ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΧΡΙΣΤΟ ΟΥΛΟΥ ΕΛΕΝΗΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ Α.Π.Θ.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΧΡΙΣΤΟ ΟΥΛΟΥ ΕΛΕΝΗΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ Α.Π.Θ. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟ ΩΝ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΑΦΟΡΑ ΕΙΓΜΑΤΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΣΕ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ. Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΧΡΙΣΤΟΔΟΥΛΟΥ ΕΛΕΝΗΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ Α.Π.Θ. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΣΕ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, του τομέα ΦΑΠΧ, του Τμήματος Χημείας Α.Π.Θ. Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης 4 Μαρτίου 2008 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Ιωάννης Παπαδογιάννης, Καθηγητής ΑΠΘ (μέλος συμβουλευτικής επιτροπής). 2. Παναγιώτης Νικήτας, Καθηγητής ΑΠΘ. 3. Εμμανουήλ Γεωργαράκης, Καθηγητής ΑΠΘ. 4. Αδριανή Παππά-Λουίζη, Αναπλ. Καθηγήτρια, ΑΠΘ. 5. Βικτωρία Σαμανίδου, Επίκ. Καθηγήτρια, ΑΠΘ (επιβλέπουσα καθηγήτρια). 6. Γεώργιος Θεοδωρίδης Επίκ. Καθηγητής ΑΠΘ (μέλος συμβουλευτικής επιτροπής). 7. Αριστείδης Ανθεμίδης Επίκ. Καθηγητής ΑΠΘ.

3

4

5 Ελένη Α. Χριστοδούλου Α.Π.Θ Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης, για τον προσδιορισμό κινολονών σε διάφορα δείγματα τροφίμων ζωικής προέλευσης και σε φαρμακευτικά σκευάσματα. ISBN «Η έγκριση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν.5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2)

6 Στη µνήµη του πατέρα µου

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Αφορµή για την ενασχόληση µε το συγκεκριµένο θέµα, στην παρούσα διατριβή, είναι το συνεχώς αυξανόµενο πρόβληµα της ανάπτυξης της µικροβιακής αντοχής, µε την ολοένα και αυξανόµενη χρήση των αντιβιοτικών στην ιατρική και στην κτηνιατρική. Οι κινολόνες αποτελούν µια από τις σηµαντικότερες κατηγορίες των αντιβιοτικών των τελευταίων δεκαετιών, µε ευρύ φάσµα δράσης για την αντιµετώπιση ασθενειών, στους ανθρώπους και στα ζώα. Το γεγονός ότι η οµάδα των κινολονών αριθµεί δεκάδες διαφορετικές ενώσεις µαρτυρά πως πρόκειται για µια κατηγορία αντιβιοτικών ιδιαίτερα σηµαντική για την εξέλιξη της ανθρωπότητας. Στη διατριβή αυτή γίνεται αναλυτική προσέγγιση του θέµατος, για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισµό µιας οµάδας δέκα κινολονών, µε τη χρήση της Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Πίεσης. Η χρήση των ενόργανων µεθόδων ανάλυσης εξασφαλίζει ιδιαίτερα χαµηλά όρια ανίχνευσης, επαναλήψιµα αποτελέσµατα και µικρούς σχετικά χρόνους ανάλυσης. Οι µέθοδοι της Υγρής Χρωµατογραφίας που αναπτύσσονται για ερευνητικούς σκοπούς στο πλαίσιο της διατριβής αυτής µπορούν να εφαρµοστούν µε επιτυχία για αναλύσεις ρουτίνας. Η διδακτορική διατριβή περιλαµβάνει το γενικό µέρος που καλύπτεται στα κεφάλαια 1 έως 10 και το πειραµατικό µέρος που καλύπτεται στα κεφάλαια 11 έως 16. Στο 1 ο κεφάλαιο του γενικού µέρους δίνονται πληροφορίες για την ανάπτυξη των αντιβιοτικών, τη δράση, τη χρήση και τις παρενέργειές τους. Στο 2 ο κεφάλαιο αναφέρονται οι σηµαντικότερες πληροφορίες για τις κινολόνες και στο 3 ο κεφάλαιο αναπτύσσεται σε συντοµία το θέµα της µικροβιακής αντοχής κυρίως σε σχέση µε τις κινολόνες. Στο 4 ο κεφάλαιο γίνεται ανασκόπηση της σχετικής νοµοθεσίας. Στα κεφάλαια 5 έως 8 περιγράφεται η αναλυτική τεχνική και η τεχνική της προκατεργασίας των δειγµάτων που χρησιµοποιήθηκαν και σε συντοµία αναπτύσσεται το θέµα της επικύρωσης των µεθόδων και της στατιστικής επεξεργασίας των αποτελεσµάτων. Στο 9 ο κεφάλαιο του γενικού µέρους παραθέτονται µε λεπτοµέρειες οι βιβλιογραφικές αναφορές που σχετίζονται µε το θέµα της διατριβής. Στο 10 ο κεφάλαιο γίνεται σύντοµη αναφορά στο σκοπό της διατριβής. Στο πειραµατικό µέρος γίνεται αναλυτική περιγραφή της πειραµατικής διαδικασίας που προηγήθηκε της διατριβής και εκτενής αναφορά στα αποτελέσµατα που προέκυψαν κατά την επικύρωση των αναπτυσσόµενων µεθόδων.

8 Στο 11 ο κεφάλαιο, το πρώτο κεφάλαιο του πειραµατικού µέρους, γίνεται αναφορά στον επιστηµονικό εξοπλισµό που χρησιµοποιήθηκε για την υλοποίηση της έρευνας της διατριβής. Περιλαµβάνεται αναφορά στα όργανα, στις συσκευές και στα χηµικά που χρησιµοποιήθηκαν. Στο 12 ο κεφάλαιο περιγράφεται η ανάπτυξη της µεθόδου υγρής χρωµατογραφίας σε πρότυπο µίγµα των δέκα υπό µελέτη κινολονών και γίνεται εφαρµογή της µεθόδου για την ανάλυση φαρµακευτικών σκευασµάτων για ιατρική και κτηνιατρική χρήση. Στο 13 ο κεφάλαιο αναπτύσσεται πρωτόκολλο για την εκχύλιση των µελετώµενων κινολονών από βόειο, χοίρειο και πρόβειο µυϊκό ιστό. Στο 14 ο κεφάλαιο αναπτύσσονται και επικυρώνονται µέθοδοι σε δύο συστήµατα υγρής χρωµατογραφίας για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών σε µυϊκό ιστό πουλερικών και σε κρόκο αυγού. Στο 15 ο κεφάλαιο αναπτύσσεται πρωτόκολλο για την εκχύλιση των προσδιοριζόµενων κινολονών από αγελαδινό γάλα. Τέλος στο 16 ο κεφάλαιο ελέγχονται για την καταλληλότητά τους, εφαρµόζονται και επικυρώνονται χρωµατογραφικές µέθοδοι για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό των δέκα κινολονών σε δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού. Στα κεφάλαια 17 και 18 δίνονται αναλυτικά τα συµπεράσµατα που εξάγονται από τη διατριβή και γίνεται ανακεφαλαίωση όλων των αποτελεσµάτων της διατριβής. Η διεξαγωγή του ερευνητικού µέρους της διατριβής πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας, του Τµήµατος Χηµείας, της Σχολής Θετικών Επιστηµών του Α.Π.Θ., υπό την επίβλεψη της Επίκουρης Καθηγήτριας κ. Β.Φ. Σαµανίδου. Η υπόδειξη του θέµατος και η υλοποίηση της έρευνας έγινε σε στενή συνεργασία µε την Επικ. Καθηγήτρια κ. Β.Φ Σαµανίδου, την οποία και ευχαριστώ θερµά. Επίσης θερµές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στον Καθηγητή κ. Ι.Ν. Παπαδογιάννη και στον Επικ. Καθηγητή Γ.Α. Θεοδωρίδη, µέλη της Τριµελούς Εισηγητικής Επιτροπής, για το αµείωτο ενδιαφέρον τους και τη συµβολή τους κατά την πειραµατική εργασία και τη συγγραφή της διατριβής. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα µέλη της εξεταστικής επιτροπής, για τη συµµετοχή τους στην εξέταση της συγκεκριµένης διατριβής και για τις κρίσιµες και σηµαντικές υποδείξεις τους πριν την τελική έκδοση της διατριβής, αλλά και όλα τα µέλη του Εργαστηρίου Αναλυτικής Χηµείας για τη συµβολή τους στη δηµιουργία ενός ευχάριστου περιβάλλοντος.

9 Κλείνοντας θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωµοσύνη και τις ευχαριστίες µου στην οικογένεια µου, για τη σηµαντική υποστήριξη και συµπαράσταση, που µου παρείχε όλα τα χρόνια που χρειάστηκαν για την υλοποίηση της προσπάθειας αυτής. Χριστοδούλου Ελένη Θεσσαλονίκη, Ιανουάριος 2008

10 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΤΑ ΑΝΤΙΒΙOΤΙΚΑ Εισαγωγή Γενικά στοιχεία για τα αντιβιοτικά Ιστορική αναδροµή Πρώτες ύλες Παραγωγική διαδικασία Ταξινόµηση αντιβιοτικών Τρόπος δράσης των αντιβιοτικών Παρενέργειες των αντιβιοτικών Μη ορθή χρήση των αντιβιοτικών Μικροβιακή αντοχή ΟΙ ΚΙΝΟΛΟΝΕΣ Εισαγωγή Ιστορία και εξέλιξη των κινολονών Η πρώτη δεκαετία των κινολονών Οι φθοροκινολόνες οµή-χαρακτηριστικά των κινολονών Υποκατάσταση στη θέση 1 (άτοµο αζώτου στο δακτύλιο) Υποκατάσταση στη θέση Υποκατάσταση στη θέση Υποκατάσταση στη θέση Αντιµικροβιακή δράση Μηχανισµοί δράσης Φαρµακοκινητική Ταξινόµηση κινολονών Χρήση στην Ιατρική και στην Κτηνιατρική Η ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΤΟΧΗ Μικροβιολογική-κλινική αντοχή Γενετική της ανθεκτικότητας Χρήση αντιβιοτικών σε κρεοπαραγωγά ζώα Επιπτώσεις της ανάπτυξης της µικροβιακής αντοχής Αντοχή στις φθοροκινολόνες ΝΟΜΟΘΕΣΙΑ ΓΙΑ ΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ ΣΤΑ ΚΡΕΟΠΑΡΑΓΩΓΑ ΖΩΑ ΚΑΙ ΣΤΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΤΟΥΣ Εισαγωγή Η Ενιαία Αγορά ιεθνείς Οργανισµοί Η Ευρωπαϊκή Νοµοθεσία ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ Εισαγωγή Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Πίεσης Χρωµατογραφία Αντίστροφης Φάσης Οργανολογία Σύστηµα διανοµής διαλυτών Μονάδα εισαγωγής δείγµατος Χρωµατογραφική στήλη Σύστηµα ανίχνευσης Σύστηµα καταγραφής. 63

11 5.4 Χαρακτηριστικά απόδοσης χρωµατογραφήµατος Χρόνος συγκράτησης Αριθµός θεωρητικών πλακών Παράγοντας διαχωρισµού και διακριτική ικανότητα Συµµετρία κορυφών Όγκος συστήµατος ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΕΙΓΜΑΤΟΣ-ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ Εισαγωγή Είδη προσροφητικών SPE και µηχανισµοί δράσης Στάδια και ανάπτυξη πρωτοκόλλου SPE ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑΣ Εισαγωγή Κριτήρια επίδοσης αναλυτικών χρωµατογραφικών µεθόδων µε βάση την απόφαση 2002/657/EC Πρόσθετα κριτήρια επίδοσης ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ Εισαγωγή Καµπύλη αναφοράς και Συντελεστής κατανοµής Ανάλυση παλινδρόµησης για τη σύγκριση δύο αναλυτικών µεθόδων ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ Προσδιορισµός των (φθορο)κινολονών σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Γενικά για τον προσδιορισµό των (φθορο)κινολονών σε ιστούς κρεοπαραγωγών ζώων και σε προϊόντα ζωικής προέλευσης Μελέτη των χρωµατογραφικών συνθηκών των δηµοσιευµένων εργασιών µε υποστρώµατα ιστούς κρεοπαραγωγών ζώων και προϊόντα ζωικής προέλευσης Προκατεργασία δειγµάτων τροφίµων ζωικής προέλευσης Εργασίες επικυρωµένες σύµφωνα µε την απόφαση 2002/657/EC ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙ ΡΑΤΗΡΙΑ Όργανα, διατάξεις και υλικά Πρότυπες ενώσεις, αντιδραστήρια και διαλύτες ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΕΚΑ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ. ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ. ΜΕΛΕΤΗ ΑΠΟ ΟΣΗΣ ΝΕΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΠΛΗΡΩΣΗΣ ΣΤΗΛΩΝ HPLC Παρασκευή πρότυπων διαλυµάτων Φάσµατα των (φθορο)κινολονών Επιλογή στατικής φάσης και βελτιστοποίηση κινητής φάσης Επιλογή εσωτερικού προτύπου Μελέτη απόδοσης της χρωµατογραφικής στήλης Χάραξη καµπυλών αναφοράς και επικύρωση της µεθόδου Ανάλυση εµπορικά διαθέσιµων φαρµακευτικών σκευασµάτων κινολονών ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΙΚΩΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΩΝ ΤΩΝ ΕΚΑ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΙΑΦΟΡΩΝ ΚΡΕΟΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΖΩΩΝ, ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ 2002/657/EC Εισαγωγή Πρότυπα διαλύµατα και χρωµατογραφικές συνθήκες Μελέτη βέλτιστων συνθηκών εκχύλισης στερεάς φάσης.. 155

12 13.4 Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για την εκχύλιση των κινολονών από τους ιστούς Επικύρωση χρωµατογραφικής µεθόδου Έλεγχος εκλεκτικότητας Μελέτη ανθεκτικότητας Μελέτη σταθερότητας Χάραξη καµπυλών αναφοράς Μελέτη πιστότητας και ανάκτησης Υπολογισµός του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης Σύγκριση της χρωµατογραφικής µεθόδου µεταξύ των διαφορετικών ιστών Εφαρµογή της µεθόδου για ανάλυση αντίστοιχων δειγµάτων µυϊκών ιστών ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΕΚΑ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΕΙΓΜΑΤΑ ΜΥΪΚΟΥ ΙΣΤΟΥ ΠΟΥΛΕΡΙΚΩΝ ΚΑΙ ΣΕ ΚΡΟΚΟ ΑΥΓΟΥ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ 2002/657/EC Εισαγωγή Πρότυπα διαλύµατα Χρωµατογραφικές συνθήκες Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για την προκατεργασία των δειγµάτων Προκατεργασία δειγµάτων µυϊκού ιστού πουλερικών Προκατεργασία δειγµάτων κρόκου αυγού Επικύρωση χρωµατογραφικής µεθόδου Έλεγχος εκλεκτικότητας Χάραξη καµπυλών αναφοράς Μελέτη πιστότητας και ανάκτησης Υπολογισµός του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης Εφαρµογή της µεθόδου για ανάλυση αντίστοιχων δειγµάτων ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ ΕΚΑ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΑΓΕΛΑ ΙΝΟ ΓΑΛΑ ΥΣΤΕΡΑ ΑΠΟ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ - ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ 2002/657/EC Εισαγωγή Πρότυπα διαλύµατα Χρωµατογραφικές συνθήκες Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για την προκατεργασία των δειγµάτων Επικύρωση χρωµατογραφικής µεθόδου Έλεγχος εκλεκτικότητας Χάραξη καµπυλών αναφοράς Μελέτη πιστότητας και ανάκτησης Υπολογισµός του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης Εφαρµογή της µεθόδου για ανάλυση δειγµάτων αγελαδινού γάλακτος ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΕΚΑ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΒΟΕΙΟ ΗΠΑΡ ΚΑΙ ΣΕ ΧΟΙΡΕΙΟ ΝΕΦΡΟ, ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ 2002/657/EC Εισαγωγή Πρότυπα διαλύµατα Χρωµατογραφικές συνθήκες Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για την προκατεργασία των δειγµάτων Επικύρωση χρωµατογραφικής µεθόδου Έλεγχος εκλεκτικότητας.. 235

13 Χάραξη καµπυλών αναφοράς Μελέτη πιστότητας και ανάκτησης Υπολογισµός του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης Εφαρµογή της µεθόδου για ανάλυση δειγµάτων βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού ΑΝΑΚΕΦΑΛΑΙΩΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ EXTENDED SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

14 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 1 ο 1. ΤΑ ΑΝΤΙΒΙOΤΙΚΑ 1.1 Εισαγωγή Η ασφάλεια των τροφίµων αποτελεί µείζον θέµα για τη διασφάλιση της δηµόσιας υγείας. Σύµφωνα µε το σύστηµα HACCP (Hazard assessment Critical Control Points, Ανάλυση Κινδύνων-Κρίσιµα Σηµεία Ελέγχου) ασφαλές χαρακτηρίζεται το τρόφιµο που µπορεί να καταναλωθεί χωρίς να προκαλέσει την οποιαδήποτε ασθένεια (π.χ. τροφική δηλητηρίαση) ή κάποια άλλη βλάβη στην υγεία του καταναλωτή. Αυτό σηµαίνει ότι τα ασφαλή τρόφιµα δεν πρέπει να περιέχουν παθογόνους µικροοργανισµούς, επικίνδυνες χηµικές ουσίες ή ξένα σώµατα. Οποιοδήποτε τρόφιµο περιέχει ένα από τα παραπάνω σε περιεκτικότητα µεγαλύτερη των επιτρεπτών ορίων χαρακτηρίζεται ως µη ασφαλές και µπορεί να προκαλέσει σοβαρές βλάβες στην υγεία του καταναλωτή. Οι κίνδυνοι που εµφανίζονται στα µη ασφαλή τρόφιµα µπορεί να είναι: βιολογικής προέλευσης, όπως βακτήρια, ιοί, πρωτόζωα κ.ά., φυσικής προέλευσης, που συνήθως προέρχονται από φυσική αλλοίωση των τροφίµων, ή χηµικής προέλευσης. Στους κινδύνους χηµικής προέλευσης περιλαµβάνονται χηµικά που χρησιµοποιούνται στις καλλιέργειες φυτών και στην εκτροφή ζώων ή κτηνιατρικά φάρµακα, άλλοτε ακατάλληλα και άλλοτε σε µη επιτρεπτές δόσεις. Τα αντιβιοτικά είναι τα συνηθέστερα κτηνιατρικά φάρµακα που χρησιµοποιούνται, άλλοτε για θεραπευτικούς λόγους, αλλά και για λόγους πρόληψης ή συχνά και ως αυξητικοί παράγοντες [1]. Οι «κινολόνες» αποτελούν µια κατηγορία αντιβιοτικών-αντιβακτηριακών φαρµάκων των οποίων η δράση εστιάζεται στην αναστολή της λειτουργίας του ενζύµου DNA-γυράση. Το πρώτο µέλος της οµάδας των κινολονών ανακαλύφθηκε το 1962 από τον Lescher και την οµάδα του και έγινε αποδεκτό από τον Οργανισµό Τροφίµων και Φαρµάκων (FDA, Food and Drug Administration) το 1963, για τη θεραπεία λοιµώξεων του ουροποιητικού συστήµατος. Όλες οι κινολόνες διαθέτουν στο µόριό τους µια καρβοξυλική οµάδα στη θέση 3 και µια καρβόνυλο οµάδα στη θέση 4. Αργότερα µε την εισαγωγή του φθορίου στη θέση 6 και της πιπεραζινυλικής οµάδας στη θέση 7, προέκυψε η δεύτερη γενιά των κινολονών, γνωστές ως «φθοροκινολόνες» [2]. 1

15 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 1 ο 1.2 Γενικά στοιχεία για τα αντιβιοτικά Τα αντιβιοτικά χωρίζονται µε βάση την πηγή προέλευσης τους σε τρεις κατηγορίες. Τα «φυσικά αντιβιοτικά» τα οποία είναι χηµικές ουσίες που παράγονται από µικροοργανισµούς, συνήθως βακτήρια και µύκητες, και παρεµποδίζουν ή αναστέλλουν την ανάπτυξη των βακτηρίων. Τα πρώτα αντιβιοτικά που χρησιµοποιήθηκαν στη σύγχρονη ιατρική αποµονώθηκαν από ζωντανούς οργανισµούς και ήταν για παράδειγµα η οµάδα της πενικιλλίνης που παράγεται από τους µύκητες του γένους Penicillium ή η στρεπτοµυκίνη που προέρχεται από τα βακτήρια του γένους Streptomyces. Εκατοντάδες είναι τα φυσικά αντιβιοτικά που έχουν ταυτοποιηθεί και περίπου 100 είναι αυτά που έχουν αναπτυχθεί σε τέτοιο στάδιο, που να µπορούν να χρησιµοποιηθούν για τη θεραπεία µολυσµατικών ασθενειών. Η δεύτερη κατηγορία των αντιβιοτικών είναι τα «ηµι-συνθετικά», τα οποία προέρχονται από τα φυσικά αντιβιοτικά µε µικρές τροποποιήσεις στη δοµή τους. Για παράδειγµα, µετά την ανακάλυψη της βενζυλοπενικιλλίνης, µια µικρή τροποποίηση στον αυξητικό παράγοντα του Penicillium οδήγησε στην εισαγωγή ενός µόνο ατόµου οξυγόνου στην αλυσίδα του φυσικού προϊόντος, σχηµατίζοντας τη φαινοξυµεθυλοπενικιλλίνη. Το παράγωγο αυτό είναι πιο σταθερό σε όξινο περιβάλλον και είναι κατάλληλο για τη χορήγηση από το στόµα (per os). Μετά τη χηµική ταυτοποίηση πολλών φυσικών αντιβιοτικών, πλήθος παραγώγων προέκυψαν και συνεχίζουν να ανακαλύπτονται. Άλλο παράδειγµα ηµι-συνθετικών αντιβιοτικών είναι οι πενικιλλινάσες, οι οποίες είναι ανθεκτικές, ηµι-συνθετικές πενικιλλίνες, όπως η ναφκιλλίνη, κλοξακιλλίνη και φλουκλοξακιλλίνη. Η τρίτη κατηγορία, τα «συνθετικά αντιβιοτικά», είναι προϊόντα χηµικής σύνθεσης και χαρακτηρίζονται ως χηµειοθεραπευτικά. Η πρόοδος της Οργανικής Χηµείας είχε ως αποτέλεσµα πολλές κατηγορίες αντιβιοτικών να είναι προϊόντα χηµικής σύνθεσης. Τα περισσότερα αντιβιοτικά είναι σχετικά µικρά µόρια µε µοριακή µάζα που συνήθως δεν ξεπερνάει τα 2000 Da. Η πρώτη ένωση µε χηµειοθεραπευτική δράση σε κλινική χρήση ήταν το Prontosil ένα αζω-παράγωγο µε δοµή παραπλήσια των σουλφονιλαµιδίων. Αργότερα αναπτύχθηκαν τα σουλφοναµίδια που µέχρι σήµερα, παίζουν σηµαντικό ρόλο στη θεραπεία 2

16 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 1 ο µολυσµατικών ασθενειών. Πιο πρόσφατα παραδείγµατα συνθετικών αντιβιοτικών είναι τα νιτροφουράνια και οι κινολόνες. Γενικότερα ως αντιβιοτικά ορίζονται οι χηµικές ενώσεις που παρεµποδίζουν ή αναστέλλουν την ανάπτυξη των µικροοργανισµών, όπως βακτήρια, µύκητες και πρωτόζωα. Ο αρχικός όρος «αντιβιοτικό» περιλαµβάνει οποιαδήποτε ουσία έχει βιολογική δράση έναντι των ζωντανών οργανισµών. Παρ όλα αυτά ο όρος πλέον χρησιµοποιείται για ουσίες που έχουν δράση αντι-βακτηριακή, αντι-µυκητιακή και αντι-παρασιτική. Αντίθετα µε προηγούµενες θεραπείες µολύνσεων, οι οποίες συνήθως βασίζονταν στη χορήγηση χηµικών ενώσεων, όπως η στρυχνίνη ή το αρσενικό µε υψηλή τοξικότητα έναντι στα θηλαστικά, τα αντιβιοτικά που προέρχονται από µικρόβια έχουν ελάχιστες παρενέργειες και ιδιαίτερα αποτελεσµατική δράση. Τα περισσότερα αντιβακτηριακά αντιβιοτικά δεν έχουν αποτελεσµατική δράση κατά των ιών, των µυκήτων και άλλων µικροβίων. Τα αντιβακτηριακά αντιβιοτικά ταξινοµούνται µε βάση τη δράση τους: στα περιορισµένου φάσµατος αντιβιοτικά (narrow-spectrum) που επιδρούν σε συγκεκριµένου τύπου βακτήρια, όπως είναι τα Gram-αρνητικά και τα Gram-θετικά βακτήρια, και στα ευρέος φάσµατος (broad spectrum), που δρουν αποτελεσµατικά σε µεγαλύτερο εύρος βακτηρίων. Η αποτελεσµατικότητα των µεµονωµένων αντιβιοτικών ποικίλλει ανάλογα µε τη θέση της µόλυνσης, την ικανότητα του αντιβιοτικού να προσεγγίσει το σηµείο της µόλυνσης και τη δυνατότητα του µικροβίου να αλληλεπιδράσει µε το αντιβιοτικό. Μερικά αντιβακτηριακά αντιβιοτικά καταστρέφουν τα βακτήρια (βακτηριοκτόνα), ενώ άλλα αποτρέπουν τον πολλαπλασιασµό του βακτηρίου (βακτηριοστατικά). Τα αντιβιοτικά που χορηγούνται συνήθως από το στόµα απορροφώνται από τον οργανισµό Για σοβαρές καταστάσεις η χορήγηση γίνεται παρεντερικά (ενδοµυϊκά, υποδόρια, ενδοφλέβια). Επίσης τα αντιβιοτικά χορηγούνται και για τοπική χρήση, όπως είναι οι σταγόνες για τα µάτια ή και σε µορφή αλοιφής. Τα τελευταία χρόνια τρεις νέες κατηγορίες αντιβιοτικών έχουν αρχίσει να χρησιµοποιούνται σε κλινικό επίπεδο. Ύστερα από ένα κενό 40 χρόνων ανακαλύφθηκαν οι τρεις νέες κατηγορίες αντιβιοτικών: α) τα κυκλικά λιποπεπτίδια (όπως η δαπροµυκίνη), β) οι γλυκυλoκυκλίνες (όπως τιγκεκυκλίνη) και γ) οι οξαζολιδινόνες (όπως το λινεζολίδη). Η τιγκεκυκλίνη είναι ευρέος φάσµατος αντιβιοτικό, ενώ τα άλλα δύο χρησιµοποιούνται έναντι των Gram-θετικών µολύνσεων. 3

17 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 1 ο Οι καινούριες αυτές κατηγορίες αντιβιοτικών είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικές, αφού µπορούν να αντιµετωπίσουν τα αναπτυσσόµενα βακτήρια που αντιδρούν στη δράση των υπαρχόντων αντιβιοτικών [1,2]. 1.3 Ιστορική Αναδροµή Παρ όλο που ισχυρές αντιβιοτικές ουσίες για τη θεραπεία ανθρώπινων νοσηµάτων που οφείλονται σε βακτήρια (όπως η φυµατίωση και η λέπρα) δεν είχαν ανακαλυφθεί και ταυτοποιηθεί µέχρι τον 20 ο αιώνα, η πρώτη γνωστή χρήση των αντιβιοτικών έγινε στην αρχαία Κίνα 2500 χρόνια πριν. Την εποχή εκείνη είχαν ανακαλύψει ότι η µούχλα στο θρόµβο του γάλακτος σόγιας είχε σε ορισµένες µολύνσεις θεραπευτική δράση. Ήταν τόσο αποτελεσµατική η δράση της που είχε καθιερωθεί ως θεραπεία. Οι Σουδανέζοι-Νούβιοι χρησιµοποιούσαν κάποιο είδος τετρακυκλίνης, το 350 π.χ. Στην Ευρώπη την περίοδο του Μεσαίωνα είχαν χρησιµοποιηθεί για την αντιµετώπιση µολύνσεων, εκχυλίσµατα φυτών και το ίζηµα του τυριού. Παρ όλο όµως που σύµφωνα µε τους παραπάνω πολιτισµούς γινόταν χρήση των αντιβιοτικών από τα αρχαία χρόνια, η δράση τους έγινε κατανοητή τον 20 ο αιώνα. Η ανάπτυξη των σύγχρονων αντιβιοτικών βασίστηκε σε ορισµένα υλικά που προήλθαν από µικροοργανισµούς και χρησιµοποιήθηκαν στη θεραπεία µολυσµατικών ασθενειών. Ο πρωτοπόρος στο επίπεδο αυτών των ανακαλύψεων ήταν ο Louis Pasteur ο οποίος µαζί µε συνεργάτη του το 1877 ανακάλυψε ότι η ανάπτυξη της ασθένειας, που οφειλόταν στο βάκιλο του άνθρακα, µπορούσε να παρεµποδιστεί από σαπροφυτικά βακτήρια (µη παθογόνα). Οι ίδιοι ερευνητές απέδειξαν ότι µεγάλες ποσότητες των βακίλων του άνθρακα µπορούσαν να χορηγηθούν στα ζώα χωρίς να έχουν αρνητικές επιπτώσεις, ενώ παράλληλα δινόταν στο ζώο σαπροφυτικά βακτήρια. Τα χρόνια που ακολούθησαν παρατηρήθηκε ότι ορισµένα βακτήρια που µπορεί να προέρχονταν από διάφορα υλικά µπορούσαν να εµποδίσουν την εξάπλωση ορισµένων ασθενειών. Το 1928 ο Alexander Fleming έκανε µια από τις σηµαντικότερες ανακαλύψεις στο πεδίο των αντιβιοτικών. Σ ένα από τα πειράµατά του ανακάλυψε ότι ένα στέλεχος του γένους Penicillium µε πράσινες αποικίες εµπόδιζε την ανάπτυξη των βακτηρίων πάνω σε µια ύαλο καλυµµένη από αγαρόζη. Η παρατήρηση αυτή οδήγησε 4

18 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 1 ο στην ανακάλυψη της πενικιλλίνης και στην ανάπτυξη της πρώτης σύγχρονης εποχής των αντιβιοτικών. Λίγα χρόνια αργότερα, το 1932, δηµοσιεύτηκε µια εργασία στην οποία προτεινόταν η θεραπεία µολυσµένων τραυµάτων µε κάποιο διάλυµα πενικιλλίνης. Παρ όλο που αυτά τα πρώτα δείγµατα πενικιλλίνης ήταν αρκετά δραστικά, δεν ήταν ιδιαίτερα αξιόπιστα και έτσι χρειάστηκαν επιπλέον µελέτες. Οι µελέτες αυτές ολοκληρώθηκαν το 1940 όταν ο Howard Florey και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν ένα νέο στέλεχος από το γένος Penicillium, από το οποίο µπορούσε να παραχθεί η πενικιλλίνη σε µεγάλες ποσότητες. Έτσι άρχισε να αναπτύσσεται και η σύγχρονη βιοµηχανία των αντιβιοτικών. Μετά την ανακάλυψη της πενικιλλίνης, άνοιξε ο δρόµος και για άλλα αντιβιοτικά. Το 1939 άρχισαν έρευνες για την αποµόνωση πιθανών αντιβιοτικών σκευασµάτων από τα βακτήρια Streptomyces. Την εποχή εκείνη έγινε και η εισαγωγή του όρου «αντιβιοτικό». Το 1944 ανακαλύφθηκε από τον Selman Waxman το αντιβιοτικό στρεπτοµυκίνη. Μελέτες που ακολούθησαν οδήγησαν στην ανακάλυψη πλήθους αντιβιοτικών όπως η ακτινοµυκίνη (actinomycin), η στρεπτοθρικίνη (streptothricin) και νεοµυκίνη (neomycin), όλα παράγωγα των βακτηρίων του γένους Streptomyces. Άλλα αντιβιοτικά που ανακαλύφθηκαν από τότε είναι η βακιτρακίνη (bacitracin), η πολυµυξίνη (polymyxin), η βιοµυκίνη (viomycin), η χλωραµφενικόλη (chloramphenicol) και οι τετρακυκλίνες (tetracyclines). Από το 1970 τα περισσότερα νέα αντιβιοτικά είναι συνθετικά προερχόµενα από χηµικές µετατροπές φυσικών αντιβιοτικών [3]. 1.4 Πρώτες ύλες Οι ενώσεις που προκαλούν τη ζύµωση του διαλύµατος είναι οι πρώτες ύλες για την παραγωγή των αντιβιοτικών. Το υδατικό αυτό διάλυµα αποτελείται από συστατικά απαραίτητα για τον πολλαπλασιασµό των µικροοργανισµών. Τα συστατικά αυτά είναι πρώτες ύλες πλούσιες σε άνθρακα, όπως η µελάσα και τα δηµητριακά, τα οποία αποτελούνται από σάκχαρα λακτόζης και γλυκόζης. Τα υλικά αυτά χρησιµοποιούνται ως θρεπτικά συστατικά των µικροοργανισµών. Το άζωτο είναι ένα επιπλέον συστατικό απαραίτητο για τους κύκλους µεταβολισµού των µικροοργανισµών. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται συνήθως αµµωνιακά άλατα. Επιπλέον, ίχνη και άλλων στοιχείων χρησιµοποιούνται για την ορθή ανάπτυξη των 5

19 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 1 ο αντιβιοτικών οργανισµών. Τέτοια στοιχεία είναι ο φώσφορος, το θείο, το µαγνήσιο, ο ψευδάργυρος, ο σίδηρος και ο χαλκός. Για να αποφευχθεί ο αφρισµός κατά τη ζύµωση, χρησιµοποιούνται αντι-αφριστικά αντιδραστήρια όπως διάφορα έλαια, οκταδεκανόλη και σιλικόνη [1]. 1.5 Παραγωγική ιαδικασία Ενώ τα περισσότερα αντιβιοτικά υπάρχουν στη φύση, δε βρίσκονται σε ικανοποιητικές ποσότητες για την παραγωγή σε µεγάλη κλίµακα. Για το σκοπό αυτό εφαρµόζονται βιοτεχνολογικές µέθοδοι παραγωγής (ζύµωση). Η ζύµωση γίνεται για την παραλαβή των επιθυµητών µικροοργανισµών, τον εµπλουτισµό του υποστρώµατος και την αποµόνωση των τελικών αντιβιοτικών προϊόντων. Είναι σηµαντικό η παραγωγή να γίνεται σε στείρο περιβάλλον, γιατί επιµόλυνση από οποιαδήποτε µικρόβια µπορεί να οδηγήσει σε καταστροφή της ζύµωσης [1]. 1.6 Ταξινόµηση Αντιβιοτικών Όπως ήδη αναφέρθηκε µια πρώτη ταξινόµηση των αντιβιοτικών είναι ο διαχωρισµός τους σε βακτηριοκτόνα (bactericidal) και σε βακτηριοστατικά (bacteriostatic). Τα βακτηριοκτόνα είναι ουσίες που σκοτώνουν εκλεκτικά τα βακτήρια, ενώ τα βακτηριοστατικά εµποδίζουν την ανάπτυξη των βακτηρίων µε βακτηριακή αλληλεπίδραση (πρωτεϊνική παραγωγή, αντιγραφή του DNA, µεταβολισµός των κυττάρων). Η ταξινόµηση αυτή των αντιβιοτικών έχει µόνο εργαστηριακή χρήση, αφού και οι δύο κατηγορίες αντιβιοτικών έχουν στόχο την αναστολή της βακτηριακής µόλυνσης [1]. Συνήθως η ταξινόµηση των αντιβιοτικών γίνεται µε βάση την οµάδα από την οποία προέρχονται. Έτσι οι κυριότερες κατηγορίες αντιβιοτικών είναι οι εξής: Αµινογλυκοζίδες Ανσαµυκίνη Καρµπασεφέµες Καρβαπενέµη Κεφαλοσπορίνες 1 ης,2 ης, 3 ης και 4 ης γενιάς Κινολόνες 6

20 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 1 ο Μακρολίδια Μονοβακτάµη Πενικιλλίνη Πολυπεπτίδια Σουλφοναµίδια Τετρακυκλίνες κ.ά. 1.7 Τρόπος ράσης τα αντιβιοτικών Τα αντιβιοτικά έχουν διάφορους τρόπους δράσης για την αντιµετώπιση των βακτηρίων. Οι κυριότεροι τρόποι δράσης τους φαίνονται στο Σχήµα 1.1 και περιγράφονται ως εξής: Αναστέλλουν τη σύνθεση των κυτταρικών τοιχωµάτων. Αντιβιοτικά µε τη συγκεκριµένη δράση είναι οι β-λακτάµες (πενικιλλίνες και κεφαλοσπορίνες) και η βανκοµυκίνη, οι οποίες αναστέλλουν τη σύνθεση της τρανσ-πεπτιδάσης. Τον ίδιο τρόπο δράσης έχει και η βακιτρακίνη, της οποίας η δράση εστιάζεται στην αναστολή της µεταφοράς συστατικών από τα κυτταρικά τοιχώµατα, µέσω των µεταφορέων. Καταστρέφουν τις κυτταρικές µεµβράνες, όπως η πολυµυξίνη Β η οποία συµπλέκεται µε την κυτταρική µεµβράνη και οδηγεί στην καταστροφή της. Αναστέλλουν τη σύνθεση του νουκλεϊνικού οξέος. Αντιβιοτικά µε τη συγκεκριµένη δράση είναι οι κινολόνες, όπως το ναλιδιξικό οξύ και η κιπροφλοξακίνη ο οποίες συµπλέκονται µε τη DNA-γυράση. Επίσης η αζιθροµυκίνη παρεµποδίζει την ανάστροφη αντιγραφή των ρέτρο-ιών (HIV-1). Παρεµποδίζουν την αντιγραφή, όπως η ριφαµπίνη η οποία συµπλέκεται µε την RNA-πολυµεράση. Αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση (συνήθως τα βακτηριοστατικά αντιβιοτικά). Αντιβιοτικά µε τη συγκεκριµένη δράση είναι οι αµινογλυκοζίδες, όπως η στρεπτοµυκίνη και η νεοµυκίνη και οι τετρακυκλίνες, οι οποίες αλληλεπιδρούν µε την υποµονάδα 30S, η χλωραµφενικόλη, µε σηµαντικά τοξικές παρενέργειες, που χρησιµοποιείται µόνο σε περιπτώσεις που δε µπορούν να δράσουν άλλες ουσίες και τα µακρολίδια, όπως η ερυθροµυκίνη, που αλληλεπιδρούν µε την υποµονάδα 50S. 7

21 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 1 ο Σχήµα 1.1: Σχηµατική αναπαράσταση του µηχανισµού δράσης των αντιβιοτικών. ρουν ως αντι-µεταβολίτες (ανάλογα µεταβολιτών), προκαλώντας ανταγωνιστική αναστολή των µεταβολικών ενζύµων και µπλοκάρουν την ολοκληρωτική βιοσύνθεση ουσιαστικών συστατικών. Για παράδειγµα τα σουλφοναµίδια αναστέλλουν τη σύνθεση του φολικού οξέος, ενώ η τριµεθοπρίµη παρεµποδίζει τη σύνθεση του φολικού οξέος [2]. 1.8 Παρενέργειες των αντιβιοτικών Οι παρενέργειες των αντιβιοτικών ποικίλλουν ανάλογα µε το είδος τους και µε τους µικροβιακούς οργανισµούς οι οποίοι καταπολεµούνται. Συνηθισµένες παρενέργειες είναι η εµφάνιση πυρετού, ναυτίας ή µέχρι και αλλεργικών αλληλεπιδράσεων, περιλαµβανοµένης και της φωτοδερµατίτιδας. Άλλη συνηθισµένη παρενέργεια είναι η διάρροια που συνήθως προέρχεται από τα αναερόβια βακτήρια Clostridium difficile, που παρεµβαίνουν στην οµαλή λειτουργία της εντερικής χλωρίδας. Η υπερ-ανάπτυξη αυτή των παθογόνων βακτηρίων προλαµβάνεται µε την 8

22 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 1 ο ταυτόχρονη κατανάλωση των προ-βιοτικών, κατά τη διάρκεια της θεραπείας µε αντιβιοτικά. Επίσης η καταστροφή βακτηριακού πληθυσµού που υπάρχει φυσιολογικά στην κολπική χλωρίδα, µπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη µυκήτων του γένους Candida στην περιοχή του κόλπου. Άλλες παρενέργειες µπορεί να προκύψουν από αλληλεπίδραση µε άλλα φαρµακευτικά σκευάσµατα, όπως η καταστροφή των τενόντων από αλληλεπίδραση των κινολονών µε τα κορτικοστερεοειδή [1]. 1.9 Μη ορθή χρήση των αντιβιοτικών Κακή χρήση των αντιβιοτικών από τους ανθρώπους συνήθως σηµαίνει λήψη του αντιβιοτικού για χρονικό διάστηµα µικρότερο από αυτό που καθορίζεται από την ιατρική συνταγή. Συχνά οι ασθενείς δεν αφήνουν το απαραίτητο χρονικό διάστηµα που απαιτείται µεταξύ της χορήγησης του αντιβιοτικού και της εκκαθάρισης του ανθρώπινου οργανισµού από τους µολυσµατικούς µικροοργανισµούς. Οι πρακτικές αυτές συχνά οδηγούν στην ανάπτυξη βακτηριακών πληθυσµών µε ιδιαίτερη αντοχή στα αντιβιοτικά. Συχνά γίνεται και λανθασµένη χορήγηση των αντιβιοτικών, όπως για παράδειγµα είναι η χρήση αντιβακτηριακών αντιβιοτικών για τη θεραπεία σοβαρών µολύνσεων ή για κάποιο συνηθισµένο κρυολόγηµα. Σοβαρότερες είναι όµως οι επιπτώσεις όταν γίνεται λάθος χρήση των αντιβιοτικών σε ζώα που εκτρέφονται και προορίζονται για κατανάλωση από τον άνθρωπο. Εκτιµάται ότι πάνω από το 50% των αντιβιοτικών που χρησιµοποιούνται στην Αµερική δίνονται σε εκτροφές ζώων (π.χ. πουλερικά και χοιρινά κρέατα) απουσία κάποιας ασθένειας. Η χρήση των αντιβιοτικών στην παραγωγή εδώδιµων κρεάτων σχετίζεται άµεσα µε το ζήτηµα της αντοχής των αντιβιοτικών σε στελέχη βακτηρίων που περιλαµβάνουν τα Salmonella ssp., Campylobacter ssp., Escherichia coli. και Enterococcus ssp. Αποτελέσµατα Ευρωπαϊκών και Αµερικάνικων ερευνών καταλήγουν στο ότι ανθεκτικά βακτήρια προκαλούν µολύνσεις στον άνθρωπο, οι οποίες δε θεραπεύονται µε τα συνηθισµένα αντιβιοτικά που συνταγογραφούνται [1] Μικροβιακή Αντοχή Η χρήση και κυρίως η κακή χρήση των αντιβιοτικών µπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη της µικροβιακής αντοχής έναντι των αντιβιοτικών από µολυσµατικούς 9

23 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 1 ο οργανισµούς, όµοιους µε την ανάπτυξη της αντοχής στα µικροβιοκτόνα από τα έντοµα. Εξελιγµένες θεωρίες σχετικά µε τις γενετικές επιλογές καταλήγουν πως θα πρέπει σχεδόν το 100% των µολυσµατικών οργανισµών να καταστραφούν συνολικά, ώστε να αποφευχθεί η επιλεκτική µικροβιακή αντοχή. Εάν ένα µικρό υποσύνολο του πληθυσµού αυτού επιβιώσει της θεραπείας, θα αρχίσει να πολλαπλασιάζεται και η ευαισθησία του νέου αυτού πληθυσµού στο συγκεκριµένο αντιβιοτικό θα είναι κατά µέσο όρο πολύ χαµηλότερη από αυτή του αρχικού πληθυσµού, αφού ο νέος πληθυσµός θα έχει προέλθει από στελέχη που επιβίωσαν µετά την αρχική θεραπεία. Η επιβίωση του πληθυσµού συχνά οδηγεί σε κληρονοµικότητα της αντοχής στις συγκεκριµένες ενώσεις, γεγονός που συναντάται πιο συχνά στον αρχικό πληθυσµό. Η ανάπτυξη της αντοχής έναντι των αντιβιοτικών έχει εξελιχθεί σε σηµαντικό πρόβληµα των αναπτυγµένων και των υποανάπτυκτων κρατών. Από το 1984 ο µισός πληθυσµός που νοσούσε από φυµατίωση, στην Αµερική, περιελάµβανε φορείς ενός στελέχους ιδιαίτερα ανθεκτικού στα συνηθισµένα αντιβιοτικά. Αυτό οδήγησε στη χρήση καινούργιων και ακριβότερων συστατικών, τα οποία µε τη σειρά τους γίνονται επίσης ανθεκτικά και έτσι η σύγχρονη επιστηµονική κοινότητα οδηγείται σ ένα συνεχή αγώνα ανακάλυψης νέων και διαφορετικών αντιβιοτικών για να µειώνεται ο κίνδυνος της εξάπλωσης των µολύνσεων. Άλλο χαρακτηριστικό παράδειγµα επιλεκτικής αντοχής σε αντιβιοτικά σκευάσµατα είναι των στελεχών Staphylococcus aureus, τα οποία τις δεκαετίες του 1940 και του 1950 µπορούσαν εύκολα να αντιµετωπιστούν µε τη χορήγηση της πενικιλλίνης. Σήµερα σχεδόν όλα τα στελέχη είναι ανθεκτικά στην πενικιλλίνη, αρκετά είναι ανθεκτικά στη ναφκιλίνη (nafcillin) και µόνο ορισµένα σκευάσµατα όπως η βανκοµυκίνη (vancomycin) είναι ακόµα χρήσιµα. Το πρόβληµα της ανάπτυξης στην αντοχή των αντιβιοτικών επιδεινώνεται όταν γίνεται λανθασµένη χρήση των αντιβιοτικών, όπως είναι η χρήση τους για την αντιµετώπιση συνηθισµένων κρυολογηµάτων ή ασθένειες ιογενούς προέλευσης, περιπτώσεις στις οποίες δεν έχουν κανένα θετικό αποτέλεσµα. Η κατάσταση επιδεινώνεται όταν τα αντιβιοτικά χρησιµοποιούνται ασύστολα για την προφύλαξη και όχι για τη θεραπεία των ζώων που προορίζονται [1]. 10

24 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο 2. ΟΙ ΚΙΝΟΛΟΝΕΣ 2.1 Εισαγωγή Η ανακάλυψη του Ναλιδιξικού οξέος το 1962 και η εισαγωγή του σε κλινική χρήση το 1967 σηµάδεψαν την αρχή των πέντε δεκαετιών της ανάπτυξης και της χρήσης των κινολονών που ανήκουν στην κατηγορία των συνθετικών αντιβιοτικών. Στο Σχήµα 2.1 δίνεται γραφικά η εξέλιξη των κινολονών στις πρώτες πέντε δεκαετίες από την ανακάλυψή τους. Παρ όλο που το ναλιδιξικό οξύ χρησιµοποιήθηκε µε επιτυχία για την αντιµετώπιση περίπλοκων µολύνσεων του ουροποιητικού συστήµατος, η χρήση των κινολονών περιορίστηκε µέχρι τις δεκαετίες του 1970 και 1980, οπότε και ανακαλύφθηκαν οι φθοροκινολόνες. Οι φθοροκινολόνες έχουν διευρυµένο φάσµα δράσης και από φαρµακοκινητική άποψη συµπεριφέρονται καλύτερα από τους προκατόχους τους. Μέσα σε δύο δεκαετίες οι φθοροκινολόνες από µια µικρή και ασήµαντη οµάδα φαρµάκων εξελίχθηκαν στις επικρατέστερες για την αντιµετώπιση των λοιµώξεων του ουροποιητικού συστήµατος και όχι µόνο. Οι ενώσεις αυτές χρησιµοποιούνται στην κλινική πρακτική πάνω από µια δεκαετία, διάστηµα στο οποίο µελετήθηκαν οι δοµές τους σε σχέση µε τον τρόπο δράσης τους. Οι µελέτες αυτές οδήγησαν στην ανακάλυψη καινούριων ενώσεων µε ευρύτερο αντιµικροβιακό φάσµα δράσης και µε βελτιωµένη φαρµακοκινητική συµπεριφορά. *: κινολόνες που αποσύρθηκαν από την κατανάλωση Σχήµα 2.1: Η εξέλιξη των κινολονών. 11

25 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο Παρ όλο που όλο και περισσότερες φθοροκινολόνες ανακαλύπτονται και πολλές από αυτές φτάνουν και σε κυκλοφορία, η ταχεία αυτή εξέλιξή τους έχει και πολλές ανατροπές. Πολλές ενώσεις αυτής της κατηγορίας αποµακρύνονται από την κατανάλωση ή ακόµα σταµατούν οι έρευνες και στο στάδιο της ανάπτυξης εξαιτίας απρόσµενων παρενεργειών. Πολλές κλινικές µελέτες για τις φθοροκινολόνες είναι ακόµα σε αρχικό στάδιο, ήδη όµως τα µηνύµατα είναι αρκετά ελπιδοφόρα για το προσεχές µέλλον. Η αντιβακτηριακή τους δράση είναι ακόµα υπό διερεύνηση, αλλά η χρήση τους καθίσταται αναπόφευκτη λόγω της εµφάνισης ανθεκτικών στελεχών [4]. 2.2 Ιστορία και εξέλιξη των κινολονών Η πρώτη δεκαετία των κινολονών Βασισµένες στη βασική δοµή της 4-κινολόνης, οι κινολόνες αποτελούν µια σχετικά µεγάλη και αναπτυσσόµενη οµάδα συνθετικών ενώσεων. Το πρώτο µέλος της οµάδας αυτής ήταν το αντιδραστήριο της ναφθιριδίνης (naphthyridine agent), το οποίο ονοµάστηκε Ναλιδιξικό οξύ. Το αντιδραστήριο αυτό ήταν ένα παραπροϊόν, κατά τη σύνθεση της χλωροκίνης, µε αντιβακτηριακή δράση. ύο χρόνια µετά την ανακάλυψη του ναλιδιξικού οξέος, ορίστηκε ο µηχανισµός της δράσης του, ως αναστολέας της σύνθεσης της βακτηριακής DNA γυράσης. Το 1990 ανακαλύφθηκε ένα οµόλογο της γυράσης, η τοποϊσοµεράση IV, η οποία προκαλεί την αποσύνθεση των χρωµοσωµάτων. Τελικά αποδείχθηκε ότι οι αντιβακτηριακές κινολόνες έχουν διπλή δράση εναντίον της DNA γυράσης και της τοποϊσοµεράσης IV. Τα ένζυµα αυτά περιπλέκονται πάνω στην αναδιπλούµενη έλικα του DNA, βοηθώντας την να παραµείνει ακέραιη κατά την αντιγραφή ή τη µεταγραφή του DNA. Τα ένζυµα αυτά δεν επηρεάζονται από τη δράση των κινολονών κατά την κλινική πρακτική. Η πρώτη δεκαετία της ανάπτυξης και της χρήσης των κινολονών ήταν αυτή του Το 1967 επιτράπηκε η χορήγηση του ναλιδιξικού οξέος για τη θεραπεία µολύνσεων του ουροποιητικού συστήµατος, που προκαλούνταν στην πλειοψηφία τους από Gram-αρνητικά βακτήρια, εκτός των περιπτώσεων που οφείλονταν σε στελέχη του είδους Pseudomonas aeruginosa. Τα περισσότερα Gram-θετικά βακτήρια ήταν ανθεκτικά στις πρώτες κινολόνες. Κλινικά το ναλιδιξικό οξύ αποδείχθηκε ότι µπορούσε να χρησιµοποιηθεί µόνο για την αντιµετώπιση των 12

26 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο λοιµώξεων του ουροποιητικού συστήµατος, λόγω των χαµηλών συγκεντρώσεών του στον ορό του αίµατος. Τα παράγωγα που ακολούθησαν, όπως το πιπεµιδικό οξύ (η πρώτη πιπεραζινυλική κινολόνη), το οξολινικό οξύ και η κινοξακίνη ανακαλύφθηκαν τη δεκαετία του 1970 και παρουσίαζαν ελάχιστες βελτιώσεις σε σχέση µε το ναλιδιξικό οξύ. Αρκετά δοµικά χαρακτηριστικά του ναλιδιξικού οξέος διατηρήθηκαν και στις ενώσεις νεότερης γενιάς, όπως π.χ. ο πυρήνας από το 4-οξο-1,8-ναφθυριδιν- 3-καρβοξυλικό οξύ. Σύντοµα, µετά την εισαγωγή του ναλιδιξικού οξέος σε ευρεία κλινική χρήση ανακαλύφθηκε ότι αναπτυσσόταν σχετικά γρήγορα η ανθεκτικότητα σε ορισµένους οργανισµούς. Αργότερα αποδείχθηκε ότι αυτό αποτελεί χαρακτηριστικό και των νεότερων κινολονών. Παρ όλο που η ανθεκτικότητα στο ναλιδιξικό οξύ εξαπλώθηκε σχετικά γρήγορα, η ανθεκτικότητα των παθογόνων του ουροποιητικού συστήµατος παρέµεινε σε σχετικά χαµηλά επίπεδα. Η ανθεκτικότητα αυτή ταυτοποιήθηκε αργότερα, το 1977, µε την κωδικοποίηση µεταλλαγµένων υποµονάδων της DNA γυράσης του E. Coli. Οι παρενέργειες του ναλιδιξικού οξέος είναι γενικά παρόµοιες µε αυτές των υπόλοιπων κινολονών, και είναι κυρίως γαστρεντερικές διαταραχές, επιδερµικά εξανθήµατα και αντιδράσεις φωτοευαισθησίας [4] Οι φθοροκινολόνες Μέχρι την ανακάλυψη της φλουµεκίνης το 1976, της πρώτης µονο-φθοριωµένης κινολόνης, καµία από τα προηγούµενες ενώσεις της οµάδας των κινολονών δεν προσέφερε σηµαντικές βελτιώσεις σε σχέση µε το ναλιδιξικό οξύ. Η φλουµεκίνη ήταν το πρώτο παράγωγο που συντέθηκε µε ένα άτοµο φθορίου στη θέση 6 και ήταν η πρώτη ένδειξη ότι µικρές αλλαγές στη βασική δοµή των κινολονών µπορούν να βελτιώσουν τη δράση έναντι των Gram-θετικών βακτηρίων. Το αντιβακτηριακό της εύρος περιλαµβάνει τα εντεροβακτήρια, συµπεριλαµβανοµένων και ορισµένων στελεχών ανθεκτικών στο ναλιδιξικό οξύ. Επίσης είναι χαρακτηριστική η δράση της έναντι της γονόρροιας µε τη χορήγηση δύο ή τριών δόσεων. Το 1978 ανακαλύφθηκε η νορφλοξακίνη, φθοροκινολόνη της οποίας το χαρακτηριστικό είναι η πιπεραζινυλική οµάδα στη θέση 7 της αλυσίδας. Το 1986 επιτράπηκε στις Ηνωµένες Πολιτείες η χορήγησή της για την αντιµετώπιση των λοιµώξεων του ουρογεννητικού συστήµατος. Η νορφλοξακίνη έχει µεγαλύτερο χρόνο 13

27 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο ηµι-ζωής από τις προηγούµενες ενώσεις (3 µε 4 ώρες), µικρότερη πρωτεϊνική δέσµευση (50%) και βελτιωµένη δράση κατά των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Η τρίτη δεκαετία της ανάπτυξης και χρήσης των κινολονών χαρακτηρίζεται από την ανακάλυψη της φλεροξακίνης, η οποία διαθέτει τρία άτοµα φθορίου στο βασικό της πυρήνα. Η φλεροξακίνη διαφοροποιείται από τις προηγούµενες ενώσεις, γιατί χαρακτηρίζεται από εξαιρετική βιοδιαθεσιµότητα, υψηλές συγκεντρώσεις στο πλάσµα και σε άλλα υγρά του σώµατος, εύκολη απορρόφηση από το δέρµα και µεγάλη ηµιπερίοδο ζωής (10-12 ώρες), επιτρέποντας τη χορήγησή της µια φορά ηµερησίως. Σε κλινικές δοκιµές η φλεροξακίνη αποδείχθηκε ότι καταπολεµά κατά 90% τις µολύνσεις του ουροποιητικού συστήµατος, τη γονόρροια και τα αφροδίσια νοσήµατα. Παρ όλα αυτά η εµφάνιση σοβαρών παρενεργειών, όπως οι φωτοτοξικές αντιδράσεις, έχουν περιορίσει την κλινική χρήση αυτού του φαρµάκου. ύο δεκαετίες µετά την ανακάλυψη του ναλιδιξικού οξέος, οι ολοκληρωµένες µελέτες σχετικά µε τη βιο-διαθεσιµότητά τους και το φάσµα δράσης τους, οδήγησαν στη γρήγορη ανάπτυξη άλλων ενώσεων της ίδιας κατηγορίας. Μεταξύ του 1979 και του 1982 ένα πλήθος κινολονών κυκλοφόρησαν µε δίπλωµα ευρεσιτεχνίας, συµπεριλαµβανοµένης και της κιπροφλοξακίνης το 1981, η οποία ακόµα και σήµερα χρησιµοποιείται ευρέως. Οι ενώσεις αυτές είναι πολύ πιο δραστικές από τους προκατόχους τους έναντι των εντερο-βακτηρίων, των P. aeruginosa και των Gramθετικών βακτηρίων. Οι φθοροκινολόνες που ανακαλύφθηκαν µέχρι το 1980 συνήθως χορηγούνται από το στόµα, ενώ κάποιες µπορούν να χορηγηθούν και παρεντερικά. Οι θεραπευτικές δόσεις αγγίζουν σχετικά χαµηλές συγκεντρώσεις στο πλάσµα, οι ενώσεις όµως αυτές κατανέµονται οµοιόµορφα στους ιστούς και συγκεντρώνονται στα κύτταρα. Από τις βελτιωµένες φθοροκινολόνες, η κιπροφλοξακίνη είναι πιο διαδεδοµένη [4]. 2.3 οµή-χαρακτηριστικά των κινολονών Οι κινολόνες είναι καρβοξυλικά οξέα που περιλαµβάνουν είτε το δακτύλιο της ναφθυριδόνης, όπου στις θέσεις 1 και 8 υπάρχει άτοµο του αζώτου (όπως είναι το ναλιδιξικό οξύ) ή το δακτύλιο της κινολόνης όπου υπάρχει µόνο ένα άτοµο αζώτου στη θέση 1 (Σχήµα 2.2α). Όλες οι δοµικές αλλαγές γίνονται πάνω στη βασική δοµή της κινολόνης και στον πυρήνα της ναφθυριδόνης, όπου προστίθενται στο µόριο επιπλέον αλυσίδες. Το ναλιδιξικό οξύ, η πρώτη κινολόνη, έχει πολλά δοµικά 14

28 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο χαρακτηριστικά όµοια µε αυτά των µεταγενεστέρων κινολονών και βασίζεται στον πυρήνα του 4-οξο-1,8-ναφθυριδιν-3-καρβοξυλικού οξέος. Όλες οι ενώσεις, κινολόνες και ναφθυριδόνες, περιλαµβάνουν ένα άτοµο οξυγόνου εκτός του δακτυλίου στη θέση 4. Έχει αποδειχθεί ότι τόσο το εξω-κυκλικό αυτό οξυγόνο όσο και η καρβοξυλική οµάδα παίζουν το σηµαντικότερο ρόλο στη δράση των ενώσεων αυτών. Οι περισσότερες ενώσεις που έχουν αναπτυχθεί βασίζονται στον πυρήνα της κινολόνης. Η πρώτη ένωση µε πυρήνα κινολόνης που συντέθηκε είναι η ροζοξακίνη η οποία έχει σηµαντικές βελτιώσεις σε σχέση µε το ναλιδιξικό οξύ (Σχήµα 2.2β). (α) O O OH N N CH 3 (β) Σχήµα 2.2: Χηµική δοµή (α) ναθφυριδόνης, κινολόνης και ναλιδιξικού οξέος, (β) ροζοξακίνης. Η εισαγωγή διακλάδωσης στη θέση 7 της πιπεραζινυλικής αλυσίδας βελτίωσε τη δράση έναντι των Gram-αρνητικών βακτηρίων και βοήθησε στη διεύρυνση του αντιβακτηριακού φάσµατος κατά των Pseudomonas. Στην κατηγορία αυτή ανήκει το 15

29 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο πιπεµιδικό οξύ, το οποίο επίσης χαρακτηρίζεται και από τη δράση έναντι των Gramθετικών ειδών. Ο πιπεραζινικός δακτύλιος αύξησε την ικανότητα των κινολονών να διεισδύουν στα βακτηριακά κύτταρα, ενισχύοντας τη δράση τους. Η πρώτη ένωση µε άτοµο φθορίου στη θέση 6 ήταν η φλουµεκίνη (δίπλωµα ευρεσιτεχνίας, 1973) η οποία ήταν η πρώτη ένωση µε ενδείξεις ότι η δράση των ενώσεων αυτής της οµάδας κατά των Gram-θετικών βακτηρίων µπορεί να βελτιωθεί. Η πραγµατική επανάσταση έγινε όταν συνδυάστηκαν τα δύο παραπάνω χαρακτηριστικά σε ένα µόριο, στο µόριο της νορφλοξακίνης, η οποία χαρακτηρίζεται ως 6-φθοριωµένη ένωση µε πιπεραζινικό δακτύλιο στη θέση 7. Παρ όλο που η νορφλοξακίνη έχει ευρύ φάσµα δράσης κατά των Gram-αρνητικών και ορισµένων Gram-θετικών βακτηρίων, ο συνδυασµός των φαρµακοκινητικών της χαρακτηριστικών µε τη δράση της είχε παραµείνει άγνωστος για αρκετό καιρό. Γεγονός ήταν πως η νορφλοξακίνη σηµάδεψε µια επιτυχηµένη περίοδο ερευνών για αλλαγές στα µόρια των φθοροκινολονών. Η νορφλοξακίνη κυκλοφόρησε µε δίπλωµα ευρεσιτεχνίας, το 1978 και τρία χρόνια αργότερα, αρκετές ακόµα κυκλοφόρησαν στην αγορά και χρησιµοποιούνται µέχρι σήµερα, όπως η πεφλοξακίνη (δίπλωµα ευρεσιτεχνίας, 1979), η ενοξακίνη (δίπλωµα ευρεσιτεχνίας, 1980), η φλεροξακίνη (δίπλωµα ευρεσιτεχνίας, 1981), η κιπροφλοξακίνη (δίπλωµα ευρεσιτεχνίας, 1981) και η οφλοξακίνη (δίπλωµα ευρεσιτεχνίας, 1982). Τα πλεονεκτήµατα των ενώσεων αυτών είναι ότι έχουν ευρύ φάσµα δράσης κατά των Gram-θετικών ειδών, αλλά και κατά των Gram-αρνητικών και ότι απορροφώνται εύκολα από τα γαστρεντερικά όργανα εξασφαλίζοντας ικανοποιητικές συγκεντρώσεις στο αίµα, επιτρέποντας τη συστηµατική τους χρήση για την αντιµετώπιση µολύνσεων. Ύστερα από αρκετά χρόνια χρήσης και µελετών αυτών των ενώσεων έχει αποδειχθεί ότι η δράση τους κατά των Gram-θετικών βακτηρίων είναι ανεπαρκής για την αντιµετώπιση µολύνσεων του αναπνευστικού συστήµατος. Επίσης παρ όλο που η ανάπτυξη της αντοχής σε αυτά τα είδη είναι σχετικά µικρή σε σχέση µε το ναλιδιξικό οξύ, για ορισµένα είδη, όπως για τα Staphylococcus aureus και τα Pseudomonas aeruginosa, η αντοχή έχει αρχίσει να γίνεται ανησυχητική. Την περίοδο αυτή οι µελέτες για τις επιπτώσεις στη δράση των ενώσεων αυτών µε µικρές δοµικές αλλαγές στο βασικό µόριο όλο και πληθαίνουν. Η εισαγωγή της κυκλοπρόπυλο οµάδας στη θέση 1, όπως είναι στη κιπροφλοξακίνη, συνέβαλε σηµαντικά στη βελτίωση της δράσης. Η οφλοξακίνη και το L-ισοµερές της, η 16

30 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο λεβοφλοξακίνη, είναι ένα άλλο παράδειγµα δοµικών αλλαγών, όπου στο µόριό τους υπάρχει γέφυρα-δακτύλιος µεταξύ του αζώτου στη θέση 1 και της θέσης 8, συµβάλλοντας επίσης στην αποτελεσµατικότερη δράση τους. Πολλές από τις έρευνες σχετικά µε τη µελέτη των επιπτώσεων στη δράση των ενώσεων αυτών εξαιτίας των δοµικών αλλαγών στον πυρήνα του µορίου των κινολονών και της εισαγωγής διαφόρων υποκαταστατών, έχουν ολοκληρωθεί προσφέροντας απαραίτητη γνώση για την ορθή χορήγηση των κινολονών. Επίσης σε τελικό στάδιο είναι πλέον οι µελέτες που αφορούν τη φαρµακοκινητική τους συµπεριφορά, την αλληλεπίδραση µε άλλα φάρµακα και τις ανεπιθύµητες επιπτώσεις από τη λανθασµένη χορήγηση των σκευασµάτων αυτών. Παρατηρήθηκε οµοιότητα των φθοροκινολονών µε τις β-λακτάµες σχετικά µε την αυξανόµενη δράση κατά των Gram-θετικών βακτηρίων, µε ταυτόχρονη µείωση της δράσης τους, κατά των Gramαρνητικών βακτηρίων. Μόνο ορισµένες από τις καινούριες ενώσεις, όπως η γκεµιφλοξακίνη και η κλιναφλοξακίνη, φαίνεται να έχουν αποτελεσµατική δράση κατά των Gram-θετικών βακτηρίων, χωρίς να µειώνεται η δράση τους επίσης και κατά των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Όπως συµβαίνει συχνά µε τη σχέση δοµήςδράσης, οι επιπτώσεις από την υποκατάσταση σε κάποια θέση δεν είναι πάντα προβλέψιµες [5]. Στη µια πλευρά του µορίου, στη θέση 2 (Η), στη θέση 3 (καρβοξυλικό οξύ) και στη θέση 4 (εξω-κυκλικό άτοµο οξυγόνου), οι αλλαγές δεν είναι ιδιαίτερα συνηθισµένες. Το καρβοξυλικό οξύ στη θέση 3 και το εξω-κυκλικό άτοµο οξυγόνου στη θέση 4 θεωρούνται ότι είναι οι θέσεις του µορίου που συνδέονται µε τη DNA γυράση του βακτηριακού κυττάρου. Έτσι, είναι σηµαντικό να µην επηρεαστεί η στερεοχηµεία σ αυτήν την πλευρά του µορίου. Η θέση 2 επίσης βρίσκεται πολύ κοντά στην πλευρά του µορίου που συµπλέκεται, οπότε οι οποιεσδήποτε αλλαγές θα πρέπει να είναι ιδιαίτερα µικρές. Ορισµένες προσπάθειες που έγιναν για να µεταβάλουν τη δοµή αυτών των θέσεων δεν ήταν ιδιαίτερα επιτυχείς. Πολλές αλλαγές έχουν γίνει σε άλλες θέσεις του δακτυλίου, επιφέροντας σηµαντικές αλλαγές στη δράση των µορίων [6-8]. Στο Σχήµα 2.3 δίνεται η χηµική δοµή των κυριότερων και πιο συχνά χρησιµοποιούµενων κινολονών και φθοροκινολονών. Επίσης στον Πίνακα 2.1 δίνονται οι χηµικές τους ονοµασίες και οι συντοµογραφίες που χρησιµοποιούνται στην παρούσα διατριβή. 17

31 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο O O O O F OH OH HN N N H 2 N H Κινολόνες Φθοροκινολόνες O O O O O O F OH F OH F OH N N H 3 C NHCH 3 N HN N OCH 3 Αµιφλοξακίνη (AMI) Βαλοφλοξακίνη (BAL) Κιπροφλοξακίνη (CIP) N H HN N N N O O F O O OH F O O OH F N N N OH N N N N CH 3 N Cl N NH 2 H 3 C Κλιναφλοξακίνη (CLIN) Ντανοφλοξακίνη (DAN) Ντιφλοξακίνη (DIF) F F O O OH F O O OH F O O OH N N N N N HN N C 2 H 5 H 2 CH 3 C N N N F CH 2 CH 2 F Ενοξακίνη (ENO) Ενροφλοξακίνη (ENR) Φλεροξακίνη (FLE) CH 3 O O O O O O F OH OH F OH N HN O N HN N OCH 3 N CH 3 H 3 C Φλουµεκίνη (FLU) Γκαρενοξακίνη (GAR) Γκατιφλοξακίνη (GAT) CHF 2 CH 3 Σχήµα 2.3: Χηµική δοµή των σηµαντικότερων κινολονών και φθοροκινολονών. 18

32 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο O O CH 3 O O O O F OH F OH F OH NH 2 N N NH N N N N O N N O CH 3 CH 3 H3 C CH 3 Γκεµιφλοξακίνη (GEM) Γκρεπαφλοξακίνη (GREP) Λεβοφλοξακίνη (LEV) O O O O O O F OH F OH F OH N N F N N N HN N N CH 3 C 2 H 5 H 3 C N O N CH 3 OCH 3 Λοµεφλοξακίνη (LOM) Μαρµποφλοξακίνη (MAR) Μοξιφλοξακίνη (MOX) O O F O O O O OH OH F OH CH 3 N N HN N N N N O N C 2 H 5 Ναλιδιξικό οξύ (NAL) Νορφλοξακίνη (NOR) Οφλοξακίνη (OFL) C 2 H 5 H 3 C CH 3 O O O O O O O OH F OH N OH O N N N N CH 2 CH 3 HN N N N C 2 H 5 H 3 C Οξολινικό οξύ (OXO) Πεφλοξακίνη (PEF) Πιπεµιδικό οξύ (PIP) C 2 H 5 Σχήµα 2.3: Συνέχεια. 19

33 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο O O O O O O N OH OH F OH N N N N N N N S N C 2 H 5 CH 3 CH 3 Πιροµιδικό οξύ (PIR) Ροζοξακίνη (ROS) Ρουφλοξακίνη (RUF) O O F OH NH 2 O O N N N F OH F O O OH HN H 3 C N N N N N F HN F H 2N F H 3 C Σαραφλοξακίνη (SAR) Σπαρφλοξακίνη (SPAR) Τεµαφλοξακίνη (TEM) F F O O OH F O O OH N N N H N N F H 2 N F H 2 N H F F Τοζουφλοξακίνη (TOS) Τροβαφλοξακίνη (TROV) Σχήµα 2.3: Συνέχεια Υποκατάσταση στη θέση 1 (άτοµο αζώτου στο δακτύλιο) Η πλαϊνή αλυσίδα που συνδέεται µε το άτοµο του αζώτου στη θέση 1 επηρεάζει σηµαντικά τη δραστικότητα του µορίου. Οι πρώτες ενώσεις (ναλιδιξικό οξύ, πιπεµιδικό οξύ, νορφλοξακίνη, ενροφλοξακίνη κ.ά.) είχαν µια αίθυλο οµάδα στη θέση αυτή, η οποία στην περίπτωση της φλεροξακίνης ήταν υποκατεστηµένη µε ένα άτοµο φθορίου. Όταν προστέθηκαν ογκώδεις οµάδες ως υποκαταστάτες στη θέση του αζώτου, τότε παρατηρήθηκαν οι σηµαντικότερες βελτιώσεις στη δράση των µορίων κατά των Gram-θετικών και αρνητικών βακτηρίων. Η κυκλοπρόπυλο οµάδα 20

34 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο που προστέθηκε συνέβαλλε σηµαντικά στη δράση κατά των Gram-αρνητικών ειδών και γι αυτό η χρήση της είναι ιδιαίτερα εκτεταµένη. Οι περισσότερες ενώσεις που έχουν αναπτυχθεί µε επιτυχία (κιπροφλοξακίνη, σπαρφλοξακίνη, γκρεπαφλοξακίνη, κλιναφλοξακίνη, µοξιφλοξακίνη, γκατιφλοξακίνη και γκεµιφλοξακίνη) ή που τώρα αναπτύσσονται, έχουν στο µόριό τους την κυκλοπρόπυλο οµάδα. Επίσης η σιταφλοξακίνη περιέχει επιπλέον ένα άτοµο φθορίου στην κυκλοπρόπυλο οµάδα. Ο δακτύλιος που ενώνει τις θέσεις 1 και 8 δοκιµάστηκε για πρώτη φορά σε µια από τις πρωταρχικές 6-φθοροκινολόνες, τη φλουµεκίνη, χωρίς ιδιαίτερα αποτελέσµατα. Αργότερα όµως, µόρια που αναπτύχθηκαν µε το δακτύλιο αυτόν, όπως η οφλοξακίνη, το L-ισοµερές της η λεβοφλοξακίνη και η ρουφλοξακίνη, παρουσίασαν βελτιωµένη δράση. Ένας 2,4-διφθοροφαίνυλο δακτύλιος στη θέση 1, όπως στη τεµαφλοξακίνη και στη τοζουφλοξακίνη, αρχικά δε θεωρήθηκε ότι βελτίωσε ιδιαίτερα τη δράση, αλλά η εισαγωγή του στην τροβαφλοξακίνη, που αναπτύχθηκε αργότερα, είχε ως αποτέλεσµα την ιδιαίτερη ανάπτυξη της δράσης κατά των Gram-θετικών βακτηρίων [6]. Πίνακας 2.1. Χηµική ονοµασία και οι αντίστοιχες συντοµογραφίες τους. Κινολόνες Χηµική Ονοµασία Συντοµογραφίες Αµιφλοξακίνη 6-φθορο-1,4-διυρδο-1-(µεθυλαµινο)-7-(4-µεθυλ-1- AMI πιπεραζινυλ)-4-οξο-3-κινολινοκαρβοξυλικό οξύ Βαλοφλοξακίνη 6-φθορο-8-µεθοξυ-1,4-διυδρο-4-οξο-7-(1-πιπεραζινυλ)- BAL 1,8-ναφθυριδιν-3-καρβοξυλικό οξύ Κιπροφλοξακίνη 1-κυκλοπροπυλο-6-φθορο-1,4-διυδρο-4-οξο-7-(1- CIP πιπεραζινυλ)-3-κινολινοκαρβοξυλικό οξύ Κλιναφλοξακίνη 7-(3-αµινο-1-πυρρολιδινυλ)-8-χλωρο-1-κυκλοπροπυλο- CLIN 6-φθορο-1,4-διυδρο-4-οξο-3- κινολινοκαρβοξυλικό οξύ Ντανοφλοξακίνη 7-[(l's,4's)-5'-µεθυλο-2',5'-διαζαδικυκλο[ ]επτ - 2' - DAN υλ] κυκλοπροπυλο φθορο- 1,4-διυδρο-4-οξο- 3- κινολινοκαρβοξυλικό οξύ Ντιφλιξακίνη 6-φθορο-1-(4-φθοροφαίνυλ)-1,4-διυδρο-7-(4-µεθυλ-1- DIF πιπεραζινυλ)-4-οξο-3- κινολινοκαρβοξυλικό οξύ Ενοξακίνη 1-αιθυλ-6-φθορο-1,4-διυδρο-4-οξο-7-(1- πιπεραζινυλ)- ENO 1,8 ναφθυριδινο-3-καρβοξυλικό οξύ) Ενροφλοξακίνη 1-κυκλοπροπυλο-6-φθορο-1,4-διυδρο-4-οξο-7-(4- ENR αιθυλο-1-πιπεραζινυλ)-3- κινολινοκαρβοξυλικό οξύ Φλεροξακίνη 6,8-διφθορο-1-(2-φθοροαιθυλο)-1,4-διυδρο-7(4- FLE µεθυλο-1-πιπεραζινυλ)-4-οξο-3-κινολινοκαρβοξυλικό οξύ Φλουµεκίνη 9-φθορο-6,7-διυδρο-5-µεθυλο-1-οξο-1H,5H-βενζο-(IJ)- κινολιζιν-2- καρβοξυλικό οξύ FLU 21

35 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο Πίνακας 2.1. Συνέχεια. Γκαρενοξακίνη Γκατιφλοξακίνη Γκεµιφλοξακίνη Γκρεπαφλοξακίνη Λεβοφλοξακίνη Λοµεφλοαξακίνη Μοξιφλοξακίνη Νορφλοξακίνη Οφλοξακίνη Πεφλοξακίνη Πιπεµιδικό οξύ Πιροµιδικό οξύ Ρουφλοξακίνη Σαραφλοξακίνη Σπαρφλοξακίνη Τεµαφλοξακίνη Τοζουφλοξακίνη Τροβαφλοξακίνη 1-κυκλοπροπυλο-8-(διφθοροµεθοξυ)-7-[(1R)-(1-µεθυλ- 2,3-διυδρο-1H-5-ισοινδολ]-4-οξο-1,4-διυδρο-3- κινολινοκαρβοξυλικό οξύ (±)-1-κυκλοπροπυλο-6-φθορο-1, 4-διυδρο-8-µεθοξυ-7- (3-µεθυλ-1-πιπεραζινυλ)- 4-οξο-3- κινολινοκαρβοξυλικό οξύ (R,S)-7-(3-αµινοµεθυλ-4-(syn)-µεθοξυϊµινο-1- πυρρολιδυνιλ)-1-κυκλοροπυλ-6-φθορο-1, 4-διυδρο-4- οξο-1, 8-ναφθυριδιν-3- καρβοξυλικό οξύ µεθανοθειϊκό 1-κυκλοπροπυλ-6-φθορο-1,4-διυδρο-5-µεθυλ-7-(3- µεθυλ-1-πιπεραζινυλ)-4-οξοκινολιν-3- καρβοξυλικό οξύ Λεβοφλοξακίνη είναι το δραστικό L-ισοµερές που αποµονώνεται από το ρακεµικό µίγµα της οφλοξακίνης. 1-αιθυλ-6,8-διφθορο-1,4-διυδρο-7-(3-µεθυλ-1- πιπεραζινυλ)-4-οξο-3- κινολινοκαρβοξυλικό οξύ 1-κυκλοπροπυλ-7-(2,8-διαζωδικυκλο[4.3.0]νανε)-6- φθορο-8-µεθοξυ-1,4-διυδρο-4-οξο-3- κινολινοκαρβοξυλικό οξύ 1-αιθυλ-6-φθορο-1,4-διυδρο-4-οξο-7-(1-πιπεραζινυλ)- 3-κινολινοκαρβοξυλικό οξύ (±)-9-φθορο-2,3-διυδρο-3-µεθυλ-10-(4-µεθυλ-1- πιπεραζινυλ)-7-οξο-7 H -πυριδο[1,2,3- de]-1,4- βενζιξαζιν-6-καρβοξυλικό οξύ 1-αιθυλ-6-φθορο-1,4-διυδρο-7-(4-µεθυλπιπεραζιν-1- υλ)-4-οξοκινολιν-3-καρβοξυλικό οξύ 8-αιθυλ-5,8-διυδρο-5-οξο-2-(1-πιπεραζινυλ)πυριδο(2,3- d)πυριµιδίνη-6-καρβοξυλικό οξύ 8-αιθυλ-5,8-διυδρο-5-οξο-2-(1- πυρρολιδινυλ)πυριδο(2,3-d) πυριµιδινη-6-καρβοξυλικό οξύ 9-φθορο-2,3-διυδρο-10-(4-µεθυλ-1-πιπεραζινυλ)-7-οξο- 7H-πυριδο[1,2,3-de]-1,4-βενζοθειαζιν-6-καρβοξυλικό οξύ 6-φθορο-1-(4-φθοροφαινυλ)-7-(3-µεθυλ-1- πιπεραζινυλ)-1,4-διυδρο-4-οξο-3- κινολινοκαρβοξυλικό οξύ 5-αµινο-1-κυκλοπροπυλ-7-(cis-3,5-διµεθυλ-πιπεραζιν- 1-υλ)-6,8-διφθορο-1,4-διυδρο-4-οξοινολιν-3- καρβοξυλικό οξύ 6-φθορο-1-(2,4-διφθοροφαινυλ)-7-(3-µεθυλ-1- πιπεραζινυλ)-1,4-διυδρο-4-οξο-3- κινολινοκαρβοξυλικό οξύ (±)-7-(3-αµινο-1-πυρρολιδινυλ)-1-(2,4-διφθοροφαινυλ)- 6-φθορο-1,4-διυδρο-4-οξο-1,8-ναφθυριδιν-3- καρβοξυλικό οξύ (1αλφα, 5αλφα, 6αλφα)-7-(6-αµινο-3- αζαδικυκλο[3.1.0]εξ-3-υλ)-1-(2,4-διφθοροφαινυλ)-6- φθορο-1,4-διυδρο-4-οξο-1,8-ναφθυριδιν-3-καρβοξυλικό οξύ GAR GAT GEM GREP LEV LOM MOX NOR OFL PEF PIP PIR RUF SAR SPAR TEM TOS TROV 22

36 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο Υποκατάσταση στη θέση 5 Η υποκατάσταση στη θέση 5 θεωρείται ότι βελτιώνει τη δράση κατά των Gramθετικών βακτηρίων. Είναι ξεκάθαρο όµως ότι αυτή η δράση επηρεάζεται σηµαντικά από την υποκατάσταση σε άλλες θέσεις, πράγµα που επιβεβαιώνεται από το γεγονός ότι όλες οι φθοροκινολόνες που χρησιµοποιούνται σήµερα (συµπεριλαµβανοµένης και της κιπροφλοξακίνης, της κλιναφλοξακίνης, της γκεµιφλοξακίνης, της γκατιφλοξακίνης, της οφλοξακίνης, της λεβοφλοξακίνης, της σιταφλοξακίνης και της τροβαφλοξακίνης) δεν έχουν παρά ένα άτοµο υδρογόνου στη θέση αυτή. Πολλές από τις παραπάνω ενώσεις έχουν ως υποκαταστάτη την κυκλοπρόπυλο οµάδα στη θέση 1, αλλά η δράση τους ως προς τα Gram-θετικά βακτήρια ποικίλλει και ορισµένες όπως η κλιναφλοξακίνη, η γκεµιφλοξακίνη, η µοξιφλοξακίνη και η σιταφλοξακίνη, έχουν ιδιαίτερα αναπτυγµένη δράση, αποδεικνύοντας ότι η δράση κατά των Gram-θετικών βακτηρίων επηρεάζεται από την υποκατάσταση και σε άλλες θέσεις. Γενικά έχει αποδειχθεί ότι οι ογκώδεις υποκαταστάτες στη θέση 5 µειώνουν σηµαντικά τη δράση, ίσως επειδή η θέση αυτή βρίσκεται κοντά στις θέσεις 3 και 4 που συµπλέκονται µε το DNA. Υποκαταστάτες στη θέση 5 που βελτιώνουν τη δράση κατά των Gram-θετικών βακτηρίων είναι η µέθυλο οµάδα (όπως στη γκρεπαφλοξακίνη) και η άµινο οµάδα (όπως είναι η σπαρφλοξακίνη) [6] Υποκατάσταση στη θέση 7 Με εισαγωγή υποκαταστάτη στη θέση 7 παρατηρούνται σηµαντικές αλλαγές στη δραστικότητα του µορίου και έχει αποδειχθεί ότι ετεροκυκλικές οµάδες µε ένα άτοµο αζώτου συµβάλλουν σηµαντικά στη δραστικότητα, επηρεάζοντας τη φαρµακοκινητική του µορίου, θεώρηση που αρχικά αποδείχθηκε από την εισαγωγή του πιπεραζινικού δακτυλίου στη θέση 7, όπως είναι στην περίπτωση του πιπεµιδικού οξέος. Η νορφλοξακίνη, η ενοξακίνη και η κιπροφλοξακίνη έχουν ως υποκαταστάτη στη θέση 7 τον πιπεραζινικό δακτύλιο, βελτιώνοντας τη δράση κατά των Gramαρνητικών βακτηρίων, ενώ η γκρεπαφλοξακίνη, η λοµεφλοξακίνη και η φλεροξακίνη έχουν τον 3-µεθυλο πιπεραζινικό δακτύλιο, η οφλοξακίνη και η λεβοφλοξακίνη έχουν το 4-µεθυλο πιπεραζινικό δακτύλιο και η σπαρφλοξακίνη τον 3,5-διµεθυλο πιπεραζινικό δακτύλιο. Οι πιπεραζινικοί αυτοί υποκαταστάτες έχουν αποτελεσµατική δράση κατά των Gram-θετικών βακτηρίων και θεωρείται ότι βελτιώνουν τη διείσδυση στα βακτηριακά κύτταρα. 23

37 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο Επίσης ενώσεις που έχουν στο µόριο τους ως υποκαταστάτες κάποια αµινοπυρρολιδίνη παρουσιάζουν βελτιωµένη δράση κατά των Gram-θετικών βακτηρίων, ενώ µόνος του ο πυρρολιδινικός δακτύλιος µειώνει τη δραστικότητα του µορίου. Γενικά, ενώσεις µε υποκαταστάτη τον 7-αµινο-πυρρολιδινικό δακτύλιο είναι πολύ πιο δραστικές κατά των Gram-θετικών βακτηρίων συγκριτικά µε τις αντίστοιχες ενώσεις που έχουν ως υποκαταστάτη τον 7-πιπεραζινικό δακτύλιο. Η τοζουφλοξακίνη και η κλιναφλοξακίνη έχουν και οι δύο την 3-άµινο πυρρολιδίνη ως υποκαταστάτη και η σιταφλοξακίνη µια 3-άµινο, 4-κυκλοέξυλο οµάδα. Οι ενώσεις αυτές έχουν εξαιρετική δράση κατά των Gram-θετικών βακτηρίων. Στη γκατιφλοξακίνη ο δακτύλιος έχει ως υποκαταστάτη µια 3-άµινο, 4-µέθυλο οµάδα. Η γκεµιφλοξακίνη διαφέρει γιατί έχει στον πυρρολιδινικό δακτύλιο, τους υποκαταστάτες 3-αµινοµέθυλο οµάδα και την 4-µεθυλοξίµινο οµάδα. Έχει αποδειχθεί ότι το µέγεθος και η λιποδιαλυτότητα της οξιµινο-αλκυλ-οµάδας στη πυρρολιδίνη της θέσης 7 επηρεάζει σηµαντικά την αντιβακτηρική δραστηριότητα και τη φαρµακοκινητική των φθοροκινολονών. Καθώς αυξάνεται το µήκος των άλκυλοαλυσίδων αυξάνεται και η δράση κατά των Gram-θετικών βακτηρίων και µειώνεται αντίστοιχα η δράση κατά των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Ογκώδεις υποκαταστάτες όπως η βένζυλο οµάδα, ενώ εξασφαλίζουν τη δραστικότητα του µορίου, εµφανίζουν µειωµένη φαρµακοκινητική και φυσικοχηµικές ιδιότητες. Για την οµάδα αυτή αποδείχθηκε ότι ενώσεις µε δακτύλιο πέντε ατόµων είναι πιο δραστικές από αυτές µε δακτύλιο έξι ατόµων και η δράση τους αυξάνεται παρουσία τόσο της αµινοµέθυλο οµάδας, όσο και της µεθοξυ-ΐµινο οµάδας, των οποίων η δράση είναι συνεργιστική. Η γκεµιφλοξακίνη έχει το βέλτιστο συνδυασµό δακτυλίου πέντε µελών µε µικρή άλκυλο οµάδα (µέθυλο) στην οξίµινο οµάδα και παρουσιάζει υψηλή δραστικότητα κατά των Gram-θετικών µορφών. Μια άλλη σπάνια µορφή πλευρικού υποκαταστάτη στη θέση 7 είναι ο δικυκλικός δακτύλιος, που έχει ένα δεύτερο δακτύλιο ενωµένο µε τον πυρρολιδινικό. Η µοξιφλοξακίνη έχει ένα διαζαδικυκλικό δακτύλιο, ενώ η τροβαφλοξακίνη ένα αζαδικυκλικό δακτύλιο. Και οι δύο αυτές ενώσεις παρουσιάζουν ικανοποιητική δράση κατά των Gram-θετικών βακτηρίων [5, 9]. 24

38 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο Υποκατάσταση στη θέση 8 Η υποκατάσταση στη θέση 8 επηρεάζει τις in vivo ιδιότητες και την αντιβακτηριακή δράση, ιδίως κατά των αναερόβιων µορφών. Οι ναφθυριδόνες έχουν ένα άτοµο αζώτου στη θέση του κυκλικού άνθρακα (ενοξακίνη, τοζουφλοξακίνη, τροβαφλοξακίνη και γκεµιφλοξακίνη). Πρόσφατες µελέτες απέδειξαν πως οι πιο ευνοϊκοί υποκαταστάτες στη θέση 8 είναι τα αλογονο-παράγωγα (ένας χλώρο ή φθόρο-υποκαταστάτης), αλλά πολλές 8-χλωροκινολόνες παρουσιάζουν µικρή σταθερότητα στην υπεριώδη ακτινοβολία, φωτοτοξικότητα και δεν έχουν αναπτυχθεί ιδιαίτερα παρά τη εξαιρετική τους δραστικότητα. Για την κλιναφλοξακίνη και τη σιταφλοξακίνη που περιέχουν την 8-χλωρο-οµάδα υπάρχουν αµφιβολίες σχετικά µε την κλινική τους εξέλιξη. Επίσης η 8-φθορο-οµάδα ευθύνεται για τη φωτοτοξικότητα του µορίου, όπως συµβαίνει µε τη σπαρφλοξακίνη, τη φλεροξακίνη και τη λοµεφλοξακίνη. Η χρήση της λοµεφλοξακίνης έχει απαγορευτεί, ενώ η χρήση της σπαρφλοξακίνης και της φλεροξακίνης είναι περιορισµένη [6]. Η µεθοξυ-οµάδα στη θέση 8 συµβάλλει στην καλή αναερόβια δράση, χωρίς να επηρεάζει τη φωτοτοξικότητα του µορίου. Η µοξιφλοξακίνη και η γκατιφλοξακίνη έχουν αυτή την οµάδα και προ-κλινικές µελέτες απέδειξαν ότι έχουν µειωµένη φωτοτοξική δραστικότητα. Πλήθος όµως κινολονών στη θέση 8 του κυκλικού άνθρακα έχουν ως υποκαταστάτη το υδρογόνο. Παράδειγµατα αποτελούν η νορφλοξακίνη, η πεφλοξακίνη, η κιπροφλοξακίνη και η γκρεπαφλοξακίνη. 2.4 Αντιµικροβιακή δράση Τα µέλη της πρώτης γενιάς των αντιβιοτικών (ναλιδιξικό οξύ, φλουµεκίνη, οξολινικό οξύ) ήταν δραστικά κυρίως κατά των Gram-αρνητικών βακτηρίων (Salmonella spp. E. coli, Bordella spp. και Yersinia spp.). Από τη σύνθεση της νορφλοξακίνης, ξεκίνησε η δεύτερη γενιά των κινολονών, που ονοµάστηκαν «φθοροκινολόνες». Το φάσµα δράσης των φθοροκινολονών διευρύνθηκε και κατά των Gram-θετικών βακτηρίων (Staphylococci, Streptococci, Listeria monocytogenes), συµπεριλαµβάνοντας επίσης τα Campylobacter spp, Pseudomonas aeruginosa, Mycoplasma spp και κατά των Gram-θετικών και Gram-αρνητικών αναερόβιων βακτηρίων. Εξαιρετική in vitro δράση παρατηρείται κατά των περισσότερων εντεροβακτηρίων, περίπλοκων Gram-αρνητικών βακτηρίων, συµπεριλαµβανοµένων 25

