλιο καθώς και το κερί από µύκητα βαλανιδιάς παρουσιάζουν αντιοξειδωτική δράση σχετικά µικρή αλλά συγκρίσιµη µε τα συνήθη συνθετικά αντιοξειδωτικά. [10] Ο µύκητας της βαλανιδιάς λόγω των αλειφατικών οξέων, πουλβινικών οξέων, δεψιδίων, διβενζοφουρανίων, ανθρακινονών κτλ ουσιών που περιέχει παρουσιάζει πληθώρα δράσεων µε αποδεδειγµένες την αντιµικροβιακή και αντιπολλαπλασιαστική. Αποτελεί έτσι δυνητικά µια πηγή άντλησης νέων φαρµάκων. [4] 11

12 3.4 Τοξικότητα Το εκχύλισµα βρύων βελανιδιάς είναι πολύ γνωστό, δηµοφιλές φυσικό εκχύλισµα και χρησιµοποιείται ως στερεωτικό αρωµάτων. Έχει αναφερθεί ως η αιτία αλλεργικών αντιδράσεων σε ένα αριθµό ατόµων. Έτσι το εκχύλισµα βρύων βελανιδιάς αποτέλεσε στόχο ερευνών για τον εντοπισµό των αλλεργιογόνων συστατικών του. Η χλωροατρανόλη, ένα αλλεργιογόνο συστατικό αρωµάτων, εντοπίστηκε σε βρύα βελανιδιάς. Στην προσπάθεια να αξιολογηθεί η κλινική σηµασία της χλωροατρανόλης ως αλλεργιογόνο άρωµατος, χρησιµοποιήθηκαν 13 ασθενείς που προηγουµένως έδειχναν µια θετική δοκιµή σε αυτοκόλλητο βρύων βελανιδιάς και χλωροατρανόλης, µαζί µε µια οµάδα ελέγχου 10 ασθενών χωρίς ευαισθητοποίηση σε κανένα από τα 2 υλικά. Μια σειρά δοκιµών µε έµπλαστρα αραίωσης διεξήχθη στο άνω τµήµα της πλάτης µε συγκεντρώσεις που κυµαίνονται 200 έως 0,0063 ppm της χλωροατρανόλης σε αιθανόλη. Ταυτόχρονα, ο συµµετέχων συµµετείχε και σε µια ανοικτή δοκιµή που προσοµοίωνε τη χρήση των αρωµάτων στην παλαµιαία πτυχή του πήχη σε µια τυχαιοποιηµένη, διπλά τυφλή, µελέτη. Ένα διάλυµα µε 5 p.p.m. χλωροατρανόλης χρησιµοποιήθηκε για 14 ηµέρες, και, σε περίπτωση µη αντίδρασης, οι εφαρµογές συνεχίστηκαν για άλλες 14 ηµέρες µε ένα διάλυµα που περιέχει 25 ppm. Όλα τα υποκείµενα δοκιµής (13/13) ανέπτυξαν µια αλλεργική αντίδραση στο σηµείο της εφαρµογής του διαλύµατος που περιέχει χλωροατρανόλη. Μεταξύ αυτών, 12/13 (92%) έδωσε θετική αντίδραση µε το διάλυµα των 5 ppm και 1 µε αυτό των 25 p.p.m. Κανένας από την οµάδα ελέγχου δεν αντέδρασε θετικά. Η δοκιµή χρήσης τερµατίστηκε στο διάµεσο 4 ηµέρες. Η δόση που προκαλεί µια αντίδραση σε 50% των υπό εξέταση υποκειµένων κατά την εξέταση εµπλάστρου ήταν 0,2 ppm. Εν κατακλείδι, η έκθεση σε ισχυρό αλλεργιογόνο που χρησιµοποιείται ευρέως σε αρώµατα, προκάλεσε αλλεργική αντίδραση των ευαισθητοποιηµένων ατόµων. Η δε χλωροατρανόλη είναι το πιο ισχυρό αλλεργιογόνο σε καταναλωτικά προϊόντα σήµερα. [15] Η χρήση αρωµάτων είναι πολύ συχνή σε προϊόντα καθηµερινής χρήσης. Ένας µεταλλουργός µε χρόνιο έκζεµα χεριών και προηγούµενη διάγνωση, ευαισθητοποιήση τύπου IV σε εποξική ρητίνη, βάλσαµο του Περού,µείγµα αρώµατος και αρωµατικό µίγµα ΙΙ διαγνώστηκε µε πρόσθετες ευαισθησίες τύπου IV σε γερανιόλη, υδροξυκιτρονελλάλη, λιναλοόλη, βρύα δέντρου, απόλυτο εκχύλισµα βρύων βελανιδιάς, κιτράλη, κιτρονελλόλη, φαρνεσόλη.έτσι τα αρώµατα που περιέχουν οι κρέµες προστασίας του δέρµατος ή αρώµατα προσωπικών καλλυντικών και απορρυπαντικών, δυνητικά µπορεί να προκαλέσουν αλλεργία εξ επαφής. [16] 12

13 Εικόνα 1. ερµατικό τέστ µε αλλεργιογόνα που πραγµατοποιήθηκε κατά την διερεύνηση αρωµάτων [16] Σύµφωνα µε τους A. Nardelli et al, µεταξύ των ετών 2000 και 2009, αναφέρθηκαν 806 αλλεργικές αντιδράσεις σε ασθενείς από προσωπικά καλλυντικά προϊόντα που περιείχαν υδροξυκιτρονελλάλη και Evernia prunastri (βρύα βελανιδιάς) ως πιο συχνά PNC συστατικά, µε ποσοστά για την Evernia prunastri 42% το 2000 µε έντονη µετάπτωση στα ενδιάµεσα χρόνια και κατάληξη στο 7% το [17] Οι ουσίες χλωροατρανόλη και ατρανόλη έχουν χαρακτηριστεί ως τα κύρια αλλεργιογόνα σε απόλυτο εκχύλισµα βρύων βελανιδιάς(evernia prunastri). Αµφότερες οι ουσίες ανευρίσκονται σε µικρές ποσότητες στη φυσική µορφή απόλυτου εκχυλίσµατος των βρύων βελανιδιάς και συγκεκριµένα περίπου 2,1% (w / w) της ατρανόλης και 0,9% (w / w) της χλωροατρανόλης. Το καθαρό ή απόλυτο διάλυµα λαµβάνεται µε εκχύλιση µε διαλύτες, για παράδειγµα µε εξάνιο, δίνοντας ένα «συγκεκριµένο διάλυµα», το οποίο στη συνέχεια εκχυλίζεται µε οινόπνευµα για να επιτευχθεί το «απόλυτο διάλυµα». Αυτό το εκχύλισµα λαµβάνεται από λειχήνες του είδους Ε. prunastri var. prunastri L. Ach. (Parmeliaceae), που φυτρώνουν στα δέντρα βελανιδιάς. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια της παραγωγής του υλικού αρώµατος, µπορούν να σχηµατίζονται µε αποσύνθεση µη-πτητικών και άοσµων ουσιών του λειχήνα όπως chloroatranorin και atranorin [18]. Οι A. Nardelli et al, κατεργάστηκαν την χλωροατρανόλη και ατρανόλη µε ένα πολυµερές µε σκοπό να µειωθεί η περιεκτικότητα του εκχυλίσµατος αυτού στα δύο κύρια αλλεργιογόνα, από 3,4% σε λιγότερο από 75 ppm και από 1.8% έως λιγότερο από 25 p.p.m., αντιστοίχως. Το µετασχηµατισµένο δείγµα δοκιµάστηκε σε 14 αλλεργικούς στην Evernia prunastri ασθενείς και έδωσε αρνητική αντίδραση σε έξι, αλλά θετικές αντιδράσεις σε οκτώ άτοµα, µε την ίδια ένταση όπως τα εµπορικώς διαθέσιµα βρύα βελανιδιάς οδηγώντας στο συµπέρασµα ότι τα βρύα βελανιδιάς δεν είναι ασφαλή στις προαναφερθείσες συγκεντρώσεις συστατικών τους για τον καταναλωτή. [19] 13

14 Το απόλυτο εκχύλισµα βρύων βελανιδιάς, ένα δηµοφιλές φυσικό εκχύλισµα που προέρχεται από τη λειχήνα Evernia prunastri, χρησιµοποιείται ευρέως στην αρωµατοποιία, επειδή έχει άρωµα ξύλου και στερεωτικές ιδιότητες [20,21]. Έχει αναγνωριστεί το απόλυτο εκχύλισµα βρύων βελανιδιάς, ως µια σηµαντική αιτία των αλλεργικών αντιδράσεων, που αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον το 20% των αντιδράσεων που παρατηρούνται µε το άρωµα Fragrance Mix I [20, 22, 23] και γι αυτό χρησιµοποιείται ως µέρος των διαγνωστικών ελέγχων στα αρώµατα για την ανίχνευση αλλεργιών εξ επαφής. [20] H 3 C OH H 3 C OH Cl CHO CHO OH 2, 4-dihydroxy-6-methyl-benzaldehyde (ατρανόλη) OH 3-Chloro-2,6-dihydroxy-4-methyl-benzaldehyde (χλωροατρανόλη) Η περιεκτικότητα της ατρανόλης (2,6-διυδρόξυ-4-µεθυλ- βενζαλδεϋδης) και χλωροατρανόλης (3- χλώρο-2,6-διυδρόξυ-4- µέθυλ-βενζαλδεϋδη) στα καλλυντικά προϊόντα εξαρτάται από τη χρήση του απόλυτου εκχυλίσµατος βρύων βελανιδιάς, από την αποικοδόµηση της ατρανορίνης και χλωροατρανορίνης στη µήτρα του προϊόντος, και, τέλος, από την επίδραση της µήτρας στον προσδιορισµό αυτών των µορίων [24].Για το λόγο αυτό, η έκθεση φαίνεται να είναι µεγαλύτερη για ατρανόλη από το χλωροατρανόλη στα αρώµατα. Πράγµατι, η ποσοτική έκθεση σε χλωροατρανόλη και ατρανόλη έχει µελετηθεί σε ορισµένα δηµοφιλή αρώµατα, αποστάγµατα αρωµάτων και κολώνιες που διατίθενται στην ευρωπαϊκή αγορά. Τριάντα ένα προϊόντα αναλύθηκαν µε LC(ESI)- MS-MS), για το περιεχόµενο τους σε ατρανόλη και χλωροατρανόλη. Οι δύο ουσίες που βρέθηκαν στο 87% των εξεταζόµενων προιόντων ήταν η ατρανόλη στα αρώµατα σε µια µέση συγκέντρωση των 0,5 ppm και η χλωροατρανόλη στα 0,25 ppm, µε ανώτατο όριο τα 190 p.p.m. και 53 ppm, αντίστοιχα [24, 25]. Το 2007, οι Rastogi et al. [24, 26], παρατήρησαν µια σηµαντική µείωση στην συχνότητα της παρουσίας της χλωροατρανόλης στα προϊόντα που αναλύθηκαν σε σύγκριση µε την ανωτέρω µελέτη. Η ικανότητα της ευαισθητοποιήσεως των χλωροατρανόλης και ατρανόλης, όπως και του απόλυτου εκχυλίσµατος βρύων βελανιδιάς, έχει µελετηθεί στην τοπική δοκιµασία λεµφαδένων, και όλα αποδείχθηκαν να είναι ισχυροί ευαισθητοποιητές, µε την χλωροατρανόλη να 14

15 είναι ικανή να επάγει την ευαισθητοποίηση σε µικρότερη ποσότητα από την ατρανόλη [27]. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η χλωροατρανόλη ήταν περισσότερο πιθανό να παράγει µία απόκριση σε έµπλαστρο δοκιµής συγκριτικά µε ισοµοριακή ποσότητα µε την ατρανόλη σε ευαισθητοποιηµένα άτοµα. Η ικανότητα παραγωγής απόκρισης της χλωροατρανόλης σε σχέση µε την ατρανόλη ήταν 217%, δηλαδή κατά ένα συντελεστή 2.2 µε βάση τις µοριακές συγκεντρώσεις [25]. Η επιστηµονική επιτροπή για τα καταναλωτικά προϊόντα (ΕΕΚΠ), µια ανεξάρτητη συµβουλευτική επιτροπή στην Ευρωπαϊκή Ένωση, συνέστησε το 2004 ότι η χλωροατρανόλη και η ατρανόλη δεν θα πρέπει να είναι παρούσες σε κάθε καλλυντικό προϊόν, λόγω της αλλεργιογόνου δράσης τους και επίσης τα ακατέργαστα βρύα βελανιδιάς θεωρούνται ανασφαλή για τους καταναλωτές. [27] Συνεπώς, µια σηµαντική πρόκληση σήµερα για τη βιοµηχανία καλλυντικών είναι η επιλεκτική αποµάκρυνση των αλλεργιογόνων συστατικών από το απόλυτο εκχύλισµα βρύων βελανιδιάς µε ένα τρόπο που δεν θα επηρεάσει τα περισσότερα από τα άλλα συστατικά του εκχυλίσµατος αλλά ούτε και τις αρωµατικές τις ιδιότητες. Για να βελτιωθεί η ανοχή του δέρµατος στις ουσίες ατρανόλη και χλωροατρανόλη, οι Ehret et al. [28] περιγράφουν την επεξεργασία του απόλυτου εκχυλίσµατος των βρύων βελανιδιάς µε αµινοξέα όπως η λυσίνη και η λευκίνη, η οποία µείωσε το περιεχόµενο των αλλεργιογόνων συστατικών. Το προκύπτον απόλυτο διάλυµα βρύων βελανιδιάς ελέγχθηκε σε συγκριτικές µελέτες σε ινδικά χοιρίδια και σε υγιείς εθελοντές. Τα αποτελέσµατα της δοκιµής έδειξαν ότι, σε σύγκριση µε το εµπορικό δείγµα δοκιµής, η αλλεργιογόνος δράση του νέου εκχυλίσµατος βελανιδιάς µειώθηκε σηµαντικά. Μια απλή και αποτελεσµατική διαδικασία που αναφέρεται στην βιβλιογραφία για την αποµάκρυνση των αλλεργιογόνων συστατικών ορισµένων αιθέριων ελαίων βασίστηκε στην σύνδεσή τους µε ένα αδιάλυτο υπόστρωµα πολυµερούς µέσω µίας ήπια αντίδραση σύζευξης [29,30]. Μεταξύ των ετών 2005 και 2008, οι Wolfgang Uter et al, [31] κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι η συχνότητα ευαισθητοποίησης λόγω επαφής διαφέρει σε µεγάλο βαθµό µεταξύ των µεµονωµένων αρωµάτων, δοκιµάζοντας σε ασθενείς έµπλαστρα µε αρώµατα στα τµήµατα του δικτύου πληροφοριών των Τµηµάτων της ερµατολογίας.συγκεκριµένα προέκυψε ότι το 15,1% αντέδρασε θετικά σε άρωµα µείγµατος (FM) I (6,6% θετικοί), FM ΙΙ (4,6% θετικά) ή σε ρητίνη από βάλσαµο του Περού, 6,8% θετικό. Μάλιστα µεταξύ των µεµονωµένων συστατικών του FM Ι, το κύριο αλλεργιογόνο συστατικό ήταν το απόλυτο εκχύλισµα της Evernia prunastri [βρύα βελανιδιάς], και αµυλκινναµικό το λιγότερο αλλεργιογόνο. Μεταξύ των αρωµάτων που δεν περιλαµβάνονται στο FM I ή FM ΙΙ, το απόλυτο εκχύλισµα της Evernia furfuracea (βρύα δέντρου) ήταν το πιο κοινό αλλεργιογόνο. 15

16 Πίνακας 3. Φύλλο ασφαλείας δεδοµένων για Evernia prunastri Φυσικά δεδοµένα Άρωµα Εµφάνιση Καπνού, µούχλας,γής Σκούρο καφέ έως µώβ Ηµιστερεά πάστα Αδιάλυτο >70 C ιαλυτότητα στο νερό Σηµείο ανάφλέξης Σταθερότητα Σταθερό υπό συνήθεις συνθήκες Επικινδυνότητα Όχι επικίνδυνο Απαιτούµενη Προστασία Αναπνευστικού Μάσκα Ματιών Γυαλιά προστασίας έρµατος Γάντια χηµικής προσασίας Εξαερισµού Απαιτείται για καθαρισµό αέρα Άλλα Σταθµός πλύσης οφθαλµών και ντούζ Τοξικότητα -πιθανό ερεθιστικό οφθαλµών και δέρµατος -ατµοί δυνητικά ερεθιστικοί για λαιµό και πνεύµονες -δυνητικά θανατηφόρο αν καταποθεί -επαναλαµβανόµενη επαφή µπορεί να προκαλέσει αλλεργική δερµατίτιδα -τοξική για την υδρόβια ζωή µε επί µακρόν διατηρητέες συνέπειες Συνίσταται κατά την χρήση η αποφυγή επαφής µε µάτια, βλεννογόνους και δέρµα. Η αποθήκευση πρέπει να γίνεται σε δροσερή περιοχή, σε ερµητικά κλειστούς περιέκτες, µακριά από πηγές ζέστης, φωτός και εκρήξεων. Στην προσπάθεια να ανακαλύψουν κατά πόσο οι ασθενείς είναι ευαίσθητοι στα συστατικά ή στις επιµολύνσεις λειχηνών Ε. furfuracea, οι Uter et al [32], πραγµατοποίησαν µια αναδροµική ανάλυση δεδοµένων από το ίκτυο Πληροφόρησης των Τµηµάτων της ερµατολογίας (www.ivkd.org) για το διάστηµα για περιστατικά µε απόλυτο διάλυµα βρύων βελανιδιάς (1%), βρύων δέντρου (1%), και κολοφωνίου ( 20%), καταλήγοντας στο συµπέρασµα από συνολικά 3030 ασθενείς,εκ των οποίων έδωσαν θετικές αντιδράσεις στην Ε. furfuracea 6,37%, στην Ε. prunastri 5,71%, και στο κολοφώνιο 4,82%,ότι υπάρχουν δύο ειδών ασθενείς.οι ευαισθητοποιηµένοι σε ρητινικά οξέα που δίνουν παραπλήσια αντίδραση και µε κολοφώνιο και οι µη-ευαισθητοποιηµένοι σε ρητινικά οξέα, αλλά ευαισθητοποιηµένοι σε κοινά συστατικά της Ε. prunastri και της Ε. furfuracea. Το καθαρό ή απόλυτο διάλυµα που λαµβάνεται από λειχήνες του είδους Ε. prunastri var. prunastri L. Ach. (Parmeliaceae), που φυτρώνουν στα δέντρα βελανιδιάς, είναι ένα γνωστό αλλεργιογόνο επαφής [33, 34] και το σηµαντικότερο αλλεργιογόνο µεταξύ εκείνων που συνδυάζονται για το άρωµα mix I [34]. Αυτό οφείλεται κύρια, αλλά όχι αποκλειστικά, στα συστατικά του ατρανόλη και χλωροατρανόλη [18]. Σύµφωνα µε το ιεθνές Πρότυπο Fragrance Research Association για την prunastri Ε. (43η τροποποίηση), «Τα εκχυλίσµατα από βρύα 16

17 βελανιδιάς που χρησιµοποιούνται σε αρωµατικές συνθέσεις πρέπει να µην περιέχουν πρόσθετα βρύα δέντρου, τα οποία είναι µια πηγή ρητινικών οξέων. Ίχνη οξέων ρητίνης µπορούν να µεταφερθούν στα παρασκευάσµατα των εµπορικών βρύων βελανιδιάς κατά την παραγωγική διαδικασία [35]. Πριν οριστεί αυτό το πρότυπο, πολλά από τα απόλυτα διαλύµατα βρύων βελανιδιάς εσκεµµένα αναµειγνύονταν µε αντίστοιχο απόλυτο βρύων δέντρου, για λόγους κόστους. Στο πλαίσιο αυτό, αξίζει να σηµειωθεί ότι υπάρχει ειδικός αριθµός CAS ( ) για τα εκχυλίσµατα του Ε. prunastri, η οποία µπορεί να περιέχει συγκεκριµένο ποσό ρητινικών οξέων και εστέρων τους [36]. Ταυτόχρονη αντιδραστικότητα µεταξύ βρύων βελανιδιάς και κολοφωνίου, η οποία θα µπορούσε να θεωρηθεί ως ένδειξη µόλυνσης από (οξειδωµένα) ρητινικά οξέα, είχε προηγουµένως εντοπιστεί σε έναν αριθµό ασθενών [37]. Σε µετέπειτα µελέτες,µε εκτεταµένες κλινικές δοκιµές µε έµπλαστρα, ωστόσο, το φαινόµενο αυτό βρέθηκε να είναι µάλλον περιορισµένο [38, 39]. Ταυτόχρονη παρουσία ειδών Evernia και Parmelia αντίστοιχα, και Frullania έχει αναφερθεί, καθιστώντας έτσι δυνατή τη µόλυνση των δειγµάτων της πρώτης µε σεσκιτερπενικές λακτόνες από την τελευταία [36, 40] Σε έρευνα που πραγµατοποιήθηκε [41] για τις παρενέργειες που εµφανίζονται από τη χρήση φυτοθεραπευτικών συµπεριλαµβανοµένης και της Ε. prunastri, σε 64 γυναίκες εµφανίστηκαν γαστρεντερικές διαταραχές και συγκεκριµένα φλεγµονές και αιµορραγίες του εντερικού επιθηλίου, για 13 ηµέρες και απαιτήθηκε νοσοκοµειακή περίθαλψη για την ίαση και αποκατάσταση των ασθενών. Σε µια αναδροµική µελέτη [42] των στοιχείων από το Τµήµα ερµατο-αλλεργιολογίας, στο Πανεπιστηµιακό Νοσοκοµείο της Κοπεγχάγης Gentofte, µελετήθηκε η ευαισθητοποίηση από τα 26 συστατικά αρωµάτων, ασθενών µε έκζεµα, για το χρονικό διάστηµα από Ιανουάριο του 2008-Ιούλιο Στους 115 (7.6%) εξ αυτών των ασθενών, εµφανίστηκε ευαισθητοποίηση, κλινικής σηµασίας (75.7%) στην πλειονότητα, µε συχνότερα αλλεργιογόνα την Evernia furfuracea (n = 50), Evernia prunastri (n = 31), και υδρόξυ-ισοξελυ 3-κυκλοεξενο καρβοξαλδεϋδη (n = 24). Ακόµα εκδηλώθηκε αλλεργία στο άρωµα µίγµα ΙΙ και το βάλσαµο του Περού, 196 (13,0%). Με τις δοκιµές µε τα 26 συστατικά των αρωµάτων, ανιχνεύτηκε η ευαισθητοποίηση για επιπλέον 23 άτοµα που διαφορετικά θα είχε περάσει απαρατήρητη. Το περίπου γνωστό για 40 έτη, µείγµα αρωµάτων (Mix) εξακολουθεί να είναι ένας σηµαντικός δείκτης της ευαισθητοποίησης σε άρωµα. Τα δύο κύρια αλλεργιογόνα σε αυτό το µίγµα είναι ακόµα τα βρύα βελανιδιάς (Evernia prunastri) και η ισοευγενόλη. [43] Παρατηρήθηκε µείωση στη συχνότητα των ευαισθητοποιήσεων στα καλλυντικά και τα προϊόντα προσωπικής φροντίδας κατά 17

18 το χρονικά διάστηµα , η οποία πιθανότατα οφείλεται στη µείωση των συγκεντρώσεων του απόλυτου διαλυύµατος βρύων βελανιδιάς (Evernia prunastri) και ισοευγενόλης σε αυτά. Αναλύσεις των στοιχείων IVDK για τα χρόνια έδειξε ότι το απόλυτο βρύων βελανιδιάς και ισοευγενόλης εξακολουθούν να θεωρούνται τα πιο σηµαντικά αλλεργιογόνα στο άρωµα Mix [34, 44 ]. Η χρήση λειχηνοπροερχόµενων πρόσθετων σε εµπορικά προϊόντα γίνεται όλο και πιο συχνή αιτία αλλεργικής δερµατίτιδας εξ επαφής. Τα πιο συχνά χρησιµοποιούµενα πρόσθετα είναι το ουσνικό οξύ και απόλυτο διάλυµα βρύων βελανιδιάς. Και τα δυο είναι χρήσιµα για ανίχνευση ασθενών που χρησιµοποιούν φυσικά ή βοτανικά προϊόντα που περιέχουν λειχηνοπροερχόµενα πρόσθετα. [45] Εκτός από τα καθαρά συνθετικά υλικά αρωµάτων, διάφορα φυσικά εκχυλίσµατα είναι ακόµα σε χρήση στη βιοµηχανία αρωµάτων. Μεταξύ αυτών το απόλυτο διάλυµα βρύων βελανιδιάς, που παρασκευάζεται από την λειχήνα Evernia prunastri (L.) Arch., θεωρείται ένας σηµαντικός ευαισθητοποιητής επαφής και ως εκ τούτου περιλαµβάνεται στο µίγµα αρωµάτων που χρησιµοποιείται για τη διάγνωση αλλεργίας στα αρώµατα. Η διαδικασία της προετοιµασίας 18

19 απόλυτου βρύων βελανιδιάς έχει µεταβληθεί τα τελευταία χρόνια και, παρόλο που έχουν αναγνωριστεί πολλοί δυνητικοί ευαισθητοποιητές από τα εκχυλίσµατα τολουολίου, τα παρόντα συστατικά του και η αλλεργιογόνος κατάστασή τους δεν είναι σαφείς. Μια µέθοδος που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισµό των αλλεργιογόνων επαφής που ανευρίσκονται στα φυσική πολύπλοκα µίγµατα του απόλυτου βρύων βελανιδιάς, βασίζεται στο συνδυασµό βιοπροσδιορισµού µε κατευθυνόµενη χηµική κλασµάτωση, αέριας χρωµατογραφίαςφασµατοµετρίας µάζας και µελέτες σχέσης δοµής-δράσης. Οι ατρονόλη και χλωροατρανόλη, που σχηµατίζονται από µετεστεροποίηση και αποκαρβοξυλίωση από προιόντα του λειχήνα (ατρανορίνη και χλωροατρανορίνη αντίστοιχα), κατά τη διάρκεια της προετοιµασίας του απόλυτου βρύων βελανιδιάς, είναι ισχυρά ερεθιστικές στους περισσότερους ασθενείς που είναι ευαίσθητοι σε βρύα βελανιδιάς. Η µεθυλο-βκαρβοξυλική ορκινόλη, ένα προϊόν αποδόµησης παραπροιόντων και το πιο σηµαντικό µονοαρυλο παράγωγο των βρύων βελανιδιάς από οσφρητική σκοπιά, βρέθηκε επίσης να προκαλεί αντίδραση στους περισσότερους ασθενείς. [18] Η χλωροατρανόλη αποδείχθηκε να είναι δυνητικά η πιο χρησιµοποιούµενη αλλεργιογόνος ουσία που ανευρίσκεται στα καλλυντικά σκευάσµατα στη σύγχρονη εποχή. [46] Και οι δύο ουσίες (ατρανόλη-χλωροατρανόλη) προκαλούν αντιδράσεις ευαισθησίας σε πολύ χαµηλά επίπεδα έκθεσης και οι διαφορές στην ικανότητα αντίδρασης µεταξύ των 2 ουσίων αντισταθµίζονται από το γεγονός ότι η έκθεση είναι µεγαλύτερη σε ατρανόλη από ότι σε χλωροατρανόλη και ότι και οι δύο ουσίες συµβάλλουν στην εµφάνιση κλινικών προβληµάτων που οφείλονται στην ευαισθητοποίηση ατόµων µε βρύα βελανιδιάς. [47] Επιβεβαιώνεται για µια ακόµη φορά η παρατήρηση ότι η χρήση του µίγµατος για την διάγνωση αλλεργίας σε αρώµατα δίνει αρκετά ψευδώς θετικά αποτελέσµατα κι ως εκ τούτου δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί µε ασφάλεια, ενώ το βάλσαµο του Περού δείχνει να βοηθάει. Τέλος το απόλυτο του µύκητα βελανιδιάς αποδείχθηκε λιγότερο ικανό σε συχνότητα αλλεργιογόνο από άλλα όπως κιναµµωµικό, κιναµµωµικές αλδεϋδες και αλκοόλες, κιτρονελλάλη, ευγενόλη, ισοευγενόλη κτλ [48] 19

