ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΕΝΤΕΡΙΚΗ ΑΤΡΟΦΙΑ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΤΕΡΗΣΗ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΟΝ ΕΠΙΜΥ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΟΣ Α` ΠΡΟΠΑΙΔΕΥΤΙΚΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ. ΜΠΑΣΔΑΝΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΕΝΤΕΡΙΚΗ ΑΤΡΟΦΙΑ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΤΕΡΗΣΗ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΟΝ ΕΠΙΜΥ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ Α. ΚΑΠΟΥΤΖΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗ ΣΧΟΛΗ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑΔΗΣ ΕΥΘΥΜΙΟΣ ΑΤΜΑΤΖΙΔΗΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΟΙΚΟΝΟΜΟΠΟΥΛΟΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΟΜ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑΔΗΣ ΕΥΘΥΜΙΟΣ ΑΤΜΑΤΖΙΔΗΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΟΙΚΟΝΟΜΟΠΟΥΛΟΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΜΠΑΖΔΑΝΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΤΟΚΜΕΚΤΖΙΟΓΛΟΥ ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΡΕΤΤΟΥ ΕΛΕΝΗ ΓΡΟΣΟΜΑΝΙΔΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΟΜ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως (Νόμος 5343/32, άρθρο 202 παρ.2 και Ν.1268/82, άρθρο 50, παρ.8) 2

3 Στους γονείς μου, στους οποίους οφείλω τα πάντα 3

4 4

5 Περιεχόμενα Εισαγωγή Προβιοτικοί μικροοργανισμοί Ιστορική αναδρομή και πρωτοπόροι ερευνητές Ορισμοί Κριτήρια επιλογής προβιοτικών μικροοργανισμών Μηχανισμοί δράσης προβιοτικών Ενίσχυση της λειτουργίας του επιθηλιακού φραγμού Ρύθμιση της σύνθεσης της εντερικής μικροχλωρίδας Ρύθμιση ανοσοβιολογικής απόκρισης Ασφάλεια των προβιοτικών Παρενέργειες, κίνδυνοι και μειονεκτήματα της χρήσης προβιοτικών Τα στελέχη Lactobacillus ως προβιοτικοί μικροοργανισμοί Το γένος Lactobacillus Τα στελέχη Lactobacillus ως μέλη της φυσιολογικής εντερικής χλωρίδας Μηχανισμοί δράσης των Lactobacillus Ο ρόλος των χαρακτηριστικών της κυτταρικής επιφάνειας (cell surface traits) των Lactobacillu Ικανότητα προσκόλλησης Η ιδιότητα της αυτοσυσσωμάτωσης Επιφανειακή υδροφοβία Πρωτεΐνες της S-στιβάδας Εξωπολυσακχαρίτες (EPS) Ανατομία Και Φυσιολογία Του Γαστρεντερικού Σωλήνα Ο Βλεννογόνος του Λεπτού Εντέρου Το Χόριο μέχρι τον Ορογόνο Βλεννογόνιος Εντερικός Φραγμός Δομικά συστατικά του εντερικού φραγμού και ο λειτουργικός τους ρόλος Ενδοαυλικοί Παράγοντες Επιθηλιακοί Παράγοντες Ενδοθηλιακοί Παράγοντες Εκτίμηση Λειτουργίας Και Διαπερατότητα Του Εντερικού Φραγμού Το Ανοσοβιολογικό Σύστημα Του Εντέρου: Δομική Και Λειτουργική Οργάνωση

6 Ο ρόλος του γαστρεντερικού επιθηλίου Εντερικός βλεννογόνιος λεμφικός ιστός Εντερική Χλωρίδα Εντέρου Σύσταση εντερικής χλωρίδας Μοριακοί και κυτταρικοί μηχανισμοί αλληλεπίδρασης της μικροχλωρίδας και του ξενιστή Η αναγνώριση των συμβιωτικών μικροοργανισμών Ρύθμιση του επίκτητου ανοσοβιολογικού συστήματος από τους συμβιωτικούς μικροοργανισμούς Απόπτωση Ορισμός, μορφολογία και βιοχημεία της απόπτωσης Επαγωγή της απόπτωσης και μεταγωγή σήματος Απόπτωση στο φυσιολογικό εντερικό επιθήλιο Απόπτωση σε παθολογικές καταστάσεις του εντερικού επιθηλίου Επίδραση της στέρησης Τροφής στο Εντερικό Βλεννογόνο Δραστηριότητα των μικροβιακών ενζύμων ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Σκοπός Υλικό μέθοδος Πειραματόζωα Στέλεχος Lactobacillus acidophilus Πειραματική διάταξη Ομάδες μελέτης Τελική φάση του πειράματος Ιστοληψία Αναισθησία Χειρουργική τεχνική Μέθοδοι μελέτης Αλλαγές του σωματικού βάρους Ιστολογική εξέταση Ανάλυση μικροβιακών μεταβολικών βιοδεικτών Προσδιορισμός της δραστηριότητας των μικροβιακών ενζύμων Συγκέντρωση των πτητικών λιπαρών οξέων Στατιστική ανάλυση

7 10. Αποτελέσματα Συζήτηση Συμπεράσματα Περίληψη Abstract Βιβλιογραφικές αναφορές

8 8

9 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 9

10 10

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η στέρηση της τροφής προεγχειρητικά είναι μια συχνή πρακτική σε ασθενείς που νοσηλεύονται σε χειρουργικές κλινικές, είτε ως προετοιμασία για την εγχείρηση είτε λόγω της πάθησης τους αυτής καθ' αυτής. Επιπλέον, πολλοί ασθενείς προσέρχονται ήδη υποσιτισμένοι λόγω της υποκείμενης νόσου. Αν και η ιδέα της ανάγκης χορήγησης διατροφής ως προετοιμασία του χειρουργικού ασθενούς αλλά και άμεσα μετεγχειρητικά ως υποστήριξη του μέχρι να σιτιστεί από του στόματος είναι πλέον αρκετά εμπεδωμένη στο υποσυνείδητο των χειρουργών, δεν είναι λίγες οι φορές που μετεγχειρητικοί ασθενείς σε βαριά κατάσταση παραμένουν για μακρό χρονικό διάστημα σε παρεντερική διατροφή, η οποία καλύπτει μεν τις ενεργειακές τους ανάγκες έχει όμως αρνητικές συνέπειες στον εντερικό βλεννογόνο και κατά συνέπεια στο ενδογενές αμυντικό σύστημα του οργανισμού, το σχετιζόμενο με το έντερο [GALT]. Σήμερα είναι πλέον καλώς τεκμηριωμένο ότι ακόμη και η μικρής διάρκειας στέρηση τροφής οδηγεί σε μορφολογικές και λειτουργικές διαταραχές του εντερικού βλεννογόνου : μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αύξηση του ρυθμού απόπτωσης των επιθηλιακών κυττάρων, ατροφία των εντερικών λαχνών, διαταραχές της αρχιτεκτονικής του βλεννογόνου, μειωμένη παραγωγή βλέννης, αντισωμάτων και ενζύμων, μεταβολές της ενδογενούς εντερικής χλωρίδας και τελικά διάταραχή της ακεραιότητας του βλεννογόνιου εντερικού φραγμού που, υπό ορισμένες προϋποθέσεις, οδηγεί σε βακτηριακή μετακίνηση. Για το λόγο αυτό υπάρχει μια εκτεταμένη βιβλιογραφία που αφορά στη χρήση ποικίλων παραγόντων που στόχο έχουν να προλάβουν ή αποκαταστήσουν την βλεννογόνια ατροφία και να ενισχύσουν έτσι έμμεσα τον διαταραγμένο, λόγω νόσου και ασιτίας βλεννογόνιο εντερικό φραγμό [1-11]. Κατά την τελευταία δεκαετία τα προβιοτικά βρίσκονται στο επίκεντρο της επιστημονικής έρευνας αλλά και του εμπορικού ενδιαφέροντος, χάρη στις δυνητικά ευεργετικές τους για τον οργανισμό ιδιότητες. Κατά τον ορισμό του Fuller προβιοτικό θεωρείται ένα διαιτητικό συμπλήρωμα ζωντανών μη παθογόνων μικροοργανισμών, το οποίο έχει ευεργετική επίδραση στον ξενιστή μέσω του μηχανισμού βελτίωσης της οικολογικής ισορροπίας της εντερικής του χλωρίδας. Τα κύρια είδη βακτηρίων που χρησιμοποιούνται είναι λακτοβάκιλλοι και bifidobacteria, τα οποία αποτελούν μέρος της ανθρώπινης εντερικής χλωρίδας και έχουν 11