39 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο των Haemophilus spp. και Gram-αρνητικών βακτηρίων, όπως οι Neissera gonorrhea, Neissera meningitides και Moraxella catarrhalis. Η 8-µεθοξυ-οµάδα των κινολονών έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει επίσης τη δράση τους κατά των Gram-θετικών βακτηρίων [10]. Η δράση των κινολονών δεν επηρεάζεται από την ανθεκτικότητα και την ευαισθησία στις β-λακτάµες και στα µακρολίδια. Προς το παρόν είναι λίγες οι διαθέσιµες συγκριτικές µελέτες σχετικά µε τα νέα µόρια φθοροκινολονών, όπως είναι η γκεµιφλοξακίνη και η σιταφλοξακίνη και µόνο λίγα συγκριτικά δεδοµένα έχουν δηµοσιευτεί για τη µοξιφλοξακίνη και τη γκατιφλοξακίνη. Οι µέχρι σήµερα µαρτυρίες από έρευνες που βρίσκονται ακόµα σε εξέλιξη, θέλουν την κλιναφλοξακίνη, τη σιταφλοξακίνη και τη γκεµιφλοξακίνη να έχουν την ευρύτερη και καλύτερη δράση, ενώ τη γκατιφλοξακίνη, τη µοξιφλοξακίνη και τη τροβαφλοξακίνη να έχουν επίσης αρκετά µεγάλο φάσµα δράσης. Το φάσµα δράσης της γκεµιφλοξακίνης είναι ευρύ, µε εξαίρεση τη σχετικά µικρή δράση έναντι των αναερόβιων [6]. 2.5 Μηχανισµοί δράσης Είναι γνωστό ότι οι κινολόνες αλληλεπιδρούν µε δύο σχετιζόµενες αλλά διακριτές µονάδες µέσα στο βακτηριακό κύτταρο, τη DNA-γυράση και την τοποϊσοµεράση IV. Η DNA-γυράση ήταν ο πρώτος στόχος των κινολονών, ο οποίος ταυτοποιήθηκε ύστερα από γενετικές µελέτες του ναλιδιξικού οξέος. Με την ανακάλυψη της E. coli τοποϊσοµεράσης IV αποκαλύφθηκε η οµολογία ανάµεσα στα δύο ένζυµα και έτσι άρχισε η µελέτη της δράσης των κινολονών σε σχέση µε την τοποϊσοµεράση IV. Οι δύο αυτές τοποϊσοµεράσες είναι ένζυµα αρκετά ανθεκτικά στα βακτήρια, δεν υπάρχουν στους ανώτερους οργανισµούς και γι αυτό είναι και επιβλαβείς. Παρεµβαίνουν στην τροποποίηση του DNA και εµπλέκονται στη διαδικασία της αντιγραφής, της µεταγραφής και στο διαχωρισµό των χρωµοσωµάτων και των πλασµιδίων. Η DNA-γυράση και η τοποϊσοµεράση IV ελέγχουν το βαθµό της αρνητικής αναδίπλωσης του βακτηριακού DNA. Τα δύο ένζυµα είναι ικανά να διαχωρίσουν και να συνδέσουν τις κυκλικές αλυσίδες του DNA, πραγµατοποιώντας ταυτόχρονα την παροδική τοµή του ενός κλώνου του DNA, εξαναγκάζοντας τον άλλο κλώνο να 26

40 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο περάσει µέσα από το σηµείο τοµής του πρώτου. Η ενέργεια που απαιτείται προέρχεται από την υδρόλυση του ATP (Αδενοσινοτριφωσφορικό οξύ). Η DNA-γυράση αποτελείται από τέσσερα τµήµατα, τις δύο υποµονάδες Α και τις δύο υποµονάδες Β, οι οποίες έχουν τους κωδικούς gyra και gyrb, αντίστοιχα (Σχήµα 2.4). Ο ρόλος της είναι να διατηρεί ένα συγκεκριµένο βαθµό αρνητικής αναδίπλωσης του DNA. ιευκολύνει τη µεταγραφή και την αντιγραφή του DNA, προσθέτοντας µια επιπλέον αρνητική αναδίπλωση στο πάνω µέρος του συµπλέγµατος. Σχήµα 2.4: οµή και λειτουργία της DNA-γυράσης. Η τοποϊσοµεράση IV αποτελείται και αυτή από τέσσερις υποµονάδες ανάλογες µε αυτές της DNA-γυράσης, τις parc και pare. Το ένζυµο αυτό συµµετέχει επίσης στο κόψιµο των κλώνων του DNA, αλλά η δράση του είναι πέντε φορές µικρότερη από τη δράση του για το διαχωρισµό των αλυσίδων του DNA, ύστερα από την αντιγραφή του. Παρεµβαίνει επίσης στην υποδιαίρεση των χρωµοσωµάτων κατά την ανάπτυξη του βακτηρίου. 27

41 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο Ο τρόπος µε τον οποίο δρά η κινολόνη πάνω στην DNA-γυράση ή στην τοποϊσοµεράση IV, αντίστοιχα, περιγράφεται ως εξής: Η DNA-γυράση ή η τοποϊσοµεράση IV, µε το DNA και τις κινολόνες σχηµατίζουν ένα τριµελές σύµπλοκο. Οι κινολόνες συνδέονται στις υποµονάδες gyra ή parc αντίστοιχα και το DNA παραµένει ακόµα στο σύµπλοκο. Κόβεται ο πρώτος κλώνος του DNA. Κόβεται και δεύτερος κλώνος του DNA. Οι δύο κλώνοι απελευθερώνονται από το σύµπλοκο και ενώ στην περίπτωση των κινολονών πρώτης γενιάς εµποδιζόταν η δράση τους από τη χλωραµφενικόλη (Cm), δε συµβαίνει πλέον το ίδιο και µε τις φθοροκινολόνες. Η πολύπλοκη µορφή του DNA και η DNA-γυράση εµποδίζονται από τις κινολόνες, οι οποίες αποτρέπουν τη σύνθεση του DNA και την κυτταρική ανάπτυξη. Ο µηχανισµός αυτός φαίνεται στο Σχήµα 2.5 [11]. 2.6 Φαρµακοκινητική Οι κινολόνες κυκλοφορούν σε σκευάσµατα που χορηγούνται από το στόµα και σε ενέσιµα διαλύµατα. Γενικά απορροφώνται εύκολα από τον οργανισµό και παρουσιάζουν υψηλή βιοδιαθεσιµότητα, διεισδύουν εύκολα στους ιστούς, δεσµεύουν µερικώς τις πρωτεΐνες και έχουν γενικά µεγάλη ηµιπερίοδο ζωής µέχρι την αφοµοίωσή τους. Οι κυριότεροι φαρµακοκινητικοί παράγοντες των κινολονών που θα πρέπει να συνυπολογίζονται πριν τη χορήγησή τους για την αντιµετώπιση λοιµώξεων του ουροποιητικού συστήµατος είναι οι συγκεντρώσεις τους στον ορό του αίµατος, η ηµιπερίοδος ζωής τους και το ποσοστό που εκκρίνεται κατά την αντιβακτηριακή δραστηριότητα, πράγµα που µπορεί να επηρεάσει τη βιοδιαθεσιµότητά τους [10]. Ο χρόνος που απαιτείται από τη στιγµή της χορήγησης από το στόµα µέχρι να αγγίξει η κινολόνη τη µέγιστη συγκέντρωση κυµαίνεται από µισή µέχρι τρεις ώρες, εκτός από τη σπαρφλοξακίνη για την οποία απαιτούνται τέσσερις έως πέντε ώρες. Επίσης διαφέρει η νεφρική απέκκριση, καθώς και η βιοδιαθεσιµότητά τους. Η βιοδιαθεσιµότητα της κιπροφλοξακίνης είναι >70%, της ενοξακίνης >90%, της 28

42 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο λοµεφλοξακίνης 95-98%, της οφλοξακίνης % και της νορφλοξακίνης 30-70% [10, 12]. Όλες οι φθοροκινολόνες απορροφώνται ύστερα από συνδυαστική λειτουργία των νεφρών και του ήπατος. Η σωστή νεφρική λειτουργία είναι καθοριστική για την αφοµοίωση των κινολονών, ακόµα και όταν απλώς ανιχνεύονται µικρά ποσοστά αµετάβλητου φαρµάκου στα ούρα. Το ποσοστό µεταβολισµού της κάθε ένωσης ποικίλλει. Υψηλή νεφρική απέκκριση παρατηρείται για τη γκατιφλοξακίνη (80%), τη λεβοφλοξακίνη (84%), τη λοµεφλοξακίνη (75%) και την οφλοξακίνη (81%). Μέτριος βαθµός απέκκρισης παρατηρείται για την κιπροφλοξακίνη (43%), την ενοξακίνη (53%) και τη φλεροξακίνη (67%), ενώ χαµηλός βαθµός απέκκρισης παρατηρείται για τη γκεµιφλοξακίνη (28%), τη µοξιφλοξακίνη (20%), τη νορφλοξακίνη (20%), την πεφλοξακίνη (14%) και τη σπαρφλοξακίνη (10%). Σχήµα 2.5: Τρόπος δράσης των κινολονών ενάντια στη DNA-γυράση και στην τοποϊσοµεράση IV. 29

43 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο Ο βαθµός της πρωτεϊνικής δέσµευσης των νεότερων φθοροκινολονών είναι σχετικά χαµηλός: περίπου 30% για την κιπροφλοξακίνη, 20% για την οφλοξακίνη και 10% για τη λοµεφλοξακίνη. Οι φθοροκινολόνες παρουσιάζουν εξαιρετική απορρόφηση από τους ιστούς. Οι συγκεντρώσεις τους στον προστάτη αδένα και στους ιστούς του γυναικείου γεννητικού συστήµατος, στη χολή, στο ήπαρ και στα παγκρεατικά υγρά είναι ακόµα µεγαλύτερες από τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις τους στον ορό του αίµατος. Σηµαντικές είναι οι αλληλεπιδράσεις των νεότερων φθοροκινολονών µε δύο άλλα φαρµακευτικά σκευάσµατα. Παρατηρήθηκε µικρή βιοδιαθεσιµότητα των φθοροκινολονών µε µείωση της γαστρεντερικής απορρόφησης, όταν χορηγούνται ταυτόχρονα αντι-όξινα σκευάσµατα µαγνησίου-αργιλλίου. Επίσης παρατηρείται αναστολή της µεταβολής της θεοφυλλίνης, όταν χορηγούνται ταυτόχρονα κάποια φθοροκινολόνη και θεοφυλλίνη. 2.7 Ταξινόµηση κινολονών Η ταξινόµηση των κινολονών µπορεί να γίνει µε διάφορα κριτήρια: την ηµεροµηνία έγκρισής τους, τη γενιά τους, τη χηµική τους δοµή, το αντιβακτηριακό τους φάσµα δράσης, τη µορφή µε την οποία χορηγούνται κ.ά. Παρ όλα αυτά δεν προτείνεται κάποια συγκεκριµένη ταξινόµησή τους. ιαφορετικές απόψεις προτείνονται από τους ειδικούς καταλήγοντας σε περισσότερα από ένα µοντέλα ταξινόµησής τους [10, 13]. Μια πρώτη ταξινόµησή τους µπορεί να είναι αυτή που χωρίζει τις κινολόνες σε δύο γενιές. Οι πρώτης γενιάς είναι οι κινολόνες που δεν περιέχουν το άτοµο του φθορίου στο µόριό τους, όπως είναι το ναλιδιξικό οξύ και το οξολινικό οξύ και οι δεύτερης γενιάς που περιλαµβάνονται οι ενώσεις που φέρουν άτοµο φθορίου. Η αντιµικροβιακή δράση των κινολονών είναι σηµαντικό κριτήριο για την οµαδοποίησή τους σε τέσσερις κατηγορίες. Στον Πίνακα 2.2 γίνεται µια προσπάθεια ταξινόµησής τους µε βάση την αντιµικροβιακή τους δράση. Προκειµένου να εκφραστεί η αντιµικροβιακή τους δράση, οι ενώσεις της κάθε οµάδας δίνονται µε αυξανόµενη την in vitro δραστικότητά τους, έναντι των αντίστοιχων βακτηρίων στόχων. Βέβαια τα όρια µεταξύ των οµάδων δε µπορεί να είναι ιδιαίτερα αυστηρά. Οι 30

44 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο ενώσεις της οµάδας Ι είναι οι κινολόνες της πρώτης γενιάς, που έχουν περιορισµένη δράση σε µολύνσεις του ουροποιητικού συστήµατος που προέρχονται από τα βακτήρια Escherichia και άλλα είδη όπως Enterobacteriaceae, καθώς επίσης και τα Staphylococci, Enterococci και µη-ενζυµικά, βακτήρια όπως Pseudomonas spp. Οι ενώσεις της οµάδας ΙΙ παρουσιάζουν ισχυρή in vitro δράση κατά των βακτηρίων Enterobacteriaceae και Haemophilus, ενώ µειωµένη µόνο δραστικότητα παρατηρείται κατά των Staphylococci, Pneumococci, Enterococci και των «άτυπων» παθογόνων µικροοργανισµών (Chlamydia και Mycoplasma). Στην οµάδα αυτή, η in vitro δραστικότητα κατά των Pseudomonas aeruginosa, ποικίλλει. Πίνακας 2.2: Ταξινόµηση των φθοροκινολονών σύµφωνα µε το αντιµικροβιακό φάσµα δράσης. Οµάδα Αντιµικροβιακή δράση Φθοροκινολόνες I Φθοροκινολόνες που χορηγούνται από το στόµα µε µειωµένη σχετικά δράση κατά των λοιµώξεων του ουροποιητικού Νορφλοξακίνη Πεφλοξακίνη II Φθοροκινολόνες ευρέος φάσµατος µε συστηµατική χρήση III IV Φθοροκινολόνες µε υψηλή δραστικότητα κατά των Gram-θετικών βακτηρίων και των άτυπων παθογόνων µικροοργανισµών Φθοροκινολόνες µε υψηλή δραστικότητα κατά των Gram-θετικών βακτηρίων και των άτυπων παθογόνων καθώς επίσης και των αναερόβιων µικροοργανισµών Ενοξακίνη Φλεροξακίνη Οφλοξακίνη Λοµεφλοξακίνη Κιπροφλοξακίνη Λεβοφλοξακίνη Σπαρφλοξακίνη Γκατιφλοξακίνη Μοξιφλοξακίνη Γκεµιφλοξακίνη Σηµαντικές διαφορές υπάρχουν σε σχέση µε την φαρµακοκινητική τους, δηλαδή τον τρόπο απορρόφησης, κατανοµής, µεταβολισµού και απέκκρισης των κινολονών που χορηγούνται σε οποιονδήποτε ζωντανό οργανισµό. Η βιοδιαθεσιµότητά τους, ο τρόπος µε τον οποίο απορροφώνται από τον ανθρώπινο οργανισµό, αλλά και από τον οργανισµό των ζώων, κυµαίνεται µεταξύ 60 και σχεδόν 100%. Όλα τα σκευάσµατα της οµάδας ΙΙ πρωταρχικά απορροφώνται από τους νεφρούς, µε νεφρική απέκκριση που ποικίλλει µεταξύ 65 και 100%. Η ηµιπερίοδος ζωής στον ορό του αίµατος µπορεί να είναι από τρεις έως έντεκα ώρες. Η µέτρηση 31

45 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο της βιοδιαθεσιµότητας οποιουδήποτε φαρµάκου γίνεται για να µελετηθεί ο κύκλος του µέσα στο σώµα σε σχέση µε την απορρόφησή του και το χρόνο ηµιζωής. Στη φαρµακολογία ο όρος «βιοδιαθεσιµότητα» χρησιµοποιείται για να περιγράψει το κλάσµα του χορηγούµενου φαρµάκου που δεν έχει µεταβολιστεί και φτάνει στα ζωτικά όργανα. Η βιοδιαθεσιµότητα είναι µια από τις κυριότερες φαρµακοκινητικές ιδιότητες του φαρµάκου. Οι οµάδες ΙΙΙ και IV διαφέρουν από την οµάδα ΙΙ, σε σχέση µε τη δραστικότητα των ενώσεων των κατηγοριών αυτών κατά των Gram-θετικών βακτηρίων, όπως staphylococci, streptococci, pneumonococci και enterococci. Ενώ οι ενώσεις της οµάδας ΙΙ είναι δραστικότερες κατά των Gram-αρνητικών παθογόνων. Επιπλέον χαρακτηριστικά των ενώσεων των οµάδων ΙΙ και IV είναι η βελτιωµένη τους δράση κατά των «άτυπων» παθογόνων µικροοργανισµών Chlamydia και Mycoplasma. Στην οµάδα IV παρατηρείται ιδιαίτερα αναπτυγµένη δραστικότητα κατά των αναερόβιων στελεχών. Οι ενώσεις των οµάδων αυτών έχουν γενικότερα υψηλότερη βιοδιαθεσιµότητα και µεγαλύτερη ηµιπερίοδο ζωής, σε σχέση µε τις περισσότερες ενώσεις των οµάδων Ι και ΙΙ, εκτός από την πεφλοξακίνη (Ι) και τη φλεροξακίνη (ΙΙ). Μια άλλη ταξινόµηση των κινολονών η οποία βασίζεται στις κλινικές εφαρµογές, δίνεται στον Πίνακα 2.3. Σύµφωνα µε αυτή την ταξινόµηση, οι κινολόνες της πρώτης γενιάς π.χ. ναλιδιξικό και οξολινικό οξύ είναι ενώσεις µε Gram αρνητική δράση, που συνήθως χρησιµοποιούνται για τη θεραπεία λοιµώξεων του ουροποιητικού συστήµατος. Οι δεύτερης γενιάς π.χ. νορφλοξακίνη, κιπροφλοξακίνη, διαθέτουν δράση κατά των Gram-θετικών και αρνητικών βακτηρίων. Τα µέλη της τρίτης γενιάς όπως η τεµαφλοξακίνη έχουν ισχυρή δράση κατά των Staphylococci, καθώς και διευρυµένο φάσµα δράσης κατά των αναερόβιων βακτηρίων, Chlamydia και Mycoplasma. Τα µέλη της τέταρτης γενιάς χρησιµοποιούνται για ενδο-γαστρικές λοιµώξεις, µεταξύ άλλων εφαρµογών. Τέλος στον Πίνακα 2.4 γίνεται ταξινόµηση των κινολονών µε βάση τους υποκαταστάτες στις θέσεις Ν-1, C-5 και C-7, στη θέση 8 και στα τρικυκλικά µόρια [14]. 32

46 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο Πίνακας 2.3: Ταξινόµηση των κινολονών σύµφωνα µε την κλινική τους χρήση και το αντιµικροβιακό τους φάσµα δράσης. Κινολόνες Κλινικές Εφαρµογές Ταξινόµηση Ναλιδιξικό οξύ Κινοξακίνη Οξολινικό οξύ Φλουµεκίνη Πιπεµιδικό οξύ Ροζοξακίνη Λοµεφλοξακίνη Νορφλοξακίνη Οφλοξακίνη Ενροφλοξακίνη Κιπροφλοξακίνη Ενοξακίνη Αµιφλοξακίνη Φλεροξακίνη Γκατιφλοξακίνη Γκεµιφλοξακίνη Πεφλοξακίνη Ρουφλοξακίνη Σπαρφλοξακίνη Τεµαφλοξακίνη Τοζουφλοξακίνη Σαραφλοξακίνη Γρεπαφλοξακίνη Λεβοφλοξακίνη Μαξιφλοξακίνη Τροβαφλοξακίνη -Απλές µολύνσεις του ουροποιητικού συστήµατος - Απλές µολύνσεις του ουροποιητικού συστήµατος - Πολύπλοκες µολύνσεις του ουροποιητικού συστήµατος -Πυελονεφρίτιδα -Σεξουαλικά µεταδιδόµενες ασθένειες -Προστάτης αδένας -Μολύνσεις του δέρµατος και των ιστών - Απλές µολύνσεις του ουροποιητικού συστήµατος - Πολύπλοκες µολύνσεις του ουροποιητικού συστήµατος -Πυελονεφρίτιδα -Σεξουαλικά µεταδιδόµενες ασθένειες -Προστάτης αδένας -Μολύνσεις του δέρµατος και των ιστών -Οξείες χρόνιες βρογχίτιδες -ιογενείς πνευµονίες - ράσεις των τριών πρώτων γενεών -Ενδο-γαστρικές µολύνσεις -Εξαιρετικά πολύπλοκες µολύνσεις του ουροποιητικού συστήµατος -Εξαιρετικές πυελονεφρίτιδες -Ενδονοσοκοµειακές πνευµονίες -Γυναικολογικές µολύνσεις 1 ης γενιάς κινολόνες 2 ης γενιάς κινολόνες 3 ης γενιάς κινολόνες 4 ης γενιάς κινολόνες 33

47 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο Πίνακας 2.4: Ταξινόµηση των κινολονών µε βάση του υποκαταστάτες και τη µορφή του µορίου. Κινολόνες Υποκαταστάτες Κινολόνες Υποκαταστάτες Υποκατάσταση στη θέση N-1 Υποκατάσταση στη θέση C-7 Νορφλαξακίνη Αίθυλο Τροβαφλοξακίνη ίκυκλο Ενοξακίνη Αίθυλο Μοξιφλοξακίνη ίκυκλο Λοµεφλοξακίνη Αίθυλο Ντανοφλοξακίνη ίκυκλο Φλεροξακίνη Φθοροαίθυλο Γκαρενοξακίνη ίκυκλο Ντιφλοξακίνη Φθοροφαίνυλο Κιπροφλοξακίνη Πιπεραζίνυλο Τεµαφλοξακίνη ιφθοροφαίνυλο Λοµεφλοξακόνη Πιπεραζίνυλο Τροβαφλοξακίνη ιφθοροφαίνυλο Νορφλοξακίνη Πιπεραζίνυλο Αµιφλοξακίνη Μεθυλάµινο Φλεροξακίνη Πιπεραζίνυλο Κιπροφλοξακίνη Κυκλοπρόπυλο Οφλοξακίνη Πιπεραζίνυλο Γκρεπαφλοξακίνη Κυκλοπρόπυλο Σπαρφλοξακίνη Πιπεραζίνυλο Αλουµοφλοξακίνη Κυκλοπρόπυλο Γκρεπαφλοξακίνη Πιπεραζίνυλο Γκεµιφλοξακίνη Κυκλοπρόπυλο Γκατιφλοξακίνη Πιπεραζίνυλο Μοξιφλοξακίνη Κυκλοπρόπυλο Λεβοφλοξακίνη Πιπεραζίνυλο Εκενοφλοξακίνη Κυκλοπρόπυλο Κλιναφλοξακίνη Πυρρολίδινυλο Βαλοφλοξακίνη Κυκλοπρόπυλο Ναδιφλοξακίνη Πυρρολίδινυλο Υποκατάσταση Πυρρολίδινυλο Σιταφλοξακίνη στη θέση C-5 Σπαρφλοξακίνη Αµίνη Ιρλοφλοξακίνη Πύρρυλο Γκρεπαφλοξακίνη Μέθυλο Βαλοφλοξακίνη Πιπεριδίνυλο Υποκατάσταση στη θέση 8 Τρικυκλικά παράγωγα Σπαρφλοξακίνη Φθόρο Αµπουφλοξακίνη Λοµεφλοξακίνη Φθόρο Ντροξακίνη Φλεροξακίνη Φθόρο Φλουµεκίνη Κιπροφλοξακίνη Μέθυλο Λεβοφλοξακίνη Τεµαφλοξακίνη Μέθυλο Μαρµποφλοξακίνη Πεφλοξακίνη Μέθυλο Μιλοξακίνη Νορφλοξακίνη Μέθυλο Οφλοξακίνη Γκρεπαφλοξακίνη Μέθυλο Οξολινικό οξύ Κλιναφλιξακίνη Χλώρο Παζουφλοξακίνη Σιταφλοξακίνη Χλώρο Προυλιφλοξακίνη Ενοξακίνη Άζω Ρουφλοξακίνη Τοζουφλοξακίνη Άζω Βερµπαφλοξακίνη Γκεµιφλοξακίνη Άζω Τροβαφλοξακίνη Άζω Εκενοφλοξακίνη Άζω Αλατροφλοξακίνη Άζω Γκατιφλοξακίνη Μέθοξυ Παζουφλοξακίνη Μέθοξυ Βαλοφλοξακίνη Μέθοξυ Μοξιφλοξακίνη Μέθοξυ Γκαρενοξακίνη Μέθοξυ 34

48 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 2 ο 2.8 Χρήση στην Ιατρική και στην Κτηνιατρική Οι κινολόνες και ειδικότερα οι φθοροκινολόνες χρησιµοποιούνται ευρέως στην ιατρική και θεωρούνται ιδιαίτερα αποτελεσµατικά και ασφαλή φάρµακα. Χρησιµοποιούνται κυρίως για την αντιµετώπιση µολύνσεων του ουροποιητικού συστήµατος, συµπεριλαµβανοµένων του προστάτη αδένα, των γαστρεντερικών µολύνσεων και της διάρροιας των ταξιδιωτών. Επίσης χρησιµοποιούνται στη θεραπεία µολύνσεων των αναπνευστικών οργάνων, δερµατικών µολύνσεων, ενδογαστρικών µολύνσεων και σεξουαλικώς µεταδιδόµενων ασθενειών. Τέλος χρησιµοποιούνται και µετεγχειρητικά για λόγους προφύλαξης. Οι γαστρεντερικές διαταραχές, η ναυτία, ο έµετος και η διάρροια είναι οι συνηθέστερες παρενέργειες των κινολονών. Σπάνια έχουν αναφερθεί φαινόµενα αϋπνίας, πονοκεφάλων και οπτικών ενοχλήσεων. Οι κινολόνες δεν συνιστάται να χρησιµοποιούνται σε παιδιά, εφήβους, εγκύους και γυναίκες κατά την περίοδο του θηλασµού, γιατί έχει παρατηρηθεί ότι προκαλούν ρήξη των αρθρώσεων στους ανώριµους οργανισµούς. Σηµαντική και ολοένα αυξανόµενη είναι την τελευταία δεκαετία η χρήση των κινολονών και των φθοροκινολονών στην κτηνιατρική. Η σαραφλοξακίνη ήταν η πρώτη φθοροκινολόνη, η χρήση της οποίας επιτράπηκε για θεραπευτικούς σκοπούς στα πουλερικά, από τον Αµερικάνικο Οργανισµό Τροφίµων και Φαρµάκων (US Food and Drug Administration). Έκτοτε οι κινολόνες άρχισαν να χρησιµοποιούνται στην κτηνοτροφία, στην πτηνοτροφία και στις ιχθυοκαλλιέργειες για την αντιµετώπιση λοιµώξεων του ουροποιητικού, του αναπνευστικού και του γαστρεντερικού συστήµατος. Επίσης χρησιµοποιούνται για τη θεραπεία κτηνιατρικών νοσηµάτων σε ζώα που προορίζονται για κατανάλωση από τον άνθρωπο. Αρκετές κινολόνες αναπτύχθηκαν αποκλειστικά για κτηνιατρική χρήση. Για παράδειγµα η ντανοφλοξακίνη, η ενροφλοξακίνη και η σαραφλοξακίνη χρησιµοποιούνται για τη θεραπεία αναπνευστικών και εντερικών βακτηριακών µολύνσεων στην πτηνοτροφία, στην κτηνοτροφία και στις ιχθυοκαλλιέργειες [10, 11, 15]. 35

49 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 3 ο 3. Η ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΤΟΧΗ 3.1 Μικροβιολογική-κλινική αντοχή Ο όρος µικροβιακή αντοχή µπορεί να χρησιµοποιηθεί µε δύο τρόπους, είτε ως µικροβιολογική αντοχή, είτε ως κλινική αντοχή. Οι ανθεκτικοί από µικροβιολογικής πλευράς οργανισµοί είναι αυτοί που έχουν οποιοδήποτε είδος ανθεκτικού µηχανισµού ή γονιδίου. Ο όρος µπορεί να αποδοθεί και ποσοτικά, χαρακτηρίζοντας κάποιο οργανισµό ως «µέτρια ή υψηλά ανθεκτικό» ή «χαµηλού και υψηλού επιπέδου ανθεκτικότητας». Η ελάχιστη συγκέντρωση ενός αντιβιοτικού που απαιτείται για να δράσει ανασταλτικά στην ανάπτυξη ενός µικροοργανισµού (MIC, Minimum Inhibitory Concentration) είναι καθοριστική της βακτηριακής του ευαισθησίας. Από την κλινική πλευρά, η ταξινόµηση των βακτηρίων ως ευαίσθητα ή ανθεκτικά, εξαρτάται αν η µόλυνση του βακτηρίου ανταποκρίνεται στη θεραπεία ή όχι. Παρ όλο που για πολλά βακτηριακά είδη, η γνώση της µικροβιακή αντοχής θεωρείται απαραίτητη για σωστή χρήση του αντιβιοτικού, συχνά η MIC για ένα συγκεκριµένο βακτήριο µπορεί να µην είναι αντιπροσωπευτική της αντιµικροβιακής δράσης του αντιβιοτικού, κάτω από καθορισµένες κλινικές συνθήκες. Η in vitro µέτρηση της ανθεκτικότητας προσδιορίζεται κάτω από αυθαίρετα οριζόµενες συνθήκες. Γενικότερα, η ανθεκτικότητα των βακτηρίων θα πρέπει να εκφράζεται ποσοτικά µε τιµές της MIC, παρά να χαρακτηρίζονται τα βακτήρια ως ευαίσθητα ή ανθεκτικά από κλινικής άποψης [2]. 3.2 Γενετική της ανθεκτικότητας Όταν τα αντιβιοτικά χρησιµοποιήθηκαν για πρώτη φορά για τη θεραπεία βακτηριακών µολύνσεων, η ανάπτυξη της µικροβιακής αντοχής κατά τη διάρκεια της θεραπείας δεν ήταν κάτι αναµενόµενο, αφού η µεταβολή της ανθεκτικότητας του βακτηρίου θεωρούνταν πολύ σπάνια. Μέχρι τότε δεν ήταν γνωστό, ότι ακόµα και στη φύση τα βακτήρια µπορούν να συλλέξουν και να ανταλλάξουν γενετικές πληροφορίες µε σπάνια είδη. Η µικροβιακή αντοχή αναπτύσσεται ταχύτατα, αµέσως µετά την ανάπτυξη και την κλινική χρήση ενός αντιβιοτικού. 36

50 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 3 ο Η µικροβιακή αντοχή έχει γενετική βάση, η οποία µπορεί να προέρχεται από ένα συγκεκριµένο σηµείο του βακτηριακού γονιδιώµατος ή να µεταφέρεται µεταξύ των βακτηρίων. Όταν χρησιµοποιούνται τα αντιβιοτικά, είναι αναπόφευκτη η ανάπτυξη της µικροβιακή αντοχής, είτε από µετάλλαξη, είτε από απόκτηση γονιδίου, είτε από το συνδυασµό των δύο. Στον Πίνακα 3.1 δίνονται οι διάφορες κατηγορίες των αντιβιοτικών συγκριτικά µε τις χρονολογίες που ανακαλύφθηκαν και τις χρονολογίες που ξεκίνησε η αντίστοιχη µικροβιακή αντοχή [2]. Πίνακας 3.1: Ανακάλυψη και χρήση των αντιβιοτικών συγκριτικά µε τη ανάπτυξη της αντίστοιχης µικροβιακής αντοχής. Αντιβιοτικά Έτος Έτος κλινικής Ανάπτυξη ανακάλυψης χρήσης µικροβιακής αντοχής Πενικιλλίνη Στρεπτοµυκίνη , 1956 Τετρακυκλίνες Ερυθροµυκίνη Βανκοµυκίνη Ναλιδιξικό οξύ Γκενταµικίνη ης γενιάς * 1980, 1985 κεφαλοσπορίνες Φθοροκινολόνες *: µη διαθέσιµη ηµεροµηνία 3.3 Χρήση αντιβιοτικών σε κρεοπαραγωγά ζώα Αντίθετα µε τη χρήση των αντιβιοτικών στην ανθρώπινη ιατρική, η χρήση τους στα κρεοπαραγωγά ζώα έχει διπλό σκοπό. Στην κτηνιατρική τα αντιβιοτικά χρησιµοποιούνται για τη θεραπεία και τον έλεγχο των βακτηριακών µολύνσεων, αλλά και για αυξητικούς λόγους. Οι περισσότερες κατηγορίες αντιβιοτικών χρησιµοποιούνται τόσο στην ιατρική, όσο και στην κτηνιατρική. Ο έλεγχος και η πρόληψη των βακτηριακών µολύνσεων επιτυγχάνεται µε την προληπτική και προφυλακτική χορήγηση των αντιβιοτικών. Στις περιπτώσεις των ζώων που η µόλυνση είναι συγκεκριµένη και η θεραπεία µπορεί να εφαρµοστεί αποκλειστικά στα ζώα που νοσούν, όπως για παράδειγµα στην εκτροφή βοοειδών, τα αντιβιοτικά 37

51 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 3 ο χορηγούνται είτε από το στόµα, είτε µέσω της παρεντερικής οδού. Στις περιπτώσεις όµως που θα πρέπει να θεραπευτούν µεγάλες οµάδες πληθυσµών, όπως γίνεται στην εκτροφή πουλερικών και χοίρων, τότε τα αντιβιοτικά χορηγούνται µαζικά µέσω της τροφής ή του νερού. Το αποτέλεσµα είναι τα αντιβιοτικά να χορηγούνται σε ολόκληρο τον πληθυσµό, ακόµα κι αν µόνο µια µικρή µερίδα του πληθυσµού έχει προσβληθεί από το µολυσµατικό βακτήριο. Ο δεύτερος λόγος χορήγησης των αντιβιοτικών στα κρεοπαραγωγά ζώα είναι ότι δρουν ως αυξητικοί παράγοντες. Η νόµιµη χορήγηση συγκεκριµένων αντιβακτηριακών ενώσεων στην εκτροφή των ζώων, παράλληλα µε την τροφή τους, επιταχύνει την ανάπτυξή τους. Υπάρχουν διεθνείς οδηγίες που καθορίζουν τις ενώσεις αυτές, τις συνθήκες που θα πρέπει να χορηγούνται, τα ζώα στα οποία µπορούν να χορηγηθούν, η διάρκεια και η δοσολογία της χορήγησης [16, 17]. 3.4 Επιπτώσεις της ανάπτυξης της µικροβιακής αντοχής Γενικότερα, όλα τα φάρµακα που χορηγούνται στα ζώα, είτε µέσω της διατροφής τους, είτε απλά για τη θεραπεία τους, µεταφέρονται στους εδώδιµους ιστούς και στα προϊόντα τους, γάλα και αυγά. Οι υπολειµµατικές συγκεντρώσεις (κατάλοιπα) µπορούν να µεταφερθούν µέσω της κατανάλωσης στον άνθρωπο. Το ποσοστό των αντιβακτηριακών φαρµάκων που τελικά καταναλώνεται από τον άνθρωπο µέσω της διατροφής, εξαρτάται όχι µόνο από το επίπεδο των δόσεων που χορηγούνται στο ζώο, αλλά και από το χρονικό διάστηµα που µεσολαβεί από τη χορήγηση µέχρι τη θανάτωση του ζώου, τη λεγόµενη περίοδο αναµονής, η οποία είναι ανάλογη µε τη φαρµακοκινητική συµπεριφορά του φαρµάκου [15, 17]. Τα παρακάτω στατιστικά δεδοµένα αποδεικνύουν τη σοβαρότητα της ανάπτυξης της µικροβιακής αντοχής εξαιτίας της αλόγιστης χορήγησης των αντιβιοτικών στην κτηνιατρική. Το 1996, τόνοι αντιβιοτικών είχαν χρησιµοποιηθεί στην Ευρωπαϊκή Ένωση, ενώ περίπου τα µισά από αυτά ήταν για θεραπευτικούς και αυξητικούς λόγους στην κτηνιατρική. Σύµφωνα µε στατιστικές µελέτες της Ευρωπαϊκής Οµοσπονδίας για την Υγεία των Ζώων (European Federation of Animal Health, FEDESA) το 1999, τόνοι αντιβιοτικών είχαν καταναλωθεί στην Ευρωπαϊκή Ένωση, το 65% των οποίων στην ιατρική, το 29% στην κτηνιατρική και το 6% ως αυξητικοί παράγοντες [18]. Καθώς οι περισσότεροι αυξητικοί παράγοντες έχουν απαγορευτεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση, παρατηρήθηκε µείωση στην κατανάλωση των αντιβιοτικών στην κτηνοτροφία 38

52 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 3 ο συγκριτικά µε την κατανάλωση τους στην ιατρική. Στις Ηνωµένες Πολιτείες το 2000 η παραγωγή των αντιβιοτικών έφτασε τους τόνους, 70% των οποίων καταναλώθηκαν στην εκτροφή των ζώων [19]. Ποσότητα των αντιβιοτικών σκευασµάτων που καταναλώθηκαν για κτηνιατρική χρήση ήταν οχτώ φορές µεγαλύτερη της ποσότητας που χρησιµοποιήθηκαν στην ιατρική. Ιδιαίτερα αυξηµένη είναι η κατανάλωση των αντιβακτηριακών σκευασµάτων στις ιχθυοκαλλιέργειες, µε επίσης τις ίδιες πιθανότητες ανάπτυξης της µικροβιακή αντοχής. Η εµφάνιση των αντιβακτηριακών ενώσεων στο περιβάλλον άρχισε πλέον να είναι ένα ιδιαίτερα ανησυχητικό πρόβληµα. Το θέµα αυτό παίρνει παγκόσµιες διαστάσεις, καθώς πολλές µορφές αυτών και τα πιθανά τους προβλήµατα είναι ακόµα άγνωστα και υπό µελέτη. Υπολογίζονται ότι περίπου τόνοι αντιβιοτικών συσσωρεύονται ετησίως στο περιβάλλον, µε κυριότερες πηγές προέλευσης τη χρήση τους στην κτηνοτροφία [20, 21]. Τα υπολείµµατα των αντιβακτηριακών φαρµάκων στις τροφές µπορούν να αποτελέσουν πηγή κινδύνου για τους καταναλωτές. Η πιθανότητα τοξικών λοιµώξεων είναι πολύ µικρή, γιατί τα υπολείµµατα µπορεί να βρίσκονται µόνο σε πολύ χαµηλές συγκεντρώσεις. Παρ όλα αυτά όµως συγκεκριµένα συστατικά χρήζουν ιδιαίτερης προσοχής, εξαιτίας της επικινδυνότητάς τους. Σε ορισµένους ευαίσθητους οργανισµούς µπορεί να προκαλέσουν αλλεργικές αλληλεπιδράσεις. Το σηµαντικότερο όµως είναι η πιθανότητα να αναπτυχθούν είδη βακτηρίων ανθεκτικά στα συγκεκριµένα σκευάσµατα. Αυτό µπορεί να οδηγήσει στην ανθεκτικότητα των µη παθογόνων, αλλά και των παθογόνων οργανισµών, οι οποίοι δε θα µπορούν πια να ανταποκριθούν σε µια αντίστοιχη φαρµακευτική αγωγή. Επίσης κάποιοι µολυσµατικοί µικροοργανισµοί είναι παθογόνοι, τόσο για τον άνθρωπο, όσο και για τα ζώα. Μολύνσεις που είναι γνωστές ως ζωονόσοι, µπορούν να εξαπλωθούν µε απ ευθείας επαφή ή µέσω της κατανάλωσης µολυσµένων προϊόντων, όπως µη παστεριωµένο γάλα και άλλα γαλακτοκοµικά προϊόντα, προκαλώντας σοβαρούς κινδύνους στη δηµόσια υγεία, αλλά και κοινωνικο-οικονοµικά προβλήµατα [17, 22, 23]. 3.5 Αντοχή στις φθοροκινολόνες Η αντοχή στις φθοροκινολόνες βασίζεται είτε στη µετάλλαξη του βακτηρίου σε ανθεκτικό στο φάρµακο, είτε στη µείωση της ενδο-κυτταρικής συγκέντρωσης του 39

53 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 3 ο φαρµάκου. Μέχρι στιγµής δεν έχει παρατηρηθεί η ενζυµατική αδρανοποίηση, εξαιτίας των φθοροκινολονών. Οι δοµικές µεταλλάξεις αφορούν τα γονιδιώµατα gyra και gyrb (κώδικες της DNA γυράσης) και τα parc, pare (κώδικες της τοποϊσοµεράσης IV). Πλήθος µεταλλάξεων έχει παρατηρηθεί σε ποικιλία γονιδιακών στόχων, µεγάλου εύρους των Gram-θετικών και Gram-αρνητικών βακτηρίων. Η επίδραση των µεταλλάξεων ποικίλλει ανάλογα µε τις φθοροκινολόνες [16]. 40

54 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 4 ο 4. ΝΟΜΟΘΕΣΙΑ ΓΙΑ ΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ ΣΤΑ ΚΡΕΟΠΑΡΑΓΩΓΑ ΖΩΑ ΚΑΙ ΣΤΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΤΟΥΣ 4.1 Εισαγωγή Σύµφωνα µε κλινικές µελέτες, όσο πιο εκτεταµένη χρήση των αντιβιοτικών γίνεται, τόσο περισσότερο αναπτύσσεται αντίστοιχα και η µικροβιακή αντοχή. Για να εξασφαλιστεί η δηµόσια υγεία ο Αµερικανικός Οργανισµός Τροφίµων και Φαρµάκων (US Food and Drug Administration, FDA) και η Ευρωπαϊκή Ένωση (EU) έχουν ορίσει ανώτατα όρια καταλοίπων (maximum residue limits, MRLs) για τα αντιβιοτικά στα κρεοπαραγωγά ζώα και στα προϊόντα τους. Επιπλέον, προκειµένου να οριστούν καθορισµένες πρότυπες µέθοδοι για τον προσδιορισµό συγκεκριµένων αντιβιοτικών καταλοίπων στους ιστούς των κρεοπαραγωγών ζώων και στα προϊόντα τους, έχουν οριστεί οι απαιτήσεις που θα πρέπει να πληρούν οι αναλυτικές µέθοδοι και ο τρόπος αξιολόγησης των αποτελεσµάτων. Προκειµένου να αντιµετωπιστούν τα προβλήµατα που προέκυψαν από την ενοποιηµένη αγορά και την ελεύθερη διακρατική διακίνηση των αγαθών και συνεπώς και των τροφίµων, ορίστηκε η ιεθνής Κτηνιατρική Συνεργασία Εναρµόνισης (Veterinary International Cooperation on Harmonization, VICH). Ο οργανισµός αυτός είναι µια τριµελής συνεργασία µεταξύ της Ευρωπαϊκής Ένωσης, των Ηνωµένων Εθνών και της Ιαπωνίας, µε στόχο την εναρµόνιση των τεχνικών απαιτήσεων για την πιστοποίηση των προϊόντων κτηνιατρικής προέλευσης. Ο πλήρης τίτλος του οργανισµού είναι ιεθνής Συνεργασία για την Εναρµόνιση των Τεχνικών Απαιτήσεων για την Εγγραφή Κτηνιατρικών Προϊόντων. Ο επίσηµος ορισµός της συνεργασίας έγινε τον Απρίλιο του 1996 [24]. 4.2 Η Ενιαία Αγορά Πυρήνας της Ευρωπαϊκής Ένωσης είναι η ενιαία αγορά. Για να γίνει αυτό πραγµατικότητα από τα θεσµικά όργανα της ΕΕ σε συνεργασία µε τα κράτη µέλη συντάχθηκαν εκατοντάδες οδηγίες για την εξάλειψη των τεχνικών, ρυθµιστικών, νοµικών, γραφειοκρατικών, πολιτιστικών και προστατευτικών εµποδίων που παρεµπόδιζαν το ελεύθερο εµπόριο και την ελεύθερη διακίνηση µέσα στην Ένωση [25]. 41

55 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 4 ο Η αρχή της αµοιβαίας αναγνώρισης εξασφαλίζει την ελεύθερη κυκλοφορία των εµπορευµάτων και των υπηρεσιών χωρίς να είναι αναγκαία η εναρµόνιση των εθνικών νοµοθεσιών των κρατών µελών. Ένα προϊόν που έχει νόµιµα παρασκευαστεί σε κράτος µέλος, µπορεί να πωλείται σε άλλο κράτος µέλος, ακόµα κι αν οι τεχνικές ή ποιοτικές προδιαγραφές διαφέρουν από εκείνες που το κράτος αυτό επιβάλλει στα δικά του προϊόντα. Μόνη εξαίρεση είναι το κοινό συµφέρον, όπως η προστασία της υγείας των καταναλωτών και του περιβάλλοντος που υπόκεινται σε αυστηρούς όρους. Τα περισσότερα προβλήµατα στην ενιαία αγορά, τίθενται σε επίπεδο εγγύησης της προστασίας, όπου το κράτος προορισµού είναι πεπεισµένο ότι µόνο ο δικός του τρόπος οργάνωσης της ασφάλειας είναι ο ορθός. Ένας από τους σηµαντικότερους τοµείς που θίγονται περισσότερο είναι τα τρόφιµα [26]. Μια σειρά κρίσεων σε σχέση µε τη διατροφή του ανθρώπου και των ζώων (σπογγοειδείς εγκεφαλοπάθειες των βοοειδών, διοξίνες κ.α.) κατέστησαν προφανείς τις αδυναµίες στη διατύπωση και στην εφαρµογή των κανόνων δικαίου περί των τροφίµων στην Ευρωπαϊκή Ένωση. Η κατάσταση αυτή οδήγησε την Ευρωπαϊκή Ένωση να συµπεριλάβει την προώθηση ενός υψηλού επιπέδου ασφαλείας των τροφίµων στις πολιτικές της προτεραιότητες. Η λευκή βίβλος για την ασφάλεια των τροφίµων αποτελεί ουσιώδες στοιχείο σ αυτήν τη στρατηγική. Μ αυτό η Ευρωπαϊκή Επιτροπή προτείνει ένα σύνολο µέτρων που επιτρέπουν να οργανωθεί η ασφάλεια των τροφίµων µε πιο συντονισµένο και ολοκληρωµένο τρόπο. Προκειµένου να επιτύχει αυτούς τους στόχους, η Ευρωπαϊκή Ένωση σχεδίασε την ίδρυση µιας ανεξάρτητης υπηρεσίας τροφίµων, της οποίας ευθύνη ήταν η επιστηµονική αξιολόγηση και επικοινωνία, σε στενή συνεργασία µε τους εθνικούς οργανισµούς και τις εθνικές επιστηµονικές οργανώσεις. Αρµοδιότητα της Ευρωπαϊκής Επιτροπής είναι ο ορισµός νοµοθετικού πλαισίου σχετικά µε τις διάφορες πτυχές της τροφικής αλυσίδας: Ζωοτροφές: χρήση ειδικών υλών και προϊόντων στη διατροφή των ζώων, αξιολόγηση, έγκριση και επισήµανση των ζωοτροφών, έγκριση των εγκαταστάσεων παραγωγής ζωοτροφών και µέτρα ελέγχου, δηµιουργία συστήµατος έγκαιρης προειδοποίησης. Υγιεινή και καλή µεταχείριση των ζώων: ενίσχυση της καταπολέµησης των ζωονόσων, της σπογγοειδούς εγκεφαλοπάθειας των βοοειδών και άλλων µεταδοτικών σπογγοειδών εγκεφαλοπαθειών, την ορθή µεταχείριση των ζώων. 42

56 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 4 ο Υγιεινή των τροφίµων: αναµόρφωση όλων των υφιστάµενων νοµικών διατάξεων, προκειµένου να εξασφαλισθεί συνοχή και σαφήνεια σε ολόκληρη την αλυσίδα παραγωγής τροφίµων. Τα όρια σε προσµίξεις και κατάλοιπα ζιζανιοκτόνων και κτηνιατρικών φαρµάκων στα τρόφιµα. Την έγκριση και επισήµανση των νέων τροφίµων. Τα πρόσθετα, τις αρωµατικές ενώσεις, τη συσκευασία και την ακτινοβόληση των τροφίµων. Τη δυνατότητα να λαµβάνονται µέτρα σε καταστάσεις έκτακτης ανάγκης. Τη διαδικασία απόφασης στον τοµέα των τροφίµων, µε σκοπό να εξορθολογισθεί και να απλουστευθεί, ώστε να εξασφαλισθούν η ταχύτητα και η διαφάνειά της [27]. Με τον κανονισµό (ΕΚ) µε αριθµό 178/2002 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου, τον Ιανουάριο του 2002 καθορίστηκαν οι γενικές αρχές και οι απαιτήσεις για τη νοµοθεσία των τροφίµων, ιδρύθηκε η Ευρωπαϊκή Αρχή για την Ασφάλεια των Τροφίµων και καθορίστηκαν οι διαδικασίες σε θέµατα ασφάλειας των τροφίµων. Για την ασφάλεια των τροφίµων κρίθηκε αναγκαίος ο ορισµός µιας πολιτικής βασιζόµενης σε σταθερές επιστηµονικές βάσεις και σε σύγχρονη νοµοθεσία. Στόχος αυτής της γενικής αναδιατύπωσης της κοινοτικής νοµοθεσίας είναι η αποκατάσταση της εµπιστοσύνης των καταναλωτών, σχετικά µε τα τρόφιµα. Η ελεύθερη κυκλοφορία ασφαλών και υγιεινών τροφίµων είναι θεµελιώδης αρχή για την ορθή λειτουργία της εσωτερικής αγοράς. Ωστόσο, οι διαφορές µεταξύ των νοµοθεσιών των κρατών µελών στον τοµέα των τροφίµων παρεµποδίζουν µερικές φορές την ελεύθερη κυκλοφορία των τροφίµων. Κρίθηκε συνεπώς αναγκαίος ο ορισµός µιας κοινής βάσης για τα µέτρα σχετικά µε τρόφιµα και τις ζωοτροφές σε κοινοτικό επίπεδο. Για να υιοθετηθεί συνολική και ολοκληρωµένη προσέγγιση «από το αγρόκτηµα µέχρι το τραπέζι» (farm to table), η νοµοθεσία πρέπει να καλύπτει όλες τις πτυχές της αλυσίδας παραγωγής τροφίµων: την παραγωγή, τη µεταποίηση, τη µεταφορά, τη διανοµή και τη διάθεση των τροφίµων ή των ζωοτροφών. Σε όλα τα στάδια αυτής της αλυσίδας τη νοµική ευθύνη για τη διασφάλιση της ασφάλειας των τροφίµων έχει η επιχείρηση των τροφίµων και παρόµοιο σύστηµα εφαρµόζεται στις επιχειρήσεις των ζωοτροφών. 43

57 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 4 ο Η ίδρυση της Ευρωπαϊκής Αρχής για την Ασφάλεια των Τροφίµων ενισχύει το ισχύον σύστηµα επιστηµονικής και τεχνικής υποστήριξης. Ουσιαστική αποστολή της είναι η παροχή βοήθειας και οι ανεξάρτητες επιστηµονικές γνώµες, καθώς και η δηµιουργία δικτύου µε σκοπό τη στενή συνεργασία µε παρόµοιους οργανισµούς στα κράτη µέλη. Τέλος η Ευρωπαϊκή Αρχή για την Ασφάλεια των Τροφίµων αξιολογεί τους κινδύνους που συνδέονται µε την τροφική αλυσίδα και ενηµερώνει το ευρύ κοινό για τους πραγµατικούς και τους αναδυόµενους κινδύνους [28]. 4.3 ιεθνείς Οργανισµοί Οι προκαταρκτικές διεργασίες για την ίδρυση της VICH έγιναν από το ιεθνή Οργανισµό Επιζωοτικών Νόσων (International Office of Epizooties, OIE). Σε δύο συσκέψεις που έγιναν το 1994 και 1995 συζητήθηκε η εναρµόνιση της κτηνιατρικής και έτσι προτάθηκε η σύσταση της VICH. Σχετικά µε το θέµα των προτύπων ασφαλών τροφίµων, αποφασίστηκε πως ο ρόλος της VICH θα ήταν ενισχυτικός της Επιτροπής Συνεργασίας µεταξύ του Οργανισµού Τροφίµων και Γεωργίας και του Παγκόσµιου Οργανισµού Υγείας για τα Πρόσθετα Τροφίµων (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA). Θέµατα σχετικά µε Καλή Εργαστηριακή Πρακτική (Good Laboratory Practice, GLP) και Καλή Παραγωγική Πρακτική (Good Manufacturing Practice, GMP) για τα οποία υπάρχουν αµοιβαίες συµφωνίες δε σχετίζονται µε τις δραστηριότητες της VICH. Όµως θέµατα σχετικά µε βιολογικά είναι στην υπευθυνότητα της VICH. Άλλες αρµοδιότητες της VICH είναι η αποτίµηση οδηγιών που ισχύουν από τη ιεθνή Συνεργασία Εναρµόνισης (International Cooperation on Harmonization, ICH) για το αν µπορούν να υιοθετηθούν σε προγράµµατα της VICH. Επίσης ρόλος της VICH είναι η διασάφηση µη εναρµονισµένων πεδίων µεταξύ της Ευρωπαϊκής Ένωσης, των Ηνωµένων Πολιτειών και της Ιαπωνίας, για θέµατα κλειδιά. Τέλος θέτει σε προτεραιότητα θέµατα σχετικά µε την οµοιογένεια των τροφίµων (στάδια παραγωγής και καλλιέργειας, συντήρηση, µεταφορά, έλεγχος τελικών προϊόντων) που αφορούν τα τρία µέλη της συνεργασίας [24]. Στενή είναι η συνεργασία της VICH µε την JECFA. Η τελευταία αποτελεί µια διεθνή επιστηµονική επιτροπή συνεργασίας µεταξύ του Οργανισµού Τροφίµων και Γεωργίας των Ηνωµένων Εθνών και του Παγκόσµιου Οργανισµού Υγείας. Η σύσταση της επιτροπής αυτής έγινε το 1956 και πρωταρχικό της µέληµα ήταν η 44

58 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 4 ο αξιολόγηση της ασφάλειας των πρόσθετων στα τρόφιµα. Σήµερα στις αρµοδιότητές της περιλαµβάνεται η εκτίµηση των επιµολύνσεων, των φυσικών αναπτυσσόµενων τοξικών και των καταλοίπων κτηνιατρικών φαρµάκων στα τρόφιµα. Μέχρι σήµερα, σύµφωνα µε τη JECFA, έχουν εκτιµηθεί περισσότερα από πρόσθετα τροφίµων, περίπου 40 επιµολυντές τροφίµων και φυσικά αναπτυσσόµενοι τοξικοί παράγοντες και κατάλοιπα περίπου 90 κτηνιατρικών φαρµάκων. Η επιτροπή έχει επίσης αναπτύξει αρχές σχετικά µε την αξιολόγηση του κινδύνου των χηµικών στα τρόφιµα, λαµβάνοντας υπόψη την ανάπτυξη της τοξικολογίας, της βιοτεχνολογίας, της διαχείρισης κινδύνου, της χηµείας τροφίµων, συµπεριλαµβανοµένης της αναλυτικής χηµείας και των µέγιστων ορίων για τα κατάλοιπα κτηνιατρικών φαρµάκων [29]. 4.4 Η Ευρωπαϊκή Νοµοθεσία Από τις οδηγίες, τους κανονισµούς και τις αποφάσεις της Ευρωπαϊκής Ένωσης που ισχύουν µέχρι και σήµερα για τα τρόφιµα, σηµαντικότερες είναι η οδηγία 89/397/EEC, σχετικά µε τον επίσηµο έλεγχο των τροφίµων, ο κανονισµός 90/2377/EEC, σχετικά µε τον καθορισµό ανώτατων ορίων καταλοίπων κτηνιατρικών φαρµάκων στα τρόφιµα ζωικής προέλευσης, η οδηγία 96/23/EC, για τη λήψη µέτρων ελέγχου για ορισµένες ενώσεις και τα κατάλοιπά τους σε ζώντα ζώα και στα προϊόντα τους και η απόφαση 2002/657/EC για την επίδοση των αναλυτικών µεθόδων και την ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Οι τελευταίες τρεις οδηγίες εστιάζονται κυρίως στο θέµα των καταλοίπων κτηνιατρικών φαρµάκων σε τρόφιµα ζωικής προέλευσης και στον ορισµό των κριτηρίων για την επικύρωση των αντίστοιχων αναλυτικών µεθόδων που εφαρµόζονται. Η οδηγία 89/397/EEC αφορά γενικότερα την αναγκαιότητα του επίσηµου ελέγχου των τροφίµων. Σύµφωνα µε την παραπάνω οδηγία, καθώς το εµπόριο των τροφίµων κατέχει πρωταρχική σηµασία στην κοινή αγορά, όλα τα κράτη µέλη οφείλουν να µεριµνούν για την προστασία της υγείας των πολιτών. Συνεπώς καθίσταται αναγκαίος ο επίσηµος έλεγχος των τροφίµων. Καθώς υπάρχουν διαφορές µεταξύ των εθνικών νοµοθεσιών, όσον αφορά στο είδος των ελέγχων, κρίθηκε αναγκαία η προσέγγιση των νοµοθεσιών αυτών µε σκοπό τη γενικότερη εναρµόνιση των αρχών που διέπουν τη διενέργεια των ελέγχων [30]. 45

59 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 4 ο Στις 26 Ιουνίου 1990 ορίστηκε ο κανονισµός υπ αριθµό 2377/90, σχετικά µε τη θέσπιση κοινοτικής διαδικασίας για τον καθορισµό ανώτατων ορίων καταλοίπων κτηνιατρικών φαρµάκων στα τρόφιµα ζωικής προέλευσης. Το Συµβούλιο των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων λαµβάνοντας υπόψη ότι η χορήγηση κτηνιατρικών φαρµάκων σε ζώα παραγωγής µπορεί να έχει ως αποτέλεσµα την παρουσία καταλοίπων στα τρόφιµα που προέρχονται από τα ζώα στα οποία έχουν χορηγηθεί τα φάρµακα, οδηγήθηκε στη θέσπιση ανώτατων ορίων καταλοίπων των κτηνιατρικών φαρµάκων, προκειµένου να προστατευτεί η δηµόσια υγεία. Καθώς η επιστηµονική και η τεχνική πρόοδος επιτρέπει την ανίχνευση καταλοίπων κτηνιατρικών φαρµάκων σε όλο και χαµηλότερες συγκεντρώσεις, ορίστηκαν ανώτατα όρια καταλοίπων των φαρµακολογικά δραστικών ενώσεων, που χρησιµοποιούνται στα κτηνιατρικά φάρµακα για όλα τα τρόφιµα ζωικής προέλευσης συµπεριλαµβανοµένου του κρέατος, των ψαριών, του γάλακτος, των αυγών και του µελιού. Για την προστασία της δηµόσιας υγείας τα ανώτατα όρια καταλοίπων καθορίζονται σύµφωνα µε γενικώς αναγνωρισµένες αρχές για την αξιολόγηση της ασφάλειας και µε βάση οποιαδήποτε άλλη επιστηµονική αξιολόγηση της ασφάλειας των σχετικών ενώσεων, η οποία πραγµατοποιείται από διεθνείς οργανισµούς και στο πλαίσιο του Κώδικα Τροφίµων (Codex Alimentarius). Καθώς η χρήση των κτηνιατρικών είναι πλέον απαραίτητη στη γεωργική παραγωγή, η θέσπιση των ανώτατων ορίων καταλοίπων διευκολύνει την εµπορία των τροφίµων ζωικής προέλευσης. Σύµφωνα µε τον κανονισµό αυτό ως κατάλοιπα κτηνιατρικών φαρµάκων θεωρούνται όλες οι φαρµακολογικά ενεργές ενώσεις, είτε πρόκειται για ενεργά συστατικά, είτε για έκδοχα, είτε για προϊόντα αποικοδόµησης ή µεταβολισµού που παραµένουν στα τρόφιµα που προέρχονται από ζώα στα οποία χορηγήθηκε το συγκεκριµένο κτηνιατρικό φάρµακο. Ως ανώτατο όριο καταλοίπων ορίζεται η µέγιστη συγκέντρωση καταλοίπων που προκύπτει από τη χρήση του κτηνιατρικού φαρµάκου εκφρασµένη σε mg/kg ή µg/kg µε βάση το βάρος του νωπού προϊόντος. Το όριο αυτό βασίζεται στον τύπο και στην ποσότητα καταλοίπων που θεωρείται ότι δε συνεπάγονται τοξικολογικό κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία, όπως εκφράζονται µε την παραδεκτή ηµερήσια δόση, ή σε προσωρινή παραδεκτή ηµερήσια δόση που χρησιµοποιεί πρόσθετο παράγοντα ασφαλείας. Το όριο αυτό λαµβάνει επίσης υπόψη άλλους κινδύνους για τη δηµόσια υγεία, καθώς και την τεχνολογία 46

60 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 4 ο τροφίµων. Κατά τη θέσπιση του ανώτατου ορίου καταλοίπων, λαµβάνονται επίσης υπόψη τα κατάλοιπα που εµφανίζονται σε τρόφιµα φυτικής προέλευσης ή/και στο περιβάλλον. Επιπλέον, το όριο αυτό µπορεί να µειώνεται, ώστε να συµβιβάζεται µε την ορθή πρακτική κατά τη χρήση κτηνιατρικών φαρµάκων και στο βαθµό που υφίστανται πρακτικές αναλυτικές µέθοδοι. Πίνακας 4.1: Τιµές MRL που θεσπίστηκαν από την Ευρωπαϊκή Ένωση στον κανονισµό 2377/90, για τις κινολόνες στα ζώα και στους ιχθύες. Ένωση Είδος ζώου Ιστοί/ Προϊόντα ΜRLs (µg/kg) Ντανοφλοξακίνη Βοοειδή, πουλερικά Ντιφλοξακίνη Ενροφλοξακίνη + Κιπροφλοξακίνη Χοίρος Βοοειδή, χοίρος Πουλερικά Βοοειδή Χοίρος, πουλερικά, πρόβειο Μύες Λίπος Ήπαρ, Νεφρός Γάλα Μύες Επιδερµίδα + Λίπος Λίπος Ήπαρ Νεφρός Μύες Λίπος Επιδερµίδα + Λίπος Ήπαρ Νεφρός Μύες Επιδερµίδα + Λίπος Μύες, Λίπος Νεφρός Ήπαρ Γάλα Μυς, Επιδερµίδα + Λίπος Ήπαρ Νεφρός

61 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 4 ο Πίνακας 4.1: Συνέχεια Ένωση Είδος ζώου Ιστοί/ Προϊόντα ΜRLs (µg/kg) Φλουµεκίνη Βοοειδή, χοίρος Πουλερικά Σολοµός Μύες Λίπος, Επιδερµίδα + Λίπος Ήπαρ Νεφρός Γάλα Μύες Επιδερµίδα + Λίπος Λίπος Ήπαρ Νεφρός Μύες + Επιδερµίδα σε φυσιολογικές αναλογίες Μαρµποφλοξακίνη Βοοειδή, χοίρος Οξολινικό οξύ Σαραφλοξακίνη Βοοειδή, χοίρος, πουλερικά Ψάρια Πουλερικά Γαλοπούλα Σολοµός Μύες, Ήπαρ, Νεφρός Λίπος Γάλα Μύες Επιδερµίδα + Λίπος Ήπαρ, Νεφρός Αυγά Μυς + Επιδερµίδα Μύες Επιδερµίδα + Λίπος Ήπαρ Νεφρός Μύες Λίπος Νεφρός, Ήπαρ Μύες + Επιδερµίδα Σύµφωνα µε τον κανονισµό αυτό οι φαρµακολογικά ενεργές ενώσεις που χορηγούνται σε κρεοπαραγωγά ζώα ταξινοµούνται σε τέσσερις κατηγορίες. Στο 48

62 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 4 ο Παράρτηµα Ι ανήκουν οι φαρµακολογικά ενεργές ενώσεις για τις οποίες καθορίζονται ανώτατα όρια καταλοίπων, το Παράρτηµα ΙΙ είναι ο κατάλογος των ενώσεων που δεν υπόκεινται σε ανώτατο όριο καταλοίπων, το Παράρτηµα ΙΙΙ είναι ο κατάλογος των ενώσεων για τις οποίες έχουν ορισθεί προσωρινά ανώτατα όρια και στο Παράτηµα IV ταξινοµούνται οι φαρµακολογικά δραστικές ενώσεις για τις οποίες δεν καθορίζεται κανένα ανώτατο όριο. Στον Πίνακα 4.1 δίνονται οι τιµές για τα ανώτατα όρια καταλοίπων κινολονών στα τρόφιµα ζωικής προέλευσης, έτσι όπως ορίζονται από τον κανονισµό 2377/90 της Ευρωπαϊκής Ένωσης [31]. Τα Παραρτήµατα Ι-IV του κανονισµού 2377/90 τροποποιούνται από τον κανονισµό 508/1999 της Ευρωπαϊκής Ένωσης, όπου γίνεται επιπλέον περιγραφή ορισµένων ενώσεων. Στον κανονισµό αυτό αποδίδεται ορθότερα η ονοµασία των φαρµακολογικά ενεργών ενώσεων που χορηγούνται σε κρεοπαραγωγά ζώα και διορθώνονται ορισµένα βασικά λάθη. Οι τέσσερις όµως κατηγορίες των ενώσεων παραµένουν οι ίδιες στα αντίστοιχα Παραρτήµατα [32]. Η οδηγία 96/23/EC αφορά στη λήψη µέτρων ελέγχου για ορισµένες ενώσεις και τα κατάλοιπά τους σε ζώντα ζώα και σε προϊόντα τους. Η οδηγία ορίστηκε τον Απρίλιο 1996 και καταργεί τις παλαιότερες οδηγίες 85/358/ΕEC και 86/469/ΕEC και αποφάσεις 89/187/ΕEC και 91/664/ΕEC. Τα κατάλοιπα κτηνιατρικών φαρµάκων που θα πρέπει να ελέγχονται σύµφωνα µε την παρούσα οδηγία αναφέρονται στο Παράρτηµα Ι αυτής και χωρίζονται σε δύο οµάδες Α και Β, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 4.2. Σύµφωνα µε την οδηγία αυτή οι κινολόνες που µελετώνται στην παρούσα διατριβή κατατάσσονται στην οµάδα Β.1 [33]. Συµπληρωµατικά της οδηγίας 96/23/EC για την εφαρµογή της εκδόθηκε τον Αύγουστο 2002 από την Ευρωπαϊκή Επιτροπή, η απόφαση 2002/657/ EC, σχετικά µε την επίδοση των αναλυτικών µεθόδων και την ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Η απόφαση αυτή διασφαλίζει την ποιότητα και τη συγκρισιµότητα των αναλυτικών αποτελεσµάτων των εργαστηρίων που διενεργούν ελέγχους καταλοίπων φαρµακολογικά ενεργών ενώσεων σε τρόφιµα ζωικής προέλευσης. Αυτό επιτυγχάνεται µε τη χρήση συστηµάτων διασφάλισης ποιότητας και συγκεκριµένα µε την εφαρµογή µεθόδων που έχουν επικυρωθεί σύµφωνα µε κοινές διαδικασίες και κριτήρια επίδοσης. Ως αποτέλεσµα της προόδου που έχει συντελεσθεί στην αναλυτική χηµεία µετά την έκδοση της οδηγίας 96/23/EC η έννοια των συνήθων µεθόδων και των µεθόδων 49

63 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 4 ο αναφοράς, έχει αντικατασταθεί από την προσέγγιση βάσει κριτηρίων, σύµφωνα µε την οποία καθορίζονται κριτήρια επίδοσης και διαδικασίες για την επικύρωση µεθόδων διαλογής και επιβεβαιωτικών µεθόδων. Προκειµένου επίσης να εξασφαλισθεί η εναρµονισµένη εφαρµογή της οδηγίας 96/23/ EC ήταν απαραίτητο να προβλεφθεί µια διαδικασία για το σταδιακό καθορισµό των ελάχιστων απαιτούµενων ορίων επίδοσης (Minimum Required Performance Limits, MRPLs) των αναλυτικών µεθόδων για τις ενώσεις χωρίς καθορισµένο επιτρεπόµενο όριο και κυρίως για τις ενώσεις που η χρήση τους απαγορεύεται ρητά στην Ευρωπαϊκή Ένωση. Πίνακας 4.2: Ταξινόµηση των ενώσεων που θα πρέπει να ελέγχονται σε ζώντα ζώα και στα προϊόντα τους, σύµφωνα µε το Παράρτηµα Ι της οδηγίας 96/23/EC. ΟΜΑ Α Α: Ενώσεις µε αναβολική δράση και µη επιτρεπόµενες ενώσεις 1. Στιλβένια, παράγωγα στιλβενίων, τα άλατα και εστέρες τους. 2. Θυρεοστατικές ενώσεις. 3. Στεροειδή. 4. Λακτόνες του ρεσοκυκλικού οξέος. 5. β-ανταγωνιστές. 6. Ενώσεις του Παραρτήµατος IV του κανονισµού 2377/90/ΕEC. ΟΜΑ Α Β: Κτηνιατρικά φάρµακα και επιβλαβείς ενώσεις. 1. Αντιβακτηριακές ενώσεις, συµπεριλαµβανοµένων των σουλφοναµιδίων και των κινολονών. 2. Άλλα κτηνιατρικά φάρµακα: i.ανθελµινθικά. ii.κοκκιδιοστατικά, συµπεριλαµβανοµένων των νιτροϊµιδαζολίων. iii.καρβαµιδικές και πυρεθροειδείς ενώσεις. iv.ηρεµιστκά. v.μη στεροειδή αντιφλεγµονώδη. vi.άλλες ενώσεις µε φαρµακολογική δράση. 3. Άλλες ενώσεις και επιβλαβείς που υπάρχουν στο περιβάλλον. i.οργανοχλωριωµένες ενώσεις, συµπεριλαµβανοµένων των PCBs. ii.οργανοφωσφορικές ενώσεις. iii.χηµικά στοιχεία. iv.μυκοτοξίνες. v.χρωστικές. 4. Άλλες, συµπεριλαµβανοµένων των µη εγκεκριµένων ενώσεων που χρησιµοποιούνται ενδεχοµένως για κτηνιατρικούς σκοπούς. Με την απόφαση 2002/657/EC καθορίζονται οι κανόνες για τις αναλυτικές µεθόδους που θα χρησιµοποιηθούν κατά τις δοκιµές ανάλυσης των επίσηµων δειγµάτων. Στο παράρτηµα της παρούσας οδηγίας δίνονται οι σχετικοί ορισµοί 50

64 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 4 ο (Κεφάλαιο 1), ορίζονται τα κριτήρια επίδοσης και οι άλλες απαιτήσεις για τις αναλυτικές µεθόδους (Κεφάλαιο 2) και περιγράφεται ο τρόπος επικύρωσης της αναλυτικής µεθόδου (Κεφάλαιο 3). Επίσης σύµφωνα µε το άρθρο 6 της συγκεκριµένης απόφασης καθορίζεται ο τρόπος ερµηνείας των αποτελεσµάτων. Έτσι, το αποτέλεσµα µιας ανάλυσης θεωρείται «µη συµµορφούµενο» όταν υπερβαίνει το όριο απόφασης της µεθόδου επιβεβαίωσης για την προσδιοριζόµενη ένωση. Ως όριο απόφασης µιας µεθόδου νοείται το όριο στο οποίο και πάνω από το οποίο µπορεί να αποφασισθεί ότι ένα δείγµα είναι µη συµµορφούµενο µε πιθανότητα σφάλµατος α. Ως σφάλµα α νοείται η πιθανότητα να είναι «συµµορφούµενο» το εξεταζόµενο δείγµα, ακόµα κι αν η µέτρηση κατέληξε σε µη συµµορφούµενα αποτελέσµατα («ψευδής απόφαση περί µη συµµόρφωσης»). Για τις ενώσεις µε καθορισµένο επιτρεπόµενο όριο, το όριο απόφασης είναι η συγκέντρωση πέραν της οποίας µπορεί να αποφασιστεί µε στατιστική βεβαιότητα 1-α, εάν έχει υπάρξει αληθώς υπέρβαση του ορίου. Ενώ για τις ενώσεις χωρίς καθορισµένο όριο απόφασης, είναι η µικρότερη συγκέντρωση στην οποία µια µέθοδος µπορεί να διακρίνει µε στατιστική βεβαιότητα 1-α, εάν είναι παρούσα η συγκεκριµένη προσδιοριζόµενη ένωση. Για τις ενώσεις της οµάδας Α του παραρτήµατος Ι της οδηγίας 96/23/EC το σφάλµα είναι µικρότερο του 1%, ενώ για όλες τις άλλες ουσίας το σφάλµα α είναι 5% ή µικρότερο [34]. Η Ευρωπαϊκή Νοµοθεσία µε τις κατάλληλες οδηγίες (89/397/ΕΕC και 96/23/EC), κανονισµούς (2377/90/EEC) και αποφάσεις (2002/657/EC) φροντίζει για τον έλεγχο των τροφίµων προασπίζοντας τη δηµόσια υγεία. Η σωστή οργάνωση της Ευρωπαϊκής Ένωσης στα θέµατα των τροφίµων εξασφαλίζει την υγιή συµµετοχή στη VICH, όπου το θέµα της ασφάλειας των τροφίµων ξεπερνάει τα όρια της Ευρωπαϊκής Ένωσης και αφορά στην παγκόσµια ενοποιηµένη αγορά. 51

65 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο 5. ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ 5.1 Εισαγωγή Οι τεχνικές που σχετίζονται µε τη χρωµατογραφία χρησιµοποιούνται εδώ και αιώνες µε αρχικές εφαρµογές το διαχωρισµό υλικών όπως χρωστικές που εκχυλίζονται από τα φυτά. Παρ όλ αυτά ο όρος «χρωµατογραφία» χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1906 από το Ρώσο χηµικό και βοτανολόγο Tswett (Mikhail Semenovich Tswett, ) για να περιγράψει τη δουλειά του για το διαχωρισµό φυτικών χρωστικών σε ζώνες πάνω σε στήλες από κιµωλία και άλλα υλικά όπως πολυσακχαρίτες, σακχαρόζη και ινδουλίνη. Ο Tswett παρατήρησε τις επιδράσεις που είχαν στο διαχωρισµό τα διαφορετικά υλικά πλήρωσης των στηλών και το µέγεθος των σωµατιδίων του υλικού πλήρωσης της στήλης. Η σηµαντικότητα του έργου του αναγνωρίστηκε το 1930, όταν ο Lederer και οι συνεργάτες του πέτυχαν το διαχωρισµό της λουτεΐνης και της ζεαξανθίνης σε διθειάνθρακα και των ξανθοφυλλών από τον κρόκο του αυγού σε στήλη µε υλικό πλήρωσης ανθρακικό ασβέστιο σε µορφή σκόνης διαµέτρου 7µm. Στη συνέχεια οι Khun, Karrier και Ruzicka βραβεύτηκαν µε το βραβείο Nobel (1937, 1938 και 1939, αντίστοιχα) για την εργασία τους στη χρωµατογραφία. Στις πρώτες δηµοσιεύσεις του Tswett (1906) ο όρος χρωµατογραφία αναφερόταν σε µια µέθοδο µε την οποία τα συστατικά ενός δείγµατος διαχωρίζονται σε µια στήλη προσρόφησης µε βάση τη ροή του συστήµατος. Αργότερα το 1993 ο ιεθνής Οργανισµός Καθαρής και Εφαρµοσµένης Χηµείας (International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC) έδωσε τον εξής ορισµό: χρωµατογραφία είναι η φυσική µέθοδος διαχωρισµού κατά την οποία τα συστατικά που πρόκειται να διαχωριστούν κατανέµονται µεταξύ δύο φάσεων, µια στατική και µια κινητή προς µια συγκεκριµένη κατεύθυνση. Οι χρωµατογραφικές τεχνικές µπορούν να διαχωριστούν σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα µε τη φύση των δυνάµεων που καθορίζουν την κατανοµή ανάµεσα στις φάσεις, την επιλογή των δύο φάσεων, τη διάταξη της στατικής φάσης, τη διεργασία ανάπτυξης και την κλίµακα εφαρµογής. Στο Σχήµα 5.1 δίνεται µια συνολική ταξινόµηση των χρωµατογραφικών τεχνικών, έτσι όπως αυτή µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε διάφορους τρόπους [35]. 52

66 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο Σχήµα 5.1: Ταξινόµηση των χρωµατογραφιών τεχνικών. 53

67 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο 5.2 Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Πίεσης Η Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Πίεσης (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) άρχισε να αναπτύσσεται τη δεκαετία του 60, µε την πρόοδο της τεχνολογίας, καθώς άρχισαν να κατασκευάζονται χαλύβδινες στήλες ανθεκτικές στις µεγάλες πιέσεις και αντλίες υψηλής πίεσης, σταθερής παροχής. Η HPLC ουσιαστικά είναι εξέλιξη της κλασικής χρωµατογραφίας µε τη διαφορά ότι χρησιµοποιούνται µικρόκοκκα υλικά πλήρωσης των στηλών, οπότε και αναπτύσσονται µεγάλες πιέσεις. Ο διαχωρισµός των συστατικών ενός µίγµατος βασίζεται στη διαφορετική κατανοµή τους ανάµεσα στη στατική και την κινητή φάση, ως αποτέλεσµα συνδυασµού των διαφορετικών µηχανισµών. Στην HPLC το δείγµα εισάγεται στην κορυφή της χρωµατογραφικής στήλης και µε τη βοήθεια της κινητής φάσης τα συστατικά του δείγµατος µετακινούνται µε τη µορφή ζωνών και τελικά εκλούονται το ένα µετά το άλλο. Πίνακας 5.1: Ταξινόµηση των µορφών της HPLC, µε βάση τις ιδιότητες των ενώσεων που διαχωρίζονται. Είδη Χρωµατογραφίας Χρωµατογραφία Προσρόφησης (κανονικής και αντίστροφης φάσης) Χρωµατογραφία Κατανοµής Χρωµατογραφία Ιοντοανταλλαγής Χρωµατογραφία Ζεύγους Ιόντων Χρωµατογραφία Συγγένειας (Χειρόµορφη χρωµατογραφία) Χρωµατογραφία Αποκλεισµού Μεγέθους/ ιάχυσης Πηκτής Μηχανισµοί ιαχωρισµού Εκλεκτική προσρόφηση/εκρόφηση των διαφόρων ενώσεων στη στατική φάση. Αλληλεπιδράσεις ηλεκτροστατικής φύσης. Εκλεκτική κατανοµή µεταξύ δύο µη µιγνυόµενων υγρών (κινητή και στατική φάση σε υγρή κατάσταση). ιαφορές σε ιοντοανταλλακτικές ιδιότητες, που οφείλονται σε ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, µεταξύ των προσδιοριζόµενων ιόντων και των φορτισµένων οµάδων της στατικής φάσης. Σχηµατισµός ζεύγους ιόντων και εκλεκτική κατανοµή ή προσρόφηση. Εκλεκτική δέσµευση των προσδιοριζόµενων ενώσεων σε υποκαταστάτες συνδεδεµένους στην επιφάνεια της στατικής φάσης. ιαχωρισµός µε βάση το Σχήµα και το µέγεθος των προσδιοριζόµενων µορίων. 54

68 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο Στα πειράµατα που αρχικά έγιναν από τον Tswett είχε χρησιµοποιηθεί µια πολική στατική φάση και η κινητή φάση ήταν περισσότερο άπολη. Το είδος αυτό της χρωµατογραφίας προσρόφησης καλείται «χρωµατογραφία κανονικής φάσης». Στον Πίνακα 5.1 δίνεται η ταξινόµηση των µορφών της HPLC ανάλογα µε το µηχανισµό διαχωρισµού [35-37] Χρωµατογραφία Αντίστροφης Φάσης Πρόκειται για την πιο διαδεδοµένη τεχνική, αφού σ αυτή βρίσκουν εφαρµογή πάνω από το 80% των αναλύσεων µε HPLC. Η στατική φάση είναι λιγότερη πολική της κινητής. Μεταξύ των µορίων του προσδιοριζόµενου συστατικού και της κινητής φάσης αναπτύσσονται κυρίως ασθενείς µη εκλεκτικές αλληλεπιδράσεις van der Waals. Οι προσδιοριζόµενες ενώσεις διαχωρίζονται µε βάση το βαθµό της υδρόφοβης αλληλεπίδρασής τους µε τη στατική φάση, και έτσι όσο πιο πολικό είναι κάποιο µόριο, τόσο πιο γρήγορα εκλούεται από τη χρωµατογραφική στήλη [37]. Τα συνηθέστερα υλικά πλήρωσης στη Χρωµατογραφία Αντίστροφης Φάσης (RP- HPLC) έχουν ως βάση την πηκτή του διοξειδίου του πυριτίου, µε ελεύθερες σιλανολικές (- SiOH) και σιλοξανικές οµάδες (-Si-O-Si). Η κατεργασία της πηκτής του διοξειδίου του πυριτίου µε οργανοχλωροσιλάνια και οργανο-αλκοξυ-σιλάνια οδηγεί στην εισαγωγή διαφόρων οµάδων, όπως όκτυλο (-C 8 ), δεκαόκτυλο (-C 18 ), φαίνυλο (-Ph), κύανο (-CN) και άλλων αλκυλοάζωτο οµάδων (R-N + (CH 3 )). Στη δεσµευµένη πηκτή του SiO 2 επιτυγχάνεται µεγαλύτερη προσρόφηση των ενώσεων και συνήθως καλύτερος διαχωρισµός. Η κινητή φάση στην RP-HPLC είναι περισσότερο πολική. Πρόκειται για µίγµατα νερού ή υδατικών ρυθµιστικών διαλυµάτων µε οργανικούς τροποποιητές, συνήθως µεθανόλη, ακετονιτρίλιο, ισοπροπανόλη, τετραϋδροφουράνιο κ.ά. Σηµαντική παράµετρος για τη συγκράτηση των ιονικών ενώσεων είναι η τιµή του ph της κινητής φάσης. Η πολικότητα της κινητής φάσης καθορίζει τη σειρά έκλουσης των προσδιοριζόµενων ενώσεων [35]. 5.3 Οργανολογία Μία απλή διάταξη ενός συστήµατος HPLC αποτελείται από τα εξής µέρη: α) τις φιάλες αποθήκευσης των διαλυτών, β) την αντλία υψηλής πίεσης, γ) το σύστηµα εισαγωγής του δείγµατος, δ) τη χρωµατογραφική στήλη, ε) τον ανιχνευτή και στ) τη µονάδα επεξεργασίας και καταγραφής των δεδοµένων. Στο Σχήµα 5.2 δίνεται µια τυπική 55

69 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο διάταξη ενός συστήµατος HPLC. Επιπλέον µπορούν να προστεθούν και άλλα τµήµατα βελτιώνοντας την απόδοση της τεχνικής. Το σύστηµα εισαγωγής του δείγµατος µπορεί να αποτελείται από βαλβίδα σταθερού όγκου για έγχυση του δείγµατος ή από αυτόµατο δειγµατολήπτη. Η χρωµατογραφική στήλη µπορεί να βρίσκεται σε ειδικό θερµοστατούµενο φούρνο, εξασφαλίζοντας µεγαλύτερη επαναληψιµότητα στις µετρήσεις. Στον πρώτο ανιχνευτή µπορεί να συνδεθεί σε σειρά και δεύτερος ανιχνευτής. Με τη σύνδεση και δεύτερη χρωµατογραφικής στήλης σε σειρά επιτυγχάνεται καλύτερος διαχωρισµός, ενώ µε µια προστήλη αµέσως πριν τη χρωµατογραφική στήλη αυξάνεται ο χρόνος ζωής της τελευταίας. Επίσης συνδέοντας µια δεύτερη αντλία και µαζί και ένα κατάλληλο σύστηµα επιλογής διαλυτών µετατρέπεται ένα σύστηµα χαµηλής πίεσης (Low Pressure) σε υψηλής πίεσης (High Pressure), εξασφαλίζοντας κυρίως πιο επαναλήψιµες ροές των διαλυτών [35]. Σχήµα 5.2: Τυπική διάταξη συστήµατος HPLC. 56

70 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο Σύστηµα διανοµής διαλυτών Η µικρή κοκκοµετρική διάσταση των υλικών πλήρωσης των χρωµατογραφικών στηλών δηµιουργεί στο σύστηµα υψηλή αντίσταση στη ροή της κινητής φάσης, η οποία υπερνικείται µε τη χρήση αντλίας. Οι αντλίες που µπορούν να χρησιµοποιηθούν χωρίζονται σε αυτές που εξασφαλίζουν σταθερή πίεση στο σύστηµα και σε αυτές που εξασφαλίζουν σταθερή ροή των διαλυτών. Και στις δύο περιπτώσεις οι αντλίες θα πρέπει να αντέχουν σε πίεση µέχρι 7000 psi. Είναι κατασκευασµένες από υλικά ανθεκτικά στους οργανικούς διαλύτες και στα υδατικά ρυθµιστικά διαλύµατα, που συνήθως χρησιµοποιούνται ως κινητές φάσεις. Σε όλες τις εφαρµογές της HPLC χρησιµοποιούνται ευρέως οι αντλίες σταθερής ροής και από αυτές οι πιο συχνά χρησιµοποιούµενες είναι οι αντλίες παλινδρόµησης. Στη βαθµωτή έκλουση, όπου η σύσταση της κινητής φάσης µεταβάλλεται µε το χρόνο, απαιτείται η ανάµιξη των διαλυτών να γίνεται από ειδική διάταξη µίξης. Συστήµατα ανάµιξης χρησιµοποιούν είτε µια αντλία, είτε συνδυασµό δύο αντλιών, όπου επιτρέπονται οι δραστικές αλλαγές της σύστασης του διαλύτη. Η βαθµωτή έκλουση είναι απαραίτητη για το διαχωρισµό ενώσεων µε παρόµοια δοµή και ιδιότητες [35, 36] Μονάδα εισαγωγής δείγµατος Ο πιο απλός τρόπος εισαγωγής δείγµατος στη στήλη είναι µε τη βοήθεια βαλβίδας καθορισµένου όγκου, η οποία αποτελείται από έξι κανάλια δύο θέσεων. Το δείγµα µε µια µικροσύρριγα εισάγεται στο βρόχο (loop). Στη συνέχεια µε περιστροφή της βαλβίδας από τη θέση πλήρωσης, στη θέση έγχυσης και µε τη βοήθεια της κινητής φάσης το δείγµα οδηγείται στην κορυφή της αναλυτικής στήλης. Η διαδικασία αυτή φαίνεται στο Σχήµα 5.3. Στις πιο σύγχρονες διατάξεις χρησιµοποιούνται αυτόµατα συστήµατα δειγµατοληψίας, εξασφαλίζοντας την πλήρη αυτοµατοποίηση του συστήµατος και τους επαναλήψιµους όγκους δείγµατος. Οι αυτόµατοι δειγµατολήπτες είναι ιδιαίτερα χρήσιµοι στις αναλύσεις ρουτίνας, για την ανάλυση µεγάλου αριθµού δειγµάτων [35, 36]. 57

71 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο (α) (β) Σχήµα 5.3 (α): Εισαγωγή του δείγµατος µε βαλβίδα έξι καναλιών δύο θέσεων, (β) Αυτόµατος δειγµατολήπτης 80 θέσεων Χρωµατογραφική στήλη Οι χρωµατογραφικές στήλες που χρησιµοποιούνται στην HPLC είναι κυρίως οι προστήλες και οι αναλυτικές στήλες. Οι προστήλες χρησιµοποιούνται για την προστασία της αναλυτικής στήλης, είναι συνήθως µικρότερες σε διαστάσεις και τοποθετούνται πριν την αναλυτική στήλη. Ενώ η αναλυτική στήλη είναι η καρδιά του χρωµατογραφικού συστήµατος, αφού εκεί πραγµατοποιείται ο διαχωρισµός των συστατικών. Η διαχωριστική ικανότητα της στήλης εξαρτάται από το υλικό πλήρωσης, το Σχήµα και τις διαστάσεις των κόκκων, την ενεργή επιφάνεια και το ποσοστό πλήρωσής της. Οι παρασκευαστικές στήλες είναι στήλες µεγάλων διαστάσεων, µε υλικά πλήρωσης παρόµοια µε αυτά των αναλυτικών στηλών, που χρησιµοποιούνται για το διαχωρισµό και την παραλαβή ενώσεων από ένα µίγµα, σε ποσότητες της τάξης των mg. 58

72 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο Τα υλικά πλήρωσης των στηλών που χρησιµοποιούνται στην HPLC βασίζονται είτε σε ανόργανα κεραµικά, είτε οργανικά πολυµερή υποστρώµατα. Τα ανόργανα κεραµικά που συνήθως χρησιµοποιούνται είναι η πηκτή του διοξειδίου του πυριτίου (silica gel) και το οξείδιο του αργιλλίου (alumina). Τα ανόργανα υλικά πλήρωσης είναι αρκετά ανθεκτικά και δεν αλληλεπιδρούν µε τους διαλύτες. Πολυµερή υλικά πλήρωσης καθαρότητας HPLC βασίζονται σε διασταυρούµενους δεσµούς στυρενίουδιβινυλβενζολίου ή µεθακρυλικών. Τα πολυµερή υλικά πλήρωσης δε χαρακτηρίζονται από υψηλή ανθεκτικότητα και είναι περισσότερο συµπιεσµένα. Οι διαλύτες και οι προσδιοριζόµενες ενώσεις µπορεί να εισχωρήσουν στο πολυµερές υπόστρωµα οδηγώντας σε µικρότερες αποδόσεις της στήλης εξαιτίας της µειωµένης µάζας που µεταφέρεται. Το συνηθέστερο υλικό που χρησιµοποιείται ως υλικό πλήρωσης στη στήλες HPLC είναι η πηκτή του διοξειδίου του πυριτίου. Επιπλέον της υψηλής φυσικής σταθερότητας που τη χαρακτηρίζει, στην επιφάνεια της πηκτής του διοξειδίου του πυριτίου µπορεί εύκολα να προσαρτηθεί ένα µεγάλο εύρος συναρµοτών (ligands). Με την τεχνική αυτή τροποποίηση της επιφάνειάς της παρασκευάζονται υλικά πλήρωσης στηλών για αντίστροφη χρωµατογραφία, για χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής, για υδροφιλικές ή υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις, και για χρωµατογραφία αποκλεισµού µεγέθους. Υλικά πλήρωσης από πηκτή του διοξειδίου του πυριτίου είναι συµβατά µε µεγάλο εύρος διαλυτών από πολικούς µέχρι και µη πολικούς. Για αναλύσεις ρουτίνας που γίνονται σε στήλες µε υλικό πλήρωσης που βασίζεται στην πηκτή του διοξειδίου του πυριτίου το εύρος ph που ενδείκνυται είναι , γιατί έχει αποδειχθεί ότι µειονέκτηµα της είναι η µειωµένη της σταθερότητα σε υδατικές αλκαλικές κινητές φάσεις. Ένα άλλο µειονέκτηµα της πηκτής του διοξειδίου του πυριτίου είναι η παρουσία ελεύθερων σιλανολικών οµάδων, δίνοντας κορυφές µε ουρά σε ουδέτερες συνθήκες (ph 7.0). Η επιφάνεια της πηκτής του διοξειδίου του πυριτίου τροποποιείται εύκολα µε χηµικές αντιδράσεις µε οργανοσιλανολικά αντιδραστήρια. Σκοπός είναι να δηµιουργηθεί οµοιόµορφη µονοµοριακή στιβάδα (δεσµευµένα υλικά πλήρωσης, bonded phase). Υπάρχουν διάφορα είδη σιλανίων που χρησιµοποιούνται για τις αντιδράσεις δέσµευσης, τα οποία χαρακτηρίζονται ως µονο-, δι- ή τρι-δραστικά σιλάνια, ανάλογα µε τον αριθµό των οµάδων πάνω στο σιλάνιο (συνήθως οµάδες χλωρίου) που αλληλεπιδρούν µε την επιφάνεια της πηκτής (Σχήµα 5.4) [35, 36]. 59

