ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΥΑΓΓΕΛΟΠΟΥΛΟΥ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ Α.Π.Θ.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΥΑΓΓΕΛΟΠΟΥΛΟΥ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ Α.Π.Θ. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (HPLC) ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΕ ΜΥΙΚΟ ΙΣΤΟ ΙΧΘΥΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΥΑΓΓΕΛΟΠΟΥΛΟΥ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ Α.Π.Θ. «Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC) για τον προσδιορισμό υπολειμμάτων διαφόρων αντιμικροβιακών παραγόντων σε μυϊκό ιστό ιχθύων» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, του τομέα Φυσικής Αναλυτικής και Περιβαλλοντικής Χημείας, του Τμήματος Χημείας Α.Π.Θ. Ημερομηνία προφορικής εξέτασης: 27 Νοεμβρίου 2012 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής Παπαδογιάννης Ιωάννης (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Καθηγητής Νικήτας Παναγιώτης (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Αναπλ. Καθηγήτρια Σαμανίδου Βικτωρία (επιβλέπουσα Καθηγήτρια) Αναπλ. Καθηγητής Μιχαηλίδης Βασίλειος (Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Αναπλ. Καθηγητής Ζαχαριάδης Γεώργιος (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Αναπλ. Καθηγητής Θεοδωρίδης Γεώργιος (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Επικ. Καθηγήτρια Κοβάτση Λήδα (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) -1-

3 -2-

4 Η επταμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε για την κρίση της Διδακτορικής Διατριβής της κ. ΕΥΑΓΓΕΛΙΑΣ Αριστοτέλειο ΕΥΑΓΓΕΛΟΠΟΥΛΟΥ, Πανεπιστήμιο Χημικού, Θεσσαλονίκης την Τρίτη συνήλθε 27 σε συνεδρίαση Νοεμβρίου 2012, στο όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της διατριβής με τίτλο: «Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC) για τον προσδιορισμό υπολειμμάτων διαφόρων αντιμικροβιακών παραγόντων σε μυϊκό ιστό ιχθύων». Η επιτροπή έκρινε ομόφωνα ότι η διατριβή είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συμβολή στην πρόοδο της επιστήμης. ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ: Παπαδογιάννης Ιωάννης, Καθηγητής ΑΠΘ (μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Νικήτας Παναγιώτης, Καθηγητής ΑΠΘ Σαμανίδου Βικτωρία, Αναπλ. Καθηγήτρια ΑΠΘ (επιβλέπουσα Καθηγήτρια) Μιχαηλίδης Βασίλειος, Αναπλ. Καθηγητής Βιολογίας ΑΠΘ (μέλος συμβουλευτικής επιτροπής) Ζαχαριάδης Γεώργιος, Αναπλ. Καθηγητής ΑΠΘ Θεοδωρίδης Γεώργιος, Αναπλ. Καθηγητής ΑΠΘ Κοβάτση Λήδα, Επικ. Καθηγήτρια Ιατρικής σχολής ΑΠΘ -3-

5 -4-

6 Ευαγγελία Ν. Ευαγγελοπούλου Α.Π.Θ. «ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (HPLC) ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΕ ΜΥΙΚΟ ΙΣΤΟ ΙΧΘΥΩΝ» ISBN «Η έγκριση της παρούσας διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ.2) -5-

7 -6-

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 19 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ (ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ) 1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ 28 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 KΙΝΟΛΟΝΕΣ 2.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΦΑΡΜΑΚΟΔΥΝΑΜΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΟΞΟΛΙΝΙΚΟ ΟΞΥ ΦΛΟΥΜΕΚΙΝΗ ΣΙΠΡΟΦΛΟΞΑΚΙΝΗ ΕΝΡΟΦΛΟΞΑΚΙΝΗ ΣΑΡΑΦΛΟΑΞΑΚΙΝΗ ΝΤΑΝΟΦΛΟΞΑΚΙΝΗ 41 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΕΣ 3.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΧΛΩΡΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΗ Φαρμακοκινητικές ιδιότητες Τοξικότητα παρενέργειες Φαρμακοδυναμικές ιδιότητες 45-7-

9 3.3 ΘΕΙΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΗ ΦΛΟΡΦAIΝΙΚΟΛΗ 47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΕΣ 4.1 ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ ΤΗΣ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΗΣ ΔΟΜΗ ΤΩΝ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΑΝΤΙΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΙΚΕΣ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΕΣ ΑΜΠΙΚΙΛΙΝΗ ΚΑΙ ΣΥΝΑΦΕΙΣ Β-ΛΑΚΤΑΜΕΣ 58 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΕΣ 5.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΑΤΑΤΑΞΗ Φαρμακοδυναμικές ιδιότητες Φαρμακοκινητικές ιδιότητες Τοξικότητα παρενέργειες ΧΛΩΡΟΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΗ ΟΞΥΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΗ ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΗ ΔΟΞΥΚΥΚΛΙΝΗ 69 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ 6.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΥΠΟΙ ΕΚΤΡΟΦΗΣ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΘΕΣΕΩΝ ΓΙΑ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Η ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΑΙΚΗ ΕΝΩΣΗ ΕΙΔΗ ΨΑΡΙΩΝ ΠΟΥ «ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΝΤΑΙ» ΣΤΗ ΧΩΡΑ ΜΑΣ 79-8-

10 6.6 ΤΡΟΦΕΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΤΙΣ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΙΧΘΥΑΛΕΥΡΑ/ΙΧΘΥΕΛΑΙΑ ΧΡΗΣΗ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΙΣ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΧΡΗΣΗ ΟΡΜΟΝΩΝ ΣΤΑ ΨΑΡΙΑ ΤΗΣ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΕΥΡΩΠΑΙΚΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΣΗΜΑΝΣΗΣ ΨΑΡΙΩΝ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΡΥΠΑΝΣΗ ΤΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑ (SPARUS AURATA) ΣΟΛΟΜΟΣ (SALMO SALAR) 90 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΝΟΜΟΘΕΣΙΑ ΓΙΑ ΤΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΑ ΠΡΟΙΟΝΤΑ 7.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΝΟΜΟΘΕΣΙΑ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ ΓΙΑ ΤΑ ΚΑΤΑΛΟΙΠΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ Κοινά κριτήρια επίδοσης και απαιτήσεις για τις αναλυτικές μεθόδους Επικύρωση μιας αναλυτικής μεθόδου 102 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (HPLC) 8.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ HPLC ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ

11 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ 9.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΛΑΣΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Εκχύλιση στερεού-υγρού Εκχύλιση Soxhlet ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑΣ Εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού (SPE) α Εκχύλιση στερεάς φάσης αντίστροφης φάσης β Γενικοί παράγοντες που επιδρούν στην πληρότητα των διαχωρισμών με εκχύλιση στερεάς φάσης γ Διαδικασία εκχύλισης στερεάς φάσης-υγρού ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ 10.1 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ Προσδιορισμός (φθορο)κινολονών σε δείγματα ιχθύων με HPLC Προσδιορισμός (φθορο)κινολονών σε δείγματα ιχθύων με άλλες αναλυτικές τεχνικές Προσδιορισμός (φθορο)κινολονών σε δείγματα ιχθυοτροφής με HPLC ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΩΝ Προσδιορισμός αμφαινικολών σε δείγματα ιχθύων με HPLC Προσδιορισμός αμφαινικολών σε δείγματα ιχθύων με αέρια χρωματογραφία Προσδιορισμός αμφαινικολών σε δείγματα τροφής με HPLC 10.3 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ Προσδιορισμός πενικιλινών σε δείγματα ιχθύων με HPLC Προσδιορισμός πενικιλινών σε δείγματα τροφών ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΩΝ Προσδιορισμός τετρακυκλινών σε δείγματα ιχθύων με HPLC Προσδιορισμός τετρακυκλινών σε δείγματα τροφών

12 10.5 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΚΑΤΗΓΟΡΙΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΙΧΘΥΩΝ 160 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ 167 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 ΣΥΣΚΕΥΕΣ-ΟΡΓΑΝΑ-ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 12.1 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΔΙΑΛΥΤΕΣ 170 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 13 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΗPLC ΓΙΑ ΤΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΚΑΙ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΕ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ 13.1 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΕΠΙΛΟΓΗ ΜΗΚΟΥΣ ΚΥΜΑΤΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΗΛΗΣ ΚΑΙ ΕΚΛΟΥΣΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Καμπύλες αναφοράς πρότυπων διαλυμάτων Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης Σταθερότητα των πρότυπων διαλυμάτων 186 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ Εφαρμογή της μεθόδου στο κτηνιατρικό σκεύασμα Baytril Εφαρμογή της μεθόδου στο κτηνιατρικό σκεύασμα Advocin Εφαρμογή της μεθόδου στο κτηνιατρικό σκεύασμα Flumix Εφαρμογή της μεθόδου στο κτηνιατρικό σκεύασμα Inoxyl

13 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 14 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΜΕΝΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΗPLC ΣΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ ΤΩΝ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ 14.1 ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ (SPE) ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΙΣΤΟ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΜΕΝΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657 ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ Έλεγχος γραμμικότητας Χάραξη καμπυλών αναφοράς μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης και γραμμικής περιοχής Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου σε δείγματα ιστού τσιπούρας Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου στα δείγματα ιστού 209 τσιπούρας Εκλεκτικότητα της μεθόδου Σταθερότητα των εμβολιασμένων δειγμάτων ιστού τσιπούρας Όρια απόφασης (CCα) και ικανότητα ανίχνευσης (CCβ) Εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα ιστού τσιπούρας ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΗ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ Έλεγχος γραμμικότητας Χάραξη καμπυλών αναφοράς μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης και γραμμικής περιοχής Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου στα δείγματα ιστού τσιπούρας Σταθερότητα των εμβολιασμένων δειγμάτων ιστού τσιπούρας Εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα ιστού τσιπούρας

14 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 15 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC ΓΙΑ ΤΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΚΑΙ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΧΘΥΟΤΡΟΦΗ 15.1 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΙΧΘΥΟΤΡΟΦΗ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΜΕΝΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΙΧΘΥΟΤΡΟΦΗΣ ΤΩΝ ΜΕ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑ 2002/657 ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ Έλεγχος γραμμικότητας Χάραξη καμπυλών αναφοράς μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης σε εμβολιασμένα δείγματα τροφής Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης και γραμμικής περιοχής Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου σε δείγματα ιχθυοτροφής Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου στα δείγματα ιχθυοτροφής ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΖΩΝΤΑΝΕΣ ΤΣΙΠΟΥΡΕΣ Έλεγχος γραμμικότητας Χάραξη καμπυλών αναφοράς μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού Πειραματική διαδικασία ΚΕΦΑΛΑΙΟ 16 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ ΤΩΝ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΣΟΛΟΜΟΥ 16.1 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΙΣΤΟ ΣΟΛΟΜΟΥ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟ ΣΟΛΟΜΟΥ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657 ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ Έλεγχος γραμμικότητας Χάραξη καμπυλών αναφοράς μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης και γραμμικής περιοχής Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου σε δείγματα ιστού σολομού

15 Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου στα δείγματα ιστού σολομού Εκλεκτικότητα της μεθόδου Σταθερότητα των εμβολιασμένων δειγμάτων ιστού σολομού Όρια απόφασης (CCα) και ικανότητα ανίχνευσης (CCβ) Εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα ιστού σολομού 273 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΜΕΝΟ ΥΛΙΚΟ ΑΝΑΦΟΡΑΣ BCR ΚΕΦΑΛΑΙΟ 17 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC ΓΙΑ ΤΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΚΑΙ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΡΙΩΝ ΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΩΝ ΚΑΙ ΕΞΙ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΕ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ 17.1 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΕΠΙΛΟΓΗ ΜΗΚΟΥΣ ΚΥΜΑΤΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΗΛΗΣ ΚΑΙ ΕΚΛΟΥΣΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Καμπύλες αναφοράς πρότυπων διαλυμάτων Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης Σταθερότητα των πρότυπων διαλυμάτων 289 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ ΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ ΣΕ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ Εφαρμογή της μεθόδου στο κτηνιατρικό σκεύασμα Orbenin Εφαρμογή της μεθόδου στο κτηνιατρικό σκεύασμα Nuflor Εφαρμογή της μεθόδου στο κτηνιατρικό σκεύασμα Cloxalene Plus

16 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 18 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ ΤΩΝ ΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ 18.1 ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ (SPE) ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΙΣΤΟ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΡΙΩΝ ΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΩΝ ΚΑΙ ΕΞΙ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/EC Έλεγχος γραμμικότητας Χάραξη καμπυλων αναφοράς μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης και γραμμικής περιοχής Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου σε δείγματα ιστού τσιπούρας Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου στα δείγματα ιστού τσιπούρας Εκλεκτικότητα της μεθόδου Σταθερότητα των εμβολιασμένων δειγμάτων ιστού τσιπούρας Όρια απόφασης (CCα) και ικανότητα ανίχνευσης (CCβ) Εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα ιστού τσιπούρας 322 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 19 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC ΓΙΑ ΤΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΚΑΙ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΕΝΝΕΑ ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΩΝ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ 19.1 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΕΠΙΛΟΓΗ ΜΗΚΟΥΣ ΚΥΜΑΤΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΗΛΗΣ ΚΑΙ ΕΚΛΟΥΣΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ

17 19.7 ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Καμπύλες αναφοράς πρότυπων διαλυμάτων Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης Σταθερότητα των πρότυπων διαλυμάτων 336 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 20 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC ΣΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ ΤΩΝ ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ 20.1 ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ (SPE) ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΙΣΤΟ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΕΝΝΕΑ ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657/EC Έλεγχος γραμμικότητας Χάραξη καμπυλων αναφοράς μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης και γραμμικής περιοχής Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου σε δείγματα ιστού τσιπούρας Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου στα δείγματα ιστού τσιπούρας Εκλεκτικότητα της μεθόδου Σταθερότητα των εμβολιασμένων δειγμάτων ιστού τσιπούρας Όρια απόφασης (CCα) και ικανότητα ανίχνευσης (CCβ) Εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα ιστού τσιπούρας 366 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 21 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 367 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΕΡΙΛΗΨΗ

18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 23 EXTENDED SUMMARY 377 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 24 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 381 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 25 ΔΗΜΟΣΙΕΥΜΕΝΕΣ ΕΡΓΑΣΙΕΣ

19 - 18 -

20 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Έναυσμα για την ενασχόληση με το θέμα της διατριβής αυτής στάθηκε το συνεχώς αυξανόμενο πρόβλημα της αλόγιστης χρήσης διαφόρων αντιβιοτικών ενώσεων ή ορθότερα αντιμικροβιακών παραγόντων στις ιχθυοκαλλιέργειες, είτε για θεραπευτικούς, είτε για προληπτικούς λόγους, καθώς και οι υποψίες της παρουσίας αντιβιοτικών καταλοίπων στους ιστούς των ψαριών. Οι ενώσεις για τις οποίες υπάρχουν υπόνοιες ότι χρησιμοποιούνται σε ιχθυογεννητικούς σταθμούς είναι οι κινολόνες, οι πενικιλίνες, οι αμφαινικόλες, καθώς και οι τετρακυκλίνες. Η παρούσα διδακτορική διατριβή χωρίζεται σε δύο μέρη. Το πρώτο τμήμα (θεωρητικό μέρος) περιλαμβάνει τα κεφάλαια 1-10 και περιέχει πληροφορίες για τη δομή και τη δράση των αντιβιοτικών ενώσεων που χρησιμοποιήθηκαν (κινολόνες, πενικιλίνες, αμφαινικόλες και τετρακυκλίνες), για τη νομοθεσία που διέπει τη χρήση τους στις ιχθυοκαλλιέργειες, καθώς και γενικές πληροφορίες για την ιχθυοκαλλιέργεια. Επίσης στα κεφάλαια 8 και 9 δίνονται συνοπτικά οι βασικές αρχές της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης καθώς και τα διάφορα στάδια προκατεργασίας των δειγμάτων. Τέλος στο κεφάλαιο 10 δίνεται η βιβλιογραφική επισκόπηση που αφορά στις ενώσεις που χρησιμοποιήθηκαν από το 1990 μέχρι και σήμερα. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας περιγράφονται αναλυτικά όλα τα στάδια της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκαν για την εύρεση και βελτιστοποίηση κατάλληλων χρωματογραφικών μεθόδων για το διαχωρισμό και ποσοτικό προσδιορισμό των επτά κινολονών σε ιστούς τσιπούρας και σολομού, σε δείγματα ιχθυοτροφής, καθώς και σε κτηνιατρικά σκευάσματα, των έξι πενικιλινών και των τριών αμφαινικολών σε δείγματα τσιπούρας και σε κτηνιατρικά σκευάσματα και των εννέα τετρακυκλινών σε δείγματα τσιπούρας. Σε κάθε περίπτωση υποστρώματος περιγράφεται όλη η προσπάθεια εύρεσης της καταλληλότερης μεθόδου προκατεργασίας, καθώς και η διαδικασία επικύρωσής της με βάση την οδηγία 2002/657/2002 της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Όλα τα αποτελέσματα από τη στατιστική επεξεργασία των μετρήσεων και των δοκιμών δίνονται υπό μορφή σχημάτων, πινάκων και γραφικών παραστάσεων. Η διατριβή αυτή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κ. Βικτωρίας Σαμανίδου, την οποία και ευχαριστώ ιδιαίτερα για την υπόδειξη του θέματος, την επίβλεψη και συνεχή καθοδήγηση, καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή Βιολογίας κ. Μιχαηλίδη Βασίλη, μέλος της τριμελούς εισηγητικής επιτροπής, για την πολύτιμη βοήθεια

21 που μου παρείχε στο σχεδιασμό και την εκτέλεση των πειραμάτων προσδιορισμού κινολονών σε ζωντανές τσιπούρες που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο Ζωολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Ιωάννη Παπαδογιάννη για το αμείωτο ενδιαφέρον και τη συμβολή του κατά τη διάρκεια της διεξαγωγής των πειραμάτων, καθώς και όλα τα υπόλοιπα μέλη της εξεταστικής επιτροπής για τις σημαντικές υποδείξεις τους πριν την τελική έκδοση της διατριβής. Ακόμα θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους μεταπτυχιακούς φοιτητές/τριες και υποψήφιους διδάκτορες του εργαστηρίου Αναλυτικής Χημείας για το ευχάριστο κλίμα και την άψογη συνεργασία που υπήρχε κατά τη διάρκεια πραγμάτωσης αυτής της διατριβής, καθώς και την επιτροπή ερευνών του πανεπιστημίου για τη χορήγηση υποτροφίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον διδάκτορα του Τμήματος Βιολογίας, Φειδάντση Κωνσταντίνο, για τη βοήθεια που μου προσέφερε στην εκτέλεση των πειραμάτων χορήγησης αντιβιοτικών σε ζωντανές τσιπούρες, καθώς και το ιχθυοτροφείο Χορόζογλου Α.Ε. στη Βουρβουρού της Χαλκιδικής για την προσφορά των ιχθύων. Τέλος θα ήθελα να εκφράσω την βαθύτατη ευγνωμοσύνη μου τόσο στους γονείς μου, όσο και στο σύζυγό μου, για την αμέριστη υποστήριξη, συμπαράσταση και ενθάρρυνση που μου παρείχαν όλα αυτά τα χρόνια που χρειάστηκαν για την υλοποίηση αυτής της διατριβής. Θεσσαλονίκη, Νοέμβριος 2012 Ευαγγελοπούλου Ευαγγελία

22 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ (ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ) 1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο όρος «αντιβιοτικό» που έχει επικρατήσει μέχρι σήμερα, αφορά σε φυσικά παράγωγα διαφόρων μικροοργανισμών (βακτηρίων, μυκήτων), τα οποία έχουν την δυνατότητα να αναστέλουν την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών και να τους καταστρέφουν. Με την παραγωγή ημισυνθετικών παραγώγων, ο όρος «αντιβιοτικά» έχει σήμερα αντικατασταθεί από τον περιεκτικότερο όρο «αντιμικροβιακά», που περιλαμβάνει φυσικές, ημισυνθετικές ή συνθετικές ουσίες ικανές να αναστέλουν τον πολλαπλασιαμό των μικροβίων και να τα καταστρέφουν. Τα αντιβιοτικά δεν είναι δραστικά στους ιούς, διότι προϋπόθεση για τη δράση τους είναι η ικανότητα του παθογόνου μικροοργανισμού να έχει δικό του μεταβολισμό, ενώ οι ιοί αποτελούν παράσιτα σε βάρος του ανθρώπινου κυττάρου. [1] Οι πρώτες αντιβιοτικές ενώσεις που χρησιμοποιήθηκαν στη σύγχρονη ιατρική παρήχθησαν και απομονώθηκαν από ζωντανούς οργανισμούς, όπως η κατηγορία των αντιβιοτικών της πενικιλίνης που παρασκευάστηκε από τους μύκητες του γένους Penicillium ή streptomycin από τα βακτηρίδια του γένους Streptomyces. Με τη συνεχή εξέλιξη της οργανικής χημείας πολλά αντιβιοτικά λαμβάνονται με χημική σύνθεση, όπως τα σουλφοναμίδια. Πολλά αντιβιοτικά είναι σχετικά μικρά μόρια με μικρό μοριακό βάρος. Τα σημεία επίθεσης στα βακτηρίδια από τα αντιβιοτικά, αντίθετα από τις προηγούμενες θεραπείες για τις μολύνσεις που ήταν συχνά οι χημικές ενώσεις, όπως η στρυχνίνη και το αρσενικό - με την υψηλή τοξικότητα ενάντια στα θηλαστικά έχουν λιγότερες παρενέργειες και υψηλότερη αποτελεσματικότητα. Τα αντιβιοτικά δρουν αναστέλλοντας ή παρεμποδίζοντας κάποια ειδική βιοχημική αντίδραση του μικροοργανισμού. Όλα τα γνωστά αντιβιοτικά δρουν σύμφωνα με έναν από τους παρακάτω μηχανισμούς: Παρεμποδίζουν τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος των μικροοργανισμών (π.χ. η πενικιλίνη), όπως φαίνεται και στο σχήμα 1.1. Αναστέλλουν κάποια αντίδραση του μεταβολισμού των μικροοργανισμών, όπως δίνεται και στο σχήμα

23 Σχήμα 1.1: Παρεμπόδιση της σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος των μικροοργανισμών από αντιβιοτικά. Σχήμα 1.2: Αναστολή του μεταβολισμού των μικροοργανισμών από αντιβιοτικά. Παρεμβαίνουν στις λειτουργίες αντιγραφής, μεταγραφής και μετάφρασης του γενετικού υλικού των μικροοργανισμών, όπως φαίνεται και στο σχήμα 1.3. Προκαλούν διαταραχές στη λειτουργία της πλασματικής μεμβράνης. [2, 3]

24 50S 30S Έναρξη μετάφρασης Μακρολίδια Αμινογλυκοσίδες Τετρακυκλίνες Λινκοζαμίνες Στρεπρογραμίνες Οξαζολιδινόνες Χλωραμφαινικόλη Επιμήκυνση πεπτιδικής αλυσίδας Σχήμα 1.3: Αναστολή των λειτουργιών του γενετικού υλικού των μικροοργανισμών από αντιβιοτικά. Τα αντιβιοτικά μπορούν να ταξινομηθούν με βάση την εστίαση της δράσης τους σε: αντιβιοτικά «στενού φάσματος», που στοχεύουν σε ιδιαίτερους τύπους βακτηριδίων, όπως τα θετικά (gram-positive), π.χ. Str. Pneumoniae, MDR pneumococci, Staphylococcus spp., ή αρνητικά (gram-negative) κατά Gram βακτηρίδια, π.χ. Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp., Fusobacterium spp., όπως φαίνονται και στο σχήμα 1.4 και σε: αντιβιοτικά «ευρέος φάσματος» που έχουν επιπτώσεις σε ένα ευρύ φάσμα βακτηριδίων. [1, 4, 5] (α) (β) Σχήμα 1.4: α) θετικά και β) αρνητικά κατά Gram βακτηρίδια

25 Η αποτελεσματικότητα των μεμονωμένων αντιβιοτικών ποικίλλει ανάλογα με τη θέση της μόλυνσης, τη δυνατότητα του αντιβιοτικού να φτάσει στην περιοχή της μόλυνσης, και τη δυνατότητα του μικροβίου να αδρανοποιηθεί ή να καταστραφεί από το αντιβιοτικό. Μερικά αντιβακτηριδιακά αντιβιοτικά καταστρέφουν τα βακτηρίδια και ονομάζονται βακτηριοκτόνα (= πλήρης εκρίζωση βακτηριδίων σε καθορισμένο χρόνο), ενώ άλλα αποτρέπουν τα βακτηρίδια να πολλαπλασιαστούν και ονομάζονται βακτηριοστατικά (= αναστολή ανάπτυξης βακτηριδίων σε καθορισμένο χρόνο). Άλλα αντιβιοτικά λαμβάνονται απλά από το στόμα, ενώ τα ενδοφλέβια αντιβιοτικά χρησιμοποιούνται σε σοβαρότερες περιπτώσεις, όπως οι βαθιές συστηματικές μολύνσεις. Τα αντιβιοτικά μπορούν επίσης μερικές φορές να χορηγηθούν τοπικά, όπως με σταγόνες ή αλοιφές. [2, 6] Τα τελευταία έτη, τρεις νέες κατηγορίες αντιβιοτικών έχουν παρουσιαστεί στην κλινική χρήση, ύστερα από παύση 40-ετών στην ανακάλυψη νέων κατηγοριών αντιβιοτικών ενώσεων. Αυτά τα νέα αντιβιοτικά είναι των ακόλουθων τριών κατηγοριών: κυκλικά λιποπεπτίδια, όπως η δαπτομυκίνη (daptomycin), γλυκοκυκλίνες, όπως η τιγκεκυκλίνη (tigecycline), και οξαζολιδινόνες, όπως η λινεζολιδίνη (linezolid). Η τιγκεκυκλίνη είναι ένα αντιβιοτικό «ευρέος φάσματος», ενώ τα άλλα δύο χρησιμοποιούνται εναντίον των θετικών κατά Gram μολύνσεων. Αυτές οι εξελίξεις δίνουν την υπόσχεση ότι θα ξεπεραστεί η αυξανόμενη βακτηριακή αντίσταση στα υπάρχοντα αντιβιοτικά. Αν και οι ισχυρές αντιβιοτικές ενώσεις για τη θεραπεία των ανθρώπινων ασθενειών που προκαλούνται από τα βακτηρίδια, όπως η φυματίωση, η βουβωνική πανώλη, η λέπρα, δεν ήταν απομονωμένες και προσδιορισμένες μέχρι τον εικοστό αιώνα, η πρώτη γνωστή χρήση αντιβιοτικών ήταν από τους αρχαίους Κινέζους πριν από πάνω έτη. Πολλοί άλλοι αρχαίοι πολιτισμοί, συμπεριλαμβανομένων των αρχαίων Αιγυπτίων και των αρχαίων Ελλήνων, χρησιμοποιούσαν ήδη μύκητες και φυτά για να θεραπεύσουν μολύνσεις, εξ αιτίας της παραγωγής των αντιβιοτικών ουσιών από αυτούς τους οργανισμούς. Την εποχή εκείνη όμως, οι ενώσεις που ανέπτυσσαν την αντιβιοτική δράση ήταν άγνωστες. Οι αντιβιοτικές ιδιότητες του μύκητα Penicillium notatum περιγράφηκε αρχικά στη Γαλλία από τον Ernest Duchesne το Εντούτοις, η εργασία του δεν επηρέασε την επιστημονική κοινότητα μέχρι την ανακάλυψη της πενικιλίνης από τον Αλεξάντερ Φλέμινγκ. Η σύγχρονη έρευνα για την αντιβιοτική θεραπεία άρχισε στη Γερμανία με την ανάπτυξη του στενού φάσματος αντιβιοτικού Salvarsan από τον Paul Ehrlich το 1909, επιτρέποντας για πρώτη φορά μια αποδοτική θεραπεία της διαδεδομένης τότε σύφιλης. Το φάρμακο αυτό, που ήταν επίσης αποτελεσματικό και ενάντια σε άλλες μολύνσεις, δεν είναι πλέον σε εφαρμογή στη σύγχρονη ιατρική. Τα αντιβιοτικά αναπτύχθηκαν περαιτέρω στη Μεγάλη Βρετανία, μετά από

26 την πρώτη ανακάλυψη της πενικιλίνης, το 1928 από τον Φλέμινγκ. Περισσότερο από δέκα έτη αργότερα, ο Ernst Chain και ο Howard Florey έδειξαν ενδιαφέρον στην εργασία του και βρήκαν την καθαρισμένη μορφή της πενικιλίνης. Οι τρεις τους μοιράστηκαν το βραβείο Νόμπελ Ιατρικής το Ο όρος «αντιβιοτικό» χρησιμοποιήθηκε αρχικά για ουσίες που εξήχθησαν από έναν μύκητα ή άλλο μικροοργανισμό, αλλά σήμερα συμπεριλαμβάνει επίσης πολλά συνθετικά και ημισυνθετικά φάρμακα που έχουν αντιβακτηριδιακά αποτελέσματα. [2] 1.2 ΠΑΡΑΓΩΓΗ Από τις πρώτες πρωτοποριακές προσπάθειες των Florey και Chain το 1939, η σημασία των αντιβιοτικών στην ιατρική έχει οδηγήσει σε πολλές έρευνες για την ανακάλυψη και την παραγωγή τους. Η διαδικασία της παραγωγής περιλαμβάνει συνήθως τη διαλογή ενός μεγάλου φάσματος μικροοργανισμών, της δοκιμής και της τροποποίησής τους. Η παραγωγή πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας τη ζύμωση, μια διαδικασία που είναι σημαντική σε αναερόβιες συνθήκες όταν δεν υπάρχει η οξειδωτική φωσφορυλίωση, για να διατηρήσει την παραγωγή του τριφωσφορικού άλατος αδενοσίνης (ATP) με γλυκόλυση. [2] 1.3 ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ Η ικανότητα των αντιβιοτικών να θεραπεύουν λοιμώδεις ασθένειες που ήταν προηγουμένως μοιραίες δημιούργησε την εντύπωση ότι είναι «θαυματουργά φάρμακα» με δυνατότητες που υπερβαίνουν σε μεγάλο βαθμό εκείνες που μπορούν να αποδοθούν στις πραγματικές φαρμακευτικές ιδιότητές τους. Στις περισσότερες ευρωπαϊκές χώρες, τα αντιβιοτικά αποτελούν τη δεύτερη ευρύτερα χρησιμοποιούμενη κατηγορία φαρμάκων μετά από τα απλά αναλγητικά. Δυστυχώς όμως, σήμερα η ανθρωπότητα καταβάλλει ένα ιδιαίτερα υψηλό τίμημα εξαιτίας αυτής της προσέγγισης, όσον αφορά στη χρήση των αντιβιοτικών. Μία υπερβολική, και σε πολλές περιπτώσεις ακατάλληλη χρήση τους στην ανθρώπινη ιατρική και την κτηνιατρική, καθώς και στη γεωργία, οδήγησε στην ταχεία αύξηση της εξάπλωσης ανθεκτικών μικροοργανισμών στα φάρμακα. Πράγματι, ορισμένα από τα παλαιότερα αντιβιοτικά έχουν καταστεί αναποτελεσματικά ή κατά πολύ λιγότερο αξιόπιστα από ό,τι ήταν στο παρελθόν. Για παράδειγμα, η ανθεκτικότητα στην πενικιλίνη - που προτιμόταν

27 προηγουμένως ως θεραπεία για λοιμώξεις οφειλόμενες στον παθογόνο μικροοργανισμό Staphylococcus aureus - αποτελεί πλέον συνηθισμένο φαινόμενο σε πολλές χώρες. Από τις αρχές της δεκαετίας του '50, οι κτηνοτρόφοι άρχισαν να χρησιμοποιούν τα αντιβιοτικά ως εργαλείο στην εκτροφή των ζώων. Προσθέτουν αντιβιοτικά στην τροφή των ζώων για να αντιμετωπίσουν τα δυσμενή αποτελέσματα της διαβίωσης των ζώων σε συνωστισμό, τη φτωχή υγιεινή, και να αυξήσουν το σωματικό βάρος των ζώων. Μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής το 40% της συνολικής κατανάλωσης αντιβιοτικών προορίζεται για τα εκτρεφόμενα ζώα. Η ευρεία όμως χρήση αντιβιοτικών προκαλεί την ανάπτυξη της αντίστασης των παθογόνων μικροβίων σε αυτά. Τα ζώα αποικίζουν τις χλωρίδες τους με ανθεκτικά στα αντιβιοτικά μικρόβια τα οποία, κυρίως με την επαφή και πολύ λιγότερο με τη βρώση κρέατος, είναι δυνατό να μεταφερθούν στον άνθρωπο. Η κατανάλωση από τον άνθρωπο, κρέατος που περιέχει αντιβιοτικά, μειώνει την αποτελεσματικότητα των αντιβιοτικών στην αντιμετώπιση των λοιμώξεων. Οι κίνδυνοι από τη χρήση αντιβιοτικών στην κτηνοτροφία είναι οι εξής: Ανάπτυξη ανθεκτικών παθογόνων βακτηρίων που προκαλούν ζωονόσους. Ανάπτυξη αντοχής σε μη παθογόνα βακτήρια. Δημιουργία «δεξαμενής» γονιδίων αντιβιοαντοχής. Μεταφορά ανθεκτικών γονιδίων σε βακτήρια παθογόνα για τον άνθρωπο. [7, 8] 1.4 ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Η ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά προέρχεται από τη μεταβίβαση γενετικώς ανθεκτικών χαρακτηριστικών μεταξύ των βακτηρίων του ιδίου ή διαφορετικών ειδών. Γενικά, όσο περισσότερο χρησιμοποιείται ένα συγκεκριμένο αντιβιοτικό, τόσο περισσότερο υπάρχει ο κίνδυνος εμφάνισης και εξάπλωσης της ανθεκτικότητας εναντίον του, με αποτέλεσμα το φάρμακο να καταστεί όλο και πιο αναποτελεσματικό. Για να αποφευχθεί μία τέτοιου είδους ανθεκτικότητα, νέα αντιβιοτικά με παρόμοιες, αλλά όχι ταυτόσημες, χημικές ιδιότητες αναπτύχθηκαν και παρέμειναν αποτελεσματικά, μέχρι να εμφανισθεί και να εξαπλωθεί η ανθεκτικότητα και σε αυτά τα νέα φάρμακα. Η σοβαρότερη συνέπεια είναι η εμφάνιση νέων βακτηριακών στελεχών που είναι ανθεκτικά σε περισσότερα αντιβιοτικά ταυτόχρονα. Οι λοιμώξεις που οφείλονται σε τέτοιου είδους ανθεκτικά σε πολλαπλά φάρμακα παθογόνα μικρόβια αποτελούν ιδιαίτερη πρόκληση, προκαλώντας αυξανόμενες κλινικές επιπλοκές και τον κίνδυνο σοβαρής λοίμωξης που

28 προηγουμένως θα μπορούσε να θεραπευθεί επιτυχώς, μεγαλύτερης διάρκειας παραμονή στα νοσοκομεία, καθώς και σημαντικά υψηλότερες δαπάνες για την κοινωνία. Το χειρότερο σενάριο, το οποίο δυστυχώς δεν είναι απίθανο, είναι ότι αυτά τα επικίνδυνα παθογόνα μικρόβια μπορεί να αποκτήσουν ανθεκτικότητα σε όλα τα προηγούμενα αποτελεσματικά αντιβιοτικά, προκαλώντας κατ' αυτόν τον τρόπο ανεξέλεγκτες επιδημίες βακτηριακών ασθενειών που δε θα μπορούν να θεραπευθούν. Είναι επιτακτική η ανάγκη ανάπτυξης νέων φαρμάκων για να διασφαλισθεί η πρόσβαση σε αποτελεσματικές θεραπείες εναντίον επιθετικών βακτηριακών λοιμώξεων. Είναι επίσης αναπόφευκτο να περιοριστεί η χρήση ειδικότερα αυτών των νέων φαρμάκων μόνο σε σοβαρούς ιατρικούς λόγους. Επιπλέον, τα μισά περίπου από όλα τα αντιβιοτικά που καταναλώνονται χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία άρρωστων ζώων, ως παράγοντες για την ανάπτυξη της κτηνοτροφίας ή για την καταστροφή διαφόρων παθογόνων μικροβίων στα τρόφιμα. Αυτή η συνεχής - συχνά χαμηλού επιπέδου - δοσολογία έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα βακτήρια στα ζώα ή στο περιβάλλον τους και ενδέχεται να παράγει νέα ανθεκτικά στελέχη ικανά να «μεταπηδήσουν» από τα ζώα στον άνθρωπο. Η εμφάνιση της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά, τόσο στην κτηνιατρική, όσο και στην εκτροφή των ζώων παρουσιάζεται παρόμοια με εκείνη στην περίπτωση των ανθρώπων. Μεγάλες ποσότητες αντιβιοτικών δε χρησιμοποιούνται μόνο για τη θεραπεία άρρωστων ζώων, αλλά και ως τακτικά συμπληρώματα για την πρόληψη λοιμώξεων. Μία σημαντική πρόοδος, η οποία τοποθετεί την Ευρωπαϊκή Ένωση στην παγκόσμια πρωτοκαθεδρία στο πλαίσιο αυτό, είναι η πρόσφατη νομοθεσία, η οποία προβλέπει ότι τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται από τους ανθρώπους δε μπορούν να χρησιμοποιούνται ως αυξητικοί παράγοντες κατά την εκτροφή των ζώων. Τέλος, οι λοιμώδεις ασθένειες, καθώς και τα ανθεκτικά στελέχη των παθογόνων μικροβίων που τις προκαλούν δε γνωρίζουν σύνορα. Η σημερινή γνώση είναι ανεπαρκής για την πρόβλεψη ή την πρόληψη της εμφάνισης και της εξάπλωσης της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά που αναπτύσσεται σε όλα τα κράτη μέλη της Ευρωπαϊκής Ένωσης και παγκοσμίως. Η καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που βρίσκονται πίσω από αυτά τα φαινόμενα είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη μίας μακροχρόνιας στρατηγικής κατά της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. [9]

29 1.5 ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ Η αποκρυπτογράφηση του ανθρώπινου και του μικροβιακού γονιδιώματος ολοκληρώνεται σήμερα με πρωτοφανή ρυθμό. Το κλειδί για την επιτυχία στον αγώνα εναντίον της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά βρίσκεται στην εγκαθίδρυση μίας ολοκληρωμένης προσέγγισης, η οποία θα μπορεί επίσης να αξιοποιήσει τις νέες δυνατότητες που προσφέρει η έρευνα του γονιδιώματος. Η νέα στρατηγική θα ασχολείται με: Νέες κατηγορίες αντιλοιμωδών φαρμάκων. Ουσιαστικά, δεν ανακαλύφθηκαν νέες κατηγορίες αντιβιοτικών τα τελευταία χρόνια. Σήμερα, το μέσο κόστος ανάπτυξης ενός νέου φαρμάκου είναι περίπου 500 εκατομμύρια ευρώ και τα βιομηχανικά κίνητρα φαίνονται ανεπαρκή για την άμεση εξουδετέρωση αυτού του εμποδίου, έτσι ώστε να διασφαλιστεί η συνεχιζόμενη πρόσβαση σε αποτελεσματικά φάρμακα εναντίον των λοιμώξεων. Η αξιοποίηση της επιστήμης του γονιδιώματος ενδέχεται να δημιουργήσει νέες γενεές φαρμάκων κατά τρόπο ταχύτερο και λιγότερο δαπανηρό. Δοκιμές διάγνωσης. Η συνετή χορήγηση των κατάλληλων αντιβιοτικών θα επιτευχθεί καλύτερα, εάν οι ιατροί έχουν πρόσβαση σε ταχείς και φθηνές δοκιμές διάγνωσης για τον εντοπισμό των παθογόνων μικροβίων και των ιδιοτήτων ανθεκτικότητάς τους. Η σύγχρονη τεχνολογία του γενετικού υλικού (DNA) βοηθάει στην επιτάχυνση της ανάπτυξης νέων και τελειοποιημένων δοκιμών και όταν αυτά θα είναι διαθέσιμα, είναι ζωτικής σημασίας η διασφάλιση της ύπαρξης των κατάλληλων κινήτρων για τη χρήση τους. Ανάπτυξη εμβολίων. Ο έλεγχος των λοιμώξεων μέσω του εμβολιασμού αποτελεί έναν έμμεσο, αλλά ιδιαίτερα ισχυρό και αποδοτικό, όσον αφορά στο κόστος, τρόπο μείωσης της ανάγκης χρήσης αντιβιοτικών κατά κύριο λόγο. Η επιστήμη του γονιδιώματος διανοίγει ένα νέο και πολλά υποσχόμενο δρόμο για την ανάπτυξη εμβολίων

30 Παρακολούθηση. Η επιδημιολογική παρακολούθηση της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά παθογόνων μικροβίων που προσβάλλουν τους ανθρώπους και τα ζώα αποτελεί ένα ουσιαστικό στοιχείο της στρατηγικής. Η κατανάλωση αντιβιοτικών θα πρέπει να ελέγχεται και να συνδέεται με στοιχεία σχετικά με την ανθεκτικότητα, καθώς και με κλινικά αποτελέσματα. Ένα πολύπτυχο πρόβλημα. Το πρόβλημα της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά είναι πράγματι πολύπτυχο και επιφέρει ευρύ φάσμα κοινωνικοοικονομικών και πολιτικών συνεπειών. Αφορά πολλές πτυχές της κοινωνικής και υγειονομικής οικονομίας, όπως είναι η χορήγηση φαρμάκων και η εκπαίδευση των ιατρών, η επιστροφή των ιατρικών εξόδων και οι δημόσιες προσδοκίες. Επίσης, πέραν της ανθρώπινης ιατρικής, αφορά στην υγεία των ζώων, στις βιομηχανίες εκτροφής και τροφίμων, καθώς και περιβαλλοντικά θέματα. Για να είναι επιτυχής η νέα προσέγγιση, θα πρέπει να ληφθεί υπόψη αυτό το ευρύ φάσμα παραγόντων. [10]

31 - 30 -

32 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 KΙΝΟΛΟΝΕΣ 2.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι κινολόνες είναι συνθετικοί αντιμικροβιακοί παράγοντες με μικροβιοκτόνο δράση. Η πρώτη κινολόνη χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το Πρόκειται για το ναλιδιξικό οξύ (nalidixic acid), ο χημικός τύπος του οποίου δίνεται στο σχήμα 2.1, που αποτέλεσε τη βάση σύνθεσης μιας σειράς νέων αντιμικροβιακών ουσιών με παραπλήσια χημική δομή, αλλά με σημαντικά καλύτερες φαρμακοκινητικές και φαρμακοδυναμικές ιδιότητες. [11] C2H5 H3C N N COOH O Σχήμα 2.1: Συντακτικός τύπος ναλιδιξικού οξέος. Το ναλιδιξικό οξύ, χορηγήθηκε κυρίως στη θεραπεία των λοιμώξεων του κατώτερου ουροποιητικού συστήματος, η χρήση του όμως περιορίστηκε γρήγορα ως συνέπεια της μη ικανοποιητικής φαρμακοκινητικής του και της ταχείας ανάπτυξης αντοχής των παθογόνων μικροβίων. Aνάλογα με το ναλιδιξικό οξύ, είναι το οξολινικό οξύ, το πιπεμιδικό οξύ και η σινοξακίνη, ενώσεις με παρόμοιες ενδείξεις, αλλά και μειονεκτήματα σε σχέση με το ναλιδιξικό οξύ. Σήμερα οι κινολόνες ταξινομούνται με βάση το χρόνο εμφάνισης και τις φαρμακολογικές τους ιδιότητες σε δύο γενεές, την α και τη β, σύμφωνα με τον πίνακα 2.1. Oι κινολόνες της β' γενεάς (σιπροφλοξακίνη, οφλοξακίνη, πεφλοξακίνη, νορφλοξακίνη) προήλθαν από τροποποίηση του χημικού δακτυλίου του ναλιδιξικού οξέος και χαρακτηρίζονται από φθορίωση του βασικού δακτυλίου, γι' αυτό και αποκαλούνται φθοροκινολόνες. H προσθήκη του φθορίου είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της δραστικότητας έναντι των Gram θετικών, ενώ η προσθήκη ενός δακτυλίου πιπεραζίνης, έναντι των Gram αρνητικών μικροοργανισμών

33 Kοινά χαρακτηριστικά των νεωτέρων παραγώγων αποτελεί το ευρύ αντιμικροβιακό φάσμα, η πλεονεκτική φαρμακοκινητική, η έλλειψη πλασμιδιακής αντοχής και η μείωση των ανεπιθύμητων ενεργειών. O μηχανισμός δράσης τους είναι η αναστολή της υποομάδας A της γυράσης του DNA. Oι νεώτερες κινολόνες σε εξαιρετικά χαμηλές πυκνότητες αναστέλλουν Gram αρνητικούς και Gram θετικούς αεροβίους μικροοργανισμούς, ενώ η α' γενεά έχει περιορισμένη δραστικότητα που αφορά μόνο στελέχη Escherichia coli και Klebsiella sp, όπως και λίγα στελέχη Proteus sp. Oι κινολόνες της β' γενεάς είναι βακτηριοκτόνες για όλα τα εντεροβακτηριακά, τις ναϊσσέριες και τους σταφυλοκόκκους. Eντούτοις δεν είναι δραστικές έναντι των σταφυλοκόκκων που είναι ανθεκτικοί στη μεθικιλίνη, ενώ η δραστικότητά τους έναντι των στρεπτοκόκκων και των αναεροβίων εν γένει είναι μικρή ή ανύπαρκτη. Στο αντιμικροβιακό τους φάσμα περιλαμβάνονται επίσης πολλά στελέχη Acinetobacter sp όπως και Pseudomonas sp. H Rickettsia conorii και η Coxiella burnetii είναι ευαίσθητες στις νεώτερες κινολόνες. Στην οφλοξακίνη είναι επίσης ευαίσθητα πολλά στελέχη Mycobacterium tuberculosis και μερικά εκ των ατύπων μυκοβακτηριδίων, όπως και στελέχη χλαμυδίων και Mycoplasma hominis. [12]

34 Πίνακας 2.1: Ταξινόμηση των κινολονών. Κινολόνες α γενεάς C2H5 CH3 O H3C N N O N O HO OH COOH O O Ναλιδιξικό οξύ O N F O Φλουμεκίνη Οξολινικό οξύ Κινολόνες β γενεάς O O O O F F F HO OH N N N N HO N CH2CH3 N NH N N Ενροφλοξακίνη O O H3C Ντανοφλοξακίνη Σιπροφλοξακίνη

35 Πίνακας 2.1: Συνέχεια. O O O O F O F O HO F OH N OH N F N N N N N HN O H3C CH3 Νορφλοξακίνη O NH F Οφλοξακίνη Τεμαφλοξακίνη O O F HO F N COOH O F N F N N N N N HN H3C F Φεροφλοξακίνη CH3 Αμιφλοξακίνη COOH N HN Ενοξακίνη N

36 Πίνακας 2.1: Συνέχεια. O F COOH H3C CH3 NH2 N N N F N COOH N HN N OH F F Λομεφλοξακίνη N HN O O O F O Πεφλοξακίνη Σπαρφλοξακίνη O F HO F O N N F N COOH H NH2 F F NH2 N N N HO HN F F Τοσουφλοξακίνη N N O Γρεπαφλοξακίνη O Τροβαφλοξακίνη H

37 2.2 ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Οι λιπόφιλες ιδιότητες εξασφαλίζουν στις κινολόνες πολύ καλό βαθμό απορρόφησης από το γαστρεντερικό σωλήνα. Ο όγκος κατανομής (Vd) των κινολονών πρώτης γενιάς θεωρείται μέτριος, σε αντίθεση με τις κινολόνες δεύτερης γενιάς, οι οποίες χαρακτηρίζονται από μεγάλο όγκο κατανομής. Το ναλιδιξικό οξύ μεταβολίζεται σε ενεργό υδροξυναλιδιξικό οξύ και αποβάλλεται κυρίως με τα ούρα. Μέρος του ναλιδιξικού οξέος μεταβολίζεται στο ήπαρ και αποβάλλεται ως αδρανής μεταβολίτης. Ο βαθμός πρωτεϊνικής σύνδεσής του είναι πολύ υψηλός (93-97%). Οι κινολόνες τελευταίας γενιάς παρουσιάζουν μικρότερο βαθμό μεταβολισμού. [11] 2.3 ΦΑΡΜΑΚΟΔΥΝΑΜΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Οι κινολόνες δρουν ως αναστολείς της σύνθεσης του DNA. Συγκεκριμένα αναστέλλουν τη δράση του μικροβιακού ενζύμου DNA-γυράση, το οποίο είναι απαραίτητο στη διαδικασία αναδιπλασιασμού του DNA. Η δράση των κινολονών είναι μικροβιοκτόνος. Ο θάνατος των μικροβίων επέρχεται μέσα σε λεπτά, μετά την επαφή τους με την απαιτούμενη συγκέντρωση των κινολονών. Η Ελάχιστη Συγκέντρωση Ανάσχεσης (MIC) των φθοροκινολονών (σιπροφλοξακίνη, ενροφλοξακίνη, νορφλοξακίνη και οφλοξακίνη) είναι εξαιρετικά χαμηλή συγκρινόμενη με την αντίστοιχη των υπόλοιπων αντιμικροβιακών. Είναι χαρακτηριστικό ότι μετά την πτώση της συγκέντρωσης των φθοροκινολονών κάτω του MIC, παρατηρείται υπολειμματική μικροβιοκτόνος δράση έναντι μερικών μικροβίων, όπως E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, που διαρκεί 4-8 ώρες. Αντίθετα, η αύξηση της συγκέντρωσης των κινολονών (κυρίως αυτών της πρώτης γενιάς) πάνω από τα θεραπευτικά όρια (0,1-10 μg/ml) μειώνει αισθητά τη μικροβιοκτόνο δράση τους έναντι των ευαίσθητων σ αυτές μικροβίων. Η αλόγιστη χρήση των κινολονών στην κτηνιατρική προκαλεί την ανάπτυξη ανθεκτικών στελεχών. Το φαινόμενο αυτό, που οφείλεται στην τροποποίηση του ενζύμου DNA-γυράση, είναι ιδιαίτερα συχνό στην περίπτωση των κινολονών πρώτης γενιάς. Πρέπει όμως να τονιστεί, ότι παρατηρείται διασταυρούμενη αντοχή μεταξύ των κινολονών. Αυτός είναι και ο κυριότερος λόγος για τη διστακτικότητα του FDA να εγκρίνει τη χρήση των νεώτερων φθοροκινολονών στην κτηνιατρική

38 Οι σημαντικότερες κινολόνες από πλευράς κλινικής εφαρμογής στην κτηνιατρική είναι η ενροφλοξακίνη, το οξολινικό οξύ και η φλουμεκίνη. [11] 2.4 ΟΞΟΛΙΝΙΚΟ ΟΞΥ Το οξολινικό οξύ είναι το πρώτο παράγωγο του ναλιδιξικού οξέος, με το οποίο έχει συγγενική χημική δομή, όπως φαίνεται στο σχήμα 2.2. Έχει βακτηριοκτόνο δράση αναστέλλοντας το ένζυμο DNA-γυράση, που είναι απαραίτητο για τη σύνθεση των βακτηριακών πυρηνικών οξέων και για την αδιάσπαστη περιέλιξη των ελίκων του βακτηριακού DNA. Το αντιμικροβιακό φάσμα δράσης του οξολινικού οξέος διευρύνεται σε σχέση με εκείνο του ναλιδιξικού οξέος, αφού περιλαμβάνει και κάποια δράση έναντι των σταφυλόκοκκων, ενώ η δράση του έναντι των κατά Gram αρνητικών βακτηριδίων είναι 2-4 φορές μεγαλύτερη της αντίστοιχης του ναλιδιξικού οξέος. Το οξολινικό οξύ απορροφάται γρήγορα από το γαστρεντερικό σωλήνα και επιτυγχάνει σχετικά υψηλό όγκο κατανομής στους ιστούς και στα υγρά του σώματος. O O O HO N O Σχήμα 2.2: Συντακτικός τύπος οξολινικού οξέος. Χορηγείται αποκλειστικά από το στόμα κυρίως σε νεογέννητα ζώα (μόσχους, αμνοερίφια, χοιρίδια) και πτηνά για την αντιμετώπιση γαστρεντερικών λοιμώξεων που οφείλονται σε κατά Gram αρνητικά βακτηρίδια, όπως Escherichia coli, Salmonella spp. Enterobacter, Proteus, Klebsiella, Shigella, Pasteurella. Ιδιαίτερη σημασία έχει η χρήση του οξολινικού οξέος στα ψάρια θαλάσσης και γλυκού νερού, στα οποία χορηγείται στη δόση των 12 mg/kg σωματικού βάρους για την αντιμετώπιση των λοιμώξεων που οφείλονται σε Vibrio spp., Pasteurella spp. και Aeromonas spp. Τα προμίγματα οξολινικού οξέος χορηγούνται από το στόμα με την τροφή, είτε μετά από ανάμιξή τους σε ιχθυέλαιο και στη συνέχεια με την τροφή, είτε μετά διάλυση σε λίγο νερό και εμβροχή της τροφής και στη συνέχεια ελαφρά επικάλυψη της τροφής με ιχθυέλαιο ως συνδετικού. Ο

39 χρόνος αναμονής πριν την αλίευση ψαριών, στα οποία έχει χορηγηθεί οξολινικό οξύ και τη διάθεσή τους στο καταναλωτικό κοινό είναι 9 ημέρες από την τελευταία χορήγηση, εφόσον η θερμοκρασία του νερού δεν είναι χαμηλότερη από 17 C. Το οξολινικό οξύ δεν πρέπει να χορηγείται σε ωοπαραγωγά πτηνά, των οποίων τα αυγά προορίζονται για ανθρώπινη κατανάλωση. Το οξολινικό οξύ δεν πρέπει να συνδυάζεται με τις σουλφοναμίδες, τριμεθοπρίμη, τετρακυκλίνες και τη νιτροφουραντοΐνη. [11, 13, 14] 2.5 ΦΛΟΥΜΕΚΙΝΗ Η φλουμεκίνη, ο συντακτικός τύπος της οποίας δίνεται στο σχήμα 2.3, έχει το ίδιο αντιμικροβιακό φάσμα με το οξολινικό. Χορηγείται κυρίως στα πτηνά με το νερό (90 ppm) για την αντιμετώπιση των κολοβακτηριδιακών λοιμώξεων και της σαλμονέλωσης. Η αντοχή που αναπτύσσεται σχετικά εύκολα εναντίον της είναι διασταυρούμενη με τις υπόλοιπες κινολόνες. Η φλουμεκίνη δεν πρέπει να συνδυάζεται με τις τετρακυκλίνες, τις σουλφοναμίδες και τη νιτροφουραντοΐνη. [11] CH3 N OH F O O Σχήμα 2.3: Συντακτικός τύπος φλουμεκίνης. 2.6 ΣΙΠΡΟΦΛΟΞΑΚΙΝΗ Η σιπροφλοξακίνη, όπως φαίνεται και στο σχήμα 2.4, είναι μια κινολόνη δραστική in vitro έναντι μεγάλου αριθμού αρνητικών κατά Gram αερόβιων βακτηρίων, καθώς και έναντι θετικών κατά Gram οργανισμών. Η σιπροφλοξακίνη επιδεικνύει μια ταχεία βακτηριοκτόνο δράση, η οποία συνίσταται στην αναστολή της DNA-γυράσης και κατ επέκταση της σύνθεσης του DNA. Η σιπροφλοξακίνη απορροφάται ταχέως και αποτελεσματικά μετά την από του στόματος χορήγηση. Υπάρχει μια γραμμική συσχέτιση μεταξύ της δόσης και της συγκέντρωσης στο πλάσμα. [15]

40 O O F HO N N NH Σχήμα 2.4: Συντακτικός τύπος σιπροφλοξακίνης. 2.7 ΕΝΡΟΦΛΟΞΑΚΙΝΗ Η ενροφλοξακίνη είναι ευρέος φάσματος αντιμικροβιακός παράγοντας, που αναπτύχθηκε το Πρόκειται για φθοροκινολόνη δεύτερης γενιάς με συγγενική χημική δομή προς την σιπροφλοξακίνη, η οποία χρησιμοποιείται αποκλειστικά στον άνθρωπο. Η ενροφλοξακίνη, ο συντακτικός τύπος της οποίας δίνεται στο σχήμα 2.5, είναι ιδιαίτερα δραστική έναντι των κατά Gram αρνητικών μικροβίων, όπως Escherichia coli, Salmonella spp., Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus spp., Bordetella bronchiseptica, Pasteurella spp.. O O F OH N N N Σχήμα 2.5: Συντακτικός τύπος ενροφλοξακίνης. Η ελάχιστη συγκέντρωση ανάσχεσης (MIC) της, έναντι των μικροβίων αυτών, είναι η μικρότερη που παρατηρείται μεταξύ των αντιμικροβιακών. Παράλληλα η ενροφλοξακίνη είναι δραστική με εξίσου χαμηλή τιμή MIC έναντι των μυκοπλασμάτων, σταφυλόκοκκων και στρεπτόκοκκων. Είναι δραστική έναντι των σπειροχαιτών (Treponema hyodysenteriae), ενώ η

41 δράση της έναντι του Corynobacterium pyogenes και αναερόβιων κρίνεται ως μη ικανοποιητική. Η ανάπτυξη αντοχής, η οποία μάλιστα είναι διασταυρούμενη με τις υπόλοιπες κινολόνες, φαίνεται ότι είναι το μόνο μειονέκτημα στην ευρεία χρήση της ενροφλοξακίνης στην κτηνιατρική. Σ αυτό προστίθεται και ο φόβος για εξουδετέρωση της πολύτιμης αντιμικροβιακής δράσης της σιπροφλοξακίνης στον άνθρωπο. Μεταξύ των ανεπιθύμητων ενεργειών που προκαλεί η ενροφλοξακίνη στα ζώα, αναφέρονται οι αλλοιώσεις στις αρθρώσεις των αναπτυσσομένων κουταβιών και γατών. Η χρήση, επομένως, της ενροφλοξακίνης στα ζώα αυτά θα πρέπει να αποφεύγεται. Η απορρόφηση της ενροφλοξακίνης από το γαστρεντερικό σωλήνα μειώνεται αισθητά από την παρουσία ιόντων ασβεστίου, μαγνησίου και αλουμινίου. Αντενδείκνυται έτσι η ταυτόχρονη χορήγησή της με αντιόξινα. [11] 2.8 ΣΑΡΑΦΛΟΑΞΑΚΙΝΗ Η σαραφλοξακίνη είναι μία φθοροκινολόνη, η οποία δρα ως αντιβακτηριακός παράγοντας αναστέλλοντας τη δραστηριότητα της DNA γυράσης. Χρησιμοποιείται για τη θεραπεία και τον έλεγχο των βακτηριακών λοιμώξεων, κυρίως στα πουλερικά, που προκαλείται από τα βακτήρια Escherichia coli και Salmonella spp. Ο συντακτικός της τύπος δίνεται στο σχήμα 2.6. [16] O O F HO N N NH F Σχήμα 2.6: Συντακτικός τύπος σαραφλοξακίνης

42 2.9 ΝΤΑΝΟΦΛΟΞΑΚΙΝΗ Η ντανοφλοξακίνη, ο συντακτικός τύπος της οποίας δίνεται στο σχήμα 2.7, είναι μία συνθετική φθοροκινολόνη με ευρύ φάσμα αντιβακτηριακής δράσης. Χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της αναπνευστικής νόσου στα κοτόπουλα, τα βοοειδή και τους χοίρους. Η ντανοφλοξακίνη δεν προορίζεται για χρήση σε αγελάδες γαλακτοπαραγωγής που παράγουν γάλα για ανθρώπινη κατανάλωση και σε ωοπαραγωγές όρνιθες. [17] O O F OH N N N H3C Σχήμα 2.7: Συντακτικός τύπος ντανοφλοξακίνης

43 - 42 -

44 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΕΣ 3.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι αμφαινικόλες, χλωραμφαινικόλη, θειαμφαινικόλη και φλορφαινικόλη, είναι συνθετικά αντιβιοτικά με ευρύ αντιμικροβιακό φάσμα. Τα τρία αυτά φάρμακα έχουν αποδειχθεί πολύτιμα για τη θεραπεία των βακτηριακών λοιμώξεων και χορηγούνται στα ζώα πολλές φορές προληπτικά. Είναι αντιβιοτικά ευρέος φάσματος, αλλά συνήθως δεν είναι αποτελεσματικά κατά των ψευδομονάδων. Η χρήση τους στις ζωοτροφές είναι παράνομη στις περισσότερες χώρες. [11, 18] 3.2 ΧΛΩΡΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΗ Η χλωραμφαινικόλη είναι αντιμικροβιακό φάρμακο, με απλό χημικό τύπο, όπως φαίνεται και στο σχήμα 3.1, ευρύτατο αντιμικροβιακό φάσμα και θαυμάσιες φαρμακοκινητικές ιδιότητες, γεγονός που την καθιστά αναντικατάστατη, κυρίως στις περιπτώσεις, όπου επιζητείται καλή διαπερατότητα μέσω των δυσδιαπερατών βιολογικών φραγμών, όπως ο αιμοεγκεφαλικός και ο πλακούντας. H OH Cl H N Cl HO H O O2N Σχήμα 3.1: Χημικός τύπος χλωραμφαινικόλης. Η αποδεδειγμένη όμως τοξικότητα της χλωραμφαινικόλης στον άνθρωπο περιορίζει τη χρήση της και στα παραγωγικά ζώα. Το γεγονός αυτό οδήγησε στην αναζήτηση παρεμφερών ενώσεων που να διαθέτουν τα πλεονεκτήματα της χλωραμφαινικόλης (ευρύ φάσμα δράσης και

45 μεγάλο όγκο κατανομής στους ιστούς και τα υγρά του σώματος), αλλά να είναι απαλλαγμένες τοξικών παρενεργειών. Έτσι ανακαλύφθηκαν πρόσφατα παράγωγα της χλωραμφαινικόλης, όπως η θειαμφαινικόλη και η φλορφαινικόλη που είναι μεν ασφαλείς, αλλά με σχετικά μικρότερο αντιμικροβιακό φάσμα. Η χλωραμφαινικόλη έχει πικρή γεύση, γι αυτό για τη χορήγηση από το στόμα χρησιμοποιείται το ουδέτερο παλμιτικό της άλας, ενώ για ενέσιμη χορήγηση χρησιμοποιείται το υδατοδιαλυτό σουκινιλονατριούχο άλας. [11] Φαρμακοκινητικές ιδιότητες Απορρόφηση κατανομή Η χλωραμφαινικόλη ως λιπόφιλη ουσία δεν ιονίζεται εύκολα, γι' αυτό περνά με πολύ μεγάλη ευκολία τις βιολογικές μεμβράνες και κατανέμεται σε υψηλά επίπεδα σ όλους τους ιστούς και τα υγρά του σώματος. Περνά τον αιμοεγκεφαλικό φραγμό και ανιχνεύεται σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Οι συγκεντρώσεις στο αίμα του εμβρύου φτάνουν το 75% των συγκεντρώσεών της στο αίμα της μητέρας. Οι συγκεντρώσεις της στο γάλα ανέρχονται σε 50% των συγκεντρώσεων στο πλάσμα, παρόλο που στις περιπτώσεις μαστίτιδας είναι ακόμη πιο ψηλές. [11] Βιομετατροπή απέκκριση Η χλωραμφαινικόλη βιομετατρέπεται έντονα στο ήπαρ με γλυκουρονιδοποίηση. Τυχόν έλλειψη του ενζύμου γλυκουρονική τρανσφεράση, όπως συμβαίνει στις γάτες ή σε νεογέννητα ή νεαρά ζώα, στα οποία το ενζυμικό σύστημα δεν είναι πλήρως ανεπτυγμένο, οδηγεί στην αύξηση της ημιπεριόδου αποβολής και σε περιπτώσεις παρατεταμένης χορήγησης σε τοξικά φαινόμενα εξαιτίας της συσσώρευσης του φαρμάκου. Η χλωραμφαινικόλη απεκκρίνεται αδρανοποιημένη με τα ούρα. Μόνο το 5-15% απεκκρίνεται με τη χολή. Στην περίπτωση αυτή παρατηρείται εντεροηπατική κυκλοφορία, δηλαδή επαναπορρόφησή της από το έντερο στη γενική κυκλοφορία, πράγμα που παρατείνει

46 τις συγκεντρώσεις της στο αίμα. Το φαινόμενο της εντεροηπατικής κυκλοφορίας παρατηρείται κυρίως στα χορτοφάγα. Ο βαθμός βιομετατροπής της χλωραμφαινικόλης είναι άμεσα εξαρτημένος από το είδος και την ηλικία του ζώου, γεγονός που εκφράζεται από τις διαφορές στο χρόνο ημιζωής (t1/2) που ποικίλλει στα διάφορα είδη ζώων. Έτσι, ο χρόνος ημιζωής μετά από ενδομυϊκή χορήγηση 20 mg/kg χλωραμφαινικόλης ανέρχεται στα βοοειδή σε 3,5 ώρες, στα άλογα σε μία ώρα και στις όρνιθες σε 150 λεπτά. Όπως ήδη αναφέρθηκε στα νεαρά ζώα, λόγω μη δραστηριοποίησης του ενζυμικού συστήματος η χλωραμφαινικόλη βιομετατρέπεται με αργό ρυθμό, πράγμα που αντανακλάται στην ημιπερίοδο αποβολής. Στους μόσχους για παράδειγμα η περίοδος αυτή ανέρχεται σε 15 ώρες. Με αυτά τα δεδομένα και λαμβανομένου υπ όψη ότι τα θεραπευτικά επίπεδα της χλωραμφαινικόλης στο πλάσμα ανέρχονται σε 5-8 μg/ml πρέπει να δίδεται μεγάλη προσοχή στις δόσεις και τη συχνότητα χορήγησής τους που ποικίλλουν ανάλογα με το είδος και την ηλικία του ζώου. [11] Τοξικότητα παρενέργειες Παρατεταμένη χορήγηση χλωραμφαινικόλης μπορεί να προκαλέσει ανωμαλίες στο αιμοποιητικό σύστημα. Στον άνθρωπο προκαλεί καταστολή του νωτιαίου μυελού των οστών, πράγμα που οδηγεί σε απλαστική αναιμία. Οι τοξικές αυτές παρενέργειες της χλωραμφαινικόλης έχουν άμεση σχέση με τον τρόπο δράσης της που είναι η αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η δράση αυτή δεν περιορίζεται μόνο στο μικροβιακό κύτταρο, αλλά επεκτείνεται και στα κύτταρα των θηλαστικών που βρίσκονται σε φάση έντονου πολλαπλασιασμού. Γι αυτό και οι τοξικές παρενέργειες της χλωραμφαινικόλης είναι εντονότερες σε νεογέννητα και αναπτυσσόμενους οργανισμούς. [11] Φαρμακοδυναμικές ιδιότητες Φάσμα και μηχανισμός δράσης Η χλωραμφαινικόλη είναι αντιμικροβιακό με ευρύτατο φάσμα δράσης. Έχει μικροβιοστατικές και σε υψηλές συγκεντρώσεις μικροβιοκτόνες ιδιότητες, τόσο έναντι των κατά Gram θετικών, όσο και των κατά Gram αρνητικών βακτηριδίων. Επίσης έναντι των χλαμυδίων και μερικών μεγαλοϊών