12 τη δυνατότητα να προσκολλώνται και να αποικίζουν στον εντερικό βλεννογόνο. Μεταξύ των πολύτιμων ιδιοτήτων τους αναφέρονται, η παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών, η αναστολή της ανάπτυξης παθογόνων βακτηρίων και η ενεργοποίηση του ενδογενούς συστήματος άμυνας του ξενιστή. Επιπρόσθετα όμως, έχει αποδειχθεί πειραματικά ότι τα προβιοτικά ασκούν τροφική δράση στον εντερικό βλεννογόνο: προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στις εντερικές κρύπτες και διατηρούν έτσι φυσιολογικό το μήκος των εντερικών λαχνών σε πειραματόζωα που η χορήγηση μεθοτρεξάτης ή η στέρηση τροφής προκαλεί σημαντική εντερική βλεννογόνια ατροφία. Η δράση τους αυτή φαίνεται ότι σχετίζεται με την ικανότητα τους να εμπλέκονται άμεσα στην παραγωγή βασικών διατροφικών στοιχείων του βλεννογόνου, όπως είναι τα λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου, τα οποία αποτελούν μεταβολίτες της βακτηριακής ζύμωσης και τα αμινοξέα αργινίνη, κυστεΐνη και γλουταμίνη. Με αυτά διατηρείται ακέραια η μορφολογία και η «στεγανότητα» του εντερικού βλεννογόνιου φραγμού, αφού του εξασφαλίζεται τροφή, μικροκυκλοφορία και ενέργεια. Ειδικά το βακτήριο Lactobacillus plantarum, βρέθηκε ότι έχει την ικανότητα να καταβολίζει την αργινίνη προς μονοξείδιο του αζώτου, το οποίο παρεμβαίνει σε ποικίλες λειτουργίες όπως η έκκριση βλέννης, η ρύθμιση τη κινητικότητας του εντέρου και της σπλαγχνικής κυκλοφορίας και η διέγερση του ανοσιακού συστήματος του εντέρου [12-28]. Ο λακτοβάκιλλος acidophilus είναι ένας από τους πιο παλιά απομονωθέντες λακτοβακίλλους ανθρώπινης προέλευσης, σκεύασμα του οποίου πωλείται στην Α- μερική από 25ετίας σε ξηρή μορφή αλλά και σε γάλατα, γιαούρτια και χυμούς, ως προβιοτικό. Κατά συνέπεια, είναι και ο πλέον μελετημένος λακτοβάκιλλος, τόσο σε πειραματικό όσο και σε κλινικό επίπεδο. Έτσι είναι επιβεβαιωμένο ότι έχει μια εξαιρετική σταθερότητα τόσο σε ξηρή μορφή όσο και σε διαλύματα, αλλά και κατά τη διέλευση του κατά μήκος του πεπτικού σωλήνα ανθρώπων και πειραματόζωων. Επίσης είναι εξακριβωμένη η ικανότητα προσκόλλησης του στον εντερικό βλεννογόνο και η αντιμικροβιακή του δράση, ιδιότητες απαραίτητες για την βέβαιη δράση του ως προβιοτικό [29,30]. Παλαιότερα χρησιμοποιήθηκε δοκιμαστικά από την πειραματική μας ομάδα το εμπορικά διαθέσιμο σκεύασμα Synbiotic 2000Forte, το οποίο είναι ένας συνδυασμός 4 προβιοτικών βακτηρίων με φυτικές ίνες. Χορηγήθηκε σε επίμυες, που μετά ολιγοήμερη στέρηση τροφής [εντερική βλεννογόνια ατροφία] σιτίσθηκαν εκ νέου εντερικά ή παρεντερικά, με σκοπό να μελετηθεί το DNA των κυττάρων του εντερικού 12

13 επιθηλίου, ως δείκτης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής έδειξαν πολύ σημαντική αποκατάσταση του εντερικού επιθηλίου στα πειραματόζωα που έλαβαν εντερική σίτιση και/ή όχι συμβιοτικά σε σύγκριση με αυτά που έλαβαν παρεντερική και/ή όχι συμβιοτικά, αντίστοιχα. Το σημαντικότερο όμως εύρημα ήταν ότι η ομάδα, που έλαβε παρεντερική σίτιση και συμβιοτικό παρουσίασε συγκρίσιμη αποκατάσταση του εντερικού επιθηλίου με αυτήν με εντερική σίτιση και όχι συμβιοτικά [31]. Επειδή όμως το σκεύασμα αυτό περιέχει τόσο συνδυασμό βακτηρίων όσο και τις φυτικές ίνες, δεν μπορούν να αξιολογηθούν μεμονωμένα η δράση του καθενός. Έτσι αποφασίσθηκε να χρησιμοποιηθεί ή ίδια βασική ιδέα στο πειραματικό πρωτόκολλο και να δοκιμασθεί ο λακτοβάκιλλος acidophilus ως «μονοθεραπεία». Επομένως, ΣΚΟΠΟΣ της πειραματικής αυτής μελέτης είναι να διερευνηθεί η πιθανή ευεργετική δράση του λακτοβακίλλου acidophilus στον εντερικό βλεννογόνο, με ιδιαίτερο στόχο την αποκατάσταση της μορφολογίας του και της λειτουργικότητας του μετά την πρόκληση εντερικής ατροφίας λόγω ολιγοήμερης στέρησης τροφής. Η εκπόνηση μιας διδακτορικής διατριβής είναι μια επίμονη και επίπονη διαδρομή, η οποία περνά μέσα από αντιφατικά πολλές φορές συναισθήματα και εμπειρίες. Η διατριβή αυτή πραγματοποιήθηκε χάρη στη βοήθεια και τη συνεργασία ανθρώπων που τους εκτιμώ βαθύτατα. Μικρό δείγμα της εκτίμησης αυτής αποτελεί η έκφραση των ειλικρινών ευχαριστιών μου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Ομ. Καθηγητή Χειρουργικής και επιβλέποντα της διατριβής κ. Ελευθεριάδη Ευθύμιο που στάθηκε πολύτιμος καθοδηγητής και υποστηρικτής σε όλη την διάρκεια της διατριβής. Υπήρξε πάντα πρόθυμος να προσφέρει την βοήθειά του και αποτέλεσε ακούραστο συμπαραστάτη στην επιτέλεση της προσπάθειάς μου. Οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Διευθύντρια Χειρουργικής κ. Κατερίνα Κοτζάμπαση, η οποία συνέβαλε τα μέγιστα τόσο στη σύλληψη και διαμόρφωση του θέματος, όσο και στον καθορισμό του πειραματικού πρωτοκόλλου, συνέβαλε τα πλείστα στη μελέτη των αναλύσεων, ενώ η εμμονή της στην επιστημονική ακρίβεια και η συγγραφική της ευχέρεια συνετέλεσαν ώστε να λάβει την τελική της μορφή η παρούσα διατριβή. Στο συνάδελφο Χειρουργό κ. Δανιήλ Παραμυθιώτη, ο οποίος με την χειρουργική επιδεξιότητα που τον διακρίνει συνέβαλε καθοριστικά στην αξιόπιστη διενέργεια των επεμβάσεων στους επίμυες. 13

14 1. ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΟΙ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ 1.1. Ιστορική αναδρομή και πρωτοπόροι ερευνητές Σύγχρονες μελέτες στον τομέα της υγείας προκάλεσαν την επανεξέταση του ρόλου των μικροοργανισμών στην υγεία του ξενιστή και προώθησαν την ιδέα της σκόπιμης διαμόρφωσης του εντερικού μικροβιόκοσμου για θεραπευτικούς σκοπούς. Ωστόσο, η ιδέα της καταστολής και αντικατάστασης των παθογόνων μέσω της δια του στόματος χορήγησης 'ωφέλιμων' βακτηρίων για τη βελτίωση της μικροβιακής ισορροπίας, της υγείας και της μακροζωίας δεν είναι καινοφανής, αλλά παρουσιάστηκε για πρώτη φορά σχεδόν έναν αιώνα νωρίτερα από τον Tissier (1906) και τον Metchnikoff [32]. Ο Νομπελίστας Ιλια Ιλιτς Μέτσνικοφ (1908), Ρώσος ζωολόγος, μικροβιολόγος ερευνητής του Ίδρύματος Παστέρ, των Παρισίων αναφέρει ότι, «η γήρανση του ανθρώπου, οφείλεται στην αυτοδηλητηρίαση του οργανισμού από διάφορους μικροβιολογικούς και τοξικούς παράγοντες οι οποίοι αναπτύσσονται κυρίως στο εσωτερικό των εντέρων». Με την επιμονή του σ αυτήν την έρευνα απέδειξε πως η εντερική χλωρίδα αποτελείται από οξυ-γαλακτικά βακτήρια που ωφελούν. Γνωρίζοντας ήδη, πως ορισμένοι λαοί που ζουν περισσότερο από τους άλλους έχουν ως βασική τροφή το γιαούρτι.( Έλληνες, Βούλγαροι, Ρώσοι), συνέδεσε το γιαούρτι (η ζύμωση του γιαουρτιού γίνεται από οξυ-γαλακτικά βακτήρια) με την καλή υγεία του εντέρου και το οποίο συνέστηνε επιμόνως ως το απαραίτητο διατροφικό προϊόν το οποίο θα συνοδεύει κάθε γεύμα. Ο Metchnikoff ανέπτυξε τη θεωρία της αυτόαποτοξίνωσης του οργανισμού και την συνέδεσε με την κατανάλωση γιαουρτιού που περιέχει βακτήρια του γένους Lactobacillus. Σημαντικές απέβησαν οι εργασίες του Henry Tissier, επίσης ερευνητή του Ιδρύματος Παστέρ, ο οποίος απεμόνωσε το βακτήριο Bifidobacterium, από το μητρικό γάλα και το ονόμασε «Bacillus bifidus communis». Ο Tissier έδειξε ότι τα βακτήρια του γένους Bifidobacterium αποτελούν κυρίαρχα μέλη της εντερικής μικροχλωρίδας των βρεφών και πρότεινε τη χορήγηση τους για την αποκατάσταση της ισορροπίας της εντερικής μικροχλωρίδας και τη θεραπεία της διάρροιας. Η πρώτη εφαρμογή του προβιοτικού έγινε το 1917 κατά την διάρκεια του Α Παγκοσμίου Πολέμου από τον Alfred Nissle, Γερμανό καθηγητή, ο οποίος εθεράπευσε με δικό του εργαστηριακό σκεύασμα προβιοτικών επιδημία εντεροκολίτιδας (δριμείας μορφής στο στρατόπεδο) από σαλμονέλωση και σιγκέλωση. 14