73 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο Μονδραστικό ιδραστικό Τριδραστικό Σχήµα 5.4: Μορφές σιλανολικών αντιδραστηρίων που αντιδρούν µε την επιφάνεια της πηκτής του διοξειδίου του πυριτίου. Συχνά τα υλικά πλήρωσης στηλών χρωµατογραφίας αντίστροφης φάσης υποβάλλονται και σε δεύτερο στάδιο δέσµευσης, µε σκοπό τη δέσµευση των µη δραστικών σιλανολικών οµάδων της πηκτής του διοξειδίου του πυριτίου. Ένα µικρό σιλάνιο, συνήθως τριµεθυλοχλωροσιλάνιο χρησιµοποιείται για το σκοπό αυτό. Οι στήλες αυτές ονοµάζονται «endcapped» και είναι ιδιαίτερα διαδεδοµένες στη χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης. Τα υλικά «endcapped» δε θα πρέπει να χρησιµοποιούνται σε ph<2.0. Στον Πίνακα 5.2 δίνονται τα συνηθέστερα εµπορικά διαθέσιµα υλικά δεσµευµένης φάσης µε τα κύρια χαρακτηριστικά τους Σύστηµα ανίχνευσης Στην HPLC χρησιµοποιούνται κυρίως ανιχνευτές συνεχούς παρακολούθησης του υγρού που βγαίνει από τη στήλη, µέσω µιας κυψελίδας συνεχούς ροής. ιάφοροι ανιχνευτές µπορούν να χρησιµοποιηθούν, η αρχή λειτουργίας των οποίων βασίζεται είτε στη µέτρηση µιας συγκεκριµένης φυσικοχηµικής ιδιότητας των προσδιοριζόµενων ενώσεων, είτε στη µέτρηση κάποιας φυσικοχηµικής ιδιότητας της κινητής φάσης. Τα κυριότερα χαρακτηριστικά ενός ανιχνευτή στην HPLC είναι ο θόρυβος, η ευαισθησία, ο χρόνος απόκρισης και η γραµµικότητα. 60

74 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο Πίνακας 5.2: Υλικά πλήρωσης στηλών αντίστροφης φάσης HPLC και τα κυριότερα χαρακτηριστικά τους. Τύπος Υλικού Χηµεία Μέγεθος σωµατιδίων (µm) ιάµετρος πόρων (Å) ραστική επιφάνεια (m 2 /g) Ποσοστό άνθρακα (%) Hypersil C 18 3/5/ Εndcap -ped C 8 3/5/ Inertsil C Kromasil C / Nova- Pack C 8 3.5/ C Amino (NH 2 ) Silica C C Phenyl CN Nucleosil C 18 3/5 100/ /200 14/11 C 8 3/5 100/ /200 9/7 Amino (NH 2 ) CN Silica 3/ Perfectsil C C Symmetry C / C 8 3.5/ XTerra C /3.5/5/ C 8 2.5/3.5/5/ Phenyl 2.5/3.5/5/ Ο πιο διαδεδοµένος ανιχνευτής στην HPLC είναι ο ανιχνευτής υπεριώδουςορατού. Ενώσεις που απορροφούν στο υπεριώδες-ορατό ( nm) µπορούν να προσδιοριστούν µε ανιχνευτές τέτοιου τύπου. Σύµφωνα µε το νόµο Lambert-Beer, η 61

75 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο απορρόφηση της ακτινοβολίας είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ένωσης στην κυψελίδα και του µήκους της διαδροµής στην κυψελίδα: A= logt = log Io = εlc (5.1) I όπου A είναι η απορρόφηση, Τα η διαπερατότητα, I o είναι η ένταση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, Ι είναι η ένταση της εξερχόµενης ακτινοβολίας, ε η µοριακή απορροφητικότητα του δείγµατος, l είναι το µήκος της οπτικής διαδροµής της κυψελίδας σε cm και C είναι η συγκέντρωση του δείγµατος σε mol/l. Η ανίχνευση βασίζεται στην απορρόφηση φωτονίων από κάποια χαρακτηριστική οµάδα της ένωσης. Ο ανιχνευτής υπεριώδους µετράει την απορρόφηση σε ένα συγκεκριµένο προεπιλεγµένο µήκος κύµατος κι έτσι για την ταυτοποίηση των ενώσεων χρησιµοποιείται µόνο ο χρόνος συγκράτησης, στοιχείο όχι πάντα ιδιαίτερα αξιόπιστο, αφού µπορεί στον ίδιο χρόνο να συνεκλούεται και κάποια παρεµπόδιση µαζί µε την ένωση που εξετάζεται. Λύση στο πρόβληµα αυτό έδωσε ο ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων (photodiode array detector, PDA) η λειτουργία του οποίου βασίζεται στη σάρωση του ολικού φάσµατος απορρόφησης της προσδιοριζόµενης ένωσης στο ορατό και στο υπεριώδες. Η ουσιαστικότερη διαφορά µε τον απλό ανιχνευτή UV-Vis είναι ότι στη θέση του µονοχρωµάτορα υπάρχει ένα ολογραφικό φράγµα. Το δείγµα στην κυψελίδα δέχεται την ακτινοβολία ολόκληρου του φάσµατος και η ακτινοβολία που εκπέµπεται, αφού διέλθει από το ολογραφικό φράγµα προσπίπτει στην παράταξη φωτοδιόδων (Σχήµα 5.5). Κάθε δίοδος δέχεται την ακτινοβολία ενός µόνο nm. Το πλεονέκτηµα του PDA είναι η δυνατότητα ταυτόχρονης ανάλυσης σε δύο ή περισσότερα µήκη κύµατος, αυξάνοντας την ευαισθησία του προσδιορισµού. Η µελέτη σε άλλα µήκη κύµατος µπορεί να γίνει και αφού ληφθεί το χρωµατογράφηµα, αφού στη µνήµη του υπολογιστή αποθηκεύεται το ολικό φάσµα απορρόφησης της κάθε ένωσης. Επίσης µπορεί να επιλεχθεί το βέλτιστο µήκος κύµατος µε βάση το φάσµα που λαµβάνεται την κάθε χρονική στιγµή. Σηµαντικό πλεονέκτηµα είναι η δυνατότητα µελέτης της καθαρότητας της κορυφής, αφού την κάθε χρονική στιγµή καταγράφεται το φάσµα της ένωσης που διέρχεται µέσα από την κυψελίδα του ανιχνευτή και µπορεί να δηµιουργηθεί βιβλιοθήκη φασµάτων, η οποία χρησιµοποιείται για την ταυτοποίηση των κορυφών, µε σύγκριση των φασµάτων. Οι φθορισµοµετρικοί ανιχνευτές χρησιµοποιούνται για ενώσεις που φθορίζουν και δίνουν σήµα ανάλογο της συγκέντρωσης του συστατικού που φθορίζει. Ο φθορισµός στηρίζεται στην εκποµπή φωτονίων από ηλεκτρονικά διεγερµένα µόρια. Η ευαισθησία 62

76 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο του φθορισµοµετρικού ανιχνευτή είναι φορές υψηλότερη έναντι του ανιχνευτή UV-Vis. Σχήµα 5.5: Σχηµατική διάταξη ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων. Οι ηλεκτροχηµικοί ανιχνευτές χωρίζονται στους αµπεροµετρικούς, τους αγωγιµοµετρικούς και τους ποτενσιοµετρικούς. Εντούτοις στην HPLC έχει ταυτιστεί ο ηλεκτροχηµικός µε τον αµπεροµετρικό, ο οποίος αναφέρεται στη µέτρηση του ηλεκτρικού ρεύµατος που παράγεται κατά την οξείδωση ή αναγωγή κάποιου συστατικού στην επιφάνεια ηλεκτροδίων µιας κυψελίδας συνεχούς ροής. Αυτοί είναι οι πιο συνηθισµένοι ανιχνευτές που χρησιµοποιούνται στην HPLC, ενώ άλλοι πιο σπάνιοι είναι οι ανιχνευτές δείκτου διάθλασης και οι ανιχνευτές σκεδασµού φωτός µετά από εξάτµιση. Με την ανάπτυξη της φασµατογραφίας µάζας αναπτύχθηκε σήµερα και η συνδυασµένη τεχνική LC-MS µε σηµαντικές εφαρµογές σε όλα τα πεδία της ανάλυσης [35-37] Σύστηµα καταγραφής Ο ολοκληρωτής-καταγραφικό καταγράφει το σήµα που λαµβάνει από τον ανιχνευτή, το ολοκληρώνει και δίνει το χρωµατογράφηµα. ίνει επίσης το χρόνο συγκράτησης του κάθε συστατικού, το ύψος της κάθε κορυφής ή/και το εµβαδόν της. Το αναλογικό καταγραφικό σήµερα έχει αντικατασταθεί από τον ηλεκτρονικό υπολογιστή, ο οποίος µε ειδικό πρόγραµµα που συνοδεύει τις διατάξεις HPLC µετατρέπει το αναλογικό 63

77 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο σήµα σε ψηφιακό. Τα πλεονεκτήµατα από τη χρήση του Η/Υ είναι πολλά, όπως η αποθήκευση µεγάλου όγκου πληροφοριών, η εύκολη αναζήτηση αποθηκευµένων χρωµατογραφηµάτων, η δυνατότητα επεξεργασίας των χρωµατογραφηµάτων και µετά την ανάλυση, η οικονοµία κ.ά [35-37]. 5.4 Χαρακτηριστικά απόδοσης χρωµατογραφήµατος Ως χρωµατογράφηµα ορίζεται η γραφική απεικόνιση του συνεχόµενου σήµατος που καταγράφεται από τον ανιχνευτή για τη σύσταση της κινητής φάσης, συµπεριλαµβανοµένων και των προσδιοριζόµενων ενώσεων, που βγαίνουν κάθε στιγµή από την έξοδο της αναλυτικής στήλης σε σχέση µε το χρόνο. Το προφίλ της συγκέντρωσης του κάθε συστατικού που εκλούεται έχει στο χρωµατογράφηµα την κατανοµή κατά Gauss, αναπαριστώντας τη διασπορά των µορίων κατά το διαχωρισµό. Όσο περισσότερο χρόνο χρειάζεται µια ένωση για να κινηθεί και να εξέλθει από τη στήλη, τόσο πιο διευρυµένη είναι η κορυφή της Χρόνος συγκράτησης Με σταθερή ροή της κινητής φάσης ο χρόνος που χρειάζεται ένα συστατικό να διέλθει µέσα από τη στήλη και να φτάσει στον ανιχνευτή ονοµάζεται χρόνος συγκράτησης t R (retention time). Στο Σχήµα 5.6 δίνεται το χρωµατογράφηµα του διαχωρισµού τριών ενώσεων Α, Β και C, µε τους αντίστοιχους χρόνους συγκράτησης t RΑ, t RΒ, και t RC. Ως t Μ ορίζεται ο χρόνος που χρειάζεται η κινητή φάση για να διέλθει από τη στήλη. Ουσιαστικά ο χρόνος t Μ ισοδυναµεί µε το χρόνο που ένα συστατικό δε συγκρατείται από τη στήλη και εκλούεται αµέσως. Ο χρόνος αυτός ονοµάζεται νεκρός χρόνος. Ο χρόνος συγκράτησης µετριέται από τη στιγµή που το δείγµα εισάγεται στην αναλυτική στήλη και µέχρι τη στιγµή που φτάνει στον ανιχνευτή. Η χρήση του χρόνου συγκράτησης ως γενικό χαρακτηριστικό απόδοσης ενός χρωµατογραφικού διαχωρισµού παρουσιάζει µειονεκτήµατα, καθώς περιλαµβάνει το χρόνο που το συστατικό βρίσκεται στην κινητή φάση, αλλά και το χρόνο που βρίσκεται στη στατική φάση και είναι συνάρτηση της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης. Ο παράγοντας συγκράτησης k (retention factor) είναι πιο πρακτικό µέγεθος για την περιγραφή των χαρακτηριστικών χρόνων συγκράτησης των συστατικών και ισούται µε το λόγο του διορθωµένου χρόνου συγκράτησης του συστατικού (t R - t Μ ) προς το νεκρό χρόνο [35]. 64

78 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο k t t t R M = (5.2) M t M νεκρός χρόνος h ύψος κορυφής V M νεκρός όγκος h 0.5 ύψος στο µέσο της κορυφής t R χρόνος συγκράτησης h 0.1 ύψος στο 10% της κορυφής t R διορθωµένος χρόνος συγκράτησης W b εύρος στη βάση της κορυφής V όγκος συγκράτησης W h εύρος στο µισό του ύψους της κορυφής V διορθωµένος όγκος συγκράτησης a, b πριν και µετά του h 0.1 A εµβαδόν κορυφής MP κινητή φάση Σχήµα 5.6: Παράµετροι που περιγράφουν τις κορυφές ενός χρωµατογραφήµατος Αριθµός θεωρητικών πλακών Η απόδοση µιας αναλυτικής στήλης καθορίζεται από την ικανότητά της να δίνει οξείες και συµµετρικές κορυφές, ανεξάρτητα από το χρόνο συγκράτησης. Μέτρο της απόδοσής της και του χρωµατογραφικού διαχωρισµού είναι ο αριθµός των θεωρητικών πλακών Ν. 65

79 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο N t = R 2 R 2 16( ) 5.54( ) t = W t (5.3) W b t h Η θεωρητική πλάκα είναι µια τεχνητή έννοια, χωρίς υπόσταση, µέσα στη στήλη. Αποτελεί την περιοχή µέσα στη στήλη, όπου επιτυγχάνεται ισορροπία του συστατικού µεταξύ των δύο φάσεων και αναφέρεται σε καθορισµένες συνθήκες του χρωµατογραφικού διαχωρισµού (ταχύτητα κινητής φάσης, θερµοκρασία κ.ά.) [35, 36] Παράγοντας διαχωρισµού και διακριτική ικανότητα Η ικανότητα της αναλυτικής στήλης να διαχωρίσει δύο συστατικά Α και Β, όπου Β είναι το πιο ισχυρά συγκρατηµένο συστατικό, προσδιορίζεται από τη σχετική τους κατανοµή τους µέσα στη στήλη. Ο παράγοντας διαχωρισµού α (separation factor) είναι ο λόγος των παραγόντων συγκράτησης των δύο συστατικών Α και Β. a k k A = (5.4) B όπου k A και k B είναι οι παράγοντες συγκράτησης των συστατικών Α και Β. Ο παράγοντας του διαχωρισµού εκτός από τη στατική φάση εξαρτάται και από τη σύσταση της κινητής φάσης. Η διακριτική ικανότητα R s (resolution) δύο κορυφών δίνεται από τη σχέση: R s tb ta = 1 ( t + t ) 2 W B W A BB (5.5) Όταν η τιµή της διακριτικής ικανότητας είναι µικρότερη από 1 τότε οι κορυφές αλληλεπικαλύπτονται, ενώ ικανοποιητική τιµή θεωρείται όταν είναι µεγαλύτερη του 1.5 [35-37] Συµµετρία κορυφών Οι κορυφές στα χρωµατογραφήµατα της HPLC πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο συµµετρικές και να έχουν τη µορφή της κανονικής κατανοµής Gauss. Συχνά όµως οι κορυφές έχουν µια µορφή ουράς. Η συµµετρία µιας κορυφής περιγράφεται µε δύο τρόπους. Ο ένας είναι ο παράγοντας ουρά της κορυφής (tailing factor) και ο άλλος είναι ο παράγοντας ασυµµετρίας (asymmetry factor). 66

80 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο Ο παράγοντας «ουρά» υπολογίζεται στο 5% του ύψους της κορυφής όπως φαίνεται στο Σχήµα 5.7 και δίνεται από τη σχέση T f =AB/2AC. Σχήµα 5.7: Παράγοντας «ουράς» κορυφής. Η ασυµµετρία (asymmetry) µιας κορυφής υπολογίζεται στο 10% του ύψους της κορυφής όπως φαίνεται στο Σχήµα 5.8 και δίνεται από τη σχέση T f =CB/AC. Σχήµα 5.8: Παράγοντας ασυµµετρίας κορυφής. 67

81 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο Συνήθως οι κορυφές που εκλούονται αργότερα από τη στήλη έχουν µεγαλύτερη ουρά, µε αποτέλεσµα το ύψος τους να είναι µικρότερο. Αυτό σηµαίνει πως τα όρια ανίχνευσης τέτοιων κορυφών είναι υψηλότερα [35, 36] Όγκος συστήµατος Μια σηµαντική παράµετρος που χαρακτηρίζει το κάθε σύστηµα HPLC είναι ο όγκος συστήµατος (όγκος υστέρησης βαθµωτής έκλουσης, dwell volume ή gradient delay volume). Ο όρος αυτός αναφέρεται στον όγκο κινητής φάσης που µεσολαβεί από τη στιγµή της ανάµιξης των διαλυτών της κινητής φάσης µέχρι και τη στιγµή που η κινητή φάση φτάνει στη στήλη. Ο όγκος αυτός περιλαµβάνει τη στιγµή της ανάµιξης, τις σωληνώσεις που µεταφέρουν την κινητή φάση και οποιοδήποτε άλλο όγκο (συµπεριλαµβανοµένης και της διαδροµής µέσα στο βρόχο εισαγωγής του δείγµατος) στο σύστηµα εισαγωγής του δείγµατος. Στο Σχήµα 5.9 φαίνεται σχηµατικά ο νεκρός όγκος µιας διάταξης υψηλής πίεσης HPLC. Ο υπολογισµός του νεκρού όγκου σε οποιαδήποτε διάταξη HPLC γίνεται µε τον παρακάτω τρόπο: Σχήµα 5.9: Σχηµατική παράσταση του όγκου συστήµατος σε διάταξη υψηλής πίεσης HPLC. 1. Αποµακρύνεται η αναλυτική στήλη και χρησιµοποιείται τριχοειδής σωλήνας, ώστε να ενωθεί η έξοδος από το βρόχο, όπου γίνεται η εισαγωγή του δείγµατος µε την είσοδο του ανιχνευτή. 2. Στη γραµµή Α των διαλυτών χρησιµοποιείται διαλύτης διαπερατός στο UV-Vis, όπως νερό. 68

82 Θεωρητικό Μέρος, Κεφάλαιο 5 ο 3. Στη γραµµή Β των διαλυτών χρησιµοποιείται διάλυµα 0.1% ακετόνης που απορροφάει στο UV-Vis στα 265 nm. 4. Επιλέγεται πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης 0-100% Β, µε ροή 1 ml/min για 20 min και εφαρµόζεται το πρόγραµµα καταγράφοντας την απόκριση του σήµατος στα 265 nm. 5. Το «χρωµατογράφηµα» που προκύπτει έχει τη µορφή που δίνεται στο Σχήµα Σχήµα 5.10: Μορφή «χρωµατογραφήµατος» που προκύπτει από τη µέτρηση του όγκου συστήµατος. 6. Υπολογίζεται γραφικά ο χρόνος t D και ο νεκρός όγκος του οργάνου δίνεται από τον τύπο: V D = t D x F (5.6) όπου F είναι η ροή. Από τον τύπο 5.6 φαίνεται πως ο νεκρός όγκος του οργάνου είναι ανάλογος του νεκρού χρόνου t D και της ροής F [35]. 69

83 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 6 ο 6. ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΕΙΓΜΑΤΟΣ-ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ 6.1 Εισαγωγή Η χρήση στερεών προσροφητικών υλικών για την εκχύλιση ενώσεων από κάποιο διάλυµα άρχισε να αναπτύσσεται τη δεκαετία του 80 και σήµερα εφαρµόζεται σε αρκετά υποστρώµατα, συµπεριλαµβανοµένων και των τροφίµων. Η πιο διαδεδοµένη τεχνική εκχύλισης µε προσροφητικό είναι η τεχνική εκχύλισης στερεάς φάσης-υγρού (Solid Phase Extraction, SPE). Η SPE τείνει να αντικαταστήσει την κλασική εκχύλιση Υγρού-Υγρού στις περισσότερες εφαρµογές, καθώς χαρακτηρίζεται από µεγαλύτερη εκλεκτικότητα και ειδικότητα, δίνει υψηλότερες ανακτήσεις και απαιτούνται µικρότεροι όγκοι διαλυτών. Γενικά η SPE είναι µια γρήγορη και αρκετά αποτελεσµατική τεχνική για αποµόνωση και προσυγκέντρωση των προσδιοριζόµενων ενώσεων [38, 39]. Η βασική αρχή της SPE είναι η κατανοµή των προσδιοριζόµενων ενώσεων µεταξύ δύο φάσεων, µιας στερεάς φάσης, του προσροφητικού και µιας υγρής φάσης, του διαλύµατος των προσδιοριζόµενων ενώσεων, όπου συνήθως συνυπάρχουν και οι παρεµποδίσεις. Καθώς το διάλυµα του δείγµατος διέρχεται µέσα από το προσροφητικό, οι ενώσεις που προσδιορίζονται συγκρατούνται πάνω στην επιφάνεια του προσροφητικού. Η ισορροπία µεταξύ των προσδιοριζόµενων συστατικών και του προσροφητικού επιτυγχάνεται γρήγορα εξαιτίας της µεγάλης συγγένειας που πρέπει να έχουν µεταξύ τους, επιτυγχάνοντας έτσι την αποµόνωσή τους από το υπόστρωµα του δείγµατος, µε το οποίο έχουν µικρότερη συγγένεια. Στη συνέχεια τα προσδιοριζόµενα συστατικά παραλαµβάνονται από το υπόστρωµα µε τη βοήθεια κάποιου διαλύτη, ο οποίος χαρακτηρίζεται από µεγάλη συγγένεια µε αυτά. Οι διαφορετικοί µηχανισµοί συγκράτησης και έκλουσης, οφείλονται στις διαµοριακές δυνάµεις µεταξύ των προσδιοριζόµενων ενώσεων, των ενεργών οµάδων του προσροφητικού, του εκλουστικού και του υποστρώµατος του δείγµατος. Με την SPE επιτυγχάνονται τα παρακάτω: Αποµάκρυνση των παρεµποδίσεων από το δείγµα. Προσυγκέντρωση του δείγµατος. Κλασµατοποίηση του δείγµατος σε διαφορετικές ενώσεις ή σε οµάδες ενώσεων, όπως γίνεται και µε την κλασική χρωµατογραφία στήλης. 70

84 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 6 ο Αποθήκευση των προσδιοριζόµενων ενώσεων, που δεν είναι σταθερές σε υδατικά διαλύµατα ή χαρακτηρίζονται από µεγάλη πτητικότητα. Αντιδράσεις παραγωγοποίησης µεταξύ των δραστικών οµάδων των προσδιοριζόµενων ενώσεων και των αντίστοιχων του προσροφητικού. Συνήθως η SPE πραγµατοποιείται µε τη βοήθεια ειδικών µικροστηλών µε προσροφητικό υλικό. Οι µικροστήλες αυτές είναι όµοιες µε τις κοινές σύριγγες που χρησιµοποιούνται στην ιατρική, µόνο που δε φέρουν το έµβολο και τη βελόνα και είναι από πολυπροπυλένιο για να αντέχουν στους διάφορους διαλύτες. Οι µικροστήλες περιέχουν υλικό πλήρωσης µε προσροφητικά διαφόρων µεγεθών κόκκων επιτρέποντας την εφαρµογή χαµηλών πιέσεων, ώστε να διέλθει το δείγµα και το εκλουστικό από τη µικροστήλη. Το προσροφητικό µέσα στη µικροστήλη βρίσκεται µεταξύ δύο δίσκων φρίττας, κατασκευασµένων από τεφλόν (PTFE), πολυαιθυλένιο ή κάποιο µέταλλο, µεγέθους κόκκων συνήθως 20 µm. Πάνω από το προσροφητικό, υλικό εφαρµόζεται το δείγµα, το οποίο συλλέγεται στο κάτω µέρος της µικροστήλης. Παρ όλο που η βαρύτητα επιτρέπει τη διέλευση του δείγµατος µέσα από το προσροφητικό η διαδικασία αυτή διευκολύνεται µε την εφαρµογή κενού, ή ασκώντας θετική πίεση πάνω από τη µικροστήλη ή µε φυγοκέντρηση. Οι µικροστήλες αυτές είτε προσαρµόζονται σε συστήµατα κενού, είτε υπάρχουν ειδικοί υποδοχείς πολλαπλών θέσεων, όπου εφαρµόζονται συνήθως από 10 έως 24 µικροστήλες, µε δυνατότητα ταυτόχρονης εφαρµογής κενού (Σχήµα 6.1). (α) (β) Σχήµα 6.1: (α) Εκχύλιση SPE µε µικροστήλη προσαρµοσµένη σε συσκευή κενού, (β) ιάταξη πολλαπλών θέσεων µικροστηλών SPE µε ταυτόχρονη εφαρµογή κενού. Οι προσροφητικοί δίσκοι SPE, µε την εµπορική ονοµασία Empore είναι µια εναλλακτική λύση εφαρµογής SPE χωρίς µικροστήλες. Ο δίσκος αυτός έχει πάχος 0.5 mm και διάµετρο 47 έως 70 mm και αποτελείται από προσροφητικά σωµατίδια 71

85 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 6 ο διαστάσεων 5 10 µm. Οι δίσκοι αυτοί τοποθετούνται σε ένα απλό σύστηµα διήθησης και µε την εφαρµογή κενού το διάλυµα του δείγµατος διέρχεται από το προσροφητικό (Σχήµα 6.2). Σχήµα 6.2: Εκχύλιση SPE µε προσροφητικούς δίσκους Empore. 6.2 Είδη προσροφητικών SPE και µηχανισµοί δράσης Η επιλογή του προσροφητικού υλικού είναι καθοριστική για µια επιτυχηµένη SPE εκχύλιση µε υψηλές ανακτήσεις των προσδιοριζόµενων ενώσεων. Η γνώση της χηµείας και των χαρακτηριστικών των συνηθέστερων προσροφητικών υλικών βοηθάει στη σωστή επιλογή του. Τα υλικά πλήρωσης µπορούν να ταξινοµηθούν µε βάση τις πιθανές αρχικές αλληλεπιδράσεις των δραστικών οµάδων µε τις προσδιοριζόµενες ενώσεις. Η πλειοψηφία των εφαρµογών γίνεται σε προσροφητικά µε µη πολικές ή πολικές οµάδες. Μια δεύτερη κατηγορία αποτελείται από προσροφητικά µε ανταλλαγή κατιόντων και ανταλλαγή ανιόντων που περιλαµβάνουν δραστικές οµάδες που ανταλλάσσουν ιόντα. Τα συνηθέστερα προσροφητικά έχουν ως βάση τους το συζευγµένο διοξείδιο του πυριτίου. Άλλη µορφή προσροφητικών είναι πολυµερείς ρητίνες πολυστυρενίουδιβινυλοβενζολίου. Τα προσροφητικά αυτά λειτουργούν σε µεγάλο εύρος ph και εξασφαλίζουν καλύτερη συγκράτηση των προσδιοριζόµενων µορίων, γεγονός ιδιαίτερα σηµαντικό για την παραλαβή πολικών µορίων. 72

86 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 6 ο Μια νέα κατηγορία προσροφητικών είναι τα προσροφητικά στα οποία υπάρχει ένα λιπόφιλο και ένα υδρόφιλο πολυµερές. Τέτοια εµπορικά διαθέσιµα προϊόντα είναι οι µικροστήλες OASIS από τη Waters και Abselut Nexus από τη Varian. Πρόκειται για συµπολυµερή πολυβινυλοπυρρολιδόνης µε διασταυρωµένες ρητίνες πολυστυρενίου-διβινυλοβενζολίου. Τα υλικά αυτά προορίζονται για την εκχύλιση λιπόφιλων, υδρόφιλων, όξινων, βασικών και ουδέτερων µορίων, χωρίς να είναι απαραίτητη η ενεργοποίηση του υλικού. Οι µικροστήλες µε προσροφητικό άνθρακα µε πόρους γραφίτη (porous graphitic carbon, PGC) συγκρατούν τα µόρια µε υδρόφοβες και ηλεκτρονιακές αλληλεπιδράσεις. Είναι υλικά περισσότερο οµοιογενή και κατάλληλα για µη πολικά προσδιοριζόµενα µόρια, αλλά και για πολύ πολικά και υδατοδιαλυτά µόρια, τα οποία µπορούν να αποµονωθούν από υδατικά υποστρώµατα. Πίνακας 6.1: Μηχανισµοί δράσης, αντίστοιχες µορφές αλληλεπίδρασης στα διάφορα προσροφητικά και ενέργειες αλληλεπίδρασης µεταξύ προσροφητικού και προσδιοριζόµενων µορίων. Μηχανισµός δράσης Αλληλεπίδραση Προσροφητικά Ενέργεια αλληλεπίδρασης (kcal/mol) van der waals Μη- πολική εκαόκτυλο, όκτυλο, αίθυλο, φαίνυλο, κυκλοέξυλο, στυρενίουδιβινυλοβενζολίου, άνθρακα γραφίτη 1-10 ιπόλου-διπόλου Πολική Κύανο, διοξείδιο του 1-10 πυριτίου εσµοί Πολική Αµίνες, διόλες 5-10 υδρογόνου Ηλεκτροστατικές Ιοντική Κατιονανταλλακτικά, ανιονανταλλακτικά Στον Πίνακα 6.1 δίνονται οι µηχανισµοί αλληλεπίδρασης που αναπτύσσονται µεταξύ του προσροφητικού υλικού και των προσδιοριζόµενων µορίων. Οι συνηθέστερες χηµικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των δραστικών οµάδων του προσροφητικού και των προσδιοριζόµενων ενώσεων είναι µη πολικές, πολικές (δεσµοί υδρογόνου και διπολικοί δεσµοί) και ιοντικές αλληλεπιδράσεις, οι µηχανισµοί των οποίων φαίνονται στο Σχήµα 6.3 [38-41]. 73

87 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 6 ο Οι µη πολικοί δεσµοί είναι ασθενείς αλληλεπιδράσεις, συνήθως δυνάµεις van der Waals ή δυνάµεις διασποράς µεταξύ δεσµών C-H του προσδιοριζόµενου συστατικού και του προσροφητικού, συνήθως δεκαόκτυλο-διοξείδιο του πυριτίου C 18. Η συγκράτηση διευκολύνεται από κάποιο πολικό διαλύτη, ενώ η έκλουση γίνεται µε κάποιο οργανικό διαλύτη ή µίγµατα διαλυτών µε µη πολική δράση (CH 3 OH, CH 3 CN, CHCl 3 κ.ά.). Οι πολικές αλληλεπιδράσεις λαµβάνουν χώρα µεταξύ πολικών οµάδων του προσροφητικού και πολικών οµάδων των συστατικών που αποµονώνονται. Παραδείγµατα οµάδων µε πολικό χαρακτήρα είναι η καρβόνυλο, η καρβόξυλο, η υδρόξυλο, οι άµινο οµάδες, δακτύλιοι µε κάποιο ετεροάτοµο και αρωµατικοί δακτύλιοι µε διπλούς και τριπλούς δεσµούς. Ο σχηµατισµός δεσµού υδρογόνου είναι ο πιο σηµαντικός πολικός µηχανισµός. Οι πολικές αλληλεπιδράσεις είναι ισχυρότερες από τις µη πολικές και παρουσιάζουν ικανοποιητική εκλεκτικότητα. Για την έκλουση χρησιµοποιούνται διαλύτες µε µεγάλη πολικότητα. Οι ιοντικές αλληλεπιδράσεις εκδηλώνονται µεταξύ δύο οµάδων (του προσροφητικού και των προσδιοριζόµενων ενώσεων) αντίθετα φορτισµένων. Πρόκειται για τις ισχυρότερες αλληλεπιδράσεις µεταξύ του προσροφητικού και των προσδιοριζόµενων ενώσεων. Παράδειγµα κατιονικών οµάδων είναι οι αµινοµοµάδες και ανιονικών οι καρβοξυλ-οµάδες. 74

88 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 6 ο (α) (β) (γ) Σχήµα 6.3: Μηχανισµοί δράσεις κατά την SPE (α) µη πολικές αλληλεπιδράσεις, (β) πολικές αλληλεπιδράσεις, (γ) ιοντικές αλληλεπιδράσεις. 75

89 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 6 ο 6.3 Στάδια και ανάπτυξη πρωτοκόλλου SPE Τα στάδια κατά την εκχύλιση µε SPE είναι τέσσερα, όπως φαίνονται και στο Σχήµα 6.4 και αναλυτικά περιγράφονται παρακάτω: 1. Ενεργοποίηση προσροφητικού: στο στάδιο αυτό γίνεται η ενεργοποίηση των δραστικών οµάδων του προσροφητικού µε κάποιο διαλύτη, ο οποίος στη συνεχεία αποµακρύνεται και το υλικό διαβρέχεται µε άλλο διαλύτη κατάλληλο για τη συγκράτηση των προσδιοριζόµενων µορίων πάνω στο προσροφητικό. 2. Εφαρµογή δείγµατος: πρόκειται για το δεύτερο στάδιο της SPE, όπου το διάλυµα του δείγµατος διέρχεται µέσα από το προσροφητικό υλικό. Καθώς το δείγµα εξαναγκάζεται να διέλθει µέσα από τη µικροστήλη αναπτύσσονται οι δυνάµεις αλληλεπίδρασης µεταξύ των συστατικών του δείγµατος και του προσροφητικού. Εκτός όµως από το προσδιοριζόµενο συστατικό συγκρατούνται στο προσροφητικό και κάποιες παρεµποδίσεις. 3. Πλύση: για την αποµάκρυνση των παρεµποδίσεων γίνεται έκπλυση της µικροστήλης µε κάποιο διαλύτη, µικρής εκλουστικής ισχύος, για να µη συµπαρασυρθεί ταυτόχρονα και το προσδιοριζόµενο συστατικό. Συνήθως χρησιµοποιείται νερό ή κάποιο ρυθµιστικό υδατικό διάλυµα. Ο όγκος του διαλύµατος πλύσης δε θα πρέπει να ξεπερνάει το 20-πλάσιο του όγκου του προσροφητικού. 4. Έκλουση του προσδιοριζόµενου συστατικού: µε κατάλληλο διαλύτη στο στάδιο αυτό γίνεται η παραλαβή των προσδιοριζόµενων συστατικών, µε εκρόφησή τους από το προσροφητικό. Η σχέση αλληλεπίδρασης µεταξύ του προσδιοριζόµενου συστατικού και του διαλύτη θα πρέπει να ξεπερνάει την ισχύ των δυνάµεων µεταξύ του προσροφητικού και του συστατικού. Ποσοτική έκλουση συνήθως επιτυγχάνεται µε όγκο διαλύτη 5-πλάσιο του όγκου του προσροφητικού. 76

90 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 6 ο Σχήµα 6.4: Απεικόνιση των σταδίων εκχύλισης µε την τεχνική SPE. Το διάλυµα του δείγµατος που παραλαµβάνεται από το τελικό στάδιο έκλουσης της SPE, συνήθως υποβάλλεται σε εξάτµιση µέχρι ξηρού σε ρεύµα αζώτου. Στη συνέχεια το προσδιοριζόµενο συστατικό επαναδιαλύεται σε συγκεκριµένο όγκο διαλύτη, συνήθως την κινητή φάση. Για την ανάπτυξη πρωτοκόλλου στη τεχνική SPE θα πρέπει να λαµβάνονται υπ όψη οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ του προσδιοριζόµενου συστατικού και του προσροφητικού, του προσροφητικού και του υποστρώµατος και του συστατικού µε το υπόστρωµα, ώστε να επιλεχθεί ο κατάλληλος µηχανισµός δράσης για το υπόστρωµα και τους διαλύτες. Επίσης δοκιµάζεται το στάδιο της πλύσης, το οποίο δεν είναι σε όλες τις περιπτώσεις απαραίτητο και επιλέγονται οι κατάλληλοι όγκοι διαλύτη έκπλυσης, ώστε να µην υπάρχουν απώλειες στο προσδιοριζόµενο συστατικό. Για την επιλογή του κατάλληλου συστήµατος έκλουσης γίνονται δοκιµές, ώστε να επιτευχθούν οι υψηλότερες ανακτήσεις. 77

91 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 7 ο 7. ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑΣ 7.1 Εισαγωγή Η ανάγκη για επικύρωση των αναλυτικών µεθόδων (Analytical Method Validation) γίνεται όλο και εντονότερη τα τελευταία χρόνια, προκειµένου να αποδειχθεί ότι η κάθε µέθοδος δίνει αξιόπιστα αποτελέσµατα. Ουσιαστικά µε τον όρο «επικύρωση» ορίζεται η επιβεβαίωση που προκύπτει µετά από την εξέταση σειράς πρότυπων και εµβολιασµένων δειγµάτων και τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων τους. Οπότε η επικύρωση αναλυτικής µεθόδου είναι µια διαδικασία, µε σκοπό να αποδειχθεί ότι η αναλυτική διαδικασία που έχει επιλεγεί για µία συγκεκριµένη δοκιµασία, είναι τελικά κατάλληλη για το σκοπό της. Οι µέθοδοι χρειάζονται επικύρωση ή επανα-επικύρωση, όταν χρησιµοποιούνται για πρώτη φορά, µετά την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση τους, όταν χρησιµοποιούνται σε αναλύσεις ρουτίνας και όταν µεταβάλλονται κάποιες από τις αρχικές συνθήκες για τις οποίες είχαν επικυρωθεί. Η επικύρωση µπορεί να γίνει µεταξύ πολλών εργαστηρίων ή το κάθε εργαστήριο µπορεί να επικυρωθεί µόνο του (in-house validation). Ο όρος in-house validation σηµαίνει ότι η διαδικασία ελέγχου της µεθόδου γίνεται µέσα σε ένα εργαστήριο, ώστε να αποδειχθεί ότι η µέθοδος δίνει σωστά αποτελέσµατα. Αυτού του είδους η επικύρωση παρέχει µια πρακτική και εναλλακτική προσέγγιση. Η τακτική του in-house validation είναι να γίνεται επικύρωση κάθε νέας µεθόδου που χρησιµοποιείται σε ένα εργαστήριο, παρ όλο που αυτή µπορεί να έχει προηγουµένως επικυρωθεί ακόµη και από διεθνή οργανισµό ή άλλα εργαστήρια. Πάντα είναι απαραίτητος ένας βαθµός επικύρωσης, αναλόγως την περίπτωση, ώστε να αποδειχθεί ότι η µέθοδος εφαρµόζεται ακριβώς µε τον ίδιο τρόπο, δίνοντας συγκρίσιµα αποτελέσµατα. Για αναλύσεις των φαρµακευτικών σκευασµάτων οδηγίες δίνονται από την Αµερικάνικη Φαρµακοποιία (United States Pharmacopoieia, USP), από τη ιεθνή ιάσκεψη Εναρµόνισης (International Conference on Harmonisation, ICH) και από τον οργανισµό ιαχείρισης Τροφίµων και Φαρµάκων (Food and Drug Administration, FDA). Γενικά η επικύρωση µιας αναλυτικής µεθόδου περιλαµβάνει µελέτες για την εξειδίκευση της µεθόδου, τη γραµµικότητα, την ακρίβεια, την επαναληψιµότητα, το 78

92 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 7 ο εύρος, τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού και την ανθεκτικότητά της. Παρ όλο που υπάρχει γενικότερη οµοφωνία σε θέµατα επικύρωσης των αναλυτικών µεθόδων, υπάρχει πληθώρα απόψεων στην υλοποίηση. Στη βιβλιογραφία υπάρχουν διάφορες προσεγγίσεις, η καταλληλότερη όµως οδηγία είναι η απόφαση 2002/657/EC, σχετικά µε την επίδοση αναλυτικών µεθόδων και την ερµηνεία αποτελεσµάτων αναλυτικών µεθόδων, για τη µελέτη παρουσίας καταλοίπων φαρµακευτικών σκευασµάτων στα προϊόντα ζωικής προέλευσης [42-44]. Σύµφωνα µε την απόφαση 2002/657/EC είναι αναγκαίο να εξασφαλιστεί η ποιότητα και η συγκρισιµότητα των αναλυτικών αποτελεσµάτων των εργαστηρίων που έχουν εγκριθεί για τον επίσηµο έλεγχο των καταλοίπων. Αυτό µπορεί να επιτευχθεί µε τη χρήση συστηµάτων διασφάλισης ποιότητας και συγκεκριµένα µε την εφαρµογή µεθόδων που έχουν επικυρωθεί σύµφωνα µε κοινές διαδικασίες επικύρωσης και κριτήρια επίδοσης [34]. 7.2 Κριτήρια επίδοσης αναλυτικών χρωµατογραφικών µεθόδων µε βάση την απόφαση 2002/657/EC Σύµφωνα µε την απόφαση 2002/657/EC για την ερµηνεία των αποτελεσµάτων έχουν γίνει οι παρακάτω θεωρήσεις: 1. Το αποτέλεσµα µιας ανάλυσης θεωρείται «µη συµµορφούµενο», εάν υπάρχει υπέρβαση του ορίου απόφασης της µεθόδου επιβεβαίωσης για την προσδιοριζόµενη ένωση. 2. Εάν έχει καθοριστεί επιτρεπόµενο όριο για µια ένωση, το όριο απόφασης είναι η συγκέντρωση πέραν της οποίας µπορεί να αποφασιστεί, µε στατιστική βεβαιότητα 1-α, εάν έχει υπάρξει αληθώς υπέρβαση του επιτρεπόµενου ορίου. 3. Εάν δεν έχει καθοριστεί επιτρεπόµενο όριο για µια ένωση, το όριο απόφασης είναι η µικρότερη συγκέντρωση στην οποία µια µέθοδος µπορεί να διακρίνει, µε στατιστική βεβαιότητα 1-α, εάν είναι παρούσα η συγκεκριµένη προσδιοριζόµενη ένωση. 4. Για τις ενώσεις της οµάδας Α του παραρτήµατος Ι της οδηγίας 96/23/EC, το σφάλµα α είναι 1% ή µικρότερο. Για όλες τις άλλες ενώσεις το σφάλµα α 5% ή µικρότερο. Μερικοί ορισµοί που δίνονται στην απόφαση 2002/657/EC είναι οι εξής: 79

93 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 7 ο Ως ακρίβεια (accuracy) νοείται η εγγύτητα του αποτελέσµατος µιας δοκιµής και της αποδεκτής τιµής αναφοράς. Προσδιορίζεται µε τον προσδιορισµό της ορθότητας και της πιστότητας. Ως σφάλµα άλφα (α) νοείται η πιθανότητα να είναι συµµορφούµενο το δοκιµασθέν δείγµα, ακόµα κι αν η µέτρηση κατέληξε σε µη συµµορφούµενα αποτελέσµατα («ψευδής απόφαση περί µη συµµόρφωσης»). Ως σφάλµα βήτα (β) νοείται η πιθανότητα να είναι αληθώς συµµορφούµενο το δοκιµασθέν δείγµα, ακόµα κι αν η µέτρηση κατέληξε σε συµµορφούµενα αποτελέσµατα («ψευδής απόφαση περί συµµόρφωσης»). Ως όριο απόφασης (decision limit, CC α ) νοείται το όριο στο οποίο και πάνω από το οποίο µπορεί να αποφασισθεί ότι ένα δείγµα είναι µη συµµορφούµενο µε πιθανότητα σφάλµατος α. Ως ικανότητα ανίχνευσης (detection capability, CC β ) νοείται η µικρότερη περιεκτικότητα σε ένωση που µπορεί να ανιχνευθεί, να ταυτοποιηθεί ή/και να προσδιοριστεί ποσοτικά σε ένα δείγµα, µε πιθανότητα σφάλµατος β. Στην περίπτωση ουσιών που δεν έχει καθοριστεί επιτρεπόµενο όριο, η ικανότητα ανίχνευσης είναι η χαµηλότερη συγκέντρωση για την οποία µια µέθοδος είναι σε θέση να ανιχνεύσει αληθώς µολυσµένα δείγµατα µε στατιστική βεβαιότητα 1-β. Στην περίπτωση ουσιών για τις οποίες έχει καθοριστεί επιτρεπόµενο όριο, αυτό σηµαίνει ότι η ικανότητα ανίχνευσης είναι η συγκέντρωση στην οποία η µέθοδος είναι σε θέση να ανιχνεύσει συγκεντρώσεις στο επιτρεπόµενο όριο µε στατιστική βεβαιότητα 1-β. Ως εµβολιασµένο (spiked) υλικό δείγµατος νοείται ένα δείγµα εµπλουτισµένο µε γνωστή ποσότητα της προσδιοριζόµενης ένωσης που πρόκειται να ανιχνευτεί. Ως εσωτερικό πρότυπο (internal standard, IS) νοείται µια ένωση που δεν περιέχεται στο δείγµα, µε φυσικές-χηµικές ιδιότητες όσο το δυνατόν παρόµοιες µε εκείνες της προσδιοριζόµενης ένωσης, που πρέπει να ταυτοποιηθεί και η οποία προστίθεται σε κάθε δείγµα. Στις περιπτώσεις όπου χρησιµοποιείται ένα κατάλληλο εσωτερικό πρότυπο, το πρότυπο αυτό θα πρέπει να προστίθεται στη δόση προς ανάλυση στην αρχή της διαδικασίας εκχύλισης. Ως επιτρεπόµενο όριο (Minimum Required Performance Limit, MRPL) νοείται το ανώτατο όριο καταλοίπου, το ανώτατο επίπεδο ή άλλο ανώτατο όριο ανοχής για ενώσεις, τα οποία έχουν καθοριστεί σε άλλα σηµεία της κοινοτικής νοµοθεσίας. 80

94 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 7 ο Ως πιστότητα (precision) νοείται η εγγύτητα µεταξύ των αποτελεσµάτων ανεξαρτήτων δοκιµών υπό ρητά καθορισµένες συνθήκες. Το µέτρο της πιστότητας εκφράζεται συνήθως µε όρους µη πιστότητας και υπολογίζεται ως τυπική απόκλιση του αποτελέσµατος της δοκιµής. Μικρότερη πιστότητα προσδιορίζεται µε µια µεγαλύτερη τυπική απόκλιση. Ως ανάκτηση (recovery) νοείται το ποσοστό της αληθούς συγκέντρωσης µιας ένωσης που ανακτάται κατά την αναλυτική διαδικασία. Προσδιορίζεται κατά την επικύρωση, εάν δε διατίθεται πιστοποιηµένο υλικό αναφοράς. Ως επαναληψιµότητα (repeatability) νοείται η πιστότητα υπό συνθήκες επαναληψιµότητας, οι οποίες νοούνται ως οι συνθήκες υπό τις οποίες τα αποτελέσµατα ανεξάρτητων δοκιµών αποκτώνται µε την ίδια µέθοδο επί ταυτόσηµων τεµαχίων δοκιµής, στο ίδιο εργαστήριο, µε τον ίδιο χειριστή που χρησιµοποιεί τον ίδιο εξοπλισµό. Ως ανθεκτικότητα (ruggedness) νοείται η επιδεκτικότητα µιας αναλυτικής µεθόδου σε αλλαγές των πειραµατικών συνθηκών. Για όλες τις πειραµατικές συνθήκες οι οποίες στην πράξη µπορεί να υπόκεινται σε διακύµανση (π.χ. σταθερότητα των αντιδραστηρίων, ph, θερµοκρασία, σύσταση δείγµατος) πρέπει να αναφέρεται κάθε µεταβολή που θα µπορούσε να επηρεάσει το αποτέλεσµα της ανάλυσης. Ως τυφλός προσδιορισµός (reagent blank) δείγµατος νοείται η πλήρης αναλυτική διαδικασία που εφαρµόζεται σε µια δόση προς ανάλυση, η οποία λαµβάνεται από ένα δείγµα στο οποίο απουσιάζει η προσδιοριζόµενη ένωση. Ως ειδικότητα (specificity) νοείται η ικανότητα µιας µεθόδου να διακρίνει µια προσδιοριζόµενη ένωση από άλλες ενώσεις. Αυτό το χαρακτηριστικό είναι κατά κύριο λόγο συνάρτηση της χρησιµοποιούµενης τεχνικής µέτρησης, µπορεί όµως να ποικίλει ανάλογα µε την κατηγορία της ένωσης ή της υποστρώµατος. Σύµφωνα µε τις γενικές απαιτήσεις της απόφασης 2002/657/EC η λήψη, ο χειρισµός και η επεξεργασία των δειγµάτων πρέπει να γίνονται κατά τρόπο, ώστε η δυνατότητα ανίχνευσης της προσδιοριζόµενης ένωσης να είναι η µέγιστη. Οι διαδικασίες χειρισµού του δείγµατος πρέπει να εµποδίζουν την τυχαία επιµόλυνση ή απώλεια της προσδιοριζόµενης ένωσης. Για την αξιολόγηση της ορθότητας αναλυτικών ποσοτικών µεθόδων αρκεί ο προσδιορισµός της ανάκτησης προστιθέµενων γνωστών ποσοτήτων της 81

95 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 7 ο προσδιοριζόµενης ένωσης σε ένα τυφλό υπόστρωµα (µητρικό υλικό). Τα δεδοµένα που διορθώνονται µε τη µέση ανάκτηση είναι αποδεκτά µόνον όταν εµπίπτουν στις τιµές εύρους του Πίνακα 7.1. Πίνακας 7.1: Αξιολόγηση των ανακτήσεων της ελάχιστης ορθότητας των ποσοτικών µεθόδων. Κλάσµα µάζας Εύρος 1 µg/kg - 50 % έως + 20% > 1 έως 10 µg/kg - 30 % έως + 10% 10 µg/kg - 20 % έως + 10% Σύµφωνα µε το κεφάλαιο 3.1 της απόφασης 2002/657/EC τα χαρακτηριστικά επίδοσης που θα πρέπει να προσδιορίζονται σε κάθε περίπτωση επικύρωσης αναλυτικής µεθοδολογίας για τον προσδιορισµό καταλοίπων σε προϊόντα ζωικής προέλευσης, όταν γίνεται η επικύρωση γίνεται σε ένα µόνο εργαστήριο είναι: Η ειδικότητα (specificity). Για τις αναλυτικές µεθόδους έχει σηµασία η ικανότητα διάκρισης ανάµεσα στην προσδιοριζόµενη ένωση και σε συγγενικές ενώσεις (ισοµερή, µεταβολίτες, προϊόντα αποικοδόµησης, ενδογενείς ενώσεις, συστατικά του υποστρώµατος κ.λ.π.) Η ορθότητα (precision). Η ορθότητα µπορεί να εξακριβωθεί µέσω πιστοποιηµένου υλικού αναφοράς ή για τις περιπτώσεις που δεν είναι διαθέσιµο προσδιορίζεται η ανάκτηση. Η ανθεκτικότητα (ruggedness). Γίνονται µελέτες των συνεπειών της µεθόδου ύστερα από λογικές µεταβολές ήσσονος σηµασίας. Σκοπός είναι να µελετηθούν οι παράγοντες που επηρεάζουν σηµαντικά τα αποτελέσµατα, ώστε να προσδιορίζονται σαφώς στο πρωτόκολλο της µεθόδου. Η σταθερότητα (stability). Έχει παρατηρηθεί ότι η ανεπαρκής σταθερότητα της προσδιοριζόµενης ένωσης ή των συστατικών του υποστρώµατος στο δείγµα κατά την αποθήκευση ή την ανάλυση µπορεί να προκαλέσει σηµαντικές αποκλίσεις στο αποτέλεσµα της ανάλυσης. Για το σκοπό αυτό µελετάται η σταθερότητα του διαλύµατος της προσδιοριζόµενης ένωσης και η σταθερότητα της προσδιοριζόµενης ένωσης στη υπόστρωµα (µητρικό υλικό). 82

96 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 7 ο Οι καµπύλες βαθµονόµησης (calibration curves). Επιλέγονται πέντε τουλάχιστον επίπεδα, τα οποία χρησιµοποιούνται για τη χάραξη της καµπύλης. Υπολογίζεται ο µαθηµατικός τύπος της καµπύλης και περιγράφεται το εύρος της γραµµικής περιοχής. Η ανάκτηση (recovery). Εάν δεν υπάρχει διαθέσιµο πιστοποιηµένο υλικό αναφοράς, έξι υποπολλαπλάσια δείγµατα τυφλού υλικού εµβολιάζονται µε ποσότητα ίση µε 0.5, 1 και 1.5 φορά το επιτρεπόµενο όριο. Τα δείγµατα αναλύονται και υπολογίζεται η συγκέντρωση σε κάθε δείγµα. Υπολογίζεται η ανάκτηση µε τον τύπο: % ανάκτηση = 100 x µετρηθείσα συγκέντρωση/επίπεδο εµβολιασµού Τέλος υπολογίζεται η µέση ανάκτηση και ο συντελεστής µεταβλητότητας για τα έξι αποτελέσµατα σε κάθε επίπεδο. Η επαναληψιµότητα (repeatability). Ένα σύνολο δειγµάτων µε τα ίδια υποστρώµατα εµβολιάζονται µε την προσδιοριζόµενη ένωση µε ποσότητα ίση µε 0.5, 1 και 1.5 φορά το επιτρεπόµενο όριο και σε κάθε επίπεδο η ανάλυση γίνεται έξι φορές. Τελικά υπολογίζονται οι συνολικές µέσες συγκεντρώσεις και ο συντελεστής µεταβλητότητας. H ενδοεργαστηριακή αναπαρωγιµότητα (within-laboratory reproducibility). Η σειρά αναλύσεων της επαναληψιµότητας επαναλαµβάνεται σε έξι τουλάχιστον αντίγραφα µε διαφορετικούς χειριστές, διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες, διαφορετικές παρτίδες αντιδραστηρίων και διαλυτών, διαφορετικά όργανα. Στο τέλος υπολογίζεται η µέση συγκέντρωση, η τυπική απόκλιση και ο συντελεστής µεταβλητότητας των εµβολιασµένων δειγµάτων. Το όριο απόφασης (decision limit, CC α ). Για τις ενώσεις που δεν έχει καθοριστεί επιτρεπόµενο όριο, υπολογίζεται αναλύοντας τουλάχιστον 20 τυφλά υλικά ανά υπόστρωµα, ώστε να υπολογιστεί ο λόγος σήµατος προς θόρυβο το χρονικό διάστηµα κατά το οποίο αναµένεται η αναλυτέα ουσία. Το τριπλάσιο του λόγου του σήµατος προς θόρυβο µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως όριο απόφασης. Αυτό ισχύει για ποσοτικές και ποιοτικές αναλύσεις. Για τις ενώσεις που έχει καθοριστεί επιτρεπόµενο όριο, το όριο απόφασης υπολογίζεται αναλύοντας τουλάχιστον 20 τυφλά υλικά ανά υπόστρωµα εµβολιασµένα µε την αναλυτέα ουσία στο επιτρεπόµενο όριο. Η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στο επιτρεπόµενο όριο συν 1.64 φορές την αντίστοιχη τυπική απόκλιση ισούται µε το όριο απόφασης (α = 5%). 83

97 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 7 ο Η ικανότητα ανίχνευσης (detection capability, CC β ). Για τις ενώσεις που δεν έχει καθοριστεί επιτρεπόµενο όριο, υπολογίζεται µε την ανάλυση τουλάχιστον 20 τυφλών υλικών ανά υπόστρωµα εµβολιασµών µε την αναλυτέα ουσία στο όριο απόφασης. Αναλύονται τα δείγµατα και ταυτοποιούνται οι αναλυτέες ουσίες. Η τιµή του ορίου απόφασης συν 1.64 φορές την τυπική απόκλιση της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιµότητας της µετρηθείσας περιεκτικότητας ισούται µε την ικανότητα ανίχνευσης (β = 5%). Για τις ενώσεις που έχει καθοριστεί επιτρεπόµενο όριο, η ικανότητα ανίχνευσης υπολογίζεται αναλύοντας τουλάχιστον 20 τυφλά υλικά ανά υπόστρωµα εµβολιασµένα µε την αναλυτέα ουσία στο όριο απόφασης. Η τιµή του ορίου απόφασης συν 1.64 φορές την αντίστοιχη τυπική απόκλιση ισούται µε την ικανότητα ανίχνευσης (β = 5%). Το όριο απόφασης και η ικανότητα ανίχνευσης που περιγράφονται παραπάνω είναι δύο καινούρια κριτήρια επίδοσης. Πρόκειται για δύο στατιστικά όρια, σύµφωνα µε τα οποία ορίζονται οι κρίσιµες συγκεντρώσεις πάνω από τις οποίες η µέθοδος µπορεί µε ασφάλεια να διαχωρίσει και προσδιορίσει ποσοτικά µια ένωση, λαµβάνοντας υπ όψη τη µεταβλητότητα της µεθόδου και τη στατιστική αβεβαιότητα. Για τις ουσίες που έχει καθοριστεί επιτρεπόµενο όριο, η γραφική παράσταση των αναλυτικών ορίων δίνεται στο Σχήµα 7.1 [45]. 84

98 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 7 ο x B Μέση «συγκέντρωση» του τυφλού δείγµατος. x Μέση συγκέντρωση του δείγµατος που περιέχει την προσδιοριζόµενη ένωση PL στο επιτρεπόµενο όριο. x S Μέση συγκέντρωση του εµβολιασµένου δείγµατος. s Τυπική απόκλιση του δείγµατος που περιέχει την προσδιοριζόµενη ένωση PL στο επιτρεπόµενο όριο (προσδιορισµός υπό ενδοεργαστηριακές συνθήκες αναπαραγωγιµότητας). s S a β Τυπική απόκλιση του εµβολιασµένου δείγµατος (προσδιορισµός υπό ενδοεργαστηριακές συνθήκες αναπαραγωγιµότητας). Ποσοστό ψευδώς µη συµµορφούµενων αποτελεσµάτων. Ποσοστό ψευδώς συµµορφούµενων αποτελεσµάτων. CC Απόκριση µε δεδοµένο σφάλµα α και 50% σφάλµα β. a CC β Απόκριση µε πολύ µικρό σφάλµα α και δεδοµένο σφάλµα β. Σχήµα 7.1: Γραφική απεικόνιση του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης, στις ουσίες για τις οποίες δεν έχει καθοριστεί επιτρεπόµενο όριο. 85

99 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 7 ο 7.3 Πρόσθετα κριτήρια επίδοσης Στην απόφαση 2002/657/EC δεν περιγράφονται οι όροι όριο ανίχνευσης και όριο ποσοτικής αποτίµησης, γιατί καλύπτονται από τους όρους «όριο απόφασης» και «ικανότητα ανίχνευσης», αντίστοιχα, πρόκειται όµως για δύο παραµέτρους σηµαντικές για µια αναλυτική µέθοδο. Ως όριο ανίχνευσης (limit of detection, LOD) ορίζεται η χαµηλότερη συγκέντρωση του εξεταζόµενου συστατικού στο δείγµα, η οποία µπορεί να ανιχνευθεί χωρίς απαραίτητα να προσδιοριστεί ποσοτικά. Με βάση την τυπική απόκλιση της απόκρισης του σήµατος και την κλίση, το όριο ανίχνευσης δίνεται από τη σχέση: 3.3σ LOD = (7.1) S Όπου σ = η τυπική απόκλιση της απόκρισης του σήµατος και S = η κλίση της καµπύλης αναφοράς του συστατικού [45]. Ως όριο ποσοτικής αποτίµησης (limit of quantitation, LOQ) ορίζεται η χαµηλότερη συγκέντρωση του συστατικού στο δείγµα, η οποία προσδιορίζεται ποσοτικά µε ικανοποιητική ακρίβεια και επαναληψιµότητα. Με βάση την τυπική απόκλιση της απόκρισης του σήµατος και την κλίση, το όριο ανίχνευσης δίνεται από τη σχέση: 10σ LOQ = (7.2) S Όπου σ = η τυπική απόκλιση της απόκρισης του σήµατος και S = η κλίση της καµπύλης αναφοράς του συστατικού [46]. 86

100 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 8 ο 8. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ 8.1 Εισαγωγή Η σύγχρονη αναλυτική χηµεία είναι κυρίως επιστήµη ποσοτική. Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων το ποσοτικό αποτέλεσµα έχει ιδιαίτερη βαρύτητα σε σχέση µε το ποιοτικό. Ακόµα και στις περιπτώσεις που ενδιαφέρει µόνο το ποιοτικό αποτέλεσµα, χρησιµοποιείται η αντίστοιχη αναλυτική µέθοδος που θα δώσει το ποσοτικό αποτέλεσµα. Καθώς οι ποσοτικές µελέτες κυριαρχούν πλέον σε ένα αναλυτικό εργαστήριο, έχει γίνει αποδεκτό ότι σε όλες τις µελέτες υπεισέρχονται σφάλµατα, που παίζουν καθοριστικό ρόλο στο αποτέλεσµα. Οποιοδήποτε ποσοτικό αποτέλεσµα έχει αξία, µόνο αν συνοδεύεται από την εκτίµηση του σφάλµατός του. Η αρχή αυτή βρίσκει εφαρµογή όχι µόνο στην αναλυτική χηµεία, αλλά σε οποιοδήποτε πεδίο µελετών όπου λαµβάνονται αριθµητικά πειραµατικά αποτελέσµατα [47]. 8.2 Καµπύλη αναφοράς και Συντελεστής κατανοµής Για τις ποσοτικές µετρήσεις στη χρωµατογραφία κατασκευάζεται η καµπύλη αναφοράς. Για τη χάραξη της καµπύλης αναφοράς, πρότυπα δείγµατα σε τρία, τέσσερα ή και περισσότερα επίπεδα γνωστών συγκεντρώσεων αναλύονται κάτω από τις ίδιες συνθήκες που θα αναλυθεί στη συνέχεια το δείγµα. Από τα αποτελέσµατα αυτών των µετρήσεων χαράσσεται η καµπύλη αναφοράς, όπου στον άξονα x εισάγονται οι γνωστές συγκεντρώσεις των πρότυπων δειγµάτων και στον άξονα y οι τιµές του σήµατος απόκρισης του οργάνου, αντίστοιχα για κάθε επίπεδο συγκέντρωσης. Στη χρωµατογραφία το σήµα του ανιχνευτή µετατρέπεται σε κορυφές τύπου Gauss και µε τη βοήθεια ηλεκτρονικών ολοκληρωτών και λογισµικών προγραµµάτων υπολογίζεται το εµβαδό της κάθε κορυφής ή και το ύψος της. Στη χρωµατογραφία η συγκέντρωση είναι ανάλογη του ύψους ή συνηθέστερα του εµβαδού της κορυφής. Ο τρόπος αυτός χάραξης της καµπύλης αναφοράς ονοµάζεται µέθοδος βαθµονόµησης. Στην HPLC συνηθέστερα για τη βαθµονόµηση χρησιµοποιείται η µέθοδος του εσωτερικού προτύπου. Εκτός από την αυξανόµενη συγκέντρωση του µετρούµενου συστατικού προστίθεται στα πρότυπα διαλύµατα και ποσότητα εσωτερικού προτύπου, 87

101 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 8 ο ώστε η τελική του συγκέντρωση να παραµένει σταθερή. Έτσι, αντί για το εµβαδόν χρησιµοποιείται κάθε φορά ο λόγος του εµβαδού του µετρούµενου συστατικού προς το εµβαδόν του εσωτερικού προτύπου. Με τον τρόπο αυτό µειώνονται οι διακυµάνσεις µιας µέτρησης εξαιτίας µικρών τυχαίων και συστηµατικών σφαλµάτων. Με ανάλυση παλινδρόµησης υπολογίζεται η εξίσωση παλινδρόµησης, η οποία είναι η καλύτερη γραµµική προσαρµογή µεταξύ των σηµείων. Ο υπολογισµός της εξίσωσης παλινδρόµησης γίνεται µε τη βοήθεια λογισµικών προγραµµάτων, όπως το Excel της εταιρίας Microsoft Corporation. Η ευθεία που προκύπτει είναι της µορφής y = (a ± S a ) + (b ± S b )x, όπου a είναι η τεταγµένη επί την αρχή, S a η τυπική απόκλιση της τεταγµένης επί την αρχή και b η κλίση της ευθείας, S b η τυπική απόκλιση της κλίσης. Από την ευθεία ελαχίστων τετραγώνων υπολογίζεται στη συνέχεια η συγκέντρωση άγνωστου δείγµατος (x) από το λόγο του εµβαδού της κορυφής του συστατικού προς το εµβαδόν του εσωτερικού προτύπου (y). Στο Σχήµα 8.1 φαίνεται ένα παράδειγµα καµπύλης αναφοράς από την οποία µπορεί να υπολογιστεί η συγκέντρωση άγνωστου δείγµατος. Σχήµα 8.1: Χάραξη καµπύλης αναφοράς όπου είναι τα σηµεία των γνωστών συγκεντρώσεων και είναι το άγνωστο δείγµα. Η γραµµικότητα της καµπύλης αναφοράς περιγράφεται από το συντελεστή συσχέτισης r. Συντελεστής συσχέτισης r = 1, σηµαίνει ότι η καµπύλη αναφοράς είναι απόλυτη γραµµική. Στην HPLC η καµπύλη αναφοράς θεωρείται ικανοποιητικά γραµµική όταν 0.95 r Ανάλυση παλινδρόµησης για τη σύγκριση δύο αναλυτικών µεθόδων Με τη βοήθεια της ανάλυσης παλινδρόµησης µπορούν δύο διαφορετικές αναλυτικές µέθοδοι να συγκριθούν, ώστε να αποδειχθεί αν µπορεί η µια να 88

102 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 8 ο αντικαταστήσει την άλλη. Αν στον άξονα x τοποθετηθούν τα αποτελέσµατα διαφορετικών συγκεντρώσεων, όπως προέκυψαν από τη µια µέθοδο και στον άξονα y τα αποτελέσµατα των αντίστοιχων συγκεντρώσεων, όπως προέκυψαν από τη δεύτερη µέθοδο, τότε κάθε σηµείο πάνω στο γράφηµα παριστάνει ένα δείγµα που έχει µετρηθεί και µε τις δύο µεθόδους. Από την ευθεία ελαχίστων τετραγώνων υπολογίζεται η κλίση της ευθείας (b), η τεταγµένη επί την αρχή (a) και ο συντελεστής συσχέτισης (r). Η ιδανική περίπτωση είναι όταν b = 1 και a = 0. Στην πράξη αυτό δεν µπορεί να συµβεί, γιατί ακόµα και όταν δεν υπάρχουν συστηµατικά σφάλµατα, υπάρχουν πάντα τα τυχαία σφάλµατα, ώστε οι δύο αναλυτικές µέθοδοι να µη δώσουν ακριβώς το ίδιο αποτέλεσµα για ένα δείγµα. Υπάρχουν διάφορες µορφές αποκλίσεων από την ιδανική περίπτωση (a = 0, b = r = 1). Για παράδειγµα όταν b = 1, αλλά a 0 σηµαίνει πως µια από τις δύο µεθόδους δίνει µεγαλύτερο ή µικρότερο αποτέλεσµα για µια συγκέντρωση. Άλλη περίπτωση είναι όταν b > 1 ή b < 1, που σηµαίνει ότι κάποιο συστηµατικό σφάλµα επηρεάζει την καµπύλη αναφοράς σε µια από τις δύο µεθόδους. Μπορεί να συµβαίνουν τα παραπάνω δύο ταυτόχρονα ή πλήθος άλλων συστηµατικών σφαλµάτων και η καµπύλη αναφοράς µεταξύ των δύο µεθόδων να µην είναι ευθεία. Η σύγκριση δύο αναλυτικών µεθόδων µε ανάλυση παλινδρόµησης γίνεται εύκολα επίσης µε τη βοήθεια του λογισµικού προγράµµατος Excel της εταιρίας Microsoft Corporation. 89

103 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο 9. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ 9.1 Προσδιορισµός των (φθορο)κινολονών σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Πλήθος αναλυτικών µεθόδων είναι δηµοσιευµένες στη βιβλιογραφία για τον προσδιορισµό των κινολονών και των φθοροκινολονών σε φαρµακευτικά σκευάσµατα (ταµπλέτες, κάψουλες, ενέσιµα, οφθαλµικά διαλύµατα και ωτικές σταγόνες). Οι µέθοδοι που αναπτύσσονται εφαρµόζουν κυρίως τις φασµατοσκοπικές τεχνικές [48-67]. Επίσης εφαρµόζονται οι τεχνικές της ηλεκτροανάλυσης [67-75], της χηµειοφωταύγειας [76-79], της φασµατοσκοπίας ατοµικής απορρόφησης [80], της χρωµατογραφίας λεπτής στιβάδας υψηλής απόδοσης [81] και της µικροβιολογικής ανάλυσης [82]. Όλες οι παραπάνω µελέτες αφορούν τον προσδιορισµό µιας µόνο (φθορο)κινολόνης ή όταν πρόκειται για παραπάνω από µια ενώσεις, ο προσδιορισµός δεν είναι ταυτόχρονος. ιαχωριστικές τεχνικές που εφαρµόζονται για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό (φθορο)κινολονών είναι η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση (CE) για τον προσδιορισµό της CIP [83] και για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό δέκα ενώσεων [84] και η HPLC για τον προσδιορισµό µιας κινολόνης [85-88] ή και ταυτόχρονα τεσσάρων ενώσεων [89]. Περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τις δηµοσιευµένες εργασίες δίνονται στον Πίνακα 9.1. Στις δηµοσιευµένες εργασίες που εφαρµόζουν την τεχνική της HPLC, οι αναλυτικές στήλες που χρησιµοποιούνται είναι η Inertsil ODS-2, 5 µm [85], η Lichrospher 100 RP-18, 10 µm [87], η Lichrosorb RP-8, 10 µm [86], η Kromasil 100 C 18, 5 µm [88] και η Kromasil 100 C 8, 5 µm [89]. Τα υλικά αυτά είναι όλα «endcapped», µε σφαιρικό του υλικό πλήρωσης και δραστική επιφάνεια (m 2 /g). 9.2 Γενικά για τον προσδιορισµό των (φθορο)κινολονών σε ιστούς κρεοπαραγωγών ζώων και σε προϊόντα ζωικής προέλευσης Η ολοένα αυξανόµενη χρήση των (φθορο)κινολονών τις τελευταίες δύο δεκαετίες, τόσο στην ιατρική, όσο και στην κτηνιατρική, οδήγησε στην ανάγκη για κλινικές και φαρµακολογικές µελέτες των ενώσεων αυτών. Επιπλέον η ανάγκη για την προστασία της υγείας των καταναλωτών καθιστούν όλο και πιο απαραίτητες τις 90

104 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο γρήγορες αναλυτικές τεχνικές για ανάλυση δειγµάτων τροφίµων που προέρχονται από ζώα στα οποία έχει γίνει χρήση αντιβιοτικών. Η πλειοψηφία των δηµοσιευµένων µελετών (49%) τα τελευταία 20 χρόνια αφορά στον ταυτόχρονο προσδιορισµό ενός, δύο ή τριών (φθορο)κινολονών σε δείγµατα τροφίµων και προϊόντων ζωικής προέλευσης. Επίσης το 20% των δηµοσιευµένων εργασιών αφορά στην ανάπτυξη µεθόδων για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό τεσσάρων, πέντε και έξι (φθορο)κινολονών. Στο 24% των σχετικών εργασιών γίνεται προσδιορισµός εφτά, οκτώ και εννέα ενώσεων και µόνο στο 7% γίνεται προσδιορισµός δέκα, έντεκα και δώδεκα ενώσεων. Σε κάποιες από τις παραπάνω εργασίες η προκατεργασία των δειγµάτων και ο προσδιορισµός των µελετώµενων ενώσεων δεν είναι ταυτόχρονος, αλλά γίνεται σε οµάδες, συνήθως όξινων και βασικών (φθορο)κινολονών. ιάφορες είναι οι αναλυτικές τεχνικές που χρησιµοποιούνται, σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία, για τη µελέτη και τον προσδιορισµό των (φθορο)κινολονών σε υποστρώµατα όπως ο µυϊκός και ο λιποειδής ιστός, το ήπαρ, οι νεφροί διαφόρων ζώων που προορίζονται για κατανάλωση από τον άνθρωπο και σε προϊόντα, όπως τα αυγά και το γάλα. Στην πλειοψηφία των εργασιών, όπως φαίνεται και από το γράφηµα του Σχήµατος 9.1 (α), χρησιµοποιείται η τεχνική της HPLC, ενώ αρκετά διαδεδοµένη είναι και η τεχνική της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης. Σχετικά µε τις τεχνικές ανίχνευσης οι περισσότερες εργασίες βασίζονται στην ιδιότητα των (φθορο)κινολονών να φθορίζουν γι αυτό ανιχνεύονται και φθορισµοµετρικά. Επίσης χρησιµοποιείται η τεχνική της φασµατοσκοπίας µαζών είτε µόνη της, είτε µε συνδυασµό µε κάποια άλλη τεχνική ανίχνευσης, συνήθως το φθορισµό ή και την απορρόφηση στο υπεριώδες-ορατό. Στη φασµατοσκοπία µάζας των (φθορο)κινολονών προκαλείται συνήθως θετικός ιονισµός, καθώς η αµινο-οµάδα των περισσοτέρων κινολονών πρωτονιώνεται εύκολα σε όξινες συνθήκες της κινητής φάσης. Τέλος πλήθος εργασιών χρησιµοποιεί απλά την απορρόφηση στο υπεριώδεςορατό, είτε µε απλό ανιχνευτή UV, είτε µε ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων, για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό, σε περισσότερα του ενός µήκη κύµατος. Στο γράφηµα του Σχήµατος 9.2 (β) δίνεται το ποσοστό εφαρµογής των διαφόρων τεχνικών ανίχνευσης. 91

105 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο CE 10% TLC 4% Φθορισµο- µετρικές 4% UV/PDA 28% MS 21% Α HPLC 82% B FD 51% Σχήµα 9.1: (α) Κατανοµή των αναλυτικών τεχνικών που έχουν χρησιµοποιηθεί από το 1989 µέχρι σήµερα για τη µελέτη των (φθορο)κινολονών σε δείγµατα τροφίµων ζωικής προέλευσης και (β) κατανοµή των αντίστοιχων τεχνικών ανίχνευσης που έχουν χρησιµοποιηθεί. Στον Πίνακα 9.2 συνοψίζονται πληροφορίες σχετικά µε τις ενώσεις που προσδιορίζονται σε κάθε δηµοσιευµένη µελέτη, το υπόστρωµα στο οποίο έγινε η έρευνα, την αναλυτική τεχνική που χρησιµοποιήθηκε, τις ανακτήσεις και το όριο ανίχνευσης της µεθόδου. 9.3 Μελέτη των χρωµατογραφικών συνθηκών των δηµοσιευµένων εργασιών µε υποστρώµατα ιστούς κρεοπαραγωγών ζώων και προϊόντα ζωικής προέλευσης Η HPLC αντίστροφης φάσης χρησιµοποιείται κυρίως για τον προσδιορισµό των (φθορο)κινολονών σε δείγµατα τροφίµων ζωικής προέλευσης. Ο διαχωρισµός τους επιτυγχάνεται σε αναλυτικές στήλες µε υλικό πλήρωσης πηκτή διοξειδίου του πυριτίου, όπου είναι δεσµευµένη µια C 8 ή C 18 αλκυλο-οµάδα και σε στήλες µε υλικό πλήρωσης διάφορα πολυµερή υλικά. Οι κινητές φάσεις που χρησιµοποιούνται είναι µίγµατα υδατικών ρυθµιστικών διαλυµάτων µε οργανικούς διαλύτες, κυρίως µεθανόλη (CH 3 OH) και ακετονιτρίλιο (CH 3 CN), σε διάφορες αναλογίες. Επίσης για να µειωθεί ο χρόνος συγκράτησης χρησιµοποιούνται αντιδραστήρια δηµιουργίας ζεύγους ιόντων, όπως 1-επτανοθειϊκό οξύ και τετραβουτυλο-βρωµιούχο αµµώνιο (TBA-Br), ενώ για να βελτιωθεί η µορφή των κορυφών (µικρότερα φαινόµενα ουράς) προστίθεται στην κινητή φάση ποσότητα τριαιθυλαµίνης (ΤΕΑ). Στη συνέχεια γίνεται εκτενής περιγραφή των χρωµατογραφικών συνθηκών που έχουν εφαρµοστεί σε κάθε δηµοσιευµένη µελέτη. 92

106 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Στήλη NovaPack C 18 (300 x 3.9 mm, 4 µm) χρησιµοποιήθηκε για το διαχωρισµό NOR και OFL σε µυϊκό ιστό πουλερικών, στα οποία έχει γίνει χορήγηση των µελετώµενων σκευασµάτων. Η έκλουση είναι ισοκρατική µε (Α) CH 3 OH και (Β) 4 ml Η 3 ΡΟ 4 και 7.5 ml ΤΕΑ σε 1 L νερό, σε αναλογία όγκων 77/23, v/v (ph 3.5). Η ροή ήταν 1.0 ml/min και για την ανίχνευση χρησιµοποιήθηκε φθορισµοµετρικός ανιχνευτής για τη NOR σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc = 278 nm και µήκος κύµατος εκποµπής λ em = 450 nm και αντίστοιχα για την OFL λ exc = 295 nm και λ em = 455 nm [90]. Για το διαχωρισµό πέντε φθοροκινολονών (CIP, DAN. ENR, SAR και DIF) και δύο κινολονών (OXO και FLU) σε µυϊκό ιστό πουλερικών χρησιµοποιήθηκε στήλη Zorbax Eclipse XDB-C 8 (150 x 4.6 mm). Η έκλουση ήταν βαθµωτή µε κινητή φάση (Α) CH 3 CN και (Β) 0.01Μ ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών σε ph 4.5, ρυθµισµένο µε ΝΗ 4 ΟΗ. Η ροή ήταν 1.5 ml/min και χρησιµοποιήθηκε εσωτερικό πρότυπο NOR. Η ανίχνευση έγινε µε PDA ανιχνευτή στα 250 nm για τις OXO και FLU και στα 280 nm για τις υπόλοιπες FQs [91]. Στήλη Inertsil C 8 (250 x 4.6 mm, 5 µm) χρησιµοποιήθηκε για το διαχωρισµό των FLU και OXO σε µυϊκό ιστό σολοµού, χοίρου και πουλερικών. Η έκλουση ήταν ισοκρατική µε µίγµα CH 3 CN/νερού (45:55, v/v) που περιείχε 10 mm οξαλικού οξέος (pη 2.0). Η ροή ήταν 1.5 ml/min και η ανίχνευση έγινε φθορισµοµετρικά. Για τη διέγερση έγινε σάρωση στα µήκη κύµατος λ exc = nm µε 50 nm/sec, ενώ η εκποµπή µετρήθηκε σε λ em =365 nm [92]. Στήλη NovaPack C 18 (150 x 3.9 mm, 4 µm) χρησιµοποιήθηκε για τη µελέτη της NOR σε διάφορους ιστούς πουλερικών (ήπαρ, νεφροί, µυϊκός και λιπώδης ιστός) και στον ορό αίµατος, ύστερα από χορήγηση της ουσίας σε συγκεκριµένο πληθυσµό πουλερικών. Η έκλουση ήταν βαθµωτή µε κινητή φάση (Α) νερό-οξικό οξύ (98/2, v/v) και (Β) CH 3 CN, µε ροή 0.4 ml/min. Η ανίχνευση έγινε µε PDA-ανιχνευτή συνδεδεµένο σε σειρά µε φασµατογράφο µάζας εφαρµόζοντας ψεκασµό σε ηλεκτρικό πεδίο (electrospray ionization, ESI) [93]. Στήλη Zorbax Eclipse XDB-Phenyl (150 x 3.0 mm, 3.5 µm) χρησιµοποιήθηκε για τον ταυτόχρονο διαχωρισµό των NOR, CIP, δευτεριωµένης CIP, DAN, ENR, ORB, SAR και DIF. Η έκλουση έγινε βαθµωτά µε κινητή φάση (Α) 1% µυρµηκικό οξύ ρυθµισµένο σε ph 3.0 µε ΝΗ 4 ΟΗ και (Β) CH 3 CN. Η ροή ήταν 0.5 ml/min και η ανίχνευση έγινε τόσο φθορισµοµετρικά σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =278nm και σε µήκος κύµατος εκποµπής λ em =440 nm, όσο και µε φασµατογράφο µάζας, 93

107 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο χρησιµοποιώντας την τεχνική του χηµικού ιονισµού σε ατµοσφαιρική πίεση (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation, APCI) προκαλώντας θετικό ιονισµό [94]. Στήλη Nucleosil C 18 (70 x 4 mm, 5 µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό των DAN, CIN, CIP, ENO, ENR, FLU, MAR, NAL, NOR, OFL και OXO σε δείγµατα νεφρών χοίρου. Η έκλουση ήταν βαθµωτή µε διαλύτες κινητής φάσης (Α) µυρµηκικό οξύ (ph 2.5) και (Β) CH 3 CN και ροή 1.0 ml/min. Χρησιµοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο η κινίνη. Η ανίχνευση έγινε µε φασµατογράφο µάζας εξοπλισµένο µε τριπλό τετράπολο MS-MS προκαλώντας θετικό ιονισµό µε ESI [95]. Στήλη LiChrospher C 18 (125 x 4 mm, 5 µm) της Merck, χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό της OFL σε µυϊκό ιστό, στο ήπαρ, στους νεφρούς και στο σύνολο λιποειδούς και επιφανειακού ιστού των πουλερικών. Η έκλουση έγινε ισοκρατικά µε µίγµα νερό-ch 3 CN-ΤΕΑ σε αναλογία όγκων 83:14:0.45, v/v/v. Η ροή ήταν 1.0 ml/min και η ανίχνευση έγινε µε απλό ανιχνευτή UV-Vis σε µήκος κύµατος 295 nm [96]. Για τον προσδιορισµό των CIP, DIF, ENR, NOR και MAR σε υποστρώµατα βόειου νεφρού, µυϊκού ιστού και σε αυγά χρησιµοποιήθηκε στήλη Hypersil C 18 (250 mm x 4.6 mm, 5 µm) της Waters. Η έκλουση ήταν ισοκρατική µε κινητή φάση µίγµα ο-φωσφορικού οξέος (ph 3.5) και CH 3 CN σε αναλογία όγκων 85:15, v/v. Η ροή ήταν 1.0 ml/min και η ανίχνευση έγινε µε PDA ανιχνευτή σε µήκος κύµατος 280 nm [97]. Στήλη PLRP-S (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό των CIP, DAN, DIF, ENR, FLU, MAR, OXO, SAR και NAL σε µυϊκό ιστό πουλερικών, χοίρου, βοοειδών και σε ιχθύες, όµως η µελέτη και ο διαχωρισµός των προσδιοριζόµενων ενώσεων γίνεται σε τρεις οµάδες και όχι ταυτόχρονα. Σε κάθε οµάδα κινολονών η ανάλυση έγινε µε ισοκρατική έκλουση διαφορετικών αναλογιών των διαλυτών της κινητής φάσης (Α) 0.02 M H 3 PO 4, (Β) CH 3 CN και (Γ) THF. Η ροή για όλες τις περιπτώσεις ήταν 0.8 ml/min. Όλες οι προσδιοριζόµενες ενώσεις ανιχνεύθηκαν φθορισµοµετρικά σε διαφορετικά µήκη κύµατος διέγερσης και εκποµπής για την κάθε οµάδα. Έτσι, οι CIP, ENR, SAR και DIF µελετήθηκαν σε λ exc =280 nm και σε λ em =450 nm αντίστοιχα, οι MAR και DAN σε λ exc =294 nm και σε λ em =514 nm, αντίστοιχα και οι OXO, NAL και FLU σε λ exc =312 nm και σε λ em =366 nm [98]. Σε δείγµατα ήπατος πουλερικών προσδιορίστηκαν οι SAR, OXO και FLU ενώ επίσης η SAR προσδιορίστηκε σε δείγµατα ήπατος πουλερικών στα οποία είχε γίνει 94

108 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο ενδοφλέβια χορήγηση σε δύο δόσεις για τρεις ηµέρες. Η µελέτη έγινε µε στήλη Supelcosil-ABZ+Plus (250 mm x 4.6 mm, 5 µm) µε βαθµωτή έκλουση της κινητής φάσης, διαλυτών (Α) M H 3 PO 4 (σε ph 2.7, ρυθµισµένο µε ΤΕΑ) και (Β) CH 3 CN και ροή 1.0 ml/min. Φθορισµοµετρική ανίχνευση της SAR έγινε σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =278 nm και σε µήκος κύµατος εκποµπής λ em =440 nm, ενώ των OXO και FLU σε λ exc =318 nm και σε λ em =368 nm, αντίστοιχα [99]. Σε αυγά ύστερα από εµβολιασµό, αλλά και ύστερα από χορήγηση στο ζώο προσδιορίστηκε η SAR. Η µελέτη έγινε σε στήλη Supelcosil-ABZ+Plus (250 x 4.6 mm, 5 µm), µε ισοκρατική έκλουση της κινητής φάσης σύστασης (Α) M H 3 PO 4 (ph 2.7, ρυθµισµένο µε ΤΕΑ) και (Β) CH 3 CN και ροή 1.0 ml/min. Χρησιµοποιήθηκε φθορισµοµετρικός ανιχνευτής σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =278 nm και εκποµπής λ em =440 nm [100]. Στήλη LiChrospher 100 RP-8 (5 µm) χρησιµοποιήθηκε για το διαχωρισµό των φθοροκινολονών CIP, DIF, ENR και SAR, σε ιστούς βοοειδών και χοίρου (µυϊκός ιστός, ήπαρ, νεφρό). Η έκλουση ήταν ισοκρατική µε µίγµα κινητής φάσης ο- φωσφορικού οξέος 0.025Μ και CH 3 CN σε αναλογία όγκων 70:30, v/v και 2.5mM 1- επτανοθειϊκό οξύ. Η ροή ήταν 1.0 ml/min και η ανίχνευση έγινε µε PDA ανιχνευτή σε µήκος κύµατος 280 nm και µε φθορισµοµετρικό ανιχνευτή σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =278 nm και εκποµπής λ em =440 nm [101]. Σε στήλη PLRP-S (150 x 4.6 mm) έγινε ο διαχωρισµός των κινολονών FLU και OXO, σε υπόστρωµα ήπατος πουλερικών, µε ισοκρατική έκλουση µίγµατος CH 3 CN, THF και 20 mm Na 2 PO 4 µε ph 5.0, σε αναλογία όγκων 20:15:65, v/v/v. Η ροή ήταν 0.6 ml/min και η ανίχνευση έγινε σε φθορισµοµετρικό ανιχνευτή σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =318 nm και εκποµπής λ em =364 nm [102]. Στήλη Lichrospher RP18e (125 x 4 mm, 5 µm) χρησιµοποιήθηκε για το διαχωρισµό των φθοροκινολονών ENR, CIP, MAR, DAN, SAR και DIF, σε υπόστρωµα µυϊκού ιστού χοίρου. Η έκλουση ήταν βαθµωτή µε κινητή φάση (Α) 1% µυρµηκικό οξύ σε 0.05 Μ οξικό αµµώνιο, ph 3 και (Β) CH 3 CN και ροή 0.6 ml/min. Η ανίχνευση έγινε σε φασµατογράφο µάζας µε την τεχνική APCI [103]. Η µελέτη των (φθορο)κινολονών FLU, CIP, DAN, ENO, ENR, LOM, MAR, NOR, OFL, SAR, OXO και NAL, έγινε σε πέντε οµάδες και σε διαφορετικά υποστρώµατά (µυϊκός ιστός και ήπαρ πουλερικών, αυγά, µέλι και µυϊκός ιστός βοοειδών και χοίρου). Οι βασικές φθοροκινολόνες (CIP, ENR, MAR, NOR, SAR, OFL, ENO, LOM, DAN) µελετήθηκαν σε στήλη Zorbax RX-C 8 (250 x 4.6 mm, 5 95

109 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο µm), µε ισοκρατική έκλουση µίγµατος κινητής φάσης 0.01 M ρυθµιστικού διαλύµατος φωρφορικών ph 3.0 και CH 3 CN σε αναλογία όγκων 80:20, v/v και ροή 0.5 ml/min. Η ανίχνευση έγινε φθορισµοµετρικά σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =278 nm και εκποµπής λ em =445 nm, ενώ η ανίχνευση της MAR έγινε σε απλό ανιχνευτή UV-Vis, σε µήκος κύµατος 302 nm. Οι όξινες κινολόνες OXO, NAL και FLU µελετήθηκαν σε στήλη Kromasil C 8 (5µm, 250mm x 3.2mm), όπου η έκλουση έγινε ισοκρατικά µε κινητή φάση µίγµατος 0.01M οξαλικό οξύ, CH 3 CN και CH 3 ΟΗ, σε αναλογία όγκων 60/30/10, v/v/v. Η ανίχνευση έγινε επίσης φθορισµοµετρικά στα ίδια µήκη κύµατος διέγερσης και εκποµπής [104]. Στήλη Ultrabase C 18 (250 x 4.6 mm, 5 µm) χρησιµοποιήθηκε για το διαχωρισµό της FLU και του υδροξυλιωµένου µεταβολίτη της, σε νεφρό χοίρου. Έγινε βαθµωτή έκλουση µε κινητή φάση (Α) CH 3 CN και (Β) Μ οξαλικό οξύ σε νερό (ph 2.5), µε ροή της κινητής φάσης 0.8 ml/min και φθορισµοµετρική ανίχνευση σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =252 nm και εκποµπής λ em =356 nm [105]. Στήλη Inertsil C 8 (250 x 4.6 mm, 5 µm) χρησιµοποιήθηκε για το διαχωρισµό της DAN και του αρχικού της µεταβολίτη Ν-αποµεθυλιωµένη- DAN, σε δείγµατα βοοειδών (ήπαρ, µυϊκός ιστός, νεφρό, λίπος) και πουλερικών (ήπαρ, µυϊκός ιστός). Η έκλουση ήταν ισοκρατική µε µίγµα 0.05 Μ ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικού οξέος ph 3.5 (6.62 g NaH 2 PO. 4 H 2 O, σε 1000 ml νερό) και CH 3 CN, σε αναλογία όγκων 88/12, v/v, µε ροή 1.0 ml/min. Έγινε φθορισµοµετρική ανίχνευση σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =280 nm και εκποµπής λ em =440 nm [106]. Στήλη RP-8 (250 x 4.0mm, 4µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό της FLU, σε δείγµατα µυϊκού ιστού και νεφρού χοίρου. Η έκλουση ήταν βαθµωτή µε κινητή φάση (Α) µίγµα CH 3 CN-φωσφορικού οξέος (25 mmol, 2.88 g/l) σε αναλογία όγκων 70-30, v/v σε ph 3.5 ρυθµισµένο µε TEA και (Β) 100% CH 3 CN. Η ροή της κινητής φάσης ήταν 0.5 ml/min. Η FLU ανιχνεύτηκε φθορισµοµετρικά σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =320 nm και εκποµπής λ em =380 nm [107]. Στήλη Wakosil II C 18 -HG (150 x 4.6mm, 5µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό τεσσάρων φθοροκινολονών (BEN, DAN, ENR και OFL) σε υπόστρωµα µυϊκού ιστού πουλερικών. Έγινε ισοκρατική έκλουση µε µίγµα κινητής φάσης 0.05Μ ρυθµιστικό φωσφορικό διάλυµα (ph 2.4) και CH 3 CN σε αναλογία όγκων 80/20, v/v και 2.5 mm 1-επτανοθειϊκού οξέος. Οι φθοροκινολόνες ανιχνεύθηκαν φθορισµοµετρικά σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc = 295 nm και εκποµπής λ em = 455 nm [108]. 96