20 3.5 Χρήσεις Τα εκχυλίσµατα του µύκητα βαλανιδιάς έχουν µεγάλη αξία ως στερεωτικά και αναµιγνύονται µε όλα σχεδόν τα άλλα έλαια και δίνουν τη βάση και πλούσια φυσική χροιά σε όλους τους τύπους των αρωµάτων. Για πολλά χρόνια, το Βρύο της βελανιδιάς ήταν γνωστό ως ισχυρό απολυµαντικό του δέρµατος που πρέπει να χρησιµοποιείται µε εξαιρετική προσοχή ώστε να αποφευχθούν οι αρνητικές δερµατικές αντιδράσεις. Ωστόσο, τον τελευταίο καιρό, αποτελεί αµφιλεγόµενο σηµείο, αφού ο IFRA, ένα όργανο που ρυθµίζει τις κατευθυντήριες γραµµές για την ασφαλή χρήση των χηµικών ουσιών και αρωµατικών αιθερίων ελαίων στα αρώµατα, κατατάσσει το Βρύο της βελανιδιάς ως περιορισµένο συστατικό. Οι κανονισµοί του IFRA δηλώνουν ότι τα εκχυλίσµατα του Βρύου της βελανιδιάς, που προέρχονται από την Evernia prunastri, δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται σε καταναλωτικά προϊόντα, εφόσον η ποσότητά τους υπερβαίνει το 0,1%. Επιπλέον, αν η συνταγή περιέχει ήδη εκχυλίσµατα βρύων δέντρου, τα επίπεδα των εκχυλισµάτων του Βρύου της βελανιδιάς και αυτών του βρύου δέντρου πρέπει να µειωθούν κατά τέτοιο τρόπο ώστε το συνολικό ποσό των δύο εκχυλισµάτων να µην υπερβαίνει το 0,1%. Επειδή είναι σχεδόν αδύνατο να συντεθεί ένα κλασικό άρωµα Chypre χωρίς ίχνος φυσικών βρύων, οι αρωµατοποιοί ήταν κάτω από µια δύσκολη πρόκληση από το 2001, προσπαθώντας να βρούν νέα εκχυλίσµατα που θα προσοµοίαζαν µε το πρότυπο άρωµα βρύων, και παράλληλα να συµµορφώνονται µε τους κανονισµούς του IFRA. Ακολουθώντας τις νέες κατευθυντήριες οδηγίες, πολλά αρωµατοποιοία επαναδηµιούργησαν τα κλασικά τους αρώµατα. Το γνήσιο "άρωµα του υγρού δάσους" υπάρχει στις δηµιουργίες της σύγχρονης φυσικής αρωµατοποιίας, καθώς χρησιµοποιούνται τα βρύα βελανιδιάς που λαµβάνονται µε εκχύλιση µε διαλύτη. Βρύα βελανιδιάς απαντώνται στη σύνθεση πολλών αρωµάτων όπως Paloma Picasso, Chanel # 19, Miss Dior by Dior, Apercu and Fougère Royale by Houbigant. [14] ιάφορα σκευάσµατα που χρησιµοποιούνται σήµερα σε ποσότητες µικρότερες του 0,1% είναι: το έλαιο βρύων βελανιδιάς: χρησιµοποιείται ως σταθεροποιητικό, όπου το µίγµα βρύων βελανιδιάς χρησιµοποιείται κυρίως στα σαπούνια. Το καθαρό έλαιο είναι το πλέον χρησιµοποιούµενο και εφαρµόζεται σε όλους τους τύπους αρωµάτων. Η ρητίνη και ρητινοειδή, που έχουν µια φτωχή διαλυτότητα, χρησιµοποιούνται σε σαπούνια, παρασκευάσµατα για τα µαλλιά, αρώµατα και βιοµηχανικά προϊόντα χαµηλού κόστους. Το καθαρό έλαιο βρύων βελανιδιάς: δένει καλά µε τα ακόλουθα αιθέρια έλαια: νερολί (άνθη πορτοκαλιάς), λεβάντα, γεράνι, κυπαρίσσι, πατσουλί, και αιθέρια έλαια εσπεριδοειδών. 20

21 Αιθέρια έλαια µπορούν επίσης να χρησιµοποιηθούν ως συστατικά στην παραγωγή σαπουνιών, λοσιόν, λάδια µασάζ, διαχύτες, ποτ πουρί, άρωµα, αποσµητικά, αρώµατα σώµατος, αρωµατικά έλαια, προϊόντα αρωµατοθεραπείας, έλαια µπάνιου, αρωµατισµό πετσετών, στο σπα, θυµίαµα, δαχτυλίδια φωτός, πλυντήριο, ατµούς προσώπου, θεραπείες µαλλιών, και πολλά άλλα. Βρύα που προέρχονται από κορµό βαλανιδιάς συχνά εφαρµόζονται ως βιολογικοί δείκτες για µελέτες ραδιενεργού ή λοιπής οικολογικής µόλυνσης, φυσικής αλλά και τεχνητής προέλευσης. Αυτό γίνεται διότι οι οργανισµοί αυτοί επιλέγονται για το σκοπό αυτό καθώς οι ιδιότητές τους πληρούν τα κριτήρια ενός βιολογικού δείκτη. [49,50] Οι τιµές ραδιενέργειας εδώ είναι θεωρητικά πιο εύκολο να υπολογιστούν εν συγκρίσει µε τα µεγάλα φυτά, καθώς η πηγή προέλευσης του ραδιενεργού καισίου είναι ενιαία και συγκεκριµένη. Τα βρύα δεν έχουν ριζικό σύστηµα, και γι αυτό το λόγω η λήψη των θρεπτικών ουσιών από το υπόστρωµα είναι ασήµαντη. Η συγκέντρωση των στοιχείων λοιπόν από τον αέρα σε µετρήσιµες συγκεντρώσεις, µετατρέπει τα βρύα σε ιδανικό µέσο δειγµατοληψίας για βαρέα µέταλλα και άλλα ιχνοστοιχεία. Στοιχεία που αποκτήθηκαν από βρύα αντιπροσωπεύουν περίπου το κλάσµα των στοιχείων που υπάρχουν στο άµεσο περιβάλλον τους. Ως εκ τούτου, αυτοί οι οργανισµοί αντικατοπτρίζουν µια εύλογη ισορροπία µεταξύ των απαιτήσεών τους και της διαθεσιµότητας των στοιχείων στο περιβάλλον τους. [51] Η ηλικία των βρύων µπορεί εύκολα να προσδιοριστεί, σε αντίθεση µε ορισµένα είδη λειχήνων. Και η εξάπλωση σε µεγάλες γεωγραφικές περιοχές, επιτρέπει τη σύγκριση της περιεκτικότητας σε ρύπους των οικοσυστηµάτων από διαφορετικές περιοχές [52-54] Ένα σηµαντικό χαρακτηριστικό των βρύων είναι ο αργός ρυθµός ανάπτυξης και η σχετικά µεγάλη επιφάνεια εν συγκρίσει µε την αναλογία βιοµάζας. Έχει υπολογιστεί ότι αυτοί οι λειχήνες έχουν 10 φορές µεγαλύτερη επιφάνεια σε σχέση µε εκείνη των ποώδων αγρωστωδών [77,78] Ως αιώνιοι και αργά αναπτυσσόµενοι οργανισµοί, διατηρούν µια αρκετά οµοιόµορφη µορφολογία στο χρόνο και αυτό παρέχει ένα αρχείο της ιστορίας της ραδιοµόλυνσης στο περιβάλλον, διατηρώντας τη µνήµη του παρελθόντος της ρύπανσης [55] Η έλλειψη της κηρώδους επιδερµίδας και των συναφών στοµάτων σηµαίνει ότι πολλοί ρυπαντές δύνανται να απορροφηθούν σε όλη την εξωτερική επιφάνεια [56] Τα βρύα συσσωρεύουν σε µεγάλο βαθµό και διατηρούν µια ποικιλία ρύπων, ιδιαίτερα ραδιονουκλιδίων, µε παθητική διαδικασία και ως εκ τούτου είναι πάρα πολύ χρήσιµα στην συλλογή στοιχείων για τοπικά και χρονικά πρότυπα εναπόθεσης ρυπαντών. [57] Οι επιφυτικοί λειχήνες, µεταξύ των οποίων και Evernia prunastri, που ελήφθησαν από φλοιό πεύκων στο ύψος του στήθους, την περίοδο του Ιανουαρίου-Μαϊου, παρουσιάζουν διαφορετική 21

22 ευαισθησία στην µόλυνση από SO2 στη Θεσσαλονίκη και όξινο ph 4,9 + 0,4. Ο µύκητας Evernia prunastri είναι από τους πιο διαδεδοµένους λειχήνες καρποφόρων στην Β.Ελλάδα και παρουσιάζει ιδιαίτερη αντοχή στη µόλυνση [49] Είναι ιδιαίτερα ανθεκτικοί οργανισµοί ακόµα και σε ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες, και γι αυτό είναι εξαπλωµένοι παντού και διαθέσιµοι όλες τις εποχές [79,80] Ένα άλλο πλεονέκτηµα της χρήσης των βρύων ως βιοδείκτες είναι ότι η διαδικασία της δειγµατοληψίας είναι πολύ πιο απλή, και επιτρέπει µια γρήγορη επισκόπηση των εκτεταµένων περιοχών µε σχετικά χαµηλό κόστος. Τα δεδοµένα ραδιο-µολύνσεων που λαµβάνονται από τα βρύα παρουσιάζουν πολύ µικρότερη µεταβλητότητα εν συγκρίσει µε αυτά από άλλα φυτά. [58,59] Η προετοιµασία των συλλεγόµενων υλικών είναι πολύ απλή, δεν υπάρχει ανάγκη για χρήση χηµικών για την παραλαβή των και τα φάσµατα ακτινοβολίας γάµµα µπορούν να ληφθούν από τα δείγµατα. Όσο υψηλότερες είναι οι συγκεντρώσεις των στοιχείων στα βρύα, τόσο απλούστερη η διαδικασία της ανάλυσης [60,61] Έξι διαφορετικά είδη από λειχήνες (Parmelia sulcata Tayl., Evernia prunastri (L.) Ach., Ramalina farinacea, Pseudevernia furfuracea (L.) Zopf., Usnea sp. και Lobaria Pulmonaria (Schreb.) Hoffm.) από δύο ορεινές κοιλάδες των Κεντρικών Πυρηναίων ελέγχθηκαν µε δυο πολυπαραγοντικές τεχνικές -ANOVA και ιαχωριστική Ανάλυση (DA) για την τοπική κατανοµή PAHs και απέδειξαν ότι η χωρική κατανοµή των λειχηνών σχετίζεται µε τις διαδικασίες καύσης και την τοξικότητα, ενώ παρατηρήθηκαν και διαφορετικές συµπεριφορές έκαστου λειχήνα ενώ η Ε. prunastri βρέθηκε να είναι η πλέον κατάλληλη για την παροχή πληροφοριών σχετικά µε τις τοπικές κατανοµές. Φυσικά η σηµαντικότερη επιρροή στη βιοσυσσώρευση έκαστου είδους λειχήνας ήταν η κίνηση. [81] Στις εύκρατες περιοχές της Ευρώπης, όπως Ελλάδα, τα βρύα είναι οι 22

23 πιο συχνά χρησιµοποιούµενοι βιοδείκτες, καθώς επιτρέπουν την σύγκριση δεδοµένων [54] Το ατύχηµα στο πυρηνικό αντιδραστήρα του Τσερνοµπίλ το 1986, είχε ως αποτέλεσµα στη διασπορά και την παγκόσµια απελευθέρωση των προϊόντων σχάσης, ιδίως 137Cs και λόγω των σφοδρών βροχοπτώσεων σηµαντικές εναποθέσεις στο έδαφος της Β.Ελλάδας [82] Μετά το ατύχηµα του αντιδραστήρα στο Τσερνοµπίλ, πολυάριθµες µελέτες που αφορούν την παρακολούθηση των µακρόβιων προϊόντων σχάσης 137Cs πραγµατοποιήθηκαν χάρη στον µύκητα της βαλανιδιάς. [62,63] Οι S. Munzi et al, [64] διερεύνησαν την φυσιολογική απόκριση του επιφυτικού λειχήνα Evernia prunastri σε αληθινές στο περιβάλλον συγκεντρώσεις των αζωτούχων ενώσεων µε στόχο να αποδείξουν τη χρησιµότητά του ως πρώιµο δείκτη περιβαλλοντικής περίσσειας αζώτου. είγµατα Λειχήνων ψεκάσθηκαν για 4 εβδοµάδες, είτε µε νερό ή 50, 150 και 500 µm NH4Cl και αναλύθηκε η ακεραιότητα των µεµβρανών των κυττάρων και η εκποµπές φθορισµού της χλωροφύλλης (FV / FM και PIABS), και διαπιστώθηκε ότι δεν προέκυψε καµία ζηµία στη µεµβράνη µετά την περίοδο της έκθεσης.ο FV / FM, ένας κλασσικός δείκτης φθορισµού, µειώθηκε κατά την διάρκεια της δεύτερης εβδοµάδας της θεραπείας µε 500 µm NH4Cl και την τρίτη εβδοµάδα µε 50 και 150 µmnh4cl, ενώ ο PIABS, ένας συνολικός δείκτης της φωτοσυνθετικής απόδοσης, φάνηκε περισσότερο ευαίσθητος και µειώθηκε ήδη κατά την πρώτη εβδοµάδα µε 500 µmnh4cl και τη δεύτερη εβδοµάδα µε 150 µmm NH4Cl. Μετά από 4 έως 24 ώρες παρατεταµένη έκθεση του λειχήνα σε Cu, παρατηρήθηκε ότι αν και ο βαθµός της συνολικής καθώς και ενδοκυτταρικής πρόσληψης Cu ήταν συγκρίσιµος, οι µεταβολικές αποκρίσεις διέφεραν αισθητά. Τα καροτενοειδή,η εργοστερόλη και οι διαλυτές πρωτεϊνες µειώθηκαν λόγω της έκθεσης σε Cu και αυτές οι διαδικασίες ακολουθήθηκαν µε µια αύξηση της περιεκτικότητας υπεροξειδίου. Η περίσσεια του Cu στο θαλό του Ε. prunastri µετά από 24 ώρες ήταν τοξική και µετέβαλλε σχεδόν όλες τις δοκιµαζόµενες παραµέτρους, συµπεριλαµβανοµένης της µείωσης των σακχάρων. Ακόµα δεν παρατηρήθηκε διέγερση της σύνθεσης των ελεύθερων αµινοοξέων στους εκτιθέµενους σε Cu λειχήνες, και µάλιστα το περιεχόµενο πολλών συγκεκριµένων αµινοξέων µειώθηκε, ενώ τέλος η περιεκτικότητα σε ολικές ευδιάλυτες φαινόλες παρέµεινε αναλλοίωτη στην περίσσεια Cu. [65] Οι λειχήνες αποτελούν εξαιρετικό µοντέλο για τη µελέτη της βιοσυσσώρευσης βαρέων µετάλλων, αλλά είναι περιορισµένες πληροφορίες διαθέσιµες για τους µοριακούς µηχανισµούς που συµβαίνουν κατά τη διάρκεια της βιοσυσσώρευσης. Οι Nicolardia et al [66] παρατήρησαν τις αλλαγές του πρωτεώµατος λειχήνα κατά τη διάρκεια της έκθεσης σε σταθερές συγκεντρώσεις του υδραργύρου, και ανακάλυψαν ότι οι περισσότερες εξ αυτών αναφέρονται σε πρωτεΐνες της φωτοσυνθετικής οδού, όπως η υποµονάδα ΙΙ του ενεργού κέντρου του χλωροπλαστικού 23

24 φωτοσυστήµατος Ι, η αναγωγική του οξυγόνου πρωτεΐνη και η β υποµονάδα της χλωροπλαστικής ΑΤΡ συνθάσης. Ο υδράργυρος λοιπόν δρά τοξικά ενάντια στη φωτοσύνθεση και αυτό διαφαίνεται και από τις αλλαγές στο περιεχόµενο των φωτοσυνθετικών χρωστικών (χλωροφύλλη α και β, και β- καροτένιο), και στη δοµή των µεµβρανών των θυλακοειδών κυττάρων, και την συµµετοχή στρες πρωτεϊνών σχετικών µε το στρές(όπως η Hsp70) αλλά δεν επηρεάζει τις κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες. Τα αποτελέσµατα υποδεικνύουν ότι οι λειχήνες δύνανται να προσαρµοστούν στην έκθεση σε υδράργυρο µε την αλλαγή της µεταβολικής παραγωγή ενέργειας. Είναι γνωστό ότι η Evernia prunastri [67,68] όπως και οι Hypogymnia physodes, Η. tubulosa, Lepraria incana, Pseudevernia furfuracea ήταν τα πιο συχνα παρατηρούµενα οξεόφυτα που οξειδώνουν τον φλοιό σε επτά τοπικά είδη Quercus. O λειχήνας Parmelia caperata που ελήφθη από κορµό βαλανιδιάς, χρησιµοποιήθηκε ώς βιολογικός δείκτης υπολογισµού ραδιενέργειας και µόλυνσης αέρα, σε περιοχές της Κεντρικής Ιταλίας, ενώ σε αυτές τις έρευνες εµφανίστηκε συχνά και ο µήκυτας Evernia Prunastri [69-74] Οι Sawidis et al,απέδειξαν ότι διάφοροι άλλοι µήκυτες δέντρων όπως οι βαλανιδιές, µπορούν να χρησιµοποιηθούν αποτελεσµατικά ως βιολογικοί ανιχνευτές της κατανοµής ραδιονουκλιδίων, µε χρήση 137 Cs,ακόµα και 20 χρόνια µετά την διασπορά τους (ατύχηµα Τσερνόµπιλ).Χαρακτηριστικά δε στο φλοιό των πλατύφυλλων (βελανιδιά και Fagus) το ποσοστό ραδιενεργών σωµατιδίων ήταν υψηλότερο από εκείνο των κωνοφόρων (Pinus). [75] Οι µήκυτες συλλέγονταν από 0.5 έως 2.0m ύψος από το έδαφος στο σύνολο των περιπτώσεων [69-75] Η θαλός της Cetraria islandica (Ισλανδική βρύα) και η Evernia prunastri (βρύα βελανιδιάς) περιέχουν σηµαντικές ποσότητες της γραµµικής (1-3), (1-4) -β- γλυκανικής λειχενίνης (λειχενάνη), η οποία διαφέρει στις αναλογίες των οµάδων σύνδεσης σε κάθε είδος. [83] Η ανοσοκυτταροχηµική θέση της λειχενάνης στο θαλλό ανευρίσκεται µε τη χρήση ένα µονοκλωνικού αντισώµατος (κριθαρικό αντι (1-3), (1-4) -β-γλυκανικό αντίσωµα) και µε τεχνικές µικροσκοπίας σάρωσης ηλεκτρονίων (LTSEM) σε χαµηλή θερµοκρασία. [83] Το αντίσωµα δεν στάθηκε δυνατό να προσδιοριστεί σε επισηµασµένα υπέρλεπτα τµήµατα των βρύων Ε. prunastri.υπάρχουν όµως ενδείξεις που υποδεικνύουν ότι εντοπίζεται σε µεγάλες περιοχές αποθήκευσης νερού [83] Με τις LTSEM παρατηρήσεις και ανοσοκυτταροχηµικά στοιχεία προκύπτει σαφώς ότι η lichenin είναι µία δοµική ένωση, και όχι ένα προϊόν αποθήκευσης, µε σηµαντικές λειτουργίες στις δράσεις του νερού στον θαλλό. [83] 24

25 3.6 Ανάλυση-σύσταση µύκητα Evernia prunastri Η ανάλυση της Evernia Prunastri, έδειξε ότι αυτή περιέχει ατραρικό οξύ, ορσινόλη, ουσνικό οξύ ορσινολικό µονοµεθυλαιθέρα, µεθυλοορσελινεστέρα, µεθυλικό αιµατοµεστέρα, ατρανόλη, αραµπινιτόλη, σπαρασσόλη,ορσελλινικό οξύ, λινολεικό οξύ,ολεικό οξύ, στεαρικό οξύ, παλµιτικό οξύ,λιχεστερόλη,εργοστερόλη,εβερνικό οξύ. [84,85] Το συνολικό φαινολικό περιεχόµενο των µελετηµένων εκχυλισµάτων λειχηνών καθορίζεται µε την µέθοδο Folin-Ciocalteu [86]. Και η Evernia prunastri έχει το µικρότερο ποσό (78,12 mg ) γαλλικού οξέος (GA) / g τ. Το συνολικό περιεχόµενο φλαβονοειδών έχει υπολογιστεί µε χρήση χλωριούχου αλουµινίου [87]. Και η Evernia prunastri έχει το µικρότερο ποσό φλαβονοειδών ( mg) ρουτίνη/ g συγκριτικά από όλα τα εως σήµερα µελετηµένα εκχυλίσµατα λειχηνών. Αναπτύχθηκε µια επικυρωµένη µέθοδο υγρής χρωµατογραφίας-µε παράλληλη φασµατοµετρία µάζας παράλληλα µέθοδος για την ποσοτική ανάλυση των δυνητικών από βρύα βελανιδιάς αλλεργιογόνων atranol και chloroatranol σε αρώµατα και συναφή προϊόντα. Η µέθοδος χρησιµοποιεί LC-MS-MS µε ιονισµό ηλεκτροψεκασµού (ESI) στην αρνητική κατάσταση. Οι ενώσεις αναλύονται µε επιλεκτική παρακολούθηση της αντίδρασης (SRM) από 2 ή 3 ιόντα για κάθε ένωση, προκειµένου να επιτευχθεί υψηλή επιλεκτικότητα και ευαισθησία. Η µέθοδος έχει επικυρωθεί για τις ακόλουθες παραµέτρους: γραµµικότητα, επαναληψιµότητα, ανάκτηση,όριο ανίχνευσης, και όριο ποσοτικοποίησης. Τα όρια ανίχνευσης, 5,0 ng / ml και 2,4 ng / ml, αντίστοιχα, για atranol και chloroatranol, που επιτυγχάνονται µε αυτή τη µέθοδο επέτρεψαν την ταυτοποίηση αυτών των ενώσεων σε συγκεντρώσεις κάτω από αυτές που προκαλούν αλλεργικές δερµατικές αντιδράσεις σε ευαίσθητους σε βρύα βελανιδιάς ασθενείς. Η ανάκτηση της chloratranol από αρώµατα ήταν 96 ± 4%. Χαµηλές ανακτήσεις (49 ± 5%) παρατηρήθηκαν για την atranol σε αρώµατα, υποδεικνύοντας καταστολή ιόντων που προκαλείται από τα συστατικά του υποστρώµατος. Η µέθοδος έχει εφαρµοστεί για την ανάλυση 10 τυχαία επιλεγµένων αρωµάτων και παρόµοιων προϊόντων. [88] Ακόµα οι Bossi et al, µε την χρήση LC-MS-MS µε αρνητικό ηλεκτροψεκασµό (-ESI) κατάφεραν να ανιχνεύσουν την ατρανόλη και χλωροατρανόλη σε 5.0 ng/ml and 2.4 ng/ml αντίστοιχα, δηλαδή πολύ πιο κάτω από τα όρια που προκαλούν αλλεργία. [88] Από συνολικά 31 προϊόντα κοσµετολογίας που διερευνήθηκαν µε LC-ESI-MS-MS αποδείχθηκε ότι το 87% εξ αυτών περιείχε συστατικά των µυκήτων βελανιδιάς ατρανόλη και χλωροατρανόλη και ως εκ τούτου ήταν δυνητικά ιδιαίτερα αλλεργιογόνα. [89] Ερευνητές ανιχνεύσαν και ποσοτικοποίησαν το ατραρικό οξύ, µε χρήση GC/MS σε δρόγες προερχόµενες από βελανιδιά µε µύκητα Evernia Prunastri. Αυτό συνδέεται µε το δεψίδιο ατρανορίνη που είναι φυσικό παράγωγο των µηκύτων του γένους Parmelia [90] 25

26 Περισσότερα από 170 συστατικά από εκχυλίσµατα oakmoss έχουν αναφερθεί, συµπεριλαµβανοµένων 47 δεψιδίων και 25 τριτερπενίων ή στεροειδών. [36] Η απευθείας ανάλυση των πτητικών εκχυλισµάτων του oakmoss µε GC, δηµιουργήσε αρκετά προβλήµατα λόγω των µη πτητικών συστατικών του που παρέµεναν κολληµένα µέσα στο χρωµατογραφικό σύστηµα και απαιτούσαν επεξεργασία όπως η σιλιλύωση. Έχουν αναφερθεί ηµιποσοτικές αναλύσεις του oakmoss απευθείας µε GC χωρίς επεξεργασία αλλά µε περιορισµένο ενδιαφέρον. [91,92] Άλλη τεχνική για ανίχνευση µικροποσοτήτων της τάξεως των p.p.m. σε ουσίες ατρανόλη και χλωροατρανόλη έχει αναφερθεί να είναι η atomatic liner exchange (ALEX ) [93] Πίνακας 4. Ουσίες που έχουν ανευρεθεί στον µύκητα Evernia Prunastri [36] εψίδια και Αναφορά 4,6-Dimethyl-4-decen-3-one 109 διβενζοφουράνια Evernic acid 94 Methyl oleate 98 Barbatic acid 95 (8Z)-1,8-Heptadecadiene 109 Atranorin 95 Methyl hexadecanoate 98 Chloroatranorin 96 (8Z,11Z)-1,8,11-Heptadecatriene 33 Thamnolic acid 95 Methyl octadecanoate 98 Divaricatic acid 97 1,2-di-p-Tolylethane 110 Lecanorin 98 Τριτερπένια και στεροειδή Αναφορά Lecanoric acid 99 3 β-hydroxy-olean-12-ene (=β-amyrin) 111 Evernin 100 3β-Hydroxy-urs-12-ene (=α-amyrin) 111 Prunastric acid 99 Ursolic acid 110 Methyl 3 -methyllecanorate 99 3β-Hydroxy-olean-12-en-11-one (=βamyrenonol) Methylevernic acid 99 3β-Hydroxy-30-nor-hopan-22-one O-Methylevernic acid 98,99 3β-Hydroxy-30-nor-hop-5-en-22-one 113 2,4-di-O-Methylgyrophoric 98,99 30-nor-Lupan-3,22-dione 113 acid (+)-Usnic acid 101 3β-Hydroxy-30-nor-lupan-22-one 113 Μονοαρωµατικές ενώσεις Αναφορά 3β-Hydroxy-6α-acetoxy-30-nor-hop en-22-one Orcinol 102,103 Taraxerol 110 β-orcinol 102,103 Isomultiflorenone 111 Atranol 95,102,103 Friedelin 110 Orcinol monomethylether 102, nor-21αH-Hopan-3,22-dione 110 β-orcinol monomethylether 103 Moretenone 110 Orsellinic acid 104 Lanosterol 110,111 Ethyl orsellinate 105 Lupeol 110 Methyl orsellinate Lup-20(29)-en-3-one 111 Methyl β-orcinolcarboxylate 95 β-amyrenone 111 Ethyl β-orcinolcarboxylate 103 Betulin 111 Haematommic acid 97 3β-Hydroxyhopan-29-oic acid 111 Methyl haematommate 97 3β-Hydroxy-6-acetoxyhopan-29-oic

27 acid Ethyl haematommate 97, Methylenecycloartan-3-one 111 Everninic acid Isomultiflorenol acetate 111 Sparassol 104 Ergosterol-5α,8α-peroxide 111 Ethyl everninate 103,106 3β-Hydroxy-5,8-epidioxyergosta ,9(11),24(28)-triene Rhizonic acid (22S)-6-O-Acetyl-21βH-hopane β,6β,22,29-tetrol Methyl rhizonate Πτητικά τερπένια Αναφορά 3,5-Dimethoxytoluene 103 Fenchone 101 Χλωριωµένα µονοαρωµατικά Αναφορά β-elemene 91,98,115 Ethyl 5-chloroorsellinate 97 Linalool 98,101 Ethyl chloroatrarate 97 α-copaene 98,101 Ethyl chlorohaematommate 106 Myrtenal 101 Ethyl 5-chloroeverninate 97,105 β-gurjunene 98,115 Chloroatranol 96,97,103 Myrtenol 98 2-Chloro-3-methoxy-5-97 α-cedrene 98 methylphenol 4-Chloro-3-methoxy-5-97 Terpinolene 98 methylphenol 2,4-Dichloro-3-methoxy-5-97 β-caryophyllene 98,115 methylphenol 2,6-Dichloro-3-methoxy-5-97 cis-carveol 98 methylphenol Παράγωγα Divarinol Αναφορά Longifolene 91,98,115 Divarinol 103 p-cymen-8-ol 98 Divarinol monomethyl ether 103 β-humulene (probably α-) 115 Divaricatinic acid 97 α-thujone 102,103 Methyl devaricatinate 97 α-muurolene 115 Ethyl devaricatinate 97, 107 β-thujone 102,103 ιάφορα Συστατικά Αναφορά β-selinene 115 Octanal 97 Citronellol 102 Phenol 97,102 Thujopsene 115 Nonanal 97 Geraniol 102 Acetophenone 97 α-guaiene 98 Decanal 97 Camphor Methylacetophenone 97 (E)-β-Farnesene 98 Undecanal 97 Borneol Phenyl-1-pentanone 97 1,8-Cineole 102,103 Benzaldehyde 97 α-pinene 102 Vanillin 97 Rimuene 101 3,5-Dimethylbenzaldehyde 97 β-pinene 103,115 Ethyl phenylacetate 97 Isophytol 97 2-Heptanone 97 Camphene 98 Ethyl furoate 97 Myrcene 98 6-Methyl-2-heptanone 97 Limonene 98 Methyl salicylate 98 α-ionone 97 2-Octanone 97 p-cymene 98 27