47 Η χλωραμφαινικόλη αναστέλλει την πρωτεϊνική σύνθεση με τη σύνδεση της στη θέση της υπομονάδος 50S του ριβοσώματος των ευαίσθητων βακτηριδίων. Οι υψηλές συγκεντρώσεις της στο κυτταρόπλασμα την καθιστούν αντιμικροβιακό επιλογής έναντι των ενδοκυτταρικών ρικετσιών και βρουκελλών. Ειδικότερα το φάσμα δράσης της περιλαμβάνει τους εξής παθογόνους μικροοργανισμούς: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Shigella fleaneri, Pseudomonas aeruginosa, Brucella, Enterobacter aerogenes, Franciella tularensis, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella, Bacillus anthracis, Corynebacterium pyogenes, Erysipelothrix rhusiopathiae, Klebsiella pneumoniae. Έτσι η χλωραμφαινικόλη παρά τις σοβαρές τοξικές παρενέργειες (που μπορούν να αποφευχθούν, αν η θεραπεία περιορίζεται σε 5-7 ημέρες και οι δόσεις δεν ξεπερνούν τις συνιστώμενες) αποτελεί, χάρη στη θαυμάσια διεισδυτικότητα και κατανομή στους ιστούς, ένα αναντικατάστατο αντιμικροβιακό στην αντιμετώπιση, τόσο γενικευμένων, όσο και τοπικών λοιμώξεων. Ιδιαίτερα δραστική είναι η χλωραμφαινικόλη στην αντιμετώπιση των σαλμονελώσεων των διάφορων ζώων. Είναι επίσης πολύ αποτελεσματική στη θεραπεία των αναπνευστικών λοιμώξεων, της μηνιγγοεγκεφαλίτιδας, της ποδοδερμίτιδας, των δερματικών λοιμώξεων της εσωτερικής και εξωτερικής ωτίτιδας. [11] Αλληλεπιδράσεις Η χλωραμφαινικόλη δε θα πρέπει να συνδυάζεται με αντιμικροβιακά, όπως οι πενικιλίνες, κεφαλοσπορίνες και αμινογλυκοσίδες. [11] 3.3 ΘΕΙΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΗ Οι τοξικές παρενέργειες που προκαλούνται από τη χλωραμφαινικόλη και ιδιαίτερα η πλαστική αναιμία οδήγησαν στην αναζήτηση παραγώγων της που να διαθέτουν τις ίδιες φαρμακοκινητικές ιδιότητες, αλλά να είναι ταυτόχρονα απαλλαγμένες των παρενεργειών αυτών. Έτσι, με την αντικατάσταση της ομάδας ΝΟ2 με τη σουλφονομεθυλική ομάδα CH2OH στο μόριο της χλωραμφαινικόλης παρήχθηκε η θειαμφαινικόλη, όπως φαίνεται και στο σχήμα 3.2. Αυτή διαθέτει το ίδιο αντιμικροβιακό φάσμα, με τη διαφορά ότι η δράση της έναντι των κατά Gram θετικών μικροβίων, είναι ασθενέστερη

48 Η θειαμφαινικόλη δε βρήκε μεγάλη εφαρμογή στην κτηνιατρική. Χρησιμοποιείται κυρίως τοπικά για την αντιμετώπιση δερματικών λοιμώξεων. OH OH O HN O Cl Cl S H3C O Σχήμα 3.2: Συντακτικός τύπος της θειαμφαινικόλης. Σε ορισμένα ωστόσο βακτήρια έχουν ανακαλυφθεί πλασμιδιακά γονίδια, τα οποία παράγουν ένζυμα που τροποποιούν τη συγκεκριμένη αντιβιοτική ουσία και ελαττώνουν την κυτταρική διαπερατότητα. [11, 19] 3.4 ΦΛΟΡΦΑΙΝΙΚΟΛΗ Η φλορφαινικόλη είναι ένα φθοριούχο συνθετικό αντιβιοτικό ευρέως φάσματος που χρησιμοποιείται ευρύτατα στην κτηνιατρική. Η χημική της δομή είναι ανάλογη με αυτή της θειαμφαινικόλης, όπως φαίνεται και στο σχήμα 3.3. OH F O HN O Cl Cl S H3C O Σχήμα 3.3: Συντακτικός τύπος φλορφαινικόλης. Η φλορφαινικόλη είναι κυρίως βακτηριοστατικό αντιβιοτικό, με αντιμικροβιακό φάσμα παρόμοιο με εκείνο της χλωραμφαινικόλης, συμπεριλαμβανομένων πολλών Gram-αρνητικών και Gram-θετικών βακτηρίων. [18]

49 - 48 -

50 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΕΣ 4.1 ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ ΤΗΣ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΗΣ Οι πενικιλίνες ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά το 15ο αιώνα από τη μοναχή Hildegarde von Bingen, η οποία παρατήρησε ότι στους κορμούς των δέντρων υπήρχε ένα είδος μούχλας, το οποίο μπορούσε να θεραπεύσει τραύματα. [20] Αιώνες αργότερα, το 1928, ο βακτηριολόγος Alexander Fleming, κατάφερε να ανακαλύψει και να απομονώσει τυχαία την πενικιλίνη. Δουλεύοντας κάποια πειράματά του, άφησε κατά λάθος μια καλλιέργεια σταφυλόκοκκου ακάλυπτη για μερικές ημέρες. Στο τέλος των πειραμάτων και ενώ ετοιμαζόταν να πετάξει το τριβλίο με την καλλιέργεια, διαπίστωσε ότι σε ορισμένα σημεία της είχαν αναπτυχθεί μύκητες (μούχλα). Σε μικρή ακτίνα γύρω από τους μύκητες δεν υπήρχαν πια βακτήρια. Όσα βακτήρια υπήρχαν, είχαν διαλυθεί, ενώ δεν είχαν αναπτυχθεί νέα. Ο Fleming απομόνωσε το μύκητα αυτό, το μελέτησε και διαπίστωσε ότι πρόκειται για το Penicillium notatum, ένα είδος που σχετίζεται με τους συνήθεις μύκητες του ψωμιού. Έτσι λοιπόν κατέληξε στο συμπέρασμα ότι ο μύκητας απελευθερώνει κάποια ένωση, η οποία παρεμποδίζει την ανάπτυξη των βακτηρίων και την οποία ονόμασε πενικιλίνη. [21] COOH O N C6H5H2COCHN CH3 S M.T.= C16H18N2O4S CH3 Σχήμα 4.1: Συντακτικός τύπος της πενικιλίνης. Ωστόσο, ο Fleming δεν προχώρησε περισσότερο τις έρευνές του και θα περνούσε περισσότερο από μια δεκαετία, μέχρις ότου το 1939, οι Florey και Chain απομόνωσαν την πενικιλίνη και δημιούργησαν με βάση αυτή νέα αντιβιοτικά φάρμακα, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ευρύτατα κατά τη διάρκεια του 2ου Παγκοσμίου Πολέμου στην επούλωση των τραυμάτων. Γι αυτές τις εργασίες τους, οι Fleming, Florey και Chain τιμήθηκαν με το Βραβείο Νόμπελ Ιατρικής και Φυσιολογίας το [22]

51 4.2 ΔΟΜΗ ΤΩΝ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ Οι πενικιλίνες είναι αντιβιοτικά πρώτης γενιάς. Οι ενώσεις αυτές είναι πεπτιδικής φύσης με ασυνήθεις όμως δομές, κύριο χαρακτηριστικό των οποίων είναι η παρουσία ενός τετραμελούς δακτυλίου (β-λακτάμη), ο οποίος είναι συμπυκνωμένος με ένα δακτύλιο θειαζολιδίνης. Οι συντακτικοί τύποι μερικών πενικιλινών δίνονται στο σχήμα 4.2. H R H S H N O CH3 N O Ακυλομάδα CH3 COOH H Δακτύλιος β-λακτάμης Δακτύλιος Θειαζολιδίνης 6-Αμινοπενικιλανικό οξύ όπου η ομάδα R μπορεί να είναι: CH3 N CH3 Cl N CH3 O CH3 O Οξακιλίνη Αμοξυκιλίνη Cl CH3 Cl N OCH3 CH3 O Μεθικιλίνη Δικλοξακιλίνη C2H5 O O N N Πενικιλίνη G CONHCH NH2 Αμπικιλίνη NH2 Κλοξακιλίνη OCH3 CH H C HO C6H5 Πιπερακιλίνη OC2H5 Ναφκιλίνη Σχήμα 4.2: Δομή των κυριότερων πενικιλινών

52 Στο σχήμα 4.3 φαίνονται τέσσερις ακόμη από τις άλλες πενικιλίνες που υπάρχουν και είναι η μπακαμπικιλίνη, η καρμπενικιλίνη, η μεζλοκιλίνη, η πενικιλίνη V, η τιρκακιλίνη και η αζλοκιλίνη. O CH3 O COOH O O COCHOCOC2H5 N H N CH3 O NH2 C CH3 S H O CH3 H CONH H S NH N CH3 H H N O H N 1 S2CH3 2 COONa H N H S O O CH3 N O 3 O S H CH3 H COONa H C HCONH CH3 CH3 S H H COOH 4 Σχήμα 4.3: Δομή πενικιλινών: (1) μπακαμπικιλίνη, (2) μεζλοκιλίνη, (3) πενικιλίνη V και (4) τιρκακιλίνη. Οι πενικιλίνες παράγονται από μύκητες των γενών Penicillium και Aspergillus (Ascomycetes, Aspergillaceae). Ο υποκαταστάτης R στο γενικό συντακτικό τύπο των πενικιλινών διαφοροποιείται στις πενικιλίνες τις παραγόμενες από ζύμωση χωρίς προσθήκη ενώσεων πρόδρομων της πλευρικής αλυσίδας. Από αυτές τις φυσικές πενικιλίνες, μόνο η βενζυλοπενικιλίνη (R = C6H5CH2) χρησιμοποιείται στην ιατρική. Με την προσθήκη όμως κατάλληλων καρβοξυλικών οξέων, όπως π.χ. φαινυλοξικού οξέος, η παραγωγή είναι δυνατόν να κατευθυνθεί προς συγκεκριμένο επιθυμητό προϊόν. Με τον τρόπο αυτό έχουν παρασκευαστεί πάνω από 100 βιοσυνθετικές πενικιλίνες. Στο εμπόριο επίσης κυκλοφορούν ημισυνθετικές πενικιλίνες. Οι ενώσεις αυτές παράγονται από τη φυσική βενζυλοπενικιλίνη, μέσω ενζυμικής διάσπασης της πλευρικής αλυσίδας (R-CO), ακολουθούμενης από χημική ακυλίωση. [23]

53 4.3 ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ Οι πενικιλίνες βιοσυντίθενται από τα αμινοξέα L-α-αμινοαδιπικό οξύ (L-α-ΑΑΑ), Lβαλίνη και L-κυστεΐνη. Αρχικά τα αμινοξέα L-α-ΑΑΑ και L-κυστεΐνη σχηματίζουν ένα διπεπτίδιο, στο οποίο στη συνέχεια προστίθεται η L-βαλίνη. Η πεπτιδική αυτή σύνθεση δεν πραγματοποιείται στα ριβοσώματα. Μία διαδικασία κυκλοποίησης δύο σταδίων μετατρέπει το τριπεπτίδιο σε ισοπενικιλίνη Ν. Τελικά, το L-α-ΑΑΑ αντικαθίσταται από μία άλλη ακυλομάδα, μέσω αντίδρασης π.χ. με ενεργοποιημένο φαινυλοξικό οξύ, προς σχηματισμό βενζυλοπενικιλίνης. Στους ασκομύκητες, τους βασιδιομύκητες και τα ευκαρυωτικά φύκη, το αμινοξύ λυσίνη δε σχηματίζεται μέσω της οδού του διαμινοπιμελικού οξέος, αλλά μέσω διαφορετικής, η οποία περιλαμβάνει το αμινοξύ L-α-ΑΑΑ. Συνεπώς, η λυσίνη αποτελεί αναστολέα της βιοσύνθεσης της πενικιλίνης, εφόσον παρεμποδίζει την παραγωγή του L-α-ΑΑΑ. Εξάλλου, η προσθήκη μικρών ποσοτήτων L-α-ΑΑΑ διεγείρει τη βιοσύνθεση της πενικιλίνης. Η διαδικασία επηρεάζεται επίσης από τις συγκεντρώσεις των φωσφορικών και του υποστρώματος, κυρίως της γλυκόζης. Στο σχήμα 4.4 δίνεται η βιοσύνθεση της βενζυλοπενικιλίνης. [24, 25]

54 HOOC + HOOC COOH H C NH2 COOH CH2 H2 C HOOC SH H2 C CH NH2 CH C H2 NH2 CONH CH2SH L-Kυστεΐνη L-α-Αμινοαδιπικό οξύ H C NH2 HC CH3 HOOC + L-Βαλίνη CH3 CH3 HC Κυκλοποίηση σε δύο στάδια NH CO H2 C HOOC CH H2 C C H2 CH COOH CH CONH CH2SH NH2 H HOOC H2 C H C H2 C H2 C CO H S H N NH2 N Ισοπενικιλίνη Ν O CH3 CH3 H COOH CoA + Βενζυλοπενικιλίνη O Τρανσακετυλάση της πενικιλίνης H H S H N _ α-ααα + CoA-SH O N O Σχήμα 4.4: Η βιοσύνθεση της βενζυλοπενικιλίνης CH3 CH3 CH3 H COOH

55 Οι πενικιλίνες χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία των μολύνσεων. Η βενζυλοπενικιλίνη είναι δραστική έναντι των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων και των γονόκοκκων. Οι πενικιλίνες με διαφορετικές πλευρικές ομάδες εμφανίζουν διαφορετικές ιδιότητες, όπως η σταθερότητα έναντι των οξέων και της πενικιλινάσης (ένζυμο το οποίο υπάρχει σε ορισμένα βακτήρια, καταστρέφει την πενικιλίνη και χρησιμοποιείται για τη θεραπεία αλλεργικών αντιδράσεων που οφείλονται στην πενικιλίνη). Η αλλαγή της πλευρικής αλυσίδας επηρεάζει επίσης και το αντιβακτηριακό φάσμα των πενικιλινών. [24, 25] 4.4 ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Οι πενικιλίνες είναι μια ομάδα αντιβιοτικών, φαρμάκων δηλαδή που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία κατά των μολύνσεων που προκαλούνται από διάφορους μικροοργανισμούς. Υπάρχουν διάφορες μορφές πενικιλινών η κάθε μία από τις οποίες χρησιμοποιείται για την καταπολέμηση διαφορετικών μορφών ασθενειών, όπως μολύνσεις του δέρματος, των δοντιών, των αυτιών, του αναπνευστικού και του ουροποιητικού συστήματος, αλλά και στη θεραπεία κατά της γονόρροιας και άλλων βακτηριακών μολύνσεων. Εντούτοις, οι πενικιλίνες είναι αναποτελεσματικές στη θεραπεία κατά της γρίπης, του κοινού κρυολογήματος και άλλων ιογενών ασθενειών. [26, 27] Ο ρόλος των πενικιλινών είναι να καταστρέφουν ή να παρεμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό των βακτηρίων που μολύνουν διάφορα μέρη του ανθρώπινου σώματος. Όλα τα βακτηριακά κύτταρα περικλείονται από το κυτταρικό τους τοίχωμα, το οποίο και τα προστατεύει. Οι πενικιλίνες εμποδίζουν τη δημιουργία αυτού του τοιχώματος, δρώντας ενάντια στα θετικά και αρνητικά κατά Gram βακτήρια, προκαλώντας κατά αυτό τον τρόπο το θάνατο του βακτηρίου. Υπάρχουν τέσσερις ομάδες παραγώγων της πενικιλίνης: i) Οι πενικιλίνες της ομάδας G (του τύπου της βενζυλοπενικιλίνης). Οι ενώσεις αυτές δρουν σε Gram-θετικούς μικροοργανισμούς και μόνο σε πολύ υψηλές δόσεις κατά των Gramαρνητικών μικροοργανισμών. Καταστρέφονται από την πενικιλινάση και δε δρουν όταν λαμβάνονται από το στόμα. Με διάφορες αμίνες, η πενικιλίνη G δίνει διάφορες μορφές παρατεταμένης δράσης, όπως η προκαϊνούχος πενικιλίνη. Η ανάμιξη ενός άλατος της πενικιλίνης με μία πενικιλίνη παρατεταμένης δράσης αποτελεί μία «διπενικιλίνη». Στο σχήμα 4.5 δίνεται ο συντακτικός τύπος της πενικιλίνης G

56 S H C N H OH N O O O Σχήμα 4.5: Συντακτικός τύπος της πενικιλίνης G. ii) Οι πενικιλίνες της ομάδας V (του τύπου της φαινοξυμεθυλοπενικιλίνης). Οι ενώσεις αυτές μπορούν να χρησιμοποιηθούν από το στόμα και δρουν σε Gram-θετικούς και σε μικρό βαθμό σε Gram-αρνητικούς μικροοργανισμούς. Είναι ευαίσθητες στη δράση της πενικιλινάσης. Στο σχήμα 4.6 δίνεται ο συντακτικός τύπος της πενικλίνης V. S H C O N H OH N O O O Σχήμα 4.6: Συντακτικός τύπος της πενικιλίνης V. iii) Οι πενικιλίνες της ομάδας Μ (του τύπου της μεθικιλίνης). Είναι ενώσεις ανθεκτικές στην πενικιλινάση και δε δρουν λαμβανόμενες από το στόμα. iv) Οι πενικιλίνες της ομάδας Α (του τύπου της αμπικιλίνης). Δρουν κατά των Gramθετικών και Gram-αρνητικών μικροοργανισμών υπό μορφή ενέσεων ή από το στόμα και είναι ευαίσθητες στην πενικιλινάση. Οι πενικιλίνες σε μικρές συγκεντρώσεις είναι μικροβιοστατικές, αλλά σε υψηλές συγκεντρώσεις στο αίμα γίνονται μικροβιοκτόνες σε ποικίλο βαθμό, ανάλογα με τη χρησιμοποιούμενη ένωση και το μικροοργανισμό που υπάρχει. Η μικροβιοκτόνος δράση τους οφείλεται στην αναστολή των ενζυμικών συστημάτων που παρεμβαίνουν στη σύνθεση των βλενοπεπτιδίων, τα οποία αποτελούν το κυτταρικό τοίχωμα των μικροβίων

57 Όλες οι πενικιλίνες είναι σταθερές σε ορισμένη θερμοκρασία και η διάρκεια ισχύος τους μπορεί να φτάσει μέχρι και τα πέντε χρόνια (π.χ. για την πενικιλίνη G). Υπάρχει ένα αντιπενικιλινικό αντίσωμα, τύπου IgM ή IgG, το οποίο παράγεται από τη θεραπεία με πενικιλίνη. Πάντως, μόνο τα αντισώματα του τύπου IgG φαίνονται ικανά να προκαλέσουν ανοσοαλλεργική αιμολυτική αναιμία, όταν χρησιμοποιούνται υψηλές δόσεις πενικιλίνης ενδοφλέβια. Οι πενικιλίνες μερικές φορές συνδυάζονται με άλλα φάρμακα, τα οποία ονομάζονται αναστολείς των β-λακταμασών και έχουν την ικανότητα να προστατεύουν τις πενικιλίνες από την προσβολή κάποιων βακτηριακών ενζύμων, που μπορεί να επιδράσουν στις πενικιλίνες και να τις απενεργοποιήσουν πριν να αρχίσει η δράση τους. Ένα παράδειγμα ενός τέτοιου συνδυασμού είναι το φάρμακο Augmentin, όπου η αμοξυκιλίνη (πενικιλίνη) συνυπάρχει μαζί με το κλαβουλανικό οξύ (αναστολέας). Oι μέχρι σήμερα γνωστοί αναστολείς των πενικιλινών είναι τρεις, το κλαβουλανικό οξύ, η σουλμπακτάμη και η ταζομπακτάμη. Έχουν πολύ μικρή αντιμικροβιακή δράση, αλλά τους διακρίνει η ικανότητα να αναστέλουν τις β-λακταμάσες, τις οποίες δεσμεύουν σταθερά, γι αυτό και αποκαλούνται μη αναστρέψιμοι αναστολείς. Oι ουσίες αυτές συνδυαζόμενες με την αμοξυκιλίνη και την τικαρκιλίνη όσον αφορά στο κλαβουλανικό οξύ- ή με την αμπικιλίνη όσον αφορά στη σουλμπακτάμη, ή με την ταζομπακτάμη-όσον αφορά στην πιπερακιλίνη, δρουν αναστέλλοντας τη δράση των σταφυλοκοκκικών και πολλών πλασμιδιακών λακταμασών, καθιστώντας έτσι ευαίσθητα τα μικρόβια που προηγουμένως ήταν ανθεκτικά στα υπό χορήγηση φάρμακα. Η προσθήκη και άλλων παρόμοιων συστατικών, δίνει τη δυνατότητα στο αντιβιοτικό να είναι ακόμα πιο αποτελεσματικό έναντι των βακτηρίων, τα οποία μπορεί να έχουν αναπτύξει ένα είδος ανθεκτικότητας σε κάποια αντιβιοτικά. [28, 29] 4.5 ΑΝΤΙΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΙΚΕΣ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΕΣ Oι περισσότεροι σταφυλόκοκκοι έχουν γίνει ανθεκτικοί στη βενζυλοπενικιλίνη επειδή παράγουν πενικιλινάσες που τη διασπούν. Mερικές από τις πενικιλίνες όμως δε διασπώνται από τις σταφυλοκοκκικές πενικιλινάσες. Στην ομάδα αυτή ανήκουν η μεθικιλίνη και οι ισοξαζολικές πενικιλίνες (οξακιλίνη, κλοξακιλίνη, δικλοξακιλίνη, φλουκλοξακιλίνη). H μοναδική τους κλινική ένδειξη είναι η θεραπεία κατά των λοιμώξεων από ανθεκτικούς στη

58 βενζυλοπενικιλίνη σταφυλόκοκκους και η χειρουργική πρόληψη (καρδιοχειρουργική, ορθοπεδική) σε χώρες, όπου η ανθεκτικότητα στη μεθικιλίνη δεν είναι συχνή. Oι ισοξαζολικές πενικιλίνες εμφανίζουν μέτρια απορρόφηση χορηγούμενες από το στόμα (30-60%). H απορρόφηση επηρεάζεται από την ταυτόχρονη λήψη τροφής, γι' αυτό και πρέπει να χορηγούνται σε κενό στομάχι (1 ώρα προ του γεύματος ή 2 ώρες μετά). Δεσμεύονται στις πρωτεΐνες του ορού σε υψηλά ποσοστά (90-95%). Δεν υπάρχουν μεγάλες διαφορές μεταξύ των διαφόρων φαρμάκων της ομάδας όσον αφορά στη φαρμακοκινητική και στη δραστικότητα. H απορρόφηση της φλουκλοξακιλίνης και της δικλοξακιλίνης είναι ελαφρώς μεγαλύτερη των υπολοίπων. H δικλοξακιλίνη είναι περισσότερο δραστική έναντι των σταφυλόκοκκων. Στα σχήματα 4.7, 4.8 και 4.9 δίνονται οι συντακτικοί τύποι της δικλοξακιλίνης, της κλοξακιλίνης και της οξακιλίνης. CH3 O Cl S H N OH CONH N O O Cl Σχήμα 4.7: Συντακτικός τύπος της δικλοξακιλίνης. Η δικλοξακιλίνη δεν πρέπει να χορηγείται συγχρόνως με β-λακτάμες και αμινογλυκοσίδες. Eπίσης δεν πρέπει να χορηγείται σε νεογνά. O Cl CH3 S H N OH CONH N O O Σχήμα 4.8: Συντακτικός τύπος της κλοξακιλίνης. Η κλοξακιλίνη χρησιμοποιείται για τη θεραπεία λοιμώξεων σταφυλόκοκκου, ανθεκτικά στην πενικιλίνη και ευαίσθητα στη μεθικιλίνη από στελέχη

59 O CH3 N S H OH CONH N O O Σχήμα 4.9: Συντακτικός τύπος της οξακιλίνης. Το μικρόβιο του σταφυλόκοκκου το οποίο υπάρχει και φυσιολογικά στη μικροβιακή χλωρίδα του ανθρώπου, μερικές φορές διεισδύει στους ιστούς και προκαλεί αποστήματα. Παρουσιάζονται συχνά πνευμονίες από σταφυλόκοκκο μετά από επιδημίες γρίπης. Επίσης είναι αρκετά συχνή στους νοσοκομειακούς αρρώστους, σε διασωληνωμένους ασθενείς και σε ασθενείς με κυστική ίνωση. Για τη θεραπεία όλων αυτών των λοιμωδών ασθενειών γίνεται ενδοφλέβια χορήγηση οξακιλίνης. [29] 4.6 ΑΜΠΙΚΙΛΙΝΗ ΚΑΙ ΣΥΝΑΦΕΙΣ Β-ΛΑΚΤΑΜΕΣ Στην ομάδα αυτή περιλαμβάνονται η αμπικιλίνη, η αμοξυκιλίνη, η επικιλίνη και οι εστέρες της αμπικιλίνης, μπακαμπικιλίνη, πιβαμπικιλίνη, ταλαμπικιλίνη και η ετακιλίνη. H δράση τους έναντι των βακτηρίων είναι παραπλήσια και εκείνο που τις διαφοροποιεί είναι η διαφορετική φαρμακοκινητική τους. Η απορρόφησή τους επηρεάζεται από τη λήψη τροφής, εκτός της αμοξυκιλίνης, που ελάχιστα επηρεάζεται. Στο φάσμα τους περιλαμβάνονται: Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella sp., Shigella sp., Campylobacter sp., Enterococcus sp., Listeria monocytogenes. Aνθεκτικά εξ ορισμού είναι τα στελέχη Klebsiella sp., Enterobacter sp., Yersinia enterocolitica, Serratia marcescens, Bacteroides fragilis, Proteus vulgaris και rettgeri. Aνθεκτικοί ακόμη είναι και οι γονόκοκκοι, οι ανθεκτικοί στην πενικιλίνη και οι σταφυλόκοκκοι που παράγουν πενικιλινάση. Η αμπικιλίνη είναι η πρώτη ημισυνθετική πενικιλίνη. Από φαρμακευτική άποψη υπερέχει σε σχέση με την πενικιλίνη, γιατί έχει ευρύτερο φάσμα δράσης και δεν επηρεάζεται από τις γαστρικές εκκρίσεις. Όμως οι σταφυλόκοκκοι παρουσιάζουν ανθεκτικότητα απέναντί της, καθώς το ένζυμο πενικιλινάση που παράγουν την καταστρέφει

60 Χρησιμοποιείται ως αντιβιοτικό για την καταπολέμηση λοιμώξεων που οφείλονται σε ευαίσθητα σε αυτή βακτηρίδια, όπως για παράδειγμα κατά των ουρολοιμώξεων, όταν οφείλονται σε ευαίσθητα μικρόβια, της γονοκοκκικής ουρηθρίτιδας, για λοιμώξεις από εντερόκοκκο, από Haemophilus influenzae τύπου b (ευαίσθητα στελέχη), από Salmonella sp. και Shigella sp., από παρόξυνση χρόνιας βρογχίτιδας (από μη ελυτροφόρα στελέχη αιμοφίλων και πνευμονιοκόκκου) και στην πρόληψη της ενδοκαρδίτιδας. Η αμπικιλίνη παρουσιάζει καλή απορρόφηση στο γαστρεντερικό σύστημα και οι πρωτεΐνες του ορού του αίματος δεσμεύουν περίπου το 20% της ουσίας. Στο σχήμα 4.10 δίνεται ο συντακτικός τύπος της αμπικιλίνης. [29] S H H2N C N H OH N O O O Σχήμα 4.10: Συντακτικός τύπος της αμπικιλίνης

61 - 60 -

62 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΕΣ 5.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Oι τετρακυκλίνες είναι αντιμικροβιακά φάρμακα ευρέος φάσματος εναντίον των κατά Gram θετικών και αρνητικών μικροοργανισμών. Δρουν αναστέλλοντας την πρωτεϊνική σύνθεση των μικροβίων. Πρόκειται για χρήσιμα σκευάσματα, παρόλο που η χρήση τους σήμερα, λόγω ανάπτυξης ανθεκτικών στελεχών των μικροοργανισμών, είναι σχετικώς περιορισμένη. Σε ορισμένες λοιμώξεις αποτελούν φάρμακα εκλογής. Όλες οι τετρακυκλίνες έχουν κατά κανόνα κοινό αντιμικροβιακό φάσμα. [30] 5.2 ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ - ΚΑΤΑΤΑΞΗ Ο βασικός χημικός πυρήνας των τετρακυκλινών είναι παράγωγο του ναφθαλενίου και αποτελείται από 4 δακτυλίους γι αυτό ονομάστηκαν τετρακυκλίνες. Στο σχήμα 5.1 δίνεται ο βασικός σκελετός των τετρακυκλινών, ενώ στον πίνακα 5.1 οι επιμέρους δομές κάποιων από αυτές. R1 R2 R3 R4 R5 R6 OH NH2 C OH OH O OH O O Σχήμα 5.1: Γενικός χημικός τύπος τετρακυκλινών

63 Πίνακας 5.1: Επιμέρους δομές τετρακυκλινών. ΟΝΟΜΑΣΙΑ R1 R2 R3 R4 τετρακυκλίνη H OH CH3 H 4-επι-τετρακυκλίνη H OH CH3 οξυτετρακυκλίνη H OH CH3 H OH N(CH3)2 H N(CH3)2 H N(CH3)2 H 4-επι- οξυτετρακυκλίνη H OH CH3 OH N(CH3)2 χλωροτετρακυκλίνη Cl OH CH3 H 4-επι- χλωροτετρακυκλίνη Cl OH CH3 μετακυκλίνη H H OH H N(CH3)2 ντεμεκλοκυκλίνη Cl OH H N(CH3)2 δοξυκυκλίνη μινοκυκλίνη = CH2 R5 R6 H N(CH3)2 H H N(CH3)2 H OH H N(CH3)2 H H CH3 H N(CH3)2 H H H H N(CH3)2 Η ονομασία τετρακυκλίνη ανήκει στην ξεχωριστή ημισυνθετική ουσία τετρακυκλίνη (tetracycline), που έδωσε και το όνομα σ ολόκληρη την ομάδα. Οι πρώτες φυσικές τετρακυκλίνες ήταν η οξυτετρακυκλίνη (oxytetracycline) και η χλωροτετρακυκλίνη (chlortetracycline). Η οξυτετρακυκλίνη απομονώθηκε από το στρεπτομύκητα εδάφους Streptomyces rimosus, γι αυτό πήρε και την εμπορική ονομασία Terramycin (Terra = έδαφος), ενώ η χλωροτετρακυκλίνη απομονώθηκε από το στρεπτομύκητα Streptomyces aurofaciens, γι αυτό πήρε την εμπορική ονομασία Aureomycin (Χρυσομυκίνη, Aureo = χρυσός). Όλες οι τετρακυκλίνες είναι αμφοτερικές ουσίες. Σχηματίζουν εύκολα άλατα τόσο με οξέα, όσο και με βάσεις. Το συνηθέστερο άλας είναι το υδροχλωρικό. Είναι ασταθείς σε υδατικά διαλύματα ιδιαίτερα σε υψηλές τιμές ph (7,0-8,5). Γενικά διαλύονται δύσκολα στο νερό με εξαίρεση τη ρολιτετρακυκλίνη. Για την αύξηση της σταθερότητας των ενέσιμων διαλυμάτων της οξυτετρακυκλίνης χρησιμοποιείται διαλύτης προπυλενικής γλυκόλης και πολυβινυλοπυρρολιδόνης σε ελαιώδη διαλύματα. Aπ όλες τις τετρακυκλίνες η δοξυκυκλίνη και μινοκυκλίνη παρουσιάζουν τη μεγαλύτερη διεισδυτικότητα, γιατί είναι οι περισσότερο λιποδιαλυτές. Αυτό εξηγεί και την καλύτερη δράση τους έναντι του Staphylococcus aureus. Τέλος, οι τετρακυκλίνες σχηματίζουν σταθερά δυσδιάλυτα σύμπλοκα (χηλικές ενώσεις) με τα μεταλλικά ιόντα ασβέστιο, μαγνήσιο, σίδηρο, γεγονός το οποίο μειώνει αισθητά την

64 απορρόφησή τους από τον εντερικό σωλήνα, σε περίπτωση ταυτόχρονης χορήγησής τους με αντιόξινα ή με την τροφή, στην οποία περιέχεται αυξημένη ποσότητα των ιόντων αυτών. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των τετρακυκλινών επιτρέπουν την παρασκευή πολλών φαρμακευτικών μορφών, όπως ενέσιμων διαλυμάτων, κάψουλων, βώλων, υδατοδιαλυτής σκόνης, προμιγμάτων ζωοτροφών, αλοιφών, αερολυμάτων. [31, 11] Φαρμακοδυναμικές ιδιότητες Αντιμικροβιακό φάσμα Οι τετρακυκλίνες είναι βακτηριοστατικά αντιμικροβιακά ευρέος φάσματος. Το αντιμικροβιακό τους φάσμα περιλαμβάνει κατά Gram θετικά και αρνητικά βακτηρίδια. Είναι δραστικές έναντι μερικών παθογόνων μικροοργανισμών, που είναι ανθεκτικοί σε άλλα αντιμικροβιακά, όπως οι ρικέτσιες και μερικοί μεγαλοϊοί (όπως π.χ. ψιτακοϊοί), καθώς επίσης έναντι των μυκοπλασμάτων, των σπειροχαιτών (Treponema, Leptospira) και των ακτινομυκήτων. Επίσης, σε υψηλές δόσεις είναι δραστικές έναντι μερικών παθογόνων πρωτοζωικών οργανισμών, όπως το Anaplasma marginale που προκαλεί την αναπλάσμωση. Μεγάλος αριθμός μικροβιακών στελεχών αναπτύσσει εύκολα ανθεκτικά στελέχη έναντι των τετρακυκλινών. Τα σημαντικότερα απ αυτά είναι: Escherichia coli, Proteus, Pseudomonas aeruginosa, Aerobacter aerogenes, Salmonella choleraesuis, S.typhimurium, S.pullorum, S.gallinarum Chlamydia psytacci, Staphylococcus aureus, Pasteurella multocida, Klebsiella pneumoniae και β-αιμολυτικοί στρεπτόκοκκοι. Η αντοχή αυτή αναπτύσσεται με μηχανισμούς που παρεμποδίζουν την είσοδο των τετρακυκλινών στο κυτταρόπλασμα ή με ένζυμα που η σύνθεσή τους κωδικοποιείται στους πλασμιδιακούς γόνους των μικροβίων. [31, 11] Μηχανισμός δράσης Οι τετρακυκλίνες συνδέονται με τα ριβοσώματα και αναστέλλουν τη σύνθεση πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα συνδέονται με τους υποδοχείς της 30S υποομάδας των ριβοσωμάτων του μικροβιακού κυττάρου, με αποτέλεσμα να ανακόπτεται η σύνθεση του αμινοακετυλο-trna με την ενεργό πλευρά του συμπλέγματος mrna. Διακόπτεται έτσι η προσθήκη νέων αμινοξέων

65 στην υπό σύνθεση πεπτιδική αλυσίδα. Αξίζει να σημειωθεί ότι η σύνδεση των τετρακυκλινών με τους 30S υποδοχείς είναι αναστρέψιμη. [31, 11] Φαρμακοκινητικές ιδιότητες Απορρόφηση Στα μονογαστρικά μετά από χορήγηση θεραπευτικών δόσεων από το στόμα, οι τετρακυκλίνες απορροφώνται σχετικά γρήγορα από το λεπτό έντερο. Η ανώτατη συγκέντρωση στο πλάσμα παρατηρείται σε 2-4 ώρες μετά τη χορήγηση και διατηρείται στο επίπεδο αυτό περίπου 6 ώρες, οπότε μειώνεται σταδιακά μέχρι που εξαφανίζεται μετά από 24 ώρες. Στα μηρυκαστικά, στα οποία λειτουργεί η μεγάλη κοιλία, δε συνιστάται η χορήγηση τετρακυκλινών από το στόμα, γιατί εκτός του ότι δεν απορροφώνται σε ικανοποιητικό βαθμό αναστέλλουν και την ανάπτυξη της μικροβιακής χλωρίδας της μεγάλης κοιλίας. Η παρεντερική χορήγηση γίνεται κυρίως ενδομυϊκά. Δε συνιστάται η ενδοφλέβια χρήση για ενέσιμα ιδιοσκευάσματα που περιέχουν τοπικό αναισθητικό. Το τελευταίο χρησιμοποιείται για να εξουδετερωθούν οι τοπικές ερεθιστικές ιδιότητες των τετρακυκλινών. Δε συνιστάται επίσης η χορήγηση στο ίδιο σημείο ποσότητας τετρακυκλινών που να ξεπερνά τα 10 ml. Μετά από ενδομυϊκή χορήγηση οξυτετρακυκλίνης παρατηρούνται θεραπευτικά επίπεδα στο αίμα σε 15 λεπτά. Οι ανώτατες συγκεντρώσεις παρατηρούνται σε μία ώρα, διατηρούνται σε υψηλά επίπεδα για 12 ώρες και ακολούθως μειώνονται σταδιακά, για να φτάσουν στο ελάχιστο μετά από 24 ώρες. Η εξασφάλιση παρατεταμένων επιπέδων οξυτετρακυκλίνης στον οργανισμό επιτυγχάνεται με τη χρήση ειδικών ιδιοσκευασμάτων παρατεταμένης δράσης, τα οποία συνήθως περιέχουν ως φορέα πολυβινυλοπυρρολιδόνη. Ο φορέας αυτός συμβάλλει στην αργή απορρόφηση από το σημείο έγχυσης, με αποτέλεσμα να επιτυγχάνονται χαμηλότερες συγκεντρώσεις στο πλάσμα, οι οποίες όμως διατηρούνται σε θεραπευτικά επίπεδα για ώρες. [31, 11] Κατανομή Οι τετρακυκλίνες χάρη στον υψηλό συντελεστή ελαιοϋδατομερισμού περνούν εύκολα τις βιολογικές μεμβράνες και διαχέονται σ όλους τους ιστούς. Ιδιαίτερα υψηλές συγκεντρώσεις

66 παρατηρούνται στους νεφρούς, ήπαρ, σπλήνα, πνεύμονες και οστά. Περνούν εύκολα τον πλακούντα και συγκεντρώνονται στα δόντια του εμβρύου προκαλώντας αποχρωματισμό τους. Γενικά οι συγκεντρώσεις οξυτετρακυκλίνης στο αίμα του εμβρύου φτάνει το ήμισυ της συγκέντρωσης από εκείνο στο αίμα της μητέρας. Με εξαίρεση τις πλέον λιποδιαλυτές, δοξυκυκλίνη και μινοκυκλίνη, οι υπόλοιπες τετρακυκλίνες με δυσκολία περνούν τον αιμοεγκεφαλικό φραγμό. Τέλος, παρατηρούνται σημαντικές διαφορές στο βαθμό πρωτεϊνικής σύνδεσης, μεταξύ των διάφορων τετρακυκλινών. Για παράδειγμα η οξυτετρακυκλίνη συνδέεται με την αλβουμίνη του πλάσματος κατά 30%, η τετρακυκλίνη κατά 60% και η δοξυκυκλίνη κατά 90%. [31, 11] Βιομετατροπή και αποβολή Δεν παρατηρείται σημαντική βιομετατροπή τετρακυκλινών στον οργανισμό των ζώων. Συνήθως αποβάλλονται αναλλοίωτες, κυρίως υπό μορφή τετρακυκλίνης. Αποβάλλονται ως επί το πλείστον με τα ούρα, αλλά ένα μεγάλο ποσοστό 25-30% αποβάλλεται με τα κόπρανα, ανεξάρτητα από τον τρόπο χορήγησης. Αυτό εξηγείται από το φαινόμενο της εντεροηπατικής κυκλοφορίας. Σημαντικό ποσοστό τετρακυκλινών αποβάλλεται αναλλοίωτο με τη χολή στο έντερο, απ όπου μέρος τους απομακρύνεται με τα κόπρανα και μέρος επαναπορροφάται στη γενική κυκλοφορία. Οι τετρακυκλίνες αποβάλλονται επίσης με το γάλα, όπου παρατηρούνται συγκεντρώσεις, οι οποίες φτάνουν το 50 και 60% των συγκεντρώσεων του πλάσματος. Το γεγονός αυτό καθιστά τις τετρακυκλίνες ιδιαίτερα κατάλληλες στη θεραπεία των μαστίτιδων. [31, 11] Τοξικότητα - παρενέργειες Οι τετρακυκλίνες είναι σχετικά ατοξικές. Το LD50 της οξυτετρακυκλίνης μετά από ενδοφλέβια χορήγηση στα ποντίκια κυμαίνεται μεταξύ 150 και 180 mg/kg. Οι σκύλοι ανέχονται ενδομυϊκές δόσεις οξυτετρακυκλίνης μεταξύ 50 και 100 mg/kg ημερησίως, δηλαδή το πενταπλάσιο έως δεκαπλάσιο της συνιστώμενης θεραπευτικής δόσης. Από τις συχνές παρενέργειες που παρατηρούνται, από τη χρήση τετρακυκλινών, είναι οι διαταραχές στην εντερική χλωρίδα, λόγω της διατάραξης της ισορροπίας μεταξύ ευαίσθητων και ανθεκτικών στις τετρακυκλίνες μικροοργανισμών. Προσοχή επίσης χρειάζεται η χορήγηση τετρακυκλινών στα άλογα, στα οποία παρατηρήθηκαν θανατηφόρες διάρροιες μετά τη

67 χορήγηση τετρακυκλινών, κυρίως σε στρεσαρισμένα και σοβαρά άρρωστα ζώα. Ιδιαίτερη προσοχή χρειάζεται στην ενδοφλέβια χορήγηση τετρακυκλινών. Η απότομη ενδοφλέβια έγχυση μπορεί να προκαλέσει υπόταση και οξεία καρδιοαγγειακή ανεπάρκεια. Αυτό αποδίδεται στην ιδιότητα των τετρακυκλινών να σχηματίζουν εύκολα σύμπλοκα με τα κατιόντα ασβεστίου. Υπάρχουν επίσης ενδείξεις ότι η παρενέργεια αυτή προκαλείται και από την προπυλενική γλυκόλη, η οποία χρησιμοποιείται ως φορέας και διαλύτης των ενέσιμων ιδιοσκευασμάτων της οξυτετρακυκλίνης. [31, 11] 5.3 ΧΛΩΡΟΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΗ Η χλωροτετρακυκλίνη ήταν το πρώτο στη σειρά αντιμικροβιακό της ομάδας των τετρακυκλινών που ανακαλύφθηκε. Απομονώθηκε από το στρεπτομύκητα Streptomyces aurofaciens. Πρόκειται για άοσμη κρυσταλλική σκόνη κίτρινου χρώματος, δυσδιάλυτη στο νερό, με πολύ πικρή γεύση. Λόγω του χρυσίζοντος χρώματος πήρε το όνομα χρυσομυκίνη (Aureomycin). Ο συντακτικός της τύπος δίνεται στο σχήμα 5.2. Cl HO CH3 H H N(CH3)2 OH NH2 C OH OH O OH O O Σχήμα 5.2: Συντακτικός τύπος χλωροτετρακυκλίνης. Η χλωροτετρακυκλίνη δε χορηγείται παρεντερικά, λόγω του έντονου ερεθισμού που προκαλεί στο σημείο της έγχυσης. Χορηγείται από το στόμα για την αντιμετώπιση των ίδιων λοιμώξεων που αντιμετωπίζονται και με την οξυτετρακυκλίνη. Το φάσμα δράσης της χλωροτετρακυκλίνης δε διαφέρει από εκείνο της οξυτετρακυκλίνης. Παρατηρούνται ωστόσο κάποιες διαφορές σε φαρμακοκινητικό επίπεδο. Συγκεκριμένα έχει το μικρότερο βαθμό απορρόφησης (35%) σε σχέση με τις υπόλοιπες τετρακυκλίνες (6090%). Ιδιαίτερα υψηλές είναι οι συγκεντρώσεις της χλωροτετρακυκλίνης στη χολή και στους

68 νεφρούς, γεγονός που την καθιστά ιδιαίτερα κατάλληλη σε περιπτώσεις ηπατικών και ουροποιητικών λοιμώξεων. Η χλωροτετρακυκλίνη χορηγείται με την τροφή, κυρίως στους χοίρους και τα πτηνά και σπανιότερα στους μόσχους, ενώ θεωρητικά μπορεί να χορηγηθεί υπό μορφή κάψουλας σε σκύλους και γάτες. [11] 5.4 ΟΞΥΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΗ Η οξυτετρακυκλίνη απομονώθηκε από στελέχη του μύκητα Streptomyces rimosus. Είναι ευρέος φάσματος βακτηριοστατικό αντιμικροβιακό. Δρα αναστέλλοντας την πρωτεϊνική σύνθεση με τη σύνδεση της οξυτετρακυκλίνης στο ριβόσωμα των ευαίσθητων βακτηριδίων. Δρα εναντίον των κατά gram+ και gram- βακτηριδίων, μυκοπλασμάτων, ρικετσιών, χλαμυδίων καθώς και επί ορισμένων πρωτοζώων. Ο συντακτικός τύπος της ένωσης δίνεται στο σχήμα 5.3. H HO CH3 OH H N(CH3)2 OH NH2 C OH OH O OH O O Σχήμα 5.3: Συντακτικός τύπος οξυτετρακυκλίνης. Οι γαστρεντερικές και πνευμονικές λοιμώξεις αποτελούν τις σημαντικότερες ενδείξεις χρήσης της οξυτετρακυκλίνης. Η από του στόματος χορήγησή της, είτε υπό μορφή υδατοδιαλυτής σκόνης, είτε υπό μορφή φαρμακούχου προμίγματος με την τροφή, θεωρείται ιδιαίτερα κατάλληλη για την αντιμετώπιση των γαστρεντερικών λοιμώξεων, κυρίως των χοίρων και των πτηνών που οφείλονται σε διάφορα στελέχη Escherichia coli και Salmonella spp. Η μη ολική απορρόφηση της οξυτετρακυκλίνης από το γαστρεντερικό επιτρέπει στην ποσότητα που παραμένει στο γαστρεντερικό σωλήνα, να εκδηλώνει τοπική αντιμικροβιακή δράση. Επιπλέον, η παρεντερική της χορήγηση εξασφαλίζει σημαντική συγκέντρωση στο γαστρεντερικό σωλήνα, λόγω της απέκκρισής της σε ενεργό μορφή με τη χολή. Θα πρέπει ωστόσο η χρήση αυτή της οξυτετρακυκλίνης να λαμβάνει σοβαρά υπόψη το μεγάλο αριθμό ανθεκτικών στελεχών κολοβακτηριδίων και σαλμονελών που έχουν αναπτυχθεί εξαιτίας της αλόγιστης χρήση της

69 Η από του στόματος χορήγηση οξυτετρακυκλίνης χρησιμοποιείται επίσης ευρύτατα στην αντιμετώπιση των αναπνευστικών λοιμώξεων των χοίρων και των πτηνών. Αυτό δικαιολογείται, τόσο από τη σχετικά καλή κατανομή της οξυτετρακυκλίνης στους πνεύμονες, όσο και από τη σχετικά καλή της δράση έναντι των μυκοπλασμάτων και της Pasteurella. Η ενέσιμος μορφή αποτελεί εναλλακτική λύση για τις περιπτώσεις μεμονωμένων ζώων όπως βοοειδών, αιγοπροβάτων, χοίρων. Η παρεντερική χρήση οξυτετρακυκλίνης αποτελεί φάρμακο επιλογής στην αντιμετώπιση της παστεριδίασης των βοοειδών. Είναι επίσης κατάλληλη για τη θεραπεία συστηματικών βακτηριακών λοιμώξεων των ψαριών εντατικής εκτροφής. Η οξυτετρακυκλίνη συχνά συνδυάζεται με φουραζολιδόνη και νεομυκίνη. Δεν πρέπει να συνδυάζεται με β-λακταμικά αντιμικροβιακά (πενικιλίνες, κεφαλοσπορίνες), αμινογλυκοσίδες και χλωραμφαινικόλη. Δεν πρέπει επίσης να διαλύεται σε διαλύματα για ενδοφλέβια χορήγηση, τα οποία περιέχουν ασβέστιο και μαγνήσιο. Η ταυτόχρονη χορήγησή της με αντιόξινα, καολίνη ή προϊόντα που περιέχουν σίδηρο μειώνει αισθητά την απορρόφησή της. [11, 32, 33] Τρόποι χορήγησης και δοσολογία Τα προμίγματα με οξυτετρακυκλίνη 50% χορηγούνται από το στόμα με την τροφή, είτε μετά από ανάμιξή τους σε ιχθυέλαιο και στη συνέχεια με την τροφή, είτε μετά διάλυση σε λίγο νερό και εμβροχή της τροφής και στη συνέχεια ελαφρά επικάλυψη της τροφής με ιχθυέλαιο ως συνδετικού. Συνιστώμενη θεραπευτική δοσολογία στα θαλασσινά ψάρια του δραστικού συστατικού: 100 mg/kg βιομάζας/ημέρα (ή 10 g/100 kg βιομάζας/ημέρα) συνεχώς επί 10 ημέρες. Αντίστοιχη δοσολογία επί 50% σκόνης προμίγματος: 20 g/100 kg βιομάζας/ημέρα (ή 200 g/1000 kg βιομάζας/ημέρα) συνεχώς επί 10 ημέρες. Συνιστώμενη ημερήσια δοσολογία προμίγματος οξυτετρακυκλίνης: 50% σε 25 kg τροφής, σύμφωνα με την αναλογία της χορηγούμενης ιχθυοτροφής % της βιομάζας των ψαριών. [11, 32, 33]

70 5.5 ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΗ Παρόλο που η χλωροτετρακυκλίνη και η οξυτετρακυκλίνη είναι παράγωγα της τετρακυκλίνης, ωστόσο η τετρακυκλίνη ανακαλύφθηκε αργότερα απ αυτές. Η τετρακυκλίνη, ο χημικός τύπος της οποίας δίνεται στο σχήμα 5.4, έχει το ίδιο φάσμα δράσης με την οξυτετρακυκλίνη και τη χλωροτετρακυκλίνη. Σπάνια χρησιμοποιείται στην κτηνιατρική. Μπορεί όμως να χορηγηθεί παρεντερικά και από το στόμα. [11] H HO CH3 H H N(CH3)2 OH NH2 C OH OH O OH O O Σχήμα 5.4: Συντακτικός τύπος τετρακυκλίνης. 5.6 ΔΟΞΥΚΥΚΛΙΝΗ Η δοξυκυκλίνη είναι ημισυνθετικό παράγωγο της οξυτετρακυκλίνης. Μαζί με τη μινοκυκλίνη συγκαταλέγονται στις τετρακυκλίνες παρατεταμένης δράσης. Αυτό το οφείλουν στις ιδιαίτερες φαρμακοκινητικές τους ιδιότητες. Συγκεκριμένα διακρίνονται για τον πολύ υψηλό βαθμό απορρόφησης (90%) και τη μεγάλη ημιπερίοδο αποβολής. Το τελευταίο οφείλεται στον υψηλό βαθμό πρωτεϊνικής σύνδεσης που ανέρχεται σε 90% σε αντίθεση με εκείνο της οξυτετρακυκλίνης και τετρακυκλίνης που είναι 30 και 60% αντίστοιχα. Λόγω των λιποδιαλυτών τους ιδιοτήτων κατανέμονται πολύ καλά στα υγρά και τους ιστούς, ενώ είναι οι μόνες μεταξύ των οξυτετρακυκλινών που διαπερνούν τον αιμοεγκεφαλικό φραγμό. Ανιχνεύονται επίσης στο σάλιο και τα δάκρυα. Η δομή της δίνεται στο σχήμα

71 H H CH3 OH H N(CH3)2 OH NH2 C OH OH O OH O O Σχήμα 5.5: Συντακτικός τύπος δοξυκυκλίνης. Η δοξυκυκλίνη δεν αποβάλλεται με τον ίδιο τρόπο, όπως οι υπόλοιπες τετρακυκλίνες, αλλά απομακρύνεται κυρίως με τα κόπρανα σε ανενεργό χηλική μορφή. Με αυτόν τον τρόπο έχει ελάχιστη επίδραση στην εντερική μικροβιακή χλωρίδα και μπορεί να χορηγηθεί με ασφάλεια από το στόμα σε ζώα με ιδιαίτερα ευαίσθητη μικροβιακή χλωρίδα, όπως π.χ. κουνέλια και άλλα μικρά τρωκτικά. Σε ζώα που βρίσκονται σε περίοδο γαλουχίας αποβάλλεται και με το γάλα. [11]

72 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ 6.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα αλιεύματα είναι η μοναδική πηγή τροφίμων του ανθρώπου που συνεχίζει να «υφαρπάζεται» από τη φύση, αντί να καλλιεργείται και να εκτρέφεται, όπως συμβαίνει αιώνες τώρα με όλα τα υπόλοιπα τρόφιμα. Ταυτόχρονα, οι παγκόσμιες ανάγκες για ψάρια και θαλασσινά αυξήθηκαν ραγδαία τις τελευταίες δεκαετίες (συνέπεια και της αύξησης του πληθυσμού του πλανήτη) και συνεχίζουν να αυξάνονται, με αποτέλεσμα η αλιεία να μη μπορεί να καλύψει τη συνεχώς αυξανόμενη ζήτηση. Ήδη οι θάλασσες και οι ωκεανοί σε όλο τον κόσμο έχουν βιαστεί -ενδεχομένως- ανεπανόρθωτα από τη βιομηχανοποιημένη αλιεία και την υπεραλίευση και πλέον δεν επαρκούν. Συνεπώς, η ιχθυοκαλλιέργεια είναι μια σύγχρονη αναγκαιότητα, αλλά και μια ηθική υποχρέωση του ανθρώπου απέναντι στη φύση. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Γεωργίας και Τροφίμων (F.A.O.) του Οργανισμού Ηνωμένων Εθνών (Ο.Η.Ε.) η παγκόσμια κατανάλωση ψαριών θα αυξηθεί κατά 25% έως το 2030, ανεβάζοντας τη ζήτηση στους εκατομμύρια τόνους. Ταυτόχρονα, το παγκόσμιο ετήσιο αλιευτικό αποτέλεσμα, προκειμένου η αλιεία να παραμένει βιώσιμη, δε μπορεί να ξεπερνά τους 100 εκατομμύρια τόνους. Η διαφορά επομένως θα πρέπει να καλυφθεί από την ιχθυοκαλλιέργεια. Εκτός όμως των παραπάνω, η παγκόσμια ανάπτυξη της ιχθυοκαλλιέργειας δε σχετίζεται μόνο με την αυξημένη ζήτηση των αλιευμάτων, αλλά και με παράγοντες, όπως είναι η ελεγχόμενη και άριστη ποιότητα των προϊόντων ιχθυοκαλλιέργειας, η ιχνηλασιμότητα στις διαδικασίες παραγωγής και η κατά τις ανάγκες προγραμματισμένη παραγωγή. Επίσης, σχετίζεται με κοινωνικοοικονομικά ζητήματα που έχουν να κάνουν με την οικονομική ανάπτυξη και την προσφορά εργασίας σε υποβαθμισμένες περιοχές, με υψηλούς δείκτες ανεργίας και κατοίκους με χαμηλά ή καθόλου εισοδήματα, καθώς και σε ακριτικές περιοχές που κινδυνεύουν από ερήμωση. Ως ιχθυοκαλλιέργεια νοείται η εκτροφή υδρόβιων οργανισμών, μεταξύ των οποίων συμπεριλαμβάνονται τα ψάρια, τα μαλάκια, τα καρκινοειδή και τα υδρόβια φυτά. Ο κλάδος της ιχθυοκαλλιέργειας στη διευρυμένη Ευρωπαϊκή Ένωση των 25 παράγει συνολικά 1,3 εκατομμύρια τόνους αλιευτικών προϊόντων κάθε χρόνο, συνολικής αξίας 3 δισεκατομμυρίων ευρώ περίπου. Αυτό το ποσό αντιστοιχεί περίπου στο ένα τρίτο της συνολικής αξίας της αλιευτικής παραγωγής της Ευρωπαϊκής Ένωσης και το ένα πέμπτο του όγκου της. Σε ορισμένα

73 κράτη μέλη, η αξία των προϊόντων της ιχθυοκαλλιέργειας είναι μεγαλύτερη από αυτή των προϊόντων της αλιείας. Σε άλλες, η ιχθυοκαλλιέργεια αντιπροσωπεύει σημαντικό μέρος της συνολικής τους παραγωγής. Στο σχήμα 6.1 δίνεται ένα παράδειγμα μονάδας ιχθυοκαλλιέργειας. Σχήμα 6.1: Μονάδα ιχθυοκαλλιέργειας. Τα μεταποιημένα αλιευτικά προϊόντα περιλαμβάνουν παρασκευάσματα αλιευμάτων και ψάρια, καρκινοειδή και μαλάκια σε κονσέρβα, νωπά, διατηρημένα σε απλή ψύξη, κατεψυγμένα, καπνιστά και αποξηραμένα. Η αξία της παραγωγής του κλάδου της μεταποίησης (18 δισεκατομμύρια ευρώ) υπερβαίνει κατά πολύ τη συνολική αξία των προϊόντων της αλιείας και της ιχθυοκαλλιέργειας. [34, 35] 6.2 ΤΥΠΟΙ ΕΚΤΡΟΦΗΣ Πολλοί τύποι ιχθυοκαλλιεργειών αναπτύχθηκαν στην πορεία της εξέλιξής τους. Τα βασικά τους χαρακτηριστικά παραμένουν σταθερά και βοηθούν στην ομαδοποίηση, διακινδυνεύοντας όμως να υποτιμήσουμε τη δυναμική των σύνθετων μορφών και τη φαντασία των παραγωγών. Απλοποιώντας την όλη διαδικασία διακρίνουμε τρεις τύπους εκτροφής: τον εκτατικό, τον ημιεντατικό και τον εντατικό. [36]

74 Εκτατικός τύπος εκτροφής Ο εκτατικός τύπος εκτροφής χαρακτηρίζεται από τα πολλά είδη (πολυκαλλιέργεια), τη χαμηλή ιχθυοπυκνότητα και τη μη χορήγηση τροφής. Η ανθρώπινη παρέμβαση είναι μικρή, αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις καθοριστική. Η λογική σε αυτόν τον τύπο εκτροφής είναι: ο εμπλουτισμός αλίευση, δηλαδή εμπλουτισμός με γόνο ή βελτίωση των φυσικών πεδίων αναπαραγωγής ή και τα δύο και κατά χρονικά διαστήματα αλίευση. Εφαρμόζεται σε μεγάλες ή μικρές φυσικές ή τεχνητές υδατοσυλλογές, σε υποβαθμισμένα υδάτινα οικοσυστήματα ή σε περιοχές που υπάρχει μεγάλη χερσαία έκταση και μικρή διαθέσιμη παροχή νερού. Συνήθως η όλη διαδικασία περιλαμβάνει: α) Εμπλουτισμό με γόνο κατάλληλων ειδών ψαριών (κυπρινοειδή, γατόψαρα, κ.λ.π.). β) Συντήρηση, καθάρισμα και διευκόλυνση της κίνησης του νερού στα πεδία αναπαραγωγής. γ) Προστασία της φυσικής αναπαραγωγής. δ) Ενίσχυση με λιπάνσεις (ενίσχυση της πρωτογενούς και δευτερογενούς παραγωγής, όπου αυτό είναι εφικτό και απαραίτητο). ε) Σταδιακή και ελεγχόμενη αλιεία ή σύλληψη κατά μεγέθη. Σε πολλές περιπτώσεις οι εγκαταστάσεις διασποράς γόνου λειτουργούν σε μόνιμη βάση ή περιοδικά, ενώ δεν είναι σπάνιες οι περιπτώσεις, όπου η ανθρώπινη παρέμβαση αφορά μόνο σε έργα συντήρησης των πεδίων φυσικής αναπαραγωγής και ρύθμισης της αλιείας. [36] Ημιεντατικός τύπος εκτροφής Ο ημιεντατικός τύπος εκτροφής χαρακτηρίζεται από πολλά είδη ψαριών, σχετικά χαμηλή ιχθυοπυκνότητα, περιορισμένη χορήγηση τροφής και υποδομή μικρής κλίμακας. Ο τύπος αυτός εκτροφής εφαρμόζεται σε μικρές τεχνητές λίμνες, σε περίκλειστα που μπορούν να κατασκευασθούν εντός ή περιφερειακά των υδατοσυλλογών και σε χωμάτινες δεξαμενές, όπου εκτρέφονται είδη όπως, «άγρια» πέστροφα, πέρκα, τούρνα, αλλά και είδη όλων των άλλων οικογενειών, συνήθως με τη μέθοδο της πολυκαλλιέργειας. Η διατροφή αποτελείται σε ποσοστό 70 80% από φυσικούς οργανισμούς (τροφική αλυσίδα) και 20 30% από ιχθυοτροφές. Η τυπική μονάδα ημιεντατικού τύπου περιλαμβάνει λεκάνες γόνου και χωμάτινες λεκάνες πάχυνσης

75 Την κατάλληλη εποχή αλιεύονται γεννήτορες και με φυσικό ή ελεγχόμενο τρόπο απελευθερώνουν τα γεννητικά τους προϊόντα. Οι προνύμφες παραμένουν στις λεκάνες των γεννητόρων και μετά από ημέρες μεταφέρονται σε λεκάνες γόνου κατάλληλα προετοιμασμένες, με πλούσια φυσική τροφή (ή απομακρύνονται οι γεννήτορες και παραμένουν οι προνύμφες). Στη συνέχεια και μετά από 1 2 μήνες μεταφέρονται στις λεκάνες πάχυνσης. Η ενίσχυση της πρωτογενούς παραγωγής θεωρείται απαραίτητη σε όλα τα στάδια της παραγωγικής διαδικασίας. Ο ημιεντατικός τύπος εκτροφής χρησιμοποιείται σε περιορισμένη κλίμακα και περιοδικά για είδη που απαιτούν υψηλό ποσοστό φυσικής τροφής («άγρια» πέστροφα, πέρκα κ.λ.π.), αλλά και για άλλα είδη ψαριών, όπως τα κυπρινοειδή. Συνήθως, μονάδες εντατικής εκτροφής εφαρμόζουν σε συγκεκριμένο χώρο τον ημιεντατικό τύπο εκτροφής για τα είδη που προαναφέρθηκαν. [36] Εντατικός τύπος εκτροφής Ο εντατικός τύπος εκτροφής χαρακτηρίζεται από υψηλή ιχθυοπυκνότητα, υποχρεωτική χορήγηση τροφής, λίγα ή ένα είδος ψαριού (μονοκαλλιέργεια), πλήρη και ελεγχόμενη υποδομή: (λεκάνες εκτροφής, δεξαμενές εκκολαπτηρίου, τμήματα υποστήριξης της παραγωγής). [36] 6.3 ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΘΕΣΕΩΝ ΓΙΑ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Η επιτυχία των ιχθυοκαλλιεργειών εξαρτάται σε μεγάλο ποσοστό από την επιλογή της κατάλληλης περιοχής που πρόκειται να εγκατασταθεί η μονάδα πάχυνσης ή το εκκολαπτήριο. Οι παράγοντες αυτοί περιλαμβάνουν το κλίμα, τα χαρακτηριστικά εδάφους, την περιοχή, την ποσότητα και ποιότητα του νερού και άλλους βιολογικούς και κοινωνινοοικονομικούς παράγοντες. Η αντικειμενική και ρεαλιστική εκτίμηση καθορίζουν και την τελική επιλογή. [36] Ποσότητα του νερού Η ποσότητα του νερού και η κατάλληλη ποιότητα, αποτελούν βασικούς παράγοντες για κάθε τύπο ιχθυοκαλλιέργειας. Είναι αναγκαίο επίσης να ελέγχεται το καθεστώς χρήσης νερού,