110 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Σε στήλη Inertsil ODS C 18 -HG (150 x 4.6mm, 5µm), προσδιορίστηκε το OXO, σε υποστρώµατα που προήλθαν από καλλιέργειες ζώων. Η έκλουση ήταν ισοκρατική µε κινητή φάση µίγµατος 1mM τρι-n-οκτυλαµίνη σε 0.45% κιτρικό οξύ:thf: CH 3 CN σε αναλογία όγκων 7:1:2, v/v/v. Το OXO ανιχνεύθηκε φθορισµοµετρικά σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =270 nm και εκποµπής λ em =370 nm [109]. Οι (φθορο)κινολόνες ENR, CIP, SAR, OXO, FLU σε µυϊκό ιστό χοίρου προσδιορίστηκαν χρησιµοποιώντας στήλη Symmetry C 18 (150 x 4.6mm, 4µm), σε δύο οµάδες (ENR, CIP, SAR και OXO, FLU). Η έκλουση και στις δύο περιπτώσεις ήταν ισοκρατική µε διαφορετικές αναλογίες του µίγµατος κινητής φάσης (Α) CH 3 CN και (Β) 0.05 Μ ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών ph 3.0. Η ροή της κινητής φάσης ήταν σταθερή στο 1.0 ml/min και η ανίχνευση έγινε φθορισµοµετρικά της πρώτης οµάδας (CIP, ENR, SAR) σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =280 nm και εκποµπής λ em =450 nm και της δεύτερης οµάδας (OXO, FLU) σε λ exc =312 nm και λ em =366 nm, αντίστοιχα [110]. Στήλη Symmetry C 18 (, 150 x 2.1mm, 5µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό των ENR, CIP, SAR, DAN, OXO, FLU, DIF και MAR σε δείγµατα µυϊκού ιστού βοοειδών, σε γάλα και σε προϊόντα ιχθυοκαλλιέργειας. Η έκλουση έγινε βαθµωτά µε κινητή φάση (Α) 0.1% TFA σε CH 3 OH και (Β) 0.1% TFA σε νερό, µε ροή 0.3 ml/min. Η κινίνη χρησιµοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Η ανίχνευση έγινε µε φασµατογράφο µάζας προκαλώντας ιονισµό µε την τεχνική ESI [111]. Στήλη NovaPack C 18 (150 x 3.9mm, 5µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό των φθοροκινολονών ENR και CIP, σε ιστό χοίρου. Η έκλουση των προσδιοριζόµενων ενώσεων ήταν ισοκρατική µε µίγµα CH 3 CN και ρυθµιστικού διαλύµατος (διάλυµα 0.02 Μ ΚΗ 2 ΡΟ 4, Μ φωσφορικό οξύ και ΤΒΑ-Br) σε αναλογία όγκων 20:80, v/v µε ph 3.0 και ροή 1.0 ml/min. Χρησιµοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο η DIF. Η ανίχνευση έγινε µε φθορισµοµετρικό ανιχνευτή σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =276 nm και εκποµπής λ em =442 nm [112]. Στήλη RP-18 (200 x 4mm, 5µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό της NOR, σε δείγµατα µυϊκού, λιποειδούς ιστού και ήπατος σε πληθυσµό πουλερικών στον οποίο είχε χορηγηθεί η δραστική ένωση, για διάστηµα πέντε ηµερών. Η κινητή φάση ήταν µίγµα νερού και CH 3 OH σε αναλογία όγκων 65:35, v/v, σε ph 3.0, ρυθµισµένο µε πυκνό Η 3 ΡΟ 4 και περιείχε 1.4g/L ΤΒΑ-HSO 4. Η έκλουση ήταν ισοκρατική µε ροή 1.0 ml/min. Η ανίχνευση της NOR έγινε µε φθορισµοµετρικό ανιχνευτή σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =278 nm και εκποµπής λ em =456 nm [113]. 97

111 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Στήλη PLRP-S (150 x 4.6mm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό των OXO και FLU, σε µυϊκό ιστό και ήπαρ ιχθύων. Έγινε ισοκρατική έκλουση µε κινητή φάση µίγµατος 0.002Μ φωσφορικού οξέος: CH 3 CN: THF σε αναλογία όγκων 64: 21: 15, v/v/v, µε ροή 0.7 ml/min. Κατά την ανάλυση η µια ένωση θεωρούνταν ως εσωτερικό πρότυπο της άλλης και αντίστροφα. Η ανίχνευση των προσδιοριζόµενων ενώσεων έγινε φθορισµοµετρικά σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =260 nm και εκποµπής λ em =380 nm [114]. Οι (φθορο)κινολόνες CIP, SAR, DIF, ENR, DAN, MAR, OXO και FLU σε υπόστρωµα δείγµατος χοιρινού µυϊκού ιστού διαχωρίστηκαν σε στήλη Zorbax Eclipse XDB-C 8 (150 x 4.6mm). Ως εσωτερικό πρότυπο στη µέθοδο χρησιµοποιήθηκε η NOR. Η έκλουση της κινητής φάσης ήταν βαθµωτή µε αρχική σύσταση διάλυµα 0.01 Μ κιτρικό οξέος και CH 3 CN σε αναλογία όγκων 88:12, v/v και ph 4.5. Η ροή της κινητής φάσης ήταν 0.7 ml/min. Η ανίχνευση των προσδιοριζόµενων ενώσεων έγινε µε απλό UV ανιχνευτή σε µήκος κύµατος 290 nm για τη MAR, στα 250 nm για τη FLU και στα 280 nm για τις υπόλοιπες (φθορο)κινολόνες [115]. Στήλη Symmetry RP-8 (150 x 4.6mm, 5µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό των DAN, CIN, CIP, ENO, ENR, FLU, MAR, NAL, NOR, OFL και OXO σε δείγµατα νεφρού χοίρου. Έγινε βαθµωτή έκλουση των προσδιοριζόµενων ενώσεων µε κινητή φάση (Α) µυρµηκικό οξύ ph 2.5 και (Β) CH 3 CN µε 0.14% (v/v) µυρµηκικό οξύ και ροή 1.0 ml/min. Χρησιµοποιήθηκε το Cincophen ως εσωτερικό πρότυπο. Η ανίχνευση έγινε σε φασµατογράφο µάζας προκαλώντας θετικό ιονισµό µε ESI [116]. Στήλη Zorbax Eclipse XDB-C 8 (150 x 4.6mm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό των CIP, DAN, ENR, SAR, DIF, OXO και FLU σε δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών. Έγινε βαθµωτή έκλουση της κινητής φάσης µίγµατος (Α) οξικό αµµώνιο 0.02 mol/l ρυθµισµένο σε ph 2.5 και (Β) CH 3 CN, µε αρχική σύσταση 86:14, v/v. Η ροή της κινητής φάσης ήταν 1.5 ml/min. Στη µέθοδο χρησιµοποιήθηκε εσωτερικό πρότυπο, η NOR. Η ανίχνευση έγινε µε φασµατογράφο µάζας, προκαλώντας θετικό ιονισµό µε ESI [117]. Στήλη Inertsil-C 8 (250 x 4.0mm, 5µm), χρησιµοποιήθηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό πέντε φθοροκινολονών (ENO, OFL, NOR, CIP και ENR) σε δείγµατα µυϊκού ιστού, ήπατος, νεφρού πουλερικών και στον κρόκο αυγού, ύστερα από εµβολιασµό των δειγµάτων στο εργαστήριο, αλλά και σε δείγµατα που προέρχονται 98

112 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο από ζώο στο οποίο είχε γίνει χορήγηση των προσδιοριζόµενων ενώσεων. Έγινε ισοκρατική έκλουση µε µίγµα κιτρικού οξέος (0.4 mol/l) - CH 3 OH - CH 3 CN σε αναλογία όγκων 87:9:4, v/v/v. Η ροή της κινητής φάσης ήταν 1.4 ml/min. Στη µέθοδο χρησιµοποιήθηκε η Λαµοτριγίνη ως εσωτερικό πρότυπο. Η ανίχνευση των φθοροκινολονών έγινε µε απλό ανιχνευτή UV σε µήκος κύµατος 275 nm [118]. Ο προσδιορισµός των MAR, ENR, CIP, DAN, NOR, SAR, DIF, OXO και FLU σε δείγµατα µυϊκού ιστού βοοειδών έγινε σε στήλη X-Terra C 18 (50 x 2.1 mm, 2.5 µm), µε βαθµωτή έκλουση της κινητής φάσης, η οποία αποτελούνταν από (Α) 0.1% οξικό οξύ και (Β) µίγµα CH 3 CN: νερό: οξικού οξέος σε αναλογία όγκων 90:10:0.1, v/v/v και ροή της κινητής φάσης 0.3 ml/min. Χρησιµοποιήθηκε η δευτεριωµένη- NOR, ως εσωτερικό πρότυπο. Η ανίχνευση έγινε µε φασµατογραφία µαζών θετικού ιονισµού µε ESI [119]. Στήλη Phenomenex AQUA TM C 18, (250 x 4.6 mm, 5 µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό πέντε φθοροκινολονών (CIP, DAN, ENR, MAR και SAR) µε εσωτερικό πρότυπο NOR, σε δείγµατα γάλακτος. Η έκλουση των ενώσεων γίνεται βαθµωτά µε κινητή φάση (A) 25 mm o-φωσφορικό οξύ ρυθµισµένο σε ph 3.0 µε NaOH και (B) CH 3 CN. Η ανίχνευση έγινε φθορισµοµετρικά σε µήκος κύµατος εκποµπής λ ex = 280 nm και διέγερσης λ em =440 nm, για όλες τις προσδιοριζόµενες κινολόνες εκτός από τη MAR η οποία ανιχνεύτηκε µε UV-DAD σε µήκος κύµατος 298 nm [120]. Στήλη PLRP-S (150 x 4.6 mm, 5 µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό των ENR και CIP, µε εσωτερικό πρότυπο SAR. HCl, σε δείγµατα αγελαδινού γάλακτος και στο πλάσµα αίµατος του ζώου. Έγινε ισοκρατική έκλουση των δύο φθοροκινολονών µε κινητή φάση µίγµατος 2.0 % υδατικό διάλυµα µυρµηκικού οξέος: CH 3 OH: CH 3 CN σε αναλογία όγκων 75: 13: 12, v/v/v. Η ανίχνευση έγινε µε φθορισµοµετρικό ανιχνευτή σε µήκος κύµατος διέγερσης λ ex = 280 nm και εκποµπής λ em =460 nm [121]. Ο προσδιορισµός των φθοροκινολονών ENR και CIP, σε υπόστρωµα δείγµατος πρόβειου γάλακτος έγινε σε στήλη C 14 Zorbax Bonus-RP (150 x 4.6 mm, 5 µm). Η έκλουση ήταν ισοκρατική µε κινητή φάση µίγµατος 0.05 M o-φωσφορικού οξέος (ph 3.4) και CH 3 CN σε αναλογία όγκων 87:13, v/v. Η ροή της κινητής φάσης ήταν 1 ml/min και η ανίχνευση έγινε µε UV-DAD σε µήκος κύµατος 277 nm [122]. Στήλη Xterra phenyl (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό των πέντε (φθορο)κινολονών ENR, CIP, SAR, OXO και FLU σε 99

113 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο δείγµατα αγελαδινού γάλακτος, µε τη χρήση των NOR και NAL, ως εσωτερικό πρότυπο. Η έκλουση των ενώσεων ήταν βαθµωτή µε κινητή φάση που αποτελούνταν από (Α) 1% (v/v) µυρµηκικό οξύ σε νερό και (Β) CH 3 CN, και ροή 1 ml/min. Η ανίχνευση έγινε µε φθορισµοµετρικό ανιχνευτή σε µήκος κύµατος διέγερσης των ENR, CIP, SAR και NOR λ exc =280 nm και εκποµπής λ em =450 nm, ενώ για τις OXO, NAL και FLU χρησιµοποιήθηκαν λ exc =312 nm και λ em =366 nm, αντίστοιχα [123]. Ταυτόχρονος προσδιορισµός των NOR, OFL, CIP, PEF, LOM, DAN, ENR, SAR, DIF, OXO και FLU, σε δείγµατα γάλακτος, πραγµατοποιήθηκε σε στήλη Hypersil C 18 BDS (250 x 4.6 mm, 5 µm). Η έκλουση ήταν βαθµωτή µε κινητή φάση (Α) CH 3 CN και (Β) υδατικό διάλυµα 50 mm κιτρικού οξέος και 100 mm οξικού αµµωνίου σε ph 4-4.3, ρυθµισµένο µε ΤΕΑ. Η ανίχνευση των προσδιοριζόµενων ενώσεων έγινε µε φθορισµοµετρικό ανιχνευτή σε µήκος κύµατος διέγερσης των OXO και FLU λ exc =312 nm και εκποµπής λ em =366 nm, ενώ των NOR, OFL, CIP, PEF, LOM, DAN, ENR, SAR και DIF σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =278 nm και εκποµπής λ em = 465 nm [124]. Στήλη Zorbax Eclipse XDB-Phenyl (150 x 3.0 mm, 5µm) χρησιµοποιήθηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό των NOR, δευτεριωµένης-cip, CIP, DAN, ENR, ORB, SAR και DIF, σε δείγµατα αυγού (λευκό και κρόκο). Η έκλουση των προσδιοριζόµενων ενώσεων ήταν βαθµωτή µε κινητή φάση (Α) 1% µυρµηκικό οξύ ρυθµισµένο σε ph 3.0 µε ΝΗ 4 ΟΗ και (Β) CH 3 CN, σε σταθερή ροή 0.5 ml/min. Η ανίχνευση των προσδιοριζόµενων ενώσεων έγινε φθορισµοµετρικά σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =278 nm και εκποµπής λ em =440 nm, αλλά και µε φασµατογράφο µάζας προκαλώντας θετικό ιονισµό µε την τεχνική του APCI [125]. Οι φθοροκινολόνες NOR, OFL, CIP, PEF, LOM, DAN, ENR, SAR και DIF, σε δείγµα αυγού (λευκό και κρόκο) προσδιορίστηκαν σε στήλη Hypersil C 18 -BDS (250 x 4.6 mm, 5 µm). Η κινητή φάση ήταν µίγµα (Α) υδατικού διαλύµατος 50 mm κιτρικού οξέος και 100 mm οξικού αµµωνίου, σε ph 4, ρυθµισµένο µε ΤΕΑ και (Β) CH 3 CN, σε αναλογία όγκων 91:9, v/v. Η έκλουση ήταν ισοκρατική µε ροή 2.2 ml/min. Η ανίχνευση των προσδιοριζόµενων ενώσεων έγινε φθορισµοµετρκά σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =278 nm και εκποµπής λ em =465 nm [126]. Οι πέντε φθοροκινολόνες OFL, NOR, CIP, ENR και SAR προσδιορίστηκαν ταυτόχρονα σε δείγµατα αυγών σε στήλη Betasil C 18 (200 x 4.6 mm, 5 µm). Η έκλουση των προσδιοριζόµενων φθοροκινολονών έγινε ισοκρατικά µε µίγµα κινητής φάσης (Α) 25 mm φωσφορικό ρυθµιστικό διάλυµα, σε ph 2.1, (Β) CH 3 OH και (Γ) 100

114 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο CH 3 CN σε αναλογία όγκων 72: 20: 8, v/v/v και σταθερή ροή 1.0 ml/min. Η ανίχνευση των προσδιοριζόµενων ενώσεων έγινε φθορισµοµετρκά σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =280 nm και εκποµπής λ em =418 nm [127]. Στήλη XDB-C 8 (150 x 4.6 mm, 5 µm) χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό των CIP, ENR, DAN, DIF, FLU, OXO και SAR, σε δείγµατα αυγών. Η έκλουση έγινε βαθµωτά µε κινητή φάση που αποτελούνταν από (Α) 10 mm κιτρικό ρυθµιστικό διάλυµα, σε ph 4.5 και (Β) CH 3 CN, µε σταθερή ροή 1.5 ml/min. Η ανίχνευση των προσδιοριζόµενων ενώσεων έγινε φθορισµοµετρικά των CIP, ENR, DAN, DIF και NOR σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc =280 nm και εκποµπής λ em =450 nm και των FLU και OXO σε λ exc =325 nm και λ em =365 nm, αντίστοιχα [128]. Οι φθοροκινολόνες CIP και ENR προσδιορίστηκαν σε δείγµατα αυγού και διαχωρίστηκαν σε στήλη X-Terra C 18 (150 x 2.2 mm, 3.5 µm). Η έκλουσή τους έγινε ισοκρατικά µε µίγµα κινητής φάσης (Α) νερό και (Β) CH 3 CN, σε αναλογία όγκων 90:10, v/v σε τελικό ph 2.8, ρυθµισµένο µε µυρµηκικό οξύ και σταθερή ροή 0.3 ml/min. Η ανίχνευση των δύο φθοροκινολονών έγινε σε φασµατογράφο µάζας µε σύζευξη API-ESΙ, προκαλώντας θετικό ιονισµό [129]. Σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία, µετά την HPLC ακολουθεί η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση σε ζώνες (capillary zone electrophoresis, CZE), µε ποσοστό 10%, ως η διαχωριστική τεχνική που εφαρµόζεται για τον προσδιορισµό (φθορο)κινολονών σε δείγµατα τροφίµων ζωικής προέλευσης. Η CZE είναι εξίσου καλή διαχωριστική τεχνική µε την HPLC, για τη µελέτη φαρµακευτικών σκευασµάτων σε δείγµατα βιολογικής προέλευσης, καθώς µπορεί να επιτευχθεί ικανοποιητικός διαχωρισµός, είναι µέθοδος αυτοµατοποιηµένη και απαιτείται µικρότερη κατανάλωση διαλυτών. Ειδικά σε συνδυασµό µε ανιχνευτή φασµατογράφο µάζας, η CZE παρουσιάζει πολύ καλή ευαισθησία, πράγµα ιδιαίτερα σηµαντικό σε περιπτώσεις που το διαθέσιµο δείγµα είναι περιορισµένο. Η CZE χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό των CIP και SAR, σε δείγµατα ιστών πουλερικών. Ο διαχωρισµός των δύο φθοροκινολονών πραγµατοποιήθηκε σε τριχοειδή µε υλικό πλήρωσης πηκτή διοξειδίου του πυριτίου, µήκους 47 cm (40 cm από την είσοδο µέχρι τον ανιχνευτή) και εσωτερικής διαµέτρου 75 µm. Για την ενεργοποίηση του τριχοειδούς χρησιµοποιήθηκε διάλυµα 1 Μ NaOH για 30 min, υπερκάθαρο νερό για 30 min και ρυθµιστικό διάλυµα, ίδιο µε αυτό της κινητής φάσης για 30 min. Η κινητή φάση ήταν ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών 50 mm σε ph 8.4. Για το διαχωρισµό εφαρµόστηκε δυναµικό διαχωρισµού 15 kv για 10 min, σε 101

115 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο θερµοκρασία του τριχοειδούς 25 ο C. Η εισαγωγή του δείγµατος έγινε υδροδυναµικά µε εφαρµογή πίεσης 0.5 psi, για 2 min. Η ανίχνευση των προσδιοριζόµενων φθοροκινολονών έγινε µε ανιχνευτή PDA, σαρώνοντας την περιοχή nm [130]. Επίσης η DIF και η SAR προσδιορίστηκαν µε την τεχνική της CZE, σε δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών. Για το διαχωρισµό χρησιµοποιήθηκε τριχοειδής µε τηγµένο διοξείδιο του πυριτίου, µήκους 57 cm (50 cm από την είσοδο µέχρι τον ανιχνευτή) και εσωτερικής διαµέτρου 75 µm. Η κινητή φάση ήταν ρυθµιστικό διάλυµα 25 mm διαιθυλαλµονικού οξέος ph Για την ενεργοποίηση του τριχοειδούς χρησιµοποιήθηκε διάλυµα 1 Μ NaOH για 1 min, υπερκάθαρο νερό για 1 min και για 3 min το ρυθµιστικό διάλυµα. Η εισαγωγή του δείγµατος έγινε υδροδυναµικά µε 0.5 psi πίεση, η θερµοκρασία του τριχοειδούς ήταν 25 ο C και εφαρµοζόταν δυναµικό διαχωρισµού 20 kv. Η ανίχνευση των προσδιοριζόµενων ενώσεων έγινε µε ανιχνευτή UV σε µήκος κύµατος 275 nm [131]. Η CZE χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό των ENR και CIP σε βιολογικά υποστρώµατα µυϊκού ιστού πουλερικών µε τη χρήση εσωτερικού προτύπου MAR. Ο διαχωρισµός των προσδιοριζόµενων ενώσεων πραγµατοποιήθηκε σε τριχοειδή 47 cm (40 cm από την είσοδο µέχρι τον ανιχνευτή) και εσωτερικής διαµέτρου 75 µm. Η ενεργοποίηση του τριχοειδούς έγινε µε 1 Μ NaOH για 15 min, µε υπερκάθαρο νερό για 20 min και µε το ρυθµιστικό διάλυµα της κινητής φάσης για 30 min. Για το διαχωρισµό εφαρµόστηκε δυναµικό διαχωρισµού 20 kv για 10 min, ενώ η θερµοκρασία του τριχοειδούς ήταν 25 ο C και η εισαγωγή δείγµατος έγινε υδροδυναµικά µε εφαρµογή 0.5 psi πίεση για 2 min. Η ανίχνευση των φθοροκινολονών έγινε µε ανιχνευτή PDA σε µήκος κύµατος 275 nm [132]. Οι δύο κινολόνες FLU και ΟΧΟ προσδιορίστηκαν σε δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών, χρησιµοποιώντας τη NOR ως εσωτερικό πρότυπο, µε την τεχνική της CZE. Η κινητή φάση που χρησιµοποιήθηκε ήταν ρυθµιστικό διάλυµα 40 mm φωσφορικού οξέος σε ph 8.02, ρυθµισµένο µε NaOH. Ο διαχωρισµός πραγµατοποιήθηκε σε τριχοειδή 47 cm (40 cm από την είσοδο µέχρι τον ανιχνευτή) εσωτερικής διαµέτρου 75 µm. Η ενεργοποίηση του τριχοειδούς έγινε µε 1Μ NaOH για 30 min, µε υπερκάθαρο νερό για 30 min και µε το ρυθµιστικό διάλυµα της κινητής φάσης για 30 min. Η θερµοκρασία του τριχοειδούς ήταν 25 ο C, η εισαγωγή δείγµατος έγινε υδροδυναµικά µε εφαρµογή 0.5 psi πίεσης και εφαρµόστηκε δυναµικό διαχωρισµού 18 kv. Η ανίχνευση έγινε µε ανιχνευτή UV και συγκεκριµένα 102

116 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο των δύο κινολονών FLU και OXO σε µήκος κύµατος 250 nm και του εσωτερικού προτύπου σε µήκος κύµατος 270 nm [133]. Τέλος η τεχνική CZE χρησιµοποιήθηκε για την πολυστοιχειακή ανίχνευση των (φθορο)κινολονών DAN, SAR, CIP, MAR, ENR, DIF, OXO και FLU, σε δείγµατα ακατέργαστου αγελαδινού γάλακτος. Η κινητή φάση ήταν ρυθµιστικό διάλυµα 70 mm οξικού αµµωνίου σε ph 9.1 ρυθµισµένο µε 5 Μ ΝΗ 4 ΟΗ. Ο τριχοειδής που πραγµατοποιήθηκε ο διαχωρισµός είχε µήκος 96 cm και 50 µm εσωτερική διάµετρο. Η ενεργοποίηση του τριχοειδούς έγινε µε 1 Μ NaOH για 10 min, µε υπερκάθαρο νερό για 5 min και µε το ρυθµιστικό διάλυµα της κινητής φάσης για 20 min. Η θερµοκρασία του τριχοειδούς ήταν 25 ο C και για το διαχωρισµό εφαρµόστηκε δυναµικό διαχωρισµού 25 kv. Η εισαγωγή του δείγµατος έγινε από το ανοδικό τµήµα του τριχοειδούς µε εφαρµογή πίεσης 50 mbar για 75 sec. Η ανίχνευση των προσδιοριζόµενων ενώσεων έγινε σε φασµατογράφο µάζας µε την τεχνική του ESI [134]. ύο µόνο είναι οι εργασίες που προτείνονται για τον προσδιορισµό κινολονών σε δείγµατα γάλακτος µε τη διαχωριστική τεχνική της Λεπτής Χρωµατογραφίας Στιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC). Η FLU προσδιορίστηκε µε TLC, σε υπόστρωµα γάλακτος και ανιχνεύτηκε µε ανιχνευτή UV σε µήκος κύµατος 254 nm [135] και οι ENR και CIP προσδιορίστηκαν ηµι-ποσοτικά επίσης σε υπόστρωµα γάλακτος µέσω TLC [136]. Στην εργασία των J.A. Hernadez-Arteseros, R. Compano και M.D. Prat προτείνεται ο συνολικός προσδιορισµός των ENR και CIP σε δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών και πέστροφας, χωρίς να γίνει χρωµατογραφικός διαχωρισµός των προσδιοριζόµενων ενώσεων. Στην εργασία αυτή ο προσδιορισµός βασίζεται στη µέτρηση του δυναµικού από τη χµειοφωταύγεια του Τερβίου. Οι κινολόνες διαθέτουν δραστικές οµάδες, που µπορούν να σχηµατίσουν σταθερά σύµπλοκα µε µεταλλικά ιόντα, οπότε παρατηρείται διαµοριακή µεταφορά ενέργειας µεταξύ των κινολονών και των ιόντων των λανθανίδων [137]. Στην εργασία τους ο L.E. Capitan-Vallvey και η οµάδα του προσπάθησαν να προσδιορίσουν το ΟΧΟ σε δείγµατα γάλακτος, αλλά και σε ανθρώπινα ούρα προσπαθώντας να συνδυάσουν τα πλεονεκτήµατα των αισθητήρων (ταχύτητα και απλότητα στη χρήση) και τα πλεονεκτήµατα του φθορισµού (εκλεκτικότητα και ευαισθησία). Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκε αισθητήρας, ο οποίος διέθετε ζώνη ευαισθησίας και ο οποίος µε την εµβάπτισή του στο προς µέτρηση διάλυµα για µια 103

117 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο ώρα προκαλούσε διέγερση του ΟΧΟ, τα µόρια του οποίου συγκεντρώνονταν πάνω σε αυτή τη ζώνη, εκπέµποντας στη συνέχεια ακτινοβολία [138]. 9.4 Προκατεργασία δειγµάτων τροφίµων ζωικής προέλευσης Από τη βιβλιογραφική επισκόπηση από το 1989 µέχρι σήµερα προκύπτει ότι το 68% των εργασιών ασχολήθηκαν µε ιστούς δειγµάτων κρεοπαραγωγών ζώων, στο 20% των εργασιών προσδιορίστηκαν οι κινολόνες σε δείγµατα γάλακτος και στο 18% σε δείγµατα αυγών. Επίσης το 14% των εργασιών πραγµατεύεται τη µελέτη των κινολονών σε ιστούς προϊόντων ιχθυοκαλλιεργειών. Τέλος µόνο το 2% των εργασιών έχει µελετήσει τις κινολόνες στο µέλι. Είναι προφανές ότι σε κάποιες εργασίες η µελέτη γίνεται τόσο σε κάποιον ιστό ζωικής προέλευσης, όσο και σε κάποιο από τα ζωικά προϊόντα. Η διαδικασία που συνήθως ακολουθείται για την εκχύλιση των προσδιοριζόµενων ενώσεων από το µελετώµενο υπόστρωµα είναι η χρήση κάποιου διαλύµατος εκχύλισης για την παραλαβή των ενώσεων και στη συνέχεια ακολουθεί ο καθαρισµός του εκχυλίσµατος. Ειδικά στο γάλα προηγείται συνήθως της εκχύλισης, η αποπρωτεΐνωση. Οι συνηθέστερες τεχνικές που εφαρµόζονται στο στάδιο της προκατεργασίας των δειγµάτων είναι η ανάµιξη και η ανάδευση µε τα διαλύµατα εκχύλισης, η εφαρµογή υπερήχων, η φυγοκέντριση και η διήθηση. Για το πρώτο στάδιο της εκχύλισης, στη βιβλιογραφία, χρησιµοποιούνται υπερκάθαρο νερό [91, 111, 119, 130] και υδατικά διαλύµατα, όπως διαλύµατα NaOH [133, 117, 118], πυκνή αµµωνία [94, 99, 114, 125, 128, 134] και διαλύµατα HCl [96, 97]. Επίσης χρησιµοποιούνται ρυθµιστικά διαλύµατα σε ph 7.0 [94, 131, 133], ph 4.1 [127], ph 7.4 [103, 110, 112, 122, 132, 136], ph 6.0 [129] και ph 9.1 [98]. Ακετονιτρίλιο [98-100, 104, 114, 116, 121, 125, 128], µεθανόλη [100], διχλωροµεθάνιο [91, 92, 109, 117, 121, 130, 132, 133, 136, 137], εξάνιο [93, 98, 100, 102, 107, 111, 136], ακετόνη [102], χλωροφόρµιο [102, 112, 114] και ισοπροπανόλη [129] είναι οι συνηθέστεροι οργανικοί διαλύτες που χρησιµοποιούνται για την εκχύλιση των (φθορο)κινολονών από τα εξεταζόµενα υποστρώµατα. Συχνά χρησιµοποιούνται διαλύµατα των παραπάνω διαλυτών µε κάποιο οξύ, όπως µίγµα µεθανόλης µε οξικό οξύ [93, 107, 109], µε φωσφορικό οξύ [108], µε µίγµα φωσφορικού και υπερχλωρικού οξέος [106, 113], διάλυµα αιθανόλης µε οξικό οξύ [126] και διάλυµα CH 3 CN µε άλας Na 2 SO 4 [95], µε τριχλωρο-οξικό οξύ [101, 111, 104

118 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο 120], µε οξικό οξύ [104] και µε φωσφορικό οξύ [115]. Σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία, ειδικά για την αποπρωτεΐνωση του γάλακτος χρησιµοποιήθηκε µετα-φωσφορικό οξύ [123], διάφορα µίγµατα τριφθορο-οξικού οξέος µε CH 3 ΟH [122] και CH 3 CN [124] και τριχλωρο-οξικού οξέος µε CH 3 ΟH [122]. Σε µερικές εργασίες η εκχύλιση των προσδιοριζόµενων κινολονών από τα διάφορα υποστρώµατα γίνεται µε την κλασική εκχύλιση υγρού-υγρού [92-94, 98, , , 121, 125, 126, 128, 129, 137]. Στις περισσότερες όµως εργασίες την εκχύλιση υγρού-υγρού ακολουθεί επιπλέον καθαρισµός του εκχυλίσµατος µε εκχύλιση στερεάς φάσης υγρού [91, 95-97, 101, 103, 104, 108, 110, 111, , 122, 124, , 136] και σε µια µόνο περίπτωση µετά την εκχύλιση υγρού-υγρού το δείγµα καθαρίζεται επιπλέον µε κλασσική χρωµατογραφία στήλης [109]. Άλλες τεχνικές προκατεργασίας δείγµατος που έχουν εφαρµοστεί είναι η τεχνική της υπερκρίσιµης ρευστής εκχύλισης µε υπερκρίσιµο CO 2 που περιείχε 20% CH 3 OH [90], η εκχύλιση µε τη βοήθεια των µικροκυµάτων (Microwave Assisted Extraction, MAE) και στη συνέχεια η εφαρµογή της εκχύλισης στερεάς φάσης υγρού [114] και η τεχνική της διασποράς υποστρώµατος σε στερεά φάση (Matrix Solid- Phase Dispersion, MSPD) για την εκχύλιση των ENR και CIP από γάλα [136]. Επίσης στις εργασίες 99, 100 και 101 η εκχύλιση γίνεται µε αυτόµατη τεχνική συνδεδεµένη σε σειρά µε το σύστηµα της υγρής χρωµατογραφίας. Ουσιαστικά γίνεται εµπλουτισµός χρησιµοποιώντας αυτοµατοποιηµένη διάταξη εµπλουτισµού των στοιχείων του διαλύµατος (Automated Trace Enrichment of Dialysates, ASTED). Τέλος στις εργασίες 123 και 127 στο δείγµα γίνεται κατεργασία µε κάποιο διαλύτη για την εκχύλιση των κινολονών από το υπόστρωµα και στη συνέχεια ο καθαρισµός γίνεται αυτόµατα σε διάταξη συνδεδεµένη πριν την εισαγωγή του δείγµατος στην αναλυτική στήλη. Αναλυτικότερες πληροφορίες για την προκατεργασία των δειγµάτων για όλες τις δηµοσιευµένες µελέτες δίνονται στον Πίνακα Εργασίες επικυρωµένες σύµφωνα µε την απόφαση 2002/657/EC Οι πρώτες εργασίες που αναφέρονταν σε µεθόδους προσδιορισµών των κινολονών σε δείγµατα τροφίµων ζωικής προέλευσης, επικυρωµένες σύµφωνα µε την παραπάνω απόφαση δηµοσιεύτηκαν το 2005, παρ όλο που η ηµεροµηνία εφαρµογής της απόφασης 2002/657/EC ήταν 1 η Σεπτεµβρίου Έτσι το 2005 δηµοσιεύτηκαν 105

119 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο οι εργασίες του N. van Hoof µε την οµάδα του [111] και της B. Toussaint µε την οµάδα της [116], ενώ το 2006 δηµοσιεύτηκαν οι εργασίες των A. Rubies [119] και F.J. Lara [134] µε τους αντίστοιχους συνεργάτες τους. Στις εργασίες τους λαµβάνεται υπόψη το MRL των µελετώµενων ενώσεων, σύµφωνα µε την οδηγία 96/23/EC και γίνεται µελέτη σε επίπεδα συγκεντρώσεων, έτσι όπως ορίζονται από την απόφαση 2002/657/EC. 106

120 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.1: Περιγραφή των αναλυτικών τεχνικών που έχουν χρησιµοποιηθεί για τον προσδιορισµό των κινολονών σε φαρµακευτικά σκευάσµατα, των αντίστοιχων ανακτήσεων και του ορίου ανίχνευσης. Ένωση, Παραποµπή CIP, NOR, PEF FLE, [48] OFL, LEV, LOM, [49] LOM, FLE, CIP, NOR, [50] SPAR, FLU, ENR, ΟΧΟ, [51] Αναλυτική Τεχνική Φθορισµοµετρική µέτρηση βασισµένη στη µεταφορά φορτίου από την αντίδραση µε 7,7,8,8- τετρακυανοδιµεθάνιο (TCNQ) στο εύρος µηκών κύµατος διέγερσης λ exc = nm και εκποµπής λ em = nm. Φθορισµοµετρική µέτρηση βασισµένη στη µεταφορά φορτίου από την αντίδραση µε 7,7,8,8- τετρακυανοδιµεθάνιο (TCNQ) Φθορισµοµετρικός αισθητήρας βασισµένος στη µεταφορά φορτίου από αντίδραση µε χλωρανιλικό οξύ. Φθορισµοµετρική µέτρηση SPAR: λ exc = 310 nm και λ em = 500 nm. FLU: λ exc = 314 nm και λ em = 366 nm. ENR: λ exc. = 310 nm και λ em = 432 nm. Ανακτήσεις LOD ( %) CIP: (µgml 1 ) ± 1.32 CIP: NOR: NOR: ± 0.81 PEF: FLE: PER: ± FLE: ±1.41 Φαρµακευτικά: (µg/ml) LOM: 99.8±1.12, FLE: (µg/ml) LOM: ±0.92, CIP: FLE: 0.09 CIP: ±1.36, NOR: NOR: ± 0.81 Ταµπλέτες: 99.92± 0.60 (ng/ml) SPAR: 6 OXO, FLU, ENR: 2 (S/N=2 :1) NOR, CIP, OFL, ENR, [52] CIP, NOR, LOM, DIF, AMI, PEF, OFL, [53] CIP, [54] Φθορισµοµετρική µέτρηση των συµπλόκων µε Μέθοδο A. Supracene Violet 3B σε µήκος κύµατος 575 nm και µε Μέθοδο B. TP 000 (0.2%) σε µήκος κύµατος 485 nm. Φθορισµοµετρική ανάλυση βασισµένη στα χηλικά σύµπλοκα που σχηµατίζονται µε το ζιρκόνιο, το µολυβδένιο, το βανάδιο και το βολφράµιο. Σάρωση στη περιοχή διέγερσης λ exc nm και εκποµπής λ em = nm. Φθορισµοµετρική µέτρηση του ορατού φωτός και προσπάθεια χρησιµοποίησης του νιτρικού σιδήρου (ΙΙ) σε µήκος κύµατος 435 nm. NOR, [55] Φθορισµοµετρική µέτρηση σε µήκος κύµατος διέγερσης λ exc = 330 nm και εκποµπής λ em = 445 nm, αλλά και µέτρηση της ακτινοβολίας UV στα 276 nm (µg/ml) Μέθοδος A. NOR: 5.0 CIP: 2.5 Μέθοδο B. OFL, ENR: 2.5 Φαρµακευτικά: (ng/ml) ± ± 0.8 Ταµπλέτες: Ενέσιµα: UV: FD: (µg/ml) UV: 0.58 FD:

121 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.1: Συνέχεια. Ένωση, Παραποµπή NOR, [56] NOR, [57] ENO, [58] Αναλυτική Τεχνική 1.Φθορισµοµετρική µέτρηση στα 280 nm. 2. Σχηµατισµός κίτρινων χηλικών ενώσεων µε σίδηρο (ΙΙ) σε ρυθµιστικό διάλυµα οξικών, µέτρηση σε µήκος κύµατος 358 nm. Φθορισµοµετρική µέτρηση χρησιµοποιώντας 2,4-δινιτροφθοροβενζόλιο 1.Αντίδραση υποκατάστασης, σε υδατικό ρυθµιστικό διάλυµα βορικών 2. Σχηµατισµό συµπλόκου Meisenhiemer σε DMSO ως απρωτικός πολικός διαλύτης Φθορισµοµετρική µέτρηση ως ζεύγη ιόντων 1. σε κυανό της βρωµοθειόλης και 2. ερυθρό βρωµοκρεσόλης Ανακτήσεις ( %) 99.8± ± ± ±0.61 CIP, [59] Έγχυση µε συνεχή ροή σε UV ανιχνευτή µε αισθητήρα για τη µετάβαση συγκράτησης και συγκέντρωσης σε κατιοντοανταλλακτική πηκτή Sephadex SP C-25. CIP, [60] Στερεής φάσης UV ανιχνευτής σε δεξτρόζη -κατιοντοανταλλακτικού τύπου- ρητίνη Sephadex SP C-25 NOR, [61] Κινητική φασµατοσκοπική τεχνική βασισµένη στην οξείδωση της NOR σε αλκαλικό περιβάλλον µε KMnO 4 στα 603 nm. CIP, NOR, [62] ιαδοχική έγχυση µε φασµατοσκοπική τεχνική για στοιχειοµετρική µελέτη βασισµένη σε 99.4± ±0.96 σύµπλοκα σιδήρου (ΙΙ) σε H 2 SO 4 (447 nm για το σύµπλοκο της CIP και 430 nm για το σύµπλοκο της NOR) CIP, NOR, [63] UV και φθορισµοµετρική µέτρηση του τριπλού συµπλόκου µε εωσίνη και παλλάδιο (II) ENR, PEF, [64] Φθορισµοµετρική µέτρηση µέσω σχηµατισµού ζευγών ιόντων µε 1. βρωµοθειόλη µπλέ και ± ± πορτοκαλί του µεθυλίου 0.89 LEV, NOR, CIP, Φασµατοσκοπικά µε σχηµατισµό διπλών συµπλόκων µε ξανθίνη Εωσίνη: ± [65] ± Μερβρωµίνη: 99.96± ±0.510 OFL, [66] Μικροβιολογική µελέτη (διάχυση σε αγαρόζη) CIP, ENR, PEF, [67] Φασµατοσκοπική µέτρηση µέσω µεταφοράς φορτίου µε σχηµατισµό συµπλόκου µε 1. χλωρανιλικό οξύ (µέτρηση στα 250 nm), 2. τετρακυανοαιθελενίου (µέτρηση στα 290 nm για τις ENR και PEF και στα 335 nm για τη CIP) και 3. 2,3 δίχλωρο-5,6 δικύανο-π-βενζοκινόνη (µέτρηση στα 460 nm) LOD (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) 0.08 CIP: 99.4±1.27 ENR :99.95±0.90, PEF: 98.98± ±0.76 (µg/ml) LEV: NOR: CIP:

122 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.1: Συνέχεια. Ένωση, Αναλυτική Τεχνική Ανακτήσεις LOD Παραποµπή ( %) NOR, [68] ιαφορική παλµική πολαρογραφία NOR Ταµπλέτες: 98.0 NOR, [69] ιαφορική παλµική πολαρογραφία NOR: 99.5±2.5 5 x 10 5 M OFL, [70] Πολαρογραφία και βολταµετρία x 10-6 M OFL, [71] ιαφορική παλµική πολαρογραφία 98.5± ±0.30 3x 10-7 M NOR, [72] Τετραγωνικού κύµατος ανοδικής βολταµµετρίας σε γυάλινο ηλεκτρόδιο άνθρακα 2.5x 10-9 M CIP, [73] Μέθοδος τιτλοδότησης βασισµένη στην διαφορική ποτενσιοµετρία 99.8± ± ng/ml ENR, CIP, [74] Κυκλική βολταµµετρία και ανοδική παλµική πολαρογραφία ENR: 69±2.3-81± ng/ml ENR, SPAR, FLE, [75] 1. Βολταµµετρία συνεχούς ρεύµατος (DC) 2. ιαφορική παλµική πολαρογραφία (DP) και 3. Βολταµµετρία εναλλασσόµενου ρεύµατος (AC) Ταµπλέτες: 98.99± ± 0.45 ENR, SPAR: 1x 10-7 M FLE: 2x 10-7 M ENO, OFL, [76] NOR, OFL, CIP, [77] CIP, NOR, OFL, [78] NOR, CIP,OFL, [79] Έγχυση σε ροή µε αισθητήρα βασισµένο στη χηµειοφωταύγεια του Tb(III). Ανίχνευση µέσω ΚMnO 4 και Na 2 SO 3. Χηµειοφωταύγεια που οφείλεται στην αντίδραση του Mn(IV) µε θειώδη σε όξινο περιβάλλον και ενισχύεται από την παρουσία των προσδιοριζόµενων FQs Έγχυση σε ροή βασισµένη σε χηµειoφωταύγεια που προκαλείται από τη χρήση του περοξύνιτρου οξέος Χηµειοφωταύγεια χρησιµοποιώντας το σύστηµα [Ru(bipy) 3 2+ ]- Ce (IV) Φαρµακευτικά: ENO: 2.4x10-10 M OFL: 5.6x10-10 M NOR: 3.0 x 10 8 M OFL: 5.0 x 10 8 M CIP: 3.0 x 10 8 M 96±3-106±2 CIP: 4.5x 10-8 M NOR: 5.9x 10-8 M OFL: 1.1x 10 7 M Φαρµακευτικά: 99.3± ± 0.6 CIP:2.6 x 10-8 M NOR:3.1 x 10-8 M OFL: 5.5 x 10-9 M 109

123 Πίνακας 9.1: Συνέχεια. Ένωση, Αναλυτική Τεχνική Παραποµπή NOR, CIP, OFL, Φασµατοσκοπία ατοµικής απορρόφηση (AAS), αγωγιµοµετρία και χρωµατοµετρία (στα 525 ENR, [80] nm) χρησιµοποιώντας το σχηµατισµό συµπλόκου ζεύγους ιόντων µε τετρακυανιούχο αµµώνιο χρωµικού διαµµωνίου (ΙΙΙ). Ανακτήσεις ( %) NOR: 99.15±1.15 OFL: 99.30±1.40 CIP: 99.60±1.50 ENR: 99.0±1.25 (µg/ml) AAS: NOR: 1.5 OFL: 3.1 CIP:1.4 ENR: 3.3 Χρωµατοµετρία: NOR: 31 OFL:48 CIP:45 ENR:65 CIP, [81] HPTLC µg σε κάθε PEF, OFL, NOR, [82] 1 H και 19 F-NMR PEF: NOR: CIP, [83] Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση σε ζώνες 280 nm ± mg/ml NAL, OXO, PIP, CIN, NOR, CIP, OFL, PEF, FLE, FLU, [84] CIP και σχετικές ενώσεις, [85] NOR, [86] CIP, [87] CIP, [88] ENO, NOR, OFL, CIP, [89] CE, σε τριχοειδή τηγµένου διοξείδιου του πυριτίου εσωτερικής διαµέτρου 75 µm και µήκους 60 cm. Κινητή φάση ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών ph 7.0. Ανίχνευση στα 214 nm. HPLC Στήλη: Inertsil ODS-2, 5 µm (150 x 4.6 mm) Κινητή φάση: THF-ACN-ρυθµιστικό διάλυµα(0.005 M 1-επτανοϊκό οξύ σε ph 3.0) v/v/v Ανίχνευση: UV 254 nm HPLC Στήλη: Lichrosorb 100RP-8 (10 µm) 20 cm x 4.6 mm). Κινητή φάση: Η 3 PΟ 4 /Νa 2 ΗPΟ 4 σε pη 3.0-CH 3 CN (85:15 v/v). Ανίχνευση: UV 278 nm HPLC Στήλη: Lichrospher 100RP-18 (10 µm). Κινητή φάσή: Water-CH 3 CN-TEA (80:20:0.6) v/v/v ρυθµισµένο σε ph 3.0, µε φωσφορικό οξύ.ροή: 1.5 ml/min.ανίχνευση: UV HPLC Στήλη: Kromasil 100 C x 4 mm, 5 µm. Κινητή φάση: CH 3 CN-CH 3 OH-Ρυθµιστικό διάλυµα οξικών 0.05 M, p 3.60 ( % v/v/v) µε 1% οξικό οξύ. Εσωτερικό Πρότυπο: Ανθραλινικό οξύ 0.1 ng/µl HPLC Στήλη: Kromasil 100 C x 4 mm, 5 µm. Κινητή φάση: CH 3 CN-CH 3 OH-Κιτρικό οξύ 0.4 M ( % v/v). Εσωτερικό Πρότυπο: Υδροχλωροθειαζίδη2 ng/µl Ανίχνευση: UV 275 nm LOD κηλίδα % ± µg/ml ng/ml (S/N=3 :1) ng/µl 97±6 ENO: ng/µl OFL, NOR, CIP: ng/µl Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο 110

124 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Σύνοψη των αναλυτικών τεχνικών που έχουν χρησιµοποιηθεί για τον προσδιορισµό των κινολονών σε δείγµατα τροφίµων, των αντίστοιχων ανακτήσεων, του ορίου ανίχνευσης και περιγραφή του τρόπου προκατεργασίας του κάθε υποστρώµατος. Ένωσεις, Αναφορά NOR, OFL, [90] CIP, DAN. ENR, SAR, DIF, OXO, FLU, [91] FLU, OXO, [92] NOR, [93] Είδος δείγµατος Εµβολιασµένο δείγµα µυϊκού ιστού (στήθος) πουλερικού Μυϊκός ιστός πουλερικών Μυϊκός ιστός σολοµού, χοίρου και πουλερικών Ιστοί πουλερικών (ορός αίµατος, ήπαρ, νεφροί, µυϊκός ιστός, λιπώδης ιστός) Αναλυτική τεχνική HPLC HPLC HPLC HPLC-MS Προκατεργασία δείγµατος Ξήρανση 2 g δείγµατος-εκχύλιση SFE µε υπερκρίσιµο CO 2 που περιλαµβάνει 20% (v/v) CH 3 OH, στους 80 o C, 300 atm και ροή 3 ml/min. Συλλογή των εκχυλισµάτων κάθε 10 min σε σφαιρική φιάλη προθερµασµένη στους 40 ο C, η οποία περιέχει 10 ml CH 3 OH. Εξάτµιση του διαλύτη-επαναδιάλυση σε 10 ml κινητής φάσης. Εµβολιασµός και προσθήκη νερού µέχρι τελικού όγκου 1 ml σε 5 g δείγµατος. Παραµονή στο σκοτάδι για 20 min. Προσθήκη ml CH 2 Cl 2. Ανάδευση- φυγοκέντρηση-εκχύλιση της οργανικής φάσης 2 x 5 ml 1 Μ ΝaΟΗ. Φυγοκέντρηση και SPE: Ενεργοποίηση των SDB- RPS µικροστηλών µε 2 ml CH 3 OH + 2 ml νερό. Εφαρµογή των δειγµάτων και καθαρισµό µε 2 ml νερό. Έκλουση των FQs µε 2 ml 2% TFA σε νερό: CH 3 CN (25:75) + 1 ml CH 3 CN. Προσθήκη 10 ml CH 2 Cl 2 σε 2 g τεµαχισµένου δείγµατος. Ανάδευση-φυγοκέντρησηαποµάκρυνση της οργανικής φάσης-προσθήκη 10 ml CH 2 Cl 2. Φυγοκέντρηση. Ένωση των δύο οργανικών φάσεων-προσθήκη 2 ml 0.01 Μ NaOH-ανάδευση-φυγοκέντρηση. ιήθηση του υπερκείµενου και έγχυση δείγµατος. Σε 1 g ιστού προσθήκη 2 ml διαλύµατος εκχύλισης (CH 3 ΟΗ/ οξικό οξύ, 98/2, v/v). Φυγοκέντρηση-εξάτµιση του υπερκείµενου-επαναδιάλυση σε 1 ml διαλύµατος εκχύλισηςπροσθήκη 2 ml κορεσµένου εξανίου µε CH 3 CN. Ανάδευση-φυγοκέντρηση-αποµάκρυνση του υπερκείµενου. Εξάτµιση της κατώτερης στιβάδας-επαναδιάλυση σε 1 ml διαλύµατος εκχύλισης-ανάδευση-διήθηση. Ανακτήσεις (%) NOR: OFL: LOD (µg/ml) CIP: (µg/kg) DAN: ENR: SAR: DIF: OXO: FLU: Σολοµός: FLU: 85 OXO: 91 Πουλερικό: FLU: 78 OXO: 79 Χοιρινό: FLU: 79 OXO: ng/g 111

125 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά DCIP, NOR, CIP, DAN, ENR, ORB, SAR, DIF, [94] DAN, CIN, CIP, ENO, ENR, FLU, MAR, NAL, NOR, OFL, OXO,[ 95] OFL, [96] Είδος δείγµατος Μυϊκός ιστός πουλερικών και ήπαρ. ENR και CIP σε δείγµατα µυϊκού ιστού και ήπατος ύστερα από χορήγηση. Χοίρειος νεφρός Ιστοί πουλερικών: νεφρό, ήπαρ, µυϊκός ιστός, λιποειδείς και επιφανειακοί ιστοί. Αναλυτική τεχνική HPLC HPLC-MS- MS HPLC Προκατεργασία δείγµατος Σε 1 g δείγµατος προσθήκη 0.1 Μ ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών. Ανάµιξη-παραµονή στο σκοτάδι-οµογενοποίηση µε 3 x (3 ml CH 3 CN ml NH 4 OH conc ). Φυγοκέντρησηψύξη του υπερκείµενου. Προσθήκη 3 ml εξανίου + 3 ml αιθυλαιθέρα ml NaCl 1M. Ανάµιξη-εξάτµιση µέχρι ξηρού της κατώτερης στιβάδας-επαναδιάλυση σε 2 ml ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών 0.1 Μ (ph 9.0). Ανάδευση-διήθηση. Σε 1g τεµαχισµένου δείγµατος προσθήκη 150 ng κινίνης (IS). Προσθήκη 10 ml CH 3 CN + 2.5g Na 2 SO 4. Οµογενοποίηση του δείγµατος-φυγοκέντρηση- παραλαβή του υπερκείµενου. ιήθηση µέσω 2.5g Na 2 SO 4 πάνω σε διηθητικό χαρτί. Οξίνιση του διηθήµατος µε 2.5 ml οξικού οξέος 96% -καθαρισµός µε SPE σε µικροστήλες SDB-RPS. Ενεργοποίηση µε 2 ml µίγµατος CH 3 CN/οξικού οξέος 96% (95/5, v/v)-εφαρµογή του δείγµατος-παραλαβή των Qs µε 4 ml µίγµατος CH 3 OH/NH 4 OH 1M (75/25, v/v). Εξάτµιση µέχρι ξηρού σε ρεύµα Ν 2 - επαναδιάλυση σε 300 µl διαλύµατος µυρµηκικού οξέος (ph 2.5) -διήθηση. Οµογενοποίηση mg δείγµατος-προσθήκη 2 x 7 ml 0.15 M HCl- φυγοκέντρηση. SPE: Ενεργοποίηση µε 2 ml νερό-εφαρµογή του δείγµατος-πλύση µε 3 ml νερό + 3 ml 0.2 M Na 2 HPO 4 (ph 9) + 5 ml νερό. Έκλουση µε 3.5 ml CH 3 OH. Εξάτµιση µέχρι ξηρούεπαναδιάλυση σε 200µL 0.2 M Na 2 HPO 4 (ph 9). Ανάδευση-φυγοκέντρηση-παραλαβή του υπερκείµενου. Ανακτήσεις (%) Ήπαρ: DCIP: NOR: CIP: DAN: ENR: ORB: SAR: DIF: Μυϊκός ιστός: DCIP: NOR: CIP: DAN: ENR: ORB: SAR: DIF: CIN: CIP: DAN: ENO: ENR: FLU: MAR: NAL: NOR: OFL: OXO: Νεφρός: Ήπαρ: Μυϊκός ιστός: Λιποειδής + επιφανειακός ιστός: LOD (µg/ml) Ήπαρ: DCIP: 0.3 NOR: 1.2 CIP: 2 DAN: 0.2 ENR: 0.3 ORB: 1.5 SAR: 2 DIF: 0.3 Μυϊκός ιστός: DCIP: 0.1 NOR: 0.2 CIP: 1.5 DAN: 0.1 ENR: 0.2 ORB: 0.5 SAR: 0.6 DIF: 0.2 (ng/g) CIN, ENO, MAR: <20 CIP, OXO: <15 DAN, ENR, FLU, NAL, NOR, OFL: <10 (µg/kg) Μυϊκός ιστός, Λιποειδής + επιφανειακός ιστός: 25 Ήπαρ, Νεφρός: 60 (µg/kg) 112

126 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά CIP, DIF, ENR, NOR, MAR, [97] CIP, DAN, DIF, ENR, FLU, MAR, OXO, SAR, NAL, [98] SAR, OXO, FLU, [99] Είδος δείγµατος Βόειος νεφρός και µυϊκός ιστός, αυγά Μυϊκός ιστός πουλερικών, χοίρου, βοοειδών, προβάτου και ιχθύων Ήπαρ πουλερικών Σε δείγµατα εµβολιασµένα και ύστερα από χορήγηση (µόνο SAR) στο ζώο. Αναλυτική τεχνική HPLC Προκατεργασία δείγµατος Σε 5 g δείγµατος προσθήκη 20 ml 1M HCl-επίδραση υπερήχων-φυγοκέντρηση. SPE σε µικροστήλες C 18 : ενεργοποίηση µε 10 ml νερό-έκλουση µε µίγµα 4 ml KH 2 PO 4 (1mM), ph 2.5: CH 3 OH (1:1). Εξάτµιση σε ρεύµα Ν 2 µέχρι όγκου 200µL. HPLC Σε 0.5 g τεµαχισµένου δείγµατος προσθήκη 300µL ρυθµιστικού διαλύµατος ph 9.1. Ανάδευση-προσθήκη 200 µl CH 3 CN-επίδραση υπερήχων. Προσθήκη 800 µl CH 3 CNανάδευση-φυγοκέντρηση. Ψύξη του υπερκείµενου-εξάτµιση µέχρι όγκου <500 µl. Επαναδιάλυση σε όγκο 500µL µε ρυθµιστικό διάλυµα ph 9.1. Προσθήκη 300 µl εξανίουανάδευση-φυγοκέντρηση. Παραλαβή 400 µl της υδατικής φάσης. HPLC Αποπρωτεΐνωση µε 0.5 ml NH 4 OH + 3 ml CH 3 CN-ανάδευση -φυγοκέντρηση. Συλλογή του υπερκείµενου. Επανεκχύλιση του στερεού υπολείµµατος-ένωση των υπερκείµενων. Αποµάκρυνση του λίπους-µεταφορά των προσδιοριζόµενων ενώσεων στην υδατική φάση µε προσθήκη 1 ml NaCl 1M + 3 ml διαιθυλαιθέρα + 2 ml εξανίου. Φυγοκέντρηση- µεταφορά της κατώτερης φάσης σε αυτόµατο δειγµατολήπτη. Επιπλέον καθαρισµός µε σύστηµα αυτόµατου εµπλουτισµού διαλυµένων ιχνών (ASTED) συνδεδεµένου σε σειρά µε την HPLC. Ανακτήσεις (%) Μυϊκός ιστός: MAR: NOR: CIP: ENR: DIF: Νεφρός: MAR: NOR: CIP: ENR: DIF: Αυγά: MAR: NOR: CIP: ENR: DIF: CIP: 67 ENR: 77 SAR: 71 DIF: 75 MAR: 64 DAN: 59 OXO: 73 NAL: 71 FLU:70 SAR: OXO: FLU: LOD (µg/ml) ENR, CIP: 1 NOR, DIF: 2 MAR: 4 (ng) CIP: 2 ENR: 0.5 SAR: 1 DIF: 0.5 MAR: 35 DAN 7.5 OXO: 12 NAL: 7.5 FLU: 3 (µg/kg) 200 µg/ml για τις τρείς Qs 113

127 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά SAR, [100] CIP, DIF, ENR, SAR, [101] FLU, OXO, [102] ENR, CIP, MAR, DAN, SAR, DIF, [103] Είδος δείγµατος Αυγά εµβολιασµένα και ύστερα από χορήγηση στο ζώο. Ιστοί βοοειδών και χοίρου (µυϊκός ιστός, ήπαρ, νεφρό) Ήπαρ πουλερικών Μυϊκός ιστός χοίρου Αναλυτική τεχνική HPLC Προκατεργασία δείγµατος Ανάµιξη του δείγµατος µε 1 ml CH 3 CN-ανάδευση-προσθήκη 1 ml of NaCl 1M. Φυγοκέντρησηπαραλαβή του υπερκείµενου. Επανεκχύλιση µε 1 ml CH 3 CN-φυγοκέντρηση-ένωση του υπερκείµενου µε αυτό της 1 ης εκχύλισης. Προσθήκη στο διάλυµα 1 ml εξανίου ml CH 3 OH-ανάδευση- φυγοκέντρηση. Η κατώτερη φάση µεταφέρεται σε αυτόµατο δειγµατολήπτη για περαιτέρω καθαρισµό µε ASTED. HPLC Σε 5g δείγµατος προσθήκη 25 ml διαλύµατος εκχύλισης (5% TCA: CH 3 CN, 70:30). Οµογενοποίηση-φυγοκέντρηση. ιήθηση του υπερκείµενου-αραίωση µε 70 ml νερό. SPE σε µικροστήλες SDB-1: ενεργοποίηση µε 3 ml CH 3 OH + 3 ml νερό + 3 ml 5% TCA. Εφαρµογή του δείγµατος-πλύση µε 10 ml 5% TCA + 10 ml νερό + 5 ml εξάνιο. Έκλουση των FQs µε 3 ml µίγµατος ο-φωσφορικού οξέος 0.025Μ: CH 3 CN (70: 30, v/v) HPLC HPLC-MS Σε 1g δείγµατος αποπρωτεΐνωση µε 2 x 5 ml ακετόνη. Φυγοκέντρηση-παραλαβή υπερκείµενου. Αποµάκρυνση του λίπους µε 3 ml ακετόνη + 3 ml εξάνιο + 6 ml 3% NaCl. Φυγοκέντρησηαποµάκρυνση της στιβάδας του εξανίου. Εκχύλιση σε 25 ml CHCl 3 -παραλαβή της στιβάδας του CHCl 3. Προσθήκη 2.5 ml 0.1 M Na 2 PO 4 ph 9+1 µε σταγόνα 1M NaOH- διαχωρισµός των φάσεων, αποµακρύνοντας το CHCl 3. Πλύση της υδατικής στιβάδας µε 2.5 ml CHCl 3 - αποµάκρυνση του CHCl 3. Φυγοκέντρηση της υδατικής φάσης-περαιτέρω καθαρισµό µε ASTED αυτόµατα πριν την HPLC. Προσθήκη 10 ml ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών (ph 7.4) σε 2 g τεµαχισµένου δείγµατος. Οµογενοποίηση-φυγοκέντρηση-διήθηση του υπερκείµενου. SPE σε µικροστήλες C 18 Bond-Elut ενεργοποιηµένες µε CH 3 OH + νερό + ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (ph 7.4). Εφαρµογή του δείγµατος-εµπλουτισµός της µικροστήλης µε 4 x 0.5 ml νερό-ξήρανση για 5 min. Πλύση µε 0.5 ml CH 3 CN ml εξάνιο-παραλαβή των FQs µε 2 x 0.5 ml 1% TFA σε CH 3 CN ml CH 3 CN. Ανακτήσεις LOD (%) (µg/ml) ng/g Μυϊκός ιστός: CIP: DIF: ENR: SAR: Ήπαρ: CIP: DIF: ENR: SAR: Νεφρός: CIP: DIF: ENR: SAR: FLU: OXO: CIP: 105 ENR: 98 5 ng/g FLU:5 OXO: 2.5 (ng/g) 2 ng/g για κάθε FQ 114

128 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά FLU, CIP, DAN, ENO, ENR, LOM, MAR, NOR, OFL, SAR, OXO, NAL, [104] Είδος δείγµατος Μυϊκός ιστός και ήπαρ πουλερικών, αυγά, µέλι, µυϊκός ιστός βοοειδών και χοίρου Αναλυτική τεχνική HPLC Προκατεργασία δείγµατος Βασικές FQs (εκτός FLU): Προσθήκη 2% οξικού οξέος σε CH 3 CN σε 5 g δείγµατος. Οµογενοποίηση- προσθήκη 5 g Na 2 SO 4. Φυγοκέντρηση-διήθηση του υπερκείµενου. SPE µε κατιονανταλλαγή σε µικροστήλες Bond-Elut SCX, ενεργοποιηµένες µε 5 ml CH 3 CN: οξικό οξύ (άνυδρο) (95: 5, v/v). Εφαρµογή του δείγµατος- πλύση µε ακετόνη (2.5 ml) + CH 3 OH (5 ml) + CH 3 CN (5 ml). Έκλουση των FQs µε 5 ml µίγµατος CH 3 OH: 35% NH 4 OH (95: 5, v/v). Εξάτµιση µέχρι ξηρού-επαναδιάλυση σε 2 ml κινητής φάσης. Όξινες Qs (και FLU): Εκχύλιση όπως και προηγούµενα χωρίς όµως προσθήκη οξικού οξέος στο CH 3 CN. Φυγοκέντρηση-εξάτµιση του CH 3 CN-επαναδιάλυση σε 0.05M Na 2 HPO 4 (ph11). SPE µε ανιονανταλλαγή σε µικροστήλες Bond-Elut µε υλικό πλήρωσης AGMP ρητίνη. Εφαρµογή του δείγµατος χωρίς ενεργοποίηση των µικροστηλών-πλύση µε νερό (5 ml) + CH 3 OH (5 ml) + CH 3 CN (5 ml). Έκλουση των Qs µε 2x5 ml µίγµατος CH 3 OH: οξικού οξέος (95: 5, v/v). Εξάτµιση µέχρι όγκου 5 ml-επαναδιάλυση µέχρι τα 10 ml σε 0.01 Μ οξαλικό οξύ. Μυϊκός ιστός πουλερικών: CIP: ENR: MAR: NOR: SAR: OXO: NAL: FLU: Αυγά: CIP: ENR: NOR: SAR: MAR: OFL: ENO: LOM: DAN: OXO: NAL: FLU: Ήπαρ πουλερικών: CIP: 65 ENR: 60 NOR: 64 OXO: NAL: FLU: Μέλι: CIP: ENR: NOR: MAR: Ανακτήσεις (%) Μυϊκός ιστός βοοειδών: CIP: ENR: NOR: SAR: MAR: Μυϊκός ιστός χοίρου: CIP: ENR: 65 NOR: SAR: MAR: 42 Μυϊκός ιστός γαλοπούλας: OFL: ENO: LOM: DAN:

129 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά FLU, OH- FLU, [105] DAN, N- desmethyl- DAN, [106] FLU, [107] BEN, DAN, ENR, OFL, [108] OXO, [109] Είδος δείγµατος Νεφρός χοίρου Ιστοί βοοειδών (ήπαρ, µυϊκός ιστός, νεφρό, λίπος) και πουλερικών (ήπαρ, µυϊκός ιστός) Μυϊκός ιστός και νεφρός χοίρου Μυϊκός ιστός πουλερικών Καλλιέργειε ς ζώων Αναλυτική τεχνική HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC Προκατεργασία δείγµατος Σε 2 g δείγµατος προσθήκη 4 g άνυδρου Na 2 SO ml οξικού αιθυλεστέρα. Ανάµιξηφυγοκέντρηση. Παραλαβή της οργανικής φάσης-επανεκχύλιση. Ένωση των οργανικών φάσεων-εξάτµιση. Επαναδιάλυση σε 1 ml CH 3 CN: διαλύµατος οξαλικού οξέος (50: 50)- ανάδευση-διήθηση του υπολείµµατος. Προσθήκη 5 ml διαλύµατος εκχύλισης (0.015M HClO M H 3 PO 4 σε νερό: CH 3 OH 50:50, v/v) σε 5 g τεµαχισµένου δείγµατος. Ανάµιξη- οµογενοποίηση, σε υδατόλουτρο στους 50 o C για 90 min. Φυγοκέντρηση- παραλαβή του υπερκείµενου. Οµογενοποίηση 10 g δείγµατος σε 40 ml CH 3 ΟΗ: οξικό οξύ (99.9: 0.1, v/v). Φυγοκέντρησηανάµιξη του υπερκείµενου µε 10 ml εξάνιο. Ανάδευση- αποµάκρυνση του εξανίου. Εξάτµιση της οργανικής φάσης-επαναδιάλυση στην (Α) κινητή φάση. Εκχύλιση µε µίγµα 0.2% m-φωσφορικού οξέος: CH 3 CN (70: 30, v/v). SPE σε µικροστήλες Bond Elut C 18 Εκχύλιση µε οξινισµένη CH 3 ΟΗ-επανεκχύλιση µε CH 2 Cl 2. Καθαρισµός µε εκχύλιση Υ-Υ και χρωµατογραφία στήλης Sep-Pak Ανακτήσεις (%) FLU: OH-FLU: DAN: N-desmethyl-DAN: LOD (µg/ml) FLU: OH-FLU: (µg/g) Νεφρός: Νεφρό: 0.09 µg/g OFL, DAN, ENR: 0.01 BEN: 0.02 (µg/g) ppm ENR, CIP, SAR, OXO, FLU, [110] Μυϊκός ιστός χοίρου και σολοµού HPLC Σε 2 g οµογενοποιηµένου δείγµατος προσθήκη 2 x 10 ml 0.05 M ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών (ph 7.4). Επίδραση υπερήχων-φυγοκέντρηση-παραλαβή του υπερκείµενου. ιήθηση-εφαρµογή σε µικροστήλες SPE DSC-18 ενεργοποιηµένες µε 3 ml CH 3 ΟΗ + 3 ml νερό. Έκλουση µε 5 ml CH 3 ΟΗ µε 30% NH 4 OH (75:25, v/v). Επαναδιάλυση σε 0.05 Μ ρυθµιστικό διάλυµα (ph 7.4). Ανάµιξη-διήθηση. Σολοµός: OXO: FLU: Χοίρειος ιστός: CIP: ENR: OXO: FLU: SAR: LOQ: 20 για όλες τις εκτός από τη SAR 40 (ng/g) 116

130 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά ENR, CIP, SAR, DAN, OXO, FLU, DIF, MAR, [111] ENR, CIP, [112] Είδος δείγµατος Βόειος ιστός, γάλα, προϊόντα ιχθυοκαλλιε ργειών Χοίρειος ιστός Αναλυτική τεχνική HPLC-ESI- MS Προκατεργασία δείγµατος Βοδινός ιστός / προϊόντα ιχθυοκαλλιεργειών : σε ποσότητα 2 g τεµαχισµένου ιστού προσθήκη IS. Εκχύλιση των FQs από τον ιστό µε 20 ml υπερκάθαρου νερού. Ανάµιξηφυγοκέντρηση-παραλαβή 10 ml από το υπερκείµενο για επιπλέον καθαρισµό. SPE µικροστήλες Isolute 500 mg C 18. Ενεργοποίηση µε 2 ml CH 3 OH + 4 ml νερό. Εφαρµογή του εκχυλίσµατος- εµπλουτισµός της µικροστήλης µε 2 ml CH 3 OH: νερό (20: 80) + 2 ml εξάνιο. Eφαρµογή κενού µέχρι ξηρού. Έκλουση µε 3 ml 1% TFA σε CH 3 CN. Εξάτµιση µέχρι ξηρού. Επαναδιάλυση σε 30 µl CH 3 OH µε 0.1% TFA. Γάλα: Προσθήκη IS σε 2 ml γάλα. Αποπρωτεϊνωση µε 2.5 ml TFA (20% σε CH 3 OH). Ανάµιξη-φυγοκέντρηση-εκχύλιση των FQs από το υπερκείµενο µε 10 ml υπερκάθαρο νερό. Καθαρισµός µε SPE ανάλογος των δειγµάτων βόειου ιστού και προϊόντων ιχθυοκαλλιέργειας. HPLC Οµογενοποίηση 2 g δείγµατος µε 5 ml 0.1M ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών (ph 7.4). Προσθήκη 6 mlchcl 3 -ανάδευση-φυγοκέντρηση. Αποµάκρυνση της υδατικής φάσηςεξάτµιση της οργανικής. Επαναδιάλυση σε 200 µl του ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών. Ανακτήσεις (%) Βόειος ιστός: ENR: 98 CIP: 97 SAR: 93 DAN:110 OXO: 108 FLU: 110 DIF: 102 MAR: 103 Ιχθυοκαλλιέργειες: ENR: 103 CIP: 102 SAR: 98 DAN:88 OXO: 107 DIF: 88 MAR: 86 Γάλα: ENR: 102 CIP: 101 SAR: 94 DAN:95 OXO: 90 FLU: 99 DIF: 82 MAR: 86 ENR: CIP: LOD (µg/ml) Βόειος ιστός: ENR: 123 CIP: 125 SAR: 43 DAN:150 OXO: 147 FLU: 285 DIF: 432 MAR:218 Ιχθυοκαλλιέργειες: ENR: 148 CIP: 124 SAR: 41 DAN: 148 OXO: 404 DIF: 505 MAR:111 Γάλα: ENR: 120 CIP: 119 SAR: 62 DAN: 42 OXO: 65 FLU: 63 DIF: 78 MAR:111 (µg/kg) 8 ng/g 117

131 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά NOR, [113] OXO, FLU, [114] CIP, SAR, DIF, ENR, DAN, MAR, OXO, FLU, [115] Είδος δείγµατος Ιστοί (µυϊκός, ήπαρ, λίπος) δειγµάτων πουλερικών ύστερα από χορήγηση στο ζώο Μυϊκός ιστός και ήπαρ ιχθύων Χοίρειος µυϊκός ιστός Αναλυτική Προκατεργασία δείγµατος τεχνική HPLC 200 mg δείγµατος οµογενοποιηµένου σε 5 ml διαλύµατος εκχύλισης (12.5 ml πυκνό HClO ml πυκνό H 3 PO 4 διαλυµένα σε 1000mL µίγµατος νερού: CH 3 OH 1: 1, v/v). Φυγοκέντρηση-διήθηση του υπερκείµενου. HPLC HPLC 3 g δείγµατος οµογενοποιούνται µε 1 ml NH ml CH 3 CN- φυγοκέντρηση. Σε 5 ml από το υπερκείµενο προσθήκη 3 ml 5 M NaCl. Ανάµιξη-φυγοκέντρηση-αποµάκρυνση της ανώτερης στιβάδας. Στην κατώτερη φάση προσθήκη 1 ml 85% H 3 PO ml CHCl 3. Ανάδευση- φυγοκέντρηση. Αποµάκρυνση της υδατικής στιβάδας. Εξάτµιση του CHCl 3 - επαναδιάλυση σε 3 ml κινητής φάσης-διήθηση. Εκχύλιση των Qs από 5 g δείγµατος µε 2 x 25 και 10 ml µίγµατος µ-φωσφορικού οξέος 0.3% : CH 3 CN (75: 25, v/v). Κλασική εκχύλιση: ανάδευση-φυγοκέντρηση. SPE σε µικροστήλες ENV+Isolute ενεργοποιηµένες µε 2 ml CH 3 ΟΗ + 2 ml νερό + 2 ml 50 mm H 3 PO 4 (ph 3). Πλύση µε 2 ml νερό ml εξάνιο. Έκλουση µε 5mL 2%TFA σε νερό: CH 3 CN (25:75) and 1 ml CH 3 CN. Εξάτµιση -επαναδιάλυση σε κινητή φάση. ΜΑΕ (microwave-assisted extraction, εκχύλιση µέσω µικροκυµάτων): το δείγµα υποβάλλεται σε πέψη µε µικροκύµατα. Φυγοκέντρηση-διήθηση του εκχυλίσµατος. Ανακτήσεις (%) Λίπος: Μυϊκός ιστός: Ήπαρ: OXO: Μυϊκός ιστός: Ήπαρ: FLU: Μυϊκός ιστός: 94 Ήπαρ : Κλασική εκχύλιση: MAR: 93 CIP: 87 DAN: 87 ENR: 92 SAR: 82 DIF: 81 OXO: 99 FLU: 95 MAE: MAR: 104 CIP: 82 DAN: 96 ENR: 87 SAR: 86 DIF: 83 OXO: 85 FLU: 82 LOD (µg/ml) 2.5 ng/µl OXO: 5 FLU: 10 (ng/g) Κλασική εκχύλιση: MAR: 9 CIP: 13 DAN: 7 ENR: 11 SAR: 12 DIF: 11 OXO: 11 FLU: 10 MAE: MAR: 6 CIP: 5 DAN: 6 ENR: 6 SAR: 10 DIF: 12 OXO: 6 FLU: 8 [µg/kg] 118

132 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά DAN, CIN, CIP, ENO, ENR, FLU, MAR, NAL, NOR, OFL, OXO, [116] CIP, DAN, ENR, SAR, DIF, OXO, FLU, [117] ENO, OFL, NOR, CIP, ENR, [118] MAR, ENR, CIP, DAN, NOR, SAR, DIF, OXO, FLU, [119] Είδος δείγµατος Χοίρειος νεφρός Μυϊκός ιστός πουλερικών Μυϊκός ιστός, ήπαρ, νεφρό πουλερικών και κρόκος αυγών Μυϊκός ιστός βοοειδών Αναλυτική τεχνική HPLC- MS/MS LC-ESI-MS Προκατεργασία δείγµατος Σε 1 g δείγµατος προσθήκη 10 ml CH 3 CN-ανάδευση-φυγοκέντρηση. Εξάτµιση του υπερκείµενου-επαναδιάλυση σε 2 ml οξικό αµµώνιο 5mM (ph 4)-ανάδευση-επίδραση υπερήχων. SPE σε µικροστήλες SDB-RPS, ενεργοποιηµένες 2 x 1 ml CH 3 OH + 2 x 1 ml νερό + 2 x 1 ml οξικό αµµώνιο 5mM (ph 4). Εφαρµογή του δείγµατος στάγδην- έκλουση µε µίγµα CH 3 CN: NH 4 OH (75: 25, v/v). Εξάτµιση µέχρι ξηρού - επαναδιάλυση σε µυρµηκικό οξύ (ph 2.5) -διήθηση. Εµβολιασµός-προσθήκη νερού µέχρι τελικού όγκος 1 ml σε 5 g δείγµατος. Παραµονή στο σκοτάδι για 20 min. Προσθήκη ml CH 2 Cl 2. Ανάδευση-φυγοκέντρηση-εκχύλιση της οργανικής φάσης µε 2 x 5 ml 1Μ ΝaΟΗ. Φυγοκέντρηση. SPE: Ενεργοποίηση των SDB-RPS µικροστηλών µε 2 ml CH 3 OH + 2 ml νερό. Εφαρµογή των δειγµάτων- πλύση µε 2 ml νερό. Έκλουση των FQs µε 2 ml 2% TFA σε νερό: CH 3 CN (25: 75) + 1 ml CH 3 CN. HPLC Σε 1 g τεµαχισµένου και οµογενοποιηµένου δείγµατος προσθήκη ml NaOH 1%- ανάδευση- παραµονή σε ηρεµία- φυγοκέντρηση-παραλαβή του υπερκείµενου. Ένωση των υπερκείµενων. SPE σε µικροστήλες OASIS HLB ενεργοποιηµένες µε 2 ml CH 3 OH + 2 ml νερό. Έκλουση µε 1.5 ml TFA 1% σε CH 3 CN ml CH 3 CN. Ξήρανση µέχρι ξηρού σε ρεύµα Ν 2 -επαναδιάλυση σε κινητή φάση. HPLC Σε 1 g δείγµατος προσθήκη 3mL υπερκάθαρου νερού. Φυγοκέντρηση. 1.5 ml από το υπερκείµενο διέρχεται µέσα από µικροστήλη SPE Oasis HLB ενεργοποιηµένη µε 1.5 ml CH 3 OH ml νερό. Εφαρµογή δείγµατος -εµπλουτισµός της µικροστήλης µε 1.5 ml νερό ml εξάνιο. Υπό κενό για 2min-έκλουση µε 2 ml CH 3 OH. Εξάτµιση µέχρι ξηρού σε ρεύµα Ν 2- επαναδιάλυση σε 250 µl κινητής φάσης- επίδραση υπερήχων -διήθηση πριν την έγχυση του δείγµατος. Ανακτήσεις (%) NOR: 99.4 OFL: ENO: MAR: ENR: CIP: DAN: CIN: FLU: NAL: OXO:104.1 CIP: 67 DAN: 68 ENR: 88 SAR: 77 DIF: 78 OXO: 108 FLU: 93 ENO: 103 OFL: 92 NOR: 99 CIP: 97 ENR: 100 NOR: 36% CIP: 37% DAN: 30% MAR, ENR, SAR, DIF, OXO, FLU: 40-55% LOD (µg/ml) NOR: 1.5µg/kg OFL: 1.2µg/kg ENO: 0.9µg/kg MAR: 2.1µg/kg ENR: 0.9µg/kg CIP: 1.8µg/kg DAN: 0.9µg/kg CIN: 0.6µg/kg FLU: 0.3µg/kg NAL: 0.3µg/kg OXO:0.6µg/kg CIP: 1 DAN: 1 ENR: 0.50 SAR: 0.5 DIF: 0.5 OXO: 0.25 FLU: 0.5 (µg/kg) ENO: OFL: NOR: CIP: ENR: (ng/g) CCβ MAR: 183 NOR: 2.4 CIP: 117 DAN: 232 ENR: 124 SAR 6.0 DIF: 485 OXO : 118 FLU : 239 (ng/g) 119

133 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά CIP, DAN, ENR, MAR, SAR, [120] ENR, CIP, [121] ENR, CIP, [122] ENR, CIP, SAR, OXO, FLU, [123] NOR, OFL, CIP, PEF, LOM, DAN, ENR, SAR, DIF, OXO, FLU, [124] Είδος δείγµατος Αναλυτική τεχνική Προκατεργασία δείγµατος Γάλα HPLC Εµβολιασµός 5 g δείγµατος- ανάδευση - παραµονή στο σκοτάδι στους 4 o C για 30 min. Προσθήκη 2.5 ml TCA (20% σε CH 3 OH)- ανάδευση -φυγοκέντρηση. Προσθήκη 12.5 ml 50 mm NH 4 Cl (ph 9), - φυγοκέντρηση -παραλαβή του υπερκείµενου. SPE σε µικροστήλες Strata X ή Strata Screen ενεργοποιηµένες µε 2 x 3 ml CH 3 OH + 2 x 3 ml NH 4 Cl 50 mm (ph 9). Εφαρµογή του δείγµατος - εµπλουτισµός µε 3 ml of 5% CH 3 OH σε νερό + 2 ml CH 3 OH σε NH 4 Cl (50 mm, ph 9). Έκλουση µε 2 x 1 ml 4% ο-φωσφορικό οξύ σε CH 3 OH. Αγελαδινό HPLC Σε 1 ml δείγµατος προσθήκη 50 µl πυκνού ο-φωσφορικού οξέος- ανάδευση - προσθήκη 2 γάλα και ml CH 3 CN. Ξανά ανάδευση - φυγοκέντρηση. Στο υπερκείµενο προσθήκη 3 ml CH 2 Cl 2. πλάσµα Ανάδευση-φυγοκέντρηση-παραλαβή του υπερκείµενου αίµατος Αιγοπρόβειο γάλα Αγελαδινό γάλα HPLC Σε 5g δείγµατος προσθήκη 2.5 ml TCA 20% σε CH 3 OH. Ανάδευση- φυγοκέντρηση. Προσθήκη 12.5 ml ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών (ph 7.4) - φυγοκέντρηση. SPE στο υπερκείµενο σε µικροστήλες C 18 Speedisk ενεργοποιηµένες µε 6 ml CH 3 OH + 6 ml νερό + 6 ml ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών (ph 7.4). Εφαρµογή δείγµατος - εµπλουτισµός µε 2 ml νερό - ξήρανση. Έκλουση των FQs µε 2 ml TFA 1% σε CH 3 CN. HPLC Αποπρωτεΐνωση του δείγµατος µε την προθήκη 0.25 ml 5% (w/v) µ-φωσφορικού οξέος ανάδευση- παραµονή στο σκοτάδι για 15 min. Φυγοκέντρηση - διήθηση του υπερκείµενου. Επιπλέον καθαρισµός του διηθήµατος µε την τεχνική παράκαµψη της στήλης σε υλικό HLB. Γάλα HPLC Ανάδευση δείγµατος 1 ml - παραµονή στους 4 o C για 30 min. Προσθήκη 5 ml διαλύµατος εκχύλισης (10% TFA σε νερό: CH 3 CN 9: 1, v/v). Φυγοκέντρηση - στο υπερκείµενο SPE σε µικροστήλες Strata-X, ενεργοποιηµένες µε 3 ml CH 3 OH + 3 ml νερό. Εφαρµογή του δείγµατος - προσθήκη 3 ml 10% CH 3 ΟΗ σε νερό. Παραλαβή των Qs µε 3 ml CH 3 ΟΗ - ξήρανση - επαναδιάλυση. Ανακτήσεις (%) MAR: CIP: 80 DAN: ENR: SAR: Γάλα: ENR: CIP: Πλάσµα: ENR: CIP: ENR: CIP: ENR: CIP: SAR: OXO: FLU: NOR: 66.3 OFL: CIP: 68.8 PEF: LOM: 97.6 DAN: ENR: SAR: 66.7 DIF: OXO: 82.1 FLU: LOD (µg/ml) MAR: CIP: DAN: ENR: SAR: LOQ: 1 ng/ml για τις δύο FQs ENR: CIP: (µg/kg) CC β (µg/l): CIP: 116 ENR: 118 SAR: 116 OXO: 126 FLU: 124 NOR: 5 OFL: 9 CIP: 4 PEF: 4 LOM: 6 DAN: 1 ENR: 23 SAR: 5 DIF: 3 OXO: 3 FLU: 2 (µg/l) 120

134 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά d-cip, NOR, CIP, DAN, ENR, ORB, SAR, DIF, [125] NOR, OFL, CIP, PEF, LOM, DAN, ENR, SAR, DIF, [126] Είδος δείγµατος Αυγά (λευκό και κρόκος) Αυγό λευκό και κρόκος Αναλυτική τεχνική HPLC-MS HPLC Προκατεργασία δείγµατος Οµογενοποίηση 1 g δείγµατος µε 3 ml CH 3 CN ml πυκνή NH 4 OH. Φυγοκέντρηση - συλλογή του υπρκείµενου. Επανεκχύλιση µε 0.75 ml. Ένωση των δύο φάσεων - προσθήκη 3 ml εξανίου + 3 ml διαιθυλαιθέρα ml NaCl 1M. Ανάδευση - αποµάκρυνση της ανώτερης στιβάδας. Εξάτµιση της κατώτερης στιβάδας - επαναδιάλυση σε 2 ml 0.1 M ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (ph 9). Ανάδευση - διήθηση. ιαχωρισµός του λευκού από τον κρόκο και συντήρηση στους 4 o C. Σε δείγµα λευκού του αυγού προσθήκη 4 ml οξικού οξέος-απόλυτης αιθανόλης (1:99, v/v) και έντονη ανάδευση. Σε κρόκο αυγού προσθήκη 0.25 ml CH 3 CN, ανάδευση και προσθήκη 4 ml οξικού οξέοςαπόλυτης αιθανόλης (1:99, v/v). Ανάδευση, φυγοκέντρηση των δειγµάτων και παραλαβή των υπερκείµενων. Επαναδιάλυση σε 0.5 ml CH 3 CN, ανάδευση και προσθήκη 2 ml εξανίου. Ανάδευση και παραµονή σε ηρεµία. Αποµάκρυνση της ανώτερης στιβάδας, εξάτµιση της κατώτερης και επαναδιάλυση σε 0.5 ml κινητής φάσης Ανακτήσεις (%) Ολόκληρο αυγό: DCIP: NOR: CIP: DAN: ENR: ORB: SAR: DIF: Λευκό: DCIP: NOR: CIP: DAN: ENR: ORB: SAR: DIF: Κρόκος: DCIP: NOR: CIP: DAN: ENR: ORB: SAR: DIF: NOR: OFL: 77.7\80.4 CIP: PEF: DAN: ENR: SAR: DIF: LOM: LOD (µg/ml) LOQ (ng/g) Ολόκληρο αυγό: DCIP, DAN: 0.1 NOR, DIF: 0.4 CIP: 1.5 ENR: 2 ORB: 1 SAR: 0.7 Λευκό: DCIP, DAN: 0.1 NOR, DIF: 0.4 CIP: 1.5 ENR: 7 ORB: 3.5 SAR: 0.7 Κρόκος: DCIP, DAN: 0.1 NOR, ORB: 1.5 CIP, DIF: 0.5 ENR, SAR: 1 LOQ: NOR,OFL,CIP, ENR,SAR: 20 ng/g. PEF,LOM,DIF: 10.0 ng/g DAN: 5.0 ng/g 121

135 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά OFL, NOR, CIP, ENR, SAR, [127] CIP, ENR, DAN, DIF, FLU, OXO, SAR, [128] CIP, ENR, [129] CIP, SAR, [130] Είδος δείγµατος Αναλυτική τεχνική Προκατεργασία δείγµατος Αυγά HPLC ιάλυση 1g δείγµατος σε 10 ml 25 mm ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών ph 4.1 ανάµιξη - ανάδευση - φυγοκέντρηση. ιήθηση του υπερκείµενου -έγχυση του δείγµατος, όπου γίνεται επιπλέον καθαρισµός µε σύστηµα SPME και µέσω µονολιθικού τριχοειδούς αµέσως πριν την εισαγωγή στην αναλυτική στήλη. Αυγό HPLC 1g αναµιγνύεται µε 250 µl πυκνής NH 3. Προσθήκη 2 ml CH 3 CN - ανάδευση - φυγοκέντρηση. Στο υπερκείµενο προσθήκη 4mL CH 2 Cl 2. Ανάδευση -φυγοκέντρηση. Ανάλυση της ανώτερης στιβάδας. Αυγό HPLC 5 g οµογενοποιηµένου αυγού αναµιγνύoνται µε 20mL ρυθµιστικού διαλύµατος κιτρικού οξέος/κιτρικού νατρίου ph ml ισοπροπανόλη. Εκχύλιση ύστερα από ανάδευση στις 150 rpm. Το διάλυµα εξατµίζεται µέχρι ξηρού σε ρεύµα Ν 2 - επαναδιάλυση σε 1mL νερό. Ιστός πουλερικών CE 5 g λεπτοκοµµένου ιστού πουλερικού-φυγοκέντρηση-εµβολιασµός του δείγµατος. Προσθήκη νερού ώστε το τελικό επίπεδο εµβολιασµού να είναι 1 ml-παραµονή για 20 min στο σκοτάδι-προσθήκη ml CH 2 Cl 2 (διαδοχικά). Ανάδευση για 5 minφυγοκέντρηση-παραλαβή της οργανικής φάσης-εκχύλιση του CH 2 Cl 2 µε 2x5 ml 1M NaOH. Φυγοκέντρηση και εξουδετέρωση µε 3 M H 3 PO 4. Αποµάκρυνση του λίπους 10 ml εξάνιο. SPE σε µικροστήλες BondElut C 18. Ενεργοποίηση µε 2 ml CH 3 OH + 2 ml νερό + 2 ml 0.05 Μ ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών ph 7. Εφαρµογή του δείγµατος -πλύση µε 2 ml ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών, 2 ml νερό και 0.5 ml CH 3 CN. Παραλαβή των FQs µε 2 ml 4% TFA σε µίγµα νερού/ CH 3 CN (25/75, v/v) + 1 ml CH 3 CN. Εξάτµιση µέχρι ξηρού σε ρεύµα Ν 2. επαναδιάλυση σε 100 µl διαλύµατος νερού/ CH 3 CN (50/50, v/v) Ανακτήσεις (%) CIP: DAN: DIF: ENR: SAR: OXO: FLU: ENR: CIP: SAR: 101±6 CIP: 93±6 LOD (µg/ml) Ολόκληρο αυγό: OFL: 1 NOR: 0.1 CIP: 0.2 ENR: 0.1 SAR: 2.6 Λευκό αυγό: OFL: 1.7 NOR: 0.2 CIP: 0.5 ENR: 0.2 SAR: 2.4 (ng/g) CIP:9 DAN:4 DIF:10 ENR:7 FLU:7 OXO:12 SAR:12 (ngg -1 ) ENR: 2 ng/g CIP: 4 ng/g 122