15 1.2 Ορισμοί Ακολουθώντας τις παραπάνω αναφερόμενες εξελίξεις, το 1965, εισήχθη από τους Lilly και Stillwell ο όρος προβιοτικός (προ-βίος, προάγω τη ζωή) για να περιγράψει βακτήρια και σπόρια που χρησιμοποιούνται ως συμπληρώματα της διατροφής των ζώων και τα οποία θα μπορούσαν να περιορίσουν τη χρήση αντιβιοτικών ουσιών [33]. Ο Parker [34], όρισε τα προβιοτικά ως: «οργανισμοί και ουσίες οι οποίες συμβάλλουν στην ισορροπία της εντερικής μικροχλωρίδας». Το 1989 προτάθηκε από τον Roy Fuller ο ορισμός που σήμερα χρησιμοποιείται ευρέως "Προβιοτικό είναι ένα ζωντανό μικροβιακό συμπλήρωμα που έχει ευεργετικές επιπτώσεις στον οργανισμό για τη βελτίωση της εντερικής του μικροβιακής ισορροπίας" [35]. Ο ορισμός του Fuller' υπογραμμίζει την προϋπόθεση της βιωσιμότητας για το προβιοτικό και εισάγει την άποψη της ευεργετικής επίδρασης στον ξενιστή. Έκτοτε, ο όρος προβιοτικός επαναδιατυπώθηκε αρκετές φορές για να καταλήξει σύμφωνα με τον Οργανισμό Τροφίμων και Γεωργίας των Η.Π.Α και τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας [36] σε μία γενικώς αποδεκτή αναθεώρηση που ορίζει ως προβιοτικούς τους 'ζωντανούς μικροοργανισμούς που ασκούν ευεργετική δράση στον ξενιστή, όταν χορηγηθούν σε κατάλληλες ποσότητες'. Συνεπώς: «Προβιοτικό είναι ένα σκεύασμα ή ένα προϊόν το οποίο περιέχει ζώντες, καθορισμένους μικροοργανισμούς σε επαρκείς ποσότητες, που μεταβάλλουν θετικά τη σύσταση της μικροχλωρίδας σε ένα τμήμα του ξενιστή, ασκώντας έτσι ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία του» Ο παραπάνω ορισμός περιορίζει την ιδέα των προβιοτικών σε επιδράσεις που παράγονται από ζώντες μικροοργανισμούς και είναι εφαρμόσιμος ανεξάρτητα από την περιοχή δράσης των προβιοτικών και τη διαδρομή που ακολουθούν στο σώμα του ξενιστή μετά τη χορήγησή τους. Συνεπώς, μπορεί να συμπεριλάβει περιοχές του σώματος όπως η στοματική κοιλότητα, το έντερο, ο κόλπος και το δέρμα. Στην περίπτωση των προβιοτικών τροφίμων, οι ευεργετικές για την υγεία επιδράσεις βασίζονται συνήθως στην τροποποίηση της γαστρεντερικής μικροχλωρίδας και συνεπώς βασίζονται στην επιβίωση κατά τη διάρκεια της διέλευσης από την πεπτική οδό [37]. Η δυνητική δράση των προβιοτικών μπορεί να ενισχυθεί με τις παρακάτω μεθόδους [38]: (α) την επιλογή των πλέον αποδοτικών στελεχών. (β) τον κατάλληλο χειρισμό του γένους. 15

16 (γ) το συνδυασμό ενός αριθμού στελεχών και (δ) το συνδυασμό προβιοτικών και συνεργικά δρώντων συστατικών (πρεβιοτικών) 1.3 Κριτήρια επιλογής προβιοτικών μικροοργανισμών Οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί επιλέγονται συχνά με εμπειρικό τρόπο και περιλαμβάνουν στελέχη που απομονώνονται από ζυμωμένα, παραδοσιακά τρόφιμα και από την εντερική μικροχλωρίδα του ανθρώπου [39]. Η πλειοψηφία των προβιοτικών μικροοργανισμών που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή προϊόντων για ανθρώπινη κατανάλωση, αποτελείται από στελέχη βακτηρίων του γαλακτικού οξέος που ανήκουν στα γένη Lactobacillus και Bifidobacterium (Πίνακας 1). Τα στελέχη των παραπάνω γενών αποτελούν μέλη της εντερικής μικροχλωρίδας του ανθρώπου και των ζώων, ενώ ταυτόχρονα χρησιμοποιούνται ως καλλιέργειες εκκίνησης ζυμωμένων τροφίμων, επιδεικνύοντας έτσι μακροχρόνιο ιστορικό αποδεδειγμένης ασφαλούς κατανάλωσης [40,41]. Ωστόσο, η επιλογή των προβιοτικών μικροοργανισμών γίνεται όχι μόνο από στελέχη των γενών Lactobacillus και Bifidobacterium, αλλά και από ένα ευρύ φάσμα βακτηρίων του γαλακτικού οξέος και άλλων μικροοργανισμών [42]. Για το λόγο αυτό, έχουν θεσπισθεί βασικά κριτήρια δράσης και ασφάλειας καθώς και τεχνολογικά κριτήρια τα οποία θα πρέπει να πληρόι ένας μικροοργανισμός, για να χαρακτηρισθεί ως προβιοτικός [43, 44]: 1. Ταυτοποίηση στο επίπεδο του γένους, του είδους και του στελέχους με φαινοτυπικές και γενοτυπικές μεθόδους. Η ασφαλής χρήση, οι ιδιότητες και η αποτελεσματικότητα των προβιοτικών μικροοργανισμών συνιστούν γνωρίσματα συγκεκριμένων μικροβιακών στελεχών (strain specific), γεγονός που καθιστά αναγκαία τη διάκριση τους σε επίπεδο στελέχους [45]. Δεδομένου ότι οι συμβατικές φαινοτυπικές μέθοδοι παρουσιάζουν περιορισμούς ως προς την ακρίβεια, την επαναληψιμότητα και τη διακριτική τους ικανότητα, η σύγχρονη ερευνητική δραστηριότητα προτείνει το συνδυασμό διαφορετικών τεχνικών (πολυφασική ταξινόμηση) για το χαρακτηρισμό των προβιοτικών στελεχών. Για το λόγο αυτό, εφαρμόζεται ένας συνδυασμός αξιόπιστων φαινοτυπικών και γενοτυπικών μεθόδων ταυτοποίησης που προσδίδει σταθερή και σαφή ονομασία-προσδιορισμό στα στελέχη που επιλέγονται για προβιοτική χρήση. Για την ταυτοποίηση σε επίπεδο γένους και είδους χρησιμοποιούνται διεθνώς αναγνωρισμένες γενοτυπικές μέθοδοι, όπως ο DNA-DNA υβριδισμός και η ανάλυση γονιδίων ριβοσωμικού RNA. Για τη διάκριση των προβιοτικών σε επίπεδο στελέχους χρησιμοποιείται η τεχνική του τυχαία ενισχυμένου πολυμορφικού DNA (RAPD)-PCR καθώς και η ηλεκτροφόρηση πηκτής 16

17 (γέλης) παλλόμενου πεδίου (PFGE), που θεωρείται η πλέον αξιόπιστη μέθοδος [46, 47]. 2. Ανθρώπινη προέλευση. Οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί που έχουν απομονωθεί από τον πεπτικό σωλήνα υγιούς ανθρώπου θεωρούνται ασφαλέστεροι για κατανάλωση και ταυτόχρονα αποτελεσματικότεροι στην αποίκιση του γαστρεντερικού σωλήνα. 3. Ασφάλεια για τον άνθρωπο. Απουσία παθογόνου και τοξικής δράσης που αποδεικνύεται μέσω πειραματικών δοκιμών (π.χ. έλεγχος σχηματισμού βιογενών αμινών, έλεγχος ικανότητας συγκόλλησης αιμοπεταλίων) και εμπειρικών διαδικασιών (π.χ. ιστορικό απουσίας βλαβερής επίδρασης στην υγεία των καταναλωτών). 4. Επιβίωση κατά τη διάρκεια της διέλευσης στο γαστρεντερικό σύστημα. Η ικανότητα επιβίωσης επιδεικνύεται από την ανθεκτικότητα των μικροοργανισμών στο γαστρικό οξύ (χαμηλό ph), στα χολικά άλατα και στα πεπτικά ένζυμα. 5. Θετική επίδραση στη μικροβιακή χλωρίδα του εντέρου. Χαρακτηριστικές ιδιότητες των μικροοργανισμών, όπως η ικανότητα προσκόλλησης, ο πολλαπλασιασμός στις συνθήκες του εντερικού σωλήνα και η παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών, αποτελούν ένδειξη της ικανότητας των προβιοτικών στελεχών να αλληλεπιδρούν με την εντερική μικροχλωρίδα. 6. Ανοσοτροποποιητική δράση. Προβιοτικοί μικροοργανισμοί που έχουν την ικανότητα να τροποποιούν αποκρίσεις του ενδογενούς και επίκτητου ανοσιακού συστήματος. 7. Τεχνολογικά χαρακτηριστικά που αφορούν στην επιβίωση και σταθερότητα της καλλιέργειας των προβιοτικών κατά τα στάδια παρασκευής και συντήρησης του προϊόντος καθώς και στη βελτίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του. 1.4 Μηχανισμοί δράσης προβιοτικών Η ευεργετική επίδραση των προβιοτικών σχετίζεται, άμεσα ή έμμεσα, με το γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου. Το γεγονός αυτό δεν οφείλεται μόνο στο ότι οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί των τροφίμων ή των θεραπευτικών σκευασμάτων χορηγούνται μέσω της στοματικής οδού, αλλά και στο ότι οι μηχανισμοί δράσης και η αποτελεσματικότητά τους βασίζονται συχνά στις αλληλεπιδράσεις τους με την εντερική μικροχλωρίδα και τα ανοσο-ικανά κύτταρα του εντερικού βλεννογόνου του ξενιστή. 17