76 παράλληλες δραστηριότητες που απαιτούν νερό, η δυνατότητα προσέγγισης πηγών, τα απαιτούμενα έργα υδροδότησης από: λίμνες, τεχνητές δεξαμενές, γεωτρήσεις, αρδευτικά κανάλια κ.λ.π, το κόστος και η απαιτούμενη ενέργεια, οι εναλλακτικές «πηγές» υδροδότησης, η εκτίμηση της ανώτερης και κατώτερης διαθέσιμης παροχής. Καθοριστικός παράγοντας θεωρείται η δυνατότητα αποχέτευσης του νερού από τη μονάδα, η αποστράγγιση των δεξαμενών και η εγγύτητα κατάλληλου αποδέκτη. [36] Ποιότητα του νερού Η ποιότητα του νερού είναι εξίσου σημαντικός και πιθανόν να αξιολογείται ως πρώτος σε σημασία παράγοντας για τις ιχθυοκαλλιέργειες. Ιδιαίτερα σήμερα με την επιβάρυνση των φυσικών υδάτινων πόρων, η ποιότητα των νερών υποβαθμίζεται και σε πολλές περιοχές της γης το φαινόμενο εμφανίζεται ιδιαίτερα έντονο. Η εκτίμηση της ποιότητας γίνεται με τη λήψη σειράς δειγμάτων, όλες τις εποχές του χρόνου, αναλύοντας φυσικές, χημικές, βιολογικές, μικροβιολογικές κ.ά. παραμέτρους, ώστε να υπάρχει σαφής εικόνα της διακύμανσης. Φυσικές και χημικές παράμετροι: η θερμοκρασία, το ph, το διαλυμένο οξυγόνο, το βιοχημικά απαιτούμενο οξυγόνο, το ελεύθερο διοξείδιο του άνθρακα, η αγωγιμότητα, η αλατότητα, η αμμωνία, κ.ά. Επίσης, ελέγχεται η ύπαρξη τοξικών ουσιών ή άλλων βιοχημικών ή γεωργικών αποβλήτων. Βιολογικές παράμετροι: η ποιότητα, η ποσότητα και τα είδη που περιλαμβάνονται στο πλαγκτόν. Μικροβιολογικές παράμετροι: τα είδη και η ποσότητα των βακτηρίων και των παρασίτων. [36] Κλίμα Εκτίμηση των κλιματικών παραμέτρων όπως, μηνιαία διακύμανση, για παράδειγμα της θερμοκρασίας, της βροχής, της εξάτμισης, της υγρασίας, της ηλιοφάνειας και των ανέμων. Η εκτίμηση του κλίματος ολοκληρώνεται με πληροφορίες για τυχόν εξαιρετικά φαινόμενα, όπως σεισμοί, κυκλώνες, κ.λ.π. Όλα τα κλιματικά στοιχεία είναι απαραίτητο να καλύπτουν, όσο το δυνατό μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. [36]

77 Χαρακτηριστικά του εδάφους Τα χαρακτηριστικά του εδάφους, όπως για παράδειγμα τα συστατικά του, οι φυσικοχημικές ιδιότητες, το οργανικό φορτίο κ.ά. είναι απαραίτητο να εκτιμηθούν, ώστε να αποφεύγονται άσκοπες και δαπανηρές ενέργειες. Συνήθως εδάφη αργιλοαμμώδη ή εδάφη που χρησιμοποιούνταν με επιτυχία στη γεωργία, θεωρούνται κατάλληλα για την κατασκευή δεξαμενών και υποδηλώνουν υψηλή παραγωγικότητα. Απαραίτητη πάντως κρίνεται η εργαστηριακή ανάλυση και τα τεκμηριωμένα αποτελέσματα. [36] Περιοχή εγκατάστασης Η περιοχή της εγκατάστασης μιας ιχθυοκαλλιέργειας θα πρέπει να επιλέγεται εκτιμώντας για παράδειγμα την υποδομή (ενέργεια, δρόμοι, επικοινωνίες), άλλες ανταγωνιστικές ή μη δραστηριότητες, τη δυνατότητα προσέγγισης από μηχανήματα, τις υπάρχουσες κλίσεις και το σχήμα του οικοπέδου, την παρουσία δέντρων, φυτών ή ζώων, την παρουσία ή την προοπτική ανάπτυξης επιβλαβών δραστηριοτήτων, την πιθανή επιβάρυνση της περιοχής από απόβλητα, την προσέγγιση στα κέντρα διανομής της παραγωγής, τη χρήση μεταφορικών μέσων κ.ά. [36] Βιολογικοί παράγοντες Οι βιολογικοί παράγοντες είναι αναγκαίο να εκτιμούνται παράλληλα με τους οικολογικούς, στο βαθμό που αλληλοεπηρεάζονται και ο συνδυασμός τους να οδηγεί στην τελική επιλογή. Ως βιολογικοί παράγοντες νοούνται: το είδος/η που πρόκειται να εκτραφούν ή το είδος/η που επιτρέπονται σύμφωνα με τους οικολογικούς παράγοντες να εκτραφούν την εξασφάλιση των γεννητόρων και γόνου το μέγεθος της εκτροφής (μικρή ή μεγάλη) τον τύπο εκτροφής που προσαρμόζεται στις συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες και προσφέρεται για το είδος ή τα είδη ψαριών (εκτατικό, ημιεντατικό, εντατικό) τη μέθοδο εκτροφής (μονοκαλλιέργεια, πολυκαλλιέργεια, ή συνδυασμός) το ύψος της παραγωγής [36]

78 Οικονομικοί και κοινωνικοί παράγοντες Η ομάδα αυτή των παραγόντων, αν και αρχικά δεν εξεταζόταν με ιδιαίτερη βαρύτητα, σήμερα στο πλαίσιο της σύγχρονης αγοράς και των κοινωνικών αναγκών, φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά την τελική επιλογή και σε πολλές περιπτώσεις να λειτουργεί καθοριστικά για την επιτυχία μιας επένδυσης στον τομέα των υδατοκαλλιεργειών. Οι κυριότεροι κοινωνικοοικονομικοί παράγοντες είναι: το γενικότερο αναπτυξιακό πρόγραμμα για την περιοχή η θέση της περιοχής και οι γειτονικές δραστηριότητες η δυνατότητα εξεύρεσης ειδικευμένου προσωπικού, τεχνολογίας και τεχνογνωσίας το κόστος των εργασιών σε όλα τα στάδια και επίπεδα (μελέτες, αγορά γης, εγκαταστάσεις, ζωικό κεφάλαιο κ.λ.π.), το κόστος της επένδυσης και η απόδοσή της η θέση των παραγόμενων προϊόντων στην τοπική και διεθνή αγορά το νομικό καθεστώς, οι περιβαλλοντικοί περιορισμοί, οι δυνατότητες χρηματοδότησης και η γενικότερη πολιτική στο συγκεκριμένο τομέα. [36] 6.4 Η ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΑΙΚΗ ΕΝΩΣΗ Υπάρχει μακρά παράδοση εκτροφής ψαριών και οστρακόδερμων σε ορισμένες ευρωπαϊκές χώρες, γεγονός που καθιστά εύκολο να εξηγηθεί η ποικιλομορφία που παρουσιάζει ο κλάδος της κοινοτικής ιχθυοκαλλιέργειας, η οποία περιλαμβάνει από μικροεπιχειρήσεις μέχρι βιομηχανικού μεγέθους πολυεθνικές επιχειρήσεις. Η κοινοτική ιχθυοκαλλιέργεια περιλαμβάνει τρεις κύριες δραστηριότητες: την εκτροφή θαλάσσιων ψαριών, την εκτροφή θαλάσσιων οστρακόδερμων, την εκτροφή ψαριών σε γλυκά ύδατα. Στο σχήμα 6.1 δίνονται τα ποσοστά των προϊόντων ιχθυοκαλλιέργειας επί της συνολικής παραγωγής στην Ευρωπαϊκή Ένωση των 27 για το

79 Σχήμα 6.1: Ποσοστά των προϊόντων ιχθυοκαλλιέργειας επί της συνολικής παραγωγής στην Ευρωπαϊκή Ένωση. Τέσσερα είδη κυριαρχούν στην παραγωγή της Ευρωπαϊκής Ένωσης: η πέστροφα, ο σολομός, τα μύδια και τα στρείδια. Λόγω της μεγαλύτερης εμπειρίας που αποκτήθηκε, όσον αφορά στις ανάγκες των εκτρεφόμενων ψαριών και της προόδου στην τεχνολογία, οι ιχθυοκαλλιεργητές στρέφουν την προσοχή τους σε περισσότερο εξωτικά είδη, όπως είναι τα λαυράκια, οι συναγρίδες και τα καλκάνια. Στο σχήμα 6.2 δίνονται τα κυριότερα είδη οργανισμών που παράγονται σε ιχθυογεννητικούς σταθμούς της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Η διαφοροποίηση του αριθμού των ειδών που διατίθενται, τους εξοπλίζει καλύτερα να αντιμετωπίσουν τον παγκόσμιο ανταγωνισμό. Σχήμα 6.2: Τα κυριότερα είδη οργανισμών που παράγονται σε ιχθυογεννητικούς σταθμούς της Ευρωπαϊκής Ένωσης

80 Οι υποστηρικτές της συστηματικής ιχθυοκαλλιέργειας διαβεβαιώνουν, εδώ και χρόνια, πως η αποκαλούμενη «μπλε επανάσταση» είναι ταυτόχρονα φθηνή και αειφόρος και προσφέρει μία εναλλακτική λύση στην κατανάλωση των απειλούμενων θαλάσσιων ειδών που αλιεύονται στους ωκεανούς. Στο σχήμα 6.3 δίνονται τα κυριότερα κράτη μέλη παραγωγοί στην Ευρωπαϊκή Ένωση για το [37] Σχήμα 6.3: Τα κυριότερα κράτη μέλη παραγωγοί στην Ευρωπαϊκή Ένωση το ΕΙΔΗ ΨΑΡΙΩΝ ΠΟΥ «ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΝΤΑΙ» ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ Στην Ελλάδα αλλά και γενικότερα στη Μεσόγειο, καλλιεργούνται σε μαζική κλίμακα τσιπούρες, λαβράκια και ούγενες (αλλιώς χιόνες ή μυτάκια), όπως φαίνονται και στο σχήμα 6.4. Αυτά τα τρία είδη αποτελούν το 98% της συνολικής ετήσιας παραγωγής ψαριών ιχθυοκαλλιέργειας. Τα ψάρια αυτά πωλούνται συνήθως σε μέγεθος γραμμάρια, αλλά τα βρίσκει κανείς και ακόμα μεγαλύτερα ( γραμμάρια μέχρι και 1 κιλό). (α) (β) Σχήμα 6.4: α) Τσιπούρα, β) Λαβράκι, γ) Ούγενα (γ)

81 Καλλιεργούνται επίσης, αλλά σε πολύ μικρότερη κλίμακα, λιθρίνια και σαργοί και ακόμα, σε κάποιες περιοχές της Ελλάδας, κέφαλοι. Αυτά αποτελούν το υπόλοιπο 2% της συνολικής ετήσιας παραγωγής. Πωλούνται σε μικρότερα μεγέθη, συνήθως 250 έως 350 γραμμάρια. Πέραν των παραπάνω, σε πειραματικό στάδιο και σε αμελητέες ποσότητες, παράγονται ακόμα φαγγριά, συναγρίδες, μουρμούρες, μελανούρια, σηκιοί κ.ά. [39] 6.6 ΤΡΟΦΕΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΤΙΣ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Τα ψάρια της ιχθυοκαλλιέργειας τρέφονται με τεχνητές ισορροπημένες πλήρεις ιχθυοτροφές που έχουν σύσταση ανάλογη των διατροφικών συνηθειών του κάθε είδους ψαριού στη φύση. Ανήκουν στην κατηγορία των ξηρών τροφών και παράγονται σε 2 μορφές αναλόγως του μεγέθους του εκτρεφόμενου ψαριού: σύμπηκτων (pellets) για τα μεγαλύτερα μεγέθη και κόκκου (granulated meal) για τις μικρές ηλικίες. Η διαδικασία παραγωγής τους περιλαμβάνει την προκατεργασία των νωπών πρώτων υλών που είναι κυρίως ιχθυάλευρα, ιχθυέλαια (fish meal & fish oil) και δημητριακά, την προσθήκη βιταμινών και ιχνοστοιχείων (απαραίτητων για τη φυσιολογική ανάπτυξη των ψαριών) και τέλος αμύλου (starch) για τη συγκόλληση των συστατικών μεταξύ τους. Τα πλεονεκτήματα της χρήσης πλήρων τεχνητών ιχθυοτροφών είναι ότι: Παράγονται σε εξειδικευμένες βιομηχανικές εγκαταστάσεις με χρήση σταθερών συνθηκών παραγωγής και πιστοποιημένων πρώτων υλών, με αποτέλεσμα να είναι όσον αφορά στην υγεία των καταναλωτών ασφαλείς. Διαθέτουν ελεγχόμενα φυσικά χαρακτηριστικά (σχήμα, μέγεθος, πυκνότητα, χρώμα). Η σύνθεσή τους είναι ελεγχόμενη και άρα έχουν σταθερή και γνωστή διατροφική αξία και οργανοληπτικές ιδιότητες. Τέλος, ακριβώς επειδή οι τεχνητές ιχθυοτροφές έχουν ως κύρια πρώτη ύλη το ιχθυάλευρο, το οποίο προέρχεται πάλι από ψάρια με αντίστοιχο προφίλ θρεπτικών ουσιών, πρωτεϊνών και κύρια πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, διατηρούν στο ακέραιο τις πολύτιμες ιδιότητες που έχει το ψάρι ως τρόφιμο, οι οποίες με τη σειρά τους μεταφέρονται αυτούσιες στο ψάρι ιχθυοκαλλιέργειας. Η σύγχρονη τεχνολογία και τεχνογνωσία στους τομείς παρασκευής ιχθυοτροφών και εκτροφής ψαριών, εξασφαλίζει σταθερότητα στην ύπαρξη αυτών των θετικών ιδιοτήτων στα

82 ψάρια της ιχθυοκαλλιέργειας και πολλές φορές βελτίωσή τους για ακόμα μεγαλύτερο όφελος στον άνθρωπο. [39] 6.7 ΙΧΘΥΑΛΕΥΡΑ/ΙΧΘΥΕΛΑΙΑ Τα ιχθυάλευρα και τα ιχθυέλαια είναι τα κυριότερα συστατικά των ιχθυοτροφών με τις οποίες τρέφονται τα ψάρια της ιχθυοκαλλιέργειας. Οι ιχθυοτροφές πρέπει να προσδίδουν στο εκτρεφόμενο ψάρι τις απαραίτητες για την ανάπτυξή του πρωτεΐνες και λίπη. Ως πηγή πρωτεϊνών και λιπών χρησιμοποιούνται τα ιχθυάλευρα και τα ιχθυέλαια. Τα ιχθυάλευρα και τα ιχθυέλαια προκύπτουν από την επεξεργασία (άλεσμα) ορισμένων ειδών πελαγικών ψαριών, τα οποία αλιεύονται κυρίως στο νότιο Ειρηνικό και βόρειο Ατλαντικό και είναι ακατάλληλα για ανθρώπινη κατανάλωση, κυρίως λόγω του μικρού τους μεγέθους και της σκληρής σάρκας τους. Τα είδη αυτά των ψαριών, σχηματίζουν τεράστιους πληθυσμούς, πολλαπλασιάζονται πολύ γρήγορα και σε μεγάλους αριθμούς, μεγαλώνουν ταχύτατα και έχουν μικρή διάρκεια ζωής. Αλιεύονται σε μεγάλες ποσότητες και αποτελούν σπουδαιότατη πηγή άριστης ποιότητας πρωτεϊνών και ιχθυελαίου, όχι μόνο για τις ανάγκες της παγκόσμιας ιχθυοκαλλιέργειας, αλλά και της ζωικής παραγωγής εν γένει (κτηνοτροφία, πτηνοτροφία). Συγκεκριμένα, εκτιμάται ότι η ετήσια παγκόσμια παραγωγή ιχθυάλευρου είναι περί τα 6,5 εκατομμύρια τόνοι, εκ των οποίων μόνο 2 εκατομμύρια τόνοι καταναλώνονται από την ιχθυοκαλλιέργεια. Αντιστοίχως, η ετήσια παραγωγή ιχθυελαίου είναι περί τα 1,2 εκατομμύρια τόνοι, εκ των οποίων η ιχθυοκαλλιέργεια καταναλώνει περίπου τόνους. [39] 6.8 ΧΡΗΣΗ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΙΣ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Οι κυριότερες φαρμακευτικές ουσίες που χρησιμοποιούνται στην ιχθυοκαλλιέργεια, έχουν να κάνουν με την πρόληψη και προφύλαξη από ασθένειες και δεν είναι τίποτα περισσότερο από εμβόλια και ανοσοενισχυτικά. Η χρήση εμβολίων (πάντοτε εγκεκριμένων από τον Εθνικό Οργανισμό Φαρμάκων, Ε.Ο.Φ.) είναι πλέον ρουτίνα στις ιχθυοκαλλιέργειες. Η συγκεκριμένη κατηγορία ουσιών, εκτός του ότι δεν παρουσιάζει καμία επικινδυνότητα για τον καταναλωτή, παράλληλα καθιστά τα ψάρια περισσότερο ανθεκτικά σε βακτήρια και μικροοργανισμούς που δυνητικά θα τα προσέβαλαν

83 Με τη χρήση εμβολίων, μειώνονται τα περιστατικά νόσου, προστατεύεται η ευζωία των εκτρεφομένων ψαριών και εξαλείφεται η ανάγκη για χρήση αντιβιοτικών ή άλλων φαρμάκων. Έτσι λοιπόν, λόγω της ευρείας χρήσης εμβολίων στις ιχθυοκαλλιέργειες, οι ασθένειες είναι πλέον ελάχιστες και συνήθως δεν υφίσταται λόγος για χρήση άλλων φαρμάκων. Τα εμβόλια χορηγούνται στα ψάρια με τις εξής μεθόδους: Εμβάπτιση Το εμβόλιο διαλύεται σε κατάλληλο δοχείο σε αναλογία 1/10, δηλαδή το περιεχόμενο κάθε φιάλης λίτρου εμβολίου σε 9 λίτρα νερό εκτροφής. Ενδείκνυται ελαφρά, συνεχής οξυγόνωση του διαλύματος. Γίνεται διαδοχική προσθήκη ομάδων ψαριών στο διάλυμα και παραμονή επί 30 sec, αποστράγγιση και έπειτα μεταφορά στο χώρο εκτροφής. [38] Ενδοπεριτοναϊκή έγχυση Το εμβόλιο εγχύεται αδιάλυτο ενδοπεριτοναϊκά στην κοιλιακή περιοχή μεταξύ της έδρας και των κοιλιακών πτερυγίων. Τα ψάρια αναισθητοποιούνται μέχρι ακινησίας. Η βελόνη εισέρχεται στην περιτοναϊκή κοιλότητα υπό γωνία 45 και μέχρι βάθους περίπου 0,5 cm. Το ελάχιστο κατάλληλο σωματικό βάρος των ψαριών είναι 25g. Ενδείκνυται η χρήση αυτομάτων, επαναληπτικών συρίγγων («πιστόλια εμβολιασμού»). Στο σχήμα 6.5 φαίνεται εμβολιασμός ψαριών ιχθυοτροφείου με χημειοπροφυλακτικό εμβόλιο. [38] Σχήμα 6.5: Εμβολιασμός ψαριών

84 Λουτρό Ιχθύδια 1g-5g παραμένουν στη δεξαμενή τους (στον ιχθυογεννητικό σταθμό ή στο όχημα/σκάφος μεταφοράς), όπου μειώνεται η στάθμη (όγκος) του νερού μέχρι τη μέγιστη ανεκτή ιχθυοπυκνότητα. Ταυτόχρονα χορηγείται οξυγόνο. Μπορεί να προστεθεί ελαφρά δόση αναισθητικού, ώστε τα ψάρια να ηρεμήσουν. Το εμβόλιο προστίθεται στην αναλογία 1:500. Τα ψάρια παραμένουν στο λουτρό τουλάχιστον για 1 ώρα (καλύτερα 100 min). Κατόπιν επαναφέρεται προοδευτικά η στάθμη του νερού στο κανονικό. [38] Προφυλάξεις κατά τη χρήση των εμβολίων Ο εμβολιασμός να γίνεται μόνο σε υγιή ψάρια κατόπιν νηστείας, τα οποία δε βρίσκονται κάτω από συνθήκες στρες. Ο εμβολιασμός αντενδείκνυται μόνον εφόσον υπάρχει ενεργή λοίμωξη ή όταν τα ψάρια είναι ήδη καταπονημένα από άλλες αιτίες. Ο εμβολιασμός πρέπει να προηγείται της έκθεσης των ψαριών σε νοσηρό περιβάλλον, κατά δύο εβδομάδες, όταν η θερμοκρασία του νερού κυμαίνεται περί τους 15 C. Λιγότερος χρόνος απαιτείται για την εγκατάσταση της ανοσίας σε υψηλότερες θερμοκρασίες (π.χ. 10 ημέρες στους 20 C). Η διαφορά θερμοκρασίας του διαλύματος του εμβολίου και του ύδατος εκτροφής κατά τον εμβολιασμό δε θα υπερβαίνει τους 2 C. Ωστόσο, αν παρ όλα αυτά εμφανιστεί ασθένεια (κυρίως σε περιπτώσεις όπου δεν έγινε εμβολιασμός) χρησιμοποιούνται μόνον εγκεκριμένα από τον Ε.Ο.Φ. αντιβιοτικά, και η χορήγησή τους γίνεται μόνο μετά από συνταγή ειδικευμένου στην παθολογία των ιχθύων κτηνιάτρου, και μόνον αφού διενεργηθούν οι αναγκαίες εξετάσεις. Σε κάθε περίπτωση, όπως και στα άλλα είδη ζώων που προορίζονται για κατανάλωση από τον άνθρωπο, θα πρέπει να τηρούνται αυστηρά οι «χρόνοι αναμονής», ώστε να εξασφαλιστεί η πλήρης απουσία, έστω και ίχνους αντιβιοτικών από τη σάρκα των ψαριών. Θα πρέπει εδώ να τονιστεί ότι υπάρχει μια βασική διαφοροποίηση στην εκτροφή ψαριών σε σχέση με τα χερσαία ζώα για την παραγωγή τροφίμων ζωικής προέλευσης. Η ιδιαιτερότητα είναι ότι το μέσο το οποίο περιβάλλει τα ψάρια, το θαλασσινό νερό, είναι σε μεγάλο βαθμό ελέγξιμο, κυρίως στις νεαρές ηλικίες που είναι και οι πιο ευαίσθητες στις ασθένειες. Σε αυτές τις ηλικίες, τα ψάρια θα πρέπει να εκτρέφονται σε χερσαίες εγκαταστάσεις υπό απόλυτα ελεγχόμενες συνθήκες, όπου το εισερχόμενο νερό δέχεται πλήρη επεξεργασία (κατακράτηση με φίλτρα, επεξεργασία με υπεριώδη ακτινοβολία UV), κατά την οποία απομακρύνονται όλα

85 τα πιθανά παθογόνα. Η μεταφορά στις μονάδες εκτροφής στη θάλασσα γίνεται σε ηλικίες, όπου τα ψάρια είναι πλέον ανθεκτικά και επιπλέον εμβολιασμένα, με αποτέλεσμα τα περιστατικά ασθενειών να είναι ελάχιστα και κατά συνέπεια η πιθανότητα χρήσης φαρμάκων πολύ μειωμένη. [38, 39] 6.9 ΧΡΗΣΗ ΟΡΜΟΝΩΝ ΣΤΑ ΨΑΡΙΑ ΤΗΣ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Σε αντίθεση με τη βιομηχανία εκτροφής χερσαίων θηλαστικών (βοοειδή, χοίροι, αιγοπρόβατα) για την παραγωγή τροφίμων ζωικής προέλευσης, όπου χρησιμοποιούνται ορμόνες για τον έλεγχο της αναπαραγωγής (συγχρονισμός του οίστρου, αύξηση παραγωγής γάλακτος και αύξηση του αριθμού των απογόνων) και σε ορισμένες χώρες, ακόμα και για την ταχύτερη αύξηση (αυξητικές ορμόνες, Η.Π.Α.), στην ιχθυοκαλλιέργεια δεν υπάρχει ανάγκη για χρήση τέτοιων ουσιών. Ο έλεγχος της αναπαραγωγής στα ψάρια επιτυγχάνεται με απόλυτα φυσικές μεθόδους όπως ο έλεγχος της διάρκειας του φωτός ανά 24ωρο (φωτοπερίοδος) και της θερμοκρασίας του ύδατος στο οποίο εκτρέφονται οι γεννήτορες (θερμοπερίοδος). Τέλος, σε ό,τι αφορά στην αύξηση του βάρους, επίσης δεν υφίσταται λόγος χρήσης τέτοιων ενώσεων, διότι το φυσιολογικό γενετικό δυναμικό στα ψάρια εξασφαλίζει, ούτως ή άλλως, ταχεία αύξηση, μικρό κύκλο παραγωγής και εκμετάλλευση της τροφής σε επίπεδα πολύ καλύτερα από τα χερσαία είδη. Συνεπώς, στις ιχθυοκαλλιέργειες δεν είναι αναγκαία η χρήση ορμονών. Τα ψάρια της μεσογειακής και Ελληνικής ιχθυοκαλλιέργειας είναι τα ίδια ακριβώς ψάρια που ζούνε και αναπαράγονται στις θάλασσες. Προέρχονται από γεννήτορες που έχουν αλιευθεί από τη φύση, όπου έπειτα από διαδοχικές γενεές έχουν αυστηρά (με βάση τους κανόνες της ζωοτεχνίας) επιλεγεί τα καταλληλότερα ψάρια, ως προς την ευρωστία τους, τη γρήγορη ανάπτυξή τους, την αντοχή τους σε ασθένειες και τα μορφολογικά τους χαρακτηριστικά. Είναι δε, γενετικά πανομοιότυπα με κάθε τσιπούρα ή κάθε λαβράκι που ζει ελεύθερο στη θάλασσα. Η ελληνική ιχθυοκαλλιέργεια είναι πρωταθλήτρια Ευρώπης στην παραγωγή μεσογειακών ειδών, αφού μόνη της παράγει το 50% της συνολικής ευρωπαϊκής παραγωγής. Η ελληνική ιχθυοκαλλιέργεια ακολουθώντας αλματώδη πορεία την τελευταία δεκαετία, εκμεταλλευόμενη τις άριστες περιβαλλοντικές συνθήκες και την ιδανική μορφολογία της ακτογραμμής της, αναπτύχθηκε έντονα, απέκτησε δική της τεχνογνωσία και πολύ γρήγορα κυριάρχησε στις ευρωπαϊκές και διεθνείς αγορές. Το 2006 σε ολόκληρη την ελληνική

86 επικράτεια λειτουργούσαν 314 μονάδες ιχθυοκαλλιέργειας, των οποίων η συνολική παραγωγή εκτιμάται ότι ξεπέρασε τους τόνους έτοιμου προϊόντος, καθώς επίσης, 40 ιχθυογεννητικοί σταθμοί, οι οποίοι παρήγαγαν περισσότερα από τεμάχια γόνου. Ο γόνος που παράγεται από τους ελληνικούς ιχθυογεννητικούς σταθμούς απορροφάται κατά 90% από τις ελληνικές μονάδες εκτροφής, ενώ το έτοιμο προϊόν που παράγουν οι ελληνικές μονάδες εκτροφής εξάγεται σε ποσοστό 70% - 80% στις αγορές της Ευρώπης και το υπόλοιπο απορροφάται από την ελληνική αγορά. Σήμερα, η θαλάσσια ιχθυοκαλλιέργεια αποτελεί για την Ελλάδα έναν πάρα πολύ σημαντικό τομέα της οικονομίας, αφού είναι ο δεύτερος μεγαλύτερος εξαγωγικός κλάδος της χώρας στα αγροτικά προϊόντα με ετήσιο τζίρο που αγγίζει τα 0,5 δισεκατομμύρια ευρώ. [39] 6.10 ΕΥΡΩΠΑΙΚΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΣΗΜΑΝΣΗΣ ΨΑΡΙΩΝ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Σύμφωνα με τις οδηγίες σήμανσης της Ευρωπαϊκής Ένωσης που ισχύουν ήδη από τον Ιανουάριο του 2002, κάθε ψάρι που πωλείται στην αγορά από τους λιανοπωλητές (σούπερμάρκετ, ιχθυοπωλεία) πρέπει να σημαίνεται, δηλαδή να παρέχει στον καταναλωτή βασικές πληροφορίες ως προς την προέλευσή του. Συγκεκριμένα, οι παραπάνω οδηγίες σήμανσης απαιτούν: Να αναγράφεται η εμπορική ονομασία του κάθε ψαριού. Να αναγράφεται η επιστημονική ονομασία του είδους. Να αναγράφεται η μέθοδος παραγωγής του, δηλαδή εάν προέρχεται από ελεύθερη αλιεία ή εάν είναι προϊόν ιχθυοκαλλιέργειας. Εάν πρόκειται για ψάρι ελεύθερης αλιείας, να αναγράφεται η προέλευσή του δηλαδή σε ποιο μέρος και πότε αλιεύθηκε. Εάν πρόκειται για προϊόν ιχθυοκαλλιέργειας, να αναγράφεται η χώρα παραγωγής του, είτε αυτή είναι χώρα της Ευρωπαϊκής Ένωσης, είτε τρίτη χώρα. [39] 6.11 ΡΥΠΑΝΣΗ ΤΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Οι ιχθυοκαλλιέργειες είναι ίσως η μοναδική ανθρώπινη βιομηχανική δραστηριότητα που εξαρτάται τόσο άμεσα από το θαλάσσιο περιβάλλον, αφού τα ψάρια ζούν και αναπτύσσονται μέσα σε λίγα κυβικά μέτρα θάλασσας που έχει στη διάθεσή του το ιχθυοτροφείο. Έτσι, εάν

87 θέλουν να συνεχίζουν να υπάρχουν, οφείλουν να μην καταστρέφουν ούτε να ρυπαίνουν, μα αντιθέτως, να διαφυλάττουν καθαρό το θαλάσσιο περιβάλλον τους για το δικό τους πρωτίστως συμφέρον. Από την άλλη μεριά, δεν υπάρχει βιομηχανική δραστηριότητα που να μην επιβαρύνει έστω και στο ελάχιστο το φυσικό περιβάλλον. Η επίδραση της ιχθυοκαλλιέργειας στην ποιότητα του νερού γύρω από αυτή, δεν είναι τίποτα περισσότερο από τη σταδιακή συσσώρευση στο βυθό υπολειμμάτων τροφής και κυρίως περιττωμάτων των ψαριών, η οποία εκφράζεται μέσω της αύξησης των συγκεντρώσεων αζώτου και φωσφόρου στο νερό και στα ιζήματα του βυθού. Ωστόσο, η συσσώρευση αυτή, αφενός περιορίζεται σε έκταση λίγων εκατοντάδων μέτρων γύρω από τις πλωτές εγκαταστάσεις και αφετέρου η αύξηση των επιπέδων αζώτου και φωσφόρου, λόγω αυτής της συσσώρευσης είναι αμελητέα σε σύγκριση με τις ποσότητες που επίσης καταλήγουν στις θάλασσες, από άλλες βιομηχανικές δραστηριότητες στην ξηρά. Επίσης, έχει αποδειχτεί ότι το θαλάσσιο περιβάλλον γύρω από μια ιχθυοκαλλιέργεια αποκαθίσταται πλήρως και επανέρχεται στην αρχική του κατάσταση, μέσα σε λίγους μόνο μήνες μετά την απομάκρυνση της ιχθυοκαλλιέργειας από μια συγκεκριμένη περιοχή. Οι σύγχρονες μονάδες ιχθυοκαλλιέργειας στην Ελλάδα, εγκαθίστανται, ούτως ή άλλως, σε περιοχές με μεγάλα βάθη, έντονα ρεύματα και ως εκ τούτου ταχύτερη διάλυση και διάχυση των οργανικών υλών που αποβάλλονται από τη μονάδα, με συνέπεια η συσσώρευσή τους στο βυθό να είναι όλο και μικρότερη τα τελευταία χρόνια. Ταυτοχρόνως, οι σύγχρονες ιχθυοτροφές είναι ειδικής σύνθεσης και ιδιαίτερα εύπεπτες, με αποτέλεσμα να είναι πλήρως εκμεταλλεύσιμες από το ψάρι, και τα παραγόμενα υποπροϊόντα πολύ λιγότερα. Η μεγαλύτερη όμως απόδειξη ότι η επιβάρυνση του θαλασσίου περιβάλλοντος από τις ιχθυοκαλλιέργειες είναι μικρή και απολύτως αναστρέψιμη, είναι η αφθονία ζωής και ιχθυοπανίδας που παρατηρείται γύρω από κάθε μονάδα. Χιλιάδες ψάρια κάθε είδους, από αθερίνα, σαρδέλες, γόπες, και κέφαλοι, μέχρι παλαμίδες, τοννάκια, γοφάρια, μαγιάτικα, έως και τεράστιες τούνες, συνωστίζονται γύρω από τους ιχθυοκλωβούς αναζητώντας τροφή και ασφάλεια, αφού η αλιεία απαγορεύεται γύρω από τις εγκαταστάσεις των ιχθυοτροφείων. [37, 38]

88 6.12 ΤΣΙΠΟΥΡΑ (SPARUS AURATA) Φύλο: Χορδωτά Κλάση: Οστεϊχθύες Υφομοταξία: Ακτινοπτερύγιοι Υπέρταξη: Τελεόστεοι Τάξη: Περκοειδείς Σχήμα 6.6: Τσιπούρα. Οικογένεια: Σπαρίδες Γένος: Sparus Η τσιπούρα (Sparus aurata) είναι ένα είδος με ευρεία εξάπλωση, κοινό στη Μεσόγειο, στην Αδριατική θάλασσα και στον Ατλαντικό ωκεανό, όπου απαντάται από τα Βρετανικά νησιά ως το Cape Verde, ενώ συναντάται σπάνια στη Μαύρη θάλασσα. Πρόκειται για μοναχικό είδος που σπάνια σχηματίζει μικρές ομάδες. Η τσιπούρα μπορεί να φτάσει σε μήκος τα 70 cm, ενώ το μεγαλύτερο βάρος που έχει παρατηρηθεί για ψάρι του είδους είναι τα 17,2 kg. Το ψάρι έχει μέγιστη ηλικία τα 11 χρόνια σε συνθήκες κράτησης. Μια μεγάλη μαύρη κηλίδα στο τέλος του βραγχιακού επικαλύμματος σε ένα ασημένιο φόντο, όπως φαίνεται και στο σχήμα 6.6, είναι το σήμα κατατεθέν της τσιπούρας. Το έντονο κυρτό προφίλ, δίνει στο ψάρι μια όμορφη αγριάδα και έναν αέρα κυριαρχίας. Οι κάθετοι ασημόγκριζοι χρωματισμοί που αποκτά το ψάρι, όταν είναι λίγο νευρικό, όταν είναι σε περίοδο αναπαραγωγής ή όταν κυνηγά για να συλλάβει την τροφή του, ολοκληρώνει την σχήμα του ψαριού. Η τσιπούρα είναι πρώτανδρο ερμαφρόδιτο είδος, δηλαδή γεννιέται πρώτα ως αρσενικό και μετά το πέρας περίπου 3 χρόνων κάνει αναστροφή φύλου και γίνεται θηλυκό. Έτσι στα πρώτα δύο χρόνια της ζωής της ως αρσενικό, έχει μήκος cm και ζυγίζει γύρω στα g. Στον τρίτο χρόνο, που γίνεται θηλυκό, το μήκος της είναι συνήθως cm και ζυγίζει από 600 g και πάνω. Η αναπαραγωγή της τσιπούρας λαμβάνει χώρα από τον Οκτώβριο μέχρι και το Δεκέμβριο, στην ανοιχτή θάλασσα. Ένα θηλυκό, μπορεί να γεννάει αυγά καθημερινά κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου. Ο γόνος που θα βγει, θα κολυμπήσει στα ρηχά νερά, εκεί που μπορεί να βρει μεγαλύτερη ασφάλεια και αφθονία τροφής, όπου και θα μείνει μέχρι τον επόμενο Οκτώβριο. Μετά θα ενσωματωθεί στο αρχικό κοπάδι, θα λαμβάνει μέρος στην αναπαραγωγή και θα το ακολουθεί στις μετακινήσεις του. Κάτι αξιοσημείωτο για

89 την τσιπούρα είναι, ότι ενώ μπορεί να είναι σε διαδικασία αλλαγής φύλου από αρσενικό σε θηλυκό, μπορεί να τη διακόψει, και να ξαναπαράγει σπέρμα για την ερχόμενη αναπαραγωγική περίοδο. Η ωρίμανση των γονάδων των ψαριών, καθώς και η αναπαραγωγική τους συμπεριφορά επηρεάζονται από περιβαλλοντικά ερεθίσματα, όπως η θερμοκρασία και η διάρκεια της ημέρας, συνεπώς είναι δυνατό με τον κατάλληλο χειρισμό αυτών των αβιοτικών παραγόντων να επιτευχθεί παραγωγή αυγών, καθ όλη τη διάρκεια του χρόνου. Αυτό εκμεταλλεύονται σήμερα οι μονάδες εκτροφής της τσιπούρας. Τα ψάρια που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή αυγών στις ιχθυοκαλλιέργειες μπορεί να προέρχονται από τη φύση, ή από γόνο που έχει παραχθεί και εκτραφεί εντατικά. Τα τελευταία χρόνια κυριαρχεί η χρήση ψαριών που υφίστανται επιλογή με κριτήρια τη γρήγορη αύξηση και την ανθεκτικότητα στις ασθένειες. Στους ελληνικούς ιχθυογεννητικούς σταθμούς έχουμε δύο κύριες διαφορετικές γραμμές προέλευσης γεννητόρων. Τα ψάρια που προέρχονται από τον Ατλαντικό ωκεανό (Γαλλία, Ισπανία, Πορτογαλία) και τα ψάρια που προέρχονται από τη Μεσόγειο θάλασσα (κυρίως από την Ελλάδα). Βέβαια και εντός των δύο αυτών βασικών κατηγοριών, υπάρχουν διαφορές ανάλογα με την ακριβή προέλευση του πληθυσμού. Υπάρχουν διάφορες πρακτικές διατήρησης γεννητόρων για εμπορική παραγωγή αυγών. Μία δυνατότητα είναι η διατήρησή τους σε πλωτούς κλωβούς και η μεταφορά τους στις εγκαταστάσεις των σταθμών λίγο πριν την περίοδο ωοτοκίας, για τη λήψη των αυγών. Η πιο συχνή όμως τακτική είναι η διατήρηση αυτών σε μόνιμες εγκαταστάσεις των ιχθυογεννητικών σταθμών. Διαφορές υπάρχουν επίσης και στον τρόπο διαχείρισης των γεννητόρων της τσιπούρας. Δύο πρακτικές είναι γνωστές. Η πρώτη ακολουθεί την ετήσια προσθήκη ψαριών μικρής ηλικίας σε υπάρχουσες ομάδες γεννητόρων, ώστε να εξασφαλίζεται η ύπαρξη αρσενικών ψαριών. Σύμφωνα με τη δεύτερη, η αρχική ομάδα γεννητόρων παραμένει ανέπαφη, με σκοπό να επιτευχθεί εσωτερικά, με κοινωνικά κριτήρια η ισορροπία του πληθυσμού. Το χρονικό διάστημα διατήρησης ενός πληθυσμού με σκοπό τη λήψη των αυγών αυτού, κυμαίνεται από 915 χρόνια. Η ωοτοκία κάθε πληθυσμού διαρκεί περίπου 3-4 μήνες και κατά την περίοδο αυτή μπορούν να παραχθούν αυγά ανά κιλό βάρους θηλυκού και ανά ημέρα. Τα αυγά συλλέγονται με υπερχείλιση της δεξαμενής των γεννητόρων μέσα σε φίλτρο με άνοιγμα ματιού μm

90 Η τσιπούρα σχηματίζει κοπάδια πολυμελή ή ολιγομελή, ενώ κάποιες φορές, μεγάλα θηλυκά άτομα μπορεί να βρεθούν να κυνηγούν μόνα τους για μια περίοδο. Τα βάθη που κινούνται συνήθως είναι μέχρι τα 40 μέτρα, ενώ το μεγαλύτερο βάθος που έχει εντοπιστεί ψάρι είναι τα 150 μέτρα. Το ψάρι είναι ευρύαλο και ευρύθερμο, αντέχει δηλαδή σε μεγάλες μεταβολές αλατότητας και θερμοκρασίας του νερού. Αυτό καθορίζει σε πολύ μεγάλο βαθμό τον τρόπο ζωής του, καθώς και πού απαντάται. Πιο συγκεκριμένα, η τσιπούρα μπορεί να βρεθεί όχι μόνο στη θάλασσα, αλλά και κοντά σε εκβολές ποταμών, μέσα σε λιμνοθάλασσες και μέσα σε ποτάμια σε κοντινή απόσταση από τη θάλασσα. Πιο συγκεκριμένα βρίσκεται συνήθως σε επίπεδους βυθούς με τραγάνα, λάσπη ή φύκια καθώς και σε λιβάδια ποσειδωνίας. Προτιμά αυτούς τους βιοτόπους, γιατί εκεί βρίσκει πιο εύκολα την τροφή της, η οποία αποτελείται από όστρακα κυρίως, όπως μύδια, στρείδια και κυδώνια, και πιο σπάνια από θαλάσσια φυτά και φύκη. Θα βρεθεί επίσης να κινείται και σε βυθούς, με πέτρες και πλάκες (όπου μπορεί και να βραχώσει), που συνορεύουν με τα προαναφερθέντα περιβάλλοντα. Η τσιπούρα είναι ένα είδος με υψηλή οικονομική σημασία ιδιαίτερα στο μεσογειακό χώρο. Το γεγονός αυτό οδήγησε σε εκτενείς μελέτες, όσον αφορά στη βιολογία της. Η εκτροφή της τσιπούρας άρχισε στις αρχές της δεκαετίας του Το 1998 η παραγωγή τσιπούρας στην περιοχή της Μεσογείου έφτασε τα 163 εκατομμύρια ιχθύδια και τους τόνους. Τα αποτελέσματα αυτά οφείλονται στην ανάπτυξη αποτελεσματικών τεχνικών και μεθοδολογιών εκτροφής ιδιαίτερα κατά τα πρώτα αναπτυξιακά στάδια. Σήμερα, οι γνώσεις σχετικά με την ηθολογία, τη μορφολογία, την ανάπτυξη, την αναπαραγωγική βιολογία και φυσιολογία της τσιπούρας είναι αρκετά καλές για να θεωρηθεί πλέον οργανισμός-μοντέλο για την οικογένεια των Σπαριδών. [39 42]

91 6.13 ΣΟΛΟΜΟΣ (SALMO SALAR) Σχήμα 6.7: Σολομός. Φύλο: Χορδωτά Κλάση: Οστεϊχθύες Υφομοταξία: Ακτινοπτερύγιοι Υπέρταξη: Τελεόστεοι Τάξη: Ισοσπόνδυλα Οικογένεια: Σαλμονίδες Γένος: Salar Ο σολομός, όπως φαίνεται και στο σχήμα 6.7, θεωρείται ένα ιδιαίτερο ψάρι, καθώς ζει και μεγαλώνει στη θάλασσα και αναπαράγεται σε λίμνες και ποτάμια, με ένα κύκλο ζωής που φτάνει τα 2 έως 7 έτη. Πιο συγκεκριμένα, γεννιέται και αναπτύσσεται σε γλυκό νερό, ωριμάζει σε αλμυρό νερό (το μεγαλύτερο μέρος της ζωής του) και τέλος γεννά και πεθαίνει πάλι σε νερό λίμνης ή ποταμού (εκεί που γεννήθηκε). Το ταξίδι της επιστροφής του είναι εξαιρετικά δύσκολο, επίπονο και επικίνδυνο, ενώ η απόσταση που καλείται να καλύψει αγγίζει τα 1000 μίλια. Διακρίνεται σε 2 μεγάλες κατηγορίες: (α) του Ειρηνικού ωκεανού και (β) του Ατλαντικού ωκεανού, επιμεριζόμενος σε 5 υπο κατηγορίες. Στις μέρες μας, η μεγαλύτερη ποσότητα σολομού αλιεύεται στα νερά της Αλάσκας, του Βορειοδυτικού Ειρηνικού, του Καναδά, της Νορβηγίας και της Γροιλανδίας. Όσον αφορά στην καλλιέργεια σολομού, οι χώρες που επιδίδονται κατεξοχήν στην παραγωγή και εν συνεχεία στην εμπορία του είναι η Χιλή, η Νορβηγία, η Σκωτία και ο Καναδάς. Το μέγεθός του ποικίλλει, καθώς ξεκινά από μερικά κιλά και μπορεί να φθάσει ακόμα και τα 55 κιλά βάρος, ενώ το χρώμα του αποτελεί μια ευρεία παλέτα τονικών αποδόσεων του κόκκινου και του πορτοκαλί. Πιο συγκεκριμένα, το κόκκινο-ροζ χρώμα του σολομού οφείλεται σε μια χρωστική ουσία που ονομάζεται ασταξανθίνη. Η χημική της δομή είναι παρόμοια με αυτή της βιταμίνης Α και του β-καροτενίου και είναι προϊόν παρασκευής διάφορων ειδών πλαγκτού και άλγεων. Πρόκειται για μια ουσία, η οποία μέσω της τροφικής αλυσίδας καταλήγει στο λιπώδη ιστό του σολομού και εφόσον δεν υπόκειται σε αποχρωματισμό, του προσδίδει, μόνιμα πια, το κοκκινωπό του χρώμα. Αποτελεί φυσική πηγή θρεπτικών ουσιών, ιδιαίτερα ισορροπημένων και απορροφήσιμων πρωτεϊνών, ενώ περιέχει σε σημαντικές ποσότητες, βιταμίνες, μέταλλα, ιχνοστοιχεία και ω-3 λιπαρά οξέα. [43]

92 Εκτροφή σολομού Παρά το γεγονός πως ο ερυθρός σολομός -με τεχνητό χρώμα- είναι το πιο διαδεδομένο είδος σολομού στις αγορές της Δύσης, ωστόσο, δεν είναι ευρέως γνωστή, η ανεξέλεγκτη καταστροφή που προκαλεί η συγκεκριμένη βιομηχανοποιημένη δραστηριότητα στις περιοχές όπου εκτρέφεται. Με μεγάλους ρυθμούς επέκτασης, οι ιχθυοκαλλιέργειες καλύπτουν σήμερα το 30% της συνολικής πρωτεΐνης που λαμβάνεται από την ετήσια κατανάλωση ψαριού σε παγκόσμιο επίπεδο. Ωστόσο, ευθύνονται αποκλειστικά για την καταστροφή αναρίθμητων οικοσυστημάτων και των πληθυσμών που εξαρτώνται από αυτά, σε μερικές από τις πιο ευαίσθητες περιοχές του πλανήτη. Η εκτροφή του σολομού συμπεριλαμβάνει την πάχυνση τεράστιων αριθμών ψαριών σε κλουβιά από δίχτυ. Ένα συνηθισμένο ιχθυοτροφείο μπορεί να περιλαμβάνει μέχρι και δώδεκα κλουβιά με δέκα έως και 15 χιλιάδες ψάρια στο κάθε ένα από αυτά. [44, 45] Εντατική εκτροφή Οι απαιτήσεις σε τροφή των σαρκοφάγων ψαριών, όπως είναι ο σολομός ή ο τόνος διαψεύδουν το διαδεδομένο μύθο πως η συστηματική ιχθυοκαλλιέργεια προσφέρει λύση στην υπεραλίευση. Για την αύξηση του βάρους ενός κιλού σολομού χρειάζονται 5 κιλά λιπαρών ψαριών, όπως είναι οι ρέγγες, τα χέλια, οι σαρδέλες και τα σκουμπριά που θα υποστούν επεξεργασία για να καταλήξουν σε ιχθυοτροφή. Τα ψάρια αυτά κυριολεκτικά τα ρουφούν από τη θάλασσα, με αποτέλεσμα να διαταράσσεται η ισορροπία των θαλάσσιων οικοσυστημάτων. Στη Βρετανική Κολομβία, τον Καναδά και τη Χιλή οι όρκες, τα δελφίνια, οι φώκιες και τα θαλάσσια λιοντάρια που μέχρι πρόσφατα σύχναζαν στις εκβολές ποταμών, θανατώνονται, αιχμαλωτίζονται, στερούνται την τροφή ή απλώς απομακρύνονται με διάφορα τεχνάσματα που επινοούν οι ιχθυοτρόφοι προκειμένου να προστατέψουν την παραγωγή τους. [44, 45] Ασθένειες Όπως και σε κάθε περίπτωση εντατικής εκτροφής ζώων ή ψαριών, η συσσώρευση πολλών σολομών στα κλουβιά, ευνοεί τη διάδοση ασθενειών. Η τακτική χορήγηση αντιβιοτικών στα ψάρια των ιχθυοτροφείων με την τροφή τους για να προστατεύονται από τις ασθένειες οδηγεί στη δημιουργία βακτηρίων ανθεκτικών στα αντιβιοτικά, τα οποία συσσωρεύονται σε ιζήματα κάτω από τα κλουβιά. Αυτά τα βακτήρια μπορούν να αποδειχθούν

93 επικίνδυνα, τόσο για τους καταναλωτές, όσο και για το οικοσύστημα όπου τοποθετούνται αυτά τα κλουβιά. Ένα συνηθισμένο ιχθυοτροφείο σολομού δυναμικότητας ψαριών παράγει περίπου την ίδια ποσότητα περιττωμάτων όση και μία πόλη ανθρώπων. Η απόρριψη αυτού του βλαβερού μίγματος στο νερό που βρίσκεται γύρω από τα ιχθυοτροφεία απειλεί άμεσα την επιβίωση των μικρότερων ειδών του σολομού, των αρπακτικών πουλιών που τρέφονται από αυτά καθώς και το μέλλον των αειφόρων μεθόδων αλιείας, αλλά και των κοινωνιών που εξαρτώνται από τις καθαρές και υγιείς θάλασσες. [44, 45]

94 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΝΟΜΟΘΕΣΙΑ ΓΙΑ ΤΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΑ ΠΡΟΙΟΝΤΑ 7.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τις τελευταίες δεκαετίες, το διεθνές εμπόριο των προϊόντων ιχθυοκαλλιέργειας έχει αυξηθεί συνεχώς, και αυτή η θετική τάση αναμένεται να συνεχιστεί και στο μέλλον. Η ποικιλία των εκτρεφόμενων υδρόβιων ειδών έχει μεγαλώσει πολύ, όπως φαίνεται και στο προηγούμενο κεφάλαιο. Ταυτόχρονα όμως έχει παρατηρηθεί αύξηση στις ασθένειες, λόγω της εντατικής ιχθυοκαλλιέργειας και της παγκοσμιοποίησης της αγοράς, οπότε έχει γίνει πιο διαδεδομένη η χρήση των κτηνιατρικών φαρμάκων και διαφόρων χημικών ουσιών. Σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή νομοθεσία ως φαρμακευτικό ιδιοσκεύασμα νοείται κάθε φάρμακο παρασκευασμένο εκ των προτέρων, που τίθεται στην κυκλοφορία υπό ειδική ονομασία και σε ιδιαίτερη συσκευασία. Θεωρείται επίσης κτηνιατρικό φάρμακο κάθε ουσία ή σύνθεση ουσιών που χαρακτηρίζεται ως έχουσα θεραπευτικές ή προληπτικές ιδιότητες έναντι ασθενειών στα ζώα. Θεωρείται, ομοίως, ως κτηνιατρικό φάρμακο, κάθε ουσία ή σύνθεση ουσιών που δύναται να χορηγηθεί σε ζώο, με σκοπό να γίνει ιατρική διάγνωση ή να αποκατασταθούν, να βελτιωθούν ή να τροποποιηθούν φυσιολογικές λειτουργίες στο ζώο. [46] Τα αντιβιοτικά όμως που χρησιμοποιούνται συχνά στην ιχθυοκαλλιέργεια, ως πρόσθετες ουσίες των ιχθυοτροφών, και επίσης ως προφυλακτικοί και θεραπευτικοί παράγοντες, συνιστούν πιθανό κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία. Ο κύριος κίνδυνος προκύπτει από τη συνεχώς αυξανόμενη βακτηριακή αντίσταση σε ολοένα και περισσότερα αντιβιοτικά καθώς και από την εμφάνιση αλλεργικών αντιδράσεων σε αυτά. Έτσι, η Ευρωπαϊκή Επιτροπή καθώς και τα επιμέρους κράτη-μέλη, προσπαθώντας να διασφαλίσουν την ασφάλεια και την υγιεινή των τροφίμων, συμπεριλαμβανομένου και των αλιευμάτων, καθώς και την προστασία της υγείας του Ευρωπαΐου καταναλωτή, προχώρησαν αρχικά στη δημιουργία της Ευρωπαϊκής Αρχής για την ασφάλεια των τροφίμων (European Food Safety Authority-EFSA), καθώς και στην αναδιοργάνωση της κοινοτικής νομοθεσίας και των εθνικών νομοθεσιών. Επί του παρόντος βρίσκονται σε ισχύ διάφορες κοινοτικές οδηγίες περί ασφάλειας των τροφίμων, μερικές από τις οποίες σχετίζονται με τη χρήση αντιβιοτικών στις ιχθυοκαλλιέργειες και την ανίχνευση των καταλοίπων τους σε εδώδιμους ιστούς στους ιχθύες. Επίσης προχώρησαν στη δημιουργία οργανισμών υπεύθυνων για την ασφάλεια των τροφίμων σε κάθε κράτος-μέλος, οι οποίοι είναι υποχρεωμένοι να συνεργάζονται μεταξύ τους

95 7.2 ΝΟΜΟΘΕΣΙΑ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΙΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ ΓΙΑ ΤΑ ΚΑΤΑΛΟΙΠΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ Η Ευρωπαϊκή Ένωση διαθέτει μια ολοκληρωμένη στρατηγική για την ασφάλεια των τροφίμων, η οποία καλύπτει επίσης την υγεία και την καλή μεταχείριση των ζώων. Η στρατηγική αυτή διασφαλίζει τη δυνατότητα ανίχνευσης των τροφίμων σε όλη την πορεία τους, από τη μονάδα παραγωγής, μέχρι το τραπέζι του καταναλωτή. Αυστηρά πρότυπα εφαρμόζονται, τόσο στα προϊόντα που παράγονται στην Ευρωπαϊκή Ένωση, όσο και σε αυτά που εισάγονται από άλλες χώρες. Οι βασικές συνιστώσες της στρατηγικής της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τα τρόφιμα είναι: η νομοθεσία για την ασφάλεια των τροφίμων και των ζωοτροφών, οι έγκυρες επιστημονικές συμβουλές, στις οποίες βασίζονται οι αποφάσεις και τα μέτρα επιβολής και ελέγχου. Η νομοθεσία καλύπτει ένα ευρύ πεδίο από τις ζωοτροφές και τα τρόφιμα, έως την υγιεινή των τροφίμων. Εφαρμόζει δε τα ίδια αυστηρά πρότυπα σε όλη την Ευρωπαϊκή Ένωση. Οι γενικοί κανόνες για όλα τα τρόφιμα και τις ζωοτροφές συμπληρώνονται από μέτρα σε τομείς, στους οποίους απαιτείται ιδιαίτερη προστασία για τον καταναλωτή, όπως είναι και η χρήση αντιβιοτικών ουσιών. Αν και το πλαίσιο για την ασφάλεια των τροφίμων είναι κοινό σε επίπεδο Ευρωπαϊκής Ένωσης, λαμβάνει, ωστόσο, υπόψη τη μεγάλη ποικιλία προϊόντων κάθε χώρας. Η Ευρωπαϊκή Ένωση μεριμνά, ώστε τα πρότυπα που θεσπίζει να μην εκτοπίζουν τα παραδοσιακά τρόφιμα από την αγορά, να μην καταπνίγουν την καινοτομία, χωρίς παράλληλα να θίγεται η ποιότητα. Όταν νέες χώρες γίνονται μέλη της Ευρωπαϊκής Ένωσης και, συνεπώς, εισέρχονται στην ενιαία αγορά αυτής, θεσπίζονται συχνά μεταβατικά μέτρα προκειμένου να τους δοθεί η δυνατότητα να συμμορφωθούν με τα αυστηρότερα πρότυπα της Ένωσης, όσον αφορά στην ασφάλεια τροφίμων. Ωστόσο, σε αυτό το διάστημα, τα τρόφιμα που δεν πληρούν τα πρότυπα της Ευρωπαϊκής Ένωσης δε μπορούν να εξαχθούν σε άλλες χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Για την έγκαιρη επίλυση προβλημάτων που προκαλούν τα ανασφαλή τρόφιμα, η Ευρωπαϊκή Ένωση εφαρμόζει ένα σύστημα έγκαιρης προειδοποίησης, ώστε να προλαμβάνεται ο κίνδυνος τροφικών δηλητηριάσεων των καταναλωτών. Το σύστημα αυτό εντοπίζει επίσης τα τρόφιμα που περιέχουν απαγορευμένες ουσίες ή υπερβολικές ποσότητες ουσιών υψηλού κινδύνου, όπως κατάλοιπα κτηνιατρικών φαρμάκων στα κτηνοτροφικά προϊόντα (εδώδιμοι ιστοί, γαλακτοκομικά, αυγά) και προϊόντα ιχθυοκαλλιέργειας

96 Όταν εντοπίζεται κίνδυνος, σήματα κινδύνου εκπέμπονται σε όλη την Ευρωπαϊκή Ένωση. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μπορεί να αρκεί η διακοπή μιας μόνο παρτίδας προϊόντος, αλλά, αν χρειαστεί, αναστέλλονται όλες οι αποστολές ενός συγκεκριμένου προϊόντος, ή ακόμη αποσύρονται προϊόντα που βρίσκονται ήδη σε αποθήκες και καταστήματα. Η Επιτροπή ελέγχει την εφαρμογή της κοινοτικής νομοθεσίας για τις ζωοτροφές και τα τρόφιμα, εξετάζοντας αν η κοινοτική νομοθεσία έχει ενσωματωθεί ορθά στην εθνική νομοθεσία και εφαρμόζεται σε όλες τις χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης και διενεργώντας επιτόπιες επιθεωρήσεις, τόσο στις χώρες της Ένωσης, όσο και σε άλλες χώρες. [47] Από τις οδηγίες, τους κανονισµούς και τις αποφάσεις της Ευρωπαϊκής Ένωσης που ισχύουν µέχρι και σήµερα για τα τρόφιµα, σηµαντικότερες είναι η οδηγία 89/397/EC, σχετικά µε τον επίσηµο έλεγχο των τροφίµων, ο κανονισµός 90/2377/EC, σχετικά µε τον καθορισµό ανώτατων ορίων καταλοίπων κτηνιατρικών φαρµάκων στα τρόφιµα ζωϊκής προέλευσης, ο οποίος έχει αντικατασταθεί από τον κανονισμό 37/2010/EC, η οδηγία 96/23/EC, για τη λήψη µέτρων ελέγχου για ορισµένες ενώσεις και τα κατάλοιπά τους σε ζώντα ζώα και στα προϊόντά τους και η απόφαση 657/2002/EC για την επίδοση των αναλυτικών µεθόδων και την ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Οι τελευταίες τρεις οδηγίες εστιάζονται κυρίως στο θέµα των καταλοίπων κτηνιατρικών φαρµάκων σε τρόφιµα ζωϊκής προέλευσης και στον ορισµό των κριτηρίων για την επικύρωση των αντίστοιχων αναλυτικών µεθόδων που εφαρµόζονται. [48, 49, 50, 51] Έτσι, με βάση την οδηγία 90/2377/EC, η Ευρωπαϊκή Επιτροπή εκτιμώντας: ότι η χορήγηση κτηνιατρικών φαρμάκων σε ζώα παραγωγής τροφίμων μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την παρουσία καταλοίπων στα τρόφιμα που προέρχονται από τα ζώα, στα οποία έχουν χορηγηθεί τα φάρμακα αυτά, ότι η επιστημονική και τεχνική πρόοδος επιτρέπει να ανιχνεύεται η παρουσία καταλοίπων κτηνιατρικών φαρμάκων στα τρόφιμα σε όλο και χαμηλότερες συγκεντρώσεις, πρέπει κατά συνέπεια να θεσπιστούν ανώτατα όρια καταλοίπων των φαρμακολογικώς ενεργών ουσιών που χρησιμοποιούνται στα κτηνιατρικά φάρμακα, για όλα τα τρόφιμα ζωϊκής προέλευσης, συμπεριλαμβανομένου και των ιχθύων, ότι, για να προστατεύεται η δημόσια υγεία, τα ανώτατα όρια καταλοίπων πρέπει να καθορίζονται σύμφωνα με γενικώς αναγνωρισμένες αρχές για την αξιολόγηση της ασφάλειας και με βάση οποιαδήποτε άλλη επιστημονική αξιολόγηση της ασφάλειας των σχετικών ουσιών, η οποία πραγματοποιείται από διεθνείς οργανισμούς, και ιδίως στο πλαίσιο του Codex Alimentarius, ή, αν οι ουσίες αυτές χρησιμοποιούνται για άλλους σκοπούς, από άλλες κοινοτικές επιστημονικές επιτροπές,

97 ότι η θέσπιση των ανώτατων ορίων καταλοίπων θα διευκολύνει την εμπορία των τροφίμων ζωϊκής προέλευσης, ότι ο καθορισμός διαφορετικών ανώτατων ορίων καταλοίπων από τα κράτη μέλη μπορεί να εμποδίσει την ελεύθερη κυκλοφορία των ίδιων των τροφίμων και των κτηνιατρικών φαρμάκων, ότι, κατά συνέπεια, πρέπει να θεσπισθεί, σε κοινοτικό επίπεδο, μια διαδικασία για τον καθορισμό των ανώτατων ορίων των καταλοίπων κτηνιατρικών φαρμάκων, η οποία θα συνίσταται σε μια και μόνη επιστημονική αξιολόγηση του καλύτερου δυνατού επιπέδου, ότι η ανάγκη να καθοριστούν ανώτατα όρια καταλοίπων, σε κοινοτικό επίπεδο, αναγνωρίζεται από τους κοινοτικούς κανόνες που διέπουν το εμπόριο τροφίμων ζωϊκής προέλευσης, ότι πρέπει να θεσπισθούν διατάξεις για το συστηματικό καθορισμό ανώτατων ορίων καταλοίπων για τις νέες ουσίες με φαρμακολογική δράση, οι οποίες χορηγούνται στα ζώα, από τα οποία παρασκευάζονται τρόφιμα, ότι πρέπει, επίσης, να θεσπισθούν διατάξεις για τον καθορισμό ανώτατων ορίων καταλοίπων για τις ουσίες που χρησιμοποιούνται ήδη ευρέως στα κτηνιατρικά φάρμακα που χορηγούνται στα ζώα παραγωγής τροφίμων, ότι, μετά από την επιστημονική τους αξιολόγηση από την επιτροπή κτηνιατρικών φαρμάκων, τα ανώτατα όρια καταλοίπων πρέπει να θεσπίζονται με μια σύντομη διαδικασία που θα εγγυάται στενή συνεργασία της Επιτροπής με τα κράτη μέλη στο πλαίσιο της επιτροπής που συστήθηκε με την οδηγία 81/852/EC, περί προσεγγίσεως των νομοθεσιών των κρατών μελών σχετικά με τα αναλυτικά, φαρμακοτοξικολογικά και κλινικά πρότυπα και πρωτόκολλα στον τομέα του ελέγχου των κτηνιατρικών φαρμακευτικών προϊόντων, όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 87/20/EC, ότι απαιτείται, επίσης, μια επείγουσα διαδικασία για να εξασφαλίζεται η ταχεία επανεξέταση κάθε ορίου ανοχής που αποδεικνύεται ανεπαρκές για την προστασία της δημόσιας υγείας, ότι η ανοσολογική αντίδραση που προκαλείται από τη χρήση φαρμάκων δε διαφέρει συνήθως από την αντίστοιχη αντίδραση που προκαλείται φυσιολογικά και δε μπορεί να επηρεάσει τους καταναλωτές τροφίμων ζωϊκής προέλευσης, ότι οι πληροφορίες που είναι αναγκαίες για την αξιολόγηση της ασφάλειας των καταλοίπων πρέπει να υποβάλλονται σύμφωνα με τις αρχές που καθορίζονται στην οδηγία 81/852/EC,

98 εξέδωσε τον παρόντα κανονισμό, για τους σκοπούς του οποίου, εφαρμόζονται οι ακόλουθοι ορισμοί: Ως «κατάλοιπα κτηνιατρικών φαρμάκων», ορίζονται όλες οι φαρμακολογικώς ενεργές ουσίες, είτε πρόκειται για ενεργά συστατικά, είτε για έκδοχα, είτε για προϊόντα αποικοδόμησης, καθώς και τα προϊόντα μεταβολισμού τους που παραμένουν στα τρόφιμα που λαμβάνονται από ζώα, στα οποία χορηγήθηκε το εν λόγω κτηνιατρικό φάρμακο. Ως «ανώτατο όριο καταλοίπων» (Maximum Residue Limit, MRL) ορίζεται η μέγιστη συγκέντρωση καταλοίπων που προκύπτει από τη χρήση κτηνιατρικού φαρμάκου (εκφραζόμενη σε mg/kg ή σε μg/kg με βάση το βάρος του νωπού προϊόντος), η οποία μπορεί να θεωρείται ως νομίμως επιτρεπτή από την Κοινότητα ή να αναγνωρίζεται ως αποδεκτή εντός ή επί τροφίμου. Το εν λόγω όριο βασίζεται στον τύπο και την ποσότητα καταλοίπων που θεωρείται ότι δε συνεπάγονται τοξικολογικό κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία, όπως εκφράζονται με την παραδεκτή ημερήσια δόση, ή σε προσωρινή παραδεκτή ημερήσια δόση που χρησιμοποιεί πρόσθετο παράγοντα ασφαλείας. Το όριο αυτό λαμβάνει επίσης υπόψη άλλους κινδύνους για τη δημόσια υγεία, καθώς και την τεχνολογία τροφίμων και επίσης μπορεί να μειώνεται, ώστε να συμβιβάζεται με την ορθή πρακτική κατά τη χρήση κτηνιατρικών φαρμάκων και στο βαθμό που υφίστανται πρακτικές αναλυτικές μέθοδοι. Ο κατάλογος των φαρμακολογικώς ενεργών ουσιών που χρησιμοποιούνται στα κτηνιατρικά φάρμακα για τις οποίες έχουν καθορισθεί ανώτατα όρια καταλοίπων αποτελεί το αντικείμενο του παραρτήματος Ι. Εάν μετά την αξιολόγηση μιας φαρμακολογικώς ενεργής ουσίας που χρησιμοποιείται σε κτηνιατρικά φάρμακα, δεν κρίνεται αναγκαίο για την προστασία της δημόσιας υγείας να θεσπισθεί ανώτατο όριο καταλοίπων, η εν λόγω ουσία εγγράφεται σε κατάλογο που αποτελεί το αντικείμενο του παραρτήματος ΙΙ. Για φαρμακολογικώς ενεργή ουσία που χρησιμοποιείται σε κτηνιατρικά φάρμακα κατά την ημερομηνία έναρξης της ισχύος του παρόντος κανονισμού, μπορεί να θεσπίζεται προσωρινό ανώτατο όριο καταλοίπων εφόσον δεν υπάρχουν υπόνοιες, ότι τα κατάλοιπα της συγκεκριμένης ουσίας, στο προτεινόμενο επίπεδο, αποτελούν κίνδυνο για την υγεία των καταναλωτών. Ένα προσωρινό ανώτατο όριο καταλοίπων εφαρμόζεται για καθορισμένη χρονική περίοδο που δε μπορεί να υπερβαίνει τα πέντε έτη, μπορεί δε να παρατείνεται εξαιρετικά μόνο μία φορά, για χρονική περίοδο που δεν υπερβαίνει τα δύο έτη, εφόσον αυτό κρίνεται χρήσιμο για την ολοκλήρωση διεξαγόμενων επιστημονικών μελετών. Σε εξαιρετικές περιπτώσεις, είναι δυνατό να θεσπίζεται προσωρινό ανώτατο όριο καταλοίπων για φαρμακολογικώς ενεργή ουσία που δε χρησιμοποιείται σε κτηνιατρικά