136 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Αναφορά DIF, SAR, [131] ENR, CIP, [132] FLU, OXO, [133] DAN, SAR, CIP, MAR, ENR, DIF, OXO, FLU, [134] Είδος δείγµατος Μυϊκός ιστός πουλερικών Βιολογικά υποστρώµατ α (µυϊκός ιστός πουλερικών) Μυϊκός ιστός πουλερικών Αγελαδινό µη επεξεργασµένο γάλα Αναλυτική τεχνική CE CE CE CZE -MS/MS Προκατεργασία δείγµατος Προσθήκη 5 ml ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών (0.05 Μ KH 2 PO 4, ph 7.0) σε 5 g τεµαχισµένου και αλεσµένου ιστού. Οµογενοποίηση εκχύλιση µε 2 x 20 ml CH 2 Cl 2. Φυγοκέντρηση-παραλαβή της οργανικής φάσης-εκχύλιση µε 5 ml of 0.5M NaOH. Εξουδετέρωση του διαλύµατος µε H 3 PO 4 -αποµάκρυνση του λίπους µε εξάνιοφυγοκέντρηση-παραλαβή της υδατικής στιβάδας.spe σε µικροστήλες C 18 ενεργοποιηµένες µε 2 ml νερό + 2 ml ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών 50 mm. Εφαρµογή του δείγµατος και πλύση µε 2 ml νερό και 0.5 ml CH 3 CN. Παραλαβή των FQs µε 2 ml 4% TFA σε νερό/ CH 3 CN (25/75, v/v) + 1mL CH 3 CN. Προσθήκη IS, εξάτµιση µέχρι ξηρού και επαναδιάλυση σε 100µL νερό/ CH 3 CN (1/1, v/v). Σε 5g τεµαχισµένου δείγµατος προσθήκη 5 ml ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών ph 7.4. Ανάδευση για 20 min-προσθήκη ml CH 2 Cl 2 (διαδοχικά) ανάδευσηφυγοκέντρηση. Ένωση των οργανικών φάσεων- εξάτµιση µέχρι ξηρού-επαναδιάλυση σε 5 ml HCl. Αποµάκρυνση λίπους µε 20 ml εξάνιο-ρύθµιση του ph της υδατικής φάσης σε 7.4 -προσθήκη επιπλέον 20 ml ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών ph 7.4. SPE σε µικροστήλες C 18. Ενεργοποίηση µε 2 ml CH 3 OH + 2 ml ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών 0.05 M ph 7.4. Εφαρµογή του δείγµατος - πλύση µε 2 ml νερό ml CH 3 CN. Παραλαβή των FQs µε 2 ml 4% TFA σε νερό/ CH 3 CN (25/75, v/v) + 1 ml CH 3 CN. Προσθήκη IS- εξάτµιση µέχρι ξηρού- επαναδιάλυση σε 100µL νερό/ CH 3 CN (1/1, v/v). Σε 5g δείγµατος προσθήκη ml CH 2 Cl 2 (διαδοχικά). Φυγοκέντρηση -ένωση των οργανικών φάσεων. Εκχύλιση του CH 2 Cl 2 µε 2 x 5 ml 1M NaOH. Φυγοκέντρησηπροσθήκη 10 ml ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών 0.05 M σε ph 7 + πυκνό φωσφορικό οξύ µέχρι εξουδετέρωση του διαλύµατος. Αποµάκρυνση του λίπους µε 10 mlεξάνιο. SPE σε µικροστήλες BondElut C 18, ενεργοποιηµένες µε 2 ml CH 3 OH + 2 ml νερό + 2 ml ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών 0.05 M ph 7.4. Εφαρµογή του δείγµατος - πλύση µε 2 ml ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών 0.05 M ph ml νερό ml CH 3 CN. Παραλαβή των FQs µε 2 ml 4% TFA σε νερό: CH 3 CN (25: 75, v/v) + 1 ml CH 3 CN. Επαναδιάλυση σε 100 µl νερό/ CH 3 CN (1/1, v/v). Σε 5 g εµβολιασµένου δείγµατος προσθήκη 400 µl πυκνής ΝΗ 3 - ανάδευση. Φυγοκέντρηση σε 2 x 2.5 ml για διαχωρισµό του στερεού λίπους. 2 ml που αποµένουν SPE σε µικροστήλες OASIS Max ενεργοποιηµένες µε 2 ml CH 3 ΟΗ + 2 ml NH 3 2%. Εφαρµογή δείγµατος - πλύση µε 2 ml NH 3 2% σε νερό + 1 ml NH 3 2% σε CH 3 CN. Έκλουση µε 3 ml µυρµηκικό οξύ 2% σε CH 3 OH. Επαναδιάλυση σε 3 x 1 ml 50 mm ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών ph 7. Εφαρµογή σε µκροστήλες SPE OASIS HLB ενεργοποιηµένες µε 2 ml CH 3 ΟΗ + 2 ml νερό. Εφαρµογή του δείγµατος - εµπλουτισµός της µικροστήλης µε 2 ml νερό. Ξήρανση - παραλαβή των Qs µε 2 ml CH 3 ΟΗ. Ξήρανση - επαναδιάλυση σε 250 µl 1 N NH 4 ΟΗ. Ανακτήσεις (%) DIF: SAR: ENR: 74 CIP: 54 OXO: 94 FLU: 84 DAN: 93 SAR: 91 CIP: 84 MAR: 93 ENR: 92 DIF: 100 OXO: 103 FLU: 101 LOD (µg/ml) DIF: 10 SAR: 25 (µg/kg) ENR: 10 CIP: 25 (µg/kg) OXO: 15 FLU: 10 (µg/kg) DAN: 18 SAR: 24 CIP: 17 MAR: 17 ENR: 18 DIF: 17 OXO: 19 FLU: 18 (mg/ml) 123

137 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 9 ο Πίνακας 9.2: Συνέχεια. Ένωσεις, Είδος Αναλυτική Προκατεργασία δείγµατος Ανακτήσεις Αναφορά δείγµατος τεχνική (%) FLU, [135] Γάλα TLC ENR, CIP, [136] CIP, ENR, [137] OXO, [138] Γάλα TLC Τεχνική διασποράς υποστρώµατος: οµογενοποίηση του υλικού Chromosorb WAW µε το δείγµα σε αναλογία όγκων 2:1 (2 g για 1 ml). Το µίγµα τοποθετείται σε µικροστήλη. Αποµάκρυνση του λίπους από το δείγµα µέσα στη µικροστήλη µε 10 ml εξανίου. Φυγοκέντρηση της µικροστήλης - αποµάκρυνση της στιβάδας του εξανίου. Προσθήκη 10mL CH 2 Cl 2 για την έκλουση των FQs. Εξάτµιση του δείγµατος µέχρι ξηρού - προσθήκη 1 ml CH 2 Cl 2 - ξήρανση - επαναδιάλυση σε 100 µl Μυϊκός ιστός πουλερικών και πέστροφας Αγελαδινό γάλα Χηµειοφωταύγεια του Τερβίου Μέτρηση φθορισµοµετρικ ής εκποµπής επίπεδης σταγόνας Σε 5 g τεµαχισµένου δείγµατος προσθήκη 1.5 ml 0.1 M ρυθµιστικού διαλύµατος διαιθυλαλµονικού διαλύµατος (ph 7.4) + 20 ml CH 2 Cl 2. Παραλαβή της οργανικής φάσηςεπαν-εκχύλιση µε 10 ml CH 2 Cl 2. Ένωση των δύο οργανικών φάσεων-προσθήκη 1 ml 0.5 M υδατικό NaCl σε 0.01 M HNO 3. Εξάτµιση του οργανικού διαλύτη-αποµάκρυνση του λίπους µε 10 ml εξάνιο. Καθίζηση των πρωτεϊνών µε την προσθήκη 12.5 ml1 M ZnSO ml 0.23 M K 4 [Fe(CN) 6 ] σε 200 ml δείγµατος. ιήθηση. ENR: 84.2±5.7 CIP: 71.7±8.6 Πέστροφα: CIP: 61.9 ENR: 67.1 Πουλερικό: CIP: 47.4 ENR: 53.8 LOD (µg/ml) Πέστροφα: CIP: 2.9 ENR: 2.7 Πουλερικό: CIP: 3.8 ENR: 3.4 (ng/g) 124

138 Γενικό Μέρος, Κεφάλαιο 10 ο 10. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ Η διατριβή αυτή πραγµατεύεται την ανάπτυξη χρωµατογραφικών µεθόδων για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό δέκα (φθορο)κινολονών σε υποστρώµατα δειγµάτων τροφίµων ζωικής προέλευσης. Όπως έχει ήδη αναφερθεί η αναγκαία και πλέον ιδιαίτερα ευρεία χρήση των κινολονών καθιστά επιτακτική την ανάγκη του ελέγχου των τροφίµων που προέρχονται από ζώα στα οποία έχει γίνει πιθανή χρήση των συγκεκριµένων αντιβιοτικών. Σκοπός είναι η προάσπιση της δηµόσιας υγείας από την κατανάλωση τροφίµων ζωικής προέλευσης που πιθανόν περιέχουν ίχνη κινολονών, ώστε να περιοριστούν, καθώς οδηγούν στην αύξηση της µικροβιακής αντοχής, στα συγκεκριµένα σκευάσµατα. Αρχικά δόθηκε έµφαση στην ανάπτυξη της µεθόδου και στην επικύρωσή της σε πρότυπα διαλύµατα. Στη µέθοδο χρησιµοποιήθηκε η αναλυτική στήλη PerfectSil Target, η οποία µελετήθηκε ως προς την καταλληλότητά της για τον προσδιορισµό γενικότερα των (φθορο)κινολονών, την επαναληψιµότητα στις µετρήσεις και την ανθεκτικότητα του υλικού πλήρωσης στο πλήθος των αναλύσεων, ακόµα και σε δύσκολα υποστρώµατα. Την ανάπτυξη της µεθόδου στα πρότυπα διαλύµατα ακολούθησε η εφαρµογή σε διαφορετικά υποστρώµατα. Η µέθοδος εφαρµόστηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό των φθοροκινολονών ENO, OFL, NOR, DAN, CIP, ENR, SAR και FLU και των κινολονών OXO και NAL σε δείγµατα µυϊκών ιστών πουλερικών, χοίρου, βοοειδών και προβάτου, σε δείγµατα ήπατος βοοειδών και νεφρών χοίρων. Επίσης οι παραπάνω κινολόνες µελετήθηκαν στον κρόκο αυγού και σε διάφορες κατηγορίες γάλακτος (υψηλής και κανονικής παστερίωσης, υψηλών και χαµηλών λιπαρών). Για όλα τα παραπάνω υποστρώµατα αναπτύχθηκαν οι κατάλληλες τεχνικές προκατεργασίας των δειγµάτων, ώστε σε κάθε περίπτωση να εξασφαλίζεται η µέγιστη ανάκτηση των εξεταζόµενων κινολονών. Τα δείγµατα που µελετήθηκαν εµβολιάστηκαν στο εργαστήριο µε γνωστές συγκεντρώσεις των προσδιοριζόµενων κινολονών, ενώ στη συνέχεια έγινε εφαρµογή σε διάφορα δείγµατα του εµπορίου. Στόχος ήταν οι µέθοδοι που αναπτύχθηκαν να προσφέρουν αξιόπιστα και επαναλήψιµα αποτελέσµατα, ώστε να εξασφαλίζεται η ασφαλής χρήση τους για τον έλεγχο των τροφίµων ζωικής προέλευσης, σύµφωνα πάντα µε τις διατάξεις της Ευρωπαϊκής Ένωσης. 125

139 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 11 ο 11. ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙ ΡΑΤΗΡΙΑ 11.1 Όργανα, διατάξεις και υλικά Στη διδακτορική αυτή διατριβή χρησιµοποιήθηκαν δύο διατάξεις Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Πίεσης (HPLC). Η διάταξη (1) χρησιµοποιήθηκε για την ανάπτυξη της µεθόδου και την εφαρµογή της σε φαρµακευτικά σκευάσµατα και σε δείγµατα ιστών πουλερικών, ενώ η διάταξη (2) χρησιµοποιήθηκε για την ανάπτυξη µεθόδου σε ιστούς χοίρου, βοοειδών, προβάτου, καθώς επίσης και στο γάλα και στο κρόκο αυγού. 1. ιάταξη Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Πίεσης που περιλαµβάνει : i. Αντλία σταθερής ροής LC 9A Shimadzu Liquid Chromatograph (Kyoto, Japan). ii. Αυτόµατο δειγµατολήπτη SIL-9A, Shimadzu. iii. Αναλυτική στήλη PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4mm, 5µm) MZ- Analysentechnik, Mainz, Germany. iv. ιάταξη σταθεροποίησης θερµοκρασίας στήλης CTO-6A, Shimadzu. v. Αναλυτική στήλη InertSil C 8 (250 x 4mm, 5µm) MZ-Analysentechnik. vi. Φασµατοφωτοµετρικό ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων (photodiode array detector, DAD) SPD M6A Shimadzu. vii. Μονάδα απαέρωσης DGU-2A Shimadzu. viii. Λογισµικό ελέγχου της διάταξης και επεξεργασίας των χρωµατογραφηµάτων Class M10A, LC Workstation, Shimadzu. 2. ιάταξη Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Πίεσης που περιλαµβάνει : i. Αντλία σταθερής ροής LC-10AD VP Shimadzu Liquid Chromatograph. ii. Σύστηµα ελέγχου όλης της διάταξης SCL-10AL VP Shimadzu. iii. Μίκτης για την ανάµιξη των κινητών φάσων FCV-10AL VP Shimadzu. ix. ιάταξη σταθεροποίησης θερµοκρασίας στήλης CTO-6A, Shimadzu. iv. Αναλυτική στήλη PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4mm), 5µm MZ- Analysentechnik. v. Εξωτερική βαλβίδα εισαγωγής του δείγµατος Rheodyne 7725i (Rheodyne, Cotati, GA, USA) µε βρόχο 20µL. 126

140 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 11 ο vi. Φασµατοφωτοµετρικό ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων (photodiode array detector, DAD) SPD-M10A VP Shimadzu. vii. Μονάδα απαέρωσης DGU-10Β Shimadzu. viii. Λογισµικό ελέγχου της διάταξης και επεξεργασίας των χρωµατογραφηµάτων LC Solution, Shimadzu. Η απαέρωση των διαλυτών πριν την αναρρόφησή τους από τις δύο αντλίες γινόταν µε συνεχόµενη παροχή ηλίου % καθαρότητας. Για την εισαγωγή των δειγµάτων στη στήλη, στη δεύτερη χρωµατογραφική διάταξη (2) χρησιµοποιήθηκε µικροσύριγγα Hamilton (Bonaduz, Switzernland) όγκου 50 µl. Η αρχική λήψη των φασµάτων όλων των προσδιοριζόµενων ενώσεων πραγµατοποιήθηκε σε φασµατοφωτόµετρο UV Vis, JASCO V-530 (Tokyo, Japan). Ο αναλυτικός ζυγός που χρησιµοποιήθηκε καθ όλη τη διάρκεια της πειραµατικής διαδικασίας είναι ο Shimadzu AUX 120 (Kyoto, Japan), ακρίβειας ±0.0001g. Για τη παρασκευή των διαλυµάτων και για την προκατεργασία των δειγµάτων χρησιµοποιήθηκαν οι εξής συσκευές : Συσκευή διήθησης διαλυτών Altech (Deerfield, IL, USA) και διηθητικοί ηθµοί Whatman Cellulose Nitrate 0,2µm-WCN Type, 47mm DIA (Maidstone, England). Συσκευή εκχύλισης στερεάς φάσης 12 θέσεων Supelco (Bellefonte, PA, USA). Συσκευή εξάτµισης Supelco Mini-Vap 6 θέσεων (Bellefonte, PA, USA). Συσκευή εξάτµισης µε ρεύµα αζώτου Pierce Model 18780, Reacti-Vap TM (Pierce, Rockford, IL, USA). Φυγόκεντρος Hermle Z230 (Gosheim, Germany). Αναδευτήρας Small Vortexer glas-col (Terre Haute, IN 47802). Αυτόµατα σιφώνια σταθερού και µεταβλητού όγκου BRAND (Wertheim Germany). Οι µικροστήλες που χρησιµοποιήθηκαν στο στάδιο της προκατεργασίας των δειγµάτων µε την τεχνική της Εκχύλισης Στερεάς Φάσης (SPE) είναι : LiChrolut RP-18 (200mg 3mL -1 ) της εταιρείας Merck (Damstadt, Germany). DSC 18 (500 mg 3 ml -1 ) της εταιρείας Supelco (Bellefonte, USA). 127

141 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 11 ο NEXUS Abselut (30 mg 1 ml -1 ) της εταιρείας Varian (Harbor City, USA). Adsorbex RP-8 (30 mg1 ml -1 ) της εταιρείας Merck (Damstadt, Germany) Πρότυπες ενώσεις, αντιδραστήρια και διαλύτες Οι πρότυπες ενώσεις ενοξακίνη (ENO), οφλοξακίνη (OFL), νορφλοξακίνη (NOR), ναλιδιξικό οξύ (NAL), φλουµεκίνη (FLU) και κιπροφλοξακίνη (CIP) ήταν της εταιρείας Sigma (Steinheim, Germany). Η ενροφλοξακίνη >98% (ENR) και το οξολινικό οξύ 97% (OXO) ήταν της εταιρείας Fluka (Steinheim, Germany) και η ντανοφλοξακίνη 98.4% (DAN) και η σαραφλοξακίνη 99.3% (SAR) της εταιρείας Riedel-de-Haen (Buchs SG, Switzerland). Επίσης οι ενώσεις που δοκιµάστηκαν ως εσωτερικά πρότυπα υδροξυχλωροθειαζίδη, υδροξυφθοροµεθαζίδη, ανθρακένιο, χλωροκίνη, καφεΐνη ήταν της εταιρείας Sigma (Steinheim, Germany), η κολχικίνη της εταιρείας Fluka (Steinheim, Germany) και η λαµοτριγίνη της εταιρείας Welcome Foundation (London, UK). Στο στάδιο της παρασκευής των πρότυπων διαλυµάτων χρησιµοποιήθηκε διάλυµα NaOH 0.1 mol/l, το οποίο παρασκευάστηκε από στερεό NaOH της εταιρείας Riedel-de-Haen (Buchs SG, Switzerland). Επίσης δοκιµαστικά χρησιµοποιήθηκαν οξικό οξύ > 99% και υδροχλωρικό οξύ 37% της εταιρείας Riedelde-Haen (Buchs SG, Switzerland). Για την κινητή φάση και για την προκατεργασία των δειγµάτων χρησιµοποιήθηκε τριφθορο-οξικό οξύ 99% (TFA) της εταιρείας Aldrich (Steinheim, Germany). Για την προκατεργασία των δειγµάτων και για τις χρωµατογραφικές αναλύσεις χρησιµοποιήθηκαν οργανικοί διαλύτες: µεθανόλη (CH 3 OH) και ακετονιτρίλιο (CH 3 CN), βαθµού καθαρότητας HPLC της εταιρείας Carlo Erba (Milano, Italy). Επίσης σε όλα τα στάδια της ανάλυσης χρησιµοποιήθηκε υπεκάθαρο νερό Mill-Q, του συστήµατος Milli-Q της εταιρείας Millipore (Bedford, MA, USA). Τα φαρµακευτικά σκευάσµατα τα οποία χρησιµοποιούνται στην ιατρική και µελετήθηκαν µε τη µέθοδο που αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε στο εργαστήριο ήταν οι ταµπλέτες Tabrin 200 mg, της εταιρείας Aventis (Compiegne, France), µε δραστική ουσία την οφλοξακίνη, οι ταµπλέτες Norocin 400 mg, της εταιρείας Merck (New Jersey, USA) µε δραστική ουσία τη νορφλοξακίνη και οι ταµπλέτες Remena 500 mg, της εταιρείας Remedina (Kamatero, Greece), µε δραστική ουσία τη 128

142 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 11 ο κιπροφλοξακίνη. Από τα κτηνιατρικά σκευάσµατα των φθοροκινολονών µελετήθηκε η ενροφλοξακίνη στο Baytril της εταιρείας Bayer AG (Leverkusen, Germany) σε µορφή πόσιµου διαλύµατος συγκέντρωσης 5 mg/ml, σε ενέσιµο διάλυµα, συγκέντρωσης 50 mg/ml και σε ταµπλέτες των 50 mg. 129

143 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο 12. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΕΚΑ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ. ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ. ΜΕΛΕΤΗ ΑΠΟ ΟΣΗΣ ΝΕΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΠΛΗΡΩΣΗΣ ΣΤΗΛΩΝ HPLC 12.1 Παρασκευή πρότυπων διαλυµάτων Για κάθε µια από τις υπό εξέταση δέκα (φθορο)κινολόνες παρασκευάστηκαν πυκνά διαλύµατα συγκέντρωσης 100 ng/µl. Η αρχική διάλυση των πρότυπων ενώσεων έγινε σε νερό Milli-Q µε την προσθήκη ποσότητας 100 µl διαλύµατος NaOH 0.1 mol L -1 για κάθε 10 ml διαλύµατος της κάθε ένωσης. Η προσθήκη του NaOH έγινε για να βελτιώσει τη διαλυτότητα των κινολονών στο νερό. Τα πυκνά διαλύµατα συντηρούνταν στους 4 o C και αποδείχθηκε ότι παρέµεναν σταθερά για χρονικό διάστηµα δύο µηνών. Μόνο τα διαλύµατα των ΟΧΟ, NAL και FLU, ίδιας συγκέντρωσης, παρουσίασαν διαφορετική συµπεριφορά ύστερα από χρονικό διάστηµα τριών εβδοµάδων. Παρατηρήθηκε µείωση της απόκρισης του σήµατος κατά 30%. Οι αραιώσεις των διαλυµάτων, για την παρασκευή των υδατικών προτύπων που προορίζονταν για τις καθηµερινές αναλύσεις, πραγµατοποιούνταν την ηµέρα της ανάλυσης. Τα αραιά υδατικά διαλύµατα ήταν ασταθή ακόµα και στους 4 o C Φάσµατα των (φθορο)κινολονών Για την επιλογή του βέλτιστου µήκος κύµατος των δέκα προσδιοριζόµενων (φθορο)κινολονών µελετήθηκαν τα φάσµατα απορρόφησης της κάθε πρότυπης ένωσης ξεχωριστά, στην περιοχή του υπεριώδους-ορατού. Από τα πυκνά διαλύµατα των πρότυπων ενώσεων παρασκευάστηκαν διαλύµατα συγκέντρωσης 5 ng/µl. Τα φάσµατα λήφθηκαν σε φασµατόµετρο JASCO V-530, µε τη χρήση κυψελίδας χαλαζία µήκους 1 cm. Τα ολικά φάσµατα απορρόφησης των µελετώµενων (φθορο)κινολονών έτσι όπως λήφθηκαν από το φασµατόµετρο συγκρίθηκαν µε τα αντίστοιχα φάσµατα που προέκυπταν από τον ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων, κατά την έκλουση των ενώσεων από τη στήλη. Στο Σχήµα 12.1 (α-ι) δίνονται τα φάσµατα απορρόφησης της ΕΝΟ, της OFL, της NOR, της CIP, της DAN, της ENR, της SAR, του OXO, του 130

144 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο NAL και της FLU, ύστερα από επεξεργασία του χρωµατογραφήµατος µίγµατος των προσδιοριζόµενων ενώσεων, στο λογισµικό LC Solution, Shimadzu. (α) Σχήµα 12.1: Φάσµατα απορρόφησης στο UV σε µήκη κύµατος nm, (α) της ενοξακίνης, (β) της οφλοξακίνης, (γ) της νορφλοξακίνης, (δ) κιπροφλοξακίνης, (ε) ντανοφλοξακίνης, (στ) ενροφλοξακίνης, (ζ) της σαραφλοξακίνης, (η) του οξολινικού οξέος, (θ) του ναλιδιξικού οξέος και (ι) της φλουµεκίνης. (β) 131

145 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο (γ) Σχήµα 12.1: Συνέχεια (δ) 132

146 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο (ε) Σχήµα 12.1: Συνέχεια (στ) 133

147 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο (ζ) Σχήµα 12.1: Συνέχεια (η) 134

148 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο (θ) Σχήµα 12.1: Συνέχεια (ι) 135

149 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο Στον Πίνακα 12.1 δίνονται τα µήκη κύµατος της µέγιστης απορρόφησης για την κάθε ένωση, σύµφωνα µε το φάσµα ολικής απορρόφησης στην περιοχή του ορατού-υπεριώδους. Η µελέτη των φθοροκινολονών (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR και SAR) έγινε στα 275 nm, ενώ του OXO, του NAL και της FLU έγινε στα 255 nm. Πίνακας 12.1: Συγκεντρωτικός Πίνακας των µέγιστων µηκών κύµατος απορρόφησης των µελετώµενων (φθορο)κινολονών Ένωση Μέγιστο µήκος κύµατος απορρόφησης (nm) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Επιλογή στατικής φάσης και βελτιστοποίηση κινητής φάσης Ο βέλτιστος διαχωρισµός των προσδιοριζόµενων ενώσεων είναι συνδυασµός του κατάλληλου υλικού πλήρωσης της αναλυτικής στήλης, της κατάλληλης σύστασης της κινητής φάσης και του βέλτιστου προγράµµατος βαθµωτής έκλουσης, εφόσον ο διαχωρισµός δεν µπορεί να επιτευχθεί ισοκρατικά. οκιµές έγιναν σε υλικά πλήρωσης C 8 και C 18, καθώς είναι τα συνηθέστερα υλικά, µε αρκετά καλή απόδοση σε ενώσεις όπως οι κινολόνες που διαθέτουν στο µόριό τους πολικό τµήµα (από την πλευρά του καρβονυλίου) και άπολο τµήµα. Αρχικά δοκιµάστηκε στήλη µε υλικό πλήρωσης C 8 Inertsil (250 x 4 mm, 5 µm). Επιδιώχθηκε ο διαχωρισµός να γίνει µε διφασικό σύστηµα υδατικού διαλύµατος 136

150 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο κιτρικού οξέος ή τριφθοροξικού οξέος µε ακετονιτρίλιο, αλλά και στις δύο περιπτώσεις σε όλες τις δοκιµές δεν επιτεύχθηκε πλήρης διαχωρισµός. Κρίθηκε απαραίτητη η χρήση και της µεθανόλης σε µικρή αναλογία στην αρχική σύσταση του προγράµµατος βαθµωτής έκλουσης της κινητής φάσης. Μεταξύ του κιτρικού οξέος και του τριφθοροοξικού οξέος δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές στη συµπεριφορά των προσδιοριζόµενων κινολονών. Για το λόγο αυτό και σε συνδυασµό µε το γεγονός ότι το τριφθοροοξικό οξύ είναι λιγότερο ζηµιογόνο για την αντλία και τις σωληνώσεις επιλέχθηκε αυτό για τις τελικές δοκιµές και για τη βελτιστοποίηση της µεθόδου. Το πρόβληµα αρχικά εντοπίστηκε στο διαχωρισµό των DAN και ENR, των οποίων η δοµή διαφέρει ελάχιστα. Αφού επιτεύχθηκε ο διαχωρισµός των εφτά φθοροκινολονών (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR και SAR), στη συνέχεια προστέθηκαν στο µίγµα για δοκιµές οι OXO, NAL και FLU. Αποδείχθηκε πως ήταν απαραίτητη η χρήση µεγάλου ποσοστού οργανικού διαλύτη, για την έκλουσή τους από τη στήλη. Για το σκοπό αυτό η σύσταση της κινητής φάσης αλλάζει στην πορεία του προγράµµατος µε αύξηση του ποσοστού του οργανικού διαλύτη. Ύστερα από τις απαραίτητες δοκιµές το πρόγραµµα της βαθµωτής έκλουσης που έδωσε τον καλύτερο διαχωρισµό δίνεται στον Πίνακα Η ροή της κινητής φάσης παρέµενε σταθερή για όλη τη διάρκεια του προγράµµατος και ήταν 1.2 ml/min. Η αρχική πίεση του συστήµατος µε την παραπάνω κινητή φάση ήταν περίπου 330 kg/cm 2 και στο τέλος του προγράµµατος 250 kg/cm 2. Πίνακας 12.2: Πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης κινητής φάσης, µε την οποία επιτυγχάνεται ο ταυτόχρονος διαχωρισµός των δέκα προσδιοριζόµενων κινολονών. t (min) TFA (0.1 % v/v) CH 3 CN CH 3 OH Στο Σχήµα 12.2α δίνεται το χρωµατογράφηµα των δέκα προσδιοριζόµενων κινολονών στα 275 nm σύµφωνα µε τις πειραµατικές συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω. Στη συνέχεια έγινε η ανάλυση του ίδιου ακριβώς δείγµατος, µε τις ίδιες 137

151 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο πειραµατικές συνθήκες, χρησιµοποιώντας στήλη C 18 του τύπου PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4mm, 3&5µm). Το χρωµατογράφηµα δίνεται στο Σχήµα 12.2β. (α) Σχήµα 12.2: Χρωµατογραφήµατα µίγµατος των δέκα κινολονών στις στήλες (α) C 8 Inertsil (250 x 4mm, 5 µm) και (β) PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4mm, 5µm), όπου οι κινολόνες που εκλούονται και στις δύο περιπτώσεις είναι οι ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU, αντίστοιχα. (β) 138

152 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο Όπως φαίνεται στα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος 12.2 ο διαχωρισµός και µε τα δυο υλικά πλήρωσης των αναλυτικών στηλών επιτυγχάνεται εξίσου ικανοποιητικά. Παρ όλο που οι χρόνοι συγκράτησης είναι στη στήλη C 18 στο σύνολό τους κατά 3 min αυξηµένοι, στη στήλη αυτή οι κορυφές είναι περισσότερο οξείες. Για το λόγο αυτό επιλέγεται η PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4 mm, 5 µm), για την παραπέρα µελέτη, της οποίας τα χαρακτηριστικά δίνονται στον Πίνακα Πίνακας 12.3: Τεχνικά χαρακτηριστικά της στήλης PerfectSil Target ODS-3 της εταιρείας MZ-Analysentechnik (Germany). Παράµετρος Τιµή Τύπος υλικού C 18 ιάµετρος πόρων 3 & 5 µm Μέγεθος πόρων 100 Å Όγκος πόρων 1,1 cm 3 /g Επιφάνεια 450 m 2 /g Περιεκτικότητα άνθρακα 17 % Επιµόλυνση από µέταλλα < 5 ppm 12.4 Επιλογή εσωτερικού προτύπου Το επόµενο στάδιο της µελέτης ήταν η επιλογή του εσωτερικού προτύπου, ώστε να εξασφαλίζεται µεγαλύτερη επαναληψιµότητα και ακρίβεια στα αποτελέσµατα των ποσοτικών προσδιορισµών. Έτσι, σε όλη τη διάρκεια της µελέτης µελετήθηκε η τιµή του εµβαδού της κορυφής του κάθε προσδιοριζόµενου συστατικού προς το εµβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου. Οι προσπάθειες εστιάστηκαν στην επιλογή κάποιου συστατικού που να εκλούεται στην αρχή του χρωµατογραφήµατος, δηλαδή στα πρώτα 15 min, ώστε να µη συµπίπτει µε τις κορυφές των προσδιοριζόµενων συστατικών που εκλούονται από τα 20 min και µετά. Το εσωτερικό πρότυπο πρέπει επίσης να έχει τα εξής χαρακτηριστικά: 139

153 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο Να αναµιγνύεται πλήρως µε τα υπόλοιπα συστατικά του αναλυόµενου δείγµατος. Να δίνει µόνο µία κορυφή στο χρωµατογράφηµα. Να µην αντιδρά µε κάποιο από τα προσδιοριζόµενα συστατικά, στο µίγµα τους. Να παραµένει σταθερό σε όλη τη διάρκεια της ανάλυσης. Να µην υπάρχει στα πραγµατικά δείγµατα. Να απορροφά στα µελετώµενα µήκη κύµατος 275 και 255 nm. Μεταξύ των ενώσεων που δοκιµάστηκαν, για να χρησιµοποιηθούν ως εσωτερικό πρότυπο, όπως η κολχικίνη, η υδροξυχλωροθειαζίδη, η υδροξυφθοροµεθαζίδη, το ανθρακένιο, η λαµοτριγίνη και η χλωροκίνη, την καταλληλότερη συµπεριφορά παρουσίασε η καφεΐνη. Ο χρόνος έκλουσης της καφεΐνης µε τις επιλεγµένες χρωµατογραφηκές συνθήκες ήταν περίπου 7.5 min, µε υψηλή διακριτική ικανότητα από την πλησιέστερη κορυφή, την ΕΝΟ. Στο Σχήµα 12.3 δίνεται το αντιπροσωπευτικό χρωµατογράφηµα µίγµατος των δέκα µελετώµενων κινολονών µε την καφεΐνη (CAF), ως εσωτερικό πρότυπο (internal standard, IS), σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl. Σχήµα 12.3: Τυπικό χρωµατογράφηµα µίγµατος των δέκα κινολονών µε CAF(IS) υπό τις βέλτιστες χρωµατογραφικές συνθήκες. Συγκεντρώσεις και χρόνοι συγκράτησης: CAF (7.5 ng/µl min), ENO (9 ng/µl, min), OFL (13 ng/µl, min), NOR (9 ng/µl, min), CIP (9 ng/µl, min), DAN (9 ng/µl, min), ENR (4 ng/µl, min), SAR (6 ng/µl, min), OXO (1.5 ng/µl, min), NAL (6 ng/µl, min), FLU (9 ng/µl, min). 140

154 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο Στον Πίνακα 12.4 δίνονται οι ενώσεις που δοκιµάστηκαν ως εσωτερικά πρότυπα, οι χρόνοι συγκράτησης και οι παρατηρήσεις σχετικά µε την καταλληλότητά τους ως εσωτερικά πρότυπα. Πίνακας 12.4: Ενώσεις που εξετάστηκαν για τη χρήση τους ως εσωτερικό πρότυπο. Ένωση Χρόνος συγκράτησης Παρατηρήσεις (min) Κολχικίνη 27.3 Μεγάλος χρόνος έκλουσης Υδροξυχλωροθειαζίδη 8.7 Μικρή απορρόφηση Υδροξυφθοροθειαζίδη 17.8 Μικρή απορρόφηση και διευρυµένη κορυφή Ανθρακένιο ---- εν έδωσε κορυφή Λαµοτριγίνη 18.3 Μεγάλος χρόνος έκλουσης Χλωροκίνη 16.5 Κορυφή µε ουρά Καφεΐνη 7.6 Ικανοποιητικός χρόνος έκλουσης, καλός διαχωρισµός, οξεία κορυφή Με την µελέτη του εσωτερικού προτύπου ολοκληρώθηκε η επιλογή των χρωµατογραφικών συνθηκών για τον ταυτόχρονο διαχωρισµό µίγµατος δέκα κινολονών, µε την τεχνική του εσωτερικού προτύπου. Στον Πίνακα 12.5 συνοψίζονται οι βέλτιστες χρωµατογραφικές συνθήκες, που τελικά επιλέχθηκαν. Με τις συνθήκες αυτές το χρωµατογράφηµα που λαµβάνεται είναι αυτό που παρουσιάζεται στο Σχήµα Η έκλουση της κινητής φάσης γίνονταν βαθµωτά, γι αυτό πριν από κάθε ανάλυση δείγµατος ήταν απαραίτητη η εξισορρόπηση της στήλης µε το πρώτο στάδιο του προγράµµατος της κινητής φάσης, για περίπου 10 min Μελέτη απόδοσης της χρωµατογραφικής στήλης Η αναλυτική στήλη πιστοποιήθηκε ως προς το συγκεκριµένο υλικό πλήρωσης PerfectSil Target ODS-3, σχετικά µε την καταλληλότητά του για την ανάλυση των κινολονών. Σύµφωνα µε τον κατασκευαστή πρόκειται για πηκτή διοξειδίου του πυριτίου υψηλής καθαρότητας (>99.999%), η οποία είναι τροποποιηµένη µε οµάδες C 18 και έχει υποστεί επεξεργασία σύµφωνα µε την τεχνική «end-capping». 141

155 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο Χαρακτηρίζεται από υψηλή χηµική και µηχανική σταθερότητα, εξασφαλίζοντας κορυφές µε µεγάλη συµµετρία. Σηµαντικό πλεονέκτηµα είναι ότι µπορεί να χρησιµοποιηθεί και σε εφαρµογές που απαιτούν στην κινητή φάση ακόµα και 100% υδατικό διαλύτη. Πίνακας 12.5: Βέλτιστες χρωµατογραφικές συνθήκες. Χαρακτηριστικό Βέλτιστη συνθήκη Σύστηµα HPLC σύστηµα Shimadzu, µε αντλία βαθµωτής έκλουσης και ανιχνευτή PDA Χρωµατογραφική στήλη C 18 PerfectSil TargetODS-3 (250 x 4 mm, 3&5 µm), MZ-Analysentechnik. Κινητή φάση Μίγµα Α: TFA 0.1% v/v, B: CH 3 CN και C: CH 3 OH Πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης t (min) Α(%) Β(%) C(%) Ροή κινητής φάσης 1.2 ml/min Μήκος κύµατος ανίχνευσης ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR: 275 nm OXO, NAL, FLU: 255 nm Θερµοκρασία στήλης 25 o C Αρχική πίεση αντλίας ~330 kg/cm 2 Όγκος αναλυόµενου δείγµατος 50 µl Εσωτερικό πρότυπο Καφεΐνη 7.5 ng/µl Για τη µελέτη απόδοσης του συγκεκριµένου υλικού πλήρωσης της αναλυτικής στήλης, σχετικά µε την καταλληλότητά του για την ανάλυση κινολονών, από το 142

156 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο χρωµατογράφηµα του µίγµατος των δέκα κινολονών τα χαρακτηριστικά που µελετήθηκαν, για την κάθε κορυφή ήταν: i. Ο αριθµός των θεωρητικών πλακών, ο οποίος υπολογίστηκε σύµφωνα µε τον τύπο 5.3. ii. Η συµµετρία της κορυφής, υπολογίζοντας τον παράγοντα «ουρά», σύµφωνα µε τον τύπο T f = AB / 2AC (Σχήµα 5.7). iii. Ο σχετικός χρόνος συγκράτησης της κορυφής του κάθε συστατικού σε σχέση µε το χρόνο συγκράτησης του εσωτερικού προτύπου (CAF), ο οποίος υπολογίζεται από τον τύπο: RRT= t Ri / t R(IS (12.1) όπου t Ri είναι ο χρόνος συγκράτησης της κάθε κινολόνης και t R(IS) είναι ο χρόνος συγκράτησης του εσωτερικού προτύπου. iv. Ο παράγοντας χωρητικότητας της κορυφής της κάθε κινολόνης και του εσωτερικού προτύπου, ο οποίος υπολογίζεται από τον τύπο: k = (t Ri t 0 ) / t 0 (12.2) όπου t Ri είναι ο χρόνος συγκράτησης της κάθε κινολόνης και t 0 είναι ο χρόνος έκλουσης συστατικού που δε συγκρατείται στη στήλη. v. Η διακριτική ικανότητα δυο διαδοχικών κορυφών, η οποία υπολογίζεται από τον τύπο 5.5 (σελ. 66). vi. Το σχετικό τυπικό σφάλµα (Relative Retention Standard, RSD) µεταξύ των χρόνων συγκράτησης και των εµβαδών της κάθε κορυφής σε δέκα διαδοχικά χρωµατογραφήµατα του ίδιου µίγµατος. Τα αποτελέσµατα της µελέτης των παραπάνω χαρακτηριστικών, για την κορυφή της κάθε κινολόνης συνοψίζονται στον Πίνακα Από τις τιµές του Πίνακα διακρίνεται η καταλληλότητα της στήλης για τη συγκεκριµένη εφαρµογή. Σηµαντικό χαρακτηριστικό του υλικού πλήρωσης είναι το µέγεθος των σωµατίδιων µε διάµετρο 3 και 5 µm, εξασφαλίζοντας υψηλή επιφάνεια επαφής (450 m 2 /g), συγκριτικά µε την πλειοψηφία των υλικών που χαρακτηρίζονται από επιφάνεια επαφής m 2 /g. Το χαρακτηριστικό αυτό εξασφαλίζει τον ταυτόχρονο καλό διαχωρισµό των δέκα προσδιοριζόµενων ενώσεων. 143

157 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο Πίνακας 12.6: Χαρακτηριστικά απόδοσης της στήλης C 18 PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4 mm, 3&5 µm) για την ανάλυση µίγµατος των δέκα κινολονών, υπό τις βέλτιστες συνθήκες. Ένωση t R (min) RSD 1 R s RRT N T f k RSD 2 CAF (IS) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU όπου t R : χρόνος συγκράτησης, RSD 1 : σχετική τυπική απόκλιση στους χρόνους συγκράτησης της κάθε κορυφής σε δέκα διαδοχικά χρωµατογραφήµατα, R s : διακριτική ικανότητα, RRT: σχετικός χρόνος συγκράτησης, Ν: αριθµός θεωρητικών πλακών, T f : παράγοντας «ουράς», k: παράγοντας συγκράτησης, και RSD 2 : σχετική τυπική απόκλιση στο εµβαδόν της κάθε κορυφής σε δέκα διαδοχικά χρωµατογραφήµατα του ίδιου µίγµατος Χάραξη καµπυλών αναφοράς και επικύρωση της µεθόδου Με βάση τις βέλτιστες συνθήκες που επιλέχθηκαν για τη χρωµατογραφική µέθοδο, χαράχτηκαν οι καµπύλες αναφοράς για την κάθε µια από τις δέκα προσδιοριζόµενες κινολόνες. Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύµατα του µίγµατος των δέκα κινολονών σε διάφορες συγκεντρώσεις, µε σταθερή τη συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου (καφεΐνη 7.5 ng/µl). Για τη χάραξη της καµπύλης αναφοράς υπολογίστηκαν οι λόγοι του εµβαδού της κορυφής της κάθε κινολόνης προς το εµβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου. Χρησιµοποιήθηκε η ανάλυση παλινδρόµησης, σε στάθµη εµπιστοσύνης 95%, για τις ευθείες των ελαχίστων τετραγώνων της κάθε κινολόνης. Οι ευθείες που προκύπτουν είναι της µορφής y = (a ± S a )x + (b ± S b ), όπου a είναι η κλίση της ευθείας, S a η τυπική απόκλιση της κλίσης b η τεταγµένη επί την αρχή και S b η τυπική απόκλιση της τεταγµένης επί την αρχή. 144

158 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο Τα πρότυπα διαλύµατα που χρησιµοποιήθηκαν για το σκοπό αυτό ήταν µίγµατα των δέκα κινολονών σε συγκεντρώσεις 0.03, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 1.0, 3.0, 5.0, 10.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0, 80.0 και ng/µl. Η συγκέντρωση της καφεϊνης ήταν σε όλα τα διαλύµατα 7.5 ng/µl. Το κάθε διάλυµα µετρήθηκε τρεις φορές και υπολογίστηκαν οι µέσοι όροι των τριών µετρήσεων. Στον Πίνακα 12.7 δίνονται τα αναλυτικά χαρακτηριστικά (κλίση και τεταγµένη επί την αρχή) για κάθε ένωση, οι τιµές των συντελεστών συσχέτισης r, το όριο ανίχνευσης της κάθε ένωσης µε την προτεινόµενη µέθοδο και εύρος της γραµµικής περιοχής. Πίνακας 12.7: Γραµµικότητα κι ευαισθησία της προτεινόµενης µεθόδου, για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών, µε τη χρήσης καφεΐνης ως εσωτερικό πρότυπο, σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl. Ένωση Κλίση Τεταγµένη επί την r LOD Εύρος (ng -1 ) αρχή (ng) (ng/µl) ENO ± 15.77E ± 0, OFL ± 1.83E ± NOR ± 4.18E ± CIP ± 4.36E ± DAN ± 4.82E ± ENR ± 6.15E ± 0, SAR ± 1.07E ± OXO ± 11.37E ± NAL ± 1.67E ± FLU ± 0.94E ± Από τον Πίνακα προκύπτει πως οι τιµές των συντελεστών συσχέτισης κυµαίνονται από µέχρι , αποδεικνύοντας τη γραµµικότητα της µεθόδου για όλες τις προσδιοριζόµενες κινολόνες. Οι τιµές των ορίων ανίχνευσης, υπολογισµένες µε τη σχέση LOD = 3S/N (λόγος σήµατος προς θόρυβο), προκύπτουν να είναι 10 ng για τις ENO, OFL, NOR, CIP, SAR και FLU, 5 ng για τις DAN, ENR και NAL και 15 ng για το OXO. Τα όρια της γραµµικής περιοχής διαφέρουν για την 145

159 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο κάθε κινολόνη. Για όλες τις κινολόνες δοκιµάστηκαν και µεγαλύτερες συγκεντρώσεις από το ανώτατο όριο, αλλά ήταν εµφανής η απόκλιση από τη γραµµική περιοχή. Παράλληλα ελέγχθηκε και η εκλεκτικότητα του χρωµατογραφικού διαχωρισµού, αφού όπως παρατηρήθηκε δεν υπήρχαν παρεµποδίσεις (προϊόντα αποικοδόµησης ή προϊόντα αντίδρασης των προσδιοριζόµενων ενώσεων) που να εκλούονται στον ίδιο χρόνο συγκράτησης µε κάποια από τις προσδιοριζόµενες ενώσεις. Στη συνέχεια ελέγχθηκε η πιστότητα της µεθόδου ως προς την επαναληψιµότητά της στη διάρκεια µιας ηµέρας και σε διαφορετικές ηµέρες. Για τον προσδιορισµό της επαναληψιµότητας κατά τη διάρκεια µιας ηµέρας παρασκευάστηκαν πρότυπα διαλύµατα µίγµατος των δέκα κινολονών σε τρία επίπεδα συγκέντρωσης (2, 5 και 10 ng/µl) µε σταθερή συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου (καφεΐνη 7.5 ng/µl). Παράλληλα υπολογίστηκε η ακρίβεια της µεθόδου υπολογίζοντας το σχετικό σφάλµα µέτρησης σε κάθε επίπεδο συγκέντρωσης χρησιµοποιώντας τη σχέση: Σχετικό Σφάλµα (%) = Π.. Τ ΘΤ.. 100% ΘΤ.. (12.3) όπου Π.Τ. = Μέση Πειραµατική Τιµή Θ.Τ. = Θεωρητική Τιµή Τα διαλύµατα µετρήθηκαν πέντε φορές σε κάθε επίπεδο συγκέντρωσης και υπολογίστηκαν οι µέσοι όροι. Στον Πίνακα 12.8 δίνονται τα αποτελέσµατα των µετρήσεων για τον υπολογισµό της ακρίβειας και της επαναληψιµότητας της µεθόδου κατά τη διάρκεια µιας ηµέρας. Ακόµα η πιστότητα της µεθόδου ελέγχθηκε σε έξι διαφορετικές ηµέρες. Τα πρότυπα διαλύµατα παρασκευάζονταν καθηµερινά σε επίπεδα συγκέντρωσης όµοια µε αυτά που χρησιµοποιήθηκαν για τη µέτρηση της επαναληψιµότητας κατά τη διάρκεια µιας ηµέρας. Το κάθε επίπεδο συγκέντρωσης µετρήθηκε τρεις φορές, για έξι διαφορετικές ηµέρες. Από τα αποτελέσµατα των µετρήσεων υπολογίστηκε η ακρίβεια της µεθόδου σε διαφορετικές ηµέρες, χρησιµοποιώντας επίσης τη σχέση Στον Πίνακα 12.9 δίνονται τα αποτελέσµατα των δοκιµών για τον έλεγχο της επαναληψιµότητας της µεθόδου κατά τη διάρκεια έξι διαδοχικών ηµερών. 146

160 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο Πίνακας 12.8: Έλεγχος της επαναληψιµότητας και της ακρίβειας της µεθόδου κατά τη διάρκεια µίας ηµέρας (n = 5). Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (ng) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (ng) RSD Σχετικό Σφάλµα (%) ± ENO ± ± ± OFL ±1, ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± ± ENR ± ± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. 147

161 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο Πίνακας 12.9: Έλεγχος της πιστότητας και της ακρίβειας της µεθόδου κατά τη διάρκεια έξι ηµερών. Προστιθέµενη Μετρηθείσα Σχετικό Ένωση ποσότητα ποσότητα ± SD (α) RSD Σφάλµα (ng) (ng) (%) ± ENO ± ± ±2, OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± ± ,4 ENR ± , ± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. Στους πίνακες 12.8 και 12.9 για το κάθε επίπεδο των µετρήσεων τα αποτελέσµατα εκφράζονται µε την αντίστοιχη σχετική τυπική απόκλιση, η οποία υπολογίζεται µε τη σχέση RSD = 100 x (SD / M.T.), όπου SD είναι η τυπική απόκλιση των µετρήσεων και Μ.T. η µέση τιµή των µετρήσεων. Σύµφωνα µε τον Πίνακα 12.8 η σχετική τυπική απόκλιση των µετρήσεων µέσα σε µια ηµέρα 148

162 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο κυµαίνεται µεταξύ 0.1 και 4.1%, ενώ η σχετική τυπική απόκλιση µεταξύ των διαφορετικών ηµερών κυµαίνεται µεταξύ 0.3 και 7.8% Ανάλυση εµπορικά διαθέσιµων φαρµακευτικών σκευασµάτων κινολονών Η µέθοδος που αναπτύχθηκε παραπάνω εφαρµόστηκε για την ανάλυση εµπορικά διαθέσιµων φαρµακευτικών σκευασµάτων, µε δραστική ουσία κάποια από τις κινολόνες που µελετήθηκαν. Συγκεκριµένα αναλύθηκαν τα δισκία Tabrin (200 mg), της εταιρείας Aventis, που περιείχαν την OFL ως δραστική ουσία, τα δισκία Norocin (400 mg), της εταιρείας Merck, που περιείχαν τη NOR ως δραστική ουσία και τα δισκία Remena (500 mg), της εταιρείας Remedina, που περιείχαν CIP ως δραστική ουσία. Τα παραπάνω είναι όλα φαρµακευτικά σκευάσµατα που χρησιµοποιούνται στην ιατρική. Ενώ µεταξύ των κινολονών µε κτηνιατρική χρήση µόνο η ENR κυκλοφορεί στην ελληνική αγορά, µε την εµπορική ονοµασία Baytril, της εταιρείας Bayer AG. Αναλύθηκαν τρεις µορφές του Baytril, ένα πόσιµο διάλυµα ονοµαστικής συγκέντρωσης 0.5% (5 mg/ml), ένα ενέσιµο διάλυµα 5% (50 mg/ml) και δισκία των 50 mg. Για την κατεργασία των δισκίων λήφθηκαν αντιπροσωπευτικά δείγµατα από κάθε σκεύασµα (πέντε δισκία Tabrin των 200 mg, πέντε δισκία Norocin των 400 mg, τέσσερα δισκία Remena των 500 mg και τρία δισκία Baytril των 50 mg), τα οποία λειοτριβήθηκαν. Στη συνέχεια ζυγίστηκε ποσότητα η οποία αντιστοιχούσε στο µέσο βάρος του κάθε σκευάσµατος. Η ποσότητα µεταφέρθηκε ποσοτικά σε ογκοµετρική φιάλη, όπου προστέθηκε ποσότητα διαλύµατος NaOH 0.1 mol/l (10 µl/ml διαλύµατος ουσίας) και το διάλυµα αραιώθηκε µε Milli-Q νερό. Έτσι, παρασκευάστηκαν πυκνά διαλύµατα των δισκίων Tabrin και Norocin σε συγκέντρωση 400 ng/µl και των δισκίων Remena και Baytril σε συγκέντρωση 500 ng/µl. Μετά τη διάλυση τα αιωρήµατα τοποθετήθηκαν σε λουτρό υπερήχων για 15 min και στη συνέχεια τα αδιάλυτα συστατικά αποµακρύνθηκαν µε διήθηση µέσω ηθµού, µε διάµετρο πόρων 0.2 µm. Για το κάθε σκεύασµα µελετήθηκαν τρία επίπεδα συγκέντρωσης, µε σταθερή συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου (καφεΐνη 7.5 ng/µl). Το πόσιµο διάλυµα (0.5%) και το ενέσιµο διάλυµα (5%) του Baytril απλά αραιώθηκαν κατάλληλα µε Milli-Q νερό σε τελική συγκέντρωση 1000 ng/µl. Στη 149

163 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο συνέχεια το κάθε σκεύασµα µελετήθηκε σε τρία επίπεδα συγκέντρωσης, µε σταθερή συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου (καφεΐνη 7.5 ng/µl). Τα τρία επίπεδα συγκέντρωσης, που µελετήθηκαν για το κάθε σκεύασµα περιείχαν ποσότητα δραστικής ουσίας 100, 250 και 500 ng, αντίστοιχα. Σε κάθε επίπεδο συγκέντρωσης λήφθηκαν τρεις συνεχόµενες µετρήσεις και στη συνέχεια υπολογίστηκε ο µέσος όρος. Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων δίνονται συγκεντρωτικά στον Πίνακα παράλληλα εξετάζεται η ακρίβεια της µεθόδου, υπολογίζοντας το σχετικό σφάλµα για την κάθε προσδιοριζόµενη κινολόνη, καθώς και η επαναληψιµότητα της µεθόδου υπολογίζοντας τη σχετική τυπική απόκλιση των αποτελεσµάτων των µετρήσεων. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσµατα του Πίνακα η ακρίβεια της µεθόδου είναι αρκετά ικανοποιητική µε εξαίρεση την περίπτωση του ενέσιµου διαλύµατος της ENR όπου το σχετικό σφάλµα είναι περίπου -25%. Παραπλήσια αποτελέσµατα είχαν όµως ληφθεί για το ίδιο σκεύασµα µε την ανάλυση µε άλλη χρωµατογραφική µέθοδο που είχε παλιότερα αναπτυχθεί στο εργαστήριο [139]. Αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα από την ανάλυση του κάθε σκευάσµατος µε τη συγκεκριµένη µέθοδο δίνονται στο Σχήµα 12.4 (α-δ). 150

164 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο Πίνακας 12.10: Ακρίβεια και επαναληψιµότητα της µεθόδου για την ανάλυση εµπορικά διαθέσιµων φαρµακευτικών σκευασµάτων. Κτηνιατρικά σκευάσµατα Ονοµαστική ποσότητα (ng) Ευρεθείσα τιµή (a) ±SD (ng) RSD Σχετικό σφάλµα(%) ENR πόσιµο ± διάλυµα ± ± Ονοµαστική συγκέντρωση: 0.5% Προσδιοριζόµενη συγκέντρωση (β) : 0.44±0.01% ENR ενέσιµο ± διάλυµα ± ± Ονοµαστική συγκέντρωση: 5% Προσδιοριζόµενη συγκέντρωση (β) : 3.76±0.09% ENR ισκία Ονοµαστική τιµή: 50mg Προσδιοριζόµενη τιµή (β) : 49.9±1.0mg Ιατρικά σκευάσµατα ± ± ± Ονοµαστική ποσότητα (ng) Ευρεθείσα τιµή (a) ±SD (ng) RSD Σχετικό σφάλµα(%) CIP ισκία ± ± ± Ονοµαστική τιµή: 500mg Προσδιοριζόµενη τιµή (β) : 536± 4.9mg NOR ισκία ± ± ± Ονοµαστική τιµή: 400mg Προσδιοριζόµενη τιµή (β) : 379.2±14.5 mg OFL ισκία ± ± ± Ονοµαστική τιµή: 200mg Προσδιοριζόµενη τιµή (β) : 173.2±1.3 mg (a) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. (β) : Μέσος όρος = (3 συγκεντρώσεις) x (3 µετρήσεις). 151

165 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 12 ο (α) (β) (γ) (δ) Σχήµα 12.4: Χρωµατογραφήµατα των αναλυόµενων φαρµακευτικών και κτηνιατρικών σκευασµάτων, εφαρµόζοντας τη χρωµατογραφική µέθοδο που αναπτύχθηκε. (α) ENR (5 ng/µl) στο Baytril, IS: min, ENR: min, (β) OFL (10 ng/µl) στο Tabrin, IS: min, OFL: , (γ) NOR (10 ng/µl) στο Norocin, IS: min, NOR: min, (δ) CIP (5 ng/µl) στο Remena, IS: min, CIP: min. 152

166 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο 13. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΙΚΩΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΩΝ ΤΩΝ ΕΚΑ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΙΑΦΟΡΩΝ ΚΡΕΟΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΖΩΩΝ, ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ 2002/657/EC Εισαγωγή Σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν η ανάπτυξη µεθόδου για την εκχύλιση και τον ταυτόχρονο χρωµατογραφικό διαχωρισµό δέκα (φθορο)κινολονών (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε εδώδιµους ιστούς κρεοπαραγωγών ζώων. Η µέθοδος που αναπτύχθηκε χαρακτηρίζεται εκλεκτική και ευαίσθητη. Εφαρµόστηκε µε επιτυχία σε µυϊκό ιστό χοίρου, βοοειδών και προβάτου. Η µελέτη στηρίχθηκε σε δείγµατα που εµβολιάζονταν κάθε φορά µε µίγµα των δέκα µελετώµενων κινολονών γνωστής συγκέντρωσης. Για την εκχύλιση των κινολονών από τους ιστούς αναπτύχθηκε πρωτόκολλο κοινό για όλους τους ιστούς, ενώ ακολούθησε επιπλέον καθαρισµός των δειγµάτων µε εφαρµογή της εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE). Η χρωµατογραφική µέθοδος που αναπτύχθηκε επικυρώθηκε σύµφωνα µε τα κριτήρια που ορίζει η απόφαση της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2002/657/EC. Για την επικύρωση της µεθόδου έγινε µελέτη της εκλεκτικότητας, της αντοχής, της σταθερότητας, της γραµµικότητας, των ανακτήσεων, της πιστότητας, του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης. Τα αποτελέσµατα των µελετών αυτών µε τη βοήθεια της ανάλυσης παλινδρόµησης συγκρίθηκαν, µε σκοπό τη συσχέτιση των καµπυλών αναφοράς για την κάθε κινολόνη µεταξύ των διαφορετικών ιστών. Τέλος συγκεντρώθηκαν και αναλύθηκαν δείγµατα από διάφορους παραγωγούς που προµηθεύουν την ελληνική αγορά και ελέγχθηκαν µε τη µέθοδο που αναπτύχθηκε Πρότυπα διαλύµατα και χρωµατογραφικές συνθήκες Η παρασκευή των πυκνών πρότυπων διαλυµάτων και των αραιών διαλυµάτων εργασίας έγινε όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Στην αρχή της µελέτης του κάθε ιστού παρασκευάζονταν τα πυκνά διαλύµατα όλων των ενώσεων, τα οποία 153

167 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο παρέµεναν σταθερά για δύο µήνες. Εκτός από το πυκνά διαλύµατα των ΟΧΟ, NAL και FLU τα οποία παρασκευάζονταν κάθε τρίτη εβδοµάδα. Πίνακας 13.1: Βέλτιστες χρωµατογραφικές συνθήκες. Παράµετρος Βέλτιστες συνθήκες Σύστηµα HPLC σύστηµα Shimadzu, µε αντλία βαθµωτής έκλουσης και ανιχνευτή PDA Χρωµατογραφική στήλη C 18 PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4 mm, 3&5 µm), MZ-Analysentechnik. Κινητή φάση Μίγµα Α: TFA 0.1% v/v, B: CH 3 CN και C: CH 3 OH Πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης t (min) Α(%) Β(%) C(%) Ροή κινητής φάσης 1.2 ml/min Μήκος κύµατος ανίχνευσης ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR: 275 nm OXO, NAL, FLU: 255 nm Θερµοκρασία φούρνου 25 o C Αρχική πίεση αντλίας ~330 kg/cm 2 Όγκος αναλυόµενου δείγµατος 50 µl Εσωτερικό πρότυπο Καφεΐνη 7.5 ng/µl Η χρωµατογραφική στήλη που χρησιµοποιήθηκε ήταν η ίδια που χρησιµοποιήθηκε για την ανάπτυξη της µεθόδου και για την ανάλυση των φαρµακευτικών σκευασµάτων, που περιγράφεται στο κεφάλαιο 12. Συνεπώς, µετά το πλήθος των δοκιµών που έγιναν στους εδώδιµους ιστούς των κρεοπαραγωγών ζώων, 154

168 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο δείγµατα αρκετά επιβαρυµένα, άρχισε να παρατηρείται µικρή αύξηση του χρόνου συγκράτησης των κορυφών και φαινοµένου «ουράς». Για το σκοπό αυτό το πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης τροποποιήθηκε στο τέλος αυξάνοντας κατά 3 min το τελευταίο ισοκρατικό στάδιο. Έτσι οι χρωµατογραφικές συνθήκες που τελικά εφαρµόστηκαν για τη µελέτη των δειγµάτων µυϊκών ιστών χοίρου, βοοειδών και προβάτου δίνονται στον Πίνακα Μελέτη βέλτιστων συνθηκών εκχύλισης στερεάς φάσης Για την εκχύλιση στερεάς φάσης, που εφαρµόστηκε στα δείγµατα µετά την παραλαβή των προσδιοριζόµενων κινολονών από τους µελετώµενους ιστούς, δοκιµάστηκαν υλικά πλήρωσης κυρίως C 18, που χρησιµοποιήθηκε στην αναλυτική στήλη και C 8 που επίσης χρησιµοποιούνται ευρέως µε σχετικά καλές ανακτήσεις σε δείγµατα βιολογικής προέλευσης. Οι µικροστήλες που δοκιµάστηκαν είναι οι Discovery DSC-18, οι Merck Adsorbex RP-8, οι Varian Abselut Nexus, και οι Merck Lichrolut RP-18. Η µελέτη σχετικά µε το στάδιο της εκχύλισης των κινολονών από τις µικροστήλες βασίστηκε σε έρευνα που είχε προηγηθεί και η οποία αποδείχθηκε ότι µπορεί να εφαρµοστεί στις συγκεκριµένες συνθήκες εξασφαλίζοντας ικανοποιητικές ανακτήσεις [118]. Έτσι αρχικά οι µικροστήλες ενεργοποιήθηκαν µε 2 ml νερό και 2 ml CH 3 OH, στη συνέχεια εφαρµόστηκε το δείγµα και τέλος η παραλαβή των προσδιοριζόµενων κινολονών έγινε µε 1.5 ml 0.1 % τριφθοροοξικό οξύ (TFA) v/v σε CH 3 CN και σε 0.5 ml CH 3 CN. Στη συνέχεια ο διαλύτης εξατµιζόταν σε ρεύµα Ν 2 µέχρι ξηρού και το δείγµα επαναδιαλυόταν σε 200 µl υδατικού διαλύµατος TFA 0.1% v/v. Εφαρµόζοντας τα παραπάνω στάδια µε τον ίδιο ακριβώς τρόπο για τις τέσσερις µικροστήλες, οι ανακτήσεις που λήφθηκαν δίνονται στον Πίνακα Οι µελέτες και ανακτήσεις που δίνονται στον Πίνακα 13.2 αφορούν µίγµα των πρότυπων κινολονών. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσµατα, τις υψηλότερες ανακτήσεις έδωσαν οι µικροστήλες Lichrolut RP-18. Οπότε, αφού βρέθηκε στο επόµενο στάδιο, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο 13.4, το πρωτόκολλο εκχύλισης των κινολονών από τους µελετώµενους ιστούς δοκιµάστηκε η εφαρµογή της SPE στις µικροστήλες Lichrolut RP-18 των µελετώµενων δειγµάτων. Παρατηρήθηκε παραπλήσια συµπεριφορά για τα τρία υποστρώµατα (µυϊκός ιστός χοίρου, βοοειδών και προβάτου) µε ανακτήσεις που κυµαίνονταν από 88 έως 101%. Οπότε επιλέχθηκαν 155

169 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο οι µικροστήλες Lichrolut RP-18, της εταιρείας Merck για το στάδιο της προκατεργασίας των δειγµάτων µε SPE. Πίνακας 13.2: Ανακτήσεις (%) των µελετώµενων κινολονών σε µίγµα προτύπων ύστερα από SPE σε διαφορετικά υλικά πλήρωσης. Ανακτήσεις (%) Ένωση Adsorbex DSC-18 LiChrolut RP-18 Varian Abselut NEXUS ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για την εκχύλιση των κινολονών από τους ιστούς. Σε όλα τα δείγµατα των ιστών που µελετήθηκαν η κατεργασία γινόταν χωρίς προηγουµένως να έχουν ξηρανθεί. Η κατεργασία γινόταν σε φρέσκα δείγµατα µυϊκών ιστών, τα οποία αρχικά τεµαχίζονταν και οµογενοποιούνταν, στη συνέχεια ζυγίζονταν σε ποσότητες ± g και διατηρούνταν συσκευασµένα σε φύλλα αλουµινίου στους -20 o C. Για το στάδιο της ανάπτυξης του πρωτοκόλλου εκχύλισης των κινολονών από τους µελετώµενους ιστούς επιλέχθηκε δείγµα βόειου µυϊκού ιστού και στη συνέχεια δοκιµάστηκε η εφαρµογή του βέλτιστου πρωτοκόλλου στους µυϊκούς ιστούς χοίρου και προβάτου. Για τις δοκιµές ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία: Εµβολιασµός ± g δείγµατος µε µίγµα γνωστής συγκέντρωσης των δέκα κινολονών και εσωτερικό πρότυπο σε σταθερή συγκέντρωση 7.5 ng/µl. Προσθήκη διαφόρων διαλυτών για την εκχύλιση των κινολονών από το υπόστρωµα του ιστού. 156

170 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Ανάδευση σε συσκευή vortex, εφαρµογή υπερήχων, φυγοκέντρηση για την παραλαβή του εκχυλίσµατος και ανάλογα µε τη φύση του διαλύµατος εκχύλισης, απ ευθείας εφαρµογή της SPE για υδατικούς διαλύτες ή πρώτα εξάτµιση, επαναδιάλυση και στη συνέχεια SPE για οργανικούς διαλύτες εκχύλισης. Αρχικά χρησιµοποιήθηκαν υδατικά διαλύµατα NaOH σε συγκεντρώσεις 0.1, 0.3, 0.5 και 1 Μ, για την εκχύλιση των κινολονών από εµβολιασµένο δείγµα µυϊκού βοοειδών. Αλλά όπως φαίνεται και από τα αποτελέσµατα του γραφήµατος στο Σχήµα 13.1α όλες οι τιµές των ανακτήσεων ήταν χαµηλότερες από 68%. Στη συνέχεια δοκιµάστηκαν για την εκχύλιση υδατικά διαλύµατα κιτρικού οξέος συγκέντρωσης 0.3 και 0.5Μ. Όµως κάποια παρεµπόδιση που οφειλόταν στο διάλυµα του κιτρικού οξέος εκλουόταν σε χρονική στιγµή 22 min από την αναλυτική στήλη. Επίσης ως εκχυλιστικά µέσα δοκιµάστηκαν υδατικά διαλύµατα οξικού αµµωνίου σε συγκεντρώσεις 0.1, 0.3, 0.5 και 0.8Μ και ρυθµιστικά διαλύµατα φωσφορικών µε ph 7.4 σε συγκέντρωση 0.05 και 0.1Μ δίνοντας επίσης σχετικά χαµηλές ανακτήσεις (<60%), όπως φαίνεται από τα γραφήµατα των σχηµάτων 13.1β και 13.1γ, αντίστοιχα. ιαλύτης εκχύλισης NaOH NaOH 1% NaOH0.1M NaOH 0.3M NaOH 0.5M NaOH 1.0M Ανακτήσεις (%) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Κινολόνες (α) Σχήµα 13.1: Γραφήµατα ανακτήσεων εκχύλισης κάθε κινολόνης από δείγµα βόειου µυϊκού ιστού χρησιµοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις υδατικών διαλυµάτων (α) NaOH, (β) CH 3 COONH 4 και (γ) ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών µε ph

171 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο ιαλύτης εκχύλισης CH 3 COONH 4 Οξικό Αµµώνιο 0.1Μ Οξικό Αµµώνιο 0.3Μ Οξικό Αµµώνιο 0.5Μ Οξικό Αµµώνιο 0.8Μ Ανακτήσεις (%) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Κινολόνες (β) ιαλύτης εκχύλισης ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών ph Μ 0.1 Μ 60 Ανακτήσεις (%) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Κινολόνες Σχήµα 13.1: Συνέχεια (γ) Στη συνέχεια για την εκχύλιση των κινολονών δοκιµάστηκε υδατικό διάλυµα TFA 0.1% v/v δίνοντας ανακτήσεις για τις περισσότερες κινολόνες πάνω από 65%. Οπότε δοκιµάστηκε στη συνέχεια διάλυµα TFA 0.1% v/v σε οργανικούς διαλύτες CH 3 OH και CH 3 CN, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται από το γράφηµα το Σχήµατος 13.2 οι ανακτήσεις µε το διάλυµα του TFA 0.1% v/v σε CH 3 ΟΗ έδωσε ανακτήσεις που κυµαίνονται από 73 έως 78%. 158

172 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο ιαλύτης εκχύλισης TFA TFA 0.1% (υδ. διάλυµα) TFA 0.1% (σε ακετονιτρίλιο) TFA 0 1% (σε µεθανόλη) 80 Ανακτήσεις (%) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Κινολόνες Σχήµα 13.2: Γράφηµα ανακτήσεων κινολονών από δείγµα βόειου µυϊκού ιστού µετά από εκχύλιση µε υδατικό διάλυµα TFA 0.1% v/v και TFA 0.1% v/v σε CH 3 OH και CH 3 CN, αντίστοιχα. Αφού επιλέχθηκε ως διαλύτης εκχύλισης το TFA 0.1% v/v σε CH 3 OH έγιναν δοκιµές για βελτίωση του πρωτοκόλλου. Έτσι, δοκιµάστηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις του TFA σε CH 3 OH (0.05, 0.1, 0.5 και 1% v/v). Όπως διακρίνεται στο γράφηµα του Σχήµατος 13.3 οι συγκεντρώσεις 0.1 και 0.5% TFA σε CH 3 OH έδωσαν παραπλήσιες ανακτήσεις (73-78%), αλλά όσο µεγαλύτερη ήταν η συγκέντρωση του TFA στη CH 3 OH, τόσο µεγαλύτερη ήταν και η παραλαβή στερεών υπολειµµάτων από το υπόστρωµα καθιστώντας αναγκαία τη διήθηση των δειγµάτων. Όµως διαπιστώθηκε πως µε τη διήθηση µειωνόταν η τελική ανάκτηση, αφού µέρος του δείγµατος προσροφούνταν στο διηθητικό ηθµό. 159

173 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο ιαφορετικές συγκεντρώσεις του TFA σε CH 3 OH 0.05% 0.10% 0.50% 1.00% Ανακτήσεις (%) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Κινολόνες Σχήµα 13.3: Γράφηµα ανακτήσεων των κινολονών από δείγµα βόειου µυϊκού ιστού µετά από εκχύλιση, χρησιµοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις TFA σε CH 3 OH (v/v). Το επόµενο στάδιο της µελέτης εστιάστηκε σε δοκιµές για το βέλτιστο όγκο του διαλύτη εκχύλισης. Έτσι δοκιµάστηκαν 2, 3, 4 και 5 ml διαλύµατος TFA 0.1% v/v σε CH 3 OH και αποδείχθηκε, όπως φαίνεται από το γράφηµα του Σχήµατος 13.4α, ότι 4 ml διαλύµατος εκχύλισης ήταν αρκετά, εξασφαλίζοντας ανακτήσεις µεταξύ 76 και 83%. Τέλος δοκιµάστηκε η εκχύλιση να γίνει σε ένα, δυο και τρία στάδια χρησιµοποιώντας κάθε φορά 4 ml διαλύµατος TFA 0.1% v/v σε CH 3 OH. ιαπιστώθηκε πως ικανοποιητικά υψηλές ανακτήσεις (84-91%) λαµβάνονταν µε δύο στάδια εκχύλισης, ενώ το επιπλέον στάδιο δε συνεισέφερε στην αύξηση της ανάκτησης, ενώ αντίθετα αυξανόταν ο χρόνος της προκατεργασίας του δείγµατος. Τα αποτελέσµατα των δοκιµών αυτών δίνονται στο γράφηµα του Σχήµατος 13.4β. Οπότε τελικά το πρωτόκολλο που εφαρµόστηκε για την ταυτόχρονη εκχύλιση των δέκα κινολονών από βόειο µυϊκό ιστό περιγράφεται στον Πίνακα Αρχικά εφαρµόζεται στο δείγµα εκχύλιση στερεού-υγρού και στη συνέχεια το εκχύλισµα καθαρίζεται επιπλέον µέσω της τεχνικής της SPE, επιτυγχάνοντας τελικές ανακτήσεις %. Το πρωτόκολλο αυτό δοκιµάστηκε και εφαρµόστηκε επίσης µε επιτυχία σε µυϊκό ιστό χοίρου και προβάτου. 160

174 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο ιαφορετικοί όγκοι διαλύµατος εκχύλισης 2 ml TFA 0.1% σε µεθανόλη 3 ml TFA 0.1% σε µεθανόλη 4 ml TFA 0.1% σε µεθανόλη 5 ml TFA 0.1% σε µεθανόλη 100 Ανακτήσεις (%) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Κινολόνες (α) ιαδοχικά στάδια εκχύλισης κάθε φορά µε 4 ml TFA 0.1% σε CH 3 OH Ανακτήσεις (%) Ένα στάδιο εκχύλισης ύο στάδια εκχύλισης Τρία στάδια εκχύλισης 65 ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Κινολόνες Σχήµα 13.4: Γράφηµα ανακτήσεων των κινολονών από δείγµα βόειου µυϊκού ιστού µετά από εκχύλιση (α) χρησιµοποιώντας διαφορετικούς όγκους διαλύµατος εκχύλισης και (β) δοκιµάζοντας ένα, δύο και τρία διαδοχικά στάδια εκχύλισης. (β) 161

175 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.3: Στάδια προκατεργασίας δειγµάτων µυϊκού ιστού βοοειδών, χοίρου και προβάτου, για την ταυτόχρονη εκχύλιση των δέκα κινολονών. Στάδια Περιγραφή 1 ο Εµβολιασµός ± g τεµαχισµένου δείγµατος µυϊκού ιστού µε 200 µl µίγµατος των δέκα κινολονών και του IS. 2 ο Προσθήκη 4 ml διαλύµατος TFA 0.1% v/v σε CH 3 OH, ανάδευση σε συσκευή vortex, παραµονή σε ηρεµία στο σκοτάδι για 10 min, εφαρµογή υπερήχων για 15 min και φυγοκέντρηση στις 3500 rpm (800 g) για 10 min. Παραλαβή του υπερκείµενου. 3 ο Επανεκχύλιση του στερεού υπολείµµατος επαναλαµβάνοντας το 2 ο στάδιο. Το υπερκείµενο που παραλαµβάνεται από το στάδιο της φυγοκέντρησης ενώνεται σε δοκιµαστικό σωλήνα µε αυτό της 1 ης εκχύλισης. 4 ο Εξάτµιση του οργανικού διαλύτη εκχύλισης σε ρεύµα Ν 2 και επαναδιάλυση του ξηρού υπολείµµατος σε 2 ml υδατικού διαλύµατος TFA 0.1% v/v. 5 ο Εφαρµογή του διαλύµατος εκχύλισης σε µικροστήλες Lichrolut RP-18, ενεργοποιηµένες µε 2 ml νερό και 2 ml CH 3 OH. 6 ο Παραλαβή των προσδιοριζόµενων κινολονών µε 1.5 ml 0.1 % TFA σε CH 3 CN και σε 0.5 ml CH 3 CN. 7 ο Εξάτµιση του διαλύτη σε ρεύµα Ν 2 µέχρι ξηρού. 8 ο Επαναδιάλυση του δείγµατος σε 200 µl υδατικού διαλύµατος TFA 0.1% v/v 9 ο Έγχυση 50 µl δείγµατος στην HPLC. Στα Σχήµατα 13.5, 13.6 και 13.7 δίνονται αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα βόειου, χοίρειου και πρόβειου ιστού σε δείγµατα εµβολιασµένα µόνο µε το διάλυµα του εσωτερικού προτύπου (καφεΐνη 7.5 ng/µl) και εµβολιασµένα µε το µίγµα των δέκα κινολονών σε συγκέντρωση 5 ng/µl, για την κάθε κινολόνη που περιέχει και το εσωτερικό πρότυπο. Επίσης στον Πίνακα 13.4 δίνονται οι χρόνοι συγκράτησης της κάθε κινολόνης, το τυπικό σφάλµα στους αντίστοιχους χρόνους συγκράτησης και η διακριτική ικανότητα µεταξύ των διαδοχικών κορυφών έτσι όπως υπολογίζεται από τη σχέση

176 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο (α) Σχήµα 13.5: α. Χρωµατογράφηµα λευκού δείγµατος βόειου µυϊκού ιστού, εµβολιασµένο µόνο µε το IS (1). β. Χρωµατογράφηµα δείγµατος βόειου µυϊκού ιστού, εµβολιασµένο µε µίγµα των δέκα κινολονών (2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU) σε συγκέντρωση 5 ng/µl και IS (1), µετρηµένα στα 275 nm. (β) 163

177 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο (α) (β) Σχήµα 13.6: α. Χρωµατογράφηµα λευκού δείγµατος πρόβειου µυϊκού ιστού, εµβολιασµένο µόνο µε το IS (1). β. Χρωµατογράφηµα δείγµατος πρόβειου µυϊκού ιστού, εµβολιασµένο µε µίγµα των δέκα κινολονών (2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU) σε συγκέντρωση 5 ng/µl και IS (1), µετρηµένα στα 275 nm. 164

178 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο (α) Σχήµα 13.7: α. Χρωµατογράφηµα λευκού δείγµατος χοίρειου µυϊκού ιστού, εµβολιασµένο µόνο µε το IS (1). β. Χρωµατογράφηµα δείγµατος χοίρειου µυϊκού ιστού, εµβολιασµένο µε µίγµα των δέκα κινολονών (2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU) σε συγκέντρωση 5 ng/µl και IS (1), µετρηµένα στα 275 nm. (β) 165

179 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.4: Συγκεντρωτικός Πίνακας των χρόνων συγκράτησης των κινολονών εφαρµόζοντας τη µέθοδο που αναπτύχθηκε, όπου υπολογίζονται οι τυπικές αποκλίσεις (SD) των χρόνων συγκράτησης για κάθε κορυφή από εννέα χρωµατογραφήµατα και η διακριτική ικανότητα µεταξύ διαδοχικών κορυφών. Κινολόνες Χρόνοι συγκράτησης ιακριτική ικανότητα ± SD (min) IS ± ENO ± OFL ± NOR ± CIP ± DAN ± ENR ± SAR ± OXO ± NAL ± FLU ± Επικύρωση χρωµατογραφικής µεθόδου Η επικύρωση της χρωµατογραφικής µεθόδου που αναπτύχθηκε έγινε σύµφωνα µε τα κριτήρια που ορίζονται από την απόφαση της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2002/657/EC. Στη συνέχεια περιγράφονται αναλυτικά τα στάδια της επικύρωσης και σχολιάζονται τα αποτελέσµατα που προκύπτουν από κάθε δοκιµή Έλεγχος εκλεκτικότητας Για τον έλεγχο της εκλεκτικότητας αναλύθηκαν πέντε λευκά δείγµατα από τον κάθε ιστό, προκειµένου να ελεγχθεί αν υπάρχει κάποια παρεµπόδιση από το υπόστρωµα, η οποία να συνεκλούεται στους χρόνους έκλουσης των µελετώµενων ενώσεων. Τα πέντε δείγµατα προέρχονται από διαφορετικούς Έλληνες παραγωγούς, προσπαθώντας να εξασφαλιστούν περισσότερο αντιπροσωπευτικά αποτελέσµατα. Σε κανένα από τα δείγµατα που αναλύθηκαν µε την µέθοδο που αναπτύχθηκε δεν παρατηρήθηκαν κορυφές που να συµπίπτουν µε τους χρόνους έκλουσης των δέκα κινολονών. Αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα λευκών δειγµάτων των τριών µελετώµενων µυϊκών ιστών δίνονται στο Σχήµα 13.8 (α, β, γ). Τα δείγµατα υποβάλλονται σε κατεργασία σύµφωνα µε το τελικό πρωτόκολλο, αλλά δεν 166

180 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο εµβολιάστηκαν ούτε µε το εσωτερικό πρότυπο. Όπως φαίνεται και από τα τρία χρωµατογραφήµατα υπάρχουν κορυφές οι οποίες οφείλονται σε συστατικά του υποστρώµατος, αλλά δεν παρεµποδίζουν τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών Μελέτη ανθεκτικότητας Η µελέτη της ανθεκτικότητας της µεθόδου έγινε αναλύοντας δείγµατα εµβολιασµένα µετά από κατεργασία σύµφωνα µε το πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε, προκαλώντας µικρές σκόπιµες αλλαγές στην αναλυτική µέθοδο. Οι παράµετροι που µελετήθηκαν ήταν η θερµοκρασία του φούρνου, το ph της κινητής φάσης αλλάζοντας της συγκέντρωση του TFA, η ροή της κινητής φάσης και το πρόγραµµα της βαθµωτής έκλουσης της κινητής φάσης. Όλα τα πειράµατα έγιναν σε πρότυπα διαλύµατα µίγµατος των δέκα κινολονών, συγκέντρωσης 5 ng/µl, µαζί µε εσωτερικό πρότυπο. Σχήµα 13.8: Χρωµατογραφήµατα λευκών δειγµάτων µυϊκών ιστών α. βοοειδών, β. προβάτου και γ. χοίρου, µετρηµένα στα 275 nm. (α) 167

181 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο (β) Σχήµα 13.8: Συνέχεια. (γ) Στη χρωµατογραφική µέθοδο που αναπτύχθηκε η θερµοκρασία της στήλης ήταν 25 o C. Για τη µελέτη της ανθεκτικότητας, πρότυπα διαλύµατα αναλύθηκαν διατηρώντας όλες τις παραµέτρους της µεθόδου σταθερές, αλλάζοντας µόνο τη θερµοκρασία της στήλης στους 30 o C και στους 35 o C. Όπως φαίνεται και από τα 168

182 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Σχήµατα 13.9 (α, β) η µορφή των κορυφών και η διακριτική τους ικανότητα παρέµεινε η ίδια. Όµως µε την αύξηση της θερµοκρασίας παρατηρήθηκε πως µειωνόταν η απόκριση του σήµατος, ελαττώνοντας έτσι την ευαισθησία της µεθόδου. (α) Σχήµα 13.9: Χρωµατογραφήµατα πρότυπων διαλυµάτων µίγµατος των δέκα κινολονών σε συγκέντρωση 5 ng/µl µε IS σε θερµοκρασία στήλης α. 30 o C και β. 35 o C. (1.CAF, 2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU). (β) 169

183 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Σχετικά µε την ανθεκτικότητα της µεθόδου εκτός από τη συγκέντρωση του TFA 0.1% v/v στην κινητή φάση, µελετήθηκαν συγκεντρώσεις 0.05, και 0.15% v/v. Παρατηρήθηκε πως όσο πιο χαµηλή ήταν η συγκέντρωση του TFA τόσο µειωνόταν ο διαχωρισµός µεταξύ των OFL και NOR. Επίσης σε συγκέντρωση TFA 0.15% v/v η διακριτική ικανότητα µεταξύ των DAN και ENR ελαττώνεται. Στα Σχήµατα (α, β, γ) δίνονται τα χρωµατογραφήµατα πρότυπων διαλυµάτων µίγµατος των δέκα κινολονών, ύστερα από τις παραπάνω αλλαγές στη συγκέντρωση του TFA στην κινητή φάση. Εκτός από την ταχύτητα ροής 1.2 ml/min της κινητής φάσης που επιλέχθηκε ως βέλτιστη για τη µέθοδο που αναπτύχθηκε, για τα πειράµατα της σταθερότητας αναλύθηκαν πρότυπα διαλύµατα µίγµατος των δέκα κινολονών µε IS σύµφωνα µε τη µέθοδο που αναπτύχθηκε, αλλάζοντας µόνο τη ροή. οκιµάστηκε ταχύτητα ροής 1.1 ml/min και 1.3 ml/min. Όπως φαίνεται και από τα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος (α, β) µε χαµηλότερη ταχύτητα ροής της κινητής φάσης ο συνολικός χρόνος της ανάλυσης ανέρχεται στα 35 min, ενώ µε µεγαλύτερη ροή ο συνολικός χρόνος της ανάλυσης µειώνεται κατά 3 min, αυξάνεται όµως αρκετά η εσωτερική πίεση του συστήµατος (320 kg/cm 2 ). Οι αλλαγές στη ροή που δοκιµάστηκαν δεν επηρέασαν σηµαντικά τη διακριτική ικανότητα της µεθόδου, µεταξύ των κορυφών. Σχήµα 13.10: Χρωµατογραφήµατα πρότυπων διαλυµάτων µίγµατος των δέκα κινολονών σε συγκέντρωση 5 ng/µl και IS µε συγκέντρωση TFA στην κινητή φάση α. 0.05%, β % και γ. 0.15% (1.CAF, 2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU). (α) 170

184 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο (β) (γ) Σχήµα 13.10: Συνέχεια. 171

185 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο (α) Σχήµα 13.11: Χρωµατογραφήµατα πρότυπων διαλυµάτων µίγµατος των δέκα κινολονών σε συγκέντρωση 5 ng/µl και IS µε ταχύτητες ροής της κινητής φάσης α. 1.1 ml/min και β. 1.3 ml/min (1.CAF, 2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU). Το τελευταίο πείραµα που έγινε για τον έλεγχο της ανθεκτικότητας της χρωµατογραφικής µεθόδου, ήταν η αλλαγή του προγράµµατος βαθµωτής έκλουσης της κινητής φάσης. Τα προγράµµατα που δοκιµάστηκαν δίνονται στον Πίνακα Και στις δύο δοκιµές διατηρήθηκε σταθερό το ποσοστό της CH 3 ΟΗ και (β) 172

186 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο δοκιµάστηκαν δυο αλλαγές στην αναλογία του υδατικού διαλύµατος του TFA 0.1% v/v µε τον οργανικό διαλύτη CH 3 CN. Στις δοκιµές που έγιναν παρατηρήθηκε µείωση στη διαχωριστική ικανότητα µεταξύ των κορυφών της OFLκαι της NOR και µεταξύ της DAN και της ENR, όπως φαίνεται και από τα χρωµατογραφήµατα του Σχήµατος (α, β). Πίνακας 13.5: Προγράµµατα βαθµωτής έκλουσης της κινητής φάσης που δοκιµάστηκαν για τη µελέτη της ανθεκτικότητας της µεθόδου. Πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης 1 Πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης 2 t, min TFA CH 3 CN CH 3 OH t, min TFA CH 3 CN CH 3 OH (0.1% v/v) (0.1% v/v) (α) Σχήµα 13.12: Χρωµατογραφήµατα πρότυπων διαλυµάτων µίγµατος των δέκα κινολονών σε συγκέντρωση 5 ng/µl και IS εφαρµόζοντας τα προγράµµατα βαθµωτής έκλουσης της κινητής φάσης που δίνονται στον Πίνακα 13.4 α. πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης 1 και β. πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης 2 (1.CAF, 2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU). 173

187 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Σχήµα 13.12: Συνέχεια. (β) Μελέτη σταθερότητας Η σταθερότητα της µεθόδου ελέγχθηκε αρχικά στα πρότυπα διαλύµατα. Παρασκευάστηκαν πυκνά πρότυπα διαλύµατα συγκέντρωσης 100 ng/µl για την κάθε κινολόνη και διατηρήθηκαν στους +4 o C. Από τα πυκνά διαλύµατα παρασκευάστηκε µίγµα των δέκα κινολονών σε συγκέντρωση 5 ng/µl, που περιείχε και το εσωτερικό πρότυπο. Το µίγµα µετρήθηκε µε τη µέθοδο που αναπτύχθηκε την ίδια µέρα και στη συνέχεια διατηρήθηκε στους +4 o C, για τη µελέτη σταθερότητας του µίγµατος. Το µίγµα των δέκα κινολονών µετρήθηκε τις επόµενες δύο διαδοχικές ηµέρες και το µίγµα έδωσε όλο και µικρότερο σήµα απόκρισης για όλες τις κινολόνες, όπως φαίνεται και από το γράφηµα του Σχήµατος ιαπιστώθηκε πως τα αραιά διαλύµατα των κινολονών δεν παρέµεναν σταθερά παραπάνω από 24 ώρες ακόµα και στους +4 o C. Για το λόγο αυτό τα αραιά διαλύµατα παρασκευάζονταν καθηµερινά µε κατάλληλες αραιώσεις των αντίστοιχων πυκνών διαλυµάτων των κινολονών. 174

188 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Λόγος των εµβαδών της κάθε κινολόνης προς το εµβαδόν του IS ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Φρέσκο µίγµα Μίγµα στους +4oC ύστερα από 24 hrs Μίγµα στους +4oC ύστερα από 48 hrs Κινολόνες Σχήµα 13.13: Γράφηµα µελέτης της σταθερότητας αραιού µίγµατος των δέκα κινολονών στους +4 o C µέχρι 48 ώρες. Επίσης µελετήθηκε η σταθερότητα των πυκνών πρότυπων διαλυµάτων στους +4 o C. Από φρέσκα πρότυπα πυκνά διαλύµατα παρασκευάστηκε µίγµα των δέκα κινολονών σε συγκέντρωση 5 ng/µl, µε εσωτερικό πρότυπο το οποίο µετρήθηκε την ίδια µέρα. Στη συνέχεια από τα ίδια πυκνά πρότυπα διαλύµατα που διατηρούνταν στους +4 o C, παρασκευάστηκαν µίγµατα των δέκα κινολονών στην ίδια συγκέντρωση και µετρήθηκαν σε χρονικό διάστηµα µίας και δύο εβδοµάδων, ενός, δυο και τριών µηνών. Τα πυκνά διαλύµατα των επτά φθοροκινολονών ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR και SAR αποδείχθηκε πως παραµένουν σταθερά στους +4 o C για χρονικό διάστηµα δύο µηνών, ενώ τα πυκνά διαλύµατα των OXO, NAL και FLU στις ίδιες συνθήκες ήταν σταθερά µόνο για δύο εβδοµάδες. Τα παραπάνω αποτελέσµατα δίνονται γραφικά στο Σχήµα

189 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Λόγος των εµβαδών της κάθε κινολόνης προς το εµβαδόν του IS ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Κινολόνες Μίγµα από φρέσκα πυκνά διαλύµατα Μίγµα από πυκνά διαλύµατα µίας εβδοµάδας Μίγµα από πυκνά διαλύµατα δύο εβδοµάδων Μίγµα από πυκνά διαλύµατα δύο µηνών Μίγµατα από πυκνά διαλύµατα τριών µηνών Σχήµα 13.14: Γράφηµα µελέτης της σταθερότητας των πυκνών διαλυµάτων των κινολονών στους +4 o C για χρονικό διάστηµα τριών µηνών. Τέλος ελέγχθηκε η σταθερότητα εµβολιασµένων δειγµάτων των µελετώµενων ιστών µε µίγµα των δέκα κινολονών σε επίπεδο συγκέντρωσης 5 ng/µl για την κάθε κινολόνη µε εσωτερικό πρότυπο. Για το σκοπό αυτό τα δείγµατα των ιστών αναλύθηκαν αµέσως µετά τον εµβολιασµό και στη συνέχεια διατηρήθηκαν στους -20 o C. Αντιπροσωπευτικά δείγµατα αναλύθηκαν σε χρονικό διάστηµα ενός, δυο, τριών εβδοµάδων και ενός µήνα. Από τα αποτελέσµατα των µετρήσεων και όπως φαίνεται από το διάγραµµα του Σχήµατος 13.15, οι κινολόνες παρέµεναν σταθερές σε όλα τα µελετώµενα υποστρώµατα για µία µόνο εβδοµάδα. Επίσης δείγµατα εµβολιασµένα που διατηρούνταν στους -20 o C αναλύθηκαν για έξι διαδοχικούς κύκλους ψύξης και απόψυξης και αποδείχθηκε πως τα εµβολιασµένα δείγµατα παραµένουν σταθερά µόνο για τους τρεις πρώτους κύκλους ψύξης-απόψυξης (Σχήµα 13.16). 176

190 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Σχήµα 13.15: Γράφηµα µελέτης της σταθερότητας των εµβολιασµένων δειγµάτων µε µίγµα των δέκα κινολονών που συντηρούνται στους -20 o C. Ανακτήσεις (%) Κύκλοι ψύξης - απόψυξης ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Σχήµα 13.16: Γράφηµα µελέτης της σταθερότητας των εµβολιασµένων δειγµάτων µε µίγµα των δέκα κινολονών που συντηρούνται στους -20 o C, ως προς τους κύκλους ψύξης και απόψυξης των εµβολιασµένων δειγµάτων Χάραξη καµπυλών αναφοράς Για τον κάθε µελετώµενο ιστό χαράχτηκαν οι αντίστοιχες καµπύλες αναφοράς ώστε να συνυπολογιστούν στη χρωµατογραφική µέθοδο που αναπτύχθηκε τα πιθανά σφάλµατα που οφείλονται στο κάθε υπόστρωµα. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκαν δείγµατα του κάθε µυϊκού ιστού (βοοειδών, προβάτου και χοίρου) εµβολιασµένα µε πρότυπα διαλύµατα µίγµατος των δέκα κινολονών σε συγκεντρώσεις 0.5, 1.0, 2.0, 177