18 Πίνακας 1 Είδη βακτηρίων που χρησιμοποιούνται ως προβιοτικά, σύμφωνα με την ελεγκτική αρχή παραγωγών γάλακτος και γιαουρτιού της Ε.Ε. Lactobacilli Bifidobacteria ιάφορα γένη Μικροοργανισμών L. acidophilus (LA-5) B. longum (BB536) Enterococcus faecalis L. crispatus (L. acidophilus Gilliland) B. longum (SP 07/3) Enterococcus faecium L. johnsonii (LA1) B. bifidum (MF 20/5) Streptococcus thermophilus L. gasser (PA 16/8) B. infantis Lactococcus lactis L. (para)casei (L. casei) "shirota", B. animalis (B. animalis ssp. Propionibacteria lactis BB-12) L. casei "defensis" Spores of Bacillus cereus "toyoi" L. rhamnosus (LGG) B. adolescentis E. coli'* (E. coli "Nissle 1917") L. reuteri B. breve Sporolactobac. Inulinus L. plantarum (299 and 299v) Saccharomyces boulardii Δεδομένου ότι οι μηχανισμοί δράσης των προβιοτικών παρουσιάζουν ποικιλομορφία και πολυπλοκότητα, τα διαφορετικά στελέχη των προβιοτικών επιδεικνύουν διαφορετικό τρόπο δράσης, εξαρτώμενο από το είδος των μορίων που εκφράζονται στην επιφάνεια των κυττάρων τους (γλυκολιπίδια, MAMP) ή εκκρίνονται από αυτά [48,49,50]. Ειδικότερα, σύμφωνα με πρόσφατα δεδομένα, θεωρείται ότι οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί επιδρούν ευεργετικά στην υγεία μέσω: 1) της ενίσχυσης της λειτουργίας του επιθηλιακού φραγμού 2) της ρύθμισης της σύστασης της εντερικής μικροχλωρίδας και 3) της ρύθμισης των αποκρίσεων του ενδογενούς και επίκτητου ανοσιακού συστήματος [51] Ενίσχυση της λειτουργίας του επιθηλιακού φραγμού Τα κύτταρα του εντερικού επιθηλίου συνδέονται πολύ στενά μεταξύ τους και σχηματίζουν έναν πολύπλοκο φραγμό που ονομάζεται εντερικός βλεννογόνιος φραγμός. Ο φραγμός αυτός παρεμποδίζει την είσοδο προς τη συστηματική κυκλοφορία των παθογόνων μικροοργανισμών, απώλεια ή μεταβολή της λειτουργίας του συνδέονται με την εκδήλωση νόσου. Συγκεκριμένα στελέχη προβιοτικών μικροοργανισμών επηρεάζουν τη λειτουργία του μηχανικού επιθηλιακού φραγμού μέσω της εκδήλωσης ποικίλων μηχανισμών, που σχετίζονται με τον τύπο των μορίων που εκφράζονται στην επιφάνεια των κυττάρων τους ή εκκρίνονται από αυτά [52]. Οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί φαίνεται ότι ενισχύουν την ακεραιότητα του μηχανικού φραγμού των επιθηλιακών κυττάρων του ξενιστή ή επάγουν την επιδιόρθωση βλαβών σε αυτά. Οι μοριακοί μηχανισμοί της παραπάνω δράσης των προβιοτικών 18

19 περιλαμβάνουν: α) την παρεμπόδιση της δράσης φλεγμονωδών κυτταροκινών που θα μπορούσαν να προκαλέσουν βλάβες στις στενές συνδέσεις μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων, β) την επαγωγή της παραγωγής βλεννινών, γ) την παραγωγή λιπαρών οξέων βραχείας αλύσου (SCFAs) και τέλος δ) την παραγωγή προστατευτικών κυτταροκινών (IL-6) που αναστέλλουν την απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων [53, 54] Ρύθμιση της σύνθεσης της εντερικής μικροχλωρίδας Η διατήρηση της ισορροπίας της εντερικής μικροχλωρίδας ως προς τη σύσταση και τη χωροταξική της κατανομή, αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα για την υγεία του ξενιστή. Διαταραχές της εντερικής μικροχλωρίδας, όπως η μείωση του αριθμού των ωφέλιμων και η επικράτηση των παθογόνων μικροοργανισμών, σχετίζονται με την εκδήλωση παθογόνων καταστάσεων, όπως οι φλεγμονώδεις και οι λοιμώδεις ασθένειες του εντέρου. Τα προβιοτικά αναστέλλουν την ανάπτυξη και δράση των παθογόνων μικροοργανισμών και επάγουν τη διατήρηση της ισορροπίας στην εντερική χλωρίδα μέσω μηχανισμών στους οποίους συμπεριλαμβάνονται [49, 52,53, 54]: 1. Η απευθείας αντιμικροβιακή δράση μέσω της παραγωγής αντιβακτηριακών ουσιών, όπως οι βακτηριοσίνες και τα οξέα. 2. Ο ανταγωνιστικός αποκλεισμός λόγω συναγωνισμού για τις ίδιες θέσεις σύνδεσης στα επιθηλιακά κύτταρα. 3. Η αναστολή της έκφρασης των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για λοιμογόνους παράγοντες των παθογόνων. 4. Η ενίσχυση των αντιμικροβιακών ανοσιακών αποκρίσεων του εντερικού βλεννογόνου με την επαγωγή της παραγωγής siga, φλεγμονωδών και ρυθμιστικών κυτταροκινών Ρύθμιση ανοσιακής απόκρισης Οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί αλληλεπιδρούν με το ανοσιακό σύστημα του ξενιστή μέσω ποικίλων μοριακών και κυτταρικών μηχανισμών. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές τροποποιούν τις αποκρίσεις του ανοσιακού συστήματος του ξενιστή και ρυθμίζουν την ισορροπία μεταξύ των φλεγμονωδών και αντι-φλεγμονωδών αποκρίσεων του, επάγοντας την εντερική ομοιόσταση [53,55]. Οι μηχανισμοί της ανοσοτροποποιητικής δράσης των προβιοτικών δεν έχουν διασαφηνιστεί πλήρως. Ωστόσο, ένας μεγάλος αριθμός δεδομένων από in vitro και in vivo δοκιμές δείχνει ότι επιδεικνύουν ειδικές δράσεις στα κύτταρα του ενδογενούς και επίκτητου ανοσιακού συστήματος, όπως τα μακροφάγα, τα ΝΚ, τα δενδριτικά κύτταρα και τα T-ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα [55]. 19

20 Ειδικότερα, όσον αφορά την επίδραση τους στα μακροφάγα, στελέχη προβιοτικών βακτηρίων αυξάνουν την φαγοκυτταρική τους ικανότητα ή επάγουν την παραγωγή μονοξείδιου του αζώτου και φλεγμονωδών κυτταροκίνων από αυτά, ενισχύοντας έτσι την αντιική τους δράση [56]. Συγκεκριμένοι προβιοτικοί μικροοργανισμοί επάγουν επίσης την ενεργοποίηση των NK στον άνθρωπο ή επιδρούν στη λειτουργία των δενδριτικών κυττάρων, είτε άμεσα μετά τη σύνδεσή τους σε αυτά είτε έμμεσα μέσω της παραγωγής κυτταροκινών από τα επιθηλιακά κύτταρα. Η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ των ωφέλιμων και παθογόνων μικροοργανισμών καθώς και η απώλεια των μικροβίων της εντερικής χλωρίδας που προάγουν τη διαφοροποίηση των T-ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε υπέρμετρη ανοσιακή απόκριση τύπου Th1 ή Th2 και στην εκδήλωση αυτοάνοσων νοσημάτων, φλεγμονωδών διαταραχών του εντέρου και αλλεργιών [57,58]. Οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί είναι ικανοί να ρυθμίζουν τη λεπτή ισορροπία ανάμεσα στην απαραίτητη και υπερβολική απόκριση του ανοσιακού συστήματος τόσο τοπικά στους βλεννογόνους του γαστρεντερικού, αναπνευστικού και ουρογεννητικού συστήματος, όσο και συστηματικά [52]. Ο μηχανισμός της ρύθμισης βασίζεται στην αλληλεπίδραση των προβιοτικών με τους διαφορετικούς πληθυσμούς των δενδριτικών κυττάρων, τα οποία ελέγχουν άμεσα μέσω της παρουσίασης των αντιγόνων στα T- λεμφοκύτταρα ή έμμεσα μέσω των κυτταροκίνων που παράγουν, τη διαφοροποίηση και ενεργοποίηση των T-ρυθμιστικών λεμφοκύτταρων. Τα T-ρυθμιστικά κύτταρα με τη σειρά τους ρυθμίζουν, κυρίως μέσω της παραγωγής IL-10 και TGF-β, τις Th1 και Th2, ανοσοαποκρίσεις. Συνεπώς, στην περίπτωση των μικροβιακών επιμολύνσεων οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί ενισχύουν την Th1 ανοσοαπόκριση που σχετίζεται με την απελευθέρωση των φλεγμονωδών κυτταροκινών την αυξημένη φαγοκυτταρική ικανότητα και την ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων. Επιπρόσθετα, στελέχη προβιοτικών μικροοργανισμών επάγουν την παραγωγή αντι-φλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-10, TGF-β) που καταστέλλουν την Th2 ανοσιακή απόκριση, η οποία σχετίζεται με αλλεργικές αντιδράσεις [49,59]. Οι έρευνες που αφορούν στους προβιοτικούς μικροοργανισμούς αποκαλύπτουν ότι αυτά επιδρούν σε ένα ευρύ φάσμα των λειτουργιών του ανοσιακού συστήματος μέσω ποικίλων μηχανισμών. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η δράση συγκεκριμένων στελεχών προβιοτικών πιθανά να οφείλεται όχι μόνο σε έναν, αλλά σε συνδυασμό διαφορετικών μηχανισμών [48] Ασφάλεια των προβιοτικών Τα οξυγαλακτικά βακτήρια (LAB) παρουσιάζουν μια μακρόχρονη ιστορία ασφαλούς χρήσης αφού καταναλώνονται καθημερινά από τότε που οι άνθρωποι 20

21 άρχισαν να χρησιμοποιούν το ζυμωμένο γάλα ως τρόφιμο. Ωστόσο η έννοια της ασφάλειας με τα σημερινά δεδομένα είναι περισσότερο πολύπλοκη. Έτσι, η ασφάλεια τους μελετήθηκε σε διάφορες κλινικές μελέτες, οι οποίες γενικά δεν έδειξαν επιβλαβείς επιδράσεις από λακτοβάκιλλους και Bifidobacteria [61]. Στελέχη λακτοβακίλλων έχουν χορηγηθεί κατά τη διάρκεια κλινικών μελετών σε βρέφη, σε παιδιά με αλλεργία, σε υγιή παιδιά και σε ηλικιωμένα άτομα, χωρίς ποτέ να αναφερθούν παρενέργειες [62]. Σύμφωνα με τους Salminen et al.[60], κάθε νέο προβιοτικό σκέυασμα πρέπει να πληροί τα ακόλουθα: (1) Ο παραγωγός που βγάζει το προϊόν στο εμπόριο να έχει την απόλυτη ευθύνη για την ασφάλεια. Τα προβιοτικά τρόφιμα θα πρέπει να είναι τόσο ασφαλή όσο και τα υπόλοιπα τρόφιμα. (2) Όταν το προβιοτικό τρόφιμο είναι νέας σύνθεσης, πρωτοεμφανιζόμενο στην αγορά, θα πρέπει να λάβει την κατάλληλη νομοθετική έγκριση (κατευθυντήρια οδηγία της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τα νεοφανή τρόφιμα). (3) Όταν ένα στέλεχος παρουσιάζει μακροχρόνια ιστορία ασφαλούς χρήσης, θα είναι ασφαλές και ως προβιοτικό στέλεχος και δε θα θεωρηθεί ως νεοφανές τρόφιμο. (4) Η καλύτερη δοκιμή για την ασφάλεια, είναι μια καλά τεκμηριωμένη πορεία ασφαλούς χρήσης - κατανάλωσης από τον άνθρωπο. Συνεπώς, όταν ένα στέλεχος ανήκει σε ένα είδος για το οποίο δεν έχει αναφερθεί ότι είναι παθογόνο, και για το οποίο άλλα στελέχη εμφανίζονται στην ιστορία ως ασφαλή, τότε πιθανόν το στέλεχος αυτό να είναι ασφαλές ως προβιοτικό στέλεχος και δε θα θεωρηθεί ως νεοφανές τρόφιμο. (5) Όταν ένα στέλεχος ανήκει σε ένα είδος για το οποίο δεν έχουν αναφερθεί παθογόνα στελέχη αλλά δεν αναφέρεται στην ιστορία ως ασφαλές, μπορεί να είναι ασφαλές ως προβιοτικό στέλεχος αλλά θα πρέπει να θεωρηθεί νεοφανές τρόφιμο, και συνεπώς θα πρέπει να υποβληθεί στην αντίστοιχη αξιολόγηση. (6) Όταν ένα νέο στέλεχος ανήκει σε ένα είδος το οποίο είναι γνωστό ότι περιέχει παθογόνα στελέχη, θα θεωρηθεί ως νεοφανές τρόφιμο. (7) Για να περιγραφεί ένα προβιοτικό στέλεχος απαιτείται υψηλότατο επίπεδο ταξινόμησης. Σήμερα αυτό περιλαμβάνει υβριδισμό DNA-DNA και προσδιορισμό της αλληλουχίας του rrna. 21

22 (8) Σε σχέση με την παράγραφο (1) στελέχη τα οποία μεταφέρουν μεταδιδόμενα γένη με αντιβιοτική αντίσταση, δηλαδή γένη με κωδικοποιημένες πρωτεΐνες οι οποίες απενεργοποιούν τα αντιβιοτικά, δεν θα πρέπει να κυκλοφορούν στο εμπόριο. (9) Στελέχη τα οποία δεν έχουν ταξινομηθεί κανονικά, όπως δηλαδή περιγράφεται με βάση τις προσεγγίσεις που αναφέρονται μετά την παράγραφο (Ί), δε θα πρέπει να κυκλοφορούν στο εμπόριο. Τα στελέχη θα πρέπει να βρίσκονται αποθηκευμένα σε μια διεθνώς αναγνωρισμένη συλλογή καλλιεργειών. Τέλος, είναι άστοχο να επιτρέπεται η χρήση του όρου προβιοτικά, χωρίς την ύπαρξη κατάλληλης κλινικής τεκμηρίωσης. Παρομοίως, είναι μη λειτουργικό για τα προϊόντα να μην έχουν τον κατάλληλο αριθμό ζώντων κυττάρων ως το τέλος της διάρκειας ζωής τους. Καθώς νέα προβιοτικά κάνουν την εμφάνισή τους, παράλληλα με γενετικά τροποποιημένους οργανισμούς (GMOs), και τα οποία προορίζονται για τη θεραπεία συγκεκριμένων ασθενειών, θα πρέπει να παρακολουθηθεί η πορεία τους για μεγάλο χρονικό διάστημα προκειμένου να διασφαλιστεί η ασφάλειά τους και στην περίπτωση των GMOs να έχουν το κατάλληλο περιβαλλοντικό περιεχόμενο. Θα πρέπει να διεξαχθούν περισσότερες κλινικές μελέτες, στις οποίες κατά προτίμηση θα πρέπει να γίνεται σύγκριση ενός προβιοτικού προϊόντος σε σχέση με ένα άλλο ή κατά το πρότυπο μιας συγκεκριμένης ιατρικής εφαρμογής. Με τον τρόπο αυτό θα προσδιοριστούν οι δυνατότητες αλλά και οι περιορισμοί των προβιοτικών [61] Παρενέργειες, κίνδυνοι και μειονεκτήματα της χρήσης προβιοτικών Γενικά μεταξύ των υγιών πληθυσμών, η κατανάλωση Bifidobacteria, λακτοβακίλλων και άλλων παραγόντων που χρησιμοποιούνται στα ζυμούμενα γαλακτοκομικά προϊόντα γίνεται χωρίς να υπάρχουν παρενέργειες. Μέχρι σήμερα, οι υπάρχουσες κλινικές μελέτες δεν οδήγησαν σε αποδείξεις κινδύνου καμιάς από αυτές τις περιπτώσεις. Όμως, ασθένειες με S. boulardii και S. cerevisiae φαίνεται ότι προκύπτουν σε ασθενείς με υποκείμενες διαταραχές. Ο S. boulardii έχει απομονωθεί από το αίμα τουλάχιστον δύο ασθενών [63]. Εδώ θα πρέπει να αναφερθεί ότι: (α) Όλες οι περιπτώσεις επιμόλυνσης με προβιοτικά που έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα παρατηρήθηκαν σε άτομα με υποκείμενες νόσους, κυρίως μηχανικες καρδιακές βαλβίδες για τις ενδοκαρδίτιδες και συνθήκες ανοσοκαταστολής σε άλλες περιπτώσεις. (β) Δεν έχει παρατηρηθεί καμία περίπτωση επιμόλυνσης με προβιοτικά σε κατά τα άλλα υγιή άτομα ή έγκυες γυναίκες. 22