28 Hexanoic acid 97 β-ionone Nonanone 97 α-p-dimethylstyrene Heptanoic acid 97 cis-γ-irone 97 2-Decanone 97 β-terpinene 98 Octanoic acid 97 trans-α-irone 97 2-Undecanone 97 Fenchyl alcohol 98 Nonanoic acid 97 cis-α-irone 97 2-Dodecanone 97 1-Terpinen-4-ol 98 Hexadecanoic acid Terpinen-8-ol 98 2-Tridecanone 97 Thymol 98 Octadecanoic acid 102 trans-pinocarveol 98 2-Tetradecanone 97 1-p-Menthen-4-ol 115 Linoleic acid 97,108 6-Methyl-5-hepten-2-one 97 2-Pentadecanone 97 Carvone 97 Linolenic acid 105 Dihydrocarvone 97 4,5/4,6-Dimethyl-3-octanone 97 Bornyl acetate 97 Ethyl linoleate 105 Συστατικά µε άζωτο Αναφορά 5,6-Dimethyl-3-hepten-2-one 97 1-Ethyl-1H-pyrrole-2-carboxaldehyde 97 Ethyl linolenate Isopentyl-1H-pyrrole-2-97 carboxaldehyde 5-Methyl-2-cyclohexen-1-one 97 N,N-Dimethyl-p-toluenesulphonamide 101,104 Methyl tetradecanoate 98 28

29 4. Αέρια Χρωµατογραφία Πολλές διαδικασίες έχουν χρησιµοποιηθεί για την ταυτοποίηση σύνθετων µιγµάτων αιθέριων ελαίων των φυτών χωρίς να αποφέρουν όλες ικανοποιητικά αποτελέσµατα. Η χρήση αέριας χρωµατογραφίας-φασµατοσκοπίας µάζας σε συνδυασµό µε την βιβλιογραφική αναζήτηση γνωστών φασµάτων µάζας και των χρόνων κατακράτησης (RT) µπορούν να αποτελέσουν ένα αξιόπιστο εργαλείο για την ταυτοποίηση των συστατικών Εισαγωγή στην Αέρια Χρωµατογραφία Η αέρια χρωµατογραφία χρησιµοποιείται για την ανάλυση πτητικών ουσιών σε φάρµακα, καλλυντικά προϊόντα, βιολογικά υλικά, χρώµατα, παράγωγα πετρελαίου, τρόφιµα, βιοµηχανίες αρωµατοποιΐας κ.α. Γενικά χρησιµοποιείται για ενώσεις που έχουν ικανοποιητική τάση ατµών στη θερµοκρασία στην οποία γίνεται η ανάλυση. Με τον όρο αέρια χρωµατογραφία αναφερόµαστε σε µια χρωµατογραφική µέθοδο διαχωρισµού, στην οποία η κινητή φάση είναι ένα αδρανές αέριο (π.χ. Ν2, He κ.λπ) και η στατική φάση µπορεί να είναι ένα στερεό αδρανές υλικό [οπότε έχουµε την αέρια στερεά χρωµατογραφία (Gas Solid Chromatography, GSC)] ή ένα υγρό, οπότε έχουµε την αέρια υγρή χρωµατογραφία (Gas Liquid Chromatography, GLC).. [116] Ο αέριος χρωµατογράφος παρέχει τη δυνατότητα υψηλής διαχωριστικής ικανότητας και ποσοτικού προσδιορισµού των συστατικών του δείγµατος. Μία τυπική διάταξη όπως φαίνεται στο σχήµα, αποτελείται από τα επιµέρους τµήµατα: 1) Φιάλες και σωληνώσεις για την αέρια κινητή φάση. 2) ιάταξη εισαγωγής του δείγµατος στο χρωµατογράφο. 3) Στήλη η οποία βρίσκεται θερµοστατούµενη σε φούρνο. 4) Ανιχνευτή 5) Σύστηµα καταγραφής αποτελεσµάτων Η διάταξη ενός αερίου χρωµατογράφου δίνεται στο παρακάτω σχήµα: 29

30 Εικόνα 2: ιάταξη Αέριου Χρωµατογράφου(ΑΝΑΛΥΤΙΚΑ) Ο διαχωρισµός των συστατικών ενός µίγµατος βασίζεται στην κίνηση των συστατικών, µέσα στη στήλη, µε διαφορετική ταχύτητα. Η ταχύτητα κάθε συστατικού εξαρτάται από την τάση ατµών που εµφανίζει αυτό στη δεδοµένη θερµοκρασία, από την ταχύτητα ροής του φέροντος αερίου και από το συντελεστή κατανοµής του συστατικού ανάµεσα στις δύο φάσεις. Έτσι η διαδικασία που λαµβάνει χώρα κατά την αέρια χρωµατογραφία, εν συντοµία έχει ως εξής: Το φέρον αέριο (συνήθως Ν2, Ηe, H2, Ar), που βρίσκεται εντός φιάλης υψηλής πίεσης, οδηγείται στη στήλη διερχόµενο από ειδικούς ρυθµιστές παροχής. Η εισαγωγή του προς ανάλυση δείγµατος γίνεται µε ειδική µικροσύριγγα στη βαλβίδα εισαγωγής του δείγµατος στην κορυφή της στήλης. Το µέγεθος του δείγµατος καθορίζεται από πολλούς παράγοντες, π.χ. την ευαισθησία του ανιχνευτή, τη χωρητικότητα στήλης και τη διαθέσιµη ποσότητα. Στο θάλαµο εισαγωγής το δείγµα εξαερώνεται σχεδόν ακαριαία και το φέρον αέριο συµπαρασύρει τους ατµούς του δείγµατος και τους φέρνει στη στήλη όπου υπάρχει η στατική φάση. Κατά συνέπεια τα συστατικά του δείγµατος συµπαρασύρονται από το φέρον αέριο κατά µήκος της στήλης και διαχωρίζονται. Τα συστατικά του µίγµατος διαχωρίζονται µέσα στη στήλη και συµπαρασυρόµενα από το φέρον αέριο βγαίνουν από τη στήλη ξεχωριστά. Στη συνέχεια, το κάθε συστατικό εισέρχεται στον ανιχνευτή ο οποίος το ανιχνεύει και παρέχει το σχετικό ηλεκτρικό σήµα. Το ηλεκτρικό σήµα του ανιχνευτή, ενισχυόµενο, διαβιβάζεται στην είσοδο του καταγραφέα όπου 30

31 και καταγράφεται. Η γραφική απεικόνιση του σήµατος εισόδου, σε mv, σε σχέση µε το χρόνο συγκρατήσεως των συστατικών, αποτελεί το χρωµατογράφηµα. Ο χρόνος συγκρατήσεως αποτελεί, κάτω από ορισµένες προϋποθέσεις, ποιοτικό µέτρο του συστατικού που καταγράφεται. Το εσωτερικό εµβαδόν, µεταξύ της καµπύλης του σήµατος και της βασικής γραµµής, αποτελεί ποσοτικό µέτρο της παρουσίας του συστατικού µέσα στο δείγµα που εξετάζεται. Ως φέρον αέριο µπορεί να χρησιµοποιηθεί κάθε αέριο σε υπερκάθαρη κατάσταση, το οποίο µπορεί να διαφοροποιηθεί στον ανιχνευτή, από τα διάφορα συστατικά του µίγµατος. Συνήθη αέρια που χρησιµοποιούνται στην GC είναι το ήλιο (He), το αργό (Ar), το άζωτο (N2) και το υδρογόνο (Η2). Ωστόσο για λόγους ασφαλείας, αλλά και επειδή το ήλιο προωθείται ευκολότερα από το υδρογόνο µέσω των βαλβίδων της φιάλης, προτιµάται ως κινητή φάση στην GC/MS λόγω της διατήρησης κατάλληλης πίεσης στο σύστηµα κενού του φασµατόµετρου µάζας. Υπάρχουν δύο κυρίως τύποι τριχοειδών στηλών: α) Οι τριχοειδείς στήλες στατικής φάσης, Wall Coated Open Tubular (WCOT). β) Οι τριχοειδείς στήλες υλικών πλήρωσης και στατικής φάσης, Support Coated Open Tubular (SCOT). Το δείγµα, συνήθως όγκου 1-2µL εισάγεται στο ρεύµα του φέροντος αερίου στην αρχή της στήλης µε µια µικροσύριγγα, διαµέσου µιας ελαστικής πλακέτας ή διαφράγµατος (septum). H ταχύτητα και η ικανότητα του διαχωρισµού εξαρτώνται από τη θερµοκρασία. Για αυτό το λόγο η στήλη βρίσκεται σε φούρνο, του οποίου η θερµοκρασία ελέγχεται αυστηρά. Ο διαχωρισµός επιτυγχάνεται εξαιτίας των ποικίλων δυνάµεων συγκράτησης και έκλουσης ανάµεσα στα συστατικά του µίγµατος, το υλικό κάλυψης του εσωτερικού της στήλης ή το υλικό πλήρωσης αυτής και της ροής του φέροντος αερίου. [ ] 4.2 Επιλογή της Στήλης Η επιλογή της στήλης πραγµατοποιείται αναλόγως του προς εξέταση δείγµατος και της πείρας του αναλυτή. Ο γενικός κανόνας υπαγορεύει την χρήση στηλών µε πολικό υλικό πλήρωσης, για την ανάλυση πολικών ενώσεων, ενώ για την ανάλυση µη πολικών ενώσεων χρήση µη πολικών στηλών. Η 31

32 στατική φάση της στήλης επηρεάζει την εκλεκτικότητά της στις διάφορες ενώσεις και η επιλογή της πρέπει να γίνεται λαµβάνοντας υπόψη παράγοντες όπως πολικότητα, αδράνεια σε ενεργές ενώσεις, ανώτατο θερµοκρασιακό όριο κ.α. Εποµένως η επιτυχής έκβαση της αέριας χρωµατογραφικής ανάλυσης στηρίζεται στην ικανότητα της στήλης να διαχωρίζει τα διάφορα συστατικά. Η απόδοση της στήλης αέριας χρωµατογραφίας εξαρτάται από : 1) Το µήκος της στήλης 2) τη διάµετρο της στήλης 3) την ποσότητα της Υγρής Στατικής Φάσης 4) τα πορώδη Πολυµερή 5) την ταξινόµηση Υγρών Στατικών Φάσεων: 6) τους δείκτες συγκράτησης Οι δείκτες συγκράτησης Kovats (RI), εκφράζουν τα δεδοµένα συγκράτησης δείχνοντας σε ποια θέση θα εµφανιστούν οι ενώσεις σε ένα χρωµατογράφηµα, ως προς τα αλκάνια ευθείας αλυσίδας που εισάγονται µε το δείγµα. [122] Τα δύο πιο γνωστά και ευρέως χρησιµοποιούµενα ευρετήρια είναι το 'Kovats Retention Index' και το 'Van den Dool και Kratz'. Το πρώτο αποτελεί χρήσιµο εργαλείο για την σύγκριση δεδοµένων κατακράτησης σε διαφορετικές συνθήκες. Είναι σχεδόν ανεξάρτητο από πολλές παραµέτρους και συνθήκες της αέριας χρωµατογραφικής ανάλυσης (σύσταση στατικής φάσης της στήλης, διάµετρος και µήκος στήλης, θερµοκρασία και ταχύτητα ροής του φέροντος αερίου). Το σηµαντικότερο µειονέκτηµα του είναι ότι µπορεί να εφαρµοστεί µόνο για ισόθερµα προγράµµατα ανάλυσης. Το ευρετήριο Van den Dool και Kratz βρίσκει εφαρµογή σε θερµοκρασιακά προγράµµατα εφόσον αυτά είναι γραµµικά [122,123] Η συλλογή του Adams [124a,b,c] αποτελεί την πιο γνωστή δηµοσιευµένη συλλογή για τα αιθέρια έλαια και ακολουθούν οι ηλεκτρονικές συλλογές αιθέριων ελαίων ESO 2000, Database of Essential Oils και Vinogradov. Εποµένως η επιλογή της στήλης εξαρτάται από τη φύση των προσδιοριζόµενων ενώσεων και από τη διαχωριστική ικανότητα (αριθµός θεωρητικών πλακών), τη µέγιστη θερµοκρασία λειτουργίας και τα γεωµετρικά χαρακτηριστικά της στήλης. 32

33 Αναστασιλάκης Δ. Χρυσόστομος Οι στήλες που χρησιµοποιούνται στη αέρια χρωµατογραφία όπως προαναφέραµε, διακρίνονται σε στήλες πλήρωσης γεµισµένες µε διάφορες στατικές φάσεις (packed columns) και σε τριχοειδείς µε εσωτερική επικάλυψη από διάφορα συστατικά (capillary ή open tubular columns). Εικόνα 3. Χρωµατογραφικές στήλες α)πληρώσεως β) τριχοειδείς [116] Πιο συγκεκριµένα οι στήλες πλήρωσης αποτελούνται από έναν µεταλλικό ή γυάλινο σωλήνα (1-10 m, 2-9 mm i.d.) πληρωµένο µε ένα κοκκώδες αδρανές υλικό το οποίο επικαλύπτεται µε λεπτό υµένιο το οποίο αποτελεί τη στατική φάση. Οι τριχοειδείς στήλες είναι σωλήνες πολύ µικρής διαµέτρου (0,1-0,5 mm) και µεγάλου µήκους (10-60m) τα εσωτερικά τοιχώµατα των οποίων επικαλύπτονται µε τη στατική φάση. Ανάλογα µε τον τρόπο µε τον οποίο τοποθετείται και ακινητοποείται η στατική φάση στη στήλη, οι τριχοειδείς στήλες διακρίνονται σε: τριχοειδείς στήλες υγρής στατικής φάσης (WCOT), τριχοειδείς στήλες υλικού πλήρωσης και στατικής φάσης (SCOT) και τριχοειδείς στήλες πορώδους στιβάδας (PLOT).[119,125] 4.3. Φούρνος της στήλης Ο φούρνος µέσα στον οποίο τοποθετείται η στήλη πρέπει να καλύπτει ένα µεγάλο εύρος θερµοκρασιών: ºC. Οι πληροφορίες που παίρνουµε στην αέρια χρωµατογραφία βασίζονται στην απόλυτη επαναληψιµότητα των δεδοµένων των χρόνων συγκράτησης. Για το λόγο αυτό ο φούρνος πρέπει να είναι ακριβής (συνήθως µε ακρίβεια 0,1ºC) και τυχόν µεταβολές της θερµοκρασίας κατά την πορεία µιας ανάλυσης πρέπει να είναι οι ελάχιστες δυνατές. Οι σύγχρονοι φούρνοι είναι ηλεκτρονικοί µε σωστό εξαερισµό και ελέγχονται από µικροϋπολογιστές, ώστε οι επικρατούσες συνθήκες στον περιβάλλοντα χώρο της στήλης µέσα στο φούρνο πρέπει να είναι αυστηρά επαναλήψιµες [116, ] 33

34 4.4 Ανιχνευτές αέριας χρωµατογραφίας Ο ανιχνευτής παρέχει µία απόκριση µε τη µορφή µετρήσιµου σήµατος, ανάλογα µε τη συγκέντρωση ή την ποσότητα ενός συστατικού που περνά µέσα από αυτόν. Η απόκριση αυτή πρέπει να έχει µορφή σήµατος που να µπορεί να µετρηθεί. Οι ανιχνευτές που χρησιµοποιούνται στην αέρια χρωµατογραφία είναι: - Ανιχνευτής ιονισµού φλόγας, FID - Ανιχνευτής θερµικής αγωγιµότητας ή καθερόµετρο, TCD - Ανιχνευτής δέσµευσης ηλεκτρονίων, ECD - Ανιχνευτής αζώτου-φωσφόρου NPD ή θερµοϊονικός (TID) - Ανιχνευτής πλάσµατος, Plasma - Φωτοµετρικός ανιχνευτής φλόγας, FPD - Φασµατογράφος µάζας, MS - Φασµατοσκοπία υπερύθρου Μετασχηµατισµού Fourier, FT-IR - Άλλοι ανιχνευτές (Χηµειοφωταύγειας Θείου, Ηλεκτρολυτικής αγωγιµότητας, Ζυγού, πυκνότητας αερίου, Ιονισµού Ηλίου και Αργού) 4.5 Εφαρµογές της αέριας χρωµατογραφίας Η αέρια χρωµατογραφία χρησιµοποιείται ευρέως για την ανάλυση πτητικών ουσιών σε: Τοξικολογία, δικονοµική ανάλυση,τρόφιµα,φάρµακα,καλλυντικά, ρόγες,φυσικά προϊόντα,προϊόντα πετρελαίου,βιοµηχανίες αρωµατοποιίας, Βιοµηχανία χρωµάτων, Περιβαλλοντικά δείγµατα (116) 34

35 5. Φαινολικές ενώσεις Οι φαινολικές ενώσεις αποτελούν οργανικές ενώσεις µε τουλάχιστον έναν αρωµατικό δακτύλιο µόνο- η πόλυ- υποκατεστηµένο µε υδροξύλια ( ΟΗ). Τα υδροξύλια αυτά µπορεί να είναι ελεύθερα ή υποκατεστηµένα υπό τη µορφή αιθέρα, εστέρα ή γλυκοζίτη. Μια γενικότερη κατάταξη των φαινολικών ενώσεων µε βάση τον ανθρακικό σκελετό φαίνεται στον Πίνακα 5. Πίνακας 5: Κατάταξη φυσικών φαινολικών ενώσεων µε βάση τον ανθρακικό σκελετό Κατηγορίες φαινολικών ενώσεων οµή Απλές φαινόλες, βενζοκινόνες Υδροξυβενζοϊκά οξέα C 6 -C 1 Φαινυλοξικά οξέα Υδροξυκινναµωµικά οξέα (Φαινυλοπροπανοΐκά) C6-C2 C6-C3 Κουµαρίνες, ισοκουµαρίνες, χρωµόνες, χρωµένια Ναφθοκινόνες Ξανθένια Στιλβένια, ανθρακινόνες Φλαβονοειδή, Ισοφλαβονοειδή Λιγνάνια, νεολιγνάνια C6-C4 C6-C1-C6 C6-C2-C6 C6-C3-C6 (C6-C3)6 ιφλαβονοειδή (C 6 -C 3 -C 6 ) 2 Λιγνίνες (C 6 -C 3 ) n Συµπυκνωµένες ταννίνες (Προανθοκυανιδίνες) (C 6 -C 3 -C 6 ) n 35

36 6. Μέτρηση αντιοξειδωτικής ικανότητας Οι ελεύθερες ρίζες είναι µόρια, τα οποία µπορούν να έχουν ανεξάρτητη ύπαρξη κάτω από ορισµένες συνθήκες. Η αντίληψη για τις ελεύθερες ρίζες άλλαξε µε πειράµατα και ανακαλύψεις στην πορεία των χρόνων. Έτσι σήµερα καλούµε ελεύθερη ρίζα, άτοµο ή οµάδα ατόµων (ανόργανα ή οργανικά µόρια) που φέρει ένα ασύζευκτο (unpaired) ηλεκτρόνιο. Στον οργανισµό των θηλαστικών, τµήµα περίπου 5%, του χρησιµοποιούµενου οξυγόνου ανάγεται µερικώς. Η αναγωγή αυτή διεκπεραιώνεται εν µέρει από ένζυµα που δίνουν µε αυτόν τον τρόπο µερικώς ανηγµένο οξυγόνο, δηλαδή ενεργές µορφές οξυγόνου όπως: ρίζα υπεροξειδικού ανιόντος - O2 -, ρίζα υδροϋπεροξειδίου - HO2, ρίζα υδροξυλίου - HO, υπεροξείδιο του υδρογόνου - H2O2. Από αυτά τα ένζυµα η οξειδάση της ξανθίνης είναι αυτή που έχει µελετηθεί περισσότερο. Σε διαδικασίες γένεσης ενεργών µορφών οξυγόνου εµπλέκονται και τα συστήµατα Ρ450, δεϋδρογονάσης της ξανθίνης και συνθετάσης των προσταγλανδινών µε την εµπλοκή µεταβατικών µετάλλων, κυρίως Fe και Cu. Επίσης στα βιολογικά συστήµατα, βιολογικώς σηµαντικά µόρια οξειδώνονται παρουσία οξυγόνου και δίνουν O2 -. Αυτές είναι οι λεγόµενες αντιδράσεις αυτοοξείδωσης, που στις περισσότερες περιπτώσεις καταλύονται από µεταβατικά µέταλλα, όπως είναι ο σίδηρος και ο χαλκός. Σε αυτές εµπλέκονται η γλυκεραλδεΰδη, νευροδιαβιβαστές όπως η αδρεναλίνη, νοραδρεναλίνη και ντοπαµίνη, η L-DOPA, FMDH2, FADH2 κ.α. O2 - επίσης δίνουν και οι πρωτεΐνες που περιέχουν ως προσθετική οµάδα την αίµη (αιµοσφαιρίνη, µυοσφαιρίνη, κυτοχρώµατα), στις οποίες ο δισθενής σίδηρος που φέρουν οξειδώνεται από το οξυγόνο προς τρισθενή κυρίως υπό την παρουσία νιτρωδών ιόντων (ΝΟ2 - ) ή συγκεκριµένων µεταβατικών µετάλλων, κυρίως χαλκού. Τα τελευταία χρόνια έχει αναπτυχθεί πολύ το ενδιαφέρον για το λεγόµενο «οξειδωτικό στρες». Ως «οξειδωτικό στρες» ορίζεται η διαταραχή της ισορροπίας µεταξύ ελεύθερων ριζών, κυρίως του οξυγόνου, και αντιοξειδωτικών ουσιών, ως αµυντικών µηχανισµών έναντι της βλαπτικής δράσης των ελευθέρων ριζών. Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου είναι ασταθή και πολύ δραστικά µόρια, που τους λείπει ένα ηλεκτρόνιο και τα οποία έχουν την τάση να λαµβάνουν το ηλεκτρόνιο που τους λείπει από µόρια που θα συναντήσουν στο δρόµο τους, ώστε να αυξήσουν τη σταθερότητά τους. Οι ελεύθερες ρίζες παράγονται είτε φυσιολογικά στον οργανισµό ως προϊόντα του µεταβολισµού των τροφών, είτε από το στρες και άλλους περιβαλλοντολογικούς παράγοντες όπως η ακτινοβολία, η ρύπανση της ατµόσφαιρας και το κάπνισµα και όταν βρίσκονται σε περίσσεια µέσα στον οργανισµό προκαλούν σηµαντικές βιολογικές βλάβες, στις κυτταρικές µεµβράνες, σε πρωτεΐνες και λιπίδια, ακόµα και στο γενετικό υλικό. Έχουν συσχετισθεί µε διάφορες ασθένειες αλλά και µε τη διαδικασία της γήρανσης. 36

37 Η άµυνα του οργανισµού έναντι των ελευθέρων ριζών περιλαµβάνει τους ενδογενείς αντιοξειδωτικούς µηχανισµούς που µπορούν να σταµατήσουν ή ακόµα και να διορθώσουν τις βλάβες που προκαλούνται από τις ελεύθερες ρίζες. Όταν όµως υπάρχει υπερπαραγωγή ελεύθερων ριζών και οι αντιοξειδωτικοί µηχανισµοί του οργανισµού δεν επαρκούν, χρειάζεται εξωγενής πρόσληψη αντιοξειδωτικών ουσιών µέσω της διατροφής. Τα αντιοξειδωτικά όπως οι βιταµίνες C, E, Α και Β καροτίνη, άλλα καροτενοειδή, τα φλαβονοειδή, οι πολυφαινόλες, το σελήνιο, ο ψευδάργυρος και το λυκοπένιο είναι ουσίες που δρουν µε τέτοιο τρόπο ώστε να δεσµεύουν και να εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες, µετατρέποντας τες σε µη τοξικές, και συνεπώς ακίνδυνες για τον οργανισµό. Τα αντιοξειδωτικά είναι φυσικές ουσίες που περιέχονται κατά κύρια βάση σε φυτικής προέλευσης τρόφιµα, όπως είναι φρούτα, λαχανικά, ξηροί καρποί και σπόρια. Είναι, συνήθως, χρωστικές ουσίες οι οποίες προσδίδουν και το χαρακτηριστικό τους χρώµα στα φυτά (κόκκινο, πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί). Αντιοξειδωτική δράση Φαινολικών Οξέων Μπορούν να διαχωριστούν σε παράγωγα του βενζοϊκού οξέος και σε παράγωγα του κιναµµωµικού οξέος. Τα παράγωγα του υδροξυκιναµµωµικού οξέος απαντώνται πιο συχνά στα τρόφιµα σε σύγκριση µε εκείνα του βενζοϊκού οξέος. Για να προχωρήσουµε στην ανάλυση των µεθόδων διερεύνησης των αντιοξειδωτικών δράσεων, είναι απαραίτητο να δοθούν οι επιστηµονικοί ορισµοί του οξειδωτικού και του αντιοξειδωτικού. Έτσι µε την στενή χηµική έννοια, οξειδωτικό ή οξειδωτικό µέσο, είναι µια ουσία που προσλαµβάνει ηλεκτρόνια και προκαλεί οξείδωση (απώλεια ηλεκτρονίων) ενός άλλου αντιδρώντος ενώ µε την βιολογική έννοια, είναι µια ουσία που οδηγεί στην δηµιουργία των βλαβερών για τον οργανισµό ελευθέρων ριζών. Αντιοξειδωτικό είναι µια αναγωγική ουσία που όταν βρίσκεται σε χαµηλές συγκεντρώσεις σε σύγκριση µε εκείνες ενός υποστρώµατος που µπορεί να οξειδωθεί, εµποδίζει ή καθυστερεί σηµαντικά την οξείδωση του υποστρώµατος από ένα προ-οξειδωτικό ή οξειδωτικό και έτσι το αντιοξειδωτικό ως αναγωγικό µέσο µπορεί να αναστείλει την δράση του οξειδωτικού µετατρέποντάς το σε µια µορφή που έχει µικρή ή καθόλου τοξικότητα. Είναι πολύ σηµαντικό να διακρίνεται ότι το αντιοξειδωτικό είναι αναγωγικό, αλλά το αναγωγικό δεν είναι απαραίτητα και αντιοξειδωτικό. (126) Συνήθως θεωρούνται ταυτόσηµοι οι όροι αντιοξειδωτική δράση και αντιοξειδωτική συγκέντρωση και αυτή η παρανόηση οδηγεί σε λανθασµένα µετρήσιµα αποτελέσµατα και συµπεράσµατα. Η αντιοξειδωτική δράση δεν έχει κανένα απολύτως νόηµα χωρίς τον προσδιορισµό των συνθηκών της αντίδρασης, όπως πίεση, θερµοκρασία κ.α. και αναφέρεται στη σταθερά ταχύτητας αντιδράσεως ενός µόνο αντιοξειδωτικού µε µια ελεύθερη ρίζα ενώ η αντιοξειδωτική συγκέντρωση είναι ο αριθµός των γραµµοµορίων (moles) µιας δοθείσας 37

38 ελεύθερης ρίζας που δεσµεύτηκε σε ένα διάλυµα ελέγχου, ανεξάρτητα από την αντιοξειδωτική δράση του κάθε αντιοξειδωτικού που βρίσκεται µέσα στο διάλυµα. Κάθε υπό διερεύνηση αντιοξειδωτικό εµφανίζει διαφορετική αντιοξειδωτική δράση ανάλογα µε το είδος της ενεργής ρίζας που σχετίζεται µε την αντίδραση οξείδωσης και έτσι η αντιοξειδωτική συγκέντρωση ενός σύνθετου µίγµατος εξαρτάται από την επιλογή της ενεργής ρίζας ή του οξειδωτικού που θα χρησιµοποιηθεί για την µέτρηση. Βάσει των Ghiselli et al., Cao G. et al., Huang et al. ( ) ένας ακόµη παράγοντας που πρέπει να ληφθεί υπόψη πριν την µέτρηση της οξειδωτικής κατάστασης ενός δείγµατος είναι η συνολική αντιοξειδωτική συγκέντρωσή του που είναι ένας συνδυασµός όλων των φαινοµένων που λαµβάνουν χώρα µέσα σε αυτό λόγω της ταυτόχρονης παρουσίας πολλών προ-οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών και έτσι δεν αποτελεί έναν απλό αναλυτικό προσδιορισµό. Η γνώση των οξειδωτικών στοιχείων που συνυπάρχουν στο υπό εξέταση δείγµα και η επιλογή της µεθόδου µέτρησης (την ενεργή ρίζα ή το οξειδωτικό), είναι δυνατόν να καταλήξει σε επιστηµονικότερη προσέγγιση της αντιοξειδωτικής κατάστασης του δείγµατος και να αποφευχθούν παράδοξα αποτελέσµατα. 38

39 6.1 Ταξινόµηση µεθόδων µέτρησης αντιοξειδωτικής ικανότητας Η ταξινόµηση των βασικότερων µεθόδων µέτρησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας µπορεί να γίνει ανάλογα µε τον µηχανισµό αντίδρασης. Ο µηχανισµός της αντίδρασης πραγµατοποιείται είτε µέσω µεταφοράς ενός ατόµου υδρογόνου (HAT, hydrogen atom transfer), είτε µέσω µεταφοράς ενός µονήρους ηλεκτρονίου (SET, single electron transfer), είτε µέσω συνδυασµού των δυο παραπάνω µηχανισµών. (130,131) Τέλος υπάρχει και µια τρίτη µέθοδος η οποία βασίζεται στη µέτρησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας βασιζόµενες σε συνδυασµό των δύο παραπάνω µηχανισµών και η ερµηνεία του µηχανισµού τους είναι πολύ δύσκολο να επιτευχθεί χωρίς επιπλέον αναλυτικές λεπτοµέρειες για την σύσταση και την δοµή του αντιοξειδωτικού που µελετάται. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν µέθοδοι όπως TEAC, DPPH, F-C. (130,131) Οι βασικότερες µέθοδοι λοιπόν, µέτρησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας ταξινοµούνται µε βάση τον µηχανισµό αντίδρασης στον οποίο στηρίζονται. Έτσι, η αντίδραση πραγµατοποιείται α) είτε βασιζόµενη στη µεταφορά ενός ατόµου υδρογόνου, HAT β) είτε βασιζόµενη στη µεταφορά ενός µονήρους ηλεκτρονίου, SET γ) είτε βασιζόµενη σε συνδυασµό των δύο µηχανισµών Παρακάτω αναπτύσσεται η χρησιµοποιούµενη στο εργαστήριο in vitro µέθοδος µέτρησης της αντιοξειδωτικής δράσης του µήκυτα βαλανιδιάς, και οι βασικές αρχές οι οποίες τη διέπουν : 39