99 φάρμακα κατά την ημερομηνία έναρξης της ισχύος του παρόντος κανονισμού, εφόσον δεν υπάρχουν υπόνοιες ότι τα κατάλοιπα της συγκεκριμένης ουσίας, στο προτεινόμενο όριο, αποτελούν κίνδυνο για την υγεία των καταναλωτών. Ο κατάλογος των φαρμακολογικώς ενεργών ουσιών που χρησιμοποιούνται σε κτηνιατρικά φάρμακα, για τις οποίες έχουν θεσπισθεί προσωρινά ανώτατα όρια καταλοίπων, περιλαμβάνεται στο παράρτημα ΙΙΙ. Εάν δεν είναι δυνατόν να καθορισθεί ανώτατο όριο καταλοίπων για μία φαρμακολογικώς ενεργή ουσία που χρησιμοποιείται σε κτηνιατρικά φάρμακα, επειδή τα κατάλοιπα των εν λόγω ουσιών, ανεξάρτητα από το όριό τους, σε τρόφιμα ζωϊκής προέλευσης, αποτελούν κίνδυνο για την υγεία των καταναλωτών, η ουσία αυτή εγγράφεται σε κατάλογο που αποτελεί το αντικείμενο του παραρτήματος IV. Η χορήγηση των ουσιών του παραρτήματος IV σε ζώα παραγωγής τροφίμων απαγορεύεται σε όλη την Κοινότητα. Τα κράτη μέλη δε μπορούν να απαγορεύουν ή να εμποδίζουν την κυκλοφορία, στο έδαφός τους, τροφίμων ζωϊκής προέλευσης που κατάγονται από άλλα κράτη μέλη, με το αιτιολογικό ότι περιέχουν κατάλοιπα κτηνιατρικών φαρμάκων, εάν η ποσότητα των καταλοίπων αυτών δεν υπερβαίνει το ανώτατο όριο καταλοίπων που προβλέπεται στα παραρτήματα Ι ή ΙΙΙ, ή εφόσον η συγκεκριμένη ουσία περιλαμβάνεται στο παράρτημα ΙΙ. Στον πίνακα 7.1 δίνονται τα ανώτατα όρια καταλοίπων (MRLs) για τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή, με βάση τον κανονισμό 90/2377 της ευρωπαϊκής νομοθεσίας. Τα αντίστοιχα όρια στο νέο κανονισμό 37/2010/EC δεν έχουν μεταβληθεί. [49, 52, 53] Πίνακας 7.1: Τα ανώτατα όρια καταλοίπων για τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν, με βάση την Ευρωπαϊκή νομοθεσία. Φαρμακολογικώς ενεργή ουσία Ανώτατα όρια Κατάλοιπο-δείκτης Ζωϊκά είδη καταλοίπων MRLs (μg/kg)* Κινολόνες Ντανοφλοξακίνη Ντανοφλοξακίνη Όλα τα είδη παραγωγής τροφίμων 100 Συνδυασμός ενροφλοξακίνης και Όλα τα είδη παραγωγής σιπροφλοξακίνης τροφίμων Οξολονικό οξύ Οξολονικό οξύ Ιχθείς 100 Σαραφλοξακίνη Σαραφλοξακίνη Σαλμονίδες 30 Ενροφλοξακίνη

100 Πίνακας 7.1: Συνέχεια. Φαρμακολογικώς ενεργή ουσία Φλουμεκίνη Ανώτατα όρια Κατάλοιπο-δείκτης Ζωϊκά είδη καταλοίπων MRLs (μg/kg)* Φλουμεκίνη Ιχθείς 600 Αμφαινικόλες Θειαμφαινικόλη Θειαμφαινικόλη Όλα τα είδη παραγωγής τροφίμων 50 Φλορφαινικόλη και Φλορφαινικόλη μεταβολίτες της μετρημένοι ως Ιχθείς 1000 φλορφαινικολαμίνη Πενικιλίνες Αμπικιλίνη Αμπικιλίνη Βενζυλοπενικιλίνη Βενζυλοπενικιλίνη Κλοξακιλίνη Κλοξακιλίνη Δικλοξακιλίνη Δικλοξακιλίνη Οξακιλίνη Οξακιλίνη Όλα τα είδη παραγωγής τροφίμων Όλα τα είδη παραγωγής τροφίμων Όλα τα είδη παραγωγής τροφίμων Όλα τα είδη παραγωγής τροφίμων Όλα τα είδη παραγωγής τροφίμων Τετρακυκλίνες Χλωροτετρακυκλίνη Οξυτετρακυκλίνη Τετρακυκλίνη Αρχικό φάρμακο και το 4- Όλα τα είδη παραγωγής επιμερές του τροφίμων Αρχικό φάρμακο και το 4- Όλα τα είδη παραγωγής επιμερές του τροφίμων Αρχικό φάρμακο και το 4- Όλα τα είδη παραγωγής επιμερές του τροφίμων * Με βάση την Ευρωπαϊκή νομοθεσία ως ιστός-στόχος στους ιχθύες νοείται μύες και δέρμα σε φυσικές αναλογίες

101 7.3 ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ Η κοινοτική οδηγία 657/2002/EC της Ευρωπαϊκής Επιτροπής καθορίζει με μεγάλη ακρίβεια τόσο τις απαιτήσεις που πρέπει να πληροί μια αναλυτική μέθοδος για να χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος επιβεβαίωσης στον έλεγχο καταλοίπων σε τρόφιμα ζωϊκής προέλευσης, όσο και τα στάδια επικύρωσής της Κοινά κριτήρια επίδοσης και απαιτήσεις για τις αναλυτικές μεθόδους Οι αναλυτικές µέθοδοι επιβεβαίωσης πρέπει, σε όσο το δυνατόν µεγαλύτερο βαθµό, να παρέχουν πληροφορίες για τη χηµική δοµή της προσδιοριζόμενης ένωσης. Όταν περισσότερες της µίας ενώσεις δίνουν την ίδια απάντηση, τότε η µέθοδος δε µπορεί να κάνει διάκριση µεταξύ αυτών των ενώσεων. Οι µέθοδοι που βασίζονται µόνο στη χρωµατογραφική ανάλυση, χωρίς να χρησιµοποιούν χρησιµοποιηθούν µόνες φασµατοµετρική τους ως µέθοδοι ανίχνευση, δεν επιβεβαίωσης. είναι Στις κατάλληλες περιπτώσεις, να όπου χρησιµοποιείται στη µέθοδο ένα κατάλληλο εσωτερικό πρότυπο, το πρότυπο αυτό πρέπει να προστίθεται στη δόση προς ανάλυση στην αρχή της διαδικασίας εκχύλισης. Ανάλογα µε το τι είναι διαθέσιµο, πρέπει να χρησιµοποιούνται, είτε σταθερές ραδιοεπισηµασµένες µορφές της προσδιοριζόμενης ένωσης, που είναι ιδιαιτέρως κατάλληλες για την ανίχνευση µε φασµατοµετρία µάζας, είτε ενώσεις που έχουν δοµική σχέση µε την προσδιοριζόμενη ένωση. Εάν δε µπορεί να χρησιµοποιηθεί κατάλληλο εσωτερικό πρότυπο, η ταυτοποίηση της προσδιοριζόμενης ένωσης πρέπει να επιβεβαιώνεται µε συγχρωµατογραφία, δηλαδή μια διαδικασία, κατά την οποία το εκχύλισμα πριν από τη χρωματογραφία μοιράζεται σε δύο μέρη. Το ένα μέρος υποβάλλεται σε χρωματογραφία όπως είναι, ενώ το δεύτερο μέρος αναμιγνύεται με την πρότυπη προσδιοριζόμενη ένωση που πρόκειται να μετρηθεί. Αυτό το αναμεμιγμένο διάλυμα εκχυλίσματος και πρότυπης προσδιοριζόμενης ένωσης υποβάλλεται σε χρωματογραφία. Η ποσότητα της προστιθέμενης πρότυπης προσδιοριζόμενης ένωσης πρέπει να είναι όμοια με την εκτιμώμενη ποσότητα της προσδιοριζόμενης ένωσης στο εκχύλισμα. Με την αέρια χρωµατογραφία ή την υγρή χρωµατογραφία, το εύρος της κορυφής στο ήµισυ του µεγίστου ύψους πρέπει να κυµαίνεται στο % του αρχικού εύρους, και οι χρόνοι συγκράτησης θα πρέπει να είναι οι ίδιοι µε περιθώριο 5%

102 Βασικό κριτήριο για όλες τις αναλυτικές τεχνικές είναι η ακρίβεια της μεθόδου. Ως ακρίβεια νοείται η εγγύτητα μεταξύ του αποτελέσματος μιας δοκιμής και της αποδεκτής τιμής αναφοράς και προσδιορίζεται μέσω της ορθότητας και της πιστότητας. Ως ορθότητα ή ακρίβεια νοείται η εγγύτητα μεταξύ της τιμής του μέσου όρου που λαμβάνεται από μια μεγάλη σειρά αποτελεσμάτων δοκιμών και της αποδεκτής τιμής αναφοράς. Η ορθότητα εκφράζεται συνήθως ως συστηματικό σφάλμα. Στον πίνακα 7.2 δίνεται το εύρος των αποδεκτών αποκλίσεων του πειραματικώς προσδιοριζόμενου μέσου κλάσματος μάζας με διόρθωση ανάκτησης από την πιστοποιημένη τιμή, στην περίπτωση που υπάρχουν επαναλαμβανόμενες αναλύσεις ενός πιστοποιημένου υλικού αναφοράς (CRM). Στην περίπτωση αντίθετα που δεν υπάρχει πιστοποιημένο υλικό αναφοράς, η αξιολόγηση της ορθότητας μπορεί να πραγματοποιηθεί με τον υπολογισμό της ανάκτησης προσθηκών γνωστών ποσοτήτων της προσδιοριζόμενης ένωσης σε ένα λευκό υπόστρωμα. Τα δεδομένα όμως που διορθώνονται με τη μέση ανάκτηση θα πρέπει και αυτά να βρίσκονται στις τιμές εύρους αποκλίσεων που δίνονται στον Πίνακα 7.2. Ως πιστοποιημένο υλικό αναφοράς (CRM) νοείται ένα υλικό, στο οποίο έχει αποδοθεί συγκεκριμένη περιεκτικότητα σε μία προσδιοριζόμενη ένωση. Πίνακας 7.2: Ελάχιστη ορθότητα ποσοτικών μεθόδων. Κλάσμα μάζας (μg/kg) Εύρος αποκλίσεων (%) 1-50 έως + 20 > 1 έως έως έως + 10 Ως πιστότητα νοείται η εγγύτητα μεταξύ των αποτελεσμάτων ανεξάρτητων δοκιμών υπό ρητά καθορισμένες (προκαθορισμένες) συνθήκες. Το μέτρο της πιστότητας εκφράζεται συνήθως με όρους μη πιστότητας και υπολογίζεται ως τυπική απόκλιση του αποτελέσματος της δοκιμής. Μικρότερη πιστότητα προσδιορίζεται με μια μεγαλύτερη τυπική απόκλιση. Για την εκτίμηση της πιστότητας μιας αναλυτικής μεθόδου, γίνονται επαναλαμβανόμενες αναλύσεις ενός πιστοποιημένου υλικού αναφοράς ή ενός εμβολιασμένου με την ένωση υλικού, τόσο υπό συνθήκες αναπαραγωγιμότητας και ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας, όσο και υπό συνθήκες επαναληψιμότητας. Ως συνθήκες αναπαραγωγιμότητας νοούνται οι συνθήκες υπό τις οποίες τα αποτελέσματα δοκιμών αποκτώνται με την ίδια μέθοδο επί ταυτόσημων τεμαχίων δοκιμής σε διαφορετικά εργαστήρια με διαφορετικούς χειριστές που χρησιμοποιούν διαφορετικό εξοπλισμό. Ως

103 ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα, νοείται η πιστότητα στο ίδιο εργαστήριο υπό ρητώς καθορισμένες συνθήκες (σχετικά π.χ. με μία μέθοδο, τα υλικά δοκιμής, τους χειριστές, το περιβάλλον) σε δικαιολογημένα μεγάλα χρονικά διαστήματα, ενώ ως συνθήκες επαναληψιμότητας νοούνται οι συνθήκες, υπό τις οποίες τα αποτελέσματα ανεξάρτητων δοκιμών αποκτώνται με την ίδια μέθοδο, επί ταυτόσημων τεμαχίων δοκιμής, στο ίδιο εργαστήριο, με τον ίδιο χειριστή που χρησιμοποιεί τον ίδιο εξοπλισμό. [51] Επικύρωση μιας αναλυτικής μεθόδου Κάθε αναλυτική μέθοδος θα πρέπει σύμφωνα με την οδηγία 657/2002/EC της Ευρωπαϊκής Επιτροπής να υφίσταται επικύρωση, έτσι ώστε τα αποτελέσματα που προκύπτουν να είναι αξιόπιστα. Ως επικύρωση ορίζεται η επιβεβαίωση κατόπιν εξέτασης και η προσκόμιση πραγματικών τεκμηρίων για το ότι πληρούνται οι ιδιαίτερες απαιτήσεις για μία συγκεκριμένη σκοπούμενη χρήση. Δηλαδή η επικύρωση μιας αναλυτικής μεθόδου έχει ως στόχο να αποδείξει, ότι η διαδικασία που έχει επιλεγεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση κάποιων ενώσεων είναι και η καταλληλότερη. Για να γίνει λοιπόν η επικύρωση μιας αναλυτικής μεθόδου, θα πρέπει να πραγματοποιηθούν μελέτες για την εξειδίκευση της μεθόδου, τη γραμμικότητά της, την ακρίβειά της, την επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητά της, την ανθεκτικότητά της, το εύρος, καθώς και τα όρια ανίχνευσης και ποσοστικού προσδιορισμού, έτσι ώστε να διασφαλιστεί η ποιότητα και η συγκρισιμότητα των αποτελεσμάτων. Σύμφωνα με την οδηγία 657/2002/EC της Ευρωπαϊκής Επιτροπής, ισχύουν οι παρακάτω ορισμοί: Ως ειδικότητα (εξειδίκευση) ορίζεται η ικανότητα μιας μεθόδου να διακρίνει μια μετρούμενη προσδιοριζόμενη ένωση από άλλες ενώσεις. Αυτό το χαρακτηριστικό είναι κατά κύριο λόγο συνάρτηση της χρησιμοποιούμενης τεχνικής μέτρησης, μπορεί όμως να ποικίλει ανάλογα με την κατηγορία της ένωσης ή του υποστρώματος. Ως ακρίβεια νοείται η εγγύτητα μεταξύ του αποτελέσματος μιας δοκιμής και της αποδεκτής τιμής αναφοράς. Προσδιορίζεται με τον προσδιορισμό ορθότητας και πιστότητας. Ως σφάλμα άλφα (α) νοείται η πιθανότητα να είναι συμμορφούμενο το δοκιμασθέν δείγμα, ακόμα και αν η μέτρηση κατέληξε σε μη συμμορφούμενα αποτελέσματα («ψευδής απόφαση περί μη συμμόρφωσης»)

104 Ως σφάλμα βήτα (β) νοείται η πιθανότητα να είναι αληθώς μη συμμορφούμενο το δοκιμασθέν δείγμα, ακόμα και αν η μέτρηση κατέληξε σε συμμορφούμενα αποτελέσματα («ψευδής απόφαση περί συμμόρφωσης»). Ως όριο απόφασης (CCα) νοείται το όριο, στο οποίο και πάνω από το οποίο, μπορεί να αποφασισθεί ότι ένα δείγμα είναι μη συμμορφούμενο με πιθανότητα σφάλματος α. Το όριο απόφασης πρέπει να καθοριστεί σύμφωνα με τις απαιτήσεις σχετικά με την ταυτοποίηση ή την ταυτοποίηση μαζί με ποσοτικό προσδιορισμό. Ως ικανότητα ανίχνευσης (CCβ) νοείται η μικρότερη περιεκτικότητα σε ουσία που μπορεί να ανιχνευθεί, να ταυτοποιηθεί ή/και να προσδιορισθεί ποσοτικώς σε ένα δείγμα με πιθανότητα σφάλματος β. Ως εμβολιασμένο υλικό δείγματος νοείται ένα δείγμα εμπλουτισμένο με γνωστή ποσότητα της ένωσης που πρόκειται να ανιχνευθεί. Ως εσωτερικό πρότυπο (Internal Standard - IS) νοείται μία ουσία που δεν περιέχεται στο δείγμα, με φυσικές και χημικές ιδιότητες, όσο το δυνατόν παρόμοιες με εκείνες της προσδιοριζόμενης ένωσης, που πρέπει να ταυτοποιηθεί και η οποία προστίθεται σε κάθε δείγμα, καθώς και σε κάθε πρότυπο βαθμονόμησης. Ως ανάκτηση νοείται το ποσοστό της αληθούς συγκέντρωσης μιας ένωσης που ανακτάται κατά την αναλυτική διαδικασία. Προσδιορίζεται κατά την επικύρωση, εάν δε διατίθεται πιστοποιημένο υλικό αναφοράς. Ως υλικό αναφοράς νοείται το υλικό, του οποίου μία ή περισσότερες ιδιότητες έχουν επιβεβαιωθεί με μία επικυρωμένη μέθοδο, έτσι ώστε αυτό να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη βαθμονόμηση συσκευής ή για την επαλήθευση μιας μεθόδου μέτρησης. Ως ανθεκτικότητα νοείται η επιδεκτικότητα μιας αναλυτικής μεθόδου σε αλλαγές των πειραματικών συνθηκών που μπορούν επίσης να πάρουν τη μορφή καταλόγου των υλικών του δείγματος, των προσδιοριζόμενων ενώσεων, των συνθηκών αποθήκευσης, των περιβαλλοντικών συνθηκών ή/και των συνθηκών προετοιμασίας του δείγματος, υπό τις οποίες, η μέθοδος μπορεί να εφαρμοσθεί, όπως παρουσιάστηκε ή με συγκεκριμένες ήσσονος σημασίας μεταβολές. Για όλες τις πειραματικές συνθήκες, οι οποίες μπορεί στην πράξη να υπόκεινται σε διακύμανση (π.χ. σταθερότητα των αντιδραστηρίων, σύνθεση του δείγματος, ph, θερμοκρασία), πρέπει να αναφέρεται κάθε μεταβολή που θα μπορούσε να επηρεάσει το αποτέλεσμα της ανάλυσης. Επομένως, τα χαρακτηριστικά επίδοσης που θα πρέπει να προσδιορίζονται κατά την επικύρωση μιας αναλυτικής μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό καταλοίπων κτηνιατρικών φαρμάκων σε προιόντα ζωϊκής προέλευσης, με βάση την οδηγία 657/2002/EC, είναι τα εξής:

105 Η ειδικότητα Η μέθοδος που χρησιμοποιείται θα πρέπει να είναι σε θέση να διακρίνει την προσδιοριζόμενη ένωση από άλλες ενώσεις υπό πειραματικές συνθήκες. Πρέπει να χρησιμοποιούνται στρατηγικές για την υπέρβαση τυχόν παρεμποδίσεων, με ενώσεις, όταν χρησιμοποιείται η προβλεφθείσα τεχνική μέτρησης, π.χ. ομόλογες ενώσεις, ανάλογες ενώσεις, μεταβολίτες του καταλοίπου που προσμετράται. Έχει πρωταρχική σημασία να διερευνάται η παρεμπόδιση που μπορεί να προκληθεί από συστατικά του υποστρώματος. Οι καμπύλες διακρίβωσης Για τη χάραξη μιας καμπύλης διακρίβωσης, επιλέγονται πέντε τουλάχιστον επίπεδα συγκεντρώσεων του καταλοίπου. Υπολογίζεται ο μαθηματικός τύπος της καμπύλης και περιγράφεται το εύρος της γραμμικής περιοχής. Η ανάκτηση Στην περίπτωση που δεν υπάρχει διαθέσιμο πιστοποιημένο υλικό αναφοράς, εμβολιάζονται έξι υποπολλαπλάσια δείγματα τυφλού υλικού με ποσότητα ίση με 0,5, 1 και 1,5 φορά το επιτρεπόμενο όριο. Τα δείγματα αναλύονται και υπολογίζεται η συγκέντρωση σε καθένα από αυτά. Η ανάκτηση υπολογίζεται με βάση τον εξής μαθηματικό τύπο: % ανάκτηση = μετρηθείσα συγκέντρωση 100 / συγκέντρωση εμβολιασμού Επίσης υπολογίζεται η μέση ανάκτηση και ο συντελεστής μεταβλητότητας για τα έξι αποτελέσματα σε κάθε επίπεδο. Η επαναληψιμότητα Για να εξακριβωθεί η επαναληψιμότητα της μεθόδου, ένα σύνολο δειγμάτων, με τα ίδια υποστρώματα εμβολιάζονται με την προσδιοριζόμενη ένωση με ποσότητα ίση με 0,5, 1 και 1,5 φορά το επιτρεπόμενο όριο. Σε κάθε επίπεδο συγκέντρωσης η ανάλυση πραγματοποιείται έξι φορές και τελικά υπολογίζονται οι συνολικές μέσες συγκεντρώσεις, καθώς και ο συντελεστής μεταβλητότητας. Η αντοχή Για να εξακριβωθεί η αντοχή, γίνονται μελέτες των συνεπειών της μεθόδου, ύστερα από λογικές μεταβολές ήσσονος σημασίας. Σκοπός είναι να βρεθούν οι παράγοντες που επηρεάζουν σημαντικά τα αποτελέσματα των αναλύσεων, έτσι ώστε να προσδιορίζονται σαφώς στο πρωτόκολλο της μεθόδου

106 Η ορθότητα Η ορθότητα μπορεί να βρεθεί μέσω ενός πιστοποιημένου υλικού αναφοράς. Στην περίπτωση που δεν υπάρχει αυτό, προσδιορίζεται η ανάκτηση. Η σταθερότητα Στο αποτέλεσμα μιας ανάλυσης μπορεί να παρατηρηθούν σημαντικές αποκλίσεις, όταν υπάρχει ανεπαρκής σταθερότητα της προσδιοριζόμενης ένωσης, ή των συστατικών του υποστρώματος στο δείγμα. Για το λόγο αυτό προσδιορίζεται η σταθερότητα της ένωσης, τόσο στο διάλυμά της, όσο και στο υπόστρωμα που μελετάται. Το όριο απόφασης CCα Στην περίπτωση ενώσεων, για τις οποίες έχει καθοριστεί επιτρεπόμενο όριο, το CC α μπορεί να καθοριστεί ως εξής: 1. Με τη διαδικασία της καμπύλης βαθμονόμησης σύμφωνα με το ISO Στην περίπτωση αυτή πρέπει να χρησιμοποιηθεί τυφλό υλικό, εμβολιασμένο κοντά στο επιτρεπόμενο όριο με ισοαπέχοντα βήματα. Αφού αναλυθούν τα δείγματα και γίνει η ταυτοποίηση, χαράσσεται η καμπύλη «σήμα/προστεθείσα συγκέντρωση». Η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στο επιτρεπόμενο όριο, συν 1,64 φορές την τυπική απόκλιση της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας ισούται με το όριο απόφασης (α = 5 %). 2. Αναλύοντας τουλάχιστον 20 τυφλά υλικά ανά υπόστρωμα, εμβολιασμένα με την προσδιοριζόμενη ένωση ή ενώσεις στο επιτρεπόμενο όριο. Η συγκέντρωση στο επιτρεπόμενο όριο συν 1,64 φορές την αντίστοιχη τυπική απόκλιση, ισούται με το όριο απόφασης (α = 5 %). Στην περίπτωση ενώσεων, για τις οποίες δεν έχει καθοριστεί επιτρεπόμενο όριο, το CCα μπορεί να καθοριστεί με δύο τρόπους: 1. Με τη διαδικασία της καμπύλης βαθμονόμησης σύμφωνα με το ISO Στην περίπτωση αυτή πρέπει να χρησιμοποιηθεί τυφλό υλικό, εμβολιασμένο στο ελάχιστο απαιτούμενο επίπεδο επίδοσης και επάνω από αυτό με ισοαπέχοντα βήματα. Αφού αναλυθούν τα δείγματα και ύστερα από την ταυτοποίησή τους, χαράσσεται η καμπύλη «σήμα/προστεθείσα συγκέντρωση». Η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στο σημείο τομής του άξονα των y συν 2,33 φορές την τυπική απόκλιση της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας του σημείου τομής ισούται με το όριο απόφασης. Αυτό ισχύει μόνο για ποσοτικές αναλύσεις (α = 1 %)

107 2. Αναλύοντας τουλάχιστον 20 τυφλά υλικά ανά υπόστρωμα, προκειμένου να υπολογιστεί ο λόγος του σήματος προς τον θόρυβο το χρονικό διάστημα, κατά το οποίο αναμένεται η προσδιοριζόμενη ένωση. Το τριπλάσιο του λόγου του σήματος προς το θόρυβο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως όριο απόφασης. Αυτό ισχύει για ποσοτικές και ποιοτικές αναλύσεις. [50, 52] Το όριο απόφασης CCβ Στην περίπτωση ενώσεων για τις οποίες δεν έχει καθοριστεί επιτρεπόμενο όριο, η ικανότητα ανίχνευσης είναι η χαμηλότερη συγκέντρωση, για την οποία μια μέθοδος είναι σε θέση να ανιχνεύσει αληθώς μολυσμένα δείγματα με στατιστική βεβαιότητα 1 β. Στην περίπτωση ενώσεων, για τις οποίες έχει καθοριστεί επιτρεπόμενο όριο, αυτό σημαίνει ότι η ικανότητα ανίχνευσης είναι η συγκέντρωση, στην οποία η μέθοδος είναι σε θέση να ανιχνεύει συγκεντρώσεις στο επιτρεπόμενο όριο με στατιστική βεβαιότητα 1 β. Στην περίπτωση ενώσεων, για τις οποίες έχει καθοριστεί επιτρεπόμενο όριο, το CCβ μπορεί να καθοριστεί ως εξής: 1. Με τη διαδικασία της καμπύλης βαθμονόμησης σύμφωνα με το ISO Στην περίπτωση αυτή πρέπει να χρησιμοποιηθεί αντιπροσωπευτικό τυφλό υλικό, που να είναι εμβολιασμένο κοντά στο επιτρεπόμενο όριο με ισοαπέχοντα βήματα. Αρχικά αναλύονται τα δείγματα και αφού ταυτοποιηθεί η προσδιοριζόμενη ένωση ή ενώσεις, έπειτα υπολογίζεται η τυπική απόκλιση της μέσης μετρηθείσας περιεκτικότητας στο όριο απόφασης. Η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στην τιμή του ορίου απόφασης, συν 1,64 φορές την τυπική απόκλιση της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας, ισούται με την ικανότητα ανίχνευσης (β = 5 %). 2. Αναλύοντας τουλάχιστον 20 τυφλά υλικά ανά υπόστρωμα, εμβολιασμένα με την αναλυτέα ουσία ή ουσίες στο όριο απόφασης. Η τιμή του ορίου απόφασης συν 1,64 φορές την αντίστοιχη τυπική απόκλιση ισούται με την ικανότητα ανίχνευσης (β = 5 %). Στην περίπτωση ενώσεων, για τις οποίες δεν έχει καθοριστεί επιτρεπόμενο όριο, το CC β μπορεί να καθοριστεί: 1. Με τη διαδικασία της καμπύλης βαθμονόμησης σύμφωνα με το ISO Στην περίπτωση αυτή πρέπει να χρησιμοποιηθεί αντιπροσωπευτικό τυφλό υλικό, που να είναι εμβολιασμένο στο ελάχιστο απαιτούμενο επίπεδο επίδοσης και κάτω από αυτό με ισοαπέχοντα βήματα. Αναλύονται τα δείγματα, ύστερα γίνεται η ταυτοποίηση και έπειτα χαράσσεται η καμπύλη «σήμα/προστεθείσα συγκέντρωση». Η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στο όριο απόφασης, συν 1,64 φορές την τυπική απόκλιση της

108 ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας της μέσης μετρηθείσας περιεκτικότητας στο όριο απόφασης, ισούται με την ικανότητα ανίχνευσης (β = 5 %). 2. Με την ανάλυση τουλάχιστον 20 τυφλών υλικών ανά υπόστρωμα εμβολιασμένων με την αναλυτέα ουσία ή ουσίες στο όριο απόφασης. Αναλύονται τα δείγματα και ταυτοποιούνται οι προσδιοριζόμενες ενώσεις. Η τιμή του ορίου απόφασης, συν 1,64 φορές την τυπική απόκλιση της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας της μετρηθείσας περιεκτικότητας, ισούται με την ικανότητα ανίχνευσης (β = 5 %). Για τις ενώσεις που έχει καθοριστεί επιτρεπόμενο όριο, η γραφική παράσταση των αναλυτικών ορίων CCα και CCβ δίνονται στο σχήμα 7.1, ενώ στο σχήμα 7.2 δίνεται η γραφική παράσταση των αναλυτικών ορίων CCα και CCβ, για ενώσεις που δεν έχει καθοριστεί επιτρεπόμενο όριο. [51]

109 όπου XB Μέση «συγκέντρωση» του τυφλού δείγματος. X PL Μέση «συγκέντρωση» του δείγματος που περιέχει την αναλυτέα ουσία στο επιτρεπόμενο όριο. XS Μέση «συγκέντρωση» του μολυσμένου δείγματος. SPL Τυπική απόκλιση του δείγματος που περιέχει την αναλυτέα ουσία (προσδιορισμός υπό ενδοεργαστηριακές συνθήκες αναπαραγωγιμότητας). SS Τυπική απόκλιση του μολυσμένου δείγματος (προσδιορισμός υπό ενδοεργαστηριακές συνθήκες αναπαραγωγιμότητας). α Ποσοστό ψευδώς μη συμμορφούμενων αποτελεσμάτων. β Ποσοστό ψευδώς συμμορφούμενων αποτελεσμάτων. CCα Απόκριση με δεδομένο σφάλμα α και 50% σφάλμα β. CCβ Απόκριση με πολύ μικρό σφάλμα α και δεδομένο σφάλμα β. Σχήμα 7.1: Γραφική παράσταση των αναλυτικών ορίων CCα και CCβ για τις ενώσεις που έχει καθοριστεί επιτρεπόμενο όριο

110 όπου XB Μέση τιμή απόκρισης του λευκού δείγματος. XS Μέση τιμή απόκρισης του μολυσμένου δείγματος. SB Τυπική απόκλιση του τυφλού δείγματος (προσδιορισμένη υπό συνθήκες ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας. SS Τυπική απόκλιση του μολυσμένου δείγματος (προσδιορισμένη υπό συνθήκες ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας. α Ποσοστό ψευδώς μη συμμορφούμενων αποτελεσμάτων. β Ποσοστό ψευδώς συμμορφούμενων αποτελεσμάτων. CCα Απόκριση με δεδομένο σφάλμα α και 50% σφάλμα β. CCβ Απόκριση με πολύ μικρό σφάλμα α και δεδομένο σφάλμα β. Σχήμα 7.2: Γραφική παράσταση των αναλυτικών ορίων CCα και CCβ για τις ενώσεις που δεν έχει καθοριστεί επιτρεπόμενο όριο

111

112 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (HPLC) 8.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Χρωματογραφική τεχνική είναι εκείνη που χρησιμοποιείται πρωταρχικά για το διαχωρισμό των συστατικών ενός δείγματος, τα οποία κατανέμονται ανάμεσα σε δύο φάσεις, η μία από τις οποίες είναι στατική, ενώ η άλλη κινείται. Η στατική φάση μπορεί να είναι στερεή ή υγρή, υποστηριζόμενη από ένα στερεό ή μια πηκτή και να βρίσκεται πακτωμένη σε στήλη, τοποθετημένη ως στοιβάδα ή ως υμένιο. Η κινητή φάση μπορεί να είναι υγρή ή αέρια ή υπερκρίσιμο ρευστό. Όταν η κινητή φάση είναι ένα υγρό και η στατική φάση είναι στερεό ή υγρό και βρίσκεται καλά πακτωμένη μέσα σε μια στήλη, τότε πρόκειται για την Υγρή Χρωματογραφία Στήλης (Liquid Chromatography: LC). Η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης (High Pressure Liquid Chromatography: HPLC) αποτελεί μια σύγχρονη τεχνική και μπορεί να θεωρηθεί ως επέκταση της υγρής χρωματογραφίας στήλης, με εφαρμογή υψηλών πιέσεων. Στην τεχνική αυτή χρησιμοποιούνται μικρότερου μεγέθους κόκκοι για το υλικό πλήρωσης και καλύτερα συστήματα ανίχνευσης, με αποτέλεσμα να επιτυγχάνεται υψηλή απόδοση των στηλών, καθώς επίσης και υψηλή ταχύτητα διαχωρισμού, σε σχέση με την απλή τεχνική. Η HPLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί και να δώσει αξιόπιστα αποτελέσματα, τόσο στην ανάλυση διαφόρων ιόντων, όσο και στην ανάλυση οργανικών μορίων. Αν και η χρωματογραφία είναι γνωστή από το 1903, όταν ο Tswett ξεχώρισε καροτένια και χλωροφύλλη, χρησιμοποιώντας ανθρακικό ασβέστιο ως στατική φάση, η υγρή χρωματογραφία αναπτύχθηκε πολύ αργότερα. Οι Martin και Synge το 1941, χρησιμοποιώντας στήλες χρωματογραφίας, μέσα στις οποίες είχαν τοποθετήσει χονδρόκοκκα υλικά, κατόρθωσαν με χαμηλές ταχύτητες ροής του εκλουστικού συστήματος και χαμηλές πιέσεις, να πετύχουν ικανοποιητικά αποτελέσματα, αν και είναι σήμερα γνωστό, ότι καλύτερα αποτελέσματα επιτυγχάνονται χρησιμοποιώντας υψηλές πιέσεις και λεπτόκοκκα υλικά. Το 1950, όταν η αέρια χρωματογραφία (Gas Chromatography: GC) αναπτύχθηκε απότομα με την ανακάλυψη της τεχνικής ανίχνευσης ιονισμού φλόγας δόθηκε παράλληλη προσοχή στην ανάπτυξη χαλύβδινων στηλών για την υγρή χρωματογραφία. Έτσι λοιπόν, έχοντας στήλες από ανοξείδωτο χάλυβα, οι οποίες μπορούσαν να αντέξουν σε υψηλές πιέσεις, αναπτύχθηκαν και αντλίες υψηλής πίεσης με σταθερή παροχή. Σήμερα, υπάρχουν αντλίες, οι οποίες δίνουν με

113 ρύθμιση μέσα από μικροϋπολογιστή, βαθμιαία μεταβαλλόμενη με το χρόνο παροχή εκλουστικού συστήματος (Gradient Elution). Στη συνέχεια, ακολούθησε η ανάπτυξη της τεχνολογίας στον τομέα των ανιχνευτών και η προσαρμογή τους στην HPLC. Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι: φασματοφωτόμετρα, ανιχνευτές παράταξης φωτοδιόδων, φθορισμομετρικοί ανιχνευτές, αγωγιμομετρικοί ανιχνευτές και άλλοι. [55, 56] 8.2 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ HPLC Με την τεχνική της HPLC επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των συστατικών ενός υγρού μίγματος, περνώντας το μέσα από μια χρωματογραφική στήλη, με τη βοήθεια αντλιών υψηλής πίεσης. Στην HPLC διακρίνουμε δυο φάσεις: α) τη στατική φάση, που αποτελείται από στερεό πορώδες υλικό, ή υγρό καθηλωμένο σε στερεό υπόστρωμα πολύ μικρής διαμέτρου, που βρίσκεται μέσα στη στήλη και β) την κινητή φάση που είναι ένας διαλύτης ή μίγμα διαλυτών. Η διαβίβαση της υγρής κινητής φάσης μέσα από τη στατική, πραγματοποιείται με τη βοήθεια αντλιών υψηλής πίεσης και έτσι επιτυγχάνονται δύσκολοι διαχωρισμοί μέσα σε λίγα λεπτά. Η HPLC χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πολύπλοκων ανόργανων και οργανικών μιγμάτων, καθώς και στην ποιοτική και ποσοτική ανάλυση. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για το διαχωρισμό και την ανάλυση μιγμάτων μοριακών ή ιοντικών ενώσεων με χαμηλές τάσεις ατμών καθώς και θερμικά ασταθών ενώσεων, που δε μπορούν να εξαερωθούν χωρίς να διασπαστούν. Σε αντίθεση με την αέρια χρωματογραφία, χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μιγμάτων ενώσεων μεγάλου μοριακού βάρους και πολικότητας, προσδιορίζοντας σε ιόντα ποσότητες της τάξης των μερών ανά δισεκατομμύριο (ppb). Η τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης έχει πολύ μεγάλη εφαρμογή στην ανάλυση βιολογικών και φαρμακευτικών μιγμάτων, καθώς και των μεταβολιτών τους. [56 58] Η HPLC αποτελείται από τα εξής τμήματα: 1. σύστημα παροχής διαλυτών 2. αντλία 3. σύστημα εισαγωγής του δείγματος στη στήλη 4. στήλη και προστήλη 5. σύστημα ανίχνευσης, ενίσχυσης και καταγραφής του σήματος

114 Στο σχήμα 8.1 δίνεται μία τυπική διάταξη HPLC. ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ (ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ HPLC) ΑΠΟΒΛΗΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΦΙΑΛΕΣ ΔΙΑΛΥΤΩΝ ΣΥΛΛΕΚΤΗΣ ΚΛΑΣΜΑΤΩΝ (ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΙΚΗ ΑΝΤΛΙΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ HPLC) HPLC ΣΤΗΛΗ Σχήμα 8.1: Διάταξη ενός υγρού χρωματογράφου υψηλής πίεσης. 1. Σύστημα παροχής διαλυτών Το σύστημα παροχής διαλυτών μιας υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης περιλαμβάνει το ή τα δοχείο/α του διαλύτη και πιθανόν κάποια διάταξη απαέρωσης των διαλυτών. Το δοχείο του διαλύτη είναι συνήθως γυάλινη φιάλη για την ισοκρατική έκλουση (isocratic), ή φιάλες μέχρι τέσσερις στη βαθμωτή έκλουση (gradient), όπου τοποθετούνται οι διαλύτες και απαερώνονται. Ένα σύστημα HPLC μπορεί να αναμίξει διαλύτες, από δύο έως τέσσερα δοχεία διαλυτών, με την προϋπόθεση ότι δε σχηματίζεται γαλάκτωμα ή ίζημα κατά την ανάμιξή τους, μπορεί όμως να αντλεί διαλύτη προκαθορισμένης σύστασης από μία φιάλη. Η απαέρωση είναι απαραίτητη προκειμένου να φύγουν όλα τα διαλυμένα αέρια, κυρίως το οξυγόνο, που μπορεί να δημιουργούν φυσαλίδες στην κυψελίδα, μη σταθερή πίεση στο κύκλωμα ροής καθώς επίσης και αστάθεια στη βασική γραμμή του χρωματογραφήματος, αν εγκλωβιστούν φυσαλίδες στην κυψελίδα του ανιχνευτή

115 Η απαέρωση μπορεί να γίνει, είτε με διαβίβαση ηλίου στο χώρο των διαλυτών, ή με κενό, ή περνώντας τους διαλύτες μέσα από συσκευή με ειδικές μεμβράνες που κατακρατούν όλα τα διαλυμένα αέρια, ή με υπερήχους είτε τέλος και με συνδυασμό όλων των παραπάνω μεθόδων. Οι διαλύτες που χρησιμοποιούνται πρέπει να είναι υψηλής καθαρότητας, ειδικοί για χρωματογραφικές αναλύσεις και να συνοδεύονται από πιστοποιητικό απορρόφησης στο υπεριώδες, απαραίτητο για την περίπτωση που χρησιμοποιείται φασματοφωτομετρικός ανιχνευτής υπεριώδους-ορατού (UV-Vis). Αρκετές φορές είναι απαραίτητη η διήθηση των διαλυτών πριν τη χρησιμοποίησή τους μέσα από κατάλληλα φίλτρα, ώστε να απομακρυνθούν τυχόν στερεά που μπορεί να φράξουν τη βαλβίδα εισαγωγής, τα έμβολα της αντλίας και να προκληθούν βλάβες στο σύστημα της ανάλυσης. Το σύστημα των διαλυτών επιλέγεται κατάλληλα, ώστε να επιτυγχάνεται ικανοποιητικός διαχωρισμός των ενώσεων που προσδιορίζονται και να έχουν μικρό χρόνο συγκράτησης. Οι δυο εφαρμοζόμενες τεχνικές ανάλυσης είναι η «ισοκρατική έκλουση» (isocratic elution), στην οποία η κινητή φάση έχει σταθερή σύσταση, καθ όλη την ανάλυση και η «βαθμωτή έκλουση» (gradient elution), στην οποία η κινητή φάση μεταβάλλεται βαθμιαία ή κατά τακτά χρονικά διαστήματα βάση προγραμματισμού. Αρχικά εκλούονται τα συστατικά που συγκρατούνται ασθενέστερα από ένα διαλύτη Α με μικρή ισχύ έκλουσης. Στη συνέχεια παρεμβάλλεται ένας δεύτερος διαλύτης Β (ή περισσότεροι Γ και Δ) με μεγαλύτερη ισχύ έκλουσης και αναμιγνύεται με τον Α, είτε σε ξεχωριστά στάδια, είτε συνεχώς, οπότε αυξάνεται η εκλουστική ικανότητα του μίγματος και επιτυγχάνεται έτσι σταδιακή έκλουση όλων των συστατικών. Η μεγάλη πίεση απαιτείται προκειμένου το δείγμα να περάσει με μια λογική ταχύτητα ροής μέσα από τη στήλη που είναι γεμάτη με μικρά σωματίδια. [56 58] 2. Αντλία Με την αντλία υψηλής πίεσης επιτρέπεται στο σύστημα των διαλυτών να περάσει μέσα από τη στήλη, έτσι ώστε να παρασύρει το δείγμα και να διαχωρίσει τα διάφορα συστατικά του ανάλογα με την πολικότητά τους και σε σχέση με το εκλουστικό σύστημα. Υπάρχουν πολλοί τύποι αντλιών, ενώ ιδανική είναι εκείνη η αντλία που μπορεί να δώσει πίεση μέχρι 5000 psi, μέσα από μια στήλη. Ανάλογα με τη σταθερότητα της πίεσης που εξασφαλίζουν αυξάνει και η τιμή τους. Η σταθερή ροή επηρεάζεται από τον κινητήρα της αντλίας, τις φλάντζες στεγανοποίησης και τη βαλβίδα εισαγωγής του δείγματος

116 Το σύστημα της αντλίας περιλαμβάνει τα διάφορα φίλτρα, καθώς και τις διατάξεις πίεσης και μέτρησης της ροής. Το έργο της αντλίας είναι η άσκηση υψηλής πίεσης στο εκλουστικό σύστημα, ώστε αυτό να περάσει με σταθερή ροή μέσα από τους πόρους του υλικού πλήρωσης της στήλης. Η υψηλή πίεση είναι απαραίτητη για να ξεπεραστεί η αντίσταση στη ροή της κινητής φάσης, η οποία οφείλεται στη στατική φάση. Το υλικό από το οποίο είναι κατασκευασμένη η αντλία είναι συνήθως ανοξείδωτος χάλυβας, ώστε να μην υπόκειται καμία διάβρωση από τις διάφορες ενώσεις και τους διαλύτες. Στην περίπτωση αυτή επιτυγχάνεται πίεση μέχρι και psi, ενώ με αντλίες από αδρανή πολυμερή, για παράδειγμα από πολυαιθερική κετόνη: PEEK, μπορεί να φτάσει μέχρι και τα psi το ανώτερο. Συνήθως χρησιμοποιείται η αντλία παλινδρομικής κίνησης με δύο έμβολα, όπως στο σχήμα 8.2, ώστε η άντληση του εκλουστικού συστήματος να γίνεται ομαλά και να διατηρείται σταθερή η ροή και η πίεση του συστήματος. [56 58] Σχήμα 8.2: Παλινδρομική αντλία με απόσβεση παλμών. 3. Σύστημα εισαγωγής του δείγματος στη στήλη Η εισαγωγή του υγρού δείγματος γίνεται με μικροσύριγγα κατευθείαν στη στήλη ή συνήθως διαμέσου βαλβίδας εισαγωγής υψηλής πίεσης με βρόχο ή με αυτόματο δειγματολήπτη. Η ποσότητα του δείγματος κυμαίνεται συνήθως από 5-50 μl. Η εισαγωγή του δείγματος με ειδική βαλβίδα εισαγωγής, φωτογραφία, της οποίας φαίνεται στο σχήμα 8.3, γίνεται σε δυο στάδια

117 Σχήμα 8.3: Βαλβίδα εισαγωγής δείγματος. Αρχικά, όταν η βαλβίδα βρίσκεται στη θέση πλήρωσης «load» της κυψελίδας, γεμίζει η προκαθορισμένου όγκου κυψελίδα, ενώ ότι περισσεύει αποβάλλεται από την ειδική έξοδο. Στη συνέχεια, η βαλβίδα στρέφεται στη θέση της έγχυσης, «inject», κι έτσι το δείγμα συμπαρασύρεται από το εκλουστικό σύστημα και διαβιβάζεται στη στήλη. Στο σχήμα 8.4 δίνεται η δομή του εσωτερικού μίας βαλβίδας εισαγωγής δείγματος, καθώς και τα δύο στάδια εισαγωγής του δείγματος. ΚΥΨΕΛΙΔΑ ΑΝΤΛΙΑ ΚΥΨΕΛΙΔΑ ΑΝΤΛΙΑ ΣΤΗΛΗ ΣΤΗΛΗ 1 2 Σχήμα 8.4 Βαλβίδα εισαγωγής του δείγματος, με: 1: Θέση πλήρωσης της κυψελίδας 2: Θέση εισαγωγής του δείγματος στη στήλη Οι βαλβίδες εισαγωγής δείγματος είναι κατασκευασμένες από ειδικό ανοξείδωτο χάλυβα ή από κεραμικά υλικά υψηλής αντοχής ή από αδρανή πολυμερή. Έχουν το πλεονέκτημα ότι δε χρειάζεται να διακοπεί η ροή του εκλουστικού και επομένως να διαταραχθεί η ισορροπία του συστήματος. Υπάρχει επίσης και η δυνατότητα αυτόματης σύνδεσης με τον ολοκληρωτή σε ορισμένους τύπους βαλβίδων εισαγωγής

118 Εκτός από τις βαλβίδες εισαγωγής δείγματος με πίεση, υπάρχουν και βαλβίδες, στις οποίες η εισαγωγή του δείγματος γίνεται με αναρρόφηση. [56 58] 4. Στήλη και προστήλη Η καρδιά του χρωματογραφικού συστήματος είναι η στήλη, αφού σ αυτήν επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των ουσιών. Πρέπει να είναι υψηλής ποιότητας, ώστε να μπορεί να δίνει ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. Το εξωτερικό περίβλημα είναι συνήθως κατασκευασμένο από ανοξείδωτο χάλυβα, ώστε να αντέχει στις πολύ υψηλές πιέσεις, της τάξης των psi, κάτι το οποίο δε μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση γυάλινων στηλών. Εσωτερικά η στήλη περιέχει τη στατική φάση καλά πακτωμένη, ώστε να μην υπάρχουν κενά που να οδηγούν σε ελάττωση της απόδοσης ή να δημιουργούν κανάλια κατά μήκος της στήλης. Το μέγεθος των κόκκων του υλικού πλήρωσης κυμαίνεται από 3 έως και 10 μm. Οι στήλες με μικρή διάμετρο κόκκων έχουν μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα, έχουν όμως μικρότερη διάρκεια ζωής, μεγαλύτερο κόστος και επιπλέον αναπτύσσονται υψηλότερες πιέσεις επαναφοράς. Οι κόκκοι του υλικού πλήρωσης μπορεί να είναι σφαιρικοί ή ακανόνιστου σχήματος. Οι πρώτοι διαποτίζονται ευκολότερα με το εκλουστικό σύστημα και έχουν μεγαλύτερη διάρκεια ζωής, ενώ οι δεύτεροι έχουν μεγαλύτερη ειδική επιφάνεια, που ευνοεί την προσρόφηση. Η στήλη βρίσκεται συνήθως σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, αλλά μπορεί και να θερμοστατείται με μανδύα, όταν πρόκειται για ειδικές εφαρμογές. Στο σχήμα 8.5 δίνονται ενδεικτικά διάφορες στήλες υγρής χρωματογραφίας. Σχήμα 8.5: Στήλες υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης

119 Το περισσότερο διαδεδομένο υλικό πλήρωσης είναι η πηκτή του διοξειδίου του πυριτίου (silica gel) που χρησιμοποιείται στην κανονικής-αδέσμευτης φάσης HPLC. Ο κύριος μηχανισμός διαχωρισμού οφείλεται σε αλληλεπιδράσεις των μορίων των συστατικών του δείγματος με τις πολικές ομάδες Si-OH της επιφάνειας του διοξειδίου του πυριτίου. Για περισσότερο εκλεκτικούς διαχωρισμούς χρησιμοποιείται η δεσμευμένης φάσης HPLC, στην οποία δεσμεύονται διάφορες ομάδες στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου. Οι ομάδες αυτές μπορεί να είναι μη πολικές, για παράδειγμα αλκύλια με 8 ή 18 άτομα άνθρακα, αντίστοιχα ( C8H17) C8 ή (-C18H37) C18, ή λιγότερο πολικές ομάδες απ ότι το αδέσμευτο διοξείδιο του πυριτίου, π.χ. φαινύλια Ρh, ομάδες κυανίου -CN, διόλες -2ΟΗ, αμινοπροπυλικές ομάδες ΝΗ2, καθώς επίσης μπορούν να δράσουν και ως ιοντοανταλλάκτες. Στη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, τα λιγότερο πολικά συστατικά αλληλεπιδρούν με τη μη πολική επιφάνεια της στατικής φάσης και έτσι εκλούονται αργότερα από τα πολικά συστατικά του δείγματος. Η επιλογή των υλικών πλήρωσης της στήλης για τη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης γίνεται με βάση το είδος των συστατικών που πρόκειται να προσδιοριστούν, τη διαλυτότητά τους σε διάφορα εκλουστικά συστήματα, την ικανότητα, την εκλεκτικότητα και τη χωρητικότητα που απαιτείται για το συγκεκριμένο διαχωρισμό. [56 58] 5. Σύστημα ανίχνευσης, ενίσχυσης και καταγραφής του σήματος Ο ανιχνευτής είναι ένα όργανο, το οποίο έχει ως σκοπό να δίνει μια απόκριση, η οποία να είναι ανάλογη της συγκέντρωσης ή της ποσότητας ενός συστατικού που περνά μέσα από αυτόν και η απόκριση αυτή θα πρέπει να έχει τη μορφή ενός τέτοιου σήματος, το οποίο να μπορεί να μετρηθεί. Κάποια από τα βασικά χαρακτηριστικά ενός ανιχνευτή είναι η ευαισθησία, η γραμμικότητα, η εκλεκτικότητα και η ικανότητα να ανιχνεύει την ελάχιστη δυνατή ποσότητα ενός συστατικού μέσα στο διάλυμα. Κάθε ανιχνευτής ΗΡLC ανεξάρτητα από την αρχή στην οποία βασίζεται η λειτουργία του πρέπει να πληροί ορισμένες προϋποθέσεις, όπως: χαμηλό επίπεδο θορύβου, υψηλή ευαισθησία και μεγάλο εύρος γραμμικής περιοχής, μικρό χρόνο απόκρισης, μικρό νεκρό όγκο, ανεξαρτησία στις μεταβολές της θερμοκρασίας και της ροής,

120 ευελιξία σε μεταβολές της σύστασης της κινητής φάσης, αξιοπιστία και ευκολία στη χρήση, δυνατότητα ανίχνευσης διαφορετικών ενώσεων και παροχή στοιχείων για την ταυτοποίησή τους, μη καταστροφή του προσδιοριζόμενου συστατικού. Οι ανιχνευτές κατατάσσονται σε δύο κατηγορίες: α) στους γενικούς, οι οποίοι μετράνε την αλλαγή μιας ιδιότητας της κινητής φάσης (ανιχνευτές δείκτη διάθλασης και αγωγιμότητας) β) στους ειδικούς, που μετράνε την αλλαγή μιας φυσικοχημικής ιδιότητας των προσδιοριζόμενων συστατικών (ανιχνευτές ορατού - υπεριώδους). Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στην HPLC είναι και των δύο κατηγοριών, για παράδειγμα ανιχνευτές υπεριώδους-ορατού, παράταξης φωτοδιόδων, αγωγιμομετρικοί, δείκτη διάθλασης, ηλεκτροχημικοί, φασματογράφοι μάζας, φθορισμομετρικοί, ραδιενέργειας κ.ά. [56 58] Φασματοφωτομετρικός ανιχνευτής (UV-Vis) Ο πλέον χρησιμοποιούμενος φασματοφωτομετρικός ανιχνευτής στην υγρή χρωματογραφία είναι ο ανιχνευτής (UV-Vis). Έχει χαμηλό όριο ανίχνευσης και δεν επηρεάζεται από την αλλαγή σύστασης του εκλουστικού, της πίεσης ή της θερμοκρασίας του περιβάλλοντος του εργαστηρίου. Μπορεί να είναι απλής δέσμης με σταθερό μήκος κύματος ή διπλής δέσμης με δυνατότητα επιλογής μήκους κύματος. Ο προσδιορισμός των ενώσεων που διέρχονται από τον ανιχνευτή γίνεται με μέτρηση της ακτινοβολίας που απορροφάται από το διάλυμα της ένωσης και στηρίζεται στο νόμο του Beer. Απαραίτητη προϋπόθεση είναι οι ενώσεις να απορροφούν στο ορατό ή στο υπεριώδες, στην αντίθετη περίπτωση θα πρέπει να επιδιώκεται ο σχηματισμός παραγώγων τους, που να απορροφούν στο ορατό ή στο υπεριώδες. Στο σχήμα 8.6 δίνεται η δομή ενός φασματοφωτομετρικού ανιχνευτή υπεριώδους-ορατού (UV-Vis). Στη συνέχεια δίνεται η αρχή λειτουργίας του ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε στην εργασία αυτή. [56 58]

121 λυχνία υπεριώδους Λυχνία ορατού 2ος μονοχρωμάτορας 1ος μονοχρωμάτορας 2η δίοδος 1η δίοδος κυψελίδες δείγματος και υλικού αναφοράς φωτοπολλαπλασιαστής Σχήμα 8.6: Φασματοφωτομετρικός ανιχνευτής UV-Vis. Ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων Ένας ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων αποτελείται από ράβδους ενός υλικού p-μορφής, που σχηματίζονται πάνω σ ένα υλικό n-μορφής, έτσι ώστε να σχηματίζεται μια σειρά p-n διόδων. Σε κάθε δίοδο εφαρμόζεται αντίστροφη τάση αποσπώντας ηλεκτρόνια από τη συμβολή. Σε κάθε συμβολή υπάρχει μια περιοχή έλλειψης, όπου υπάρχει ένας μικρός αριθμός ηλεκτρονίων. Η συμβολή συμπεριφέρεται ως πυκνωτής με φορτίο, που αποθηκεύεται σε κάθε πλευρά της περιοχής έλλειψης. Στην αρχή κάθε κύκλου μέτρησης, κάθε δίοδος είναι πλήρως φορτισμένη. Όταν πέσει ακτινοβολία στον ημιαγωγό, σχηματίζονται ελεύθερα ηλεκτρόνια που μετακινούνται σε περιοχές αντίθετου φορτίου και αποφορτίζουν μερικώς τον πυκνωτή. Όσο περισσότερη ακτινοβολία πέφτει στη δίοδο, τόσο λιγότερο φορτίο απομένει στο τέλος του κύκλου μέτρησης και όσο περισσότερο εκτίθεται η παράταξη στο φως ανάμεσα στις μετρήσεις, τόσο περισσότερο αποφορτίζεται ο πυκνωτής. Η κατάσταση κάθε πυκνωτή προσδιορίζεται στο

122 τέλος κάθε κύκλου με μέτρηση του ρεύματος που χρειάζεται για να επαναφορτίσει τον πυκνωτή. Η αρχή λειτουργίας ενός φασματοφωτόμετρου παράταξης φωτοδιόδων είναι ότι το λευκό φως (με όλα τα μήκη κύματος) περνά μέσα από το δείγμα. Στη συνέχεια το φως εισέρχεται σε πολυχρωμάτορα, ο οποίος διαχωρίζει το φως στα συστατικά του, ανάλογα με το μήκος κύματος και κατευθύνει το φως στην παράταξη διόδων. Μια διαφορετικού μήκους κύματος δέσμη πέφτει σε κάθε δίοδο και η ανάλυση εξαρτάται από το πόσο κοντά είναι παρατεταγμένες οι δίοδοι και πόση διασπορά προκαλείται από τον πολυχρωμάτορα. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιήθηκε ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων, ο οποίος αποτελείται από 512 διόδους. Στο σχήμα 8.7 δίνεται η δομή ενός τέτοιου ανιχνευτή. Η/Υ Λάμπα δευτερίου Μετατροπέας σήματος Ενισχυτής σήματος Επεξεργαστής σήματος Διαχωριστής δέσμης Παράταξη φωτοδιόδων Λάμπα βολφραμίου Κοίλο πρίσμα Κοίλο πρίσμα Φίλτρο Κυψελίδα Σχήμα 8.7: Ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων. Με το φασματοφωτόμετρο παράταξης φωτοδιόδων δίνεται η δυνατότητα να παρατηρείται ταυτόχρονα όλο το φάσμα κάθε ένωσης. Η παράταξη αποτελείται από μερικές εκατοντάδες έως και μερικές χιλιάδες διόδους, οι οποίες μπορούν να αναγνωριστούν μέσα σε κλάσματα δευτερολέπτου. Η πληροφορία κάθε διόδου μετατρέπεται σε ψηφιακό σήμα και αποθηκεύεται στον ηλεκτρονικό υπολογιστή

123 Η ανίχνευση με παράταξη φωτοδιόδων παρουσιάζει τα εξής πλεονεκτήματα: Ταυτόχρονη ανίχνευση σε διάφορα μήκη κύματος. Δυνατότητα ταυτοποίησης της κορυφής. Προσδιορισμός της καθαρότητας της κορυφής. [56 58] Φασματόμετρο μάζας Συνδυάζεται η φασματοσκοπία μάζας με την υγρή ή την αέρια χρωματογραφία. Όλη η διάταξη ελέγχεται από ηλεκτρονικό υπολογιστή και κατάλληλο λογισμικό. Ο συνδυασμός αυτός χαρακτηρίζεται από εξαιρετική ευαισθησία, εκλεκτικότητα και αξιοπιστία. Το φασματόμετρο μαζών ανιχνεύει ιόντα με προκαθορισμένη τιμή m/z, (λόγος μάζας/φορτίου), οπότε το χρωματογράφημα θα έχει τις κορυφές μόνο των ενώσεων που αποτελούνται από τα συγκεκριμένα ιόντα. Σε κάθε νέα καταγραφόμενη τιμή m/z, ο υπολογιστής καταχωρεί το αντίστοιχο σήμα από τον ανιχνευτή, που αντιστοιχεί σε δεδομένο χρόνο συγκράτησης. Μετά από την πλήρη έκλουση όλων των συστατικών, ο υπολογιστής αναπαραγάγει το χρωματογράφημα που αντιστοιχεί σε κάθε τιμή m/z. Το σύστημα LC/MS (Υγρής Χρωματογραφίας/Φασματοσκοπίας Μάζας) αποτελεί σήμερα την πλέον αξιόπιστη τεχνική ταυτοποίησης ουσιών σε πολύπλοκα βιολογικά δείγματα. Στα αρνητικά, το κόστος του παραμένει πολύ υψηλό έτσι, ώστε η αγορά τους από τα περισσότερα εργαστήρια είναι ανέφικτη. Στο σχήμα 8.8 παρουσιάζεται μια τυπική σχηματική αναπαράσταση ενός φασματόμετρου μάζας Σύστημα εισαγωγής δείγματος Torr Πηγή ιονισμού Αναλυτής μαζών Ανιχνευτής Σύστημα υψηλού κενού Επεξεργαστής σήματος Εκτύπωση φασμάτων Σχήμα 8.8: Σχηματική αναπαράσταση ενός φασματόμετρου μάζας

124 Τα συστήματα που χρησιμοποιούνται για την εισαγωγή του δείγματος στην πηγή ιονισμού εξαρτώνται από τη φυσική του κατάσταση, τις χημικές του ιδιότητες και τον τρόπο ιονισμού του. Τα συστήματα που χρησιμοποιούνται είναι: α. σύστημα μεμονωμένης εισαγωγής δείγματος για τις αναλύσεις αερίων και πτητικών υγρών ενώσεων, β. σύστημα άμεσης εισαγωγής για τις αναλύσεις στερεών και μη πτητικών υγρών ενώσεων. Οι πηγές ιονισμού στη φασματομετρία μάζας διακρίνονται: σε πηγές ιονισμού για πτητικές ενώσεις, όπου το δείγμα πρώτα εξαερώνεται και μετά ιονίζεται σε συνθήκες κενού (είτε με τη χρήση δέσμης ηλεκτρονίων, είτε με χημικό ιονισμό με τη χρήση ενός αερίου, π.χ. μεθάνιο) και σε πηγές ιονισμού για μη πτητικές ενώσεις, όπου το δείγμα σε υγρή ή στερεή κατάσταση μετατρέπεται απευθείας σε αεριώδη ιόντα κατά τον ιονισμό του σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης (API). Ο ιονισμός μπορεί να γίνει είτε με ηλεκτροψεκασμό (ESI), είτε μέσω χημικών αντιδράσεων (χημικός ιονισμός APCI). Ο ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό αποτελεί μία από τις σημαντικότερες τεχνικές για αναλύσεις πολυπεπτιδίων, πρωτεινών και ολιγονουκλεοτιδίων με μεγάλα μοριακά βάρη. Στο σχήμα 8.9 απεικονίζεται η διάταξη της πηγής ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό. Σχήμα 8.9: (α) Διάταξη ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό. (β) Εκρόφηση ιόντων από το διάλυμα

125 Όπως φαίνεται και στο σχήμα 8.9α, το διάλυμα μέσω ενός εκνεφωτή διαβιβάζεται σε μια ακίδα που βρίσκεται σε υψηλή τάση πολλών kv. Τα μόρια του δείγματος αφού πρώτα ιονιστούν, περνούν από ένα τριχοειδές, όπου με τη βοήθεια θερμαινόμενου αζώτου εξατμίζεται ο διαλύτης. Τα σταγονίδια κατόπιν συρρικνώνονται, οπότε αυξάνει η πυκνότητα του φορτίου τους και εκροφώνται στο ρεύμα του αερίου μετά από διάσπαση, όπως φαίνεται και στο σχήμα 8.9β. Το πλεονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι ότι μπορεί εύκολα να προσαρμοστεί στην έξοδο στηλών υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC) ή τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (CE), όπου η κινητή φάση εκνεφούται απευθείας στο φασματόμετρο μάζας. [57] Οι ενισχυτές χρησιμοποιούνται κατά τη διάρκεια του πειράματος για την ενίσχυση του σήματος, καθώς αυτό που παράγεται από τον ανιχνευτή συνήθως δε μπορεί να καταγραφεί χωρίς κάποια επεξεργασία. Η τάξη ενίσχυσης εξαρτάται από το σύστημα καταγραφής που χρησιμοποιείται. Ο ολοκληρωτής-καταγραφέας καταγράφει το σήμα του ανιχνευτή και αφού το ολοκληρώσει, δίνει το χρωματογράφημα, στο οποίο εκτός από το χρόνο συγκράτησης του κάθε συστατικού δίνεται και το ύψος ή το εμβαδόν της κάθε κορυφής, ανάλογα με τις απαιτήσεις της ανάλυσης. Έτσι, μπορεί να γίνει μετά ο ποιοτικός και ο ποσοτικός προσδιορισμός της κάθε ένωσης. Η αναγνώριση των ενώσεων (ποιοτική ανάλυση) γίνεται με βάση το χρόνο συγκράτησης, ο οποίος είναι σταθερός για ορισμένο χρωματογραφικό σύστημα (αναλυτική στήλη, εκλουστικό σύστημα, ταχύτητα ροής, πίεση). Για την ταυτοποίηση απαιτούνται φασματικά δεδομένα (UV, NMR, MS κ.ά.) Ο ποσοτικός προσδιορισμός γίνεται με βάση την καμπύλη αναφοράς, εφαρμόζοντας συνήθως την τεχνική του εσωτερικού προτύπου. [56 58]

126 8.3 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ Η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης είναι μια ευαίσθητη ποιοτική και ποσοτική αναλυτική τεχνική, η οποία εμφανίζει μια σειρά από πλεονεκτήματα, τα οποία την καθιστούν σήμερα μια από τις πλέον εφαρμοζόμενες διαχωριστικές τεχνικές που υπερέχει σαφώς έναντι των υπολοίπων. Αυτά είναι: Πολύ καλή ακρίβεια και επαναληψιμότητα. Υψηλή ευαισθησία και εκλεκτικότητα. Χαμηλά όρια ανίχνευσης και μικροί χρόνοι ανάλυσης, της τάξης των μερικών λεπτών. Απλότητα και ευκολία εφαρμογής. Δυνατότητα εφαρμογής σε ένα ευρύ φάσμα ενώσεων τόσο για αναλύσεις ρουτίνας όσο και για ερευνητικούς σκοπούς. [56]

127

128 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ 9.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σ ένα εργαστήριο, η πλειοψηφία των δειγμάτων απαιτεί κάποια ιδιαίτερη προκατεργασία πριν την ανάλυσή τους. Η προκατεργασία έχει σκοπό την απομάκρυνση των ενώσεων που παρεμποδίζουν και δημιουργούν πρόβλημα μόλυνσης ή απόφραξης της στήλης, την απομόνωση των προσδιοριζόμενων συστατικών χωρίς την παραμικρή αλλοίωση της σύστασής τους και την προσυγκέντρωσή τους, όταν αυτά βρίσκονται σε μεγάλο όγκο δείγματος. Ο στόχος της προκατεργασίας των δειγμάτων είναι η μεγαλύτερη ευαισθησία, η εκλεκτικότητα, η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα της μεθόδου που χρησιμοποιείται. Για να είναι μια μέθοδος προκατεργασίας αποτελεσματική, θα πρέπει: 1) Να είναι εκλεκτική, όσον αφορά στις ενώσεις που ενδιαφέρουν τη ανάλυση. 2) Να είναι επαναλήψιμη, όσον αφορά στην ανάκτηση της ένωσης ή των ενώσεων, εφόσον οι συνθήκες της ανάλυσης παραμένουν αμετάβλητες. 3) Να είναι γρήγορη. 4) Να είναι απλή στους χειρισμούς προετοιμασίας του δείγματος. 5) Να είναι οικονομική. 6) Να μπορεί να αυτοματοποιηθεί. 7) Να μην καταστρέφει ή αλλοιώνει το δείγμα. Οι κυριότερες κλασικές τεχνικές προκατεργασίας των δειγμάτων στην HPLC είναι: Εκχύλιση στερεού-υγρού. Εκχύλιση Soxhlet. Τα τελευταία χρόνια όμως, εκτός από τις κλασικές τεχνικές προκατεργασίας έχουν αναπτυχθεί διάφορες άλλες τεχνικές, οι οποίες ανήκουν στην κατηγορία των λεγόμενων σύγχρονων τεχνικών προκατεργασίας. Οι κυριότερες σύγχρονες τεχνικές προκατεργασίας των δειγμάτων στην HPLC είναι: Εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού. Εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού σε στήλη. Υπερκρίσιμη ρευστή εκχύλιση. Τεχνική παρέκκλισης της στήλης. Μικροεκχύλιση στερεάς φάσης

129 Τεχνικές μεμβράνης. Διασπορά στερεάς φάσης υποστρώματος. Δεδομένου όμως ότι καμία τεχνική προκατεργασίας, είτε κλασική είτε σύγχρονη, δεν πληροί όλες τις παραπάνω προϋποθέσεις, θα πρέπει να επιλέγεται κάθε φορά η καταλληλότερη, ανάλογα με το είδος του δείγματος που πρόκειται να αναλυθεί, τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των προσδιοριζόμενων συστατικών, την αναλυτική τεχνική, την επιθυμητή ακρίβεια των προσδιορισμών, αλλά και τις δυνατότητες του εκάστοτε εργαστηρίου με βάση τον εξοπλισμό του. [55, 56] 9.2 ΚΛΑΣΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Η μεταφορά ενός συγκεκριμένου συστατικού από μία φάση (διάλυμα ή αιώρημα) σε μία άλλη (υγρή) λέγεται εκχύλιση και είναι η διαδικασία που χρησιμοποιείται, κυρίως για το διαχωρισμό, την απομόνωση και την παραλαβή ενός συστατικού από ένα χημικό σύστημα. Στις κλασικές τεχνικές προκατεργασίας δείγματος περιλαμβάνονται η εκχύλιση στερεού-υγρού και η εκχύλιση Soxhlet, οι οποίες υπήρξαν από τις πρώτες που χρησιμοποιήθηκαν για την προκατεργασία των δειγμάτων στη χημική ανάλυση. Βασική αρχή στην οποία στηρίζονται οι δύο παραπάνω τεχνικές είναι η επαφή του μίγματος που περιέχει το προσδιοριζόμενο συστατικό με κατάλληλο διαλυτικό μέσο το οποίο διαλύει εκλεκτικά το συγκεκριμένο συστατικό Εκχύλιση στερεού-υγρού Βιομηχανία τροφίμων, η εκχύλιση συστατικών από ένα στερεό τρόφιμο είναι μια σύνθετη διεργασία. Στις περισσότερες περιπτώσεις, είτε το «στερεό» τρόφιμο περιέχει από τη φύση του μία υγρή φάση, είτε εμποτίζεται από το διαλύτη, έτσι ώστε η διάχυση της υγρής φάσης στο στερεό είναι ένας καθοριστικός μηχανισμός για τη μεταφορά μάζας στην όλη διεργασία. Στην πραγματικότητα πρόκειται για μια διεργασία μεταφοράς πολλών συστατικών, συχνά μέσω περισσότερων από δύο διακριτών φάσεων, υπό μη μόνιμες συνθήκες. Οι συνήθεις διαλύτες που χρησιμοποιούνται είναι το νερό, η αιθανόλη (ή μίγματα νερού-αιθανόλης) και το εξάνιο. Τα τρόφιμα έχουν την ιδιαιτερότητα ότι η μικροδομή τους παίζει σημαντικότατο ρόλο στο ρυθμό και στην αποτελεσματικότητα της εκχύλισης. Η μικροδομή των τροφίμων που

130 υποβάλλονται σε εκχύλιση συνίσταται από κύτταρα, μεσοκυττάρια διαστήματα και τριχοειδείς πόρους. Το συστατικό που πρόκειται να εκχυλισθεί μπορεί να βρίσκεται μέσα στα κύτταρα ή στον εξωκυτταρικό χώρο. Στην πρώτη περίπτωση τα κυτταρικά τοιχώματα και οι μεμβράνες συγκράτησης των κυττάρων αποτελούν την κύρια συνήθως αντίσταση στη διάχυση. Η σύσταση αυτών διαφέρει και μπορεί να περιέχει σημαντικό ποσοστό λιγνίνης, ιδιαίτερα στους υποστηρικτικούς ιστούς, που παρεμποδίζει ακόμη περισσότερη τη διάχυση. Η διαπερατότητα των κυτταρικών τοιχωμάτων και μεμβρανών είναι μεγαλύτερη για τα μικρά μόρια, οδηγώντας σε μια εκλεκτική μεταφορά μάζας. Η διαπερατότητα μπορεί να αυξηθεί και η εκλεκτικότητα να περιορισθεί με θερμική μετουσίωση των κυτταρικών τοιχωμάτων και μεμβρανών. Προκειμένου να υποβληθεί σε εκχύλιση, το τρόφιμο αλέθεται σε μικρότερα σωματίδια για αύξηση της επιφάνειας επαφής και μείωση της απόστασης διάχυσης, ώστε να αυξηθεί ο ρυθμός διάχυσης. Όσο το μέγεθος των σωματιδίων μικραίνει τα σπασμένα εξωτερικά κύτταρα αποτελούν μεγαλύτερο ποσοστό των συνολικών κυττάρων του σωματιδίου και ο ρυθμός εκχύλισης αυξάνει επί πλέον. Η μείωση όμως σε πολύ μικρά μεγέθη δυσκολεύει την κίνηση του υγρού και απαιτεί μεγάλη διαφορά πίεσης στον εκχυλιστήρα. Επίσης τα πολύ μικρά σωματίδια διαχωρίζονται δύσκολα από το υγρό μετά την εκχύλιση. [59] Εκχύλιση Soxhlet Η εκχύλιση οργανικών στερεών από μίγματα στερεών αποτελεί το κύριο τρόπο παραλαβής των διαφόρων φυσικών προϊόντων από τις πρωτογενείς πηγές τους. Στην κατηγορία αυτή των εκχυλίσεων μπορούν να αναφερθούν σπουδαίες βιομηχανικές διαδικασίες, όπως η παραλαβή της ζάχαρης από τα τεύτλα ή το ζαχαροκάλαμο, η παραλαβή ελαίων από ορισμένους ελαιούχους σπόρους και πολλές άλλες βιομηχανικές διαδικασίες παραλαβής φυσικών προϊόντων. Σημειώνεται ότι η εκχύλιση είναι συνήθως η κύρια διαδικασία παραλαβής των αλκαλοειδών από τα φυτά (φύλλα, ρίζες, καρπούς κλπ), των γευστικών συστατικών από διάφορους σπόρους, των αρωμάτων από άνθη κλπ. Μια απλή εκχύλιση ενός στερεού μπορεί να γίνει με θέρμανση της ένωσης με ένα διαλύτη και στη συνέχεια απόχυση ή διήθηση του θερμού μίγματος. Για μικρές ποσότητες ένωσης η διαδικασία αυτή μπορεί να γίνει σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα με προσαρμοσμένο ένα μακρύ γυάλινο σωλήνα σαν κάθετο ψυκτήρα και η εργασία αυτή να επαναληφθεί πολλές φορές. Ένας ακόμα απλούστερος τρόπος είναι να αφεθεί για εκχύλιση ένα στερεό σε επαφή με ένα κατάλληλο διαλύτη σε μια πωματισμένη φιάλη για κάποιο χρονικό διάστημα

131 Στο εργαστηριακό επίπεδο η εκχύλιση από στερεά μίγματα γίνεται συνήθως με την εκχυλιστική συσκευή Soxhlet, η οποία δίνεται στο σχήμα 9.2. Το προς εκχύλιση στερεό τοποθετείται σε ειδικό πορώδη χάρτινο υποδοχέα στο επίθεμα της συσκευής. Οι ατμοί του ζέοντος διαλύτη διέρχονται από τον πλευρικό υάλινο σωλήνα του επιθέματος, συμπυκνώνονται στον ψυκτήρα και επαναρρέουν επί του χάρτινου ή υάλινου υποδοχέα του στερεού μίγματος. Όταν ο χώρος του επιθέματος πληρωθεί με διαλύτη μέχρι του ύψους του κεκκαμένου πλευρικού απαγωγού σωλήνα, γίνεται αυτόματος σιφωνισμός και ο διαλύτης (εκχύλισμα) επαναρρέει στη φιάλη και ο κύκλος επαναλαμβάνεται Η τεχνική αυτή με παρατεταμένη λειτουργία είναι κατάλληλη για την παραλαβή και ελάχιστα διαλυτών ενώσεων. [60] Σχήμα 9.2: Σχηματική απεικόνιση συσκευής Soxhlet. 9.3 ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑΣ Τα σημαντικά μειονεκτήματα των κλασικών τεχνικών προκατεργασίας ανάγκασαν τους επιστήμονες να αναζητήσουν νέες μεθόδους και τεχνικές απαλλαγμένες από τα μειονεκτήματα αυτά, οι οποίες θα είναι σε θέση να παρέχουν αξιόπιστα, εκλεκτικά και επαναλήψιμα αποτελέσματα. Από την εξέλιξη της κλασικής τεχνικής εκχύλισης προέκυψε μια σειρά τεχνικών προκατεργασίας με εκχύλιση με τη χρήση στερεού προσροφητικού υλικού, όπως η εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού, η εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού σε στήλη, η υπερκρίσιμη ρευστή εκχύλιση, η διασπορά στερεάς φάσης υποστρώματος η χρήση μικροκυμάτων κ.ά

132 9.3.1 Εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού (SPE) Η εκχύλιση στερεάς φάσης (Solid Phase Extraction, SPE) αποτελεί μια ευρύτατα χρησιμοποιούμενη τεχνική προετοιμασίας του προς ανάλυση δείγματος. Η εκχύλιση στερεάς φάσης χρησιμοποιείται κυρίως για τις ακόλουθες αναλυτικές διαδικασίες: Προσυγκέντρωση (pre-concentration) της προσδιοριζόμενης ένωσης (αναλύτη) από μεγάλους όγκους δειγμάτων. Σε πολλές περιπτώσεις η ευαισθησία των διάφορων αναλυτικών μεθόδων δεν επαρκεί για μετρήσεις σε πολλά δείγματα, στα οποία ο αναλύτης βρίσκεται σε εξαιρετικά χαμηλές συγκεντρώσεις. Επιπλέον η παρουσία διάφορων ενώσεων στο αρχικό δείγμα είναι πολύ πιθανό να παρεμποδίζει την απ'ευθείας μέτρηση (άμεση εισαγωγή του δείγματος στην αναλυτική συσκευή). Στις περιπτώσεις αυτές μεγάλοι όγκοι δειγμάτων (αερίων ή υγρών) υπόκεινται σε εκχύλιση στερεάς φάσης έτσι, ώστε η συνολική ποσότητα του αναλύτη να "παγιδευθεί" στο μικρό όγκο της στερεάς φάσης, από την οποία μπορεί να παραληφθεί εύκολα με μικρό όγκο διαλύτη, συγχρόνως απαλλαγμένη από άλλα συστατικά που θα παρεμπόδιζαν τη μέτρηση. Καθαρισμός δείγματος. Με τη διαδικασία της εκχύλισης στερεάς φάσης συχνά επιδιώκεται η δέσμευση ουσιών από τα δείγματα, οι οποίες παρεμποδίζουν μια διαδικασία μέτρησης. Χρονοπρογραμματιζόμενες δειγματοληψίες πεδίου (time-programmed field sampling). Η διαδικασία της εκχύλισης στερεάς φάσης είναι απλή και συχνά μπορεί να πραγματοποιηθεί εύκολα εκτός εργαστηρίου. Έτσι, με την εκχύλιση στερεάς φάσης μπορούν να πραγματοποιείται αυτοματοποιημένη/προγραμματισμένη δειγματοληψία (π.χ. αέρα μιας περιοχής ή φυσικών υδάτων σε ένα ή περισσότερα σημεία ενός ποταμού) σε τακτά χρονικά διαστήματα. Στους "σωλήνες" της εκχύλισης στερεάς φάσης που τελικά συλλέγονται (ένας για κάθε δειγματοληψία), κατακρατούνται τα υπό μέτρηση συστατικά και μετά το πέρας όλων των δειγματοληψιών, οι σωλήνες μεταφέρονται στο εργαστήριο και μετριέται κατά μαζικό τρόπο το περιεχόμενο του κάθε σωλήνα στην υπό προσδιορισμό ένωση. Με την εκχύλιση στερεάς φάσης επιλύονται πολλά προβλήματα της υγρής/υγρής εκχύλισης, όπως π.χ. ο ατελής διαχωρισμός φάσεων, η μη ποσοτική ανάκτηση των διαχωριζόμενων ενώσεων,

133 η χρήση ακριβού και εύθραυστου εξοπλισμού (διαχωριστικές χοάνες), χρήση και απόρριψη μεγάλων ποσοτήτων δαπανηρών και κατά κανόνα εύφλεκτων ή/και τοξικών οργανικών διαλυτών. Η εκχύλιση στερεάς φάσης είναι κατά πολύ αποτελεσματικότερη τεχνική από αυτήν της υγρής/υγρής εκχύλισης, καθώς με αυτή επιτυγχάνονται εύκολα ποσοτικοί διαχωρισμοί, είναι ταχύτατη στην εφαρμογή της και μπορεί εύκολα να αυτοματοποιηθεί. H εκχύλιση στερεάς φάσης χρησιμοποιείται κυρίως για την επεξεργασία υγρών δειγμάτων και την εκχυλιστική δέσμευση από αυτά ημιπτητικών ή μη πτητικών ενώσεων. Επίσης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για στερεά δείγματα, τα οποία προηγουμένως θα έχουν υποστεί εκχύλιση με κατάλληλο διαλύτη. Στο σχήμα 9.3 παρουσιάζεται μία συσκευή ταυτόχρονου χειρισμού πολλών μικροστηλών εκχύλισης στερεάς φάσης, καθώς και μερικά δείγματα μικροστηλών εκχύλισης στερεάς φάσης. [61] Σχήμα 9.3: (α) Συσκευή ταυτόχρονου χειρισμού πολλών μικροστηλών εκχύλισης στερεάς φάσης (η ροή επιταχύνεται με εφαρμογή κενού). (β) Χαρακτηριστικές μικροστήλες εκχύλισης στερεάς φάσης

134 9.3.1.α Εκχύλιση στερεάς φάσης αντίστροφης φάσης Οι διαχωρισμοί αντίστροφης φάσης πραγματοποιούνται με κατανομή της προσδιοριζόμενης ένωσης (δηλαδή του "αναλύτη") μεταξύ ενός πολικού ή μετρίως πολικού διαλύτη (συνήθως ύδατος) ή "μήτρας" (matrix) και μίας μη πολικής στατικής φάσης. Η ένωση μπορεί να είναι μέσης πολικότητας ή μη πολική. Στον πίνακα 9.1 παρουσιάζεται μια σειρά διαλυτών κατά αυξανόμενη πολικότητα. Από τις κυριότερες στατικές φάσεις που χρησιμοποιούνται στην εκχύλιση στερεάς φάσης είναι η πυριτία SiO2 (πηκτή διοξειδίου του πυριτίου), στην επιφάνεια της οποίας έχουν προσδεθεί με ομοιοπολικούς δεσμούς άλκυλο- ή αρυλο- ομάδες. Η πρόσδεση πραγματοποιείται μέσω των αρχικά ελεύθερων ομάδων σιλανόλης (Si OH) που είναι υδρόφιλες (πολικές) και βρίσκονται στην επιφάνεια του πυριτικού πληρωτικού υλικού (υλικό που "γεμίζει" τη στήλη). Οι ομάδες αυτές αντιδρούν με κατάλληλα "σιλανοποιητικά" αντιδραστήρια και μετατρέπονται χημικά σε υδρόφοβες αλκυλο- ή αρυλο- ομάδες, όπως π.χ. με την αντίδραση που δείχνεται στο σχήμα 9.4. Η συγκράτηση των οργανικών ενώσεων από πολικά διαλύματα (π.χ. υδατικά), σε αυτά τα υλικά οφείλεται κυρίως στις ασθενείς ελκτικές δυνάμεις μεταξύ των δεσμών C H της ένωσης και των αντίστοιχων δεσμών των υδρόφοβων ομάδων της σιλανοποιημένης επιφάνειας της πυριτίας. Αυτές οι ελκτικές δυνάμεις καλούνται δυνάμεις van der Waals ή δυνάμεις διασποράς. Στο σχήμα 9.5 δίνεται η γενική αρχή διαχωρισμού της προσδιοριζόμενης ένωσης με την τεχνική της εκχύλισης στερεάς φάσης αντίστροφης φάσης. Για την έκλουση μιας προσροφημένης ένωσης από έναν σωλήνα ή δισκίο εκχύλισης στερεάς φάσης αντίστροφης φάσης χρησιμοποιείται ένας μη πολικός διαλύτης τα μόρια του οποίου ανταγωνίζονται τα μόρια της προσροφημένης ένωσης και λόγω της μεγάλης περίσσειάς τους, την "διώχνουν" από το υπόστρωμα. Τα υποστρώματα πυριτίας C-8 και C-18 (silica C-8 και C-18) είναι από τα πλέον ευρύτερα χρησιμοποιούμενα. [61]

135 Πίνακας 9.1: Κατάταξη ορισμένων διαλυτών κατά αυξανόμενη πολικότητα. Διαλύτης Χημικός τύπος Σημείο ζέσεως (οc) Διπολική ροπή (debye) Διηλεκτρική σταθερά κ-εξάνιο CH3(CH2)4CH ,02 τετραχλωράνθρακας CCl , ,28 (CH3CH2)2Ο 35 1,15 4,34 CH2Cl2 40 1,60 9,08 1,63 7,52 βενζόλιο Αυξανόμενη πολικότητα διαιθυλαιθέρας μεθυλενοχλωρίδιο 66 τετραϋδροφουράνιο (THF) αιθανόλη CH3CH2OH 78 1,69 24,3 μεθανόλη οξικό οξύ CH3OH 68 1,70 33 CH3COOH 118 1,74 6,15 ύδωρ Η2Ο 100 1,85 80 ακετόνη CH3COCH3 56 2,88 20,7 φορμαμίδιο HCONH , N,N-διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) ακετονιτρίλιο HCON(CH3) ,82 38,3 81 3,92 36,6 διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) CH3SOCH ,96 47,2 CH3CN

136 Σχήμα 9.4: Τυπική αντίδραση σιλανοποίησης, κατά την οποία οι επιφανειακές ομάδες SiOH καθαρής πυριτίας, αντικαθίστανται με μεγάλα αλκύλια (εδώ: δεκαοκτύλια), με αποτέλεσμα η πυριτία αυτή να καθίσταται υδρόφοβη και ως στατική φάση "μη-πολική". Η συγκεκριμένη στατική φάση συχνά αναφέρεται ως "C-18". Σχήμα 9.5: Διαχωρισμός με εκχύλιση στερεάς φάσης αντίστροφης φάσης. Η χρήση πολυμερών υλικών βοηθά στην πληρέστερη κάλυψη της πυριτικής επιφάνειας και στη χωρητικότητα της στήλης (μέγιστη ποσότητα κατακρατούμενης ουσίας ανά μονάδα βάρους υλικού). Τα πολυμερή υλικά είναι ανθεκτικότερα σε ακραίες τιμές του ph και γι αυτόν τον λόγο είναι περισσότερο κατάλληλα σε περιβαλλοντικές εφαρμογές για το

137 διαχωρισμό οργανικών ενώσεων από οξινισμένα υδατικά δείγματα. Όλα τα υλικά τα οποία βασίζονται στην πυριτία μετά τη διαδικασία της σιλανοποίησης εξακολουθούν να περιέχουν έστω και μικρό ποσοστό ελεύθερων ομάδων υδροξυλίου (σιλανόλης), οι οποίες δρουν ως δευτερεύουσες θέσεις αλληλεπίδρασης. Αυτές οι δευτερεύουσες αλληλεπιδράσεις μπορεί να είναι χρήσιμες για το διαχωρισμό ή την συγκράτηση ισχυρά πολικών ουσιών ή προσμίξεων, αλλά επίσης μπορεί να προκαλέσουν το ανεπιθύμητο αποτέλεσμα της μη αντιστρεπτής δέσμευσης της προσδιοριζόμενης ένωσης. Άλλα υλικά, τα οποία χρησιμοποιούνται στην εκχύλιση στερεάς φάσης αντίστροφης φάσης είναι ανθρακούχα υλικά, καθώς και πολυμερή υλικά, τα οποία συνδέονται με το πυριτικό υπόστρωμα. Τα ανθρακούχα υλικά αποτελούνται από μη πορώδη γραφίτη, ο οποίος παρουσιάζει υψηλή εκλεκτικότητα σε πολικές και μη πολικές οργανικές ενώσεις οι οποίες βρίσκονται σε πολικές ή μη πολικές μήτρες. Η επιφάνεια του γραφιτικού άνθρακα αποτελείται από άτομα C, τα οποία είναι διατεταγμένα σε δομές εξαγωνικού δακτυλίου διασυνδεδεμένες μεταξύ τους. Η δομή εξαγωνικού δακτυλίου παρουσιάζει υψηλή εκλεκτικότητα προς επίπεδες αρωματικές ενώσεις, μόρια με αντίστοιχη δομή δακτυλίου καθώς και προς ανθρακικές αλυσίδες, οι οποίες παρουσιάζουν τάση ταυτόχρονης πρόσδεσης σε πολλά σημεία της επιφάνειας. Η συγκράτηση των προσδιοριζόμενων συστατικών βασίζεται, κυρίως, στη δομή τους (μέγεθος και δομή), παρά στην ύπαρξη αλληλεπιδράσεων μεταξύ των δραστικών ομάδων της ένωσης με την επιφάνεια του προσροφητικού. Η έκλουση στην περίπτωση αυτή πραγματοποιείται με διαλύτες μέσης πολικότητας ή μη πολικούς. Αντί πυριτίας είναι εξίσου συνηθισμένη η χρήση πολυμερών υλικών ως υποστρωμάτων στήριξης των χαρακτηριστικών ομάδων κατά την εκχύλιση στερεάς φάσης αντίστροφης φάσης. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το συμπολυμερές στυρενίου/διβινυλοβενζολίου, όπως φαίνεται και στο σχήμα 9.6, το οποίο χρησιμοποιείται για τη συγκράτηση υδρόφοβων ενώσεων, οι οποίες παρουσιάζουν μερικώς υδρόφιλο χαρακτήρα και ιδιαίτερα για αρωματικές οργανικές ενώσεις. Τυπική εφαρμογή αποτελεί η συγκράτηση των φαινολών, οι οποίες κατακρατούνται δύσκολα σε χημικώς τροποποιημένη πυριτία C-18 σε συνθήκες αντίστροφης φάσης, κυρίως, λόγω της μεγαλύτερης διαλυτότητά τους στο νερό. Από αυτήν παραλαμβάνονται εύκολα με οργανικούς διαλύτες. Η έκλουση μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη χρήση διαλυτών μέσης πολικότητας ή μη πολικών, επειδή το πολυμερές πληρωτικό υλικό είναι σταθερό σε σχεδόν σε κάθε σύστημα διαλύτη. Μια άλλη περίπτωση εφαρμογής πολυμερών υλικών αποτελεί η χρήση των υλικών που αποτελούνται από υδρόφοβη τροποποιημένη πυριτία, η οποία επικαλύπτεται από υδρόφιλο πολυμερές. Το πορώδες πολυμερές το οποίο επικαλύπτει την πυριτία αποτρέπει την

138 προσρόφηση μεγάλων ανεπιθύμητων μορίων και δρα σαν "μοριακό κόσκινο". Οι πόροι του πολυμερούς έχουν μέγεθος, που επιτρέπει την επιλεκτική διέλευση μικρών οργανικών μορίων (π.χ. ναρκωτικών ουσιών) προς την επιφάνεια της πυριτίας, ενώ αποκλείει τα μεγάλα μόρια (π.χ. πρωτεΐνες), τα οποία δεν συγκρατούνται και εκλούονται κατά το στάδιο της φόρτωσης της στήλης. Μια άλλη κατηγορία προσροφητικών στις μικροστήλες SPE είναι αυτά στα οποία υπάρχει ένα λιπόφιλο και ένα υδρόφοβο πολυμερές, όπως συμβαίνει στις μικροστήλες Abselut Nexus της εταιρείας Varian (Harbor City, CA, USA) και στις μικροστήλες Oasis της εταιρείας Waters (Milford Massachusetts, USA). Στις περιπτώσεις αυτές υπάρχουν συμπολυμερή πολυβινυλοπυρρολιδόνης με διασταυρωμένες ρητίνες πολυστυρενίου-διβινυλοβενζολίου. Τα υλικά αυτά χρησιμοποιούνται στην εκχύλιση λιπόφιλων, υδρόφιλων, όξινων, βασικών ή/και ουδέτερων μορίων, χωρίς να είναι απαραίτητη η ενεργοποίηση του υλικού. [61] Σχήμα 9.6: Τμήμα "σκελετού" συμπολυμερούς στυρενίου-διβινυλοβενζολίου β Γενικοί παράγοντες που επιδρούν στην πληρότητα των διαχωρισμών με εκχύλιση στερεάς φάσης Η επιλογή του διαλύτη επηρεάζει σημαντικά τη συγκράτηση της προσδιοριζόμενης ένωσης στο προσροφητικό και την εν συνεχεία έκλουσή του. Η πολικότητα του διαλύτη καθορίζει την ικανότητά του να εκλούει την ένωση από το προσροφητικό υλικό σε μικρότερο όγκο από αυτόν ενός ασθενέστερου διαλύτη. Σε αρκετές περιπτώσεις απαιτείται η χρήση μίγματος διαλυτών. Πρέπει να σημειωθεί ότι για ένα διαλύτη για την εκχύλιση στερεάς φάσης,

139 κανονικής φάσης, η πολικότητα και η ικανότητά του συμπίπτουν. Το ίδιο δεν ισχύει για την περίπτωση της εκχύλισης στερεάς φάσης, αντίστροφης φάσης, και γι αυτό οι διαλύτες, οι οποίοι χρησιμοποιούνται σε προσροφητικά αντίστροφης φάσης πρακτικά περιορίζονται στο ύδωρ, τη μεθανόλη, την ισοπροπυλική αλκοόλη και το ακετονιτρίλιο. Η τιμή ph του δείγματος, καθώς και του εκχυλιστικού επηρεάζει, αναλόγως τη χρησιμοποιούμενη τεχνική της εκχύλισης στερεάς φάσης. Τα πληρωτικά υλικά που βασίζονται στην πυριτία (SiO2) έχουν μία σταθερή περιοχή τιμών ph χρήσης 2-7,5. Σε τιμές εκτός αυτής της περιοχής μπορεί να παρατηρηθεί υδρόλυση της συνδεμένης φάσης ή διαλυτοποίηση του πυριτικού υποστρώματος. Στην περίπτωση, κατά την οποία η σταθερότητα του πληρωτικού υλικού είναι κρίσιμη σε ακραίες τιμές ph μπορούν να χρησιμοποιηθούν πολυμερή ή ανθρακούχα υλικά, τα οποία παρουσιάζουν σταθερότητα σε περιοχή ph Στην εκχύλιση στερεάς φάσης αντίστροφης φάσης, εάν είναι επιθυμητή η συγκράτηση της προσδιοριζόμενης ένωσης, τότε το ph του δείγματος και του διαλύτη εξισορρόπησης πρέπει να ρυθμισθούν για τη βέλτιστη συγκράτηση. Εάν ο αναλύτης είναι όξινη ή βασική ένωση το ph ρυθμίζεται έτσι, ώστε αυτή να μη βρίσκεται σε ιονισμένη μορφή. Η συγκράτηση ουδέτερων ενώσεων δεν επηρεάζεται από την τιμή του ph. Για τα προσροφητικά υλικά, τα οποία χρησιμοποιούνται στην εκχύλιση στερεάς φάσης αντίστροφης φάσης, το ph ομοίως πρέπει να ρυθμίζεται για τη βέλτιστη συγκράτηση. Κατά την έκλουση της ένωσης, η οποία πραγματοποιείται με οργανικό διαλύτη το ph δεν είναι σημαντικός παράγοντας. Στην εκχύλιση στερεάς φάσης, κανονικής φάσης, το ph συνήθως δεν αποτελεί κρίσιμο παράγοντα, διότι χρησιμοποιούνται μη πολικοί οργανικοί διαλύτες. Η συγκράτηση στην εκχύλιση στερεάς φάσης ιοντοανταλλαγής εξαρτάται σημαντικά από την τιμή του ph του δείγματος και των διαλυμάτων εξισορρόπησης. Για την συγκράτηση το ph του δείγματος πρέπει να λαμβάνει τέτοια τιμή, ώστε η ένωση και οι δραστικές ομάδες, οι οποίες είναι προσδεμένες στο πυριτικό υπόστρωμα να είναι αντιθέτως φορτισμένες. Η επιλογή του πληρωτικού υλικού αποτελεί επίσης σημαντικό παράγοντα με κύριο χαρακτηριστικό τη χωρητικότητα (εκφραζόμενη συνήθως σε mmol συγκρατούμενης ένωσης ανά g υλικού), επειδή, προφανώς, εάν η χωρητικότητα είναι μικρή, δε θα κατακρατηθεί η συνολική ποσότητα της ένωσης. Επιπλέον η ταχύτητα ροής του δείγματος, καθώς και του εκλουστικού μέσου, μέσω του πληρωτικού υλικού, αποτελούν σημαντικούς παράγοντες στην αποτελεσματικότητα της τεχνικής αυτής, λόγω του ότι απαιτείται καθορισμένος ελάχιστος χρόνος αλληλεπίδρασης προσδιοριζόμενης ένωσης και πληρωτικού υλικού (οι ετερογενείς χημικές ισορροπίες δεν αποκαθίστανται ακαριαίως). Συνήθεις ταχύτητες ροής για την περίπτωση, όπου το πληρωτικό

140 βρίσκεται σε σωλήνα είναι 3 10 ml/min, ενώ στην περίπτωση, κατά την οποία το πληρωτικό υλικό βρίσκεται σε δίσκο είναι ml/min. Σε κάθε περίπτωση, για να είναι επαναλήψιμα τα αποτελέσματα ενός διαχωρισμού (έστω και ατελούς) με την εκχύλιση στερεάς φάσης, είναι κρίσιμο να χρησιμοποιούνται πάντοτε οι ίδιες ροές. Για το λόγο αυτό στο εμπόριο διατίθενται συστήματα που ελέγχουν επακριβώς τις ροές αυτές (π.χ. με έλεγχο της ταχύτητας κίνησης του εμβόλου σύριγγας που χορηγεί τα εκάστοτε διαλύματα ή με εφαρμογή της ίδιας υποπίεσης -κενού- σε μια ομάδα στηλών). [61] γ Διαδικασία εκχύλισης στερεάς φάσης-υγρού Η παραδοσιακή εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού συνεπάγεται την ανάμιξη μιας ενεργής επιφάνειας ενός στερεού προσροφητικού με ένα διάλυμα δείγματος. Τα συστατικά του δείγματος κατανέμονται ανάμεσα στη στερεή και στην υγρή φάση. Το συστατικό που πρόκειται να προσδιοριστεί, έπειτα από κατάλληλο σχεδιασμό μπορεί είτε να παραμείνει στο διάλυμα, είτε να προσροφηθεί στη στερεά φάση, οπότε μπορεί να γίνει η ανάλογη προσυγκέντρωση και ο προσδιορισμός του. Η εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού διαχωρίζει τις προσδιοριζόμενες ενώσεις από τις προσμίξεις, με τους εξής τρόπους: Εκλεκτική εκχύλιση Επιλέγονται οι κατάλληλες συνθήκες της εκχύλισης, έτσι ώστε να συγκρατούνται οι ενώσεις που ενδιαφέρουν την ανάλυση από το υλικό πλήρωσης της μικροστήλης και να απομακρύνονται οι παρεμποδίσεις. Εκλεκτική έκπλυση Γίνεται έκπλυση με διαλύτες αρκετά ισχυρούς, ώστε να παρασύρουν τις προσμίξεις, αλλά όχι τόσο, ώστε να μπορούν να απομακρύνουν και την ένωση που ενδιαφέρει. Εκλεκτική έκλουση Γίνεται έκλουση των προσδιοριζόμενων ενώσεων με τον κατάλληλο διαλύτη, ενώ οι προσμίξεις παραμένουν στη μικροστήλη

141 Η διαδικασία της εκχύλισης στερεάς φάσης-υγρού περιλαμβάνει τα εξής στάδια: i) Ενεργοποίηση της μικροστήλης Είναι απαραίτητη προκειμένου να ενεργοποιηθούν οι λειτουργικές ομάδες του προσροφητικού υλικού. ii) Προσθήκη του δείγματος Το δείγμα μεταφέρεται με προσοχή στη μικροστήλη. Όσο μεγαλύτερος είναι ο όγκος του δείγματος, τόσο μικρότερη είναι η αποτελεσματικότητα της στήλης και η ανάκτηση του δείγματος. Για να βελτιωθεί η συγκράτηση των κατάλληλων ενώσεων και η έκλουση των ενώσεων που παρεμποδίζουν, προσαρμόζεται ανάλογα η τιμή του ph, η ιονική ισχύς και η περιεκτικότητα σε οργανικό διαλύτη του διαλύματος του δείγματος. Για να αποφευχθεί η απόφραξη των πόρων της μικροστήλης, το δείγμα διηθείται ή φυγοκεντρείται πριν την εκχύλιση. Στο στάδιο αυτό, το δείγμα αφήνεται να περάσει σιγά-σιγά μέσα από τη μικροστήλη. Η ταχύτητα ροής μπορεί να επηρεάσει τη συγκράτηση ορισμένων ενώσεων. Γενικά, η ταχύτητα ροής του δείγματος δεν πρέπει να ξεπερνά τα 5 ml/min. iii) Έκπλυση της μικροστήλης Αν οι προσδιοριζόμενες ενώσεις συγκρατούνται από το υλικό της πλήρωσης, τότε με έκπλυση της μικροστήλης με τον ίδιο διαλύτη, μέσα στο οποίο είχε προηγουμένως διαλυθεί το δείγμα, απομακρύνονται μερικώς τα ανεπιθύμητα συστατικά. Για να απομακρυνθούν τα ανεπιθύμητα συστατικά, τα οποία έχουν συγκρατηθεί ασθενώς, πρέπει να χρησιμοποιηθεί διάλυμα με ισχυρότερη εκλουστική ισχύ, αλλά όχι τόσο μεγάλη, ώστε να συμπαρασύρει και τις προσδιοριζόμενες ενώσεις. Συνήθως, το διάλυμα έκπλυσης πρέπει να περιέχει λιγότερο οργανικό διαλύτη ή ανόργανα άλατα από το τελικό διάλυμα έκλουσης. iv) Έκλουση των ενώσεων που ενδιαφέρουν Στο στάδιο αυτό γίνεται έκλουση της στήλης με τον κατάλληλο διαλύτη ή μίγμα διαλυτών κι έτσι παραλαμβάνονται οι ενώσεις που ενδιαφέρουν, επιτρέποντας να παραμείνουν στη στήλη οι προσμίξεις που δεν απομακρύνθηκαν στο στάδιο της έκπλυσης. Στο σχήμα 9.7 δίνεται η διαδικασία εκχύλισης στερεάς φάσης-υγρού

142 Α = προσδιοριζόμενη ένωση Μ = υπόστρωμα W = διαλύτης έκπλυσης Ε = διαλύτης έκλουσης i) ii) iii) iv) Σχήμα 9.7. Διαδικασία εκχύλισης στερεάς φάσης-υγρού (SPE). i) Ενεργοποίηση της μικροστήλης. ii) Προσθήκη του δείγματος. iii) Απομάκρυνση των ενώσεων που παρεμποδίζουν. iv) Παραλαβή (έκλουση) των προσδιοριζόμενων συστατικών. Πριν την προκατεργασία του δείγματος με την εκχύλιση στερεάς φάσης προηγείται η σωστή επιλογή της κατάλληλης μικροστήλης, του προσροφητικού υλικού και των κατάλληλων διαλυτών. Η διαδικασία αυτή αποτελεί το στάδιο της βελτιστοποίησης της εκχύλισης στερεάς φάσης. Η επιλογή της κατάλληλης μικροστήλης εξαρτάται από: Τον όγκο του δείγματος. Την έκταση της επιμόλυνσης του δείγματος. Την πολυπλοκότητα του υποστρώματος του δείγματος. Την ποσότητα των ενώσεων που μας ενδιαφέρουν. Την ισχύ του διαλύτη. Η επιλογή του κατάλληλου προσροφητικού εξαρτάται από: Το μοριακό βάρος της ένωσης που πρόκειται να προσδιοριστεί. Τη διαλυτότητα της ένωσης (υδατοδιαλυτή ή διαλυτή σε οργανικούς διαλύτες). Την πολικότητα της ένωσης. Τα κυριότερα προσροφητικά υλικά που χρησιμοποιούνται για τη δέσμευση διαφόρων ενώσεων στην εκχύλιση στερεάς φάσης είναι τα: C18, C8, C4, C2, Ph, Si, -CN, -NH2, διόλες κ.ά. Η επιλογή του κατάλληλου διαλύτη είναι σημαντική, γιατί δημιουργεί το κατάλληλο περιβάλλον, το οποίο συντελεί στη συγκράτηση του δείγματος. Αν η στερεή φάση είναι μη πολική, ο διαλύτης πρέπει να είναι όσο γίνεται πιο πολικός. Αν ο διαλύτης είναι ρυθμιστικό

143 διάλυμα, τότε η ιονική ισχύς του δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 0,1Μ, γιατί επηρεάζεται η συγκράτηση, αφού οι λειτουργικές ομάδες καθίστανται ικανές να αλληλεπιδράσουν με την ένωση που πρόκειται να απομονωθεί. Επίσης, θα πρέπει να ελέγχεται και η τιμή του ph, γιατί επηρεάζει τη συγκράτηση του δείγματος. Τέλος, σημαντική είναι η επιλογή του διαλύτη έκλουσης, γιατί θα πρέπει η διαλυτότητα της ένωσης που εκλούεται να είναι όσο γίνεται μεγαλύτερη. Επίσης, η έκλουση των συστατικών πρέπει να γίνεται με το μικρότερο δυνατό όγκο διαλύτη, γιατί στο τέλος της διαδικασίας θα ακολουθήσει εξάτμιση μέχρι ξηρού. Τα πλεονεκτήματα της τεχνικής της εκχύλισης στερεάς φάσης είναι τα εξής: Δυνατότητα κατεργασίας περισσότερων δειγμάτων, με ταχύτητα περίπου 1 δείγμα/λεπτό. Δεν απαιτείται χρόνος για την πλύση γυάλινων συσκευών, αφού οι μικροστήλες είναι μιας χρήσης. Εκχυλίζονται ακόμα και ίχνη των προσδιοριζόμενων ενώσεων από μεγάλους όγκους διαλύτη χωρίς να προηγηθεί εξάτμιση. Τα αποτελέσματα είναι επαναλήψιμα, αφού η διαδικασία της εκχύλισης στερεάς φάσης-υγρού στηρίζεται σε μοριακές αλληλεπιδράσεις, οπότε η κάθε εκχύλιση είναι ίδια με την προηγούμενη. Η μεγάλη εκλεκτικότητα της μεθόδου αυτής μειώνει στο ελάχιστο τα σφάλματα. Ωστόσο, κατά την εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού υπάρχουν ορισμένα πιθανά στάδια απώλειας της προς προσδιορισμό ένωσης ή επιμόλυνσης του δείγματος, τα οποία μπορεί να οφείλονται στο δοχείο συντήρησης, στη διαδικασία της εκχύλισης, της έκπλυσης, της έκλουσης, της εξάτμισης ή και της ανάλυσης. Επιπλέον, κατά την εφαρμογή αυτής της μεθόδου μπορεί να προκύψουν ορισμένα προβλήματα, όπως: Ανεπαρκής συγκράτηση των ενώσεων. Ανεπαρκής έκλουση των ενώσεων. Ανεπαρκής καθαρισμός του υποστρώματος του δείγματος. Μη επαναλήψιμη ανάκτηση των ενώσεων. [55]

144 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ Τις τελευταίες δύο δεκαετίες παρατηρείται συνεχώς να αυξάνεται η χρήση των αντιβιοτικών φαρμάκων, τόσο στην ιατρική, όσο και στην κτηνιατρική, για τη θεραπεία βακτηριακών κυρίως μολύνσεων. Όσο όμως αυξάνεται η χορήγηση αντιβιοτικών στις ιχθυοκαλλιέργειες, είτε για θεραπευτικούς, είτε για προληπτικούς λόγους, τόσο πιο επιτακτική γίνεται η ανάγκη για την ανάπτυξη γρήγορων και εκλεκτικών αναλυτικών μεθόδων προσδιορισμού τέτοιων ενώσεων σε δείγματα ιχθύων, για την προάσπιση της υγείας των καταναλωτών. Στη συνέχεια δίνεται η βιβλιογραφική επισκόπηση διάφορων αντιβιοτικών ενώσεων την τελευταία εικοσαετία, όσον αφορά στις χρωματογραφικές μεθόδους που έχουν αναπτυχθεί για τον προσδιορισμό τους σε διάφορα δείγματα ιχθύων και σε ζωοτροφές/ιχθυοτροφές ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ Προσδιορισμός (φθορο)κινολονών σε δείγματα ιχθύων με HPLC. Από το 1990 έως και σήμερα βρέθηκαν 13 συνολικά δημοσιευμένες εργασίες για τον προσδιορισμό (φθορο)κινολονών με τη τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC) σε διάφορα δείγματα ιχθύων. Συγκεκριμένα, για τον προσδιορισμό του οξολινικού οξέος σε δείγματα ιστού πέστροφας και ορού του αίματος σολομού χρησιμοποιήθηκε αναλυτική στήλη Nova-Pak C18, 4 mm (150 3,9 mm) μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης σε μικροστήλη Sep-Pak Accell με 70% μεθανόλη σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών (ph = 4,9) με τις ανακτήσεις να κυμαίνονται από 96-98%. Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν μίγμα μεθανόλης και ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ph = 8,2 με NaOH 1 M), το οποίο περιείχε και 7,5 g/l KH2PO4.2H2O (40:60 v/v), ενώ ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε το ναλιδιξικό οξύ (5 μg/ml). Η ανίχνευση έγινε με UV στα 258 nm και το όριο ανίχνευσης ήταν το 1 ng/ml. [62] Για το διαχωρισμό του οξολινικού, ναλιδιξικού και πιρομιδικού οξέος σε δείγματα πέστροφας, χελιού, τσιπούρας, πέστροφας και μαγιάτικου χρησιμοποιήθηκε στήλη Nucleosil 3 C18 (3 μm, 75 4,6 mm) με την κινητή φάση να αποτελείται από μίγμα ακετονιτριλίου, μεθανόλης και υδατικού διαλύματος οξαλικού οξέος (3:1:6 v/v) και UV ανιχνευτή στα 295 nm

145 Τα δείγματα αφού εκχυλίστηκαν με μίγμα n-εξανίου και οξικού αιθυλεστέρα (1:3 v/v) σε μικροστήλη SPE Baker. Οι ενώσεις εκχυλίστηκαν με μίγμα μεθανόλης, ακετονιτριλίου και υδατικού διαλύματος οξαλικού οξέος 0,01Μ (ph = 3,0 με NaOH) σε αναλογία όγκων 3:1:6 v/v. Οι ανακτήσεις που επιτεύχθησαν ήταν από 73,9 έως 95,5%, ενώ το όριο ανίχνευσης στα 0,05 ppm. [63] Η μιλοξακίνη και ο κύριος μεταβολίτης της (5,8-διυδροξυ-8-οξο-l,3-διοξο [4,5g]κινολινο-7-καρβοξυλικό οξύ) προσδιορίστηκαν με την τεχνική της HPLC σε ιστούς χελιού, μαγιάτικου, τσιπούρας και πέστροφας. Μετά από εκχύλιση υγρού-υγρού με μίγμα 0,2% μεταφωσφορικού οξέος και μεθανόλης (7:3 v/v), τα δείγματα εφαρμόστηκαν σε μικροστήλη Bond Elut C18. Για την εκχύλιση στερεάς φάσης χρησιμοποιήθηκε η μεθανόλη. Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν ODS (15 cm 4,6 mm), ενώ η κινητή φάση αποτελείτο από 0,05 M NaH2PO4 (ph = 4,5) και ακετονιτρίλιο (65:35 v/v). Η ανίχνευση έγινε με UV ανιχνευτή στα 260 nm και φθορισμομετρικό ανιχνευτή στα λex = 325 nm και λem = 365 nm. Το όριο ανίχνευσης ήταν τα 0,01 μg/g ιστού και οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 84,5 87,9% για τη μιλοξακίνη και 74,8 77,6% για το μεταβολίτη της. [64] Το οξολινικό οξύ προσδιορίστηκε σε ιστούς ψαριού μετά από εκχύλιση υγρού-υγρού με μίγμα 70:30 v/v ακετονιτριλίου και υδατικού διαλύματος KCl και KOH, δίνοντας ανακτήσεις μεγαλύτερες από 97%. Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε το ναλιδιξικό οξύ, ενώ η ανίχνευση έγινε με φθορισμό. [65] Χρωματογραφική στήλη Ultracarb 5 ODS (30, 5 μm, mm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της φλουμεκίνης σε δείγματα ιστού, συκωτιού, δέρματος και οστών τσιπούρας. Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε το οξολινικό οξύ. Μετά από εκχύλιση υγρού-υγρού με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (ph = 10) και n-εξανίου, η φλουμεκίνη εκχυλίστηκε από την υπερκείμενη φάση των δειγμάτων με διχλωροομεθάνιο και κατόπιν έγινε πλύση με διάλυμα McIlvaine (ph = 3,6), εξάτμιση μέχρι ξηρού και επαναδιάλυση με 0,1 M NaOH. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα KH2PO4, H3PO4 με ακετονιτρίλιο και τετραϋδοφουράνιο (55:26,5:18,5 v/v/v) και φθορισμομετρικός ανιχνευτής σε λex = 324 nm και λem = 363 nm. Οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 73,0 86,3%. [66] Χρωματογραφική στήλη Nova-Pak C18 ( mm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του ναλιδιξικού οξέος, του 7-υδροξυμεθυλο-ναλιδιξικού οξέος, του οξολινικού οξέος και της κινοξακίνης σε δείγματα ιστού πέστροφας. Για την προκατεργασία των δειγμάτων ακολουθήθηκαν δύο διαφορετικές διαδικασίες. Στην πρώτη τα δείγματα εκχυλίστηκαν με χλωροφόρμιο, εξατμίστηκαν μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκαν στην κινητή φάση. Στη δεύτερη διαδικασία τα δείγματα εκχυλίστηκαν με NaOH 2Μ και έπειτα προστέθηκε

146 χλωροοξικό οξύ 1Μ (ph = 3). Η οργανική φάση έπειτα εξατμίστηκε μέχρι ξηρού, επαναδιαλύθηκε στην κινητή φάση και εισήχθη στην αναλυτική στήλη. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα ακετονιτριλίου και οξαλικού οξέος M (72/28 v/v) και φθορισμομετρικός ανιχνευτής στα λex = 260 nm και λem = 360 nm στην πρώτη διαδικασία και λex = 270 nm και λem = 440 nm για τη δεύτερη διαδικασία. Οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 70 97% και για τις τέσσερις ενώσεις. [67] Χρωματογραφική στήλη PLRP-S (150 4,6 mm, 5 μm, 100 Å) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του οξολινικού οξέος, της φλουμεκίνης και της σαραφλοξακίνης σε δείγματα ιστού σολομού και πέστροφας. Μετά από εκχύλιση υγρού-υγρού με ρυθμιστικό διάλυμα ακετονιτριλίου και n-εξανίου (ph = 9), η υδατική φάση που περιείχε τις τρεις ενώσεις εισήχθη στην αναλυτική στήλη. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα ακετονιτριλίου και 0,02Μ φωσφορικού οξέος (ph = 2,2) με βαθμωτή έκλουση. Η θερμοκρασία της στήλης ήταν στους 50 ο C, ενώ ως ανιχνευτής χρησιμοποιήθηκε φθορισμόμετρο αρχικά στα λex = 280 nm και λem = 450 nm, ενώ κατέληγε στα λex = 320 nm και λem = 360 nm. Οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 56,9 71,0% ενώ τα όρια ανίχνευσης ήταν τα 2, 5 and 7 μg/kg ιστού για τις τρεις ενώσεις αντίστοιχα. [68] Χρωματογραφική στήλη ZORBAX SB-C18, 5 μm (250 4,6 mm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της σαραφλοξακίνης σε δείγματα ιστού, ήπατος, νεφρού, δέρματος και οστών τσιπούρας. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα 30% μίγματος ακετονιτριλίου και μεθανόλης (3 + 2 v/v) και 70% τριφθοροοξικό οξύ 0,1% (ph = 2,15) σε θερμοκρασία 60 oc. Ο ανιχνευτής ήταν φθορισμομετρικός με μήκη κύματος λex = 278 nm και λem = 450 nm. Οι ανακτήσεις κυμαινόταν από 76,6 82,1% ενώ το όριο ανίχνευσης ήταν 1 μg/kg ιστού. [69] Χρωματογραφική στήλη Zorbax SB-C18 (5 μm, 25 cm x 4,6 mm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του οξολινικού οξέος σε δείγματα πλάσματος, ιστού, δέρματος, ήπατος και χολής τσιπούρας και μυτακίου (sharpsnout sea bream). Για την προκατεργασία των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε η εκχύλιση υγρού-υγρού με οξικό αιθυλεστέρα και άνυδρο Na2SO4. Τα δείγματα έπειτα από εξάτμιση μέχρι ξηρού επαναδιαλύθηκαν στην κινητή φάση, η οποία ήταν 50% μίγμα ακετονιτριλίου και μεθανόλης (3:2 v/v) και 50% τριφθοροοξικό οξύ 0,1% (ph = 2,15) και στην οποία είχαν προστεθεί και 2 ml εξανίου. Ο ανιχνευτής ήταν φθορισμομετρικός στα λex = 327 nm και λem = 369 nm. Οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 69 75%. [70] Χρωματογραφική στήλη Symmetry C18, 5 μm (4,6 150 mm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της σιπροφλοξακίνης, της ενροφλοξακίνης, της σαραφλοξακίνης, του οξολινικού οξέος και της φλουμεκίνης σε δείγματα ιστού σολομού. Για την προκατεργασία των δειγμάτων προστέθηκε στα δείγματα ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (ph = 7,4) και

147 εφαρμόστηκε η εκχύλιση στερεάς φάσης σε μικροστήλες Discovery DSC-18. Η έκλουση των ενώσεων έγινε με μίγμα μεθανόλης και 30% υδροξειδίου του αμμωνίου σε αναλογία όγκων 75:25 v/v. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα ακετονιτριλίου και ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ph = 3,0) με βαθμωτή έκλουση και φθορισμομετρικός ανιχνευτής σε λex = 312 nm και λem = 366 nm. Οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 85,5 95,2% και τα όρια ανίχνευσης ήταν τα 5 ng/g για τις τέσσερις ενώσεις, εκτός της σαραφλοξακίνης που ήταν τα 10 ng/g ιστού. [71] Χρωματογραφική στήλη ZORBAX SBC18, 5 μm (250 4,6 mm), θερμοστατούμενη στους 60 οc χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της φλουμεκίνης σε δείγματα ιστού τσιπούρας. Για την προκατεργασία των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε η εκχύλιση υγρού-υγρού με ακετόνη και φωσφορικό οξύ 3Μ. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε 50% μίγματος ακετονιτριλίου-μεθανόλης (3 + 2 v/v) και 50% τριφθοροοξικού οξέος 0,1% (ph = 2,15) και φθορισμομετρικός ανιχνευτής σε λex = 327 nm και λem = 369 nm. Οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 78 82% και το όριο ανίχνευσης ήταν τα 15 μg/kg ιστού. [72] Χρωματογραφική στήλη Ultracarb 5 ODS 30 (5 μm, 150 4,6 mm), θερμοστατούμενη στους 60 ο C χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ενροφλοξακίνης και της σιπροφλοξακίνης σε δείγματα ιστού, ορού του αίματος και δέρματος τσιπούρας. Για την προκατεργασία των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε η εκχύλιση υγρού-υγρού. Τα δείγματα ορού του αίματος εκχυλίστηκαν με 2,5 ml 1% αιθανόλης και οξικού οξέος, εξατμίστηκαν μέχρι ξηρού, επαναδιαλύθηκαν με 2000 μl μίγματος KH2PO4 0,01 M (ph = 2), ακετονιτριλίου και τετραϋδοφουρανίου (75:15:10, v/v/v) και εισήχθησαν στην αναλυτική στήλη. Στα δείγματα ιστού και δέρματος τσιπούρας προστέθηκαν ρυθμιστικό διάλυμα KH2PO4 10 mm (ph = 2) και n-εξανίου. Στην υδατική φάση προστέθηκε διάλυμα KOH 2 Μ (ph = 7,5). Η ενροφλοξακίνη εκχυλίστηκε με διχλωρομεθάνιο, ενώ η οργανική φάση εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκε σε μίγμα KH2PO4 0,01 M (ph = 2), ακετονιτριλίου και τετραϋδοφουρανίου (75:15:10, v/v/v) και εισήχθη στην αναλυτική στήλη. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα 85% KH2PO4 0,01Μ με 4,5 ml/l H3PO4 (ph = 3,0 με τριαιθυλαμίνη) και 15% ακετονιτρίλιο, ενώ για την ανίχνευση των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε φθορισμόμετρο σε μήκη κύματος λex = 278 nm και λem = 440 nm. Τα όρια ποσοτικής αποτίμησης ήταν τα 0,01 μg/ml για τον ορό του αίματος και τα 0,015 μg/ml για τον ιστό και το δέρμα. [73] Χρωματογραφική στήλη PLRP-S 100 Å (5 μm, 150 4,6 mm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της σιπροφλοξακίνης, της ενροφλοξακίνης και της φλουμεκίνης σε δείγματα ιστού θαλάσσιου ψαριού. Για την προκατεργασία των δειγμάτων με εκχύλιση υγρού-υγρού προστέθηκαν στα δείγματα ρυθμιστικό διάλυμα (ph = 9,1) και ακετονιτρίλιο. Η οργανική

148 φάση εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα (ph = 9,1) και nεξάνιο, για να εισαχθεί στην αναλυτική στήλη. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα φωσφορικού οξέος 0,02 M, ακετονιτριλίου και τετραϋδοφουρανίου, ενώ η ανίχνευση έγινε με φθορισμό στα λex = 280 nm και λem = 450 nm για την ενροφλοξακίνη και την σιπροφλοξακίνη και τα λex = 326 nm και λem = 355 nm για τη φλουμεκίνη. Οι ανακτήσεις ήταν 62,78% και τα όρια ανίχνευσης ήταν τα 1 μg/kg ιστού. [74] Χρωματογραφική στήλη Kromasil C18 (Scharlab 150 4,6 mm, 5 μm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του οξολινικού οξέος, της φλουμεκίνης, της ενροφλοξακίνης, της ντιφλοξακίνης και της σαραφλοξακίνης σε δείγματα ιστού τσιπούρας, σολομού, πέστροφας, λαβρακιού, μυδιών και γαρίδας. Για την προκατεργασία των δειγμάτων με εκχύλιση υγρούυγρού προστέθηκαν στα δείγματα διάλυμα δωδεκυλο-σουλφονικού νατρίου (SDS) 0,05 Μ (ph = 3,0). Μετά από φυγοκέντρηση και αραίωση του υπερκείμενου 10 φορές στο ίδιο διάλυμα, το δείγμα οδηγήθηκε στην αναλυτική στήλη. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα SDS 0,065 Μ και προπανόλης, που περιείχε και 0,5% τριαιθυλαμίνη, ενώ η ανίχνευση έγινε με φθορισμό στα λex = 260 nm και λem = 366 nm για το οξολινικό οξύ και τη φλουμεκίνη και τα λex = 280 nm και λem = 450 nm για την ενροφλοξακίνη, τη ντιφλοξακίνη και τη σαραφλοξακίνη. Οι ανακτήσεις ήταν της τάξης του % και τα όρια ανίχνευσης ήταν τα 2 μg/kg για τη ντιφλοξακίνη, το 1 μg/kg για την ενροφλοξακίνη, τα 7 μg/kg για τη φλουμεκίνη, τα 6 μg/kg για το οξολινικό οξύ και τα 3 μg/kg για τη σαραφλοξακίνη. [75] Προσδιορισμός (φθορο)κινολονών σε δείγματα ιχθύων με άλλες αναλυτικές τεχνικές. Το οξολινικό οξύ προσδιορίστηκε σε δείγματα ιστού ιχθύων με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε το ναλιδιξικό οξύ. Τα δείγματα εκχυλίστηκαν αρχικά με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 10 mm και κατόπιν εκχυλίστηκαν σε μικροστήλη SPE με μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών 10 mm (ph = 9,0) και μεθανόλης σε αναλογία όγκων 9/1. Ο ανιχνευτής που χρησιμοποιήθηκε ήταν UV στα 254 nm, ενώ το όριο ανίχνευσης που επιτεύχθηκε ήταν τα 0,08 μg/ml. Οι ανακτήσεις ήταν της τάξης του 84,8%. [76] Η ντανοφλοξακίνη, η ενροφλοξακίνη, η φλουμεκίνη, η οφλοξακίνη και το πιπεμιδικό οξύ προσδιορίστηκαν σε δείγματα ιστού ιχθύων με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Στα δείγματα προστέθηκε NaH2PO4 50 mm (ph = 7,0), εκχυλίστηκαν με διχλωρομεθάνιο και στην οργανική

149 φάση προστέθηκε NaOH 0,5 Μ. Στην υδατική φάση κατόπιν φωσφορικού οξέος 200 mm για τη ρύθμιση του ph στη τιμή 7, προστέθηκε n-εξάνιο για την απομάκρυνση από τα δείγματα των λιπαρών. Έπειτα στην υδατική φάση εφαρμόστηκε η εκχύλιση στερεάς φάσης σε μικροστήλες C18. Η έκλουση των ενώσεων έγινε αρχικά με μίγμα 4% υδατικού διαλύματος τριφθοροοξικού οξέος και ακετονιτριλίου (25:75 v/v) και κατόπιν με ακετονιτρίλιο. Ο ηλεκτρολύτης ήταν (NH4)2CO3 60 mm (ph = 9,2), ενώ ο τριχοειδής σωλήνας που χρησιμοποιήθηκε ήταν από τηγμένο οξείδιο του πυριτίου, μήκους 75 cm, τα 50 πρώτα των οποίων θερμοστατούνταν, ενώ τα τελευταία 25 cm βρισκόταν σε θερμοκρασία δωματίου. Για την ανίχνευση των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε ανιχνευτής μάζας. Τα όρια ανίχνευσης που επιτεύχθησαν ήταν τα 20 ng/g ιστού και οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 52-90%. [77] Μία μέθοδος προσδιορισμού κινολονών βρέθηκε στη βιβλιογραφία με την τεχνική της ELISA. Με τη μέθοδο αυτή προσδιορίστηκαν σε δείγματα ιστού ψαριού και γαρίδας οι ενώσεις: σαραφλοξακίνη, νορφλοξακίνη, ντιφλοξακίνη, σιπροφλοξακίνη, περφλοξακίνη, οφλοξακίνη, κινοξακίνη, ντανοφλοξακίνη, ενροφλοξακίνη, μαρμποφλοξακίνη, λομεφλοξακίνη, ενοξακίνη, φλουμεκίνη, οξολινικό και ναλιδιξικό οξύ. Τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν με μίγμα μεθανόλης και PBS (NaCl, Na2HPO4.2H2O, KH2PO4.H2O, ph = 7,4 με HCl) σε αναλογία όγκων 1:1 v/v. Μετά την εκχύλιση στα δείγματα προστέθηκε ρυθμιστικό διάλυμα NaCl 0,15 M, Na2HPO4.2H2O 0,056 M, NaH2PO4.2H2O 0,009 M, 0,2% ζελατίνης, 0,05% Tween 20, 0,01% αμμωνιακό άλας του 8-αμινο-1-ναφθαλενοσουλφονικού οξέος και ασκορβικό οξύ 0,0028 M. Η ικανότητα ανίχνευσης της μεθόδου (CCβ) ήταν τα 10 μg/kg για όλες τις ενώσεις, εκτός της σαραφλοξακίνης (4 μg/kg), του οξολινικού οξέος (25 μg/kg), της φλουμεκίνης (100 μg/kg) και της κινοξακίνης (200 μg/kg). [78] Από τις δημοσιευμένες εργασίες που αναφέρθηκαν μπορούν να παρατηρηθούν τα εξής: Η πλειοψηφία των δημοσιευμένων εργασιών χρησιμοποιούν την HPLC για την ανάλυση των δειγμάτων [62 75], δύο μόνο την τριχοειδή ηλεκτροφόρηση [76, 77] και μία την τεχνική της ELISA [78]. Σε όλες τις εργασίες [62 77], με εξαίρεση αυτή της ELISA [78], οι ενώσεις που προσδιορίζονται στα διάφορα δείγματα ιχθύων είναι λιγότερες από 5. Για την εκλεκτική παραλαβή των αντιβιοτικών ενώσεων από τα δείγματα χρησιμοποιείται, τόσο η εκχύλιση υγρού-υγρού, με διαλύτες, όπως το ακετονιτρίλιο, το διχλωρομεθάνιο, η ακετόνη, το n-εξάνιο, ρυθμιστικά διαλύματα φωσφορικών σε διάφορες τιμές ph, το χλωροφόρμιο, το χλωροοξικό οξύ κ.ά. [65 68, 70, 72 75], όσο και η εκχύλιση στερεάς φάσης, με την έκλουση των ενώσεων να πραγματοποιείται με μεθανόλη, ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, ακετονιτρίλιο ή οξαλικό οξύ [62 64, 71, 76, 77]