23 (γ) Δεν έχει παρατηρηθεί καμία περίπτωση σε άτομα που εργάζονται με προβιοτικά ή που εκτίθενται σε υψηλότερους αριθμούς προβιοτικών σε σχέση με το σύνολο του πληθυσμού [64]. 2. Τα στελέχη Lactobacillus ως προβιοτικοί μικροοργανισμοί 2.1. Το γένος Lactobacillus Τα Lactobacillus ανήκουν στην ομάδα των βακτηρίων του γαλακτικού οξέος (lactic acid bacteria-lab), μία ετερογενή ομάδα μικροοργανισμών που χρησιμοποιούν υδατάνθρακες ως πηγή ενέργειας και παράγουν γαλακτικό οξύ ως αποκλειστικό ή κύριο προϊόν των ζυμωτικών μεταβολικών διεργασιών τους. Τα βακτήρια του γένους Lactobacillus είναι Gram-θετικοί, κοκκιόμορφοι ή ραβδόμορφοι, μη σπορογόνοι και προαιρετικά αναερόβιοι μικροοργανισμοί [65]. Χρησιμοποιούνται ευρύτατα στην παρασκευή τροφίμων και το γεγονός τόσο του μακροχρόνιου ιστορικού της ασφαλούς χρήσης τους, όσο και η παρουσία τους στην εντερική μικροχλωρίδα του ανθρώπου, τα έχει καταστήσει γενικώς αποδεκτά ως ασφαλή. Το γένος περιλαμβάνει 106 είδη που εμφανίζουν ποικιλία βιοχημικών και φαινοτυπικών γνωρισμάτων και χαρακτηρίζονται από μεγάλη ετερογένεια [66,67]. Η ταξινόμηση των στελεχών του γένους Lactobacillus στο επίπεδο του είδους εμφανίζεται περίπλοκη. Μέχρι πρόσφατα η διάκριση μεταξύ των ειδών των Lactobacillus πραγματοποιούνταν βάσει των φαινοτυπικών τους ιδιοτήτων (π.χ. πρότυπο ζύμωσης των υδατανθράκων, μορφολογία, ανάπτυξη σε συγκεκριμένες θερμοκρασίες) οι οποίες, αν και αναγνωρίζονται ως σημαντικά εργαλεία, παρουσιάζουν περιορισμούς ως προς την ακρίβεια, την επαναληψιμότητα και τη διακριτική τους ικανότητα. [66,68]. Αν και οι σύγχρονες μοριακές μέθοδοι όπως ο DNA-DNA υβριδισμός, η ανάλυση γονιδίων ριβοσωμικού RNA, η RAPD-PCR και η PFGE ανάλυση παρέχουν αξιόπιστη ταξινόμηση και ταυτοποίηση των Lactobacillus στο επίπεδο του είδους και του στελέχους, η φυλογενετική δομή του γένους παραμένει ασαφής. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για την ομάδα του L. casei, η οποία περιλαμβάνει αρκετά προβιοτικά βακτήρια. [69] Τα στελέχη Lactobacillus ως μέλη της φυσιολογικής εντερικής χλωρίδας. Ο μεταβολισμός και η φυσιολογία των βακτηρίων του γαλακτικού οξέος αντανακλούν εξελικτικούς μηχανισμούς προσαρμογής σε περιβάλλοντα πλούσια σε θρεπτικά συστατικά και πηγές ενέργειας. Για αυτόν το λόγο, τα βακτήρια του γαλακτικού οξέος, συμπεριλαμβανομένων των Lactobacillus, απαντώνται συνήθως σε 23

24 τρόφιμα (γαλακτοκομικά προϊόντα, λαχανικά, χυμούς), σε φυτικά υλικά καθώς και στον αναπνευστικό, ουρογεννητικό και γαστρεντερικό σωλήνα των ζώων[66]. Τα τελευταία χρόνια, τα είδη του γένους Lactobacillus που αποτελούν μέλη της ανθρώπινης εντερικής χλωρίδας έχουν γίνει αντικείμενο έντονης ερευνητικής δραστηριότητας λόγω των ευεργετικών για την υγεία του ξενιστή ιδιοτήτων τους και της εμπορικής τους χρήσης σε προβιοτικά προϊόντα. Οι γαλακτοβάκιλλοι συναντώνται σε διάφορες θέσεις του γαστρεντερικού σωλήνα (στομάχι, λεπτό έντερο, παχύ έντερο) και συνήθως σε μικρούς αριθμούς μια και αποτελούν περίπου το 0,01% έως 0,6% του συνολικού αριθμού των μικροοργανισμών της γαστρεντερικής μικροχλωρίδας [70]. Συγκριτικά με τη εντερική μικροχλωρίδα των ενήλικων ανθρώπων, η αντίστοιχη των βρεφών εμφανίζεται περισσότερο ασταθής. Ο αριθμός των Lactobacillus στα κόπρανα νεογέννητων προσδιορίστηκε σε περίπου 10 5 CFU/g, ενώ σε βρέφη ενός μηνός ή μεγαλύτερα ο αριθμός τους κυμαίνεται από10 6 έως10 8 CFU/g κοπράνων [71]. Με τη χρήση μοριακών τεχνικών έχουν ανιχνευθεί ως τώρα 17 είδη Lactobacillus που σχετίζονται με το γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου (Πίνακας 3). Ωστόσο, τα δεδομένα των ερευνών που αφορούν την προέλευση τους υποδεικνύουν ότι πολλά από τα παραπάνω είδη αποτελούν ετερόχθονα και όχι αυτόχθονα μέλη της μικροβιακής κοινότητας του εντέρου. Συγκεκριμένα, ως πρόσφατα, είδη όπως τα L. acidophilus, L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus, L. delbrueckii, L. brevis, L. johnsonii, L. plantarum, και L. fermentum δεν έχει παρατηρηθεί να σχηματίζουν σταθερούς πληθυσμούς στο έντερο. Τα περισσότερα από αυτά εμφανίζουν σταθερούς πληθυσμούς στη στοματική κοιλότητα και περιέχονται σε ζυμουμένα τρόφιμα, γεγονός που υποστηρίζει την παραπάνω άποψη [72] Μηχανισμοί δράσης των Lactobacillus Οι μηχανισμοί της ευεργετικής δράσης των Lactobacillus ανήκουν σε μία από τις παρακάτω, συχνά αλληλεπικαλυπτόμενες, κύριες κατηγορίες: 1) αναστολή των παθογόνων μικροοργανισμών και αποκατάσταση της ομοιόστασης της εντερικής χλωρίδας, 2) ενίσχυση της λειτουργίας του επιθηλιακού φραγμού και 3) ρύθμιση της απόκρισης του ενδογενούς και επίκτητου ανοσιακού συστήματος. Η ικανότητα των Lactobacillus να αναστέλλουν τους παθογόνους μικροοργανισμούς, είναι ευρέως γνωστή, μια και χρησιμοποιούνται εδώ και αιώνες για τη συντήρηση των τροφίμων για την αποτροπή των μικροβιακών αλλοιώσεων τους. Επίσης, τα τελευταία χρόνια, έχει διερευνηθεί εντατικά και έχει τεκμηριωθεί η ανοσοενισχυτική και 24

25 ανοσορυθμιστική δράση των Lactobacillus καθώς και η ιδιότητα τους να ενισχύουν το βλεννογόνιο εντερικό φραγμό ενάντια σε παθογόνους μικροοργανισμούς και τοξίνες. Οι προβιοτικές ιδιότητες των Lactobacillus χαρακτηρίζουν συγκεκριμένα στελέχη και δεν μπορούν να αποτελέσουν γενικευμένο γνώρισμα του γένους: διαφορετικά στελέχη παρουσιάζουν διαφορετικές προβιοτικές ιδιότητες που καθορίζονται από την ικανότητα τους να εκφράζουν συγκεκριμένα επιφανειακά μόρια ή να εκκρίνουν πρωτεΐνες και μεταβολίτες που αλληλεπιδρούν άμεσα ή έμμεσα με τον ξενιστή. Πίνακας 2 Τα είδη των Lactobacillus που ανιχνεύονται συχνά στα κόπρανα, στην σίελο και στην τροφή των ανθρώπων. Είδος Κόπρανα L. acidophilus + + Στοματική κοιλότητα Τροφή L. crispatus + + L. gasseri L. johnsonii + L. salivarius + + L. ruminis + + L. casei L.paracasei L. rhamnosus L. plantarum L. reuteri + + L. fermentum + + L. brevis L. delbruecki + + L. sakei + + L. vaginalis + L. curvatus Έτσι, αναγνωρίζονται συγκεκριμένοι μεταβολικοί και δομικοί παράγοντεςχαρακτηριστικά των Lactobacillus που σχετίζονται με τις προβιοτικές τους δράσεις και οι οποίοι εμπίπτουν σε δύο κύριες κατηγορίες, που συχνά είναι δύσκολο να διακριθούν: α) παράγοντες που καθορίζουν άμεσα τις ευεργετικές για την υγεία ιδιότητες των Lactobacillus (probiotic factors-προβιοτικοί παράγοντες) και β) παράγοντες που συνεισφέρουν στις ιδιότητες αυτές χωρίς οι ίδιοι να ασκούν άμεση επίδραση, αλλά επιτρέπουν την προσαρμογή των Lactobacillus προάγοντας την 25