40 6.2 Μέθοδος ικανότητας σάρωσης της ρίζας DPPH* [132] Η ρίζα DPPH* (2,2-διφαίνυλο-1-πικρύλο-ϋδράζυλο ελεύθερη ρίζα) που φαίνεται στην Εικόνα 4, είναι µία σταθερή υπό συνθήκες οργανική ρίζα νιτριλίου. Παρουσιάζει βαθύ µωβ χρώµα (515 nm) και είναι εµπορικά διαθέσιµη χωρίς να απαιτείται αναγέννηση ακολούθως των πειραµάτων όπως γίνεται µε την ρίζα του ABTS*+. Βασίζεται στην µέτρηση της ικανότητας των αντιοξειδωτικών να ανάγουν την ρίζα αυτή. Εικόνα 4: Η δοµή της ρίζας DPPH* Η ικανότητα µπορεί να εκτιµηθεί είτε µε electron spin resonance (EPR), είτε µε φασµατοµετρική καταγραφή της µείωσης στην απορρόφηση της ρίζα. Το ποσοστό της ρίζας που µένει υπολογίζεται σύµφωνα µε τον τύπο: % DPPH*rem )= 100 x [DPPH*]rem/[DPPH*]t=o Το ποσοστό αυτό είναι ανάλογο µε την αντιοξειδωτική συγκέντρωση. Ως EC50 ορίζεται η συγκέντρωση που προκαλεί µείωση της αρχικής συγκέντρωσης της ρίζας DPPH * κατά 50%, ενώ ως TEC50 ο χρόνος που απαιτείται για να φτάσει στη σταθερή κατάσταση της EC50. Μια άλλη µορφή έκφρασης της αντιοξειδωτικής συγκέντρωσης είναι η αντι-ριζική απόδοση (antiradical efficiency, AE) και δίνεται από την σχέση: AE= 1/ EC50 Tec5o 40

41 Εικόνα 5 : Α) DPPH 1,1 διφαινυλο-2-πικρυζυδραζύλιο, οξειδωτική, ελεύθερη ρίζα µε αζωτούχο κέντρο. Σταθερή, διαθέσιµη στο εµπόριο. ιαλυτό στην µεθανόλη. Β) DPPH 1,1 διφαινυλο-2-πικρυζυδραζίνη, τελικό σταθερό προϊόν. [132] Η συγκεκριµένη µέθοδος στηρίζεται στο γεγονός ότι το αντιοξειδωτικό αντιδρά µε το DPPH και το µετατρέπει σε 1,1 διφαινυλο-2-πικρυζυδραζίνη. Η δράση των αντιοξειδωτικών αποδίδεται στην ικανότητά τους να δίνουν υδρογόνα. Είναι γνωστό ότι οι ελεύθερες ρίζες προκαλούν αυτόοξειδώσεις των ακόρεστων λιπών. Απ την άλλη µεριά τα αντιοξειδωτικά διακόπτουν την αλυσίδα των οξειδώσεων προσφέροντας υδρογόνα από τις οµάδες των φαινολικών υδροξυλίων. Έτσι σχηµατίζουν ένα σταθερό τελικό προϊόν (την 1,1 διφαινυλο-2-πικρυζυδραζίνη) που δεν ξεκινά ή διασπείρει περαιτέρω οξείδωση των λιπών. Η µέθοδος θεωρείται κυρίως ότι ακολουθεί τον SET µηχανισµό, ενώ ο µηχανισµός HAT αποτελεί µονοπάτι παράπλευρης αντίδρασης. Πρόκειται για ταχεία και απλή µέθοδο το µόνο όργανο που χρειάζεται είναι φασµατοφωτόµετρο ορατού υπερύθρου. Μερικά µειονεκτήµατα όµως είναι κατά την ερµηνεία που δυσχεραίνει όταν οι προς εξέταση ενώσεις δίνουν φάσµα που ξεπερνά τα 515 nm. Η ρίζα DPPH * είναι µια σταθερή ρίζα νιτριλίου που διαφέρει από τις υπερδραστικές ρίζες του υπεροξειδίου που µετέχουν στην οξείδωση των λιπιδίων και ως εκ τούτου αντιοξειδωτικά που αντιδρούν ταχύτατα µε την ρίζα υπεροξειδίου, µπορεί να αντιδρούν αργά ή να παραµένουν αδρανή λόγω στερεοχηµικής παρεµπόδισης. Τέλος, η ρίζα αποχρωµατίζεται από έτερα αναγωγικά αντιδραστήρια και από µεταφορά πρωτονίου, οδηγώντας έτσι σε λανθασµένα αποτελέσµατα που δεν οφείλονται αποκλειστικά στην αντιοξειδωτική ικανότητα. (131,132) 41

42 7. Μέτρηση αναστολής της λιποξυγενάσης 7.1 Αναστολή των κυκλοξυγονασών COXs και των λιποξυγονασών LOXs Κατά την φλεγµονώδη διαδικασία οι κυκλοξυγoνάσες αποτελούν τα ένζυµα κλειδί στο πρώτο στάδιο της βιοσύνθεσης των προσταγλαδίνων (PGs) από το υπόστωµα (αραχιδονικό οξύ, ΑΑ). Οι δύο µορφές των ενζύµων COX, COX-1 και COX-2, είναι γνωστό ότι καταλύουν την σύνθεση των προσταγλαδινών. Η αναστολή τους αποτελεί δείκτη µέτρησης των µη στεροειδών αντιφλεγµονωδών φαρµάκων (NSAIDs). Έχουν αναφερθεί περιστατικά στα οποία τα NSAIDs εµφάνισαν γαστρεντερικές παρενέργειες και πολλοί ασθενείς που χρησιµοποιούν τα φάρµακα αυτά πάσχουν από γαστρεντερικά έλκη και αιµορραγίες. Η υπόθεση, ότι επιλεκτικοί αναστολείς των COX-2 έχουν την ίδια αντιφλεγµονώδη δράση µε τα παραδοσιακά φάρµακα χωρίς την γαστρεντερική τοξικότητα, εγκαταλείφτηκε επειδή, επίσης, απέτυχε να ικανοποιήσει τα κριτήρια για ασφαλέστερα φάρµακα, λόγω των άλλων παρενεργειών που εµφανίστηκαν (καρδιαγγειακές επιπλοκές, ηπατικές βλάβες και πολλές άλλες σοβαρές παρενέργειες). Γενικότερα οι νεώτερες µελέτες αναζητούν ασφαλέστερα αντιφλεγµονώδη φάρµακα µε τις µικρότερες δυνατές παρενέργειες. Εκτός από µεταβολικό µονοπάτι των COX, το αραχιδονικό οξύ µεταβολίζεται και µέσω της οδού των λιποξυγονασών. Οι λιποξυγονάσες ανήκουν στην κατηγορία των ενζύµων χωρίς αίµη και καταλύουν την αντίδραση υπεροξείδωσης των λιπαρών οξέων προς σχηµατισµό υπεροξειδίων. Η 5-LOX σχετίζεται µε την παραγωγή λευκοτριενίων (LTs) από αραχιδονικό οξύ, η οποία προκαλεί φλεγµονή, βρογχοστένωση, υπερευαισθησία, αναφυλακτική αντίδραση και ασθµατικά επεισόδια. Για τους παραπάνω λόγους, οι αναστολείς της 5-LOX έχουν, επίσης, χρησιµοποιηθεί ως πιθανοί θεραπευτικοί παράγοντες για την αντιµετώπιση φλεγµονωδών και αλλεργικών παθήσεων. Ορισµένοι τύποι γνωστών αναστολέων της 5-LOX έχουν εµφανίσει λιγότερες παρενέργειες από τους αναστολείς των COX. (133) Σύµφωνα µε τους Chen et al., (133) ο σχεδιασµός και γενικότερα η ανακάλυψη διπλού αναστολέα και για τους δύο τύπους ενζύµων θα µπορούσε να παρέχει µια νέα ορθολογική προσέγγιση για ασφαλέστερους, δραστικούς αντιφλεγµονώδεις παράγοντες, επειδή η αναστολή µόνο της µίας ενζυµατικής οδού θα µπορούσε πιθανότατα να στρέψει τον µεταβολισµό του αραχιδονικού οξέος προς την άλλη οδό και να προκαλέσει παρενέργειες. Έχει βρεθεί ότι υπάρχει ποιοτική αναλογία µεταξύ της αναστολής, που προκαλείται από NSAID's στην φυτικής προέλευσης (σόγια) LOX και της αναστολής της ζωικής LOX (134) και για αυτόν τον λόγο η φυτική LOX µπορεί να χρησιµοποιηθεί για µια απλή κατά προσέγγιση δοκιµασία αναστολής. 42

43 8. Μέτρηση αναστολής της αναγωγάσης της αλδόζης Αναστολείς της αναγωγάσης της αλδόζης Η αναγωγάση της αλδόζης (AR, ALR2, EC ), ανήκει στην υπεροικογένεια των αλδοκετοαναγωγασών (aldoketoreductases, AKR), στην υποοικογένεια AKR1B και στον άνθρωπο κωδικοποιείται από το γονίδιο AKR1B1. Πρόκειται για κυτοσολικό ένζυµο που απαντάται κυρίως στο φακό και τον αµφιβληστροειδή, στους νεφρούς, στα επινεφρίδια και σε αναπαραγωγικά όργανα. (135) Είναι ένα NADPH- εξαρτώµενο ένζυµο που καταλύει την αναγωγή αλδεϋδικών και κετονικών υποστρωµάτων στις αντίστοιχες αλκοόλες. Eίναι το πρώτο ένζυµο της µεταβολικής οδού των πολυολών που καταλύει την αναγωγή της γλυκόζης προς σορβιτόλη, χρησιµοποιώντας το NADPH σαν συµπαράγοντα. Η σορβιτόλη µεταβολίζεται σε φρουκτόζη από την αφυδρογωνάση της σορβιτόλης (SDH). Ως φυσιολογικά υποστρώµατα του ενζύµου έχουν αναφερθεί σάκχαρα και βιογενείς αλδεΰδες από τον καταβολισµό των στεροειδών, κατεχολαµινών και φωσφολιπιδίων. (135) Το ένζυµο και ο ρόλος του στο µεταβολικό µονοπάτι των πολυολών αναφέρθηκε πρώτη φορά από τον Hers. (136) Φυσιολογικά, η µεταβολική οδός των πολυολών αντιπροσωπεύει δευτερεύουσα οδό που χρησιµοποιεί γλυκόζη και φτάνει στο 3% της κατανάλωσής της. Παρόλα αυτά, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης (υπεργλυκαιµία) παρατηρείται µια αυξηµένη ροή στην µεταβολική οδό των πολυολών, η οποία αντιπροσωπεύει περισσότερο του 30% του µεταβολισµού της γλυκόζης. Αυτή η µη-φυσιολογική ενεργοποίηση της οδού των πολυολών σε άτοµα µε διαβήτη οδηγεί στην συσσώρευση ωσµωτικά ενεργής σορβιτόλης που µπορεί να προκαλέσει ωσµωτικό και οξειδωτικό στρες και τελικά βλάβη των ιστών. Έτσι τις τελευταίες δεκαετίες, οι αναστολείς της αναγωγάσης της αλδόζης (ARIs) κερδίζουν την προσοχή της φαρµακευτικής κοινότητας ως µια πολλά υποσχόµενη και ελκυστική στρατηγική. ( ) Το τετραµεθυλογλουταρικό οξύ ήταν το πρώτο µόριο που βρέθηκε πως µπορεί να παρέµβει στην διαδικασία του καταρράκτη διαµέσου αναστολής της αναγωγάσης της αλδόζης. Η επαλρεστάτη είναι µια ένωση που κυκλοφορεί ως φάρµακο για το σκοπό αυτό στην Ιαπωνία,. Παρόλο που ένα µεγάλο εύρος ενώσεων έχουν συντεθεί µε σκοπό να αναστέλλουν την ALR2 και πολλά πειραµατικά µοντέλα έχουν µελετηθεί, µόνο ένας περιορισµένος αριθµός φαρµάκων έχει φτάσει σε κλινικές δοκιµές. Τα τελευταία χρόνια µόνο δύο τάξεις αναστολέων (υδαντοϊνες και καρβοξυλικά οξέα) έχουν προχωρήσει σε κλινικές µελέτες φάσεις ΙΙΙ. 43

44 Η κατηγορία που περιλαµβάνει υδαντοίνες, όπως σορβινίλη µε µεγάλη τιµή pka (pka>8) παρουσιάζει ως κυριότερο πλεονέκτηµα την αποτελεσµατική διαπερατότητα διαµέσου µεµβρανών (µεγάλη βιοδιαθεσιµότητα), αλλά πολλές ενώσεις έχουν προκαλέσει δερµατικές αντιδράσεις και τοξικότητα ήπατος. Πολύ πρόσφατα, µία νέα τάξη αναστολέων αποτελούν µόρια συζευγµένα µε SO2 και µια οµάδα πυριδαζινόνης ((6-(5-χλωρο-3-µεθυλοβενζοφουρανο-2-σουλφονυλο)- 2Η-πυριδαζιν-3-όνη και φλαβονοειδή βιο-ισοστερή πυριδοπυριµιδινόνες PPP). Η τάξη των ενώσεων αυτών έχει αναφερθεί ότι εµφανίζει άριστη εκλεκτικότητα και ισχυρή ανασταλτική δράση τόσο in vitro όσο και in vivo. Επίσης, φαινολικές ενώσεις µπορούν να χρησιµοποιηθούν αντί για καρβοξυλικά οξέα ως βιο-ισοστερή. Οι αναστολείς εκτός από την κύρια δράση τους εµφανίζουν και αντιοξειδωτική ικανότητα. Η άλλη κατηγορία αποτελείται από καρβοξυλικά οξέα, όπως ζοπολρεστάτη µε µικρή τιµή pka (pka=3-4). Τα µειονεκτήµατα της κατηγορίας είναι ότι εµφανίζουν µειωµένη διαπερατότητα διαµέσου µεµβρανών, εµφανίζουν στενό εύρος δράσης και δεν είναι πολύ ισχυροί αναστολείς in vivo. Οι πληθώρα παρενεργειών καθώς και η µικρή αποτελεσµατικότητα οδήγησαν στην εγκατάλειψη των αναστολέων. Οι παρενέργειες πιθανότατα οφείλονται σε έλλειψη εκλεκτικότητας των αναστολέων, συνήθως επειδή µετράται η αναγωγάση της αλδεΰδης (ALR1) λόγω της κοντινής συγγένειας που εµφανίζει µε την αναγωγάση της αλδόζης. Η ανεπάρκεια αποτελεσµατικών αναστολέων ικανών να εµποδίσουν την ροή διαµέσου της οδού των πολυολών στην κλινική πράξη φαίνεται να αποτελεί το κυριότερο πρόβληµα έλλειψης σχετικών φαρµάκων από την φαρµακευτική βιοµηχανία. Η αναζήτηση αναστολέων µε µεγάλη δράση και εκλεκτικότητα παραµένει στο επίκεντρο της προσοχής πολλών ερευνητών. (138,140) 44

45 9. Σκοπός διατριβής Το αντικείµενο µε το οποίο πραγµατεύεται η παρούσα µεταπτυχιακή εργασία είναι ο µύκητας της βελανιδιάς Evernia prunastri (Oak moss) που ελήφθη από την περιοχή του Λαχανά Ν. Κιλκίς. Επιδιώκεται η ανάλυση των περιεχοµένων σε αυτόν ουσιών, η αποµόνωση και η ταυτοποίηση αυτών, η ανεύρεση πιθανών νέων δοµών και η διαφορική χρήση του µύκητα από τις έως σήµερα εφαρµογές λόγω νέων βιολογικών δεδοµένων. Η εργασία είχε τρία διακριτά αλλά αλληλένδετα τµήµατα: Αρχικά αναλύθηκαν τα αιθέρια έλαια της δρόγης που ελήφθησαν µε την χρήση πεντανικού διαλύτη και πραγµατοποιήθηκε η ταυτοποίηση των πτητικών συστατικών µε την χρήση αέριου χρωµατογράφου/ φασµατογράφου µάζας, GC/MS µε πολική στήλη. Ακολούθως πραγµατοποιήθηκε διερεύνηση των εκχυλισµάτων του µύκητα µε πετρελαϊκό αιθέρα, διχλωροµεθάνιο, µεθανόλη, και οι µεθανολικές κατανοµές µε οξικό αιθυλεστέρα και νερό και έγινε ποιοτική ανάλυση της σύστασης του διχλωροµεθανικού σε φαινολικές ενώσεις µε την βοήθεια του πυρηνικού µαγνητικού συντονισµού (NMR). Τέλος, διερευνήθηκαν τα εκχυλίσµατα του µύκητα της βελανιδιάς για συγκεκριµένες βιολογικές δράσεις όπως: α) την ικανότητά του να αναστέλλει ένα ένζυµο το οποίο σχετίζεται άµεσα µε τις επιπλοκές του διαβήτη τύπου ΙΙ- αναστολή της αναγωγάσης της αλδόζης, β) την ικανότητά του να αναστέλλει την ενζυµική οδό που σχετίζεται µε παρενέργειες της φλεγµονώδους διαδικασίας και της λιπιδικής υπεροξείδωσης-αναστολή του ενζύµου λιποξυγονάση, και γ) την in vitro αντιοξειδωτική του ικανότητα µε την µέθοδο σάρωσης της ρίζας DPPH*. Τα αποτελέσµατα της τριπλής αυτής εξέτασης, αναλύθηκαν και οδήγησαν στην εξαγωγή συµπερασµάτων, σε νέα δεδοµένα τόσο αναφορικά µε την σύσταση του µύκητα όσο και σε ενδεχόµενες εφαρµογές αυτού. 45

46 10. Πειραµατικό µέρος 10.1 Ανάλυση µε GC-MS Προετοιµασία δείγµατος Η δρόγη Evernia Prunastri που ελήφθη από την περιοχή Λαχανά του Ν.Κιλκίς τεµαχίστηκε και κονιορτοποιήθηκε. Ακολούθως τοποθετήθηκε στον εργαστηριακό πάγκο για 10 ηµέρες για να ξηρανθεί. Κατόπιν ζυγίστηκε σε ηλεκτρονικό ζυγό (198,59 gr δρόγης) και τοποθετήθηκε σε δυο 2000lt εσµυρισµένες σφαιρικές φιάλες. Ακολούθησε προσθήκη διαλύτη (πεντάνιο 900 ml) σε έκαστη εξ αυτών, αποσκοπώντας στην λήψη τερπενίων,σεσκιτερπενίων και γενικά αιθερίων ελαίων. Οι φιάλες µε τη δρόγη και το διαλύτη, πωµατίστηκαν µε υάλινο εσµυρισµένο πώµα και αφέθηκαν σε σκιερό και δροσερό µέρος για 5 ηµέρες. Ακολούθησε διήθηση της δρόγης την 5η ηµέρα από το υγρό του διαλύτη (πεντάνιο) και σταδιακή συµπύκνωση µε την συσκευή της Εικόνας 6 σε εσµυρισµένη κωνική φιάλη 50 ml. Εικόνα 6. Συσκευή συµπύκνωσης διαλυµάτων Στο τελικό στάδιο, µε συνεχή ροή αζώτου στο άνωθεν εκχύλισµα υγρού διαλύτη εξατµίστηκε η µεγαλύτερη ποσότητα υγρού, ώστε να επιτευχθεί µεγαλύτερη συµπύκνωση του διαλύµατος. Εν συνεχεία διατηρήθηκε µικροποσότητα σε υγρή µορφή και πραγµατοποιήθηκε µε αυτή χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) σε πλάκες διοξειδίου του πυριτίου µε διαλύτη οξικό αιθυλεστέρα όπου διαπιστώθηκε η ύπαρξη πληθώρας ενώσεων (Εικόνα 7) και έτσι ακολούθησε διερεύνηση µε GC-MS. 46

47 Εικόνα 7. Αποτέλεσµα υγρής χρωµατογραφίας λεπτής στιβάδας πεντανικού εκχυλίσµατος E.prunastri Εξετάστηκαν διάφορες συγκεντρώσεις διαλυµάτων, µε διαφορετικούς διαλύτες και σε διαφορετικές συνθήκες έγχυσης (split) και τα βέλτιστα αποτελέσµατα ελήφθησαν µε πεντάνιο και ακετόνη σε συγκέντρωση 1000 µl και διαχωρισµό (split) 10 και 2 για πεντάνιο και ακετόνη αντίστοιχα. Χρησιµοποιήθηκε και ακετόνη ως διαλύτης για την παραλαβή των πολικότερων ενώσεων, καθώς µε το πεντάνιο παρέµενε στερεό (αδιάλυτο) υπόλειµµα. 47

48 Οργανολογία Αέριος χρωµατογράφος Φασµατογράφος Μάζας (GC-MS) Συσκευή απόσταξης τύπου Clevenger. Χρωµατογράφος: Shimadzu GC 2010, Φασµατογράφος µάζας: Shimadzu GC/MS QP 2010, µε ιονισµό (ΕΙ) ενέργεια ιονισµού 70 Ev., MFG INC, USA. Αυτόµατος δειγµατολήπτης: Shimadzu AOC-20s Αυτόµατη έγχυση: Shimadzu AOC-20i Λογισµικό επεξεργασίας φασµάτων: Shimadzu Lab Solutions software (GCMS solution version 2.50). Βιβλιοθήκη φασµάτων µάζας: NIST (National Institute of Standards and Technology) MS computer database (NIST 21 & NIST 107). Φέρον αέριο: Ήλιο (He) υψηλής καθαρότητας 99,99%. Τριχοειδής στήλη: Πολικού υποστρώµατος AT TM WAX, Serial No , Alltech Πίνακας 6: Χαρακτηριστικά της στήλης AT ΤΜ WAX Μήκος 60m Εσωτερική διάµετρος 0.32mm Πάχος εσωτερικής στοιβάδας 0.25µm Ανώτατο όριο θερµοκρασίας 280 o C 48

49 Συνθήκες ανάλυσης Αέριας Χρωµατογραφίας (GC) Ως φέρον αέριο χρησιµοποιήθηκε το ήλιο µε παροχή 3 ml/min ενώ στον χώρο εισαγωγής του δείγµατος (injection port) η θερµοκρασία ήταν σταθερή και ίση µε C και χρόνο χωρίς καταγραφή τα 8 min για το πεντάνιο και τα 6 για την ακετόνη. Για το διαχωρισµό των ενώσεων µετά από δοκιµές προγραµµάτων έκλουσης επιλέχθηκε το εξής: Αρχική θερµοκρασία 60 0 C, ισόθερµη για 5 λεπτά, αύξηση µε ρυθµό 4 0 /min µέχρι τους C και ισόθερµη για 5 λεπτά. Παύση καταγραφής στα 50 min και 7,50 min παραµονή σε υψηλή θερµοκρασία για τον καθαρισµό της στήλης. Συνολικός χρόνος χρωµατογραφικής ανάλυσης: 57,50 min. Πίνακας 7. Παράµετροι του φούρνου GC. Φούρνος Ροή Φέροντος Αερίου 3 ml/min Χρόνος 57,50 min Αρχική 60ºC και ισόθερµη για 5 λεπτά Θερµοκρασιακό πρόγραµµα Αύξηση στους 250ºC (4ºC /min) και ισόθερµη για 5 λεπτά Οι συνθήκες στο φασµατογράφο µάζας ήταν: θερµοκρασία πηγής ιόντων: 200 C; Θερµοκρασία διεπαφής: 250 C;ενέργεια ιονισµού: 70 ev; ανίχνευση µαζών: m/z. 49

50 Χρωµατογραφήµατα Η επεξεργασία των αποτελεσµάτων έγινε µε το λογισµικό Shimadzu Lab Solutions software (GCMS solution version 2.50). Για την σύγκριση των χρόνων κατακράτησης που λαµβάνονται από την πολική στήλη σε διαφορετικές συνθήκες, υπολογίστηκε το ευρετήριο χρόνων κατακράτησης (retention times) για αυτήν την στήλη, έχοντας σαν αναφορά µια οµόλογη σειρά αλκανίων C7-C24. Η ταυτοποίηση των ενώσεων πραγµατοποιήθηκε µε σύγκριση των καταγεγραµµένων φασµάτων µάζας µε φάσµατα µάζας αυθεντικών δειγµάτων, των ηλεκτρονικών βιβλιοθήκων NIST 21, 27, 107 και 147, καθώς και PMW Tox3, την υπάρχουσα βιβλιογραφία (36, 86, 107,95-115,124a,b,c, ) λαµβάνοντας υπόψη τα ευρετήρια χρόνων κατακράτησης (retention times) και τους µηχανισµούς θραυσµατοποίησης. Πίνακας 8. Περιεχόµενα εκχυλίσµατος πεντανίου µήκυτα βελανιδιάς, σε διαλύτη για GC-MS πεντάνιο όπως προκύπτουν από ανάλυση µε αέρια χρωµατογραφία-φασµατοµετρία µάζας µε οµοιότητα >85% ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΠΕΝΤΑΝΙΟΥ EVERNIA PRUNASTRI ME ΔΙΑΛΥΤΗ GC-MS ΠΕΝΤΑΝΙΟ A/A Ουσία Area % Ret. time M +. m/z (%) Αναφορές 1 1,4,7,10,13,16 Hexaoxacyclooctadecane (100),43(50),44(40),59(40),89(40) - 2 3,8 dimethyl undecane (100),43(85),70(40),71(90),85(50) Eucalyptol (100),55(50),71(60),81(70),93(50) - 4 Cyclopropane, nonyl (100),43(90),69(80),83(60),97(50) Butanol, 3-methyl (100),41(40),42(60),57(60),70(50) - 6 Isooctanol (100),43(90),56(60),57(80),69(55) Hexanol, 3-methyl (100),41(40),56(80),57(50),70(60) Hexanol (100),42(30),43(40),55(50),69(30) Pentanone, 4-hydroxy- 4- methyl (100),58(20),59(70),98(20),101(20) Pentanol, 4-methyl-2- propyl (100),41(40),43(55),55(30),56(40) Tridecene (100),43(80),69(65),83(70),97(60) Heptanol (Gentanol) (100),41(40),43(40),55(60),70(80) Octene, 6-methyl (100),41(45),43(45),56(70),69(50) ,7-Dimethylnonane (100),41(20),43(60),71(60),85(45) 36, Camphor (100),41(40),55(40),69(40),81(60) 36,106, Linalool (100),41(60),43(60),55(80),93(80) 36,106, Octanol (100),41(40),43(40),69(50),84(40) - 18 Linalyl isobutyrate (100),43(50),69(20),80(40),121(20) Octadecene, (E) (100),43(70),57(90),69(70),83(80) Nonanol (Pelargonic alcohol) (100),41(50),43(60),55(90),70(60) - 50

51 21 Heptadecane (100),43(50),71(60),85(40),99(20) p-menth-1-en-8-ol (100),45(20),81(50),93(60),121(30) - 23 Borneol (100),41(10),55(20),67(10),110(20) 36,105, Octadecyne (100),41(60),55(60),81(70),95(60) Tetradecen-1-ol, (Z) (100),41(60),55(90),81(80),96(90) - 26 Patchoulane (100),55(60),67(70),79(80),91(90) - 27 Hexanoic acid (Caproic acid) (100),41(20),43(20),73(40),87(10) 36,100, Benzaldehyde, 2-hydroxy-6-methyl (100),51(20),63(10),77(40),90(40) 36, Butanoic acid, anhydride (100),43(50),56(20),72(10),88(10) - 30 Tetramethyl Heptadecane (100),43(60),71(80),85(50),99(20) - 31 Phenol (100),47(10),55(10),65(20),66(30) 36, 100,105, Octanoic Acid (100),43(40),55(40),73(50),101(30) 36, Nonanoic acid (100),41(40),57(70),73(60),115(20) 36, Patchouli alcohol (100),55(50),67(40),79(40),98(90) Hexen-1-ol, 6-(2,6,6- trimethyl-1-cyclohexenyl) (100),41(40),55(40),81(70),95(80) - methyl- 36 Octane, 1,1'-oxybis (100),41(30),43(30),5(100),82(40) - 37 n-decanoic acid (Capric acid) (100),41(40),55(40),73(90),129(30) - 38 Phenol, 3,5-bis(1,1- dimethylethyl) (100),41(20),57(80),74(20),206(20) Hexadecenal (100),43(80),55(95),67(90),81(80) - 40 Acetic acid, octadecyl ester (100),55(70),61(60),83(70),97(80) Methoxybenzyl alcohol (100),51(10),77(40),107(30),109(60) - Πίνακας 9. Περιεχόµενα εκχυλίσµατος πεντανίου µήκυτα βελανιδιάς, σε διαλύτη για GC-MS ακετόνη όπως προκύπτουν από ανάλυση µε αέρια χρωµατογραφία-φασµατοµετρία µάζας µε οµοιότητα >85%. ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΠΕΝΤΑΝΙΟΥ EVERNIA PRUNASTRI ME ΔΙΑΛΥΤΗ GC-MS ΑΚΕΤΟΝΗ A/A Ουσία Area % Ret. Time M +. m/z (%) Αναφορές 1 Benzene 0,94 6, (100),52(10),63(40),73(10),79(10) 106,174 2 Toluene (100),51(10),65(10),74(10),92(60) 106, ,4,7,10,13,16- Hexaoxacyclooctadecane (100),59(60),72(20),89(30),133(10) - 4 Ethylbenzene (100),51(20),65(10),77(10),106(40) Penten-2-one (100),43(40),53(15),55(90),95(50) - 6 1,3-dimethyl-Benzene (100),51(10),65(10),77(10),106(40) - 7 m-xylene (100),51(10),65(10),77(10),106(40) - 8 Benzene, (1-methylethyl) (100),77(20),79(20),103(10),120(30) - 9 o-xylene (100),51(15),65(10),77(15),106(45) ,7-Dimethylnonane (100),43(70),55(10),71(60),85(40) - 11 Chloro-Benzene (100),51(40),74(10),77(80),114(40) - 12 Cyclopropane, nonyl (100),43(80),57(60),69(70),83(50) - 51

52 13 Hemelitol (100)51(10),77(20),91(10),120(40) - 14 Dimethylformamide (100),44(80),45(10),56(10),58(10) - 2-Pentanone, 4-hydroxy-4-15 methyl (100),41(10),58(30),59(70),101(30) Methylundecane (100),41(30),43(50)71(50),85(40) Undecene, 3-methyl-, (Z) (100),43(60),55(90),69(55),70(55) Tridecene (100),43(80),69(70),83(65),97(60) Pentanone, 4-hydroxy (100),42(10),58(20),61(10),84(20) - 20 Acetic acid (100),42(10),45(90),57(10),60(80) - 21 Ethylhexanol (100),41(40),43(40),70(20),83(20) - 22 Ether, hexyl t-butyl (100),43(40),55(10),57(60),85(10) - 23 Hexanal, 3,3-dimethyl (100),41(50),43(80),57(50),69(80) - Acetic acid, 1-methylpropyl 24 ester (100),41(10),83(10),87(30),101(10) - 25 Butane, 2,2-dimethyl (100),41(60),57(90),71(70),85(10) - Cyclopropane, 1-(1-26 methylethyl)-2-nonyl (100),41(40),43(40),55(40),57(45) ,2-Diacetylethylene (100),42(10),69(30),97(70),112(20) Octadecene, (E) (100),43(80),69(70),83(75),97(80) - Pentanoic acid, 1,1-29 dimethylpropyl ester (100),43(60),57(60),70(60),71(90) - 30 Octyl ether (Antar) (100),41(20),43(60),69(40),71(80) Undecene, 3-methyl-, (E) (100),41(50),43(40),55(80),83(40) Eicosene, (E) (100),43(90),55(95),69(70),83(80) Butanol, 3-methyl-, acetate (100),55(10),70(10),87(40),89(10) - 34 Dipropylene glycol (100),41(20),45(30),85(10),103(30) Dodecanol (100),43(90),56(70),69(80),83(70) Butyl-1-decene (100),55(50),70(40),83(20),98(10) - 37 Phenol (Izal) (100),55(10),65(10),66(40),74(10) 36,100,105, Octadecene (100),43(90),55(90),69(70),83(80) - Phenol, 3,5-bis(1,1-39 dimethylethyl) (100),41(20),57(80),74(20),206(20) - 40 Diethyl phthalate (100),50(10),65(20),76(10),93(10) Hexadecanol (100),43(40),57(40),69(30),83(20) - 42 n-hexadecanoic acid (100),57(60),60(80),73(80),129(25) Acetic acid, octadecyl ester (100),55(60),69(50),83(55),97(55) - Στην Εικόνα 8 α και 8β παρουσιάζεται το χρωµατογράφηµα εκχυλίσµατος µήκυτα βελανιδιάς µε πεντάνιο και ακετόνη αντίστοιχα και στον Πίνακα 10 µερικά από τα φάσµατα µάζας των αλκοολικών πτητικών ουσιών του: 52

53 3.0 (x100,000) TIC (1.00) Εικόνα 8α. Χρωµατογράφηµα σε πεντάνιο, εκχυλίσµατος µήκυτα βελανιδιάς µε πεντάνιο (x1,000,000) TIC (1.00) Εικόνα 8β. Χρωµατογράφηµα σε ακετόνη, εκχυλίσµατος µήκυτα βελανιδιάς µε πεντάνιο 53

54 Πίνακας 10. Μερικά φάσµατα αλκολικών ουσιών µε MS σε διαλύτη πεντάνιο και ακετόνη Α/Α ΟΥΣΙΑ ΧΡΟΝΟΣ (min) GC-MS % 1 Ευκαλυπτόλη 43(100),55(50),71(60), 81(70),93(50) 13, % 2 Καμφορά 95(100),41(40),55(40), 69(40),81(60) 24, Λιναλόλη 71(100),41(60),43(60), 55(80),93(80) 24, (x10,000) OH % 4 1-Νονανόλη 56(100),41(50),43(60), 55(90),70(60) 28, Βορνεόλη 95(100),41(10),55(20), 67(10),110(20) 29, % Πατσουλόλη 43(100),55(50),67(40), 79(40),98(90) 43, %

55 10.2 Φυτοχηµική ανάλυση του µύκητα της βαλανιδιάς Μέθοδοι και Υλικά ( ιαλύτες- Αντιδραστήρια) Οι τεχνικές που χρησιµοποιήθηκαν σε αυτό το τµήµα της εργασίας είναι α. Εκχύλιση soxhlet β. Η χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) γ. Η χρωµατογραφία στήλης. δ. Φασµατοσκοπία Υπεριώδους Ορατού ε. Πυρηνικός Μαγνητικός Συντονισµός Οι διαλύτες που χρησιµοποιήθηκαν κατά την εκχύλιση sohlet ήταν οι ακόλουθοι: Ν-πεντάνιο Carlo Erba (PA), UN1208 Πετρελαϊκός αιθέρας 40 ο -60 ο C Panreac, PA ιχλωροµεθάνιο Panreac, PA και Carlo Erba (PA), UN1593 ιαιθυλαιθέρας Carlo Erba (PA), Νο Οξικός αιθυλεστέρας, Merck Art.9623 Mεθανόλη Carlo Erba (PA), UN1230 Απιονισµένο ύδωρ Αντιδραστήρια και διαλύτες που χρησιµοποιήθηκαν κατά την TLC: Ατµοί πυκνής αµµωνίας Αντιδραστήριο Neu (naturstoff reagenz A), το οποίο παρασκευάζεται από τη διάλυση 1 g διφαινυλοβορικού αµινοαιθυλεστέρα σε 100 ml µεθανόλης Αντιδραστήριο θεϊκής βανιλλίνης, το οποίο αποτελείται από διάλυµα θειϊκού οξέος 5% σε µεθανόλη και διάλυµα βανιλλίνης 5% σε µεθανόλη. Αναµυγνύονται µεταξύ τους σε αναλογία 1:1, ακολουθεί ψεκασµός και θέρµανση του χρωµατογραφήµατος για 5 min στους 105 ο C. Σύστηµα AcOH 15% ο/ο 55

56 Σύστηµα ΕΑW: Οξικός αιθυλεστέρας, οξικό οξύ νερό 4:1:2 (οργ. φάση). Σύστηµα CAW: ιχλωροµεθάνιο, οξικό οξύ και νερό 50 :45 :5 (οργ. φάση). Σύστηµα BAW: n-βουτανόλη, οξικό οξύ νερό 4:1:5 (οργ. φάση). Σύστηµα Οξικός αιθυλεστέρας-τολουόλιο 93:7 Εξάνιο ιχλωροµεθάνιο Μίγµατα εξανίου-διχλωροµεθανίου Οι πλάκες που χρησιµοποιήθηκαν κατά την διενέργεια χρωµατογραφίας λεπτής στιβάδας (TLC) στη συγκεκριµένη έρευνα είναι οι εξής: Πλάκες αλουµινίου µε προσροφητικό υλικό την κυτταρίνη (cellulose), διαστάσεων 20x20 cm, πάχος στιβάδας 0,1 mm, χωρίς δείκτη φθορισµού στα 254 και 366 nm (Merck, Art.5552) Πλάκες αλουµινίου επικαλυµµένες µε οξείδιο του πυριτίου διαστάσεων 20x20 cm, πάχος στιβάδας 0,1 mm, (Kieselgel 60 F254, Merck.Art.5554) και (Kieselgel 60, Merck.Art.5554) Υλικό που χρησιµοποιήθηκε για την χρωµατογραφία στήλης: Γέλη οξειδίου του πυριτίου 60 (silica gel 60) mm (Merck, Art.9385) µε βαθµωτή έκλουση C6H14 CH2Cl2 Tα χρωµατογραφήµατα παρατηρήθηκαν στο υπεριώδες φώς ( 254 nm και 365nm) πριν και µετά από την έκθεση ή τον ψεκασµό µε βανιλίνη. Φασµατοφωτοµετρία Υπεριώδους- Ορατού (UV-Vis Spectra) Φασµατοφωτόµετρα Υπεριώδους Ορατού (UV-Vis) Hitachi U-2000 Spectrometer µε κυψελίδες χαλαζία 10mm QS Spectrometer Lambda 20 (Perkin Elmer) Φασµατοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισµού (Nuclear Magnetic Resnance) Φασµατογράφος AGILENT DD

57 1 H-NMR (Proton) 13 C-NMR). (Carbon) COSY (Correlation spectroscopy) HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) Ως διαλύτης των ουσιών υπό διερεύνηση µε NMR χρησιµοποιήθηκε το CDCl3 Η διαδικασία της εκχύλισης Φυτικό υλικό βάρους 198,59 g από τον Λαχανά του Ν.Κιλκίς τοποθετήθηκε σε συσκευή συνεχούς εκχύλισης (Soxhlet) και έγινε εξαντλητική διαδοχική εκχύλιση µε διαλύτες αυξανόµενης πολικότητας (πετρελαϊκός αιθέρας, διχλωροµεθάνιο και µεθανόλη). Το ίζηµα που προήλθε από την εκχύλιση της δρόγης µε µεθανόλη στην συσκευή Soxhlet διαλύθηκε σε 1,5 lt απεσταγµένου νερού το οποίο είχε προηγουµένως θερµανθεί µέχρι το σηµείο βρασµού. Ακολούθησε διήθηση "εν θερµώ", ψύξη και εκχύλιση µε οξικό αιθυλεστέρα (p.a. Merck) ενώ παρέµεινε και ποσότητα υδατικού διαλύµατος. Τα εκχυλίσµατα στη συνέχεια συµπυκνώθηκαν µέχρι ξηρού σε περιστροφικό συµπυκνωτή απόσταξης υπό κενό ( Buchi 461 ) και παρελήφθησαν αντίστοιχα τα στερεά υπολείµµατα που φαίνονται στον Πίνακα 11: Πίνακας 11: Στερεά υπολείµµατα σε gr των εκχυλισµάτων µε soxhlet του µύκητα της βελανιδιάς ΙΑΛΥΤΗΣ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΤΕΡΕΟΥ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΟΣ(gr) Πεντάνιο 1,52 ιχλωροµεθάνιο 6,562 Πετρελαϊκός αιθυλεστέρας 6,136 Μεθανόλη 17,635 Κατανοµή µε οξικό αιθυλεστέρα 0,467 Κατανοµή µε νερό 3,56 57

58 Αναστασιλάκης Δ. Χρυσόστομος Τα εκχυλίσµατα αυτά ελέγχθηκαν µε χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας και κρίθηκε ιδιαίτερα ενδιαφέρον για περαιτέρω έλεγχο το εκχύλισµα του διχλωροµεθανίου, διότι µε αυξανόµενης πολικότητας διαλύτη παρουσίαζε πληθώρα ουσιών όπως βλέπουµε στην Εικόνα 9. Εικόνα 9: Χρωµατογραφήµατα λεπτής στιβάδας του διχλωροµεθανικού εκχυλίσµατος του µύκητα E.prunastri Πραγµατοποιήθηκε χρωµατογραφία στήλης µε γέλη οξειδίου του πυριτίου 60 (silica gel 60) mm (Merck, Art.9385) 30 cm µε διαλύτη έκλουσης αρχικά 100% εξάνιο και βαθµιαία έκλουση µε αυξανόµενη συγκέντρωση διχλωροµεθανίου έως συγκέντρωση 100% διχλωροµεθάνιο, ακολούθως διχλωροµεθάνιο-µεθανόλη και τελικό διαλύτη νερό. 58

59 Πίνακας 12: Συστήµατα έκλουσης χρωµατογραφίας στήλης ΙΑΛΥΤΗΣ ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΟΥ ΕΛΗΦΘΗΣΑΝ ΕΞΑΝΙΟ 100% 1-25 ΕΞΑΝΙΟ 90%- ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 10% 1-11 ΕΞΑΝΙΟ 70%- ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 30% ΕΞΑΝΙΟ 60%- ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 40% ΕΞΑΝΙΟ 50%- ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 50% ΕΞΑΝΙΟ 40%- ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 60% ΕΞΑΝΙΟ 30%- ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 70% ΕΞΑΝΙΟ 25%- ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 75% ΕΞΑΝΙΟ 20%- ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 80% ΕΞΑΝΙΟ 10%- ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 90% ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 100% ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 90%-ΜΕΘΑΝΟΛΗ 10% ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 85%-ΜΕΘΑΝΟΛΗ 15% ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 80%-ΜΕΘΑΝΟΛΗ 20% ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 70%-ΜΕΘΑΝΟΛΗ 30% ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 50%-ΜΕΘΑΝΟΛΗ 50% ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 40%-ΜΕΘΑΝΟΛΗ 60% ΙΧΛΩΡΟΜΕΘΑΝΙΟ 20%-ΜΕΘΑΝΟΛΗ 80% ΜΕΘΑΝΟΛΗ 100% ΜΕΘΑΝΟΛΗ 95%-ΝΕΡΟ 5% ΝΕΡΟ 100% Ακολούθησε συµπύκνωση των εν λόγω δειγµάτων και χρωµατογραφικός έλεγχος µε TLC. Ακολούθως τα δείγµατα που έδιναν σαφή δεδοµένα και υψηλή καθαρότητα σε σύστηµα τριών διαλυτών ανάπτυξης (διαφορετικής πολικότητας), οδηγήθηκαν για ενδελεχή έλεγχο µε φασµατοσκοπία πυρηνικού µαγνητικού συντονισµού (NMR). 59

60 Ουσίες που αποµονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν µε Φάσµατα πυρηνικού µαγνητικού συντονισµού (NMR) Ουσία 1 η 4 H 3 CO CH COOCH 3 OH 2-Hydroxy-4-methoxy-6-methyl-benzoic acid methyl ester Η Oυσία 1 έχει µοριακό τύπο C10H12O4 και Μ.Β.= 196, 20. Ονοµάζεται και µεθυλεστέρας του 2 υδροξυ 4 µεθοξυ 6 µεθυλ βενζοϊκού οξέος, ή εστέρας του Εβερνινικού οξέος ή µεθυλ 2 υδροξυ 4 µεθοξυ 6 µεθυλ βενζοϊκό οξύ ή και Sparassol. Η ουσία 1 ελήφθη από το κλάσµα 15 (διαλύτης 70% εξάνιο-30% διχλωροµεθάνιο) και η καθαρότητά της ουσίας ελέγχθηκε και πιστοποιήθηκε µε χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) σε πλάκα Kieselgel (Merck, Art. 5554) µε τρεις διαφορετικής πολικότητας κάθε φορά διαλύτες, και ακολούθως µε ψεκασµό µε αντιδραστήριο θειϊκής βανιλίνης και θέρµανση. Το διάλυµα της ουσίας 1 έδινε µετά τον ψεκασµό µε βανιλίνη µια έντονη κόκκινη κηλίδα. 60

61 Σύστηµα ιαλυτών EtOAc-Tol. 7-93% CH2Cl2 30% CH2Cl2 50% Rf 0,72 0,21 0,35 216nm 262nm 300nm Φάσµα UV Ουσίας 1 σε µεθανόλη Χαρακτηριστικό φαινολικό φάσµα (UV:216,262,300), µε εµφανή την επίδραση του καρβονυλιακού (συζυγιακού) δεσµού σε µεγαλύτερα µήκη κύµατος, και µια φυσιολογική βαθυχρωµική µετατόπιση προς τα µεγαλύτερα µήκη κύµατος. (147,148) 61

62 Φάσµα 1 HNMR της Ουσίας 1. 62

63 Πίνακας 13α. εδοµένα φασµάτων 1 HNMR Oυσίας1 (Sparassol) 1 H NMR (CDCl3, 500Hz) Αρ.Υδρογόνων Θέση-Ταυτοποίηση H Πολλαπλότητα Χηµική Μετατόπιση δ (PPM) 1 3 D (J=2,5 Hz) 6, D (J=2,5 Hz) 6,33 3 COOCH3 S 3,92 3 CH3 S 2,49 3 OCH3 S 3, ΟΗ S 11,79 63

64 Φάσµα 13 CNMR της Ουσίας 1. 64

65 Πίνακας 13β. εδοµένα φασµάτων 13 C NMR Oυσίας1 (Sparassol) 13 C NMR ( CDCl3 ) Ταυτοποίηση θέσης C Χηµική Μετατόπιση δ (PPM) 1 105, , , , , ,09 COOCH3 172,30 COOCH3 51,85 CH3 24,37 OCH3 55,28 65

66 Φάσµα HSQC της Ουσίας 1. Φάσµα HSBC της Ουσίας 1. 66

67 Μετά την επεξεργασία των φασµάτων της Ουσίας 1 και την καταγραφή των δεδοµένων, ακολούθησε η επεξεργασία και ερµηνεία των δεδοµένων αυτών που µε τη σειρά της, οδήγησε στην αναγνώριση της Ουσίας 1. Έτσι στην αρωµατική περιοχή του φάσµατος 1 H NMR, παρατηρούνται δύο πρωτόνια µε διπλή κορυφή (J=2,5 Hz) και χηµική µετατόπιση δ 6,28 και 6,33 ppm αντιστοιχούν στα πρωτόνια των θέσεων 3 και 5 αντίστοιχα. Σε δ 3,92 παρατηρείται µια απλή κορυφή τριών πρωτονίων που αποδίδεται στα 3 πρωτόνια COOCH3, ενώ σε δ 3,79 παρατηρείται η απλή κορυφή των τριών πρωτονίων της µεθόξυ οµάδας. Ακόµα µια απλή κορυφή τριών πρωτονίων σε δ 2,49 αποδίδεται στη µεθυλοµάδα της θέσης 6. Τέλος η µοναδική υδροξυλοµάδα της ένωσης δίνει µια απλή κορυφή στα 11,79 ppm. Στο φάσµα 13 C NMR της ουσίας µας παρατηρούµε σήµατα από δέκα άτοµα άνθρακα, έξι εκ των οποίων σε αρωµατική περιοχή και ένα χαρακτηριστικό καρβοξυλικής οµάδας σε δ 172,30. Από το φάσµα HMBC, επιβεβαιώνεται η συγκεκριµένη θέση των διαφόρων οµάδων στον αρωµατικό δακτύλιο. Τα δεδοµένα αυτά επιβεβαιώνονται από την υπάρχουσα βιβλιογραφία και συγκεκριµένα από τους Renaud et al (104 ), Rycroft (149), Joulain et al (36) και από τους Huneck et al. (147) 67

68 Ουσία 2 η OCH 3 H 3 CO CH O CH 3 OH O 2-Hydroxy-4-methoxy-6-methyl-benzoic acid 3 -methoxy-5 -methyl-phenyl ester Η Ουσία 2 έχει µοριακό τύπο C17H18O5 και Μ.Β.= 302,3. Ονοµάζεται 3 µεθοξυ 5 µεθυλ φαινυλ εστέρας του 2 υδρόξυ 4 µεθόξυ 6 µέθυλ βενζοϊκού οξέος ή διµεθοξυ λεκανορίνη ή 2-Ο -µεθυλεβερνόλη Η ουσία 2 ελήφθη από το κλάσµα 33 (εξάνιο 70%-διχλωροµεθάνιο 30%) και η καθαρότητά της ουσίας ελέγχθηκε µε διενέργεια χρωµατογραφίας λεπτής στιβάδας (TLC) σε πλάκα Kieselgel (Merck, Art. 5554) και ανάπτυξη µε τα παρακάτω συστήµατα διαλυτών ενώ ακολούθησε ψεκασµός µε αντιδραστήριο θειϊκής βανιλίνης και θέρµανση. Το διάλυµα της ουσίας 2 έδινε µετά τον ψεκασµό µε βανιλίνη µια έντονη κόκκινη κηλίδα. 68

69 Σύστηµα ιαλυτών EtOAc-Tol. 7-93% CH2Cl2 30% CH2Cl2 50% Rf 0,93 0,12 0, nm 269 nm 305 nm Φάσµα UV Ουσίας 1 σε µεθανόλη Χαρακτηριστικό φάσµα UV-Vis δεψιδίου (UV:218,269,305), (147), µε εµφανή την επίδραση του καρβονυλιακού (συζυγιακού) δεσµού σε µεγαλύτερα µήκη κύµατος, και µια φυσιολογική βαθυχρωµική µετατόπιση προς τα µεγαλύτερα µήκη κύµατος. (148) 69

70 Φάσµα 1 H NMR της Ουσίας 2. 70

71 Πίνακας 14α. εδοµένα φασµάτων 1 H NMR Ουσίας 2 1 H NMR (CDCl3, 500Hz) Αρ.Υδρογόνων Θέση-Ταυτοποίηση Η Πολλαπλότητα Χηµική Μετατόπιση δ (PPM) 1 3 S 6, S 6, CH3 S 2,6 3 4-OCH3 S 3, ΟΗ S 11, S 6, S 6, S 6, OCH3 S 3, CH3 S 2,35 71

72 Πίνακας 14β. εδοµένα φασµάτων 13 C NMR Ουσίας 2 13 C NMR ( CDCl3 ) Ταυτοποίηση θέσης C Χηµική Μετατόπιση δ (PPM) 1 104, , , , , ,27 COO- 169,65 6-CH3 24,49 4-OCH3 55, , , , , , ,41 3 -OCH3 54,2 5 -CH3 21,30 72

73 Φάσµα COSY της Ουσίας 2. 73

74 Φάσµα HSQC της Ουσίας 2. Φάσµα HSBC της Ουσίας 2. 74

75 Μετά την επεξεργασία των φασµάτων της ουσίας και την καταγραφή των δεδοµένων, ακολούθησε η επεξεργασία και ερµηνεία των δεδοµένων αυτών που µε τη σειρά τους, οδήγησαν στην τελική αναγνώριση της δοµής της Ουσίας 2 ως δεψίδιο. Έτσι στην αρωµατική περιοχή του φάσµατος 1 H NMR, παρατηρείται µια απλή κορυφή δύο πρωτονίων στα 6,37 ppm που αντιστοιχεί στα δύο πρωτόνια των θέσεων 3 και 5 του ενός αρωµατικού δακτυλίου, καθώς και τρείς απλές κορυφές ενός πρωτονίου έκαστη στα 6,54, 6,68 και 6,61 ppm που αντιστοιχούν στα πρωτόνια των θέσεων 2, 4, 6 του δεύτερου αρωµατικού δακτυλίου. ύο απλές κορυφές, τριών πρωτονίων εκάστη σε δ 3,82 και 3,78 αποδίδονται στα πρωτόνια των µεθοξυοµάδων των θέσεων 4 και 3, ενώ οι δύο απλές κορυφές των τριών πρωτονίων στα 2,6 και 2,35 ppm αντιστοιχούν στις µεθυλοµάδες των θέσεων 6 και 5 αντίστοιχα. Τέλος µια απλή κορυφή στα 11,55 ppm αποδίδεται στο πρωτόνιο του υδροξυλίου της θέσης 2. Στο φάσµα 13 C NMR της ουσίας παρατηρούµε σήµατα από δεκαεφτά άτοµα άνθρακα, δώδεκα εκ των οποίων σε αρωµατική περιοχή (γεγονός που δικαιολογεί την δοµή του δεψιδίου) και ένα χαρακτηριστικό καρβοξυλικής οµάδας. Στο φάσµα HMBC της ένωσης παρατηρούνται οι συσχετισµοί µεταξύ πρωτονίων και ανθράκων. Από τα παραπάνω επιβεβαιώνεται η προτεινόµενη δοµή για την ουσία 2 η οποία συµφωνεί µε την υπάρχουσα βιβλιογραφία (5,36,98,147,150,151) 75

76 Ουσία 3 η CH 3 H 3 CO CH COOCH O OH Η Ουσία 3 έχει µοριακό τύπο C19H20O7 και Μ.Β.= 360,35. Ονοµάζεται µεθυλ εστέρας του 2 υδρόξυ- 4-(2-υδροξυ-4 µεθοξυ-6 µεθυλ-βενζόυλοξυ)- 3,6 διµεθυλ βενζοϊκού οξέος ή και µεθυλεστέρας του 3 µεθυλ εβερνικού οξέος ή Evernin. Η ουσία 3 ελήφθη από το κλάσµα 45 (εξάνιο 70%-διχλωροµεθάνιο 30%) και η καθαρότητά του διαλύµατος της ουσίας ελέγχθηκε µε διενέργεια TLC σε πλάκα διοξειδίου του πυριτίου και ανάπτυξη µε τρια διαφορετικής πολικότηταςσυστήµατα διαλυτών και ακολούθως µε ψεκασµό µε αντιδραστήριο θειϊκής βανιλίνης και θέρµανση. Το διάλυµα της ουσίας 3 έδινε µοναδική κάθε φορά έντονη κόκκινη ένδειξη. Το διάλυµά της ουσίας από το οποίο ελήφθησαν τα δείγµατα παρουσίαζε πορτοκαλί χρώµα στο ορατό. OH O 2 -Hydroxy-4''-(2-hydroxy-4-methoxy-6-methyl-benzoyloxy)-3,6 -dimethyl-benzoic acid methyl ester CH 3 76

77 Αναστασιλάκης Δ. Χρυσόστομος Σύστηµα ιαλυτών EtOAc-Tol. 7-93% CH2Cl2 30% CH2Cl2 50% Rf 0,84 0,05 0, nm 266 nm 304 nm Φάσµα UV Ουσίας 3 σε µεθανόλη Χαρακτηριστικό φάσµα δεψιδίου (UV:221,266,304), (147), µε εµφανή την επίδραση του επιπρόσθετου καρβονυλιακού (συζυγιακού) δεσµού σε µεγαλύτερα µήκη κύµατος, και µια φυσιολογική βαθυχρωµική µετατόπιση προς τα µεγαλύτερα µήκη κύµατος (πορτοκαλί-ερυθρό).(148) 77

78 Φάσµα 1 H NMR της Ουσίας 3. 78

79 Πίνακας 15α. εδοµένα φασµάτων 1 H NMR Oυσίας 3 (Evernin) 1 H NMR (CDCl3, 500Hz) Αρ.Υδρογόνων Θέση-Ταυτοποίηση H Πολλαπλότητα Χηµική Μετατόπιση δ (PPM) 1 3 S 6, S 6, CH3 S 2,7 3 4-OCH3 S 3,9 1 2-ΟΗ S 11,9 1 5 S 6,6 3 COOCH3 S 3, CH3 S 2, CH3 S 2, ΟΗ S 11,4 79

80 Φάσµα 13 C NMR της Ουσίας 3. 80

81 Πίνακας 15β. εδοµένα φασµάτων 13 C NMR Ουσίας 3 (Evernin) 13 C NMR ( CDCl3 ) Ταυτοποίηση θέσης C Χηµική Μετατόπιση δ (PPM) 1 104, , , , , ,48 COO- 169,79 6-CH3 24,60 4-OCH3 55, , , , , , ,64 COOCH3 172,25 COOCH3 52,23 6 -CH3 9,31 3 -CH3 23,99 81

82 Φάσµα COSY της Ουσίας 3. 82

83 Φάσµα HSQC της Ουσίας 3. Φάσµα HSBC της Ουσίας 3. 83

84 Μετά την επεξεργασία των φασµάτων της ουσίας και την καταγραφή των δεδοµένων, ακολούθησε η επεξεργασία και ερµηνεία των δεδοµένων αυτών που µε τη σειρά τους, οδήγησαν στην τελική αναγνώριση της δοµής της Ουσίας 3 ως δεψίδιο. Έτσι στην αρωµατική περιοχή του φάσµατος 1 H NMR, παρατηρούνται δύο απλές κορυφές ενός πρωτονίου εκάστη µε χηµική µετατόπιση δ στα 6,35 ppm, που αντιστοιχούν στα πρωτόνια 3 και 5 του ενός φαινολικού δακτυλίου και µία απλή κορυφή ενός πρωτονίου µε χηµική µετατόπιση δ στα 6,6 ppm που αποδίδεται στο πρωτόνιο της θέσης 5 του δεύτερου φαινολικού δακτυλίου. Μία απλή τριών πρωτονίων κορυφή σε δ 3,90 αντιστοιχεί στο µεθοξύλιο της θέσης 4, ενώ µία τριών πρωτονίων απλή κορυφή σε δ 3,70 αποδίδεται στο µεθύλιο του εστέρα της θέσης 1. Τρεις απλές τριών πρωτονίων κορυφές σε δ 2,70, 2,60 και 2,20 ppm αποδίδονται στα πρωτόνια των µεθυλίων των θέσεων 6, 3 και 6 αντίστοιχα Τέλος δύο απλές κορυφές ενός πρωτονίου η καθεµία σε δ 11,9 και 11,4 ppm αντιστοιχούν στα πρωτόνια των υδροξυλοµάδων των θέσεων 2 και 2. Στο φάσµα 13 C NMR της ουσίας µας παρατηρούµε σήµατα από δεκαεννιά άτοµα άνθρακα, δώδεκα εκ των οποίων σε αρωµατική περιοχή (γεγονός που δικαιολογεί την δοµή του δεψιδίου) και δύο στα ppm χαρακτηριστικά καρβονυλικής οµάδας. Στο φάσµα HMBC παρατηρούµε τις σχέσεις των πρωτονίων µε τους γειτονικούς άνθρακες και επιβεβαιώνουµε τις θέσεις των διαφόρων οµάδων στους αρωµατικούς δακτυλίους, όπως φαίνεται άλλωστε και από το παραπάνω φάσµα. Η προτεινόµενη δοµή της ουσίας 3 επιβεβαιώνεται και από την υπάρχουσα βιβλιογραφία. (36,99,147) 84

85 Ουσία 4 η COOCH 3 HO 1 CH H 3 C OH 2,4-Dihydroxy-3,6-dimethyl-benzoic acid methyl ester Η Ουσία 4 έχει µοριακό τύπο C10H12O4 και Μ.Β.= 196,199. Ονοµάζεται και Evernyl, ή methyl atrarate ή και µεθυλεστέρας του 2,4 διυδρόξυ-3,6 διµεθυλ βενζοϊκού οξέος ή και methyl β orcinolcarboxylate. Η ουσία 4 ελήφθη από το κλάσµα 71 (εξάνιο 70%-διχλωροµεθάνιο 30%). Το διάλυµά της ουσίας παρουσίαζε χαρακτηριστικό υποκίτρινο-ελαφρώς ερυθρό χρώµα στο ορατό. Η καθαρότητά του διαλύµατος της ουσίας ελέγχθηκε και πιστοποιήθηκε µε διενέργεια TLC σε Kieselgel (Merck, Art. 5554) και ανάπτυξη µε τρία διαφορετικής πολικότητας συστήµατα διαλυτών και ακολούθως µε ψεκασµό µε αντιδραστήριο θειϊκής βανιλίνης και θέρµανση. Το διάλυµα της Ουσίας 4 έδινε µοναδική κάθε φορά µετά τον ψεκασµό και την θέρµανση έντονη κόκκινη ένδειξη. 85

86 Σύστηµα ιαλυτών EtOAc-Tol. 7-93% CH2Cl2 30% CH2Cl2 50% Rf 0,93 0,03 0,27 Φάσµα UV Ουσίας 4 σε µεθανόλη Χαρακτηριστικό φαινολικό φάσµα (UV: 268,297) (147), µε εµφανή την επίδραση του επιπρόσθετου καρβονυλιακού (συζυγιακού) δεσµού σε µεγαλύτερα µήκη κύµατος, και µια φυσιολογική βαθυχρωµική µετατόπιση προς τα µεγαλύτερα µήκη κύµατος (υποκίτρινο-ερυθρό). (148) Μετά την επεξεργασία των φασµάτων της ουσίας και την καταγραφή των δεδοµένων, ακολούθησε η επεξεργασία και ερµηνεία των δεδοµένων αυτών που µε τη σειρά τους, οδήγησαν στην τελική αναγνώριση της Ουσίας 4. 86

87 Φάσµα 1 H NMR της Ουσίας 4. 87

88 Πίνακας 16α. εδοµένα φασµάτων 1 H NMR Ουσίας 4 (Evernyl) 1 H NMR (CDCl3, 500Hz) Αρ.Υδρογόνων Θέση-Ταυτοποίηση H Πολλαπλότητα Χηµική Μετατόπιση δ (PPM) 1 5 S 6,21 3 COOCH3 S 3, CH3 S 2, ΟΗ S 5, CH3 S 2, OΗ S 12,04 88

89 Φάσµα 13 C NMR της Ουσίας 4. 89

90 Πίνακας 16β. εδοµένα φασµάτων 13 C NMR Ουσίας 4 (Evernyl) 13 C NMR ( CDCl3 ) Ταυτοποίηση θέσης C Χηµική Μετατόπιση δ (PPM) 1 105, , , , , ,01 COOCH3 172,81 COOCH3 51,74 6-CH3 24,07 3-CH3 7,96 90

91 Φάσµα COSY της Ουσίας 4. Φάσµα HSQC της Ουσίας 4. 91

92 Φάσµα HSBC της Ουσίας 4. Με την µελέτη των φασµάτων ΝΜR παρατηρούµε τα παρακάτω: Στην αρωµατική περιοχή του φάσµατος 1 H NMR, εµφανίζεται µία απλή κορυφή ενός πρωτονίου µε χηµική µετατόπιση δ στα 6,21ppm που αντιστοιχεί στο πρωτόνιο 5 του αρωµατικού δακτυλίου. Τα τρία πρωτόνια του µεθυλίου του εστέρα εµφανίζονται σαν απλή τριών πρωτονίων κορυφή σε δ 3,92, ενώ δύο απλές τριών πρωτονίων κορυφές σε δ 2,46 και 2,09 αποδίδονται στα πρωτόνια των µεθυλοµάδων 6 και 3. Τέλος σε δ 5,01 και 12,04 εµφανίζονται δύο απλές κορυφές ενός πρωτονίου εκάστη που αντιστοιχούν στα πρωτόνια των υδροξυλίων 4 και 2. Το τελευταίο εµφανίζεται πολύ αποθωρακισµένο σε σχέση µε αυτό της θέσης 4 λόγω γειτνίασης µε την καρβονυλική οµάδα η οποία λειτουργεί σαν δέκτης ηλεκτρονίων. Στο φάσµα 13 C NMR της ουσίας µας παρατηρούµε σήµατα από δέκα άτοµα άνθρακα, έξι εκ των οποίων σε αρωµατική περιοχή και ένα περίπου στα 173 ppm, περιοχή χαρακτηριστική καρβονυλικής οµάδας. Στο δε φάσµα HSBC οι σχέσεις που προκύπτουν είναι:η3,92-c51,74/172,81, Η2,46- C140,01/105,41/110,56,H6,21-C24,07/105,41/158,31/108,31,H5,01-C110,56/ 158,31/108,31, H2,09-C163,14/158,31/105,41/110,56, H12,04-C51,74/105,41/ 108,31/ 163,14. Από τα παραπάνω δεδοµένα καθώς και από την υπάρχουσα βιβλιογραφία (36,95,99, ,147) επιβεβαιώνεται η προτεινόµενη δοµή της ουσίας 4. 92

93 Ουσία 5 η 6 1 OCH H 3 C 4 OCH 3 1,3-Dimethoxy-5-methyl-benzene Η ουσία 5 έχει µοριακό τύπο C9H12O2 και Μ.Β.= 152,19. Ονοµάζεται εκτός από 1,3 διµεθόξυ 5 µέθυλ βενζένιο και 3, 5 διµεθόξυ τολουένιο ή και διµεθυλαιθέρας της ορσινόλης. Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός ότι το διάλυµά της ουσίας παρουσίαζε βαθύ κόκκινο χρώµα και στο ορατό. Η ουσία 5 ελήφθη από το κλάσµα 236 (εξάνιο 40%-διχλωροµεθάνιο 60%). Η καθαρότητά του ελέγχθηκε µε διενέργεια χρωµατογραφίας λεπτήςε στιβάδας (TLC) σε πλάκα διοξειδίου του πυριτίου και ανάπτυξη µε τρεις διαφορετικής πολικότητας κάθε φορά διαλύτες και ακολούθως µε ψεκασµό µε αντιδραστήριο θειϊκής βανιλίνης και θέρµανση. Κάθε φορά µετά τον ψεκασµό εµφανιζόταν µία έντονη κόκκινη ένδειξη και την θέρµανση. Σύστηµα ιαλυτών EtOAc CH2Cl2 60% CH2Cl2 80% Rf 0,75 0,01 0,11 93

94 273 nm 279 nm Φάσµα UV Ουσίας 5 σε µεθανόλη Χαρακτηριστικό φαινολικό φάσµα (UV: 273,279), µε εµφανή την επίδραση των συζυγιακών δεσµών και µια σχετική βαθυχρωµική µετατόπιση προς τα µεγαλύτερα µήκη κύµατος (ερυθρό). (147,148) 94

95 Φάσµα 1 H NMR της Ουσίας 5. 95

96 Πίνακας 17α. εδοµένα φασµάτων 1 H NMR Ουσίας 5 1 H NMR (CDCl3, 500Hz) Αρ.Υδρογόνων Θέση-Ταυτοποίηση H Πολλαπλότητα Χηµική Μετατόπιση δ (PPM) 1 2 S 6, S 6, S 6, CH3 S 2, OCH3 S 3, OCH3 S 3,45 96

97 CARBON_ KRIS_ f1 (ppm) Φάσµα 13 C NMR της Ουσίας 5. 97

98 Πίνακας 17β. εδοµένα φασµάτων 13 C NMR Ουσίας 5 13 C NMR ( CDCl3 ) Ταυτοποίηση θέσης C Χηµική Μετατόπιση δ (PPM) 1 160, , , , , ,95 5-CH3 21,21 1-OCH3 55,52 3-OCH3 50,3 98

99 Φάσµα COSY της Ουσίας 5. Φάσµα HSQC της Ουσίας 5. Φάσµα HSBC της Ουσίας 5. 99

100 Μετά την επεξεργασία των φασµάτων της ουσίας και την καταγραφή των δεδοµένων, ακολούθησε η επεξεργασία και ερµηνεία αυτών που µε τη σειρά τους, οδήγησαν στην τελική αναγνώριση της Ουσίας 5. Έτσι στην αρωµατική περιοχή του φάσµατος 1 H NMR, παρατηρούνται µία απλή κορυφή δύο πρωτονίων σε δ 6,26 που αντιστοιχεί στα πρωτόνια των θέσεων 4 και 6 και µία ενός πρωτονίου απλή κορυφή σε δ 6,24 που αντιστοιχεί στο πρωτόνιο της θέσης 2. Τα έξι πρωτόνια των δύο µεθοξυ οµάδων εµφανίζονται σαν δύο απλές κορυφές τριών πρωτονίων, σε δ 3,40 αµφότερες καθώς έχουν ισοδύναµο περιβάλλον, ενώ τα πρωτόνια του µεθυλίου εµφανίζονται σαν απλή κορυφή σε δ 2,24 Στο φάσµα 13 C NMR παρατηρούµε σήµατα από εννέα άτοµα άνθρακα, έξι εκ των οποίων σε αρωµατική περιοχή. Από όλα τα παραπάνω στοιχεία καθώς και µε σύγκριση µε την υπάρχουσα βιβλιογραφία (36,103,155,147) επιβεβαιώνεται η προτεινόµενη δοµή της ουσίας

101 10.3 Μέτρηση Βιολογικών δράσεων Evernia prunastri Μέτρηση αντιοξειδωτικής δράσης Για τη µέτρηση της αντιοξειδωτικής δράσης των εκχυλισµάτων που αναφέρονται ακολούθως, µε τη µέθοδο DPPH και για το πείραµα της αναστολής της LOX χρησιµοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντιδραστήρια: DPPH, Sigma-Aldrich ιµέθυλο σουλφοξείδιο (DMSO) Άλας µε νάτριο του λινελαϊκού οξέος (0.1mM) σε ph=9.00 Φυτική λιποξυγονάση (σόγιας) (1.9 Χ 10 4 w/vσε φυσιολογικό ορό) ( LOX) Ρυθµιστικό διάλυµα Tris ph=9.00 (Tris HCl-> υδροξυ-µεθυλ-αµινο-µεθάνιο) Για την µέτρηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των εκχυλισµάτων του φυτού παρασκευάστηκαν διαλύµατα από το πεντανικό, πετρελαϊκό αιθέρα, διχλωροµεθανικό και το µεθανολικό κλάσµα,και από το τελευταίο την κατανοµή του οξικού αιθυλεστέρα και του νερού σύµφωνα µε τη παρακάτω διαδικασία: 1. Κατασκευάστηκε η πρότυπη καµπύλη βάσει διάφορων συγκεντρώσεων µητρικού (DPPH) διαλύµατος. Πίνακας 18. Απορροφήσεις διαλυµάτων διαφόρων συγκεντρώσεων του µητρικού διαλύµατος µε την µέθοδο DPPH ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ (mg/ml) ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ(M) ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ(abs) στα 515nm 9,86E-04 2,50E-06 0,023 1,97E-03 5,00E-06 0,05 3,94E-03 1,00E-05 0,098 7,89E-03 2,00E-05 0,19 101

102 0,25 0,2 y = 24,037x + 0,0014 R² = 0,9994 0,15 0,1 0,05 0 Εικόνα 10. Πρότυπη καµπύλη µητρικού διαλύµατος στην µέθοδο DPPH για τον µήκυτα βελανιδιάς 2. Τα εκχυλίσµατα του πεντανίου, πετρελαϊκού αιθέρα, διχλωροµεθανίου, µεθανόλης, και οι κατανοµές του οξικού αιθυλεστέρα και του νερού αραιώθηκαν µε µεθανόλη. Έγιναν δοκιµές µε διάφορες αραιώσεις ώστε να καταλήξουµε στις συγκεντρώσεις που έδιναν απορροφήσεις εντός των ορίων γραµµικότητας της καµπύλης αναφοράς. 3. Ακολούθησε ανάδευση µε Vortex των διαλυµάτων. 4. Μέσα σε Eppendorf έγινε τοποθέτηση µε πιπέτα ακριβείας 25 µl από τα αραιωµένα δείγµατα. Ακολούθησε προσθήκη 975 µl DPPH 0,06 mm και ανάδευση στο Vortex. 5. Το δείγµα αφέθηκε να αντιδράσει για 30 min στο σκοτάδι. 6. Τοποθετήθηκαν τα δείγµατα σε κυψελίδες και αµέσως ακολούθησε φωτοµέτρηση στα 515 nm. 7. Ελήφθησαν οι µετρήσεις για χρονικό διάστηµα 90 λεπτών, 8. χρησιµοποιήθηκε κερκετίνη ως µέτρο σύγκρισης (0,096 mg Κερκετίνη/mg DPPH) και µε βάσει την πρότυπη καµπύλη αποδόθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα έκαστου εκχυλίσµατος όπως παρουσιάζεται στον Πίνακα 18 και 19 και στην Εικόνα 10 και

103 Πίνακας 19. Αντιοξειδωτική ικανότητα και EC50 των εκχυλισµάτων του µήκυτα βελανιδιάς µε την µέθοδο DPPH Α/Α Εκχύλισµα ΑΕ (Αντιοξειδωτική ικανότητα) EC50 1 Πεντάνιο ± Πετρ. Αιθέρας ± ιχλωροµεθάνιο ± Μεθανόλη ± Οξικ.Αιθυλεστέρας ± Υδατικό ± Κερκετίνη (πρότυπο) 14,022 0,071±

104 Τα εκχυλίσµατα του πεντανίου, του πετρελαϊκού αιθέρα, του διχλωροµεθανίου, του µεθανολικού, καθώς και αυτά του οξικού αιθυλεστέρα και του απιονισµένου ύδατος (από το µεθανολικό), ερευνήθηκαν µε χρήση της µεθόδου DPPH (132) και κατέδειξαν ότι ο µύκητας παρουσιάζει και αντιοξειδωτική δράση. Η αρχική συγκέντρωση DPPH (C DPPH.) στην αντίδραση υπολογίζεται από την καµπύλη βαθµονόµησης µε την εξίσωση, Α (515nm) = 0,0174 CDPPH. (µg / ml) + 0,0194, όπου R 2 = 0,9996. H µέτρηση των δεδοµένων βασίστηκε στη µείωση της απορρόφησης των δειγµάτων κατά την αναγωγή του DPPH'. Για κάθε συγκέντρωση αντιοξειδωτικού εκχυλίσµατος που διερευνήθηκε, το ποσοστό DPPH που παραµένει σε σταθερή κατάσταση, υπολογίσθηκε ως εξής: % DPPH.rem = [DPPH. ]T /[DPPH. ]T-0, όπου Τ είναι ο χρόνος που απαιτείται για την επίτευξη της σταθερής κατάστασης [DPPH. ]. Υπολογίζεται η ποσότητα του αντιοξειδωτικού / mole DPPH. για να ληφθεί η ποσότητα αντιοξειδωτικού που είναι αναγκαίο να µειωθεί η αρχική συγκέντρωση DPPH. κατά 50% (EC50). AE = 1 / EC50 Χρησιµοποιήθηκε κερκετίνη (0,096 mg Κερκετίνη/mg DPPH), ως εσωτερικό πρότυπο. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι και τα έξι εκχυλίσµατα είναι αποδοτικά και αποτελεσµατικά στην αναστολή της ελεύθερης ρίζας DPPH., και η δραστικότητα της σάρωσης τους µειώθηκε µε την ακόλουθη σειρά: εκχύλισµα οξ.αιθυλεστέρα>πεντανίου>διχλωροµεθανίου>µεθανόλης>πετρ.αιθέρα> υδατικού. Η αντιοξειδωτική δράση όλων των εκχυλισµάτων σε σχέση µε το πρότυπο της κερκετίνης εµφανίστηκε αρκετά χαµηλότερη αλλά σαφώς αξιοσηµείωτη. 104

105 2,5 Αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων του μήκυτα Evernia Prunastri 2 1,5 A.E. 1 0,5 0 Εκχυλίσματα του μήκυτα Evernia Prunastri Εικόνα 11. Αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισµάτων του µήκυτα βελανιδιάς µε την µέθοδο σάρωσης των ριζών DPPH. Η εντονότερη αντιοξειδωτική δράση όπως διαφαίνεται και από την Εικόνα 11 παρουσιάστηκε στο πεντανικό, στο διχλωροµεθανικό εκχύλισµα και κυρίως σε αυτό του οξικού αιθυλεστέρα λόγω των αναµενόµενων φαινολικών ενώσεων και ιδίως των φλαβονοειδών. 105

106 Μέτρηση της αναστολής του ενζύµου αναγωγάση της αλδόζης Σύµφωνα µε τις ισχύουσες τεχνικές (156,157) παρασκευάστηκαν τα ακόλουθα διαλύµατα: ιάλυµα φωσφορικών 0,067Μ ph = 6,2 µε ζύγιση 0,947g άνυδρου Na2HPO4 (MΒ=141,98) ή 1,187g ένυδρου Na2HPO4 (MΒ=177,98), και ακολούθως αραίωση σε 100 ml H2O και από αυτά λήψη 18,5 ml και µε ζύγιση 0,908g άνυδρου KH2PO4 (MΒ=136,09), και ακολούθως αραίωση σε 100 ml H2O και λήψη 81,5 ml από αυτά. ιάλυµα NADPH 0,104 mm (τετρανατριούχο άλας, MΒ=833,4) µε διάλυση 6,91 mg NADPH σε 2,5ml buffer την ηµέρα του πειράµατος και διατήρηση σε πάγο. ιάλυµα DL-γλυκερυναλδεύδης 10 mm (MΒ=90,08) µε διάλυση 49,54mg DL-γλυκερυναλδεύδης σε 5ml buffer την ηµέρα του πειράµατος και διατήρηση σε πάγο. Κορεσµένο διάλυµα (NH4)2SO4 µε ανάδευση 43,5g (NH4)2SO4 σε 56,5ml Η2Ο για τουλάχιστον 6h ιάλυµα NaHCO3 0,2M (MΒ=84,01) µε διάλυση 1,68g NaHCO3 σε 100ml Η2Ο ιάλυµα της υπό εξέτασης ουσίας µε συγκέντρωση 10-4 Μ µε ζύγιση σε mg 3,19x10-3 xmβ και διάλυση σε 1ml 0,2M NaHCO3 ή 1ml 10% υδατικού διαλύµατος DMSO (0,1ml DMSO + 0,9ml H2O). ( Για µίγµατα εκχυλισµάτων φυτών µε τελική περιεκτικότητα 50µg/ml ο όγκος που χρειάζεται είναι V=x»10 3 /1595 όπου x=βάρος του µίγµατος σε mg και V=όγκος του 10% υδατικού διαλύµατος DMSO σε ml. ) Το ένζυµο της αναγωγάσης της αλδόζης προετοιµάστηκε αρχικά µε οµογενοποίηση 10 φακών οφθαλµών επίµυων σε 5ml H2O και ακολούθως ψύξη. Φυγοκέντρηση στις rpm/min στους 0 C. Παραλαβή της υπερκείµενης φάσης και ανάµειξη µε το κορεσµένο διάλυµα (NH4)2SO4 [αναλογία 4,5ml υπερκείµενο/ 3ml κορεσµένο διάλυµα (NH4)2SO4]. Εν συνεχεία φυγοκέντρηση στις rpm/ min στους 0 C και παραλαβή του υπερκείµενου και διατήρηση αυτού στους -80 C για 24h. Πείραµα µε control Έγινε ανάµειξη των εξής διαλυµάτων: Buffer 2,4 ml NADPH 100µL Ένζυµο 300µL 106

107 ιάλυµα NaHCO3 ή 10% DMSO 100µL Ακολούθως ανάµειξη 1ml από το παραπάνω µίγµα µε 100µL buffer στην κυψελίδα αναφοράς και µηδενίστηκε το φασµατοφωτόµετρο. Αµέσως µετά, ανάµειξη 1ml από το παραπάνω µίγµα µε 100 µl DL-γλυκεραλδεύδης στην κυψελίδα µέτρησης και καταγραφή της έναρξης του χρόνου. Ισορροπία του συστήµατος για 1min στους 30 ο C και µέτρηση στα 340nm για 5' ανά 30''. Η ταχύτητα της αντίδρασης πρέπει να είναι περίπου 0,020µον/ λεπτό ή 0,010µον/ λεπτό. Πείραµα µε αναστολέα Έγινε ανάµειξη των εξής διαλυµάτων: Buffer 2,4ml NADPH 100 µl Ένζυµο 300 µl Ουσία 100 µl ή 90 µl H2O + 10 µl ουσία σε DMSO Ακολούθησε ανάµειξη 1ml από το παραπάνω µίγµα µε 100 µl buffer στην κυψελίδα αναφοράς και µηδενίστηκε το φασµατοφωτόµετρο. Αµέσως µετά 1ml από το παραπάνω µίγµα αναµείχθηκε µε 100µL DL-γλυκεραλδεύδης στην κυψελίδα µέτρησης και καταγράφηκε η έναρξη του χρόνου. Αφέθηκε το σύστηµα να ισορροπήσει για 1min στους 30 ο C και ακολούθησε µέτρηση στα 340nm για 5' ανά 30''. Η ταχύτητα της αντίδρασης πρέπει να είναι περίπου 0,020µον/ λεπτό ή 0,010µον/ λεπτό. Και τελική καταγραφή της % αναστολής του ενζύµου. Η αναστολή της δράσης του ενζύµου υπολογίστηκε από τον τύπο: %ALR2inhibition = 100[(Absc- Abss) / Abs<1 Absc, Abss: η µεταβολή της απορρόφησης του control και του δείγµατος αντίστοιχα. Επειδή πρόκειται για µίγµατα ουσιών και όχι για καθαρές ουσίες, τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται ως ανασταλτικές δράσεις και αντιστοιχούν στο µέσο όρο δύο διαφορετικές µετρήσεις µε τυπική απόκλιση (SD)<10%. H σορβινίλη θεωρήθηκε ως control µε ικανότητα αναστολής του ενζύµου της αναγωγάσης της αλδόζης 45% σε συγκέντρωση 0,25Μµ (59µg/ml). 107

108 Πίνακας 20. Ικανότητα των εκχυλισµάτων του µήκυτα βελανιδιάς να αναστέλλουν την αναγωγάση της αλδόζης ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΑΝΑΓΩΓΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΛΔΟΖΗΣ Συγκέντρωση δείγματος 50µg/ml Κλάσµα αναστολή(α) αναστολή(β) MO SD EtOAc 91,41 93,94 92,68 1, CH2Cl2 92,42 91,41 91,92 0, CH3OH 71,21 71,72 71,46 0, Petr. Ether 84,85 83,84 84,34 0, C5 69,19 70,71 69,95 0, H2O 21,21 18,18 19,70 1, Όπως φαίνεται και από τα πειραµατικά δεδοµένα σε φυσιολογικά µάτια επίµυων Wistar rats όλα τα εκχυλίσµατα του µήκυτα της βελανιδιάς παρουσιάζουν ισχυρή ανασταλτική δράση στην 108

109 αναγωγάση της αλδόζης, κι αυτό διότι τόσο οι φαινολικές ενώσεις όσο και τα καρβοξυλικά οξέα που περιέχουν, αποτελούν δραστικούς αναστολείς αυτού του ενζύµου. Ιδιαίτερα δε το εκχύλισµα του οξικού αιθυλεστέρα και αυτό του διχλωροµεθανίου µε ποσοστά άνω του 90%, ενώ το υδατικό ήταν αυτό µε την λιγότερο σηµαντική δράση. (<21%) Αναστολή της αναγωγάσης της αλδόζης από εκχυλίσματα του μύκητα E.prunastri 100,00 90,00 80,00 % αναστολή της αναγωγάσης της αλδόζης 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 EtOAc CH2Cl2 CH3OH Petr. Ether C5 H2O Εικόνα 12. Ικανότητα των εκχυλισµάτων του µήκυτα βελανιδιάς να αναστέλλουν την αναγωγάση της αλδόζης 109

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 8 (ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ) ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 8 (ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ) ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 8 (ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ) ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Με τον όρο αυτό ονοµάζουµε την τεχνική ποιοτικής και ποσοτικής ανάλυσης ουσιών µε βάση το µήκος κύµατος και το ποσοστό απορρόφησης της ακτινοβολίας

Διαβάστε περισσότερα

Ποιοτικά Χαρακτηριστικά Λυµάτων

Ποιοτικά Χαρακτηριστικά Λυµάτων Ποιοτικά Χαρακτηριστικά Λυµάτων µπορούν να καταταχθούν σε τρεις κατηγορίες: Φυσικά Χηµικά Βιολογικά. Πολλές από τις παραµέτρους που ανήκουν στις κατηγορίες αυτές αλληλεξαρτώνται π.χ. η θερµοκρασία που

Διαβάστε περισσότερα

ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΣΤΙΓΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ ΚΡΟΚΟΣ (Crocus sativus L. )

ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΣΤΙΓΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ ΚΡΟΚΟΣ (Crocus sativus L. ) ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΣΤΙΓΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ ΚΡΟΚΟΣ (Crocus sativus L. ) Μόσχος Γ. Πολυσίου, Χημικός, Καθηγητής Χημείας, Εργαστήριο Γενικής Χημείας, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΙΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 3.1 ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ

ΕΡΓΑΣΙΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 3.1 ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΕΡΓΑΣΙΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 3.1 ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ Οι οργανισμοί εξασφαλίζουν ενέργεια, για τις διάφορες λειτουργίες τους, διασπώντας θρεπτικές ουσίες που περιέχονται στην τροφή τους. Όμως οι φωτοσυνθετικοί

Διαβάστε περισσότερα

Τοπικά παραδοσιακά τρόφιμα : Oίνος OΡΘΕΣ ΠΡΑΚΤΙΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΟΙΟΤΙΚΩΝ ΟΙΝΩΝ

Τοπικά παραδοσιακά τρόφιμα : Oίνος OΡΘΕΣ ΠΡΑΚΤΙΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΟΙΟΤΙΚΩΝ ΟΙΝΩΝ Τοπικά παραδοσιακά τρόφιμα : Oίνος OΡΘΕΣ ΠΡΑΚΤΙΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΟΙΟΤΙΚΩΝ ΟΙΝΩΝ ΓΙΩΡΓΟΣ ΚΟΤΣΕΡΙΔΗΣ Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου Τοπικά Παραδοσιακά

Διαβάστε περισσότερα

TERMS USED IN STANDARDIZAfiON OF CHEMICAL FOOD ANALYSIS SUMMARY

TERMS USED IN STANDARDIZAfiON OF CHEMICAL FOOD ANALYSIS SUMMARY ΑΠΟΔΟΣΗ ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΩΝ ΟΡΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ ΧΗΜΙΚΩΝ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Τεχνική Επιτροπή ΕΛΟΤ 85 "Τρόφιμα", Κ. Τζιά, I. Σαριδάκης ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το αντικείμενο της εργασίας είναι η απόδοση των