150 Ο ανιχνευτής που χρησιμοποιείται, κυρίως, είναι ο φθορισμομετρικός [64 75]. Σε αρκετές εργασίες χρησιμοποιείται επίσης και ανιχνευτής υπεριώδους (UV) [62 64, 76], ενώ σε μία μόνο περίπτωση χρησιμοποιείται ανιχνευτής μάζας [77] Προσδιορισμός (φθορο)κινολονών σε δείγματα ιχθυοτροφής με HPLC. Μία και μοναδική εργασία βρέθηκε στη βιβλιογραφία με προσδιορισμό (φθορο)κινολονών σε δείγματα ιχθυοτροφής. Συγκεκριμένα, ο Pecorelli και η ομάδα του πρότειναν μία μέθοδο για τον προσδιορισμό του πιπεμιδικού οξέος, της ρουφλοξακίνης, της ενοξακίνης, της οφλοξακίνης, της νορφλοξακίνης, της σιπροφλοξακίνης, της ντανοφλοξακίνης, της ενροφλοξακίνης, της ντιφλοξακίνης, της κινοξακίνης, του οξολινικού οξέος, του ναλιδιξικού οξέος και της φλουμεκίνης σε ιχθυοτροφή. Τα δείγματα αρχικά εκχυλίστηκαν με υδατικό διάλυμα μεταφωσφορικού οξέος 0,2% και ακετονιτρίλιο (70:30 v/v, ph = 2,6). Κατόπιν, το ακετονιτρίλιο απομακρύνθηκε με εξάτμιση και το υπόλοιπο καθαρίστηκε σε μικροστήλες HLB με την τεχνική της SPE. Η τελική έκλουση των ενώσεων έγινε με μεθανόλη. Κατόπιν τα δείγματα εξατμίστηκαν μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκαν σε K2HPO4 0,02 Μ για να εισαχθούν στην αναλυτική στήλη, η οποία ήταν C5 LUNA (150 4,6 mm, 5 μm). Η κινητή φάση αποτελείτο από Α: μίγμα ακετονιτριλίου/τετραϋδοφουρανίου/k2hpo4 0,04 Μ (50:1:49 v/v, ph = 2,6) και Β: ακετονιτριλίου/τετραϋδοφουρανίου/k2hpo4 0,12 Μ (10:1:89 v/v, ph = 2,6) με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης. Για την ανίχνευση των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε είτε ανιχνευτής UV, στα 278 nm, είτε φθορισμομετρικός ανιχνευτής, με μήκη κύματος λex = 278 nm και λem = 446 nm για το πιπεμιδικό οξύ, τη ρουφλοξακίνη, την ενοξακίνη, την οφλοξακίνη, τη νορφλοξακίνη, τη σιπροφλοξακίνη, τη ντανοφλοξακίνη, την ενροφλοξακίνη, τη ντιφλοξακίνη και την κινοξακίνη, και τα λex = 324 nm και λem = 366 nm για το οξολινικό οξύ, το ναλιδιξικό οξύ και τη φλουμεκίνη. Τα όρια ανίχνευσης των ενώσεων κυμαίνονταν από 0,4 έως 1,5 mg/kg τροφής και οι ανακτήσεις από %, εκτός της ενοξακίνης. [79]

151 10.2 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΩΝ Προσδιορισμός αμφαινικολών σε δείγματα ιχθύων με HPLC. Για την εκλεκτική παραλαβή και τον προσδιορισμό της θειαμφαινικόλης, της φλορφαινικόλης και της χλωραμφαινικόλης από δείγματα ιστού μαγιάτικου χρησιμοποιήθηκε η εκχύλιση στερεάς φάσης σε μικροστήλες Sep-Pak Florisil. Τα δείγματα αρχικά εκχυλίστηκαν με οξικό αιθυλεστέρα, 3% NaCl και n-εξάνιο για την παραλαβή των ενώσεων. Για την έκλουση των ενώσεων από τις μικροστήλες SPE χρησιμοποιήθηκε μίγμα αιθέρα/μεθανόλης (7:3 v/v). Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν Chromatorex ODS, (150 mm 4,6 mm, 5 μm), στους 55 οc. Η κινητή φάση ήταν μίγμα μεθανόλης/νερού (15:85 v/v). Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με UV στα 225 nm για τη θειαμφαινικόλη και τη φλορφαινικόλη και τα 270 nm για τη χλωραμφαινικόλη. Τα όρια ανίχνευσης που επιτεύχθησαν ήταν το 1 ng, ενώ οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 75,4-82,6%. [80] Χρωματογραφική στήλη Supelcosil-LC-18-DB (25 cm 4,6 mm, 5 μm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της φλορφαινικόλης και της άμινο-φλορφαινικόλης σε δείγματα ιστού και ήπατος πέστροφας. Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η θειαμφαινικόλη. Για την προκατεργασία των δειγμάτων με εκχύλιση υγρού-υγρού προστέθηκαν στα δείγματα αρχικά νερό και ακετόνη και κατόπιν στο υπερκείμενο διχλωρομεθάνιο. Μετά από ανάδευση και φυγοκέντρηση, η οργανική φάση εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκε σε μίγμα Na2HPO4 0,01 M (ph = 2,8) και μεθανόλης (80:20 v/v) και εξάνιο και εισήχθη στην αναλυτική στήλη. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα επτανοσουλφονικού οξέος 0,02 Μ (που περιείχε Na3PO4 0,025 M, ph = 3,85 με H3PO4 1 Μ) και μεθανόλης (που περιείχε 0,1% ΤΕΑ) (68:32 v/v), ενώ η ανίχνευση έγινε με UV στα 220 nm. Οι ανακτήσεις ήταν % και τα όρια ανίχνευσης τα 20 ng/g για τον ιστό και τα 50 ng/g για το ήπαρ. [81] Για την εκλεκτική παραλαβή και τον προσδιορισμό της χλωραμφαινικόλης σε δείγματα ιστού τσιπούρας χρησιμοποιήθηκε η εκχύλιση στερεάς φάσης σε μικροστήλες με υλικό πλήρωσης διοξείδιο του πυριτίου. Τα δείγματα αρχικά εκχυλίστηκαν με οξικό αιθυλεστέρα, 3% NaCl και n-πεντάνιο για την παραλαβή της χλωραμφαινικόλης. Για την έκλουση κατά την SPE χρησιμοποιήθηκε η μεθανόλη. Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν ZORBAXm SB C18, 5 μm (250 4,6 mm), στους 50 οc. Η κινητή φάση ήταν μίγμα μεθανόλης/νερού (30:70 v/v). Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με UV στα 278 nm. Το όριο ανίχνευσης ήταν τα 5 μg/kg ιστού, ενώ οι ανακτήσεις της τάξης του 88,62%. [82]

152 Χρωματογραφική στήλη C18 Symmetry-Shield (15 2,1 mm, 3,5 μm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της χλωραμφαινικόλης σε δείγματα ιστού γλώσσας και γαρίδας. Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η [2H5]-χλωραμφαινικόλη. Για την προκατεργασία των δειγμάτων, αρχικά πραγματοποιήθηκε εκχύλιση με ρυθμιστικό διάλυμα οξικών (ph = 5), έπειτα με μίγμα οξικού αιθυλεστέρα/διαιθυλεθέρα (75:25 v/v) και η οργανική φάση καθαρίστηκε επιπλέον μέσα από μικροστήλες SPE SymmetryShield RP. Η έκλουση των ενώσεων έγινε με ρυθμιστικό διάλυμα K2HPO4 0,05 Μ. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα νερού και ακετονιτριλίου με βαθμωτή έκλουση, ενώ χρησιμοποιήθηκε ανιχνευτής μάζας. Το όριο απόφασης (CCα) της μεθόδου ήταν τα 0,01 μg/kg και η ικανότητα ανίχνευσης (CCβ) τα 0,02 μg/kg ιστού. [83] Χρωματογραφική στήλη Zorbax Eclipse XDB C18 (150 3 mm, 5 μm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της χλωραμφαινικόλης σε δείγματα ιστού μαγιάτικου και γλώσσας. Για την προκατεργασία των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της εκχύλισης υγρού-υγρού. Αρχικά προστέθηκαν στα δείγματα άνυδρο Na2SO4 και οξικός αιθυλεστέρας. Μετά από ανάδευση, φυγοκέντρηση και εξάτμιση μέχρι ξηρού, έγινε επαναδιάλυση με ακετονιτρίλιο και n-εξάνιο. Μετά από ανάδευση, η φάση του ακετονιτριλίου εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκε σε μίγμα ακετονιτριλίου/υδατικού διαλύματος οξικού αμμωνίου 10 mm (10:90 v/v) και εισήχθη στην αναλυτική στήλη. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα υδατικού διαλύματος οξικού αμμωνίου 10 mm και μεθανόλης με βαθμωτή έκλουση, ενώ ο ανιχνευτής ήταν φασματοφωτόμετρο μάζας. Οι ανακτήσεις που επιτεύχθησαν κυμαίνονταν από 87,4 έως 102,5%, ενώ τα όρια ανίχνευσης ήταν τα 0,27 ng/g για τη γλώσσα και τα 0,1 ng/g για το μαγιάτικο. [84] Χρωματογραφική στήλη Zorbax RX-C8, (250 4,6 mm), χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της αμινο-φλορφαινικόλης σε δείγματα φιλέτου γατόψαρου. Για την προκατεργασία των δειγμάτων, αρχικά έγινε εκχύλιση με HCl 6 Μ στους 100 οc, έπειτα με οξικό αιθυλεστέρα, ενώ κατόπιν προστέθηκε στην υδατική φάση NaOH (30% w/w, ph = 12,5). Το δείγμα έπειτα περάστηκε από μικροστήλη Varian Chem Elut CE1020, για περαιτέρω καθαρισμό με την τεχνική της SPE. Η παραλαβή της ένωσης έγινε με οξικό αιθυλεστέρα, εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκε σε μίγμα K3PO4 και ακετονιτριλίου (ph = 4,0 με H3PO4) και εισήχθη στην αναλυτική στήλη. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα υδατικού διαλύματος K3PO4 (που περιείχε τριαιθυλαμίνη, με ph = 4,0 με H3PO4) και μεθανόλης με βαθμωτή έκλουση, ενώ χρησιμοποιήθηκε ανιχνευτής UV στα 220 nm. Οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 85,7-92,3%, ενώ το όριο ανίχνευσης ήταν τα 0,044 μg/g ιστού. [85]

153 Στην επόμενη εργασία, η χλωραμφαινικόλη προσδιορίστηκε σε δείγματα ιστού γαρίδας. Τα δείγματα αφού αρχικά ομογενοποιήθηκαν με οξικό αιθυλεστέρα, εξατμίστηκαν μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκαν στην κινητή φάση, η οποία ήταν μίγμα υδατικού διαλύματος NH4OH 2% και ακετονιτριλίου (60:40 v/v) και εκχυλίστηκαν περαιτέρω με SPE σε μικροστήλες Oasis HLB. Η παραλαβή των ενώσεων έγινε με μεθανόλη, ενώ η επαναδιάλυση των δειγμάτων σε μίγμα μεθανόλης/νερού (10:90 v/v). Η αναλυτική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν RP-C18 Xterra (150 2,1 mm, 3,5 μm), ενώ εσωτερικό πρότυπο ήταν θειαμφαινικόλη και η ανίχνευση έγινε με ESI-MS/MS. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου ήταν 0,1 ng/ml, ενώ οι ανακτήσεις 91,18 116,3%. [86] Ακολούθως, η φλορφαινικόλη προσδιορίστηκε σε δείγματα ιστού γατόψαρου. Τα δείγματα, αφού αρχικά ομογενοποιήθηκαν με HCl 6 Μ στους 100 οc και εκχυλίστηκαν με οξικό αιθυλεστέρα, κατόπιν καθαρίστηκαν επιπλέον με SPE σε μικροστήλες Varian Chem Elut CE1020. Η παραλαβή των ενώσεων έγινε με οξικό αιθυλεστέρα, ενώ η επαναδιάλυση των δειγμάτων με την κινητή φάση, η οποία ήταν μίγμα οξικού νατρίου 0,01 Μ και ακετονιτριλίου (2:1 v/v, ph = 4,4). Η αναλυτική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν Nucleosil C18 (100 Å, 5 mm, 250 4,6 mm), ενώ η ανίχνευση έγινε με UV στα 225 nm. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου ήταν τα 44 ppb και οι ανακτήσεις 98,5-106%. [87] Χρωματογραφική στήλη Purospher Star RP-18 (55 mm 4 mm, 3 μm), χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της χλωραμφαινικόλης σε δείγματα ιστού καραβίδας. Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η d5-χλωραμφαινικόλη. Για την προκατεργασία των δειγμάτων, αρχικά πραγματοποιήθηκε εκχύλιση με ακετονιτρίλιο και στο υπερκείμενο διάλυμα προστέθηκε χλωροφόρμιο και εκχυλίστηκε. Η οργανική φάση εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκε με μίγμα μεθανόλης/νερού (3 + 4) και εισήχθη στην αναλυτική στήλη. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα μυρμηκικού οξέος 0,15% και μεθανόλης με βαθμωτή έκλουση, ενώ χρησιμοποιήθηκε ανιχνευτής μάζας. [88] Προσδιορισμός αμφαινικολών σε δείγματα ιχθύων με αέρια χρωματογραφία. Μία μόνο εργασία βρέθηκε στη βιβλιογραφία που να προσδιορίζει τη χλωραμφαινικόλη σε δείγματα ιστού κυπρίνου και γαρίδας με αέρια χρωματογραφία. Συγκεκριμένα στα δείγματα αρχικά προστέθηκε οξικός αιθυλεστέρας και μετά από εκχύλιση και εξάτμιση σχεδόν μέχρι ξηρού προστέθηκε NaCl 4%. Τα δείγματα μετά από ανάδευση, εξατμίστηκαν μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκαν με εξάνιο, νερό και οξικό αιθυλεστέρα. Έπειτα η οργανική φάση

154 εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκε με μίγμα Obis (τριμεθυλοσιλανο) τριφθοροακεταμίδιο/ τριμεθυλοχλωροσιλάνιο (99 + 1) για την παραγωγοποίηση. Κατόπιν προστέθηκε στο δείγμα τολουόλιο και νερό και εισήχθη στην αέρια χρωματογραφία. Η αρχική θερμοκρασία ήταν 150 οc, ενώ η τελική 270 oc. Ο τριχοειδής σωλήνας περιείχε 5% φαινυλομεθυλο-πυρίτιο και είχε διαστάσεις 30,0 m 320 μm 0,50 μm, η ροή του συστήματος ήταν στα 67,5 ml/min, ενώ χρησιμοποιήθηκε ανιχνευτής μάζας. Οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 69,9-90,8% ενώ το όριο ανίχνευσης ήταν τα 0,04 ng/g ιστού. [89] Από τις δημοσιευμένες εργασίες που αναφέρθηκαν μπορούν να παρατηρηθούν τα εξής: Η πλειοψηφία των δημοσιευμένων εργασιών χρησιμοποιούν την HPLC για την ανάλυση των δειγμάτων [80 88] και μία μόνο την αέρια χρωματογραφία [89]. Στις περισσότερες εργασίες [82 89] προσδιορίζεται μία μόνο ένωση, ενώ στις υπόλοιπες, είτε δύο ενώσεις [81], είτε τρεις [80]. Για την εκλεκτική παραλαβή των αντιβιοτικών ενώσεων από τα δείγματα χρησιμοποιείται, τόσο η εκχύλιση υγρού-υγρού, με διαλύτες όπως το ακετονιτρίλιο, το διχλωρομεθάνιο, η ακετόνη, το χλωροφόρμιο, ο οξικός αιθυλεστέρας και το εξάνιο [81, 84, 88, 89], όσο και η εκχύλιση στερεάς φάσης, με την έκλουση των ενώσεων να πραγματοποιείται με μεθανόλη, ρυθμιστικό διάλυμα K2HPO4 και οξικό αιθυλεστέρα [80, 82, 83, 85 87]. Για την ανίχνευση χρησιμοποιήθηκε τόσο UV [80 82, 85, 87], αλλά και φασματοφωτόμετρο μάζας [83, 84, 86, 88, 89] Προσδιορισμός αμφαινικολών σε δείγματα τροφής με HPLC. Μία εργασία βρέθηκε στη βιβλιογραφία με προσδιορισμό αμφαινικολών και συγκεκριμένα της αμφαινικόλης σε ιχθυοτροφή. Πιο ειδικά, ο Vinas και η ομάδα του ανέπτυξαν μια μέθοδο HPLC για τον προσδιορισμό της αμφαινικόλης σε δείγματα ζωοτροφών (bran, soya, calf food, cow food, bull food). Αρχικά τα δείγματα, μετά από προσθήκη νερού, εκχυλίστηκαν με οξικό αιθυλεστέρα. Η οργανική φάση αφού εξατμίστηκε μέχρι ξηρού, επαναδιαλύθηκε με την κινητή φάση και καθαρίστηκε περαιτέρω σε μικροστήλες a Discovery DSC-18Lt (500 mg) με την τεχνική της SPE. Η έκλουση της χλωραμφαινικόλης έγινε με διάλυμα 20% μεθανόλης σε οξικό αιθυλεστέρα. Μετά από συμπύκνωση του δείγματος στους 40 οc, έγινε επαναδιάλυση σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών και εισήχθη στην αναλυτική στήλη, η οποία ήταν Discovery RP-AmideC16, RP column (150 4,6 mm, 5 μm). Ο ανιχνευτής

155 ήταν UV στα 278 nm, ενώ το όριο ανίχνευσης και οι ανακτήσεις που επιτεύχθησαν ήταν 0,7 μg/kg και 92,4-98,5% αντίστοιχα. [90] 10.3 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΩΝ Προσδιορισμός πενικιλινών σε δείγματα ιχθύων με HPLC. Μία μόνο εργασία βρέθηκε για τον προσδιορισμό αμοξυκιλίνης σε δείγματα ιστού γατόψαρου και σολομού με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης. Τα δείγματα αρχικά εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 0,5 Μ (ph = 4,5 με οξικό οξύ και αμμωνία). Μετά από θέρμανση και ψύξη ακολούθησε εκχύλιση με αιθυλαιθέρα. Η οργανική φάση κατόπιν εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκε στην κινητή φάση, η οποία ήταν 18% ακετονιτρίλιο σε νερό (ph = 4,35 με μυρμηκικό οξύ). Η αναλυτική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν Prodigy ODS-3 (5 μm, 4,6 250 mm), ενώ ο ανιχνευτής UV στα 254 nm. [91] Προσδιορισμός πενικιλινών σε δείγματα τροφών. Μία μόνο εργασία βρέθηκε επίσης στη βιβλιογραφία για τον προσδιορισμό της αμοξυκιλίνης σε δείγματα τροφής για χοίρους. Συγκεκριμένα οι De Baere και De Backer εκχύλισαν τα δείγματά τους με διάλυμα KH2PO4 0,01 M (ph = 4,5) και το υπερκείμενο διάλυμα, αφού διηθήθηκε και αραιώθηκε, εισήχθη στην αναλυτική στήλη, η οποία ήταν PLRPS (150 2,1 mm, 3 μm). Ως εωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η αμπικιλίνη, ενώ η κινητή φάση ήταν μίγμα υδατικού διαλύματος μυρμηκικού οξέος 0,1% και ακετονιτριλίου με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης. Η ένωση ανιχνεύτηκε με φασφατοφωτόμετρο μάζας στους 250 οc. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου ήταν το 1,03 mg/kg τροφής και η ανάκτηση στα 89,9%. [92]

156 10.4 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΤΕΤΡΑΚΥΚΛΙΝΩΝ Προσδιορισμός τετρακυκλινών σε δείγματα ιχθύων με HPLC. Για την εκλεκτική παραλαβή και τον ποσοτικό προσδιορισμό της οξυτετρακυκλίνης σε δείγματα από ιστό σολομού, αρχικά έγινε εκχύλιση με HCl 0,05 Μ και εξάνιο. Στην υδατική φάση έπειτα προστέθηκε υδατικό διάλυμα 0,01% w/v Triton X-100 και κατόπιν ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (ph = 5) που περιείχε 1-επτανοσουλφονικό νάτριο (SHS) 0,005Μ. Η αναλυτική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν PLRP-S (5 μm, 150 mm 4,6 mm id), ενώ η κινητή φάση αποτελείτο από μίγμα ακετονιτριλίου/υδατικού διαλύματος SHS 0,005 M/ ορθοφωσφορικού οξέος 0,02 Μ (23:77, v/v). Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η τετρακυκλίνη, ενώ η ανίχνευση έγινε με φθορισμόμετρο στα λ ex = 358 nm και λem = 461 nm. Η ανάκτηση που επιτεύχθηκε ήταν 100,6% και το όριο ανίχνευσης τα 5 ng/g. [93] Χρωματογραφική στήλη Capcell C18 SG-120 (5 μm, 250 4,6 mm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της τετρακυκλίνης, της οξυτετρακυκλίνης και της χλωροτετρακυκλίνης σε φαρμακευτικά σκευάσματα και ιστό σολομού. Στα φαρμακευτικά σκευάσματα προστέθηκε HCl 50 mm, κατόπιν φυγοκεντρήθηκαν και στο υπερκείμενο προστέθηκε μεθανολικό διάλυμα 24% τριχλωροοξικού οξέος (TCA) για να εισαχθεί στην αναλυτική στήλη. Στα δείγματα του σολομού αρχικά προστέθηκε HCl 1 Μ και έπειτα μεθανολικό διάλυμα 24% TCA. Μετά από φυγοκέντρηση, στο υπερκείμενο διάλυμα προστέθηκε ρυθμιστικό διάλυμα οξικών 0,1 Μ (ph = 6,5) που περιείχε CaCl2 35 mm και EDTA 25 mm, κατόπιν τα δείγματα εκχυλίστηκαν και το υπερκείμενο διάλυμα εισήχθη στην αναλυτική στήλη. Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν μίγμα από Α: ρυθμιστικό διάλυμα οξικών 0,1 Μ (ph = 6,5) που περιείχε CaCl2 35 mm και EDTA 25 mm και Β: μεθανόλη (45:55, v/v). Η ανίχνευση έγινε με φθορισμόμετρο στα λex = 390 nm και λem = 512 nm, ενώ οι ανακτήσεις για τα φαρμακευτικά σκευάσματα ήταν 92,3 106,7%, ενώ για τον ιστό σολομού οι ανακτήσεις ήταν αντίστοιχα 73,6-95,5% και τα όρια ανίχνευσης ppb. [94] Για τον προσδιορισμό της οξυτετρακυκλίνης σε δείγματα ιστού, ήπατος, οστών και δέρματος τσιπούρας και λαβρακιού, αρχικά έγινε εκχύλιση με ρυθμιστικό διάλυμα McIlvaine (ph = 4) που περιείχε Na2EDTA 0,1Μ. Η υδατική φάση κατόπιν οδηγήθηκε για περαιτέρω καθαρισμό σε μικροστήλες SPE. Η έκλουση της οξυτετρακυκλίνης έγινε με μεθανόλη και η επαναδιάλυση με την κινητή φάση, η οποία ήταν ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (ph = 2)/ ακετονιτρίλιο/τετραϋδοφουράνιο (87:4:9, v/v). Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν Supelcosil LC-18-DB (5 μm, 150 4,6 mm) και ο ανιχνευτής UV στα

157 355 nm. Οι ανακτήσεις που επιτεύχθησαν ήταν 55,6-71,1% και τα όρια ποσοτικού προσδιορισμού 0,02-0,2 μg/g. [95] Χρωματογραφική στήλη PLRPS (5 μm, 150 4,6 mm) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της τετρακυκλίνης, της οξυτετρακυκλίνης, της ντεμεκλοκυκλίνης και της χλωροτετρακυκλίνης σε δείγματα ιστού σολομού και πέστροφας. Για την προκατεργασία των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε η εκχύλιση υγρού-υγρού. Αρχικά προστέθηκε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών (ph = 5) και οξικός αιθυλεστέρας. Κατόπιν η οργανική φάση εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκε σε μεθανόλη για να εισαχθεί στην αναλυτική στήλη. Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν μίγμα από Α: KH2PO4 0,1 M/κιτρικό οξύ 0,01 Μ/EDTA 0,01 Μ και Β: ακετονιτρίλιο/μεθανόλη/ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών (ph = 5) (25:10:65, v/v) με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης. Η ανίχνευση έγινε με UV στα 350 nm. Οι ανακτήσεις της μεθόδου ήταν % και τα όρια ανίχνευσης τα 5 μg/kg για την τετρακυκλίνη και την ντεμεκλοκυκλίνη, τα 3 μg/kg για την οξυτετρακυκλίνη και τα 6 μg/kg για την χλωροτετρακυκλίνη. [96] Για τον προσδιορισμό της οξυτετρακυκλίνης σε δείγματα ιστού λούτσου, σολομού του Ατλαντικού, πέρκας, λευκού οξύρρυγχου, πέστροφας και γατόψαρου, αρχικά έγινε εκχύλιση με ρυθμιστικό διάλυμα McIlvaine που περιείχε EDTA. Μετά από φυγοκέντρηση προστέθηκε στο υπερκείμενο 20% TCA και κατόπιν οδηγήθηκε για περαιτέρω καθαρισμό σε μικροστήλες SPE. Η έκλουση της οξυτετρακυκλίνης έγινε με το ρυθμιστικό διάλυμα McIlvaine που περιείχε EDTA και η επαναδιάλυση με την κινητή φάση, η οποία ήταν μίγμα οξαλικού οξέος 0,01 Μ (που περιείχε άλας του οκτανοσουλφονικού οξέος με νάτριο) και ακετονιτρίλιο (70.5:29.5, v/v). Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν YMC C18 (250 4,6 mm, 5 μm) στους 45 οc και ο ανιχνευτής UV στα 355 nm. Οι ανακτήσεις που επιτεύχθησαν ήταν 59,098,4% και τα όρια ανίχνευσης τα 2 ng/g για το λούτσο, τα 4 ng/g για το σολομό του Ατλαντικού και την πέστροφα, τα 6 ng/g για την πέρκα και τα 3 ng/g για τον λευκό οξύρρυγχο και το γατόψαρο. [97] Για τον προσδιορισμό της τετρακυκλίνης, της χλωροτετρακυκλίνης, της οξυτετρακυκλίνης, και της δοξυκυκλίνης σε δείγματα ιστού μαγιάτικου και χελιού αρχικά έγινε εκχύλιση με ρυθμιστικό διάλυμα McIlvaine που περιείχε Na2EDTA 0,1 Μ (ph = 4). Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο διάλυμα οδηγήθηκε για περαιτέρω καθαρισμό σε μικροστήλες Bond Elut ENV για εκχύλιση στερεάς φάσης. Η έκλουση των ενώσεων έγινε με μεθανόλη και η επαναδιάλυση των δειγμάτων με μίγμα νερού/μεθανόλης (50:50, v/v). Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν Bakerbond C8 (5 μm, 250 4,6 mm) στους 30 οc, ενώ για την ανίχνευση υπήρχε φασματοφωτόμετρο μάζας και ανιχνευτής UV στα 350 nm. Η κινητή

158 φάση ήταν μίγμα μεθανόλης/ακετονιτριλίου/υδατικού διαλύματος οξαλικού οξέος 5 mm (18:27:55, v/v/v) και ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η ντεμεκλοκυκλίνη. Οι ανακτήσεις που επιτεύχθησαν ήταν 66,8-85,1% και τα όρια ανίχνευσης τα 0,001 ppm για την τετρακυκλίνη και την οξυτετρακυκλίνη, τα 0,004 ppm για τη χλωροτετρακυκλίνη και τα 0,002 ppm για την δοξυκυκλίνη. [98] Για τον προσδιορισμό της οξυτετρακυκλίνης σε δείγματα ιστού πέστροφας αρχικά έγινε εκχύλιση με ρυθμιστικό διάλυμα McIlvaine που περιείχε EDTA. Μετά από φυγοκέντρηση το υπερκείμενο διάλυμα οδηγήθηκε για περαιτέρω καθαρισμό σε μικροστήλες Oasis HLB (Waters) για εκχύλιση στερεάς φάσης. Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν PLRP-S (4,6 150 mm, 100 Å, 5 μm), ενώ για την ανίχνευση χρησιμοποιήθηκε UV στα 350 nm. Η κινητή φάση ήταν μίγμα υδατικού διαλύματος τριφθοροοξικού οξέος 0,1% και 0,1% τριφθοροοξικό οξύ σε ακετονιτρίλιο με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης. Οι ανακτήσεις που επιτεύχθησαν ήταν % και το όριο ανίχνευσης τα 0,04 μg/g. [99] Η τετρακυκλίνη, η οξυτετρακυκλίνη, η χλωροτετρακυκλίνη και η δοξυκυκλίνη προσδιορίστηκαν σε εδώδιμους ιστούς κυπρίνου με μία γρήγορη μέθοδο σύζευξης της μικροεκχύλισης στερεάς φάσης SPME στην HPLC με φασματοφωτομετρικό ανιχνευτή στα 355 nm. Στα δείγματα προστέθηκε EDTA 0,01Μ σε διάλυμα McIlvaine (ph = 4,0) και μετά από ανάδευση και φυγοκέντρηση το υπερκείμενο διάλυμα εισήχθη στην αναλυτική στήλη, η οποία ήταν Kromasil ODS (5 μm, 250 4,6 mm), ενώ η κινητή φάση αποτελείτο από 20% μεθανόλη 20% ακετονιτρίλιο και 60% οξαλικό οξύ 0,02 mol/l (ph = 3,0). Τα όρια ανίχνευσης της μεθόδου ήταν τα 22 ng/g για την τετρακυκλίνη, τα 16 ng/g για την οξυτετρακυκλίνη, τα 30 ng/g για τη χλωροτετρακυκλίνη και τα 21 ng/g για τη δοξυκυκλίνη. [100] Ο προσδιορισμός της οξυτετρακυκλίνης σε δείγματα ιστού ψαριού πραγματοποιήθηκε με μέθοδο HPLC ενός σταδίου. Η μέθοδος περιλαμβάνει προκατεργασία των δειγμάτων με εκχύλιση υγρού-υγρού, αποπρωτεΐνωση και ανάλυση. Η ανίχνευση έγινε με φασματοφωτόμετρο. Οι ανακτήσεις της μεθόδου ήταν 33-35% και το όριο ποσοτικού προσδιορισμού που επιτεύχθηκε 0,04 μg/g. Η μέθοδος εφαρμόστηκε με επιτυχία σε φαρμακοκινητικές μελέτες. [101] Από τις δημοσιευμένες εργασίες που αναφέρθηκαν μπορούν να παρατηρηθούν τα εξής: Όλες οι δημοσιευμένες εργασίες χρησιμοποιούν την HPLC για την ανάλυση των δειγμάτων [93 101]. Στις περισσότερες εργασίες [93, 95, 97, 99, 101] προσδιορίζεται μία μόνο ένωση, ενώ στις υπόλοιπες, είτε τρεις ενώσεις [94], είτε τέσσερις [96, 98, 99]

159 Για την εκλεκτική παραλαβή των αντιβιοτικών ενώσεων από τα δείγματα χρησιμοποιείται τόσο η εκχύλιση υγρού-υγρού, με διαλύτες όπως υδροχλώριο, εξάνιο, ρυθμιστικό διάλυμα, είτε φωσφορικών, είτε κιτρικών, σε διάφορες τιμές ph και το τριχλωροοξικό οξύ [93, 94, 96, 101], όσο και η εκχύλιση στερεάς φάσης, με την έκλουση των ενώσεων να πραγματοποιείται με μεθανόλη, ρυθμιστικό διάλυμα McIlvaine που περιείχε EDTA ή Na2EDTA [95, 97 99]. Σε μία μόνο εργασία χρησιμοποιείται για την εκλεκτική παραλαβή των ενώσεων η μικροεκχύλιση στερεάς φάσης SPME [100]. Για την ανίχνευση χρησιμοποιήθηκε κυρίως UV ανιχνευτής [95 101], αλλά και σε δύο εργασίες φθορισμόμετρο [93, 94] Προσδιορισμός τετρακυκλινών σε δείγματα τροφών. Συνολικά τρεις εργασίες βρέθηκαν στη βιβλιογραφία με προσδιορισμό τετρακυκλινών σε δείγματα ζωοτροφών. Από αυτές οι δύο είναι HPLC μεθοδολογίες και η μία χρησιμοποιεί χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC). Στην εργασία που ακολουθεί, ο Fiori και η ομάδα του προσδιόρισαν τη δοξυκυκλίνη, τη μετακυκλίνη και την 6-επι-δοξυκυκλίνη σε φαρμακευτικό πρόμιγμα τροφής που περιείχε 10% δοξυκυκλίνη. Τα δείγματα της τροφής αρχικά διαλύθηκαν σε μίγμα νερού/ακετονιτριλίου 80:20 v/v, οξινισμένο με HCl 0,1 Μ, θερμάνθηκαν στους 45 oc και αραιώθηκαν στο διπλάσιο όγκο με νερό. Οι ενώσεις ανιχνεύθηκαν με δύο τρόπους. Πρώτα με UV στα 346 nm, είτε σε στήλη Phenomenex Luna C18 (3,5 μm, 150 2,0 mm) με κινητή φάση οξαλικό οξύ/naoh 0,02 M (ph = 2,5)/ακετονιτρίλιο/μεθανόλη (75:17:8 v/v), είτε σε στήλη Phenomenex Synergi PolarRP80A (150 x 2,00 mm, 4 μm) με κινητή φάση οξαλικό οξύ 0,02 Μ (ph = 2,5)/ακετονιτρίλιο (82:18 v/v). Ο δεύτερος τρόπος ανίχνευσης ήταν με φασματοφωτόμετρο μάζας (MS/MS), είτε με στήλη Phenomenex Luna C18 (3,5 μm, 150 2,0 mm) και κινητή φάση μίγμα οξικού οξέος 0,01% (ph = 3,0)/ακετονιτριλίου/μεθανόλης (75:10:15 v/v) για το θετικό ιονισμό και μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος τριχλωροοξικού οξέος 20 mm (ph = 8,0)/μεθανόλης (70:30 v/v) για τον αρνητικό ιονισμό, είτε με στήλη Phenomenex Synergi Polar-RP 80A (4 μm, 150 2,00 mm) και κινητή φάση μίγμα τριφθοροοξικού οξέος 0,1%/διάλυμα αμμωνίας (ph = 2,5)/ακετονιτρίλιο (87:13 v/v) στο θετικό ιονισμό. Το όριο ανίχνευσης που επιτεύχθηκε για τη δοξυκυκλίνη ήταν 0,00290 mg/ml και η ανάκτηση 101,71%. [102] Για τον προσδιορισμό της οξυτετρακυκλίνης, της τετρακυκλίνης και της χλωραμφαινικόλης σε δείγματα ζωοτροφής χρησιμοποιήθηκε στήλη Cosmosil 5 C18-MS-II (4,

160 250 mm, 5 μm). Στα δείγματα αρχικά προστέθηκε οξικός αιθυλεστέρας και μετά από φυγοκέντρηση η υπερκείμενη φάση εξατμίστηκε μέχρι ξηρού. Η επαναδιάλυση του δείγματος έγινε με διάλυμα μεθανόλης 20% v/v, που περιείχε NaCl 4% m/m για να εισαχθεί στην αναλυτική στήλη. Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν μίγμα ακετονιτριλίου 25% v/v και 0,01 mol/l NaH2PO4 με 0,001 mol/l Na2EDTA (ph = 2,5 με 30% HNO3) 75% v/v. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με UV στα 270 nm, ενώ τα όρια ανίχνευσης ήταν 0,015 mg/l για την οξυτετρακυκλίνη, 0,031 mg/l για την τετρακυκλίνη και 0,011 mg/l για τη χλωραμφαινικόλη και οι ανακτήσεις των ενώσεων από τα δείγματα 82,1 90,0%. [103] Ο Naidong και η ομάδα του ανέπτυξαν μια TLC μέθοδο για τον προσδιορισμό της τετρακυκλίνης σε δείγματα ζωοτροφής και της τετρακυκλίνης, της χλωροτετρακυκλίνης και της οξυτετρακυκλίνης σε προμίγματα τροφής. Τα δείγματα ζωοτροφής αρχικά εμβολιάστηκαν με υδροχλωρική τετρακυκλίνη και κατόπιν προστέθηκε οξινισμένη μεθανόλη (μεθανόλη/hcl 1 Μ, 99:1 v/v) και το εσωτερικό πρότυπο (b-αποοξυτετρακυκλίνη). Έπειτα προστέθηκε μεθανόλη και το δείγμα εφαρμόστηκε πάνω στην TLC πλάκα. Η ίδια μέθοδος ακολουθήθηκε και στα προμίγματα τροφής. Η πλάκα επίστρωσης των ενώσεων ήταν επικαλυμένη με διοξείδιο του πυριτίου, ενώ είχε ψεκασθεί επίσης με Na2EDTA 10% m/v (ph = 8,0 για την τετρακυκλίνη και τη χλωροτετρακυκλίνη και ph = 9,0 για την οξυτετρακυκλίνη). Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν μίγμα διχλωρομεθανίου,μεθανόλης και νερού σε αναλογίες 59:35:6 v/v για την τετρακυκλίνη, 60:35:5 v/v για τη χλωροτετρακυκλίνη και 58:35:7 v/v για την οξυτετρακυκλίνη. Η πλάκα ανάπτυξης των ενώσεων θερμάνθηκε στους 105 οc και κατόπιν βυθίστηκε κάθετα σε υγρή παραφίνη με εξάνιο (30:70 v/v). Η ανίχνευση των ενώσεων πραγματοποιήθηκε με πυκνόμετρο σάρωσης στα 400 nm. Τα όρια ποσοτικού προσδιορισμού που επιτεύχθησαν ήταν τα 0,2 ng για την τετρακυκλίνη και τη χλωροτετρακυκλίνη και τα 0,1 ng για την οξυτετρακυκλίνη, ενώ οι ανακτήσεις στη ζωοτροφή ήταν 72,6 80,2% και στα προμίγματα μεγαλύτερες από 98%. [104]

161 10.5 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΚΑΤΗΓΟΡΙΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΙΧΘΥΩΝ Εκτός από τις μεθόδους που περιγράφηκαν στις προηγούμενες παραγράφους, υπάρχουν και ορισμένες εργασίες στη βιβλιογραφία που περιγράφουν τον ταυτόχρονο προσδιορισμό ενώσεων από διάφορες κατηγορίες αντιβιοτικών σε δείγματα ιχθύων, αλλά και σε ιζήματα από ιχθυοκαλλιέργειες με την τεχνική της HPLC. Για παράδειγμα, στην εργασία που ακολουθεί αναλύθηκαν οι ενώσεις: φουραζολιδόνη, νιφουρπυρινόλη, ντιφουραζόνη, φουραμιζόλη, σουλφαμεραζίνη, σουλφισοζόλη, σουλφαμονομεθοξίνη, σουλφαντιμεθοξίνη και τρεις ενώσεις από την κατηγορία των (φθορο)κινολονών: το οξολινικό οξύ, το ναλιδιξικό οξύ και το πιρομιδικό οξύ σε δείγματα ιστού από ψάρι. Η εκχύλιση των δειγμάτων έγινε με ακετόνη, ενώ καθαρίστηκαν επιπλέον σε μικροστήλες SPE με προσροφητικό υλικό Al2O3 δίνοντας ανακτήσεις της τάξης του 80%. Ο διαχωρισμός των 11 ενώσεων έγινε με στήλη Nucleosil C18 και η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν μίγμα τετραϋδοφουρανίου/ακετονιτριλίου/φωσφορικού οξέος/νερού σε αναλογία 29/1/0,06/69,94 v/v. [105] Χρωματογραφική στήλη Chromspher C8 χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της αμφαινικόλης, χλωραμφαινικόλης και των ενώσεων: φουραζολιδόνη, φουραλταδόνη και νιτροφουραζόνη σε ιστούς από ψάρι. Οι ενώσεις εκχυλίστηκαν αρχικά με οξικό αιθυλεστέρα και κατόπιν με πετρελαϊκό αιθέρα και n-πεντάνιο. Για την ανίχνευση των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε παράταξη φωτοδιόδων στα 280 nm για τη χλωραμφαινικόλη και τα 360 nm για τη φουραζολιδόνη, τη φουραλταδόνη και τη νιτροφουραζόνη. Τα όρια ανίχνευσης της μεθόδου ήταν το 1 μg/kg για τη φουραζολιδόνη και τη νιτροφουραζόνη και τα 2 μg/kg για τη χλωραμφαινικόλη και τη φουραλταδόνη, ενώ οι ανακτήσεις κυμαίνονταν από 69 88%. [106] Στην επόμενη εργασία προσδιορίστηκαν η οξυτετρακυκλίνη από τις τετρακυκλίνες και το οξολινικό οξύ και η φλουμεκίνη από τις (φθορο)κινολόνες σε δείγματα από σύμπηκτα τροφής (pellets) που χρησιμοποιούνται σε ψάρια ιχθυοκαλλιέργειας. Τα δείγματα που περιείχαν οξυτετρακυκλίνη εκχυλίστηκαν με μίγμα που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών και μεθανόλη (1:1 v/v) και ισοπροπανόλη, ενώ ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η ντεμεκλοκυκλίνη. Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο διαλύθηκε σε διάλυμα οξυτετρακυκλίνης. Τα δείγματα που περιείχαν φλουμεκίνη εκχυλίστηκαν με μίγμα που περιείχε NaOH 0,1M σε ακετόνη/νερό (2:1 v/v), ενώ ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε το οξολινικό οξύ. Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο διαλύθηκε σε διάλυμα φλουμεκίνης. Τα δείγματα που περιείχαν οξολινικό οξύ εκχυλίστηκαν με μίγμα που περιείχε

162 NaOH 0,5M σε ακετόνη/νερό (2:1 v/v), ενώ ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η φλουμεκίνη. Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο διαλύθηκε σε διάλυμα οξολινικού οξέος. Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε για την οξυτετρακυκλίνη ήταν μίγμα οξαλικού οξέος 0,02 Μ (ph = 2,0) και μεθανόλης (950:50 v/v) που περιείχε διμεθυλοφορμαμίδιο, ενώ για τον προσδιορισμό του οξολινικού οξέος και της φλουμεκίνης η κινητή φάση αποτελείτο από μίγμα φωσφορικού οξέος 0,02 Μ/ακετονιτριλίου/τετραϋδοφουρανίου (65:20:15 v/v). Ο ανιχνευτής ήταν UV στα 350 nm για την οξυτετρακυκλίνη και 336 nm για το οξολινικό οξύ και τη φλουμεκίνη. Οι ανακτήσεις ήταν της τάξης του % για την οξυτετρακυκλίνη και 100% για το οξολινικό οξύ και τη φλουμεκίνη. [107] Η οξυτετρακυκλίνη από τις τετρακυκλίνες, το οξολινικό οξύ και η μιλοξακίνη από τις (φθορο)κινολόνες, καθώς και η σουλφαμονομεθοξίνη προσδιορίστηκαν σε ιστούς από μαγιάτικο, συναγρίδα, σκουμπρί, βακαλάο, κυπρίνο, χέλι, πέστροφα, ψάρι ayu, κιχλίδες, σολομό amago, salmon, πεταλούδα (crucian carp), ασημένιο σολομό, καραβίδα (Kuruma prawn) και γαρίδα. Για την οξυτετρακυκλίνη, προστέθηκε στο μυϊκό ιστό διάλυμα 30% μεθανόλης που περιείχε 0,5% EDTA. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο οδηγήθηκε στην αναλυτική στήλη Hisep (15 4,6 mm, 5 μm) για ανάλυση. Για το οξολινικό οξύ, τη μιλοξακίνη και τη σουλφαμονομεθοξίνη, προστέθηκε στο μυϊκό ιστό μίγμα ακετονιτριλίου/τετραϋδοφουρανίου (95:5 v/v). Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και οδηγήθηκαν κατόπιν στη στήλη. Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της οξυτετρακυκλίνης ήταν μίγμα μεθανόλης/ οξαλικού οξέος 0,2Μ (1:9, v/v) (ph = 7,0 με αμμωνιακό διάλυμα 28%), ενώ για το οξολινικό οξύ, τη μιλοξακίνη και τη σουλφαμονομεθοξίνη μίγμα κιτρικού οξέος 0,05 Μ και ρυθμιστικού διαλύματος Na2HPO4 0,2 Μ (ph = 2,5 με τετρα-n-βουτυλο-βρωμιούχο αμμώνιο) με ακετονιτρίλιο (85:15 v/v). Για την ανίχνευση χρησιμοποιήθηκε UV στα 360 nm για την οξυτετρακυκλίνη και 265 nm για το οξολινικό οξύ, τη μιλοξακίνη και τη σουλφαμονομεθοξίνη. Τα όρια ανίχνευσης της μεθόδου ήταν της τάξης του 0,02 0,04 μg/g και οι ανακτήσεις 77% για την οξυτετρακυκλίνη, 92% για το οξολινικό οξύ, 89% για τη μιλοξακίνη και 80% για τη σουλφαμονομεθοξίνη. [108] Ο προσδιορισμός των (φθορο)κινολονών: σιπροφλοξακίνη, σαραφλοξακίνη, ντανοφλοξακίνη, ενροφλοξακίνη και ντιφλοξακίνη, καθώς και των τετρακυκλινών: οξυτετρακυκλίνη, τετρακυκλίνη και χλωροτετρακυκλίνη σε δείγματα ιστού από γατόψαρο έγινε με εκχύλιση υγρού-υγρού με μίγμα 1:1 ακετονιτριλίου και ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικών, που περιείχε MgCl2. Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν Agilent ZORBAX Eclipse XDB-phenyl (3,0 150 mm, 3,5 μm) και η κινητή φάση ήταν μίγμα από Α: άλας του μηλονικού οξέος 0,1 Μ, MgCl2 50 mm (ph = 6,5 με NH4OH) και Β: μεθανόλη, με

163 πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης. Για την ανίχνευση των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε φθορισμόμετερο και συγκεκριμένα στα λex = 275 nm και λem = 425 nm για τις (φθορο)κινολόνες (σιπροφλοξακίνη, σαραφλοξακίνη, ντανοφλοξακίνη, ενροφλοξακίνη, ντιφλοξακίνη) και στα λex = 375 nm και λem = 535 nm για τις τετρακυκλίνες (οξυτετρακυκλίνη, τετρακυκλίνη, χλωροτετρακυκλίνη). Οι ανακτήσεις της μεθόδου κυμάνθηκαν από 60-92%, ενώ τα όρια ποσοτικού προσδιορισμού ήταν το 0,15 ng/g για τη ντανοφλοξακίνη, το 0,5 ng/g για την οξυτετρακυκλίνη, τη χλωροτετρακυκλίνη, τη σαραφλοξακίνη και την ενροφλοξακίνη, το 1 ng/g για την τετρακυκλίνη και τη ντιφλοξακίνη και το 1,5 ng/g για την σιπροφλοξακίνη. [109] Ο προσδιορισμός των κινολονών: οξολινικό οξύ και φλουμεκίνη, της τετρακυκλίνης: οξυτετρακυκλίνη, καθώς και της σουλφαδιαζίνης και της τριμεθοπρίμης σε δείγματα ιστού και δέρματος τσιπούρας έγινε με εκχύλιση υγρού-υγρού, αρχικά με ακετονιτρίλιο και κατόπιν με κιτρικό οξύ (ph = 4,0) που περιείχε και Na2EDTA 0,5M. Τα δείγματα αφού φυγοκεντρήθηκαν, η υπερκείμενη φάση τους εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκε στην κινητή φάση για να αναλυθεί. Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν Atlantis dc18 (150 2,00 mm, 5 μm Waters) και η κινητή φάση μίγμα μυρμηκικού οξέος 0,1% και μεθανόλης με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης. Για την ανίχνευση των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο μάζας (MS-ESI). Οι ανακτήσεις της μεθόδου κυμάνθηκαν από %, ενώ τα όρια ποσοτικού προσδιορισμού ήταν τα 20 μg/kg για όλες τις ενώσεις. [110] Στην επόμενη εργασία προσδιορίστηκαν η οξυτετρακυκλίνη, η χλωροτετρακυκλίνη και η τετρακυκλίνη από τις τετρακυκλίνες και η σουλφαδιαζίνη, η σουλφαμεραζίνη και η σουλφαδιμεθοξίνη από την οικογένεια των σουλσοναμιδίων σε δείγματα ιστού τσιπούρας. Τα δείγματα εκχυλίστηκαν με μίγμα μεθανόλης/νερού (70/30 v/v) που περιείχε Na2EDTA 0,1 M. Μετά από φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο διάλυμα των δειγμάτων εισήχθη στην αναλυτική στήλη, η οποία ήταν Teknokroma (15,0 0,21cm, 5 μm). Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε ήταν μίγμα μυρμηκικού οξέος 0,1% και ακετονιτριλίου με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης. Ο ανιχνευτής ήταν φασματοφωτόμετρο μάζας, ενώ οι ανακτήσεις που επιτεύχθησαν ήταν της τάξης του % και τα όρια ανίχνευσης 1,2-16 μg/kg. [111] Ο προσδιορισμός των 5 τετρακυκλινών: χλωροτετρακυκλίνης, οξυτετρακυκλίνης, τετρακυκλίνης, δοξυκυκλίνης και ντεμεκλυκυκλίνης και των 17 σουλφοναμιδίων: σουλφαδιαζίνη, σουλφαδιαζόλη, σουλφαμεραζίνη, σουλφαδιμιδίνη, σουλφαμεθοξυπυριδαζίνη, σουλφαμονομεθοξίνη, σουλφαχλωροπυριδαζίνη, σουλφαντιμεθοξίνη, σουλφαμεθιζόλη, σουλφαμεθοξαζόλη, σουλφισοξαζόλη, σουλφαγουανιδίνη, σουλφαπυριδίνη, σουλφαμοξόλη, σουλφακινοξαλίνη, σουλφαδοξίνη και σουλφακλοζίνη σε δείγματα ιστού τσιπούρας και λαβρακιού έγινε με εκχύλιση υγρού-υγρού με μίγμα μεθανόλης/ακετονιτριλίου (50/50 v/v)

164 οξινισμένο με μυρμηκικό οξύ 0,05%. Τα δείγματα αφού φυγοκεντρήθηκαν, η υπερκείμενη φάση τους εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκε σε μυρμηκικό οξύ 0,2% για να αναλυθεί. Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν Zorbax Eclipse plus C18 (2,1 50 mm, 1,8 μm) και η κινητή φάση μίγμα μυρμηκικού οξέος 0,1% και ακετονιτριλίου με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης. Για την ανίχνευση των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο μάζας (MS/MS-ESI). Οι ανακτήσεις της μεθόδου ήταν πολύ υψηλές, ενώ τα όρια ανίχνευσης ήταν 5,65 25,8 μg/kg για όλες τις ενώσεις. [112] Ο προσδιορισμός των τετρακυκλινών: χλωροτετρακυκλίνης και οξυτετρακυκλίνης, των αμφαινικολών: χλωραμφαινικόλης και θειαμφαινικόλης, των πενικιλινών: αμοξυκιλίνης, αμοξυκιλοικού σουλφαδιαζίνης, οξέος, αμπικιλίνης Ν4-ακετυλο- και αμπικιλοικού σουλφαδιαζίνης, οξέος, των σουλφοναμιδίων: σουλφαμεθαζίνης, Ν4-ακετυλο- σουλφαμεθαζίνης, σουλφαμεραζίνης, Ν4-ακετυλο- σουλφαμεραζίνης και σουλφαμεθοξαζόλης καθώς και της τριμετροπρίμης σε δείγματα ιστού μπακαλιάρου, γαύρου, μυδιών και γλώσσας έγινε με ενζυμική εκχύλιση υγρού-υγρού με μικροκύματα, αρχικά με νερό και κατόπιν με διχλωρομεθάνιο. Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν Phenomenex Gemini C18 (150 4,6 mm, 5 μm) και η κινητή φάση μίγμα μυρμηκικού οξέος 0,1% και ακετονιτριλίου με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης. Για την ανίχνευση των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο μάζας, ενώ οι ανακτήσεις της μεθόδου ήταν %. [113] Τέλος, βρέθηκε μία εργασία στη βιβλιογραφία για τον προσδιορισμό της οξυτετρακυκλίνης και της φλουμεκίνης σε ιζήματα από δύο ιχθυοκαλλιέργειες με πέστροφα και τρεις ιχθυοκαλλιέργειες με λαβράκι. Αρχικά τα δείγματα εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα McIlvaine που περιείχε και Na2EDTA 0,1 Μ (ph = 4,0) και κατόπιν το υπερκείμενο διάλυμα καθαρίστηκε περαιτέρω σε μικροστήλες Lichrolut EN (200 mg/3 ml) με την τεχνική της SPE. Η έκλουση των ενώσεων έγινε με μεθανόλη και οξικό αιθυλεστέρα. Τα εκχυλίσματα εξατμίστηκαν μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκαν σε μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος μυρμηκικού οξέος 0,1% και ακετονιτριλίου (9:1 v/v) για να εισαχθούν στην αναλυτική στήλη LUNA C8 (50 2 mm, 3 μm). Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η βαρφαρίνη, ενώ η έκλουση των ενώσεων από τη στήλη έγινε βαθμωτά με μυρμηκικό οξύ 0,1% και ακετονιτρίλιο. Ο ανιχνευτής ήταν φασματοφωτόμετρο μάζας και οι ανακτήσεις που επιτεύχθησαν 88% για την οξυτετρακυκλίνη και 93% για τη φλουμεκίνη. Όσον αφορά στα όρια ανίχνευσης για την οξυτετρακυκλίνη ήταν τα 0,061 μg/kg και τα 0,012 μg/kg για τη φλουμεκίνη. [114] Συνοψίζοντας από τις όλες τις παραπάνω εργασίες, είτε αναλύονται δείγματα ιχθύων, είτε δείγματα τροφής με χρωματογραφικές τεχνικές (υγρή και αέρια χρωματογραφία), όπως φαίνεται και στο σχήμα 10.1, στις περισσότερες εργασίες ο ανιχνευτής που χρησιμοποιείται

165 είναι το φασματοφωτόμετρο υπεριώδους UV [62, 63, 76, 79 82, 85, 87, 90, 91, , 103, ], ενώ σε αρκετές εργασίες υπάρχει το φθορισμόμετρο [64 75, 93, 94, 109], όπως επίσης και το φασματοφωτόμετρο μάζας [77, 83, 84, 86, 88, 89, 92, 102, ]. Επιπλέον στις περισσότερες εργασίες το μοναδικό υπόστρωμα που χρησιμοποιείται είναι ο μυϊκός ιστός των ιχθύων που αναλύονται [63 65, 67, 68, 71, 72, 74 77, 80, 82 89, 91, 93, 94, , 105, 106, 108, 109, ]. Όπως φαίνεται και στο σχήμα 10.2, λιγότερες είναι οι εργασίες στη βιβλιογραφία που προσδιορίζουν αντιβιοτικά εκτός από τον ιστό των ιχθύων και σε περισσότερα υποστρώματα, όπως στο πλάσμα των ιχθύων [62, 70, 73], στο ήπαρ [66, 69, 70, 81, 95], στο δέρμα [66, 69, 70, 73, 95, 110], στα οστά [66, 69, 95], στα νεφρά [69] και στη χολή των ιχθύων [70]. Μία μόνο εργασία βρέθηκε επίσης σε ιζήματα ιχθυοκαλλιεργειών [114], ενώ αρκετές προσδιορίζουν αντιβιοτικές ενώσεις σε ζωοτροφές [79, 90, 92, 102, 103, 107]. 26% UV 44% ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΟ MS 30% Σχήμα 10.1: Ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στις μεθόδους της βιβλιογραφίας. 12% 2% Μυϊκός ιστός Περισσότερα από ένα υποστρώματα 16% Ζωοτροφή 70% Ιζήματα Σχήμα 10.2: Υποστρώματα στα οποία εφαρμόζονται οι μέθοδοι της βιβλιογραφίας

166 Επίσης, όσον αφορά στις τεχνικές προκατεργασίας των δειγμάτων, όπως φαίνεται και στο σχήμα 10.3, χρησιμοποιείται περισσότερο η εκχύλιση υγρού-υγρού [65 70, 72 75, 81, 84, 88, 89, 91 94, 96, , ] και λιγότερο η εκχύλιση στερεάς φάσης SPE [62 64, 71, 76, 77, 79, 80, 82, 83, 85 87, 90, 95, 97 99, 105, 114], ενώ σε μία μόνο εργασία χρησιμοποιείται η μικροεκχύλιση στερεάς φάσης SPME [100]. Τέλος, στις μισές περίπου από τις δημοσιευμένες εργασίες που χρησιμοποιούν την HPLC ως αναλυτική τεχνική, οι ενώσεις που προσδιορίζονται είναι μόνο μία [62, 65, 66, 69, 70, 72, 76, 82 88, 90 93, 95, 97, 99, 101], όπως φαίνεται και στο σχήμα Λίγες είναι οι εργασίες που προσδιορίζουν δύο ενώσεις [64, 73, 81, 114], τρεις ενώσεις [63, 68, 74, 80, 94, 102, 103, 107] και τέσσερις [67, 96, 98, 100, 106, 108], ενώ από πέντε και περισσότερες ενώσεις βρέθηκαν δέκα συνολικά εργασίες [71, 75, 77, 79, 105, ]. 2% ΥΓΡΟΥ-ΥΓΡΟΥ 39% SPE 59% SPME Σχήμα 10.3: Τεχνικές προκατεργασίας των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται στις μεθόδους της βιβλιογραφίας. 1 ένωση 20% 2 ενώσεις 44% 12% 3 ενώσεις 4 ενώσεις 16% Πέντε ή/και περισσότερες ενώσεις 8% Σχήμα 10.4: Αριθμός ενώσεων που προσδιορίζονται με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) στις μεθόδους της βιβλιογραφίας

167

168 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Από όσα έχουν ήδη προαναφερθεί στο γενικό θεωρητικό μέρος, είναι φανερό το πρόβλημα της αλόγιστης χρήσης διαφόρων αντιβιοτικών ενώσεων στις ιχθυοκαλλιέργειες, είτε για θεραπευτικούς, είτε για προληπτικούς λόγους. Επομένως είναι επιτακτική η ανάγκη ελέγχου και προσδιορισμού της παρουσίας αντιβιοτικών καταλοίπων στους ιστούς των ψαριών της ιχθυοκαλλιέργειας με άμεσο στόχο την προστασία της υγείας των καταναλωτών από την εμφάνιση ανθεκτικών στα αντιβιοτικά βακτηριακών στελεχών στον άνθρωπο. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη και η επικύρωση μεθόδων Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης (HPLC) για τον ταυτόχρονο διαχωρισμό και προσδιορισμό υπολειμμάτων διαφόρων αντιβιοτικών ενώσεων, καθώς και η εφαρμογή τους στον ποσοτικό προσδιορισμό τους σε δείγματα ιχθύων ιχθυοκαλλιέργειας. Η παρούσα διατριβή είναι χωρισμένη σε τρία μέρη. Στο πρώτο μέρος αναπτύχθηκε μία μέθοδος για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό επτά κινολονών [φλουμεκίνη (FLU), σιπροφλοξακίνη (CIP), ενροφλοξακίνη (ENR), ντανοφλοξακίνη (DAN), ναλιδιξικό οξύ (NAL), οξολινικό οξύ (OXO) και σαραφλοξακίνη (SAR)]. Αρχικά η αναπτυσσόμενη μέθοδος βελτιστοποιήθηκε και επικυρώθηκε για τον προσδιορισμό των επτά ενώσεων σε πρότυπα διαλύματά τους. Στη συνέχεια η μέθοδος εφαρμόστηκε σε κτηνιατρικά φαρμακευτικά σκευάσματα που περιείχαν κάποιες από τις συγκεκριμένες κινολόνες, έτσι ώστε να ελεγχθεί η περιεκτικότητά τους. Έπειτα αναπτύχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν τα κατάλληλα πρωτόκολλα προκατεργασίας εμβολιασμένων δειγμάτων ιστών ιχθύων (τσιπούρας και σολομού) και ιχθυοτροφής με κινολόνες για την παραλαβή και απομόνωσή τους. Τέλος, έγινε εφαρμογή του πρωτοκόλλου και σε πραγματικά δείγματα ιστών από τσιπούρες, οι οποίες εκτρέφονταν για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα με ιχθυοτροφή, στην οποία είχαν προστεθεί ποσότητες οξολινικού οξέος και φλουμεκίνης. Στο δεύτερο μέρος αναπτύχθηκε μία μέθοδος για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό τριών αμφαινικολών [χλωραμφαινικόλης (CAP), θειαμφαινικόλης (TAP) και φλορφενικόλης (FFC)], καθώς και έξι πενικιλινών [αμπικιλίνη (AMP), οξακιλίνη (OXA), κλοξακιλίνη (CLO), δικλοξακιλίνη (DICLO), πενικιλίνη V (PV) και πενικιλίνη G (PG)]. Αρχικά η μέθοδος βελτιστοποιήθηκε και επικυρώθηκε για τον προσδιορισμό των εννέα ενώσεων σε πρότυπα διαλύματά τους, ενώ κατόπιν εφαρμόστηκε σε κτηνιατρικά φαρμακευτικά σκευάσματα που περιείχαν κάποιες από τις παραπάνω ενώσεις, έτσι ώστε να ελεγχθεί η περιεκτικότητά τους

169 Έπειτα αναπτύχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν τα κατάλληλα πρωτόκολλα προκατεργασίας εμβολιασμένων δειγμάτων ιστών τσιπούρας για την παραλαβή και απομόνωσή τους. Στο τελευταίο κομμάτι αναπτύχθηκε μία μέθοδος για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό εννέα αντιβιοτικών της ομάδας των τετρακυκλινών [τετρακυκλίνη (TC), επι-τετρακυκλίνη(epitc), οξυτετρακυκλίνη (OTC), επι-οξυτετρακυκλίνη (epi-otc), χλωροτετρακυκλίνη (CTC), επι-χλωροτετρακυκλίνη (epi-ctc), δοξυκυκλίνη (DC), ντεμεκλοκυκλίνη (DMC) και μετακυκλίνη (MTC)]. Αρχικά η αναπτυσσόμενη μέθοδος βελτιστοποιήθηκε και επικυρώθηκε για τον προσδιορισμό των εννέα ενώσεων σε πρότυπα διαλύματά τους. Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν τα κατάλληλα πρωτόκολλα προκατεργασίας εμβολιασμένων δειγμάτων ιστών τσιπούρας με τετρακυκλίνες για την παραλαβή και την απομόνωσή τους. Όλες οι μέθοδοι που εφαρμόστηκαν επικυρώθηκαν με βάση τις απαιτήσεις που έχει καθορίσει η Ευρωπαϊκή νομοθεσία μέσω της οδηγίας 2002/657/EC περί κριτηρίων που πρέπει να πληρούν τεχνικές και μέθοδοι ανάλυσης για τον προσδιορισμό καταλοίπων αντιβιοτικών σε τρόφιμα που προορίζονται για το καταναλωτικό κοινό. Έτσι όλες οι μέθοδοι ελέγχθηκαν ως προς τη γραμμικότητα, την επαναληψιμότητα, την ενδιάμεση πιστότητα, την ευαισθησία, την εκλεκτικότητα και τη σταθερότητα των ενώσεων, το όριο απόφασης και την ικανότητα ανίχνευσης

170 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 ΣΥΣΚΕΥΕΣ-ΟΡΓΑΝΑ-ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 12.1 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Τα όργανα που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, ήταν: Διάταξη Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης, η οποία συμπεριλαμβάνει τα εξής: Αντλία βαθμωτής έκλουσης και σταθερής ροής, LC-10ADVP της εταιρείας Shimadzu (Kyoto, Japan). Βαλβίδα εισαγωγής δείγματος Rheodyne 7725i, με βρόχο χωρητικότητας 20 μl, (Rheodyne, Cotati, GA, USA). Μίκτης κινητών φάσεων FCV-10ALVP, Shimadzu. Ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων SPD-M10AVP, Shimadzu. Μονάδα ελέγχου συστήματος SCL-10ALVP, Shimadzu. Λογισμικό ελέγχου συστήματος Lab Solutions, LC Solution, Shimadzu. Συσκευή απαέρωσης διαλυτών DGU-10B, Shimadzu. Μικροσύριγγα SGE μl (Australia). 4 φιάλες αποθήκευσης διαλυτών. Εκτυπωτής Hewlett Packard LaserJet 1100 (California, USA). Φασματοφωτόμετρο DMS 100S, Varian (Harbor City, CA, USA), με το οποίο ελήφθησαν τα φάσματα υπεριώδους όλων των εξεταζόμενων ενώσεων. Οι χρωματογραφικές στήλες που δοκιμάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν ήταν όλες της εταιρείας ΜΖ-Αnalysentechnick, Mainz, Germany, και ήταν οι εξής: Χρωματογραφική στήλη: Kromasil, C8, 5 μm, mm Χρωματογραφική στήλη: Kromasil, C18, 5 μm, mm Χρωματογραφική στήλη: Perfectsil, ODS-3, 5 μm, mm Χρωματογραφική στήλη: Perfectsil, ODS-2, 5 μm, mm Χρωματογραφική στήλη: Inertsil, C8, 5 μm, mm Χρωματογραφική στήλη: Inertsil, ODS-2 120, 5 μm, mm Χρωματογραφική στήλη: Inertsil, ODS-3, 5 μm, mm, Χρωματογραφική στήλη: MZ-Aqua Perfect, C18, 5 μm, mm

171 12.2 ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ Γυάλινη συσκευή διήθησης διαλυτών από την Alltech Associates (Deerfield, IL USA). Διηθητικοί ηθμοί WHATMAN νιτρικής κυτταρίνης, 0,2 μm (Maidstone, England). Φίλτρα σύριγγας 13 mm, 0,2μm, Supelco (Bellefonte, PA, USA). Αναλυτικός ζυγός SHIMADZU AUX 120, ακρίβειας ±0,0001g. Φυγόκεντρος Hermle Z 230 (Gosheim, Germany). Συσκευή υπερήχων, Transonic 460/h (Elma, Germany). Aναδευτήρας Small Vortexer Glass-col (Terre Haute, USA). Συσκευή για εκχύλιση στερεάς φάσης (SΡΕ), Supelco Visiprep (Bellefonte, PA, USA). Συσκευή εξάτμισης με ρεύμα αζώτου με εννέα κανάλια ReactiVapTM (model 18780), Pierce (Rockford, IL, USA). Μικροστήλες εκχύλισης στερεάς φάσης: Discovery DSC-18, 500 mg/3 ml, Supelco (Bellefonte, PA, USA). Nexus abselut, 30 mg/1 ml, Varian (Harbor City, CA, USA). Adsorbex RP-8, 30 mg/1 ml, Merck, (Darmstadt, Germany). Lichrolut RP-18, 200 mg/3 ml, Merck. Oasis HLB, 200 mg/6 ml, Waters Corporation (Milford Massachusetts, USA). Oasis HLB, 200 mg/3 ml, Waters Corporation ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΔΙΑΛΥΤΕΣ Τα αντιδραστήρια και οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας, τα οποία ήταν όλα αναλυτικώς καθαρά, ήταν τα εξής: Από την εταιρεία Sigma (St. Louis, MO, USA): Κλοξακιλλίνη, δικλοξακιλλίνη, κινίνη, χλωροκίνη, κινιδίνη, θεοφυλλίνη, καφεΐνη, υδροχλωροθειαζίδη, υδροφθορομεθαζίδη, οξυτετρακυκλίνη, δοξυκυκλίνη, ναλιδιξικό οξύ, φλουμεκίνη, σιπροφλοξακίνη, οξακιλίνη, αμπικιλίνη, φαινοξυμέθυλοπενικιλινικό οξύ (ή πενικιλίνη V), βενζυλοπενικιλίνη (ή πενικιλίνη G), θειαμφαινικόλη, φλορφαινικόλη

172 Από την εταιρεία Merck (Damstadt, Germany): οξαλικό οξύ, κιτρικό τρινάτριο, όξινο φωσφορικό νάτριο, κολχικίνη, σαλικυλικό οξύ, 4υδροξυ-βενζοϊκό οξύ, αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό νάτριο, ανθρανιλικό οξύ, υδροξείδιο του νατρίου, χλωριούχο νάτριο, ακετόνη. Από την εταιρεία Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA): Οξακιλίνη, οξικός αιθυλεστέρας, υδροξυανθρακινόνη, τριφθορο-οξικό οξύ, κολχικίνη, nεξάνιο. Από την εταιρεία Riedel-de Haen (Buchs SG, Switzerland): Κιτρικό οξύ, ντανοφλοξακίνη, σαραφλοξακίνη, οξικό αμμώνιο. Από την εταιρεία Alfa Aesar GmbH CoKG (Karlsruhe, Germany): Χλωραμφαινικόλη. Από την εταιρεία ALFA, WASSERMANN SpA (Bologna, Italy): Βαμιφυλλίνη. Από την εταιρεία Wellcome Foundation (London, UK): Λαμοτρυγίνη. Από την εταιρεία Fisher Scientific (Loughborough, Leicestershine, UK): Ακετονιτρίλιο, Μεθανόλη (για χρωματογραφία). Από την εταιρεία Fluka, (Buchs SG, Switzerland): Οξικό οξύ, χλωροτετρακυκλίνη, τετρακυκλίνη, ενροφλοξακίνη, οξολινικό οξύ. Από την εταιρεία Chem-Lab (NV, Zedelgem, Germany): Μυρμηκικό οξύ. Δις απιονισμένο νερό. Νερό υψηλής καθαρότητας από σύστημα καθαρισμού Milli-Q (Millipore, Bedford, USA)

173 Τα κτηνιατρικά φαρμακευτικά σκευάσματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή, ήταν τα εξής: 1) Εναιώρημα Baytril 0,5% της εταιρείας Bayer AG (Leverkusen, Germany). 2) Ενέσιμο Advocin 2,5% της εταιρείας Pfizer Inc. (New York, USA). 3) Εναιώρημα Flumix 10% της εταιρείας Ceva Sante Animale (France). 4) Σκόνη Inoxyl της εταιρείας Laboratoires Biové (Arques, France). 5) Αλοιφή Orbenin L.A. της εταιρείας Pfizer Inc. (New York, USA). 6) Ενέσιμο Nuflor της εταιρείας Schering-Plough Animal Health Corp. (Kenilworth, New Jersey, USA). 7) Ενέσιμο Cloxalene Plus της εταιρείας Fatro S.p.A. (Bologna, Italy)

174 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 13 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΟΝ ΜΕΘΟΔΟΥ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΗPLC ΓΙΑ ΤΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΕ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ 13.1 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Οι κινολόνες που προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε ήταν η σιπροφλοξακίνη (CIP), η ντανοφλοξακίνη (DAN), η ενροφλοξακίνη (ENR), η σαραφλοξακίνη (SAR), το οξολινικό οξύ (OXO ), το ναλιδιξικό οξύ (NAL) και η φλουμεκίνη (FLU). Αρχικά παρασκευάστηκαν πυκνά υδατικά διαλύματα της τάξης των 100 mg/l, για κάθε ένωση από τη στερεή κρυσταλλική μορφή τους, με διάλυση 1 mg της κάθε ένωσης σε 10 ml νερό Milli-Q με την προσθήκη ποσότητας 100 μl διαλύματος NaOH 0,1 Μ για κάθε 10 ml διαλύματος της κάθε ένωσης. Η προσθήκη του NaOH έγινε για να βελτιώσει τη διαλυτότητα των κινολονών στο νερό. Τα πυκνά διαλύματα συντηρούνταν στους 4oC. Οι αραιώσεις των διαλυμάτων, για την παρασκευή των υδατικών προτύπων που προορίζονταν για τις καθημερινές αναλύσεις, πραγματοποιούνταν κατά τη διάρκεια της ημέρας της ανάλυσης. Τα αραιά υδατικά διαλύματα (συγκέντρωσης μικρότερης των 2 ng/μl) ήταν ασταθή ακόμα και στους 4oC. Στη συνέχεια από τα παραπάνω πυκνά διαλύματα παρασκευάστηκαν με τις κατάλληλες αραιώσεις, υδατικά διαλύματα των 2, 5 και 10 ng/μl για την κάθε ένωση, έτσι ώστε να βρεθούν οι βέλτιστες συνθήκες της μεθόδου με διάφορες δοκιμές και μετρήσεις ΕΠΙΛΟΓΗ ΜΗΚΟΥΣ ΚΥΜΑΤΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ Ως σύστημα ανίχνευσης στην ΗΡLC χρησιμοποιήθηκε ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων. Για την επιλογή του κατάλληλου μήκους κύματος ανίχνευσης, όπου οι κινολόνες παρουσιάζουν μέγιστο απορρόφησης της υπεριώδους ακτινοβολίας, ελήφθησαν τα UV φάσματά τους σε υδατικά διαλύματα συγκέντρωσης 5 ng/μl ng/μl, από τα 190 μέχρι και τα 400 nm. Όπως φαίνεται και στο σχήμα 13.1 οι ενώσεις: CIP, DAN, ENR και SAR εμφανίζουν στα φάσματά τους μεγάλη απορρόφηση στην περιοχή των nm και γι αυτό

175 επιλέχθηκαν τα 275 nm για τη μελέτη τους, ενώ για τις ενώσεις OXO, NAL και FLU επιλέχθηκαν τα 255 nm. Στον Πίνακα 13.1 δίνονται τα μήκη κύματος της μέγιστης απορρόφησης για την κάθε ένωση, σύμφωνα με το φάσμα ολικής απορρόφησης στην περιοχή του υπεριώδους. CIP DAN Σχήμα 13.1: Φάσματα υπεριώδους (UV) των (φθορο)κινολονών σε υδατικά πρότυπα διαλύματά τους, συγκέντρωσης 5 ng/μl

176 ENR SAR OXO Σχήμα 13.1: Συνέχεια

177 NAL FLU Σχήμα 13.1: Συνέχεια

178 Πίνακας 13.1: Μέγιστα μήκη κύματος απορρόφησης των μελετώμενων (φθορο)κινολονών. Μέγιστο μήκος κύματος απορρόφησης Ένωση (nm) CIP 279 DAN 284 ENR 279 SAR 281 OXO 259 NAL 258 FLU ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΗΛΗΣ ΚΑΙ ΕΚΛΟΥΣΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Η επιλογή του κατάλληλου εκλουστικού συστήματος και της κατάλληλης στήλης είναι ένα πολύ σημαντικό βήμα για την επίτευξη ενός βέλτιστου διαχωρισμού των ενώσεων σε σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα. Και αυτό γιατί η βελτιστοποίηση των παραμέτρων Ν (= αριθμός θεωρητικών πλακών), k' (= παράγοντας συγκράτησης) και α (= παράγοντας διαχωρισμού), από τις οποίες εξαρτάται η διαχωριστική ικανότητα Rs, καθορίζεται από την επιλογή της κατάλληλης στήλης και του εκλουστικού συστήματος αντίστοιχα. Με βάση προηγούμενες βιβλιογραφικές αναφορές, ο βέλτιστος διαχωρισμός των (φθορο)κινολονών CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU, μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση στο εκλουστικό σύστημα κάποιου οξέος, όπως για παράδειγμα του τριφθοροοξικού ή του κιτρικού, είτε σε χρωματογραφικές στήλες με πληρωτικό υλικό C8, είτε με C18. Σε πρώτη φάση έγιναν δοκιμές με στήλη Kromasil, C8, 5 μm, mm και εκλουστικό σύστημα υδατικό διάλυμα τριφθοροοξικού οξέος CF3COOH (TFA) 0,1% (ph=1,00) και ακετονιτρίλιο με διάφορα προγράμματα βαθμωτής έκλουσης, αλλά παρατηρήθηκε ότι δεν γινόταν έκλουση της φλουμεκίνης. Κατόπιν, αντικαταστάθηκε η αρχική στήλη Kromasil με νέα στήλη Perfectsil ODS-2, 5 μm, mm, με το εκλουστικό σύστημα να είναι μίγμα από υδατικό διάλυμα TFA 0,1%, ακετονιτρίλιο και μεθανόλη σε διάφορα προγράμματα βαθμωτής έκλουσης. Στα χρωματογραφήματα, όμως, παρατηρήθηκε, ότι μόνο οι τρεις από τις επτά κινολόνες διαχωρίζονταν

179 Έπειτα δοκιμάστηκε να επιτευχθεί ο διαχωρισμός στη στήλη Perfectsil ODS-3, 5 μm, mm, με το εκλουστικό σύστημα να αποτελείται από υδατικό διάλυμα TFA 0,1% και ακετονιτρίλιο ή μεθανόλη ή συνδυασμό και των δύο αυτών οργανικών τροποποιητών, με βαθμωτή έκλουση. Από τα αποτελέσματα παρατηρήθηκε, ότι η προσθήκη της μεθανόλης βελτιώνει σημαντικά το διαχωρισμό των ενώσεων και γι αυτό το λόγο χρησιμοποιήθηκε τελικά ως οργανικός τροποποιητής στην κινητή φάση διφασικό οργανικό σύστημα ακετονιτριλίου (CH3CN) και μεθανόλης (CH3OH). Οι ενώσεις εκλούονται με την εξής σειρά: CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU, δηλαδή από την περισσότερο πολική (CIP) στη λιγότερο (FLU). Στη συνέχεια έγινε προσπάθεια βελτίωσης του διαχωρισμού των ενώσεων ως προς την παράμετρο του χρόνου, χωρίς όμως να ελαττώνεται η διαχωριστική ικανότητα του συστήματος. Για το σκοπό αυτό δοκιμάστηκαν διάφορα προγράμματα βαθμωτής έκλουσης, αλλάζοντας είτε το χρόνο μεταβολής του ποσοστού του υδατικού διαλύματος τριφθοροοξικού οξέος, είτε τη ροή του εκλουστικού συστήματος, είτε και τους δύο παράγοντες ταυτόχρονα. Σε όλα τα προγράμματα που δοκιμάστηκαν υπήρχε πάντα στην αρχή ένα ισοκρατικό στάδιο με υψηλό ποσοστό του υδατικού διαλύματος, προκειμένου να εκλουστούν οι πολικές ενώσεις CIP, DAN, ENR, SAR, ενώ προς το τέλος του προγράμματος κρίθηκε απαραίτητη η αύξηση του ποσοστού των οργανικών διαλυτών (μεθανόλης και ακετονιτριλίου) προκειμένου να εκλουστούν, όσο γίνεται νωρίτερα οι λιγότερο πολικές ενώσεις OXO, NAL και FLU. Το πρόγραμμα με το οποίο επιτεύχθηκε ο καλύτερος και ταχύτερος διαχωρισμός και τελικά επιλέχθηκε να χρησιμοποιηθεί δίνεται στον πίνακα Στο πρόγραμμα αυτό, το ποσοστό του υδατικού διαλύματος τριφθοροοξικού οξέος ήταν αρχικά υψηλό (75%) και σταθερό (ισοκρατική έκλουση) για τα πρώτα 4 min, ενώ στα επόμενα 21 min μειώνεται σταδιακά μέχρι το 45%, διατηρώντας σταθερή τη ροή του συστήματος στο 1,0 ml/min. Έτσι, με το πρόγραμμα αυτό και με τη πίεση του συστήματος να κυμαίνεται από bar, οι (φθορο)κινολόνες διαχωρίζονται με τη σειρά που αναφέρθηκε προηγουμένως σε χρονικό διάστημα 20 min

180 Πίνακας 13.2: Σύσταση της κινητής φάσης και πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης για το βέλτιστο διαχωρισμό των ενώσεων. TFA 0,1% CH3CN CH3OH % v/v % v/v % v/v 0, , , t (min) 13.4 ΕΠΙΛΟΓΗ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ Η χρήση εσωτερικού προτύπου στον ποσοτικό προσδιορισμό βελτιώνει κατά πολύ την επαναληψιμότητα και την ακρίβεια της μεθόδου. Η ένωση η οποία χρησιμοποιείται ως εσωτερικό πρότυπο προστίθεται σ αυτό σε σταθερή συγκέντρωση. Για να μπορεί μία ένωση να χρησιμοποιηθεί ως εσωτερικό πρότυπο, πρέπει να πληροί τις εξής προϋποθέσεις: Θα πρέπει να είναι σταθερή. Δε θα πρέπει να αντιδρά με κανένα από τα συστατικά του δείγματος της ανάλυσης. Θα πρέπει να δίνει μία και μοναδική κορυφή. Ο χρόνος συγκράτησης της ένωσης θα πρέπει να διαφέρει από τους αντίστοιχους χρόνους των ενώσεων που εξετάζονται, αλλά να είναι κοντά σε αυτούς. Επίσης θα πρέπει να μην υπάρχει στα προς ανάλυση δείγματα. Για την επιλογή του κατάλληλου εσωτερικού προτύπου, έγιναν διάφορες δοκιμές, οι οποίες φαίνονται στον πίνακα

181 Πίνακας 13.3: Δοκιμές για την εύρεση του καταλληλότερου εσωτερικού προτύπου. Συγκέντρωση Χρόνος έκλουσης (ng/μl) (min) Βαμιφυλλίνη 5 14,1 Εκλούεται μαζί με το OXO Σαλικυλικό οξύ 1,3,9-τριμέθυλοξανθίνη Θεοφυλλίνη 5 20,0 Εκλούεται μαζί με την FLU Δεν εκλούστηκε 5 3,9 Εκλούεται πολύ νωρίς Κινίνη 5 7,5 Εκλούεται μαζί με την CIP Κολχικίνη 5 18,1 Εκλούεται μαζί με το NAL Λαμοτρυγίνη 5 10,2 Ένωση Παρατηρήσεις Κατάλληλη για εσωτερικό πρότυπο Με βάση τα αποτελέσματα του πίνακα 13.3, ως εσωτερικό πρότυπο επιλέχθηκε τελικά η λαμοτρυγίνη (LTG) (υδατικό διάλυμα), σε συγκέντρωση όμως 20 ng/μl. Στο σχήμα 13.2 δίνεται το φάσμα υπεριώδους της λαμοτρυγίνης, καθώς και ο συντακτικός της τύπος. mau Cl 100 Cl N N H2N N NH2 nm Σχήμα 13.2: Φάσμα υπεριώδους (UV) υδατικού διαλύματος λαμοτρυγίνης συγκέντρωσης 2 ng/μl και συντακτικός τύπος

182 13.5 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ Οι βέλτιστες χρωματογραφικές συνθήκες που επιλέχθηκαν τελικά προκειμένου να επιτευχθεί η έκλουση των εννέα συνολικά αντιβιοτικών ενώσεων, δίνονται στον πίνακα Πίνακας 13.4: Βέλτιστες χρωματογραφικές συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν για το διαχωρισμό των (φθορο)κινολονών. Στήλη: Perfectsil, ODS-3, 5 μm, mm Εκλουστικό σύστημα: CF3COOH 0,1% (ph=1,00)/ch3cn/ch3oh Πίεση: bar Εσωτερικό πρότυπο (IS): υδατικό διάλυμα λαμοτρυγίνης συγκέντρωσης 20 ng/μl Θερμοκρασία στήλης: περιβάλλοντος Ανιχνευτής: παράταξης φωτοδιόδων με ανίχνευση σε μήκη κύματος 275 και 255 nm Εισαγόμενος όγκος: 20 μl Στο σχήμα 13.3 δίνεται ένα τυπικό χρωματογράφημα διαχωρισμού αυτών των ενώσεων σε ένα πρότυπο υδατικό διάλυμά τους συγκέντρωσης 5 ng/μl, ενώ στον πίνακα 13.5 δίνονται οι χρόνοι συγκράτησής τους

183 275 nm 255 nm Σχήμα 13.3: Χρωματογράφημα πρότυπου διαλύματος των ενώσεων, συγκέντρωσης 5 ng/μl, σύμφωνα με τις χρωματογραφικές συνθήκες που αναφέρονται στο κείμενο. Πίνακας 13.5: Χρόνοι συγκράτησης των (φθορο)κινολονών. Ένωση Χρόνος συγκράτησης (min) CIP 8,627 DAN 9,356 ENR 9,865 LTG 10,976 SAR 11,991 OXO 14,574 NAL 18,744 FLU 19,

184 13.6 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΔΙΑΚΡΙΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ Ο υπολογισμός της διακριτικής ικανότητας των κορυφών των χρωματογραφημάτων γίνεται με βάση τη σχέση: Rs 2 t 2 t1, όπου t1 και t2 είναι οι χρόνοι συγκράτησης των w1 w2 συγκρινόμενων κορυφών και w1, w2 τα εύρη τους. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν δίνονται στον πίνακα Πίνακας 13.6: Διακριτική ικανότητα του συστήματος. Ζεύγη ενώσεων Διακριτική ικανότητα (Rs) CIP-DAN 1,8 DAN-ENR 1,2 ENR-IS 1,6 IS-SAR 2,5 SAR-OXO 4,3 OXO-NAL 6,0 NAL-FLU 1, ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Καμπύλες αναφοράς πρότυπων διαλυμάτων Το επόμενο βήμα στην πειραματική διαδικασία ήταν η κατασκευή πρότυπης καμπύλης αναφοράς για την κάθε ένωση (CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU), έτσι ώστε να ελεγχθεί η γραμμικότητα της μεθόδου. Για την κατασκευή των προτύπων καμπυλών αναφοράς και την επικύρωση της μεθόδου παρασκευάστηκαν 9 υδατικά μίγματα των ενώσεων από τα αρχικά πυκνά τους διαλύματα των 100 ng/μl, με διάφορες συγκεντρώσεις για την κάθε ένωση: 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 3, 5, 7 και 10 ng/μl. Σε καθένα από αυτά τα μίγματα προστέθηκε και το εσωτερικό πρότυπο, η λαμοτρυγίνη, σε τέτοια ποσότητα, έτσι ώστε η τελική της συγκέντρωση στο διάλυμα να είναι 20 ng/μl. Για την κάθε συγκέντρωση πραγματοποιήθηκαν τρεις μετρήσεις

185 Έπειτα υπολογίστηκε ο λόγος του εμβαδού της κορυφής κάθε ένωσης προς το εμβαδόν της κορυφής της λαμοτρυγίνης. Από τα αποτελέσματα αυτά μετά από επεξεργασία στον υπολογιστή με τη μέθοδο της παλινδρόμησης για στάθμη εμπιστοσύνης 95%, υπολογίστηκαν: η κλίση της ευθείας (b), η τεταγμένη επί την αρχή (α), το τυπικό σφάλμα κατά τον προσδιορισμό των σταθερών α και b και ο συντελεστής γραμμικής συσχέτισης r. Οι εξισώσεις που προέκυψαν είναι του τύπου: y = (a ± SDa)x + (b ± SDb), όπου y = ο μέσος όρος του λόγου του εμβαδού της κορυφής της κάθε ένωσης, προς το εμβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου, x = η ποσότητα της προσδιοριζόμενης ένωσης σε ng, a = η κλίση της ευθείας, b = η τεταγμένη επί την αρχή και SDa και SDb οι τυπικές αποκλίσεις τους αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την παραπάνω στατιστική επεξεργασία, δίνονται στον πίνακα Πίνακας 13.7: Καμπύλες αναφοράς των ενώσεων σε πρότυπα διαλύματά τους. Ένωση CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Στατιστική επεξεργασία y = (0,0371 ± 0,0010)x + (0,1529 ± 0,0893) r = 0,9975 y = (0,0196 ± 0,0003)x + (0,0013 ± 0,0251) r = 0,9993 y = (0,0872 ± 0,0020)x + (0,7117 ± 0,1833) r = 0,9981 y = (0,0208 ± 0,0005)x + (0,0716 ± 0,0416) r = 0,9983 y = (0,0717 ± 0,0015)x + (0,3185 ± 0,1348) r = 0,9985 y = (0,0375 ± 0,0008)x + (0,1798 ± 0,0679) r = 0,9986 y = (0,0298 ± 0,0006)x + (0,6082 ± 0,0514) r = 0,9987 όπου y = ο μέσος όρος του λόγου του εμβαδού της κορυφής της κάθε ένωσης, προς το εμβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου x = η ποσότητα της προσδιοριζόμενης ένωσης σε ng

186 Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης Το όριο ανίχνευσης (LOD) και το όριο ποσοτικής αποτίμησης (LOQ) ορίζονται ως η ελάχιστη συγκέντρωση της προσδιοριζόμενης ένωσης που μπορεί να ανιχνευθεί ή να προσδιορισθεί ποσοτικά αντίστοιχα, με βεβαιότητα 99%. Στην πράξη εκφράζει τη συγκέντρωση της ένωσης που δίνει τιμή μέτρησης x L ίση με τη μέση τιμή των μετρήσεων xb μιας σειράς από λευκούς προσδιορισμούς αυξημένη κατά το τριπλάσιο της τυπικής απόκλισης sb αυτών των μετρήσεων (στην περίπτωση του LOQ η τιμή αυτή είναι αυξημένη κατά το δεκαπλάσιο της τυπικής απόκλισης sb). Με βάση την εξίσωση της καμπύλης αναφοράς, ισχύει: LOD xl xb ί και επειδή είναι xl xb 3sb αντίστοιχα LOQ 10 και LOD 3,3 sb ί θα είναι και sb ί Στον πίνακα 13.7 δίνονται τα όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικής αποτίμησης (LOQ) των εννέα ενώσεων, καθώς και τα ανώτατα όρια της γραμμικής περιοχής για την κάθε ένωση. Πίνακας 13.8: Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης των εξεταζόμενων ενώσεων. Ανώτατο όριο LOD LOQ (ng) (ng) CIP 7,9 23,7 200 DAN 4,2 12,6 200 ENR 6,9 20,7 200 SAR 6,6 19,8 200 OXO 6,2 18,6 200 NAL 6,0 18,0 200 FLU 5,7 17,1 200 Ένωση γραμμικής περιοχής (ng)

187 Σταθερότητα των πρότυπων διαλυμάτων Μετά την εύρεση των καμπυλών διακρίβωσης σε πρότυπα διαλύματα των (φθορο)κινολονών μελετήθηκε η σταθερότητα των διαλυμάτων αυτών σε θερμοκρασία 4 οc, σύμφωνα με όσα ορίζει η ευρωπαϊκή νομοθεσία με την οδηγία 2002/657/EC. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε η μεταβολή της συγκέντρωσης των επτά ενώσεων, σε διάλυμα μίγματός τους συγκέντρωσης 5 ng/μl, με την πάροδο χρονικού διαστήματος 1, 2, 4 και 6 εβδομάδων. Ως κριτήριο αστάθειας χρησιμοποιήθηκε η μείωση του ποσοστού των προσδιοριζόμενων ενώσεων στο διάλυμά τους κατά -10%, με βάση τη σχέση: Ένωση που παραµένει (%) = Ci 100/Cfresh, όπου Ci = συγκέντρωση (σε ng/μl) τη χρονική στιγµή i και Cfresh= συγκέντρωση (σε ng/μl) του φρέσκου διαλύµατος Στον πίνακα 13.9 δίνονται οι ποσότητες των ενώσεων σε ng που προσδιορίζονται μετά από πάροδο 1, 2, 4 και 6 εβδομάδων, ενώ στο σχήμα 13.4 απεικονίζεται γραφικά η μεταβολή της συγκέντρωσης των επτά κινολονών με την πάροδο έξι εβδομάδων. Από τις τιμές του πίνακα 13.9 φαίνεται ότι τα διαλύματα όλων των ενώσεων ήταν σταθερά για 4 εβδομάδες, εκτός από τις OXO, NAL και FLU, που ήταν σταθερές για 2 εβδομάδες. Πίνακας 13.9: Σταθερότητα των ενώσεων σε ng μετά την πάροδο 1, 2, 4 και 6 εβδομάδων. Ένωση CIP DAN Ποσότητα που προστέθηκε Χρόνος ανάλυσης Βρέθηκαν (ng) (εβδομάδες) (ng) 0 98,5 1 96,3 2 92,2 4 90,7 6 80, ,4 1 97,3 2 93,2 4 91,1 6 78,

188 Πίνακας 13.9: Συνέχεια. Ένωση ENR SAR OXO NAL FLU Ποσότητα που προστέθηκε Χρόνος ανάλυσης Βρέθηκαν (ng) (εβδομάδες) (ng) 0 98,6 1 95,2 2 92,3 4 90,5 6 81,7 0 97,6 1 94,2 2 92,4 4 90,5 6 70,2 0 98,2 1 95,2 2 91,5 4 87,3 6 76,2 0 99,6 1 94,2 2 91,4 4 85,6 6 80,2 0 98,8 1 94,3 2 91,2 4 82,3 6 77,

189 (%) Αναλυτέα ουσία που απομένει 120 CIP 100 DAN 80 ENR 60 SAR 40 OXO NAL 20 FLU Εβδομάδες Σχήμα 13.4: Μεταβολή του ποσοστού της κάθε προσδιοριζόμενης ένωσης που απομένει σε διάλυμα μίγματός τους συγκέντρωσης 5 ng/μl μετά την πάροδο 1, 2, 4 και 6 εβδομάδων σε συνθήκες ψύξης στους 4oC ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ Μετά την επικύρωση της μεθόδου HPLC που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισμό των επτά ενώσεων (σιπροφλοξακίνης, ντανοφλοξακίνης, ενροφλοξακίνης, σαραφλοξακίνης, οξολινικού οξέος, ναλιδιξικού οξέος και φλουμεκίνης) σε πρότυπα διαλύματα, ακολούθησε η εφαρμογή της μεθόδου στον προσδιορισμό, ποιοτικό και ποσοτικό αυτών των αντιβιοτικών σε διάφορα κτηνιατρικά σκευάσματα που κυκλοφορούν στο εμπόριο. Στην κτηνιατρική αγορά, βρέθηκαν τέσσερα φαρμακευτικά σκευάσματα, το εναιώρημα Baytril 0,5%, το ενέσιμο Advocin 2,5%, το εναιώρημα Flumix 10% και το στερεό Inoxyl, για τα οποία υπάρχουν υπόνοιες ότι χρησιμοποιούνται στις ιχθυοκαλλιέργειες Εφαρμογή της μεθόδου στο κτηνιατρικό σκεύασμα Baytril Η συσκευασία του κτηνιατρικού εναιωρήματος Baytril 0,5% που κυκλοφορεί στην αγορά περιείχε 5 mg ENR σε κάθε 1 ml, δηλαδή ήταν συγκέντρωσης 5000 ng/μl. Το περιεχόμενο του φιαλιδίου αραιώθηκε με νερό Milli-Q και έτσι παρασκευάστηκε ένα πυκνό υδατικό διάλυμα 1000 ng/μl. Από αυτό και έπειτα από τις κατάλληλες αραιώσεις και την

190 προσθήκη του εσωτερικού προτύπου σε σταθερή συγκέντρωση των 20 ng/μl, παρασκευάστηκαν υδατικά διαλύματα των 1, 2 και 4 ng/μl, τα οποία εισήχθησαν τελικά στην αναλυτική στήλη. Για την κάθε συγκέντρωση έγιναν συνολικά τρεις μετρήσεις. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν μετά από κατάλληλη στατιστική επεξεργασία, δίνονται στον πίνακα 13.10, ενώ στο σχήμα 13.5 δίνεται ένα τυπικό χρωματογράφημα του εναιωρήματος Baytril 0,5%. Πίνακας 13.10: Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων του εναιωρήματος Baytril (n=9). Ονομαστική ποσότητα Ποσότητα που του εναιωρήματος βρέθηκε ± SD (ng) (ng) 20 19,0 ± 0,4-4, ,7 ± 0,6-0, ,2 ± 0,2 0,3 Ένωση ENR Σχετικό σφάλμα (%) Αναγραφόμενη περιεκτικότητα ενροφλοξακίνης στο εναιώρημα (mg): 5 mg/ml Ευρεθείσα ποσότητα στο εναιώρημα (mg): 4,9 ± 0,1 Σχήμα 13.5: Χρωματογράφημα εναιωρήματος Baytril 0,5% (2 ng/μl)-is, σύμφωνα με τις συνθήκες που περιγράφονται στο κείμενο. (12,273 min ENR, 13,314 min IS)

191 Εφαρμογή της μεθόδου στο κτηνιατρικό σκεύασμα Advocin Τα φιαλίδια με το ενέσιμο Advocin 2,5% που κυκλοφορεί στην αγορά περιείχε το καθένα 25 mg DAN σε κάθε ml ενέσιμου, δηλαδή η αρχική του συγκέντρωση ήταν ng/μl. Το περιεχόμενο του φιαλιδίου αραιώθηκε με νερό Milli-Q μέχρι τα 1000 ml και έτσι παρασκευάστηκε ένα πυκνό υδατικό διάλυμα 1000 ng/μl. Από αυτό και έπειτα από τις κατάλληλες αραιώσεις και την προσθήκη του εσωτερικού προτύπου σε σταθερή συγκέντρωση των 20 ng/μl, παρασκευάστηκαν υδατικά διαλύματα των 1, 2 και 4 ng/μl, τα οποία εισήχθησαν τελικά στην αναλυτική στήλη. Για την κάθε συγκέντρωση έγιναν συνολικά τρεις μετρήσεις. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν μετά από κατάλληλη στατιστική επεξεργασία, δίνονται στον πίνακα 13.11, ενώ στο σχήμα 13.6 δίνεται ένα τυπικό χρωματογράφημα του ενέσιμου Advocin. Πίνακας 13.11: Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων του ενέσιμου Advocin (n=9). Ένωση DAN Ονομαστική ποσότητα Ποσότητα που του ενέσιμου βρέθηκε ± SD (ng) (ng) 20 20,9 ± 1,0 4, ,8 ± 0,9-0, ,3 ± 2,0 1,7 Σχετικό σφάλμα (%) Αναγραφόμενη περιεκτικότητα ντανοφλοξακίνης στο ενέσιμο (mg): 25 mg/ml Ευρεθείσα ποσότητα στο ενέσιμο (mg): 25,5 ± 0,

192 Σχήμα 13.6: Χρωματογράφημα Advocin ενέσιμου (2 ng/μl)-is, σύμφωνα με τις συνθήκες που περιγράφονται στο κείμενο. (12,020 min DAN 13,463 min IS) Εφαρμογή της μεθόδου στο κτηνιατρικό σκεύασμα Flumix Τα φιαλίδια με το εναιώρημα Flumix που κυκλοφορούν στην αγορά περιείχαν το καθένα 10% φλουμεκίνης, δηλαδή 100 mg FLU σε κάθε ml εναιωρήματος. Επομένως η αρχική του συγκέντρωση ήταν ng/μl. Το περιεχόμενο του φιαλιδίου αραιώθηκε κατάλληλα με νερό Milli-Q μέχρι να παρασκευαστεί τελικά ένα πυκνό υδατικό διάλυμα 100 ng/μl ως προς την φλουμεκίνη. Από αυτό και έπειτα από τις κατάλληλες αραιώσεις και την προσθήκη του εσωτερικού προτύπου σε σταθερή συγκέντρωση των 20 ng/μl, παρασκευάστηκαν υδατικά διαλύματα των 1, 2, και 4 ng/μl, τα οποία εισήχθησαν τελικά στην αναλυτική στήλη. Για την κάθε συγκέντρωση έγιναν συνολικά τρεις μετρήσεις. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν μετά από κατάλληλη στατιστική επεξεργασία, δίνονται στον πίνακα 13.12, ενώ στο σχήμα 13.7 δίνεται ένα τυπικό χρωματογράφημα του εναιωρήματος Flumix

193 Πίνακας 13.12: Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων του εναιωρήματος Flumix (n=9). Ένωση FLU Ονομαστική ποσότητα Ποσότητα που του εναιωρήματος βρέθηκε ± SD (ng) (ng) 20 18,9 ± 0,2-5, ,9 ± 0,3-0, ,9 ± 1,4-2,6 Σχετικό σφάλμα (%) Αναγραφόμενη περιεκτικότητα φλουμεκίνης: 100 mg/ ml εναιωρήματος Ευρεθείσα ποσότητα στο εναιώρημα (mg/ml): 97,2 ± 2,5 Σχήμα 13.7: Χρωματογράφημα εναιωρήματος Flumix (2 ng/μl)-is, με βάση τις συνθήκες που περιγράφονται στο κείμενο. (22,498 min FLU 13,420 min IS) Εφαρμογή της μεθόδου στο κτηνιατρικό σκεύασμα Inoxyl Το φαρμακευτικό σκεύασμα Inoxyl κυκλοφορεί στην κτηνιατρική αγορά σε μορφή σκόνης. Στη συσκευασία αναγράφεται ότι περιέχει 11,5 g οξολινικού οξέος ανά 100 g του φαρμάκου. Το περιεχόμενο της συσκευασίας αραιώθηκε κατάλληλα με νερό Milli-Q μέχρι να παρασκευαστεί τελικά ένα πυκνό υδατικό διάλυμα 1000 ng/μl ως προς το οξολινικό οξύ. Από αυτό και έπειτα από τις κατάλληλες αραιώσεις και την προσθήκη του εσωτερικού προτύπου σε σταθερή συγκέντρωση 20 ng/μl, παρασκευάστηκαν υδατικά διαλύματα των 1, 2, και 4 ng/μl, τα οποία εισήχθησαν τελικά στην αναλυτική στήλη. Για την κάθε συγκέντρωση έγιναν συνολικά τρεις μετρήσεις. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν μετά από κατάλληλη στατιστική

194 επεξεργασία, δίνονται στον πίνακα 13.13, ενώ στο σχήμα 13.8 δίνεται ένα τυπικό χρωματογράφημα του σκευάσματος Inoxyl. Πίνακας 13.13: Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων του σκευάσματος Inoxyl (n=9). Ένωση OXO Ονομαστική ποσότητα Ποσότητα που του σκευάσματος βρέθηκε ± SD (ng) (ng) 20 19,3 ± 0,3-3, ,5 ± 2,3 3, ,1 ± 1,0 1,4 Σχετικό σφάλμα (%) Αναγραφόμενη περιεκτικότητα οξολινικού οξέος: 11,5 g/100 g σκευάσματος Ευρεθείσα ποσότητα στο σκεύασμα (g/100 g): 11,6 ± 0,5 Σχήμα 13.8: Χρωματογράφημα σκευάσματος Inoxyl (2 ng/μl)-is, με βάση τις συνθήκες που περιγράφονται στο κείμενο. (17,516 min OXO 13,742 min IS)

195

196 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 14 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΜΕΝΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΗPLC ΣΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ ΤΩΝ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ Μετά την επικύρωση της μεθόδου HPLC που αναπτύχθηκε και την εφαρμογή αυτής σε κτηνιατρικά σκευάσματα για τον προσδιορισμό (ποιοτικό και ποσοτικό) της ντανοφλοξακίνης, της ενροφλοξακίνης, της φλουμεκίνης και του οξολινικού οξέος, μελετήθηκε η εφαρμογή της σε ιστό τσιπούρας ιχθυοκαλλιέργειας. Όπως γίνεται εύκολα αντιληπτό, για την επίτευξη του σκοπού αυτού είναι απαραίτητη η εύρεση και η εφαρμογή μιας αποτελεσματικής, αλλά και απλής προκατεργασίας των ιστών, η οποία να προηγείται της ανάλυσης με HPLC. Η προκατεργασία αυτή θα πρέπει να χαρακτηρίζεται από αξιοπιστία, εκλεκτικότητα, επαναληψιμότητα καθώς και απλότητα. Για το λόγο αυτό, επιλέχθηκε ως τεχνική παραλαβής και απομόνωσης των (φθορο)κινολονών από τους ιστούς η εκχύλιση στερεού-υγρού και ο καθαρισμός του εκχυλίσματος με την τεχνική της εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE). Αρχικά έγιναν δοκιμές για την εύρεση του κατάλληλου πρωτοκόλλου SPE για την εκχύλιση των ενώσεων από πρότυπα διαλύματα, ενώ στη συνέχεια εφαρμόστηκε η μέθοδος που αναπτύχθηκε και σε πραγματικά δείγματα ιστού τσιπούρας ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ (SPE) ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Στο πρώτο στάδιο εύρεσης της κατάλληλης μεθόδου προκατεργασίας, δοκιμάστηκε μια σειρά από μικροστήλες και πρωτόκολλα SPE, έτσι ώστε να βρεθεί το καταλληλότερο για τη παραλαβή των ενώσεων CIP DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU από πρότυπα μίγματά τους. Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκε ένα υδατικό διάλυμα μίγματος των εννέα ενώσεων συγκέντρωσης 5 ng/μl, προσθέτοντας και το εσωτερικό πρότυπο (λαμοτρυγίνη) σε σταθερή συγκέντρωση των 20 ng/μl. Οι μικροστήλες που μελετήθηκαν ήταν οι εξής: Oasis HLB (200 mg/6 ml) NEXUS abselut (30 mg/ml)

197 LiChrolut RP-18 (200 mg/3 ml) Adsorbex RP-8 (30 mg/ml) DSC-18 (500 mg/3 ml) Η εκκίνηση της ενεργοποίησης των μικροστηλών σε όλες τις δοκιμές ήταν η ίδια, χρησιμοποιώντας ως διαλύτη τη μεθανόλη, με όγκο 2 ml. Το δεύτερο στάδιο της ενεργοποίησης ήταν και αυτό το ίδιο για όλες τις δοκιμές, χρησιμοποιώντας 2 ml νερό MilliQ. Έπειτα από προηγούμενη εμπειρία στο εργαστήριο στον προσδιορισμό των (φθορο)κινολονών σε ιστούς κρεατοπαραγωγών ζώων, επιλέχθηκε ως καλύτερο σύστημα η σταδιακή έκλουση με 1,5 ml τριφθοροοξικού οξέος 0,1% σε ακετονιτρίλιο και 0,5 ml ακετονιτρίλιο, ενώ για την επαναδιάλυση χρησιμοποιήθηκαν 200 μl υδατικού διαλύματος τριφθοροοξικού οξέος 0,1%. Η γενική πορεία που ακολουθήθηκε με όλα τα είδη των μικροστηλών δίνεται στο σχήμα Ενεργοποίηση της μικροστήλης με: 1) 2 ml CH3OH 2) 2 ml H2O Εισαγωγή 200 μl πρότυπου δείγματος Έκλουση των ενώσεων με 1,5 ml 0,1% TFA σε CH3CN 0,5 ml CH3CN Επαναδιάλυση με 200 μl TFA 0,1% Εξάτμιση με ρεύμα αζώτου (30 oc) Σχήμα 14.1: Σχηματική αναπαράσταση των σταδίων της SPE. Μετά από εκτεταμένες δοκιμές, παρατηρήθηκε ότι κατά τη χρησιμοποίηση της μικροστήλης Nexus, η έκλουση των επτά κινολονών δεν ήταν επιτυχής, καθώς οι ανακτήσεις που επιτεύχθησαν ήταν πολύ χαμηλές (<50%), οπότε και τελικά απορρίφθηκε. Επίσης, οι δοκιμές που έγιναν για την εκχύλιση του πρότυπου διαλύματος κινολονών στις μικροστήλες Lichrolut RP-18, RP-8 και DSC-18 δεν έφεραν το επιθυμητό αποτέλεσμα, καθώς και στις τρεις περιπτώσεις δεν εκλούονταν όλες οι κινολόνες, αλλά και οι ανακτήσεις των υπολοίπων κυμαίνονταν σε ποσοστά χαμηλότερα του 62%. Σε αντίθεση όμως με τις προηγούμενες μικροστήλες, η μικροστήλη Oasis εμφάνισε τα καλύτερα αποτελέσματα. Στο σημείο αυτό δοκιμάστηκε να τροποποιηθεί και το εκλουστικό σύστημα, το οποίο αποτελούνταν από διάλυμα 0,1% τριφθοροοξικού οξέος σε ακετονιτρίλιο και ακετονιτρίλιο, δοκιμάζοντας διάφορους όγκους. Τα αποτελέσματα αυτών των δοκιμών στη

198 μικροστήλη Oasis δίνονται στον πίνακα Οι ανακτήσεις που υπολογίστηκαν για κάθε ένωση είναι οι απόλυτες ως προς το εμβαδό της κάθε ένωσης στο πρότυπο διάλυμα. Από τα αποτελέσματα που δίνονται στον πίνακα 14.1 φαίνεται ότι οι καλύτερες ανακτήσεις επιτεύχθησαν όταν η έκλουση των ενώσεων πραγματοποιήθηκε με τη διαδοχική χρήση 1,5 ml διαλύματος TFA 0,1% σε ακετονιτρίλιο και 0,5 ml ακετονιτριλίου. Πίνακας 14.1: Ανακτήσεις που επιτυγχάνονται με την εφαρμογή διαφόρων εκλουστικών συστημάτων στη μικροστήλη Oasis. Ανάκτηση (%) Σύστημα διαλυτών έκλουσης CIP DAN ENR IS SAR OXO NAL FLU 82,5 77,1 80,4 78,7 81,2 79,6 86,4 88,3 87,6 82,4 88,3 84,0 89,9 85,5 90,1 92,6 93,7 95,3 96,6 93,7 97,0 94,7 98,7 100,2 0,75 ml TFA 0,1% σε CH3CN 0,25 ml CH3CN 1 ml TFA 0,1% σε CH3CN 0,3 ml CH3CN 1,5 ml TFA 0,1% σε CH3CN 0,5 ml CH3CN

199 14.2 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΙΣΤΟ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ Σε όλα τα δείγματα του ιστού τσιπούρας ιχθυοτροφείου που μελετήθηκε η κατεργασία γινόταν χωρίς προηγουμένως το δείγμα να έχει υποστεί ξήρανση. Η προκατεργασία γινόταν σε φρέσκα δείγματα ιστών, τα οποία αρχικά τεμαχίζονταν και ομογενοποιούνταν, στη συνέχεια ζυγίζονταν σε ποσότητες 1,0000 ± 0,0001 g και διατηρούνταν συσκευασμένα σε φύλλα αλουμινίου στην κατάψυξη στους -18oC. Για το στάδιο της ανάπτυξης του πρωτοκόλλου εκχύλισης των κινολονών από τον ιστό της τσιπούρας, όπου ως ιστός στην παρούσα εργασία θεωρείται μύες και δέρμα σε φυσική αναλογία, έγιναν διάφορες δοκιμές, στις οποίες ακολουθήθηκε η εξής πορεία: 1) Εµβολιασµός 1,0000 ± 0,0001 g δείγματος µε 400 μl µίγµατος συγκέντρωσης 5 ng/μl των επτά ενώσεων και του εσωτερικού προτύπου (λαμοτρυγίνη) σε σταθερή συγκέντρωση 20 ng/μl. 2) Ανάδευση σε συσκευή vortex του δείγματος. 3) Προσθήκη 5 ml διαφόρων διαλυτών για την εκχύλιση των ενώσεων από το υπόστρωµα του ιστού. 4) Ανάδευση σε συσκευή vortex. 5) Εφαρμογή υπερήχων για 15 min. 6) Φυγοκέντρηση για 10 min στις 4500 στροφές/λεπτό για την παραλαβή του εκχυλίσματος και ανάλογα µε τη φύση του διαλύματος εκχύλισης, 7) Απ ευθείας εφαρμογή της SPE για υδατικούς διαλύτες ή πρώτα εξάτμιση, επαναδιάλυση με 2 ml H2O MQ και στη συνέχεια SPE σε μικροστήλες Oasis με το πρωτόκολλο που δόθηκε προηγουμένως. 8) Εξάτμιση σε ρεύμα αζώτου στους 30oC. 9) Επαναδιάλυση με 400 μl υδατικού διαλύματος τριφθοροοξικού οξέος 0,1% και διήθηση του μίγματος με φίλτρα σύριγγας. 10) Εισαγωγή του δείγματος στη στήλη HPLC. Η διαδικασία των σταδίων 3-6 επαναλαμβανόταν στις δοκιμές και δεύτερη φορά με χρήση 3 ml του εκχυλιστικού μέσου, προκειμένου να επιτευχθεί πλήρης ανάκτηση των ενώσεων από το υπόστρωμα της τσιπούρας. Οι δοκιμές που πραγματοποιήθηκαν με τα διάφορα εκχυλιστικά μέσα, είχαν ως πρωταρχικό στόχο την καταβύθιση των πρωτεϊνών του ιστού της τσιπούρας, καθώς και την απομάκρυνση των λιπαρών ουσιών από τον ιστό, οι οποίες παρεμποδίζουν την έκλουση των

200 προσδιοριζόμενων ενώσεων. Τα διάφορα εκχυλιστικά συστήματα που δοκιμάστηκαν δίνονται στον πίνακα Αρχικά δοκιμάστηκε να γίνει η απελευθέρωση των ενώσεων που είναι δεσμευμένες στις πρωτεΐνες με διάλυμα τριφθοροοξικού οξέος 0,1%, είτε υδατικό, είτε σε ακετονιτρίλιο, είτε σε μεθανόλη, ωστόσο όμως παρατηρήθηκε, ότι τα ποσοστά των ανακτήσεων όλων των (φθορο)κινολονών ήταν χαμηλά. Έπειτα δοκιμάστηκε να χρησιμοποιηθούν ως πρώτο στάδιο εκχύλισης 5 ml υδατικού διαλύματος εξανίου 5%. Στο δείγμα αυτό εφαρμόστηκαν υπέρηχοι, φυγοκέντρηση για 10 min και απόρριψη του οργανικού διαλύτη. Στο δείγμα έπειτα προστέθηκε διάλυμα τριφθοροοξικού οξέος 0,1%, είτε υδατικό, είτε σε ακετονιτρίλιο, είτε σε μεθανόλη και ακολουθήθηκε η διαδικασία που περιγράφηκε και προηγουμένως, χωρίς όμως να υπάρχει και αντίστοιχη αύξηση του ποσοστού των ανακτήσεων. Κατόπιν, δοκιμάστηκε αντί του εξανίου να χρησιμοποιηθούν ως πρώτο στάδιο εκχύλισης 5 ml ακετονιτριλίου ή 5 ml μίγματος 50-50% v/v ακετονιτριλίου-υδατικού διαλύματος εξανίου 5% πριν την εκχύλιση με το τριφθοροοξικό οξύ, αλλά τα αποτελέσματα ήταν και πάλι απογοητευτικά, αφού παρατηρήθηκε μείωση του ποσοστού των ανακτήσεων με τη χρήση του ακετονιτριλίου. Στη συνέχεια εφαρμόστηκε εκχύλιση με 0,1% υδατικό διάλυμα μυρμηκικού οξέος, είτε απευθείας, είτε να προηγείται ένα στάδιο εκχύλισης με υδατικό διάλυμα εξανίου 5%, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως. Και στις δύο όμως περιπτώσεις τα αποτελέσματα δεν ήταν πάλι τα αναμενόμενα. Η επόμενη δοκιμή που έγινε ήταν με διάλυμα 0,1% οξικού οξέος, είτε σε υδατικό περιβάλλον, είτε σε ακετονιτρίλιο, αρχικά απευθείας, είτε πάλι να προηγείται ένα στάδιο εκχύλισης με υδατικό διάλυμα εξανίου 5%. Τα αποτελέσματα όμως και σ αυτή τη περίπτωση δεν ήταν τα αναμενόμενα, αφού ούτε όλες οι κινολόνες εκχυλίζονταν, ούτε και οι ανακτήσεις των υπολοίπων βελτιώνονταν. Τέλος, δοκιμάστηκε να γίνει η εκχύλιση με υδατικό διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (NaOH) συγκέντρωσης 0,1Μ, είτε απευθείας είτε να προηγείται ένα στάδιο εκχύλισης με διάλυμα εξανίου 5%. Οι ανακτήσεις που επιτεύχθησαν για όλες τις κινολόνες ήταν πολύ καλές, ενώ παρατηρήθηκε ότι το στάδιο της εκχύλισης με το εξάνιο δεν ήταν απαραίτητο, αφού μείωνε σημαντικά τις ανακτήσεις. Στο σημείο αυτό και με βάση τη βιβλιογραφία, προστέθηκε στο διάλυμα του υδροξειδίου του νατρίου και χλωριούχο νάτριο ως τροποποιητής, κάτι το οποίο αποδείχθηκε πως βελτίωνε ακόμη περισσότερο τις ανακτήσεις όλων των (φθορο)κινολονών

201 Πίνακας 14.2: Δοκιμές διαφόρων εκχυλιστικών συστημάτων σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας. Εκχυλιστικό μέσο Ανακτήσεις (%) CIP DAN ENR IS SAR OXO NAL FLU 0,1% δ/μα TFA σε H2O 40,2 51,8 45,2 64,2 61,1 46,8 57,1 49,2 0,1% δ/μα TFA σε CH3CN 42,6 45,5 38,1 60,8 56,2 33,8 50,7 45,2 0,1% δ/μα TFA σε CH3OH 38,9 44,3 30,0 61,3 43,8 30,8 44,3 43,9 48,7 50,9 48,8 63,4 55,2 42,1 28,9 22,4 50,3 51,2 43,7 65,8 50,8 38,7 30,1 25,7 49,6 47,6 44,2 58,9 47,2 35,6 27,5 20,1 38,7 30,1 32,3 55,2 45,6 30,8 24,2 26,3 35,5 31,8 28,7 50,1 44,2 27,5 18,6 21,0 32,4 27,9 25,5 51,9 28,5 29,3 19,2 18,9 25,6 25,6 20,9 48,4 35,1 25,4 20,8 21,8 22,0 22,3 20,0 40,5 30,7 28,8 23,1 25,0 18,9 20,1 16,5 38,4 31,2 22,1 22,7 24,6 58,3 60,3 56,1 52,1 42,1 44,6 56,1 50,3 50,1 47,3 43,7 47,1 31,6 28,7 35,1 34, , ,2 22,3 25,6 28, , ,1 20,1 28,7 21, ,1 85,2 86,4 90,8 88,2 90,1 87,1 90,6 Εξάνιο 5% 0,1% δ/μα TFA σε H2O Εξάνιο 5% 0,1% δ/μα TFA σε CH3CN Εξάνιο 5% 0,1% δ/μα TFA σε CH3OH CH3CN 0,1% δ/μα TFA σε H2O CH3CN 0,1% δ/μα TFA σε CH3CN CH3CN 0,1% δ/μα TFA σε CH3OH Εξάνιο 5%-CH3CN (50-50%) 0,1% δ/μα TFA σε H2O Εξάνιο 5%-CH3CN (50-50%) 0,1% δ/μα TFA σε CH3CN Εξάνιο 5%-CH3CN (50-50%) 0,1% δ/μα TFA σε CH3OH 0,1% υδατικό δ/μα HCOOH Εξάνιο 5% 0,1% υδατικό δ/μα HCOOH 0,1% υδατικό δ/μα CH3COOH Εξάνιο 5% 0,1% υδατικό δ/μα CH3COOH Υδατικό δ/μα 0,1M NaOH

202 Πίνακας 14.2: Συνέχεια. Εκχυλιστικό μέσο Εξάνιο 5% Υδατικό δ/μα 0,1M NaOH Υδατικό δ/μα 0,1M NaOH + NaCl Ανακτήσεις (%) CIP DAN ENR IS SAR OXO NAL FLU 70,0 73,1 80,1 81,2 80,4 75,2 70,1 77,6 95,6 94,9 96,7 98,3 97,8 99,4 100,2 97,1 Στο σχήμα 14.2 δίνεται ένα τυπικό χρωματογράφημα λευκού δείγματος ιστού τσιπούρας, ενώ στο σχήμα 14.3 ένα χρωματογράφημα εμβολιασμένου δείγματος τσιπούρας ιχθυοτροφείου με πρότυπο διάλυμα των ενώσεων συγκέντρωσης 5 ng/μl ενώ στον πίνακα 14.3 δίνονται οι χρόνοι συγκράτησης των ενώσεων στο εμβολιασμένο δείγμα τσιπούρας και στον πίνακα 14.4 η διακριτική ικανότητα του χρωματογραφικού συστήματος. 275 nm Σχήμα 14.2: Χρωματογράφημα λευκού δείγματος ιστού τσιπούρας

203 255 nm Σχήμα 14.2: Συνέχεια. 275 nm Σχήμα 14.3: Χρωματογράφημα των επτά (φθορο)κινολονών σε εμβολιασμένο δείγμα ιστού τσιπούρας ιχθυοτροφείου με μίγμα των ενώσεων συγκέντρωσης 5 ng/μl

204 255 nm Σχήμα 14.3: Συνέχεια. Πίνακας 14.3: Χρόνοι συγκράτησης των (φθοροκινολονών) σε εμβολιασμένο δείγμα ιστού τσιπούρας ιχθυοτροφείου. Ένωση Χρόνος συγκράτησης (min) CIP 9,396 DAN 9,996 ENR 10,498 IS 11,786 SAR 12,720 OXO 15,263 NAL 19,333 FLU 20,

205 Πίνακας 14.4: Διακριτική ικανότητα του συστήματος. Ζεύγη ενώσεων 14.3 Διακριτική ικανότητα (Rs) CIP-DAN 1,1 DAN-ENR 1,2 ENR-IS 2,1 IS-SAR 1,8 SAR-OXO 4,1 OXO-NAL 5,2 NAL-FLU 1,4 ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΜΕΝΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657 ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ. Η επικύρωση της μεθόδου HPLC που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισμό των επτά (φθορο)κινολονών (CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε ιστό τσιπούρας έγινε με βάση τα κριτήρια επίδοσης και τις απαιτήσεις που καθορίζει η νομοθεσία της Ευρωπαϊκής Ένωσης με βάση την απόφαση 2002/657, για τις τεχνικές και μεθόδους που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον προσδιορισμό καταλοίπων αντιβιοτικών σε προϊόντα ζωικής προέλευσης. Ως εκ τούτου η μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τα κριτήρια της γραμμικότητας, της επαναληψιμότητας, της πιστότητας, της ευαισθησίας, της εκλεκτικότητας, τη σταθερότητας, του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης, όπως αυτά ορίζονται στις διατάξεις της παραπάνω αναφερθείσας απόφασης

206 Έλεγχος γραμμικότητας Χάραξη καμπυλών αναφοράς μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού. Σύμφωνα με την απόφαση 2002/657/EC για τη χάραξη των καμπυλών αναφοράς για ποσοτικούς προσδιορισμούς, θα πρέπει: Να επιλέγονται τουλάχιστον πέντε επίπεδα συγκεντρώσεων για τη χάραξη της κάθε καμπύλης Να περιγράφεται το εύρος εργασίας της κάθε καμπύλης. Να δίνεται ο μαθηματικός τύπος της εξίσωσης που περιγράφει την καμπύλη, καθώς και το εύρος των παραμέτρων της. Προκειμένου λοιπόν να ελεγχθεί η γραμμικότητα μέσω της χάραξης των καμπυλών αναφοράς σε εμβολιασμένα δείγματα ιστών, ακολουθήθηκε η προκατεργασία που περιγράφηκε στην προηγούμενη παράγραφο σε 8 δείγματα ιστού τσιπούρας του 1,0000 ± 0,0001 g, τα οποία εμβολιάστηκαν αντίστοιχα με πρότυπα διαλύματα μιγμάτων των επτά ενώσεων συγκέντρωσης 0,05, 0,1, 0,5, 1, 3, 5, 7 και 10 ng/μl. Σε όλα τα πρότυπα διαλύματα μιγμάτων είχε προστεθεί και το εσωτερικό πρότυπο (υδατικό διάλυμα λαμοτρυγίνης), σε τελική συγκέντρωση 20 ng/μl. Το τελικό εκχύλισμα που προέκυπτε από κάθε δείγμα αναλυόταν τρεις φορές. Όπως και στην επικύρωση της μεθόδου στα πρότυπα διαλύματα, η ποσοτική αποτίμηση των αποτελεσμάτων έγινε με βάση το μέσο όρο του λόγου των εμβαδών της κορυφής της κάθε ένωσης, προς το εμβαδό της κορυφής του εσωτερικού προτύπου στις τρεις μετρήσεις για κάθε συγκέντρωση. Με βάση τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων υπολογίστηκαν οι εξισώσεις των καμπυλών αναφοράς καθώς και ο συντελεστής γραμμικής συσχέτισης r και δίνονται στον πίνακα

207 Πίνακας 14.5: Καμπύλες αναφοράς των ενώσεων σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας μετά από SPE. Ένωση CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU όπου Στατιστική επεξεργασία y = (0,0597 ± 0,0004)x - (0,0077 ± 0,0298) r = 0,9999 y = (0,0472 ± 0,0018)x + (0,3904 ± 0,1351) r = 0,9971 y = (0,0412 ± 0,0010)x + (0,6346 ± 0,1009) r = 0,9986 y = (0,0152 ± 0,0004)x - (0,0065 ± 0,0395) r = 0,9984 y = (0,0132 ± 0,0003)x + (0,3501 ± 0,0290) r = 0,9984 y = (0,0311 ± 0,0005)x + (0,8986 ± 0,0466) r = 0,9990 y = (0,0496 ± 0,0012)x + (0,7099 ± 0,1185) r = 0,9981 y = ο μέσος όρος του λόγου του εμβαδού της κορυφής της κάθε ένωσης, προς το εμβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου x = η ποσότητα της προσδιοριζόμενης ένωσης σε ng Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης και γραμμικής περιοχής Μετά την εύρεση των εξισώσεων των καμπυλών αναφοράς για τις επτά ενώσεις, ακολούθησε ο προσδιορισμός των ορίων ανίχνευσης (LOD) και των ορίων ποσοτικής αποτίμησης (LOQ), όπως αυτά έχουν ήδη ορισθεί στη παράγραφο Έτσι τα όρια υπολογίστηκαν με βάση τις σχέσεις LOD 3,3 sb ί και LOQ 10 sb, όπου ί sb είναι η τυπική απόκλιση των τεταγμένων επι την αρχή που προκύπτουν από τη χάραξη των καμπυλών αναφοράς και κλίση είναι η κλίση των ευθειών των καμπυλών αυτών, και δίνονται στον πίνακα Η Ευρωπαϊκή Ένωση έχει θεσπίσει ως ανώτατα όρια καταλοίπων (MRLs), σύμφωνα με την οδηγία 90/2377/EC, τα 30 μg/kg ιστού για την SAR, τα 100 μg/kg ιστού για τις ENR και OXO, τα 300 μg/kg ιστού για την DAN και τα 600 μg/kg ιστού για την FLU. Για τις υπόλοιπες

208 ενώσεις (CIP και NAL) για τις οποίες δεν έχουν ορισθεί όρια, ετέθησαν ως όριο η τιμή των 100 μg/kg ιστού, που ισχύει και για άλλες δύο κινολόνες. Από τα αποτελέσματα που δίνονται στον πίνακα 14.6, φαίνεται ότι τα όρια ποσοτικής αποτίμησης που επιτεύχθηκαν με την αναπτυσσόμενη μέθοδο είναι μικρότερα από τα MRLs των ενώσεων για τον ιστό της τσιπούρας. Πίνακας 14.6: Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης της μεθόδου για τον προσδιορισμό των εννέα ενώσεων σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας. LOD LOQ MRL (μg/kg ιστού) (μg/kg ιστού) (μg/kg ιστού) CIP 1,7 5,1 100 DAN 9,5 28,5 300 ENR 8,1 24,3 100 SAR 8,6 25,8 30 OXO 7,3 21,9 100 NAL 4,9 14,7 100 FLU 7,9 23,7 600 Ένωση Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου σε δείγματα ιστού τσιπούρας. Οι όροι της ακρίβειας και της πιστότητας μιας μεθόδου δόθηκαν λεπτομερώς στο γενικό τμήμα της παρούσας διατριβής. Σύμφωνα με την οδηγία 2002/657/EC της Ευρωπαϊκής Ένωσης, στην περίπτωση που δεν υπάρχει διαθέσιμο το αντίστοιχο πιστοποιημένο υλικό αναφοράς, όπως στην προκειμένη περίπτωση, προβλέπεται ο προσδιορισμός της ορθότητας μέσω του υπολογισμού των ανακτήσεων από μετρήσεις σε εμβολιασμένα δείγματα. Η ανάκτηση ορίζεται ως το ποσοστό της αληθούς συγκέντρωσης μιας ένωσης που ανακτάται κατά την αναλυτική διαδικασία. Η πιστότητα ελέγχθηκε με επαναλαμβανόμενες δοκιμές, τόσο κατά τη διάρκεια της ίδιας ημέρας, όσο και κατά τη διάρκεια πολλών ημερών (πιστότητα κατά τη διάρκεια 6 ημερών)

209 Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Η επαναληψιμότητα ελέγχεται με τη λήψη μιας σειράς πολλαπλών μετρήσεων σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις, μία όση είναι η τιμή του ορίου MRL της κάθε ένωσης, μία στο μισό του ορίου του MRL και μία στο ενάμισυ της τιμής του ορίου MRL της κάθε ένωσης. Έτσι λήφθηκε κατά τη διάρκεια της ίδιας ημέρας ένα σύνολο έξι μετρήσεων από τα εκχυλισμένα πρότυπα μίγματα των επτά ενώσεων. Στον πίνακα 14.7 δίνονται η μέση ευρεθείσα συγκέντρωση σε κάθε δείγμα, η τυπική απόκλιση (SD) της μέτρησης, η σχετική τυπική απόκλιση (RSD), καθώς και η % ανάκτηση της κάθε ένωσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με μίγματα των ενώσεων σε συγκεντρώσεις των 0,5MRL, MRL και 1,5MRL για 6 μετρήσεις, κατά τη διάρκεια της ίδιας ημέρας. Πίνακας 14.7: Ακρίβεια και επαναληψιμότητα της μεθόδου σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με μίγματα των επτά ενώσεων σε συγκεντρώσεις των 0,5MRL, MRL και 1,5MRL της κάθε ένωσης (n = 6). Ένωση CIP DAN ENR SAR OXO Ποσότητα που Ποσότητα που βρέθηκε προστέθηκε (μg/kg) ± SD (μg/kg) 50 47,7 ± 1,6 3,3 95, ,6 ± 1,3 1,4 98, ,1 ± 0,7 0,4 99, ,4 ± 1,2 0,8 100, ,4 ± 2,8 0,9 100, ,7 ± 1,6 0,4 99, ,6 ± 1,8 3,7 99, ,1 ± 2,1 2,1 101, ,6 ± 1,8 1,2 99, ,8 ± 0,5 3,4 98, ,4 ± 1,5 4,8 104, ,0 ± 1,4 3,0 102, ,5 ± 1,6 3,3 96, ,5 ± 1,4 1,3 100, ,9 ± 2,4 1,6 99, RSD Ανάκτηση (%)

210 Πίνακας 14.7: Συνέχεια. Ένωση NAL FLU Ποσότητα που Ποσότητα που βρέθηκε προστέθηκε (μg/kg) ± SD (μg/kg) 50 50,4 ± 2,7 5,3 100, ,5 ± 2,9 2,8 103, ,2 ± 3,2 2,1 99, ,4 ± 7,1 2,4 100, ,8 ± 10,4 1,8 99, ,0 ± 9,3 1,0 100,8 RSD Ανάκτηση (%) Όπως φαίνεται από τον πίνακα 14.7 τόσο η επαναληψιμότητα, όσο και η ακρίβεια της μεθόδου κατά την εφαρμογή της σε δείγματα ιστού τσιπούρας ήταν πολύ καλές. Η σχετική τυπική απόκλιση RSD, η οποία εκφράζει την επαναληψιμότητα των μετρήσεων, δεν ξεπερνάει για καμία ένωση το 5,3%, ενώ οι ανακτήσεις της μεθόδου κυμαίνονται από 95,5 έως 104,6% Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου στα δείγματα ιστού τσιπούρας Η ακρίβεια και η πιστότητα της μεθόδου ελέγχεται με τη λήψη μιας σειράς πολλαπλών μετρήσεων σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις, μία όσο είναι η τιμή του ορίου MRL της κάθε ένωσης, μία στο μισό του ορίου του MRL και μία στο ενάμισυ της τιμής του ορίου MRL της κάθε ένωσης, κατά τη διάρκεια 6 ημερών. Στον πίνακα 14.8 δίνονται η μέση ευρεθείσα συγκέντρωση σε κάθε δείγμα, η τυπική απόκλιση (SD) της μέτρησης, η σχετική τυπική απόκλιση (RSD), καθώς και η % ανάκτηση της κάθε ένωσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με μίγματα των επτά ενώσεων σε συγκεντρώσεις των 0,5MRL, MRL και 1,5MRL για 3 μετρήσεις, κατά τη διάρκεια 6 ημερών. Όπως φαίνεται και από τα αποτελέσματα που δίνονται στον πίνακα 14.8, τόσο η ακρίβεια, όσο και η πιστότητα της μεθόδου κατά την εφαρμογή της σε δείγματα ιστού τσιπούρας, κατά τη διάρκεια 6 ημερών, ήταν πολύ καλές. Η σχετική τυπική απόκλιση RSD, η οποία εκφράζει την πιστότητα των μετρήσεων, δεν ξεπερνάει για καμία (φθορο)κινολόνη το 6,6%, ενώ οι ανακτήσεις της μεθόδου κυμαίνονται από 94,5 έως 103,0%

211 Πίνακας 14.8: Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου κατά τη διάρκεια 6 ημερών σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με μίγματα των επτά ενώσεων μετά από SPE. Ένωση CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Ποσότητα που προστέθηκε (μg/kg) Ποσότητα που βρέθηκε ± SD RSD (μg/kg) Ανάκτηση (%) 50 48,2 ± 1,3 2,8 96, ,7 ± 1,1 1,1 98, ,2 ± 0,7 0,5 99, ,4 ± 1,7 1,1 99, ,3 ± 3,4 1,1 100, ,5 ± 1,9 0,4 99, ,7 ± 1,8 3,7 97, ,0 ± 2,2 2,2 100, ,2 ± 1,6 1,1 99, ,2 ± 0,9 6,6 94, ,3 ± 1,8 6,0 101, ,0 ± 2,0 4,3 100, ,0 ± 1,7 3,6 98, ,1 ± 1,3 1,3 101, ,2 ± 2,3 1,5 100, ,8 ± 2,1 4,1 101, ,0 ± 2,3 2,2 103, ,4 ± 2,7 1,8 98, ,9 ± 6,4 2,1 101, ,8 ± 12,1 2,0 99, ,4 ± 9,1 1,0 100,