26 επιβίωση τους και τον αποικισμό του ξενιστή (adaptation factors-παράγοντες προσαρμογής) [73] Ο ρόλος των χαρακτηριστικών της κυτταρικής επιφάνειας (cell surface traits) των Lactobacillus Η ικανότητα προσκόλλησης των Lactobacillus καθώς και συγκεκριμένα δομικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της κυτταρικής τους επιφάνειας, όπως η ιδιότητα της αυτοσυσσωμάτωσης [74], η υδροφοβία [75], η παρουσία των πρωτεϊνών της κυτταρικής επιφανειακής στιβάδας [76] και η παραγωγή εξωπολυσακχαριτών [77] αναγνωρίζονται ως βασικοί παράγοντες που εμπλέκονται στην ανοσοτροποποιητική δράση των Lactobacillus Ικανότητα προσκόλλησης Η ικανότητα της προσκόλλησης στα επιθηλιακά κύτταρα θεωρείται ότι αποτελεί μία σημαντική ιδιότητα των προβιοτικών μικροοργανισμών και ο χαρακτηρισμός αρκετών Lactobacillus ως υποψήφια προβιοτικά στελέχη βασίζεται σε αυτήν [78]. Η αυξημένη ικανότητα προσκόλλησης θεωρείται ότι παρέχει στα βακτηριακά στελέχη μεγαλύτερες πιθανότητες επιβίωσης και αποικισμού στους βλεννογόνους του ξενιστή, διότι επάγει την τροποποίηση της ανοσοαπόκρισης και την προστασία των επιθηλιακών κυττάρων και ενισχύει τον αποκλεισμό των παθογόνων μικροοργανισμών, διατηρώντας την ισορροπία της εντερικής μικροχλωρίδας [79,80]. Η βακτηριακή προσκόλληση αποτελεί μία διαδικασία που επιτελείται σε πολλαπλά στάδια και στην οποία συμμετέχουν τόσο μη ειδικοί, όσο και ειδικοί υποδοχείς μορίων προσκόλλησης [81]. Σύμφωνα με πρόσφατες έρευνες, η προσκόλληση των Lactobacillus στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα εξαρτάται από πρωτεϊνικούς και υδατανθρακικούς παράγοντες της επιφανειάς τους, όπως οι πρωτεΐνες της S-στιβάδας και οι εξωπολυσακχαρίτες (EPS) [55,82]. Η διαδικασία της προσκόλλησης περιλαμβάνει επίσης αντιστρεπτές και μη αντιστρεπτές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των βακτηριακών κυττάρων και της επιφάνειας προσκόλλησης. Το αρχικό και εν δυνάμει αντιστρέψιμο στάδιο της προσκόλλησης πραγματοποιείται μέσω πολύπλοκων φυσικοχημικών αλληλεπιδράσεων, οι οποίες καθορίζονται και από την υδροφοβία της επιφάνειας του βακτηριακού κυττάρου [82]. Η ικανότητα προσκόλλησης των Lactobacillus φάνηκε σε in vitro πειραματικές δοκιμές σε Caco-2 ή HT-29 επιθηλιακά κύτταρα [83]. Ωστόσο, στα περισσότερα φυσικά περιβάλλοντα τα προσκολλημένα βακτήρια οργανώνονται με τη μορφή πολυκύτταρων συσσωματωμάτων, δομές που αναγνωρίζονται ως βιομεμβράνες (biofilms) [84], οι οποίες σχετίζονται με την 26

27 προστατευτική δράση που ασκούν αυτά στον ουρογεννητικό και γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου [85] Η ιδιότητα της αυτοσυσσωμάτωσης Ορισμένα βακτηριακά στελέχη παρουσιάζουν την τάση να σχηματίζουν συσσωματώματα κατά την ανάπτυξή τους σε υγρά υποστρώματα. Η ιδιότητα αυτή παρατηρείται συχνά σε στελέχη του γένους Lactobacillus, συνδέεται θετικά με την αυξημένη ικανοτητά τους να αποικίζουν τον γαστρεντερικό σωλήνα και να ρυθμίζουν την ισορροπία της εντερικής μικροχλωρίδας καθώς και με την ανοσοτροποποιητική τους δράση. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η ικανότητα της αυτοσυσσωμάτωσης συνδυάζεται και με αυξημένη in vitro ικανότητα προσκόλλησης [74,78, 86] Επιφανειακή υδροφοβία Η υδροφοβία καθορίζει τις ελκτικές δυνάμεις προσκόλλησης των βακτηρίων σε διάφορες επιφάνειες και επηρεάζει την αυτοσυσσωμάτωση τους, αποτελώντας ένα από τα κύρια φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της επιφάνειας των μικροβιακών κυττάρων [81,87] η οποία εκδηλώνεται ακόμα και ανάμεσα σε στενά συγγενικά στελέχη [83,88]. Η παρουσία (γλυκο-) πρωτεϊνών στην κυτταρική επιφάνεια σχετίζεται θετικά με την υδροφοβία, σε αντίθεση με τους πολυσακχαρίτες οι οποίοι αυξάνουν την υδροφιλία της κυτταρικής επιφάνειας [87] Πρωτεΐνες της S-στιβάδας Σε αρκετά είδη του γένους Lactobacillus, όπως τα L. acidophilus, L. helveticus, L. casei, L. brevis, L. buchneri, L. fermentum, L. bulgaricus και L. plantarum εμφανίζεται ως τυπική δομή μία στιβάδα (surface layer, S-στιβάδα) που καλύπτει την επιφάνεια των κυττάρων τους και αποτελείται από υπομονάδες μιας μικρού μεγέθους (γλυκό-) πρωτεΐνης, με μοριακή μάζα 40 ως 55 kda, με σταθερή τριτοταγή δομή οι οποίες ενώνονται με το τοίχωμα των βακτηριακών κυττάρων με μη ομοιοπολικούς δεσμούς [89,90,91]. Η S-στιβάδα εμπλέκεται σε ποικίλες διαφορετικές λειτουργίες του βακτηριακού κυττάρου, δρώντας ως προστατευτικό περίβλημα, ως μοριακό κόσκινο, ως παγίδα ιόντων και ως παράγοντας μολυσματικότητας. Αναφορικά με το ρόλο της S-στιβάδας στον τρόπο δράσης των Lactobacillus, έχει προταθεί ότι οι πρωτεΐνες της S-στιβάδας λειτουργώντας ως ειδικές προσκολλητίνες, εμπλέκονται στη διαδικασία της προσκόλλησης των βακτηριακών κυττάρων σε επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπου. Επιπρόσθετα, πρόσφατα δεδομένα προτείνουν ότι οι πρωτεΐνες της S-στιβάδας των στελεχών του γένους, όπως του L. acidophilus NCFM, δρουν άμεσα ως προβιοτικοί 27

28 παράγοντες που εμπλέκονται στη ρύθμιση της λειτουργίας των δενδριτικών και Τ κυττάρων [82,91,92] Εξωπολυσακχαρίτες (EPS) Οι εξωπολυσακχαρίτες είναι εξωκυτταρικά πολυμερή υψηλού μοριακού βάρους που αποτελούνται από διακλαδιζόμενες και επαναλαμβανόμενες μονάδες, κυρίως γλυκόζης, γαλακτόζης και ραμνόζης ή παραγώγων αυτών των σακχάρων. Εκκρίνονται στον εξωκυτταρικό χώρο κατά τη διάρκεια της μικροβιακής ανάπτυξης και δεν συνδέονται μόνιμα με την επιφάνεια του κυττάρου [93]. Οι EPS των Lactobacillus συνιστούν πολύπλοκες δομές που διαφέρουν όχι μόνο ως προς τη φύση των μονομερών των σακχάρων από τα οποία αποτελούνται, αλλά και στον τρόπο που αυτά συνδέονται και διακλαδίζονται, συνεισφέροντας έτσι στη μεγάλη δομική ποικιλομορφία που παρουσιάζουν τα κυτταρικά τοιχώματα των στελεχών του γένους [94]. Αναγνωρίζονται ως παράγοντες που επηρεάζουν την ικανότητα προσκόλλησης και το σχηματισμό βιομεμβρανών, ενώ σύμφωνα με τα αποτελέσματα αρκετών πειραματικών ερευνών θεωρείται ότι εμπλέκονται στην ανοσοτροποποιητική δράση των Lactobacillus, όπως τον πολλαπλασιασμό των Τ-λεμφοκυττάρων, την ενεργοποίηση των μακροφάγων και την επαγωγή της παραγωγής κυτταροκινών [77,95,96]. 3. ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΙΚΟΥ ΣΩΛΗΝΑ Ο βλεννογόνος του γαστρεντερικού σωλήνα αποτελεί μείζονα διαχωριστική επιφάνεια μεταξύ του εσωτερικού και εξωτερικού περιβάλλοντος. Για χρόνια εθεωρείτο ότι ο βασικός του λειτουργικός προορισμός ήταν η απορρόφηση θρεπτικών για τον οργανισμό ουσιών, παραβλέποντας την συμμετοχή του σε διαφόρους παθογόνους καταστάσεις. Τις τελευταίες δεκαετίες όμως έχει τεκμηριωθεί η συμμετοχή του εντερικού βλεννογόνου σε παραγωγή ορμονών και η δράση του ως ανοσολογικού ρυθμιστή και μείζονος λειτουργικού φραγμού [97,98]. Η ικανότητα του εντερικού βλεννογόνου να διαχωρίζει επιλεκτικά τα βλαπτικά συστατικά του εξωτερικού (ενδοαυλικού) περιβάλλοντος περιγράφεται υπό τον όρο «βλεννογόνιος εντερικός φραγμός (ΒΕΦ)», η επάρκεια ή οι μεταβολές του οποίου αποτελούν ζωτικής σημασίας παράγοντα σε ποικίλες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Η βακτηριακή μετακίνηση (ΒΤ), είναι αποτέλεσμα διαταραχής της ανατομικής και 28