191 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο 5.0 και 10.0 ng/µl, µε εσωτερικό πρότυπο σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl. Για όλα τα δείγµατα ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο προκατεργασίας του Πίνακα Το κάθε δείγµα µετρήθηκε τρεις φορές και υπολογίστηκαν οι µέσοι όροι των τριών µετρήσεων. Στους πίνακες 13.5 έως 13.7 δίνονται τα αναλυτικά χαρακτηριστικά (κλίση, τεταγµένη επί την αρχή) για κάθε ένωση, οι τιµές των συντελεστών συσχέτισης r, το όριο ανίχνευσης της κάθε ένωσης µε την προτεινόµενη µέθοδο και το εύρος της γραµµικής περιοχής, για τα δείγµατα µυϊκού ιστού βοοειδών, προβάτου και χοίρου, αντίστοιχα. Η κατασκευή των καµπυλών βασίστηκε στο λόγο των εµβαδών των κορυφών που δίνουν οι ανακτώµενες ενώσεις κατά τη µέθοδο της προκατεργασίας, προς το εµβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου. Οι τιµές των ορίων ανίχνευσης υπολογίστηκαν χρησιµοποιώντας τη σχέση LOD = 3.3σ/S (σχέση 7.1) Πίνακας 13.5: Γραµµικότητα και ευαισθησία της προτεινόµενης µεθόδου, για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών, µε καφεΐνη ως εσωτερικό πρότυπο, σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl, σε δείγµατα βόειου µυϊκού ιστού. Ένωση Κλίση Τεταγµένη επί την r LOD Εύρος (ng -1 ) αρχή (µg/kg) (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ± ± ENR ± ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ±

192 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.6: Γραµµικότητα και ευαισθησία της προτεινόµενης µεθόδου, για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών, µε καφεΐνη ως εσωτερικό πρότυπο, σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl, σε δείγµατα πρόβειου µυϊκού ιστού. Ένωση Κλίση Τεταγµένη επί την r LOD Εύρος (ng -1 ) αρχή (µg/kg) (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ± ± ENR ± ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ± Πίνακας 13.7: Γραµµικότητα και ευαισθησία της προτεινόµενης µεθόδου, για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών, µε καφεΐνη ως εσωτερικό πρότυπο, σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl, σε δείγµατα χοίρειου µυϊκού ιστού. Ένωση Κλίση Τεταγµένη επί την r LOD Εύρος (ng -1 ) αρχή (µg/kg) (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ± ± ENR ± ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ±

193 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Μελέτη πιστότητας και ανάκτησης Για τη µελέτη της επαναληψιµότητας της µεθόδου αναλύθηκαν δείγµατα των τριών µελετώµενων ιστών εµβολιασµένα σε τρία επίπεδα συγκέντρωσης (ή τέσσερα για τις κινολόνες που ορίζεται το MRL) συµπεριλαµβανοµένου και του επιπέδου του LOQ. Το κάθε επίπεδο συγκέντρωσης αναλύθηκε έξι φορές στη διάρκεια µίας ηµέρας. Επίσης για τον έλεγχο της πιστότητας της µεθόδου για τον κάθε ιστό, δείγµατα των τριών ιστών εµβολιασµένα στα ίδια επίπεδα συγκέντρωσης αναλύθηκαν για έξι διαφορετικές ηµέρες. Την κάθε µέρα παρασκευάζονταν και αναλύονταν τρία δείγµατα για τον κάθε ιστό. Παράλληλα µε της µετρήσεις της πιστότητας υπολογίστηκε η ανάκτηση της µεθόδου για τον κάθε µελετώµενο µυϊκό ιστό. Σύµφωνα µε την απόφαση 2002/657/EC, όταν για τα µελετώµενα υποστρώµατα δεν υπάρχουν διαθέσιµα υλικά αναφοράς, η µελέτη της ανάκτησης γίνεται σε εµβολιασµένα δείγµατα σε επίπεδα συγκέντρωσης των προσδιοριζόµενων ενώσεων 0.5, 1 και 1.5 φορά το επιτρεπόµενο όριο. Ακόµα για τις ενώσεις που ορίζεται το MRL, η ανάκτηση υπολογίστηκε στο επίπεδο συγκέντρωσης LOQ για τον κάθε ιστό. Ενώ για τις ενώσεις που δεν έχει οριστεί MRL η ανάκτηση υπολογίστηκε στο αντίστοιχο επίπεδο LOQ και σε δύο ακόµα συγκεντρώσεις. Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων της πιστότητας και της ανάκτησης της χρωµατογραφικής µεθόδου για δείγµατα µυϊκού ιστού µοσχαρίσιου, πρόβειου και χοιρινού κρέατος δίνονται στους πίνακες 13.8 έως αντίστοιχα. Οι ανακτήσεις της χρωµατογραφικής µεθόδου κυµαίνονται µεταξύ 96.3% και 101.6% για µυϊκό ιστό βοοειδών, µεταξύ 98.2% και 107.4% για µυϊκό ιστό προβάτου και µεταξύ 92.0% και 102.8% για µυϊκό ιστό χοίρων. Στους πίνακες 13.8 έως υπολογίζονται επίσης οι τιµές της σχετικής απόκλισης για όλες τις µετρήσεις της πιστότητας. 180

194 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.8: α. Μελέτη της επαναληψιµότητας της µεθόδου σε δείγµατα µυϊκού ιστού βοοειδών. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) Ανάκτηση (%) RSD ιάρκεια µίας ηµέρας (n=6) ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± * 200.8± ± ENR ± ± * 99.2± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 199.0± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 181

195 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.8: β. Μελέτη της πιστότητας της µεθόδου για έξι ηµέρες, µε τρεις µετρήσεις ανά ηµέρα, σε δείγµατα µυϊκού ιστού βοοειδών. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) Ανάκτηση (%) RSD ιάρκεια έξι ηµερών ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± * 200.2± ± ENR ± ± * 99.2± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 199.8± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 182

196 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.9: α. Μελέτη της επαναληψιµότητας της µεθόδου σε δείγµατα µυϊκού ιστού προβάτου. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια µίας ηµέρας (n=6) ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± ± ENR ± ± * 100.0± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 200.5± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 183

197 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.9: β. Μελέτη της πιστότητας της µεθόδου για έξι ηµέρες, µε τρεις µετρήσεις ανά ηµέρα, σε δείγµατα µυϊκού ιστού προβάτου. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια έξι ηµερών ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± ± ENR ± ± * 101.0± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 200.9± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 184

198 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.10: α. Μελέτη της επαναληψιµότητας της µεθόδου σε δείγµατα µυϊκού ιστού χοίρου. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια µίας ηµέρας (n=6) ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± * 101.5± ± ENR ± ± * 101.1± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 195.8± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 185

199 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.10: β. Μελέτη της πιστότητας της µεθόδου για έξι ηµέρες, µε τρεις µετρήσεις ανά ηµέρα, σε δείγµατα µυϊκού ιστού χοίρου. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια έξι ηµερών ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± * 97.7± ± ENR ± ± * 96.4± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 195.3± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 186

200 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Υπολογισµός του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης Η µέτρηση του ορίου απόφασης CC α έγινε αντίστοιχα και για τα τρία είδη των µελετώµενων ιστών. Μετρήθηκαν δείγµατα εµβολιασµένα στο αντίστοιχο επίπεδο LOQ και στο MRL, για τις κινολόνες που αυτό ορίζεται από τον Ευρωπαϊκό Κανονισµό 2377/90/EEC. Ο υπολογισµός των CC α έγινε προσθέτοντας στην ανακτηµένη ποσότητα της κάθε κινολόνης από τα εµβολιασµένα δείγµατα, ποσότητα ίση µε 1.64 φορές την τυπική απόκλιση των µετρήσεων των αντίστοιχων δειγµάτων. Για τη µέτρηση της ικανότητας ανίχνευσης CC β δείγµατα του κάθε µυϊκού ιστού εµβολιάστηκαν στο επίπεδο CC α της αντίστοιχης µεθόδου. Ο υπολογισµός των CC β έγινε προσθέτοντας στην ανακτηµένη ποσότητα της κάθε κινολόνης από τα εµβολιασµένα δείγµατα, ποσότητα ίση µε 1.64 φορές την τυπική απόκλιση των µετρήσεων των αντίστοιχων δειγµάτων. Η στατιστική ανάλυση για τον υπολογισµό των CC α και CC β έγινε σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%. Για το κάθε υπόστρωµα ετοιµάστηκαν είκοσι δείγµατα τα οποία µετρήθηκαν από τρεις φορές. Τα αποτελέσµατα των παραπάνω υπολογισµών δίνονται στους πίνακες έως για τους µυϊκούς ιστούς βοοειδών, προβάτου και χοίρου, αντίστοιχα. 187

201 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.11: Υπολογισµός του ορίου απόφασης (CC α ) και της ικανότητας ανίχνευσης (CC β ) στο επίπεδο LOQ και στο MRL, για τις κινολόνες που έχει οριστεί σε βόειο µυϊκό ιστό. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ±SD (µg/kg) Σφάλµα α (1.64*SD) CC α (µg/kg) Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. Μετρηθείσα ποσότητα ±SD (µg/kg) Σφάλµα β (1.64*SD) ENO ± ± CC β (µg/kg) OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN * ± * * ± * ENR ± ± * ± * * ± * SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± ± ± FLU * ± * * ± * 188

202 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.12: Υπολογισµός του ορίου απόφασης (CC α ) και της ικανότητας ανίχνευσης (CC β ) στο επίπεδο LOQ και στο MRL, για τις κινολόνες που έχει οριστεί, σε πρόβειο µυϊκό ιστό. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ±SD (µg/kg) Σφάλµα α (1.64*SD) CC α ( µg/kg ) Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ±SD (µg/kg) Σφάλµα β (1.64*SD) CC β ( µg/kg ) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ± ± ENR ± ± * ± * * ± * SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± ± ± FLU * ± * * ± * * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 189

203 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο Πίνακας 13.13: Υπολογισµός του ορίου απόφασης (CC α ) και της ικανότητας ανίχνευσης (CC β ) στο επίπεδο LOQ και στο MRL, για τις κινολόνες που έχει οριστεί, σε χοίρειο µυϊκό ιστό. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ±SD (µg/kg) Σφάλµα α (1.64*SD) CC α ( µg/kg) Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ±SD (µg/kg) Σφάλµα β (1.64*SD) CC β ( µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN * ± * * ± * ENR ± ± * 99.36± * * ± * SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± ± ± FLU * ± * * ± * * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 190

204 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 13 ο 13.6 Σύγκριση της χρωµατογραφικής µεθόδου µεταξύ των διαφορετικών ιστών Χρησιµοποιώντας την ανάλυση παλινδρόµησης συγκρίθηκαν οι καµπύλες αναφοράς της κάθε κινολόνης µεταξύ των τριών µελετώµενων ιστών, χρησιµοποιώντας το πρόγραµµα Excel. Όλα τα δεδοµένα συγκρίθηκαν σε οµάδες ανά δύο, δηλαδή έγινε σύγκριση της καµπύλης αναφοράς για κάθε κινολόνη µεταξύ δύο διαφορετικών ιστών. Στον άξονα x τοποθετήθηκαν τα αποτελέσµατα διαφορετικών συγκεντρώσεων, όπως προέκυψαν από τη µια µέθοδο και στον άξονα y τα αποτελέσµατα των αντίστοιχων συγκεντρώσεων, όπως προέκυψαν από τη δεύτερη µέθοδο. Οπότε κάθε σηµείο πάνω στο γράφηµα παριστάνει ένα δείγµα που έχει µετρηθεί και µε τις δύο µεθόδους. Η ανάλυση παλινδρόµησης έγινε για επίπεδο εµπιστοσύνης 95%. Από την επεξεργασία των πειραµατικών αποτελεσµάτων προκύπτει πως το τυπικό σφάλµα της τεταγµένης επί την αρχή για όλες τις συγκρίσεις τείνει στο µηδέν και το τυπικό σφάλµα της κλίσης επίσης για όλες τις συγκρίσεις είναι κοντά στη µονάδα. Από τα αποτελέσµατα της ανάλυσης παλινδρόµησης προέκυψε πως οι καµπύλες αναφοράς που χαράχτηκαν για τον κάθε µελετώµενο ιστό µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ανάλυση όλων των σχετικών δειγµάτων, µε αποδεκτό ποσοστό σφάλµατος Εφαρµογή της µεθόδου για ανάλυση αντίστοιχων δειγµάτων µυϊκών ιστών Με τη χρωµατογραφική µέθοδο που αναπτύχθηκε για µυϊκό ιστό βοοειδών, προβάτου και χοίρου αναλύθηκαν δείγµατα και από τις τρεις κατηγορίες. Εφαρµόστηκε για όλα τα δείγµατα το πρωτόκολλο προκατεργασίας που δίνεται στον Πίνακα 13.3 και για την ανάλυση των δειγµάτων εφαρµόστηκε η χρωµατογραφική µέθοδος, τα χαρακτηριστικά της οποίας, δίνονται στον Πίνακα Από τον κάθε µελετώµενο µυϊκό ιστό αναλύθηκαν εννέα δείγµατα επιλεγµένα από παραγωγούς διαφόρων περιοχών της Βόρειας Ελλάδας. Σε κανένα από τα δείγµατα που αναλύθηκαν και για κανέναν από τους µελετώµενους ιστούς δε βρέθηκαν κατάλοιπα των προσδιοριζόµενων κινολονών, από πιθανή χορήγησή τους στο ζώο. 191

205 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο 14. ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΕΚΑ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΕΙΓΜΑΤΑ ΜΥΪΚΟΥ ΙΣΤΟΥ ΠΟΥΛΕΡΙΚΩΝ ΚΑΙ ΣΕ ΚΡΟΚΟ ΑΥΓΟΥ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ 2002/657/EC 14.1 Εισαγωγή Στο τµήµα αυτό της διδακτορικής διατριβής δύο διαφορετικές χρωµατογραφικές µέθοδοι αναπτύχθηκαν για τον προσδιορισµό των δέκα µελετώµενων κινολονών (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών και σε κρόκο αυγού. Η µελέτη έγινε σε δείγµατα εµβολιασµένα µε πρότυπο διάλυµα µίγµατος των δέκα κινολονών γνωστής συγκέντρωσης. Η εκλεκτική αποµόνωση των κινολονών και στα δύο υποστρώµατα έγινε σε πρώτη φάση µε εκχύλιση στερεού-υγρού και στη συνέχεια ακολούθησε καθαρισµός των δειγµάτων µε εφαρµογή της εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE). Η ουσιαστική διαφορά µεταξύ των µεθόδων είναι ότι αναπτύχθηκαν σε δύο διαφορετικά συστήµατα HPLC και ότι διαφέρουν στο πρωτόκολλο εκχύλισης των κινολονών από τα µελετώµενα υποστρώµατα. Οι χρωµατογραφικές µέθοδοι που αναπτύχθηκαν επικυρώθηκαν σύµφωνα µε τα κριτήρια που ορίζει η απόφαση της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2002/657/EC. Η επικύρωσή τους αφορά στις παραµέτρους: εκλεκτικότητα, αντοχή, σταθερότητα, γραµµικότητα, ανακτήσεις, πιστότητα, όριο απόφασης και ικανότητα ανίχνευσης. Αντιπροσωπευτικά δείγµατα από τα δύο υποστρώµατα αναλύθηκαν µε τις αντίστοιχες χρωµατογραφικές µεθόδους που αναπτύχθηκαν Πρότυπα διαλύµατα Η παρασκευή των πυκνών πρότυπων διαλυµάτων και των αραιώσεών τους έγινε όπως ακριβώς περιγράφεται στο κεφάλαιο Στην αρχή της µελέτης του κάθε υποστρώµατος παρασκευάζονταν τα πυκνά διαλύµατα όλων των ενώσεων. Εκτός από το πυκνά διαλύµατα των ΟΧΟ, NAL και FLU, τα οποία παρασκευάζονταν κάθε τρίτη εβδοµάδα. 192

206 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο 14.3 Χρωµατογραφικές συνθήκες Η µέθοδος που εφαρµόστηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό των δέκα κινολονών σε δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών είναι όµοια µε τη µέθοδο που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισµό των ίδιων κινολονών σε δείγµατα µυϊκού ιστού βοοειδών, προβάτου και χοίρου. Τα χαρακτηριστικά της µεθόδου περιγράφονται αναλυτικά στο προηγούµενο κεφάλαιο και δίνονται συνοπτικά στον Πίνακα Η µέθοδος που εφαρµόστηκε για τον προσδιορισµό των µελετώµενων κινολονών σε δείγµατα κρόκου αυγού αναπτύχθηκε στο δεύτερο σύστηµα HPLC. οκιµάστηκε η µεταφορά της µεθόδου από το ένα σύστηµα στο άλλο, άλλα οι χρόνοι έκλουσης των µελετώµενων κινολονών και του εσωτερικού προτύπου διέφεραν σηµαντικά. Για το σκοπό αυτό µετρήθηκε ο όγκος συστήµατος των δύο οργάνων (dwell volume) ακολουθώντας τα βήµατα 1 έως 6 που περιγράφονται στην παράγραφο Στα Σχήµατα 14.1 και 14.2 δίνονται τα «χρωµατογραφήµατα» που προέκυψαν από τη µέτρηση του όγκου συστήµατος των δύο διατάξεων HPLC 1 και 2, αντίστοιχα. Εφαρµόζοντας τον τύπο 5.6 (σελ. 66) ο όγκος συστήµατος της διάταξης HPLC 1 υπολογίζεται σε 10.5 ml και ο όγκος της διάταξης HPLC 2 υπολογίζεται σε 1.6 ml. Στη διαφορά αυτή των όγκων οφείλεται η διαφορά στους χρόνους συγκράτησης των µελετώµενων ενώσεων µεταξύ των δύο οργάνων. Με βάση την κινητή φάση που χρησιµοποιήθηκε στη διάταξη HPLC 1 έγινε η µελέτη για την εύρεση του βέλτιστου προγράµµατος έκλουσης της κινητής φάσης στη διάταξη HPLC 2. Τα χαρακτηριστικά της µεθόδου που αναπτύχθηκε για τον ταυτόχρονο διαχωρισµό των δέκα κινολονών στη διάταξη HPLC 2 δίνονται στον Πίνακα Στο Σχήµα 14.3 δίνεται αντιπροσωπευτικό χρωµατογράφηµα πρότυπου µίγµατος των δέκα κινολονών σε συγκέντρωση 5 ng/µl µαζί µε εσωτερικό πρότυπο. Όπως φαίνεται από το χρωµατογράφηµα η ανάλυση ολοκληρώνεται σε περίπου 27 min. 193

207 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Πίνακας 14.1: Βέλτιστες χρωµατογραφικές συνθήκες στη διάταξη HPLC 1, για τον προσδιορισµό κινολονών σε υπόστρωµα µυϊκού ιστού πουλερικών. Παράµετρος Βέλτιστες συνθήκες ιάταξη HPLC 1 HPLC σύστηµα Shimadzu, µε αντλία LC-9A βαθµωτής έκλουσης και ανιχνευτή PDA SPD-M6A Χρωµατογραφική στήλη C 18 PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4 mm, 3&5 µm) Κινητή φάση Μίγµα Α: TFA 0.1% v/v, B: CH 3 CN και C: CH 3 OH Πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης t (min) Α(%) Β(%) C(%) Ροή κινητής φάσης 1.2 ml/min Μήκος κύµατος ανίχνευσης ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR: 275 nm OXO, NAL, FLU: 255 nm Θερµοκρασία φούρνου 25 o C Αρχική πίεση αντλίας ~330 kg/cm 2 Όγκος αναλυόµενου δείγµατος 50 µl Εσωτερικό πρότυπο Καφεΐνη 7.5 ng/µl 194

208 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Σύστηµα 1: LC-9A Shimadzu t D = min Σχήµα 14.1: «Χρωµατογράφηµα» του όγκου συστήµατος της διάταξης HPLC 1. Σύστηµα 2: LC-10AD VP Shimadzu t D = 1.60 min Σχήµα 14.2: «Χρωµατογράφηµα» του όγκου συστήµατος της διάταξης HPLC

209 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Πίνακας 14.2: Βέλτιστες χρωµατογραφικές συνθήκες στη διάταξη HPLC 2, για τον προσδιορισµό κινολονών σε υπόστρωµα κρόκου αυγού. Παράµετρος ιάταξη HPLC 2 Βέλτιστες συνθήκες HPLC σύστηµα Shimadzu, µε αντλία LC- 10AD VP βαθµωτής έκλουσης και ανιχνευτή PDA SPD-M10A VP Χρωµατογραφική στήλη C 18 PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4 mm, 3&5 µm) Κινητή φάση Μίγµα Α: TFA 0.1% v/v, B: CH 3 CN και C: CH 3 OH Πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης t (min) Α(%) Β(%) C(%) Ροή κινητής φάσης 1.2 ml/min Μήκος κύµατος ανίχνευσης ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR: 275 nm OXO, NAL, FLU: 255 nm Θερµοκρασία φούρνου 25 o C Αρχική πίεση αντλίας ~ kg/cm 2 Όγκος αναλυόµενου δείγµατος 20 µl Εσωτερικό πρότυπο Καφεΐνη 7.5 ng/µl 196

210 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο (α) (β) Σχήµα 14.3: Αντιπροσωπευτικό χρωµατογράφηµα πρότυπου µίγµατος των δέκα κινολονών σε συγκέντρωση 5 ng/µl µε καφεΐνη ως εσωτερικό πρότυπο σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl (1..IS, 2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU), σε µήκος κυµατος (α) 275nm και (β) 255 nm. 197

211 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Στον Πίνακα 14.3 δίνονται συγκεντρωτικά οι χρόνοι συγκράτησης των δέκα κινολονών στις δύο διατάξεις HPLC αντίστοιχα. Ακόµα υπολογίζονται οι τιµές της διακριτικής ικανότητας µεταξύ των διαδοχικών κορυφών. Ο συνολικός χρόνος της ανάλυσης στα δύο συστήµατα διαφέρει περίπου 8 min, χρόνος συγκρίσιµος µε τη διαφορά στο νεκρό όγκο µεταξύ των δύο οργάνων ( = 8.86 min). Πίνακας 14.3: Χρόνοι συγκράτησης και τιµές διακριτικής ικανότητας των µελετώµενων δέκα κινολονών στις διατάξεις HPLC 1 και 2. HPLC διάταξη 1 HPLC διάταξη 2 ιακριτική Χρόνοι ικανότητα συγκράτησης Χρόνοι συγκράτησης (min) ιακριτική ικανότητα (min) CAF(IS) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Συνολικός χρόνος ανάλυσης Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για την προκατεργασία των δειγµάτων Προκατεργασία δειγµάτων µυϊκού ιστού πουλερικών Η προκατεργασία των δειγµάτων µυϊκού ιστού των πουλερικών γίνεται εφαρµόζοντας το πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε στο κεφάλαιο 13 και περιγράφεται στον Πίνακα Οι ανακτήσεις των µελετώµενων κινολονών από υπόστρωµα µυϊκού ιστού πουλερικών εφαρµόζοντας το προτεινόµενο πρωτόκολλο κυµαίνονται µεταξύ 96 και 103%. Στα Σχήµατα 14.4 (α, β) δίνονται αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα λευκού και εµβολιασµένου δείγµατος µυϊκού ιστού πουλερικού, αντίστοιχα. 198

212 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο (α) (β) Σχήµα 14.4: α. Χρωµατογράφηµα λευκού δείγµατος µυϊκού ιστού πουλερικού, και β. Χρωµατογράφηµα δείγµατος µυϊκού ιστού πουλερικού, εµβολιασµένο µε µίγµα των δέκα κινολονών (2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU) σε συγκέντρωση 5 ng/µl και IS (1), σε µήκος κύµατος 275 nm Προκατεργασία δειγµάτων κρόκου αυγού Ο διαλύτης εκχύλισης TFA 0.1% v/v σε CH 3 OH που χρησιµοποιήθηκε για την εκχύλιση των µελετώµενων κινολονών από τα υπόλοιπα υποστρώµατα δεν έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσµατα στα δείγµατα του κρόκου αυγού. Επίσης δοκιµάστηκαν 199

213 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο και άλλα όξινα συστήµατα εκχύλισης, όπως TFA 1% v/v σε CH 3 CN, CH 3 COOH 2% v/v σε CH 3 CN, και διάλυµα HCl 1 M, αλλά κανένα από τα παραπάνω δεν έδωσε ανακτήσεις µεγαλύτερες από 55%. Έτσι, δοκιµάστηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις NaOH σε νερό και σε οργανικούς διαλύτες. Τα αποτελέσµατα των δοκιµών αυτών συνοψίζονται στον Πίνακα Από τα πρωτόκολλα που δοκιµάστηκαν τις υψηλότερες ανακτήσεις έδωσε το πρωτόκολλο 8, εξασφαλίζοντας αρκετά καθαρά τελικά δείγµατα. Όλες οι δοκιµές έγιναν µε 4 ml διαλύτη εκχύλισης και η εκχύλιση επαναλήφθηκε δύο φορές. Στη συνέχεια το δείγµα υποβαλλόταν σε επιπλέον καθαρισµό µέσω SPE. Το τελικό πρωτόκολλο προκατεργασίας των δειγµάτων κρόκου αυγού δίνεται στον Πίνακα

214 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Πίνακας 14.4: Εύρεση ου βέλτιστου διαλύτη εκχύλισης, για την παραλαβή των µελετώµενων κινολονών από το υπόστρωµα του κρόκου αυγού. Πρωτόκολλο ιαλύτης Ανακτήσεις (%) εκχύλισης ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU 1 0.5M NaOH M NaOH M NaOH M NaOH σε CH 3 OH M NaOH σε CH 3 OH M NaOH σε CH 3 OH M NaOH σε CH 3 CN M NaOH σε CH 3 CN M NaOH σε CH 3 CN

215 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Πίνακας 14.5: Στάδια προκατεργασίας δειγµάτων κρόκου αυγού, για την ταυτόχρονη εκχύλιση των δέκα κινολονών. Στάδια Λεπτοµέρειες 1 ο Εµβολιασµός ± g δείγµατος κρόκου µε 200 µl µίγµατος των δέκα κινολονών και του IS. 2 ο Προσθήκη 4 ml διαλύµατος NaOH 0.75 M σε CH 3 CN, ανάδευση σε συσκευή vortex, παραµονή σε ηρεµία στο σκοτάδι για 10 min, εφαρµογή υπερήχων για 15 min και φυγοκέτρηση στις 3500 rpm (800 g) για 10 min. Παραλαβή του υπερκείµενου. 3 ο Επανεκχύλιση του στερεού υπολείµµατος επαναλαµβάνοντας το 2 ο στάδιο. Το υπερκείµενο που παραλαµβάνεται από το στάδιο της φυγοκέντρησης ενώνεται σε δοκιµαστικό σωλήνα µε αυτό της 1 ης εκχύλισης. 4 ο Εξάτµιση του οργανικού διαλύτη εκχύλισης σε ρεύµα Ν 2 και επαναδιάλυση του ξηρού υπολείµµατος σε 2 ml υδατικού διαλύµατος TFA 0.1% v/v. 5 ο Εφαρµογή του διαλύµατος εκχύλισης σε µικροστήλες Lichrolut RP-18, ενεργοποιηµένες µε 2 ml νερό και 2 ml CH 3 OH. 6 ο Παραλαβή των προσδιοριζόµενων κινολονών µε 1.5 ml TFA 0.1 % v/v σε CH 3 CN και σε 0.5 ml CH 3 CN. 7 ο Εξάτµιση του διαλύτη σε ρεύµα Ν 2 µέχρι ξηρού. 8 ο Επαναδιάλυση του δείγµατος σε 200 µl υδατικού διαλύµατος TFA 0.1% v/v 9 ο Έγχυση 20 µl δείγµατος στην HPLC. Στα Σχήµατα 14.5 (α, β) δίνονται αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα λευκού και εµβολιασµένου δείγµατος κρόκου αυγού, αντίστοιχα, τα οποία έχουν υποστεί προκατεργασία σύµφωνα µε το πρωτόκολλο του Πίνακα

216 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο (α) (β) Σχήµα 14.5: α. Χρωµατογράφηµα λευκού δείγµατος κρόκου αυγού. β. Χρωµατογράφηµα δείγµατος κρόκου αυγού, εµβολιασµένο µε µίγµα των δέκα κινολονών (2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU) σε συγκέντρωση 5 ng/µl και IS (1), σε µήκος κύµατος 275 nm. 203

217 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο 14.5 Επικύρωση χρωµατογραφικής µεθόδου Οι µέθοδοι που αναπτύχθηκαν επικυρώθηκαν σύµφωνα µε τα κριτήρια που ορίζονται από την απόφαση της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2002/657/EC. Για τα στάδια της επικύρωσης, που αφορούν τη µελέτη της ανθεκτικότητας και τη µελέτη της σταθερότητας ισχύουν τα αποτελέσµατα της έρευνας που έγινε στα κεφάλαια και Παρακάτω περιγράφονται αναλυτικά τα υπόλοιπα στάδια της επικύρωσης και σχολιάζονται τα αποτελέσµατα που προκύπτουν από την κάθε δοκιµή Έλεγχος εκλεκτικότητας Προκείµενου να ελεγχθούν οι δύο µέθοδοι που αναπτύχθηκαν σχετικά µε την εκλεκτικότητά τους, λευκά δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών και λευκά δείγµατα κρόκων αυγού, αναλύθηκαν µε τις αντίστοιχες µεθόδους. Για το κάθε υπόστρωµα αναλύθηκαν πέντε διαφορετικά δείγµατα, διαφορετικών παραγωγών, προκειµένου να αποδειχθεί ότι δεν υπάρχουν παρεµποδίσεις που να οφείλονται στα µελετώµενα υποστρώµατα. Οι κορυφές που εκλούονται στα λευκά δείγµατα που αναλύθηκαν δεν παρεµποδίζουν σε κανένα από τα δύο µελετώµενα υποστρώµατα τις προσδιοριζόµενες κινολόνες. Αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα λευκών δειγµάτων µυϊκού ιστού πουλερικού και κρόκου αυγού δίνονται στα Σχήµατα 14.4(α) και 14.5(α), αντίστοιχα. Η προκατεργασία των δειγµάτων έγινε σύµφωνα µε τα πρωτόκολλα που δίνονται στους πίνακες 13.3 και Όπως φαίνεται από τα δύο χρωµατογραφήµατα υπάρχουν κορυφές οι οποίες οφείλονται στα υποστρώµατα, αλλά δεν παρεµποδίζουν τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών Χάραξη καµπυλών αναφοράς Για τα δύο υποστρώµατα χαράχτηκαν οι καµπύλες αναφοράς ώστε να συνυπολογιστούν στις χρωµατογραφικές µεθόδους που αναπτύχθηκαν τα πιθανά σφάλµατα που οφείλονται στο κάθε υπόστρωµα. είγµατα του µυϊκού ιστού πουλερικών εµβολιάστηκαν µε πρότυπα διαλύµατα µίγµατος των δέκα κινολονών σε συγκεντρώσεις 0.3, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0 και 15.0 ng/µl, µε εσωτερικό πρότυπο σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl. Για όλα τα δείγµατα 204

218 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο προκατεργασίας του Πίνακα Το κάθε δείγµα µετρήθηκε τρεις φορές και υπολογίστηκαν οι µέσοι όροι των τριών µετρήσεων. Στον Πίνακα 14.6 δίνονται τα αναλυτικά χαρακτηριστικά (κλίση, τεταγµένη επί την αρχή) για κάθε ένωση, οι τιµές των συντελεστών συσχέτισης r, το όριο ανίχνευσης της κάθε ένωσης µε την προτεινόµενη µέθοδο και το εύρος της γραµµικής περιοχής. Η κατασκευή των καµπυλών βασίστηκε στο λόγο των εµβαδών των κορυφών που δίνουν οι ανακτώµενες ενώσεις κατά τη µέθοδο της προκατεργασίας, προς το εµβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου. Οι τιµές των ορίων ανίχνευσης υπολογίστηκαν χρησιµοποιώντας τη σχέση LOD = 3.3σ/S (σχέση 7.1). Πίνακας 14.6: Γραµµικότητα και ευαισθησία της προτεινόµενης µεθόδου, για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών, µε καφεΐνη ως εσωτερικό πρότυπο, σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl, σε δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών. Ένωση Κλίση Τεταγµένη επί την r LOD Εύρος (ng -1 ) αρχή (µg/kg) (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ± ± ENR ± ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ± Για τη χάραξη των καµπυλών αναφοράς στα δείγµατα κρόκου αυγού, τα µελετώµενα δείγµατα εµβολιάστηκαν µε πρότυπα διαλύµατα µίγµατος των δέκα κινολονών σε συγκεντρώσεις 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0 και 25.0 ng/µl, µε εσωτερικό πρότυπο σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl. Για όλα τα δείγµατα ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο προκατεργασίας του Πίνακα Το κάθε δείγµα µετρήθηκε τρεις φορές και υπολογίστηκαν οι µέσοι όροι των τριών µετρήσεων. Στον Πίνακα 14.7 δίνονται οι ευθείες ελαχίστων τετραγώνων για κάθε ένωση, οι τιµές των 205

219 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο συντελεστών συσχέτισης r, το όριο ανίχνευσης της κάθε ένωσης µε την προτεινόµενη µέθοδο και το εύρος της γραµµικής περιοχής. Η κατασκευή των καµπυλών βασίστηκε στο λόγο των εµβαδών των κορυφών που δίνουν οι ανακτώµενες ενώσεις κατά τη µέθοδο της προκατεργασίας, προς το εµβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου. Οι τιµές των ορίων ανίχνευσης υπολογίστηκαν χρησιµοποιώντας τη σχέση LOD = 3.3σ/S (σχέση 7.1). Πίνακας 14.7: Γραµµικότητα και ευαισθησία της προτεινόµενης µεθόδου, για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών, µε καφεΐνη ως εσωτερικό πρότυπο, σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl, σε δείγµατα κρόκου αυγού. Ένωση Κλίση Τεταγµένη επί την r LOD Εύρος (ng -1 ) αρχή (µg/kg) (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ± ± ENR ± ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ± Μελέτη πιστότητας και ανάκτησης Η επαναληψιµότητα της κάθε µεθόδου ελέγχθηκε αναλύοντας δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών και κρόκου αυγού εµβολιασµένα σε τρία επίπεδα συγκέντρωσης (ή τέσσερα για τις κινολόνες που ορίζεται το MRL) συµπεριλαµβανοµένου και του επιπέδου LOQ. Το κάθε επίπεδο συγκέντρωσης αναλύθηκε έξι φορές στη διάρκεια µίας ηµέρας. Επίσης για τον έλεγχο της πιστότητας της κάθε µεθόδου, δείγµατα των δύο υποστρωµάτων εµβολιασµένα στα ίδια επίπεδα συγκέντρωσης αναλύθηκαν για 206

220 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο έξι διαφορετικές ηµέρες. Την κάθε µέρα ετοιµάζονταν και αναλύονταν τρία δείγµατα για τον κάθε ιστό. Παράλληλα υπολογίστηκε η ανάκτηση της µεθόδου για το κάθε υπόστρωµα, σε επίπεδα συγκέντρωσης των προσδιοριζόµενων ενώσεων 0.5, 1 και 1.5 φορά το επιτρεπόµενο όριο, όπως ορίζεται από την απόφαση 2002/657/EC, για τα υποστρώµατα που δεν υπάρχουν διαθέσιµα υλικά αναφοράς. Ακόµα για τις ενώσεις που ορίζεται το MRL η ανάκτηση υπολογίστηκε στο επίπεδο συγκέντρωσης LOQ. Για τις ενώσεις που δεν έχει οριστεί MRL η ανάκτηση υπολογίστηκε στο αντίστοιχο επίπεδο LOQ και σε δύο επιπλέον συγκεντρώσεις. Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων της πιστότητας και της ανάκτησης της χρωµατογραφικής µεθόδου για τα δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών και για τον κρόκο αυγού δίνονται στους πίνακες 14.8(α, β) και 14.9(α, β) αντίστοιχα. Οι ανακτήσεις της χρωµατογραφικής µεθόδου κυµαίνονται µεταξύ 96.7% και 102.8% για µυϊκό ιστό πουλερικών και µεταξύ 96.4% και 102.8% για τον κρόκο αυγού. Στους πίνακες 14.8 έως 14.9 υπολογίζονται επίσης οι τιµές της σχετικής απόκλισης για όλες τις µετρήσεις της πιστότητας. 207

221 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Πίνακας 14.8: α. Μελέτη της επαναληψιµότητας της µεθόδου σε δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια µίας ηµέρας (n=6) ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± * 200.8± ± ENR ± ± * 99.8± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 399.0± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 208

222 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Πίνακας 14.8: β. Μελέτη της πιστότητας της µεθόδου για έξι ηµέρες, µε τρεις µετρήσεις ανά ηµέρα, σε δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια έξι ηµερών ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± * 200.2± ± ENR ± ± * 99.2± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 399.8± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 209

223 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Πίνακας 14.9: α. Μελέτη της επαληψιµότητας της µεθόδου σε δείγµατα κρόκου αυγού. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια µίας ηµέρας (n=6) ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± ± ENR ± ± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. 210

224 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Πίνακας 14.8: β. Μελέτη της πιστότητας της µεθόδου για έξι ηµέρες, µε τρεις µετρήσεις ανά ηµέρα, σε δείγµατα κρόκου αυγού. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια έξι ηµερών ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± ± ENR ± ± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων Υπολογισµός του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης Το όριο απόφασης CC α µετρήθηκε για τις δύο µεθόδους που αναπτύχθηκαν, µε υποστρώµατα µυϊκό ιστό πουλερικών και κρόκου αυγού, αντίστοιχα. Ο µετρήσεις έγιναν σε δείγµατα εµβολιασµένα στο αντίστοιχο επίπεδο LOQ και στο MRL, για τις κινολόνες που αυτό ορίζεται από τον Ευρωπαϊκό Κανονισµό 2377/90/EEC. Ο 211

225 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο υπολογισµός των CC α έγινε προσθέτοντας στην ανακτηµένη ποσότητα της κάθε κινολόνης από τα εµβολιασµένα δείγµατα, ποσότητα ίση µε 1.64 φορές την τυπική απόκλιση των µετρήσεων των αντίστοιχων δειγµάτων. Επίσης µετρήθηκε η ικανότητα ανίχνευσης CC β των δύο µεθόδων. Τα δείγµατα που µετρήθηκαν εµβολιάστηκαν στο επίπεδο CC α της κάθε µεθόδου. Ο υπολογισµός των CC β έγινε προσθέτοντας στην ανακτηµένη ποσότητα της κάθε κινολόνης από τα εµβολιασµένα δείγµατα, ποσότητα ίση µε 1.64 φορές την τυπική απόκλιση των µετρήσεων των αντίστοιχων δειγµάτων. Η στατιστική ανάλυση για τον υπολογισµό των CC α και CC β έγινε σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%. Για το κάθε υπόστρωµα ετοιµάστηκαν είκοσι δείγµατα τα οποία µετρήθηκαν από τρεις φορές. Τα αποτελέσµατα των υπολογισµών αυτών για τον µυϊκό ιστό πουλερικών και για τον κρόκο αυγού, δίνονται στους πίνακες 14.9 και Εφαρµογή της µεθόδου για ανάλυση αντίστοιχων δειγµάτων Με τη χρωµατογραφική µέθοδο που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισµό κινολονών σε µυϊκό ιστό πουλερικών και µε τη µέθοδο που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισµό κινολονών σε κρόκου αυγού αναλύθηκαν αντιπροσωπευτικά δείγµατα από τα δύο µελετώµενα υποστρώµατα. Για τα δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών εφαρµόστηκε το πρωτόκολλο προκατεργασίας που δίνεται στον Πίνακα 13.3 και για την ανάλυση των δειγµάτων εφαρµόστηκε η χρωµατογραφική µέθοδος, τα χαρακτηριστικά της οποίας, δίνονται στον Πίνακα Για τα δείγµατα κρόκου αυγού εφαρµόστηκε το πρωτόκολλο προκατεργασίας που δίνεται στον Πίνακα 14.5 και για την ανάλυση των δειγµάτων εφαρµόστηκε η χρωµατογραφική µέθοδος, τα χαρακτηριστικά της οποίας, δίνονται στον Πίνακα Από το κάθε µελετώµενο υπόστρωµα αναλύθηκαν δέκα δείγµατα επιλεγµένα από παραγωγούς διαφόρων περιοχών της βόρειας Ελλάδας. Σε κανένα από τα δείγµατα που αναλύθηκαν και για τα δύο υποστρώµατα δε βρέθηκαν κατάλοιπα των προσδιοριζόµενων κινολονών, από πιθανή χορήγησή τους στο ζώο. 212

226 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Πίνακας 14.9: Υπολογισµός του ορίου απόφασης (CC α ) και της ικανότητας ανίχνευσης (CC β ) στο επίπεδο LOQ και στο MRL, για τις κινολόνες που έχει οριστεί, σε µυϊκό ιστό πουλερικών. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ±SD (µg/kg) Σφάλµα α (1.64*SD) CC α (µg/kg) Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. Μετρηθείσα ποσότητα ±SD (µg/kg) Σφάλµα β (1.64*SD) CC β (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN * ± * ± ENR ± ± * 96.52± * ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± ± ± FLU * ± * ±

227 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 14 ο Πίνακας 14.10: Υπολογισµός του ορίου απόφασης (CC α ) και της ικανότητας ανίχνευσης (CC β ) στο επίπεδο LOQ για υπόστρωµα κρόκου αυγού. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ±SD (µg/kg) Σφάλµα α (1.64*SD) CC α (µg/kg) Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ±SD (µg/kg) Σφάλµα β (1.64*SD) CC β (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ENR ± ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ±

228 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο 15. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ ΕΚΑ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΑΓΕΛΑ ΙΝΟ ΓΑΛΑ ΥΣΤΕΡΑ ΑΠΟ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ - ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ 2002/657/EC 15.1 Εισαγωγή Η HPLC µέθοδος που αναπτύχθηκε στο κεφάλαιο 14 στο HPLC 2 σύστηµα Shimadzu, µε αντλία LC-10AD VP βαθµωτής έκλουσης και ανιχνευτή PDA SPD- M10A VP επικυρώθηκε για τον προσδιορισµό των δέκα µελετώµενων κινολονών (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε δείγµατα αγελαδινού γάλακτος. Η µελέτη εστιάστηκε στην ταυτόχρονη αποπρωτεΐνωση του γάλακτος και εκχύλιση των προσδιοριζόµενων κινολονών από το υπόστρωµα Η µελέτη έγινε σε δείγµατα εµβολιασµένα µε πρότυπα διάλυµα µίγµατος των δέκα κινολονών γνωστής συγκέντρωσης. Η εκχύλιση των κινολονών περιλαµβάνει σε πρώτη φάση την καθίζηση των πρωτεϊνών µέσω της εκχύλισης υγρού-υγρού και στη συνέχεια τον καθαρισµό των δειγµάτων µε εφαρµογή της εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE). είγµατα αγελαδινού γάλακτος αντιπροσωπευτικά από διάφορες κατηγορίες αναλύθηκαν µε τη χρωµατογραφική µέθοδο που αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε Πρότυπα διαλύµατα Για την παρασκευή των πυκνών πρότυπων διαλυµάτων και τις αραιώσεις τους ακολουθήθηκε η διαδικασία που περιγράφεται στο κεφάλαιο Στην αρχή της µελέτης παρασκευάστηκαν τα πυκνά διαλύµατα όλων των ενώσεων, ενώ τα πυκνά διαλύµατα των ΟΧΟ, NAL και FLU παρασκευάστηκαν και δεύτερη φορά, αφού όπως αποδείχθηκε δεν παραµένουν σταθερά για παραπάνω από δύο εβδοµάδες Χρωµατογραφικές συνθήκες Η µέθοδος που εφαρµόστηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό των δέκα µελετώµενων κινολονών σε δείγµατα αγελαδινού γάλακτος είναι όµοια µε τη µέθοδο που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισµό των αυτών κινολονών σε δείγµατα κρόκου 215

229 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο αυγού. Τα χαρακτηριστικά της µεθόδου είναι αυτά που περιγράφονται συνοπτικά στον Πίνακα Πίνακας 15.1: Βέλτιστες χρωµατογραφικές συνθήκες σε σύστηµα HPLC, για τον προσδιορισµό κινολονών σε δείγµατα αγελαδινού γάλακτος. Παράµετρος Σύστηµα 1 Βέλτιστες συνθήκες HPLC σύστηµα Shimadzu, µε αντλία LC- 10AD VP βαθµωτής έκλουσης και ανιχνευτή PDA SPD-M10A VP Χρωµατογραφική στήλη C 18 PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4 mm, 3&5 µm) Κινητή φάση Μίγµα Α: TFA 0.1% v/v, B: CH 3 CN και C: CH 3 OH Πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης t (min) Α(%) Β(%) C(%) Ροή κινητής φάσης 1.2 ml/min Μήκος κύµατος ανίχνευσης ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR: 275 nm OXO, NAL, FLU: 255 nm Θερµοκρασία φούρνου 25 o C Αρχική πίεση αντλίας ~ kg/cm 2 Όγκος αναλυόµενου δείγµατος 20 µl Εσωτερικό πρότυπο Καφεΐνη 7.5 ng/µl 15.4 Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για την προκατεργασία των δειγµάτων Η βελτιστοποίηση του πρωτοκόλλου προκατεργασίας των δειγµάτων γάλακτος εστιάστηκε στη µελέτη για την αποπρωτεΐνωση του γάλακτος και στην εκχύλιση των µελετώµενων κινολονών από το υπόστρωµα. Η ανάπτυξη του 216

230 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο πρωτοκόλλου έγινε σε 1 g δείγµατος, το οποίο εµβολιάστηκε στο εργαστήριο µε πρότυπο µίγµα των δέκα κινολονών. Ως διαλύτες εκχύλισης δοκιµάστηκαν υδατικά διαλύµατα TFA σε διάφορες συγκεντρώσεις και διαλύµατα του TFA σε οργανικούς διαλύτες. Επίσης οργανικοί διαλύτες σε συνδυασµό µε κάποιο υδατικό διάλυµα του TFA και διαλύµατα του TCA σε µεθανόλη και ακετονιτρίλιο. Την εκχύλιση υγρού-υγρού ακολουθεί η εκχύλιση στερεάς φάσης µε σκοπό την αποµάκρυνση των παρεµποδίσεων που οφείλονται στο υπόστρωµα. Η εκχύλιση στερεάς φάσης βασίστηκε σε προηγούµενη µελέτη στο κεφάλαιο Τα αποτελέσµατα των δοκιµών για τους διαλύτες εκχύλισης µετά από καθαρισµό των δειγµάτων µε SPE δίνονται συγκεντρωτικά στον Πίνακα Στις περιπτώσεις που δοκιµάστηκε στη σειρά και δεύτερη εκχύλιση παρατηρήθηκαν µειωµένες ανακτήσεις. Οι απώλειες των προσδιοριζόµενων ενώσεων οφείλονται στη διήθηση του εκχυλισµένου διαλύµατος πριν την εφαρµογή του στις µικροστήλες εκχύλισης. Όπως διαπιστώνεται από τις ανακτήσεις των προσδιοριζόµενων κινολονών ο διαλύτης εκχύλισης του πρωτοκόλλου 4 έδωσε τις υψηλότερες ανακτήσεις. Όλες οι παραπάνω δοκιµές έγιναν µε 4 ml διαλύτη εκχύλισης. Το πρωτόκολλο 4 που έδωσε τις υψηλότερες ανακτήσεις δοκιµάστηκε επίσης µε 2, 3 και 5 ml διαλύτη εκχύλισης. Όµως, οι όγκοι 3 και 4 ml έδωσαν παραπλήσιες ανακτήσεις, ενώ τα 5 ml έδωσαν χαµηλότερες ανακτήσεις. Οπότε τελικά χρησιµοποιήθηκαν 3 ml διαλύµατος TFA 25% v/v σε CH 3 OH, ως διαλύτης εκχύλισης. Το τελικό πρωτόκολλο που εφαρµόστηκε για την προκατεργασία των δειγµάτων αγελαδινού γάλακτος δίνεται στον Πίνακα

231 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο Πίνακας 15.2: Βελτιστοποίηση του πρωτοκόλλου εκχύλισης των µελετώµενων κινολονών από αγελαδινό γάλα. Πρωτό Ανακτήσεις (%) ιαλύτες εκχύλισης -κολλο ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU 1 Υδατικό διάλυµα TFA 15% v/v Υδατικό διάλυµα TFA 20% v/v Υδατικό διάλυµα TFA 25% v/v ιάλυµα TFA 25% v/v σε CH 3 OH ιάλυµα TFA 25% v/v σε CH 3 OH, εκχύλιση σε δύο στάδια ιάλυµα TFA 25% v/v σε CH 3 CN ιάλυµα TFA 25% v/v σε CH 3 CN, εκχύλιση σε δύο στάδια ιάλυµα TCA 25% v/v σε CH 3 OH ιάλυµα TCA 25% v/v σε CH 3 OH, εκχύλιση σε δύο στάδια ιάλυµα TCA 25% v/v σε CH 3 CN ιάλυµα TCA 25% v/v σε CH 3 CN, εκχύλιση σε δύο στάδια mL υδατικό διάλυµα TFA 25% v/v ml CH 3 CN και 3 ml υδατικού διαλύµατος TFA 25% v/v ml CH 3 OH και 3 ml υδατικού διαλύµατος TFA 25% v/v

232 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο Πίνακας 15.3: Στάδια προκατεργασίας δειγµάτων αγελαδινού γάλακτος για την ταυτόχρονη εκχύλιση των δέκα κινολονών. Στάδια Λεπτοµέρειες 1 ο Εµβολιασµός ± g δείγµατος γάλακτος µε 200 µl µίγµατος των δέκα κινολονών και του IS. 2 ο Προσθήκη 3 ml διαλύµατος TFA 25% v/v σε CH 3 OH, ανάδευση σε συσκευή vortex, παραµονή σε ηρεµία στο σκοτάδι για 10 min, εφαρµογή υπερήχων για 15 min και φυγοκέντρηση στις 3500 rpm (800 g) για 10 min. Παραλαβή του υπερκείµενου. 3 ο Εξάτµιση του οργανικού διαλύτη εκχύλισης σε ρεύµα Ν 2 και επαναδιάλυση του ξηρού υπολείµµατος σε 2 ml υδατικού διαλύµατος TFA 0.1% v/v. 4 ο Εφαρµογή του διαλύµατος εκχύλισης σε µικροστήλες Lichrolut RP-18, ενεργοποιηµένες µε 2 ml νερό και 2 ml CH 3 OH. 5 ο Παραλαβή των προσδιοριζόµενων κινολονών µε 1.5 ml TFA 0.1 % v/v σε CH 3 CN και σε 0.5 ml CH 3 CN. 6 ο Εξάτµιση του διαλύτη σε ρεύµα Ν 2 µέχρι ξηρού. 7 ο Επαναδιάλυση του δείγµατος σε 200 µl υδατικού διαλύµατος TFA 0.1% v/v. 8 ο Έγχυση 20 µl δείγµατος στην HPLC. Στα Σχήµατα 15.1 και 15.2 δίνονται αντίστοιχα αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα λευκού και εµβολιασµένου δείγµατος αγελαδινού γάλακτος, τα οποία έχουν υποστεί κατεργασία σύµφωνα µε το πρωτόκολλο του Πίνακα

233 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο (α) Σχήµα 15.1: α. Χρωµατογράφηµα λευκού δείγµατος αγελαδινού γάλακτος µε IS (1) καφεΐνη στα 7.5 ng/µl στα 275 nm και β. Χρωµατογράφηµα λευκού δείγµατος αγελαδινού γάλακτος µε IS (1) καφεΐνη στα 7.5 ng/µl στα 255 nm. (β) 220

234 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο (α) Σχήµα 15.2: Χρωµατογράφηµατα αγελαδινού γάλακτος εµβολιασµένου µε πρότυπο µίγµα των δέκα κινολονών (2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU) σε συγκέντρωση 5 ng/µl και IS (1), µετρηµένα (α) στα 275nm και (β) στα 255 nm. (β) 221

235 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο 15.5 Επικύρωση χρωµατογραφικής µεθόδου Η χρωµατογραφική µέθοδος που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών σε αγελαδινό γάλα επικυρώθηκε σύµφωνα µε την απόφαση της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2002/657/EC σε ότι αφορά τις παραµέτρους: εκλεκτικότητα, γραµµικότητα, ευαισθησία, πιστότητα, επαναληψιµότητα, όριο απόφασης και ικανότητα ανίχνευσης Έλεγχος εκλεκτικότητας Η εκλεκτικότητα της µεθόδου ελέγχθηκε αναλύοντας δείγµατα αγελαδινού γάλακτος διαφορετικών εταιρειών. Τα δείγµατα που επιλέχθηκαν για τη µελέτη ήταν όλα της κατηγορίας «πλήρες αγελαδινό παστεριωµένο» γάλα (µε λιπαρά συστατικά 3.5%). Αναλύθηκαν δέκα διαφορετικά δείγµατα ύστερα από κατεργασία σύµφωνα µε το πρωτόκολλο του Πίνακα Για κανένα από τα δείγµατα που αναλύθηκαν δεν παρατηρήθηκαν παρεµποδίσεις που να οφείλονται στο υπόστρωµα και να παρεµποδίζουν τον προσδιορισµό των δέκα µελετώµενων κινολονών. Οι κορυφές που εκλούονται στα λευκά δείγµατα αγελαδινού γάλακτος που αναλύθηκαν δεν παρεµποδίζουν σε κανέναν από τα δυο µήκη κύµατος τις προσδιοριζόµενες κινολόνες. Αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα λευκών δειγµάτων γάλακτος σε µήκη κύµατος 275 και 255 nm δίνονται στα Σχήµατα 15.3(α, β), αντίστοιχα. 222

236 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο (α) (β) Σχήµα 15.3: Χρωµατογράφηµα λευκού δείγµατος αγελαδινού γάλακτος σε µήκος κύµατος (α) 275 nm και (β) 255 nm. 223

237 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο Χάραξη καµπυλών αναφοράς είγµατα αγελαδινού γάλακτος εµβολιάστηαν µε πρότυπα διαλύµατα µίγµατος των δέκα κινολονών σε συγκεντρώσεις 1.0, 1.5, 3.0, και 9.0 ng/µl, µε εσωτερικό πρότυπο καφεΐνη σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl, για τη χάραξη των καµπυλών αναφοράς της χρωµατογραφικής µεθόδου που αναπτύχθηκε. Για τα δείγµατα ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο προκατεργασίας του Πίνακα Το κάθε δείγµα µετρήθηκε τρεις φορές και υπολογίστηκαν οι µέσοι όροι των τριών µετρήσεων. Στον Πίνακα 15.4 δίνονται τα αναλυτικά χαρακτηριστικά (κλίση, τεταγµένη επί την αρχή) τετραγώνων για κάθε ένωση, οι τιµές των συντελεστών συσχέτισης r, το όριο ανίχνευσης για κάθε ένωση και το εύρος της γραµµικής περιοχής. Η κατασκευή των καµπυλών βασίστηκε στο λόγο των εµβαδών των κορυφών που δίνουν οι ανακτώµενες ενώσεις κατά τη µέθοδο της προκατεργασίας, προς το εµβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου. Οι τιµές των ορίων ανίχνευσης υπολογίστηκαν χρησιµοποιώντας τη σχέση LOD = 3.3σ/S (σχέση 7.1). Πίνακας 15.4: Γραµµικότητα και ευαισθησία της προτεινόµενης µεθόδου, για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών, µε καφεΐνη ως εσωτερικό πρότυπο, σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl, σε δείγµατα αγελαδινού γάλακτος. Ένωση Κλίση (ng -1 ) Τεταγµένη επί την αρχή r LOD (µg/kg) Εύρος (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ± ± ENR ± ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ±

238 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο Η µέθοδος είναι γραµµική µέχρι 9.0 ng/µl για όλες τις ενώσεις, ενώ σύµφωνα µε την ανάλυση παλινδρόµησης οι συντελεστές συσχέτισης κυµαίνονται µεταξύ και Μελέτη πιστότητας και ανάκτησης Η επαναληψιµότητα της προτεινόµενης µεθόδου ελέγχθηκε αναλύοντας δείγµατα αγελαδινού γάλακτος εµβολιασµένα σε τρία επίπεδα συγκέντρωσης (ή τέσσερα για τις κινολόνες που ορίζεται το MRL) συµπεριλαµβανοµένου και του επιπέδου LOQ. Το κάθε επίπεδο συγκέντρωσης αναλύθηκε έξι φορές στη διάρκεια µίας ηµέρας. Επίσης για τον έλεγχο της πιστότητας της κάθε µεθόδου, δείγµατα εµβολιασµένα στα ίδια επίπεδα συγκέντρωσης αναλύθηκαν για έξι διαφορετικές ηµέρες. Την κάθε µέρα ετοιµάζονταν και αναλύονταν τρία δείγµατα. Παράλληλα υπολογίστηκε η ανάκτηση της µεθόδου για την κάθε κινολόνη, σε επίπεδα συγκέντρωσης των προσδιοριζόµενων ενώσεων 0.5, 1 και 1.5 φορά το επιτρεπόµενο όριο, όπως ορίζεται από την απόφαση 2002/657/EC, για τα υποστρώµατα που δεν υπάρχουν διαθέσιµα υλικά αναφοράς. Ακόµα για τις ενώσεις που ορίζεται το MRL η ανάκτηση υπολογίστηκε στο επίπεδο συγκέντρωσης LOQ. Ενώ για τις ενώσεις που δεν έχει οριστεί MRL η ανάκτηση υπολογίστηκε στο αντίστοιχο επίπεδο LOQ και σε δύο επιπλέον συγκεντρώσεις. Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων της πιστότητας και της ανάκτησης της χρωµατογραφικής µεθόδου για τα δείγµατα αγελαδινού γάλακτος δίνονται στους πίνακες 15.5 (α, β) αντίστοιχα. Οι ανακτήσεις της χρωµατογραφικής µεθόδου κυµαίνονται µεταξύ 96.0% και 110.0%. 225

239 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο Πίνακας 15.5: α. Μελέτη της επαναληψιµότητας της µεθόδου σε δείγµατα αγελαδινού γάλακτος. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια µίας ηµέρας (n=6) ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± * 30.7± ± ENR ± ± * 99.1± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 50.7± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 226

240 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο Πίνακας 15.5: β. Μελέτη της πιστότητας της µεθόδου για έξι ηµέρες, µε τρεις µετρήσεις ανά ηµέρα, σε δείγµατα αγελαδινού γάλακτος. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια έξι ηµερών ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± * 30.5± ± ENR ± ± * 99.9± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 50.6± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 227

241 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο Υπολογισµός του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης Σύµφωνα µε την απόφαση της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2002/657/EC υπολογίστηκαν επίσης το όριο απόφασης CC α και η ικανότητα ανίχνευσης της µεθόδου CC β. Για τον υπολογισµό του ορίου απόφασης έγιναν µετρήσεις σε δείγµατα αγελαδινού γάλακτος εµβολιασµένα στο αντίστοιχο επίπεδο LOQ και στο MRL, για τις κινολόνες που αυτό ορίζεται από τον Κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. Ο υπολογισµός των CC α έγινε προσθέτοντας στην ανακτηµένη ποσότητα της κάθε κινολόνης από τα εµβολιασµένα δείγµατα, ποσότητα ίση µε 1.64 φορές την τυπική απόκλιση των µετρήσεων των αντίστοιχων δειγµάτων. Επίσης για τον υπολογισµό της ικανότητας ανίχνευσης CC β της µεθόδου δείγµατα εµβολιάστηκαν στο αντίστοιχο επίπεδο CC α και αναλύθηκαν µε την προτεινόµενη µέθοδο. Ο υπολογισµός των CC β έγινε προσθέτοντας στην ανακτηµένη ποσότητα της κάθε κινολόνης από τα εµβολιασµένα δείγµατα, ποσότητα ίση µε 1.64 φορές την τυπική απόκλιση των µετρήσεων των αντίστοιχων δειγµάτων. Η στατιστική ανάλυση για τον υπολογισµό των CC α και CC β έγινε σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%. Για τον υπολογισµό του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης επεξεργάστηκαν κάθε φορά είκοσι δείγµατα, τα οποία µετρήθηκαν από τρεις φορές και υπολογίστηκε ο µέσος όρος τους. Τα αποτελέσµατα των παραπάνω υπολογισµών δίνονται στον Πίνακα Εφαρµογή της µεθόδου για ανάλυση δειγµάτων αγελαδινού γάλακτος Με τη χρωµατογραφική µέθοδο που αναπτύχθηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό δέκα κινολονών σε αγελαδινό γάλα αναλύθηκαν οχτώ διαφορετικά δείγµατα εφαρµόζοντας το πρωτόκολλο προκατεργασίας που δίνεται στον Πίνακα Τα δείγµατα προµηθεύτηκαν από πολυκατάστηµα τροφίµων και περιλαµβάνουν πλήρες παστεριωµένο γάλα (µε λιπαρά συστατικά 3.5%), γάλα παστεριωµένο χαµηλών λιπαρών (µε λιπαρά συστατικά 1.5%), παστεριωµένο αποβουτυρωµένο γάλα (µε µηδενικά λιπαρά συστατικά), πλήρες εβαπορέ (µε λιπαρά συστατικά 7.5%), µειωµένων λιπαρών εβαπορέ (µε λιπαρά συστατικά 1.5%), πλήρες γάλα υψηλής παστερίωσης (µε λιπαρά συστατικά 3.5%), υψηλής παστερίωσης χαµηλών λιπαρών (µε λιπαρά συστατικά 1.5%) και γάλα επεξεργασµένο σε υψηλή θερµοκρασία (µε 228

242 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 15 ο λιπαρά συστατικά 4.0%). Σε κανένα από τα δείγµατα που αναλύθηκαν δε βρέθηκαν κατάλοιπα των προσδιοριζόµενων κινολονών, από πιθανή χορήγησή τους στο ζώο. Πίνακας 15.6: Υπολογισµός του σφάλµατος α και β και του ορίου απόφασης (CC α ) και της ικανότητας ανίχνευσης (CC β ) στο επίπεδο LOQ και στο MRL, για τις κινολόνες που έχει οριστεί, σε αγελαδινό γάλα. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) Σφάλµα α (1.64*SD) CC α (µg/kg) ENO ± OFL ± NOR ± CIP ± DAN 30.0 * 30.66± ENR ± * 101.3± SAR ± OXO ± NAL ± ± FLU 50.0 * 50.17± Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) Σφάλµα β (1.64*SD) CC β (µg/kg) ENO ± OFL ± NOR ± CIP ± DAN 34.0 * 34.06± ENR ± * ± SAR ± OXO ± NAL ± ± FLU 53.0 * 53.17± * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 229

243 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο 16. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΕΚΑ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΒΟΕΙΟ ΗΠΑΡ ΚΑΙ ΣΕ ΧΟΙΡΕΙΟ ΝΕΦΡΟ, ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ 2002/657/EC 16.1 Εισαγωγή Για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό των δέκα κινολονών (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού χρησιµοποιήθηκε µε επιτυχία η HPLC µέθοδος που αναπτύχθηκε στο κεφάλαιο 14 στο HPLC σύστηµα Shimadzu, µε αντλία LC-10AD VP βαθµωτής έκλουσης και ανιχνευτή PDA SPD-M10A VP. Η µέθοδος επικυρώθηκε για τον προσδιορισµό των δέκα µελετώµενων κινολονών στα συγκεκριµένα δύο υποστρώµατα. Η µελέτη έγινε σε δείγµατα εµβολιασµένα µε µίγµα των δέκα κινολονών γνωστής συγκέντρωσης. Αρχικά έγινε αποµόνωση των κινολονών από τα µελετώµενα υποστρώµατα, µέσω εκχύλισης στερεού-υγρού και στη συνέχεια έγινε επιπλέον καθαρισµός των δειγµάτων µε εφαρµογή της εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE). είγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού αντιπροσωπευτικά από διάφορες κατηγορίες αναλύθηκαν µε τη χρωµατογραφική µέθοδο που αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε Πρότυπα διαλύµατα Για την παρασκευή των πυκνών πρότυπων διαλυµάτων και τις αραιώσεις τους ακολουθήθηκε η διαδικασία που περιγράφεται στο κεφάλαιο Στην αρχή της µελέτης παρασκευάστηκαν τα πυκνά διαλύµατα όλων των ενώσεων, ενώ τα πυκνά διαλύµατα των ΟΧΟ, NAL και FLU παρασκευάστηκαν και δεύτερη φορά, αφού όπως αποδείχθηκε δεν παραµένουν σταθερά για παραπάνω από δύο εβδοµάδες Χρωµατογραφικές συνθήκες Η µέθοδος που εφαρµόστηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό των δέκα µελετώµενων κινολονών σε δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού είναι όµοια µε τη µέθοδο που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισµό των ενώσεων αυτών σε δείγµατα 230

244 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο κρόκου αυγού. Τα χαρακτηριστικά της µεθόδου είναι αυτά που περιγράφονται συνοπτικά στον Πίνακα Πίνακας 16.1: Βέλτιστες χρωµατογραφικές συνθήκες σε σύστηµα HPLC 2, για τον προσδιορισµό κινολονών σε δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού. Παράµετρος Σύστηµα 1 Βέλτιστες συνθήκες HPLC σύστηµα Shimadzu, µε αντλία LC- 10AD VP βαθµωτής έκλουσης και ανιχνευτή PDA SPD-M10A VP Χρωµατογραφική στήλη C 18 PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4 mm, 3&5 µm) Κινητή φάση Μίγµα Α: TFA 0.1% v/v, B: CH 3 CN και C: CH 3 OH Πρόγραµµα βαθµωτής έκλουσης t (min) Α(%) Β(%) C(%) Ροή κινητής φάσης 1.2 ml/min Μήκος κύµατος ανίχνευσης ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR: 275 nm OXO, NAL, FLU: 255 nm Θερµοκρασία φούρνου 25 o C Αρχική πίεση αντλίας ~ kg/cm 2 Όγκος αναλυόµενου δείγµατος 20 µl Εσωτερικό πρότυπο Καφεΐνη 7.5 ng/µl 16.4 Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για την προκατεργασία των δειγµάτων. Η ανάπτυξη του πρωτοκόλλου προκατεργασίας των δειγµάτων βασίστηκε στην προηγούµενη µελέτη που είχε γίνει για τους διάφορους µυϊκούς ιστούς. Εφαρµόζοντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται στον Πίνακα 16.2 λαµβάνονται ικανοποιητικές 231

245 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο ανακτήσεις (82-95%) τόσο για τα δείγµατα βόειου ήπατος όσο και για τα δείγµατα χοίρειου νεφρού. Στα Σχήµατα 16.1(α, β) και 16.2(α, β) δίνονται αντίστοιχα αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα λευκών και εµβολισµένων δειγµάτων βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού, αντίστοιχα, µετά από κατεργασία σύµφωνα µε το πρωτόκολλο του Πίνακα Πίνακας 16.2: Στάδια προκατεργασίας δειγµάτων βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού, για την ταυτόχρονη εκχύλιση των δέκα κινολονών. Στάδια Λεπτοµέρειες 1 ο Εµβολιασµός ± g τεµαχισµένου δείγµατος µε 200 µl µίγµατος των δέκα κινολονών και του IS. 2 ο Προσθήκη 4 ml διαλύµατος TFA 0.1% v/v σε CH 3 OH, ανάδευση σε συσκευή vortex, παραµονή σε ηρεµία στο σκοτάδι για 10 min, εφαρµογή υπερήχων για 15 min και φυγοκέντρηση στις 3500 rpm (800 g) για 10 min. Παραλαβή του υπερκείµενου. 3 ο Επανεκχύλιση του στερεού υπολείµµατος επαναλαµβάνοντας το 2 ο στάδιο. Το υπερκείµενο που παραλαµβάνεται από το στάδιο της φυγοκέντρησης ενώνεται σε δοκιµαστικό σωλήνα µε αυτό της 1 ης εκχύλισης. 4 ο Εξάτµιση του οργανικού διαλύτη εκχύλισης σε ρεύµα Ν 2 και επαναδιάλυση του ξηρού υπολείµµατος σε 2 ml υδατικού διαλύµατος TFA 0.1% v/v. 5 ο Εφαρµογή του διαλύµατος εκχύλισης σε µικροστήλες Lichrolut RP-18, ενεργοποιηµένες µε 2 ml νερό και 2 ml CH 3 OH. 6 ο Παραλαβή των προσδιοριζόµενων κινολονών µε 1.5 ml TFA 0.1 % v/v σε CH 3 CN και σε 0.5 ml CH 3 CN. 7 ο Εξάτµιση του διαλύτη σε ρεύµα Ν 2 µέχρι ξηρού. 8 ο Επαναδιάλυση του δείγµατος σε 200 µl υδατικού διαλύµατος TFA 0.1% v/v 9 ο Έγχυση 20 µl δείγµατος στην HPLC. 232

246 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο (α) Σχήµα 16.1: α. Χρωµατογράφηµα λευκού δείγµατος βόειου ήπατος, και β. Χρωµατογράφηµα δείγµατος βόειου ήπατος, εµβολιασµένου µε µίγµα των δέκα κινολονών (2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU) σε συγκέντρωση 5 ng/µl και IS (1), στα 275 nm. (β) 233

247 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο (α) Σχήµα 16.2: α. Χρωµατογράφηµα λευκού δείγµατος χοίρειου νεφρού, και β. Χρωµατογράφηµα δείγµατος χοίρειου νεφρού, εµβολιασµένου µε µίγµα των δέκα κινολονών (2.ENO, 3.OFL, 4.NOR, 5.CIP, 6.DAN, 7.ENR, 8.SAR, 9.OXO, 10.NAL, 11.FLU) σε συγκέντρωση 5 ng/µl και IS (1), στα 275 nm. (β) 234

248 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο 16.5 Επικύρωση χρωµατογραφικής µεθόδου Η χρωµατογραφική µέθοδος που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών σε υποστρώµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού επικυρώθηκε σε ότι αφορά τις παραµέτρους εκλεκτικότητα, γραµµικότητα, ευαισθησία, πιστότητα, επαναληψιµότητα, όριο απόφασης και ικανότητα ανίχνευσης, έτσι όπως περιγράφονται στην απόφαση της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2002/657/EC Έλεγχος εκλεκτικότητας Η εκλεκτικότητα της µεθόδου ελέγχθηκε αναλύοντας αντιπροσωπευτικά λευκά δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού διαφορετικής προέλευσης. Στα δείγµατα εφαρµόστηκε κατεργασία σύµφωνα µε το πρωτόκολλο του Πίνακα Σε κανένα από τα δείγµατα που αναλύθηκαν δεν παρατηρήθηκαν παρεµποδίσεις που να οφείλονται στο υπόστρωµα και να παρεµποδίζουν τον προσδιορισµό των δέκα µελετώµενων κινολονών. Οι κορυφές που εκλούονται στα λευκά δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού που αναλύθηκαν δεν παρεµποδίζουν τις προσδιοριζόµενες κινολόνες. Αντιπροσωπευτικά χρωµατογραφήµατα λευκών δειγµάτων από τα δύο µελετώµενα υποστρώµατα στα 275 στα Σχήµατα 16.3(α, β) Χάραξη καµπυλών αναφοράς είγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού εµβολιάστηκαν µε πρότυπα διαλύµατα µίγµατος των δέκα κινολονών σε συγκεντρώσεις 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 1.5, 3.0, και 9.0 ng/µl, µε εσωτερικό πρότυπο καφεΐνη σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl, για τη χάραξη των καµπυλών αναφοράς της χρωµατογραφικής µεθόδου που αναπτύχθηκε. Για τα δείγµατα ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο προκατεργασίας του Πίνακα Το κάθε δείγµα µετρήθηκε τρεις φορές και υπολογίστηκαν οι µέσοι όροι των τριών µετρήσεων. Στους πίνακες 16.3 και 16.4 δίνονται τα αναλυτικά χαρακτηριστικά (κλίση, τεταγµένη επί την αρχή) για κάθε ένωση, οι τιµές των συντελεστών συσχέτισης r, το όριο ανίχνευσης για κάθε ένωση και το εύρος της γραµµικής περιοχής για τα υποστρώµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού, αντίστοιχα. Η κατασκευή των καµπυλών αναφοράς βασίστηκε στο λόγο των εµβαδών των κορυφών που δίνουν οι 235

249 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο ανακτώµενες ενώσεις κατά τη µέθοδο της προκατεργασίας, προς το εµβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου. Οι τιµές των ορίων ανίχνευσης υπολογίστηκαν χρησιµοποιώντας τη σχέση LOD = 3.3σ/S (σχέση 7.1). (α) (β) Σχήµα 16.3: Χρωµατογράφηµατα σε µήκος κύµατος 275 nm λευκού δείγµατος (α) βόειου ήπατος και (β) χοίρειου νεφρού. 236

250 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο Πίνακας 16.3: Γραµµικότητα και ευαισθησία της προτεινόµενης µεθόδου, για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών, µε καφεΐνη ως εσωτερικό πρότυπο, σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl, σε δείγµατα βόειου ήπατος. Ένωση Κλίση (ng -1 ) Τεταγµένη επί την αρχή r LOD (µg/kg) Εύρος (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ± ± ENR ± ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ± Πίνακας 16.4: Γραµµικότητα και ευαισθησία της προτεινόµενης µεθόδου, για τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών, µε καφεΐνη ως εσωτερικό πρότυπο, σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl, σε δείγµατα χοίρειου νεφρού. Ένωση Κλίση (ng -1 ) Τεταγµένη επί την αρχή r LOD (µg/kg) Εύρος (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ± ± ENR ± ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ±

251 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο Τα όρια ανίχνευσης για τις προσδιοριζόµενες δέκα κινολόνες κυµαίνονται µεταξύ 3 και 7 µg/kg για τα δείγµατα βόειου ήπατος και µεταξύ 3 και 4 µg/kg για τα δείγµατα χοίρειου νεφρού. Οι καµπύλες αναφοράς για την κάθε κινολόνη συγκρίθηκαν µεταξύ των δύο µελετώµενων υποστρωµάτων, χρησιµοποιώντας την ανάλυση παλινδρόµησης. Σύµφωνα µε την ανάλυση παλινδρόµησης σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%, για όλες τις µελετώµενες κινολόνες, το τυπικό σφάλµα της τεταγµένης επί την αρχή προσεγγίζει το µηδέν και η τιµή της κλίσης προσεγγίζει τη µονάδα. Οι τιµές αυτές αποδεικνύουν συσχέτιση µεταξύ των δύο υποστρωµάτων, δηλαδή για τον προσδιορισµό της κάθε κινολόνης µπορεί να χρησιµοποιηθεί οποιαδήποτε αντίστοιχη καµπύλη αναφοράς, χωρίς σηµαντικό σφάλµα Μελέτη πιστότητας και ανάκτησης Η επαναληψιµότητα της προτεινόµενης µεθόδου ελέγχθηκε αναλύοντας δείγµατα των δύο µελετώµενων υποστρωµάτων εµβολιασµένα σε τρία επίπεδα συγκέντρωσης (ή τέσσερα για τις κινολόνες που ορίζεται το MRL) συµπεριλαµβανοµένου και του επιπέδου του LOQ. Το κάθε επίπεδο συγκέντρωσης αναλύθηκε έξι φορές στη διάρκεια µίας ηµέρας. Επίσης για τον έλεγχο της πιστότητας της κάθε µεθόδου, δείγµατα εµβολισµένα στα ίδια επίπεδα συγκέντρωσης αναλύθηκαν για έξι διαφορετικές ηµέρες. Την κάθε µέρα ετοιµάζονταν και αναλύονταν τρία δείγµατα για τον κάθε ιστό. Παράλληλα υπολογίστηκε η ανάκτηση της µεθόδου για την κάθε κινολόνη, σε επίπεδα συγκέντρωσης των προσδιοριζόµενων ενώσεων 0.5, 1 και 1.5 φορά το επιτρεπόµενο όριο, όπως ορίζεται από την απόφαση 2002/657/EC, για τα υποστρώµατα που δεν υπάρχουν διαθέσιµα υλικά αναφοράς. Ακόµα για τις ενώσεις που ορίζεται το MRL η ανάκτηση υπολογίστηκε στο επίπεδο συγκέντρωσης LOQ. Ενώ για τις ενώσεις που δεν έχει οριστεί MRL, η ανάκτηση υπολογίστηκε στο αντίστοιχο επίπεδο LOQ και σε δύο ακόµα συγκεντρώσεις. Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων της πιστότητας και της ανάκτησης της χρωµατογραφικής µεθόδου για τα δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού δίνονται στους πίνακες 16.5 (α, β) και 16.6 (α, β) αντίστοιχα. Οι ανακτήσεις της χρωµατογραφικής µεθόδου κυµαίνονται µεταξύ 97.3% και 104.7%, για τα δείγµατα βόειου ήπατος και µεταξύ 95.6% και 102.5%, για τα δείγµατα χοίρειου νεφρού. 238

252 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο Πίνακας 16.5: α. Μελέτη της επαναληψιµότητας της µεθόδου σε δείγµατα βόειου ήπατος. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια µίας ηµέρας (n=6) ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± * 400.7± ± ENR ± ± * 299.1± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 500.7± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 239

253 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο Πίνακας 16.5: β. Μελέτη της πιστότητας της µεθόδου για έξι ηµέρες, µε τρεις µετρήσεις ανά ηµέρα, σε δείγµατα βόειου ήπατος. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια έξι ηµερών ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± * 400.5± ± ENR ± ± * 299.9± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * 500.6± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 240

254 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο Πίνακας 16.6: α. Μελέτη της επαναληψιµότητας της µεθόδου σε δείγµατα χοίρειου νεφρού. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια µίας ηµέρας (n=6) ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± * 200.7± ± ENR ± ± * 299.1± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * ± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 241

255 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο Πίνακας 16.6: β. Μελέτη της πιστότητας της µεθόδου για έξι ηµέρες, µε τρεις µετρήσεις ανά ηµέρα, σε δείγµατα χοίρειου νεφρού. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (α) (µg/kg) RSD Ανάκτηση (%) ιάρκεια έξι ηµερών ΕΝΟ ± ± ± OFL ± ± ± NOR ± ± ± CIP ± ± ± DAN ± ± * 200.5± ± ENR ± ± * 299.9± ± SAR ± ± ± OXO ± ± ± NAL ± ± ± FLU ± ± * ± ± (α) : Μέσος όρος τριών µετρήσεων. * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 242

256 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο Υπολογισµός του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης Σύµφωνα µε την απόφαση της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2002/657/EC υπολογίστηκαν επίσης το όριο απόφασης CC α και η ικανότητα ανίχνευσης της µεθόδου CC β. Για τον υπολογισµό του ορίου απόφασης έγιναν µετρήσεις σε δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού εµβολιασµένα στο αντίστοιχο επίπεδο LOQ και στο MRL, για τις κινολόνες που αυτό ορίζεται από τον Κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. Ο υπολογισµός των CC α έγινε προσθέτοντας στην ανακτηµένη ποσότητα της κάθε κινολόνης από τα εµβολιασµένα δείγµατα, ποσότητα ίση µε 1.64 φορές την τυπική απόκλιση των µετρήσεων των αντίστοιχων δειγµάτων. Επίσης για τον υπολογισµό της ικανότητας ανίχνευσης CC β της µεθόδου δείγµατα εµβολιάστηκαν στο αντίστοιχο επίπεδο CC α και αναλύθηκαν µε την προτεινόµενη µέθοδο. Ο υπολογισµός των CC β έγινε προσθέτοντας στην ανακτηµένη ποσότητα της κάθε κινολόνης από τα εµβολιασµένα δείγµατα, ποσότητα ίση µε 1.64 φορές την τυπική απόκλιση των µετρήσεων των αντίστοιχων δειγµάτων. Η στατιστική ανάλυση για τον υπολογισµό των CC α και CC β έγινε σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%. Για τον υπολογισµό του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης επεξεργάστηκαν κάθε φορά είκοσι δείγµατα, τα οποία µετρήθηκαν από τρεις φορές και υπολογίστηκε ο µέσος όρος τους. Τα αποτελέσµατα δίνονται στους πίνακες 16.7 και 16.8, για τα δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού, αντίστοιχα. 243

257 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο Πίνακας 16.7: Υπολογισµός του σφάλµατος α και β και του ορίου απόφασης (CC α ) και της ικανότητας ανίχνευσης (CC β ) στο επίπεδο LOQ και στο MRL, για τις κινολόνες που έχει οριστεί, σε δείγµατα βόειου ήπατος. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (µg/kg) Σφάλµα α (1.64*SD) CC α (µg/kg) Προστιθέµενη ποσότητα (µg/kg) Μετρηθείσα ποσότητα ± SD (µg/kg) Σφάλµα β (1.64*SD) CC β (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN * ± * ± ENR ± ± * ± * ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ± * ± * ± * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 244

258 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο Πίνακας 16.8: Υπολογισµός του σφάλµατος α και β και του ορίου απόφασης (CC α ) και της ικανότητας ανίχνευσης (CC β ) στο επίπεδο LOQ και στο MRL, για τις κινολόνες που έχει οριστεί, σε δείγµατα χοίρειου νεφρού. Ένωση Προστιθέµενη ποσότητα Μετρηθείσα ποσότητα ± Σφάλµα α (1.64*SD) CC α (µg/kg) Προστιθέµενη ποσότητα Μετρηθείσα ποσότητα ± SD Σφάλµα β (1.64*SD) CC β (µg/kg) (µg/kg) SD (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN * ± * ± ENR ± ± * ± * ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ± * ± * ± * Μέγιστο επιτρεπόµενο όριο σύµφωνα µε τον κανονισµό της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2377/90/EEC. 245

259 Πειραµατικό Μέρος, Κεφάλαιο 16 ο 16.6 Εφαρµογή της µεθόδου για ανάλυση δειγµάτων βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού Με τη χρωµατογραφική µέθοδο που αναπτύχθηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό δέκα κινολονών σε δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού αναλύθηκαν δέκα διαφορετικά δείγµατα για το κάθε υπόστρωµα εφαρµόζοντας το πρωτόκολλο προκατεργασίας που δίνεται στον Πίνακα Τα δείγµατα προέρχονται από τρεις διαφορετικούς παραγωγούς, από τρία διαφορετικά µέρη τη Βόρειας και Κεντρικής Ελλάδας. Σε κανένα από τα δείγµατα που αναλύθηκαν δε βρέθηκαν κατάλοιπα των προσδιοριζόµενων κινολονών, από πιθανή χορήγησή τους στο ζώο. 246

260 Ανακεφαλαίωση-Συµπεράσµατα, Κεφάλαιο 17 ο 17. ΑΝΑΚΕΦΑΛΑΙΩΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αναπτύσσονται µέθοδοι Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Πίεσης για την ανάλυση φαρµακευτικών σκευασµάτων κινολονών και τον ταυτόχρονο προσδιορισµό υπολειµµάτων δέκα κινολονών σε δείγµατα τροφίµων ζωικής προέλευσης. Οι κινολόνες που µελετήθηκαν είναι η ενοξακίνη, η οφλοξακίνη, η νορφλοξακίνη, η κιπροφλοξακίνη, η ντανοφλοξακίνη, η ενροφλοξακίνη, η σαραφλοξακίνη, το οξολινικό οξύ, το ναλιδιξικό οξύ και η φλουµεκίνη. Αναπτύχθηκε µέθοδος διαχωρισµού του πρότυπου µίγµατος των δέκα κινολονών σε σύστηµα HPLC Shimadzu, µε αντλία βαθµωτής έκλουσης LC 9A και ανιχνευτή PDA SPD M6A. Χρησιµοποιήθηκε η αναλυτική στήλη C 18 PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4 mm, 3&5 µm), της εταιρείας MZ-Analysentechnik. Η κινητή φάση ήταν µίγµα Α: TFA 0.1%, B: CH 3 CN και C: CH 3 OH. Η έκλουση γινόταν βαθµωτά, µε σταθερή ταχύτητα ροής 1.3 ml/min. Η ανίχνευση γινόταν σε δύο µήκη κύµατος στα 275 nm, για τις ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR και SAR και στα 255 nm για τις OXO, NAL και FLU. Χρησιµοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο η καφεΐνη σε συγκέντρωση 7.5 ng/µl. Ο συνολικός χρόνος ανάλυσης ήταν περίπου 33 min, µε τιµές διακριτικής ικανότητας µεγαλύτερες από 1.1. Από τη διαδικασία επικύρωσης της µεθόδου διαπιστώθηκε ικανοποιητική επαναληψιµότητα στους χρόνους συγκράτησης και στα εµβαδά των κορυφών. Οι τιµές των συντελεστών συσχέτισης κυµαίνονται από µέχρι , αποδεικνύοντας τη γραµµικότητα της µεθόδου για όλες τις προσδιοριζόµενες κινολόνες και οι τιµές των ορίων ανίχνευσης υπολογισµένες µε τη σχέση LOD = 3.3σ/S προκύπτουν να είναι 10 ng για τις ENO, OFL, NOR, CIP, SAR και FLU, 5 ng για τις DAN, ENR και NAL και 15 ng για το OXO. Από τον έλεγχο της µεθόδου για την επαναληψιµότητα στη διάρκεια µιας ηµέρας προέκυψαν τιµές σχετικής τυπικής απόκλισης µεταξύ 0.1 και 4.1% και για την πιστότητα σε έξι διαφορετικές ηµέρες προέκυψαν τιµές σχετικής τυπικής απόκλισης µεταξύ 0.3 και 7.8%. Η µέθοδος που αναπτύχθηκε εφαρµόστηκε για την ανάλυση εµπορικά διαθέσιµων φαρµακευτικών σκευασµάτων, µε δραστική κάποια από τις κινολόνες που µελετήθηκαν. Η ακρίβεια της µεθόδου είναι αρκετά ικανοποιητική µε εξαίρεση την περίπτωση του ενέσιµου διαλύµατος της ENR, όπου το σχετικό σφάλµα είναι περίπου -25%, τιµή που είχε διαπιστωθεί επίσης σε παλαιότερη ανάλυση του συγκεκριµένου 247

261 Ανακεφαλαίωση-Συµπεράσµατα, Κεφάλαιο 17 ο σκευάσµατος, µε άλλη µέθοδο Υγρής Χρωµατογραφίας, σε διαφορετικό σύστηµα HPLC. Στη συνέχεια αναπτύχθηκε µέθοδος για την εκχύλιση και τον ταυτόχρονο χρωµατογραφικό διαχωρισµό των δέκα µελετώµενων (φθορο)κινολονών (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε µυϊκό ιστό χοίρου, βοοειδών και προβάτου. Για την εκχύλιση των προσδιοριζόµενων κινολονών από τα µελετώµενα υποστρώµατα αρχικά εφαρµόστηκε πρωτόκολλο εκχύλισης στερεού-υγρού µε διαλύτη εκχύλισης TFA 0.1% σε CH 3 OH και στη συνέχεια για τον καθορισµό του δείγµατος εφαρµόστηκε SPE σε µικροστήλες Lichrolut RP-18, Merck. Η χρωµατογραφική µέθοδος που αναπτύχθηκε επικυρώθηκε σύµφωνα µε τα κριτήρια που ορίζει η απόφαση της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2002/657/EC. Από τον έλεγχο της εκλεκτικότητας αποδείχθηκε πως οι κορυφές που υπάρχουν και οφείλονται σε συστατικά του υποστρώµατος, δεν παρεµποδίζουν τον προσδιορισµό των δέκα κινολονών. Σχετικά µε την ανθεκτικότητα της µεθόδου ως προς τη θερµοκρασία του φούρνου παρατηρήθηκε πως η µορφή των κορυφών και η διακριτική ικανότητα δεν µεταβλήθηκαν, όµως µε την αύξηση της θερµοκρασίας παρατηρήθηκε µείωση της ευαισθησίας της µεθόδου. Όσον αφορά την ανθεκτικότητα της µεθόδου σε συγκεντρώσεις 0.05, και 0.15% του TFA παρατηρήθηκε πως η ελάττωση συγκέντρωσης του TFA επηρεάζει το διαχωρισµό µεταξύ των OFL και NOR, ενώ συγκέντρωση του TFA 0.15% µειώνει τη διακριτική ικανότητα µεταξύ των DAN και ENR. Ο διαχωρισµός των δέκα µελετώµενων κινολονών και του εσωτερικού προτύπου παραµένει µε τη µεταβολή της ταχύτητας ροής, αλλάζοντας µόνο το συνολικό χρόνο της ανάλυσης. Σε µικρές αλλαγές που έγιναν στο πρόγραµµα της βαθµωτής έκλουσης παρατηρήθηκε µείωση στη διαχωριστική ικανότητα µεταξύ των κορυφών της OFL και της NOR και µεταξύ της DAN και της ENR. Σχετικά µε τη µελέτη της σταθερότητας αποδείχθηκε πως τα πυκνά διαλύµατα των επτά φθοροκινολονών ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR και SAR παραµένουν σταθερά στους +4 o C για χρονικό διάστηµα δύο µηνών, ενώ τα πυκνά διαλύµατα των OXO, NAL και FLU στις ίδιες συνθήκες είναι σταθερά µόνο για δύο εβδοµάδες. Αντίθετα τα αραιά διαλύµατα των κινολονών δεν παρέµεναν σταθερά παραπάνω από 24 ώρες, ακόµα και στους +4 o C. Σε δείγµατα εµβολιασµένα µε µίγµα των δέκα µελετώµενων κινολονών που διατηρήθηκαν στους -20 o C, οι κινολόνες παρέµεναν σταθερές σε όλα τα µελετώµενα υποστρώµατα για µία µόνο εβδοµάδα. Επίσης 248