Διαβάστε περισσότερα

-H 2 H2 O R C COOH. α- κετοξύ

-H 2 H2 O R C COOH. α- κετοξύ Παραπροϊόντα αλκοολικής ζύµωσης Τα παραπροϊόντα της αλκοολικής ζύµωσης είναι χηµικές ενώσεις που προέρχονται είτε από τον ίδιο το µηχανισµό της αλκοολικής ζύµωσης, είτε από το µεταβολισµό της ζύµης, είτε

Διαβάστε περισσότερα

Ο ρόλος και η σημασία των μοριακών τεχνικών στον έλεγχο των. μικροβιολογικών παραμέτρων σε περιβαλλοντικά δείγματα για την προστασία

Ο ρόλος και η σημασία των μοριακών τεχνικών στον έλεγχο των. μικροβιολογικών παραμέτρων σε περιβαλλοντικά δείγματα για την προστασία Ο ρόλος και η σημασία των μοριακών τεχνικών στον έλεγχο των μικροβιολογικών παραμέτρων σε περιβαλλοντικά δείγματα για την προστασία της Δημόσιας Υγείας Α. Βανταράκης Εργαστήριο Υγιεινής, Ιατρική Σχολή,

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΣΤΟΥΣ ΧΩΡΟΥΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Περίληψη εισήγησης σε σεµινάριο τεχνικών ασφαλείας του ΕΛΙΝΥΑΕ ΤΖΙΝΑΣ ΘΕΟ ΩΡΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΤΕΧΝΙΚΟΣ ΕΠΙΘΕΩΡΗΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΟΡΙΣΜΟΙ Βιολογικοί

Διαβάστε περισσότερα

ΡΑΔΙΟΧΗΜΕΙΑ 4. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ

ΡΑΔΙΟΧΗΜΕΙΑ 4. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΡΑΔΙΟΧΗΜΕΙΑ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΩΝ ΙΣΟΤΟΠΩΝ Τμήμα Χημικών Μηχανικών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ 4. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ Ιωάννα Δ. Αναστασοπούλου Βασιλική

Διαβάστε περισσότερα

ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΧΛΩΡΟΠΡΟΠΑΝΟΛΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ PSEUDOMONAS PUTIDA DSM437

ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΧΛΩΡΟΠΡΟΠΑΝΟΛΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ PSEUDOMONAS PUTIDA DSM437 1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 215. ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ ΧΛΩΡΟΠΡΟΠΑΝΟΛΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΒΑΚΤΗΡΙΟ PSEUDOMONAS PUTIDA DSM437 Κ. Κόντη, Δ. Μαμμά, Δ. Κέκος Σχολή Χημικών

Διαβάστε περισσότερα

❷ Η εµφάνιση και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των τροφίµων. ❸ Η θρεπτική αξία των τροφίµων. ❻ Η προσαρµογή στο νέο προφίλ των τροφίµων

❷ Η εµφάνιση και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των τροφίµων. ❸ Η θρεπτική αξία των τροφίµων. ❻ Η προσαρµογή στο νέο προφίλ των τροφίµων Ποιότητα Ορισµός Η έννοια της ποιότητας όπως αυτή ορίζεται από τον ιεθνή Οργανισµό Τυποποίησης (ISO) αναφέρεται στο σύνολο των ιδιοτήτων και των χαρακτηριστικών ενός προϊόντος τα οποία του προσδίδουν τη

Διαβάστε περισσότερα

ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΕΛΙΑΣ, ΥΠΟΤΡΟΠΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΚΑΙ ΑΜΠΕΛΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΛΕΓΧΟΥ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΜΥΤΙΛΗΝΗΣ

ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΕΛΙΑΣ, ΥΠΟΤΡΟΠΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΚΑΙ ΑΜΠΕΛΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΛΕΓΧΟΥ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΜΥΤΙΛΗΝΗΣ ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΕΛΙΑΣ, ΥΠΟΤΡΟΠΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΚΑΙ ΑΜΠΕΛΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΛΕΓΧΟΥ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΜΥΤΙΛΗΝΗΣ Β. Βανδέρα Χημικός Msc, Τεχνικός Υπεύθυνος Εργαστηρίου Ελαιολάδου Μυτιλήνης ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟΥ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ

Διαβάστε περισσότερα

Πανελλήνιος Μαθητικός Διαγωνισμός για την επιλογή στη 10η Ευρωπαϊκή Ολυμπιάδα Επιστημών - EUSO 2012 Σάββατο 21 Ιανουαρίου 2012 ΒΙΟΛΟΓΙΑ

Πανελλήνιος Μαθητικός Διαγωνισμός για την επιλογή στη 10η Ευρωπαϊκή Ολυμπιάδα Επιστημών - EUSO 2012 Σάββατο 21 Ιανουαρίου 2012 ΒΙΟΛΟΓΙΑ Πανελλήνιος Μαθητικός Διαγωνισμός για την επιλογή στη 10η Ευρωπαϊκή Ολυμπιάδα Επιστημών - EUSO 2012 Σάββατο 21 Ιανουαρίου 2012 ΒΙΟΛΟΓΙΑ Σχολείο: Ονοματεπώνυμα μαθητών: 1) 2). 3) 1 Προετοιμασία νωπού παρασκευάσματος

Διαβάστε περισσότερα

3.1 Ενέργεια και οργανισμοί

3.1 Ενέργεια και οργανισμοί Δημήτρης Η. Β 1 25.3.14 3 Ο Κεφάλαιο 3.1 Ενέργεια και οργανισμοί Η ενέργεια έχει κεντρική σημασία για έναν οργανισμό, γιατί ό,τι και να κάνουμε χρειαζόμαστε ενέργεια. Ο κλάδος της βιολογίας που ασχολείται

Διαβάστε περισσότερα

«ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΔΟΜΗ ΞΥΛΟΥ» ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΞΥΛΟΥ. Δρ. Γεώργιος Μαντάνης Εργαστήριο Τεχνολογίας Ξύλου Τμήμα Σχεδιασμού & Τεχνολογίας Ξύλου & Επίπλου

«ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΔΟΜΗ ΞΥΛΟΥ» ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΞΥΛΟΥ. Δρ. Γεώργιος Μαντάνης Εργαστήριο Τεχνολογίας Ξύλου Τμήμα Σχεδιασμού & Τεχνολογίας Ξύλου & Επίπλου «ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΔΟΜΗ ΞΥΛΟΥ» ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΞΥΛΟΥ Δρ. Γεώργιος Μαντάνης Εργαστήριο Τεχνολογίας Ξύλου Τμήμα Σχεδιασμού & Τεχνολογίας Ξύλου & Επίπλου ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΞΥΛΟΥ ΣΥΣΤΑΣΗ ΞΥΛΟΥ ΣΕ ΔΟΜΙΚΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ

Διαβάστε περισσότερα

Περιοδικό: Αισθητική Σήμερα Τεύχος: 21, Ιανουάριος Μάρτιος 2003

Περιοδικό: Αισθητική Σήμερα Τεύχος: 21, Ιανουάριος Μάρτιος 2003 Περιοδικό: Αισθητική Σήμερα Τεύχος: 21, Ιανουάριος Μάρτιος 2003 Η ΒΙΤΑΜΙΝΗ C ΣΤΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΠΕΡΙΠΟΙΗΣΗΣ ΔΕΡΜΑΤΟΣ Δρ. Des Fernandes (πλαστικός χειρουργός, ιδρυτής της Environ Skin Care και δημιουργός των

Διαβάστε περισσότερα

Παραγωγή βιοντήζελ: πρώτες ύλες και παραπροϊόντα. Νίκος Λιάπης ιευθυντής Εκµετάλλευσης ΕΛΙΝΟΙΛ Α.Ε.

Παραγωγή βιοντήζελ: πρώτες ύλες και παραπροϊόντα. Νίκος Λιάπης ιευθυντής Εκµετάλλευσης ΕΛΙΝΟΙΛ Α.Ε. Παραγωγή βιοντήζελ: πρώτες ύλες και παραπροϊόντα Νίκος Λιάπης ιευθυντής Εκµετάλλευσης ΕΛΙΝΟΙΛ Α.Ε. Θεσσαλονίκη Νοέµβριος 2006 Στόχοι παραγωγής: ΕΝ 14214 Βελτιστοποίηση οικονοµικών αποτελεσµάτων Ασφάλεια

Διαβάστε περισσότερα

Η ΑΝΑΓΚΗ ΓΙΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ

Η ΑΝΑΓΚΗ ΓΙΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η ΑΝΑΓΚΗ ΓΙΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Οι Ενόργανες Μέθοδοι Ανάλυσης είναι σχετικές μέθοδοι και σχεδόν στο σύνολο τους παρέχουν την αριθμητική τιμή μιας φυσικής ή φυσικοχημικής ιδιότητας, η

Διαβάστε περισσότερα

Παράρτημα καυσίμου σελ.1

Παράρτημα καυσίμου σελ.1 Παράρτημα καυσίμου σελ.1 Περιγραφές της σύστασης καύσιμης βιομάζας Η βιομάζα που χρησιμοποιείται σε ενεργειακές εφαρμογές μπορεί να προέρχεται εν γένει από δέντρα ή θάμνους (ξυλώδης ή λιγνο-κυτταρινούχος

Διαβάστε περισσότερα

Ηλίας Σμυρνιούδης Διευθυντής Έρευνας & Ανάπτυξης

Ηλίας Σμυρνιούδης Διευθυντής Έρευνας & Ανάπτυξης Ηλίας Σμυρνιούδης Διευθυντής Έρευνας & Ανάπτυξης Η μαστίχα Χίου Η μαστίχα Χίου, αποτελεί 100% φυσικό προϊόν, προέρχεται από τον κορμό και τα κλαδιά του μαστιχόδεντρου (Pistacia Lentiscus var. Chia), Το

Διαβάστε περισσότερα

ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΤΜΟΣΦΑΙΡΙΚΟΥ ΑΕΡΑ ΣΕ ΚΤΗΡΙΑ

ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΤΜΟΣΦΑΙΡΙΚΟΥ ΑΕΡΑ ΣΕ ΚΤΗΡΙΑ ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΤΜΟΣΦΑΙΡΙΚΟΥ ΑΕΡΑ ΣΕ ΚΤΗΡΙΑ Έλεγχος Ποιότητας Υλικών ΛΕΙΒΑΔΑΡΑ ΘΕΟΔΩΡΑ ΚΑΡΑΓΚΟΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΑΘΗΝΑ 2007 ΕΙΣΑΓΩΓΗ O σύγχρονος τρόπος ζωής επιβάλλει σε πολλούς ανθρώπους να περνούν τουλάχιστον

Διαβάστε περισσότερα

Οικοτοξικολογικέςαναλύσεις στα νερά

Οικοτοξικολογικέςαναλύσεις στα νερά Οικοτοξικολογικέςαναλύσεις στα νερά Αθανάσιος Κούγκολος ρ. Χηµικός µηχανικός Αναπληρωτής καθηγητής Τµήµα Μηχανικών Χωροταξίας, Πολεοδοµίας και Περιφερειακής Ανάπτυξης, Πολυτεχνική Σχολή, Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας,

Διαβάστε περισσότερα

ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ

ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΗΜΕΡΑ: ΤΡΙΤΗ 11-11-2014 ΩΡΑ: 11:00-14:00 OMADA 3 Name: Celia Koutrafouri ΆΣΚΗΣΗ 10 (p.107-114) Εργαστηριακές Σημειώσεις Τίτλος Άσκησης: Φασματοφωτομετρικός Προσδιορισμός Σορβικού

Διαβάστε περισσότερα

AMINEMAX και ΤΡΟΠΟΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ

AMINEMAX και ΤΡΟΠΟΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ AMINEMAX και ΤΡΟΠΟΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ Το AMINΕMAX παραλαμβάνεται από κανονική ενζυματική υδρόλυση με πρώτες ύλες από σπόρους σιτηρών και καλαμποκιού σε ισορροπία με μείγμα από ειδικά ένζυμα ( Έξω πρωτει πρωτεΐνάσες-

Διαβάστε περισσότερα

Επιδραση της αλατισης και καπνισης στα θρεπτικα συστατικά των ζωικών προιοντων Εκτός από το χλωριούχο νάτριο, για συντηρηση για τα ψαρια και το

Επιδραση της αλατισης και καπνισης στα θρεπτικα συστατικά των ζωικών προιοντων Εκτός από το χλωριούχο νάτριο, για συντηρηση για τα ψαρια και το Επιδραση της αλατισης και καπνισης στα θρεπτικα συστατικά των ζωικών προιοντων Εκτός από το χλωριούχο νάτριο, για συντηρηση για τα ψαρια και το κρεας, γίνεται και χρήση άλλων αλατων όπως νιτρικών και νιτρωδών.

Διαβάστε περισσότερα

ΔΕΛΤΙΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ TULIP ΥΓΡΟ ΠΙΑΤΩΝ ΜΕ ΞΥΔΙ

ΔΕΛΤΙΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ TULIP ΥΓΡΟ ΠΙΑΤΩΝ ΜΕ ΞΥΔΙ ΔΕΛΤΙΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ TULIP ΥΓΡΟ ΠΙΑΤΩΝ ΜΕ ΞΥΔΙ Ημερ. Έκδοσης : ΙΑΝ 2008 Αναθεώρηση: ΟΚΤ 2011 Έκδοση: 4 1. ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΟΥΣΙΑΣ/ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΕΤΑΙΡΕΙΑΣ ΕΠΙΧΕΙΡΗΣΗΣ ΠΡΟΪΟΝ TULIP ΥΓΡΟ ΠΙΑΤΩΝ ΣΚΟΠΟΣ

Διαβάστε περισσότερα

ΜΙΑ ΔΙΔΑΚΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΔΟΣ ΤΗ ΒΔΟΜΑΔΑ ΔΙΔΑΚΤΕΑ ΥΛΗ ΣΤΟΧΟΙ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ ΠΡΩΤΗ ΕΝΟΤΗΤΑ

ΜΙΑ ΔΙΔΑΚΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΔΟΣ ΤΗ ΒΔΟΜΑΔΑ ΔΙΔΑΚΤΕΑ ΥΛΗ ΣΤΟΧΟΙ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ ΠΡΩΤΗ ΕΝΟΤΗΤΑ ΑΝΑΛΥΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ Γ ΤΑΞΗ ΓΥΜΝΑΣΙΟΥ ΥΠΟΥΡΓΕΙΟ ΠΑΙΔΕΙΑΣ ΚΑΙ ΠΟΛΙΤΙΣΜΟΥ ΓΡΑΦΕΙΑ ΕΠΙΘΕΩΡΗΤΩΝ ΜΕΣΗΣ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗΣ ΛΕΥΚΩΣΙΑ ΣΧΟΛΙΚΗ ΧΡΟΝΙΑ 2007-2008 ΜΙΑ ΔΙΔΑΚΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΔΟΣ ΤΗ ΒΔΟΜΑΔΑ ΔΙΔΑΚΤΕΑ ΥΛΗ ΣΤΟΧΟΙ

Διαβάστε περισσότερα

ΔΕΛΤΙΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ (Σύμφωνα με το Παρ.2 του Καν. 1907/2006) Όπως τροποποιήθηκε από τον Καν. 453/2010

ΔΕΛΤΙΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ (Σύμφωνα με το Παρ.2 του Καν. 1907/2006) Όπως τροποποιήθηκε από τον Καν. 453/2010 Ημερομηνία Έκδοσης: 07/02/2013 Αριθμός Έκδοσης: 0 ΔΕΛΤΙΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ (Σύμφωνα με το Παρ.2 του Καν. 1907/2006) Όπως τροποποιήθηκε από τον Καν. 453/2010 1. ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΤΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ

Διαβάστε περισσότερα

ToxPlus. Spin-off εταιρία του Εργαστηρίου Τοξικολογίας Πανεπιστημίου Κρήτης. Επιδοτούμενη από το ΕΣΠΑ (2007 2013)

ToxPlus. Spin-off εταιρία του Εργαστηρίου Τοξικολογίας Πανεπιστημίου Κρήτης. Επιδοτούμενη από το ΕΣΠΑ (2007 2013) KENTΡΟ ΤΟΞΙΚΟΛΟΓΙΑΣ Α.Ε. Επιστημονικό και Τεχνολογικό Πάρκο Κρήτης Step C, N. Πλαστήρα 100, Βασιλικά Βουτών, Τ.Κ. 700 13 Ηράκλειο, Κρήτη www.toxplus.gr ToxPlus Spin-off εταιρία του Εργαστηρίου Τοξικολογίας

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ 10 Ιουνίου 2013 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Απαντήσεις Θεμάτων Επαναληπτικών Πανελληνίων Εξετάσεων Ημερησίων Γενικών Λυκείων Περιεχόμενα ΘΕΜΑ Α.... 2 Α1.... 2 Α3.... 2 Α5.... 2 ΘΕΜΑ B.... 2 Β1.... 2 Β2....

Διαβάστε περισσότερα

Εισαγωγικά. Σύνταξη, ταξινόμηση και τάξεις οργανικών ενώσεων. Τρόποι γραφής οργανικών ενώσεων. Λειτουργικές ομάδες.

Εισαγωγικά. Σύνταξη, ταξινόμηση και τάξεις οργανικών ενώσεων. Τρόποι γραφής οργανικών ενώσεων. Λειτουργικές ομάδες. ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ - Μάθημα «ΟΡΓΑΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ» Ακαδημαϊκό έτος 2012-2013 ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΘΕΩΡΗΤΙΚΩΝ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΚΑΙ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΜΑΘΗΜΑΤΩΝ ΤΡΙΤΗ 9.00-12.00 (Ι3 - Θεωρία) ΠΕΜΠΤΗ 10.00 12.00 (I3-Θεωρία) ή (Εργαστήρια)

Διαβάστε περισσότερα

Αναερόβιες Μονάδες για την παραγωγή βιο-αερίου από βιοµάζα

Αναερόβιες Μονάδες για την παραγωγή βιο-αερίου από βιοµάζα Αναερόβιες Μονάδες για την παραγωγή βιο-αερίου από βιοµάζα Βιο-αέριο? Το αέριο που παράγεται από την ζύµωση των οργανικών, ζωικών και φυτικών υπολειµµάτων και το οποίο µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή. Κεφάλαιο 2: Η Βιολογία των Ιών

Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή. Κεφάλαιο 2: Η Βιολογία των Ιών Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή 1.1 Μικροοργανισμοί, Μικροβιολογία και Μικροβιολόγοι... 19 1.1.1 Μικροοργανισμοί... 19 1.1.2 Μικροβιολογία... 20 1.1.3 Μικροβιολόγοι... 21 1.2 Σύντομη Ιστορική Εξέλιξη της Μικροβιολογίας...

Διαβάστε περισσότερα

3021 Οξείδωση του ανθρακενίου σε ανθρακινόνη

3021 Οξείδωση του ανθρακενίου σε ανθρακινόνη Οξείδωση του ανθρακενίου σε ανθρακινόνη Ce(IV)(NH ) (N ) 6 C H CeH 8 N 8 8 C H 8 (78.) (58.) (8.) Βιβλιογραφία Tse-Lok Ho et al., Synthesis 97, 6. Ταξινόµηση Τύποι αντιδράσεων και τάξεις ουσιών Οξείδωση.

Διαβάστε περισσότερα

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΧΡΗΣΗ ΟΖΟΝΤΟΣ ΣΤΗΝ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΣΕ ΠΥΡΓΟΥΣ ΨΥΞΗΣ

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΧΡΗΣΗ ΟΖΟΝΤΟΣ ΣΤΗΝ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΣΕ ΠΥΡΓΟΥΣ ΨΥΞΗΣ ΧΡΗΣΗ ΟΖΟΝΤΟΣ ΣΤΗΝ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΣΕ ΠΥΡΓΟΥΣ ΨΥΞΗΣ Η χρήση του όζοντος για την κατεργασία νερού σε πύργους ψύξης αυξάνει σηµαντικά τα τελευταία χρόνια και αρκετές έρευνες και εφαρµογές που έχουν

Διαβάστε περισσότερα

ΦΥΤΟΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΠΟΣΙΜΟΥ ΝΕΡΟΥ. Δρ. Γ. Ε. Μηλιάδης. Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς g.miliadis@bpi.

ΦΥΤΟΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΠΟΣΙΜΟΥ ΝΕΡΟΥ. Δρ. Γ. Ε. Μηλιάδης. Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς g.miliadis@bpi. ΦΥΤΟΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΠΟΣΙΜΟΥ ΝΕΡΟΥ Δρ. Γ. Ε. Μηλιάδης Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς g.miliadis@bpi.gr Σχεδιασμός αναλυτικών μεθόδων: Οι παράγοντες που πρέπει να ληφθούν

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ 3

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ 3 ΒΙΟΛΟΓΙΑ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ 3 Το θέμα που απασχολεί το κεφάλαιο σε όλη του την έκταση είναι ο μεταβολισμός και χωρίζεται σε τέσσερις υποκατηγορίες: 3.1)Ενέργεια και οργανισμοί,

Διαβάστε περισσότερα

Περιβαλλοντικοί παράγοντες. και η επίδρασή τους στους ζωντανούς οργανισμούς

Περιβαλλοντικοί παράγοντες. και η επίδρασή τους στους ζωντανούς οργανισμούς Περιβαλλοντικοί παράγοντες και η επίδρασή τους στους ζωντανούς οργανισμούς Νερό Ολοι οι οργανισμοί αποτελούνται κατά μεγάλο ποσοστό από νερό ανεξάρτητα από το εάν ζουν σε χερσαία ή υδατικά περιβάλλοντα

Διαβάστε περισσότερα

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Σελίδα 1 από 6 ΤΜΗΜΑ 1: Στοιχεία ουσίας/παρασκευάσματος και εταιρείας/επιχείρησης Αναγνωριστικός κωδικός προϊόντος FINOWAX PLUS Κερί βύθισης 20565 Συναφείς προσδιοριζόμενες χρήσεις της ουσίας ή του μείγματος

Διαβάστε περισσότερα

Σας αποστέλλουμε τις προτεινόμενες απαντήσεις που αφορούν τα θέματα της Βιολογίας Γενικής Παιδείας των Ημερησίων Γενικών Λυκείων και ΕΠΑΛ (Ομάδας Β ).

Σας αποστέλλουμε τις προτεινόμενες απαντήσεις που αφορούν τα θέματα της Βιολογίας Γενικής Παιδείας των Ημερησίων Γενικών Λυκείων και ΕΠΑΛ (Ομάδας Β ). Αθήνα, 30/5/2014 ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΑ ΕΝΩΣΗ ΒΙΟΕΠΙΣΤΗΜΟΝΩΝ Σας αποστέλλουμε τις προτεινόμενες απαντήσεις που αφορούν τα θέματα της Βιολογίας Γενικής Παιδείας των Ημερησίων Γενικών Λυκείων και ΕΠΑΛ (Ομάδας Β ). Η

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΙΣΤΗΜΗ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ: ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ-Ι ΙΟΤΗΤΕΣ-ΡΕΟΛΟΓΙΑ-ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ- ΠΟΙΟΤΗΤΑ- ΣΥΚΕΥΑΣΙΑ

ΕΠΙΣΤΗΜΗ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ: ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ-Ι ΙΟΤΗΤΕΣ-ΡΕΟΛΟΓΙΑ-ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ- ΠΟΙΟΤΗΤΑ- ΣΥΚΕΥΑΣΙΑ E. M. ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΗ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ: ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ-Ι ΙΟΤΗΤΕΣ-ΡΕΟΛΟΓΙΑ-ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ- ΠΟΙΟΤΗΤΑ- ΣΥΚΕΥΑΣΙΑ Κ. Τζιά, Π. Ταούκης, Β. Ωραιοπούλου ΕΠΙΣΤΗΜΗ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΠΑΡΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Σελίδα 1 από 6 1. Στοιχεία ουσίας/παρασκευάσματος και εταιρείας/επιχείρησης Στοιχεία τής ουσίας ή τού παρασκευάσµατος Καθορισμός του ασκούντος την επιχείρηση Εταιρεία: Οδός: Τόπος: LH1132 / LH1134 FINO

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ. ΖΗΤΗΜΑ 1 ο

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ. ΖΗΤΗΜΑ 1 ο ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ ΖΗΤΗΜΑ 1 ο Να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις Α1 έως Α5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη ή τη φράση, η οποία συμπληρώνει

Διαβάστε περισσότερα

Ε ΑΦΟΣ. Έδαφος: ανόργανα οργανικά συστατικά

Ε ΑΦΟΣ. Έδαφος: ανόργανα οργανικά συστατικά Ε ΑΦΟΣ Έδαφος: ανόργανα οργανικά συστατικά ρ. Ε. Λυκούδη Αθήνα 2005 Έδαφος Το έδαφος σχηµατίζεται από τα προϊόντα της αποσάθρωσης των πετρωµάτων του υποβάθρου (µητρικό πέτρωµα) ή των πετρωµάτων τω γειτονικών

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΔΑΚΤΕΑ ΥΛΗ ΧΗΜΕΙΑΣ Β ΓΥΜΝΑΣΙΟΥ 2015-16

ΔΙΔΑΚΤΕΑ ΥΛΗ ΧΗΜΕΙΑΣ Β ΓΥΜΝΑΣΙΟΥ 2015-16 ΔΙΔΑΚΤΕΑ ΥΛΗ ΧΗΜΕΙΑΣ Β ΓΥΜΝΑΣΙΟΥ 205-6 ΔΕΙΚΤΕΣ ΕΠΙΤΥΧΙΑΣ Οι μαθητές και οι μαθήτριες θα πρέπει να είναι σε θέση: ΔΕΙΚΤΕΣ ΕΠΑΡΚΕΙΑΣ Διδ. περ. Σύνολο διδ.περ.. Η συμβολή της Χημείας στην εξέλιξη του πολιτισμού

Διαβάστε περισσότερα

1.5 Ταξινόμηση της ύλης

1.5 Ταξινόμηση της ύλης 1.5 Ταξινόμηση της ύλης Θεωρία 5.1. Πως ταξινομείται η ύλη; Η ύλη ταξινομείται σε καθαρές ή καθορισμένες ουσίες και μίγματα. Τα μίγματα ταξινομούνται σε ομογενή και ετερογενή. Οι καθορισμένες ουσίες ταξινομούνται

Διαβάστε περισσότερα

ΟΙ ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΗΣ ΟΞΙΝΗΣ ΒΡΟΧΗΣ ΣΤΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ

ΟΙ ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΗΣ ΟΞΙΝΗΣ ΒΡΟΧΗΣ ΣΤΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ !Unexpected End of Formula l ΟΙ ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ ΤΗΣ ΟΞΙΝΗΣ ΒΡΟΧΗΣ ΣΤΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Παραδεισανός Αδάμ ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η εργασία αυτή εκπονήθηκε το ακαδημαϊκό έτος 2003 2004 στο μάθημα «Το πείραμα στη

Διαβάστε περισσότερα

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Σελίδα 1 από 5 ΤΜΗΜΑ 1: Στοιχεία ουσίας/παρασκευάσματος και εταιρείας/επιχείρησης 1.1. Αναγνωριστικός κωδικός προϊόντος 1.2. Συναφείς προσδιοριζόμενες χρήσεις της ουσίας ή του μείγματος και αντενδεικνυόμενες

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑ 1ο Να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις 1 έως 5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη ή στη φράση, η οποία

Διαβάστε περισσότερα

Εργασία Βιολογίας 3.1 ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ

Εργασία Βιολογίας 3.1 ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ Εργασία Βιολογίας Καθηγητής: Πιτσιλαδής Β. Μαθητής: Μ. Νεκτάριος Τάξη: Β'2 Υλικό: Κεφάλαιο 3 3.1 ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ Την ενέργεια και τα υλικά που οι οργανισμοί εξασφαλίζουν από το περιβάλλον

Διαβάστε περισσότερα

Διαχείριση Αποβλήτων

Διαχείριση Αποβλήτων ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Διαχείριση Αποβλήτων Ενότητα 11 : Βιομηχανικά Στερεά και Υγρά Απόβλητα Δρ. Σταυρούλα Τσιτσιφλή Τμήμα Μηχανικών Χωροταξίας, Πολεοδομίας και Περιφερειακής Ανάπτυξης Άδειες Χρήσης Το

Διαβάστε περισσότερα

Τεχνικές διεργασίες. Βιομάζα Βιομόρια Οργ. μόρια Ανοργ. μόρια

Τεχνικές διεργασίες. Βιομάζα Βιομόρια Οργ. μόρια Ανοργ. μόρια Τεχνικές διεργασίες Βιομάζα Βιομόρια Οργ. μόρια Ανοργ. μόρια ΓΕΩΡΓΙΑ Γενετική βελτίωση ποικιλιών φυτών για αντοχή στις ασθένειες, ξηρασία, αφιλόξενα εδάφη Μαζική παραγωγή κλώνων Ανάπτυξη βιο-εντομοκτόνων

Διαβάστε περισσότερα

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι

Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Μικροβιολογία Τροφίμων Ι Ενότητα 15: Αντιμικροβιακή Δράση Οργανικών Οξέων, 1ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου Διδάσκοντες: Γεώργιος - Ιωάννης Νύχας Ευστάθιος Πανάγου Μαθησιακοί Στόχοι

Διαβάστε περισσότερα

ΤΗΛ. 210 7201173 / Fax 210 7254767

ΤΗΛ. 210 7201173 / Fax 210 7254767 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΥΠΟΥΡΓΕΙΟ ΥΓΕΙΑΣ & ΚΟΙΝΩΝΙΚΗΣ ΑΛΛΗΛΕΓΓΥΗΣ 1 η ΥΠΕ ΑΤΤΙΚΗΣ Γ.Ν.Α. «Ο ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ» ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΤΗΛ. 210 7201173 / Fax 210 7254767 Αρ. Πρ. 1140/15

Διαβάστε περισσότερα

Βιοµηχανική παραγωγή βιοντίζελ στην Θεσσαλία. Κόκκαλης Ι. Αθανάσιος Χηµικός Μηχ/κός, MSc Υπεύθυνος παραγωγής

Βιοµηχανική παραγωγή βιοντίζελ στην Θεσσαλία. Κόκκαλης Ι. Αθανάσιος Χηµικός Μηχ/κός, MSc Υπεύθυνος παραγωγής Βιοµηχανική παραγωγή βιοντίζελ στην Θεσσαλία Κόκκαλης Ι. Αθανάσιος Χηµικός Μηχ/κός, MSc Υπεύθυνος παραγωγής Ορισµοί 1. Βιοµάζα : το βιοαποικοδοµήσιµο κλάσµα προϊόντων, αποβλήτων και καταλοίπων που προέρχονται

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΤΙΚΟ ΑΤΥΧΗΜΑ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ

ΕΡΓΑΤΙΚΟ ΑΤΥΧΗΜΑ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ TEE TKM ΣΕΜΙΝΑΡΙΑ ΜΙΚΡΗΣ ΙΑΡΚΕΙΑ ΣΤ ΚΥΚΛΟΣ2005 ΥΓΕΙΑ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΕΡΓΑΖΟΜΕΝΩΝ ΣΤΗΝ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑ ΕΡΓΑΤΙΚΟ ΑΤΥΧΗΜΑ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Ν. Μαραγκός Μηχανολόγος Mηχ. Msc ΚΙΛΚΙΣ 2005 ΕΡΓΑΤΙΚΟ ΑΤΥΧΗΜΑ ΒΑΣΙΚΕΣ

Διαβάστε περισσότερα

ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ. Ο μεταβολισμός είναι μία πολύ σημαντική λειτουργία των μονογαστρικών ζώων και επιτυγχάνεται με τη δράση φυσικών

ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ. Ο μεταβολισμός είναι μία πολύ σημαντική λειτουργία των μονογαστρικών ζώων και επιτυγχάνεται με τη δράση φυσικών ΧΡΗΣΙΜΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ Ο μεταβολισμός είναι μία πολύ σημαντική λειτουργία των μονογαστρικών ζώων και επιτυγχάνεται με τη δράση φυσικών Ενζύμων που βρίσκονται κατά μήκος του πεπτικού τους σωλήνα. Τα ένζυμα

Διαβάστε περισσότερα

Τμήμα Η3 - Κίνδυνοι για την ανθρώπινη υγεία, Ειδική Τοξικότητα σε Όργανα Στόχους STOT SE, Κατ. 1

Τμήμα Η3 - Κίνδυνοι για την ανθρώπινη υγεία, Ειδική Τοξικότητα σε Όργανα Στόχους STOT SE, Κατ. 1 ΔΙΕΥΘΥΝΣΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑΚΩΝ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΩΝ & ΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΓΕΝΙΚΟΥ ΧΗΜΕΙΟΥ ΤΟΥ ΚΡΑΤΟΥΣ 11 η Ετήσια Σύσκεψη Επιθεωρητών REACH, CLP 2015 Εθνική Συνάντηση Εργασίας του PROTEAS Αθήνα, 27-2929 Απριλίου 2015 Γενικό

Διαβάστε περισσότερα

Σύµβολα Επικινδυνότητας

Σύµβολα Επικινδυνότητας Σύµβολα Επικινδυνότητας Με την Οδηγία για τις Επικίνδυνες Ουσίες θεσµοθετήθηκε η χρήση των Συµβόλων επικινδυνότητας για την επισήµανση των επικίνδυνων ουσιών. Η Οδηγία των Επικίνδυνων Ουσιών είναι ένας

Διαβάστε περισσότερα

Φασματομετρία μαζών. Αρχή Οργανολογία Τεχνικές Ομολυτική ετερολυτική σχάση Εφαρμογές GC/MS, LC/MS ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΜΑΖΩΝ ΟΡΙΣΜΟΙ

Φασματομετρία μαζών. Αρχή Οργανολογία Τεχνικές Ομολυτική ετερολυτική σχάση Εφαρμογές GC/MS, LC/MS ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΜΑΖΩΝ ΟΡΙΣΜΟΙ Φασματομετρία μαζών Αρχή Οργανολογία Τεχνικές Ομολυτική ετερολυτική σχάση Εφαρμογές GC/MS, LC/MS ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΜΑΖΩΝ ΟΡΙΣΜΟΙ 2 Εφαρμογές 1) Επαλήθευση ή διερεύνηση οργανικών ενώσεων κατά τη συνθετική τους

Διαβάστε περισσότερα

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ

ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Σελίδα 1 από 5 ΤΜΗΜΑ 1: Στοιχεία ουσίας/παρασκευάσματος και εταιρείας/επιχείρησης Αναγνωριστικός κωδικός προϊόντος Συναφείς προσδιοριζόμενες χρήσεις της ουσίας ή του μείγματος και αντενδεικνυόμενες χρήσεις

Διαβάστε περισσότερα

Ελληνικά Αρωματικά Φυτά Αξιοποίηση των ελληνικών φυτών

Ελληνικά Αρωματικά Φυτά Αξιοποίηση των ελληνικών φυτών ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΟ ΕΠΙΜΕΛΗΤΗΡΙΟ ΕΛΛΑΔΑΣ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΑΝΑΤΟΛΙΚΗΣ ΜΑΚΕΔΟΝΙΑΣ Ελληνικά Αρωματικά Φυτά Αξιοποίηση των ελληνικών φυτών Δρ. Ελένη Μαλούπα τακτική ερευνήτρια ΕΛ.Γ.Ο.- ΔΗΜΗΤΡΑ (ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε.) Δράμα, 10 και 11

Διαβάστε περισσότερα

Σύντομη περιγραφή του πειράματος

Σύντομη περιγραφή του πειράματος Σύντομη περιγραφή του πειράματος Παρασκευή διαλυμάτων ορισμένης περιεκτικότητας και συγκέντρωσης, καθώς επίσης και παρασκευή διαλυμάτων συγκεκριμένης συγκέντρωσης από διαλύματα μεγαλύτερης συγκέντρωσης

Διαβάστε περισσότερα

panagiotisathanasopoulos.gr

panagiotisathanasopoulos.gr Χημική Ισορροπία 61 Παναγιώτης Αθανασόπουλος Χημικός, Διδάκτωρ Πανεπιστημίου Πατρών Χημικός Διδάκτωρ Παν. Πατρών 62 Τι ονομάζεται κλειστό χημικό σύστημα; Παναγιώτης Αθανασόπουλος Κλειστό ονομάζεται το

Διαβάστε περισσότερα

4001 Μετεστεροποίηση του καστορελαίου σε ρικινολεϊκό µεθυλεστέρα

4001 Μετεστεροποίηση του καστορελαίου σε ρικινολεϊκό µεθυλεστέρα 4001 Μετεστεροποίηση του καστορελαίου σε ρικινολεϊκό µεθυλεστέρα καστορέλαιο + NaOMe MeOH CH 4 O OH O OMe (32.0) C 19 H 36 O 3 (312.5) Ταξινόµιση Τύποι αντιδράσεων και τάξεις ουσιών Αντίδραση του καρβονυλίου

Διαβάστε περισσότερα

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ & ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ & ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΥΠΡΟΥ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ & ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΕΣΠΕΡΙΔΟΕΙΔΩΝ ΠΟΥ ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΚΥΠΡΟ ΣΙΑΚΟΥ ΜΕΛΠΟΜΕΝΗ Λεμεσός, 2013

Διαβάστε περισσότερα

ROSELIA.GR / 17,SARANDA EKKLISION ST. PERISTERI,ATHENS /GREECE TEL: +30 210 5725000 www.roselia.gr

ROSELIA.GR / 17,SARANDA EKKLISION ST. PERISTERI,ATHENS /GREECE TEL: +30 210 5725000 www.roselia.gr THE OLIVE OIL LINE Οι αρχαίοι Έλληνες θεωρούσαν το λάδι ως υγρό χρυσάφι, τις ελιές ως σύμβολο της καλοσύνης και της ευγένειας, ενώ ακόμη και σήμερα τα κλαδιά της ελιάς συμβολίζουν την ειρήνη. Το ελαιόλαδο

Διαβάστε περισσότερα

Άσκηση 4 η : Χρωματογραφία

Άσκηση 4 η : Χρωματογραφία Άσκηση 4 η : ΑΣΚΗΣΕΙΣ 1. Εκχύλιση - Διήθηση Διαχωρισμός-Απομόνωση 2. Φασματοφωτομετρία Ποσοτικός Προσδιορισμός 3. Ποτενσιομετρία Ηλεκτροχημεία 4. Διαχωρισμός-Απομόνωση 5. Ταυτοποίηση Σακχάρων Χαρακτηριστικές

Διαβάστε περισσότερα

Επίκουρος Καθηγητής Π. Μελίδης

Επίκουρος Καθηγητής Π. Μελίδης Χαρακτηριστικά υγρών αποβλήτων Επίκουρος Καθηγητής Π. Μελίδης Τμήμα Μηχανικών Περιβάλλοντος Εργαστήριο Διαχείρισης και Τεχνολογίας Υγρών Αποβλήτων Τα υγρά απόβλητα μπορεί να προέλθουν από : Ανθρώπινα απόβλητα

Διαβάστε περισσότερα

Προσδιορισμός φυσικοχημικών παραμέτρων υγρών αποβλήτων και υδάτων

Προσδιορισμός φυσικοχημικών παραμέτρων υγρών αποβλήτων και υδάτων Προσδιορισμός φυσικοχημικών παραμέτρων υγρών αποβλήτων και υδάτων (DO - BOD - COD - TOC) Χ. Βασιλάτος Οργανική ύλη Αποξυγόνωση επιφανειακών και υπογείων υδάτων Οι οργανικές ύλες αποτελούν πολύ σοβαρό ρύπο,

Διαβάστε περισσότερα

Betamalt 25 FBD. Ένζυµα και βυνάλευρο βασικές πληροφορίες

Betamalt 25 FBD. Ένζυµα και βυνάλευρο βασικές πληροφορίες Betamalt 25 FBD Αµυλολυτικό φυτικό συµπύκνωµα για τη βελτίωση των αρτοποιητικών ιδιοτήτων των αλεύρων σίτου και σίκαλης και τη µείωση του Falling Number. Ένζυµα και βυνάλευρο βασικές πληροφορίες Σε όλα

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Υπεύθυνος Εργαστηρίου: Δρ. Πέτρος Α. Ταραντίλης, Λέκτορας Δρ. Χρήστος Παππάς, Λέκτορας (βάσει Ν. 407/80) Δρ. Σοφία Κουλοχέρη, Επιστημονικός συνεργάτης Δρ. Αναστασία Μίχου, Επιστημονικός συνεργάτης Βάση

Διαβάστε περισσότερα

ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΑ

ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΑ ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΑ 1 Ποιότητα και Ποιοτικός Έλεγχος Ο όρος «ποιότητα» συχνά χρησιµοποιείται χωρίς την πραγµατική της έννοια. ηλαδή δεν προσδιορίζεται αν το προϊόν στο οποίο αναφέρεται

Διαβάστε περισσότερα

ΦΥΛΛΑΔΙΟ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ (Σύμφωνα με την οδηγία 2001/58/CE) TRAVERTINO ROMANO Αναθεώρηση: 1

ΦΥΛΛΑΔΙΟ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ (Σύμφωνα με την οδηγία 2001/58/CE) TRAVERTINO ROMANO Αναθεώρηση: 1 Σελίδα 1 από 6 Ημ/νία Αναθεώρηση Περιγραφή 2/11/06 1 Εισαγωγή των τιμών VOC και ανανεωμένο σύμφωνα με την τροποποίηση ΧΧΙΧ της οδηγίας 1999/45/CE 17/03/05 0 Έκδοση 1 Ταυτοποίηση εταιρίας και προϊόντος

Διαβάστε περισσότερα

ΡΥΠΑΝΣΗ. Ρύποι. Αντίδραση βιολογικών συστημάτων σε παράγοντες αύξησης

ΡΥΠΑΝΣΗ. Ρύποι. Αντίδραση βιολογικών συστημάτων σε παράγοντες αύξησης ΡΥΠΑΝΣΗ 91 είναι η άμεση ή έμμεση διοχέτευση από τον άνθρωπο στο υδάτινο περιβάλλον ύλης ή ενέργειας με επιβλαβή αποτελέσματα για τους οργανισμούς ( ο ορισμός της ρύπανσης από τον ΟΗΕ ) Ρύποι Φυσικοί (εκρήξεις

Διαβάστε περισσότερα

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ HPLC

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ HPLC ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ HPLC ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC) ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΣΤΗΛΗ / ΣΤΑΤΙΚΗ ΦΑΣΗ Επίπεδη, μήκους 3-25 cm και διαμέτρου 0,5-5 mm. Μικροπορώδη σωματίδια πηκτής διοξειδίου

Διαβάστε περισσότερα

ΓΕΝΙΚΟ ΕΠΙΤΕΛΕΙΟ ΣΤΡΑΤΟΥ ΓΕΝΙΚΗ ΕΠΙΘΕΩΡΗΣΗ ΣΤΡΑΤΟΥ ΓΡ. ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΠΤΗΣΕΩΝ Ε ΑΦΟΥΣ/2 27 εκ 2005

ΓΕΝΙΚΟ ΕΠΙΤΕΛΕΙΟ ΣΤΡΑΤΟΥ ΓΕΝΙΚΗ ΕΠΙΘΕΩΡΗΣΗ ΣΤΡΑΤΟΥ ΓΡ. ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΠΤΗΣΕΩΝ Ε ΑΦΟΥΣ/2 27 εκ 2005 ΠΡΟΣΘΗΚΗ «3» ΣΤΟ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ «Β» ΣΤΗΝ Φ. 900/1/26594/Σ. 130 ΓΕΝΙΚΟ ΕΠΙΤΕΛΕΙΟ ΣΤΡΑΤΟΥ ΓΕΝΙΚΗ ΕΠΙΘΕΩΡΗΣΗ ΣΤΡΑΤΟΥ ΓΡ. ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΠΤΗΣΕΩΝ Ε ΑΦΟΥΣ/2 27 εκ 2005 ΕΛΑΧΙΣTEΣ ΠΡO lαγραφεσ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΗΝ ΕΠlΣΗΜΑΝΣΗ

Διαβάστε περισσότερα

Δελτίο Δεδομένων Ασφαλείας

Δελτίο Δεδομένων Ασφαλείας Σελίδα 1 από 6 ΤΜΗΜΑ 1: Στοιχεία ουσίας/παρασκευάσματος και εταιρείας/επιχείρησης 1.1. Αναγνωριστικός κωδικός προϊόντος 1.2. Συναφείς προσδιοριζόμενες χρήσεις της ουσίας ή του μείγματος και αντενδεικνυόμενες

Διαβάστε περισσότερα

η λύση στο πρόβληµα της κυτταρίτιδας Συµπλήρωµα διατροφής µε ω3 - ω6, βιταµίνες Β6 & Ε και φυτικά εκχυλίσµατα

η λύση στο πρόβληµα της κυτταρίτιδας Συµπλήρωµα διατροφής µε ω3 - ω6, βιταµίνες Β6 & Ε και φυτικά εκχυλίσµατα η λύση στο πρόβληµα της κυτταρίτιδας Συµπλήρωµα διατροφής µε ω3 - ω6, βιταµίνες Β6 & Ε και φυτικά εκχυλίσµατα "Κλινικά αποδεδειγµένα αποτελέσµατα σε 47 ηµέρες" Αντιμετώπιση της κυτταρίτιδας Ένα από τα

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 2 ΤΡΟΦΙΜΑ. ΠΛΕΣΣΑΣ ΣΤΑΥΡΟΣ, PhD

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 2 ΤΡΟΦΙΜΑ. ΠΛΕΣΣΑΣ ΣΤΑΥΡΟΣ, PhD ΑΣΚΗΣΗ 2 ΑΝΑΛΥΣΗ ΛΙΠΩΝ & ΕΛΑΙΩΝ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ ΠΛΕΣΣΑΣ ΣΤΑΥΡΟΣ, PhD Εργαστήριο Μικροβιολογίας Τροφίµων, Βιοτεχνολογίας και Υγιεινής, Τµήµα Αγροτικής Ανάπτυξης, ηµοκρίτειο Πανεπιστήµιο Θράκης Λίπη & έλαια (Λιπίδια)

Διαβάστε περισσότερα

Τι είναι άμεση ρύπανση?

Τι είναι άμεση ρύπανση? ΡΥΠΑΝΣΗ ΝΕΡΟΥ Τι είναι ρύπανση; Ρύπανση μπορεί να θεωρηθεί η δυσμενής μεταβολή των φυσικοχημικών ή βιολογικών συνθηκών ενός συγκεκριμένου περιβάλλοντος ή/και η βραχυπρόθεσμη ή μακροπρόθεσμη βλάβη στην

Διαβάστε περισσότερα

26/5/2015. Φωτεινές αντιδράσεις - Σκοτεινές αντιδράσεις. Μήκος κύµατος φωτός (nm) φως. Σάκχαρα πρίσµα

26/5/2015. Φωτεινές αντιδράσεις - Σκοτεινές αντιδράσεις. Μήκος κύµατος φωτός (nm) φως. Σάκχαρα πρίσµα Δηµοκρίτειο Πανεπιστήµιο Θράκης Τµήµα Αγροτικής Ανάπτυξης Φάσµα απορρόφησης της χρωστικής ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΦΥΤΩΝ «Φωτοσύνθεση» Ορεστιάδα 2015 Φωτοσύνθεση CO 2 +2H 2 S (CH 2 O) + H 2 O + 2S 6CO 2 +12H 2 O C 6

Διαβάστε περισσότερα

Τα κύρια βιογραφικά στοιχεία των υποψηφίων παρουσιάζονται συνοπτικά στους πίνακες που ακολουθούν.

Τα κύρια βιογραφικά στοιχεία των υποψηφίων παρουσιάζονται συνοπτικά στους πίνακες που ακολουθούν. ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Στις 25/02/2015, ηµέρα Τρίτη και ώρα 12:00 συνεκλήθη η Επιτροπή Αξιολόγησης, όπως ορίστηκε µε την µε αρ. πρωτ. 100/2014-17 της 14/01/2015 απόφαση, αποτελούµενη από τον Δρ Σ. Κακαµπάκο,

Διαβάστε περισσότερα

Θέµατα Βιολογίας Γενική Παιδεία Γ Λυκείου 2000

Θέµατα Βιολογίας Γενική Παιδεία Γ Λυκείου 2000 Ζήτηµα 1ο Θέµατα Βιολογίας Γενική Παιδεία Γ Λυκείου 2000 Στις ερωτήσεις 1-5 να γράψετε στο τετράδιο σας τον αριθµό της ερώτησης και δίπλα το γράµµα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. 1. Οι ιοί είναι :

Διαβάστε περισσότερα

3.2 Οξυγόνο. 2-3. Ποιες είναι οι φυσικές ιδιότητες του οξυγόνου. Οι φυσικές ιδιότητες του οξυγόνου εμφανίζονται στον παρακάτω πίνακα.

3.2 Οξυγόνο. 2-3. Ποιες είναι οι φυσικές ιδιότητες του οξυγόνου. Οι φυσικές ιδιότητες του οξυγόνου εμφανίζονται στον παρακάτω πίνακα. 93 Ερωτήσεις θεωρίας με απαντήσεις 3.2 Οξυγόνο 2-1. Ποιο είναι το οξυγόνο και πόσο διαδεδομένο είναι στη φύση. Το οξυγόνο είναι αέριο στοιχείο με μοριακό τύπο Ο 2. Είναι το πλέον διαδεδομένο στοιχείο στη

Διαβάστε περισσότερα

Βασικές έννοιες και κατάρτιση φακέλου, Μέρος III

Βασικές έννοιες και κατάρτιση φακέλου, Μέρος III Βασικές έννοιες και κατάρτιση φακέλου, Μέρος III Ουσίες UVCB Gabriele CHRIST http://echa.europa.eu 1 Ουσίες UVCB Άγνωστης (U) ή Ασταθούς σύνθεσης (V) Προϊόντα πολύπλοκων αντιδράσεων (C) ή Βιολογικά υλικά

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις:

ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Μία αλεπού και ένα τσακάλι που ζουν σε ένα οικοσύστημα ανήκουν: Α. Στον ίδιο πληθυσμό Β. Στην

Διαβάστε περισσότερα

3.1 Ενέργεια και οργανισμοί..σελίδα 2 3.2 Ένζυμα βιολογικοί καταλύτες...σελίδα 4 3.3 Φωτοσύνθεση..σελίδα 5 3.4 Κυτταρική αναπνοή.

3.1 Ενέργεια και οργανισμοί..σελίδα 2 3.2 Ένζυμα βιολογικοί καταλύτες...σελίδα 4 3.3 Φωτοσύνθεση..σελίδα 5 3.4 Κυτταρική αναπνοή. 5ο ΓΕΛ ΧΑΛΑΝΔΡΙΟΥ Μ. ΚΡΥΣΤΑΛΛΙΑ 2/4/2014 Β 2 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 3.1 Ενέργεια και οργανισμοί..σελίδα 2 3.2 Ένζυμα βιολογικοί καταλύτες...σελίδα 4 3.3 Φωτοσύνθεση..σελίδα 5 3.4 Κυτταρική

Διαβάστε περισσότερα

ΝΕΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟ

ΝΕΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟ ΝΕΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟ Κωνσταντίνα Τζιά Καθηγήτρια ΕΜΠ Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ Νέα προϊόντα - Ελαιόλαδο Αντικατάσταση άλλων λιπαρών σε προϊόντα

Διαβάστε περισσότερα

Θέµατα Βιολογίας Γενική Παιδεία Γ Λυκείου 2000

Θέµατα Βιολογίας Γενική Παιδεία Γ Λυκείου 2000 Θέµατα Βιολογίας Γενική Παιδεία Γ Λυκείου 2000 ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ Ζήτηµα 1ο Στις ερωτήσεις 1-5 να γράψετε στο τετράδιο σας τον αριθµό της ερώτησης και δίπλα το γράµµα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. 1. Οι

Διαβάστε περισσότερα

Μελέτη αξιολόγησης της επίδρασης διαφορετικών φυσικών. ουσιών στην αντοχή της ροδιάς σε χαµηλές θερµοκρασίες

Μελέτη αξιολόγησης της επίδρασης διαφορετικών φυσικών. ουσιών στην αντοχή της ροδιάς σε χαµηλές θερµοκρασίες Μελέτη αξιολόγησης της επίδρασης διαφορετικών φυσικών ουσιών στην αντοχή της ροδιάς σε χαµηλές θερµοκρασίες Παυλίνα ρογούδη, αναπλ. ερευνήτρια Ανθούλα έλλα, γεωπόνος MSc Γεώργιος Παντελίδης, µεταδιδακτορικός

Διαβάστε περισσότερα

ΚΑΘΑΡΙΣΤΙΚΑ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΑ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΚΑΘΑΡΙΣΤΙΚΑ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΑ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΚΑΘΑΡΙΣΤΙΚΑ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΑ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ

ΚΑΘΑΡΙΣΤΙΚΑ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΑ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΚΑΘΑΡΙΣΤΙΚΑ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΑ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΚΑΘΑΡΙΣΤΙΚΑ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΑ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΜΑΘΗΜΑ 3 ο ΟΡΙΣΜΟΣ ΩΣ ΚΑΘΑΡΙΣΤΙΚΑ ΟΡΙΖΟΥΜΕ ΤΑ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΑ ΠΡΟΙΟΝΤΑ, ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΩΣ ΚΥΡΙΟ ΣΚΟΠΟ ΤΟΥΣ ΕΧΟΥΝ ΤΗΝ ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗ ΤΟΥ ΡΥΠΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΠΡΟΣΩΠΟ. Η ΡΥΠΑΝΣΗ ΤΟΥ ΠΡΟΣΩΠΟΥ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΠΡΟΕΡΧΕΤΑΙ ΕΙΤΕ ΑΠΟ ΤΗΝ

Διαβάστε περισσότερα

Εργαστηριακή Διάγνωση της HIV λοίμωξης. Δρ. Μαρία Κοτσιανοπούλου Βιολόγος Υπεύθυνη Εργαστηριού Κέντρου Αναφοράς AIDS, ΕΣΔΥ

Εργαστηριακή Διάγνωση της HIV λοίμωξης. Δρ. Μαρία Κοτσιανοπούλου Βιολόγος Υπεύθυνη Εργαστηριού Κέντρου Αναφοράς AIDS, ΕΣΔΥ Εργαστηριακή Διάγνωση της HIV λοίμωξης Δρ. Μαρία Κοτσιανοπούλου Βιολόγος Υπεύθυνη Εργαστηριού Κέντρου Αναφοράς AIDS, ΕΣΔΥ Διάγνωση της HIV λοίμωξης Από το 1985 και μέχρι σήμερα η διαγνωστική διαδικασία

Διαβάστε περισσότερα

Παραγωγή βιοντήζελ: πρώτες ύλες και παραπροϊόντα

Παραγωγή βιοντήζελ: πρώτες ύλες και παραπροϊόντα Παραγωγή βιοντήζελ: πρώτες ύλες και παραπροϊόντα Νίκος Λιάπης Διευθυντής Εκμετάλλευσης ΕΛΙΝΟΙΛ Α.Ε. Θεσσαλονίκη Νοέμβριος 2006 Στόχοι παραγωγής: ΕΝ 14214 Βελτιστοποίηση οικονομικών αποτελεσμάτων Ασφάλεια

Διαβάστε περισσότερα

εισέρχεται στο φυτό ως ενυδατωµένο κατιόν

εισέρχεται στο φυτό ως ενυδατωµένο κατιόν Κατιόν µαγνησίουmg 2+ εισέρχεται στο φυτό ως ενυδατωµένο κατιόν Θρέψη Φυτών. Μπουράνης, Σ. Χωριανοπούλου 1 Επίπεδο Μg για κανονική αύξηση 0,15 0,35% ή60 140 µmol Mg gξμ -1 ΤοMgκινείταιστοΞΑΣκαιστοΗΑΣ HΑΣ100

Διαβάστε περισσότερα

Βασικές Διεργασίες Μηχανικής Τροφίμων

Βασικές Διεργασίες Μηχανικής Τροφίμων Βασικές Διεργασίες Μηχανικής Τροφίμων Ενότητα 8: Εκχύλιση, 1ΔΩ Τμήμα: Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής Του Ανθρώπου Σταύρος Π. Γιαννιώτης, Καθηγητής Μηχανικής Τροφίμων Μαθησιακοί Στόχοι Τύποι εκχύλισης

Διαβάστε περισσότερα

( 91 / 155 / ΕΚ & 93 / 112 ΕΚ ) : RAWASH. Τηλ. 210-4819558 Fax: 210-4823555 R35 R34 1310-58-3 7681-52-9 C C

( 91 / 155 / ΕΚ & 93 / 112 ΕΚ ) : RAWASH. Τηλ. 210-4819558 Fax: 210-4823555 R35 R34 1310-58-3 7681-52-9 C C ΧΗΜΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΑΠΟΛΥΜΑΝΤΙΚΑ - ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΑ ΕΛΤΙΟ Ε ΟΜΕΝΩΝ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ( 91 / 155 / ΕΚ & 93 / 112 ΕΚ ) 1. ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΕΠΙΧΕΙΡΗΣΗΣ Ονοµασία προϊόντος Μέγεθος συσκευασίας Κατασκευαστής

Διαβάστε περισσότερα

Απώλειες των βιταμινών κατά την επεξεργασία των τροφίμων

Απώλειες των βιταμινών κατά την επεξεργασία των τροφίμων Απώλειες των βιταμινών κατά την επεξεργασία των τροφίμων Αποφλοίωση και καθαρισμός Πολλά φυτικά προϊόντα π.χ, μήλα, πατάτες χρειάζονται αποφλοίωση ή καθαρισμό μερικών τμημάτων τους πριν από την κατεργασία.

Διαβάστε περισσότερα

ΤΕΣΤ 30 ΕΡΩΤΗΣΕΩΝ ΓΝΩΣΤΙΚΟΥ ΧΗΜΕΙΑΣ

ΤΕΣΤ 30 ΕΡΩΤΗΣΕΩΝ ΓΝΩΣΤΙΚΟΥ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΕΣΤ 30 ΕΡΩΤΗΣΕΩΝ ΓΝΩΣΤΙΚΟΥ ΧΗΜΕΙΑΣ ο αριθμός Avogadro, N A, L = 6,022 10 23 mol -1 η σταθερά Faraday, F = 96 487 C mol -1 σταθερά αερίων R = 8,314 510 (70) J K -1 mol -1 = 0,082 L atm mol -1 K -1 μοριακός

Διαβάστε περισσότερα