29 λειτουργικής ακεραιότητας του εντερικού βλεννογόνου, της ανοσολογικής του κατάστασης και της φυσιολογικής εντερικής χλωρίδας [99]. Στο λεπτό έντερο ολοκληρώνεται η διαδικασία της πέψης και τα προϊόντα της πέψης απορροφώνται. Το λεπτό έντερο είναι σχετικά μακρύ -περίπου 5 μέτρα - και επιτρέπει την παρατεταμένη επαφή τόσο μεταξύ της τροφής και των πεπτικών ενζύμων όσο και μεταξύ των προϊόντων που έχουν ήδη υποστεί πέψη και των απορροφητικών κυττάρων του καλυπτήριου επιθηλίου. Το λεπτό έντερο αποτελείται από τρία τμήματα: το δωδεκαδάκτυλο, τη νήστιδα και τον ειλεό. Αυτά τα 3 τμήματα έχουν πολλά κοινά χαρακτηριστικά και θα συζητηθούν μαζί Ο Βλεννογόνος του Λεπτού Εντέρου Σε γενικές γραμμές το επένδυμα του λεπτού εντέρου παρουσιάζει μια σειρά μόνιμων πτυχών, τις κυκλικές πτυχές ή βαλβίδες του Kerckring, οι οποίες αποτελούνται από βλεννογόνο και υποβλεννογόνια στοιβάδα και έχουν ημισεληνοειδές, κυκλικό ή ελικοειδές σχήμα. Οι πτυχές είναι πιο αναπτυγμένες στη νήστιδα και κατά συνέπεια αποτελούν ένα χαρακτηριστικό της. Αν και απαντώνται συχνά στο 12δάκτυλο και στον ειλεό, όμως δεν αποτελούν σημαντικό χαρακτηριστικό αυτών των τμημάτων του λεπτού εντέρου. Κάτω από μεγέθυνση φαίνονται οι εντερικές λάχνες. Αυτές οι δομές έχουν μήκος 0,5-1,5 χιλ. και πάχος 0,1 χιλ. Είναι προσεκβολές του βλεννογόνου (επιθήλιο και χόριο) που προβάλλουν στον αυλό του λεπτού εντέρου. Στο δωδεκαδάκτυλο έχουν φυλλοειδές σχήμα και σταδιακά φτάνοντας στον ειλεό αποκτούν δακτυλιοειδές σχήμα. Ένα mm 2 βλεννογόνου του δωδεκαδάκτυλου και της νήστιδας μπορεί να έχει μέχρι και 40 εντερικές λάχνες, οι όποιες αυξάνουν την επιφάνεια του βλεννογόνου 5 έως 6 φορές (συνολικά περίπου 4 m2). Μεταξύ των λαχνών υπάρχουν μικρά ανοίγματα απλών σωληνοειδών αδένων που ονομάζονται εντερικοί αδένες (κρύπτες ή αδένες Lieberkuhn), που είναι καταδύσεις του επιθηλίου μέσα στο χόριο, μεταξύ των λαχνών, βάθους μ. Η κύρια λειτουργία του επιθηλίου των κρυπτών είναι η δυναμική διαδικασία της αναγέννησης του εντερικού επιθηλίου (λαχνών και κρυπτών). Παρατηρούνται συχνές μιτώσεις με αποτέλεσμα να υπάρχουν επιθηλιακά κύτταρα σε ποικίλα στάδια διαφοροποίησης, τα οποία βαθμιαία μεταναστεύουν από τον πυθμένα των εντερικών κρυπτών προς την επιφάνεια των λαχνών. Τα κύτταρα αυτά αναγεννιούνται κάθε πέντε ημέρες, φαινόμενο που αποτελεί έναν από τους ταχύτερους ρυθμούς αναγέννησης 29

30 κυττάρων του σώματος. Στις κρύπτες απαντώνται πέντε είδη κυττάρων με διαφορετική λειτουργική διαφοροποίηση : Τα αδιαφοροποίητα κυλινδρικά κύτταρα, που βρίσκονται στον πυθμένα των κρυπτών και είναι υπεύθυνα για την αναγέννηση των άλλων κυττάρων των κρυπτών και των λαχνών Τα κύτταρα του Paneth τα οποία βρίσκονται μόνο στις εντερικές κρύπτες και κυρίως στη βάση (πυθμένα) τους. Είναι οξεόφιλα κύτταρα με μεγάλη συγκέντρωση ψευδαργύρου. Περιέχουν λυσοζύμη και άλλα πρωτεολυτικά ένζυμα, ανοσοσφαιρίνες, ενώ έχουν και φαγοκυτταρική ικανότητα. Έχουν έντονη ενζυματική δραστηριότητα και γι αυτό θεωρείται ότι το σύνολο των κυττάρων αυτών αποτελούν έναν εξωκρινή αδένα. Τα αργυρόφιλα ή ωχρά κύτταρα του Kultschitzky. Πιστεύεται ότι παράγουν και εκκρίνουν σεροτονίνη, που ερεθίζει τις λείες μυϊκές ίνες της μυϊκής στιβάδας του εντέρου με αποτέλεσμα να αυξάνει η κινητικότητά του. Τα καλυκοειδή ή λαγηνοειδή κύτταρα (Goblet cells). Είναι λιγότερο άφθονα στο δωδεκαδάκτυλο και αυξάνουν σε αριθμό όπως προσεγγίζουν τον ειλεό. Αυτά τα κύτταρα διακρίνονται εύκολα τόσο από το χαρακτηριστικό σχήμα τους (καλαθοειδές) όσο και από το περιεχόμενό τους (άφθονο και διαυγές κυτταρόπλασμα). Ο αριθμός τους αυξάνει βαθμιαία προς το ουραίο τμήμα του λεπτού εντέρου. Παράγουν όξινες γλυκοπρωτείνες που η κύρια λειτουργία τους είναι να επαλείφουν και να λιπαίνουν την επένδυση του εντέρου. Τα απορροφητικά κύτταρα είναι υψηλά κυλινδρικά κύτταρα γύρω στα 25 μm ύψος x 8-10 μm πλάτος, με ωοειδή πυρήνα στο κάτω ήμισυ του κυττάρου. Στην κορυφαία επιφάνεια κάθε κυττάρου υπάρχει μια ομοιογενής στοιβάδα που καλείται γραμμωτή (ψηκτροειδής) παρυφή. 30

31 Εικ. 1: Σχηματική απεικόνιση της δομής του λεπτού εντέρου έντερου σε μικρή μεγέθυνση όπου φαίνεται και η πορεία που ακολουθούν κατά την διάρκεια της ζωής τους τα επιθηλιακά κύτταρα. Με τη βοήθεια του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου η γραμμωτή παρυφή φαίνεται να είναι μια στοιβάδα πυκνά συναθροισμένων μικρολαχνών. Κάθε μικρολάχνη αποτελεί μια κυλινδρική προεξοχή της κορυφής του κυτταροπλάσματος και συνίσταται από κυτταρική μεμβράνη που περικλείει ένα σκελετό κυρίως από ινίδια ακτίνης. Εικ. 2: Εντερική λάχνη Εικ. 3: Εντερικός αδένας (κρύπτη ή αδένας Lieberkuhn) 31

32 Κάθε μικρολάχνη έχει περίπου 1 μm ύψος x 0,1 μm διάμετρο. Υπολογίζεται ότι κάθε απορροφητικό κύτταρο έχει κατά μέσο όρο 3000 μικρολάχνες και ότι 1 τετραγωνικό χιλιοστό βλεννογόνου περιέχει γύρω στα 200 εκατομμύρια απ' αυτές τις δομές. Οι μικρολάχνες επιτελούν σημαντική φυσιολογική λειτουργία, γιατί αυξάνουν σε αξιοσημείωτο βαθμό την περιοχή επαφής μεταξύ της εντερικής επιφάνειας και της τροφής. Με μελέτες που έχουν γίνει, απομονώνοντας τη γραμμωτή παρυφή αυτών των κυττάρων με διαφορική φυγοκέντρηση και στη συνέχεια χρησιμοποιώντας μεθόδους ανοσοφθορισμού, συμπεραίνεται ότι η γραμμωτή παρυφή είναι η περιοχή δραστηριότητας των δισακχαριδασών του λεπτού εντέρου. Αυτά τα ένζυμα που συνδέονται με τις μικρολάχνες υδρολύουν τους δισακχαρίτες σε μονοσακχαρίτες οι οποίοι εύκολα απορροφώνται. Εχουν περιγραφεί ανεπάρκειες αυτών των δισακχαριδασών σε ανθρώπινες ασθένειες που χαρακτηρίζονται από πεπτικές διαταραχές. Μερικές από τις ενζυμικές ανεπάρκειες φαίνεται πως έχουν γενετική προέλευση. Ανάλογη ενζυμική εντόπιση έχει προταθεί για τις διπεπτιδάσες που υδρολύουν τα διπεπτίδια στα συστατικά τους που είναι τα αμινοξέα. Μια πιο σημαντική λειτουργία των κυλινδρικών εντερικών κυττάρων είναι η απορρόφηση των μεταβολιτών που προέρχονται από τη λειτουργία της πέψης. Τα Μ κύτταρα (βλεννογόνια επιθηλιακά), είναι εξειδικευμένα επιθηλιακά κύτταρα που επικαλύπτουν τα λεμφοζίδια των κηλίδων του Peyer. Είναι σχετικά επίπεδα κύτταρα των οποίων οι κορυφαίες επιφάνειες προβάλλουν σαν μικρές πτυχές μάλλον παρά σαν μικρολάχνες. Τα Μ κύτταρα ενδοκυτταρώνουν αντιγόνα και τα μεταφέρουν στα υποκείμενα λεμφικά κύτταρα, απ' όπου μπορεί να ξεκινήσει η ανοσολογική απόκριση στα ξένα αντιγόνα Το Χόριο μέχρι τον Ορογόνο Το χόριο του λεπτού εντέρου αποτελείται από χαλαρό συνδετικό ιστό με αιμοφόρα και λεμφοφόρα αγγεία, νευρικές ίνες και λεία μυϊκά κύτταρα.ακριβώς κάτω από το βασικό υμένα υπάρχει μια στοιβάδα λεμφικών κυττάρων και μακροφάγων, που σχηματίζουν ένα ανοσολογικό φραγμό σ' αυτή την περιοχή. Το χόριο εισχωρεί στο κεντρικό σημείο των εντερικών λαχνών, φέροντας μαζί αιμοφόρα και λεμφοφόρα αγγεία, νεύρα, συνδετικό ιστό και λεία μυϊκά κύτταρα. Αυτά τα τελευταία είναι υπεύθυνα τις ρυθμικές κινήσεις των λαχνών, οι οποίες είναι σημαντικές για την απορρόφηση. 32