262 Ανακεφαλαίωση-Συµπεράσµατα, Κεφάλαιο 17 ο δείγµατα εµβολιασµένα που διατηρούνταν στους -20 o C παρέµειναν σταθερά µόνο για τους τρεις κύκλους ψύξης-απόψυξης. Η µέθοδος αποδείχθηκε γραµµική για τους τρεις µελετώµενους ιστούς, µε τιµές των συντελεστών συσχέτισης r, για βόειο µυϊκό ιστό , για χοίρειο µυϊκό ιστό και για πρόβειο µυϊκό ιστό Τα όρια ανίχνευσης κυµαίνονται για τους µελετώµενους ιστούς µεταξύ 10 και 17 µg/kg. Οι ανακτήσεις της χρωµατογραφικής µεθόδου κυµαίνονται µεταξύ 96.3% και 101.6% για µυϊκό ιστό βοοειδών, µεταξύ 98.2% και 107.4% για µυϊκό ιστό προβάτου και µεταξύ 92.0% και 102.8% για µυϊκό ιστό χοίρων. Ο υπολογισµός των CC α και CC β έγινε σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%, µε τιµές σφάλµατος α µεταξύ 0.21 και 2.94 και τιµές σφάλµατος β µεταξύ 0.21 και 1.65, αντίστοιχα. Τέλος από τα αποτελέσµατα της ανάλυσης παλινδρόµησης για τη σύγκριση των καµπυλών αναφοράς των τριών ιστών προέκυψε πως µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ανάλυση όλων των σχετικών δειγµάτων, µε αποδεκτό ποσοστό σφάλµατος. Στη συνέχεια δύο διαφορετικές χρωµατογραφικές µέθοδοι, σε δύο συστήµατα HPLC αναπτύχθηκαν για τον προσδιορισµό των δέκα µελετώµενων κινολονών (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών και σε κρόκο αυγού. Η µέθοδος που εφαρµόστηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό των δέκα κινολονών σε δείγµατα µυϊκού ιστού πουλερικών είναι όµοια µε τη µέθοδο που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισµό των ίδιων κινολονών σε δείγµατα µυϊκού ιστού βοοειδών, προβάτου και χοίρου. Η µέθοδος που εφαρµόστηκε για τον προσδιορισµό των µελετώµενων κινολονών σε δείγµατα κρόκου αυγού αναπτύχθηκε στο δεύτερο σύστηµα HPLC Shimadzu, µε αντλία βαθµωτής έκλουσης LC-10AD VP και ανιχνευτή PDA SPD-M10A VP. Στο δεύτερο σύστηµα HPLC ο συνολικός χρόνος ανάλυσης ήταν περίπου 27 min, µε τιµές διακριτικής ικανότητας µεγαλύτερες του 1.3. Η προκατεργασία των δειγµάτων µυϊκού ιστού των πουλερικών γίνεται εφαρµόζοντας το πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε για τα υπόλοιπα δείγµατα µυϊκού ιστού, που µελετήθηκαν προηγουµένως. Για την εκχύλιση των προσδιοριζόµενων κινολονών από δείγµατα κρόκου αυγού χρησιµοποιήθηκε διαλύτης εκχύλισης NaOH 0.75 M σε CH 3 CN και στη συνέχεια ο καθαρισµός των δειγµάτων έγινε µε SPE σε µικροστήλες Lichrolut RP-18, Merck. Οι µέθοδοι αποδείχθηκαν γραµµικές για τα δύο υποστρώµατα, µε τιµές των συντελεστών συσχέτισης r, για το µυϊκό ιστό πουλερικών και για τον 249

263 Ανακεφαλαίωση-Συµπεράσµατα, Κεφάλαιο 17 ο κρόκο αυγού Τα όρια ανίχνευσης κυµαίνονται για το µυϊκό ιστό πουλερικών µεταξύ 5 και 12 µg/kg, ενώ για τον κρόκο αυγού ήταν 8 µg/kg. Οι ανακτήσεις της χρωµατογραφικής µεθόδου κυµαίνονται µεταξύ 96.7% και 102.8% για µυϊκό ιστό πουλερικών και µεταξύ 96.4% και 102.8% για τον κρόκο αυγού. Ο υπολογισµός των CC α και CC β έγινε σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%, µε τιµές σφάλµατος α µεταξύ 0.02 και 5.25 για τον µυϊκό ιστό πουλερικών και µεταξύ 0.61 και 3.56 για τον κρόκο αυγού και τιµές σφάλµατος β µεταξύ 0.02 και 2.16 για τον µυϊκό ιστό πουλερικών και µεταξύ 0.39 και 3.13 για τον κρόκο αυγού, αντίστοιχα. Η HPLC µέθοδος που αναπτύχθηκε στο σύστηµα HPLC για τον προσδιορισµό των δέκα µελετώµενων κινολονών (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε δείγµατα κρόκου αυγού εφαρµόστηκε επίσης για τον προσδιορισµό των ίδιων κινολονών σε αγελαδινό γάλα. Για την παραλαβή των κινολονών από το υπόστρωµα αρχικά έγινε αποπρωτεΐνωση του γάλακτος µε διαλύτη TFA 25% σε CH 3 OH και στη συνέχεια τα δείγµατα καθαρίστηκαν επίσης µε SPE σε µικροστήλες Lichrolut RP-18, Merck. Η µέθοδος ήταν γραµµική, µε τιµές των συντελεστών συσχέτισης r, Τα όρια ανίχνευσης κυµαίνονται µεταξύ 1.6 και 6.8 ng/µl. Οι ανακτήσεις της χρωµατογραφικής µεθόδου κυµαίνονται µεταξύ 96.0% και 110.0%. Ο υπολογισµός των CC α και CC β έγινε σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%, µε τιµές σφάλµατος α µεταξύ 1.80 και 4.10 και τιµές σφάλµατος β µεταξύ 0.66 και 3.44, αντίστοιχα. Τέλος η παραπάνω χρωµατογραφική µέθοδος χρησιµοποιήθηκε επίσης για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό των δέκα κινολονών (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού. Το πρωτόκολλο που εφαρµόστηκε για την προκατεργασία των δειγµάτων είναι όµοιο µε αυτό που εφαρµόστηκε στην περίπτωση των διαφόρων µυϊκών ιστών. Από την επικύρωση των µεθόδων προέκυψε πως οι δύο µέθοδοι ήταν γραµµικές για τα δύο υποστρώµατα, µε τιµές των συντελεστών συσχέτισης r, για τα δείγµατα βόειου ήπατος και χοίρειου νεφρού Τα όρια ανίχνευσης κυµαίνονται στο βόειο ήπαρ µεταξύ 3 και 7 µg/kg και στο χοίρειο νεφρό µεταξύ 3 και 4 µg/kg. Οι ανακτήσεις της χρωµατογραφικής µεθόδου κυµαίνονται µεταξύ 97.3% και 104.7%, για τα δείγµατα βόειου ήπατος και µεταξύ 95.6% και 102.5%, για τα δείγµατα χοίρειου νεφρού. Ο υπολογισµός των CC α και CC β έγινε σε επίπεδο εµπιστοσύνης 95%, µε τιµές σφάλµατος α µεταξύ 0.56 και 5.25 για τα δείγµατα βόειου ήπατος και µεταξύ 0.92 και 3.47 για τα δείγµατα χοίρειου νεφρού και τιµές σφάλµατος β µεταξύ 0.38 και 250

264 Ανακεφαλαίωση-Συµπεράσµατα, Κεφάλαιο 17 ο 5.28 για τα δείγµατα βόειου ήπατος και µεταξύ 0.54 και 3.69 για τα δείγµατα χοίρειου νεφρού, αντίστοιχα. Συµπερασµατικά οι µέθοδοι που αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν ήταν σχετικά απλές και εύχρηστες. Οι προκατεργασίες των δειγµάτων ήταν σύντοµες, µε µικρή κατανάλωση διαλυτών, εξασφαλίζοντας υψηλή καθαρότητα των δειγµάτων, αποµακρύνοντας τυχόν παρεµποδίσεις και πετυχαίνοντας σταθερά υψηλές ανακτήσεις. Επίσης αποδείχθηκε πως χωρίς µεγάλο ποσοστό σφάλµατος µπορούν να χρησιµοποιηθούν κάποιες καµπύλες αναφοράς για τον προσδιορισµό αυτών των κινολονών σε διαφορετικά υποστρώµατα, παρέχοντας τη δυνατότητα εύκολης εφαρµογής των µεθόδων για διαγνωστικούς σκοπούς αλλά και για ποιοτικό έλεγχο. Οι µέθοδοι που αναπτύχθηκαν στα δείγµατα τροφίµων ζωικής προέλευσης επικυρώθηκαν όλες σύµφωνα µε την απόφαση της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2002/657/EC. Συνεπώς οι µέθοδοι αυτές µπορούν να χρησιµοποιηθούν σε επίσηµους ελέγχους των συγκεκριµένων τροφίµων πριν την κατανάλωση από το κοινό, µε σκοπό την προστασία των καταναλωτών. 251

265 Extended Summary, Κεφάλαιο 18 ο 18. EXTENDED SUMMARY DEVELOPMENT AND VALIDATION OF HPLC METHODS FOR THE DETERMINATION OF QUINOLONES IN VARIOUS EDIBLE TISSUES, PRODUCTS OF FOOD-PRODUCING ANIMALS AND PHARMACEUTICAL FORMULATIONS. In the present work, different methods for the analysis of human and veterinary pharmaceutical formulations of quinolones and for the multi-residue determination of quinolones in various edible tissues and products of food-producing animals using HPLC, are developed. Ten quinolones are examined herein: enoxacin, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin, oxolinic acid, nalidixic acid and flumequine. The method has initially been developed for the separation of the examined quinolones in standard solution, using an HPLC system of Shimadzu with a gradient pump LC 9A and an SPD M6A detector. The analytical column was a C 18 PerfectSil Target ODS-3 (250 x 4 mm, 3&5 µm), provided by MZ-Analysentechnik. The mobile phase was a mixture of Α: TFA 0.1%, B: CH 3 CN and C: CH 3 OH delivered to the system by a gradient program, at a constant flow rate of 1.3 ml/min. The chromatogram was monitored at 275 nm for ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR and SAR and at 255 nm for OXO, NAL and FLU. For the quantitative determination, caffeine was used as internal standard, at a concentration of 7.5 ng/µl. The separation was achieved within 33 min, with resolution factors greater than 1.1. During method validation, it has been proved that the method was quite reproducible concerning the retention times of quinolones and their peak areas. Regression analysis revealed correlation coefficients between and , proving the linearity of the method. LOD defined as 3.3σ/S, was 10 ng for ENO, OFL, NOR, CIP, SAR and FLU, 5 ng for DAN, ENR and NAL and 15 ng for OXO. RSD values from the repeatability study ranged between 0.1 and 4.1% and RSD values from the precision study ranged between 0.3 and 7.8%. The developed method was applied to the analysis of commercial pharmaceutical formulations for human and veterinary medicine. The accuracy of the method was proved to be satisfactory, with only exception the one noticed for ENR injectable 252

266 Extended Summary, Κεφάλαιο 18 ο solution, where a mean relative error of 25% was obtained. However, similar results were also found in our previous paper. The developed method was then applied to the simultaneous multi-residue determination of the examined quinolones (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL and FLU) in bovine, porcine and ovine muscle tissues. The isolation of the quinolones from the matrix was performed by solid-liquid extraction, using TFA 0.1% in CH 3 OH. The sample was further purified by SPE on Lichrolut RP-18 Merck cartridges. The chromatographic method was validated according to the European Decision 2002/657/EC. The method was proved to be specific, as no endogenous interference was noticed at the retention times of quinolones. Concerning the robustness of the method using different column temperature, peak shape and resolution of all analytes were remained the same, but it was noticed that as the temperature increased, the sensitivity of the method decreased. To check the robustness of the method, different TFA concentrations were also examined: 0.05, 0.075, and 0.15%. The lower the concentration of TFA the worse the resolution between OFL and NOR it was. Moreover, at higher TFA concentrations DAN, and ENR, resolution deteriorated. The robustness of the method was also checked in terms of different flow rates. The modification of the flow rate influenced only the retention times of the analytes. At a lower flow rate the total time of analysis increased (35 min), while the resolution factors remained the same. At a higher flow rate the total analysis time was decreased by about 3 min, but the inlet pressure was extremely high. The final test for robustness was the modification of the gradient program, which influenced the resolution between OFL and NOR and between DAN and ENR. Stock solutions of fluoroquinolones (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, and SAR) were found to be stable for 2 months at +4 o C, in contrast to stock solutions of OXO, NAL and FLU, which were stable only for a couple of weeks at the same conditions. Working solutions of the examined quinolones were proved to be unstable at +4 o C and they had to be prepared daily. It has also been proved that quinolones were stable in the matrix for one week, at 20 o C and for three freezing and defrosting cycles. The method was proved to be linear for the three studied tissues with coefficient correlations varying between and for bovine muscle tissue, between and for porcine muscle tissue and between and for ovine muscle tissue. The limits of detection for the three tissues ranged from 10 to 17 µg/kg. The 253

267 Extended Summary, Κεφάλαιο 18 ο recoveries of the proposed method ranged from 96.3 to 101.6% for bovine muscle tissue, between 98.2 and 107.4% for ovine muscle tissue and between 92.0 and 102.8% for porcine muscle tissue. The calculations of CC α and CC β were performed at 95% confidential level. The values of error α were between 0.21 and 2.94 and these of error β were between 0.21 and A benefit and novelty of the specific study is the multifunction of the calibration curves that are suitable for all kinds of tissues. Two methods were developed for the determination of the examined quinolones in chicken muscle samples and in sample of egg yolk, respectively, using two different HPLC systems. The method applied to the determination of the quinolones in samples of chicken muscle was identical to the method applied to the bovine, ovine and porcine tissues. The second method for the determination of the ten quinolones in samples of egg yolk was developed on an HPLC system of Shimadzu, with a gradient pump LC- 10AD VP and a detector SPD-M10A VP. The separation of quinolones using the second HPLC system was achieved within 27 min, with resolution values greater than 1.3. The samples of chicken muscle were pretreated according to the same protocol as the one applied to the other muscle tissues. On the contrary the extraction of quinolones from egg yolk was performed with extraction solvent NaOH 0.75 M in CH 3 CN, followed by SPE on Lichrolut RP-18 cartridges. The methods were proved to be linear with values of coefficient correlations for chicken muscle varying between and and for egg yolk between and The limits of detection for chicken muscle varied between 5 and 12 µg/kg and for egg yolk were 8 µg/kg. The recoveries of the proposed method ranged from 96.7 to 102.8% for chicken muscle and from 96.4 to 102.8% for egg yolk. The values of error α were between 0.02 and 5.25 for chicken muscle and between 0.61 and 3.56 for egg yolk and these of error β were between 0.02 and 2.16 for chicken muscle and between 0.39 and 3.13 for egg yolk. Calculations of CC α and CC β were performed at 95% confidential level. The HPLC method developed for the determination of the ten quinolones in samples of egg yolk was successfully applied to the simultaneous determination of the same quinolones in milk. For the extraction of the quinolones from milk, the sample was initially defatted with the solution of TFA 25% in CH 3 OH, followed by further clean up on SPE Lichrolut RP-18 cartridges. 254

268 Extended Summary, Κεφάλαιο 18 ο The method was linear with values of correlation coefficient varying between and The limits of detection ranged between 1.6 and 6.8 ng/µl. The recoveries were between 96.0 and 110.0%. The values of error α were between 1.80 and 4.10 and these of error β were between 0.66 and 3.44, for calculations of CC α and CC β performed at 95% confidential level. Finally the chromatographic method mentioned above was also applied to the multi-residue determination of the examined quinolones in samples of bovine liver and porcine kidney. The protocol applied to the extraction of the quinolones from the studied matrices was similar to that applied to the previously studied muscle tissues. The validation of the methods revealed their linearity with values of correlation coefficient being between and for bovine liver and between and for porcine kidney. The LODs for bovine liver were between 3 and 7 µg/kg and for porcine kidney between 3 and 4 µg/kg. The recoveries of the method were % for bovine liver and % for porcine kidney. The values of error α were between 0.56 and 5.25 for bovine liver and between 0.92 and 3.47 for porcine kidney and these of error β were between 0.38 and 5.28 for bovine liver and between 0.54 and 3.69 for porcine, for calculations of CC α and CC β performed at 95% confidential level. Conclusively it could be said that all the developed and validated methods are simple and easy to be applied. The sample pre-treatment is not time-consuming, requires low consumption of solvents, while it provides satisfactory clean up of the samples and reproducibly high recoveries. The multi-function of calibration curves for different tissues has also been proved with no significant error. All the developed methods in this study for the determination of quinolones in food samples were validated according to the criteria determined by the European Decision 2002/657/EC. This makes them applicable to the quality control of the respective food samples, preventing the consumption of quinolones through human nutrition. 255

269 Βιβλιογραφικές Παραποµπές, Κεφάλαιο 19 ο 19. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ [1] (September 2007). [2] Antibiotic Resistance in the European Union Associated with Therapeutic Use of Veterinary Medecines, EMEA/CVMP/342/99-corr-Final (14 July 1999). [3] (September 2007). [4] A.M. Emmerson, A.M. Jones, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 51, (2003). [5] J.M. Domagala, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 33, (1994). [6] P.C. Appelbaum, P.A. Hunter, International Journal of Antimicrobial Agents, 16, 5 15 (2000). [7] G.E. Stein, Pharmacotherapy, 8, (1998). [8] S. Radl, Pharmacology Therapy, 48, 1 17 (1990). [9] G.S. Tillotson, Journal of Medicine Microbiology, 44, (1996) [10] V.F. Samanidou, E.A. Christodoulou, I.N. Papadoyannis, Current Pharmaceutical Analysis, 1, (2005). [11] (September 2007). [12] R.A. Robson, International Journal of Antimicrobial Agents, 2, 3-10 (1992). [13] K. Naber, D. Adams, International Journal of Antimicrobial Agents, 10, (1998). [14] (November 2007). [15] N.A. Botsoglou, D.J. Fletouris, Drug Residues in Foods, Pharmacology, Food Safety and Analysis, Marcel Dekker (2001). [16] S. Schwarz, E. Chaslus-Dancla, INRA, EDP Sciences, 32, (2001). [17] C. Blasco, C.M. Torres, Y. Pico, Trends in Analytical Chemistry, Progress in analysis of residual antibecterials in food, accepted manuscript (2007). [18] European Union, Council and Parliament on Regulation on feed additives as growth promoters: Commissioner Byrne welcomes adoption on feed additives, Press release rapid, Brussels, 22 July 2003, (2007). [19] K. Kummerer, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 52, 5-7 (2003). [20] S. Bogialli, A. Di Corcia, A. Lagana, V. Mastrantoni, M. Sergi, Rapid Communications in Mass Spectrometry 21, (2007). 256

270 Βιβλιογραφικές Παραποµπές, Κεφάλαιο 19 ο [21] G.Z. Fang, J.X. He, S. Wang, Journal of Chromatography A, 1127, (2006). [22] M. Reig, F. Toldra, Meat Science, 78 (1-2), (2008). [23] E. Perez-Trallero, C. Ziorraga, International Journal of Antimicrobial Agents, 6, (1995). [24] (September 2007). [25] (August 2005). [26] (August 2005). [27] (August 2005). [28] (August 2005). [29] (September 2007). [30] Council Directive 89/397/EEC of 14 June 1989 on the official control of foodstuffs. Official Journal of European Community 1989, L186, [31] Council Regulation (EEC) No 2377/90 of 26 June 1990 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. Official Journal of European Community 1997, L67, 1-8. [32] Council Directive (EEC) 508/1999 of 4 March 1999 on the amendment of Annexes I to IV of Council Regulation 2377/90 for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. Official Journal of European Community 1999, L60, [33] Council Directive 96/23/EC of 29 April 1996 on measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and animal products and repealing Directives 85/358/EEC and 86/469/EEC and Decisions 89/187/EEC and 91/664/EEC. Official Journal of European Community 1996, L125, [34] Commission Decision 2002/657/EC of 14 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of European Community 2002, L221, [35] A. Braithwaite, F.J. Smith, Chromatographic Methods, 5 th edition, Kluer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London (1996). [36] L.R. Snyder, J.J. Kirkland, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2 nd edition, John Willey& Sons, Inc, New York, Chichester, Brisbane, Toronto (1979). 257

271 Βιβλιογραφικές Παραποµπές, Κεφάλαιο 19 ο [37] Ι.Ν. Παπαδογιάννης, Β.Φ Σαµανίδου, Εισαγωγή στην Ενόργανη Χηµική Ανάλυση, Πήγασος 2000 (2001). [38] H.Y. Aboul-Enein, Separation Techniques in Clinical Chemistry, Marcel Dekker, Inc. (2003). [39] P.L. Buldini, L.Ricci, J.L.Sharma, Journal of Chromatography A, 975, (2002). [40] J.R. Dean, Extraction Methods for Envoronmental Analysis, John Willey& Sons, Chichester, New York, Weinheim, Brisbane, Singapore, Toronto (1998). [41] S. Mitra, Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry, Willey- Interscience, John Willey& Sons, Inc., Publication (2003). [42] J.M. Green, Analytical Chemistry, 68, 305A-309A (1996). [43] Validation of Analytical Methods for Food Control, A Report of a Joint FAO/IAEA Expert Consultation, 2-4 December 1997, Vienna, Austria. [44] Validation of Chromatographic Methods, Reviewer Guidance, Center for Drug Evaluaion and Research (November 1994). [45] E. Verdon, D. Hurtaud-Pessel, P. Sanders, Accredited Quality Assurance, 11, (2006). [46] Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, Q2(R1) Current Step 4 version, Parent Guideline dated 27 October 1994 (Complementary Guideline on Methodology dated 6 November 1996, incorporated in November 2005) International Conference on Harmanisation of Technical Requirements for Registration of pharmaceuticals for Human Use. [47] J.N. Miller, J.C. Miller, Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 5 th edition, Pearson Prentice Hall (2005). [48] L.M. Du, H.Y.Yao, M. Fu, Spectrochimica Acta, 61, (2005). [49] Du L. Ming, Y.Qin Yang. Wang Q. Mei, Analytica Chimica Acta, 516, (2004). [50] D. Liming, X. Qingqin, Y. Jianmei, Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis, 33, (2003). [51] M. Rizk, F. Belal, F. Ibrahim, S. Ahmed, N.M. El-Enany, Pharmaceutica Acta Helvetiae, 74, (2000). [52] C. Sastry, K. Rama Rao, D. Siva Prasad, Talanta, 42 (3), (1995). [53] M. El-Kommos, G. Saleh, S. El-Gizawi, M. Abou-Elwafa Talanta, 60, (2003). 258

272 Βιβλιογραφικές Παραποµπές, Κεφάλαιο 19 ο [54] L. Fratini, E. Schapoval, International Journal of Pharmaceutics, 127, (1996). [55] M. Cordoba-Borrego, M. Cordoba-Diaz, I. Bernabé, D. Cordoba-Diaz, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, (1996). [56] S.Z. El Khateeb, S.A. Abdel Razek, M.M. Amer, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 17 (4-5), (1998). [57] A. Fattah M. El Walily, O.A. Razak, S.F. Belal, R.S. Bakry, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 21, (1999). [58] I. Suslu, A.Tamer, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 29, (2002). [59] M.I. Pascual-Reguera, G. Perez Parras, A. Molina Diaz, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35, (2004). [60] M.I. Pascual-Reguera, G.,Perez Parras, A. Molina Diaz, Microchemical Journal, 77, (2004). [61] N. Rahman, Y. Ahmad, S.N. Hejaz Azmi, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 57, (2004). [62] F. Eldin, O. Suliman, S. Sultan, Talanta, 43, (1996). [63] A.F.M. El Walily, S.F. Belal, R. Bakry, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 14, (1996). [64] S. Mostaza, M. El-Sadek, E.A. Alla, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 28 (1), (2002). [65] A.M. El-Brashy, M. El-Sayed Metwally, F.A. El-Sepai, Il Farmaco, 59, (2004) [66] Ev L. Silveira, E. Schapoval, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 27, (2002). [67] S. Mostaza, M. El-Sadek, E.A. Alla, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 27 (1-2), (2002). [68] P. Conti, G. Corbini, P. Gratteri, S. Furlanetto, S. Pizauti, International Journal of Pharmaceutics, 111, (1994). [69] A. Jaber, A. Lounici, Analytica Chimica Acta, 291,53-64 (1994). [70] G. Zhou, J. Pan Analytica Chimica Acta, 307, (1995). [71] M. Rizk, F. Belal, F.A. Aly, N.M. El-Enany, Talanta, 46 (1),83-89 (1998). [72] M.M. Ghoneim, A. Radi, A.M. Beltagi, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 25, (2001) 259

273 Βιβλιογραφικές Παραποµπές, Κεφάλαιο 19 ο [73] A.M. Abulkibash, S.M. Sultan; A.M. Al-Olyan, S.M. Al-Ghannam Talanta, 61 (2), (2003). [74] A. Navalon, R. Blanc, L. Reyes, N. Navas; J.L. Vilchez, Analytica Chimica Acta, 454, (2002). [75] M. Rizk, F. Belal, F. Ibrahim, S. Ahmed, N. El-Enany, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 24, (2000). [76] L. Yi, H. Zhao; S. Chen, L. Jin, D. Zheng, Z. Wu, Talanta, 61, (2003). [77] J.X. Du, Y.H. Li, J.R. Lu, Luminescence, 20(1), (2005). [78] Y-D. Liang, J-F. Song, X-F. Yang, Analytica Chimica Acta, 510, (2004). [79] F. Aly, S. Al-Tamimi, A. Alwarthan, Talanta, 53, (2001). [80] G. Ragab, A. Amin, Spectrochimica Acta Part A, 60, (2004). [81] J. Novakovic, K. Nesmerak, H. Nova, K. Filka, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 25, (2001). [82] G. Fardella, P. Barbetti, I. Chiappini, G. Grandolini, International Journal of Pharmaceutics, 121, (1995). [83] K. Michalska, G. Pajchel, S. Tyski, Journal of Chromatography A, 1051, (2004). [84] C. Fierens, S. Hillaert, W. van de Bossche, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 22, (2000). [85] P. Lacroix, N. Curran, R. Sears, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 14, (1996). [86] M. Cordoba-Borrego, M. Cordoba-Diaz, D. Cordoba-Diaz, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 18, (1999). [87] S.Thoppil, P.D. Amin, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 22, (2000). [88] A. Zotou, N.Miltiadou, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 28, (2002). [89] V.F. Samanidou, C.E. Demetriou, I.N. Papadoyannis, Analytical Bioanalytical Chemistry, 375, (2003). [90] J.Y. Shen, M.R. Kim, C.J. Lee, I.S. Kim, K.B. Lee, J.H. Shim, Analytica Chimica Acta, 513, (2004). [91] S. Bailllac, O. Ballesteros, E. Jimenez-Lozano, V. Sanz-Nebot, A. Navalon, J. Barbosa, Journal of Chromatography A, 1029, (2004). 260

274 Βιβλιογραφικές Παραποµπές, Κεφάλαιο 19 ο [92] J.A. Hernandez-Arteseros, J.L. Beltran, R. Compano, M.D. Prat, Journal of Chatography A, 942, (2002). [93] J. Lim, B. Park, H. Yun, Journal of Chromatography B, 772, (2002). [94] M.J. Schneider, D.J. Donoghue, Journal of Chromatography B, 780, (2002). [95] G. van Vyncht, A. Janosi, G. Bordin, B. Toussaint, G. Maghuin-Rogister, E. De Pauw, A.R. Roriguez, Journal of Chromatography A, 952, (2002). [96] C. Maraschiello, E. Cusido, M. Abellan, J. Vilageliu, Journal of Chromatography B, 754, (2001). [97] P.G. Gigosos, P.R. Rvesado, O. Cadahia, C.A. Fente, B.I. Vazquez, C.M. Franco, A. Cepeda, Journal of Chromatography A, 871, (2000). [98] J.C. Yorke, P. Froc, Journal of Chromatography A, 882, (2000). [99] E. Cohen, R.J. Maxwell, D.J. Donoghue, Journal of Chromatography B, 724, (1999). [100] R.J. Maxwell, E. Cohen, D.J. Donoghue, Journal of Agricultural Food Chemistry, 47, (1999). [101] A. Posyniak, J. Zmudzki, S. Stanislaw, J. Niedzkielska, R. Ellis, Biomedical Chromatography, 13, (1999). [102] G.Y. Eng, R.J. Maxwell, E. Cohen, E.G. Piotrowski, W. Fiddler, Journal of Chromatography A, 799, (1998). [103] B. Delepine, D. Hurtaud-essel, P. Sanders, The Analyst, 123, (1998). [104] M.D. Rose, J. Bygrave, G.W.F. Stubbings, The Analyst, 123, (1998). [105] J. Guyonnet, M. Pacaud, M. Richard, A. Doisi, F. Spavone, Ph. Hellings, Journal of Chromatography B, 679, (1996). [106] T.J. Strelevitz, M.C. Linhares, Journal of Chromatography B, 675, (1996). [107] L. Ellerbroek, M. Bruhn, Journal of Chromatography B, 495, (1989). [108] M. Horie, K. Saito, N. Nose, H. Nakazawa, Journal of Chromatography B, 653 (1), (1994). [109] N. Shiga, O. Matano, Journal of Chromatography A, 643 (1-2), (1993). [110] M Ramos, A. Aranda, E. Garcia, T. Reuvers, H. Hooghuis, Journal of Chromatography B, 789, (2003). [111] N. Van Hoof, K. De Wash, L. Okerman, W. Reybroek, S. Poelmans, N. Hoppe, H. De Brabander, Analytica Chimica Acta, 529, (2005). 261

275 Βιβλιογραφικές Παραποµπές, Κεφάλαιο 19 ο [112] M.A. Garcia, C. Solans, A. Calvo, E. Hernandez, R. Rey, M.A. Bregante, M. Puig, Biomedical Chromatography, 19, (2005). [113] C. Kowalski, Z. Rolinski, T. Slawik, B.K. Glod, Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 28, (2005). [114] I. Steffenak, V. Hormazabal, M. Yndestad, Journal of Liquid Chromatography, 14(1), (1991). [115] M.P. Hermo, D. Barron, J. Barbosa, Analytica Chimica Acta 539, (2005). [116] B. Toussaint, M. Chedin, G. Bordin, A.R. Rodriquez, Journal of Chromatography A, 1088, (2005). [117] S. Bailac, D. Barron, V. Sanz-Debot, J. Barbosa, Journal of Separation Science, 29, (2006). [118] V.F. Samanidou, E.A. Christodoulou, I.N. Papadoyannis, Journal of Separation Science, 28, (2005). [119] A. Rubies, R. Vaquerizo, F, Centrich, R. Compano, M. Granados, M.D. Prat, Talanta, 72(1), (2007). [120] M.D. Marazuela, M.C. Moreno-Bondi, Journal of Chromatography A, 1034, (2004). [121] O.R. Idowu, J.O. Peggins, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35, (2004). [122] A.L. Cinquina, P. Roberti, L. Giannetti, F. Longo, R. Draisci, A. Fagiolo, Journal of Chromatography A, 987, (2003). [123] C. Ho, D.W.M. Sin, H.P.O. Tang, L.P.K. Chunk, S.M.P. Siu, Journal of Chromatography A, 1061, (2004). [124] G. Yang, B. Lin, Z. Zeng, Z. Chen, X. Huang, Journal of AOAC International, 88 (6), (2005). [125] M.J. Schneider, D.J. Donoghue, Analytica Chimica Acta, 483, (2003). [126] Z. Yeng, A. Dong, G. Yang, Z. Chen, X. Huang, Journal of Chromatography B, 821, (2005). [127] J-F. Huang, B. Lin, Q-W. Yu, Analytical Bioanalytical Chemistry, 384, (2006). [128] M.K. Hassouan, O. Ballesteros, J. Taoufiki, J.L. Vilchez, M. Cabrera-Aguilera, A. Navalon, Journal of Chromatography B, 852 (1-2), (2007). [129] M. Lolo, S. Pedreira, C. Fente, B.I. Vazquez, C.M. Franco, A. Cepeda, Analytica Chimica Acta, 480, (2003). 262

276 Βιβλιογραφικές Παραποµπές, Κεφάλαιο 19 ο [130] J.L. Beltran, E. Jimenez-Lozano, D. Barron, J. Barbosa, Analytica Chimica Acta, 501, (2004). [131] D. Barron, E. Jimenez-Lozano, S. Baillac, J. Barbosa, Journal of Chromatography B, 767, (2002). [132] D. Barron, E. Jimenez-Lozano, J. Cano, J. Barbosa, Journal of Chromatography B, 759, (2001). [133] D. Barron, E. Jimenez-Lozano, S. Baillac, J. Barnosa, Analytica Chimica Acta, 477, (2003). [134] F.J. Lara, A.M. Garcia-Campana, F. Ales-Barrero, J.M. Bosque-Sendra, L.E. Garcia-Ayuso, Analytical Chemistry, 78, (2006). [135] I. Choma, D. Grenda, I. Malinowska, Z. Suprynowicz, Journal of Chromatography B, 734, 7-14 (1999). [136] I. Choma, I. Komaniecka, Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 28, (2005). [137] J.A. Hernandez-Arteseros, R. Compano, M.D. Prat, The Analyst, 123, (1998). [138] L.F. Capitan-Vallvey, O.M.A. Al-Barbarawi, M.D. Fernandez-Ramos, R. Avidad, Talanta, 60, (2003). [139] V.F. Samanidou, E.A. Christodoulou, I.N. Papadoyannis, Journal of Separation Science, 28, (2005). 263

277 Παράρτημα, Κεφάλαιο 20 ο 20. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Στο παράρτημα που ακολουθεί παραθέτονται οι εργασίες που προέκυψαν, από τη διδακτορική διατριβή όπως δημοσιεύτηκαν σε σχετικά επιστημονικά περιοδικά. 264

278 2444 Samanidou, Christodoulou, Papadoyannis Victoria F. Samanidou Eleni A. Christodoulou Ioannis N. Papadoyannis Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki, Greece Validation of a novel HPLC sorbent material for the determination of ten quinolones in human and veterinary pharmaceutical formulations A novel sorbent material of ultrapure silica gel provided with novel State of the Art Bonding- and Endcapping Technology commercially available under the name PerfectSilm Target (25064 mm, ODS-3, 5 lm, by MZ-Analysentechnik, Germany) was used and validated for the sensitive HPLC determination of ten quinolone antibiotics: enoxacin, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin (DAN), enrofloxacin (ENR), sarafloxacin, oxolinic acid (OXO), nalidixic acid (NAL), and flumequine. The analytical column validation was performed in terms of separation efficiency, precision, and peak asymmetry. The separation was achieved at ambient temperature using a mobile phase of TFA (0.1%) CH 3 OH CH 3 CN delivered under the optimum gradient program, at a flow rate of 1.2 ml/min. Photodiode array detection was used and eluant was monitored at 275 nm. For the quantitative determination caffeine (7.5 ng/ll) was used as internal standard. The achieved LODs were 0.03 ng/ll per 50 ll injected volume for OXO, 0.1 ng/ll for DAN, ENR, and NAL, and 0.2 ng/ll for the remaining six studied quinolones. The method was validated in terms of interday (n = 6) and intraday (n = 5) precision and accuracy. The proposed method was successfully applied to the analysis of pharmaceutical formulations destined either for human or for veterinary use. Key Words: HPLC; Human pharmaceuticals; Novel sorbent material; Quinolones; Veterinary drug; Received: June 30, 2005; revised: July 21, 2005; accepted: July 21, 2005 DOI /jssc Introduction Correspondence: Professor Ioannis N. Papadoyannis, Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, GR Thessaloniki, Greece. Fax: papadoya@chem.auth.gr. The first member of quinolone antibiotics nalidixic acid (NAL) was discovered by Lescher and his coworkers in 1962, and it was approved by the Food and Drug Administration (FDA) in 1963 for the treatment of urinary tract infections. The main structural characteristics of quinolones are the carboxylic group in position 3 and the carbonyl group in position 4 as shown in Fig. 1. The next generation of quinolones possesses a 6-fluoro and a 7- piperazinyl moiety. The addition of both these groups enhances the antibacterial activity of quinolones against Gram-positive and Gram-negative pathogens. Quinolones and fluoroquinolones act by inhibiting the bacterial DNA gyrase (topoisomerase II) [1, 2]. From the examined quinolones NAL, oxolinic acid (OXO), and flumequine (FLU) belong to the first generation quinolone antibiotics, enoxacin (ENO), ofloxacin (OFL), norfloxacin (NOR), ciprofloxacin (CIP), and enrofloxacin (ENR) belong to the second generation, while danofloxacin (DAN) and sarafloxacin (SAR) belong to the third generation. The above classification is according to their clinical application and antimicrobial spectrum ( che- micalland21.com/arokorhi/info/quinolone%20class- %20ANTIBIOTICS.htm; accessed 6/9/2004). Most of the commercial drug formulations, especially in the Greek market, are based on the second generation of quinolone antibiotics, called fluoroquinolones. These are the main components of various human medicines, which are prescribed for the treatment of urinary tract infections, infections of the gastrointestinal tract, respiratory tract infections, infections of the skin structure, and also for surgical prophylaxis. Moreover, fluoroquinolones are used for the treatment and prevention of urinary, pulmonary, and digestive infections in animals intended for human consumption [2]. Several analytical methods are published in the literature for the determination of quinolones, applying mainly spectrophotometry [3 22]. Electroanalysis [23 30], chemiluminescence [31 34], atomic absorption spectroscopy [35], high performance TLC [36], and microbiological methods [37] are also reported. However, these methods refer either to the single determination of some antibiotics or the nonsimultaneous multiple determination of up to eight compounds. Separation methods used for the simulta- J. Sep. Sci. 2005, 28, i 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

279 Novel sorbent for HPLC determination of quinolones in pharmaceuticals 2445 Original Paper Figure 1. Chemical structures of examined quinolones. neous multiple determination include one applying CE to the separation of ten compounds [38] and two applying HPLC to four [39] or five quinolones [40]. CE [41] and HPLC methods are also reported for the single determination [42 44]. Among published HPLC methods, analytical columns used involve Inertsil ODS-2 5 lm [42], Kromasil 100 C 18 5 lm [45], Lichrospher 100 RP lm [44], Lichrosorb RP-8 10 lm [43], Kromasil 100 C 8 5 lm [39], and Inertsil C 8 5 lm [40]. All these materials are endcapped and J. Sep. Sci. 2005, 28, i 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

280 2446 Samanidou, Christodoulou, Papadoyannis Table 1. Technical data of PerfectSil Target ODS-3 Parameter Value Modification C18 Particle size, lm 3 and 5 Pore size, Š 100 Pore volume, cm 3 /g 1.1 Surface, m 2 /g 450 Carbon content, % 17 Metal impurity, ppm a 5 spherical in shape except for Lichrosorb, with a similar surface area in the range from 300 to 340 m 2 /g. Herein a novel sorbent material is used and validated for the determination of ten quinolones. PerfectSilm Target (MZ-Analysentechnik, Mainz, Germany) is an ultrapure silica gel (A99.999%) provided with novel State of the Art Bonding- and Endcapping Technology, characterized by excellent chemical and mechanical stability, providing excellent peak symmetry for basic analytes. A significant advantage is that it can be used even for 100% aqueous applications. Table 1 summarizes the technical data of PerfectSil Target ODS-3. The aim of the present work is the evaluation of the above-mentioned sorbent material and the development of a validated chromatographic method for the simultaneous determination of ten quinolones, by HPLC. The method was applied for the determination of certain quinolones, which were the active ingredients of commercially available pharmaceutical formulations for human and veterinary use. The human medicines were formulated as tablets containing OFL, NOR, or CIP. The analyzed veterinary drug was available in three forms: oral solution, injectable solution, and tablets, containing ENR as an active ingredient. The proposed method is simple and suitable for routine determination of the drugs. The analytical column was proved to be excellent for the separation of the examined ten quinolones. 2.1 Reagents and materials ENO, OFL, NOR, nalixic acid (NAL), FLU, and CIP were purchased from Sigma (Steinheim, Germany), ENR A 98%, OXO 97% from Fluka (Steinheim, Germany), and DAN 98.4%, SAR 99.3% VETRANALm from Riedel-de Haen (Buchs SG, Schweiz). Sodium hydroxide (NaOH, 1 mol/l) was purchased from Riedel-de Haen and TFA 99% from Aldrich (Steinheim, Germany). HPLC-grade methanol and ACN were supplied from Carlo Erba (Milano, Italy). Ultrapure water provided by a Milli-Qm purification system (Millipore, Bedford, MA, USA) was used throughout the study. OFL was determined in Tabrin tablets (200 mg) by Aventis (Compiegne, France), NOR was determined in Norocin tablets (400 mg) by Merck (New Jersey, USA), and CIP in Remena tablets (500 mg) by Remedina (Kamatero, Greece). Among examined fluoroquinolones ENR was the only one that was found in the Greek veterinary market under the trade name Baytril by Bayer AG (Leverkusen, Germany). Three formulations were analyzed: one oral solution 0.5% (5 mg/ml), one injectable solution 5% (50 mg/ml), and tablets of 50 mg. 2.2 Instrumentation A Shimadzu (Kyoto, Japan) quaternary low-pressure gradient system was used for the chromatographic determination of the examined quinolones. The solvent lines were mixed in an FCV-9AL mixer, and an LC-9A pump was used to deliver the mobile phase to the analytical column. Sample injection was performed by an SIL-9A autosampler equipped with a 150 ll loop for sample injection, and detection was achieved by an SPD-M6A Photodiode Array Detector, complied with Data acquisition software Class-M10A. Chromatograms were stored on the hard disk of a Function 486 PC and printed on a Star Laser Printer 4. Degassing of the mobile phase was achieved by continuous helium sparging in the solvent reservoirs by a DGU-2A degassing unit. The analytical columns, a PerfectSil Target ODS-3, 5 lm, mm, were kindly donated by MZ-Analysentechnik. A glass vacuum-filtration apparatus obtained from Alltech Associates was employed for the filtration of the buffer solution, using Whatman Cellulose Nitrate 0.2 lm-wcn Type (47 mm DIA) membrane filters. Dissolution of pharmaceuticals in tablet form was achieved by sonication in a Transonic 460/H Ultrasonic bath (Elma, Germany). 2 Experimental 2.3 Chromatographic conditions A PerfectSil Target ODS-3 analytical column (25064 mm), 5 lm, from MZ-Analysentechnik (Mainz, Germany) maintained at ambient temperature was used for the separation of the quinolones. Column effluent was monitored at 275 nm. The mobile phase consisted of TFA (0.1%) CH 3 CN CH 3 OH and was delivered to the analytical column according to the gradient program of Table 2. The flow rate was 1.2 ml/min and the inlet pressure ranged from 290 to 310 kg/cm 2. Caffeine (CAF, 7.5 ng/ll) was used as internal standard (IS). Injected sample volume was 50 ll. J. Sep. Sci. 2005, 28, i 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

281 Novel sorbent for HPLC determination of quinolones in pharmaceuticals Standard solutions, stability Individual stock solutions of 100 ng/ll of ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL, and FLU were prepared in water by dissolving the appropriate amount of quinolone. An aliquot of 100 ll of NaOH 0.1 mol/l per 10 ml was added to enhance solubility of all the compounds. Stock solutions were stored, refrigerated at 48C, and found to be stable for 2 months, except for OXO which was stable only for 3 wk. Working aqueous solutions were prepared daily from stocks. The stock solution of CAF was aqueous at the concentration of 50 ng/ll. 2.5 Validation study Method validation The proposed analytical method was fully validated in terms of sensitivity, selectivity, accuracy, within-day and between-day precision for five consecutive days. Accuracy was studied by analyzing three concentration levels (2, 5, and 10 ng/ll). The relative error of the three measurements was calculated with the following equation: Relative error ð%þ ¼ ½Mean determined value added amountš 6100 added amount In order to evaluate within-day and between-day precision standard solutions at three concentration levels (2, 5, and 10 ng/ll) were used. Each concentration was measured five times within a day and three times for six consecutive days, respectively. Linearity was studied by analyzing mixtures of standard solutions covering the entire working range. Regression analysis revealed calibration curves with the respective correlation coefficients. Method's LODs were estimated upon the criterion of the concentration of the standard solution, which gives the signal of peak high three times the size of the background noise (S/N = 3). Selectivity was assessed by the absence of interference in the same chromatographic windows as examined quinolones in the respective pharmaceutical solutions. Accuracy expressed as relative error was determined by analyzing 50 ll of each pharmaceutical formulation at three different levels (100, 250, and 500 ng) Column validation The analytical column was validated in order to define the particular packing material PerfectSil Target. The characteristics of every peak of the chromatogram, which were defined from the chromatographic validation test, were the number of theoretical plates N = 16(t R /t w ) 2, the tailing factor T f =(A+B) 5% /2A 5%, the relative retention time RRT = t R t 0, the retention factor k =(t R t 0 )/t 0, the resolution factor R s =(t 2 t 1 )/0.5 (t w1 + t w2 ), and the RSD of the retention time and of the area of each peak. 2.6 Sample preparation Tablets Commercial film-coated tablets (five of Tabrin 200 mg, five of Norocin 400 mg, four of Remena 500 mg, and three of Baytril 50 mg) were powdered and an accurately weighed portion of the powdered sample, equivalent to the antibiotic content of every capsule, was quantitatively transferred to a volumetric flask, dissolved and diluted with the appropriate amount of water in order to achieve stock solutions of 400 ng/ll for Tabrin and Norocin, 500 ng/ll for Remena and Baytril. Dilute solutions were subsequently prepared in 0.01 M NaOH to enhance solubility. After dilution, the solutions were sonicated for 15 min and filtered through 0.2 lm membrane filter. Three different concentrations were studied from each solution, with the addition of CAF, the IS, at the concentration of 7.5 ng/ll Oral and injectable solutions Baytril oral solution 0.5% and Baytril injectable solution 5% were simply diluted with water in volumetric flasks to the concentration of 1000 ng/ll. Then, three concentration levels of every drug with the IS at concentration of 7.5 ng/ll were analyzed. 3 Results and discussion 3.1 Chromatography The mobile phase was a gradient program of the mixture of TFA (0.1%) CH 3 OH CH 3 CN according to Table 2. The separation of the ten quinolones was achieved in 33 min. Under the assay conditions described above, the examined fluoroquinolones were well resolved with retention times of min for ENO, min for OFL, min for NOR, min for CIP, min for DAN, min for ENR, min for SAR, min for OXO, min for nalidixic acid, and min for FLU. CAF (IS) was eluted at min. Resolution factors ranged from 1.15 to 5.28, indicating a perfect separation as shown in Fig. 2. Table 2. Gradient timetable t, min TFA (0.1%) CH 3 CN CH 3 OH J. Sep. Sci. 2005, 28, i 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

282 2448 Samanidou, Christodoulou, Papadoyannis Figure 2. Typical HPLC chromatogram of the standard solution of ten quinolones with CAF as IS (7.5 ng/ll). Peaks: CAF (7.620 min), ENO (9 ng/ll, min), OFL (13 ng/ll, min), NOR (9 ng/ll, min), CIP (9 ng/ll, min), DAN (9 ng/ll, min), ENR (4 ng/ll, min), SAR (6 ng/ll, min), OXO (1.5 ng/ll, min), NAL (6 ng/ll, min), FLU (9 ng/ll, min). 3.2 Method validation study Calibration curves using mixtures of standard solutions were obtained by least-squares linear regression analysis of the peak area ratio of analyte to IS versus analyte concentration. The analytical method was linear up to 100 ng/ ll for OFL, DAN, ENR, SAR, and NAL, 70 ng/ll for CIP, 50 ng/ll for ENO and NOR, 55 ng/ll for FLU, and 40 ng/ ll for OXO. Regression equations revealed correlation coefficients ranging between and as shown in Table 3. The LOD for each compound is defined as an S/N, which should be greater than 3. The LOQs of the assay were evaluated upon the criterion S/N = 10. All these values are also shown in Table 3. Excellent repeatability and satisfactory interday precision were noticed with RSD values lower than 4.1 and 7.8%, respectively. Accuracy in both assays was in the range l10%. Precision and accuracy results are summarized in Table 4. Table 3. Linearity and sensitivity data of the developed method for the determination of the ten examined quinolones using CAF (7.620 min) 7.5 ng/ll asis Analytes t R, min Slope, /ng Intercept R 2 LOD, ng Range, ng/ll ENO l 15.77E l OFL l 1.83E l NOR l 4.18E l CIP l 4.36E l DAN l 4.82E l ENR l 6.15E l SAR l 1.07E l OXO l 11.37E l NAL l 1.67E l FLU l 0.94E l J. Sep. Sci. 2005, 28, i 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

283 Novel sorbent for HPLC determination of quinolones in pharmaceuticals 2449 Table 4. Evaluation of intraday and interday precision and accuracy data of quinolones Analyte Added, ng Found l SD, ng Intraday n = 5 Interday n =6 Relative error, % RSD Found l SD, ng Relative error,% ENO l l l l l l OFL l l l l l NOR l l l l l l CIP l l l l l l DAN l l l l l l ENR l l l l l l SAR l l l l l l OXO l l l l l l NAL l l l l l l FLU l l l l l l RSD 3.3 Column validation PerfectSil Target is a novel sorbent supplied by MZ-Analysentechnik. In order to establish its applicability to quinolones analysis, column validation was performed by means of several parameters. These include the number of theoretical plates N, the tailing factor T f, the relative retention time RRT, the retention factor k, the resolution factor R s, and the RSD of the retention time and the area of each peak. The results of this study are presented in J. Sep. Sci. 2005, 28, i 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

284 2450 Samanidou, Christodoulou, Papadoyannis Figure 3. High performance liquid chromatograms of veterinary and human drugs. (A) ENR (5 ng/ll) in Baytril, IS: min, ENR min, (B) OFL (10 ng/ll) in Tabrin, IS: min, OFL: , (C) NOR (10 ng/ll) in Norocin, IS: min, NOR: min, (D) CIP (5 ng/ll) in Remena, IS: min, CIP: min. J. Sep. Sci. 2005, 28, i 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

285 Novel sorbent for HPLC determination of quinolones in pharmaceuticals 2451 Table 5. PerfectSil Target analytical column performance characteristics Analyte t R, min N T f RRT k R s RSD 1 RSD 2 CAF (IS) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU t R : Retention time; theoretical plates: N = 16(t R /t W ) 2. Tailing factor: T f =(A+B) 5% /2 A 5%. RRT: Relative retention time (with reference to IS CAF): RRT = t Ri /t Rcaf. Retention factor: k =(t R t 0 )/t 0. Resolution: R s =(t 2 (t 1 )/0.5(t w1 + t w2 ). RSD 1 : RSD of the retention times of each peak at ten chromatograms. RSD 2 : RSD of the area of each peak at five chromatograms. Table 5. From the reported values it is obvious that the column exhibits a great efficiency for the examined compounds. The highly satisfactory separation may be attributed to its special characteristics that make it different from the other sorbents previously used. The small particle size (3 and 5 lm) leads to significantly higher surface area that is 450 m 2 /g, compared to m 2 /g that the other columns possess. 3.4 Analysis of veterinary drug Each commercially available formulation containing OFL, NOR, ciprofloacin, and ENR was analyzed at three different concentrations (100, 250, and 500 ng). Results of accuracy tests are given in Table 6. These are mean values from three concentration levels and three measurements for each level. Excellent accuracy can be observed for all drug formulations with an exception concerning the ENR injectable solution where a mean relative error of 25% is noticed. However, similar results were found in our previous paper [40]. A representative high performance liquid chromatogram of each drug sample is shown in Fig. 3A D. 4 Concluding remarks The aim of this study was to evaluate PerfectSil Target analytical column containing a novel sorbent material made of ultrapure silica gel provided with novel State of the Art Bonding- and Endcapping Technology, to be used in the development and validation of a direct method for the determination of ten quinolones in various pharmaceutical formulations, for human and veterinary medicine. The analysis was completed within 33 min. The method has been proved to be suitable to monitor the concentration of the studied antibiotics in all these drug formulations. PerfectSil Target was proved to be of excellent performance for the determination of the examined quinolones. The authors would like to thank Dr. Mathäos Chatziathanasiou from MZ-Analysentechnik, Mainz, Germany, for his kind donation of analytical columns PerfectSilm Target. 5 References [1] Botsoglou, N. A., Fletouris, D. J. (Eds.), Drug Residue in Foods, Marcel Dekker, New York [2] Samanidou, V. F., Christodoulou, E. A., Papadoyannis, I. N., Curr. Pharm. Anal. 2005, 1, [3] Du, L. M., Yao, H. Y., Fu, M., Spectrochim. Acta A 2005, 61, [4] Du, L. M., Yang, Y. Q., Wang, Q. M., Anal. Chim. Acta 2004, 516, [5] Liming, D., Qingqin, X., Jianmei, Y., J. Pharm. Biomed. Anal. 2003, 33, [6] Rizk, M., Belal, F., Ibrahim, F., Ahmed, S., El-Enany, N., Pharm. Acta Helvetiae 2000, 74, [7] Sastry, C. S. P., Rao, K. R., Prasad, D. S., Talanta 2005, 42(3), [8] El-Kommos, M. E., Saleh, G. A., El-Gizawi, S. M., Abou- Elwafa, M. A., Talanta 2003, 60, [9] Fratini, L., Schapoval, E. E. S., Int. J. Pharm. 1996, 127, [10] Cordoba-Borrego, M., Cordoba-Diaz, M., Cordoba-Diaz, D., J. Pharm. Biomed. Anal 1996, 41, J. Sep. Sci. 2005, 28, i 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

286 2452 Samanidou, Christodoulou, Papadoyannis Table 6. Precision and accuracy (relative error, RE) data of fluoroquinolones analysis in human and veterinary drug formulations Veterinary drugs Nominal amount, ng Found a) l SD, ng RE, % RSD ENR oral solution l l l Labeled concentration: 0.5% Found concentration: 0.44 l 0.01% ENR injectable solution l l l Labeled concentration: 5% Found concentration: 3.76 l 0.09% ENR tablets l l l Labeled concentration: 50 mg Found concentration: 49.9 l 1.0 mg Human tablets Nominal amount, ng Found a) l SD, ng RE,% RSD CIP tablets l l l Labeled concentration: 500 mg Found concentration: 536 l 4.9 mg NOR tablets l l l Labeled concentration: 400 mg Found concentration: l 14.5 mg OFL tablets l l l a) Mean values of three measurements. [11] Khateeb, S. Z. E., Razek, S. A., Amer, M. M., J. Pharm. Biomed. Anal. 1998, 17, [12] Walily, A. F. M. E., Razak, O. A., Belal, S. F., Bakry, R. S., J. Pharm. Biomed. Anal. 1999, 21, [13] Suslu, I., Tamer, A., J. Pharm. Biomed. Anal. 2002, 29, [14] Pascual-Reguera, M. I., Parras, G. P., Diaz, A. M., J. Pharm. Biomed. Anal. 2004, 35, [15] Pascual-Reguera, M. I., Parras, G. P., Diaz, A. M., Microchem. J. 2004, 77, [16] Rahman, N., Ahmad, Y., Azmi, S. N. H., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004, 57, [17] Sulima, F. E. O., Sultan, S. M., Talanta 1996, 43, [18] El Walily, A. F. M., Belal, S. F., Bakry, R. S., J. Pharm. Biomed. Anal. 1996, 14, [19] Mostafa, S., El-Sadek, M., Alla, E. A., J. Pharm. Biomed. Anal. 2002, 28, [20] El-Brashy, A. M., Metwally, M. E.-S., El-Sepai, F. A., Il Farmaco 2004, 59, [21] da Silveira Ev, L., Schapoval, E. E. S., J. Pharm. Biomed. Anal. 2002, 27, [22] Mostafa, S., El-Sadek, M., Alla, E. A., J. Pharm. Biomed. Anal. 2002, 27, [23] Corti, P., Corbini, G., Gratteri, P., Furlanetto, S., Pinzauti, S., Int. J. Pharm. 1994, 111, [24] Jaber, A. M. Y., Lounici, A., Anal. Chim. Acta 1994, 291, [25] Zhou, G., Pan, J., Anal. Chim. Acta 1995, 307, [26] Rizk, M., Belal, F., Aly, F. A., El-Enamy, N. M., Talanta 1998, 46, [27] Ghoneim, M. M., Radi, A., Beltagi, A. M., J. Pharm. Biomed. Anal. 2001, 25, [28] Abulkibash, A. M., Sultan, S. M., Al-Olyan, A. M., Al-Ghannam, S. M., Talanta 2003, 61, J. Sep. Sci. 2005, 28, i 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

287 Novel sorbent for HPLC determination of quinolones in pharmaceuticals 2453 [29] Navalon, A., Blanc, R., Reyers, L., Navas, N., Vilchez, J. L., Anal. Chim. Acta 2002, 454, [30] Rizk, M., Belal, F., Ibrahim, F., Ahmed, S., El-Enamy, N. M., J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 24, [31] Yi, L., Zhao, H., Chen, S., Jin, L., Zheng, D., Wu, Z., Talanta 2003, 61, [32] Du, J. X., Li, Y. H., Lu, J. R., Luminescence 2005, 20(1), [33] Liang, Y.-D., Song, J.-F., Yang, X.-F., Anal. Chim. Acta 2004, 510, [34] Aly, F. A., Al-Tamimi, S. A., Alwarthan, A. A., Talanta 2001, 53, [35] Ragab, G. H., Amin, A. S., Spectrochim. Acta A 2004, 60, [36] Novakivic, J., Nesmerak, K., Nova, H., Filka, K., J. Pharm. Biomed. Anal. 2001, 25, [37] Fardella, G., Barbetti, P., Chiappini, I., Grandolini, G., Int. J. Pharm. 1995, 121, [38] Fierens, C., Hillaert, S., den Bossche, W. V., J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 22, [39] Samanidou, V. F., Demetriou, C. E., Papadoyannis, I. N., Anal. Bioanal. Chem. 2003, 375, [40] Samanidou, V. F., Christodoulou, E. A., Papadoyannis, I. N., J. Sep. Sci. 2005, 28, [41] Michalska, K., Pajchel, G., Tyski, S., J. Chromatogr. A 2004, 1051, [42] Lacroix, P. M., Curran, N. M., Sears, R. W., J. Pharm. Biomed. Anal. 1996, 14, [43] Cordoba-Borrego, M., Cordoba-Diaz, M., Cordoba-Diaz, D., J. Pharm. Biomed. Anal. 1999, 18, [44] Thoppil, S. O., Amin, P. D., J. Pharm. Biomed. Anal. 2000, 22, [45] Zotou, A., Miltiadou, N., J. Pharm. Biomed. Anal. 2002, 28, J. Sep. Sci. 2005, 28, i 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

288 J. Sep. Sci. 2007, 30 E. A. Christodoulou et al. Eleni A. Christodoulou Victoria F. Samanidou Ioannis N. Papadoyannis Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki, Greece Original Paper Development and validation of an HPLC confirmatory method for residue analysis of ten quinolones in tissues of various food-producing animals, according to the European Union Decision 2002/657/EC The aim of this work was to develop an HPLC method for the simultaneous determination of ten quinolones: enoxacin, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin, oxolinic acid, nalidixic acid, and flumequine, in various tissues of food-producing animals. Separation was achieved on a PerfectSilm Target column (250 mm64 mm, ODS-3, 5 lm), by MZ-Analysentechnik (Germany), at room temperature. The mobile phase consisted of 0.1% TFA CH 3 OH CH 3 CN and was delivered by a gradient program of 35 min. The detection and quantitation was performed on a photodiode array detector at 275 and 255 nm. Caffeine (7.5 ng/ll) was used as the internal standard (IS). Analytes were isolated from tissue samples by 0.1% methanolic TFA solution. SPE, using LiChrolut RP-18 cartridges, was applied for further purification. The extraction protocol was optimized and the final recoveries varied between 92.0 and 107.4%. The method was fully validated according to Commission Decision 2002/657/EC. Limits of quantitation for the examined quinolones extracted from each tissue were much lower than the respective Maximum Residue Levels, ranging between 30 and 50 lg/kg for bovine tissue, between 30 and 55 lg/kg for ovine tissue, and between 40 and 50 lg/kg for porcine tissue. Keywords: Bovine / Commission decision 2002/657/EC / Ovine / Porcine tissues of food-producing animals / Quinolones / Received: April 18, 2007; revised: May 31, 2007; accepted: June 12, 2007 DOI /jssc Introduction According to Council Directive 96/23/EC certain substances and residues should be measured and monitored in live animals and animal products [1]. Quinolones are among these substances which are listed in Group B (Veterinary drugs and contaminants) of Annex I from the previous directive. The limits for most of the veterinary medicines which are often used in food-producing animals such as quinolones are included in Council Regulation 1990/2377/EEC. This regulation categorizes the veterinary medicines into four groups depending on their permeated usage [2]. Correspondence: Dr. Victoria F. Samanidou, Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, GR Thessaloniki, Greece samanidu@chem.auth.gr Fax: Abbreviations: IS, internal standard; LOD, limits of detection; LOQ, limits of quantitation; MRL, maximum residue limit Quinolones constitute a synthetic group of antibacterials whose action is based on the inhibition of DNA-gyrase in bacterial cells [3]. Nalidixic acid was the first member of quinolone antibiotics, which was approved by the Food and Drug Administration in Nalidixic acid, flumequine, and oxolinic acid constitute the first generation of quinolones which are effective, particularly, against Gram-negative bacteria. The introduction of a 6- fluoro and a 7-piperazinyl moiety gave birth to the second generation of quinolones known as fluoroquinolones. The introduction of piperazinyl group increased the activity of quinolones against Pseudomonas spp., while the fluorine atom increased the activity against some Gram-positive bacteria. Quinolones and fluoroquinolones are both used in human and in veterinary medicine for the treatment of severe systemic infections. In human medicine, they are mostly used in the treatment of urinary tract infections, including prostatitis infections, infections of the gastrointestinal tract, respiratory tract infections, sexually transmitted diseases, as well as of surgical prophylaxis. i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

289 E. A. Christodoulou et al. J. Sep. Sci. 2007, 30 In veterinary medicine they are widely used to treat urinary, pulmonary, and digestive infections. They are also used for prophylaxis and as feed additives for mass gain promotion. Their misuse has led to the drawing up of enforcement regulations, with the aim of minimizing the risk to human health associated with their consumption as residues in food. Increased bacterial resistance to these antibiotics may occur as a result of their presence as residues in food-producing animals and in their products. The Council Regulation (EEC) 2377/90/EC is laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits (MRLs) of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. The examined quinolones DAN, ENR, SAR, and FLU according to the previous regulation are listed in Annex I, between the pharmacologically active substances for which MRLs have been set. On the other hand, OXO is listed in Annex III which consists of pharmacologically active substances used in veterinary medicinal products for which provisional MRLs have been set [2]. Recently European Union has issued the specific Decision 2002/657/EC which concerns the performance of analytical methods and the interpretation of results in the official control of residues in products of animal origin. This decision also provides rules for the analytical methods to be used in the testing of official samples and specifies common criteria for the interpretation of analytical results. Some new performance criteria that should be calculated are the limits of decision (CC a ) and the detection capability (CC b ) [4]. Due to the widespread use of quinolones and fluoroquinolones in veterinary medicine, which is a serious cause for the development of resistant human pathogens, quite a variety of techniques for determining these compounds are published. The most widely applied chromatographic technique for the determination of quinolones in tissues of food-producing animals is HPLC. Almost 90% of published papers are using HPLC. The rest include CE and TLC [3]. Although quite a few articles are published regarding the determination of quinolones and fluoroquinolones in edible tissues of food-producing animals, only three of them focus on the simultaneous determination of eight compounds of this group of antibiotics [5 7]. Two more articles, by Bailac et al. [8, 9], discuss a method for the determination of seven quinolones. Delepine et al. [10] and Choma [11] have proposed methods for the determination of six fluoroquinolones. Gigosos [12] and Samanidou et al. [13] have proposed a method for the determination of five quinolones. There are also studies that have published techniques for the separation and the determination of four [14, 15], three [16], two [17 28], and one quinolone [29 34]. Rose et al. [35], Yorke and Froc [36], and Ramos et al. [37] determined quinolones in smaller groups and not in a single run. Finally, van Vyncht et al. [38] and Toussaint et al. [39, 40] determined 11 fluoroquinolones in the kidney of food-producing animals, but their works do not focus on the separation of the studied compounds but only on the selective screening of them in a single run, due to the detection system that is MS/MS. Since quinolones are soluble in aqueous acidic or basic media and in polar organic solvents as well, various approaches have been proposed for their isolation from edible tissue samples. Most of the papers propose SPE for sample clean up. In some papers, extraction of quinolones from tissue is performed by CH 2 Cl 2 or phosphate buffers followed by extraction of the studied compounds from the organic phase with either basic (NaOH) or acidic (HCl) solutions [9 11, 18, 21, 22, 27, 37]. Other researchers use acidic solutions such as acetic acid, HCl, phosphoric acids, TCA [5, 8, 13, 15, 16, 32, 35, 38 40], or basic solutions such as NaOH [14] prior to SPE. Liquid liquid extraction has also been applied for sample preparation. The most common extraction solvents are phosphate buffers [6, 28] and other buffer solutions [36], mixtures of acids such as HClO 4 and H 3 PO 4 [34], or simply CH 3 OH [29, 30, 33], CH 2 Cl 2 [20, 26, 41], NH 3 [29], or ethyl acetate [25] followed by addition of hexane or CHCl 3 for defatting. Cohen et al. [16], Eng et al. [22], and Maxwell et al. [31] applied aqueous on-line microdialysis using the automated trace enrichment of dialysates system combined with liquid liquid extraction. Finally, Shen et al. [18] applied supercritical fluid extraction for the extraction of quinolones. The aim of the present study is the simultaneous extraction and separation of eight fluoroquinolones (enoxacin, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin, and flumequine) and two quinolones (oxolinic acid and nalidixic acid) in edible tissues of food-producing animals. The developed method is selective and sensitive and is successfully applied to bovine, porcine, and ovine edible muscle tissues. Especially for ovine tissues, there is no other method available in literature, to the best of the authors' knowledge, concerning the determination of quinolones. The innovation of this study is the statistical comparison of the results obtained for the three matrices (bovine, porcine, and ovine tissues), which was performed and proved that the calibration curves are comparable among the three tissues for each quinolone [41]. Samples collected from various Greek farmers of food-producing animals have been tested by the specific method, which is also validated according to European Decision 2002/657/EC. 2 Experimental 2.1 Reagents and materials Enoxacin, ofloxacin, norfloxacin, nalixic acid, flumequine, ciprofloxacin, and IS caffeine were purchased from Sigma (Steinheim, Germany). Enrofloxacin >98% i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

290 J. Sep. Sci. 2007, 30 Liquid Chromatography and oxolinic acid 97% were obtained from Fluka (Steinheim, Germany), and danofloxacin 98.4% and sarafloxacin 99.3% VETRANALm from Riedel-de Ha n ( (Buchs SG, Schweiz). HPLC grade methanol (99.8%), ACN (99.9%), and analytical grade sodium hydroxide (NaOH, 1 mol/l) were supplied by Merck ( (Darmstadt, Germany). 99% TFA was obtained from Aldrich (Steinheim, Germany). Citric acid, ammonium acetate, sodium phosphate monobasic, and sodium phosphate dibasic anhydrous were supplied from Riedel-de Ha n. Ultrapure water provided by a Milli-Qm purification system Millipore ( (Bedford, MA, USA) was used throughout the study. Four different SPE cartridges were comparatively studied for the optimization of analytes' isolation from endogenous interference: silica-based DSC-18 (500 mg/ 3 ml) from Supelco ( Supelco_Home.html) (Bellefonte, USA), LiChrolut RP-18 (200 mg/3 ml), and Adsorbex RP-8 30 mg/1cc from Merck, and polymeric NEXUS Abselut (30 mg/1 ml) from Varian ( (Harbor City, USA). Bovine, porcine, and ovine muscle tissue samples were purchased from local market. 2.2 Instrumentation A Shimadzu ( (Kyoto, Japan) quaternary low-pressure gradient system was used for the chromatographic determination of examined quinolones. The solvent lines were mixed in an FCV-9AL mixer and an LC-9A pump was used to deliver the mobile phase to the analytical column. Sample injection was performed by an SIL-9A autosampler and detection was achieved by an SPD- M6A photodiode array detector complied with Data acquisition software Class-M10A. Degassing of solvents was achieved by continuous helium sparking in the solvent flasks through a DGU-2A degassing unit. Buffer solutions used for the mobile phase were filtered through Whatman Cellulose Nitrate 0.2 lm-wcn Type (47 mm DIA) (Whatman Laboratory Division, Maidstone, England; membrane filters on a glass vacuum-filtration apparatus obtained from Alltech Associates ( (Deerfield, IL, USA). A Glass-col (Terre Haute, IN 47802, USA) small vortexer and a Hermle centrifuge, model Z 230 (B. Hermle, Gosheim, Germany) were employed for sample pretreatment. All evaporations were performed with a Supelco 6- port Mini-Vap concentrator/evaporator (Bellefonte, PA, USA). SPE was carried out on a 12-port vacuum manifold from Supelco. 2.3 Chromatographic conditions The separation was performed on a PerfectSilm Target ODS-3 analytical column (250 mm64 mm), 5 lm, from MZ-Analysentechnik ( (Mainz, Germany) operated at room temperature. Column effluent was monitored at 275 nm for all the analytes except OXO, NAL, and FLU, which were monitored at 255 nm. The mobile phase consisted of 0.1% TFA CH 3 CN CH 3 OH and was delivered to the analytical column according to the gradient program of Table 1. The flow rate was 1.2 ml/ min and the inlet pressure ranged from 290 to 310 kg/ cm 2. Caffeine was used as IS at a concentration of 7.5 ng/ ll. Injected sample volume was 50 ll. 2.4 Standard solutions Individual stock solutions of 100 ng/ll of ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL, and FLU were prepared in water by dissolving an appropriate amount of quinolone. An aliquot of 100 ll of NaOH 0.1 mol/l per 10 ml was added to enhance the solubility of all compounds. Stock solutions were stored, refrigerated at 48C, and found to be stable for 2 months, except for OXO, NAL, and FLU which were stable only for 2 wk. Working aqueous solutions were prepared daily from stocks. Stock aqueous solution of CAF was prepared at a concentration of 100 ng/ll. 2.5 Sample preparation All tissue samples (bovine, porcine, and ovine) were treated fresh, without being previously dried. Chopped tissue samples were homogenized and stored at 208Cin Table 1. Gradient timetables examined for the determination of examined quinolones Gradient 1 Gradient 2 a) Gradient 3 a) T (min) A 1 = TFA (0.1%) B 1 =CH 3 CN C =CH 3 OH A 2 = TFA (0.1%) B 2 =CH 3 CN A 3 = TFA (0.1%) B 3 =CH 3 CN a) Methanol concentration was as in gradient 1. i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

291 E. A. Christodoulou et al. J. Sep. Sci. 2007, 30 aliquots of 1 l g. According to the protocol about 1 g of tissue was either spiked with 200 ll of the mixture of quinolones (including the IS at a concentration of 7.5 mg/l) or treated as blank sample. Aliquot of 4 ml of 0.1% TFA in CH 3 OH (extraction solvent) was added and the mixture was vortexed and left to settle in dark for 10 min. The solution was sonicated for 15 min and directly centrifuged at 8006g for 10 min. The supernatant was collected in a test tube and was evaporated under stream of N 2. The sample was re-extracted with 4 ml of the same extraction solvent. The solution was again vortexed, left to settle in dark, sonicated for 15 min, and centrifuged. The supernatant solutions were pooled and evaporated to dryness. The dry residue was dissolved in 2 ml of an aqueous solution of 0.1% TFA and applied to the SPE cartridge, which was previously conditioned with 2 ml of CH 3 OH and 2 ml of water. Elution was performed with 1.5 ml solution of 0.1% TFA in ACN and 0.5 ml ACN. The eluent was evaporated to dryness at 458C under a gentle stream of N 2. The dry residue was reconstituted in 200 ll of an aqueous solution of 0.1% TFA and 50 ll were injected into the HPLC system. The protocol for sample preparation was successfully applied to three edible animal tissues: bovine, porcine, and ovine yielding approximately the same recoveries. 2.6 Method validation The method was fully validated following the criteria specified by the European Commission Decision 2002/ 657/EC. Method validation was performed in terms of specificity, robustness, stability, linearity, recovery, repeatability, decision limit (CC a ), and detection capability (CC b ). The specificity was checked for matrix interferences. An appropriate number of representative blank samples (five of each tissue) were analyzed and checked for any interference in the region of the chromatogram where the targeted analytes are expected to elute. Robustness was studied by measuring the samples under deliberate small variations of the analytical method. Such studies use the deliberate introduction of minor reasonable variations by the laboratory and the observation of their consequences. Standard solutions of quinolones were analyzed besides room temperature at two different temperatures (30 and 358C). The influence of the ph of the mobile phase was studied, by preparing 0.05, 0.075, and 0.15% TFA besides that of 0.1% for the aqueous part of the mobile phase. Two different flow rates (1.1 and 1.3 ml/min) were studied, and finally two variations were tried at the gradient program of the mobile phase, as is shown in Table 1. All tests were performed using standard solutions of the ten quinolones at a concentration of 5 ng/ll with the IS. The sample solution stability was checked both for the standard solutions and also for the spiked animal tissues. For each quinolone, a stock solution at a concentration of 100 mg/l was prepared and stored at +48C. A mixture of the ten quinolones at a concentration of 5 mg/l with CAF/IS (7.5 ng/ll) was also prepared from the stock solutions. The mixture was directly measured and then stored at +48C, in order to check its stability. Also the stability of stock solutions stored at +48C was monitored. For the stability of the analytes spiked on tissues, spiked tissues (at a concentration of 5 ng/ll) were stored at 208C. Aliquots of these spiked samples were analyzed immediately after spiking as well as after 1, 2, 3 wk, and 1, 2 months. Aliquots of spiked tissues kept at 208C were analyzed after six freezing and defrosting cycles. Degradation was determined using the 10% criterion. Calibration curves were constructed for each investigated tissue using spiked tissues. The calibration curves were obtained by least-squares linear regression analysis of the peak area ratio of analyte to IS. The analytical procedure was linear for all analytes over the concentration range tested for all analyzed tissues, and calibration curves had a correlation coefficient higher than The calculations for the limits of detection (LOD) were based on the SD of y-intercepts of regression analysis (r) and the slope (S), using the equation LOD = 3.3 r/s [42]. Limits of quantitation (LOQ) were calculated by the equation LOQ = 10 r/s. For each quinolone and for each tissue (bovine, porcine, and ovine), the calibration curves were compared using the regression analysis, in order to check the uniformity of the methods [42]. Since no certified reference materials were available for porcine, bovine, and ovine muscle tissues, the recovery was determined by experiments using spiked tissues at three different concentration levels including LOQ. For quinolones for which MRLs are specified by the Council Regulation 2377/90/EEC, accuracy was determined at the LOQ level and at concentrations of 0.5, 1, and 1.5 times the permitted limit. For each concentration level, six samples were prepared and analyzed three times. The concentration present in each sample was derived from the calibration curves. The recovery was calculated for each tissue and for each quinolone. For the repeatability test, samples from the three tissues were prepared and spiked at three concentration levels (or four, for quinolones which have MRLs) including the LOQ level. At each level, the analysis was performed at six replicates in 1 day (intraday precision). To check the reproducibility between days the same concentrations of the standard solutions were spiked to the three tissues, and analyzed three times per day for six consecutive days. Decision limit (CC a ) is a new criterion of decision and means the limit at and above which it can be concluded with an error probability of a that a sample is noncomplii 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

292 J. Sep. Sci. 2007, 30 Liquid Chromatography ant. For the measurement of CC a, the three kinds of tissues were spiked at the LOQ level of each compound and also at the concentration of MRL for the quinolones for which the permitted limits are specified. The CC a was calculated by adding to the spiked concentration 1.64 times the SD of the spiked samples. Detection capability (CC b ) is another decision criterion and means the smallest content of the substance that may be detected, identified, and/or quantified in a sample with an error probability of b. In the case of substances for which no permitted limit has been established, the detection capability is the lowest concentration at which a method is able to detect truly contaminated samples with a statistical certainty of 1 b. In the case of substances with an established permitted limit, this means that the detection capability is the concentration at which the method is able to detect permitted limit concentrations with a statistical certainty of 1 b. For the measurement of CC b, the three kinds of tissues were spiked at the CC a level of each method. The CC b was extracted by calculating the concentration of each quinolone by the respective calibration curve. 3 Results and discussion 3.1 Chromatographic conditions The mobile phase was a gradient program of the mixture of 0.1% TFA CH 3 OH CH 3 CN according to Table 1. The separation of the ten quinolones was achieved in 33 min. Under the assay conditions described above, the examined fluoroquinolones were well resolved with retention times of 20.2 min for ENO, 21.3 min for OFL, 22.1 min for NOR, 23.5 min for CIP, 25.3 min for DAN, 26.0 min for ENR, 27.7 min for SAR, 29.3 min for OXO, 32.0 min for NAL, and 32.6 min for FLU. CAF (IS) was eluted in 7.6 min. Resolution factors, which vary between 1.1 and 4.9 for the ten quinolones are proof for the satisfactory separation of the analytes. 3.2 Study of SPE conditions Table 2. Recoveries (%) of the examined quinolones extracted on different sorbents Quinolone DSC-18 Adsorbex Abselut NEXUS In order to optimize SPE, four different cartridges have been tested. Results are summarized in Table 2. Lichrolut RP-18 cartridges provided higher recovery rates. Elution was based on a previous publication of the authors [13]. The protocol was also optimized as far as it concerns the extraction solvent and the times of sequential extractions. Optimization was performed using bovine tissue on Lichrolut RP-18 cartridges, which gave the highest recoveries. The final protocol was applied to porcine and ovine tissue samples and showed the same behavior. Different concentrations of NaOH, 0.1, 0.3, 0.5, and 1 M, have been tried for the extraction of quinolones from bovine tissue. Recoveries were lower than 68%. Citric acid at the concentrations of 0.3 and 0.5 M was tried, but interference appeared at 22 min. Ammonium acetate at different concentrations, 0.1, 0.3, 0.5, and 0.8 M, provided recoveries lower than 60%. Phosphate buffers, 0.05 and 0.1 M at a ph of 7.4, were also tried as extraction solvents providing recoveries lower than 60%. The highest absolute recoveries were achieved with 0.1% TFA in aqueous and organic (in CH 3 OH and CH 3 CN) solutions. TFA (0.1%) in CH 3 OH gave the best recoveries (72 78%), but some more assays were performed to enhance the protocol. So the concentrations of 0.05, 0.5, and 1% of TFA in CH 3 OH were tried. Both 0.1 and 0.5% TFA in CH 3 OH showed almost the same behavior (73 78%), but the more concentrated the extraction solvent the more precipitates were extracted from the matrix and filtration was necessary. TFA (0.1%) in CH 3 OH was tried for the extraction of quinolones from 1 g bovine tissue, at different extraction volumes, 2, 3, 4, and 5 ml. A volume of 4 ml extraction solvent proved to be enough for sufficient recovery (76 83%). The final test was the comparison of recoveries of one, two, and three sequential extraction steps from 1 g bovine tissue with 4 ml 0.1% TFA in CH 3 OH each time. Recoveries were highly satisfactory (84 91%) with two extraction steps, since a third step made no difference. The final protocol, mentioned above, was successfully applied to 1 g bovine tissue and to 1 g ovine and 1 g porcine tissue giving about the same absolute recoveries. No interference was observed in bovine, ovine, and porcine tissue blank samples as shown in Figs. 1a, c, and e. Representative high performance liquid chromatograms of the ten quinolones extracted from spiked tissue samples are shown in Figs. 1b, d, and f. Resolution factors ranged from 1.15 to 5.28, indicating a perfect separation. 3.3 Method validation results LiChrolut RP-18 ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Five different blank samples of each tissue (bovine, ovine, and porcine) from various producers were analyzed to check the specificity of the method. None of them i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

293 E. A. Christodoulou et al. J. Sep. Sci. 2007, 30 Figure 1. (a) Chromatogram of blank sample of bovine tissue spiked with IS. (b) Chromatogram of bovine tissue spiked with a mixture of the ten quinolones at a concentration of 5 mg/l and IS. (c) Chromatogram of blank sample of ovine tissue spiked with IS. (d) Chromatogram of ovine tissue spiked with a mixture of the ten quinolones at a concentration of 5 mg/l and IS. (e) Chromatogram of blank sample of porcine tissue spiked only with the IS. (f) Chromatogram of porcine tissue spiked with a mixture of the ten quinolones at a concentration of 5 mg/l and IS. Peaks monitored at 275 nm: 1, IS; 2, ENO; 3, OFL; 4, NOR; 5, CIP; 6, DAN; 7, ENR; 8, SAR; 9, OXO; 10, NAL; 11, FLU. showed any interference from the matrix at the retention times that the quinolones elute. To study the robustness of the method, standard solution of the ten quinolones at the concentration of 5 ng/ ll and IS at the concentration of 7.5 ng/ll was monitored under small and deliberate variations of the analytical method. The whole method was validated at ambient temperature (about 258C), but it was also checked at 30 and 358C. Peak shape and resolution of all analytes were the same but as the temperature increases the sensitivity of the method was decreased. To check the robustness of the method, different TFA concentrations were examined: 0.05, 0.075, and 0.15%, besides 0.1% TFA. The smaller the concentration of TFA i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

294 J. Sep. Sci. 2007, 30 Liquid Chromatography Figure 2. Stability of quinolones in tissues stored at 208C. Figure 3. Stability of quinolones in tissues after six freezing defrosting cycles. the worse the resolution between OFL and NOR is. Moreover, at higher concentration of TFA, DAN, and ENR resolution deteriorates. Robustness of the method was also checked in terms of different flow rates. Besides the flow rate of 1.2 ml/min that was chosen to deliver the mobile phase to the column with inlet pressure kg/ cm 2, flow rates of 1.1 ml/min and 1.3 ml/min were also examined. The modification of the flow rate influenced only the retention times of the analytes. The lower flow rate increased the total time of analysis at 35 min, with the same resolution factors. Higher flow rate decreased the total analysis time about 3 min, but the inlet pressure was extremely high (about 320 kg/cm 2 ). The final test for robustness was modification of the gradient program of the mobile phase, as shown at Table 1. This modification influenced resolution of OFL and NOR and for DAN and ENR, due to the slightly different retention times. To check the stability of stock solutions (100 ng/ll), mixtures of the examined quinolones at a concentration of 5 ng/ll and IS at a concentration of 7.5 ng/ll were freshly prepared and measured immediately after preparation of the stock solutions and then prepared and remeasured in 1, 2 wk, and 1, 2, 3 months time. The stock solutions were kept at +48C. Stock solutions of the seven fluoroquinolones (ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, and SAR) are found to be stable for 2 months. In contrast, stock solutions of OXO, NAL, and FLU are stable only for a couple of weeks. A mixture of the quinolones at the concentration of 5 ng/ll with IS (7.5 ng/ll) freshly prepared was measured and then kept at the +48C to check the stability of the mixture. The mixture proved to be unstable and it should be freshly prepared every day. According to the performance criteria of the regulation 2002/ 657/EC the stability of analytes in matrix should also be checked. For this purpose, aliquots of 1 g of bovine tissue were spiked with the mixture of the ten quinolones at the concentration of 5 mg/l and IS (7.5 ng/ll). One aliquot was directly analyzed and the rest were kept at 208C and analyzed in 1, 2 wk and 1 month time. In Fig. 2 it is clearly shown that quinolones are stable in the matrix for one week, at 208C. For measuring the cycles of freezing and defrosting stability of the spiked bovine, aliquots of bovine tissue spiked with the mixture of quinolones were analyzed directly after preparation and after 2 6 cycles of freezing and defrosting. From Fig. 3, it is obvious that the spiked bovine samples are stable for three freezing and defrosting cycles. The same series of experiments were also performed for ovine and porcine tissue and both of them proved to have exactly the same stability as the bovine tissue. Degradation was decided using the 10% criterion. For the calibration curves, spiked standard samples of bovine, porcine, and ovine tissues at various concentrai 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

295 E. A. Christodoulou et al. J. Sep. Sci. 2007, 30 Table 3. Calibration curves and sensitivity data of the developed method for the determination of the ten examined quinolones using CAF 7.5 mg/l as IS Bovine tissue Ovine tissue Porcine tissue Quinolones RetentionSlope Intercept r Range time (lg/kg) (min) LOD (lg/kg) Slope Intercept r Range (lg/kg) LOD (lg/kg) Slope Intercept r Range (lg/kg) LOD (lg/kg) ENO l OFL l NOR l CIP l DAN l ENR l SAR l OXO l NAL l FLU l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l Table 4. Intraday (n = 6) and interday (over a period of six consecutive days) precision and accuracy data for the determination of quinolones in bovine tissue Bovine tissue Added Found l SD (ng) RSD Recovery (%) Found l SD (ng) RSD Recovery (%) Analytes (ng) Intraday Interday ENO l l l l l l OFL l l l l l l NOR l l l l l l CIP l l l l l l DAN l l l l a) l l l l ENR l l l l a) 99.2 l l l l SAR l l l l l l OXO l l l l l l NAL l l l l l l FLU l l l l a) l l l l i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

296 J. Sep. Sci. 2007, 30 Liquid Chromatography Table 5. Intraday (n = 6) and interday (over a period of six consecutive days) precision and accuracy data for the determination of quinolones in ovine tissue Ovine tissue Added Found l SD (ng) RSD Recovery (%) Found l SD (ng) RSD Recovery (%) Analytes (ng) Intraday Interday ENO l l l l l l OFL l l l l l l NOR l l l l l l CIP l l l l l l DAN l l l l l l ENR l l l l a) l l l l SAR l l l l l l OXO l l l l l l NAL l l l l l l FLU l l l l a) l l l l a) MRL according to Council Regulation 2377/90/EEC. tion levels were extracted following the extraction procedure described in Section 2. Each calibration level was prepared twice and each sample was analyzed three times. The calibration curves were obtained by leastsquares linear regression analysis of the peak area ratio of analyte to IS. All calibration data, as well as LOD and LOQ, are presented in Table 3. The LODs of the ten quinolones extracted from bovine tissue ranged from 10 to 17 lg/kg, from ovine tissue lg/kg, and from porcine tissue lg/kg. The calibration curves for each quinolone were compared among the three different tissues using regression analysis. All data were compared in groups of two (different tissue, same quinolone). After regression analysis at confidence level 95%, the range of intercept for every graph includes the model value which is zero and the slope and the range for slope includes the model value, which is in this case one. With this comparison, it is proved that the calibration curve for one tissue can be used with an acceptable error for the measurement of the respective quinolone in one of the other two tissues. The measurements for the recovery were performed on spiked samples of bovine, ovine, and porcine tissues at the concentrations of 0.5, 1, and 1.5 times the permitted limit, when it is specified by the European Regulation, as well as at the LOQ level of the method. For Quinolones for which an MRL is not defined, the recovery was calculated at the LOQ level and at two more concentrations. At each spiking level six different samples were prepared. The recoveries for bovine tissue varied between 96.3 and 101.6% (Table 4), for ovine tissue between 98.2 and 107.4% (Table 5), and for porcine tissue between 92.0 and 102.8% (Table 6). Intraday precision of the method was also checked. Statistical evaluation revealed RSDs, at different values in the range % for bovine tissue (Table 4), for ovine tissue (Table 5), and % for porcine tissue (Table 6). To study the reproducibility of the method i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

297 E. A. Christodoulou et al. J. Sep. Sci. 2007, 30 Table 6. Intraday (n = 6) and interday (over a period of six consecutive days) precision and accuracy data for the determination of quinolones in porcine tissue Porcine tissue Added Found l SD (ng) RSD Recovery (%) Found l SD (ng) RSD Recovery (%) Analytes (ng) Intraday Interday ENO l l l l l l OFL l l l l l l NOR l l l l l l CIP l l l l l l DAN l l l a) l l l l ENR l l l l a) l l l l SAR l l l l l l OXO l l l l l l NAL l l l l l l FLU l l l l a) l l l l a) MRL according to Council Regulation 2377/90/EEC. Table 7. Detection limit and detection capability at the LOQ level of the method and at the MRLs for the quinolones, which are specified for bovine, ovine, and porcine tissue (lg/kg) Bovine tissue Ovine tissue Porcine tissue Analytes CC a CC b CC a CC b CC a CC b ENO OFL NOR CIP DAN 41.2/202.1 a) 42.3/203.3 a) /106.2 a) 46.7/106.9 a) ENR 32.3/100.7 a) 33.2/101.6 a) 42.8/101.5 a) 43.2/103.1 a) 35.5/100.7 a) 36.2/101.5 a) SAR OXO NAL FLU 35.7/202.2 a) 36.2/203.7 a) 45.5/203.0 a) 47.3/204.1 a) 50.3/202.1 a) 51.6/203.5 a) a) At the MRLs. between six consecutive days, the same experimental procedure was followed (three samples per day, analyzed in triplicate). Excellent interday precisions were noticed with RSD values between 0.7 and 8.0% for bovine tissue (Table 4), 0.5 and 6.4% for ovine tissue (Table 5), and 0.2 and 6.8% for porcine tissue (Table 6). i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

298 J. Sep. Sci. 2007, 30 Liquid Chromatography The decision limits (CC a ) were calculated as the mean values of the found concentrations plus 1.64 times the corresponding SDs. The detection capability (CC b ) was obtained by adding to 1.64 times the corresponding SD. Table 7 summarizes the obtained CC a and CC b for each tissue. 4 Conclusions The method herein developed proposes an analytical approach with a common instrumentation of an HPLC system for the simultaneous determination of ten quinolones, extracted from bovine, porcine, and ovine tissues. The method was fully validated for each tissue separately, according to performance criteria and other requirements of the Commission Decision 2002/657/EC. The extracted recoveries of quinolones from the studied tissues are above 92% and the LODs for each quinolone and each tissue are well below the prescribed MRLs. Another benefit and novelty of the specific study is the multifunctioning of the calibration curves that are suitable for all kinds of tissues. The authors would like to thank Dr. Mathäos Chatziathanasiou from MZ-Analysentechnik, Mainz, Germany, for his kind donation of analytical columns PerfectSilm Target. 5 References [1] 96/23/EC: Council Directive of 29 April 1996 on measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and animal products and repealing Directives 85/358/EEC and 86/469/EEC and Decisions 89/187/EEC and 91/664/EEC. Off. J. Eur. Commun. 1996, L125, [2] Council Regulation (EEC) No 2377/90 of 26 June 1990 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. Off. J. Eur. Commun. 1990, L 224,1 8. [3] Samanidou, V. F., Christodoulou, E. A., Papadoyannis, I. N., Curr. Pharm. Anal. 2005, 1, [4] 2002/657/EC: Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, Off. J. Eur. Commun. 2002, L221, [5] Van Hoof, N., De Wasch, K., Okerman, L., Reybroeck, W., Poelmans, S., Noppe, H., De Brabander, H., Anal. Chim. Acta 2005, 529, [6] Schneider, M. J., Donogue, D. J., J. Chromatogr. B 2002, 780, [7] Hermo, M. P., Barron, D., Barbosa, J., Anal. Chim. Acta 2005, 539, [8] Bailac, S., Ballesteros, O., Jimenez-Lozano, E., Barron, D., Sanz- Nebot, V., Navalon, A., Barbosa, J., J. Chromatogr. A 2004, 1029, [9] Bailac, S., Barron, D., Sanz-Nebot, V., Barbosa, J., J. Sep. Sci. 2006, 29, [10] Delepine, B., Hurtaud-Pessel, D., Sanders, P., Analyst 1998, 123, [11] Choma, I. M., J. Liquid Chromatogr. Relat. Technol. 2003, 26, [12] Gigosos, P. G., Revesado, P. R., Cadahia, O., Fente, C. A., Vazquez, B. I., Franco, C. M., Cepeda, A., J. Chromatogr. A 2000, 871, [13] Samanidou, V. F., Christodoulou, E. A., Papadoyannis, I. N., J. Sep. Sci. 2005, 28, [14] Posyniak, A., Zmudzki, J., Semeniuk, S., Niedzielska, J., Ellis, R., Biomed. Chromatogr. 1999, 13, [15] Horie, M., Saito, K., Nose, N., Nakazawa, N., J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 1994, 653, [16] Cohen, E., Maxwell, R. J., Donoghue, D. J., J. Chromatogr. B 1999, 724, [17] Beltran, J. L., Jimenez-Lozano, E., Barron, D., Barbosa, J., Anal. Chim. Acta 2004, 501, [18] Shen, J. Y., Kim, M. R., Lee, C. J., Kim, I. S., Lee, K. B., Kim, I. S., Lee, K. B., Shim, J. H., Anal. Chim. Acta 2004, 513, [19] Hernandez-Arteseros, J. A., Beltran, J. L., Compano, R., Prat, M. D., J. Chromatogr. A 2002, 942, [20] Barron, D., Jimenez-Lozano, E., Bailac, S., Barbosa, J., J. Chromatogr. B 2002, 767, [21] Barron, D., Jimenez-Lozano, E., Cano, J., Barbosa, J., J. Chromatogr. B 2001, 757, [22] Eng, G. Y., Maxwell, R. J., Cohen, E., Piotrowski, E. G., Fiddler, W., J. Chromatogr. A 1998, 799, [23] Hernandez-Arteseros, J. A., Compano, R., Prat, M. D., Analyst 1998, 123, [24] Guyonnet, J., Pacaud, M., Richard, M., Doisi, A., Spavone, F., Helllings, P., J. Chromatogr. B 1996, 679, [25] Strelevitz, T. J., Linhares, M. C., J. Chromatogr. B 1996, 675, [26] Barron, D., Jimenez-Lozano, E., Bailac, S., Barbosa, J., Anal. Chim. Acta 2003, 477, [27] Garcia, M. A., Solans, C., Calvo, A., Hernandez, E., Rey, R., Bregante, M. A., Puig, M., Biomed. Chromatogr. 2005, 19, [28] Steffenak, I., Hormazabal, V., Yndestad, M., J. Liq. Chromatogr. 1991, 14, [29] Ellerbroek, L., Bruhn, M., J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 1989, 495, [30] Shiga, N., Matano, O., J. Chromatogr. A 1993, 643, [31] Maxwell, R. J., Cohen, E., Donoghue, D., J. Agric. Food Chem. 1999, 47, [32] Maraschiello, C., Cusido, E., Abellan, M., Vilageliu, J., J. Chromatogr. B 2001, 754, [33] Lim, J., Park, B., Yun, H., J. Chromatogr. B 2002, 675, [34] Kowalski, C., Rolinsli, Z., Slawik, T., Glod, B. K., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2005, 28, [35] Rose, M. D., Bygrave, J., Stubbings, G. W. F., Analyst 1998, 123, [36] Yorke, J. C., Froc, P., J. Chromatogr. A 2000, 882, [37] Ramos, M., Aranda, A., Garcia, E., Reuvers, T., Hooghuis, H., J. Chromatogr. B 2003, 789, [38] van Vyncht, G., Janosi, A., Bordin, G., Toussaint, B., Maghuin- Rogister, G., de Pauw, E., Rodriquez, A. R., J. Chromatogr. A 2002, 952, [39] Toussaint, B., Bordin, G., Janosi, A., Rodriquez, A. R., J. Chromatogr. A 2002, 976, [40] Toussaint, B., Chedin, M., Bordin, G., Rodriquez, A. R., J. Chromatogr. A 2005, 1088, [41] Miller, J. N., Miller, J. C., Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 5th edn., Prentice Hall, New Jersey 5.9, [42] Guidance for Industry, Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology, November 1996, ICH. i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

299 This article was published in an Elsevier journal. The attached copy is furnished to the author for non-commercial research and education use, including for instruction at the author s institution, sharing with colleagues and providing to institution administration. Other uses, including reproduction and distribution, or selling or licensing copies, or posting to personal, institutional or third party websites are prohibited. In most cases authors are permitted to post their version of the article (e.g. in Word or Tex form) to their personal website or institutional repository. Authors requiring further information regarding Elsevier s archiving and manuscript policies are encouraged to visit:

300 Author's personal copy Available online at Journal of Chromatography B, 859 (2007) Validation of an HPLC-UV method according to the European Union Decision 2002/657/EC for the simultaneous determination of 10 quinolones in chicken muscle and egg yolk Eleni A. Christodoulou, Victoria F. Samanidou, Ioannis N. Papadoyannis Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, GR Thessaloniki, Greece Received 17 May 2007; accepted 7 October 2007 Available online 13 October 2007 Abstract Herein two different methods are proposed for the determination of 10 quinolones (enoxacin, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin, oxolinic acid, nalidixic acid and flumequine) in chicken muscle and egg yolk. Two different HPLC systems were used comparatively and the respective methods were fully validated. The analytes were initially extracted from chicken muscle and egg yolk and purified by a solid phase extraction using LiChrolut RP-18 cartridges. Recoveries varied between 96.6 and 102.8% for chicken muscle and % for egg yolk. HPLC separation was performed at 25 C using an ODS-3 PerfectSil Target (250 mm 4 mm) 5 m analytical column (MZ-Analysentechnik, Germany). The mobile phase consisted of a mixture of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) ACN CH 3 OH, delivered by a gradient program, different for each method. In both cases caffeine was used as internal standard at the concentration of 7.5 ng/ L. Column effluent was monitored using a photodiode array detector, set at 275 and 255 nm. The developed methods were validated according to the criteria of Commission Decision 2002/657/EC. The LODs for chicken muscle varied between 5.0 and 12.0 g/kg and for egg yolk was 8.0 g/kg for all examined analytes Elsevier B.V. All rights reserved. Keywords: Quinolones; Solid phase extraction; Chicken muscle; Egg yolk; HPLC; Commission decision 2002/657/EC 1. Introduction Quinolones are synthetic antibiotics whose action is based on their anti-dna activity. Nalidix acid was the first quinolone approved on 1963, by Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of urinary tract infections. Quinolones are widely used till nowadays in human and in veterinary medicine, due to their safety with good tolerance and broad antibacterial spectrum. Fluoroquinolones belong to the second generation of quinolones and their characteristic is the greater effectiveness against both Gram-negative and Gram-positive pathogens that are resistant to other antibacterials [1]. Data collected from 25 European countries showed that fluoroquinolones represented more than 50% of the quinolones used. Ciprofloxacin is the most widely prescribed fluoroquinolone in the world, followed by ofloxacin [2]. Corresponding author. Tel.: ; fax: address: samanidu@chem.auth.gr (V.F. Samanidou). The widespread use of quinolones in human and in veterinary medicine has led to a significant increase in antibacterial resistance, having therefore important consequences for public health. To minimize risks in human health by the consumption of quinolones residues in foods, the European Union by the Council Regulation No. 2377/90 has established maximum residue limits (MRLs) of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin and among them are some quinolones [3]. The MRLs according to this regulation in chicken muscle are 200 g/kg for danofloxacin, 300 g/kg for difloxacin, 100 g/kg for enrofloxacin and 200 g/kg for flumequine. Another provision according to this directive is that the use of quinolones is prohibited in animals from which eggs are produced for human consumption. Therefore, analytical methods as sensitive as possible are required in order to check food samples before their disposal to the markets for human consumption. Recently European Union has issued the decision 2002/657/EC which concerns the performance of analytical methods and the interpretation of results in the official control of residues in products of animal origin [4] /$ see front matter 2007 Elsevier B.V. All rights reserved. doi: /j.jchromb

301 Author's personal copy E.A. Christodoulou et al. / J. Chromatogr. B 859 (2007) The increasing number of published papers concentrating on the determination of quinolones residues in food is illustrating the seriousness of this state. The last decade the majority of the articles propose a simultaneous analysis of more than five quinolones residues in chicken tissue and in eggs. Huang and his team and Gigosos et al. have developed methods for the determination of five quinolones in eggs [5,6]. Hassouan et al. propose a method for the determination of seven quinolones in eggs [7] and Bailac et al. in two different papers develop methods for the determination of seven quinolones in chicken muscle [8,9]. Schneider and Donoghue have developed a method for the determination of eight quinolones in eggs and in chicken tissue [10,11]. Also York and Froc propose a method for the determination of eight quinolones in chicken tissue but in three groups [12]. Finally Zeng et al. have developed a method for the simultaneous determination of nine quinolones in eggs [13]. All published methods mentioned above involve the use of HPLC. Most of them are using a Fluorescence Detector single [7,8,12,13], or coupled with MS [10,11] or a photodiode array detector [5]. Gigosos et al. use a UV-diode array detector [6] and Baillac et al. use ESI-MS/MS detector [8]. A previous work of the authors deals with the simultaneous determination of five quinolones in chicken tissue by HPLC [14]. The innovation of the present work is the analysis of five more Fig. 1. Chemical structure of the examined quinolones.