212 Εκλεκτικότητα της μεθόδου Η εκλεκτικότητα της μεθόδου όσον αφορά στην ύπαρξη παρεμποδίσεων από ενδογενή συστατικά των δειγμάτων των ιστών, ελέγχθηκε με την ανάλυση 5 διαφορετικών λευκών δειγμάτων ιστών τσιπούρας ιχθυοτροφείου. Σε κανένα από τα δείγματα τα οποία ελήφθησαν από διαφορετικούς προμηθευτές της τοπικής αγοράς δεν παρατηρήθηκε η εμφάνιση κορυφών που να οφείλονται σε ενώσεις που παρεμποδίζουν κοντά στις κορυφές των προσδιοριζόμενων ενώσεων, όπως επίσης και του εσωτερικού προτύπου Σταθερότητα των εμβολιασμένων δειγμάτων ιστού τσιπούρας Ο έλεγχος της σταθερότητας είναι μεγάλης σημασίας, καθώς έχει παρατηρηθεί ότι ενδεχόμενη διάσπαση των εξεταζόμενων ενώσεων στο δείγμα του ιστού, είτε κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, είτε κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, μπορεί να προκαλέσει σημαντικές αποκλίσεις στα αποτελέσματα των αναλύσεων δίνοντας λανθασμένη εικόνα για την κατάσταση του δείγματος. Για να γίνει ο έλεγχος της σταθερότητας των επτά ενώσεων στα εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας στις συνθήκες αποθήκευσής τους (-18oC), σύμφωνα με την οδηγία 2002/657/EC και εφόσον δεν υπάρχει πιστοποιημένο υλικό αναφοράς, γίνεται ως εξής: Επτά δείγματα ιστού τσιπούρας τοποθετήθηκαν σε ισάριθμους δοκιμαστικούς σωλήνες από πολυπροπυλένιο και εμβολιάστηκαν με πρότυπο μίγμα των ενώσεων (CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε συγκέντρωση του ορίου MRL που έχει θεσπίσει η Ευρωπαϊκή Ένωση για την κάθε ένωση, και τοποθετήθηκαν στην κατάψυξη στους -18oC. Στο δείγμα προστέθηκε επίσης και το εσωτερικό πρότυπο (λαμοτρυγίνη) σε συγκέντρωση 20 ng/μl. Από τα δείγματα αυτά το ένα αναλύθηκε αμέσως και τα άλλα έξι μετά από τη πάροδο μίας, δύο, επτά, δεκατεσσάρων ημερών, ενός μήνα και δύο μηνών αντίστοιχα, ενώ για το κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν τρεις μετρήσεις. Ως κριτήριο για τον έλεγχο της σταθερότητας ορίστηκε η ευρεθείσα συγκέντρωση του αποθηκευμένου δείγματος να βρίσκεται στο -10% της αρχικής συγκέντρωσης του φρέσκου δείγματος. Το ποσοστό της κάθε ένωσης υπολογίστηκε με βάση τη σχέση: Ένωση που παραµένει (%) = Ci 100/Cfresh, όπου Ci = συγκέντρωση (σε μg/kg) τη χρονική στιγµή i και Cfresh= συγκέντρωση (σε μg/kg) του φρέσκου διαλύµατος

213 Στον πίνακα 14.9 δίνονται οι συγκεντρώσεις των ενώσεων σε μg/kg που αναλύονται μετά από 1, 2, 7, 14, 30 και 60 ημέρες, ενώ στο σχήμα 14.4 απεικονίζεται γραφικά η μεταβολή της συγκέντρωσης των επτά (φθορο)κινολονών με την πάροδο 60 ημερών. Πίνακας 14.9: Σταθερότητα των εννέα ενώσεων στους -18 oc σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας μετά από χρονικό διάστημα 1, 2, 7 και 14 ημερών. Ένωση CIP DAN ENR SAR Ποσότητα που προστέθηκε Χρόνος ανάλυσης Βρέθηκαν Ανάκτηση (μg/kg ιστού) (ημέρες) (μg/kg) (%) 0 99,1 99,1 1 97,9 97,9 2 96,7 96,7 7 92,9 92, ,9 83, ,6 64, ,3 53, ,2 101, ,4 98, ,8 96, ,4 93, ,2 82, ,2 74, ,4 34,5 0 99,5 99,5 1 98,3 98,3 2 97,6 97,6 7 92,2 92, ,4 73, ,1 54, ,7 26,7 0 30,4 101,2 1 29,5 98,3 2 28,8 95,9 7 27,7 92,

214 Πίνακας 14.9: Συνέχεια. Ένωση SAR OXO NAL FLU Ποσότητα που προστέθηκε Χρόνος ανάλυσης Βρέθηκαν Ανάκτηση (μg/kg ιστού) (ημέρες) (μg/kg) (%) 14 21,9 73, ,1 63, ,9 53,0 0 99,1 99,1 1 97,6 97,6 2 95,1 95,1 7 91,3 91, ,1 79, ,0 67, ,1 45, ,1 102,1 1 98,8 98,8 2 97,2 97,2 7 91,1 91, ,9 83, ,7 71, ,6 46, ,3 100, ,0 97, ,4 95, ,5 93, ,1 85, ,0 82, ,2 49, Από τις τιμές των ανακτήσεων που βρέθηκαν και παρατίθενται στον πίνακα 14.9, όλες οι (φθορο)κινολόνες ήταν σταθερές για χρονική περίοδο 7 ημερών (1 εβδομάδας) σε συνθήκες κατάψυξης (-18oC) και έπειτα η συγκέντρωσή τους ελαττώνεται

215 120 CIP DAN ENR % Ανάκτηση SAR OXO NAL FLU Ημέρες Σχήμα 14.4: Μεταβολή του ποσοστού της κάθε προσδιοριζόμενης ένωσης που απομένει στο εμβολιασμένο δείγμα ιστού τσιπούρας με διάλυμα μίγματός τους μετά την πάροδο 0, 1, 2, 7, 14, 30 και 60 ημερών σε συνθήκες κατάψυξης στους -18 oc. Εκτός από τον έλεγχο της σταθερότητας των επτά (φθορο)κινολονών σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με την πάροδο του χρόνου, ελέγχθηκε και η σταθερότητά τους σε σχέση με το χειρισμό των δειγμάτων, μετά από συνεχόμενους κύκλους ψύξης-απόψυξης. Για να γίνει ο έλεγχος αυτός, μία ποσότητα ιστού τσιπούρας ομογενοποιήθηκε και έπειτα χωρίστηκε σε δείγματα του 1,0000 ± 0,0001 g, τα οποία εμβολιάστηκαν με πρότυπο διάλυμα των ενώσεων σε συγκέντρωση ίση με το όριο MRL για την κάθε ένωση που ορίζει η Ευρωπαϊκή Ένωση, δηλαδή τα 30 μg/kg για την SAR, τα 100 μg/kg για τις ενώσεις CIP, ENR, OXO και NAL, τα 300 μg/kg για την DAN και τα 600 μg/kg για την FLU. Επίσης στο μίγμα προστέθηκε και το εσωτερικό πρότυπο (LTG) σε συγκέντρωση 20 ng/μl. Ένα από τα δείγματα αναλύθηκε αμέσως, ενώ τα υπόλοιπα αποθηκεύτηκαν στην κατάψυξη στους -18 οc απουσία φωτός. Για τις επόμενες τέσσερις ημέρες, αφού ξεπάγωναν τα δείγματα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, αναλυόταν ένα κάθε φορά και τα υπόλοιπα ψύχονταν πάλι στους -18 oc. Από τα αποτελέσματα που δίνονται στον πίνακα φαίνεται ότι όλες οι ενώσεις είναι σταθερές για 3 κύκλους ψύξης απόψυξης. Στο σχήμα 14.5, δίνεται η μεταβολή του ποσοστού της ανάκτησης των επτά κινολονών σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με διάλυμα μίγματός τους, μετά από 4 κύκλους απόψυξης

216 Πίνακας 14.10: Σταθερότητα των (φθορο)κινολονών σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας μετά από 4 κύκλους ψύξης-απόψυξης. Ποσότητα που Ένωση προστέθηκε (μg/kg ιστού) CIP DAN ENR SAR OXO NAL Κύκλος Βρέθηκαν Ανάκτηση απόψυξης (μg/kg) (%) 0 99,1 99,1 1 98,3 98,3 2 97,3 97,3 3 92,6 92,6 4 88,0 88, ,2 101, ,8 100, ,7 97, ,9 94, ,0 84,3 0 99,5 99,5 1 98,7 98,7 2 94,3 94,3 3 93,2 93,2 4 82,7 82,7 0 30,4 101,2 1 29,9 99,6 2 28,8 95,9 3 27,7 92,3 4 25,6 85, ,0 101,0 1 97,2 97,2 2 93,6 93,6 3 91,4 91,4 4 81,2 81, ,1 102,1 1 99,9 99,9 2 98,2 98,

217 Πίνακας 14.10: Συνέχεια. Ποσότητα που Ένωση προστέθηκε (μg/kg ιστού) NAL Κύκλος Βρέθηκαν Ανάκτηση απόψυξης (μg/kg) (%) 3 92,8 92,8 4 82,2 82, ,3 100, ,0 98, ,1 97, ,1 94, ,0 85,4 100 FLU CIP % Ανάκτηση 100 DAN 80 ENR 60 SAR OXO 40 NAL 20 FLU Κύκλοι ψύξης - απόψυξης Σχήμα Μεταβολή του ποσοστού της ανάκτησης των επτά ενώσεων σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με διάλυμα μίγματός τους μετά από 4 κύκλους απόψυξης

218 Όρια απόφασης (CCα) και ικανότητα ανίχνευσης (CCβ). Ο προσδιορισμός των ορίων απόφασης και ικανότητας ανίχνευσης είναι από τα χαρακτηριστικά επίδοσης που πρέπει να προσδιορίζονται σε μια αναλυτική μέθοδο, όπως έχει περιγραφεί και στην παράγραφο Η εύρεση των ορίων αυτών είναι πολύ σημαντική, αφού καθορίζει πότε και με ποια βεβαιότητα ένα δείγμα μπορεί να θεωρηθεί ότι υπερβαίνει τα όρια καταλοίπου που έχει θεσπίσει η Ευρωπαϊκή Ένωση. Το όριο απόφασης CCα εκφράζει τη συγκέντρωση της ένωσης πάνω από την οποία, μπορεί να αποφασισθεί ότι ένα δείγμα είναι μη συμμορφούμενο σε μία ορισμένη πιθανότητα λάθους, να είναι δηλαδή συμμορφούμενο το δείγμα που δοκιμάζεται ακόμα και αν η μέτρηση κατέληξε σε μη συμμορφούμενο αποτέλεσμα (σφάλμα α). Όταν για τις ενώσεις, οι οποίες μελετώνται, έχει καθοριστεί επιτρεπόμενο όριο, η ικανότητα ανίχνευσης CCβ εκφράζει τη συγκέντρωση, στην οποία η μέθοδος είναι σε θέση να ανιχνεύσει συγκεντρώσεις στο επιτρεπόμενο όριο, με στατιστική βεβαιότητα 1 β, όπου το σφάλμα β είναι η πιθανότητα το δείγμα να είναι αληθώς μη συμμορφούμενο, ακόμα και αν η μέτρηση κατέληξε σε συμμορφούμενα αποτελέσματα. Για να προσδιοριστούν αυτά τα όρια εμβολιάστηκαν 20 τυφλά δείγματα ιστών τσιπούρας με διάλυμα μίγματος των επτά (φθορο)κινολονών σε τέτοια συγκέντρωση, η καθεμία ίση με το επιτρεπόμενο όριο που έχει θεσπίσει η Ευρωπαϊκή Ένωση, δηλαδή τα 100 μg/kg ιστού για τις CIP, ENR, OXO και NAL, τα 300 μg/kg ιστού για την DAN, τα 30 μg/kg ιστού για την SAR και τα 600 μg/kg ιστού για την FLU. Η συγκέντρωση στο επιτρεπόμενο όριο συν 1,64 φορές την αντίστοιχη τυπική απόκλιση δίνει το CCα, για στάθμη εμπιστοσύνης 95% και βαθμούς ελευθερίας που τείνουν στο άπειρο. Στον πίνακα δίνονται τα όρια απόφασης της αναπτυσσόμενης μεθόδου για τις επτά (φθορο)κινολόνες, τα οποία είναι: 101,3 μg/kg για την CIP, 303,8 μg/kg για την DAN, 102,6 μg/kg για την ENR, 31,2 μg/kg για την SAR, 103,2 μg/kg για το OXO, 103,6 μg/kg για το NAL και τα 619,3 μg/kg για την FLU

219 Πίνακας 14.11: Όρια απόφασης της μεθόδου για τις επτά (φθορο)κινολόνες στο MRL της καθεμίας και υπολογισμός του σφάλματος α. Ένωση Προστέθηκαν (μg/kg) Μετρήθηκαν ± SD (μg/kg) RSD Ανάκτηση Σφάλμα α CCα (%) (%) (1,64.SD) (μg/kg) CIP ,6 ± 0,8 0,8 97,6 1,3 101,3 DAN ,6 ± 2,3 0,8 98,9 3,8 303,8 ENR ,2 ± 1,6 1,6 97,2 2,6 102,6 SAR 30 28,8 ± 0,7 2,5 96,0 1,2 31,2 OXO ,6 ± 2,0 2,0 99,6 3,2 103,2 NAL ,0 ± 2,2 2,1 103,0 3,6 103,6 FLU ,8 ± 11,8 2,0 99,5 19,3 619,3 Έπειτα από τον προσδιορισμό των ορίων απόφασης CCα, υπολογίστηκε η ικανότητα ανίχνευσης CCβ με την ίδια διαδικασία. Έτσι, εμβολιάστηκαν πάλι 20 δείγματα ιστού τσιπούρας με μίγμα των επτά (φθορο)κινολονών, σε τέτοια συγκέντρωση η καθεμία ίση με το όριο απόφασης CCα που δίνονται στον πίνακα Η συγκέντρωση στο CCα συν 1,64 φορές την αντίστοιχη τυπική απόκλιση δίνει την ικανότητα ανίχνευσης CCβ, για στάθμη εμπιστοσύνης 90% και βαθμούς ελευθερίας που τείνουν στο άπειρο. Στον πίνακα δίνονται τα όρια CCβ για την κάθε κινολόνη, τα οποία είναι: 102,9 μg/kg για την CIP, 306,2 μg/kg για την DAN, 105,9 μg/kg για την ENR, 32,3 μg/kg για την SAR, 106,8 μg/kg για το OXO, 106,6 μg/kg για το NAL και τα 622,8 μg/kg για την FLU

220 Πίνακας 14.12: Ικανότητα ανίχνευσης της μεθόδου CCβ για τις επτά (φθορο)κινολόνες και υπολογισμός του σφάλματος β. Προστέθηκαν Μετρήθηκαν ± SD RSD Ανάκτηση Σφάλμα β CCβ (%) (%) (1,64.SD) (μg/kg) Ένωση (μg/kg) CIP 101,0 102,4 ± 1,1 1,1 101,3 1,9 102,9 DAN 304,0 301,9 ± 1,3 0,4 99,3 2,2 306,2 ENR 103,0 102,7 ± 1,8 1,7 99,7 2,9 105,9 SAR 31,0 30,5 ± 0,8 2,7 98,5 1,3 32,3 OXO 103,0 104,3 ± 2,3 2,2 101,3 3,7 106,7 NAL 104,0 105,0 ± 1,6 1,5 101,0 2,6 106,6 FLU 619,0 616,7 ± 2,3 0,4 99,6 3,8 622,8 (μg/kg) Εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα ιστού τσιπούρας. Στη συνέχεια των πειραμάτων, η μέθοδος που αναπτύχθηκε εφαρμόστηκε στην ανάλυση 20 διαφορετικών δειγμάτων ιστού τσιπούρας από διάφορους προμηθευτές του εμπορίου. Σε όλα τα δείγματα εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο προκατεργασίας που περιγράφηκε στην παράγραφο Σε κανένα από τα δείγματα που αναλύθηκαν δε βρέθηκαν κατάλοιπα των προσδιοριζόμενων (φθορο)κινολονών από πιθανή χορήγησή τους στις τσιπούρες

221 14.4 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΗ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ Το επόμενο βήμα στην παρούσα διατριβή ήταν η ανάπτυξη και η επικύρωση μεθόδου για τον προσδιορισμό των 7 (φθορο)κινολονών σε δείγματα ιστού τσιπούρας με ανιχνευτή φασματογράφο μάζας σε συνεργασία με το Πολυτεχνείο του Graz στην Αυστρία. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε διάταξη HPLC Agilent 1100 της εταιρείας Agilent Technologies (Palo Alto, CA, USA) με αυτόματο δειγματολήπτη και όγκο του εισαγόμενου δείγματος τα 20 μl. Ο διαχωρισμός των ενώσεων πραγματοποιήθηκε σε χρωματογραφική στήλη Perfectsil ODS-2, 5 μm, 250 mm 4 mm (της εταιρείας MZ Analysentechnik, Mainz, Germany). Ο φασματογράφος μάζας ήταν τριπλό τετράπολο API 2000 και η σύζευξη με τη διάταξη της HPLC έγινε χρησιμοποιώντας ιονισμό με ηλεκτροψεκασμό σε θετικό δυναμικό (ESI+). Η ανίχνευση με το φασματογράφο μάζας πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της παρακολούθησης πολλαπλής αντίδρασης (multiple reaction monitoring MRM). Ως αέριο ψεκασμού (nebulizer air) χρησιμοποιήθηκε συνθετικός αέρας, ως βοηθητικό αέριο (curtain gas) χρησιμοποιήθηκε το άζωτο, ως σαν αέριο θέρμανσης (heater gas) συνθετικός αέρας. Για το διαχωρισμό των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε βαθμωτή έκλουση με ένα σύστημα 3 διαλυτών: μεθανόλης (στο οποίο είχε προστεθεί και 0,2% μυρμηκικό οξύ), ακετονιτριλίου (στο οποίο είχε επίσης προστεθεί 0,2% μυρμηκικό οξύ) και υδατικού διαλύματος μυρμηκικού οξέος 0,2%. Στον πίνακα δίνεται η σύσταση της κινητής φάσης. Ο χρόνος ανάλυσης ήταν 30 min ενώ η πίεση του συστήματος κυμαινόταν από 170 έως 180 bar. Η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης ρυθμίστηκε στα 1000 μl/min, ενώ μέσω ενός συνδέσμου «Τ» ελαττωνόταν στα 150 μl/min πριν εισέλθει το δείγμα στο φασματογράφο μάζας. Η θερμοκρασία του αερίου θέρμανσης ρυθμίστηκε στους 400 οc και η διαφορά δυναμικού του τριχοειδούς σωλήνα στα 4,7 kv. Το δυναμικό εστίασης (focusing potential) ρυθμίστηκε στα 200 V ενώ το δυναμικό αποσύζευξης (declustering potential) στα 50 V. Στο σχήμα 14.5 δίνεται ένα τυπικό χρωματογράφημα εμβολιασμένου ιστού τσιπούρας σε συγκέντρωση ίση με το MRL της κάθε ένωσης, ενώ στον πίνακα δίνονται τα αρχικά και τα θυγατρικά ιόντα της κάθε ένωσης καθώς και οι παράμετροι λειτουργίας του φασματογράφου μάζας (δυναμικό αποσύζευξης DP και ενέργεια σύγκρουσης CE)

222 Πίνακας 14.13: Σύσταση της κινητής φάσης και πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης για το βέλτιστο διαχωρισμό των ενώσεων. CH3CN* CH3OH* HCOOH 0,2% % v/v % v/v % v/v 2 12,5 7, ,5 7, ,5 7, ,5 7,5 80 t (min) * περιέχει 0,2% HCOOH Σχήμα 14.5: Χρωματογράφημα εμβολιασμένου ιστού τσιπούρας σε συγκέντρωση ίση με το MRL της κάθε ένωσης

223 Πίνακας 14.14: Βέλτιστες συνθήκες MS/MS και θραύσματα της κάθε κινολόνης στα δείγματα ιστού τσιπούρας. [M+H]+ Ένωση μητρικό Θυγατρικά ιόντα (m/z) MS/MS (σχετική αφθονία) (MRM) ιόν Μετάπτωση προσδιορισμού (m/z) DP CE (V) (ev) CIP 332,2 294 (3), 231 (20), 314,2 (100) 332,2 314,2 [M H2O] DAN 358,1 82 (10), 255 (10), 340,2 (100) 358,1 340,2 [M H2O] ENR 360,3 245 (60), 286 (60), 316,3 (75), 360,3 316,3 [M CO2] ,2 (100) SAR 386,2 368,1 (100), 348,2 (5), 299 (8) 386,2 368,1 [M H2O] OXO 262,1 216 (28) 244,1 (100) 262,1 244,1 [M H2O] NAL 233,2 187 (20), 158,7 (1), 215,0 233,2 215,0 [M H2O] [M C3H6 H2O] (100) FLU 262,1 202,0(100), 244 (50), 174,0 262,1 202,0 (10) DP: δυναμικό αποσύζευξης CE: ενέργεια σύγκρουσης Η διαδικασία παραλαβής των ενώσεων από τον μυϊκό ιστό της τσιπούρας ήταν ακριβώς η ίδια με αυτή που περιγράφηκε στην παράγραφο 14.2, με τη μόνη διαφορά ότι η επαναδιάλυση των δειγμάτων γινόταν με 0,2% μυρμηκικό οξύ σε μίγμα που αποτελείτο από 50% νερό, 40% ακετονιτρίλιο και 10% μεθανόλη Έλεγχος γραμμικότητας Χάραξη καμπυλών αναφοράς μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού. Προκειμένου να ελεγχθεί η γραμμικότητα μέσω της χάραξης των καμπυλών αναφοράς σε εμβολιασμένα δείγματα ιστών, ακολουθήθηκε η προκατεργασία που περιγράφηκε στην παράγραφο 14.2 σε 7 δείγματα ιστού τσιπούρας του 1,0000 ± 0,0001 g, τα οποία εμβολιάστηκαν αντίστοιχα με πρότυπα διαλύματα μιγμάτων των επτά ενώσεων συγκέντρωσης 10, 20, 40, 100, 200, 400 και 800 μg/kg. Ως ιστός τσιπούρας στην παρούσα εργασία νοείται μύες και δέρμα σε φυσική αναλογία. Το τελικό εκχύλισμα που προέκυπτε από κάθε δείγμα αναλυόταν τρεις φορές. Όπως και στην επικύρωση της μεθόδου στα πρότυπα διαλύματα, η ποσοτική αποτίμηση των αποτελεσμάτων έγινε με βάση το μέσο όρο του λόγου των εμβαδών

224 της κορυφής της κάθε ένωσης, προς το εμβαδό της κορυφής του εσωτερικού προτύπου στις τρεις μετρήσεις για κάθε συγκέντρωση. Με βάση τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων υπολογίστηκαν οι εξισώσεις των καμπυλών αναφοράς, καθώς και ο συντελεστής γραμμικής συσχέτισης r και δίνονται στον πίνακα Πίνακας 14.15: Καμπύλες αναφοράς των ενώσεων σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας μετά από SPE. Ένωση CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Στατιστική επεξεργασία y = (250427,9 ± 4150,1)x + (4234,5 ± 724,0) r = 0,9993 y = (176272,7 ± 2811,6)x + (12437,0 ± 490,5) r = 0,9993 y = (170213,8 ± 3219,5)x + (13824,9 ± 546,8) r = 0,9993 y = (95742,6 ± 2154,7)x - (35,6 ± 375,9) r = 0,9987 y = (582763,4 ± 9080,0)x + (25040,9 ± 1710,8) r = 0,9995 y = ( ,0 ± 91532,0)x + (306625,5 ± 15967,6) r = 0,9991 y = (452946,4 ± 8941,8)x + (72410,1 ± 1559,9) r = 0,9991 όπου y = ο μέσος όρος του λόγου του εμβαδού της κορυφής της κάθε ένωσης, προς το εμβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου x = η ποσότητα της προσδιοριζόμενης ένωσης σε μg/kg

225 Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης και γραμμικής περιοχής Μετά την εύρεση των εξισώσεων των καμπυλών αναφοράς για τις επτά ενώσεις, ακολούθησε ο προσδιορισμός των ορίων ανίχνευσης (LOD) και των ορίων ποσοτικής αποτίμησης (LOQ), με βάση τις σχέσεις LOD 3,3 sb ί και LOQ 10 sb, ί όπου sb είναι η τυπική απόκλιση των τεταγμένων επι την αρχή που προκύπτουν από τη χάραξη των καμπυλών αναφοράς και κλίση είναι η κλίση των ευθειών των καμπυλών αυτών, και δίνονται στον πίνακα Η Ευρωπαϊκή Ένωση έχει θεσπίσει ως ανώτατα όρια καταλοίπων (MRLs), σύμφωνα με την οδηγία 90/2377/EC, τα 30 μg/kg ιστού για την SAR, τα 100 μg/kg ιστού για τις ENR και OXO, τα 300 μg/kg ιστού για την DAN και τα 600 μg/kg ιστού για την FLU. Για τις υπόλοιπες ενώσεις (CIP και NAL) για τις οποίες δεν έχουν ορισθεί όρια, ετέθησαν ως όριο η τιμή των 100 μg/kg ιστού, που ισχύει και για άλλες δύο κινολόνες. Από τα αποτελέσματα που δίνονται στον πίνακα 14.16, φαίνεται ότι τα όρια ποσοτικής αποτίμησης που επιτεύχθηκαν με το φασματοφωτόμετρο μάζας είναι πολύ μικρότερα τόσο από τα MRLs των ενώσεων για τον ιστό της τσιπούρας, όσο και από τα όρια που επιτεύχθησαν με τον ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων, με εξαίρεση της CIP, που δίνονται στην παράγραφο στον πίνακα Πίνακας 14.16: Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης της μεθόδου για τον προσδιορισμό των εννέα ενώσεων σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με φασματογράφο μάζας. LOD LOQ MRL (μg/kg ιστού) (μg/kg ιστού) (μg/kg ιστού) CIP 2,0 6,0 100 DAN 2,0 6,0 300 ENR 2,0 6,0 100 SAR 2,7 8,0 30 OXO 2,0 6,0 100 NAL 2,0 6,0 100 FLU 2,3 7,0 600 Ένωση

226 Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου στα δείγματα ιστού τσιπούρας Η ακρίβεια και η πιστότητα της μεθόδου ελέγχθηκαν με τη λήψη μιας σειράς πολλαπλών μετρήσεων σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις, μία όσο είναι η τιμή του ορίου MRL της κάθε ένωσης, μία στο μισό του ορίου του MRL και μία στο ενάμισυ της τιμής του ορίου MRL της κάθε ένωσης, κατά τη διάρκεια 3 ημερών. Στον πίνακα δίνονται η μέση ευρεθείσα συγκέντρωση σε κάθε δείγμα, η τυπική απόκλιση (SD) της μέτρησης, η σχετική τυπική απόκλιση (RSD), καθώς και η % ανάκτηση της κάθε ένωσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με μίγματα των επτά ενώσεων σε συγκεντρώσεις των 0,5MRL, MRL και 1,5MRL για 3 μετρήσεις, κατά τη διάρκεια 3 ημερών. Όπως φαίνεται και από τα αποτελέσματα που δίνονται στον πίνακα 14.17, τόσο η ακρίβεια, όσο και η πιστότητα της μεθόδου κατά την εφαρμογή της σε δείγματα ιστού τσιπούρας κατά τη διάρκεια 3 ημερών, ήταν πολύ καλές. Η σχετική τυπική απόκλιση RSD, η οποία εκφράζει την πιστότητα των μετρήσεων, δεν ξεπερνάει για καμία (φθορο)κινολόνη το 19,5%, ενώ οι ανακτήσεις της μεθόδου κυμαίνονται από 90,0 έως 132,0%. Πίνακας 14.17: Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με μίγματα των επτά ενώσεων μετά από SPE. Ένωση CIP DAN ENR SAR Ποσότητα που Ποσότητα που προστέθηκε βρέθηκε ± SD (μg/kg) (μg/kg) ± 8 14,8 108, ± 7 6,5 108, ± 28 16,4 114, ± 32 19,5 109, ± 48 16,4 97, ± 10 2,0 110, ± 12 19,4 124, ± 20 17,2 116, ± 10 5,0 132, ± 2 12,5 106, ± 4 14,8 90, ± 3 6,5 102, RSD Ανάκτηση (%)

227 Πίνακας 14.17: Συνέχεια. Ποσότητα που Ένωση Ποσότητα που βρέθηκε ± SD (μg/kg) (μg/kg) ± 10 18,9 106, ± 10 10,5 95, ± 25 15,7 106, ± 10 16,7 120, ± 3 2,8 109, ± 8 4,6 114, ± 22 7,1 103, ± 31 5,4 95, ± 9 1,0 104,4 OXO NAL FLU RSD Ανάκτηση προστέθηκε (%) Σταθερότητα των εμβολιασμένων δειγμάτων ιστού τσιπούρας Ο έλεγχος της σταθερότητας είναι μεγάλης σημασίας, καθώς έχει παρατηρηθεί ότι ενδεχόμενη διάσπαση των εξεταζόμενων ενώσεων στο δείγμα του ιστού, είτε κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, είτε κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, μπορεί να προκαλέσει σημαντικές αποκλίσεις στα αποτελέσματα των αναλύσεων δίνοντας λανθασμένη εικόνα για την κατάσταση του δείγματος. Για να γίνει ο έλεγχος της σταθερότητας των επτά ενώσεων στα εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας στις συνθήκες αποθήκευσής τους (-18 oc), σύμφωνα με την οδηγία 2002/657/EC και εφόσον δεν υπάρχει πιστοποιημένο υλικό αναφοράς, γίνεται ως εξής: Επτά δείγματα ιστού τσιπούρας τοποθετήθηκαν σε ισάριθμους δοκιμαστικούς σωλήνες από πολυπροπυλένιο και εμβολιάστηκαν με πρότυπο μίγμα των ενώσεων (CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε συγκέντρωση του ορίου MRL που έχει θεσπίσει η Ευρωπαϊκή Ένωση για την κάθε ένωση, και τοποθετήθηκαν στην κατάψυξη στους -18oC. Από τα δείγματα αυτά το ένα αναλύθηκε αμέσως και τα άλλα έξι μετά από τη πάροδο μίας, δύο, επτά, δεκατεσσάρων ημερών, ενός μήνα και δύο μηνών αντίστοιχα, ενώ για το κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν τρεις μετρήσεις

228 Ως κριτήριο για τον έλεγχο της σταθερότητας ορίστηκε η ευρεθείσα συγκέντρωση του αποθηκευμένου δείγματος να βρίσκεται στο -10% της αρχικής συγκέντρωσης του φρέσκου δείγματος. Το ποσοστό της κάθε ένωσης υπολογίστηκε με βάση τη σχέση: Ένωση που παραµένει (%) = Ci 100/Cfresh, όπου Ci = συγκέντρωση (σε μg/kg) τη χρονική στιγµή i και Cfresh= συγκέντρωση (σε μg/kg) του φρέσκου διαλύµατος Στο σχήμα 14.6 απεικονίζεται γραφικά η μεταβολή της συγκέντρωσης των επτά (φθορο)κινολονών με την πάροδο 60 ημερών. Σχήμα 14.6: Μεταβολή του ποσοστού της κάθε προσδιοριζόμενης ένωσης που απομένει στο εμβολιασμένο δείγμα ιστού τσιπούρας με διάλυμα μίγματός τους μετά την πάροδο 0, 1, 2, 7, 14, 30 και 60 ημερών σε συνθήκες κατάψυξης στους -18 oc. Από τις τιμές των ανακτήσεων που βρέθηκαν όλες οι (φθορο)κινολόνες ήταν σταθερές για χρονική περίοδο 14 ημερών (2 εβδομάδες) σε συνθήκες κατάψυξης (-18 oc) και έπειτα η συγκέντρωσή τους ελαττώνεται. Εκτός όμως από τον έλεγχο της σταθερότητας των επτά (φθορο)κινολονών σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με την πάροδο του χρόνου, ελέγχθηκε και η σταθερότητά τους σε σχέση με το χειρισμό των δειγμάτων μετά από συνεχόμενους κύκλους ψύξης-απόψυξης. Για να γίνει ο έλεγχος αυτός, μία ποσότητα ιστού τσιπούρας ομογενοποιήθηκε και έπειτα χωρίστηκε σε δείγματα του 1,0000 ± 0,0001 g, τα οποία εμβολιάστηκαν με πρότυπο διάλυμα των ενώσεων σε συγκέντρωση ίση με το όριο MRL για την κάθε ένωση που ορίζει η Ευρωπαϊκή Ένωση, δηλαδή τα 30 μg/kg για την SAR, τα

229 μg/kg για τις ενώσεις CIP, ENR, OXO και NAL, τα 300 μg/kg για την DAN και τα 600 μg/kg για την FLU. Ένα από τα δείγματα αναλύθηκε αμέσως, ενώ τα υπόλοιπα αποθηκεύτηκαν στην κατάψυξη στους -18 οc απουσία φωτός. Για τις επόμενες τέσσερις ημέρες, αφού ξεπάγωναν τα δείγματα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, αναλυόταν ένα κάθε φορά και τα υπόλοιπα ψύχονταν πάλι στους -18 oc. Από το διάγραμμα του σχήματος 14.7, στο οποίο δίνεται η μεταβολή του ποσοστού της ανάκτησης των επτά κινολονών σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με διάλυμα μίγματός τους, μετά από 4 κύκλους απόψυξης, φαίνεται ότι όλες οι ενώσεις ήταν σταθερές για 3 κύκλους ψύξης απόψυξης. Σχήμα Μεταβολή του ποσοστού της ανάκτησης των επτά ενώσεων σε εμβολιασμένα δείγματα ιστού τσιπούρας με διάλυμα μίγματός τους μετά από 4 κύκλους απόψυξης Εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα ιστού τσιπούρας Στη συνέχεια των πειραμάτων, η μέθοδος που αναπτύχθηκε εφαρμόστηκε στην ανάλυση 20 διαφορετικών δειγμάτων ιστού τσιπούρας από διάφορους προμηθευτές του εμπορίου. Σε όλα τα δείγματα εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο προκατεργασίας που περιγράφηκε στην παράγραφο Σε κανένα από τα δείγματα που αναλύθηκαν δε βρέθηκαν κατάλοιπα των προσδιοριζόμενων (φθορο)κινολονών από πιθανή χορήγησή τους στις τσιπούρες

230 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 15 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ ΚΑΙ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΟΝ ΜΕΘΟΔΟΥ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ HPLC ΓΙΑ ΤΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΙΧΘΥΟΤΡΟΦΗ Μετά τον προσδιορισμό των επτά (φθορο)κινολονών σε δείγματα ιστού τσιπούρας και σολομού, ακολούθησε η ανίχνευση και ο προσδιορισμός των ενώσεων αυτών (CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε δείγμα ιχθυοτροφής, η προμήθεια της οποίας πραγματοποιήθηκε από την Ελληνική Βιομηχανία Ζωοτροφών (ΕΛ.ΒΙ.Ζ.) ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΕ ΙΧΘΥΟΤΡΟΦΗ Τα ψάρια της ιχθυοκαλλιέργειας, όπως έχει τονιστεί και στο θεωρητικό μέρος, τρέφονται με τεχνητές ισορροπημένες πλήρεις ιχθυοτροφές, οι οποίες περιέχουν κυρίως ιχθυάλευρα, ιχθυέλαια και δημητριακά και σε μικρότερες ποσότητες βιταμίνες, ιχνοστοιχεία και άμυλο. Η μορφή της ιχθυοτροφής που μελετήθηκε ήταν η σύμπηκτη (pellets), αφού προορίζεται για τη χορήγηση σε τσιπούρες ιχθυοτροφείου μεγάλου μεγέθους. Σε όλα τα δείγματα της ξηρής ιχθυοτροφής η προκατεργασία γινόταν σε ποσότητα 1,0000 ± 0,0001 g, αφού πρώτα το δείγμα κονιορτοποιόταν και ομογενοποιόταν. Για το στάδιο της ανάπτυξης του πρωτοκόλλου εκχύλισης των κινολονών έγιναν διάφορες δοκιμές, στις οποίες ακολουθήθηκε η εξής πορεία: 1) Εµβολιασµός 1,0000 ± 0,0001 g σκόνης ιχθυοτροφής µε 400 μl µίγµατος συγκέντρωσης 5 ng/μl των επτά ενώσεων και του εσωτερικού προτύπου (λαμοτρυγίνη) σε σταθερή συγκέντρωση των 20 ng/μl ή 400 μl H2O προκειμένου για το λευκό δείγμα. 2) Ανάδευση του δείγματος σε συσκευή vortex. 3) Προσθήκη 5 ml διαφόρων διαλυτών για την εκχύλιση των ενώσεων από το υπόστρωµα του ιστού. 4) Ανάδευση σε συσκευή vortex. 5) Εφαρμογή υπερήχων για 15 min. 6) Φυγοκέντρηση για 10 min στις 4500 στροφές/λεπτό για την παραλαβή του εκχυλίσματος και ανάλογα µε τη φύση του διαλύματος εκχύλισης, είτε εξάτμιση του εκχυλίσματος μέχρι ξηρού και επαναδιάλυση με 400 μl υδατικού διαλύματος τριφθοροοξικού οξέος 0,1% (για υδατικούς διαλύτες εκχύλισης) και προσθήκη H2O, μέχρι ο τελικός όγκος να γίνει 2 ml,

231 είτε απόρριψη του εκχυλίσματος (για οργανικούς διαλύτες που προηγούνταν των υδατικών), 7) Απ ευθείας εφαρμογή της SPE σε μικροστήλες Oasis HLB (200 mg/3 ml, Waters) με το πρωτόκολλο που ισχύει και στην τσιπούρα, όπως φαίνεται και στο σχήμα ) Εξάτμιση σε ρεύμα αζώτου στους 45oC. 9) Επαναδιάλυση με 400 μl υδατικού διαλύματος τριφθοροοξικού οξέος 0,1% και διήθηση του μίγματος με φίλτρα σύριγγας. 10) Εισαγωγή του δείγματος στη στήλη HPLC. Ενεργοποίηση της μικροστήλης με: 1) 2 ml CH3OH 2) 2 ml H2O Εισαγωγή του εκχυλισμένου δείγματος Έκλουση των ενώσεων με 1,5 ml 0,1% TFA σε CH3CN 0,5 ml CH3CN Σχήμα 15.1: Πρωτόκολλο εκχύλισης SPE για την παραλαβή των κινολονών από ιχθυοτροφή. Η διαδικασία των σταδίων 3-6 επαναλαμβανόταν στις δοκιμές και δεύτερη φορά με χρήση 3 ml του εκχυλιστικού μέσου, προκειμένου να επιτευχθεί πλήρης ανάκτηση των ενώσεων από το υπόστρωμα της ιχθυοτροφής. Όλες οι δοκιμές έγιναν στη χρωματογραφική στήλη MZ-Aqua Perfect, C18, 5 μm, mm. Τα διάφορα εκχυλιστικά συστήματα που δοκιμάστηκαν δίνονται στον πίνακα Αρχικά δοκιμάστηκε η επεξεργασία των δειγμάτων με ml υδατικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου (NaCl) 1%, είτε απευθείας, είτε μετά από ένα στάδιο εκχύλισης με 5 ml μίγματος εξανίου/οξικού αιθυλεστέρα (50/50 % v/v), οι ανακτήσεις όμως των κινολονών και στις δύο περιπτώσεις ήταν πολύ χαμηλές (<10%) ενώ το OXO, το NAL και η FLU δεν εκλούστηκαν καθόλου. Μετά δοκιμάστηκε αντί του χλωριούχου νατρίου (NaCl), υδατικό διάλυμα ανθρακικού νατρίου (Na2CO3) 1%, είτε απευθείας, είτε μετά από ένα στάδιο εκχύλισης με 5 ml μίγματος εξανίου/οξικού αιθυλεστέρα (50/50 % v/v). Πάλι όμως οι ανακτήσεις των κινολονών ήταν χαμηλές (<65%). Κατόπιν δοκιμάστηκε αντί του διαλύματος ανθρακικού νατρίου να χρησιμοποιηθεί υδατικό διάλυμα τρυγικού οξέος 0,1%, είτε απευθείας, είτε μετά από ένα στάδιο εκχύλισης με 5 ml μίγματος εξανίου/οξικού αιθυλεστέρα (50/50 % v/v). Και σε αυτή τη περίπτωση όμως οι ανακτήσεις των κινολονών ήταν χαμηλές (<40%)

232 Έπειτα δοκιμάστηκε να γίνει η επεξεργασία των δειγμάτων με την εκχύλιση σε πρώτο στάδιο με 5 ml υδατικού διαλύματος εξανίου 100% ή 5 ml ακετονιτριλίου (CH3CN) ή μίγμα 5 ml εξανίου/ CH3CN (50/50 % v/v), ανάδευση, φυγοκέντρηση, απόρριψη του υπερκείμενου και προσθήκη στο υπόλειμμα, είτε υδατικού διαλύματος τριφθοροοξικού οξέος 0,1%, είτε ρυθμιστικού διαλύματος οξικών (ph = 4,00), είτε υδατικού διαλύματος φωσφορικού οξέος (H3PO4) 0,2%, είτε υδατικού διαλύματος H3PO4 0,5%, είτε τέλος διαλύματος H3PO4 0,2% διαλυμένο σε μίγμα H2O/CH3CN (70/30 % v/v), είτε απευθείας προσθήκη των υδατικών διαλυμάτων εκχύλισης, χωρίς να προηγείται δηλαδή το στάδιο με τους οργανικούς διαλύτες. Σε όλες όμως τις δοκιμές, τα ποσοστά των κινολονών ήταν πολύ χαμηλά και σε κάποιες περιπτώσεις, κάποιες από αυτές δεν εκλούστηκαν. Τέλος δοκιμάστηκαν να εφαρμοστούν και τα πρωτόκολλα εκχύλισης που χρησιμοποιήθηκαν στην περίπτωση της τσιπούρας και του σολομού που αναφέρθηκαν σε προηγούμενα κεφάλαια. Δηλαδή δοκιμάστηκε να γίνει η επεξεργασία των δειγμάτων της ιχθυοτροφής με εκχύλιση σε πρώτη φάση με 5 ml υδατικού διαλύματος εξανίου 100% ή 5 ml CH3CN ή μίγμα 5 ml εξανίου/ CH3CN (50/50 % v/v), ανάδευση, φυγοκέντρηση, απόρριψη του υπερκείμενου και προσθήκη στο υπόλειμμα, είτε ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικών (ph = 4,68) πρωτόκολο προκατεργασίας σολομού), είτε υδατικού διαλύματος NaOH 0,1Μ (5 + 3 ml) σε συνδυασμό με στερεό NaCl (0,2 + 0,1g) (πρωτόκολο προκατεργασίας τσιπούρας), είτε απευθείας προσθήκη των υδατικών διαλυμάτων εκχύλισης. Στις τελευταίες περιπτώσεις παρατηρήθηκε ότι οι ανακτήσεις των κινολονών, άρχισαν να αυξάνονται και μάλιστα οι καλύτερες από αυτές ήταν με το πρωτόκολλο της τσιπούρας, χωρίς να προηγείται στάδιο εκχύλισης με οργανικό διαλύτη. Οι χρωματογραφικές συνθήκες που εφαρμόστηκαν στα δείγματα ιχθυοτροφής ήταν οι ίδιες με αυτές στην περίπτωση των δειγμάτων τσιπούρας και σολομού και δίνονται στον πίνακα

233

234 Πίνακας 15.1: Δοκιμές διαφόρων εκχυλιστικών συστημάτων σε εμβολιασμένα δείγματα ιχθυοτροφής. Εκχυλιστικό μέσο Υδατικό δ/μα NaCl 1% Εξάνιο/οξικός αιθυλεστέρας Υδατικό δ/μα NaCl 1% Υδατικό δ/μα Na2CO3 1% Εξάνιο/οξικός αιθυλεστέρας Υδατικό δ/μα Na2CO3 1% Υδατικό δ/μα τρυγικού οξέος 0,1% Εξάνιο/οξικός αιθυλεστέρας Υδατικό δ/μα τρυγικού οξέος 0,1% Υδατικό δ/μα τριφθοροοξικού οξέος 0,1% Εξάνιο Υδατικό δ/μα τριφθοροοξικού οξέος 0,1% CH3CN Υδατικό δ/μα τριφθοροοξικού οξέος 0,1% Εξάνιο/CH3CN Υδατικό δ/μα τριφθοροοξικού οξέος 0,1% Ρυθμιστικό διάλυμα οξικών (ph = 4,00) Ανακτήσεις (%) CIP DAN ENR IS SAR OXO NAL FLU 8,4 5,3 7,1 6,2 4, ,4 5,9 8,0 4,6 6, ,4 36,7 52,0 62,5 47,3 56,5 42,1 12,0 12,8 34,6 25,8 43,9 30,3 5,6 15,2 7,1 21,3 30,7 15,8 23,8 16,9 4,7 8,2 5,6 15,7 10,6 24,3 31,7 38,2 10,6 25,7 8,4 50,3 38,7 32,6 71,2 35,4 40, ,8 28,9 17,2 58,4 21,4 34, ,8 35,6 27,7 90,0 38,4 72,2 15,4 21, , συνέκλουση 63,4 46,7 42, διπλή κορυφή συνέκλουση

235 Πίνακας 15.1: Συνέχεια. Εκχυλιστικό μέσο Εξάνιο Ρυθμιστικό διάλυμα οξικών (ph = 4,00) CH3CN Ρυθμιστικό διάλυμα οξικών (ph = 4,00) Εξάνιο/CH3CN Ρυθμιστικό διάλυμα οξικών (ph = 4,00) Υδατικό δ/μα H3PO4 0,2% Εξάνιο Υδατικό δ/μα H3PO4 0,2% CH3CN Υδατικό δ/μα H3PO4 0,2% Εξάνιο/CH3CN Υδατικό δ/μα H3PO4 0,2% Υδατικό δ/μα H3PO4 0,5% Εξάνιο Υδατικό δ/μα H3PO4 0,5% CH3CN Υδατικό δ/μα H3PO4 0,5% Ανακτήσεις (%) CIP IS SAR συνέκλουση 56,6 38, , ,4 38,1 75,5 20,3 58,4 37,1 72,8 19,9 67,7 40,0 70,6 15,5 36,4 16,6 65,8 16,7 51,8 36,7 DAN συνέκλουση ENR ,4 41, ,5 66, , OXO διπλή κορυφή NAL FLU συνέκλουση ,4 26,6 24, ,3 52,9 18,8 21,4 57, ,3 62, ,3 10, ,1 διπλή διπλή κορυφή κορυφή διπλή διπλή κορυφή κορυφή διπλή κορυφή 28,4 διπλή κορυφή διπλή κορυφή διπλή κορυφή 13,7 --- διπλή κορυφή ---

236 Πίνακας 15.1: Συνέχεια. Εκχυλιστικό μέσο Εξάνιο/CH3CN Υδατικό δ/μα H3PO4 0,5% Δ/μα H3PO4 0,2% σε H2O/CH3CN (70/30 %v/v) Εξάνιο Δ/μα H3PO4 0,2% σε H2O/CH3CN (70/30 %v/v) CH3CN Δ/μα H3PO4 0,2% σε H2O/CH3CN (70/30 %v/v) Εξάνιο/CH3CN Δ/μα H3PO4 0,2% σε H2O/CH3CN (70/30 %v/v) Ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών (ph = 4,68) Εξάνιο Ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών (ph = 4,68) CH3CN Ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών (ph = 4,68) Εξάνιο/CH3CN Ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών (ph = 4,68) Εξάνιο/CH3CN NaOH 0,1M + (0,2 + 0,1g NaCl) Ανακτήσεις (%) CIP DAN ENR IS 12,7 συνέκλουση 108,8 18,6 10, ,4 15,4 συνέκλουση 22,4 SAR διπλή OXO NAL FLU 41,9 συνέκλουση 13,4 20,4 συνέκλουση 54,6 42,7 31,6 συνέκλουση 40,7 32,6 12,3 συνέκλουση 48,2 16,7 76,8 48,7 55,6 88,5 50,7 85,6 56,3 71,6 38,4 83,7 48,3 72,8 24,1 18,7 48,6 41,4 30,9 81,7 50,7 68,9 20, ,4 16, ,3 51,7 26, ,3 40,8 34,9 82,7 65,5 38,6 16, κορυφή διπλή κορυφή 41,2 διπλή κορυφή διπλή κορυφή ---- διπλή κορυφή συνέκλουση συνέκλουση συνέκλουση

237 Πίνακας 15.1: Συνέχεια. Ανακτήσεις (%) Εκχυλιστικό μέσο Εξάνιο NaOH 0,1M + (0,2 + 0,1g NaCl) CH3CN NaOH 0,1M + (0,2 + 0,1g NaCl) NaOH 0,1M + (0,2 + 0,1g NaCl) CIP DAN ENR IS SAR OXO NAL FLU 67,6 58,9 37,2 89,2 28,4 61,8 25,4 27,8 63,8 76,4 20,6 102,6 36,7 80,7 52,6 10,8 92,4 95,7 91,6 96,5 89,4 97,6 94,5 90,1 Πίνακας 15.2: Βέλτιστες χρωματογραφικές συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν για το διαχωρισμό των (φθορο)κινολονών σε δείγματα ιχθυοτροφής. Στήλη: MZ-Aqua Perfect, C18, 5 μm, mm Εκλουστικό σύστημα: CF3COOH 0,1% (ph=1,00)/ch3cn/ch3oh Πίεση: bar Εσωτερικό πρότυπο (IS): υδατικό διάλυμα λαμοτρυγίνης συγκέντρωσης 20 ng/μl Θερμοκρασία στήλης: περιβάλλοντος Ανιχνευτής: παράταξης φωτοδιόδων με ανίχνευση σε μήκη κύματος 275 και 255 nm Εισαγόμενος όγκος: 20 μl

238 Στο σχήμα 15.2 δίνεται ένα τυπικό χρωματογράφημα λευκού δείγματος ιχθυοτροφής, ενώ στο σχήμα 15.3 ένα χρωματογράφημα εμβολιασμένου δείγματος ιχθυοτροφής με πρότυπο διάλυμα των εννέα ενώσεων συγκέντρωσης 5 ng/μl. Στον πίνακα 15.3 δίνονται οι χρόνοι συγκράτησης των ενώσεων στο εμβολιασμένο δείγμα ιχθυοτροφής, οι οποίοι δεν ξεπερνούν τα 23 min και στον πίνακα 15.4 η διακριτική ικανότητα του χρωματογραφικού συστήματος, η οποία κυμαινόταν από 1,1 έως 6, nm 255 nm Σχήμα 15.2: Χρωματογράφημα λευκού δείγματος ιχθυοτροφής

239 Σχήμα 15.3: Χρωματογράφημα των επτά (φθορο)κινολονών σε εμβολιασμένο δείγμα ιχθυοτροφής με μίγμα των ενώσεων συγκέντρωσης 5 μg/kg

240 Πίνακας 15.3: Χρόνοι συγκράτησης των (φθορο)κινολονών σε εμβολιασμένο δείγμα ιχθυοτροφής. Χρόνος συγκράτησης Ένωση (min) CIP 8,202 DAN 9,109 ENR 9,960 IS 12,097 SAR 13,179 OXO 15,961 NAL 20,998 FLU 22,290 Πίνακας 15.4: Διακριτική ικανότητα του συστήματος. Διακριτική ικανότητα Ζεύγη ενώσεων 15.2 (Rs) CIP-DAN 1,1 DAN-ENR 1,1 ENR-IS 2,8 IS-SAR 1,3 SAR-OXO 3,7 OXO-NAL 6,7 NAL-FLU 1,7 ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΜΕΝΗΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΟΥ (ΦΘΟΡΟ)ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΓΙΑ ΤΟΝ ΔΕΙΓΜΑ ΙΧΘΥΟΤΡΟΦΗΣ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΑΠΟΦΑΣΗ 2002/657 ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ Η επικύρωση της μεθόδου HPLC που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισμό των επτά (φθορο)κινολονών (CIP, DAN, ENR, SAR, OXO, NAL και FLU) σε ιχθυοτροφή έγινε με βάση την απόφαση 2002/657/EC, για τις τεχνικές και μεθόδους που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον προσδιορισμό καταλοίπων αντιβιοτικών

241 Έλεγχος γραμμικότητας Χάραξη καμπυλών αναφοράς μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης σε εμβολιασμένα δείγματα τροφής. Για να ελεγχθεί η γραμμικότητα, μέσω της χάραξης των καμπυλών αναφοράς σε εμβολιασμένα δείγματα ιχθυοτροφής, εμβολιάστηκαν συνολικά 8 δείγματα του 1,0000 ± 0,0001 g με πρότυπα μίγματα των επτά ενώσεων συγκέντρωσης 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 8, 10 και 12 ng/μl, στα οποία είχε προστεθεί και το εσωτερικό πρότυπο (υδατικό διάλυμα λαμοτρυγίνης) σε τελική συγκέντρωση 20 ng/μl. Το εκχύλισμα που προέκυπτε από κάθε δείγμα αναλυόταν τρεις φορές. Η ποσοτική αποτίμηση των αποτελεσμάτων έγινε με βαση το μέσο όρο του λόγου των εμβαδών της κορυφής της κάθε ένωσης προς το εμβαδό της κορυφής του εσωτερικού προτύπου στις τρεις μετρήσεις για κάθε συγκέντρωση. Οι εξισώσεις των καμπυλών αναφοράς, καθώς και ο συντελεστής γραμμικής συσχέτισης r και δίνονται στον πίνακα Πίνακας 15.5: Καμπύλες αναφοράς των ενώσεων σε εμβολιασμένα δείγματα ιχθυοτροφής μετά από SPE. Ένωση CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU όπου Στατιστική επεξεργασία y = (0,0022 ± 0,0001)x + (0,0343 ± 0,0062) r = 0,9981 y = (0,0008 ± 0,00003)x + (0,0791 ± 0,0035) r = 0,9954 y = (0,0029 ± 0,0001)x + (0,0345 ± 0,0096) r = 0,9966 y = (0,0021 ± 0,0001)x + (0,1326 ± 0,0091) r = 0,9942 y = (0,0059 ± 0,0003)x + (0,3422 ± 0,0314) r = 0,9936 y = (0,0058 ± 0,0002)x + (0,0269 ± 0,0244) r = 0,9961 y = (0,0054 ± 0,0002)x + (0,1107 ± 0,0254) r = 0,9951 y = ο μέσος όρος του λόγου του εμβαδού της κορυφής της κάθε ένωσης, προς το εμβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου x = η ποσότητα της προσδιοριζόμενης ένωσης σε μg/kg

242 Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης και γραμμικής περιοχής Μετά την εύρεση των εξισώσεων των καμπυλών αναφοράς για τις επτά ενώσεις, ακολούθησε ο προσδιορισμός των ορίων ανίχνευσης (LOD) και των ορίων ποσοτικής αποτίμησης (LOQ) με βάση τις σχέσεις LOD 3,3 sb ί και LOQ 10 sb, ί όπου sb είναι η τυπική απόκλιση των τεταγμένων επι την αρχή που προκύπτουν από τη χάραξη των καμπυλών αναφοράς και κλίση είναι η κλίση των ευθειών των καμπυλών αυτών, τα οποία δίνονται στον πίνακα Στη περίπτωση της ιχθυοτροφής δεν ορίζονται ανώτατα όρια καταλοίπων από την Ευρωπαϊκή Ένωση. Από τα αποτελέσματα που δίνονται στον πίνακα 15.6, φαίνεται ότι τα όρια ποσοτικής αποτίμησης που επιτεύχθηκαν με την αναπτυσσόμενη μέθοδο στα δείγματα ιχθυοτροφής είναι αρκετά χαμηλά. Πίνακας 15.6: Όρια ανίχνευσης και ποσοτικής αποτίμησης της μεθόδου για τον προσδιορισμό των εννέα ενώσεων σε εμβολιασμένα δείγματα ιχθυοτροφής. Ανώτερο όριο γραμμικής LOD LOQ (μg/kg) (μg/kg) CIP 9,3 27,9 200 DAN 14,4 43,2 200 ENR 10,9 32,7 200 SAR 14,3 42,9 200 OXO 17,6 52,8 200 NAL 13,9 41,7 200 FLU 15,5 46,5 200 Ένωση περιοχής (μg/kg) Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου σε δείγματα ιχθυοτροφής. Σύμφωνα με την οδηγία 2002/657/EC ο προσδιορισμός της ακρίβειας και της πιστότητας γίνεται μέσω του υπολογισμού των ανακτήσεων από μετρήσεις σε εμβολιασμένα δείγματα. Η πιστότητα ελέγχθηκε με επαναλαμβανόμενες δοκιμές, τόσο κατά τη διάρκεια της ίδιας ημέρας, όσο και κατά τη διάρκεια πολλών ημερών

243 Ακρίβεια και επαναληψιμότητα (intra-day repeatability) Η επαναληψιμότητα ελέγχεται με τη λήψη μιας σειράς πολλαπλών μετρήσεων σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις. Στην περίπτωση της ιχθυοτροφής, αφού δεν υπάρχουν θεσπισμένες τιμές MRL για τα συγκεκριμένα αντιβιοτικά από την Ευρωπαϊκή Ένωση, επιλέχθησαν οι συγκεντρώσεις των 2, 5 και 10 ng/μl. Έτσι πραγματοποιήθησαν κατά τη διάρκεια της ίδιας ημέρας έξι διαφορετικές μετρήσεις από τα εκχυλισμένα πρότυπα μίγματα των επτά ενώσεων. Στον πίνακα 15.7 δίνονται η μέση ευρεθείσα συγκέντρωση σε κάθε δείγμα, η τυπική απόκλιση (SD) της μέτρησης, η σχετική τυπική απόκλιση (RSD), καθώς και η (%) ανάκτηση της κάθε ένωσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιχθυοτροφής με μίγματα των ενώσεων σε συγκεντρώσεις των 2, 5 και 10 ng/μl για 6 μετρήσεις, κατά τη διάρκεια της ίδιας ημέρας. Όπως φαίνεται και στον πίνακα 15.7, τόσο η επαναληψιμότητα, όσο και η ακρίβεια της μεθόδου κατά την εφαρμογή της σε δείγματα ιχθυοτροφής ήταν πολύ καλές. Η σχετική τυπική απόκλιση RSD, η οποία εκφράζει την επαναληψιμότητα των μετρήσεων, δεν ξεπερνάει για καμία ένωση το 8,9%, ενώ οι ανακτήσεις της μεθόδου κυμαίνονται από 93,1 έως 101,3%. Πίνακας 15.7: Ακρίβεια και επαναληψιμότητα της μεθόδου σε εμβολιασμένα δείγματα ιχθυοτροφής με μίγματα των επτά ενώσεων σε συγκεντρώσεις των 2, 5 και 10 ng/μl της κάθε ένωσης (n = 6). Ένωση CIP DAN ENR Ποσότητα που Ποσότητα που προστέθηκε βρέθηκε ± SD (μg/kg) (μg/kg) 40 RSD Ανάκτηση (%) (%) 37,2 ± 1,7 4,5 93, ,1 ± 1,7 1,7 99, ,0 ± 3,9 2,0 99, ,7 ± 1,9 4,9 96, ,9 ± 3,0 3,2 95, ,7 ± 6,0 3,0 101, ,5 ± 2,0 5,2 96, ,2 ± 1,4 1,4 98, ,4 ± 2,5 1,3 97,

244 Πίνακας 15.7: Συνέχεια. Ένωση SAR OXO NAL FLU Ποσότητα που Ποσότητα που προστέθηκε βρέθηκε ± SD (μg/kg) (μg/kg) 40 RSD Ανάκτηση (%) (%) 39,1± 3,5 8,9 97, ,0 ± 3,3 3,3 99, ,5 ± 2,2 1,1 100, ,2 ± 2,3 6,0 95, ,6 ± 2,5 2,6 96, ,5 ± 4,3 2,1 101, ,3 ± 0,9 2,1 100, ,8 ± 1,5 1,6 95, ,0 ± 1,7 0,8 99, ,4 ± 1,2 3,1 98, ,6 ± 0,8 0,9 97, ,3 ± 1,7 0,9 98, Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου στα δείγματα ιχθυοτροφής Η ακρίβεια και η πιστότητα της μεθόδου ελέγχεται με τη λήψη μιας σειράς πολλαπλών μετρήσεων σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις των 2, 5 και 10 ng/μl της κάθε ένωσης, κατά τη διάρκεια 6 ημερών. Στον πίνακα 15.8 δίνονται η μέση ευρεθείσα συγκέντρωση σε κάθε δείγμα, η τυπική απόκλιση (SD) της μέτρησης, η σχετική τυπική απόκλιση (RSD), καθώς και η (%) ανάκτηση της κάθε ένωσης σε εμβολιασμένα δείγματα ιχθυοτροφής με μίγματα των επτά ενώσεων σε συγκεντρώσεις των 2, 5 και 10 ng/μl για 3 μετρήσεις, κατά τη διάρκεια 6 ημερών. Όπως φαίνεται και από τα αποτελέσματα που δίνονται στον πίνακα 15.8, τόσο η ακρίβεια, όσο και η πιστότητα της μεθόδου, κατά την εφαρμογή της σε δείγματα ιχθυοτροφής, κατά τη διάρκεια 6 ημερών, ήταν πολύ καλές. Η σχετική τυπική απόκλιση RSD δεν ξεπερνάει για καμία (φθορο)κινολόνη το 8,6%, ενώ οι ανακτήσεις της μεθόδου κυμαίνονται από 95,3 έως 101,4%

245 Πίνακας 15.8: Ακρίβεια και πιστότητα της μεθόδου κατά τη διάρκεια 6 ημερών σε εμβολιασμένα δείγματα ιχθυοτροφής με μίγματα των επτά ενώσεων μετά από SPE. Ένωση CIP DAN ENR SAR OXO NAL FLU Ποσότητα που Ποσότητα που προστέθηκε βρέθηκε ± SD (μg/kg) (μg/kg) 40 RSD Ανάκτηση (%) (%) 38,1 ± 1,7 4,5 95, ,3 ± 1,4 1,5 98, ,1 ± 3,8 1,9 97, ,4 ± 3,3 8,6 96, ,0 ± 4,0 4,1 97, ,8 ± 6,1 3,0 101, ,3 ± 1,9 4,9 95, ,8 ± 1,6 1,6 98, ,5 ± 3,8 1,9 98, ,8 ± 3,0 7,5 99, ,1 ± 3,1 3,2 98, ,9 ± 1,9 0,9 100, ,6 ± 2,0 5,1 96, ,8 ± 2,6 2,7 97, ,3 ± 2,5 1,2 101, ,0 ± 0,9 2,3 100, ,0 ± 2,5 2,5 98, ,4 ± 1,6 0,8 99, ,9 ± 1,3 3,2 99, ,3 ± 1,3 1,3 98, ,5 ± 1,8 0,9 98,

246 15.3 ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΚΙΝΟΛΟΝΩΝ ΣΕ ΖΩΝΤΑΝΕΣ ΤΣΙΠΟΥΡΕΣ Μετά την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των κινολονών σε δείγματα ιχθυοτροφής, ακολούθησε εφαρμογή του πρωτοκόλου ανάλυσης κινολονών σε ζωντανές τσιπούρες. Τα ψάρια που χρειάσθηκαν για το διερευνητικό αυτό πειραματισμό προέρχονταν από ιχθυογεννητικό σταθμό της εταιρείας Χορόζογλου Α.Ε., στην περιοχή Βουρβουρού της Χαλκιδικής, όπως φαίνεται και στο σχήμα Οι τσιπούρες, σύμφωνα με δήλωση του ιχθυοτροφείου, από όπου έγινε η παραλαβή τους, προέρχονταν από μονάδα απαλλαγμένη από ασθένειες και με τη διαβεβαίωση, ότι δεν έχει εφαρμοστεί φαρμακευτική αγωγή με αντιμικροβιακές ή αντιπαρασιτικές ουσίες, τουλάχιστον κατά τους τελευταίους δύο μήνες. Σχήμα 15.4: Ιχθυογεννητικός σταθμός της εταιρείας Χορόζογλου Α.Ε. Από εκεί μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο Ζωολογίας, του Τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης μέσα σε πλαστικά βαρέλια με συνεχή παροχή οξυγόνου, όπως φαίνεται και στο σχήμα

247 Σχήμα 15.5: Πλαστικά βαρέλια με συνεχή παροχή οξυγόνου για τη μεταφορά των τσιπούρων από τη Χαλικιδική στο Α.Π.Θ. Εκεί αφέθηκαν σε δύο δεξαμενές, χωρητικότητας 500 L η καθεμία, για να εγκλιματιστούν για χρονικό διάστημα 10 ημερών μέχρι την έναρξη της πειραματικής διαδικασίας, όπως φαίνονται και στο σχήμα Το νερό στα ενυδρεία περνούσε συνεχώς από φίλτρα με συνεχή ανακύκλωση, ενώ υπήρχε διαρκής παροχή οξυγόνου με αντλίες αέρα. Τα πρωτεϊνικά απορρίμματα και τα υποπροϊόντα μεταβολισμού των ψαριών απομακρύνονταν από τα ενυδρεία με κατάλληλες συσκευές. Η θερμοκρασία των δεξαμενών διατηρήθηκε σταθερή στους 18 οc. Επίσης στα ενυδρεία ελέγχονταν σε καθημερινή βάση ορισμένοι φυσικοχημικοί παράγοντες, όπως η αλατότητα, η συγκέντρωση της αμμωνίας, των νιτρικών αλάτων και του διαλυμένου οξυγόνου, προκειμένου να εξασφαλιστούν, όσο γίνεται, σταθερότερες συνθήκες για την επιβίωση των ιχθύων. Σχήμα 15.6: Ενυδρεία πειραματικής διαδικασίας