302 Author's personal copy 248 E.A. Christodoulou et al. / J. Chromatogr. B 859 (2007) quinolones, in total ten Quinolones: enoxacin (ENO), ofloxacin (OFL), norfloxacin (NOR), ciprofloxacin (CIP), danofloxacin (DAN), enrofloxacin (ENR), sarafloxacin (SAR), oxolinic acid (OXO), nalidixic acid (NAL) and flumequine (FLU), which are determined in chicken tissues and in eggs yolk. Chemical structures of examined quinolones are illustrated in Fig. 1. Two methods have been developed and validated using two different HPLC instruments. The comparison of the two methods proved that they are applicable for both matrices, with the same recoveries and the same limits of quantitation. Solid phase extraction was selected for the sample preparation of both matrices as the fastest, easiest and most efficient technique. 2. Experimental 2.1. Reagents and materials Enoxacin, ofloxacin, norfloxacin, nalidixic acid, flumequine, ciprofloxacin and internal standard caffeine, all of analytical grade were purchased from Sigma (Steinheim, Germany), enrofloxacin >98%, oxolinic acid 97% from Fluka (Steinheim, Germany), danofloxacin 98.4% and sarafloxacin 99.3% VETRANAL from Riedel-de Haen (Buchs SG, Schweiz). HPLC grade methanol (99.8%), gradient grade acetonitrile (99.9%) were supplied by Carlo Erba (Milano, Italy) and analytical grade sodium hydroxide (NaOH, 1 mol/l) by Merck (Darmstadt, Germany). Trifluoroacetic acid 99% was obtained from Aldrich (Steinheim, Germany). Ultrapure water provided by a Milli-Q purification system (Millipore, Bedford, MA, USA) was used throughout the study. Merck LiChrolut RP-18 (200 mg/3 ml) SPE cartridges were used for the isolation of the analytes from any endogenous interference stemmed from chicken and egg yolk matrices Instrumentation HPLC system 1 A Shimadzu (Kyoto, Japan) HPLC system was used for the analysis of the examined quinolones in chicken muscle. It was consisted of a mixer FCV-9AL for the mixing of the solvent lines, an LC-9A pump for delivering the mobile phase to the analytical column, a SIL-9A autosampler equipped with a 50 L loop for sample injection a column oven for maintaining the temperature stable and an SPD-M6A Photodiode Array Detector. Degassing of the mobile phase was achieved by continuous helium sparking in the solvent reservoirs by a DGU-2A degassing unit. The whole system was complied by the software Class M-10A HPLC system 2 A Shimadzu (Kyoto, Japan) quaternary low-pressure gradient system was used for chromatographic determination of the examined quinolones in egg yolk. The solvent lines were mixed in an FCV-10AL VP mixer. An LC-10AD VP pump was used to deliver the mobile phase to the analytical column, equipped with a Shimadzu SCL-10AL VP System Controller, permitting fully automated operation, used to deliver the mobile phase to the analytical column. Sample injection was performed via a Rheodyne 7725i injection valve (Rheodyne, Cotati, California, USA) equipped with a 20 L loop. Detection was achieved by an SPD- M10A VP Photodiode Array Detector, in compliance with data acquisition software LabSolutions-LCsolutions by Shimadzu. Functions of the whole system were controlled by an SCL- 10A VP controller. Degassing of the mobile phase was achieved by continuous helium sparking in the solvents reservoirs by a DGU-10B degassing unit. Glass vacuum-filtration apparatus obtained from Alltech Associates (Deerflied, IL, USA) was used for the filtration of buffer solutions through Whatman Cellulose Nitrate 0.2 m- WCN Type (47 mm DIA) (Whatman Laboratory Division, Maidstone, England) membrane filters. A Glasscol (Terre Haute, IN 47802, USA) small vortexer, a Hermle centrifuge, model Z- 230 (B. Hermle, Gosheim, Germany) and an Ultrasonic bath Transonic460/H (Elma, Germany) were employed for sample pre-treatment. All evaporations were performed with a Supelco 6-port Mini-Vap concentrator/evaporator (Bellefonte, PA, USA). SPE was carried out on a 12-port vacuum manifold from Supelco Chromatographic conditions A PerfectSil Target ODS-3 analytical column (250 mm 4 mm), 5 m, purchased from MZ-Analysentechnik (Mainz, Germany) was used for the separation of the studied quinolones, operated at 25 C. The mobile phase consisted of A: 0.1% TFA, B: ACN and C: CH 3 OH. Two different gradient programs were used for the separation of the 10 quinolones, which are described in Table 1. Column effluent was monitored Table 1 Gradient timetable for the two HPLC systems HPLC system 1 HPLC system 2 t (min) TFA (0.1%) ACN CH 3 OH t (min) TFA (0.1%) ACN CH 3 OH

303 Author's personal copy E.A. Christodoulou et al. / J. Chromatogr. B 859 (2007) at 275 nm for all analytes except OXO, NAL and FLU, which were monitored at 255 nm. The flow rate was 1.2 ml/min for both systems but the inlet pressure ranged from 290 to 310 kg/cm 2 for HPLC system 1 and from 230 to 240 kg/cm 2 for HPLC system 2. Caffeine (CAF) was used as internal standard at a concentration of 7.5 ng/ L. Injected sample volume was 50 L for HPLC system 1 and 20 L for HPLC system Preparation of standard solutions Stock solutions at a concentration of 100 ng/ L for ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR and SAR were prepared every 2 months, while those for OXO, NAL and FLU, proved to be less stable and were prepared every 2 weeks. All stock solutions were prepared in water by dissolving the appropriate amount of quinolone and by adding an aliquot of 100 L of NaOH 0.1 mol/l per 10 ml to enhance solubility of the compounds. Stock solutions were stored at 4 C. All working standards were prepared every day by appropriate dilutions of the concentrated stock standard solutions. Aqueous stock solution of CAF was prepared at the concentration of 100 ng/ L Sample preparation elution was performed with 1.5 ml solution of 0.1% TFA in ACN and 0.5 ml ACN. The eluent was evaporated to dryness at 45 C under a gentle stream of N 2. Finally, the dry residue of the quinolones in case of spiked sample or of the blank sample was dissolved in 200 L of an aqueous solution of TFA 0.1% and 50 L was injected into the HPLC system Sample preparation of egg yolk 1 ± g of egg yolk sample was either spiked with 200 L of the mixture of quinolones (including the internal standard at the concentration of 7.5 ng/ L) or not (in case of blank sample). Two milliliters of NaOH 0.75 M in ACN (extraction solvent) were added and the mixture was vortexed and left to settle in dark for 10 min. The solution was then sonicated for 15 min and directly centrifuged at 800 g for 10 min. The supernatant was collected in a test tube and was evaporated under stream of N 2. The sample was re-extracted a second time with 2 ml of the same extraction solvent. Again the solution was vortexed, left to settle in dark, sonicated for 15 min and centrifuged. The supernatant was added to the same test tube and was also evaporated to dryness. The extracted was dissolved then in 2 ml of an aqueous solution of 0.1% TFA. The solution was applied to the SPE cartridge, which was previously conditioned with 2 ml CH 3 OH Sample preparation of chicken muscle Chicken tissues were chopped, homogenised and stored at 20 C at packages of 1 ± g. According to the protocol about 1 g of tissue was either spiked with 200 L of the mixture of quinolones (including the internal standard at the concentration of 7.5 ng/ L) or not (in case of blank sample). A volume of 4 ml of 0.1% TFA in CH 3 OH (extraction solvent) was added and the mixture was vortexed and left to settle in dark for 10 min. The solution was then sonicated for 15 min and directly centrifuged at 800 g for 10 min. The supernatant was collected in a test tube and was evaporated under stream of N 2. The sample was re-extracted a second time with 4 ml of the same extraction solvent. The solution was vortexed, left to settle in dark, sonicated for 15 min and centrifuged. The supernatant was added to the same test tube and was also evaporated to dryness. The residue was dissolved then in 2 ml of an aqueous solution of 0.1% TFA. The solution was applied to the SPE cartridge, which was previously conditioned with 2 ml CH 3 OH and 2 ml water. The Table 2 Resolution factors of the analytes in the different methods HPLC system 1 HPLC system 2 CAF(IS)-ENO ENO-OFL OFL-NOR NOR-CIP CIP-DAN DAN-ENR ENR-SAR SAR-OXO OXO-NAL NAL-FLU Total analysis time 33 min 27 min Fig. 2. (a) Chromatogram of blank chicken muscle monitored at 275 nm. (b) Chromatogram of chicken muscle spiked with a mixture of the 10 quinolones at near MRL level monitored at 275 nm: (1) Caffeine: 7.6 min (7.5 ng/ L), (2) ENO: 20.2 min (3.0 ng/ L), (3) OFL: 21.3 min (3.0 ng/ L), (4) NOR: 22.1 min (3.0 ng/ L), (5) CIP: 23.5 min (3.0 ng/ L), (6) DAN: 25.3 min (4.0 ng/ L, MRL), (7) ENR: 26.0 min (2.0 ng/ L, MRL), (8) SAR: 27.7 min (3.0 ng/ L), (9) OXO: 29.3 min (3.0 ng/ L), (10) NAL: 32.0 min (3.0 ng/ L), and (11) FLU: 32.6 min (3.0 ng/ L).

304 Author's personal copy 250 E.A. Christodoulou et al. / J. Chromatogr. B 859 (2007) and 2 ml water. The elution was performed with 1.5 ml solution of 0.1% TFA in ACN and 0.5 ml ACN. The eluent was evaporated to dryness at 45 C under a gentle stream of N 2. Finally, the dry residue of the quinolones in case of spiked sample or of the blank sample was dissolved in 200 L of an aqueous solution of 0.1% TFA and 20 L was injected into the HPLC system Method validation Both methods were validated in order to accomplish the criteria specified by the European s Commission Decision 2002/657/EC. Both methods were checked for the linearity and the sensitivity. Linearity was studied by injecting a series of mixture of the analytes at different concentration levels, in order to cover the whole working range. Calibration curves of spiked samples for every quinolone, with the respective correlation coefficient, were calculated by least-squares linear regression analysis of the peak area ratio of each analyte to IS of the respective results versus analyte concentration. The calculations for the limits of detection (LODs) were based on the standard deviation of y-intercepts of regression analysis (σ) and the slope (S), using the following equation LOD = 3.3σ/S [15]. In turn, the limits of quantitation (LOQs) were calculated by the equation LOQ = 10σ/S [15]. Selectivity of the methods was assessed by studying the absence of any interference in same chromatographic run as the examined quinolones with the respective method for chicken tissue and egg yolk samples. The methods were also validated with respect to accuracy, intra-day (n = 6) and inter-day (n = 6) precision. Accuracy was studied by analyzing six times three concentration levels. Decision limits (CC ) and detection capability (CC ), the new criteria according to European Decision 2002/657/EC were also calculated. For the measurement of CC samples were spiked at the respective LOQ level of each method as well as at the concentration of MRL for those quinolones with specified permitted limits. The decision limits (CC ) were calculated as the mean values of the found concentrations plus 1.64 times the corresponding standard deviations. The detection capability (CC ) values were obtained after spiking the samples at the CC levels by adding 1.64 times the corresponding standard devia- Fig. 3. (a) Chromatogram of blank egg yolk sample monitored at 275 nm. (b) Chromatogram of egg yolk spiked with a mixture of the 10 quinolones near LOQ level (0.5 ng/ L) monitored at 275 nm. (1) Caffeine: 8.9 min (7.5 ng/ L), (2) ENO: 13.0 min, (3) OFL: 13.3 min, (4) NOR: 13.6 min, (5) CIP: 14.2 min, (6) DAN: 14.8 min, (7) ENR: 15.2 min, (8) SAR: 17.5 min, (9) OXO: 20.2 min, (10) NAL: 25.0 min, and (11) FLU: 26.6 min. tion. Statistical analysis for CC and CC was performed at the 95% confidential level and the number of replicate analyses was Results and discussion 3.1. Chromatography The mobile phase for both methods consisted of a mixture of 0.1% TFA CH 3 OH ACN delivered to the analytical column according to the corresponding gradient program described in Table 1. In HPLC system 1 the separation of 10 quinolones was achieved in 33 min while using HPLC system 2 all analytes were separated in 27 min. This difference is expected if we take into Table 3 Optimization of egg yolk pre-treatment Protocol Extraction solution Recoveries (%) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU M NaOH M NaOH M NaOH M NaOH in CH 3 OH M NaOH in CH 3 OH M NaOH in CH 3 OH M NaOH in ACN M NaOH in ACN M NaOH in ACN

305 Author's personal copy E.A. Christodoulou et al. / J. Chromatogr. B 859 (2007) Table 4 Calibration curves and sensitivity data of both the developed methods for the determination of the ten examined quinolones using as IS CAF 7.5 ng/ L as internal standard Quinolones Chicken muscle HPLC system 1 Egg yolk HPLC system 2 Slope ( g/kg) 1 Intercept R Range ( g/kg) LOD ( g/kg) Slope ( g/kg) 1 Intercept R Range ( g/kg) LOD ( g/kg) ENO ± ± ± ± OFL ± ± ± ± NOR ± ± ± ± CIP ± ± ± ± DAN ± ± ± ± ENR ± ± ± ± SAR ± ± ± ± OXO ± ± ± ± NAL ± ± ± ± FLU ± ± ± ± consideration that the two instruments differ by 8 min in their dwell volume. In Table 2 resolution factors (R s ) of the 10 analytes and the internal standard are calculated according to the formula: R s =2(t 2 t 1 )/(t w1 + t w2 ), where t 1 and t 2 are the retention times and t w1 and t w2 the baseline peak widths of successive peaks. The separation of the analytes in both systems is quite satisfactory, as it is proved from the resolution factors. Retention times of the examined analytes in HPLC system 1 were ± min for CAF, ± min for ENO, ± min for OFL, ± min for NOR, ± min for CIP, ± min for DAN, ± min for ENR, ± min for SAR, ± min for OXO, ± min for NAL and ± min for FLU. Column effluent was monitored using a photodiode array detector, set at 275 and 255 nm. Typical chromatograms of blank and spiked chicken muscle at near MRL level monitored at 275 nm are shown in Fig. 2(a and b). Retention times of the examined analytes in HPLC system 2 were ± min for CAF, ± min for ENO, ± min for OFL, ± min for NOR, ± min for CIP, ± min for DAN, ± min for ENR, ± min for SAR, ± min for OXO, ± min for NAL and ± min for FLU. Typical chromatograms of egg yolk blank and spiked at near LOQ level monitored at 275 are shown in Fig. 3(a and b). OXO, NAL and FLU were monitored at 255 nm, since they present higher sensitivity Optimization of sample preparation Optimization of sample preparation was focused on the extraction of the 10 quinolones from egg yolk. The extraction solvent used for chicken muscle (TFA 0.1% in CH 3 OH) did not give satisfactory recoveries. Also other acidic extraction solvents were used such as 1% TFA in ACN, 2% CH 3 COOH in ACN and HCl 1 M but none of them gave recoveries higher than 55%. Various concentrations of NaOH in water and in organic solvents were tried for the extraction of the 10 analytes from egg yolk. Results are recorded in Table 3. It is obvious that protocol 8 gave the highest recoveries. This protocol provides higher recovery and cleaner sample than the one previously described by the authors [14]. All trials were performed with 4 ml extraction solvent and the extraction was repeated twice, followed by the SPE for a further clean-up Method validation Linearity and sensitivity Calibration curves were obtained by least-squares linear regression analysis of the peak area ratio of analyte to internal standard versus analyte concentration. The two methods were linear up to 500 g/kg for all analytes except OFL, NOR, OXO, NAL and FLU in chicken muscle which were linear up to 600 g/kg. Regression analysis revealed correlation coefficients between and for chicken muscle and for egg yolk. The LODs for chicken muscle varied between 5.0 and 12.0 g/kg and for egg yolk were 8.0 g/kg

306 Author's personal copy 252 E.A. Christodoulou et al. / J. Chromatogr. B 859 (2007) for all examined analytes. All calibration data are presented in Table Selectivity Selectivity of both methods was assessed by the absence of any interference at the elution times of the studied analytes in the same chromatographic run as shown in blank chromatograms. To check the selectivity of the methods ten different samples of chicken muscle and ten different samples of egg yolk were analyzed with the respective method, after being pre-treated as described above, without any spiking Precision and accuracy To check the repeatability of the each method, spiked sample of chicken muscle and of egg yolk, respectively, were measured at three different concentrations. For chicken muscle the spiking levels were the MRLs/2, the MRLs and the MRLs 1.5 for quinolones with limits defined by the Council Regulation EEC 2377/90 and for the other quinolones the spiking levels were the LOQ of the method and two more concentrations. According to the same regulation the use of quinolones is prohibited in chickens from which eggs are produced for human consumption. So the LOQ of the respective method and moreover two more concentrations were chosen for the within-day repeatability and between-day precision assay. At each spiking level six different samples were prepared. To study the reproducibility of the method between six consecutive days the same experimental procedure was followed with spiked samples at the same concentration level as mentioned above (measurements for three samples per day, analyzed in triplicate). Precision and accuracy results are summarized in Table 5 for chicken muscle and in Table 6 for egg yolk. The accuracy of the methods was tested by studying the obtained average recoveries ranging between 96.6 and 102.8% Table 5 Within-day (n = 6) and between-day (over a period of six consecutive days) precision and accuracy data for the determination of quinolones in chicken muscle Analytes Added ( g/kg) Within-day Between-day Found ± S.D. ( g/kg) R.S.D. Recovery (%) Found ± S.D. ( g/kg) R.S.D. Recovery (%) Chicken muscle (HPLC system 1) ENO ± ± ± ± ± ± OFL ± ± ± ± ± ± NOR ± ± ± ± ± ± CIP ± ± ± ± ± ± DAN ± ± ± ± a ± ± ± ± ENR ± ± ± ± a 99.8 ± ± ± ± SAR ± ± ± ± ± ± OXO ± ± ± ± ± ± NAL ± ± ± ± ± ± FLU ± ± ± ± a ± ± ± ± a Maximum residue level according to Council Regulation (EEC) No. 2377/90.

307 Author's personal copy E.A. Christodoulou et al. / J. Chromatogr. B 859 (2007) Table 6 Within-day (n = 6) and between-day (over a period of six consecutive days) precision and accuracy data for the determination of quinolones in egg yolk Analytes Added ( g/kg) Within-day Between-day Found ± S.D. ( g/kg) R.S.D. Recovery (%) Found ± S.D. ( g/kg) R.S.D. Recovery (%) Egg yolk (HPLC system 2) ENO ± ± ± ± ± ± OFL ± ± ± ± ± ± NOR ± ± ± ± ± ± CIP ± ± ± ± ± ± DAN ± ± ± ± ± ± ENR ± ± ± ± ± ± SAR ± ± ± ± ± ± OXO ± ± ± ± ± ± NAL ± ± ± ± ± ± FLU ± ± ± ± ± ± Table 7 Calculations of error α and β, as well as decision limits (CC ) and detection capabilities (CC ) at the LOQ levels of the method and at the MRLs for the quinolones which are specified for chicken tissues ( g/kg). Analytes Added ( g/kg) Measured ± S.D. ( g/kg) Error α (1.64 S.D.) CC ( g/kg) Added ( g/kg) Measured ± S.D. ( g/kg) Errorβ(1.64 S.D.) CC ( g/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN a ± a ± ENR ± ± a ± a ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ± a ± a ± a Maximum residue level according to Council Regulation (EEC) No. 2377/90.

308 Author's personal copy 254 E.A. Christodoulou et al. / J. Chromatogr. B 859 (2007) Table 8 Calculations of error α and β, as well as decision limits (CC ) and detection capabilities (CC ) at the LOQ levels of the method and at the MRLs for the quinolones which are specified for egg yolk ( g/kg) Analytes Added ( g/kg) Measured ± S.D. ( g/kg) Error α (1.64 S.D.) CC ( g/kg) Added ( g/kg) Measured ± S.D. ( g/kg) Error (1.64 S.D.) CC ( g/kg) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ± ± ENR ± ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ± for chicken muscle and between 96.4 and 102.8% for egg yolk. All R.S.D. values were lower than 4.2% for chicken muscle and lower than 4.0% for egg yolk Decision limit and detection capability According to the 2002/657/EC decision the two novel criteria CC (limit of decision) and CC (capability of detection) were calculated for both methods in order to complete the validation procedure. The decision limits (CC ) were calculated as the mean values of the found concentrations plus 1.64 times the corresponding standard deviations. The detection capability (CC ) values were obtained after spiking the samples at the CC levels by adding 1.64 times the corresponding standard deviation. Table 7 summarises the obtained CC and CC for chicken tissues at the LOQ level of the method for each quinolone and at the MRL for DAN, ENR and FLU. For the measurements of CC and CC 20 blank milk samples were spiked, respectively. The same procedure was followed for the method of spiked egg yolk samples. Table 8 summarises the obtained CC and CC for egg yolk at the LOQ level of the method for each quinolone. 4. Concluding remarks In the present work two different methods were developed for the simultaneous determination of ten quinolones in chicken muscle and in egg yolk, respectively. Both methods were validated according to 2002/657/EC European decision and the results of validation process demonstrate that the method is suitable for any surveillance programme for veterinary drug residue in European Union. Following these two methods 10 samples of chicken tissues and 10 of egg yolk were analyzed all from different sources. No residues of quinolones were detected. The methods proved to be quite flexible. HPLC method 1 developed for chicken muscle proved to be suitable for egg yolk and vice versa for HPLC method 2. The major difference between the two analytical methods is the instrumentation, but both methods are applicable for both matrices. The accuracy of the methods was tested by obtaining average recoveries ranging between 96.6 and 102.8% for chicken muscle and between 96.4 and 102.8% for egg yolk. All R.S.D. values were lower than 4.2% for chicken muscle and lower than 4.0% for egg yolk. To conclude both methods developed herein are quite easy to be applied considering also the section of sample preparation which is also easy to implement for both methods with quite good recoveries. References [1] V.F. Samanidou, E.A. Christodoulou, I.N. Papadoyannis, Curr. Pharm. Anal. 1 (2005) 155. [2] V. Andreu, C. Blasco, Y. Pico, Trends Anal. Chem. 26 (6) (2007) 534. [3] Council Regulation (EEC) No. 2377/90 of 26 June 1990 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. Off. J. Eur. Commun. 1990, L224, 1 8.

309 Author's personal copy E.A. Christodoulou et al. / J. Chromatogr. B 859 (2007) [4] 2002/657/EC: Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, Off. J. Eur. Commun. 2002, L221, [5] J.-F. Huang, B. Lin, Q.-W. Yu, Y.-Q. Feng, Anal. Bioanal. Chem. 384 (2006) [6] P.G. Gigosos, P.R. Revesado, O. Cadahia, C.A. Fente, B.I. Vazquez, C.M. Franco, A. Cepeda, J. Chromatogr. A 871 (2000) 31. [7] M.K. Hassouan, O. Ballesteros, J. Taoufiki, J.L. Vilchez, M. Cabrera- Aguilera, A. Navalon, J. Chromatogr. B 852 (1 2) (2007) 625. [8] S. Baillac, D. Barron, V. Sanz-Nebot, J. Barbosa, J. Sep. Sci. 29 (2006) 131. [9] S. Baillac, O. Ballesteros, E. Jimenez-Lozano, D. Barron, V. Sanz-Nebot, A. Navalon, J.L. Vilchez, J. Barbosa, J. Chromatogr. A 1029 (2004) 145. [10] M.J. Schneider, D.J. Donogue, Anal. Chim. Acta 483 (2003) 39. [11] M.J. Schneider, D.J. Donogue, J. Chromatogr. B 780 (2002) 83. [12] J.C. York, P. Froc, J. Chromatogr. A 882 (2000) 63. [13] Z. Zeng, A. Dong, G. Yang, Z. Chen, X. Huang, J. Chromatogr. B 821 (2005) 202. [14] V.F. Samanidou, E.A. Christodoulou, I.N. Papadoyannis, J. Sep. Sci. 28 (2005) 555. [15] Guidance for Industry, Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology, November 1996, ICH.

310 Accepted Manuscript Title: Validation of an HPLC-UV method according to the European Union Decision 2002/657/EC for the simultaneous determination of ten quinolones in chicken muscle and egg yolk Authors: Eleni A. Christodoulou, Victoria F. Samanidou, Ioannis N. Papadoyannis PII: S (07) DOI: doi: /j.jchromb Reference: CHROMB To appear in: Journal of Chromatography B Received date: Revised date: Accepted date: Please cite this article as: E.A. Christodoulou, V.F. Samanidou, I.N. Papadoyannis, Validation of an HPLC-UV method according to the European Union Decision 2002/657/EC for the simultaneous determination of ten quinolones in chicken muscle and egg yolk, Journal of Chromatography B (2007), doi: /j.jchromb This is a PDF file of an unedited manuscript that has been accepted for publication. As a service to our customers we are providing this early version of the manuscript. The manuscript will undergo copyediting, typesetting, and review of the resulting proof before it is published in its final form. Please note that during the production process errors may be discovered which could affect the content, and all legal disclaimers that apply to the journal pertain.

311 1 2 Validation of an HPLC-UV method according to the European Union Decision 2002/657/EC for the simultaneous determination of ten quinolones in chicken muscle and egg yolk. Eleni A. Christodoulou, Victoria F. Samanidou* and Ioannis N. Papadoyannis Laboratory of Analytical Chemistry Department of Chemistry. Aristotle University of Thessaloniki. GR , Thessaloniki, Greece. Running Title: Multi-residue HPLC analysis of ten quinolones in chicken muscle and egg yolk after SPE. * Corresponding author: Victoria F. Samanidou. Laboratory of Analytical Chemistry Department of Chemistry. Aristotle University of Thessaloniki. GR Thessaloniki, Greece. Tel.: ; Fax: address: samanidu@chem.auth.gr Keywords: Quinolones, solid phase extraction, chicken muscle, egg yolk, HPLC, Accepted Manuscript Commission decision 2002/657/EC Page 1 of 28

312 1 Abstract Herein two different methods are proposed for the determination of ten quinolones (enoxacin, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin, oxolinic acid, nalidixic acid and flumequine) in chicken muscle and egg yolk. Two different HPLC systems were used comparatively and the respective methods were fully validated. The analytes were initially extracted from chicken muscle and egg yolk and purified by a Solid Phase Extraction using LiChrolut RP-18 cartridges. Recoveries varied between % for chicken muscle and % for egg yolk. HPLC separation was performed at 25 o C using an ODS-3 PerfectSil Target (250 x 4 mm) 5 µm analytical column (MZ-Analysentechnik, Germany). The mobile phase consisted of a mixture of 0.1% Trifluoroacetic acid (TFA)-ACN-CH 3 OH, delivered by a gradient program, different for each method. In both cases caffeine was used as internal standard at the concentration of 7.5 ng/µl. Column effluent was monitored using a photodiode array detector, set at 275 and 255nm. The developed methods were validated according to the criteria of Commission Decision 2002/657/EC. The LODs for chicken muscle varied between 5.0 and 12.0 µg/kg and for egg yolk was 8.0 µg/kg for all examined alalytes. Accepted Manuscript Page 2 of 28

313 1 1. Introduction Quinolones are synthetic antibiotics whose action is based on their anti-dna activity. Nalidix acid was the first quinolone approved on 1963, by Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of urinary tract infections. Quinolones are widely used till nowadays in human and in veterinary medicine, due to their safety with good tolerance and broad antibacterial spectrum. Fluoroquinolones belong to the second generation of quinolones and their characteristic is the greater effectiveness against both Gram-negative and Gram-positive pathogens that are resistant to other antibacterials [1]. Data collected from 25 European countries showed that fluoroquinolones represented more than 50% of the quinolones used. Ciprofloxacin is the most widely prescribed fluoroquinolone in the world, followed by ofloxacin. [2]. The widespread use of quinolones in human and in veterinary medicine has led to a significant increase in antibacterial resistance, having therefore important consequences for public health. To minimize risks in human health by the consumption of quinolones residues in foods, the European Union by the Council Regulation N o 2377/90 has established maximum residue limits (MRLs) of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin and among them are some quinolones [3]. The MRLs Accepted Manuscript according to this Regulation in chicken muscle are 200 µg/kg for danofloxacin, 300 µg/kg for difloxacin, 100 µg/kg for enrofloxacin and 200 µg/kg for flumequine. Another provision according to this directive is that the use of quinolones is prohibited in animals from which eggs are produced for human consumption. Therefore analytical methods as 3 Page 3 of 28

314 1 2 sensitive as possible are required in order to check food samples before their disposal to the markets for human consumption. Recently European Union has issued the decision /657/EC which concerns the performance of analytical methods and the interpretation of results in the official control of residues in products of animal origin [4]. The increasing number of published papers concentrating on the determination of quinolones residues in food is illustrating the seriousness of this state. The last decade the majority of the articles propose a simultaneous analysis of more than five quinolones residues in chicken tissue and in eggs. Huang and his team and Gigosos et al. have developed methods for the determination of five quinolones in eggs [5, 6]. Hassouan et al. propose a method for the determination of seven quinolones in eggs [7] and Bailac et al in two different papers develope methods for the determination of seven quinolones in chicken muscle [8, 9]. Schneider M.J. and Donoghue D.J. have developed a method for the determination of eight quinolones in eggs and in chicken tissue [10, 11]. Also York and Froc propose a method for the determination of eight quinolones in chicken tissue but in three groups [12]. Finally Zeng et al. have developed a method for the simultaneous determination of nine quinolones in eggs [13]. All published methods mentioned above involve the use of HPLC. Most of them are using a Fluorescence Detector single [7, 8, 12 and 13], or coupled with MS [10, 11] or a Accepted Manuscript photodiode array detector [5]. Gigosos et al. use a UV-diode array detector [6] and Baillac et al. use ESI-MS/MS detector [8] A previous work of the authors deals with the simultaneous determination of five quinolones in chicken tissue by HPLC [14]. The innovation of the present work is the 4 Page 4 of 28

315 1 2 analysis of five more quinolones, in total ten Quinolones: enoxacin (ENO), ofloxacin (OFL), norfloxacin (NOR), ciprofloxacin (CIP), danofloxacin (DAN), enrofloxacin (ENR), sarafloxacin (SAR), oxolinic acid (OXO), nalidixic acid (NAL) and flumequine (FLU), which are determined in chicken tissues and in eggs yolk. Chemical structures of examined quinolones are illustrated in Fig. 1. Two methods have been developed and validated using two different HPLC instruments. The comparison of the two methods proved that they are applicable for both matrices, with the same recoveries and the same limits of quantitation. Solid Phase extraction was selected for the sample preparation of both matrices as the fastest, easiest and most efficient technique. 2. Experimental 2.1 Reagents and materials Enoxacin, ofloxacin, norfloxacin, nalidixic acid, flumequine, ciprofloxacin and internal standard caffeine, all of analytical grade were purchased from Sigma (Steinheim, Germany), enrofloxacin >98%, oxolinic acid 97% from Fluka (Steinheim, Germany), Accepted Manuscript danofloxacin 98.4 % and sarafloxacin 99.3% VETRANAL from Riedel-de Haen (Buchs SG, Schweiz). HPLC grade methanol (99.8%), gradient grade acetonitrile (99.9%) were supplied by Carlo Erba (Milano, Italy) and analytical grade sodium hydroxide (NaOH, 1 mol/l) by Merck (Darmstadt, Germany). Trifluoroacetic acid 99% was obtained from 5 Page 5 of 28

316 1 2 Aldrich (Steinheim, Germany). Ultrapure water provided by a Milli-Q system (Millipore, Bedford, MA, USA) was used throughout the study. purification Merck LiChrolut RP-18 (200 mg/3 ml) SPE cartridges were used for the isolation of the analytes from any endogenous interference stemmed from chicken and egg yolk matrices. 2.2 Instrumentation HPLC System 1 A Shimadzu (Kyoto, Japan) HPLC system was used for the analysis of the examined quinolones in chicken muscle. It was consisted of a mixer FCV-9AL for the mixing of the solvent lines, an LC-9A pump for delivering the mobile phase to the analytical column, a SIL-9A autosampler equipped with a 50 µl loop for sample injection a column oven for maintaining the temperature stable and an SPD-M6A Photodiode Array Detector. Degassing of the mobile phase was achieved by continuous helium sparking in the solvent reservoirs by a DGU-2A degassing unit. The whole system was complied by the software Class M-10A. HPLC System 2 Accepted Manuscript A Shimadzu (Kyoto, Japan) quaternary low-pressure gradient system was used for chromatographic determination of the examined quinolones in egg yolk. The solvent lines 6 Page 6 of 28

317 1 2 were mixed in an FCV-10AL VP mixer. An LC-10AD VP pump was used to deliver the mobile phase to the analytical column, equipped with a Shimadzu SCL-10AL VP System Controller, permitting fully automated operation, used to deliver the mobile phase to the analytical column. Sample injection was performed via a Rheodyne 7725i injection valve (Rheodyne, Cotati, California, USA) equipped with a 20 µl loop. Detection was achieved by an SPD-M10A VP Photodiode Array Detector, in compliance with data acquisition software LabSolutions-LCsolutions by Shimadzu. Functions of the whole system were controlled by an SCL-10A VP controller. Degassing of the mobile phase was achieved by continuous helium sparking in the solvents reservoirs by a DGU-10B degassing unit. Glass vacuum-filtration apparatus obtained from Alltech Associates (Deerflied, IL, USA) was used for the filtration of buffer solutions through Whatman Cellulose Nitrate 0.2 µm- WCN Type (47 mm DIA) (Whatman Laboratory Division, Maidstone, England) membrane filters. A Glasscol (Terre Haute, IN 47802, USA) small vortexer, a Hermle centrifuge, model Z-230 (B. Hermle, Gosheim, Germany) and an Ultrasonic bath Transonic460/H (Elma, Germany) were employed for sample pre-treatment. All evaporations were performed with a Supelco 6-port Mini-Vap concentrator/evaporator (Bellefonte, PA, USA). SPE was carried out on a 12-port vacuum manifold from Supelco. Accepted Manuscript Page 7 of 28

318 1 2.3 Chromatographic conditions A PerfectSil Target ODS-3 analytical column (250 x 4 mm), 5 µm, purchased from MZ- Analysentechnik (Mainz, Germany) was used for the separation of the studied quinolones, operated at 25 o C. The mobile phase consisted of A: 0.1% TFA, B: ACN and C: CH 3 OH. Two different gradient programs were used for the separation of the ten quinolones, which are described in Table 1. Column effluent was monitored at 275 nm for all analytes except OXO, NAL and FLU, which were monitored at 255 nm. The flow rate was 1.2 ml/min for both systems but the inlet pressure ranged from 290 to 310 kg/cm 2 for HPLC system 1 and from 230 to 240 kg/cm 2 for HPLC system 2. Caffeine (CAF) was used as internal standard at a concentration of 7.5 ng/µl. Injected sample volume was 50 µl for HPLC system 1 and 20 µl for HPLC system Preparation of standard solutions Stock solutions at a concentration of 100 ng/µl for ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR and SAR were prepared every two months, while those for OXO, NAL and FLU, proved to be less stable and were prepared every two weeks. All stock solutions were prepared in Accepted Manuscript water by dissolving the appropriate amount of quinolone and by adding an aliquot of 100 µl of NaOH 0.1 mol/l per 10 ml to enhance solubility of the compounds. Stock 21 solutions were stored at 4 ο C. All working standards were prepared every day by 8 Page 8 of 28

319 1 2 appropriate dilutions of the concentrated stock standard solutions. Aqueous stock solution of CAF was prepared at the concentration of 100 ng/µl Sample preparation Sample preparation of chicken muscle Chicken tissues were chopped, homogenised and stored at -20 o C at packages of 1±0.0001g. According to the protocol about 1g of tissue was either spiked with 200µL of the mixture of quinolones (including the internal standard at the concentration on 7.5 ng/µl) or not (in case of blank sample). A volume of 4 ml of 0.1% TFA in CH 3 OH (extraction solvent) was added and the mixture was vortexed and left to settle in dark for 10min. The solution was then sonicated for 15 min and directly centrifuged at 800g for 10 min. The supernatant was collected in a test tube and was evaporated under stream of N 2. The sample was re-extracted a second time with 4 ml of the same extraction solvent. The solution was vortexed, left to settle in dark, sonicated for 15 min and centrifuged. The supernatant was added to the same test tube and was also evaporated to dryness. The residue was dissolved then in 2 ml of an aqueous solution of 0.1% TFA. The solution Accepted Manuscript was applied to the SPE cartridge, which was previously conditioned with 2 ml CH 3 OH and 2 ml water. The elution was performed with 1.5 ml solution of 0.1% TFA in ACN and 0.5 ml ACN. The eluent was evaporated to dryness at 45 o C under a gentle stream of N 2. Finally, the dry residue of the quinolones in case of spiked sample or of the blank 9 Page 9 of 28

320 1 2 sample was dissolved in 200 µl of an aqueous solution of TFA 0.1% and 50 µl was injected into the HPLC system Sample preparation of egg yolk 1±0.0001g of egg yolk sample was either spiked with 200µL of the mixture of quinolones (including the internal standard at the concentration on 7.5 ng/µl) or not (in case of blank sample). 2 ml of NaOH 0.75M in ACN (extraction solvent) were added and the mixture was vortexed and left to settle in dark for 10min. The solution was then sonicated for 15 min and directly centrifuged at 800g for 10 min. The supernatant was collected in a test tube and was evaporated under stream of N 2. The sample was re-extracted a second time with 2 ml of the same extraction solvent. Again the solution was vortexed, left to settle in dark, sonicated for 15 min and centrifuged. The supernatant was added to the same test tube and was also evaporated to dryness. The extracted was dissolved then in 2 ml of an aqueous solution of 0.1% TFA The solution was applied to the SPE cartridge, which was previously conditioned with 2 ml CH 3 OH and 2 ml water. The elution was performed with 1.5 ml solution of 0.1% TFA in ACN and 0.5 ml ACN. The eluent was evaporated to dryness at 45 o C under a gentle stream of N 2. Finally, the dry residue of the quinolones Accepted Manuscript in case of spiked sample or of the blank sample was dissolved in 200 µl of an aqueous solution of 0.1% TFA and 20 µl was injected into the HPLC system Page 10 of 28

321 1 2.6 Method validation Both methods were validated in order to accomplish the criteria specified by the European s Commission Decision 2002/657/EC. Both methods were checked for the linearity and the sensitivity. Linearity was studied by injecting a series of mixture of the analytes at different concentration levels, in order to cover the whole working range. Calibration curves of spiked samples for every quinolone, with the respective correlation coefficient, were calculated by least-squares linear regression analysis of the peak area ratio of each analyte to IS of the respective results versus analyte concentration. The calculations for the limits of detection (LODs) were based on the standard deviation of y-intercepts of regression analysis (σ) and the slope (S), using the following equation LOD = 3.3 σ / S [15]. In turn, the limits of quantitation (LOQs) were calculated by the equation LOQ=10 σ/s [15]. Selectivity of the methods was assessed by studying the absence of any interference in same chromatographic run as the examined quinolones with the respective method for chicken tissue and egg yolk samples. The methods were also validated with respect to accuracy, intra day (n=6) and inter day (n=6) precision. Accuracy was studied by analyzing six times three concentration levels. Decision limits (CC α ) and detection capability (CC β ), the new criteria according to Accepted Manuscript European Decision 2002/657/EC were also calculated. For the measurement of CC α samples were spiked at the respective LOQ level of each method as well as at the 11 Page 11 of 28

322 1 2 concentration of MRL for those quinolones with specified permitted limits The decision limits (CC α ) were calculated as the mean values of the found concentrations plus times the corresponding standard deviations. The detection capability (CC β ) values were obtained after spiking the samples at the CC α levels by adding 1.64 times the corresponding standard deviation. Statistical analysis for CC α and CC β was performed at the 95% confidential level and the number of replicate analyses was Results and Discussion 3.1 Chromatography The mobile phase for both methods consisted of a mixture of 0.1% TFA CH 3 OH ACN delivered to the analytical column according to the corresponding gradient program described in Table 1. In HPLC system 1 the separation of ten quinolones was achieved in 33 min while using HPLC system 2 all analytes were separated in 27 min. This difference is expected if we take into consideration that the two instruments differ by 8 min. in their dwell volume. In Table 2 resolution factors (R s ) of the ten analytes and the internal standard are calculated according to the formula: R s = 2(t 2 t 1 )/(t w1 + t w2 ), where t 1 and t 2 Accepted Manuscript are the retention times and t w1 and t w2 the baseline peak widths of successive peaks. The separation of the analytes in both systems is quite satisfactory, as it is proved from the resolution factors. Retention times of the examined analytes in HPLC system 1 were 7.602±0.032 min for CAF, ±0.017 min for ENO, ±0.026 min for OFL, 12 Page 12 of 28

323 ±0.013 min for NOR, ±0.021 min for CIP, ±0.031 min for DAN, ±0.025 min for ENR, ±0.018 min for SAR, ±0.011 min for OXO, ±0.024 min for NAL and ±0.022 min for FLU. Column effluent was monitored using a photodiode array detector, set at 275 and 255nm. Typical chromatograms of blank and spiked chicken muscle at near MRL level monitored at 275 nm are shown in Fig. 2 (a and b). Retention times of the examined analytes in HPLC system 2 were 8.905±0.012 min for CAF, ±0.024 min for ENO, ±0.022 min for OFL, ±0.033 min for NOR, ±0.023 min for CIP, ±0.030 min for DAN, ±0.013 min for ENR, ±0.022 min for SAR, ±0.024 min for OXO, ±0.009 min for NAL and ±0.018 min for FLU. Typical chromatograms of egg yolk blank and spiked at near LOQ level monitored at 275 are shown in Fig. 3 (a and b). OXO, NAL and FLU were monitored at 255 nm, since they present higher sensitivity. 3.2 Optimization of Sample Preparation Optimization of sample preparation was focused on the extraction of the ten quinolones from egg yolk. The extraction solvent used for chicken muscle (TFA 0.1% in CH 3 OH) Accepted Manuscript didn t give satisfactory recoveries. Also other acidic extraction solvents were used such as 1% TFA in ACN, 2% CH 3 COOH in ACN and HCl 1M but none of them gave recoveries higher than 55%. Various concentrations of NaOH in water and in organic solvents were tried for the extraction of the ten analytes from egg yolk. Results are 13 Page 13 of 28

324 1 2 recorded in Table 3. It s obvious that protocol 8 gave the highest recoveries. This protocol provides higher recovery and cleaner sample than the one previously described by the authors [14]. All trials were performed with 4 ml extraction solvent and the extraction was repeated twice, followed by the SPE for a further clean-up. 3.3 Method Validation Linearity and sensitivity Calibration curves were obtained by least-squares linear regression analysis of the peak area ratio of analyte to internal standard versus analyte concentration. The two methods were linear up to 500 µg/kg for all analytes except OFL, NOR, OXO, NAL and FLU in chicken muscle which were linear up to 600µg/Kg. Regression analysis revealed correlation coefficients between for chicken muscle and for egg yolk. The LODs for chicken muscle varied between 5.0 and 12.0 µg/kg and for egg yolk were 8.0 µg/kg for all examined analytes. All calibration data are presented in Table Selectivity Accepted Manuscript Selectivity of both methods was assessed by the absence of any interference at the elution times of the studied analytes in the same chromatographic run as shown in blank 14 Page 14 of 28

325 1 2 chromatograms. To check the selectivity of the methods ten different samples of chicken muscle and ten different samples of egg yolk were analysed with the respective method, after being pre-treated as described above, without any spiking Precision and accuracy To check the repeatability of the each method, spiked sample of chicken muscle and of egg yolk respectively were measured at three different concentrations. For chicken muscle the spiking levels were the MRLs/2, the MRLs and the MRLsx1.5 for quinolones with limits defined by the Council Regulation EEC 2377/90 and for the other quinolones the spiking levels were the LOQ of the method and two more concentrations. According to the same regulation the use of quinolones is prohibited in chickens from which eggs are produced for human consumption. So the LOQ of the respective method and moreover two more concentrations were chosen for the within day repeatability and between day precision assay. At each spiking level six different samples were prepared. To study the reproducibility of the method between six consecutive days the same experimental procedure was followed with spiked samples at the same concentration level as mentioned above (measurements for three samples per day, analyzed in Accepted Manuscript triplicate). Precision and accuracy results are summarized in Table 5 for chicken muscle and in Table 6 for egg yolk The accuracy of the methods was tested by studying the obtained average recoveries ranging between % for chicken muscle and between % for egg yolk. 15 Page 15 of 28

326 1 2 All RSD values were lower than 4.2% for chicken muscle and lower than 4.0% for egg yolk Decision limit and detection capability According to the 2002/657/EC decision the two novel criteria CC α (limit of decision) and CC β (capability of detection) were calculated for both methods in order to complete the validation procedure. The decision limits (CC α ) were calculated as the mean values of the found concentrations plus 1.64 times the corresponding standard deviations. The detection capability (CC β ) values were obtained after spiking the samples at the CC α levels by adding 1.64 times the corresponding standard deviation. Table 7 summarises the obtained CC α and CC β for chicken tissues at the LOQ level of the method for each quinolone and at the MRL for DAN, ENR and FLU. For the measurements of CC α and CC β 20 blank milk samples were spiked, respectively. The same procedure was followed for the method of spiked egg yolk samples. Table 8 summarises the obtained CC α and CC β for egg yolk at the LOQ level of the method for each quinolone. 4. Concluding remarks Accepted Manuscript In the present work two different methods were developed for the simultaneous determination of ten quinolones in chicken muscle and in egg yolk, respectively. Both 21 methods were validated according to 2002/657/EC European decision and the results of 16 Page 16 of 28

327 1 2 validation process demonstrate that the method is suitable for any surveillance programme for veterinary drug residue in European Union Following these two methods ten samples of chicken tissues and ten of egg yolk were analyzed all from different sources. No residues of quinolones were detected. The methods proved to be quite flexible. HPLC method 1 developed for chicken muscle proved to be suitable for egg yolk and vice versa for HPLC method 2. The major difference between the two analytical methods is the instrumentation, but both methods are applicable for both matrices. The accuracy of the methods was tested by obtaining average recoveries ranging between % for chicken muscle and between % for egg yolk. All RSD values were lower than 4.2% for chicken muscle and lower than 4.0% for egg yolk. To conclude both methods developed herein are quite easy to be applied considering also the section of sample preparation which is also easy to implement for both methods with quite good recoveries. 5. References [1] V.F. Samanidou, E.A. Christodoulou, I.N. Papadoyannis, Cur. Pharm. Analysis 1, (2005), 155. Accepted Manuscript [2] V. Andreu, C. Blasco, Y. Pico, Trends in Analytical Chemistry, (2007), in press. 17 Page 17 of 28

328 1 2 [3] Council Regulation (EEC) No 2377/90 of 26 June 1990 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. Off. J. Eur. Commun. 1990, L 224, 1-8. [4] 2002/657/EC: Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, Off. J. Eur. Commun. 2002, L221, [5] J.-F. Huang, B. Lin, Q.-W.Yu, Y.-Q. Feng, Anal. Bioanal. Chem, 384, (2006), [6] P.G. Gigosos, P.R. Revesado, O. Cadahia, C.A. Fente, B.I. Vazquez, C.M. Franco, A. Cepeda, J. of Chromatogr. A, 871, (2000), 31. [7] M.K. Hassouan, O. Ballesteros, J. Taoufiki, J.L. Vilchez, M. Cabrera-Aguilera, A. Navalon, J. of chromatogr. B, (2007), in press. [8] S. Baillac, D. Barron, V. Sanz-Nebot, J. Barbosa, J. Sep. Sci., 29, (2006), 131. [9] S. Baillac, O. Ballesteros, E. Jimenez-Lozano, D. Barron, V. Sanz-Nebot, A. Navalon, J.L. Vilchez, J. Barbosa, J. of Chromatogr. A, 1029, (2004), 145. [10] M.J. Schneider, D.J. Donogue Anal. Chim. Acta, 483, (2003), 39. [11] M.J. Schneider, D.J. Donogue J. of Chromatogr. B, 780, (2002), 83. [12] J.C. York, P. Froc,, J. of Chromatogr. A, 882, (2000), 63. [13] Z. Zeng, A. Dong, G. Yang, Z. Chen, X. Huang, J. of Chromatogr. B, 821, (2005), 202. Accepted Manuscript [14] V.F. Samanidou, E.A. Christodoulou, I.N. Papadoyannis, J. Sep. Sci., 28, (2005), Page 18 of 28

329 1 2 [15] Guidance for Industry, Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology, November 1996, ICH Figure Legends Figure 1: Chemical structure of the examined quinolones. Figure 2: a. Chromatogram of blank chicken muscle monitored at 275nm. b. Chromatogram of chicken muscle spiked with a mixture of the ten quinolones at near MRL level monitored at 275nm: 1. Caffeine: 7.6 min (7.5 ng/µl), 2.ENO: 20.2 min (3.0 ng/µl), 3.OFL: 21.3 min (3.0 ng/µl), 4.NOR: 22.1 min (3.0 ng/µl), 5.CIP: 23.5 min (3.0 ng/µl), 6.DAN: 25.3 min (4.0 ng/µl, MRL), 7.ENR: 26.0 min (2.0 ng/µl, MRL), 8.SAR: 27.7 min (3.0 ng/µl), 9.OXO: 29.3 min (3.0 ng/µl), 10.NAL: 32.0 min (3.0 ng/µl), 11.FLU: 32.6 min (3.0 ng/µl). Figure 3: a. Chromatogram of blank egg yolk sample monitored at 275nm. b. Chromatogram of egg yolk spiked with a mixture of the ten quinolones near LOQ level (0.5 ng/ µl) monitored at 275nm. 1. Caffeine: 8.9 min, (7.5 ng/µl), 2.ENO: 13.0 min, 3. OFL: 13.3 min, 4. NOR: 13.6 min, 5. CIP: 14.2 min, 6. DAN: 14.8min, 7. ENR: 15.2 min, 8. SAR: 17.5 min, 9. OXO: 20.2 min, 10. NAL: 25.0 min, 11. FLU: 26.6 min. Accepted Manuscript Page 19 of 28

330 Figure 1 O O F OH F O O F O O OH OH N N N N N N HN O HN CH C 2 H 3 5 CH 3 HN F N Enoxacin Ofloxacin Norfloxacin N O N O OH N CH 3 F N Ciprofloxacin Danofloxacin Enrofloxacin HN F N N O N F O OH O O O O CH 2 CH 3 Sarafloxacin Oxolinic acid Nalidixic acid Figure 1 F O N Accepted Manuscript CH 3 O O Flumequine OH OH OH H 3CH 2C N H 3 C F N N O N O N N C 2 H 5 C 2 H 5 O OH O OH Page 20 of 28

331 Figure 2 a. Accepted Manuscript b. Figure 2 Page 21 of 28

332 Figure 3 a. b. Figure 3 Accepted Manuscript Page 22 of 28

333 Tables Table 1. Gradient timetable for the two HPLC systems. HPLC system 1 HPLC system 2 t, min TFA (0.1%) ACN CH 3 OH t, min TFA (0.1%) ACN CH 3 OH Table 2. Resolution factors of the analytes in the different methods. HPLC system 1 HPLC system 2 CAF(IS)-ENO ENO-OFL OFL-NOR NOR-CIP CIP-DAN DAN-ENR ENR-SAR SAR-OXO OXO-NAL NAL-FLU Total analysis time 33 min 27 min Table 3. Optimization of egg yolk pre-treatment. Protocol Extraction Recoveries (%) solution ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU 1 0.5M NaOH M NaOH M NaOH M NaOH in CH 3 OH M NaOH in CH 3 OH M NaOH in CH 3 OH M NaOH in ACN M NaOH in ACN M NaOH in ACN Accepted Manuscript Page 23 of 28

334 Table 4. Calibration curves and sensitivity data of both the developed methods for the determination of the ten examined quinolones using as IS CAF 7.5 ng/μl as internal standard. ENO ± OFL ± NOR ± CIP ± DAN ± ENR ± SAR ± OXO ± NAL ± FLU ± Chicken Muscle HPLC system 1 Slope Intercept R Range (μg/kg) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± (μg/kg) LOD (μg/kg) Egg Yolk HPLC system 2 Slope Intercept R Range (μg/kg) -1 (μg/kg) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Quinolones Accepted Manuscript LOD (μg/kg) Page 24 of 28

335 Table 5. Within-day (n = 6) and Between-day (over a period of 6 consecutive days) precision and accuracy data for the determination of quinolones in chicken muscle. Chicken Muscle (HPLC System 1) Analytes Added Found ± SD Recovery Found ± SD Recovery RSD RSD (μg/kg) (μg/kg) [%] (μg/kg) [%] Within-Day Between-Day ENO ± ± ± ± ± ± OFL ± ± ± ± ± ± NOR ± ± ± ± ± ± CIP ± ± ± ± ± ± DAN ± ± ± ± * 200.8± ± ± ± ENR ± ± ± ± * 99.8± ± ± ± SAR ± ± ± ± ± ± OXO ± ± ± ± ± ± NAL ± ± ± ± ± ± FLU ± ± ± ± * 399.0± ± ± ± * : Maximum residue level according to Council Regulation (EEC) N o 2377/90 Accepted Manuscript Page 25 of 28

336 Table 6. Within-day (n = 6) and Between-day (over a period of 6 consecutive days) precision and accuracy data for the determination of quinolones in egg yolk. Egg Yolk (HPLC System 2) Analytes Added Found ± SD Recovery Found ± SD Recovery RSD RSD (μg/kg) (μg/kg) [%] (μg/kg) [%] Within Day Between Day ENO ± ± ± ± ± ± OFL ± ± ± ± ± ± NOR ± ± ± ± ± ± CIP ± ± ± ± ± ± DAN ± ± ± ± ± ± ENR ± ± ± ± ± ± SAR ± ± ± ± ± ± OXO ± ± ± ± ± ± NAL ± ± ± ± ± ± FLU ± ± ± ± ± ± Accepted Manuscript Page 26 of 28

337 Analytes Table 7. Calculations of error α and β, as well as decision limits (CC α ) and detection capabilities (CC β ) at the LOQ levels of the method and at the MRLs for the quinolones which are specified for chicken tissues (μg/kg). Added (μg/kg) Measured ±SD (μg/kg) Error α (1.64*SD ) CC α ( μg/kg ) Added (μg/kg) Measured ±SD (μg/kg) * : Maximum residue level according to Council Regulation (EEC) N o 2377/90 Error β (1.64*SD) Accepted Manuscript CC β ( μg/kg ) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN * ± * ± ENR ± ± * 96.52± * ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ± * ± * ± Page 27 of 28

338 Table 8. Calculations of error α and β, as well as decision limits (CC α ) and detection capabilities (CC β ) at the LOQ levels of the method and at the MRLs for the quinolones which are specified for egg yolk (μg/kg). Analytes Added (μg/kg) Measured ±SD (μg/kg) Error α (1.64*SD) CC α (μg/kg) Added (μg/kg) Measured ±SD (μg/kg) Error β (1.64*SD) Accepted Manuscript CC β ( μg/kg ) ENO ± ± OFL ± ± NOR ± ± CIP ± ± DAN ENR ± ± SAR ± ± OXO ± ± NAL ± ± FLU ± ± Page 28 of 28

339 J. Sep. Sci. 2007, 30, E. A. Christodoulou et al Eleni A. Christodoulou Victoria F. Samanidou Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki, Greece Original Paper Multiresidue HPLC analysis of ten quinolones in milk after solid phase extraction: Validation according to the European Union Decision 2002/ 657/EC A rapid and sensitive analytical method was developed for the residue analysis of ten quinolones (enoxacin (ENO), ofloxacin (OFL), norfloxacin (NOR), ciprofloxacin (CIP), danofloxacin (DAN), enrofloxacin (ENR), sarafloxacin (SAR), oxolinic acid (OXO), nalidixic acid (NAL), and flumequine (FLU)) in cow s milk. The analytes were extracted from milk by a deproteinization step followed by a simple SPE cleanup procedure using LiChrolut RP-18 Merck cartridges. Recoveries varied between 75 and 92%. HPLC separation was performed at 258C using an ODS-3 PerfectSilm Target (25064 mm 2 )5lm analytical column (MZ-Analysentechnik, Germany). The mobile phase consisted of a mixture of TFA 0.1% CH 3 CN CH 3 OH, delivered by a gradient program at the flow rate of 1.2 ml/min. Elution of the ten analytes and the internal standard (caffeine, 7.5 ng/ll) was completed within 27 min. Column effluent was monitored using a photodiode array detector, set at 275 and 255 nm. The developed method was validated according to the criteria of Commission Decision 2002/657/ EC. The LODs of the specific method of quinolones' determination in milk varied between 1.5 and 6.8 ng/ll. Keywords: Commission Decision 2002/657/EC / HPLC / Milk / Quinolones / Solid phase extraction / Received: March 27, 2007; revised: May 1, 2007; accepted: May 2, 2007 DOI /jssc Introduction The widespread use of antibiotics in veterinary medicine for the treatment of diseases as well as in the form of nutritional supplements may lead to their residues in animal-derived food products. Despite their beneficial usage, the misuse of antibiotics results in the development of nonpathogenic and pathogenic organisms' resistance. The illicit use of antibiotics could thus increase the risk of food borne infection with antibioticresistant pathogenic bacteria contaminating the food consumed by humans [1]. Milk is one of the products from food-producing animals that may be contaminated by residues of drugs. The consumption of antibiotics Correspondence: Dr. Victoria F. Samanidou, Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, GR Thessaloniki, Greece samanidu@chem.auth.gr Fax: Abbreviations: CIP, ciprofloxacin; DAN, danofloxacin; ENO, enoxacin; ENR, enrofloxacin; FLU, flumequine; MRL, maximum residue limit; NAL, nalidixic acid; NOR, norfloxacin; OFL, ofloxacin; OXO, oxolinic acid; SAR, sarafloxacin through milk may generate allergic reactions to sensitive individuals [2]. In 1990, the European Union established the Council Regulation (EEC) no. 2377/90 which determines the maximum residue limits (MRLs) of certain veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin [3]. Different MRL values have been set for quinolones in milk: 30 lg/ kg for danofloxacin (DAN), 100 lg/kg for enrofloxacin (ENR), 50 lg/kg for flumequine (FLU), and 75 lg/kg for marbofloxacin [4]. The use of veterinary drugs in the EU is regulated by the Council Directive 96/23/EC where quinolones are classified in Group B1 (veterinary medicines and contaminants, with an MRL) of Annex I. Quinolones comprise an interesting group of antibacterials whose action is based on their anti-dna activity. All quinolone antibiotics possess a carboxylic group in position 3 and a carbonyl group in position 4. The introduction of 6-fluoro and 7-piperazinyl moiety gave rise to the production of second-generation quinolones, known as fluoroquinolones. The addition of these two moieties has increased the activity against Gram-positive and Gram-negative organisms [5]. i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

340 2422 E. A. Christodoulou et al. J. Sep. Sci. 2007, 30, In order to accomplish the European Union's requirements for the MRLs sensitive multiresidue screening methods for quinolones in milk are required. Only a limited number of articles for the determination of quinolones in milk can be found in the literature. The analytical techniques used include HPLC [6 11], CE [12], TLC [13, 14], and single-use phosphorimetric drop plane sensor [15]. Yang et al. [11] proposed the simultaneous determination of 11 quinolones in milk. Although the method is quite simple and sensitive enough, it is not validated according to European Decision 2002/657/EC, which provides rules for the analytical methods to be used in the testing of official samples and specifies common criteria for the interpretation of analytical results of official control laboratories for such samples. Two more studies, those of Van Hoof et al. [10] and Lara et al. [12] deal with the separation of eight quinolones in milk. Ho et al. [7] and Marazuela and Moreno-Bondi [9] developed methods for five quinolones. Three more articles are available for the study of only two quinolones [6, 8, 13] and two for the study of only one quinolone [14, 15]. Most of the methods found in the literature for the determination of quinolones in milk propose the precipitation of proteins with various solutions such as 20% TCA in CH 3 OH [6, 9] or 20% in CH 3 CN [10], 10% TFA in the mixture of water CH 3 CN (9 + 1) [11] prior to an extraction step of quinolones from the matrix by SPE. Lara et al. [12] separated the fat of the milk by centrifugation at 1800 rpm and then proceeded to SPE. Idowu et al. [8] have used liquid liquid extraction with CH 2 Cl 2. Similar procedure was followed by Choma and Komaniecka [13] but the sample was previously pretreated with matrix solidphase dispersion. Capitan-Vallvey et al. [15] used 1 M ZnSO 4 and 0.23 M K 4 [Fe(CN) 6 ] for the precipitation of proteins, followed by filtration. Ho et al. [7] proposed deproteinization of milk samples with 5% w/v m-phosphoric acid and then a simple centrifugation and filtration. The aim of the present work was to develop a sensitive and simple multiresidue method for the determination of ten quinolones' residues in milk: enoxacin (ENO), ofloxacin (OFL), norfloxacin (NOR), ciprofloxacin (CIP), DAN, ENR, sarafloxacin (SAR), oxolinic acid (OXO), nalidixic acid (NAL), and FLU. Among these quinolones, only for DAN, ENR, and FLU, MRLs have been established in milk, according to the Council Directive (EEC) no. 2377/ 90. The proposed method is validated according to the performance criteria of European Decision 2002/657/EC which came into force from September 2002 [16]. This is quite important because till now only two studies, those of Van Hoof et al. [10] and Lara et al. [12] are available, where the methods proposed for the determination of quinolones in milk are validated according to the criteria of European Decision 2002/657/EC. The method was subsequently applied to various milk samples available in Greek market: full cream, low fat and skimmed pasteurized milk, full cream and reduced fat evaporated milk, full cream and low fat high pasteurized milk, and milk treated at ultrahigh temperature. 2 Experimental 2.1 Reagents and materials ENO, OFL, NOR, NAL, FLU, CIP, and internal standard caffeine, all of analytical grade were purchased from Sigma (Steinheim, Germany), ENR A98% and OXO 97% from Fluka (Steinheim), DAN 98.4% and SAR 99.3% VETRANALm from Riedel-de Haen (Buchs SG, Schweiz). HPLC grade methanol (99.8%) and gradient grade ACN (99.9%) were supplied by Carlo Erba (Milano, Italy) and analytical grade sodium hydroxide (NaOH, 1 mol/l) by Merck (Darmstadt, Germany). TFA (99%) was obtained from Aldrich (Steinheim). Ultrapure water provided by a Milli- Qm purification system (Millipore, Bedford, MA, USA) was used throughout the study. 2.2 Instrumentation A Shimadzu (Kyoto, Japan) quaternary low-pressure gradient system was used for the chromatographic determination of the examined quinolones. The solvent lines were mixed in an FCV-10AL VP mixer. An LC-10AD VP pump was used to deliver the mobile phase to the analytical column, equipped with a Shimadzu SCL-10AL VP System Controller, permitting fully automated operation, used to deliver the mobile phase to the analytical column. Sample injection was performed via a Rheodyne 7725i injection valve (Rheodyne, Cotati, CA, USA) equipped with a 20 ll loop. Detection was achieved by an SPD-M10A VP Photodiode Array Detector, in compliance with data acquisition software LabSolutions-LCsolutions by Shimadzu. Monitoring was performed at 275 nm for all analytes except OXO, NAL, and FLU, which were monitored at 255 nm. Functions of the whole system were controlled by an SCL- 10A VP controller. Degassing of the mobile phase was achieved by continuous helium sparking in the solvents reservoirs by a DGU-10B degassing unit. Glass vacuum-filtration apparatus obtained from Alltech was used for the filtration of buffer solutions through Whatman cellulose nitrate 0.2 lm-wcn Type, 47 mm DIA (Whatman Laboratory Division, Maidstone, England) membrane filters. A Glass-col (Terre Haute, IN, USA) small vortexer, a Hermle centrifuge, model Z-230 (B. Hermle, Gosheim, Germany), and an Ultrasonic bath Transonic 460/H (Elma, Germany) were employed for sample pretreatment. All evaporations were performed with a Supelco 6-port Mini-Vap concentrator/evaporator (Bellefonte, PA, USA). SPE was carried out on a 12-port vacuum manifold from Supelco. i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

341 J. Sep. Sci. 2007, 30, Liquid Chromatography 2423 Merck LiChrolut RP-18 (200 mg/3 ml) SPE cartridges were used for the isolation of the analytes from any endogenous interference stemmed from milk matrices. 2.3 Chromatographic conditions A PerfectSilm Target ODS-3 analytical column (25064 mm 2 ), 5 lm, purchased from MZ-Analysentechnik (Mainz, Germany) was used for the separation of the examined quinolones, operated at 258C. The mobile phase consisted of (i) 0.1% TFA, (ii) CH 3 CN, and (iii) CH 3 OH. A simple gradient program was used starting at 80:4:16 A/B/C by volume. After an isocratic step of 17 min, final composition after 30 min was 30:70 A/B v/v. Column effluent was monitored at 275 nm for all analytes except OXO, NAL, and FLU, which were monitored at 255 nm. The flow rate was 1.2 ml/min and the inlet pressure ranged from 230 to 240 kg/cm 2. Caffeine was used as the internal standard at a concentration of 7.5 ng/ll. Injected sample volume was 20 ll. 2.4 Preparation of standard solutions Stock solutions at a concentration of 100 ng/ll for ENO, OFL, NOR, CIP, DAN, ENR, and SAR were prepared every 2 months, while those for OXO, NAL, and FLU proved to be less stable and were prepared every 2 wk. All stock solutions were prepared in water by dissolving the appropriate amount of quinolone and by adding an aliquot of 100 ll of NaOH 0.1 mol/l per 10 ml to enhance solubility of the compounds. Stock solutions were stored at 48C. All working standards were prepared every day by appropriate dilutions of the concentrated stock standard solutions. Aqueous stock solution of CAF was prepared at the concentration of 100 ng/ll. 2.5 Sample preparation Aliquots of 1 g of milk sample were spiked with 200 llof the mixture of quinolones (containing the internal standard at the concentration of 7.5 ng/ll) or treated as blanks. For the deproteinization of milk and the extraction of analytes, 3 ml of 25% TFA in CH 3 OH were added. The mixture was vortexed and left to settle in the dark for 15 min. The solution was then sonicated for 15 min and directly centrifuged at 800 g for 15 min. The supernatant was collected in a test tube and was evaporated under a stream of N 2. The dry residue was dissolved with 2 ml of an aqueous solution of 0.1% TFA and applied to the LiChrolut RP-18 SPE cartridge, which was previously conditioned with 2 ml of CH 3 OH and 2 ml of water. Elution was performed with 1.5 ml solution of 0.1% TFA in ACN and 0.5 ml of ACN. The eluent was evaporated to dryness at 458C under a gentle stream of N 2. The dry residue was reconstituted in 200 ll of an aqueous solution of 0.1% TFA and aliquots of 20 ll were injected into the HPLC system. The protocol proved to be applicable with the same recoveries, to all types of milk, regardless of the concentration of fat. 2.6 Validation method The method described herein was validated in terms of linearity, accuracy and precision, selectivity, and sensitivity. Linearity was studied by injecting mixtures of quinolones at different concentration levels, in order to cover the whole working range. Calibration curves for every quinolone with the respective correlation coefficient were calculated by least-squares linear regression analysis of the peak area ratio of each analyte to IS of the respective results. The calculations for the LODs were based on the SD of y-intercepts of regression analysis (r) and the slope (S), using the following equation LOD = 3.3 r/s [17]. LOQs were calculated by the equation LOQ = 10 r/s. For each quinolone the calibration curve was compared using the regression analysis, in order to check the uniformity of the methods [17]. Selectivity of the method was assessed by the absence of any interference in the same chromatographic run as the examined quinolones in the respective milk matrix. Precision was assessed not only at the concentrations of 0.5, 1, and 1.5 times the permitted limit according to the European Directive for DAN, ENR, and FLU but also at the LOQ level of the method performing within-day (n = 5) and between-day (n = 5) assays. For the rest of the quinolones, the recovery was calculated at the LOQ level and at two more concentrations. Accuracy was expressed as the recovery of analytes in comparison to the added amounts. Decision limits (CC a ) and detection capability (CC b ), criteria according to European Decision 2002/657/EC were also calculated. For the measurement of CC a, 20 milk samples were spiked at the LOQ level of each method and also at the concentration of MRL for the quinolones for which permitted limits are specified. Each sample was analyzed in three replicates. The CC a was calculated by adding to the spiking concentration 1.64 times the SD. For the measurement of CC b, 20 milk samples were spiked at the CC a level of each method. Each sample was analyzed in three replicates. The CC b was calculated by adding to the spiking concentration 1.64 times the SD. 3 Results and discussion 3.1 Chromatographic conditions The mobile phase consisted of a mixture of 0.1% TFA CH 3 OH CH 3 CN delivered to the analytical column according to the gradient program described under the i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

342 2424 E. A. Christodoulou et al. J. Sep. Sci. 2007, 30, Figure 1. Chromatogram of blank milk sample spiked only with the IS (1) at the concentration of 7.5 mg/l and monitored at: (a) 275 nm and (b) 255 nm. experimental part. A satisfactory separation of ten quinolones was achieved in about 27 min as indicated by resolution factors (R s ). These were calculated according to the formula: R s =2(t 2 t 1 )/(t w1 + t w2 ), where t 1 and t 2 are the retention times and t w1 and t w2 the baseline peak widths of successive peaks, and found to be 10.1 for CAF(IS) ENO, 1.1 for ENO OFL, 1.3 for OFL NOR, 2.1 for NOR CIP, 2.1 for CIP DAN, 1.5 for DAN ENR, 5.7 for ENR SAR, 4.6 for SAR OXO, 11.9 for OXO NAL, and 3.2 for NAL FLU. Retention times of the examined analytes were l min for CAF, l min for ENO, l min for OFL, l min for i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

343 J. Sep. Sci. 2007, 30, Liquid Chromatography 2425 Figure 2. Chromatogram of milk spiked with a mixture of the ten quinolones (2, ENO; 3, OFL; 4, NOR; 5, CIP; 6, DAN; 7, ENR; 8, SAR; 9, OXO; 10, NAL; 11, FLU) at the concentration of 5 mg/l and IS, monitored at: (a) 275 nm and (b) 255 nm. Peaks: 1, IS (8.9 min); 2, ENO (13.0 min); 3, OFL (13.3 min); 4, NOR (13.6 min); 5, CIP (14.2 min); 6, DAN (14.8 min); 7, ENR (15.2 min); 8, SAR (17.5 min); 9, OXO (20.2 min); 10, NAL (25.0 min); 11, FLU (26.6 min). NOR, l min for CIP, l min for DAN, l min for ENR, l min for SAR, l min for OXO, l min for NAL, and l min for FLU. Typical chromatograms of blank milk and milk spiked at 5 mg/l monitored at 275 and 255 nm are shown in Figs. 1a and b and Figs. 2a and b, respectively. 3.2 Optimization of the sample preparation The optimization of the sample preparation procedure was mainly focused on the simultaneous deproteinization of fat milk and the extraction of analytes from the matrix. For the extraction of quinolones from milk, various concentrations of TFA were used. ACN, methanol, i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

344 2426 E. A. Christodoulou et al. J. Sep. Sci. 2007, 30, Table 1. Optimization of sample pretreatment Protocol Extraction solution Recoveries (%) ENO OFL NOR CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU 1 15% aqueous TFA % aqueous TFA % aqueous TFA % TFA in CH 3 OH % TFA in CH 3 OH, extraction performed twice 6 25% TFA in CH 3 CN % TFA in CH 3 CN, the extraction performed twice 8 25% TCA in CH 3 OH % TCA in CH 3 OH, the extraction performed twice 10 25% TCA in CH 3 CN % TCA in CH 3 CN, extraction performed twice 12 3 ml of aqueous 25% TFA, followed by 2nd extraction with 1 ml of aqueous 25% TFA 13 2 ml of CH 3 CN followed by 2nd extraction with 3 ml of aqueous 25% TFA 14 2 ml of CH 3 OH followed by 2nd extraction with 3 ml of aqueous 25% TFA and TCA in various concentrations were also investigated as extraction solvents, though yielding lower recoveries. The extraction step was followed by a further cleanup step by SPE. The SPE protocol was based on previous studies. LiChrolut RP-18 SPE cartridges were previously conditioned with methanol and water. The elution of the analytes was performed with 0.1% TFA in ACN and also pure ACN. Table 1 summarizes the different protocols with the respective recoveries, after the purification of the sample by SPE. It is obvious that protocol 4 gave higher recoveries. The introduction of a second extraction step provided lower recoveries, due to analyte loss during filtration which in this case was necessary to remove the precipitate. The trials were performed with 4 ml of the extraction solution, but during optimization the protocol 4 was also tried with 2, 3, and 5 ml. Both 3 and 4 ml extraction volume yielded similar recoveries, thus 3 ml was chosen as the extraction volume. 3.3 Validation method Linearity and sensitivity Calibration curves were constructed using spiked milk samples and were obtained by least-squares linear regression analysis of ratio of the peak area of each quinolone to the peak area of the internal standard versus the added amount of the respective quinolone. The method was linear up to 9.0 ng/ll for all analytes. Regression analysis revealed correlation coefficients between and The slopes, the intercepts, the correlation coefficients, and the linear working ranges as well as the LODs for the ten quinolones are summarized in Table Selectivity Selectivity was proved by the absence of interference in the retention times of the analytes, at both studied wavelengths (275 and 255 nm). Quite a lot of small unknown peaks appear in the chromatogram of blank milk samples, but they are well separated from the examined quinolones and the IS. To verify the selectivity of the method ten different blank milk samples were analyzed, according to the proposed method and no interferences were detected Precision and accuracy The precision of the method based on within-day repeatability was assessed by replicate (n = 5) measurements from three spiked milk samples not only at the concentrations of 0.5, 1, and 1.5 times the permitted limit according to the European Directive for DAN, ENR, and FLU but also at the LOQ level of the method. For the rest of the quinolones, the recovery was calculated at the LOQ level and at two more concentrations. Statistical evaluation revealed RSDs at different values in the range of %. To study the reproducibility of the method between five consecutive days, milk samples at the same concentration range as above were analyzed (three samples per i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

345 J. Sep. Sci. 2007, 30, Liquid Chromatography 2427 Table 2. The data of the regression analysis and the LODs of the developed method for the determination of the ten quinolones Quinolones Slope (ng 1 ) Intercept r Range (ng/ll) LOD (lg/kg) ENO l l OFL l l NOR l l CIP l l DAN l l ENR l l SAR l l OXO l l NAL l l FLU l l Table 3. Within-day (n = 5) and between-day (over a period of five consecutive days) precision and accuracy data for the determination of quinolones in milk Analytes Added (ng) Found l SD (ng) RSD Recovery (%) Found l SD (ng) RSD Recovery (%) Within-day Between-day ENO l l l l l l OFL l l l l l l NOR l l l l l l CIP l l l l l l DAN l l a) 30.7 l l l l ENR l l l l a) 99.1 l l l l SAR l l l l l l OXO l l l l l l NAL l l l l l l FLU l l l l a) 50.7 l l l l a) Maximum residue level according to Council Regulation (EEC) no. 2377/90. day, analyzed in triplicate). Excellent between-day precision was noticed with RSD values between 0.2 and 7.2%. The results of the within-day repeatability and the between-day precision of the method applied to fortified matrix samples are illustrated in Table Decision limit and detection capability In compliance with the 2002/657/EC decision, the validation procedure includes the determination of two novel criteria CC a (limit of decision) and CC b (capability of detection). The decision limits (CC a ) were calculated as i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

346 2428 E. A. Christodoulou et al. J. Sep. Sci. 2007, 30, Table 4. Calculations of error a (A) and b (B) as well as decision limits (CC a ) (A) and detection capabilities (CC b ) (B) at the LOQ levels of the method and at the MRLs for the quinolones which are specified for milk samples (lg/kg) (A) Analytes Added (lg/kg) Measured l SD (lg/kg) RSD Recovery (%) Error a (1.646SD) CC a (lg/kg) ENO l OFL l NOR l IP l DAN l a) l ENR l a) l SAR l OXO l NAL l FLU l a) l (B) Analytes Added (lg/kg) Measured l SD (lg/kg) RSD Recovery (%) Error b (1.646SD) CC b (lg/kg) ENO l OFL l NOR l CIP l DAN l a) l ENR l a) l SAR l OXO l NAL l FLU l a) l a) Maximum residue level according to Council Regulation (EEC) no. 2377/90. the mean values of the found concentrations plus 1.64 times the corresponding SDs. The detection capability (CC b ) was obtained by adding 1.64 times the corresponding SD. Table 4 summarizes the obtained CC a and CC b for milk at the LOQ level of the method for each quinolone and at the MRL for DAN, ENR, and FLU. For the measurements of CC a and CC b, 20 blank milk samples were spiked. 4 Application of the method to various milk samples Eight different types of milk samples, purchased from the local market, were analyzed following the proposed method in order to investigate the presence of the examined quinolones. Milk samples included full-cream pasteurized (3.5%), low-fat pasteurized (1.5%), skimmed pasteurized (0.0%), full-cream evaporated (7.5%), reduced-fat evaporated (1.5%), high pasteurized full cream (3.5%), high pasteurized low fat (4.0%), and ultrahigh temperature treated (4.0%). None of them presented any peak at the retention times of the examined quinolones. 5 Concluding remarks In the present work, a direct method is proposed for the simultaneous determination of ten quinolones. The method is fully validated and also fulfills the new criteria of CC a and CC b, specified by the European Union Decision 2002/657/EC for the validation of an analytical method for residues in animal products. Remarkable is the fact that LOQ values of all the studied quinolones are well below the established MRLs. The method was applied for the determination and the quantitation of the analytes in milk samples, after a deproteinization step, followed by SPE. The recoveries of the analytes' extraction ranged between 99.5 and for ENO, 98.0 and for OFL, 96 and for NOR, 97.3 and 99.0 for CIP, and for DAN, 93.3 and 99.9 for ENR, 99.0 and for SAR, 98.3 and for i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

347 J. Sep. Sci. 2007, 30, Liquid Chromatography 2429 OXO, 98.3 and for NAL, and 99.6 and for FLU. All RSDs were below 4.6%. In conclusion, the accuracy, the sensitivity, and the selectivity of the developed method, in combination with the applicability to commercial milk samples, make it a useful, fast, and reliable tool for the quinolone residue analysis in the quality control of milk according to the European Union Legislation. 6 References [1] Botsoglou, N. A., Fletouris, D. J. (Eds.), Drug Residues in Foods, Marcel Dekker, New York [2] Schenck, F. J., Caller, P. S., J. Chromatogr. A 1998, 812, [3] Council Regulation (EEC) No. 2377/90 of 26 June 1990 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. Off. J. Eur. Commun. 1990, L 224,1 8. [4] 96/23/EC: Council Directive of 29 April 1996 on measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and animal products and repealing Directives 85/358/EEC and 86/469/EEC and Decisions 89/187/EEC and 91/664/EEC. Off. J. Eur. Commun. 1996, L125, [5] Samanidou, V. F., Christodoulou, E. A., Papadoyannis, I. N., Curr. Pharm. Anal. 2005, 1, [6] Cinquina, A. L., Roberti, P., Giannetti, L., Longo, F., Draisci, R., Fagiolo, A., Brizioli, N. R., J. Chromatogr. A 2003, 987, [7] Ho, C., Sin, D. W. M., Tang, H. P. O., Chung, L. P. K., Siu, S. M. P., J. Chromatogr. A 2004, 1061, [8] Idowu, O. R., Peggins, J. O., J. Pharm. Biomed. Anal. 2004, 35, [9] Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C., J. Chromatogr. A 2004, 1034, [10] Van Hoof, N., De Wash, K., Okerman, L., Reybroeck, W., Poelmans, S., Noppe, H., De Brabander, H., Anal. Chim. Acta 2005, 529, [11] Yang, G., Lin, B., Zeng, Z., Chen, Z., Huang, X., J. AOAC Intern. 2005, 88, [12] Lara, F. J., Garcia-Campana, A. M., Ales-Barrero, F., Bosque-Sendra, J., Garcia-Ayuso, L. E., Anal. Chem. 2006, 78, [13] Choma, I., Komaniecka, I., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2005, 28, [14] Choma, I., Grenda, D., Malinowska, I., Suprynowicz, Z., J. Chromatogr. B 1999, 734, [15] Capitan-Vallvey, L. F., Al-Barbarawi, O. M. A., Fernandez-Ramos, M. D., Avidad, R., Talanta 2003, 60, [16] 2002/657/EC: Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Off. J. Eur. Commun. 2002, L221, [17] Guidance for Industry, Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology, ICH, November i 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

348 J. Sep. Sci. 2008, 31, E. A.Christodoulou et al. 119 Eleni A. Christodoulou Victoria F. Samanidou Ioannis N. Papadoyannis Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki, Greece Original Paper Development of an HPLC multi-residue method for the determination of ten quinolones in bovine liver and porcine kidney according to the European Union Decision 2002/657/EC A sensitive multi-residue analytical method was developed for the determination of ten quinolones: enoxacin, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin, oxolinic acid, nalidixic acid, and flumequine in bovine liver and porcine kidney. A simple liquid extraction step followed by a solid phase extraction clean up procedure was applied for the extraction of quinolones from liver and kidney tissues. Recoveries of the extraction varied between 82 and 88% for bovine liver and 92 and 95% for porcine kidney. Separation was performed on an ODS-3 PerfectSil Target (25064 mm) 5 lm analytical column at 258C. The mobile phase consisted of a mixture of TFA 0.1% CH 3 CN CH 3 OH, delivered at a flow rate of 1.2 ml/ min according to a gradient program. Elution of quinolones and the internal standard (caffeine, 7.5 ng/ll) was complete within 27 min. Photodiode array detection was used for monitoring the eluants at 275 and 255 nm. The method was fully validated according to the European Union Decision 2002/657/EC, determining linearity, selectivity, decision limit, detection capability, accuracy, and precision. The LODs of the specific method of quinolone determination in bovine liver varied between 3 and 7 lg/kg and in porcine kidney between 3 and 4 lg/kg. Keywords: Bovine liver / European Union Decision 2002/657/EC / Porcine kidney / Quinolones / Solid phase extraction / Received: July 3, 2007; revised: August 13, 2007; accepted: August 17, 2007 DOI /jssc Introduction Quinolones are synthetic antibiotics whose action is based on their selective inhibition of the enzyme DNA gyrase, which is necessary for the synthesis of bacterial DNA. The US Food and Drug Administration approved nalidixic acid for the treatment of urinary infections in Since then, quinolones and fluoroquinolones, the second generation of quinolones, have been widely used both in human and in veterinary medicine. They are most frequently used for the treatment of urinary, pulmonary, and digestive infections [1]. Correspondence: Dr. Victoria F. Samanidou. Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, Aristotle University of Thessaloniki, GR Thessaloniki, Greece samanidu@chem.auth.gr Fax: Abbreviations: CIP, ciprofloxacin; DAN, danofloxacin; ENO, enoxacin; ENR, enrofloxacin; FLU, flumequine; MRLs, maximum residue limits; NAL, nalidixic acid; NOR, norfloxacin; OFL, ofloxacin; OXO, oxolinic acid; SAR, sarafloxacin Due to their misuse as feed additives for mass gain promotion in veterinary medicine, an increased bacterial resistance to these antibiotics may occur as a result of their presence as residues in food producing animals. In 1990, the European Union established the Council Regulation (EEC) No 2377/90, which determines the maximum residue limits (MRLs) of certain veterinary medicinal products, such as quinolones, in foodstuffs of animal origin [2]. European Decision 2002/657/EC concerns the performance of analytical methods and the interpretation of results in the official control of residues in products of animal origin. This decision also provides rules for the analytical methods to be used in testing of official samples and specifies common criteria for the interpretation of analytical results. The limit of decision (CC a ) and the detection capability (CC b ) are novel performance criteria introduced by this decision [3]. Methods published in the literature concerning the multi-residue analysis of quinolones in food-producing animal tissues namely kidney or liver tissue mainly involve HPLC [4 17]. Most of the above mentioned meth- i 2008 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim