ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΝΖΥΜΩΝ ΚΑΙ ΠΟΛΥ(ΥΔΡΟΞΥ ΑΛΚΑΝΟΪΚΩΝ) ΕΣΤΕΡΩΝ (ΡΗΑs) ΑΠΟ ΘΕΡΜΟΦΙΛΟΥΣ ΚΑΙ ΜΕΣΟΦΙΛΟΥΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΤΟΜΕΑΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ, ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ ΚΑΙ ΕΓΚΑΤΑΣΤΑΣΕΩΝ ΕΙΡΗΝΗ-ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ Δ. ΚΡΕΤΖΑ Διπλωματούχος Χημικός Μηχανικός ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΝΖΥΜΩΝ ΚΑΙ ΠΟΛΥ(ΥΔΡΟΞΥ ΑΛΚΑΝΟΪΚΩΝ) ΕΣΤΕΡΩΝ (ΡΗΑs) ΑΠΟ ΘΕΡΜΟΦΙΛΟΥΣ ΚΑΙ ΜΕΣΟΦΙΛΟΥΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΤΟΜΕΑΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ, ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ ΚΑΙ ΕΓΚΑΤΑΣΤΑΣΕΩΝ ΕΙΡΗΝΗ-ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ Δ. ΚΡΕΤΖΑ Διπλωματούχος Χημικός Μηχανικός ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΝΖΥΜΩΝ ΚΑΙ ΠΟΛΥ(ΥΔΡΟΞΥ ΑΛΚΑΝΟΪΚΩΝ) ΕΣΤΕΡΩΝ (ΡΗΑs) ΑΠΟ ΘΕΡΜΟΦΙΛΟΥΣ ΚΑΙ ΜΕΣΟΦΙΛΟΥΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης Εξεταστική Επιτροπή: Καθηγητής Κ. Κυπαρισσίδης, Επιβλέπων Καθηγητής Σ Αναστασιάδης, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Μ. Λιακοπούλου-Κυριακίδη, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Δ. Κυριακίδης, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Μ. Στουκίδης, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Επίκουρος Καθηγητής Δ. Αχιλιάς, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Λέκτορας Χ. Χατζηδούκας, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής.

3 Ειρήνη-Αικατερίνη Δ. Κρέτζα Α.Π.Θ. «Η έγκριση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2).

4 \ Στους γονείς μου και στον αδελφό μου

5 Έκθεση Πρωτοτυπίας Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής αντιμετωπίστηκαν θέματα που σχετίζονται με τη παραγωγή και καθαρισμό του θερμόφιλου ενζύμου, λιπάσης, καθώς και τη μικροβιακή παραγωγή μεσαίου μήκους πολύ(3-υδροξυαλκανοϊκών) εστέρων (mcl- ΡΗΑs) χρησιμοποιώντας τους μικροοργανισμούς Thermus thermophilus HB8 και Pseudomonas putida KT2442, αντίστοιχα. Η ενδελεχής ανασκόπηση της τρέχουσας βιβλιογραφίας καθόρισε τα σημεία καινοτομίας της παρούσης διατριβής που στόχευσαν στην κάλυψη των ερευνητικών κενών. Συνοψίζοντας, τα σημεία αυτά είναι: Μελέτη των παραμέτρων, όπως είναι ο αερισμός και η πηγή άνθρακα, που βοηθάνε στην αύξηση της παραγωγής της λιπάσης από το συγκεκριμένο βακτηριακό στέλεχος, Thermus thermophilus HB8 Καθαρισμός της εξωκυττάριας λιπάσης από το συγκεκριμένο βακτηριακό στέλεχος Thermus thermophilus HB8 για την μελέτη των φυσικοχημικών ιδιοτήτων του, βέλτιστες τιμές ph και θερμοκρασίας, θερμοανθεκτικότητα και εξειδίκευση υποστρώματος. Καθήλωση της ευρέως χρησιμοποιούμενης εμπορικής λιπάσης, Candida antarctica, σε διαφορετικούς φορείς για αύξηση της δραστικότητα της και πολλαπλές εφαρμογές. Μελέτη σημαντικών παραμέτρων στην επιρροή των ποσοτικών και ποιοτικών χαρακτηριστικών του συστήματος παραγωγής mcl-ρηαs από το βακτήριο Pseudomonas putida KT2442. Η επίδραση των πηγών άνθρακα και μαγνησίου επηρεάζουν το σχηματισμό του πολυμερούς και κατ επέκταση το μέσο μοριακό βάρος πολυμερούς. Με βάση τα παραπάνω πρωτότυπα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προέκυψαν οι παρακάτω δημοσιεύσεις σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά: E. Kretza, C. P. Papaneophytou, R. M. Papi, K. Karidi, C. Kiparissidis, D. A. Kyriakkidis, Optimization of lipase production from Thermus thermophilus HB8:

6 Purification and characterization of the extracellular enzyme (υποβλήθηκε στο Applied Biochemistry and Biotechnology). G. Penloglou, E. Kretza, C. Chatzidoukas, S. Parouti and C. Kiparissides: Molecular Weight Distribution Control of the Microbially Produced Polyhydroxybutyrate in Azohydromonas lata (υποβλήθηκε στο Biotechnology and Bioengineering). E. Kretza, C. Chatzidoukas, S. Parouti and C. Kiparissides Experimental investigation of the optimal production of mcl-phas in Pseudomonas putida strain KT2442 (είναι να υποβληθεί στο Biotechnology and Bioengineering). Σε Πρακτικά Επιστημονικών Συνεδρίων: Ε. Κρέτζα, Γ. Πενλόγλου, Χ. Χατζηδούκας, Κ. Κυπαρισσίδης: Μικροβιακή παραγωγή μικρής και μεσαίας ανθρακικής αλυσίδας πολυ-(υδροξυ αλκανοϊκών) εστέρων από τα βακτήρια Alcaligenes latus και Pseudomonas putida, 8 ο Πανελλήνιο Επιστημονικό Συνέδριο Χημικής Μηχανικής (ΠΕΣΧΜ8) Μαΐου 2011 Θεσσαλονίκη, Ελλάδα. Kretza E., Chatzidoukas C. and Kiparissides C.: Effect of different nutrients on the production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) in Pseudomonas putida KT2442 bacterial strain 1 st International Conference on Advances in Biotechnology Industrial Microbial Biotechnology (ABIMB 2010), 3-5 November 2010, Thessaloniki, Greece. G. Penloglou, E. Kretza, C. Chatzidoukas, S. Parouti and C. Kiparissides: Production of short- and medium- chain-length polyhydroxyalkanoates by bacterial cultures: Experimental investigation and process optimization, 6 th International Conference on Modification, Degradation and Stabilization of Polymers (MoDeST 2010), 5-9 September 2010, Athens, Greece. G. Penloglou, E. Kretza, C. Chatzidoukas, S. Parouti and C. Kiparissides: Microbial production of PHB with high polymer content: the key roles of oxygen and nitrogen (Poster), First International Meeting on Material/Bioproduct Interactions (MATBIM 2010), 3-5 March 2010, AfroParis Tech, Paris, France. Chatzidoukas C., Karidi K., Kretza E., Mantourlias T., Parouti S., Penloglou G., Rousos A., Seretis A. and Kiparissides C.: Sustainable microbial and biocatalytic production of advanced functional materials (Poster), Symposium on New Frontiers in Chemical & Biochemical Engineering, November 2009, Thessaloniki, Greece.

7 Ευχαριστίες Η διατριβή αυτή εκπονήθηκε στο Τμήμα Χημικών Μηχανικών του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.) υπό την επίβλεψη και καθοδήγηση του Καθηγητή του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Α.Π.Θ., κ. Κ. Κυπαρισσίδη τον οποίο ευχαριστήσω θερμά για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε με την ανάθεση μιας τόσο ενδιαφέρουσας εργασίας και τη δυνατότητα να ασχοληθώ με την έρευνα σε αυτήν την επιστημονική περιοχή. Πολύ σημαντική ήταν και η βοήθεια της Καθηγήτριας του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Α.Π.Θ., κ. Μ. Λιακοπούλου-Κυριακίδου και του Καθηγητή του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Κρήτης, κ. Σ. Αναστασιάδης, μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής. Οφείλω να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στον Καθηγητή του Τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ., κ. Δ. Κυριακίδη, για την ευγενική του φιλοξενία στο Εργαστήριο Βιοχημείας και για την καθοδήγησή του στα πειράματα παραγωγής και καθαρισμό της λιπάσης. Ευχαριστήσω, επίσης, το Λέκτορα του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Α.Π.Θ., κ. Χρήστο Χατζηδούκα για την πολύτιμη συνεργασία και καθοδήγησή του για τη διεξαγωγή της διατριβής μου. Επίσης επιθυμώ να ευχαριστήσω και τα άλλα μέλη της εξεταστικής επιτροπής, τον Καθηγητή του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Α.Π.Θ., Μ. Στουκίδη και τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ., κ. Δ. Αχιλιά, για την εποικοδομητική κριτική της παρούσας εργασίας. Ακόμα θα ήθελα να ευχαριστήσω τη διδάκτορα Κωνσταντίνα Καρύδη για την πολύτιμη βοήθεια της στα πρώτα χρόνια της διατριβής και τη διδάκτορα Σοφία Παρούτη για τη βοήθεια των προσδιορισμών των ιδιοτήτων των παραγόμενων πολυμερών. Ευχαριστώ επίσης τους υπόλοιπούς συνεργάτες του Εργαστηρίου Μηχανικής Αντιδράσεων Πολυμερών του ΕΚΕΤΑ, όπου διεξήχθη η διατριβή μου, που ο καθένας με το μοναδικό του τρόπο συνέβαλλαν στην περάτωση αυτής της εργασίας σε ένα ευχάριστο περιβάλλον

8 και ιδιαίτερα τη Βίβιαν Καρακώστα για την ηθική υποστήριξη της και τις ευχάριστες αναμνήσεις όλα αυτά τα χρόνια. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τα μέλη του Εργαστηρίου Βιοχημείας για το φιλικό περιβάλλον και ιδιαίτερα τους διδάκτορες Ρηγίνη Παπή και Χρίστο Παπανεοφύτου για τη συνεργασία τους και τη πολύτιμη βοήθεια τους. Τέλος, δε θα μπορούσα να παραλείψω την οικογένεια στην οποία χρωστάω το μεγαλύτερο και ουσιαστικότερο ευχαριστώ. Τη μητέρα μου Ελένη και τον πατέρα μου Δημήτριο για τη στήριξη και συμπαράσταση τους καθόλη τη διάρκεια των σπουδών μου, καθώς και τον αδελφό μου Ευστράτιο για την ηθική του υποστήριξη.

9 Περίληψη28/6/2011 Περίληψη Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιείται πειραματική μελέτη για τη μικροβιακή παραγωγή ενζύμων (βιοκαταλύτες) και βιοπολυμερών. Το ένζυμο που μελετάται είναι η λιπάση, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο ένζυμο στη βιομηχανία. Για την παραγωγή της λιπάσης χρησιμοποιήθηκε το θερμόφιλο βακτήριο Thermus thermophilus HB8. Το βακτήριο αυτό επιλέχθηκε λόγω των παραγόμενων θερμοάντοχων πρωτεϊνών και ενζύμων, μια πολύ χρήσιμη ιδιότητα για τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία. Με σκοπό την εύρεση διαφορετικών παραμέτρων που βοηθάνε στην αύξηση της παραγωγής της λιπάσης μελετήθηκαν ο αερισμός και η προσθήκη στο μέσο ανάπτυξης δυο πηγών άνθρακα (σουκρόζης και ελαιόλαδο). Η επίδραση του αερισμού μελετήθηκε σε κωνική φιάλη, με διαφορετικούς όγκους του μέσου ανάπτυξης. Η φιάλη με το μικρότερο όγκο μέσου ανάπτυξης, όπου είχε και τις καλύτερες συνθήκες αερισμού, απέδωσε τη μεγαλύτερη βιομάζα και τη μεγαλύτερη παραγωγή ενδο-και εξω-κυττάριας λιπάσης. Για τη μελέτη της επίδρασης της πηγής άνθρακα, στο μέσο ανάπτυξης προστέθηκε ελαιόλαδο, σουκρόζη και συνδυασμός τους, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Η προσθήκη του ελαιολάδου, ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση του, αύξησε την παραγωγή της βιομάζας και της εξωκυττάριας λιπάσης, μειώνοντας όμως την παραγωγή της ενδοκυττάριας λιπάσης. Αντίθετα, η προσθήκη της σουκρόζης δεν επηρέασε ιδιαίτερα την παραγωγή της βιομάζας και της εξωκυττάριας λιπάσης, αύξησε όμως την παραχθείσα ενδοκυττάρια λιπάση. Ο συνδυασμός των δυο πηγών, ελαιόλαδο και σουκρόζη, είχε το καλύτερο αποτέλεσμα από όλες τις περιπτώσεις που μελετήθηκαν, καθώς αυξήθηκε η παραγωγή της βιομάζας και της ενδο-και εξω-κυττάριας λιπάσης. Για το χαρακτηρισμός της εξωκυττάριας λιπάσης, που παράγεται από το βακτήριο Thermus thermophilus HB8, πραγματοποιήθηκε καθαρισμός της. Τα στάδια καθαρισμού που ακολουθήθηκαν ήταν καθίζηση των πρωτεϊνών, με θειικό αμμώνιο και με αιθανόλη

10 Περίληψη ii και στη συνέχεια με στήλη υδρόφοβής χρωματογραφίας βουτυλ-σεφαρόζης. Το ένζυμο μετά το τελικό στάδιο καθαρισμού ήταν αρκετά καθαρό και δραστικό. Η εξωκυττάρια λιπάση που παράγεται από το βακτήριο έχει μοριακό βάρος 56 kda και υψηλή εξειδίκευση σε εστέρες μεγάλου μήκους αλυσίδας. Επίσης, είναι σταθερή σε ουδέτερο και αλκαλικό περιβάλλον, καθώς και σε αρκετά υψηλές θερμοκρασίες. Ακόμα, η δραστικότητά της μπορεί να ενισχυθεί με την παρουσία ορισμένων μετάλλων. Με σκοπό να αυξηθεί η δραστικότητα της εμπορικής λιπάσης Candida antarctica με τη μέθοδο της καθήλωσης, μελετήθηκε η καθήλωση του ενζύμου σε τέσσερις διαφορετικούς φορείς με διαφορετικές τεχνικές. Αρχικά το ένζυμο καθηλώθηκε με φυσική προσρόφηση σε σωματίδια χιτοζάνης, στη συνέχεια με ομοιοπολικό δεσμό σε σωματίδια Eupergit C, και τέλος με εγκλεισμό σε αλγινικού και αλγινικού πολυβινυλικής αλκοόλης σωματίδια. Η καθήλωση της λιπάσης στα σωματίδια της χιτοζάνης είχε ως αποτέλεσμα να μειώσει τη δραστικότητα του ενζύμου, σε αντίθεση με την περίπτωση του εγκλεισμού της σε σωματίδια αλγινικού, όπου αυξήθηκε η δραστικότητά της σε σχέση με αυτή του ελεύθερου ενζύμου. Στην περίπτωση των άλλων δυο φορέων καθήλωσης, η δραστικότητα του ενζύμου δεν μεταβλήθηκε ιδιαίτερα. Στο δεύτερο μέρος, εξετάστηκε η επίδραση των θρεπτικών συστατικών (άνθρακας, άζωτο, φώσφορος και μαγνήσιο) στην παραγωγή του μεσαίου μήκους αλυσίδας πολύυδροξυαλκανοϊκού εστέρα (mcl-pha) από το βακτήριο Pseudomonas putida KT2442, σε επίπεδο κωνικής φιάλης και σε επίπεδο εργαστηριακού βιοαντιδραστήρα. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση δυο πηγών άνθρακα (οκτανοϊκό οξύ, γλυκόζη και συνδυασμός τους) στη μικροβιακή παραγωγή του ΡΗΑ. Χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα μόνο οκτανοϊκό οξύ, το ποσοστό του συσσωρευμένου πολυμερούς ήταν αρκετά υψηλό (50% wt) ενώ στην περίπτωση που χρησιμοποιήθηκε μόνο γλυκόζη, ως πηγή άνθρακα, η συσσώρευση του ΡΗΑ μειώθηκε στο 10% του συνολικού βάρους των κυττάρων. Η παραγόμενη βιομάζα και στις δυο περιπτώσεις ήταν ίδια. Όταν όμως χρησιμοποιήθηκαν και οι δυο πηγές άνθρακα, η τελική βιομάζα σχεδόν διπλασιάστηκε, ενώ η συσσώρευση του ΡΗΑ ήταν επίσης υψηλή (55% wt). Μελετώντας την επίδραση διαφορετικών αρχικών συγκεντρώσεων της πηγής αζώτου στη διεργασία παραγωγής του ΡΗΑ διαπιστώθηκε ότι η αρχική συγκέντρωση του αζώτου στο μέσο ανάπτυξης δεν επηρεάζει την παραγωγή του ΡΗΑ. Ωστόσο, συνθήκες έλλειψης του παρεμποδίζουν την ανάπτυξη του βακτηρίου. Οπότε, για την αύξηση της παραγωγής του ΡΗΑ, αυξάνοντας τη βιομάζα, εξετάστηκε ο τρόπος τροφοδοσίας των πηγών άνθρακα

11 Περίληψη iii και αζώτου. Από αυτή τη μελέτη διαπιστώθηκε ότι, μεγάλες μεταβολές της συγκέντρωσης της πηγής αζώτου, κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, αλλάζει το μεταβολικό μονοπάτι από παραγωγή ΡΗΑ σε παραγωγή βιομάζας. Ωστόσο, με συνεχή προσθήκη άνθρακα και αζώτου η παραγωγή του ΡΗΑ αυξήθηκε λόγω της αύξησης της παραγόμενης βιομάζας. Με σκοπό την αύξηση του συσσωρευμένου ΡΗΑ στο κύτταρο του βακτηρίου, μελετήθηκε η έλλειψη του φώσφορου κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, μειώνοντας την αρχική συγκέντρωση των φωσφορικών αλάτων. Από αυτή τη μελέτη, διαπιστώθηκε, ότι η έλλειψη του φωσφόρου δεν ενισχύει τη συσσώρευση του ΡΗΑ άλλα δρα παρεμποδιστικά στην περαιτέρω ανάπτυξη του βακτηρίου. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι η κατανάλωση του φωσφόρου από το βακτήριο σχετίζεται με την αρχική του συγκέντρωση στο μέσο ανάπτυξης. Τέλος, ερευνήθηκε η επίδραση του μαγνησίου στη βακτηριακή παραγωγή του ΡΗΑ. Από τη μελέτη αυτή, διαπιστώθηκε ότι, μια μεγάλη μεταβολή της συγκέντρωσης του μαγνησίου στο μέσο ανάπτυξης κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας οδηγεί στον τερματισμό της ανάπτυξης του βακτηρίου ή στη μείωση του συσσωρευμένου ΡΗΑ στα κύτταρα του βακτηρίου. Μελετώντας την επίδραση των διαφόρων θρεπτικών συστατικών στην παραγωγή του ΡΗΑ, παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση της πηγής άνθρακα και μαγνησίου στο μέσο ανάπτυξης, κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, επηρεάζει την εξέλιξη του μοριακού βάρους του παραγόμενου πολυμερούς.

12 Abstract Abstract In the present study, it was examined the microbial production of enzymes (biocatalysts) and biopolymers. The enzyme, which was studded, is lipase, a widely-used enzyme in the industry. For the production of lipase the microorganism, which was used, is the thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB8. This bacterium was selected since it can produce thermostable proteins and enzymes, a very useful property for enzymes used in industry. In order to investigate parameters that can increase the production of lipase, it was examined the influence of the aeration and the addition of carbon source in the growth medium. The effect of the aeration was studied in Erlenmeyer flask loaded with different volumes of a basal reach growth medium. The flask loaded with the smallest volume, which had the bigger oxygen concentration, attributed the highest biomass and the highest intra-and extra-cellular lipase. For the examination of the effect of the carbon source, in the growth medium was added olive oil in different concentrations, sucrose and a combination of sucrose and olive oil. The oil, regardless of its initial concentration, increased the production of the biomass and the extracellular lipase, but it reduced the production of intracellular lipase. In contrast, sucrose, did not influence the production of the biomass and the extracellular lipase, but increased significantly the produced intracellular lipase. The combination of the two carbon sources, oil and sucrose gave the best results of all studied cases since it managed to increase the production of the biomass and both intra-and extra-cellular lipase. In order to characterize the biochemical properties of the extracellular lipase, produced by the bacterium Thermus thermophilus HB8, it was first purified. The lipase was purified by using two precipitation steps with ammonium sulphate and ethanol and with hydrophobic chromatography. The enzyme after the final purification step was quite clean and active. The molecular weight of the produced extracellular lipase is 56 kda and it has a high specificity to long chain esters. Moreover, the purified lipase is stable under neutral

13 Abstract v and alkaline environment and at high temperatures. Also, its activity can be enhanced in the presence of certain metals. In the present study, it was also studied the immobilization of the commercial lipase from the microorganism Candida antarctica on four different supports, in order to increase its activity. The enzyme was immobilized with physical adsorption on chitosan particles, with covalent bond on Eupergit C beads, and it was encapsulated in alginates and alginate - polyvinyl alcohol particles. The immobilization of lipase on the chitosan particles resulted in a reduction of the enzyme activity, in contrast to the case of the encapsulation of lipase in the alginate particles where the enzyme activity was increased. In the other two cases of immobilization, the activity of the enzyme was slightly increased. In the second part of this study, it was examined the effect of different nutrients (carbon, nitrogen, phosphorus and magnesium) in the production of medium chain length poly- (3-hydroxyalkanoates) (mcl-pha) from the bacterium Pseudomonas putida KT2442, in Erlenmeyer flask and at a laboratory bioreactor level. Initially, it was studded the effect of two carbon sources (octanoic acid, glucose and their combination) in the microbial production of PHA. Using the octanoic acid as the only carbon source, the polymer content was quite high (50% wt), in contrast to when glucose was used as the only carbon source where the PHA content was only 10% wt. The produced biomass in both cases was almost the same. Nevertheless, when both carbon sources were used for the PHA production, the final biomass was almost doubled, while the accumulation of PHA was also high (55% wt). In addition, it was studied the effect of the different initial nitrogen source concentrations on the PHA production. The experimental results showed that the initial concentration of nitrogen in the growth medium does not affect the production of PHA. For the increase of the PHA production, by increasing the produced biomass, it was examined the feeding rate of the carbon and nitrogen sources. From this study, it was found that a sharp increase of the nitrogen source concentration during the cultivation changes the metabolic pathway from producing PHA to biomass production. However, with continuous addition of carbon and nitrogen sources it was managed to increase the production of PHA due to an increase of the produced biomass. In order to increase the PHA content, it was investigated the phosphorus limitation effect during the cultivation, by reducing the initial phosphorus concentration in the culture medium. However, it was found that phosphorus deficiency does not enhance the PHA

14 Abstract vi accumulation but it acts as an inhibitor for further growth of the biomass. Also it was observed that phosphorus consumption is associated with its initial concentration in the growth medium. Finally, it was examined, the effect of the magnesium in the bacterial production of PHA. From this study it was found that an increase in the concentration of magnesium in the growth medium during cultivation leads to the termination of the bacterium growth or to a reduction of the accumulated PHA in the cells. Studying the effect of various nutrients in the production of PHA it was also observed that the concentration of carbon and magnesium in the growth medium, during the culture affects the development of the polymer molecular weight.

15 Πίνακας Περιεχομένων Πίνακας Περιεχομένων Περίληψη i Abstract iv Πίνακας Περιεχομένων vii Κατάλογος Πινάκων xvii Κατάλογος Σχημάτων xix Κεφάλαιο 1 Καλλιέργειες Βακτηρίων 1.1 Ανάπτυξη μικροοργανισμών Βακτήρια Κατάταξη μικροοργανισμών ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης τους Τρόποι ανάπτυξης μικροοργανισμών Μικροβιακά μέσα ανάπτυξης Συνθετικά μέσα ανάπτυξης Ημισυνθετικά μέσα ανάπτυξης Σύνθετα μέσα ανάπτυξης Διατροφικά στοιχεία Πηγές άνθρακα Πηγές αζώτου Άλλα υποστρώματα Ιχνοστοιχεία Αερισμός Βιοαντιδραστήρες

16 Πίνακας Περιεχομένων viii Είδη βιοαντιδραστήρων Βασικός σχεδιασμός βιοαντιδραστήρων Τρόποι αποστείρωσης Θερμότητα Ακτινοβολίες Διήθηση Σκοπός Διατριβής Δομή Διατριβής Βιβλιογραφία 1 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 2 Παράγωγη ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 2.1 Εισαγωγή Ένζυμα Ένζυμα που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία Θερμόφιλα ένζυμα Βιομηχανικές εφαρμογές θερμοάντοχων ενζύμων Λιπασές Ιστορία της λιπάσης Βακτηριακές πηγές λιπάσης Κυτταρική τοποθεσία λιπασών Κινητική της λιπάσης Δομή λιπάσης Παραγωγή λιπάσης και παράγοντες που την επηρεάζουν Επίδραση πηγής άνθρακα Επίδραση πηγής αζώτου Επίδραση μεταλλικών ιόντων

17 Πίνακας Περιεχομένων ix Επίδραση άλλων παραγόντων Εφαρμογές της λιπάσης Λιπάσες στη βιομηχανία λιπών και ελαιοχημικών προϊόντων Παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών Λιπάσες στη βιομηχανία κλωστοϋφαντουργίας Λιπάσες στη βιομηχανία απορρυπαντικών Λιπάσες στη βιομηχανία τροφίμων Λιπάσες στη βιομηχανία χαρτιού και πολτοποίησης Λιπάσες στην οργανική σύνθεση Λιπάσες στη γαλακτοβιομηχανία Λιπάσες στη βιομηχανία φαρμάκων Πειραματική διαδικασία Υλικά Βακτηριακό στέλεχος Θρεπτικά υποστρώματα και συνθήκες ανάπτυξης του βακτηρίου Thermus thermophilus Aνάπτυξης του βακτηρίου T. thermophilus Μελέτη επίδρασης του Ο 2 στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus και στην ενδο- / εξω-κυττάρια δραστικότητα της λιπάσης Μελέτη επίδρασης των διαφορετικών πηγών άνθρακα στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus και στην ενδο-/εξω-κυττάριας δραστικότητα της λιπάσης Παρακολούθηση ανάπτυξης βακτηρίου Υπολογισμός ξηρού βάρους κυττάρων Επεξεργασία δειγμάτων για προσδιορισμό δραστικότητας Προσδιορισμός δραστικότητας λιπάσης

18 Πίνακας Περιεχομένων x 2.7 Αποτελέσματα Σχολιασμός Μελέτη ανάπτυξης του βακτηρίου T. thermophilus και της ενδο- / εξω-κυττάριας δραστικότητας της λιπάσης Επίδρασης Ο 2 στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus και στην ενδο- / εξω-κυττάρια δραστικότητα της λιπάσης Παραγωγή λιπάσης με διαφορετικές πηγές άνθρακα στο μέσο ανάπτυξης Συμπεράσματα Βιβλιογραφία 2 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 3 Καθαρισμός Ενζύμων 3.1 Μέθοδοι ανάκτησης ενζύμων Κάθετη επεξεργασία (Downstream processing) Λύση των κυττάρων Μέθοδοι καθαρισμού ενζύμων Φυγοκέντριση Κατακρήμνιση Χρωματογραφία Διήθηση με μεμβράνες Μέθοδοι καθαρισμού λιπασών Υδατικό σύστημα δύο φάσεων Συστήματα αντίστροφου μικκυλίου Άλλες τεχνικές Βιοχημικά χαρακτηριστικά βακτηριακών λιπασών Βέλτιστες τιμές ph και θερμοκρασία Επίδραση απορρυπαντικών/επιφανειοδραστικών Επίδραση μεταλλικών ιόντων

19 Πίνακας Περιεχομένων xi Ανθεκτικότητα σε οργανικούς διαλύτες Ανθεκτικότητα στις πρωτεάσες Εξειδίκευση υποστρώματος Κινητική μελέτη λιπάσης Πειραματική διαδικασία Υλικά Βακτηριακό στέλεχος Θρεπτικό υπόστρωμα και συνθήκες ανάπτυξης του βακτηρίου T. thermophilus Στάδια καθαρισμού εξωκυττάριας λιπάσης Διαπίδυση Προσδιορισμός πρωτεϊνών Προσδιορισμός δραστικότητας λιπάσης Επίδραση θερμοκρασίας και ph Επίδραση μεταλλικών ιόντων και αναστολέων στην ενζυμική δραστικότητα Κινητική εξωκυττάριας λιπάσης Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE) Χρώση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακριλαμιδίου In situ προσδιορισμός ενζύμων με δράση εστεράσης / λιπάσης Αποτελέσματα Σχολιασμός Παραγωγή εξωκυττάρια λιπάσης Μερικώς καθαρισμός εξωκυττάριας λιπάσης Επίδραση του ph στη δραστικότητα της εξωκυττάριας λιπάσης Επίδραση θερμοκρασίας στην εξωκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης

20 Πίνακας Περιεχομένων xii Επίδραση μεταλλικών ιόντων και αναστολέων στη δραστικότητα της εξωκυττάριας λιπάσης Εξειδίκευση υποστρώματος εξωκυττάριας λιπάσης Κινητική μερικώς καθαρισμένης εξωκυττάριας λιπάσης Συμπεράσματα Βιβλιογραφία 3 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 4 Καθήλωση Ενζύμων 4.1 Εισαγωγή Βιομηχανική εφαρμογή καθηλωμένων ενζύμων Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα χρήσης καθηλωμένων ενζύμων Τεχνικές καθήλωσης ενζύμων Σύνδεση ενζύμων σε αδιάλυτους φορείς Σύνθεση ενζύμων με ιονικούς δεσμούς Μέθοδος ομοιοπολικής σύνδεσης Διαμοριακή σύνδεση ενζύμων (σταυροσύνδεση) Εγκλωβισμός ενζύμων σε δικτυωτά πολυμερή ή μικροκάψουλες Εγκλωβισμός ενζύμων σε λιποσώματα ή άλλα υδρόφοβα πολυμερή Ιδιότητες των καθηλωμένων ενζύμων Κατανομή Περιορισμοί διάχυσης Στερεοχημικές παρεμποδίσεις Παράμετροι επιρροής ιδιοτήτων του καθηλωμένου ενζύμου Υλικά ακινητοποίησης ενζύμων Χιτοζάνη Αλγινικό και αλγινικό-πολυβινυλική αλκοόλη

21 Πίνακας Περιεχομένων xiii Eupergit C Καθήλωση της λιπάσης Πειραματική διαδικασία Υλικά Παρασκευή σωματιδίων χιτοζάνης Καθήλωση λιπάσης σε σωματίδια χιτοζάνης Καθήλωση λιπάσης σε σωματίδια Eupergit C Εγκλεισμός λιπάσης σε σωματίδια αλγινικού Εγκλεισμός λιπάσης σε σωματίδια αλγινικού-πολυβινυλικής αλκοόλης Προσδιορισμός πρωτεϊνών Ικανότητα καθήλωσης φορέα Μέτρηση δραστικότητας της λιπάσης Αποτελέσματα σχολιασμός Καθήλωση λιπάσης στους διάφορους φορείς Μορφολογία και μέγεθος φορέων καθήλωσης Συμπεράσματα Βιβλιογραφία 4 ου Κεφαλαίου Κεφάλαιο 5 Μικροβιακή Παραγωγή Βιοπολυμερών 5.1 Συνθετικά πολυμερή Βιοπολυμερή Βιοπολυμερή στη βιομηχανία Πολύ-υδροξυαλκανοϊκοί εστέρες (ΡΗΑs) ΡΗΑs στη Βιομηχανία Μεταβολικοί οδοί σύνθεσης των ΡΗΑs

22 Πίνακας Περιεχομένων xiv 5.7 Βιοσύνθεση και δομή κόκκων ΡΗΑ Μοντέλο δημιουργίας κόκκων ΡΗΑ στα βακτήρια Στάδια απομόνωσης και καθαρισμού των ΡΗΑs Προεπεξεργασία κυττάρων Απομόνωση ΡΗΑs Καθαρισμός του απομονωμένου ΡΗΑ Παραγωγή των ΡΗΑs Παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή του ΡΗΑ Παραγωγή mcl-phas από το είδος Pseudomonas Παράγοντες που επηρεάζουν το μοριακό βάρος των ΡΗΑ Εφαρμογές Βιοϊατρικές εφαρμογές Βιομηχανικές εφαρμογές Άλλες εφαρμογές Βιοαποικοδόμηση των ΡΗΑs Πειραματική διαδικασία Υλικά Βακτηριακό στέλεχος Θρεπτικά υποστρώματα και συνθήκες ανάπτυξης του βακτηρίου Pseudomonas putida KT Μελέτη επίδρασης θρεπτικών συστατικών στην ανάπτυξη του βακτηρίου P. putida και στην παραγωγή του ΡΗΑ σε κωνική φιάλη Μελέτη επίδρασης θρεπτικών συστατικών στην ανάπτυξη του βακτηρίου P. putida και στην παραγωγή του ΡΗΑ σε βιοαντιδραστήρα Παρακολούθηση ανάπτυξης του βακτηρίου Μέτρηση βιομάζας

23 Πίνακας Περιεχομένων xv Προσδιορισμός συγκέντρωσης πηγής άνθρακα Μέτρηση συγκέντρωσης αμμωνιακών αλάτων Μέτρηση συγκέντρωσης φωσφορικών αλάτων Μέτρηση συγκέντρωσης θειικού μαγνησίου Απομόνωση πολυμερούς Υπολογισμός απόδοσης παραγωγής πολυμερούς Ταυτοποίηση και υπολογισμός %ΡΗΑ σε δείγματα ξηρής βιομάζας Χαρακτηρισμός του ΡΗΑ Αποτελέσματα σχολιασμός Επίδραση των πηγών άνθρακα και αζώτου στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού και στην παραγωγή του ΡΗΑ, σε κωνική φιάλη Επίδραση της προσθήκης διατροφικών συστατικών στη μικροβιακή παραγωγή του PHA, σε κωνική φιάλη Βακτηριακή παραγωγή του ΡΗΑ, με συνεχόμενη προσθήκη οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου σε βιοαντιδραστήρα υπό ελεγχόμενες συνθήκες Επίδραση της έλλειψης φωσφόρου στη διεργασία της μικροβιακής παραγωγής του ΡΗΑ από το βακτήριο P. Putida σε βιοαντιδραστήρα Επίδραση προσθήκης θειικού μαγνησίου, στη διεργασία της μικροβιακής παραγωγής του ΡΗΑ από το βακτήριο P. Putida σε βιοαντιδραστήρα Παράγοντες που επηρεάζουν το μοριακό βάρος του παραγόμενου πολυμερούς Ταυτοποίηση του παραγόμενου ΡΗΑ Προσδιορισμός της σύστασης του παραγόμενου πολυμερούς Θερμική ανάλυση του παραγόμενου ΡΗΑ Συμπεράσματα Βιβλιογραφία 5 ου Κεφαλαίου

24 Πίνακας Περιεχομένων xvi Κεφάλαιο 6 Συμπεράσματα και Προτάσεις Μελλοντικής Έρευνας 6.1 Γενικά συμπεράσματα Παραγωγή και χαρακτηρισμός βιοκαταλυτών Παραγωγή βιοπολυμερών Προτάσεις μελλοντικής έρευνας Σύμβολα-Συντομογραφίες 316

25 Κατάλογος Πινάκων Κατάλογος Πινάκων Πίνακας 2.1 Ενζυμα που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία και εφαρμογές τους. 35 Πίνακας 2.2 Παγκόσμια αγορά ενζύμων ανά τομέα εφαρμογών, μέχρι το 2009 (σε εκατομμύρια $) Πίνακας 2.3 Κύρια πλεονεκτήματα εφαρμογών θερμόφιλων ενζύμων στη βιομηχανία Πίνακας 2.4 Κύρια προβλήματα εφαρμογών θερμόφιλων ενζύμων στη βιομηχανία Πίνακας 2.5 Βιομηχανικές εφαρμογές μικροβιακών λιπασών Πίνακας 2.6 Εμπορικά διαθέσιμες λιπάσες και βιομηχανικές εφαρμογές τους. 64 Πίνακας 2.7 Λιπάσες που χρησιμοποιούνται στην παραγωγή και ωρίμαση τυριού. 74 Πίνακας 3.1 Βέλτιστες τιμές ph και θερμοκρασίας λιπάσης Πίνακας 3.2 Ανθεκτικότητα λιπάσης σε ph και θερμοκρασία Πίνακας 3.3 Επίδραση διάφορων παραγόντων στη δραστικότητα της λιπάσης. 126 Πίνακας 3.4 Προσδιορισμός πρωτεϊνών και δραστικότητα λιπάσης ύστερα από συμπύκνωση του εξωκυττάριου υγρού Πίνακας 3.5 Προσδιορισμός πρωτεϊνών και δραστικότητα λιπάσης ύστερα από κατακρήμνιση πρωτεϊνών με θειικό αμμώνιο Πίνακας 3.6 Προσδιορισμός πρωτεϊνών και δραστικότητα λιπάσης ύστερα από κατακρήμνιση πρωτεϊνών με αιθανόλη στο ίζημα και στο υπερκείμενο Πίνακας 3.7 Πρωτόκολλο καθαρισμού της εξωκυττάριας λιπάσης σε στήλη βουτυλ-σεφαρόζης Πίνακας 3.8 Επίδραση διαφορετικών ιόντων στη μερικώς καθαρισμένη εξωκυττάρια λιπάση Πίνακας 3.9 Επίδραση διαφορετικών αναστολέων ή απορρυπαντικών στη μερικώς καθαρισμένη εξωκυττάρια λιπάση Πίνακας 4.1 Σύγκριση μεθόδων καθήλωσης ενζύμων

26 Κατάλογος Πινάκων viii Πίνακας 4.2 Κριτήρια για ένα υγιές/γερό (robust) καθηλωμένο ένζυμο Πίνακας 4.3 Φορείς καθήλωση ενζύμων Πίνακας 4.4 Ειδική δραστικότητα ελεύθερης και καθηλωμένης λιπάσης στους τέσσερις φορείς Πίνακας 5.1 Εμπορικά πολυμερή και η προέλευση τους Πίνακας 5.2 Δομή σημαντικότερων ομοπολυμερών των ΡΗΑs. (scl-phas: μικρού μήκους αλυσίδας ΡΗΑs, mcl-phas: μεσαίου μήκους αλυσίδας ΡΗΑs) Πίνακας 5.3 Σύγκριση φυσικών ιδιοτήτων scl-phas και mcl-phas με το πολυπροπυλένιο (PP) Πίνακας 5.4 Τιμή και παραγωγή εμπορικών ΡΗΑs Πίνακας 5.5 Ένζυμα κατάλυσης μεταβολικών αντιδράσεων του Σχήματος Πίνακας 5.6 Επίδραση πηγής άνθρακα στην ανάπτυξη του βακτηρίου P. putida και στην παραγωγή του ΡΗΑ Πίνακας 5.7 Επίδραση αρχικής συγκέντρωσης του οκτανοϊκού οξέος στην ανάπτυξη του βακτηρίου P. putida και στην παραγωγή του ΡΗΑ. 265 Πίνακας 5.8 Επίδραση αρχικής συγκέντρωσης του θειικού αμμωνίου στην ανάπτυξη του βακτηρίου P. putida και στην παραγωγή του ΡΗΑ Πίνακας 5.9 Επίδραση αρχικής συγκέντρωσης του θειικού αμμωνίου στην ανάπτυξη του βακτηρίου P. putida και στην παραγωγή του ΡΗΑ, με προσθήκη 25 mm οκτανοϊκού οξέος Πίνακας 5.10 Σύγκριση τελικών αποτελεσμάτων της καλλιέργειας του βακτηρίου P. putida σε φιάλη με και χωρίς προσθήκη οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου Πίνακας 5.11 Σύγκριση τελικών αποτελεσμάτων της καλλιέργειας του βακτηρίου P. putida υπό ημισυνεχείς συνθήκες σε φιάλη και βιοαντιδραστήρα Πίνακας 5.12 Σύγκριση τελικών αποτελεσμάτων της καλλιέργειας του βακτηρίου P. putida σε βιοαντιδραστήρα υπό ημισυνεχείς συνθήκες, σε συνθήκες έλλειψης φωσφόρου Πίνακας 5.13 Σύγκριση τελικών αποτελεσμάτων της καλλιέργειας του βακτηρίου P. putida σε βιοαντιδραστήρα υπό ημισυνεχείς συνθήκες, με και χωρίς προσθήκη μαγνησίου

27 Κατάλογος Σχημάτων Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 1.1 Φάσεις ανάπτυξης μικροοργανισμών Σχήμα 1.2 Μορφολογικοί σχηματισμοί βακτηρίων Σχήμα 1.3 Διάταξη δοχείου καλλιέργειας α: αναβίωση, β: ανασπορά... 8 Σχήμα 1.4 Διάγραμμα τυπικής αερόβιας διεργασίας Σχήμα 1.5 Βιοαντιδραστήρας ανάδευσης Σχήμα 1.6 Αντιδραστήρες τύπου βρόχου Σχήμα 1.7 Αντιδραστήρες κλίνης Σχήμα 1.8 Αντιδραστήρας μεμβράνης Σχήμα 2.1 Βιομηχανική αγορά ενζύμων Σχήμα 2.2 Παγκόσμια αγορά ενζύμων ανά τομέα εφαρμογών μέχρι το 2009 ($ εκατομμύρια) Σχήμα 2.3 Δομή συμπλόκου ΗΡL- λιπάσης στην κλειστή (Ε) και ανοιχτή διαμόρφωση (Ε * S). Οι δύο αυτές εικόνες δείχνουν την αλλαγή της διαμόρφωση του καλύματος (lid) που γίνεται στη β5 θηλιά (loop) και της συνλιπάσης κατά τη διάρκεια της διεπιφανειακής ενεργοποίησης. 50 Σχήμα 2.4 Δομή της λιπάσης Mucor miehei στην κλειστή (Α, C) και ανοιχτή (B, D) της μορφή. A και Β (πλαϊνή όψη): η καταλυτική τριάδα με κίτρινο χρώμα και τα στοιχεία της δευτερεύουσας δομής δείχνουν τη δομή a/bυδρολάση κοινή σε όλες τις λιπάσες. C και D (κάτοψη): μοντέλο της πλήρωσης του χώρου, χρωματισμένο με μείωση της πόλωσης (σκούρο μπλε ± ανοιχτό μπλε ± άσπρο ± ανοιχτό κόκκινο ± σκούρο κόκκινο). Καθώς ανοίγει το καπάκι, η καταλυτική τριάδα (κίτρινο) γίνεται προσβάσιμη (D), και οι τοπικοί δεσμοί στην διεπιφάνεια γίνονται σημαντικά μη πολικοί Σχήμα 2.5 Καταλυτικός μηχανισμός των λιπασών βασισμένος στην «καταλυτική τριάδα» σερίνης, ιστιδίνης, και ασπαρτικής ή γλουταμινικού (συνδεόμενων μέσο ενός δεσμού υδρογόνου). Το τετραεδρικό σύμπλοκο σταθεροποιείται από ένα οξυανιόν. To αμινοξύ σε αυτό το παράδειγμα αναφέρεται στη λιπάση από το μικροοργανισμό Rhizopus

28 Κατάλογος Σχημάτων viii oryzae Σχήμα 2.6 Καταλυτικές αντιδράσεις λιπάσης Σχήμα 2.7 Καταλυτική υδρόλυση του δωδεκανοϊκού π-νιτροφαινυλεστέρα (p- NPL) από τη λιπάση Σχήμα 2.8 Κινητική μελέτη ανάπτυξης του βακτηρίου T. thermophilus ΗΒ Σχήμα 2.9 Κινητική μελέτη ενδο- και εξω-κυττάριας δραστικότητας λιπάσης.. 82 Σχήμα 2.10 Ανίχνευση λιπολυτικής δραστικότητας από το βακτήριο T. thermophilus σε τρυβλίο που περιέχει άγαρ,tween 80 CaCl 2 και 0.01%v/v Nile Blue Σχήμα 2.11 Επίδραση οξυγόνου στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus HB8 (Οπτική πυκνότητα καλλιέργειας) Σχήμα 2.12 Επίδραση οξυγόνου στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus HB8 (Ξηρή μάζα κυττάρων) Σχήμα 2.13 Επίδραση οξυγόνου στην εξωκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB Σχήμα 2.14 Επίδραση οξυγόνου στην ενδοκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB Σχήμα 2.15 Επίδραση οξυγόνου στη συνολική δραστικότητα της λιπάσης ως προς τον όγκο του μέσου ανάπτυξης, την παραγόμενη βιομάζας και του χρόνου καλλιέργειας (30 ώρες) Σχήμα 2.16 Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων ελαιόλαδου στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus HB8 (Οπτική πυκνότητα καλλιέργειας) Σχήμα 2.17 Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων ελαιόλαδου στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus HB8 (Ξηρή μάζα κυττάρων) Σχήμα 2.18 Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων ελαιόλαδου στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ στη δραστικότητα της εξωκυττάριας λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB Σχήμα 2.19 Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων ελαιόλαδου στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ στη δραστικότητα της ενδοκυττάριας λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB Σχήμα 2.20 Επίδραση σουκρόζης και ελαιόλαδου στην ανάπτυξη του βακτηρίου T.

29 Κατάλογος Σχημάτων ix thermophilus HB8 (Οπτική πυκνότητα καλλιέργειας) Σχήμα 2.21 Επίδραση σουκρόζης και ελαιόλαδου στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus HB8 (Ξηρή μάζα κυττάρων) Σχήμα 2.22 Επίδραση σουκρόζης και ελαιόλαδου στην παραγωγή της εξωκυττάριας λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB Σχήμα 2.23 Επίδραση σουκρόζης και ελαιόλαδου στην παραγωγή της ενδοκυττάριας λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB Σχήμα 2.24 Επίδραση πηγής άνθρακα στη συνολική δραστικότητα της λιπάσης ως προς τον όγκο του μέσου ανάπτυξης, της παραγόμενης βιομάζας και του χρόνου (χρόνος καλλιέργειας 30 ώρες) Σχήμα 3.1 Στάδια απομόνωσης και καθαρισμού ενδοκυττάριων ενζύμων Σχήμα 3.2 Διάγραμμα διπλού αντιστρόφου κατά Lineweaver Burk και υπολογισμός των σταθερών Κ m και v max Σχήμα 3.3 Ανάπτυξη βακτηρίου T. thermophilus, παραγωγή εξωκυττάριων πρωτεϊνών και ειδική δραστικότητα εξωκυττάριας λιπάσης Σχήμα 3.4 Εντοπισμός λιπολυτικής δραστικότητας σε SDS-PAGE. Χρώση πηκτής με α-οξικό ναφθαλενίο και Fast Blue BB. Διαδρομή 1: εξωκυττάριο υγρό χωρίς κύτταρα, Διαδρομή 2: Μάρτυρες μοριακής μάζας Σχήμα 3.5 Προσδιορισμός πρωτεϊνών με απορρόφηση στα 280 nm και ενζυμική δραστικότητα της λιπάσης των κλασμάτων της στήλης χρωματογραφίας. Με το βέλος δηλώνεται το σημείο έναρξης της έκλουσης με το διαβαθμισμένο διάλυμα NaCl Σχήμα 3.6 SDS-ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και χρώση με AgNO 3, της μερικώς καθαρισμένης εξωκυττάριας λιπάσης. Διαδρομές: 1: Μάρτυρες μοριακής μάζας, 2: αρχικό εξωκυττάριο εκχύλισμα, 3: μερικώς καθαρισμένη λιπάση Σχήμα 3.7 Επίδραση του ph στην εξωκυττάρια δραστικότητα της μερικώς καθαρισμένης λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus Σχήμα 3.8 Επίδραση θερμοκρασίας στην εξωκυττάρια δραστικότητα της μερικώς καθαρισμένης λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus Σχήμα 3.9 Εξειδίκευση υποστρώματος μερικώς καθαρισμένης λιπάσης του T. thermophilus Σχήμα 3.10 Μεταβολή της δραστικότητας της μερικώς καθαρισμένης

30 Κατάλογος Σχημάτων x εξωκυττάριας λιπάσης σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος (pnpl) Σχήμα 3.11 Καμπύλη διπλού αντιστρόφου κατά Lineweaver Burk της λιπάσης Σχήμα 4.1 Απεικόνιση μεθόδων καθήλωσης ενζύμων Σχήμα 4.2 Ομοιοπολική σύνδεση ενζύμων σε φορέα, με και χωρίς βραχίονα Σχήμα 4.3 Σχηματική παράσταση εγκλωβισμένων ενζύμων σε μικροκάψουλες Σχήμα 4.4 Μέθοδος εγκλωβισμού σε μικροκάψουλες Σχήμα 4.5 Παράμετροι που σχετίζονται με τις τελικές ιδιότητες του καθηλωμένου ενζύμου Σχήμα 4.6 Δομική μονάδα χιτοζάνης (α) μονάδα Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη, (β) μονάδα γλυκοζαμίνης Σχήμα 4.7 Δομή των (α) β-d- μανουρονικό οξύ, (β) α-l-γουλουρινικό οξύ (guluronic acid) και (γ) αλγινικό οξύ Σχήμα 4.8 Δομή του Eupergit C και η ομοιοπολική σύνδεση με ένα ένζυμο Σχήμα 4.9 Ομοιοπολική καθήλωση λιπάσης σε σωματίδια Εupergit C Σχήμα 4.10 Ικανότητα καθήλωσης των τεσσάρων φορέων (Εupergit C, χιτοζάνη, αλγινικού και αλγινικού ΡVA σωματίδια) Σχήμα 4.11 Απόδοση καθήλωσης της λιπάσης στους τέσσαρις φορείς (Εupergit C, χιτοζάνη, αλγινικού και αλγινικού ΡVA σωματίδια) Σχήμα 4.12 Μορφολογία και μέγεθος σωματιδίων χιτοζάνης (α), αλγινικού (β), αλγινικού-πολυβινυλικής αλκοόλης (γ) και Εupergit C (δ) Σχήμα 5.1 Κατανομή αριθμών εταιριών που παράγουν βιοπλαστικά ανά χώρα Σχήμα 5.2 Κατανομή αριθμών εταιριών ανά είδος παραγόμενου βιοπολυμερούς. 207 Σχήμα 5.3 Παγκόσμια δυναμικότητα βιοπλαστικών μέχρι το 2020 βασισμένη σε ανακοινώσεις εταιριών Σχήμα 5.4 Παγκόσμια δυναμική παραγωγής ανερχόμενων βιοπολυμερών στα έτη 2003 και Σχήμα 5.5 Μεταβολικοί οδοί σύνθεσης των ΡΗΑs Σχήμα 5.6 Καταλυτική αντίδραση ΡΗΑ-συνθάσης Σχήμα 5.7 Αρχή βιοσύνθεσης ΡΗΑ στα βακτήρια, τριών φάσεων. Στη πρώτη φάση οι πρωτεΐνες δεσμεύονται στην κυτταρική μεμβράνη, στη δεύτερη οι πρωτεΐνες γίνονται διαλυτές και μέσω αναβολικού ή καταβολικού μονοπατιού μετατρέπονται σε υδροξυακέτυλο-coa, που

31 Κατάλογος Σχημάτων xi με τη δράση της ΡΗΑ συνθάσης στο τρίτο στάδιο μετατρέπεται σε πολυμερές Σχήμα 5.8 Σχηματική απεικόνιση κόκκου πολυεστέρα Σχήμα 5.9 Εικόνα από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο κόκκου πολυεστέρα από το βακτήριο Pseudomonas aeruginosa Σχήμα 5.10 Μηχανισμός σχηματισμού των κόκκων ΡΗΑ προτεινόμενος από τους Gerngross και Martin Σχήμα 5.11 Στάδια απομόνωσης και καθαρισμού των ΡΗΑs Σχήμα 5.12 Παρασκευασμένα αντικείμενα από βιοαποκοδομήσιμο ΡΗΒ, διαφορετικών εφαρμογών, τα οποία μπορούν να βιοδιασπαστούν μέσα σε τρείς εβδομάδες Σχήμα 5.13 Βιοαποικοδόμηση του Ρ(3ΗΒ-3ΗV) σε αερόβια απόβλητα. Τα μπουκάλια που αποτελούνται από βιοαποικοδομήσιμο πλαστικό έχουν υποστεί επώαση σε μέση θερμοκρασία 20 ο C για 0. 2, 4, 6, 8 και 10 εβδομάδες (από αριστερά προς τα δεξιά) Σχήμα 5.14 Γραμμική συσχέτιση της ξηρής μάζας των κυττάρων με την οπτική πυκνότητα δειγμάτων των κυττάρων για τιμές O.D Σχήμα 5.15 Γραμμική συσχέτιση της ξηρής μάζας των κυττάρων με την οπτική πυκνότητα δειγμάτων των κυττάρων για τιμές O.D.> Σχήμα 5.16 Δυναμική μεταβολή της οπτικής πυκνότητας, της συγκέντρωσης της ξηρής μάζας των κυττάρων, του ποσοστιαίου περιεχομένου του ΡΗΑ και της συγκέντρωσης του παραγόμενου ΡΗΑ, κατά την καλλιέργεια της P. putida, με προσθήκη 5 και 10 mm οκτανοϊκού οξέος μαζί με 0.1 g/l και 0.2 g/l θειικού αμμωνίου (περίπτωση 1) Σχήμα 5.17 Επίδραση προσθήκης 5 και 10 mm οκτανοϊκού οξέος μαζί με 0.1 g/l και 0.2 g/l θειικού αμμωνίου στην πορεία ανάπτυξης του βακτηρίου P. putida και παραγωγής ΡΗΑ (περίπτωση 1) Σχήμα 5.18 Δυναμική μεταβολή της οπτικής πυκνότητας, της συγκέντρωσης της ξηρής μάζας των κυττάρων, του ποσοστιαίου περιεχομένου του ΡΗΑ και της συγκέντρωσης του παραγόμενου ΡΗΑ, κατά την καλλιέργεια της P. putida, με προσθήκη 5, 10 και 15 mm οκτανοϊκού οξέος μαζί με 0.1 g/l θειικού αμμωνίου (περίπτωση 2) Σχήμα 5.19 Επίδραση προσθήκη 5, 10 και 15 mm οκτανοϊκού οξέος μαζί με 0.1 g/l

32 Κατάλογος Σχημάτων xii θειικού αμμωνίου στην πορεία ανάπτυξης του βακτηρίου P. putida και παραγωγής ΡΗΑ (περίπτωση 2) Σχήμα 5.20 Δυναμική μεταβολή της οπτικής πυκνότητας, της συγκέντρωσης της ξηρής μάζας των κυττάρων, του ποσοστιαίου περιεχομένου του ΡΗΑ και της συγκέντρωσης του παραγόμενου ΡΗΑ, κατά την καλλιέργεια της P. putida, με προσθήκη 5 mm οκτανοϊκού οξέος μαζί με 0.1 g/l θειικού αμμωνίου, (περίπτωση 3) Σχήμα 5.21 Επίδραση προσθήκη 5 mm οκτανοϊκού οξέος μαζί με 0.1 g/l θειικού αμμωνίου, στην πορεία ανάπτυξης του βακτηρίου P. putida και παραγωγής ΡΗΑ (περίπτωση 3) Σχήμα 5.22 Σύγκριση τελικών συγκεντρώσεων ξηρής μάζας κυττάρων, μοριακού βάρους και ποσοστιαίου περιεχομένου του ΡΗΑ, καλλιεργειών σε κωνικές φιάλες με και χωρίς προσθήκη πηγών άνθρακα και αζώτου Σχήμα 5.23 Δυναμική μεταβολή της οπτικής πυκνότητας, της συγκέντρωσης της ξηρής μάζας των κυττάρων, του ποσοστιαίου περιεχομένου του ΡΗΑ και της συγκέντρωσης του παραγόμενου ΡΗΑ, κατά την καλλιέργεια της P. putida,, υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία πηγών άνθρακα και αζώτου) Σχήμα 5.24 Επίδραση συγκεντρώσεων φωσφόρου, οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου, στην παραγωγή του ΡΗΑ, κατά τη διάρκεια ανάπτυξης του βακτηρίου P. putida, υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία πηγών άνθρακα και αζώτου) Σχήμα 5.25 Δυναμική μεταβολή του διαλυμένου οξυγόνου και της σύστασης των αερίων σε όρους %O 2 και %CO 2 κατά την καλλιέργεια της P. putida υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία πηγών άνθρακα και αζώτου) Σχήμα 5.26 Δυναμική μεταβολή της οπτικής πυκνότητας, της συγκέντρωσης της ξηρής μάζας των κυττάρων, του ποσοστιαίου περιεχομένου του ΡΗΑ και της συγκέντρωσης του παραγόμενου ΡΗΑ, κατά την καλλιέργεια της P. putida,, με αρχική συγκέντρωση φωσφορικών αλάτων στο μέσο ανάπτυξης 2.2 g/l. υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία πηγών άνθρακα και αζώτου) Σχήμα 5.27 Επίδραση συγκεντρώσεων φωσφόρου, οκτανοϊκού οξέος και θειικού

33 Κατάλογος Σχημάτων xiii αμμωνίου, στην παραγωγή ΡΗΑ και την ανάπτυξης του βακτηρίου P. putida, με αρχική συγκέντρωση φωσφορικών αλάτων στο μέσο ανάπτυξης 2.2 g/l, στην παραγωγή ΡΗΑ, υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία πηγών άνθρακα και αζώτου) Σχήμα 5.28 Δυναμική μεταβολή της οπτικής πυκνότητας, της συγκέντρωσης της ξηρής μάζας των κυττάρων, του ποσοστιαίου περιεχομένου του ΡΗΑ και της συγκέντρωσης του παραγόμενου ΡΗΑ, κατά την καλλιέργεια της P. putida, με αρχική συγκέντρωση φωσφορικών αλάτων στο μέσο ανάπτυξης 1.1 g/l, υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία πηγών άνθρακα και αζώτου) Σχήμα 5.29 Επίδραση συγκεντρώσεων φωσφόρου, οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου, στην ανάπτυξης του βακτηρίου P. putida, με αρχική συγκέντρωση φωσφορικών αλάτων στο μέσο ανάπτυξης 1.1 g/l, στην παραγωγή ΡΗΑ, υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία πηγών άνθρακα και αζώτου) Σχήμα 5.30 Δυναμική μεταβολή της συγκέντρωσης της ξηρής μάζας των κυττάρων κατά την καλλιέργεια του P. putida, με αρχικές συγκεντρώσεις συνολικών φωσφορικών αλάτων 11 g/l, 2.2 g/l και 1.1 g/l, υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου) Σχήμα 5.31 Δυναμική μεταβολή του ποσοστιαίου περιεχομένου του ΡΗΑ, κατά την καλλιέργεια του P. putida, με αρχικές συγκεντρώσεις συνολικών φωσφορικών αλάτων 11 g/l, 2.2 g/l και 1.1 g/l, υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου) Σχήμα 5.32 Δυναμική μεταβολή του ρυθμού παραγωγής του ΡΗΑ, κατά την καλλιέργεια της P. putida, με αρχικές συγκεντρώσεις συνολικών φωσφορικών αλάτων 11 g/l, 2.2 g/l και 1.1 g/l, υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία πηγών άνθρακα και αζώτου) Σχήμα 5.33 Ρυθμός κατανάλωσης φωσφόρου, κατά την καλλιέργεια της P. putida, με αρχική συγκέντρωση συνολικών φωσφορικών αλάτων στο μέσο

34 Κατάλογος Σχημάτων xiv ανάπτυξης, 11 g/l, 2.2 g/l και 1.1 g/l, υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία πηγών άνθρακα και αζώτου). 290 Σχήμα 5.34 Δυναμική μεταβολή της οπτικής πυκνότητας, της συγκέντρωσης της ξηρής μάζας των κυττάρων, του ποσοστιαίου περιεχομένου ΡΗΑ και της συγκέντρωσης του παραγόμενου ΡΗΑ, κατά τη διάρκεια της καλλιέργεια του βακτηριου P. putida, με προσθήκη 0.4g/l MgSO 4, υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία οκτανοϊκού οξέος και θειικού αμμωνίου) Σχήμα 5.35 Δυναμική μεταβολή της οπτικής πυκνότητας, της συγκέντρωσης της ξηρής μάζας των κυττάρων, του ποσοστιαίου περιεχομένου του ΡΗΑ και της συγκέντρωσης του παραγόμενου ΡΗΑ, κατά την καλλιέργεια του P. putida, υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία οκτανοϊκού οξέος, θειικού αμμωνίου και θειικού μαγνησίου) Σχήμα 5.36 Επίδραση συγκεντρώσεων φωσφόρου, οκτανοϊκού οξέος, θειικού αμμωνίου και θειικού μαγνησίου στην παραγωγή του ΡΗΑ, κατά τη διάρκεια ανάπτυξης του βακτηρίου P. putida υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία οκτανοϊκού οξέος, θειικού αμμωνίου και θειικού μαγνησίου) Σχήμα 5.37 Συσχέτιση συγκέντρωσης οκτανοϊκού οξέος στο μέσο ανάπτυξης της καλλιέργειας με την εξέλιξη του μοριακού βάρους του παραγόμενου ΡΗΑ Σχήμα 5.38 Συσχέτιση συγκέντρωσης οκτανοϊκού οξέος στο μέσο ανάπτυξης της καλλιέργειας με την εξέλιξη του μοριακού βάρους του παραγόμενου ΡΗΑ Σχήμα 5.39 Συσχέτιση συγκεντρώσεων οκτανοϊκού οξέος και θειικού μαγνησίου με την εξέλιξη του μοριακού βάρους του παραγόμενου ΡΗΑ Σχήμα 5.40 Συσχέτιση συγκεντρώσεων οκτανοϊκού οξέος και θειικού μαγνησίου με την εξέλιξη του μοριακού βάρους του παραγόμενου ΡΗΑ Σχήμα 5.41 Ποιοτική αναπαράσταση μεθόδου προσδιορισμού του ποσοστιαίου περιεχόμενου του PHA με τη μέθοδο FTIR. Τα τρία φάσματα προέρχονται από διαφορετικούς χρόνους της ίδιας καλλιέργειας με διαφορετικά ποσοστά συσσώρευσης ΡΗΑ. (α) αρχικό στάδιο

35 Κατάλογος Σχημάτων xv καλλιέργειας, (β) κατά τη διάρκεια ανάπτυξης του βακτηρίου, (γ) στο τέλος της καλλιέργειας Σχήμα 5.42 Θερμογράφημα-DSC του παραγόμενου ΡΗΑ κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας του βακτηρίου P. putida Σχήμα 5.43 Θερμογράφημα-DSC του παραγόμενου ΡΗΑ στο τέλος της καλλιέργειας του βακτηρίου P. putida

36 Καλλιέργειες Βακτηρίων 1 Κεφάλαιο 1 Καλλιέργειες Βακτηρίων 1.1 Ανάπτυξη μικροοργανισμών Η πλειοψηφία των μικροοργανισμών μπορούν να αναπτυχθούν κάτω από κανονικές συνθήκες σε τεχνικά θρεπτικά υποστρώματα. Τα θρεπτικά υποστρώματα αποτελούνται από οργανικές και ανόργανες ουσίες, στις οποία οι μικροοργανισμοί έχουν τη δυνατότητα να παραμένουν ζωντανοί, να αναπτύσσονται και να πολλαπλασιάζονται. Τα είδη μικροβιακών καλλιεργειών που υπάρχουν είναι δύο: η υγρή και η στερεή καλλιέργεια. Στις υγρές καλλιέργειες, τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται ως ένα κλειστό σύστημα μέχρις ότου είτε να καταναλωθούν πλήρως ορισμένα απαραίτητα για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού θρεπτικά συστατικά, είτε να παραχθούν μερικά προϊόντα σε τέτοια συγκέντρωση που να παρεμποδίζουν την περαιτέρω ανάπτυξη του. Επίσης, η έλλειψη διαθέσιμου χώρου για τον αναδιπλασιασμό των κυττάρων του μικροοργανισμού, είναι παρεμποδιστικός παράγοντας για την περαιτέρω ανάπτυξή του. Κατά τη διάρκεια ανάπτυξής των κυττάρων, τα διάφορα συστατικά του κυττάρου μεταβάλλονται ποικιλοτρόπως και τα κύτταρα αλλάζουν σε μέγεθος πριν από την διαίρεση τους (Κυριακίδης, 2002). Στις στερεές καλλιέργειες, τα βακτήρια ακολουθούν περίπου τους ίδιους κανόνες ανάπτυξης με τις υγρές καλλιέργειες. Η διαφορά τους είναι ότι από ένα μόνο κύτταρο του μικροοργανισμό, που δε φαίνεται χωρίς τη βοήθεια μικροσκοπίου, μετά από διαδοχικές διαιρέσεις παράγονται τελικά ένα άθροισμα από πολλά βακτηριακά κύτταρα, που διακρίνονται με το μάτι, το οποίο ονομάζεται μικροβιακή αποικία (Αντωνιάδης, 2000). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

37 Καλλιέργειες Βακτηρίων 2 Η πορεία ανάπτυξης των μικροοργανισμών μέσα σε υγρό θρεπτικό υλικό παριστάνεται από μία καμπύλη που χωρίζεται σε τέσσερεις φάσεις, οι οποίες αποτελούνται από (Παπαπαναγιώτου, 1999): τη φάση προσαρμογής (log phase), τη λογαριθμική/εκθετική φάση (logarithmic/exponential phase), τη φάση στασιμότητας (stationary phase), και τη φάση θανάτου (decline or death phase) Η καμπύλη αυτή λαμβάνεται με τη μέτρηση της οπτικής πυκνότητας, στα 600 nm, του μέσου ανάπτυξης ως προς το χρόνο όπως δίνεται στο Σχήμα Φάση Στασιμότητας Φάση Θανάτου Οπτική πυκνότητα 600 nm Λογαριθμική/εκθετική Φασή Φάση Προσαρμογής Χρόνος (h) Σχήμα 1.1 Φάσεις ανάπτυξης μικροοργανισμών Κατά τη διάρκεια της φάσης προσαρμογής δεν παρατηρείται πολλαπλασιασμός των κυττάρων αλλά γίνεται σύνθεση των ενζύμων που είναι απαραίτητα για την επόμενη φάση. Πρόκειται δηλαδή για τη φάση στην οποία ο μικροοργανισμός προσαρμόζεται στις νέες συνθήκες στις οποίες βρέθηκε. Η διάρκειά της εξαρτάται από την ποιότητα του θρεπτικού υλικού και από τον αρχικό αριθμό των κυττάρων του μικροοργανισμού που έχουν εμφυτευτεί σε αυτό. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

38 Καλλιέργειες Βακτηρίων 3 Κατά τη διάρκεια της λογαριθμικής φάσης αρχίζει ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, ο οποίος εξακολουθεί με γρήγορο ρυθμό για μερικές ώρες. Σε αυτή τη φάση παρατηρείται απότομη αύξηση του αριθμού των κυττάρων κατά γεωμετρική πρόοδο. Επίσης, παρατηρείται πολύ γρήγορη αύξηση τόσο της συγκέντρωσης του RNA, όσο και του ρυθμού της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Πρέπει να σημειωθεί ότι ο λογάριθμος του αριθμού των κυττάρων βρίσκεται σε γραμμική σχέση ως προς το χρόνο. Κατά τη διάρκεια της φάσης στασιμότητας αναστέλλεται ο γρήγορος πολλαπλασιασμός των κυττάρων. Παρατηρείται όμως πολλαπλασιασμός σε ελάχιστο βαθμό, ικανός να αντικαθιστά τον αριθμό των νεκρών κυττάρων. Ο αριθμός των κυττάρων σε αυτή τη φάση παραμένει σταθερός. Κατά τη διάρκεια της φάσης θανάτου το θρεπτικό υλικό έχει εξαντληθεί. Ο αριθμός των νεκρών κυττάρων υπερτερεί από τον αριθμό των κυττάρων που παράγονται με αποτέλεσμα να μειώνεται σιγά-σιγά ο αριθμός των κυττάρων (Παπαπαναγιώτου, 1999). Η ταχύτητα με την οποία ένας μικροοργανισμός πολλαπλασιάζεται εκφράζεται είτε με το χρόνο διπλασιασμού t d (doubling time), είτε με την ταχύτητα ανάπτυξής μ (growth rate) που είναι η ταχύτητα σύνθεσης των νεοσυντιθέμενων ουσιών, εκφρασμένη ανά μονάδα βάρους των υπαρχουσών κυτταρικών ουσιών. Οι δύο αυτοί παράμετροι σχετίζονται με τις εξισώσεις [1.1](Κυριακίδης, 2002): 1 dx d(ln x) ln m= = = m= x dt dt t t d d [1.1] (όπου x = ο αριθμός των κυττάρων, t = ο χρόνος) Στις καλλιέργειες η τιμή του μ ποικίλλει, διότι μεταβάλλεται η συγκέντρωση των συστατικών του υγρού ανάπτυξης. Σε πολλές περιπτώσεις αερόβιων μικροοργανισμών η ταχύτητα παροχής του Ο 2 κατευθύνει την ταχύτητα ανάπτυξης. Μόνο σε συνεχείς καλλιέργειες μπορεί η ταχύτητα ανάπτυξης να παραμείνει σταθερή, με σταθερή παροχή νέου υγρού καλλιέργειας. Οι παράγοντες που καθορίζουν τη μέγιστη ταχύτητα ανάπτυξης ενός οργανισμού, ποικίλουν από οργανισμό σε οργανισμό, και στις περισσότερες των περιπτώσεων είναι άγνωστοι. Ενδέχεται η μέγιστη ταχύτητα ανάπτυξης να καθορίζεται από την ταχύτητα σύνθεσης του DNA, την ταχύτητα με την οποία κάποιες ουσίες εισέρχονται μέσα στα κύτταρα ή την ταχύτητα βιοσύνθεσης και οργάνωσης μερικών στοιχείων του κυττάρου, όπως π.χ. το κυτταρικό τοίχωμα. Ο χρόνος διπλασιασμού t d μπορεί να ποικίλλει από 10 λεπτά μέχρι πολλές ώρες, ανάλογα με τη σύσταση του θρεπτικού υγρού. Τα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

39 Καλλιέργειες Βακτηρίων 4 περισσότερα είδη των βακτηρίων έχουν χρόνο διπλασιασμού 30 λεπτά ή περισσότερο, ενώ λίγα αρκετές ημέρες (Κυριακίδης, 2002). Εμπειρικά ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εξαρτάται από πολλούς παράγοντες όπως (Κυριακίδης, 2002): η φύση της πηγής άνθρακα η πορεία καταβολισμού του θρεπτικού υποστρώματος η απαίτηση σε ενέργεια για τη διαμετακίνηση άλλων θρεπτικών συστατικών, ειδικά του Νa. η αλλαγή της ισορροπίας ιόντων ή άλλων ουσιών του θρεπτικού υγρού, με αποτέλεσμα τη μεταβολή των συστατικών μεταφοράς ουσιών μέσα στα κύτταρα η φυσιολογική κατάσταση του μικροοργανισμού η φύση του θρεπτικού υποστρώματος που βρίσκεται σε οριακές συγκεντρώσεις η επιτρεπόμενη ταχύτητα ανάπτυξής ο μικροοργανισμός αυτός καθαυτός και η ικανότητα του ερευνητή Βακτήρια Τα βακτήρια είναι προκαρυωτικοί οργανισμοί και απαντώνται σε τρεις βασικούς μορφολογικούς σχηματισμούς, σπειροειδές, σφαιρικό και ραβδοειδές (Σχήμα 1.2). Υπάρχουν πολλές υποδιαιρέσεις βακτηρίων. Οι ταξινομήσεις που ακολουθούνται, συνήθως στηρίζονται στο αν βάφονται ή όχι με χρώση κατά Gram (θετικά ή αρνητικά βακτήρια κατά Gram), στον τρόπο διαβίωσης τους (αυτότροφα ή ετερότροφα) και στο αν σχηματίζουν ή όχι σπόρια. Για την ταξινόμηση τους σε Gram θετικά ή αρνητικά, τα βακτήρια βάφονται πρώτα με τη χρωστική κρυσταλλικόν ιώδες, στη συνέχεια κατεργάζονται με διάλυμα ιωδίου και ξεπλένονται με αλκοόλη. Βακτήρια που κρατούν το ιώδες-κυανού χρώμα της χρωστικής, μετά από αυτή την κατεργασία ονομάζονται θετικά κατά Gram. Τα βακτήρια που ύστερα από αυτή την κατεργασία χάνουν το χρώμα της χρωστικής χαρακτηρίζονται ως αρνητικά κατά Gram. Η διαφοροποίηση αυτή οφείλεται στη διαφορετική χημική σύσταση των κυτταρικών τοιχωμάτων των βακτηρίων (Κυριακίδης, 2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

40 Καλλιέργειες Βακτηρίων 5 Τα βακτήρια είναι κυρίως ετερότροφα (αξιοποιούν ενέργεια από οργανικές ενώσεις) και ζουν παντού ως σαπρότροφα (τρέφονται από νεκρά οργανικά υλικά) ή παράσιτα (τρέφονται με ζώντα υλικά του ξενιστή κυττάρου) ή ζουν ως συμβατικοί οργανισμοί (Κυριακίδης, 2002). Σχήμα 1.2 Μορφολογικοί σχηματισμοί βακτηρίων (Κυριακίδης, 2002). Ένας καθοριστικός παράγοντας για όλες τις βιοτεχνολογικές διεργασίες είναι η ανάγκη των βακτηρίων και γενικότερα όλων των μικροοργανισμών, για οξυγόνο. Σε αερόβιους μικροοργανισμούς (π.χ. για την παραγωγή ξιδιού ή αντιβιοτικών) παρέχεται οξυγόνο, συνήθως διαβιβάζοντας αέρα της ατμόσφαιρας. Σε περιπτώσεις παραγωγής αλκοόλης ή πέψης οργανικών αποβλήτων οι μικροοργανισμοί λειτουργούν χωρίς οξυγόνο σε αναερόβιες συνθήκες (Κυριακίδης, 2002). Τα βακτήρια που σχηματίζουν ενδοσπόρια κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες, έχουν μεγάλη σημασία στη βιοτεχνολογία. Τα σπόρια είναι εφησυχασμένοι σχηματισμοί μικροοργανισμών, που ανθίστανται σε αυξημένες θερμοκρασίες, δηλητηριώδη χημικά ή ραδιενέργεια. Όταν τα σπόρια επιστρέψουν σε κατάλληλες συνθήκες, μπορούν να αναπτυχθούν και να σχηματίσουν κανονικά και λειτουργικά κύτταρα. Αυτή η ενεργός βιολογική κατάσταση των κυττάρων ονομάζεται βλαστική κατάσταση (vegetative state). Υπάρχουν δύο ομάδες βακτηρίων που σχηματίζουν σπόρια. Στην πρώτη ανήκουν τα αερόβια είδη του Bacillus που είναι πολύ διαδεδομένα και παρουσιάζουν μεγάλο βαθμό προσαρμογής στο περιβάλλον τους. Στη δεύτερη ανήκουν πολλά είδη του Clostridium που ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

41 Καλλιέργειες Βακτηρίων 6 κανονικά αναπτύσσονται κάτω από αναερόβιες συνθήκες και πεθαίνουν παρουσία οξυγόνου, αλλά μπορούν και σχηματίζουν χωρίς να επηρεάζονται από το οξυγόνο (Κυριακίδης, 2002). Μερικά βακτήρια των οποίων η βλαστική κατάσταση καταστρέφεται στη θερμοκρασία των 45 ο C μπορούν και σχηματίζουν σπόρια που επιζούν σε βραστό νερό για πολλές ώρες. Συνεπώς, οι προσπάθειες για καταστροφή των βακτηρίων με θέρμανση απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες, που τυπικά κατορθώνονται με βράσιμο υπό πίεση σε κλίβανο, όπου επιτυγχάνεται θερμοκρασία μεγαλύτερη των 120 ο C (heat sterilization) (Κυριακίδης, 2002) Κατάταξη μικροοργανισμών ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης τους Ανάλογα με τη θερμοκρασία στην οποία αναπτύσσονται καλύτερα οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε ψυχρόφιλα, μεσόφιλα και θερμόφιλα. Τα ψυχρόφιλα αναπτύσσονται σε χαμηλή θερμοκρασία (15 ο C) και διακρίνονται σε υποχρεωτικά και προαιρετικά ψυχρόφιλα. Τα υποχρεωτικά ψυχρόφιλα θανατώνονται σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των 20 ο C και έχουν άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης ο C. Τα προαιρετικά ψυχρόφιλα έχουν άριστη και μέγιστη θερμοκρασία ανάπτυξης αυτήν των μεσόφιλων. Όλα τα ψυχρόφιλα έχουν ελάχιστη θερμοκρασία ανάπτυξης τους 0 ο C (Παπαπαναγιώτου, 1999). Τα μεσόφιλα αναπτύσσονται καλύτερα σε θερμοκρασία ο C. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν η πλειοψηφία των μικροοργανισμών. Ένας τυπικός μεσόφιλος είναι η E. coli. Οι μικροοργανισμοί αυτοί έχουν άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης τους 30 ο C (Παπαπαναγιώτου, 1999). Τα θερμόφιλα αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες από ο C και συναντώνται κυρίως στο έδαφος και σε ηφαιστειακές περιοχές. Ο μεταβολισμός τους και τα κύρια θρεπτικά συστατικά που χρειάζονται για την ανάπτυξη τους είναι τα ίδια με αυτά των μεσόφιλων οργανισμών (Αντωνιάδης, 2000, Παπαπαναγιώτου, 1999, Zeikus, 1979). Ανάλογα με το εύρος της θερμοκρασίας ανάπτυξης τους, οι θερμόφιλοι μικροοργανισμοί χωρίστηκαν αυθαίρετα σε τρείς κατηγορίες (Brock, 1985): «μέτρια θερμόφιλα» με βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης μεταξύ ο C, τα «ακραία θερμόφιλα» που μεγαλώνουν στους ο C, και τα «υπερθερμόφιλα» που μεγαλώνουν βέλτιστα σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες από 90 ο C. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

42 Καλλιέργειες Βακτηρίων Τρόποι ανάπτυξης μικροοργανισμών Επειδή υπάρχει μεγάλος συναγωνισμός στο χώρο της βιομηχανίας ο τρόπος ανάπτυξης των μικροοργανισμών σε μεγάλη κλίμακα δεν είναι λεπτομερώς γνωστός. Παρ όλες τις παραλλαγές που υπάρχουν, χρησιμοποιούνται δυο βασικές μέθοδοι ανάπτυξης μικροοργανισμών, η μέθοδος σε στερεά φάση (solid-state) και η μέθοδος καταβύθισης (sub-merged) (Κυριακίδης, 2002). Η μέθοδος ανάπτυξης των μικροοργανισμών σε στερεά φάση αναφέρεται στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών σε στερεά υλικά με υγρασία μεταξύ των πόρων του στερεού υλικού αλλά χωρίς την παρουσία ελεύθερης υγρής φάσης. Το στερεό υλικό είναι τοποθετημένο σε μεγάλους δίσκους που μπορούν να αερίζονται διαβιβάζοντας αποστειρωμένο τον υγρό αέρα. Το όλο σύστημα περιστρέφεται, ώστε να επιτυγχάνεται η ανάμιξη του αέρα ανάμεσα στους δίσκους και ο έλεγχος της θερμοκρασίας. Ο εμβολιασμός της καλλιέργειας, η ανάπτυξη και η συλλογή γίνονται αυτόματα (Κυριακίδης, 2002). Η μέθοδος καταβύθισης περιλαμβάνει δοχεία καλλιέργειας (ζυμωτήρες) χωρητικότητας από m 3 που αποτελούνται από τον αναδευτήρα στο κέντρο του δοχείου, το υγρό ανάπτυξης και τις μικροσωληνώσεις για την εισαγωγή του αποστειρωμένου αέρα (Σχήμα 1.3). Το πρώτο στάδιο της ανάπτυξης των μικροοργανισμών είναι η ανάπτυξη των κυττάρων της αρχικής καλλιέργειας (stock) σε κωνικές φιάλες. Στη συνέχεια το περιεχόμενο της κωνικής φιάλης εμβολιάζεται σε μικρό δοχείο με το κατάλληλο θρεπτικό υλικό. Στο δοχείο αυτό αναπτύσσονται τα κύτταρα μέχρι το επιθυμητό επίπεδο με την κατάλληλη ανάδευση και παροχή οξυγόνου και ακολούθως προσθέτονται στο μεγάλο δοχείο καλλιέργειας. Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, το θρεπτικό υλικό με τα κύτταρα αναδεύεται συνεχώς, τροφοδοτείται με οξυγόνο και ελέγχεται το ph του και η θερμοκρασία του. Από την καλλιέργεια λαμβάνονται δείγματα κατά την πορεία ανάπτυξης των μικροοργανισμών, για τον έλεγχο της σύστασης του υγρού της καλλιέργειας, καθώς και ο τύπος των μικροοργανισμών που αναπτύσσονται. Για την καλύτερη απόδοση παραγωγής βιομάζας ή ενζύμων από τα εκχυλίσματα κυττάρων, απαραίτητο είναι να βρεθούν οι βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας του μικροοργανισμού (Κυριακίδης, 2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

43 Καλλιέργειες Βακτηρίων 8 Σχήμα 1.3 Διάταξη δοχείου καλλιέργειας α: αναβίωση, β: ανασπορά (Κυριακίδης, 2002). 1.3 Μικροβιακά μέσα ανάπτυξης Τα μέσα ανάπτυξης που χρησιμοποιούνται στις βιοεφαρμογές μπορούν να χωριστούν σε τρείς κατηγορίες βάση της σύνθεσης τους: τα συνθετικά, τα ημισυνθετικά και τα σύνθετα (McNeil and Harvey, 2008) Συνθετικά μέσα ανάπτυξης Τα συνθετικά μέσα ανάπτυξης είναι ως πλήρως χημικά ορισμένα. Όλα τα συστατικά του είναι γνωστά, καθώς και η συγκεκριμένη συγκέντρωση του κάθε στοιχείου. Τέτοια μέσα ανάπτυξης είναι συνήθως πολύ απλά και περιέχουν μια πηγή άνθρακα / ενέργειας, μια πηγή αζώτου και μια σειρά αλάτων (συνήθως ανόργανα). Ωστόσο, εάν το επιλεγμένο κύτταρο έχει σύνθετες τροφικές ανάγκες και / ή έχει συγκεκριμένες απαιτήσεις ανάπτυξης, η πολυπλοκότητα του συνθετικού μέσου ανάπτυξης μπορεί να αυξηθεί σημαντικά (McNeil and Harvey, 2008). Τα συνθετικά μέσα ανάπτυξης είναι χρήσιμα στην έρευνα και σε κατάσταση εργαστηρίου, όπου η εργαστηριακή ακρίβεια είναι σημαντική και η ερμηνεία των αποτελεσμάτων πρέπει να είναι ξεκάθαρη. Γενικά, αυτού του είδους μέσα ανάπτυξης είναι πολύ πιο ακριβά από άλλα είδη μέσα ανάπτυξης, ειδικά αν χρειάζονται συγκεκριμένα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

44 Καλλιέργειες Βακτηρίων 9 συστατικά όπως βιταμίνες και αυξητικοί παράγοντες, καθώς αυτά τα συστατικά είναι πολύ ακριβά όταν παρέχονται στην καθαρή τους μορφή. Η απόδοση των κυττάρων τείνει να είναι πολύ μικρότερη σε σχέση με όταν τα κύτταρα είχαν αναπτυχθεί σε ημισυνθετικό ή σύνθετο μέσο ανάπτυξης, καθώς το συνθετικό μέσο ανάπτυξης δεν ανταποκρίνεται πλήρως στις ανάγκες ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Παρόλα αυτά, είναι πιο εύκολο να εξετάσει κανείς τις επιπτώσεις ενός θρεπτικού συστατικού στην ανάπτυξη του κυττάρου και τη φυσιολογία του, χρησιμοποιώντας αυτό του είδους μέσου ανάπτυξης από ένα πιο σύνθετο (McNeil and Harvey, 2008) Ημισυνθετικά μέσα ανάπτυξης Τα ημισυνθετικά μέσα ανάπτυξης είναι σε μεγαλύτερο βαθμό χημικά ορισμένα, όπως προηγουμένως, αλλά περιέχουν ένα ή περισσότερα ανεπαρκώς προσδιορισμένα μεταβλητά συστατικά αλλά ελεγχόμενης σύστασης. Για παράδειγμα, το εκχύλισμα μαγιάς το οποίο είναι αρκετά χρήσιμο για την ανάπτυξη των κυττάρων που χρειάζονται μία σειρά από βιταμίνες Β. Τέτοιου είδους μέσα ανάπτυξης είναι χρήσιμα στην έρευνα και σε εργαστηριακή κλίμακα, όπου ένας συγκεκριμένος οργανισμός έχει ανάγκες για ένα συστατικό το οποίο είναι πολύ ακριβό στην καθαρή του μορφή. Τέτοιου είδους συστατικά είναι επίσης χρήσιμα όταν οι συγκεκριμένες διατροφικές ανάγκες του κυττάρου δεν είναι γνωστές και μία πλούσια πηγή πολλών θρεπτικών συστατικών όπως είναι το εκχύλισμα μαγιάς χρησιμοποιείται προσεγγιστικά για τον εφοδιασμό δευτερευόντων θρεπτικών συστατικών (McNeil and Harvey, 2008). Η χρήση του ημισυνθετικού μέσου ανάπτυξης μπορεί να επηρεάσει τις αναλύσεις που χρειάζονται για την παρακολούθηση της διαδικασίας ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας ένα συστατικό, όπως είναι το εκχύλισμα μαγιάς, για την τροφοδοσία βιταμινών στο κύτταρο, σημαίνει ότι για μια απλή ανάλυση ρουτίνας όπως είναι η μέτρηση της συγκέντρωσης του αζώτου στο μέσο ανάπτυξης, γίνεται πιο πολύπλοκη, καθώς το εκχύλισμα μαγιάς περιέχει σύνθετες πηγές αζώτου. Συνεπώς, χρειάζεται να γίνουν επιπρόσθετες αναλύσεις για τον προσδιορισμό του συνολικού διαθέσιμου αζώτου στα κύτταρα (McNeil and Harvey, 2008) Σύνθετα μέσα ανάπτυξης Τα σύνθετα μέσα ανάπτυξης αποτελούνται σε μεγάλο βαθμό από συστατικά που συνήθως προέρχονται από φυτά και ζώα και που η ακριβής του σύσταση δεν είναι ορισμένη. Τα υλικά αυτά ποικίλουν από παραγωγή σε παραγωγή και η σύσταση τους ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

45 Καλλιέργειες Βακτηρίων 10 επηρεάζεται από την εποχή του χρόνου, τον τόπο προέλευσης και μικρές αλλαγές στη μέθοδο παραγωγής τους. Συνήθως είναι σχετικά φτηνά, μπορούν να προμηθεύονται σε μη συσκευασμένη μορφή και η προέλευση τους μπορεί να παραμένει αξιόπιστη. Συστατικά όπως μελάσες από ζαχαρότευτλα και ζαχαροκάλαμα, εκχύλισμα καλαμποκιού, τυρόγαλα σε σκόνη και μια σειρά από πολλών διαφορετικών λαδιών, όλα ανήκουν σε αυτή την κατηγορία υλικών. Τα σύνθετα μέσα ανάπτυξης, χρησιμοποιούνται σε πολλές βιοτεχνολογικές διεργασίες, ειδικά σε αυτές που παράγουν μεγάλους όγκους χαμηλής αξίας προϊόντα, όπως είναι οι μονοκυτταρικές πρωτεΐνες (μαγειρική μαγιά) (McNeil and Harvey, 2008). 1.4 Διατροφικά στοιχεία Η διατροφή έχει ως σκοπό την παροχή των απαραίτητων θρεπτικών συστατικών που χρησιμοποιούν τα βακτήρια, αφενός για την παραγωγή ενέργειας, αφετέρου για τη σύνθεση των κυτταρικών πολυμερών (Αντωνιάδης, 2000). Ως πηγές ενέργειας μπορούν να χρησιμοποιηθούν η ηλιακή ενέργεια, οργανικές ή ανόργανες ενώσεις, ενώ για τη σύνθεση των κυτταρικών πολυμερών είναι απαραίτητη η παρουσία ανθρακούχων ενώσεων. Είναι δυνατόν η ίδια η ουσία, π.χ. η γλυκόζη, να χρησιμοποιηθεί ως πηγή άνθρακα και ενέργειας. Ανάλογα με την πηγή άνθρακα και ενέργειας, τα βακτήρια κατατάσσονται στις ακόλουθες κατηγορίες (Αντωνιάδης, 2000): Τα αυτότροφα, τα οποία για τη σύνθεση οργανικών ενώσεων χρησιμοποιούν το CO 2. Εάν το ηλιακό φως χρησιμεύει για παροχή ενέργειας, ονομάζονται φωτοαυτότροφα ή φωτοσυνθετικά, ενώ εάν προμηθεύονται ενέργεια από την οξείδωση ανόργανων ουσιών ονομάζονται χημειοαυτότροφα ή χημειοσυνθετικά. Τα ετερότροφα, τα οποία χρησιμοποιούν ως πηγή άνθρακα οργανικές ενώσεις. Εάν χρησιμοποιούν ηλιακή ενέργεια ονομάζονται φωτοετερότροφα. Χημειοετερότροφα ονομάζονται όταν οι οργανικές ενώσεις χρησιμεύουν ως πηγή ενέργειας. Για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών, εκτός από τον άνθρακα, είναι απαραίτητο το Ν 2, το S, το P, διάφορα άλατα όπως Ca, Fe, Mg και οι φυσικοί παράγοντες (οξυγόνο, θερμοκρασία). Τα περισσότερα βακτήρια έχουν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε θρεπτικά υλικά που περιέχουν ανόργανα άλατα και μια μόνο οργανική ένωση (σάκχαρα ή αμινοξέα) ως πηγή άνθρακα και ενέργειας (Αντωνιάδης, 2000). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

46 Καλλιέργειες Βακτηρίων 11 Το άζωτο, είναι απαραίτητο συστατικό των θρεπτικών υλικών, καθώς πολλά κυτταρικά συστατικά και κυρίως οι πρωτεΐνες και τα νουκλεϊνικά οξέα περιέχουν άζωτο. Υπολογίζεται ότι το άζωτο αποτελεί το 10% του ξηρού βάρους των κυττάρων του βακτηρίου. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιούνται κυρίως αμινοξέα ή άζωτο σε ανόργανη μορφή όπως νιτρικά και ΝΗ 3 (Αντωνιάδης, 2000). Το θείο αποτελεί συστατικό πολλών οργανικών ουσιών του κυττάρου. Το μεγαλύτερο μέρος του ανευρίσκεται στη μορφή σουλφυδρικών ομάδων (SH) στις πρωτεΐνες (αμινοξέα: κυστεΐνη και μεθειονίνη). Ως πηγή θείου χρησιμεύουν κυρίως τα ανόργανα θειικά άλατα (Αντωνιάδης, 2000). Ο φώσφορος αποτελεί συστατικό του DNA, του RNA, του ΑΤΡ και των συνενζύμων όπως των πυριδινονουκλεοτιδίων (NAD, NADP) και των φλαβινονουκλεοτιδίων (FMN, FAD). Ως πηγή φωσφόρου χρησιμεύουν μόνο ανόργανα φωσφορικά άλατα (Αντωνιάδης, 2000). Η παρουσία των κατιόντων είναι απαραίτητη για τη δράση διαφόρων ενζυμικών συστατικών. Επιπλέον ορισμένα κατιόντα υπεισέρχονται στη δομή διαφόρων ουσιών που παίζουν ουσιαστικό ρόλο στη λειτουργία του κυττάρου. Ο Fe π.χ., είναι ενσωματωμένος στο μόριο των κυττοχρωμάτων, της κατάλυσης και της υπεροξειδάσης, το Mg βρίσκεται στο μόριο της χλωροφύλλης κ.α. Γενικά ως συστατικά θρεπτικών υλικών για την ανάπτυξη των περισσότερων μικροοργανισμών απαιτούνται ανόργανα άλατα όπως Κ, Mg, Ca και Fe (Αντωνιάδης, 2000) Πηγές άνθρακα Η πηγή άνθρακα είναι απαραίτητη για τον εφοδιασμό των κυττάρων με ενέργεια, καθώς και των υλικών με τα οποία μεγαλώνουν και είναι απαραίτητα για τη σύνθεση πρωτογενών και δευτερογενών μεταβολιτών. Η καλύτερη πηγή ενέργειας εξαρτάται από τον τύπο του οργανισμού που χρησιμοποιείται (π.χ. αυτότροφα ή ετερότροφα) (McNeil and Harvey, 2008). Προφανώς υπάρχει ένα μεγάλο εύρος πηγών άνθρακα και αυτός που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί θα πρέπει να είναι κατάλληλος για το μικροοργανισμό αλλά και οικονομικός ως προς τη διεργασία. Ένας τυπικός μικροοργανισμός αποτελείται περίπου από 50% άνθρακα, κάνοντας τον άνθρακα το πιο σημαντικό υπόστρωμα. Έτσι θα πρέπει η συγκέντρωση του άνθρακα να μη βρίσκεται σε έλλειψη για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού (McNeil and Harvey, 2008). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

47 Καλλιέργειες Βακτηρίων 12 Η μεγάλη πλειοψηφία των εργαστηριακών και των βιομηχανικών ζυμώσεων τείνουν να χρησιμοποιούν μια περιορισμένη ποικιλία υποστρωμάτων για την παροχή ενέργειας και άνθρακα που χρειάζονται οι καλλιέργειες. Αυτό δε σημαίνει ότι άλλες πηγές άνθρακα και ενέργειας δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν, απλώς ότι η περιορισμένη ποικιλία είναι συνήθως διαθέσιμη και μέθοδοι για την προετοιμασία και την ανάλυση των ρυθμών κατανάλωσης αυτών των υποστρωμάτων είναι καλά κατανοητά. Κάποιες ευρέως χρησιμοποιημένες πηγές άνθρακα και ενέργειας αναφέρονται στην συνέχεια (McNeil and Harvey, 2008). Γλυκόζη Η γλυκόζη είναι παγκοσμίως αποδεκτή για την ανάπτυξη της κυτταρικής σειράς, από τα ζώα, τα φυτά και τα μικρόβια. Προμηθεύεται σε μορφή σκόνης στην καθαρή της μορφή, το υπόστρωμα είναι εύκολα διαθέσιμο, αξιόπιστο, αποθηκεύεται και χειρίζεται εύκολα και δεν έχει καμία σοβαρή επίπτωση στην υγεία και στην ασφάλεια. Αυτά τα προσόντα κάνουν τη γλυκόζη μια δημοφιλή επιλογή για πηγή άνθρακα. Υπάρχουν όμως κάποια ελαττώματα στη χρήση της γλυκόζης τα οποία είναι: Η πιθανότητα ο οργανισμός να υποφέρει από την επίδραση Crabtree (Crabtree effect) εάν υπερτροφοδοτηθεί με γλυκόζη το αρχικό στάδιο ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Η απώλεια του διαθέσιμου υποστρώματος στις αντιδράσεις Maillard, το οποίο μπορεί να συμβεί εάν η γλυκόζη αποστειρωθεί μαζί με κάποια πηγή αζώτου. Οι δυο αυτές περιπτώσεις μπορούν να ξεπεραστούν εύκολα με τον προσεκτικό έλεγχο της τροφοδοσίας της γλυκόζης για την πρώτη περίπτωση και είτε με τη γνωστή αποστείρωση των υποστρωμάτων για τη δεύτερη περίπτωση. (McNeil and Harvey, 2008). Σουκρόζη Συχνά, το ζάχαρο που επιλέγεται στα ερευνητικά εργαστήρια είναι η σουκρόζη, η οποία χρησιμοποιείται από πολλά αλλά όχι από όλα τα κύτταρα. Εμπορικά η σουκρόζη διατίθεται σε πολλές μορφές και βαθμούς, από μορφή καθαρών κόκκων μέχρι σύνθετα διαλύματα μελασών. Η σουκρόζη δεν έχει τα ελαττώματα που παρουσιάζει η γλυκόζη, παρόλο που μπορεί να καραμελωθεί κατά τη διάρκεια της αποστείρωσης, γενικά όμως μπορεί να αποστειρωθεί μαζί με ενώσεις αζώτου χωρίς να έχει τα ίδια προβλήματα όπως η γλυκόζη (McNeil and Harvey, 2008). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

48 Καλλιέργειες Βακτηρίων 13 Λακτόζη Η λακτόζη μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο από λίγα είδη κυττάρων και συνήθως μεταβολίζεται πάρα πολύ αργά. Το ζάχαρο αυτό είναι χρήσιμο μόνο σε μερικές εμπορικές διεργασίες που χρησιμοποιούν το σύνθετο υπόστρωμα τυρόγαλο, ένα υποπροϊόν γαλακτοκομικής βιομηχανίας, το οποίο περιέχει και λακτόζη (περίπου 50 g λακτόζης ανά λίτρο τυρόγαλου και 4% w/w άζωτο) (McNeil and Harvey, 2008). Λάδια Ένας αριθμός λαδιών χρησιμοποιούνται ως πηγές άνθρακα στις βιοδιεργασίες της βιομηχανίας. Το κραμβέλαιο και ο ελαϊκός μεθυλεστέρας είναι δύο δημοφιλείς επιλογές. Αντιπροσωπεύοντας ταυτόχρονα πηγή ενέργειας και άνθρακα, τα λάδια είναι οικονομικά και εύκολα διαθέσιμα. Ένα επιπρόσθετο πλεονέκτημα της χρήσης του λαδιού είναι ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν αντιαφριστικό, αποφεύγοντας έτσι τη χρήση αντιαφριστικών που πιθανών μπορεί να εμπλακούν στην όλη διεργασία. (McNeil and Harvey, 2008) Πηγές αζώτου Η ποσότητα του αζώτου σε κάθε μέσο ανάπτυξης καθορίζει την ποσότητα της βιομάζας που μπορεί να επιτευχθεί από τα συγκεκριμένα κύτταρα, με την προϋπόθεση ότι αρκετός άνθρακας είναι διαθέσιμος και όλα τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά υπάρχουν στο αρχικό μέσο ανάπτυξης. Κάποιες τυπικές πηγές αζώτου περιγράφονται παρακάτω. (McNeil and Harvey, 2008). Αμμωνία Η αμμωνία συνήθως χρησιμοποιείται στις βιομηχανικές διεργασίες και όχι τόσο συχνά σε ερευνητικά εργαστήρια, λόγω της μεταβλητότητας του υγρού και τα προβλήματα χειρισμού του. Με αυτή την πηγή αζώτου υπάρχουν επίσης θέματα υγείας και ασφάλειας και έτσι πρέπει να υπάρχει ειδικός εξοπλισμός και χώρος αποθήκευσής του. Επίσης θα πρέπει να παρθούν κάποια μέτρα ασφαλείας για την περίπτωση διαρροής της αμμωνίας (McNeil and Harvey, 2008). Άλατα με βάση το άζωτο Το θειικό αμμώνιο ((NH 4 ) 2 SO 4 ) και το χλωριούχο αμμώνιο (NH 4 Cl) είναι οι πιο κοινές πηγές αζώτου που απαντώνται στη βιβλιογραφία. Το αμμώνιο αξιοποιείται από πολλούς οργανισμούς και η χρήση του άλατος είναι μια φτηνή και βολική μέθοδος για την παροχή ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

49 Καλλιέργειες Βακτηρίων 14 του κυττάρου με αυτό που χρειάζεται. Επιπλέον, είναι εύκολο να υπολογιστή η ακριβής ποσότητα του αζώτου που προμηθεύεται στα κύτταρα (McNeil and Harvey, 2008). Σύνθετες πηγές αζώτου Υπάρχει ένας αριθμός σύνθετων πηγών αζώτου που είναι διαθέσιμοι, όπως είναι το εκχύλισμα ζύμης και το εκχύλισμα καλαμποκιού. Όλα παρέχουν ικανοποιητικές ποσότητες αζώτου μαζί με άλλα σημαντικά θρεπτικά συστατικά όπως είναι ο άνθρακας, οι βιταμίνες και ανόργανα υλικά (McNeil and Harvey, 2008) Άλλα υποστρώματα Υπάρχουν αρκετά συστατικά τα οποία είναι ουσιαστικά για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Το κάθε ένα πρέπει να παρέχεται, γενικά στην μορφή ανόργανων αλάτων, έτσι ώστε τα κύτταρα να μεγαλώσουν και να λειτουργούν σωστά (McNeil and Harvey, 2008; Asenjo et al., 1995). Ασβέστιο: Χρειάζεται για να σταθεροποιήσει το κυτταρικό τοίχωμα και είναι πολύ σημαντικό εάν τα κύτταρα σχηματίζουν ενδοσπόρια. Μαγνήσιο: Δρα συνήθως ως συνένζυμο για τη δραστικότητα των ενζύμων, μπορεί επίσης να παίξει ρόλο στο σχηματισμό της κυτταρικής μεμβράνης και στη λειτουργία της. Επίσης, θεωρείται απαραίτητη για το διπλασιασμό των κυττάρων εφόσον βοηθά στη σταθερότητα των ριβοσωμάτων και ελέγχει τη διαπερατότητα των θρεπτικών συστατικών από τις κυτταρικές μεμβράνες Φώσφορος: Χρειάζεται για την παραγωγή φωσφορολιπιδίων, νουκλεϊκών οξέων και στην παραγωγή ενέργειας. Κάλιο: Εμπλέκεται σε πολλές αντιδράσεις μεταξύ των κυττάρων και χρειάζεται από όλα τα κύτταρα μικροβιακά ή ζώων. Νάτριο: Λίγα είναι τα είδη που χρειάζονται το νάτριο, όπως είναι τα θαλάσσια είδη. Ωστόσο, πολλά κύτταρα δεν χρειάζονται αυτό το στοιχείο. Θείο: Χρειάζεται για τη σύνθεση αμινοξέων, για την παραγωγή κάποιων βιταμινών και για τη λειτουργιά συνενζύμων σε αρκετά αλλά όχι όλα τα κύτταρα Ιχνοστοιχεία Τα ιχνοστοιχεία θεωρούνται ως μικροθρεπτικά συστατικά και χρειάζονται μόνο σε πολύ μικρές ποσότητες, συνήθως ποσότητες μg ανά λίτρο καλλιέργειας. Οι λειτουργίες ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

50 Καλλιέργειες Βακτηρίων 15 των ιχνοστοιχείων μέσα στο κύτταρο είναι πολλές και ποικίλουν αλλά συνήθως συνδέονται με τη δραστικότητα των ενζύμων, όπου τα ιχνοστοιχεία σχηματίζουν μέρη των ενζύμων ή λειτουργούν ως καταλύτες για τις βιοχημικές αντιδράσεις όπου εμπλέκονται τα ένζυμα. Μερικά ιχνοστοιχεία που συνήθως χρησιμοποιούνται είναι ο σίδηρος (Fe, πιθανώς το πιο σημαντικό στοιχείο, λαμβάνοντας υπόψη το ρόλο του στην κυτταρική αναπνοή), ο χαλκός (Cu), το κοβάλτιο (Co), το μαγγάνιο (Mn), το μολυβδαίνιο (Mo), το χρώμιο (Cr, στα κύτταρα των ζώων μόνο) κ.α. (McNeil and Harvey, 2008). 1.5 Αερισμός Η παρουσία του οξυγόνου είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των αυστηρώς αερόβιων μικροοργανισμών, ενώ η απουσία του είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των αυστηρώς αναερόβιων μικροοργανισμών. Ειδικότερα, με βάση τις απαιτήσεις τους σε οξυγόνο για την επιβίωση τους και τον πολλαπλασιασμό τους, αυτά διακρίνονται σε 4 κατηγορίες: Στα υποχρεωτικώς αερόβια, τα οποία απαραιτήτως χρειάζονται οξυγόνο ως δέκτη υδρογόνου. Δέκτης υδρογόνου ονομάζεται η ουσία η οποία οξειδώνεται. Χωρίς οξυγόνο τα βακτήρια αυτά δεν αναπτύσσονται. Στα δυνητικώς αναερόβια, τα οποία έχουν τη δυνατότητα να αναπτυχθούν είτε παρουσία οξυγόνου είτε απουσία οξυγόνου. Στα μικροαερόφιλα, τα οποία αναπτύσσονται καλύτερα σε ελαττωμένη πίεση οξυγόνου και Στα υποχρεωτικώς αναερόβια, τα οποία δεν αναπτύσσονται παρουσία οξυγόνου. Αυτά αντί του οξυγόνου χρησιμοποιούν ανόργανες ουσίες ως δέκτη υδρογόνου. Τα αερόβια βακτήρια χρησιμοποιούν το οξυγόνο ως τελικό δέκτη των ηλεκτρονίων που παράγονται στο μεταβολισμό. Αντίθετα τα αναερόβια για τον πιο πάνω σκοπό χρησιμοποιούν οργανικές ενώσεις. Επιπροσθέτως, το οξυγόνο προκαλεί τη δημιουργία τοξικών προϊόντων (Αντωνιάδης, 2000). Η τοξικότητα του οξυγόνου οφείλεται στην αναγωγή του από τα ένζυμα του βακτηρίου (ως οι φλαβοπρωτεΐνες) σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) και από τα ιόντα σιδήρου στο σχηματισμό τοξικών ελεύθερων ριζών οξυγόνου σε υπεροξειδική μορφή (Ο - 2 ). Τα αερόβια και τα προαιρετικά αναερόβια προφυλάσσονται από τη δράση των προϊόντων ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

51 Καλλιέργειες Βακτηρίων 16 αυτών από την παρουσία ενζύμου, της υπεροξειδικής δισμουτάσης, το οποίο καταλύει την αντίδραση [1.2]: 2Ο + 2Η Ο +Η Ο [1.2] και από την παρουσία άλλου ενζύμου της καταλάσης, το οποίο καταλύει την αντίδραση [1.3]: 2ΗΟ 2 2 2ΗΟ+Ο 2 2 [1.3] Τα αυστηρώς αναερόβια βακτήρια στερούνται των ενζύμων αυτών. Ιδιαίτερα το ένζυμο υπεροξειδική δισμουτάση είναι απαραίτητο για την επιβίωση των μικροβίων παρουσία οξυγόνου. Κατά την καλλιέργεια αερόβιων βακτηρίων, πρέπει να προβλέπεται ο ελεύθερος αερισμός της καλλιέργειας. Αυτό κατορθώνεται με την καλλιέργεια σε δοχεία, τα οποία έχουν μεγάλη επιφάνεια θρεπτικού υλικού, με μηχανική συνεχή ανατάραξη, και τέλος με την συνεχή τροφοδοσία αέρος στην καλλιέργεια (Αντωνιάδης, 2000). Μια ταχέως αυξανόμενη καλλιέργεια έχει πολύ μεγάλη απαίτηση για οξυγόνο. Υπάρχει δηλαδή μεγαλύτερη απαίτηση για διαλυμένο οξυγόνο. Το αέριο οξυγόνο θα πρέπει να διαλύεται στο υγρό καλλιέργειας, έτσι ώστε να αλληλεπιδρά με το μεμβρανικό σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων και να επηρεάζει την οξείδωση των ανοιγμένων συνενζύμων. Το πρωταρχικό πρόβλημα για την παροχή του οξυγόνου είναι ότι το οξυγόνο είναι πολύ αδιάλυτο σε υδατικά συστήματα. Θα πρέπει να σημειωθεί επίσης ότι καθώς η θερμοκρασία αυξάνεται, η διαλυτότητα του οξυγόνου ελαττώνεται. Η διαλυτότητα του οξυγόνου επίσης ελαττώνεται καθώς η συγκέντρωση των διαφόρων διαλυμένων μεταβολιτών αυξάνεται. Πάντως, η διαλυτότητα του οξυγόνου στο υγρό καλλιέργειας μπορεί να αυξηθεί, αυξάνοντας την πίεση του στην αέρια φάση. Ένα δεύτερο πρόβλημα είναι ότι σε πολλές ζυμώσεις, ειδικά σε αυτές που περιλαμβάνουν καλλιέργειες νηματοειδών μικροοργανισμών όπως είναι οι μύκητες ή οι ακτινομύκητες, το υγρό ανάπτυξης γίνεται αρκετά ιξώδες, οπότε ο παράγοντας που ελέγχει τη διαδικασία είναι η μεταφορά του διαλυμένου οξυγόνου από το υγρό στα κύτταρα και όχι η μεταφορά του οξυγόνου από την αέρια στην υγρή φάση (Κυριακίδης, 2002). Για τις μικρές καλλιέργειες (λιγότερο από ένα λίτρο), είναι δυνατό να χορηγηθούν ικανοποιητικά ποσά οξυγόνου αναπτύσσοντας τους μικροοργανισμούς σε φιάλες με ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

52 Καλλιέργειες Βακτηρίων 17 συνεχή ανακίνηση. Για μεγάλης κλίμακας καλλιέργειας με υψηλή απόδοση σε κύτταρα, η απαίτηση σε οξυγόνο μπορεί να καλυφθεί μόνο με διαβίβαση οξυγόνου μέσω του υγρού καλλιέργειας. Η αποτελεσματικότητα με την οποία το οξυγόνο μεταφέρεται από τις φυσαλίδες αέρος στην υγρή φάση εξαρτάται από το χρόνο παραμονής και το μέγεθος των φυσαλίδων στο υγρό ανάπτυξης και από τον τρόπο που αναπτύσσεται η καλλιέργεια π.χ. σε ζυμωτήρα ή όχι. (Κυριακίδης, 2002). Αντιθέτως, στις καλλιέργειες των αναερόβιων βακτηρίων πρέπει να αποκλεισθεί το οξυγόνο από την καλλιέργεια, διότι για την ανάπτυξη των αναερόβιων τα θρεπτικά υλικά πρέπει να έχουν χαμηλό οξειδοαναγωγικό δυναμικό (Eh < 0.1 V). Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για να επιτευχθεί αυτό είναι αρκετές, όπως η προσθήκη αναγωγικών ουσιών στο θρεπτικό υλικό (όπως γλυκόζη, θειογλυκονικό νάτριο, ασκορβικό οξύ), η τοποθέτηση των δοχείων της καλλιέργειας σε φιάλες, από το εσωτερικό των οποίων αφαιρείται το οξυγόνο με χημικά μέσα (πυρογαλόλη) ή εκκενώνεται και αντικαθίσταται με αδρανή αέριο (υδρογόνο). Τέλος, με καλλιέργεια σε υψηλή στήλη θρεπτικού υλικού του οποίου η ελεύθερη επιφάνεια καλύπτεται με παραφίνη (Παπαπαναγιώτου, 1999). 1.6 Βιοαντιδραστήρες Κύριο μέρος της βιομηχανίας των μικροοργανισμών αποτελούν οι ζυμώσεις, δηλαδή οι διεργασίες που περιλαμβάνουν την ανάπτυξη των μικροοργανισμών σε ένα θρεπτικό περιβάλλον με σκοπό την παραγωγή χρήσιμων προϊόντων (Κυριακίδης, 2002). Η ζύμωση είναι μια πράξη γνωστή από την αρχαιότητα, που χρονολογείται πολλές χιλιετίες πριν. Πρόσφατα, οι εφαρμογές της ζύμωσης έχουν εξελιχθεί για την παραγωγή ενός εύρους υλικών από απλές χημικές πρώτες ύλες, όπως η αιθανόλη, μέχρι σύνθετες πρωτεϊνικές δομές. Η προέλευση της ζύμωσης έχει χαθεί με το πέρασμα του χρόνου. Είναι γνωστό ότι οι αρχαίοι Αιγύπτιοι και οι Σουμέριοι είχαν τη γνώση της τεχνικής για να μετατρέψουν αμυλούχους κόκκους σε αλκοόλ. Αυτή η εφαρμογή ή παρόμοιες που βασίζονται στη μετατροπή των χυμών των φρούτων, για την ιστορία αποτελούν την πιο κοινή και αποδεκτή ερμηνεία της λέξης «ζύμωση». Ωστόσο, η «ζύμωση» έχει πολλές διαφορετικές και ξεχωριστές ερμηνείες για διαφορετικές ομάδες ατόμων. Στο παρόν κείμενο με τη λέξη ζύμωση θα εννοείται η χρήση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

53 Καλλιέργειες Βακτηρίων 18 μίας υγρής καλλιέργειας ενός είδους μικροοργανισμού, φυτού ή κύτταρα ζώων, για την παραγωγή κάποιων χρήσιμων προϊόντων (McNeil and Harvey, 2008). Το υλικό που τροφοδοτείται στο δοχείο ζύμωσης ονομάζεται υπόστρωμα και αποτελεί για τους μικροοργανισμούς τη τροφή που χρειάζεται για να αναπτυχθούν και να παράγουν τα τελικά προϊόντα. Οι βιοαντιδραστήρες είναι οι κατασκευές στις οποίες γίνονται βιομηχανικές διεργασίες υλικών με τη δράση είτε ζωντανών κυττάρων ή ενζύμων. Γενικά υπάρχουν δυο είδη βιοαντιδραστήρων, αυτοί όπου γίνονται ζυμώσεις με ζωντανά κύτταρα και αυτοί που γίνονται διεργασίες με χρήση βιολογικών συστημάτων π.χ. ενζύμων. (Κυριακίδης, 2002). Στους βιοαντιδραστήρες ζυμώσεων που συχνά αποκαλούνται και ζυμωτήρες, επιδιώκεται η ανάπτυξη των κυττάρων ή διατηρούνται τέτοιες οι συνθήκες ώστε να σχηματίζονται τα επιθυμητά προϊόντα (π.χ. αντιβιοτικά, αλκοόλη, οξικό οξύ) ή βιομάζα (πρωτεΐνες μονοκυττάρων, κύτταρα ζύμης κλπ.) ή να γίνεται μετατροπή υποστρωμάτων (π.χ. στεροειδών). Στους βιοαντιδραστήρες ενζύμων, η μετατροπή του υποστρώματος επιτυγχάνεται χωρίς να είναι απαραίτητη η ακεραιότητα των κυττάρων. Συνήθως στους αντιδραστήρες αυτούς χρησιμοποιούνται καθηλωμένα ένζυμα. Για τα προϊόντα βιοτεχνολογίας όπως είναι τα αντιβιοτικά, οι ορμόνες, τα εμβόλια, οι αλκοόλες, τα ένζυμα κλπ., ο ρόλος του βιοαντιδραστήρα είναι πολύ σημαντικός αφού αυτός είναι ο συνδετικός κρίκος μεταξύ πρώτων υλών και προϊόντων. Στο Σχήμα 1.4 παρουσιάζεται μια τυπική αερόβια διεργασία όπου ο βιοαντιδραστήρας είναι το κεντρικό στοιχείο μιας τέτοιας διεργασίας. (Κυριακίδης, 2002). Δεν πρέπει βέβαια να υποτιμήσουμε το ρόλο των υπολοίπων συσκευών που εμφανίζονται στο Σχήμα, ειδικά για της διεργασίες που περιλαμβάνουν τη χρήση βιολογικών συστημάτων όπου ο ρόλος των υπολοίπων συσκευών (π.χ. ρύθμισης ή αποστείρωσης) είναι εξίσου σημαντικός (Κυριακίδης, 2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

54 Καλλιέργειες Βακτηρίων 19 Αποθήκη πρώτων υλών Σύστημα Ρύθμισης Ενέργεια Προετοιμασία πρώτων υλών Αποστείρωση Βιοαντιδραστήρας Καθαρισμός επιθυμητών προϊόντων Προϊόντα Αέρας Συμπίεση Αποστείρωση Θερμότητα Απόβλητα Σχήμα 1.4 Διάγραμμα τυπικής αερόβιας διεργασίας (Κυριακίδης, 2002) Είδη βιοαντιδραστήρων Η ταξινόμηση των βιοαντιδραστήρων σε κατηγορίες μπορεί να γίνει με τα ακόλουθα κριτήρια: τον τρόπο λειτουργίας τους τον αριθμό των φάσεων που συνυπάρχουν στον αντιδραστήρα τα πρότυπα ροής και ανάμειξης το είδος του βιοκαταλύτη που χρησιμοποιείται και τον τρόπο εισαγωγής και διατήρησης του βιοκαταλύτη μέσα στο χώρο της αντίδρασης. Με βάση το πρώτο κριτήριο οι βιοαντιδραστήρες μπορούν να χαρακτηριστούν ως ασυνεχούς, ημισυνεχούς και συνεχούς λειτουργίας. Στην περίπτωση ασυνεχούς λειτουργίας, τα αντιδρώντα τροφοδοτούνται αρχικά στον αντιδραστήρα και τα προϊόντα απομακρύνονται μόνο μετά το τέλος της αντίδρασης. Στην περίπτωση ημισυνεχούς λειτουργίας κάποιο από τα προϊόντα απομακρύνεται συνεχώς, ενώ η προσθήκη και η απομάκρυνση των υπολοίπων αντιδρώντων και προϊόντων γίνεται ασυνεχώς. Τέλος στην περίπτωση συνεχούς λειτουργίας η είσοδος των αντιδρώντων και η έξοδος των προϊόντων είναι συνεχής (Κυριακίδης, 2002). Με βάση το δεύτερο κριτήριο, τον αριθμό των φάσεων που συνυπάρχουν στον αντιδραστήρα, οι βιοαντιδραστήρες ταξινομούνται σε δυο κατηγορίες: τους ομογενείς και ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

55 Καλλιέργειες Βακτηρίων 20 τους ετερογενείς. Ως ομογενείς χαρακτηρίζονται οι βιοαντιδραστήρες όταν τα προϊόντα και τα αντιδρώντα εμφανίζονται μόνο σε μία φάση, ενώ ως ετερογενείς όταν συνυπάρχουν περισσότερες φάσεις μέσα στον αντιδραστήρα. Αυτή η τελευταία περίπτωση είναι και η πιο συνηθισμένη στην πράξη. Έτσι στην κλασσική περίπτωση ζύμωσης που σχεδιάστηκε στο Σχήμα 1.4 ο βιοαντιδραστήρας μπορεί να χαρακτηριστεί ως ένα σύστημα τριών φάσεων: Υγρή φάση, η οποία περιλαμβάνει άλατα, υποστρώματα και μεταβολίτες (δηλαδή τα υγρά προϊόντα της αντίδρασης και της αποικοδόμησης) Στερεή φάση που αποτελείται από μικροοργανισμούς και αδιάλυτα υποστρώματα. Αέρια φάση που είναι η πηγή οξυγόνου για το σύστημα και ο χώρος όπου συγκεντρώνονται τα αέρια προϊόντα της ζύμωσης. Με βάση το κριτήριο της πρότυπης ροής και ανάμειξης, οι βιοαντιδραστήρες διακρίνονται σε πλήρους ανάμειξης και εμβολικής ροής. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν εκείνοι οι αντιδραστήρες όπου συμβαίνει συνεχής και πλήρης ανάμειξη προϊόντων και πλήρης ανάμειξη προϊόντων και αντιδρώντων. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν εκείνοι οι αντιδραστήρες όπου τα στοιχεία του ρευστού κινούνται εμβολικά χωρίς να γίνεται ανάμειξη με ρευστό που προηγείται ή ακολουθείται (Κυριακίδης, 2002). Ενώ τα τρία πρώτα κριτήρια ταξινόμησης ισχύουν για όλα τα είδη αντιδραστήρων είτε αυτοί χρησιμοποιούνται σε βιολογικές διεργασίες είτε σε οποιεσδήποτε άλλες διεργασίες, τα τελευταία κριτήρια ταξινόμησης είναι χαρακτηριστικά των βιοαντιδραστήρων. Με βάση το είδος του βιοκαταλύτη που χρησιμοποιείται, οι βιοαντιδραστήρες μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κατηγορίες: εκείνους όπου οι βιοκαταλύτες είναι ανεξάρτητα ένζυμα και εκείνους όπου χρησιμοποιούνται ολόκληρα κύτταρα (μικροοργανισμοί). Πάντως και στη δεύτερη περίπτωση τα ένζυμα των μικροοργανισμών είναι αυτά που επιτελούν τις αντιδράσεις. Τέλος, το τελευταίο κριτήριο είναι εκείνο όπου οι βιοκαταλύτες μέσα στον αντιδραστήρα μπορεί να βρίσκονται κάτω από διαφορετικές συνθήκες κίνησης και ανάπτυξης. Τα ένζυμα δηλαδή μπορεί να είναι ακινητοποιημένα. Επίσης, τα κύτταρα μπορεί να βρίσκονται σε κατάσταση αύξησης ή όχι και να είναι ακινητοποιημένα ή να αιωρούνται μέσα στο υπόστρωμα (Κυριακίδης, 2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

56 Καλλιέργειες Βακτηρίων 21 Γενικά οι αντιδραστήρες που χρησιμοποιούνται στην βιοτεχνολογία διακρίνονται στις εξής κατηγορίες: Αντιδραστήρες ανάδευσης Αντιδραστήρες βρόχου Αντιδραστήρες κλίνης Αντιδραστήρες μεμβρανών Και στους ειδικά κατασκευασμένους αντιδραστήρες Αντιδραστήρες ανάδευσης Οι αντιδραστήρες ανάδευσης είναι οι περισσότερο χρησιμοποιημένοι σε διαδικασίες ζυμώσεων. Ένας μεγάλος αναδευτήρας εισέρχεται στο κέντρο του αντιδραστήρα που αναδεύει και μεταφέρει το οξυγόνο σε περιπτώσεις αεροβικών ζυμώσεων (Σχήμα 1.5). Οι αντιδραστήρες ανάδευσης συνήθως δε χρησιμοποιούνται όταν έχει γίνει καθήλωση ενζύμων, οπότε και δε χρειάζεται εσωτερική ανάδευση των σφαιριδίων που έχουν δεσμευμένα τα μόρια των ενζύμων. Οι αντιδραστήρες ανάδευσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο για συνεχούς ροής όσο και για μη συνεχούς ροής αντιδράσεις. (Κυριακίδης, 2002). Αντιδραστήρες βρόχου Στους αντιδραστήρες βρόχου, τα αντιδρώντα υλικά ακολουθούν κυκλοφορία βρόχου (Σχήμα 1.6). Αυτό επιτυγχάνεται με την κατασκευή μέσα στον αντιδραστήρα ενός κυλινδρικού πύργου, ενός «διευθυντηρίου» που καθορίζει τη ροή που γίνεται μέσα στον κλειστό βρόχο, είτε με τον αέρα ή με αναδευτήρα ή με την εκροή υγρού. Τα διάφορα ονόματα των αντιδραστήρων βρόχου π.χ. αερομεταφοράς, ανάδευσης, εκροής, δείχνουν τον τρόπο με τον οποίο επιτυγχάνεται η κυκλοφορία. Αλλιώς, για να επιτευχθεί κυκλοφορία τύπου βρόχου πρέπει να φτιαχτεί ο αντιδραστήρας σαν δακτύλιος ή να προστεθεί ένας εσωτερικός κυκλοφορητής στον κύριο αντιδραστήρα. Οι διάφοροι τύποι αυτού του είδους αντιδραστήρων φαίνονται στο Σχήμα 1.6 και όλοι μπορούν να λειτουργήσουν, αν χρειαστεί με ανάστροφη ροή (Κυριακίδης, 2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

57 Καλλιέργειες Βακτηρίων 22 Σχήμα 1.5 Βιοαντιδραστήρας ανάδευσης (Κυριακίδης, 2002). Σχήμα 1.6 Αντιδραστήρες τύπου βρόχου (Κυριακίδης, 2002). Ένα πλεονέκτημα των βιοαντιδραστήρων βρόχου είναι ότι η μεταφορά μάζας μπορεί να επιτευχθεί με πολύ λίγη ή μέτρια δαπάνη ενέργειας. Εφόσον επικρατούν συνθήκες νηματοειδούς ροής, σε αντιδραστήρες αυτού του τύπου οι βιοκαταλύτες υπόκεινται σε πολύ μικρή ταλαιπωρία. Από την άλλη μεριά η έρευνα και ανάπτυξη του πεδίου των αντιδραστήρων βρόχου βρίσκεται σε εξέλιξη και δεν υπάρχουν προς το παρόν ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

58 Καλλιέργειες Βακτηρίων 23 αποτελέσματα που μπορούν εύκολα να εφαρμοστούν σε βιομηχανική κλίμακα (Κυριακίδης, 2002). Αντιδραστήρες κλίνης Οι αντιδραστήρες κλίνης είναι χρήσιμοι σε αντιδράσεις που συμμετέχουν βιοκαταλύτες υπό μορφή σωματιδίων. Στις περισσότερες περιπτώσεις χρησιμοποιούνται σε διεργασίες συνεχούς ροής. Ανάλογα με τη φύση του βιοκαταλύτη, ως και τον τρόπο με τον οποίο ρέει το υπόστρωμα, ονομάζονται οι αντιδραστήρες ως πακεταρισμένης κλίνης, στρώματος καλής ανάμειξης κλπ. (Σχήμα 1.7). Σχήμα 1.7 Αντιδραστήρες κλίνης (Κυριακίδης, 2002). Ο πακεταρισμένης κλίνης αντιδραστήρας είναι ο πιο πολυχρησιμοποιημένος βιοαντιδραστήρας για καθηλωμένους βιοκαταλύτες, επειδή επιτρέπει τη χρησιμοποίηση των βιοκαταλυτών στην πιο μεγάλη τους πυκνότητα. Ως αποτέλεσμα, ανάλογα με το διαθέσιμο όγκο του αντιδραστήρα, είναι εφικτή η μέγιστη δυνατή μετατροπή του υποστρώματος στη μονάδα του χρόνου. Η παραγωγικότητα επομένως είναι μεγαλύτερη στον αντιδραστήρα πακεταρισμένης κλίνης από ότι σε οποιονδήποτε άλλο αντιδραστήρα. (Κυριακίδης, 2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

59 Καλλιέργειες Βακτηρίων 24 Αντιδραστήρες μεμβρανών Στην πράξη, οι αντιδραστήρες μεμβρανών χρησιμοποιούνται για διαχωρισμό χαμηλού από υψηλού μοριακού βάρους ουσιών, με τη βοήθεια μεμβράνης με εξαιρετικά μικρούς πόρους. Ο τύπος των αντιδραστήρων αυτών είναι πολύ χρήσιμος για ενζυμικές αντιδράσεις, δεδομένου ότι το μοριακό βάρος των ενζύμων είναι πολύ μεγαλύτερο από αυτό των προϊόντων (Κυριακίδης, 2002). Το ένζυμο και το υπόστρωμα τοποθετούνται στη μία πλευρά της μεμβράνης και εφαρμόζεται από την ίδια πλευρά μικρή πίεση, με αποτέλεσμα τα δημιουργούμενα προϊόντα να διαπερνούν τους πόρους της μεμβράνης. Στο εμπόριο υπάρχουν διαθέσιμες μεμβράνες υπερδιήθησης που μπορούν να συγκρατούν μόρια μοριακού βάρους από 500 έως 300,000 Da. Η μεμβράνη υπερδιήθησης αποτελείται κατά κανόνα από ένα συνθετικό πολυμερές συνήθως πολυακριλαμίδιο ή πολυαιθερική σουλφόνη. Η μορφή του αντιδραστήρα μεμβράνης φαίνεται στο Σχήμα 1.8. Σχήμα 1.8 Αντιδραστήρας μεμβράνης (Κυριακίδης, 2002) Αξιοσημείωτο πλεονέκτημα των αντιδραστήρων μεμβρανών είναι το γεγονός ότι οι βιοκαταλύτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη φυσική τους μορφή, εμποδίζοντας έτσι να εκτεθούν σε στάδια που θα μπορούσαν να τα καταστήσουν ανενεργά. Στους αντιδραστήρες μεμβρανών, κατάσταση παρόμοια με αυτή των φυσικών κυττάρων, οι βιοκαταλύτες ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

60 Καλλιέργειες Βακτηρίων 25 συγκρατούνται από το σύστημα της μεμβράνης. Με τον τρόπο αυτό οι αντιδράσεις είναι δυνατόν να γίνονται συνεχώς ή με επαναλαμβανόμενο τρόπο (Κυριακίδης, 2002) Βασικός σχεδιασμός βιοαντιδραστήρων Όπως είδαμε υπάρχουν πολλά είδη βιοαντιδραστήρων και ο κάθε ένας είναι κατάλληλος για διαφορετική εφαρμογή. Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω ο κατάλληλος αντιδραστήρας για μικροβιακές καλλιέργειες είναι ο αντιδραστήρας ανάδευσης με κατάλληλο σύστημα παροχής οξυγόνου (Κυριακίδης, 2002). Παρόλα αυτά, πολλοί άλλοι παράγοντες πρέπει να ληφθούν υπόψη όπως: Προσθήκη σωλήνων για τη δημιουργία φυσαλίδων στα τοιχώματα του ζυμωτήρα μπορεί να κάνει αποτελεσματικότερη τη μεταφορά οξυγόνου, καθώς αυξάνει τις αναταράξεις στο υγρό ανάδευσης. Είναι αναγκαίος ο έλεγχος αντιαφρισμού, δεδομένου ότι σε υψηλές κυτταρικές αποδόσεις παρατηρείται έντονος αφρισμός της καλλιέργειας. Ο έντονος αφρισμός της καλλιέργειας είναι ανεπιθύμητος γιατί στην περίπτωση που η καλλιέργεια γίνεται σε φιάλη υγραίνεται το βαμβάκι του στομίου της και προκαλεί μολύνσεις. Συνεπώς η προσθήκη αντιαφριστικού επιβάλλεται. Έλεγχος του ph. Ο μεταβολισμός των περισσότερων μικροοργανισμών οδηγεί στην αλλαγή του ph της καλλιέργειας με ανάλογη αλλαγή της φυσιολογίας του μικροοργανισμού. Συνηθίζεται να γίνεται συνεχώς ρύθμιση του ph με την προσθήκη οξέος ή βάσεως. Έλεγχος της θερμοκρασίας. Οι μικροοργανισμοί παράγουν θερμότητα καθώς μεταβολίζουν τα διάφορα υποστρώματα. Για να διατηρηθεί η θερμοκρασία σταθερή τοποθετούνται εναλλάκτες θερμότητας με κρύο νερό γύρο από το ζυμωτήρα. 1.7 Τρόποι αποστείρωσης Πριν από τη χρήση οποιουδήποτε σκεύους ή θρεπτικού μέσου ανάπτυξης, σε μία βακτηριακή καλλιέργεια, πρέπει πρώτα να αποστειρωθούν για την αποφυγή τυχόν μολύνσεων της καλλιέργειας. Με τη λέξη αποστείρωση δηλώνεται η καταστροφή ή πλήρης απομάκρυνση κάθε ζωντανού μικροοργανισμού, συμπεριλαμβανομένου και του σπόρου τους. Ένα αντικείμενο θεωρείται στείρο όταν έχει υποστεί τη διαδικασία της αποστείρωσης και στη συνέχεια έχει συσκευαστεί με τέτοιο τρόπο ώστε να μην επιμολυνθεί. Η ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

61 Καλλιέργειες Βακτηρίων 26 αποστείρωση επιτυγχάνεται κυρίως με φυσικά μέσα όπως η θερμότητα, η ακτινοβολία, η διήθηση, αλλά και με χημικά μέσα όπως η φορμαλδεΰδη και το αιθυλενοξείδιο (Αντωνιάδης, 2000) Θερμότητα Επειδή η εφαρμογή θερμότητας είναι γρήγορη, απλή και σχετικά φθηνή μέθοδος καταστροφής των μικροβίων, χρησιμοποιείται ευρέως στη βιομηχανία, την ιατρική και την καθημερινή ζωή ως μέθοδο αποστείρωσης (Αντωνιάδης, 2000). Χαμηλές θερμοκρασίες Θερμοκρασίες κάτω από το μηδέν δεν επιφέρουν το θάνατο των μικροοργανισμών, αλλά απλώς αναστέλλουν την ανάπτυξη τους. Στην κατάσταση αυτή οι μικροοργανισμοί λαθροβιούν, καθώς δεν εμφανίζουν μεταβολική δραστικότητα. Η μικροβιοστατική δράση των χαμηλών θερμοκρασιών αποτελεί τη βάση για τη διατήρηση των τροφίμων στο ψυγείο (4 ο C) ή στην κατάψυξη ( 20 ο C) (Αντωνιάδης, 2000). Υψηλές θερμοκρασίες Αύξηση της θερμοκρασίας περιβάλλοντος πάνω από τη μέγιστη θερμοκρασία αντοχής των μικροοργανισμών επιφέρει τον θάνατο τους. Πιστεύεται ότι η καταστροφή των μικροοργανισμών οφείλεται στην αδρανοποίηση των ενζύμων, στη διάσπαση των κυτταρικών λιποειδών, στη βλάβη των μηχανισμών αναπαραγωγής και στην καταστροφή της κυτταροπλασματικής μεμβράνης (Αντωνιάδης, 2000). Χρησιμοποίηση της θερμότητας για την καταστροφή των μικροοργανισμών Η θερμότητα ως μέσο αποστείρωσης μπορεί να εφαρμοστεί σε δύο μορφές, τη ξηρή και υγρή θερμότητα. Ξηρή θερμότητα: Χρησιμοποιείται ξηρός κλίβανος για 2 ώρες στους 160 o C, ή 30 λεπτά στους 180 o C, ή 1 ώρα στους 170 o C. Ο κλίβανος θα πρέπει να διαθέτει ενισχυμένο αερισμό, ώστε να επιτυγχάνεται ομοιόμορφη θερμοκρασία σε όλο το χώρο. Επειδή όμως ο ξηρός αέρας δεν είναι το ίδιο καλός αγωγός της θερμότητας με τον υγρό, για αυτό απαιτούνται υψηλότερες θερμοκρασίες (Αντωνιάδης, 2000). Υγρή θερμότητα: Χρησιμοποιούνται υδρατμοί. Αυξάνοντας την πίεση των υδρατμών, ο χρόνος μειώνεται ακόμα περισσότερο. Η υγρή θερμότητα είναι δραστικότερη από τη ξηρή, καθότι επιτυγχάνεται αποστείρωση σε χαμηλότερες θερμοκρασίες. (Αντωνιάδης, 2000). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

62 Καλλιέργειες Βακτηρίων 27 Βρασμός: Παλιά μέθοδος για υαλικά που δεν αλλοιώνονται στους 100 o C και κατάλληλη για την καταστροφή των φυτικών μορφών των μικροοργανισμών. Δε θεωρείται όμως αποστείρωση, γιατί οι σπόροι μπορεί να μην καταστρέφονται. Αυτόκαυστο: Χρησιμοποιείται ατμός υπό πίεση. Είναι ο πιο συνηθισμένος τρόπος αποστείρωσης. Η αποστείρωση διάρκειας λεπτών στους 121 o C υπό πίεση είναι κατάλληλη για να καταστραφούν όλοι οι μικροοργανισμοί και οι σπόροι των βακτηρίων. Η αποστείρωση με ατμό υπό πίεση γίνεται στον κλίβανο υγρής αποστείρωσης που λέγεται αυτόκαυστο. Είναι μια χύτρα με ισχυρά μεταλλικά τοιχώματα και κάλυμμα που κλείνει αεροστεγώς. Φέρει στρόφιγγα, θερμόμετρο και μανόμετρο Ακτινοβολίες Διάφορα είδη ακτινοβολίας μπορούν να προκαλέσουν το θάνατο ή μεταλλαγές στους μικροοργανισμούς. Στόχος τους είναι το DNA, η διαδικασία αναπνοής και ο μηχανισμός ανάπτυξης. (Αντωνιάδης, 2000). Ιονίζουσα ακτινοβολία: Χρησιμοποιούνται σήμερα ακτίνες γ, ηλεκτρομαγνητικές ακτινοβολίες μικρού μήκους κύματος και σωματιδιακές ακτίνες μεγάλης ταχύτητας. Η ιονίζουσα ακτινοβολία έχει μεγάλη διαπεραστική ικανότητα και χρησιμοποιείται για την αποστείρωση αντικειμένων μιας χρήσης, ευαίσθητων στη θερμότητα. Η απορροφόμενη δόση πρέπει να είναι επαρκής, ώστε να είναι αποτελεσματική και κατάλληλη για τη φύση του προϊόντος. Μη ιονίζουσα ακτινοβολία: Περιλαμβάνει τις υπεριώδεις ακτίνες που εκπέμπονται από λάμπες υδρογόνου και υδραργύρου, με μήκος κύματος μm. Έχουν μικρή διεισδυτική ικανότητα, απορροφώνται από το γυαλί, πλαστικό, χαρτί, ξύλο κ.α. Χρησιμοποιούνται κυρίως για την πρόληψη μόλυνσης χώρων (βιομηχανίες παρασκευής τροφίμων και μικροβιολογικά εργαστήρια) μειώνοντας τον αριθμό των μικροβίων στον αέρα (Αντωνιάδης, 2000) Διήθηση Διαλύματα που δεν μπορούν να αποστειρωθούν με θερμότητα ή με χημικά μέσα μπορούν να απαλλαγούν από τα μικρόβια με διήθηση. Χρησιμοποιούνται φίλτρα από διάφορους εστέρες κυτταρίνης με διαβαθμισμένα μεγέθη των πόρων (8 μm έως μm). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

63 Καλλιέργειες Βακτηρίων 28 Συνήθως χρησιμοποιούνται φίλτρα με διάμετρο πόρων 0.22 μm που κατακρατούν τα βακτήρια (Αντωνιάδης, 2000). 1.8 Σκοπός Διατριβής Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη καλλιεργειών βακτηρίων για την παραγωγή ενζύμων (λιπάση) και βιοπολυμερών (πολύυδροξυαλκανοϊκών εστέρων). O κυρίως στόχος αυτής της μελέτης είναι η διεξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων, που θα βοηθήσουν τόσο στην κατανόηση των παραμέτρων που επηρεάζουν την ανάπτυξη των βακτηρίων και την παραγωγή του επιθυμητού προϊόντος, όσο και τη μετέπειτα μεταφορά του συστήματος σε βιομηχανικής κλίμακας αντιδραστήρα. Πιο συγκεκριμένα, στο πρώτο μέρος αυτής της εργασίας έγινε προσπάθεια, σε επίπεδο κωνικής φιάλης, εύρεσης παραμέτρων που βοηθάνε στην αύξηση της παραγωγής της λιπάσης από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus thermophilus. Οι παράμετροι που μελετήθηκαν ήταν ο αερισμός και δυο πηγές άνθρακα σουκρόζη και ελαιόλαδο. Για την επίτευξη του χαρακτηρισμού της εξωκυττάριας λιπάσης που παράγεται από το βακτήριο πραγματοποιήθηκε καθαρισμός της. Ακολούθως, με σκοπό την αύξηση της δραστικότητας της εμπορικής λιπάσης Candida antarctica δοκιμάστηκαν τέσσερις διαφορετικοί φορείς καθήλωσης, για καθήλωση του ενζύμου με διαφορετικές μεθόδους. Στο δεύτερο μέρος, εξετάστηκε η επίδραση των θρεπτικών συστατικών στη μικροβιακή παραγωγή του ΡΗΑ από το βακτήριο Pseudomonas putida. Αρχικά σε επίπεδο κωνικής φιάλης μελετήθηκε η επίδραση των πηγών άνθρακα και αζώτου. Κατόπιν, σε επίπεδο εργαστηριακού βιοαντιδραστήρα, ερευνήθηκε η επίδραση που έχει η συνεχής τροφοδοσία πηγών άνθρακα και αζώτου κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας στην ανάπτυξη του βακτηρίου και την παραγωγή του ΡΗΑ. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση της έλλειψης φωσφόρου, καθώς και της προσθήκης μαγνησίου στη βακτηριακή παραγωγή του ΡΗΑ. 1.9 Δομή Διατριβής H δομή της παρούσας εργασίας αποτελείται από 6 συνολικά κεφάλαια. Στο 1 ο κεφάλαιο, αρχικά, γίνεται μια σύντομη περιγραφή των βακτηριακών καλλιεργειών και του τρόπου που αναπτύσσονται οι μικροοργανισμοί. Στην συνέχεια περιγράφεται τι είναι τα βακτήρια και το πώς ταξινομούνται σε σχέση με τη θερμοκρασία ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

64 Καλλιέργειες Βακτηρίων 29 ανάπτυξή τους. Μετέπειτα παρουσιάζονται τα διαφορετικά είδη μέσων ανάπτυξης που υπάρχουν, καθώς και τα διατροφικά στοιχεία που είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη των βακτηρίων. Τέλος γίνεται μια σύντομη περιγραφή των διαφόρων ειδών βιοαντιδραστήρων που υπάρχουν και οι τρόποι αποστείρωσης που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για απολύμανση των σκευών πριν τη χρήση τους. Στο 2 ο κεφάλαιο, αρχικά περιγράφονται οι λόγοι που κάνουν τους θερμόφιλους μικροοργανισμούς άξιους προσοχής. Στη συνέχεια, γίνεται περιγραφή του ρόλου των ενζύμων στη βιομηχανία και συγκεκριμένα των θερμοάντοχων ενζύμων. Ακολούθως, γίνεται αναφορά στο ένζυμο που μελετάται στην παρούσα εργασία, τη λιπάση, ποιά είναι η δομή της, ποια είναι η χρήση της στις βιομηχανικές διεργασίες, πώς παράγεται, καθώς και ποιες είναι οι παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή της. Τέλος γίνεται περιγραφή της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκε για τη μελέτη των παραμέτρων που βοηθάνε στην αύξηση της παραγωγής της λιπάσης και ο σχολιασμός των αποτελεσμάτων. Στο 3 ο κεφάλαιο, παρουσιάζονται οι τρόποι ανάκτησης των ενζύμων. Γίνεται περιγραφή των μεθόδων καθαρισμού των ενζύμων και στη συνέχεια πραγματοποιείται μια σύντομη περιγραφή των τεχνικών που έχουν χρησιμοποιηθεί για τον καθαρισμό της λιπάσης. Ύστερα, γίνεται αναφορά των βιοχημικών χαρακτηριστικών των βακτηριακών λιπασών. Τέλος περιγράφεται η πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε για τον καθαρισμό της λιπάσης, που παράχθηκε από το βακτήριο Thermus thermophilus και ακολουθεί ο σχολιασμός των αποτελεσμάτων. Στο 4 ο κεφάλαιο, αρχικά γίνεται μια εισαγωγή στο τι ακριβώς σημαίνει καθήλωση ενζύμων και περιγράφονται διάφορες τεχνικές που χρησιμοποιούνται. Στη συνέχεια γίνεται περιγραφή των πλεονεκτημάτων και μειονεκτημάτων των καθηλωμένων ενζύμων, τι προδιαγραφές πρέπει να ακολουθούν οι φορείς καθήλωσης και παρουσιάζονται μερικά ευρέως χρησιμοποιημένα υλικά για την ακινητοποίηση των ενζύμων. Τέλος, γίνεται περιγραφή της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκε για την καθήλωση της εμπορικής λιπάσης Candida antarctica σε διάφορους φορείς με διαφορετικές τεχνικές και σχολιάζονται τα αποτελέσματα. Στο 5 ο κεφάλαιο, αρχικά γίνεται σύντομη περιγραφή των συνθετικών πολυμερών και για πιο λόγο απαιτείται η αντικατάστασή τους. Έπειτα, περιγράφεται τί είναι τα βιοπολυμερή και συγκεκριμένα οι πολύ υδροξυαλκανοϊκοί εστέρες (PHAs), σε ποιες κατηγορίες χωρίζονται, με ποιόν τρόπο παρασκευάζονται και πώς μπορούν να ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

65 Καλλιέργειες Βακτηρίων 30 αποικοδομηθούν. Στη συνέχεια, παρουσιάζονται οι παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή των PHAs, με ποιό τρόπο μπορούν να απομονωθούν και ποιές είναι οι εφαρμογές τους. Τέλος γίνεται περιγραφή της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκε για τη μικροβιακή παραγωγή των PHAs και ο σχολιασμός των αποτελεσμάτων. Τέλος, στο 6 ο κεφάλαιο, παρουσιάζονται τα συμπεράσματα της παρούσας εργασίας και γίνονται προτάσεις για μελλοντική έρευνα. Βιβλιογραφία 1 ου Κεφαλαίου Asenjo J.A., Schmidt A.S., Andersen P.R. and Andrews B.A., Biotechnology and Bioengineering, 46, 497, (1995). Brock T. D., Science, 230, 132, (1985). McNeil B., Harvey L. M., Practical fermentation Technology Edited by Brian McNeil and Linda M. Harvey, John Wiley & Sons, Ltd., (2008). Zeikus J. G., Enzyme Microbiol. Technol., 1, 243, (1979). Αντωνιάδης Α., Αντωνιάδης Γρ., Λεγάκης Ν., Τσελέντης Ι., Ιατρική Μικροβιολογία, Τόμος Ά, ιατρικές εκδώσεις Π.Χ. Πασχαλίδης, (2000). Κυριακίδη Δ. Α., Βιοτεχνολογία, εκδόσεις Ζήτη, Β έκδοση, (2002). Παπαπαναγιώτου Ι. Κ., Ιατρική Μικροβιολογία και Ανοσοβιολογία, Τόμος Ά, εκδόσεις Παρατηρητής, (1999). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

66 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 31 Κεφάλαιο 2 Παράγωγη ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 2.1 Εισαγωγή H μελέτη των βακτηρίων που αναπτύσσονται σε ακραίες συνθήκες, όπως σε πολύ υψηλές θερμοκρασίες ή σε πολύ υψηλή συγκέντρωση αλάτων, έχει κινήσει το ενδιαφέρον για ερευνητικούς, βιοτεχνολογικούς και βιοχημικούς σκοπούς. Για πολλά χρόνια οι θερμόφιλοι οργανισμοί βρίσκονται στο γενικό βιολογικό ενδιαφέρον και η απομόνωση των θερμόφιλων βακτηρίων έχει γίνει απο αρκετές πηγές, όπως σε υπονόμους, στο έδαφος και στο νερό. Η ικανότητα που έχουν τα θερμόφιλα να μεγαλώνουν σε θερμοκρασίες όπου απενεργοποιούνται τα ένζυμα, τα νουκλεϊκά οξέα και τα κυτταρικά όργανα των μεσόφιλων οργανισμών, έχει μελετηθεί εντατικά τα τελευταία χρόνια και πολλά είναι πλέον γνωστά για την ανάπτυξη των θερμόφιλων οργανισμών και τις βιοχημικές ιδιότητες των κυτταρικών συστατικών τους (Oshima and Imahori, 1974). Στις περισσότερες βιοεφαρμογές ο μικροοργανισμός που χρησιμοποιείται ευρέως είναι το βακτήριο Escherichia coli, διότι είναι ένα πολύ καλά μελετημένο βακτήριο. Οι εφαρμογές των θερμόφιλων βακτηρίων στη βιοτεχνολογία έχει πολλά πλεονεκτήματα, όπως υψηλή μεταβολική δραστικότητα, χαμηλό ποσοστό μόλυνσης, καλύτερη διαλυτότητα των μη αεριούχων συστατικών (non-gaseous components), χαμηλό ιξώδες, παραγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

67 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 32 ενζύμων και πρωτεϊνών ανθεκτικά στη μεταβολή της θερμοκρασίας, καλή σταθερότητα της διεργασίας και απόδοση της κατεργασίας (Meltem et al., 2003). Τα τελευταία χρόνια μελετώνται κυρίως βακτήρια που αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 70 ο C, τόσο από πλευράς γονιδιακής οργάνωσης, όσο και από πλευράς αξιοποίησης των θερμοάντοχων ενζύμων τους σε διάφορες διεργασίες. Ένας τέτοιος οργανισμός με μεγάλο επιστημονικό ενδιαφέρον είναι και ο μικροοργανισμός Thermus thermophilus, ο οποίος είναι ένα θερμόφιλο βακτήριο που κατατάσσεται στους προκαρυωτικούς οργανισμούς και συγκεκριμένα στα ευβακτήρια. Το βακτήριο Thermus thermophilus αναπτύσσεται σε θερμοκρασίες που κυμαίνονται από τους 48 ο C μέχρι τους 85 ο C και είναι μέχρι στιγμής ο πιο μελετημένος θερμόφιλος μικροοργανισμός. Το θερμόφιλο αυτό βακτήριο ανακαλύφθηκε σε θερμοπηγές με ουδέτερο και αλκαλικό ph, καθώς και σε θερμά νερά ή σε φυσικά νερά που εκτίθενται σε θερμική ρύπανση (Oshima and Imahori, 1974; Brock, 1981). Το βακτηριακό στέλεχος ΗΒ8 του μικροοργανισμού T. Thermophilus, το οποίο και θα μας απασχολήσει, απομονώθηκε για πρώτη φορά από θερμές πηγές στην Ιαπωνία (Oshima and Imahori, 1974), ανήκει στα αερόβια gram αρνητικά βακτήρια, έχει κίτρινο χρώμα και αναπτύσσεται σε θερμοκρασίες από 65 o C μέχρι και 85 o C. To T. thermophilus δεν παράγει σπόρια και δεν εμφανίζει κινητικότητα. Αυτός ο θερμόφιλος οργανισμός παράγει ένζυμα μεγάλου βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος, όπως πρωτεάσες, φωσφατάσες, καταλάσες, κάποια ένζυμα για την επεξεργασία του DNA κλπ., τα οποία εκτενώς αναφέρονται από την Pantazaki et al., Κάποιοι ερευνητές έχουν αναφέρει την παρουσία δράσης εστεράσης και/ή λιπάσης σε μικροοργανισμούς που ανήκουν στο γένος Thermus (Sigurgisladottir et al., 1993; Berger et al., 1995; Lagarde et al., 2002). 2.2 Ένζυμα Τα ένζυμα θεωρούνται ως φυσικοί καταλύτες. Τα λιπίδια αποτελούν ένα μεγάλο κομμάτι της βιομάζας της γης και τα λιπολυτικά ένζυμα παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην αλλαγή αυτών των αδιάλυτων συστατικών στο νερό. Τα λιπολυτικά ένζυμα συμμετέχουν στη διάσπαση των λιπιδίων μέσα στα κύτταρα μεμονωμένων οργανισμών, καθώς επίσης και στη μεταφορά των λιπιδίων από έναν οργανισμό σε έναν άλλον (Beisson et al., 2000). Πρωτίστως είχε ανακαλυφθεί ότι οι μικροοργανισμοί έχουν την ικανότητα να παράγουν ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

68 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 33 γαλακτοματοποιητές ή βιοεπιφανειοδραστικές ουσίες (biosurfactants) οι οποίες βοηθάνε στην διαλυτοποιήση των λιπιδίων (Van Dyke et al., 1991). Σήμερα είναι γνωστά αρκετές χιλιάδες ένζυμα που κατέχουν διαφορετική ιδιαιτερότητα υποστρώματος, παρόλα αυτά, συγκριτικά μόνο λίγα από αυτά τα ένζυμα έχουν απομονωθεί στην καθαρή τους μορφή και λίγα είναι αυτά που η δομή τους και η λειτουργίες τους είναι γνωστές. Έτσι, η έλευση της τεχνικής της πρωτεϊνικής μηχανικής, έκανε εφικτή την εφαρμογή στη βιομηχανία πολλών σημαντικών ενζύμων, όπως είναι η πρωτεάση και η λιπάση να μπορούν να χρησιμοποιούνται με μεγάλη αποδοτικότητα στα απορρυπαντικά, οι αμυλάσες και οι ισομεράσες της γλυκόζης στις αμυλούχες διεργασίες και στις βιοδιεργασίες ακατέργαστων υλικών ή στη σύνθεση οργανικών χημικών ουσιών (Cheetham, 1995). Μερικά πλεονεκτήματα που προσφέρονται από τα ένζυμα είναι οι ήπιες συνθήκες της διεργασίας και τα μειωμένα απόβλητα. Μπορεί να είναι πιθανό με τη χρήση του κατάλληλου ενζύμου να ελέγχεται ποια γίνεται έλεγχος του προϊόντος που παράγεται με αποτέλεσμα λόγω της εξειδίκευσης των ενζύμων οι ανεπιθύμητες παράπλευρες αντιδράσεις να ελαχιστοποιούνται. Οι διεργασίες που βασίζονται στα ένζυμα τείνουν να έχουν λιγότερα έξοδα για την επεξεργασία των αποβλήτων (Posorske, 1984). Τα ένζυμα που παράγονται από μικρόβια, είναι συνήθως πιο χρήσιμα από τα ένζυμα που παράγονται από ζώα ή φυτά, λόγω της μεγάλης ποικιλίας της διαθέσιμης καταλυτικής δραστικότητας, προμηθεύονται εύκολα καθώς δεν επηρεάζονται από εποχιακές διακυμάνσεις και οι μικροοργανισμοί που τους παράγουν αναπτύσσονται γρήγορα σε φτηνά μέσα ανάπτυξης. Επίσης, η παραγωγή των μικροβιακών ενζύμων σε σχέση με αυτή των φυτών και των ζώων είναι πιο εύκολη και ασφαλής (Wiseman, 1995). Μόνο το 2% των μικροοργανισμών που υπάρχουν έχουν ελεγχτεί για πηγή παραγωγής ενζύμων. Τα βακτηριακά στελέχη είναι αυτά που γενικά χρησιμοποιούνται για την παραγωγή των ενζύμων, καθώς προσφέρουν μεγαλύτερη δραστικότητα, σε σύγκριση με τις ζύμες (yeasts) (Frost and Moss, 1987) και τείνουν να έχουν βέλτιστο ph ουδέτερο και αλκαλικό και συχνά είναι θερμοάντοχα (thermostable) Ένζυμα που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία Η βιομηχανία των ενζύμων όπως είναι σήμερα είναι το αποτέλεσμα μιας ταχείας ανάπτυξης η οποία πρωτοεμφανίστηκε τις τελευταίες τέσσερεις δεκαετίες χάρις στην εξέλιξη της μοντέρνας βιοτεχνολογίας. Τα ένζυμα που βρίσκονται στην φύση έχουν ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

69 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 34 χρησιμοποιηθεί από τα αρχαία χρόνια για την παραγωγή προϊόντων τροφής, όπως είναι το τυρί, ζύμη, μπύρα, κρασί και ξίδι και για την παραγωγή εμπορευμάτων όπως είναι το δέρμα. Όλες αυτές οι διεργασίες βασίζονταν είτε στην παραγωγή ενζύμων από την ανάπτυξη μικροοργανισμών, είτε από ένζυμα που βρίσκονταν στα συστατικά του μείγματος. Επομένως, η χρήση των ένζυμων δεν γινόταν με την καθαρή τους μορφή. Η ανάπτυξη των διεργασιών ζύμωσης τα τελευταία χρόνια του περασμένου αιώνα, στόχευε εξειδικευμένα στην παραγωγή των ενζύμων χρησιμοποιώντας την παραγωγή συγκεκριμένου επιλεγμένου οργανισμού, κάνοντας εφικτή την παραγωγή των ενζύμων στην καθαρή τους μορφή και με μελετημένες της φυσικο-χημικές τους ιδιότητες, ακόμα και σε μεγάλη κλίμακα διεργασιών (Kirk et al., 2002). Αυτή η ανάπτυξη, επέτρεψε την εισαγωγή των ενζύμων σε πραγματικά βιομηχανικά προϊόντα και διεργασίες, όπως είναι οι βιομηχανίες απορρυπαντικών, κλωστοϋφαντουργίας και αμύλου. Η χρήση της τεχνολογίας του ανασυνδεμένου γονιδίου βελτίωσε περισσότερο της βιομηχανικές διεργασίες και επέτρεψε την εμπορευματοποίηση των ενζύμων που προηγουμένως ήταν δύσκολο να παραχθούν. Επιπλέον, οι τελευταίες εξελίξεις στη σύγχρονη βιοτεχνολογία, εισήγαγε την πρωτεϊνική μηχανική και την κατευθυνόμενη εξέλιξη, φέρνοντας μεγάλη επανάσταση στην ανάπτυξη της βιομηχανίας των ενζύμων. Αυτά τα πλεονεκτήματα έκαναν εφικτό τον εφοδιασμό ένζυμων, που παρουσιάζουν καινούριες δραστικότητες και προσαρμόζονται σε νέες συνθήκες διεργασιών, επιτρέποντας την περαιτέρω επέκταση της βιομηχανικής τους χρήσης (Kirk et al., 2002). Στις μέρες μας, στις βιομηχανικές εφαρμογές, χρησιμοποιούνται αρκετά ένζυμα (Πίνακας 2.1) από τα οποία η πλειοψηφία τους έχει υδρολυτική δράση, και χρησιμοποιούνται για την αποικοδόμηση ποικίλων φυσικών υποστρωμάτων. Από αυτά τα ένζυμα, οι πρωτεάσες είναι αυτές που κυριαρχούν λόγω της εκτεταμένης εφαρμογής τους σε βιομηχανικές διεργασίες απορρυπαντικών και γαλακτοκομικών. Την δεύτερη μεγάλη ομάδα ενζύμων αποτελούν οι καρβοϋδρολάσες, πρωταρχικές αμυλάσες και κυτταρινάσες και χρησιμοποιούνται σε βιομηχανίες αμύλου, απορρυπαντικών και κλωστοϋφαντουργίας (Godfrey and West, 1996). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

70 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 35 Πίνακας 2.1 Ενζυμα που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία και εφαρμογές τους (Kirk et al., 2002). Βιομηχανία Ένζυμο Εφαρμογή Απορρυπαντικά Τρόφιμα (μαζί με τα γαλακτοκομικά) Ζωοτροφές Πρωτεάση Αμυλάση Λιπάση Κυτταρινάση Πρωτεάση Λιπάση Λακτάση Πηκτίνη μεθυλικής εστεράσης Τρανσγλουταμινάση Φυτάση Ξυλανάση Πρωτεϊνική αφαίρεση λεκέδων Αφαίρεση λεκέδων αμύλου Αφαίρεση λιπαρών λεκέδων Καθαρισμός, Κάνει τα χρώματα πιο έντονα Πήξη του γάλακτος, συνταγή για βρέφη (ελαφρός αλλεργιογόνα), γεύση Ενίσχυση τις γεύσης του τυριού Απομάκρυνση λακτόζης (γάλα) Σύσφιξη των προϊόντων με βάση τα φρούτα Τροποποιεί τις ελαστικές ιδιότητες Βοηθάει την φυτική πέψη απελευθέρωσης φωσφόρου Βοηθητικά πέψης Κλωστοϋφαντουργία β-γλυκανάση Κυτταρινάση Αμυλάση Υπεροξειδάσης Βοηθητικά πέψης Κάνει το βαμβάκι πιο μαλακό De-διαστασιολόγηση Αφαίρεση περίσσειας βαφής ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

71 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 36 Βιομηχανία Ένζυμο Εφαρμογή Πολτοποίηση και χαρτί Λιπάση Πρωτεάση Αμυλάση Ξυλανάση Κυτταρινάση Έλεγχος ρετσίνις, έλεγχος μόλυνσης Αφαίρεση βιο-υμενίων Επίστρωση αμύλου, απομελάνωσης, βελτίωση αποστράγγισης Ενίσχυση της λεύκανσης Απομελάνωσης, τροποποίηση ινών χαρτιού Λίπη και έλαια Λιπάση Μετεστεροποίηση Οργανική σύνθεση Λιπάση Ακυλάση Νιτριλάση Διάλυση χιλαρικών αλκοολών και αμιδίων Σύνθεση ημισυνθετικής πενικιλλίνης Σύνθεση καρβοξυλικών οξέων Δέρματα Πρωτεάση Στην επεξεργασία Προσωπική φροντίδα Λιπάση Αμυλογλυκοσιδάζη Οξειδάση γλυκόζης Υπεροξειδάση l Καθαρισμός Αντιμικροβιακή (σε συνδυασμό με οξειδάση γλυκόζης) Λεύκανση, αντιμικροβιακή Αντιμικροβιακή Τα λιπολυτικά ένζυμα σήμερα έχουν τραβήξει το ενδιαφέρον λόγω των βιοτεχνολογικών τους ικανοτήτων (Benjamin and Pandey, 1998). Αποτελούν το πιο σημαντικό μέλος των βιοκαταλυτών για βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Τα υψηλά επίπεδα παραγωγής των μικροβιακών λιπασών απαιτεί όχι μόνο την ικανότητα υπερέκφρασης από το αντίστοιχο γονίδιο, αλλά επίσης και τη λεπτομερή κατανόηση του μοριακού μηχανισμού που ελέγχει την αναδίπλωση τους και την έκκριση τους. Η βελτιστοποίηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

72 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 37 των ιδιοτήτων των λιπασών, σχετικών με τη βιομηχανία, μπορεί να επιτευχθεί με κατευθυνόμενη εξέλιξη. Επιπλέον, καινούριες βιοτεχνολογικές εφαρμογές έχουν επιτυχώς καθιερωθεί χρησιμοποιώντας λιπάσες για τη σύνθεση βιοπολυμερών και βιοντίζελ, παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων, αγροχημικών και αρωματικών ενώσεων (Jaeger and Eggert, 2002). Μερικά σημαντικά βιομηχανικά χημικά, που παράγονται από λίπη και έλαια με χημικές διεργασίες, μπορούν να παραχθούν με τις λιπάσες με μεγαλύτερη ταχύτητα και καλύτερη εξειδίκευση υπό ήπιες συνθήκες (Sih and Wu, 1989; Vulfson 1994). H χημειο-, τοπο και εναντιο εξειδικευμένη συμπεριφορά των ενζύμων αυτών μπορεί να προκαλέσει τεράστιο ενδιαφέρον στη βιομηχανία και την επιστήμη (Saxena et al., 2003). Οι λιπάσες είναι πολύ σημαντικές στο χώρο της βιομηχανίας. Αρκετές από αυτές προέρχονται από ένα μεγάλο αριθμό βακτηρίων, μυκητών και φυτών και ζώων, και υπάρχουν στην καθαρή τους μορφή (Saxena and Sheoran, 2003). Οι λιπάσες που έχουν απομονωθεί από διαφορετικές πηγές, έχουν ένα ευρύ φάσμα ιδιοτήτων που εξαρτάται από την προέλευση τους σε σχέση με τη θέση της εξειδίκευσης, την εξειδίκευση των λιπαρών οξέων, την θερμοανθεκτικοτητά τους, το βέλτιστο ph, κλπ. (Huang, 1984). Έτσι, μπορεί να βρεθεί μια λιπάση που έχει παραχθεί από τη φύση, που να είναι κατάλληλη για την επιθυμητή εφαρμογή. Με αυτό τον τρόπο, η χρήση ενζύμων στη βιομηχανία επιτρέπει στους τεχνολόγους να αναπτύξουν διεργασίες που είναι πιο κοντά στις διεργασίες της φύσης. Με την αύξηση της ευαισθητοποίησης προς το περιβάλλον και τα θέματα κόστους, η βιοτεχνολογία κερδίζει γρήγορα έδαφος, χάρη στα πολλά πλεονεκτήματα που προσφέρει σε σχέση με τις συμβατικές τεχνολογίες. Ο τομέας των βιομηχανικών ενζύμων τώρα τελευταία βιώνει σημαντικές αλλαγές στην έρευνα και ανάπτυξη, με αποτέλεσμα να αναπτυχθούν μια σειρά από νέα προϊόντα και στη βελτίωση των διεργασιών και των αποδόσεων μερικών υπαρχόντων προϊόντων. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 2.1 η τεχνική βιομηχανία, η οποία απαρτίζεται από τις βιομηχανίες απορρυπαντικών, αμύλου, κλωστοϋφαντουργίας και καυσίμων αλκοόλης, αποτελούν την κυρίως κατανάλωση των βιομηχανικών ενζύμων. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

73 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 38 Ένζυμα ζωοτροφών Ένζυμα τροφίμων Τεχνολογικά ένζυμα Σχήμα 2.1 Βιομηχανική αγορά ενζύμων. Γενικά, η υπολογιζόμενη αξία της παγκόσμιας χρήσης των βιομηχανικών ενζύμων αυξήθηκε από το $1 δισεκατομμύριο το 1995 σε $1.5 δισεκατομμύρια το 2000 και αναμένεται να φτάσει τα $7 δισεκατομμύρια το 2013 με μέση ετήσια αύξηση 6.3%, κυρίως για τα φαρμακευτικά και βιοκαταλυτικά ένζυμα (Godfrey and West, 1996; Hasan et al., 2010; McCoy, 2000). Σύμφωνα με μια αναφορά από το Business Communication Company, Inc. η παγκόσμια αγορά για τα βιομηχανικά ένζυμα υπολογίζεται στα 2 δις. $ το 2004 (Πίνακας 2.2). Η αύξηση του όγκου πωλήσεων των βιομηχανικών ενζύμων κυμαίνεται μεταξύ 4% με 5% μέσος ετήσιος ρυθμός αύξησης [AAGR, (average annual growth rate)], ο οποίος ακολουθείται με μείωση της τιμής, λόγω της αύξησης των αριθμών μικρότερων παικτών που ανταγωνίζονται στην αγορά. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα να αυξηθεί η αγορά σε AAGR σε λίγο περισσότερο από 3% τα επόμενα 4 χρόνια, έτσι που η συνολική αγορά των βιομηχανικών ενζύμων το 2009 έφτασε κοντά στα 2.4 δις $ (Hasan et al., 2006). Η αγορά των βιομηχανικών ενζύμων χωρίζεται σε τρία τμήματα εφαρμογών (Σχήμα 2.2): σε ένζυμα για την τεχνολογία (Technical Enzymes), σε ένζυμα τροφίμων (Food Enzymes) και σε ένζυμα για ζωοτροφές (Animal Feed Enzymes) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

74 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 39 Πίνακας 2.2 Παγκόσμια αγορά ενζύμων ανά τομέα εφαρμογών, μέχρι το 2009 (σε εκατομμύρια $) (πηγή: Business Communication Company, Inc.), (Hasan et al., 2006) % AAGR Ένζυμα για την τεχνολογία Ένζυμα για τα τρόφιμα Ένζυμα για ζωοτροφές Σύνολο Τεχνολογικά ένζυμα Ένζυμα τροφίμων Ένζυμα ζωοτροφών Παγκόσμια αγορά ενζύμων ($ Εκαττομύρια) Σχήμα 2.2 Παγκόσμια αγορά ενζύμων ανά τομέα εφαρμογών μέχρι το 2009 ($ εκατομμύρια) (πηγή: Business Communication Company, Inc.), (Hasan et al., 2006). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

75 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 40 Η ανάπτυξη για τα ένζυμα για ζωοτροφές είναι κατά κάποιο τρόπο υψηλότερη, αναμένεται να είναι κοντά στο 4% του AAGR και βοηθά σε μεγάλο βαθμό από την αύξηση της χρήσης του ενζύμου φυτάσης για την καταπολέμηση της μόλυνσης από το φώσφορο. Τα τεχνολογικά ένζυμα για την κατασκευή μεταξύ άλλων απορρυπαντικών, χαρτοπολτού και χαρτιού, είναι το μεγαλύτερο τμήμα με 52% μερίδιο. Το τμήμα της ζαχαροπλαστικής και των γλυκαντικών ουσιών είναι ο μεγαλύτερος τομέας στις εφαρμογές των τροφίμων και αναμένεται να αυξηθεί με ένα υγιές AAGR που φτάνει περίπου το 3%. (Hasan et al., 2006). Ανάμεσα στα τεχνολογικά ένζυμα οι καρβοϋδρολάσες (carbohydrases) και οι πρωτεάσες είναι τα κυρίαρχα ένζυμα που χρησιμοποιούνται στα τρόφιμα και τις ζωοτροφές. Οι πρωτεάσες, οι αμυλάσες, οι λιπάσες και οι σελουλάσες χρησιμοποιούνται σε προϊόντα καθαρισμού, συμπεριλαμβανομένων των απορρυπαντικών πλυντηρίων ρούχων και πιάτων και άλλων καθαριστικών. Η παραγωγή χημικών είναι η τρίτη πιο σημαντική αγορά. Οι ζυμώσεις αλκοόλης αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος του τμήματος της αγοράς, τα φαρμακευτικά προϊόντα (στεροειδή και αντιβιοτικά), αμινοξέα, πρωτεΐνες, λιπίδια (τριγλυκερίδια, φωσφολιπίδια), κλωστοϋφαντουργία, δέρμα, που ακολουθείται από τις εφαρμογές γούνας. Το σημαντικότερο κομμάτι αυτής της εφαρμογής είναι το βαμβάκι και τα κυτταρινικά (cellulosic) υφάσματα, στα οποία κυρίως χρησιμοποιούνται οι κυτταρινάσες (celluloses) και οι αμυλάσες. Η πολτοποίηση χαρτιού και το χαρτί στην αγορά είναι η τελευταία σημαντική βιομηχανική εφαρμογή των ενζύμων, η οποία αποτελεί περίπου το 6%. Η πιο αξιοσημείωτη χρήση είναι αυτή της ξυλανάσης (xylanase) για τον αποχρωματισμό του χαρτοπολτού αντί των χημικών μειώνοντας σημαντικά τα επιβλαβή απόβλητα. Η αμυλάση επίσης χρησιμοποιείται στην βιομηχανία χαρτοπολτού και χαρτιού (Hasan et al., 2006). Η γρήγορη ανάπτυξη των βιομηχανιών ενίσχυσε κατά πολύ το πρόβλημα της μόλυνσης των υδάτων. Βιομηχανίες όπως της κλωστοϋφαντουργίας, χαρτιού, συνθετικών φαρμάκων, εντομοκτόνων και τα βυρσοδεψεία, εκκένωναν μεγάλους όγκους επιβλαβών αποβλήτων στις κεντρικές πηγές ύδατος. Η συστηματική βιομηχανική χρήση ενζύμων και μικροοργανισμών χρονολογείται πάνω από 100 χρόνια. Η πρώτη μελετημένη χρήση απομονωμένων ενζύμων σε εμπορική διεργασία φαίνεται να είναι η εισαγωγή της παγκρεατικής πρωτεάσης για την επεξεργασία ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

76 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 41 δερμάτων από τον Rahm το Η ιμβερτάση (invertase) ήταν το πρώτο ένζυμο που καθηλώθηκε και χρησιμοποιήθηκε εμπορικά από τους Tate και Lyre το 1908 (Cheetham, 1995). Επίσης, ένζυμα έχουν χρησιμοποιηθεί στη βιομηχανία δερμάτων για πολλά χρόνια και έχουν επίσης εισαχθεί και στη μοντέρνα βιομηχανία κλωστοϋφαντουργίας. Η κύρια εφαρμογή των ενζύμων στη βιομηχανία δερμάτων είναι οι πρωτεάσες οι οποίες βοηθάνε στην αφαίρεση των τριχών από το τομάρι των ζώων και οι λιπάσες που χρησιμοποιούνται για την απολύμανσή τους (Hasan et al., 2006). Η χρησιμοποίηση της γονιδιακής τεχνολογίας και η παραγωγή καινούριων τεχνολογιών έφτιαξαν διαθέσιμα βιομηχανικά ένζυμα με βελτιωμένες ιδιότητες και καλύτερο κόστος απόδοσης. Τα πλεονεκτήματα για τους πελάτες είναι αξιοσημείωτα: εξοικονόμηση κόστους στην εφαρμογή της διεργασίας, βελτιωμένη ποιότητα του προϊόντος και στις περισσότερες περιπτώσεις μια σημαντική μείωση των καταστροφικών επιπτώσεων στο περιβάλλον. Η γονιδιακή τεχνολογία προσφέρει αρκετά πλεονεκτήματα στα βιομηχανικά ένζυμα. Αυτή η τεχνολογία δίνει τη δυνατότητα της χρήσης καλά μελετημένων οργανισμών που καλλιεργούνται εύκολα, τη μικροβιακή παραγωγή των ενζύμων που προέρχονται από ζώα ή φυτά, την πραγματοποίηση βελτιωμένης αποτελεσματικότητας και υψηλής καθαρότητας προϊόντων και επίσης την παραγωγή ενζύμων με βελτιωμένη σταθερότητα και δραστικότητα (Falch, 1991) Θερμόφιλα ένζυμα Η χρήση των ενζύμων ως καταλύτες για βιομετατροπές είναι ευρέως γνωστή. Η πλειοψηφία των ενζύμων που χρησιμοποιείται σήμερα προέρχεται από μεσόφιλους μικροοργανισμούς και παρ όλα τα πολλά πλεονεκτήματα τους η εφαρμογή τους είναι περιορισμένη λόγω της χαμηλής σταθερότητας τους σε υψηλές θερμοκρασίες. Από την άλλη μεριά, η εφαρμογή των ενζύμων που προέρχονται από θερμόφιλους μικροοργανισμούς ως βιοκαταλύτες είναι θελκτική καθώς είναι σταθερά και δραστικά κάτω από συνθήκες που προηγουμένως θεωρούνταν μη συμβατές με τα βιολογικά υλικά (Hough et al, 1999). Η ικανότητα πολλών μικροοργανισμών να αναπτύσσονται σε υψηλές θερμοκρασίες προκάλεσε μεγάλο ενδιαφέρον στους μικροβιολόγους και τους βιοχημικούς εδώ και πολλά χρόνια. Όπως κάθε κυτταρικό συστατικό τους, οι πρωτεΐνες τους είναι πιο σταθερές στη θερμότητα σε σχέση με αυτές των κοινών οργανισμών. Αυτή η θερμική σταθερότητα δεν οφείλεται σε κάποιο συγκεκριμένο χαρακτηριστικό, αλλά είναι αποτέλεσμα ποικίλων ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

77 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 42 αλλαγών οι οποίες συνέβαλαν στη σταθερότητα της πρωτεΐνης με αθροιστικό τρόπο. Αυτά τα ένζυμα δεν είναι μόνο πιο θερμοάντοχα, αλλά επίσης αντέχουν περισσότερο σε οργανικούς διαλύτες, από τα μεσοφιλικά ομολογά τους, πολύ χρήσιμες ιδιότητες για βιομηχανικές εφαρμογές (Lasa and Berenguer, 1993). Τα ένζυμα από τους θερμόφιλους οργανισμούς είναι ενεργά κάτω από ακραίες συνθήκες και πιο σταθερά σε υψηλές θερμοκρασίες. Μάλιστα, παρουσιάζουν χαμηλή δραστικότητα σε θερμοκρασίες χαμηλότερες από 30 ο C, συνθήκες κατά τις οποίες οι περισσότερες ενδιαφέρουσες χημικές ενώσεις είναι σταθερές. Είναι ανθεκτικότερα στη μετουσίωση από πρωτεόλυση και χημικούς παράγοντες από τα αντίστοιχα στα μεσόφιλα βακτήρια (Pantazaki et al., 2002). Εκτός από τις ενδιαφέρουσες εφαρμογές στη βιοτεχνολογία, τα ένζυμα από τους οργανισμούς αυτούς παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον πάνω στην έρευνα των δομών που απαιτούνται για την υψηλή θερμοδυναμική τους σταθερότητα (Zeikus et al., 1998; Pantazaki et al., 2002). Δομικοί παράγοντες που συνεισφέρουν στη αξιοσημείωτη ανθεκτικότητα αυτών των ενζύμων είναι οι αλλαγές που παρουσιάζουν στην πλευρική αλυσίδα των αμινοξέων, οι αυξημένες υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υπομονάδων και οι αλλαγές στην επιφάνεια έκθεσης του διαλύτη (Demirjian et al., 2001). Επιπλέον, είναι πολύ χρήσιμοι ως βιοκαταλύτες για βιοτεχνολογικές εφαρμογές και επίσης από τη μελέτη τους κατανοείται καλύτερα η δομή των πρωτεϊνών (Sellek and Chaudhuri, 1999; Cowan, 1992). Γι αυτούς τους λόγους, η έρευνα πάνω στην παραγωγή των θερμόφιλων ενζύμων έχει αυξηθεί τα τελευταία χρόνια Βιομηχανικές εφαρμογές θερμοάντοχων ενζύμων Οι θερμοάντοχοι καταλύτες, (όπως είναι τα θερμοάντοχα ένζυμα), επιτρέπουν μια υψηλότερη θερμοκρασία λειτουργίας, η οποία είναι σαφώς πλεονεκτική λόγω της καλύτερης αντίδρασης που πραγματοποιείται (υψηλότερη ρυθμοί αντίδρασης, χαμηλότεροι περιορισμοί διάχυσης), της υψηλότερης σταθερότητας, τις υψηλότερες αποδόσεις της διεργασίας (αυξημένη διαλυτότητα των υποστρωμάτων και των προϊόντων και ευνοϊκή ισορροπία σε ενδοθερμικές αντιδράσεις), το χαμηλότερο ιξώδες και τα λιγότερα προβλήματα μόλυνσης (Mozhaev, 1993). Αυτά τα πλεονεκτήματα ξεπερνούν ορισμένα μειονεκτήματα που προκύπτουν από αυστηρότερες απαιτήσεις στα υλικά, στις δυσκολότερες αντιδράσεις αδρανοποίησης και στους περιορισμούς στην περίπτωση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

78 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 43 ασταθών υποστρωμάτων ή προϊόντων. Για αυτούς τους λόγους οι θερμοάντοχοι καταλύτες είναι πολύ ελκυστικοί (Illanes, 1999). Τα θερμοάντοχα ένζυμα μπορούν να παραχθούν από μεσόφιλους και θερμόφιλους οργανισμούς. Ακόμα και οι ψυχρόφιλοι έχουν μερικά θερμοσταθερά ένζυμα. Οι θερμόφιλοι αντιπροσωπεύουν μια προφανή πηγή θερμοσταθερών ενζύμων και είναι λογικό να υποτεθεί ότι μπορούν να παρέχουν πρωτεΐνες με υψηλή θερμική σταθερότητα. Αυτό είναι σίγουρο, όπως μπορεί να εκτιμηθεί και στην περίπτωση μερικών ενζύμων που χρησιμοποιούνται σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές και προέρχονται από τα αρχαιοβακτήρια Pyrococcus furiosus και Thermotoga sp. (Adams et al., 1995; Fischer et al., 1996; Adams et al., 1998). Η σημαντικότητα των θερμοάντοχων λιπασών σε διαφορετικές εφαρμογές έχει αυξηθεί πολύ γρήγορα. Οι περισσότερες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί μέχρι τώρα ήταν με μεσόφιλους μικροοργανισμούς. Αρκετές λιπάσες από μεσόφιλους οργανισμούς είναι σταθερές σε υψηλές θερμοκρασίες (Sugihara et al., 1991). Ωστόσο, οι πρωτεΐνες από θερμόφιλους οργανισμούς έχει αποδειχθεί ότι είναι πιο χρήσιμες για βιοτεχνολογικές εφαρμογές από ότι παρόμοιες πρωτεΐνες από τους μεσόφιλους, λόγω της σταθερότητας τους σε υψηλές θερμοκρασίες (Imamura et al., 2000). Οι θερμοάντοχες λιπάσες που προέρχονται από μικρόβια είναι πολύ πλεονεκτικές, για βιοτεχνολογικές εφαρμογές, καθώς μπορούν να παραχθούν με χαμηλό κόστος και να παρουσιάσουν βελτιωμένη σταθερότητα (Handelsman and Shoham, 1994). Καθώς τα τελευταία χρόνια οι απαιτήσεις για θερμοσταθερά ένζυμα στον τομέα της βιομηχανίας έχει αυξηθεί κατά πολύ, θερμοσταθερές λιπάσες από διάφορες πηγές έχουν καθαριστεί και χαρακτηριστεί για περαιτέρω εφαρμογή τους (Sugihara et al., 1991; Imamura and Kitaura 2000; Mozhaev 1993; Illanes, 1999; Adams et al., 1995; Fischer et al., 1996; Adams et al., 1998; Handelsman and Shoham,1994; Sugihara et al.,1992; Kim et al.,1998). Μερικά από τα πλεονεκτήματα των διαφόρων διεργασιών σε υψηλές θερμοκρασίες είναι: Υψηλότερος ρυθμός διάχυσης Αυξημένη διαλυτότητα των λιπιδίων και άλλων υδροφοβικών υποστρωμάτων στο νερό Μειωμένο ιξώδες του υποστρώματος Αυξημένη διαλυτότητα του αντιδραστηρίου ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

79 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 44 Υψηλότερη θερμοκρασία, πιο γρήγοροι ρυθμοί αντίδρασης Μειωμένος κίνδυνος μικροβιακής μόλυνσης. Οι θερμόφιλοι μικροοργανισμοί είναι πολύτιμες πηγές θερμοάντοχων ενζύμων με ιδιότητες που συνήθως σχετίζονται με τη σταθερότητα τους σε διαλύτες και απορρυπαντικά, δίνοντας σε αυτά τα ένζυμα αξιοσημείωτες προοπτικές για πολλές βιοτεχνολογικές και βιομηχανικές εφαρμογές (Coolbear et al.,1992; Haki and Rakshit, 2003). Το κυριότερο εμπόδιο για την εκτεταμένη εφαρμογή των ενζύμων στη βιομηχανία ήταν εκτός από το κόστος η θερμική ευαισθησία (Kristjansson, 1989). Για αυτό το λόγο το πιο ελκυστικό χαρακτηριστικό των θερμόφιλων μικροοργανισμών, από τη μεριά της βιοτεχνολογίας, είναι η ικανότητα τους να παράγουν ένζυμα ικανά να καταλύουν διεργασίες σημαντικές για τη βιομηχανία, σε υψηλές θερμοκρασίες σε σχέση με τα αντίστοιχα τους από τους μεσόφιλους μικροοργανισμούς (Lasa and Berenguer, 1993). Για αυτό, η ικανότητα των θερμόφιλων ενζύμων να δουλεύουν σε υψηλές θερμοκρασίες, συνεπάγεται πολλά πλεονεκτήματα για τις εφαρμογές τους σε βιομηχανικούς αντιδραστήρες (ή ζυμωτήρες). Όλα αυτά τα πλεονεκτήματα που συνοψίζονται στον Πίνακα 2.3, πηγάζουν απευθείας από εξαιρετική σταθερότητα αυτών των πρωτεϊνών: Στις υψηλές θερμοκρασίες, το ιξώδες του ζωμού της καλλιέργειας μειώνεται, αυξάνεται η μεταφορά μάζας κάνοντας εύκολη την ανάδευση και την άντληση των υποστρωμάτων. Αυτό το πλεονέκτημα είναι πολύ σημαντικό για κάποιες από τις υπάρχουσες εφαρμογές των ενζύμων, όπως αυτή της υδρόλυσης των πολυσακχαριτών (polysaccharides) (Bergquist et al., 1987; Kristjansson, 1989) Οι απαιτήσεις αποστείρωσης δεν είναι τόσο αυστηρές σε σχέση με τη χρησιμοποίηση ενζύμων από μεσόφιλους μικροοργανισμούς, λόγω της μικρής πιθανότητας μόλυνσης. Εκτός από αυτά, τα ένζυμα αυτά έχουν μικρή δραστικότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες. Αυτό τους επιτρέπει να σταματήσουν την αντίδραση μόνο με τη ψύξη. Είναι πιο ανθεκτικά, σε σχέση με τα μουσόφιλα, στην παρουσία μέσων απενεργοποίησης τους που βρίσκονται συνήθως στις αντιδράσεις, όπως οργανικοί διαλύτες, υψηλό και χαμηλό ph. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

80 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 45 Τέλος, καθώς μεγάλης κλίμακας διεργασίες ζύμωσης παράγουν θερμότητα, η συνηθισμένη ψύξη των αντιδραστήρων μπορεί να αποφευχθεί, όταν χρησιμοποιούνται θερμόφιλα ή τα ενζυμα τους. Πίνακας 2.3 Κύρια πλεονεκτήματα εφαρμογών θερμόφιλων ενζύμων στη βιομηχανία (Lasa and Berenguer, 1993). Ιδιότητα Θερμοανθεκτικότητα Αντοχή σε ποικίλους χημικούς παράγοντες Υψηλή βέλτιστη θερμότητα Διαλυτότητα Ιξώδες Μικροβιακή μόλυνση Πλεονεκτήματα Χρόνος ημίσειας ζωής του ενζύμου αυξάνεται. Ο καθαρισμός των ενζύμων είναι ευκολότερος. Μπορούν να αντέξουν σε ακραίες συνθήκες συμπεριλαμβανομένου μεγάλες ποσότητες οργανικού διαλύτη, διάφορα επίπεδα ph Χαμηλή δραστικότητα σε θερμοκρασία δωματίου. Δε χρειάζεται δραστική ψύξη στη διεργασία. Υψηλό ποσοστό διάχυσης των υποστρωμάτων και των προϊόντων. Σε υψηλές θερμοκρασίες η συγκέντρωση των υποστρωμάτων μπορεί να αυξηθεί με εξαίρεση αυτή των αερίων. Μειώνεται. Η ανάδευση και η άντληση μπορεί να αυξηθεί. Η πιθανότητα μόλυνσης μειώνεται καθώς ανεβαίνει η θερμοκρασία. Παρόλα αυτά, εκτός από τα πολλά σημαντικά οικονομικά πλεονεκτήματα των θερμόφιλων ενζύμων, υπάρχουν επίσης και κάποια μειονεκτήματα για κάποιες εφαρμογές (Πίνακας 2.4) τα οποία είναι τα ακόλουθα: Κάποια συνένζυμα που συνήθως χρησιμοποιούνται στη φαρμακευτική βιομηχανία καταστρέφονται με τη θερμότητα Η διαλυτότητα των αερίων όπως το οξυγόνο μειώνεται. Η αμετάκλητη απενεργοποίηση των ενζύμων είναι δύσκολη και ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

81 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 46 Τα υλικά των αντιδραστήρων καταστρέφονται εύκολα, εκτός και αν είναι ειδικά κατασκευασμένα για να δουλεύουν σε υψηλές θερμοκρασίες (Lasa and Berenguer, 1993). Πίνακας 2.4 Κύρια προβλήματα εφαρμογών θερμόφιλων ενζύμων στη βιομηχανία (Lasa and Berenguer, 1993). Ιδιότητα Ευαισθησία στην θερμότητα Διαλυτότητα αερίων Σταθερότητα ενζύμων Εξοπλισμός Κύριο πρόβλημα που παρατηρήθηκε Υπάρχουν αρκετά υποστρώματα, προϊόντα ή συνένζυμα ασταθή σε υψηλές θερμοκρασίες. Μειώνεται. Η διάχυση των αερίων περιορίζει κάποιες αντιδράσεις. Η απενεργοποίηση των ενζύμων είναι πολύ δύσκολη. Όλα τα υλικά καταστρέφονται σε σύντομο χρονικό διάστημα εκτός αν είναι ειδικά σχεδιασμένα. Παρόλα τα πολλά πλεονεκτήματα που έχουν τα ένζυμα από τους θερμόφιλους μικροοργανισμούς, για τη χρήση τους στη βιομηχανία, οι βιοτεχνολογικές εφαρμογές τους είναι πολύ περιορισμένες μέχρι σήμερα. Οι λόγοι που συμβαίνει αυτό οφείλεται στο κόστος και το ρίσκο που έχει μια καινούρια μέθοδος. Ένας άλλος λόγος είναι ο περιορισμένος αριθμός των θερμόφιλων μικροοργανισμών που είναι διαθέσιμα για να μελετηθεί η θερμοανθεκτικότητα των ενζύμων τους (Brock, 1985, Kristjansson, 1989). Παρόλα αυτά, κατά τη διάρκεια των τελευταίων χρόνων κάποια ένζυμα από θερμόφιλους μικροοργανισμούς έχουν εμπορευματοποιηθεί (Kristjansson, 1989), τα πιο σημαντικά από οικονομικής πλευράς, όπως οι πρωτεάσες για την παραγωγή απορρυπαντικών. 2.3 Λιπασές Οι λιπάσες (ακυλοϋδρολάσες των τριακυλογλυκορολών (triacylglycerol acylhohdrolases), E.C ) είναι ευρέως διαδεδομένα ένζυμα αξιοσημείωτης ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

82 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 47 φυσιολογικής σημασίας και βιομηχανικής δυνατότητας. Οι λιπάσες καταλύουν την υδρόλυση των τριακυλογλυκερολών σε γλυκερόλη και σε ελεύθερα λιπαρά οξέα. Σε αντίθεση με τις εστεράσες, οι λιπάσες ενεργοποιούνται μόνο όταν προσροφούνται σε μία διεπιφάνεια οργανικής υδατικής φάσης (Martinelle et al., 1995). Μια πραγματική λιπάση διαιρεί γαλακτοποιημένους εστέρες σε γλυκερίνη και μεγάλες αλυσίδες λιπαρά οξέα όπως τριολεείνη και τριπαλμιτίνη. Οι λιπάσες είναι υδρολάσες σερίνης (serine hydrolases) και επιδεικνύουν μικρή δραστικότητα σε υδατικά διαλύματα που περιέχουν διαλυτά υποστρώματα. Εν αντιθέσει, οι εστεράσες δείχνουν κανονική κινητική, βάσει του μοντέλου Michaelis-Menten στα διαλύματα. Στους ευκαριωτικούς οργανισμούς οι λιπάσες εμπλέκονται σε διαφορετικά στάδια του μεταβολισμού των λιπιδίων συμπεριλαμβανομένου στην χώνεψη των λιπών, στην απορρόφηση, στην αναδόμηση και στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών (Rohit et al., 2001). Εμπορικά, οι χρήσιμες λιπάσες συνήθως προμηθεύονται από μικροοργανισμούς που παράγουν μία μεγάλη ποικιλία εξωκυττάριων λιπασών. Πολλές λιπάσες είναι δραστικές σε οργανικούς διαλύτες όπου καταλύουν ένα αριθμό χρήσιμων αντιδράσεων, συμπεριλαμβανομένου αυτής της εστεροποιήσης (Chowdary et al., 2001; Hamsaveri et al., 2001; Kiran, et al., 2001; Kiyota, et al., 2001; Krishna and Karanth, 2001; Krinsha et al., 2001; Rao and Divakar, 2001), υπερεστεροποίηση, μετεστεροποίηση (transesterification), τοπο-εκλεκτική ακυλίωση των γλυκολών και μεθανολών, και της σύνθεση των πεπτιδίων (Ducret et al., 1998; Zhang et al., 2001) και άλλων χημικών (Therisod and Klibanov, 1987; Weber et al., 1999; Azin et al., 2001) Ιστορία της λιπάσης Οι λιπάσες ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά το 1856 από τον Claude Bernard μέσα σε παγκρεατικό χυμό. Το εκχύλισμα ζωικού παγκρέατος ήταν η κυρίως πηγή παραγωγή της λιπάσης για εμπορικές εφαρμογές. Ωστόσο, η παραγωγή της λιπάσης από μικρόβια άρχισε να διερευνείται όταν οι βιομηχανικές δυνατότητες των λιπασών ενισχύθηκαν και η παραγωγή τους από πηγές ζώων δεν μπορούσε να καλύψει της ανάγκες της αγοράς (Sangeetha et al., 2011) Βακτηριακές πηγές λιπάσης H μικροβιακή παραγωγή των ενζύμων είναι ανώτερη από την παραγωγή τους από φυτά ή ζώα, καθώς μπορούν να καλλιεργηθούν εύκολα σε μεγάλες ποσότητες και να τροποποιηθούν γενετικά (Hasan et al., 2006). Εμπορικά, οι μικροβιακές λιπάσες ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

83 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 48 παράγονται από βακτήρια, μύκητες και ακτινομύκητες (actinomycetes) (Babu and Rao, 2007). Οι πιο καλά μελετημένες μικροβιακές λιπάσες είναι αυτές που έχουν απομονωθεί από μύκητες. Παρόλα αυτά, τα βακτηριακά γένη εξετάζονται συνεχώς και βελτιώνονται για την παραγωγή της λιπάσης. Οι βακτηριακές λιπάσες παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά το 1901 στα γένη Serratia marescens και Pseudomonas aeruginosa (Hasan et al., 2006). Από τότε, η παραγωγή της λιπάσης από πολλά διαφορετικά είδη βακτηρίων έχει εκτεταμένα μελετηθεί και αναφερθεί. Υπάρχουν πολλές διαθέσιμες αναφορές για παραγωγή της βακτηριακής λιπάσης ειδικά από τους Pseudomonas και Bacillus sp. (Madan and Mishra, 2010). Μερικά από αυτά είναι: Pseudomonas fluorescens (Yang et al., 2009), Bacillus pumilus (Sangeetha et al., 2010a), B. thermocatenulatus (Quyen et al., 2003), B. subtilis (Ahmed et al., 2010), B. licheniformis (Sangeetha et al., 2010b), B. coagulans (Mnisi et al., 2005), B. cereus (Dutta and Ray, 2009) και B. halodurans (Ramchuran et al., 2006). Επίσης, έχουν μελετηθεί και άλλα είδη βακτηρίων όπως: Acinetobacter (Li et al., 2004), Staphylococcus (Talon et al., 1996), Burkolderia (Wang et al., 2009), S. marescens (Long et al., 2007), Achromobacter, Arthrobacter, Alcaligenes και Chromobacterium (Riaz et al., 2010) Κυτταρική τοποθεσία λιπασών Οι βακτηριακές λιπάσες μπορεί να είναι ενδοκυτταρικές, δεσμευμένες στην κυτταρική μεμβράνη ή εξωκυττάριες. Για παράδειγμα, έχει αναφερθεί η ενδοκυτταρική παραγωγή τη λιπάσης από τον B. clausii (Lee and Park, 2008). Τα βακτηριακά γένη που παράγουν μόνο ενδοκυτταρικές λιπάσες μπορούν να αναπτυχθούν μόνο σε γλυκερόλη και απλά λιπίδια, αλλά όχι σε μεγάλης αλυσίδας τριγλυκερίδια. Η ομάδα του Ertugrul (2007) παρατήρησε την ταυτόχρονη ενδοκυτταρική και εξωκυτταρική παραγωγή της λιπάσης από το Bacillus sp. Oι Boekema et al. (2007) ανέφερε την εξωκυττάρια παραγωγή της λιπάσης ως αποτέλεσμα της έκκρισης συσσωρευμένης ενδοκυτταρικής λιπάσης από δεσμευμένες στην κυτταρική μεμβράνη σαπερόνες. Τα βακτήρια εκκρίνουν την λιπάση στο μέσο ανάπτυξης μέσο διαφορετικών τύπων συστημάτων έκκρισης. Το σύστημα έκκρισης τύπου Ι (Τ1SS) περιλαμβάνει ένα ενεργειακό σύμπλοκο που οδηγεί στην έκκριση που αποτελείται από τρείς πρωτεϊνικές υπομονάδες. Το σύστημα έκκρισης τύπου ΙΙ (Τ2SS) περιλαμβάνει δυο συνθέσεις (components): τη γενική πρωτεϊνική έκκριση, Sec-εξαρτημένο μονοπάτι (Sec-dependent pathway) και το (twin-arginate translocate) Tat-εξαρτημένο μονοπάτι (Sangeetha et al., 2011). Οι βακτηριακές λιπάσες εκκρίνονται σε αποδιαταγμένη κατάσταση (unfolded state) μέσω του ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

84 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 49 Sec-εξαρτημένου μονοπατιού μέσα στην πλασματική μεμβράνη όπου διπλώνονται με την βοήθεια σαπερωνών που ονομάζονται φολντάσες των λιπασών (lipase-specific foldase) (Lif). Η αναδιπλωμένη λιπάση στην συνέχεια μεταφέρεται στο εξωτερικό μέσο ανάπτυξης μέσω ενός σύμπλοκου μεταφοράς (transporter complex) (Angkawidjaja and Kanaya, 2006; Buist et al., 2006) Κινητική της λιπάσης Η λιπόλυση λαμβάνει χώρα σε μια διεπιφάνεια υποστρώματος / νερού και για αυτό το λόγο δε μπορεί να περιγραφεί απόλυτα με από το Michaelis Menten μοντέλο, το οποίο ισχύει μόνο για βιοκατάλυση σε ομογενής φάση, στην οποία το υπόστρωμα και το ένζυμο είναι διαλυτά. Ένα απλό μοντέλο έχει προταθεί για την περιγραφή της κινητικής της λιπόλυσης σε μία διεπιφάνεια (Verger, et al., 1973; Verger, and de Haas, 1976) και αποτελείται από δυο διαδοχικά σημεία ισορροπίας (equilibria). Στην πρώτη φάση ισορροπίας, εμφανίζεται αντιστρεπτή προσρόφηση του ενζύμου με την διεπιφάνεια (E E * ), ενώ στη δεύτερη φάση, το προσροφημένο ένζυμο ενώνεται με ένα μόριο του υποστρώματος (S), με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός συμπλόκου (E * S). Αυτή η τελευταία ισορροπία είναι ισοδύναμη με την Michaelis Menten ισορροπία για το σύμπλοκο ένζυμο υπόστρωμα. Όταν δημιουργείται το σύμπλοκο (E * S), λαμβάνουν χώρα μεταγενέστερα καταλυτικά βήματα, καταλήγοντας με απελευθέρωση των προϊόντων (P) και την αναγέννηση του ενζύμου στην μορφή (E * ). Αυτό το μοντέλο λαμβάνει υπόψη το γεγονός ότι η συγκέντρωση του υποστρώματος που βρίσκεται γύρω από το προσροφημένο ένζυμο στην διεπιφάνεια, είναι η συγκέντρωση στην επιφάνεια (εκφρασμένη σε moles / units της επιφάνειας) (moles per units of surface area) αντί για την ογκομετρική συγκέντρωση που βρίσκεται στο περιβάλλον (volumetric concentration established in the environment). Σε αυτό το μοντέλο, η αναγεννημένη λιπάση παραμένει προσροφημένη στη διεπιφάνεια και απελευθερώνεται μόνο μετά από κάποιους καταλυτικούς κύκλους (Σχήμα 2.3), (Houde et al., 2004) Δομή λιπάσης Οι βακτηριακές λιπάσες, ποικίλουν σε μέγεθος (20-60 kda), καθώς και η σειρά παράταξης των στοιχείων της δευτερεύουσας δομής τους αποκαλύπτουν σε κάποιο βαθμό μία απόκλιση, πιθανόν όμως όλες να έχουν παρόμοιες συνολικές τρισδιάστατες δομές (Jaeger et al., 1994). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

85 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 50 Το 1990, με τη βοήθεια κρυσταλλογραφίας ακτινών-χ, αποσαφηνίστηκε η δομή των πρώτων δύο λιπασών και ένας μοναδικός μηχανισμός διαφορετικός από οποιοδήποτε άλλο ένζυμο. Η τρισδιάστατη μορφή τους δηλώνει ότι η διεπιφανειακή ενεργοποίηση, που παρατηρείται στο ένζυμο, μπορεί να οφείλεται στην παρουσία ενός αμφίφυλου πεπτιδίου βρόγχου που καλύπτει την ενεργή θέση του ενζύμου στο διάλυμα, όπως ένα «καπάκι» (lid ή flap) (Winkler et al., 1990; Brady et al., 1990). Από τις ακτίνες Χ η δομή των συγκρυστάλλων μεταξύ της λιπάσης και του υποστρώματος αναλογικά υπάρχει μια ισχυρή έμμεσή απόδειξη ότι, όταν υπάρχει επαφή με μια διεπιφάνεια λιπιδίου / νερό, αυτό το καπάκι υφίσταται μια επαναδιευθέτηση της διαμόρφωσης της πρωτεϊνικής δομής το οποίο καθιστά το ενεργό μέρος προσβάσιμο στο υπόστρωμα. (Σχήμα 2.4) (Brozozowski, 1991). Λιπίδια Νερό Σχήμα 2.3 Δομή συμπλόκου ΗΡL- λιπάσης στην κλειστή (Ε) και ανοιχτή διαμόρφωση (Ε * S). Οι δύο αυτές εικόνες δείχνουν την αλλαγή της διαμόρφωση του καλύματος (lid) που γίνεται στη β5 θηλιά (loop) και της συνλιπάσης κατά τη διάρκεια της διεπιφανειακής ενεργοποίησης (Schmid and Verger, 1998). Παρόλα αυτά, από μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στα πλαίσια ευρωπαϊκού προγράμματος, αποδείχτηκε ότι δεν ανταποκρίνονται όλες οι λιπάσες στο φαινόμενο της ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

86 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 51 διεπιφανειακής ενεργοποίησης. Έτσι, οι λιπάσες από τους μικροοργανισμούς Pseudomonas glumae και Candida antarctica (type B), όπου η τρισδιάστατη δομή τους είναι γνωστή, και οι δύο έχουν ένα αμφιφιλικό καπάκι (amphiphilic lid). που καλύπτει το ενεργό μέρος αλλά δεν εμφανίζουν διεπιφανειακή ενεργοποίηση (Noble, 1993; Uppenberg, 1994; Schmid and Verger, 1998). Σχήμα 2.4 Δομή της λιπάσης Mucor miehei στην κλειστή (Α, C) και ανοιχτή (B, D) της μορφή. A και Β (πλαϊνή όψη): η καταλυτική τριάδα με κίτρινο χρώμα και τα στοιχεία της δευτερεύουσας δομής δείχνουν τη δομή a/b-υδρολάση κοινή σε όλες τις λιπάσες. C και D (κάτοψη): μοντέλο της πλήρωσης του χώρου, χρωματισμένο με μείωση της πόλωσης (σκούρο μπλε ± ανοιχτό μπλε ± άσπρο ± ανοιχτό κόκκινο ± σκούρο κόκκινο). Καθώς ανοίγει το καπάκι, η καταλυτική τριάδα (κίτρινο) γίνεται προσβάσιμη (D), και οι τοπικοί δεσμοί στην διεπιφάνεια γίνονται σημαντικά μη πολικοί (Schmid and Verger, 1998). Μέχρι στιγμής όλες οι λιπάσες που η δομή τους έχει διευκρινιστεί ανήκουν στην ομάδα της οικογένειας «α/β-υδρολάσης» με μία κοινή αρχιτεκτονική σύνθεση με συγκεκριμένη ακολουθία με α έλικες (helices) και β ελάσματα (strands) (Winkler et al.,1990; Brady et al.,1990; Noble et al.,1993; Uppenberg et al.,1994; Grochulski et al.,1993, Schrag and Cygler, 1993; Derewenda et al., 1994; Martinez et al.,1992; Schrag et al., 1997; Ollis et ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

87 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 52 al., 1992). Υδρολύουν εστερικούς δεσμούς μέσω μιας «καταλυτικής τριάδας», που αποτελείται από μια τριάδα αμινοξέων, σερίνη-ιστιδίνη, και ασπαραγινικό ή γλουταμινικό οξύ, (Σχήμα 2.5) (Schmid and Verger,1998). Σχήμα 2.5 Καταλυτικός μηχανισμός των λιπασών βασισμένος στην «καταλυτική τριάδα» σερίνης, ιστιδίνης, και ασπαρτικής ή γλουταμινικού (συνδεόμενων μέσο ενός δεσμού υδρογόνου). Το τετραεδρικό σύμπλοκο σταθεροποιείται από ένα οξυανιόν. To αμινοξύ σε αυτό το παράδειγμα αναφέρεται στη λιπάση από το μικροοργανισμό Rhizopus oryzae. (Schmid and Verger, 1998). Όπως έχει ήδη σημειωθεί, ένα κοινό χαρακτηριστικό της δομής στις περισσότερες λιπάσες είναι ένα καπάκι που αποτελείται από μια αμφίφυλη α έλικα πεπτιδικής ακολουθίας, η οποία στην κλειστή της μορφή (π.χ. στην απουσία ενδιάμεσης φάσης ή ενός οργανικού διαλύτη) εμποδίζει την πρόσβαση του υποστρώματος στην καταλυτική τριάδα. Όταν ανοίξει το καπάκι, δημιουργείται μία μεγάλη υδροφοβική επιφάνεια στην οποία ενώνεται το υδροφοβικό υπόστρωμα (super-substrate) (συνήθως σταγόνα λαδιού). Αυτός ο υποθετικός μηχανισμός, υποστηρίζεται από τη δομή των ακτινών-χ των λιπασών που ενώνονται ομοιοπολικά με υδροφοβικούς αναστολείς όπως τα αλκυλοφωσφονικά, τα κυκλοαλκυλοφωσφονικά ή τα αλκυλοσουλφονικά. Αυτά αποκαλύπτουν ένα ανοιχτό ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

88 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 53 καπάκι, υπονοώντας ότι τα φωσφονικά μιμούνται τη μεταβατική κατάσταση για την ακυλίωση και τα σουλφωνικά για την αποακετυλίωση (deacylation) των φυσικών υποστρωμάτων τριαλκυλο γλυκερικών εστέρων (Derewenda and Derewenda, 1991, Derewenda and Sharp, 1993). Συνοψίζοντας τα παραπάνω, όλες οι λιπάσες που έχουν ερευνηθεί μέχρι τώρα, παρουσιάζουν έναν εκπληκτικό βαθμό ομοιότητας στη δομή και τη λειτουργικότητα τους, ανεξάρτητα από ποιόν οργανισμό έχουν απομονωθεί (Schmid and Verger, 1998). Ταξινόμηση των βακτηριακών λιπασών Οι λιπάσες ανήκουν στην οικογένεια των υδρολασών σερίνης και η δραστικότητα της βασίζεται στην καταλυτική τριάδα που αποτελείται από την σερίνη, ιστιδίνη και ασπαργινικό και μια δομή α/β υδρολάσης (De Pascale et al., 2008). Τα βακτηριακά λιπολυτικά ένζυμα κατηγοριοποιούνται σε 8 οικογένειες και η μεγαλύτερη οικογένεια από 6 υπό-οικογένειες σύμφωνα με τους Arpigny και Jaeger (1999). Αυτή η κατηγοριοποίηση βασίστηκε στα συντηρημένα μοτίβα ακολουθίας και στις βιολογικές ιδιότητες των ενζύμων. Οι πραγματικές λιπάσες ανήκουν στην οικογένεια Ι, η οποία αποτελείται από τις περισσότερες λιπάσες των Pseudomonas, Bacillus και Staphylococcus. Αυτές οι λιπάσες κατέχουν το συμβατικό καταλυτικό πενταπεπτίδιο Gly-X-Ser-X-Gly. Η οικογένεια ΙΙ αποτελείται από τις λιπάσες που παρουσιάζουν το μοτίβο Gly-Asp-Ser-Leu στο ενεργό τους μέρος και τις εστεράσες των Streptomyces, Aeromonas και Salmonella. Η οικογένεια ΙΙΙ περιλαμβάνει τις λιπάσες των Streptomyces sp, αλλά σε αντίθεση με την οικογένεια ΙΙ, αυτές οι εστεράσες είναι εξωκυττάριες λιπάσες. Οι λιπάσες που παρουσιάζουν ομοιότητες με τις ορμονοευαίσθητες λιπάσες θηλαστικών (mammalian hormone sensitive lipases), κατατάσσονται στην οικογένεια ΙV ενώ οι λιπάσες από τα μεσόφιλα βακτήρια όπως P. oleovorans και Haemophilus influenza ανήκουν στην οικογένεια V. Στην οικογένεια VI των λιπασών, βρίσκονται οι μικρότερες εστεράσες και τα ενεργά ένζυμα είναι διμερή. Στην οικογένεια VII των λιπασών, ανήκουν οι μεγάλες εστεράσες και η αλληλουχία των αμινοξέων είναι ομόλογη με αυτή των ευκαρυωτικών εστερασών ακετυλοχολίνης. Στην οικογένεια VIII βρίσκονται οι λιπάσες που είναι παρόμοιες με τις β-λακταμάσες. Οι αλληλουχίες μερικών άλλων ενζύμων που δεν μπόρεσαν να ομαδοποιηθούν σε κάποια από τις 8 οικογένειες που περιγράφονται από τους Arpigny και Jaeger, κατηγοριοποιούνται αυθαίρετα ως νέα οικογένεια 9 και 10. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

89 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 54 Μια άλλη περιεκτική βάση δεδομένων για τις μικροβιακές λιπάσες και εστεράσες είναι το MELDB (Kang et al., 2009). Αυτή η κατηγοριοποίηση πραγματοποιήθηκε βάση των συντηρημένων αλληλουχιών (conserved sequence) των ενζύμων που προέκυψαν από την τοπική στοίχιση ακολουθιών (local sequence alignment) και τον αλγόριθμο γραφικής ομαδοποίησης (graph clustering algorithm) (Tribe MCL) (Sangeetha et al., 2011). 2.4 Παραγωγή λιπάσης και παράγοντες που την επηρεάζουν Οι μικροβιακές λιπάσες παράγονται κυρίως σε υδατικές καλλιέργειες (Ito, 2001), αλλά μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν και μέθοδοι στερεής φάσης καλλιέργειες (Christi, 1999). Πολλές μελέτες έχουν γίνει για να ορίσουν τη βέλτιστη καλλιέργεια και τα θρεπτικά στοιχεία που χρειάζονται για την παραγωγή της λιπάσης σε υδατική καλλιέργεια. Η παραγωγή της λιπάσης επηρεάζεται από τον τύπο και τη συγκέντρωση των πηγών άνθρακα και αζώτου, το ph της καλλιέργειας, τη θερμοκρασία ανάπτυξης και τη συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου (Elibol and Ozer, 2001). Λιπιδικές (lipidic) πηγές άνθρακα φαίνεται να είναι ουσιώδεις για την καλύτερη απόδοση της παραγωγής της λιπάσης, ωστόσο, έχουν επιτευχτεί και καλές αποδόσεις σε απουσία λιπών και ελαίων (Sharma et al., 2001) Επίδραση πηγής άνθρακα Η πηγή άνθρακα έχει αναφερθεί ως ο σημαντικότερος παράγοντας για την έκφραση της δραστικότητας της λιπάσης, καθώς θεωρείται επαγόμενο (inducible) ένζυμο. Αυτά τα ένζυμα συνήθως παράγονται παρουσία ενός λιπιδίου όπως είναι το λάδι ή οποιουδήποτε άλλου παρακινητή όπως οι τριακυλογλυκελόλες, λιπαρά οξέα, ικανοί προς υδρόλυση (hydrolysable) εστέρες, χολικά άλατα και γλυκερόλη (Gupta et al., 2004; Sharma et al., 2001). Οι πηγές άνθρακα από λιπίδια φαίνεται να είναι ουσιώδεις για παραγωγή της λιπάσης με μεγάλη απόδοση (Trechel et al., 2010). Ωστόσο, η παραγωγή τους επηρεάζεται σημαντικά και από άλλες πηγές άνθρακα όπως είναι τα σάκχαρα, οι πολυσακχαρίτες, το τυρόγαλα (ορό γάλατος) και άλλες σύνθετες πηγές (Gilbert et al., 1991a; Lotrakul and Dharmsthiti, 1997; Dharmstiti and Kuhasuntisuk, 1998; Ghanem et al., 2000; Rashid et al., 2001). Κάποια μεγάλης αλυσίδας λιπαρά οξέα, όπως είναι το ελαϊκό (oleic), το λινελαϊκό (linoleic) και το λινολαϊκό (lonolenic), είναι γνωστό ότι υποστηρίζουν την παραγωγή της λιπάσης από διάφορα βακτήρια όπως είναι το P. mephitica (Ghosh, et al., 1996). Ωστόσο, οι λιπάσες από τους μικροοργανισμούς P. aeruginosa EF2 (Gilbert, et al., 1991a) και ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

90 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 55 Acinetobacter calcoaceticus (Mahler, et al., 2000), παρουσία μεγάλων αλυσίδων λιπαρών οξέων, όπως το ελαϊκό οξύ, έχει αναφερθεί ότι η παραγωγή της καταστέλλεται. Οι Sugihara, et al. (1991) ανέφεραν παραγωγή της λιπάσης από τον Bacillus sp. στην παρουσία 1% (v/v) λάδι ελιάς στο μέσο ανάπτυξης της καλλιέργειας. Μικρή ενζυμική δραστικότητα εμφανίστηκε απουσία ελαιόλαδου, ακόμα και μετά από παρατεταμένη καλλιέργεια. Η φρουκτόζη και το φοινικέλαιο αναφέρθηκαν ως οι καλύτερες πηγές υδατανθράκων και λιπιδίων, αντίστοιχα, για την παραγωγή εξωκυττάριας λιπάσης από τον Rhodotorula glutinis. Όταν οι δυο αυτές πηγές άνθρακα συγκριθήκαν, το φοινικέλαιο με συγκέντρωση 2% (v/v) βρέθηκε να παράγει 12 φορές πιο πολύ λιπάση από ότι η φρουκτόζη (Papaparaskevas et al., 1992). Μια αλκαλική λιπάση από τον Penicillium expansum απέδωσε μέγιστη δραστικότητα όταν η βιομάζα αναπτύχθηκε σε ένα μέσο που περιείχε ελαιόλαδο (0.1%) σε ph 8.3. Η σταθερότητα του ενζύμου ενισχύθηκε με την προσθήκη του Τween 20 και Lubrox PX (Sztajer et al., 1993). H παραγωγή μιας θερμοάντοχης λιπάσης από τον θερμόφιλο μικροοργανισμό Bacollus sp. strain Wai 28A 45, παρουσία τριπαλμιτίνης στους 70 ο C περιγράφει η ομάδα του Janssen (1994). Τα μέσα ανάπτυξης που εξετάστηκαν είχαν ως πηγή άνθρακα τριπαλμιτίνη (tripalmitin), τριστεαρίνη (tristearin) και tristystin με το πρώτο να είναι ο καλύτερος παρακινητής για την δραστικότητα της λιπάσης. Οι Gao και Breuil (1995) σύγκριναν διαφορετικά λάδια φυτών για την παραγωγή της λιπάσης από τον Ophiostoma piceae. Υψηλά επίπεδα δραστικότητας της λιπάσης αποκτήθηκαν όταν λάδια από φυτά (ελιά, σόγια, ηλίανθο, σουσάμι, σπόρος βαμβακιού, καλαμπόκι και φιστίκι) χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή άνθρακα. Η μέγιστη παραγωγή της λιπάσης σημειώθηκε όταν χρησιμοποιήθηκε ελαιόλαδο. Αντίστοιχα, ο θερμόφιλος Bacillus strain A30-1 (ATCC 53841), όταν ως πηγές άνθρακα χρησιμοποιήθηκαν καλαμποκέλαια και ελαιόλαδα (1%) (v/v) είχε τις καλύτερες επιδώσεις παραγωγής μια θερμοάντοχης αλκαλικής λιπάσης (Wang et al., 1995). Η ομάδα του Gordillo (1995) παρατήρησε ότι η παραγωγή της λιπάσης από τον C. rugosa επηρεάστηκε από την αρχική συγκέντρωση του ελαϊκού οξέος (oleic acid). Η μέγιστη απόδοση της λιπάσης αποκτήθηκε με αρχική συγκέντρωση 2 g/l και η απόδοση μειώθηκε με μεγαλύτερη συγκέντρωση του ελαϊκού οξέος. Αρκετές άλλες μελέτες επιβεβαίωσαν την ενίσχυση της παραγωγής της λιπάσης όταν λάδια χρησιμοποιούνται ως παρακινητές. Οι Lin et al. (1996) παρήγαγαν μια αλκαλική λιπάση από τον P. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

91 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 56 pseudoalcaligenes F-111 με ένα μέσο ανάπτυξης που περιέχει ελαιόλαδο (0.4% v/v) και Triton X-100 (0.2%). H προσθήκη του Triton X-100 ενίσχυσε 50 φορές την παραγωγή της λιπάσης σε σχέση με όταν χρησιμοποιήθηκε μόνο ελαιόλαδο ως πηγή άνθρακα. Λόγω της χρήσης τους σε αλκαλικά καθαριστικά, οι αλκαλοσταθερές λιπάσες έχουν μεγάλη ζήτηση. Μια αλκαλική λιπάση παράχθηκε από τον P. alcaligenes M-1 σε ένα μέσο ανάπτυξης με κιτρικό οξύ και σογιέλαιο ως υποστρώματα σε ασυνεχείς (Batch) και ημιασυνεχείς (fed - batch) φάσεις, αντίστοιχα (Gerritse et al., 1998). Αυτή η λιπάση έχει εξαιρετική ικανότητα για να αφαιρεί λιπαρούς λεκέδες σε αλκαλικό περιβάλλον. Ένα θερμόφιλο βακτήριο, B. thermoleovorans ID-1, που απομονώθηκε σε θερμές πηγές στην Ισλανδία, εμφάνισε εξωκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης και μεγάλο ρυθμό ανάπτυξης σε υπόστρωμα λιπιδίων σε αυξημένες θερμοκρασίες (Lee et al., 1999). Χρησιμοποιώντας λάδι ελιάς (1.5% v/v) ως τη μοναδική πηγή άνθρακα, ο μικροοργανισμός αναπτύχθηκε γρήγορα στους 65 o C και η μέγιστη δραστικότητα της λιπάσης παρατηρήθηκε στο τέλος της εκθετικής φάσης. O Dominguez (2007) και η ομάδα του μελέτησαν την επίδραση μονοσακχαριτών (monosaccharides) (γλυκόζη, φρουκτόζη) και δισακχαριτών (disaccharides) (μαλτόζη και σουκρόζη) σε διάφορους θερμόφιλους μικροοργανισμούς (T. aquaticus YT1, T. thermophilus HB8 και HB27). H σουκρόζη ενίσχυσε την παραγωγή της ενδοκυττάριας λιπάσης στους μικροοργανισμούς T. aquaticus YT1 και T. thermophilus HB8, ενώ η ενδοκυττάρια και εξωκυττάρια παραγωγή της λιπάσης ενισχύθηκε με την παρουσία της μαλτόζης στον μικροοργανισμό T. thermophilus HB27. Η εξωκυτάρια παραγόμενη λιπάση από το μικροοργανισμό T. aquaticus YT1 ενισχύθηκε με τη φρουκτόζη. Επίσης διαπίστωσαν ότι η παρουσία λαδιού ελιάς αύξησε κατά 70% την παραγωγή της εξωκυττάριας λιπάσης στον T. thermophilus HB27. Παρόμοια μελέτη έκανε και η ομάδα του Deive (2009), οι οποίοι μελέτησαν την επίδραση διαφόρων λαδιών στην παραγωγή της λιπάσης από το θερμόφιλο μικροοργανισμό T. thermophilus HB27. Παρατήρησαν ότι το ηλιέλαιο ήταν ο πιο ικανός παρακινητής για τη μεγαλύτερη δραστικότητα της λιπάσης από όλα τα έλαια που μελετήθηκαν (καρυδέλαιο και ελαιόλαδο). Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω, μπορεί να συμπεράνει κανείς ότι η παραγωγή της λιπάσης είναι εξαρτημένη από έναν παρακινητή (inducer-dependent) και στις περισσότερες φορές τα λάδια δρουν ως καλοί παρακινητές για το ένζυμο. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

92 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς Επίδραση πηγής αζώτου Εκτός από την πηγή άνθρακα, το είδος της πηγής αζώτου στο μέσο ανάπτυξης επηρεάζει επίσης την παραγωγή της λιπάσης (Ghosh et al., 1996). Γενικά, ως πηγή αζώτου προτιμάται το οργανικό άζωτο όπως είναι η πεπτόνη και το εκχύλισμα ζύμης, τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή της λιπάσης από διάφορα είδη βακτηρίων όπως είναι τα Bacillus spp, τα Pseudomonas, και ο Staphylococcus haemolyticus (Wang et al., 1995; Khyami-Horani, 1996, Pabai et al., 1996, Oh, et al., 1999, Ghanem, et al., 2000; Lanser, et al., 2002; Sharma, et al., 2002 b), ενώ τρυπτόνη και εκχύλισμα ζύμης έχουν χρησιμοποιηθεί στην περίπτωση του S. haemolyticus L62 (Oh et al., 1999). Ανόργανες πηγές αζώτου όπως το χλωριούχο αμμώνιο και διαμμωνιακό υδρογονούχο φωσφορικό (diammonium hydrogen phosphate), έχουν αναφερθεί να είναι αποτελεσματικά για την παραγωγή της λιπάσης σε μερικά μικρόβια (Gilbert, et al., 1991a, 1991b; Bradoo, et al., 1999, Dong, et al., 1999, Rathi, et al., 2001). Για την εξωκυττάρια παραγωγή της λιπάσης από τον μικροοργανισμό Pe. citrium, oι Sztajer και Maliszewska (1989) πέτυχαν τη μέγιστη παραγωγή της με ένα μέσο ανάπτυξης που περιείχε 5% (w/v) πεπτόνη. Πηγές αζώτου όπως είναι το εκχύλισμα καλαμποκιού και σόγιας διεγείρουν την παραγωγή της λιπάσης αλλά σε λιγότερο ποσοστό σε σχέση με την πεπτόνη. Σε αντίθεση, η ουρία και το θειικό αμμώνιο αναστέλλουν τη σύνθεση της λιπάσης (Sztajer and Maliszewska, 1989). Μια θερμοάντοχη λιπάση από τον Pseudomonas sp. KWI 56 παράχθηκε με ένα μέσο ανάπτυξης που περιέχει πεπτόνη (2% wt/vol) και εκχύλισμα μαγιάς (0.1% wt/vol) ως πηγές αζώτου (Izumi et al., 1990). Η λιπάση καθαρίστηκε με κατακρήμνιση με ακετόνη και διήθηση σε τζέλ (gel). O συντελεστής καθαρισμού ήταν 13.9 φορές, αλλά η ολική ανάκτηση ήταν μόνο 2.9% (Izumi et al., 1990). Το παραγόμενο ένζυμο είχε μοριακό βάρος περίπου 33 kda, η βέλτιστη θερμοκρασία του ήταν 60 o C και μετά από 24 ώρες στους 60 o C εξακολουθούσε να έχει περισσότερο από 96% της αρχικής του δραστικότητας (Izumi et al., 1990). Ο Acremonium stuctum παράγει μια μεγάλη ποσότητα λιπάσης υπο σταθερές συνθήκες με ένα μέσο ανάπτυξης που περιέχει 35% (w/v) σόγια ως πηγή άνθρακα (Οkeke and Okolo, 1990). Γενικά, οι μικροοργανισμοί παρέχουν μεγάλες αποδόσεις λιπάσης όταν χρησιμοποιείται οργανική πηγή άνθρακα. Μια εξαίρεση αποτελεί ο μικροοργανισμός Rho. glutinis (Papaparaskevas et al., 1992). Αν και για την καλή ανάπτυξη του μικροοργανισμού ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

93 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 58 χρειάζονται οργανικές πηγές άνθρακα (εκχύλισμα ζύμης και τρυπτόνη), μια ανόργανη πηγή άνθρακα όπως το φωσφορικό αμμώνιο φαίνεται να ευνοεί την παραγωγή της λιπάσης (Papaparaskevas et al., 1992). Σε συμφωνία με άλλους συγγραφείς, ο Salleh και η ομάδα του (1993) πέτυχε μέγιστη εξωκυττάρια παραγωγή της λιπάσης από το θερμόφιλο μύκητα Rhizop. oryzae, όταν το μέσο ανάπτυξης περιέχει πεπτόνη ως πηγή άνθρακα. Η ενδοκυττάρια παραγόμενη λιπάση από τον Rhizop. oryzae δεν επηρεάστηκε ιδιαίτερα από τη χρήση οργανικών πηγών άνθρακα (τρυπτόνη, εκχύλισμα καλαμποκιού, πολυπεπτόνη). Σε μελέτες για την παραγωγή θερμοσταθερών λιπασών από θερμόφιλους μύκητες Emericella rugulosa, Humicola sp., T. lanuginosus, Pe. purpurogenum και Chrysosporium sulfureum, η χρήση εκχυλίσματος ζύμης ως πηγή άνθρακα έδωσε υψηλή παραγωγή της λιπάσης (Venkateshwarlu and Reddy, 1993). O μικροοργανισμός A. oryzae παρήγαγε τη μέγιστη αλκαλική λιπάση με ένα μέσο ανάπτυξης που περιείχε εκχύλισμα ζύμης (1%), πολυπεπτόνη (3%) και σόγια (3%) ως πηγές άνθρακα (Ohnishi 1994). Το ένζυμο που παράχθηκε είχε μια βέλτιστη δραστικότητα σε ph 7.5 και 10.0 με αντίστοιχα υποστρώματα ελαιόλαδο και τριβουτυρική. Ένα γένος του μικροοργανισμού Pe. citrium παρήγαγε τη μέγιστη δραστικότητα της λιπάσης με ένα μέσο ανάπτυξης που περιέχει εκχύλισμα μαγιάς (0.5%) ως πηγή άνθρακα (Pimentel et al., 1994). Μια μείωση στη συγκέντρωση του εκχυλίσματος ζύμης ελάττωσε την δραστικότητα της λιπάσης. Επίσης, η αντικατάσταση του εκχυλίσματος μαγιάς με θειικό αμμώνιο μείωσε την παραγωγή της λιπάσης (Pimentel et al., 1994). Οι Wang et al. (1995) ανέφεραν την παραγωγή μιας υψηλά θερμοάντοχη αλκαλικής λιπάσης από τον Bacillus strain A 30-1 (ATCC 53841), σε ένα μέσο που περιέχει εκχύλισμα ζύμης (0.1% w/v) και χλωριούχο αμμώνιο (1%w/v) ως πηγές αζώτου. Η μερικώς καθαρισμένη λιπάση είχε μια βέλτιστη θερμοκρασία δραστικότητας στους 60 ο C και με το βέλτιστο ph ήταν 9.5 (Wang, 1995). Οι Cordenons et al. (1996) εξέτασαν διάφορες πηγές άνθρακα για την παραγωγή εξωκυττάριας λιπάσης από τον Acinetobacter calcoaceticus. Η χρήση αμινοξέων και τρυπτόνης βελτίωσαν την απόδοση της λιπάσης με ένα συντελεστή 2 ή 3 σε σχέση με όταν χρησιμοποιήθηκαν αμμωνία, εκχύλισμα ζύμης και πεπτονική πρωτεάση (Cordenons et al., 1996). Οι Lin et al. (1996) ανέφεραν μια εξωκυττάρια παραγόμενη αλκαλική λιπάση από τον P. alcaligenes F-111 σε ένα μέσο ανάπτυξης που περιέχει σόγια (1% w/v), πεπτόνη (1.5% ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

94 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 59 w/v) και εκχύλισμα ζύμης (0.5% w/v). Η παραγόμενη λιπάση δεν επηρεάστηκε από διάφορα καθαριστικά. Η κατιονική επιφάνεια δραστικών παραγόντων όπως είναι το SDS, το τριπολυφωσφορικό νάτριο, το δωδεκυλοβενζενοσουλφωνικό νάτριο (sodium dodecyl benzene sulfonate) και το άλκυλο βενζένο σουλφονικό νάτριο (sodium alkyl benzene sulfonate) δεν επηρέασαν την ενζυμική δραστικότητα, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτό το ένζυμο είναι ένας καλός υποψήφιος για εφαρμογές του στα απορρυπαντικά Επίδραση μεταλλικών ιόντων Ένας άλλος παράγοντας που επηρεάζει την παραγωγή της λιπάσης είναι η παρουσία μεταλλικών ιόντων. Έχει διαπιστωθεί ότι τα δισθενή κατιόντα μπορούν να διεγείρουν ή να αναστέλλουν την ενζυμική παραγωγή στους μικροοργανισμούς. Οι Rathi et al. (2001) παρατήρησαν ότι η παραγωγή της λιπάσης από το μικροοργανισμό Burkholderia sp. διεγέρθηκε με την παρουσία των ιόντων Ca 2+ και Mg 2+. Οι Sharma et al. (2002), επίσης ανέφεραν διέγερση της παραγωγής της λιπάσης από τον μικροοργανισμό Bacillus sp. RSJ1 παρουσία χλωριούχου ασβεστίου. Ωστόσο, τα περισσότερα μεταλλικά ιόντα ήταν ανασταλτικά στην παραγωγή της λιπάσης. Ο σίδηρος, βρέθηκε να παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην παραγωγή της λιπάσης από το μικροοργανισμό Pseudomonas sp. G6 (Kanwar, et al., 2002). Η παραγωγή της λιπάσης από τον θερμόφιλο Bacillus sp. αυξήθηκε μερικές φορές όταν προστέθηκαν στο μέσο ανάπτυξης ιόντα μαγνησίου, σίδηρου, και ασβεστίου (Janssen et al., 1994). Παρόμοια, οι Pokorny et al. (1994) ανέφεραν ότι η παραγωγή της λιπάσης από τον A. niger ενισχύθηκε στην παρουσία Mg 2+. Η παραγωγή της εξωκυττάριας λιπάσης από το μικροοργανισμό Aci. calcoaceticus BD 413 ενισχύθηκε όταν στο μέσο ανάπτυξης συμπληρώθηκε με Mg 2+, Ca 2+, Cu 2+ και Co 2+ (Kok et al., 1995). Η παραγωγή της λιπάσης από τον P. pseudoalcaligenes F-111, ενισχύθηκε όταν το φωσφορικό μέσο ανάπτυξης εφοδιάστηκε με Μg 2+ (Lin et al., 1995). Αυτή η αλκαλική λιπάση είναι πιο δραστική και σταθερή σε ένα εύρος ph 6-10 και η βέλτιστη θερμοκρασία αντίδρασης ήταν 40 ο C. Η παραγωγή της λιπάσης από τον Bacillus sp. A 30-1 (ATCC 53841) χρειάζεται ένα σύνθετο μέσο ανάπτυξης που να περιέχει Ca 2+, Mg 2+, Na 2+, Co 2+, Cu 2+, Fe 2+, K +, Mn 2+, Mo 2+, και Zn 2+ (Wang et al., 1995). Η μέγιστη παραγωγή της λιπάσης από τον μικροοργανισμό P. pseudoalcaligenes ΚΚΑ- 5 σημειώθηκε με μια συγκέντρωση 0.8 Μ Mg 2+. Χωρίς την προσθήκη μαγνησίου στο μέσο ανάπτυξης, η παραγωγή της λιπάσης μειώθηκε στο περίπου 50% (Sharon et al., 1998), ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

95 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 60 αλλά η προσθήκη ιόντων ασβεστίου στο μέσο ανάπτυξης δεν επηρέασε καθόλου την παραγωγή της λιπάσης. Σε μία περίπτωση, αναφέρθηκε ότι η παρουσία Ca 2+ ενισχύει την παραγωγή της λιπάσης από το θερμόφιλο μικροοργανισμό Bacullus sp. RS-12 (Sidhu et al., 1998a,b). Η βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης του βακτηρίου ήταν 50 ο C και δεν μπορεί να αναπτυχθεί σε θερμοκρασία κάτω των 40 ο C. Η παραγωγή του ενζύμου είναι συνδεδεμένη με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Η ομάδα του Fucinos (2008) ανακάλυψε ότι η παρουσία Ca 2+ και Mg 2+ δεν επηρέασε ούτε την ανάπτυξη της βιομάζας του μικροοργανισμού Thermus thermophilus HB 27 αλλά ούτε και την παραγωγή της λιπάσης. Παρατήρησαν όμως ότι η παρουσία HCO - 3, παρεμποδίζει την παραγωγή της μέγιστης βιομάζας και της ενδοκυττάριας λιπάσης αλλά έχει μια θετική επίδραση στην εξωκυτάρια δραστικότητα της λιπάσης Επίδραση άλλων παραγόντων Άλλοι παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την παραγωγή της λιπάσης από τους διάφορους μικροοργανισμούς, εκτός από τα χημικά συστατικά του μέσου ανάπτυξης είναι οι φυσιολογικοί παράμετροι όπως είναι το ph, η θερμοκρασία, η ανάδευση, ο αερισμός και ο χρόνος επώασης. Το αρχικό ph του μέσου ανάπτυξης είναι σημαντικό για την παραγωγή της λιπάσης (Gupta et al., 2004). Σε μεγάλο βαθμό, τα βακτήρια προτιμάνε για τη βέλτιστη ανάπτυξη τους και παραγωγή της λιπάσης ένα ph γύρω στο 7, όπως είναι οι περιπτώσεις των Bacillus sp. (Sugihara et al., 1991), Acinetobacter sp. (Barbaro et al. 2001) και Burkholderia sp. (Rathi et al., 2001). Ωστόσο, η μέγιστη δραστικότητα σε υψηλότερα (ph > 7.0) έχει παρατηρηθεί σε πολλές περιπτώσεις (Gilbert et al. 1991a; Wang et al. 1995; Khyami-Horani, 1996; Dong et al., 1999; Sharma et al. 2002). Η βέλτιστη θερμοκρασία παραγωγής της λιπάσης αντιστοιχεί με τη θερμοκρασία ανάπτυξης του αντίστοιχου μικροοργανισμού. Για παράδειγμα, η καλύτερη θερμοκρασία για ανάπτυξη και παραγωγή της λιπάσης στην περίπτωση του Bacillus sp. RSJ1 ήταν οι 50 ο C (Sharma et al. 2002). Έχει παρατηρηθεί ότι, γενικά, οι λιπάσες παράγονται σε ένα εύρος θερμοκρασίας μεταξύ ο C. Οι περίοδοι επώασης που είναι καλύτεροι για τη μέγιστη παραγωγή των βακτηρίων κυμαίνονται από λίγες ώρες μέχρι μερικές μέρες. Μια περίοδος επώασης 12 ωρών ήταν η βέλτιστη για την παραγωγή της λιπάσης από τους μικροοργανισμούς A. calcoaceticus και Bacillus sp. RSJ1 (Mahler et al., 2000; Sharma et al., 2002) και 16 ώρες για τον B. thermocatenulatus (Schmidt-Dannert et al., 1997). Ενώ η μέγιστη ποσότητα λιπάσης παράχθηκε μετά 72 ώρες και 96 ώρες επώασης αντιστοίχως για τις περιπτώσεις Pseudomonas sp, P. fragi και P. fluorescens BW 96CC (Pabai et al., 1996; ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

96 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 61 Dong et al., 1999). Η βέλτιστη διάρκεια καλλιέργειας για το βακτήριο T. Thermophilus βρέθηκε ότι είναι 30 ώρες (Fucinos, 2005). Συνοψίζοντας μπορεί να ειπωθεί ότι οι βακτηριακές λιπάσες γενικά παράγονται με την παρουσία κάποιου λαδιού ή οποιουδήποτε άλλου λιπιδικού υποστρώματος (δηλ. εστέρες λιπαρών οξέων, λιπαρά οξέα, γλυκερόλη) ως άνθρακα και με την παρουσία οποιασδήποτε σύνθετης πηγής αζώτου. Η απαίτηση για μεταλλικά ιόντα εξαρτάται από τον οργανισμό. Ωστόσο, φυσικές παράμετροι όπως είναι το ph, θερμοκρασία, ανάδευση και αερισμός επηρεάζουν την παραγωγή της λιπάσης μέσω της διαμόρφωσης της ανάπτυξης του βακτηρίου. Οι λιπάσες παράγονται καθ όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης με μέγιστο σημείο ανάπτυξης στο τέλος της λογαριθμικής φάσης. Η περίοδος παραγωγής της λιπάσης ποικίλει από λίγες ώρες μέχρι μερικές ημέρες. 2.5 Εφαρμογές της λιπάσης Οι μικροβιακές λιπάσες αποτελούν ένα σημαντικό μέλος των βιοτεχνολογικών πολύτιμων ενζύμων, κυρίως λόγω της ευελιξίας των εφαρμοσμένων ιδιοτήτων τους και της εύκολης μαζικής παραγωγής τους. Οι μικροβιακές λιπάσες είναι ευρέως διαφοροποιημένες στις ενζυματικές τους ιδιότητες και στην ιδιαιτερότητα του υποστρώματος, κάτι που τις κάνει πολύ ελκυστικές στις βιομηχανικές εφαρμογές. Στον τομέα της βιομηχανίας, οι λιπάσες και οι κυτταρινάσες (cellulases) προβλέπεται να είναι αυτές που θα φέρουν τα πιο πολλά κέρδη. Αναμένεται ότι τα επόμενα χρόνια οι λιπάσες θα ωφεληθούν από την ευελιξίας τους και θα συνεχίσουν την εισχώρηση τους στο εμπόριο των απορρυπαντικών και των καλλυντικών (Hasan et al., 2006). Οι λιπάσες συνήθως χρησιμοποιούνται με δύο τρόπους, ως βιολογικοί καταλύτες για την παραγωγή άλλων προϊόντων (όπως συστατικά φαγητών) και με την εφαρμογή τους όπως στην παραγωγή χημικών ουσιών. Μετά τις πρωτεάσες και τις καρβοϋδράσες (carbohydrases), οι λιπάσες θεωρούνται ως η τρίτη μεγαλύτερη ομάδα σε σχέση με τον συνολικό όγκο πωλήσεων. Η εμπορική χρήση της λιπάσης είναι μια επιχείρηση δισεκατομμυρίων δολαρίων που περιλαμβάνει μια μεγάλη ποικιλία διαφορετικών εφαρμογών (Jaeger et al., 1999). Η πλειοψηφία των ενζύμων στην σύγχρονη βιομηχανική χρήση, είναι μικροβιακής προέλευσης και παράγονται σε συμβατικές αερόβιες υγρές καλλιέργειες, στις οποίες επιτρέπεται καλύτερος έλεγχος των συνθηκών ανάπτυξης από ότι στις στερεές καλλιέργειες (Cheetham, 1995). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

97 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 62 Οι λιπάσες πρόσφατα άρχισαν να λαμβάνουν μεγάλο ενδιαφέρον, αρχικά λόγο της έρευνας τους για τον ρόλο του στην παθογένεση και στην αυξημένη χρήση τους σε βιομηχανικές εφαρμογές. Οι λιπάσες είναι πολύτιμοι βιοκαταλύτες καθώς μπορούν να δράσουν κάτω από ήπιες συνθήκες, είναι πολύ σταθερές σε οργανικούς διαλύτες, έχουν ένα μεγάλο εύρος υποστρωμάτων και συνήθως δείχνουν υψηλή τόπο- και/ή στερεοεκλεκτικότητα στην κατάλυση (Snellman, 2002). Η χρησιμότητα των βακτηριακών λιπασών στο εμπόριο και στην έρευνα πηγάζει από τη φυσιολογία τους και τις φυσικές τους ιδιότητες. Μεγάλη ποσότητα καθαρής λιπάσης μπορεί να είναι διαθέσιμη, καθώς είναι εύκολη η μαζική παραγωγή της. Οι λιπάσες είναι ενεργές σε συνθήκες περιβάλλοντος, και οι ενεργειακές δαπάνες που χρειάζονται για να διεξαχθούν αντιδράσεις σε ανεβασμένες θερμοκρασίες και πιέσεις αποκλείονται, καθώς μειώνει την καταστροφή των ασταθών αντιδρώντων και προϊόντων. Οι θερμόφιλοι μικροοργανισμοί και τα σταθερά ένζυμα σε υψηλές θερμοκρασίες και σε δυσμενές χημικό περιβάλλον είναι ένα πλεονέκτημα για τη βιομηχανική τους χρήση. Λόγω της εξειδίκευσης των ενζύμων, ανεπιθύμητα παραπροϊόντα που συνήθως εμφανίζονται στο ρεύμα των αποβλήτων, είναι μειωμένα ή δεν υπάρχουν καθόλου. Η χρήση των ενζύμων μπορεί να μειώσει τις παράπλευρες αντιδράσεις. Η διεργασία κατάλυσης με τη λιπάση μπορεί, επίσης, να μειώσει το κόστος, σε σχέση με μια παραδοσιακή διεργασία. Οι λιπάσες παραμένουν ενεργές σε οργανικούς διαλύτες στην βιομηχανική τους εφαρμογή. Όταν χρησιμοποιούνται καθηλωμένες λιπάσες σε τυπικές βιομηχανικές συνθήκες, σε υψηλές θερμοκρασίες αντίδρασης όπως 70 ο C, είναι πιθανή η παρατεταμένη περίοδος. Οι λιπάσες είνα ευρέως χρησιμοποιημένες στις εφαρμογές των λιπών και λαδιών, των απορρυπαντικών, στην επεξεργασία τροφών, στη σύνθεση καθαρών χημικών και φαρμακευτικών, στη βιομηχανία χαρτιού, και στην παραγωγή καλλυντικών (Rubin and Dennis, 1997a,b; Kazlauskas and Bornscheuer, 1998). Οι λιπάσες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να επιταχύνουν την αποικοδόμηση των λιπαρών αποβλήτων (Masse ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

98 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 63 et al., 2001) και του πολυουρεθανίου (Takamoto et al.,2001). Οι σημαντικότερες εφαρμογές των λιπασών συνοψίζονται στον Πίνακα 2.5. Πίνακας 2.5 Βιομηχανικές εφαρμογές μικροβιακών λιπασών (Vulfson, 1994). Βιομηχανία Δράση Προϊόν ή εφαρμογή Απορρυπαντικά Υδρόλυση των λιπών Αφαίρεση των λεκέδων λαδιού από το ύφασμα Γαλακτοκομικά τρόφιμα Υδρόλυση των λιπών του γάλατος, στην ωρίμανση του τυριού, στην μετατροπή των λιπών του βουτύρου. Ανάπτυξη παραγόντων γεύσεως στο γάλα, στο τυρί και στον βούτυρο. Τρόφιμα αρτοποιού Βελτίωση στην γεύση Επέκταση στην διάρκεια ζωής Ποτά Βελτίωση του αρώματος Ποτά Αλοιφές τροφίμων Βελτίωση στην ποιότητα Μαγιονέζα και σάλτσα Υγιεινής διατροφής Μετεστεροποίηση Υγιεινής διατροφής Κρέας και ψάρι Ανάπτυξη της γεύσης Προϊόντα κρέατος και ψαριού; αφαίρεση λίπους. Λίπη και έλαια Χημικά Φαρμακευτικά Μετεστεροποίηση, υδρόλυση Εναντιοεκλεκτικότητα, σύνθεση Μετεστεροποίηση, υδρόλυση Μαργαρίνες, λιπαρά οξέα, γλυκερόλη, μονο- και διγλυκερίδια. Χημικά Ειδικά λιπίδια, βοηθητικά πέψης Καλλυντικά Σύνθεση Γαλακτωματοποιητές, υγραντοποιητές (moisturizers) Δέρμα Υδρόλυση Προϊόντα δέρματος Χαρτί Υδρόλυση Χαρτί καλύτερης ποιότητας Καθαριστικά Υδρόλυση Αφαίρεση των λιπών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

99 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 64 Πίνακας 2.6 Εμπορικά διαθέσιμες λιπάσες και βιομηχανικές εφαρμογές τους (Houde 2004). Βιομηχανία Εφαρμογή Εμπορική Ονομασία a Προμηθευτής Γαλακτοκομία Lipase A Amano 6 (Aspergillus niger) Amano Lipase AY Amano 30 (Candida rugosa) Amano Piccnate (Mucor miehei) Gist-Brocades EMC παραγωγής (cheddar τύπου γεύσεις) Lipomod 224P- L224P (porcine pancreas) Biocatalysts EMC παραγωγής Lipomod 34P- L034P (Candida cylindracea [rugosa]) Biocatalysts Ενίσχυση γεύσης του τυριού-γεύση ενίσχυση Palatase (Rhizomucor miehei) Novozymes Εστεροποίηση των φυτικών ελαίων Lipozyme TL IM Novozymes Φαρμακοβιομηχανία Σύνθεση χηραλικών ενώσεων Lipase ALC, Lipase ALG (Achromobacter sp.) Meito Sangyo Χηλαρική σύνθεση Lipase AYS Amano (Candida rugosa) Amano Απορρυπαντικά Lipolase, Lipolase Ultra, Lipo Prime, Lipex (Thermomyces lanuginosus) Novozymes Δέρμα Αποχρωμάτιση NovoLime (μαζί με πρωτεάση) Novozymes Διασπορά λίπους Greasex, NovoCor AD Novozymes ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

100 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 65 Βιομηχανία Εφαρμογή Εμπορική Ονομασία a Προμηθευτής Καλλυντικά Παραγωγή ισοπροπυλικής myristate (συστατικά καλλυντικών) Novozym 435 (Candida antarctica B) Novozymes Χαρτί Έλεγχος της ρετσίνας Resinase (Candida rugosa) Novozymes Ζυμαρικά Βελτίωση της ποιότητας των ζυμαρικών Noopazyme Novozymes Διάφορες Συμπληρώματα διατροφής Lipase L036P-L036P (Rhizopus oryzae) Biocatalysts Συμπληρώματα διατροφής Lipase F-DS (Rhizopus oryzae) Amano Διάφορες χρήσεις Lypolyve AN (Aspergillus niger) ( α Οι λιπάσες με έντονα γράμματα είναι με γενετικό ανασυνδιασμό (recombinant).) Lyven Οι λιπάσες είναι μέλος της οικογένειας των υδρολασών που ενεργεί στον καρβοξυλικό εστερικό δεσμό. Ο φυσιολογικός ρόλος τους είναι να υδρολύει τα τριγλυκερίδια σε διγλυκερίδια, μονογλυκερίδια, λιπαρά οξέα και γλυκερόλη. Εκτός από τη φυσική λειτουργία να υδρολύουν καρβοξυλικούς εστερικούς δεσμούς, οι λιπάσες μπορούν να καταλύσουν τις αντιδράσεις εστεροποιήσης, διαεστεροποίηση και μετεστεροποίηση σε μη υδατικά διαλύματα, όπως στις καταλυτικές αντιδράσεις της λιπάσης (Σχήμα 2.6). RCOOR + H O RCOOH + ROH Ηδρόλυση R COOH + R OH R COOR + H O Εστεροποίηση R COOR + R COOR R COOR + R COOR Διαεστεροποίηση R COOR + R COOH R COOR + R COOH Acidolysis Αλκοόλυση RCOOR ROH 3 RCO 1 OR3 + R2OH R COOR + R NH R CONHR + R OH Αμυν όλυση Σχήμα 2.6 Καταλυτικές αντιδράσεις λιπάσης. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

101 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 66 Αυτή η ευελιξία κάνει τις λιπάσες ένζυμα επιλογής για πιθανή τους χρήση στις βιομηχανίες τροφίμων, απορρυπαντικών, φαρμάκων, δερμάτων, κλωστοϋφαντουργίας, καλλυντικών και χαρτιού (Houde et al., 2004) (Πίνακας 2.6) Λιπάσες στη βιομηχανία λιπών και ελαιοχημικών προϊόντων Η λιπόλυση είναι η δημιουργική συνέπεια της ικανότητας της λιπάσης να υδρολύει λιπίδια, έτσι ώστε να λαμβάνει λιπαρά οξέα και γλυκερόλη. Και τα δύο είναι σημαντικά στις βιομηχανικές εφαρμογές. Για παράδειγμα, τα λιπαρά οξέα χρησιμοποιούνται στην παραγωγή σαπουνιών (Hoq, 1985). Τα γλυκερίδια, είναι το σημαντικότερο συστατικό αποθήκευσης των λιπών στα φυτικά ή ζωικά κύτταρα. Αυτά που είναι στερεά σε θερμοκρασία δωματίου είναι γνωστά ως έλαια. Οι λιπάσες καταλύουν την υδρόλυση των λιπών και των ελαίων και άλλων καρβοξυλικών εστερικών οξέων (Hasan et al., 2006). Ο σκοπός της εφαρμογής των λιπασών στη βιομηχανία της ελαιοχημείας είναι τεράστιος. Τα λίπη και τα έλαια παράγονται παγκοσμίως σε ένα επίπεδο περίπου 60 εκατομμυρίων t pa και ένα ουσιαστικό κομμάτι αυτών (πάνω από 2 εκατομμύρια t pa) χρησιμοποιούνται σε διεργασίες κατανάλωσης υψηλής ενέργειας όπως είναι η υδρόλυση, η γλυκερόλυση και η αλκοόλυση. Οι συνθήκες διάσπασης των λιπών με τον ατμό και η συμβατική γλυκερόλυση των λαδιών περιλαμβάνουν υψηλές θερμοκρασίες από ο C και υψηλές πιέσεις (η μεθανόλυση, διεξάγεται κάτω από ελαφρώς πιο ήπιες συνθήκες). Τα τελικά προϊόντα είναι συνήθως ασταθή όπως αποκτώνται και χρειάζεται ξανά απόσταξη για αφαίρεση των ακαθαρσιών και τα αποικοδομήσιμα προϊόντα. Επιπρόσθετα, πολυακόρεστα λάδια ευαίσθητα στη θερμοκρασία δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε αυτή τη διεργασία χωρίς προηγούμενη υδρογόνωση (Hasan et al., 2006). Η εξοικονόμηση ενέργειας και η ελαχιστοποίηση της θερμικής αποικοδόμησης είναι οι κύριες αιτίες αντικατάστασης στις τρέχουσες χημικές τεχνολογίες με βιολογικές. Ωστόσο, εκτός από την προφανή ανωτερότητα τους, οι ενζυμικές μέθοδοι δεν είναι ακόμα σε επίπεδο εμπορικής εκμετάλλευσης αναλογικά με της δυνατότητες τους. Έχουν υπάρξει μερικές ανακοινώσεις σχετικά μικρής κλίμακας διεργασίες ενζυμικής διάσπασης λιπών για την παραγωγή μερικών υψηλής αξίας πολυακόρεστων λιπαρών οξέων και για την κατασκευή σαπουνιού. Για παράδειγμα, Miyoshi Oil & Fat Co., Japan, ανακοίνωσαν την εμπορική χρήση λιπάσης από το μικροοργανισμό Candida cylindracea για την παραγωγή σαπουνιού (McNeill et al., 1991). Η εταιρία ισχυρίζεται ότι με την ενζυμική μέθοδο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

102 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 67 απέδωσε ένα ανώτερο προϊόν που γενικά είναι φτηνότερο από τη συνηθισμένη Colgate Emery διεργασία. Κάποια λίπη είναι πιο πολύτιμα από άλλα λόγω της δομής τους. Λιγότερα πολύτιμα λίπη μπορούν να μετατραπούν σε άλλα πιο χρήσιμα χρησιμοποιώντας ανάμειξη χημικών μεθόδων, αλλά αυτό τείνει να δίνει αρκετά παραπροϊόντα. Η λιπάση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την κατάλυση της μετεστεροποίησης φτηνών λαδιών, για παράδειγμα για την παραγωγή βούτυρο-κακάο από μεσαία κλάσματα κλασμάτωσης φοινικέλαιου (Hasan et al., 2006). H καταλυτική μετεστεροποίηση της λιπάσης σε οργανικούς διαλύτες είναι μια αναδυόμενη βιομηχανική εφαρμογή, όπως η παραγωγή του ισοδύναμου βούτυρο-κακάο, το υποκατάστατο του ανθρώπινου λιπαρού γάλατος, τα φαρμακευτικής σημασίας πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, πλούσια/χαμηλά σε θερμίδες λιπαρά και παραγωγή βιοκαυσίμων (biodiesel) από φυτικά έλαια (Nakajima et al., 2000; Jaeger et al.,1998). Λιπάσες από τους μικροοργανισμούς Mucor miehei (IM 20) και Candida antarctica (SP 382) έχουν χρησιμοποιηθεί για την εστεροποιήση ελεύθερων λιπαρών οξέων σε απουσία οργανικού διαλύτη ή για την μετεστεροποίηση μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων (fatty acid methyl esters) σε εξάνιο με ισοπροπυλίδενο γλυκερόλες (isopropylidene glycerols) (Akoh, 1993). Η διαεστεροποίηση και η υδρογόνωση είναι τεχνικές, οι οποίες είναι χρήσιμες για την προετοιμασία των προϊόντων γλυκεριδίων, για τη χρήση τους στην παραγωγή βουτύρου και μαργαρίνης. Στις κλασσικές αντιδράσεις διαεστεροποίησης, η διαεστεροποίηση διεξάγεται με την παρουσία καταλύτη όπως είναι το νάτριο και το μεθυλικό νάτριο. Ωστόσο, η συμβατική αντίδραση δεν επιλέγεται λόγω της εστεροποιήσης του υποστρώματος του λιπαρού οξέος όταν αντιδρά με τη γλυκερίνη. Όμως, έχει γίνει γνωστή μια διεργασία διαεστεροποίηση που διεξάγεται με την παρουσία μιας λιπάσης ως καταλύτη (Japanese Published Unexamined Patent Application No ,1977), παρόλα αυτά, αυτή η διεργασία χρειάζεται την παρουσία νερού για την ενεργοποίηση της λιπάσης. Η παρουσία του νερού προκαλεί υδρόλυση της διαεστεροποίηση γλυκερίνης, με αποτέλεσμα τη μείωση της απόδοσης του προϊόντος των γλυκεριδίων. Συνεπώς, η ανάγκη εξακολουθεί να υπάρχει για μια μέθοδο βελτιστοποίησης της απόδοσης των προϊόντων της γλυκερίνης από μια αντίδραση διαεστεροποίηση (Tanaka, 1981). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

103 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 68 Η χρήση της λιπάσης για την εκτέλεση βιομηχανικής υδρόλυσης του λίπους έχει ένα αριθμό πλεονεκτημάτων. Η θερμοκρασία που χρειάζεται για τη διεργασία αυτή είναι πολύ μικρότερη, καθώς μόνο η θερμοκρασία που απαιτείται για να λειώσει το λίπος είναι περίπου 50 ο C, έτσι η κατανάλωση ορυκτών καυσίμων για την παραγωγή ατμού και η χρήση ανοξείδωτου χάλυβα στα σκεύη της διεργασίας είναι πολύ μικρότερη. Επίσης λόγω της χαμηλής θερμοκρασίας, υπάρχει πολύ λιγότερη αποικοδόμηση των ακόρεστων λιπαρών οξέων, έτσι καθαρά φυσικά λιπαρά οξέα μπορούν να αποκτηθούν χωρίς απόσταξη, ακόμα και από πολυακόρεστα λάδια. Λόγω της θρεπτικής τους αξίας, κανονικά πολυακόρεστα λιπαρά οξέα μπορεί να είναι σημαντικά να διατηρηθούν στην παραγωγή διατροφικών προσθετικών, όπως τα μονο- και δι- γλυκερίδια. Τέλος, ανάλογα με την εκλεκτικότητα της λιπάσης και τα ακατέργαστα υλικά, μερική υδρόλυση μπορεί να αποδώσει ένα συγκεντρωμένο ή καθαρισμένο μίγμα λιπαρών οξέων και / ή μερικών γλυκεριδίων με μοναδικές ικανότητες που δεν βρίσκονται στα λιπαρά οξέα που προέρχονται από ολική υδρόλυση λίπους (Hasan et al., 2006). Η διακυλογλυκερόλη είναι το κύριο συστατικό νέων μαγειρικών λαδιών (π.χ. Econa, Kao corp.). Αυτά τα λάδια προτείνονται για την επιβράδυνση της αύξησης των τριγλυκεριδίων του αίματος, για να βοηθήσουν στην πρόληψη της συσσώρευσης λιπών στο σώμα και της υψηλής χοληστερίνης στο αίμα (Hasan et al., 2006) Παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών Οι λιπάσες έχουν γίνει μία από τις πιο σημαντικές ομάδες ενζύμων λόγω των εφαρμογών τους στην οργανική σύνθεση. Οι λιπάσες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοκαταλύτες για την παραγωγή χρήσιμων βιοαποδομήσιμων ενώσεων. Το 1-βουτιλο ελαϊκό (1-butyl oleate) παράχθηκε από απευθείας εστεροποίηση βουτανόλης και ελαϊκού οξέος για τη μείωση του ιξώδους του βιοντίζελ. Οι λιπάσες μπορούν να καταλύσουν τη σύνθεση των εστέρων και αντιδράσεις μετεστεροποίησης σε σύστημα οργανικών διαλυτών. Αυτή η ιδιότητα χρησιμεύει για την καταλυτική παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων πολυεστέρων. Σύνθεση αρωματικών πολυεστέρων μπορεί να πραγματοποιηθεί με βιοκατάλυση της λιπάσης (Linko et al., 1998) Λιπάσες στη βιομηχανία κλωστοϋφαντουργίας Οι λιπάσες χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία της κλωστοϋφαντουργίας για να βοηθήσουν στην αφαίρεση των λιπαντικών, με σκοπό να παρέχουν ένα ύφασμα με καλύτερη απορροφητικότητα για βελτιωμένη επιφανειακή βαφή. Η χρήση της μειώνει ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

104 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 69 επίσης τη συχνότητα των ραβδώσεων και των ρωγμών που δημιουργούνται από την τριβή στο ύφασμα τύπου τζίν. Στην εμπορική παραγωγή υφασμάτων τύπου τζιν και άλλων βαμβακερών υφασμάτων, χρησιμοποιούνται δύο ένζυμα η α-αμυλάση και η λιπάση (Hasan et al., 2006) Στη βιομηχανία της κλωστοϋφαντουργίας, οι πολυεστέρες έχουν κάποια πλεονεκτήματα όπως είναι η υψηλή αντοχή, είναι απαλά, δεν λερώνουν εύκολα, πλένονται στο πλυντήριο και είναι ανθεκτικά στην τριβή. Οι συνθετικές ίνες, έχουν τροποποιηθεί ενζυμικά για τη χρήση τους στην παραγωγή του μαλλιού πλεξίματος, στα υφάσματα, στα υφαντά, στις κουβέρτες και σε άλλα καταναλωτικά αντικείμενα. Σχετίζεται με την τροποποίηση των χαρακτηριστικών των ινών του πολυεστέρα, έτσι ώστε οι πολυεστέρες να είναι πιο ευαίσθητοι στη μετέπειτα τροποποίηση τους (Hasan et al., 2006). Στο PCT Publication No. WO 97/43014 (Bayer AG) περιγράφεται η ενζυμική αποικοδόμηση της πολυεστεραμίνης με την επεξεργασία ενός υδατικού διαλύματος που περιλαμβάνει μία εστεράση, λιπάση ή πρωτεάση. Στο JP (Amano Pharmaceutical KK) περιγράφεται μια εμπορική σύσταση της λιπάσης η οποία είναι διαλυμένη σε διάλυμα με ένα αλειφατικό πολυεστέρα με το αποτέλεσμα ότι η υφή της ίνας να είναι βελτιωμένη χωρίς να χάνει τις αντοχές της. Στο PCT Publication No. 97/33001 (Genencor International, Inc.) περιλαμβάνεται μία τεχνική για τη βελτιστοποίηση της αφύγρανσης (wettability) και απορροφητικότητας των ινών του πολυεστέρα επεξεργάζοντάς τον με μία λιπάση Λιπάσες στη βιομηχανία απορρυπαντικών Το πιο σημαντικό πεδίο της εμπορικής εφαρμογής των υδρολυτικών λιπασών είναι η προσθήκη τους στα καθαριστικά, τα οποία χρησιμοποιούνται κυρίως σε οικιακό και σε βιομηχανικό πλύσιμο και σε οικιακά πλυντήρια πιάτων. Η καθαριστική δύναμη των απορρυπαντικών φαίνεται να έχει κορυφωθεί, καθώς όλα περιέχουν παρεμφερή συστατικά και βασίζονται σε παρόμοιους καθαριστικούς μηχανισμούς. Οπότε, για να βελτιώσουν την καθαριστική ισχύ, καινούρια είδη απορρυπαντικών σε σκόνη, συνήθως περιέχουν ένα ή περισσότερα ένζυμα όπως οι πρωτεάσες, οι αμυλάσες, οι κυτταρινάσες (cellulose) ή οι λιπάσες (Ito et al., 1998). Τα ένζυμα μπορούν να μειώσουν το περιβαλλοντικό φορτίο των καθαριστικών προϊόντων, καθώς (Hasan et al., 2006): ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

105 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 70 Εξοικονομούν ενέργεια, καθώς επιτρέπουν τη χρήση χαμηλότερης θερμοκρασίας πλυσίματος Επιτρέπουν τη μείωση του ποσοστού στα καθαριστικά άλλων χημικών λιγότεροo επιθυμητών Είναι βιοαποικοδομήσιμα, αφήνοντας μη επιβλαβή κατάλοιπα Δεν έχουν αρνητική επίδραση στη διεργασία επεξεργασία των λυμάτων και Δεν εμφανίζουν κάποιο κίνδυνο για την υδρόβια ζωή. Λόγω της ικανότητας που έχουν οι λιπάσες να υδρολύουν τα λίπη, χρησιμοποιούνται σαν προσθετικά στα απορρυπαντικά που χρησιμοποιούνται στην βιομηχανία αλλά και για οικιακή χρήση. Οι λιπάσες που χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία των απορρυπαντικών θα πρέπει να έχουν τις ακόλουθες ιδιότητες: Χαμηλή ιδιαιτερότητα υποστρώματος π.χ. να έχει την ικανότητα να υδρολύει λίπη από διαφορετικές συνθέσεις Ικανότητα να αντέχει σε σκληρές συνθήκες όπως ph και θερμοκρασία ο C Ικανότητα να αντέχει σε επιβλαβή ένζυμα και απολυμαντικά, τα οποία είναι σημαντικά συστατικά αρκετών συνταγών για απορρυπαντικά. Οι λιπάσες με τις επιθυμητές ιδιότητες αποκτώνται μέσα από συνδυασμό συνεχές ψάξιμο (Yeoh et al., 1986, Wang et al., 1995; Cardenas et al., 2001) και της πρωτεϊνικής μηχανικής (Kazlauskas and Bornscheuer, 1998). Στο παρελθόν, πάγκρεας από χοίρους ή βοοειδή, πλούσια σε λιπάσες, χρησιμοποιούνταν στη χημική βιομηχανία ως προσθετικό στα απορρυπαντικά. Στην πραγματικότητα, η χρήση της λιπάσης στη βιομηχανία των απορρυπαντικών αντιπροσωπεύει την πιο σημαντική εφαρμογή αυτών των ενζύμων. Το 1995, τα ένζυμα για τα απορρυπαντικά αντιπροσώπευαν το 30% της συνολικής ενζυμικής αγοράς, υπολογιζόμενη στα 30 εκατομμύρια $ (Godfrey and West, 1996). Το 2000, αυτή η αγορά έφτασε το 1.5 δις $ (Kirk et al., 2002). Η προβληματική περιοχή στον καθαρισμό των υφασμάτων είναι η αφαίρεση των λιπαρών λεκέδων. Το 1988 η εταιρία Novo Nordisk ανάπτυξε μια λιπάση, ένα ένζυμο ικανό να διαλύσει λιπαρούς λεκέδες. Αυτό το ένζυμο παράγεται φυσικά από ένα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

106 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 71 επιλεγμένο γένος μυκητών Humicola, αλλά δεν παράγεται σε ποσότητα για εμπορικές εφαρμογές. Παραδοσιακές τεχνικές για να αυξήσουν την απόδοση αποδείχθηκαν ανεπιτυχείς, έτσι ο γενετικός κώδικας (gene coding) για αυτή τη λιπάση κλωνοποιήθηκε και εισάχθηκε στον μύκητα Aspergillus oryzae. Αυτός ο μύκητας τώρα παράγει το ένζυμο σε σχετικά εμπορικές αποδόσεις, έτσι ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε καθαριστικά, επιτρέποντας καλύτερες επιδόσεις πλύσης και εξοικονόμηση ενέργειας (Hasan et al., 2006). Το 1994, η Novo Nordisk εισήγαγε την πρώτη εμπορική λιπάση, Lipolase TM, η οποία προέρχεται από το μύκητα T. Lanuginosus και εκφράστηκε στον Aspergillus oryzae. To 1995, δυο βακτηριακές λιπάσες παρουσιάστηκαν, Lumafast TM από το μικροοργανισμό Pseudomonas mendocina και η Lipomax TM από το μικροοργανισμό Pseudomonas alcaligenes. Και τα δυο παράχθηκαν από την Genencor International (Jaeger and Reetz, 1998). Οι προκλήσεις που έχουν να αντιμετωπίσουν οι παραγωγοί λιπασών για απορρυπαντικά είναι: Η μεγάλη ποικιλία στο περιεχόμενο των τριγλυκεριδίων σε λιπαρούς λεκέδες, (χρειάζονται λιπάσες με μικρή εκλεκτικότητα υποστρώματος) Οι σχετικά άγριες συνθήκες πλύσης (ph και o C) (χρειάζονται σταθερά ένζυμα) και Οι επιδράσεις της χημικής μετουσίωσης και / ή πρωτεολυτική αποικοδόμηση που προκαλούνται από τα προσθετικά των καθαριστικών όπως τα επιφανειοδραστικά γραμμικό άλκυλο σουλφονικό βενζένιο (linear alkyl benzene sulfonate) (LAS) και οι πρωτεάσες. Λύσεις για αυτά τα προβλήματα αναζητήθηκαν μέσω ενός συνδυασμού συνεχούς αναζήτησης για βελτιωμένες λιπάσες και απόπειρες ενίσχυσης των ιδιοτήτων της λιπάσης με βάση την πρωτεϊνική μηχανική (Malcata, 1996) Λιπάσες στη βιομηχανία τροφίμων Σήμερα, η μετατροπή των λιπών και των ελαίων είναι μια από τις σημαντικότερες περιοχές στη βιομηχανία των τροφίμων που απαιτεί καινούριες οικονομικές, φιλικές προς το περιβάλλον, τεχνικές. Προσαρμοσμένα έλαια από λαχανικά θρεπτικής αξίας με δομημένες τριακυλογλυκερόλες (structured triacyglycerols) και μεταβλητές φυσικοχημικές ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

107 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 72 ιδιότητες έχουν μια μεγάλη προοπτική στην αγορά του μέλλοντος. Μικροβιακές λιπάσες που είναι τοποεξειδικευμένες και ειδικεύονται στα λιπαρά οξέα, είναι πολύ σημαντικές και μπορούν να αξιοποιηθούν για αναπροσαρμογή των ελαίων από λαχανικά. Τα φτηνά λάδια μπορούν επίσης να αναβαθμιστούν για να συνθέσουν θρεπτικής αξίας δομημένα τριακυλογλυκερόλες, όπως το υποκατάστατο του βούτυρο κακάο, χαμηλών θερμίδων τριακυλογλυκερόλες και ελαϊκό οξύ εμπλουτισμένο με έλαια. Η λιπάση ως μεσολαβητής για αυτές τις μετατροπές είναι πιθανό να καταλάβουν μια μόνιμη θέση στην βιομηχανία των ελαίων για να προσαρμόσουν την δομή των λιπιδίων καθώς η ενζυμική μετατροπή είναι συγκεκριμένη και μπορεί να πραγματοποιηθεί σε μέτριες συνθήκες αντίδρασης (Gupta et al., 2003). Οι λιπάσες χρησιμοποιήθηκαν επίσης για την προσθήκη στα τρόφιμα βελτιωτικών για τη γεύση και το άρωμα με τη σύνθεση εστέρων μικρής αλυσίδας λιπαρών οξέων και αλκοολών, που είναι ενώσεις γνωστής γεύσης και αρώματος (Macedo, 2003). Ψυχρότροφα Gram-αρνητικά βακτήρια, όπως είναι το Pseudomonas species, θέτουν ένα σημαντικό πρόβλημα αλλοίωσης καταψυγμένων κρεάτων και γαλακτοκομικών προϊόντων, λόγω της έκκρισης υδρολυτικών ενζύμων, ειδικά των λιπασών και των προτεασών (Rajmohan et al., 2002). Οι λιπάσες έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή άπαχου κρέατος. Το λίπος αφαιρείται κατά την διάρκεια της διεργασίας του κρέατος από ψάρια με την προσθήκη λιπασών και αυτή η διεργασία ονομάζεται βιολιπόλυση (biolipolysis). Οι λιπάσες επίσης παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στα στάδια ζύμωσης της βιομηχανίας αλλαντικών και για να προσδιορίσουν αλλαγές στις μεγάλες αλυσίδες των λιπαρών οξέων που απελευθερώνονται κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης. Πρωτίστως, λιπάσες διαφορετικής μικροβιακής προέλευσης έχουν χρησιμοποιηθεί για τη βελτιστοποίηση της γεύσης του ρυζιού, για την τροποποίηση του γάλατος από σόγια και για τη βελτιστοποίηση του αρώματος και επιτάχυνση της ζύμωσης του κρασιού από μήλα (Seitz, 1974). Τα λίπη και τα έλαια είναι σημαντικά συστατικά στοιχεία των φαγητών. Οι θρεπτικές και αισθητήριες αξίες (sensory values) καθώς και οι φυσικές ιδιότητες των τριγλυκεριδίων επηρεάζονται από παράγοντες, όπως η θέση των λιπαρών οξέων, στη δομή της γλυκερόλης, το μήκος της αλυσίδας του λιπαρού οξέως και στο πόσο ακόρεστο είναι. Οι λιπάσες επιτρέπουν την τροποποίηση των ιδιοτήτων των λιπιδίων, μεταβάλλοντας την τοποθεσία των λιπαρών οξέων στο γλυκερίδιο και αντικαθιστώντας ένα ή περισσότερα λιπαρά οξέα με νέα. Με αυτό τον τρόπο, ένα σχετικά φτηνό και λιγότερο επιθυμητό λιπίδιο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

108 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 73 μπορεί να μετατραπεί σε ένα λιπαρό υψηλότερης αξίας (Colman and Macrae, 1980; Pabai, 1996; Undurraga et al., 2001) Λιπάσες στη βιομηχανία χαρτιού και πολτοποίησης Οι τεχνολογίες που υπάρχουν για την κατασκευή χαρτοπολτού είναι πολύ διαφορετικές, και υπάρχουν πολλές ευκαιρίες για την εφαρμογή μικροβιακών ενζύμων. Ιστορικά, τα ένζυμα έχουν βρει κάποιες χρήσεις στη βιομηχανία χαρτιού, αλλά αυτό περιορίστηκε κυρίως σε περιοχές όπως η τροποποίηση του ακατέργαστου αμύλου. Από τις αρχές του 1990, η ενζυμική μέθοδος για τον έλεγχο της ρετσίνις (pitch control) με τη χρήση λιπάσης, χρησιμοποιείται σε μεγάλης κλίμακας διεργασίες κατασκευής χαρτιού ως μια εργασία ρουτίνας (Bajpai, 1999). Η λιπάση μπορεί να αυξήσει το ρυθμό πολτοποίησης του χαρτιού, αυξάνοντας τη λευκότητα, μειώνοντας τη χρήση χημικών, παρατείνοντας τη ζωή των συσκευών, μειώνει τα ποσοστά μόλυνσης των λυμάτων, εξοικονομούν ενέργεια και χρόνο και μειώνουν το κόστος σύνθεσης. Η προσθήκη της λιπάσης από τον Pseudomonas species (KWI 56) σε μία deinking σύνθεση για το αιθυλενοξείδιο προπυλενοξείδιο στεατικό σύμπλοκο (ethylene oxide propylene oxide adduct stearate) βελτίωσε τη λευκότητα του χαρτιού και μείωσε την παραμένουσα κηλίδα μελανιού (Fukuda, 1990). Η ρητίνη ή τα υδροφοβικά συστατικά του ξύλου (κυρίως τα τριγλυκερίδια και τα κεριά προκαλούν αρκετά προβλήματα στην κατασκευή πολτού και χαρτιού (Jaeger and Reetz, 1998). Οι λιπάσες χρησιμοποιούνται στο να αφαιρούν τη ρητίνη από τον παραγόμενο πολτό για την κατασκευή του χαρτιού. Στην Ιαπωνία, η βιομηχανία χαρτιού (Nippon Paper Industries), ανέπτυξε μία μέθοδο για τον έλεγχο της ρητίνης, όπου χρησιμοποιείται η λιπάση από το μικροοργανισμό Candida rugosa για την υδρόλυση των τριγύκεριδίων μέχρι 90% Λιπάσες στην οργανική σύνθεση Οι χρήση των λιπασών στη σύνθεση της οργανικής χημείας γίνεται ολοένα και πιο σημαντική. Οι λιπάσες χρησιμοποιούνται για την κατάλυση της μεγάλης ποικιλίας των χημειο-, τοπο-, και εναντιο-εξειδικευμένων μετατροπών (Rubin and Dennis 1997b; Kazlauskas and Bornscheuer, 1998; Berglund and Hutt, 2000). Η πλειοψηφία των λιπασών που χρησιμοποιούνται ως καταλύτες στην οργανική χημεία είναι μικροβιακής προελεύσεως. Τα ένζυμα αυτά δουλεύουν σε μία υδροφοβική-λιποφιλική διεπιφάνεια και δεν επηρεάζονται από οργανικούς διαλύτες στο αντιδρών μείγμα (Sharma et al., 2001). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

109 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 74 Τα ένζυμα καταλύουν την υδρόλυση των αναμειγνυόμενων νερού και τριγλυκεριδίων σε μια διεπιφάνεια νερού-υγρού (water-liquid). Κάτω από καθορισμένες συνθήκες, η ποσότητα του νερού στο αντιδρών μείγμα θα ορίσει την κατεύθυνση της καταλυτικής αντίδρασης της λιπάσης. Όταν υπάρχει λίγο ή καθόλου νερό η εστεροποίηση και η μετεστεροποίηση ευνοούνται, ενώ όταν υπάρχει περίσσεια νερού ευνοείται η αντίδραση της υδρόλυσης (Klibanov, 1997) Λιπάσες στη γαλακτοβιομηχανία Η πυτιά (rennet), απομονωμένη από το στομάχι μηρυκαστικών ζώων, όπως οι αγελάδες και οι κατσίκες, είναι ένα μείγμα ενζύμων που χρησιμοποιείται παραδοσιακά για την παρασκευή του τυριού. Τα ενεργά συστατικά της πυτιάς είναι η χυμοσίνη (chymosin), μια ασπαρτική πρωτεάση που επιδρά στη θρόμβωση του γάλατος μέσω της υδρόλυσης της κ καζεΐνης. Ωστόσο, οι λιπάσες και οι εστεράσες που περιέχονται στην πυτιά επίσης συμβάλλουν στην ωρίμανση του τυριού. Πίνακας 2.7 Λιπάσες που χρησιμοποιούνται στην παραγωγή και ωρίμαση τυριού. Τύπος τυριού Romano (ιταλικό σκληρό), domiati, φέτα Μοτσαρέλα, παρμεζάνα, προβολόνε Fontina, ras, romi Cheddar, manchero, blue Λιπάση Προγαστρική λιπάση (pregastric lipase) από αρνί ή αίγα, Mucor miehei Προγαστρική λιπάση ( pregastric lipase) από αρνί ή αίγα Mucor miehei Asprgillus oryzae, Aspergillus niger Το 1955 το US Food and Drug Administration εξέδωσαν μία απαγόρευση για περεταίρω εισαγωγή πυτιάς από μοσχάρι που προέρχεται από την Ευρώπη λόγω της κακής της ποιότητας. Από τότε, πρωτεάσες και λιπάσες από άλλες πηγές άρχισαν να χρησιμοποιούνται για την παραγωγή του τυριού. Ανάλογα με την εκλεκτικότητα της εκάστοτε λιπάσης στο μήκος της ανθρακικής αλυσίδας του υποστρώματος, η προσθήκη της σε ένα προϊόν γάλατος μπορεί να ενισχύσει τη γεύση του τυριού, να επιταχύνει την ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

110 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 75 ωρίμανση του τυριού ή να βοηθήσει στην προετοιμασία ενός ενζυμικά τροποποιημένου τυριού (EMC), ένα σημαντικό βελτιωτικό γεύσης που χρησιμοποιείται στις ΗΠΑ, για την παραγωγή σαλτσών, κράκερ, κλπ. Το EMC παράγεται από πηγμένο γάλα για τυρί με την προσθήκη λιπάσης σε υψηλές θερμοκρασίες, αυξάνοντας το περιεχόμενο των ελεύθερων λιπαρών οξέων περίπου δέκα φορές. Ο Πίνακας 2.7 περιέχει μερικά παραδείγματα λιπάσης που χρησιμοποιούνται στην παραγωγή τυριού και στην επιτάχυνση της ωρίμανσης του (Houde, 2004) Λιπάσες στη βιομηχανία φαρμάκων Στην βιομηχανία φαρμάκων, οι βιοκαταλύτες προσφέρουν πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με τη χημική σύνθεση και αυτό δικαιολογεί και την αναπτυσσόμενη ζήτηση για ένζυμα. Αυτά τα πλεονεκτήματα συμπεριλαμβάνουν: Εναντιο- και τοπο-εξειδίκευση Ήπιες συνθήκες που με αυτόν τον τρόπο αποφεύγονται οι αντιδράσεις ισομερίωσης, ρακεμοποίηση, επιμερίωση και επανατοποθέτησης Επαναχρησιμοποίηση του καθηλωμένου βιοκαταλύτη Οικονομικότερη διεργασία και Μετάλλαξη του ενζύμου για συγκεκριμένες ιδιότητες. Η ικανότητα των λιπασών να διαχωρίζουν (resolve) ρακεμικά μείγματα, από τη σύνθεση ενός εναντιομερούς, αξιοποιείται για την παραγωγή φαρμάτων από φαρμακευτικές βιομηχανίες. Αυτό που παρατηρήθηκε με τη χρήση οπτικά καθαρών φαρμακευτικών προϊόντα ήταν ότι στην πραγματικότητα μόνο ένα εναντιομερές του φαρμάκου ευθύνεται για τα επιθυμητά θεραπευτικά αποτελέσματα και ηπιότερες ή λιγότερες παρενέργειες σε σχέση με αυτά που βρέθηκαν με τη χρήση ρακεμικού μίγματος (Houde, 2004). Μερικές από τις λιπάσες που αναφέρονται στον Πίνακα 2.6 είναι κατάλληλες να χρησιμοποιηθούν για τη σύνθεση διαφόρων εναντιοκαθαρών μορίων όπως είναι οι αλκοόλες, τα αμίδια, τα καρβοξυλικά οξέα και οι εστέρες. Αυτά τα μόρια χρησιμοποιούνται σε αντιφλεγμονώδη φάρμακα (idoprofen, naproxen) (Kademi et al., 2004), σε αντικαρκινικά φάρμακα (Taxol, spergualin), σε φάρμακα κατά των ιώσεων (lobucavir), σε αντι-υπερτασικά φάρμακα (captopril), σε φάρμακα κατά της χοληστερίνης, σε φάρμακα κατά του Alzheimer και σε βιταμίνες Α (Bonrath et al., 2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

111 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς Πειραματική διαδικασία Υλικά Όλα τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας των οίκων Fluka Biochemical, Sigma Aldrich Chemie GmbH και Panreac Quimica S.A. Τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν του οίκου Panreac Quimica S.A. και το θερμοσταθερό άγαρ (gellum gum) ήταν του οίκου Roeper GmbH (Hamburg, Germany) Βακτηριακό στέλεχος Στην παρούσα διδακτορική εργασία χρησιμοποιήθηκε ο κλώνος ΗΒ8 του θερμόφιλου βακτηρίου Thermus thermophilus (DSM 579), ο οποίος προμηθεύτηκε από τον οίκο Deutsche Sammlung Mikroorganismen. Το βακτήριο Thermus thermophilus ΗΒ8 αποθηκεύεται στους 20 ο C σε διάλυμα του μέσου ανάπτυξης του με προσθήκη 10% (v/v) γλυκόζης (stock) Θρεπτικά υποστρώματα και συνθήκες ανάπτυξης του βακτηρίου Thermus thermophilus Για την παραγωγή της λιπάσης το βακτήριο Thermus Thermophilus HB8 καλλιεργήθηκε, σε όλες τις περιπτώσεις, σε πλούσιο μέσο ανάπτυξης (ΜΤ) που περιλαμβάνει στο λίτρο: 8 g τρυπτόνη, 4 g εκχύλισμα ζύμης και 3 g NaCl. Όλα τα υλικά και τα σκεύη που χρησιμοποιήθηκαν για την καλλιέργεια αποστειρώθηκαν σε κλίβανο στους 120 ο C για 20 λεπτά. Ο κλίβανος που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο Steam sterilizer Raypa AES-75 της ισπανικής εταιρίας R. Espinal S.L. Η ανάπτυξη των βακτηρίων έγινε στους 67 ο C σε επωαστήρα, με ανάδευση στα 210 rpm, έως το τέλος της λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων, χρησιμοποιήθηκαν δυο διαφορετικοί κινούμενοι επωαστήρες (shaking incubators) της γερμανικής εταιρίας GFL mbh μοντέλων GFL3033 και GFL3031 με συνολικό όγκο 150 l και 46 l αντίστοιχα. Τα στάδια της καλλιέργειας είναι δύο. Το πρώτο στάδιο αποτελείται από την προκαλλιέργεια, όπου ο αποθηκευμένος μικροοργανισμός (stock) αναπτύσσεται σε πλούσιο θρεπτικό συστατικό (ΜΤ) για περίπου 12 ώρες. Στη συνέχεια, η εκθετικά αναπτυσσόμενη προ-καλλιέργεια ενοφθαλμίζεται στην προς μελέτη καλλιέργεια για περαιτέρω ανάπτυξη της (δεύτερο στάδιο). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

112 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς Aνάπτυξης του βακτηρίου T. thermophilus Για τη μελέτη του τρόπου ανάπτυξης του μικροοργανισμού T. thermophilus HB8 και τον τρόπο παραγωγής της λιπάσης, το βακτήριο καλλιεργήθηκε σε 2l Erlenmeyer, φιάλη που περιέχει 500 ml μέσο ανάπτυξης ΜΤ. Το μέσο ανάπτυξης ενοφθαλμίστηκε με 2% (v/v) της εκθετικά αναπτυσσόμενης προ-καλλιέργειας του T. thermophilus και επωάστηκε στους 67 ο C για περίπου 50 ώρες με συνεχή ανάδευση στα 210 rpm. Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, συλλέχτηκαν δείγματα των 10 ml και 50 ml για μέτρηση της βιομάζας και της ενδο- / εξω- κυττάριας λιπολυτικής δραστικότητας (lipolytic activity), αντίστοιχα. Όλες οι καλλιέργειες και οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν τρείς φορές για τον έλεγχο τη επαναληψιμότητας, ενώ τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι αντίστοιχοι μέσοι όροι Μελέτη επίδρασης του Ο 2 στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus και στην ενδο- / εξω-κυττάρια δραστικότητα της λιπάσης Με σκοπό τη μελέτη της επίδρασης του οξυγόνου στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού T. thermophilus HB8 και την παραγωγή της λιπάσης, τα βακτηριακά κύτταρα αναπτύχθηκαν με τον τρόπο που περιγράφτηκε στην Παράγραφο σε 2 l Erlenmeyer φιάλη που περιέχει 300, 500 και 800 ml μέσο ανάπτυξης ΜΤ, για 36 ώρες. Μειώνοντας τον όγκο του μέσου ανάπτυξης παράγονται διαφορετικές συγκεντρώσεις οξυγόνου στο μέσο της καλλιέργειας. Αυτό επιτυγχάνεται διότι μειώνοντας τον όγκο του μέσου ανάπτυξης στην φιάλη αυξάνεται η επιφάνεια εναλλαγής αέρα, κατά συνέπεια ο βαθμός αερισμού της καλλιέργειας. Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, συλλέχτηκαν δείγματα των 10 ml και 50 ml για μέτρηση της βιομάζας και της ενδο- / εξω- κυττάριας λιπολυτικής δραστικότητας (lipolytic activity), αντίστοιχα Μελέτη επίδρασης των διαφορετικών πηγών άνθρακα στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus και στην ενδο-/εξω-κυττάριας δραστικότητα της λιπάσης Για τη μελέτη της επίδρασης διαφόρων πηγών άνθρακα στη βακτηριακή ανάπτυξη του T. thermophilus HB8 και τη δραστικότητα της λιπάσης, ελαιόλαδο (1 g/l, 2 g/l, ή 4 g/l), σουκρόζη (1 g/l) ή συνδυασμός σουκρόζης και ελαιόλαδου (1 g/l το καθένα) προστέθηκαν ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

113 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 78 στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ. Το βακτήριο T. thermophilus HB8 αναπτύχθηκε με τον τρόπο που περιγράφτηκε στην Παράγραφο σε 2 l Erlenmeyer φιάλη που περιέχει 500 ml μέσο ανάπτυξης για 36 ώρες. Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, συλλέχτηκαν δείγματα των 10 ml και 50 ml για μέτρηση της βιομάζας και της ενδο- / εξω- κυττάριας λιπολυτική δραστικότητας (lipolytic activity), αντίστοιχα Παρακολούθηση ανάπτυξης βακτηρίου Για την άμεση παρακολούθηση της ανάπτυξης του βακτηρίου Thermus thermophilus, κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, μετράται η θολερότητα ή οπτική πυκνότητα (Optical Density, O.D.) στα 600 nm του ορατού φωτός με φασματοφωτομετρία υπεριώδους/ορατού. Το φασματοφωτόμετρο που χρησιμοποιήθηκε για τις μετρήσεις είναι το U-1800UV/vis Spectrophotometer της αμερικανικής εταιρίας Hitachi High-Technologies Inc Υπολογισμός ξηρού βάρους κυττάρων Για τον υπολογισμό του ξηρού βάρος των κυττάρων λαμβάνονται 10 ml από τις καλλιέργειες, σε καθορισμένες χρονικές στιγμές, φυγοκεντρούνται για 15 λεπτά στα 5,000 x g στους 4 ο C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα που έχουν συλλεχθεί, εφόσον ξεπλυθούν με 0.9% (w/v) NaCl, ξηραίνονται με λυοφιλοποίηση. Η λυοφιλοποιημένη βιομάζα αντιπροσωπεύει την τιμή του ξηρού βάρος των κυττάρων Επεξεργασία δειγμάτων για προσδιορισμό δραστικότητας Το κάθε δείγμα που συλλέγεται (50 ml), κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας για τον προσδιορισμό της λιπολυτικής δραστικότητας, φυγοκεντρείται για 15 λεπτά στις 5,000 x g στους 4 ο C για διαχωρισμό των κυττάρων από το μέσο ανάπτυξης. Στη συνέχεια τα συλλεχθέντα κύτταρα επεξεργάζονται όπως περιγράφεται στη συνέχεια, ενώ το μέσο ανάπτυξης με τα παραχθέντα εξωκυττάρια ένζυμα συμπυκνώνεται περίπου 5 φορές με μεμβράνες υπερδιήθησης (UM30; Amicon, Beverly, MA), και χρησιμοποιείται για προσδιορισμό της εξωκυττάριας δραστικότητας της λιπάσης. Συμπύκνωση πρωτεϊνών με υπερδιήθηση Η υπερδιήθηση γίνεται σε συσκευή Amicon, στους 4 ο C, με φίλτρα διαφόρων διαστάσεων πορώδους, που επιτρέπουν μόνο τη δίοδο μορίων μικρότερου μεγέθους από τη διάμετρο των πόρων τους. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

114 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 79 Λύση κυττάρων Για τον προσδιορισμό της ενδοκυττάριας παραγόμενης λιπάσης, η υγρή βιομάζα που συλλέγεται από κάθε δείγμα κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας ξεπλένεται αρχικά με 0.9% (w/v) NaCl. Στη συνέχεια για τη λύση των κυττάρων, η υγρή βιομάζα αναδεύεται για 1.5 ώρα στους 4 ο C σε ρυθμιστικό διάλυμα 50 ml Tris HCl ph 7 που περιέχει 25 mm EDTA ph 8.0, 25 mm NaCl και 1 mm PMSF, σε συνολικό όγκο 5 ml/g υγρής βιομάζας. Μετά την πάροδο της 1.5 ώρας ακολουθεί περαιτέρω λύση των κυττάρων με τη βοήθεια υπερήχων για 30 κύκλους των 20 δευτερολέπτων με ενδιάμεση παύση 20 δευτερόλεπτων. Η συσκευασία υπερήχων που χρησιμοποιείται είναι η Vibra Cell VC-505 της αμερικανικής εταιρίας Sonics & Materials Inc., εφοδιασμένη με ένα μεταλλικό probe από κράμα τιτανίου (ΤΙ-6ΑL-4V). Το τελικό μίγμα φυγοκεντρείται στα 5,000 x g για 15 λεπτά και το υπερκείμενο χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της ενδοκυττάριας λιπάσης Προσδιορισμός δραστικότητας λιπάσης Ο προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας της λιπάσης πραγματοποιείται υπολογίζοντας την ποσότητα του προϊόντος που ελευθερώνεται από μια συγκεκριμένη αντίδραση, χρησιμοποιώντας ένα κατάλληλο για τη λιπάση υπόστρωμα. Το συνηθέστερο φυσικό υπόστρωμα για τη λιπάση είναι το ελαιόλαδο. Ωστόσο, αρκετοί άλλοι φυσικοί και συνθετικοί εστέρες καθώς και τριγλυκερίδια έχουν χρησιμοποιηθεί ως υποστρώματα λιπάσης (Zheng, 2005). Η αντίδραση που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της λιπάσης είναι η υδρόλυση του δωδεκανοϊκού π-νιτροφαινυλεστέρα (p-npl). Η υδρόλυση του p-npl καταλύεται από τη λιπάση ελευθερώνοντας π-νιτροφαινόλη (Σχήμα 2.7). Η π- νιτροφαινόλη από μόνη της είναι άχρωμη, όμως, σε ουδέτερο και αλκαλικό περιβάλλον (ph 7) βρίσκεται κυρίως σε μορφή ανιόντος, όπου λαμβάνει κίτρινο χρώμα. Η ένταση του κίτρινου χρώματος ανιχνεύεται φασματοφωτομετρικά στα 410 nm και η ένταση της απορρόφησης είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση της π-νιτροφαινόλης. Η συγκέντρωση της π-νιτροφαινόλης που ελευθερώνεται υπολογίζεται από πρότυπη καμπύλη αναφοράς, γνωστής συγκέντρωσης π-νιτροφαινόλης (Zheng, 2005). To διάλυμα της αντίδρασης για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της λιπάσης περιέχει 2.5 mm (pnpl) (διαλυμένο σε υψηλής καθαρότητας αιθανόλη) και 50 mm φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος ph 7.0 σε τελικό όγκο 1 ml (Sigurgisladottir, 1993). H αντίδραση αρχίζει με την προσθήκη μl διαλύματος ενζύμου στο αντιδρόν μίγμα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

115 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 80 (1 ml συνολικός όγκος) και στη συνέχεια επωάζεται στους 65 o C για 20 λεπτά. Η αντίδραση τερματίζεται με την προσθήκη 0.25 ml διαλύματος Na 2 CO M και με φυγοκέντριση του μίγματος για 10 λεπτά στα 10,000 x g για την απομάκρυνση των κατακρημνισμένων πρωτεϊνών. Η τιμή της οπτικής απορρόφησης προσδιορίζεται στα 410 nm. Από την απορρόφηση των δειγμάτων αφαιρείται η αντίστοιχη μέτρηση ενός πρότυπου διαλύματος μηδενικής συγκέντρωσης λιπάσης, για την αφαίρεση της ποσότητας της π- νιτροφαινόλης που έχει παραχθεί από μη καταλυτική δράση της λιπάσης. O O C C O 2 N O (CH 2 ) 10 CH 3 + H 2 O Λιπάση O 2 N OΗ + ΗO (CH 2 ) 10 CH 3 Σχήμα 2.7 Καταλυτική υδρόλυση του δωδεκανοϊκού π-νιτροφαινυλεστέρα (p-npl) από τη λιπάση. H δραστικότητα της λιπάσης εκφράζεται σε U/l, οπού 1 U ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που παράγει 1 μmol π-νιτροφαινόλης ανά λεπτό στις συγκεκριμένες συνθήκες. Ο μοριακός συντελεστής αποσβέσεως (molar extriction coefficient) (ε) υπολογίστηκε 17.2 mm -1 cm -1, με βάση πρότυπης καμπύλης αναφοράς με γνωστές ποσότητες συγκεντρώσεων π-νιτροφαινόλης. Τα U/ml υπολογίζονται από την εξίσωση [2.1]: U A ml = ε tv 410nm / [2.1] Όπου: Α 410nm : Η απορρόφηση του διαλύματος στα 410 nm μετά από το χρόνο επώασης ε: Ο μοριακός συντελεστής αποσβέσεως (molar extriction coefficient) (mm -1 cm -1 ) t: Ο χρόνος της αντίδρασης (min) V: Ο όγκος του ενζυμικού διαλύματος (ml). Η δραστικότητα της λιπάσης προσδιορίστηκε επίσης σε τρυβλία που περιείχαν άγαρ, Tween 80 CaCl 2 και Nile blue (0.01% w/v) όπως περιγράφει ο Sierra, (1957). Ποσότητα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

116 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς μl από μια υγρή καλλιέργεια του T. thermophilus HB8, που έχει επωαστεί για ώρες στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ, ενοφθαλμίστηκε σε ένα τρυβλίο που περιέχει άγαρ και 1% v/v Tween 80 (εστέρας ελαϊκού οξέος) και επωάστηκε στους 70 ο C. Η λιπολυτική δραστικότητα παρατηρήθηκε μέσω της δημιουργίας ομόκεντρων κύκλων γύρω από τις αποικίες του μικροοργανισμού. 2.7 Αποτελέσματα Σχολιασμός Μελέτη ανάπτυξης του βακτηρίου T. thermophilus και της ενδο- / εξωκυττάριας δραστικότητας της λιπάσης Η ικανότητα του βακτηρίου T. thermophilus ΗΒ8 να παράγει λιπάση είναι γνωστή από αρκετούς ερευνητές (Fucinos et al., 2005; Dominguez et al., 2007; Sigurgisladottir et al., 1993). Ωστόσο πριν ερευνηθούν οι διάφοροι παράγοντες (αερισμός, και πηγή άνθρακα) που επηρεάζουν την παραγωγή της λιπάσης θεωρήθηκε σκόπιμο να μελετηθεί ο τρόπος ανάπτυξης του βακτηρίου και η εξωκυττάρια και ενδοκυττάρια παραγωγή της λιπάσης. Για το σκοπό αυτό ο μικροοργανισμός αναπτύχθηκε στο πλούσιο μέσο ανάπτυξης ΜΤ για ~50 ώρες. O.D. D.C.W Οπτική Πυκνότητα (Ο.D.) 600nm Ξηρή Μάζα Κυττάρων (D.C.W.) (g/l) Χρόνος Καλλιέργειας (h) 0.0 Σχήμα 2.8 Κινητική μελέτη ανάπτυξης του βακτηρίου T. thermophilus ΗΒ8 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

117 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 82 Όπως φαίνεται από τα Σχήματα 2.8 και 2.9 το βακτήριο T. thermophilus ΗΒ8 αναπτύσσεται αρκετά γρήγορα με ταυτόχρονη παράγωγη ενδο- και εξω- κυττάριας λιπάσης. Στο Σχήμα 2.8 παρατηρείται ότι η εκθετική ανάπτυξη του μικροοργανισμού τελειώνει περίπου στις 30 ώρες και στη συνέχεια μέχρι το τέλος της καλλιέργειας η βιομάζα παραμένει σχεδόν σταθερή με μια ελάχιστη μείωση. Όπως διακρίνεται στο Σχήμα 2.9, το βακτήριο T. thermophilus από την αρχή της ανάπτυξης του παράγει ενδοκυττάρια και εξωκυττάρια λιπάση. Η δραστικότητα της ενδοκυττάριας παραγόμενης λιπάσης αυξάνεται συνεχώς μέχρι τις 30 ώρες όπου παρατηρείται και η μέγιστη τιμή δραστικότητας και στη συνέχεια, μέχρι το τέλος της καλλιέργειας, αρχίζει να μειώνεται. Ωστόσο, η δραστικότητα της εξωκυττάριας λιπάσης αυξάνεται συνεχώς μέχρι το τέλος της καλλιέργειας. Πρέπει να σημειωθεί ότι μετά τις 30 ώρες καλλιέργειας αύξηση της δραστικότητας της εξωκυττάριας παραγόμενης λιπάσης που διακρίνεται οφείλεται στη λύση των κυττάρων. Ύστερα από 30 ώρες καλλιέργειας η ανάπτυξη του βακτηρίου βρίσκεται σε φάση στασιμότητας με αποτέλεσμα η περαιτέρω ανάπτυξη του να έχει σταματήσει. Έτσι, η παραχθείσα ενδοκυττάρια λιπάση ελευθερώνεται στο μέσο ανάπτυξης, με αποτέλεσμα την αύξηση της δραστικότητας της εξωκυττάριας λιπάσης. Εξωκυττάρια Δραστικότητα Λιπάσης (U/l) Εξωκυττάρια Ενδοκυττάρια Χρόνος καλλιέργειας (h) Ενδοκυττάρια Δραστικότητα Λιπάσης (U/l) Σχήμα 2.9 Κινητική μελέτη ενδο- και εξω-κυττάριας δραστικότητας λιπάσης. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

118 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 83 Με σκοπό να προσδιοριστεί κατά πόσο η λιποδιαλυτική δραστικότητα (lipolytic activity) που εμφανίζει ο T. thermophilus ΗΒ8 οφείλεται στη λιπάση ή στην εστεράση, ελέγχτηκε εάν τα ένζυμα που παράγονται από το βακτήριο μπορούν να αποικοδομήσουν το Tween 80, ένα εμπορικό υπόστρωμα της λιπάσης. Το Tween 80 είναι ένα κατάλληλο μη διαλυτό στο νερό υπόστρωμα, για τον προσδιορισμό της λιπάσης από την εστεράση, καθώς οι εστεράσες προτιμούν να υδρολύσουν υδατοδιαλυτούς εστέρες (π.χ. οξικός αιθυλεστέρας) και διαχωρίζουν συνήθως μόνο εστέρες λιπαρών οξέων που έχουν ανθρακική αλυσίδα μικρότερη από C 6 (Jaeger et al., 1994, Fojan et al., 2000). Γενικά, το Tween 80 έχει ευρέως χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση της δραστικότητας της λιπάσης, καθώς περιέχει μια εστερική ομάδα που μπορεί να υδρολυθεί από τις λιπάσες (Sierra, 1957; Kennedy, 1969). Η δραστικότητα της λιπάσης προσδιορίστηκε σε τρυβλία που περιείχαν άγαρ, Tween 80 CaCl 2, και Nile Blue. O σχηματισμός χαρακτηριστικών ομόκεντρων κύκλων, λόγω της υδρόλυσης το ελαϊκού οξέος (Tween 80) και του σχηματισμού του ολεϊκού ασβεστίου, δηλώνουν την έκκριση της λιπάσης στο μέσο ανάπτυξης του T. thermophilus (Σχήμα 2.10). Σχήμα 2.10 Ανίχνευση λιπολυτικής δραστικότητας από το βακτήριο T. thermophilus σε τρυβλίο που περιέχει άγαρ,tween 80 CaCl 2 και 0.01%v/v Nile Blue Επίδρασης Ο 2 στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus και στην ενδο- / εξω-κυττάρια δραστικότητα της λιπάσης. Ο αερισμός κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας των οργανισμών που ανήκουν στο γένος του Thermus, έχει αναφερθεί από πολλούς ερευνητές (Belo et al, 2000; Demirtas et al., 2003; Janssen et al., 1994) ότι είναι ένας πολύ σημαντικός παράγοντας στην ανάπτυξη ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

119 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 84 του μικροοργανισμού. Ωστόσο, επειδή η διαλυτότητα του Ο 2 σε υψηλές θερμοκρασίες είναι χαμηλή και καθώς το βακτήριο Thermus thermophilus είναι ένα καθαρά αερόβιος μικροοργανισμός, οι ανάγκες του για οξυγόνο είναι μεγάλες. Με σκοπό να ερευνηθεί ο ρόλος αυτού του παράγοντα στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού και στην ενδοκυττάρια και εξωκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης του T. thermophilus HB8, ο μικροοργανισμός καλλιεργείται σε διαφορετικές συνθήκες αερισμού και κατά συνέπεια συγκεντρώσεων οξυγόνου. Όπως περιγράφεται στην πειραματική διαδικασία, για να επιτευχθούν διαφορετικές συνθήκες αερισμού κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, διεξήχθηκαν πειράματα με τρείς διαφορετικούς όγκους του μέσου ανάπτυξης ΜΤ. Μειώνοντας τον όγκο του μέσου ανάπτυξης επιτυγχάνεται αύξηση της επιφάνειας του ελεύθερου αέρα στη φιάλη, με αποτέλεσμα κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας με τη βοήθεια της ανάδευσης να δημιουργούνται καλύτερες συνθήκες αερισμού. 10 Οπτική πυκνότητα (O.D.) 600 nm ml 500 ml 800 ml Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.11 Επίδραση οξυγόνου στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus HB8 (Οπτική πυκνότητα καλλιέργειας). Όπως φαίνεται από τα Σχήματα , ο αερισμός (οξυγόνο) παίζει ένα πολύ σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του βακτηρίου αλλά και στην δραστικότητα της ενδο- ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

120 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 85 /εξω-κυττάριας λιπάσης. Όπως παρατηρείται στο Σχήμα 2.12 η βιομάζα της καλλιέργειας που πραγματοποιήθηκε σε φιάλη με 300 ml μέσο ανάπτυξης, όπου επικρατούν και οι καλύτερες συνθήκες αερισμού, παρουσιάζει ένα μέγιστο στις 25 ώρες καλλιέργειας και μετά μειώνεται. Σε αντίθεση, οι καλλιέργειες στις φιάλες με τα 500 και 800 ml μέσο ανάπτυξης παρατηρείται μια μικρή και συνεχόμενη αύξηση της βιομάζας. Στο Σχήμα 2.13 εμφανίζεται η εξωκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης η οποία σε όλες τις φιάλες αυξάνεται συνεχώς σε όλη τη διάρκεια της καλλιέργειας, σε αντίθεση με την ενδοκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης η οποία παρουσιάζει ένα μέγιστο στις 30 ώρες καλλιέργειας (Σχήμα 2.14), όπως παρατηρήθηκε και στην περίπτωση της μελέτης ανάπτυξης του Τ. thermophilus. Επιπροσθέτως, παρατηρείται ότι οι καλύτερες συνθήκες αερισμού ευνοούν την αύξηση της δραστικότητας της λιπάσης (ενδο- και εξω- κυττάριας). Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα, η ποσότητα του οξυγόνου που βρίσκεται κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας επηρεάζει και την ανάπτυξη της βιομάζας και τη δραστικότητα της λιπάσης. Συγκεκριμένα η ανάπτυξη της βιομάζας και η ένδο-, εξωκυττάρια δραστικότητα ευνοείται σε συνθήκες καλύτερου αερισμού όπου η συγκέντρωσης του διαλυμένου οξυγόνου είναι περισσότερη Ξηρή Μάζα Κυττάρων (g/l) ml 500 ml 800 ml Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.12 Επίδραση οξυγόνου στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus HB8 (Ξηρή μάζα κυττάρων). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

121 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 86 Εξωκυττάρια Δραστικότητα Λιπάσης (U/l) ml 500 ml 800 ml Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.13 Επίδραση οξυγόνου στην εξωκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB8. 40 Ενδοκυυτάρια Δραστικότητα Λιπάσης (U/l) ml 500 ml 800 ml Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.14 Επίδραση οξυγόνου στην ενδοκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB8. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

122 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 87 Συνολικά U/l καλλιέργειας Συνολικά U/mg βιομάζας Συνολικά U/l/h ml 500 ml 800 ml 0 Συνολικά U/l Συνολικά U/mg βιομάζας Συνολικά U/l/h Σχήμα 2.15 Επίδραση οξυγόνου στη συνολική δραστικότητα της λιπάσης ως προς τον όγκο του μέσου ανάπτυξης, την παραγόμενη βιομάζας και του χρόνου καλλιέργειας (30 ώρες). Επίσης πρέπει να σημειωθεί ότι ο αερισμός επηρεάζει και την συνολική δραστικότητα της λιπάση. Όπως παρατηρείται και από το Σχήμα 2.15 η καλλιέργεια που είχε τις καλύτερες συνθήκες αερισμού (300 ml μέσο ανάπτυξης) παρουσίασε και τη βέλτιστη συνολική ολική δραστικότητα της λιπάσης (ένδο και έξω) 41 U/l, καθώς επίσης και την καλύτερη παραγωγικότητα της λιπάσης 1.37 U/l/h. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που προέκυψαν για το βακτήριο T. thermophilus HB 27 (Fucinos et al., 2005) Παραγωγή λιπάσης με διαφορετικές πηγές άνθρακα στο μέσο ανάπτυξης Με σκοπό να βελτιωθεί η ανάπτυξη του βακτηρίου και να ευνοηθεί η έκκριση του ενζύμου, μελετήθηκε η επίδραση μερικών σημαντικών παραμέτρων όπως είναι αυτή της πηγής άνθρακα. Η πηγή άνθρακα έχει αναφερθεί ως ο σημαντικότερος παράγοντας για την έκφραση της λιπάσης καθώς θεωρείται επαγώγιμο ένζυμο. Επίσης, έχει αναφερθεί ότι η παρουσία λιπιδίων είναι κρίσιμη για την παραγωγή της λιπάσης και της εστεράσης από αρκετούς μικροοργανισμούς (Sharma, 2001). Σε αυτές τις διεργασίες, τα λιπίδια που διεγείρουν περισσότερο την έκκριση της λιπάσης και που χρησιμοποιούνται περισσότερο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

123 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 88 είναι τα λιπαρά οξέα, τα τριγλυκερίδια και μερικοί εστέρες. Ωστόσο, η παραγωγή τους επηρεάζεται σημαντικά και από άλλες πηγές άνθρακα όπως είναι τα σάκχαρα, οι πολυσακχαρίτες, το τυρόγαλα (ορό γάλατος) και άλλες σύνθετες πηγές (Gilbert et al., 1991a; Lotrakul and Dharmsthiti, 1997; Dharmstiti and Kuhasuntisuk, 1998; Ghanem et al., 2000; Rashid et al., 2001). Με σκοπό να μελετηθεί η επίδραση της πηγής άνθρακα στην παραγωγή της λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB8 πραγματοποιηθήκαν καλλιέργειες σε κωνικές φιάλες με 500 ml μέσο ανάπτυξης ΜΤ που περιείχε διαφορετικές συγκεντρώσεις ελαιόλαδου, σουκρόζης ή συνδυασμός των δύο. Για τον προσδιορισμό της βιομάζας και τη δραστικότητα της λιπάσης κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας συλλέχθηκαν δείγματα όπως περιγράφεται στην πειραματική διαδικασία. Στα Σχήματα 2.16 και 2.17 παρουσιάζονται η επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων του ελαιόλαδου (1 g/l, 2 g/l και 4 g/l) στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ στην ανάπτυξη του βακτηρίου. Όπως παρατηρείται από το Σχήμα 2.17 η αύξηση της συγκέντρωσης του ελαιόλαδου από τα 1 g/l στα 4g/l, κατέληξε σε μεγαλύτερη ανάπτυξη του βακτηρίου και σε μεγαλύτερη παραγόμενη βιομάζα. Επίσης, παρατηρήθηκε παρόμοια αύξηση της εξωκυττάριας δραστικότητας της λιπάσης, ανεξάρτητα από την αρχική συγκέντρωση του ελαιολάδου (Σχήμα 2.18). Ωστόσο, η προσθήκη του ελαιόλαδου στο πλούσιο μέσο ανάπτυξης μείωσε ελάχιστα την ενδοκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης σε σχέση με την καλλιέργεια όπου δεν προστέθηκε ελαιόλαδο (Σχήμα 2.19). Οι χαμηλές τιμές της ενδοκυττάριας δραστικότητας της λιπάσης δηλώνουν ότι η παρουσία του ελαιόλαδου επάγουν την έκφραση του γονίδιου της εξωκυττάριας λιπάσης, με σκοπό η λιπάση που θα παραχθεί να το διασπάσει για να μπορέσει το βακτήριο να το μεταβολίσει. Παρόμοια αποτελέσματα παρουσιάστηκαν σε μια παρόμοια μελέτη για το βακτήριο T. thermophilus HB27 (Dominquez et al., 2007), όπου η προσθήκη 1 g/l ελαιόλαδου στο μέσο αναφοράς ήταν η βέλτιστη συγκέντρωση για την αύξηση της εξωκυττάριας δραστικότητας της λιπάσης. Συμπερασματικά μπορεί να ειπωθεί ότι το ελαιόλαδο ενισχύει την παραγωγή της εξωκυττάριας λιπάσης μέσω ενός μονοπατιού έκκρισης, ενώ μια συγκέντρωση ελαιόλαδου πάνω από ένα όριο στο μέσο ανάπτυξης, δεν επηρεάζει περαιτέρω τη λιπολυτική δραστικότητα της. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

124 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς Οπτική Πυκνότητα 600nm Χωρίς προσθήκη 1 g/l ελαιόλαδο 2 g/l ελαιόλαδο 4 g/l ελαιόλαδο Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.16 Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων ελαιόλαδου στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus HB8 (Οπτική πυκνότητα καλλιέργειας) Ξηρή Μάζα Κυττάρων (g/l) Χωρίς προσθήκη 1 g/l ελαιόλαδο 2 g/l ελαιόλαδο 4 g/l ελαιόλαδο Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.17 Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων ελαιόλαδου στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus HB8 (Ξηρή μάζα κυττάρων). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

125 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 90 Εξωκυττάρια Δραστικότητα Λιπάσης (U/l) Χωρίς προσθήκη 1 g/l ελαιόλαδο 2 g/l ελαιόλαδο 4 g/l ελαιόλαδο Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.18 Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων ελαιόλαδου στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ στη δραστικότητα της εξωκυττάριας λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB8. 30 Ενδοκυττάρια Δραστικότητα Λιπάσης (U/l) Χωρίς προσθήκη 1 g/l ελαιόλαδο 2 g/l ελαιόλαδο 4 g/l ελαιόλαδο Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.19 Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων ελαιόλαδου στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ στη δραστικότητα της ενδοκυττάριας λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB8. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

126 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 91 Η δεύτερη πηγή άνθρακα που μελετήθηκε στην επίδραση της δραστικότητα της λιπάσης είναι η σουκρόζη, μόνη και σε συνδυασμό με ελαιόλαδο. Όπως παρατηρείται από τα Σχήματα 2.20 και 2.21, η προσθήκη 1 g/l σουκρόζης δεν επηρέασε σημαντικά την ανάπτυξη του βακτηρίου και την παραγωγή της βιομάζας. Ωστόσο, η πρόσθεση 1 g/l σουκρόζης μαζί με 1 g/l ελαιόλαδου κατέληξαν σε υψηλότερους ρυθμούς ανάπτυξης και παραγωγής βιομάζας. Στο Σχήμα 2.22 παρουσιάζεται η επίδραση της σουκρόζης στην εξωκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης. Όπως παρατηρείται η παρουσία της σουκρόζης στο μέσο ανάπτυξης δεν είχε καμία επίδραση στην έκκριση της εξωκυττάριας λιπάσης, σε αντίθεση με την προσθήκη του ελαιόλαδου που βοήθησε, όπως ειπώθηκε και προηγουμένως, στην αύξηση της παραγωγής της εξωκυττάριας λιπάσης. Ωστόσο, η προσθήκη της σουκρόζης στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ αύξησε κατά πολύ τη δραστικότητα της ενδοκυττάριας λιπάσης (42 U/l από 31 U/l) (Σχήμα 2.23). Οπτική Πυκνότητα 600nm Χωρίς προσθήκη 1 g/l ελαιόλαδο 1 g/l σουκρόζη 1 g/l ελαιόλαδο & σουκρόζη Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.20 Επίδραση σουκρόζης και ελαιόλαδου στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus HB8 (Οπτική πυκνότητα καλλιέργειας). Στους ευκαριωτικούς οργανισμούς, οι λιπάσες εμπλέκονται σε διαφορετικά στάδια του μεταβολισμού των λιπιδίων συμπεριλαμβανομένου στην χώνεψη των λιπών, στην ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

127 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 92 απορρόφηση, στην αναδόμηση και στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών. (Rohit et al., 2001). Όπότε, η αύξηση της δραστικότητας της ενδοκυττάριας λιπάσης μπορεί να εξηγηθεί από το μεταβολικό μονοπάτι του μεταβολισμού της σουκρόζης. Η σουκρόζη διασπάται σε φρουκτόζη και γλυκόζη, η οποία, η τελευταία, εισέρχεται στο κύκλο του κιτρικού οξέος (Παράγραφος 5.6) όπου συνθέτεται συνενζυμοακέτυλο-α, το οποίο οδηγεί στη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων. Τα λιπαρά οξέα που συνθέτονται επάγουν την έκφραση του γονιδίου της ενδοκυττάριας λιπάσης, με αποτέλεσμα την αύξηση της ενδοκυττάριας δραστικότητας της. 2.0 Ξηρή Μάζα Κυττάρων (g/l) Χωρίς προσθήκη 1 g/l ελαιόλαδο 1 g/l σουκρόζη 1 g/l ελαιόλαδο & 1 g/l σουκρόζη Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.21 Επίδραση σουκρόζης και ελαιόλαδου στην ανάπτυξη του βακτηρίου T. thermophilus HB8 (Ξηρή μάζα κυττάρων). Παρόμοια αποτελέσματα, έχουν αναφερθεί και σε άλλες μελέτες (Dominquez et al., 2007), όπου η προσθήκη σουκρόζης και μαλτόζης στο ΜΤ μέσο ανάπτυξης της καλλιέργειας αύξησε την ενδοκυττάρια λιπολυτική δραστικότητα και το ρυθμό ανάπτυξης του βακτηρίου, χωρίς να επηρεάσει την παραγόμενη εξωκυττάρια λιπάση. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

128 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 93 Εξωκυττάρια Δραστικότητα Λιπάσης (U/l) Χωρίς προσθήκη 1 g/l ελαιόλαδο 1 g/l σουκρόζη 1 g/l ελαιόλαδο & 1 g/l σουκρόζη Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.22 Επίδραση σουκρόζης και ελαιόλαδου στην παραγωγή της εξωκυττάριας λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB8. Ενδοκυττάρια Δραστικότητα Λιπάσης (U/l) Χωρίς προσθήκη 1 g/l ελαιόλαδο 1 g/l σουκρόζη 1 g/l ελαιόλαδο & σουκρόζη Χρόνος καλλιέργειας (h) Σχήμα 2.23 Επίδραση σουκρόζης και ελαιόλαδου στην παραγωγή της ενδοκυττάριας λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB8. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

129 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 94 Όπως διαπιστώθηκε προηγουμένως, η ταυτόχρονη παρουσία σουκρόζης και ελαιόλαδου στο μέσο ανάπτυξης ΜΤ του βακτηρίου ενίσχυσε ταυτόχρονα την ανάπτυξη της βιομάζας, και την παραγόμενη ενδο- και εξω-κυττάρια λιπάση. Όπως φαίνεται και στο Σχήμα 2.24 η συνολική δραστικότητα της λιπάσης ως προς τον όγκο της καλλιέργειας στην περίπτωση της ταυτόχρονης προσθήκης σουκρόζης και ελαιόλαδου είναι η υψηλότερη (~48 U/l). Επίσης, παρατηρείται ότι στις καλλιέργειες που προστέθηκε σουκρόζη, είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με ελαιόλαδο, η συνολική δραστικότητα της λιπάσης ως προς τη βιομάζα και το χρόνο καλλιέργειας παρουσίασαν τα καλύτερα αποτελέσματα (~28 U/mg και 1.5 U/l/h) Συνολικά U/l καλλιέργειας Συνολικά U/ mg βιομάζας Συνολικά U/l/h Χωρίς προσθήκη 1 g/l ελαιόλαδο 1 g/l σουκρόζη 1g/l σουκρόζη & ελαιόλαδο 0 Συνολικά U/l Συνολικά U/mg βιομάζας Συνολικά U/l/h Σχήμα 2.24 Επίδραση πηγής άνθρακα στη συνολική δραστικότητα της λιπάσης ως προς τον όγκο του μέσου ανάπτυξης, της παραγόμενης βιομάζας και του χρόνου (χρόνος καλλιέργειας 30 ώρες). Πρέπει να σημειωθεί ότι στην περίπτωση που ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε το ελαιόλαδο, αν και αυξήθηκε η εξωκυττάρια λιπάση, επειδή μειώθηκε η ενδοκυττάρια λιπάση, η συνολική δραστικότητα της λιπάσης δεν μεταβλήθηκε. Επίσης, παρατηρώντας το Σχήμα 2.24 μπορεί να ειπωθεί ότι η αύξηση της εξωκυττάριας λιπάσης οφείλεται ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

130 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 95 κυρίως στην αύξηση της παραγωγής της βιομάζας καθώς η συνολική δραστικότητα της λιπάσης ως προς την παραγόμενη βιομάζα είναι μικρότερη από αυτή της καλλιέργειας χωρίς καμία προσθήκη άνθρακα. 2.8 Συμπεράσματα Με σκοπό τη μελέτη μερικών παραμέτρων που επηρεάζουν την παραγωγή της λιπάσης, ενδοκυττάριας και εξωκυττάριας, από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus thermophilus ΗΒ8, μελετήθηκε η επίδραση του αερισμού και δυο πηγών άνθρακα (ελαιόλαδο και σουκρόζη). Αρχικά μελετήθηκε ο τρόπος ανάπτυξης του βακτηρίου με σκοπό να διαπιστωθεί ο βέλτιστος χρόνος ανάπτυξης του για τη βέλτιστη παραγωγή βιομάζας και ενζυμικής δραστικότητας. Όπως παρατηρήθηκε από τα Σχήματα 2.8 και 2.9 ο βέλτιστος χρόνος που απαιτείται για τη μέγιστη παραγωγή βιομάζας και λιπάσης είναι οι 30 ώρες καλλιέργειας. Σε αυτό το χρόνο καλλιέργειας, τα κύτταρα ακόμα αναπτύσσονται χωρίς να έχει αρχίσει η λύση τους και έτσι λαμβάνεται η μέγιστη παραχθείσα βιομάζα με τη βέλτιστη ενδοκυττάρια λυπολιτική δραστικότητα. Επίσης, σε αυτό το χρόνο καλλιέργειας, μπορεί να προσδιοριστεί μόνο η δραστικότητα της λιπάσης που έχουν εκκρίνει τα κύτταρα στο μέσο ανάπτυξης, χωρίς να υπολογίζεται και η δραστικότητα της λιπάση που έχει απελευθερωθεί από τη λύση των κυττάρων. Στη συνέχεια μελετώντας την επίδραση του οξυγόνου στην καλλιέργεια του Thermus thermophilus ΗΒ8 διαπιστώθηκε ότι η μεγαλύτερη συγκέντρωση οξυγόνου στο μέσο ανάπτυξης κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας βοηθά θετικά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και τη δραστικότητα της ενδο- και εξω- κυττάριας λιπάσης, Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση δυο διαφορετικών πηγών άνθρακα και ο συνδυασμός τους (σουκρόζη και ελαιόλαδο) στην ανάπτυξη των κυττάρων του Thermus thermophilus ΗΒ8 και στην παραγωγή της λιπάσης. Το συμπέρασμα που βγήκε από αυτή τη μελέτη ήταν ότι η παρουσία του ελαιόλαδου στο μέσο ανάπτυξης ενισχύει την εξωκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης καθώς και την παραγωγή της βιομάζας, μειώνοντας όμως την ενδοκυττάρια παραγωγή της λιπάσης. Σε αντίθεση με το ελαιόλαδο, η σουκρόζη ενισχύει την παραγωγή την ενδοκυττάριας λιπάσης χωρίς να επηρεάζει, όμως, την παραγόμενη βιομάζα και την εξωκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης. Οπότε, ο συνδυασμός αυτών των δυο πηγών άνθρακα κατάφερε να αυξήσει τη βιομάζα και τη συνολική παραγωγή της λιπάσης, καθώς αυξήθηκαν ταυτόχρονα η ενδοκυττάρια και η εξωκυττάρια λιπολυτική δραστικότητα. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

131 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 96 Βιβλιογραφία 2 ου Κεφαλαίου Adams M., Kelly R., Trends Biotechnol, 16, 329, (1998). Adams M., Perler F., Kelly R., Bio/Technology,13, 662, (1995). Ahmed E.H., Raghavendra T., Madamwar D., Bioresour. Technol., 101, , (2010). Akoh C.C., Biotechnol. Lett., 15, 949, (1993). Angkawidjaja C. and Kanaya S., Cell Mol. Life Sci., 63, , (2006). Arpigny J.L., Jaeger K.E., Biochem. J., 343, , (1999). Azim A, Sharma SK, Olsen CE, Parmar VS., Bioorg Med Chem, 9, 1345, (2001). Babu I.S., Rao G.H., Res. J. Microbiol., 2, 88-93, (2007). Bajpai P., Biotechnol Progr, 15, 147, (1999). Barbaro S.E., Trevors J.T., Inniss W.E., Can J Microbiol, 47, 194, (2001). Beisson F., Arondel V., Verger R., Biochem Soc Trans, 28, 73, (2000). Belo I., Pinheiro R., Mota M., Applied Microbiology and Biotechnology, 53, , (2000). Benjamin S., Pandey A., Yeast, 14, 1069, (1998). Berger J. L., Lee B. H., Lacroix C., Appl. Microbiol. Biotechnol., 44, 81-87, (1995). Berglund P, Hutt K. Biocatalytic synthesis of enantiopure compounds using lipases. In: Patel RN, editor. Stereoselective biocatalysis. New York: Marcel Dekker, (2000). Bergquist, P. L., Love, D. R., Croft, J. E., Streiff, M. B., Daniel, R. M. and Morgan, W. H., Biotech. Gen. Eng. Revs., 5, 199, (1987). Boekema A.B., Breuer M., Hauer B., Koster M., Rosenau F., Jaeger K.E., Tommassen J., Appl. Env. Microbiol., 73, , (2007). Bonrath W., Karge R., Netscher T., J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 19 20, 67 72, (2002). Bradoo S., Saxena R.K., Gupta R., World J. Microbiol. Biotechnol., 15, 87, (1999). Brady L. Brzozowski A. M., Derewenda Z. S., Dodson E., Dodson G., Tolley S., Turkenburg J. P., Christiansen L., Huge-Jensen B., Norskov L., Thim L., Menge U., Nature, 343, 767, (1990). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

132 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 97 Brock T. D., Extreme thermophiles of the genera Thermus and Sulfolobus. In.: Starr M. P., Stolp H., Truper H. G., Ballows A., and Schlegel H. G. (Eds), The Prokaryotes: A handbook of habitats, isolation, and identification of bacteria. Springer-Verlag, Berlin, pp , (1981). Brock T. D., Science., 230, 132, (1985). Brzozowski A.M., Derewenda U., Derewenda Z.S., Dondson G., Lawson D.M., Turkenburg J.P., Bjorkling F., Huge-Jensen B., Patkar S.A., Thim L., Nature, 351, 491, (1991). Buist G., Ridder A.N.J.A., Kok J., Kuipers O.P., Microbiol., 152, , (2006). Cardenas J, Alvarez E, de Castro-Alvarez M-S, Sanchez-Montero J-M, Valmaseda M, Elson SW, Sinisterra J-V., J Mol Catal B: Enzym, 14, 111, (2001). Cheetham P.S.J., Principles of industrial biocatalysis and bioprocessing. In: Wiseman A, editor. Handbook of enzyme biotechnology. UK: Ellis Horwood, p , (1995). Cheetham P.S.J., The applications of enzymes in industry. In: Wiseman A, editor. Handbook of enzyme biotechnology. UK: Ellis Horwood, p , (1995). Chisti Y. Solid substrate fermentations, enzyme production, food enrichment. In: Flickinger MC, Drew SW, editors. Encyclopedia of bioprocess technology: fermentation, biocatalysis, and bioseparation, vol. 5. New York: Wiley, pp (1999). Chowdary GV, Ramesh MN, Prapulla SG., Process Biochem, 36, 331, (2001). Colman MH, Macrae AR. UK Patent No , (1980). Coolbear T., Daniel R.M., Morgan H.W., Adv Biochem Eng Biotechnol, 45, 57, (1992). Cordenons A., Gonzalez R., Kok R., Hellingwerf K.J., Nudel C., Biotechnol Lett, 18, 633 8, (1996). Cowan D. A., Biochem. Soc. Sym., 58, , (1992). De Pascale D., Cusano A.M., Autore F., Parrilli E., Di Prisco G., Marino G., Tutino M.L., Extremophiles, 12, , (2008). Demirjian D. C., Moris-Varas F., Cassidy C. S., Curr. Opin. Chem. Biol., 5, , (2001). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

133 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 98 Demirtas M.U., Kolhatkar A., Kilbane J.J., Journal of Bioscience and Bioengineering, 95, , (2003). Derewenda U., Derewenda Z. S., Biochem. Cell. Biol., 69, 842, (1991). Derewenda U., Swenson L., Green R., Wei Y., Dodson G. G., Yamaguchi S., Haas M. J., Derewenda Z. S., Nat. Struct. Biol., 1, 36, (1994). Derewenda Z. S., Sharp A. M., TIBS, 18, 20, (1993). Dharmsthiti S., Kuhasuntisuk B., J Ind Microbiol Biotechnol, 21, 75, (1998) Dominguez A., Fucinos P., Rua M.L., Pastrana L., Longo M.A., Sanroman M.A., Enzyme Microb. Technol., 40, , (2007). Dong H., Gao S., Han S., Cao S., Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 251, (1999). Ducret A, Trani M, Lortie R., Enzyme Microb Technol, 22, 212, (1998). Dutta S., Ray L., Appl. Biochem. Biotechnol., 159, , (2009). Elibol M., Ozer D., Process Biochem., 36, 325, (2001). Ertugrul S., Donmez G., Takac S., J. Haz. Meter., 149, , (2007). Falch E.A., Biotechnol. Adv., 9, 643, (1991). Fischer L., Bromann R., Kengen S., de Vos W., Wagner F., Bio/Technology, 14, 88, (1996). Fojan P., Jonson P.H., Petersen M.T.N., Petersen S.B., Biochimie, 82, , (2000). Frost G.M., Moss D.A., Production of enzymes by fermentation. In: Rehm HJ, Reed G, editors. Biotechnology, vol. 7a. Weinheim: Verlag Chemie, p , (1987). Fucinos P., Dominguez A., Sanroman M.A., Longo M.A., Rua M.L., Pastrana L., Biotechnology Progress, 21, , (2005). Fucinos P., Rua M.L., Longo M.A., Sanroman M.A., Pastrana L., Process Biochemistry, 48, 1383, (2008). Fukuda S., Hayashi S., Ochiai H., Iiizumi T., Nakamura K., Improvers for deinking of wastepaper. Japanese Patent 2, 229,290 (1990). Gao Y., Breuil C., World J Microbiol Biotechnol, 11, , (1995). Gerritse G., Hommes R.W., Quax W.J., J Appl Environ Microbiol, 64, , (1998). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

134 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 99 Ghanem E.H., Al-Sayeed HA, Saleh KM, World J Microbiol Biotechnol, 16, 459, (2000). Ghosh P.K., Saxena R.K., Gupta R., Yadav R.P., Davidson W.S. Sci Prog., 79, 119, (1996). Gilbert E.J., Cornish A., Jones C.W., J. Gen. Microbiol., 137, 2223, (1991b). Gilbert E.J., Drozd J.W., Jones C.W., J Gen Microbiol, 137, 2215, (1991a). Godfrey T., West S.I.: Introduction to industrial enzymology. In Industrial Enzymology, edn 2. Edited by Godfrey T., West S. London: Macmillan Press; 1-8, (1996). Gordillo M.A., Obradors N., Montesinos J.L., Valero F., Lafuente J., Sola C., Appl Microbiol Biotechnol, 43, 38 41, (1995). Grochulski P., Li Y., Schrag J. D., Bouthillier F., Smith P., Harrison D., Rubin B., Cygler M., J. Biol. Chem., 268, 12843, (1993). Gupta R., Gupta N., Rathi P., Applied Microbiology and Biotechnology, 64, 763, (2004). Gupta R., Rathi P., Bradoo S., Crit Rev Food Sci Nutr, 43, 635, (2003). Haki G.D., Rakshit S.K., Bioresour Technol, 89, 17, (2003). Hamsaveni D. R., Prapulla S. G., Divakar S., Process Biochem, 36, 1103, (2001). Handelsman T., Shoham Y., J Gen Appl Microbiol, 40, 435, (1994). Hasan F., Shah A.A., Hameed A, Enzyme Microb. Technol., 39, , (2006). Hasan F., Shah A.A., Javed S., Hameed A., African Journal of Biotechnology, 9, , (2010). Hoq M.M., J Am Oil Chem Soc, 62, 1016, (1985). Houde A., Kademi A., Leblanc D., Applied Biochemistry and Biotechnology, 118, 155, (2004). Hough D. W. and Danson M. J., Extremozymes, Current Opinion in Chemical Biology, 3, 39, (1999). Huang A.H.C. Studies on specificity of lipases. In: Borgstrom B, BrockmannHL, editors. Lipases. Amsterdam: Elsevier, p , (1984). Illanes A., Stability of biocatalysts. EJB Electron J Biotechnol, 2, (1999). Imamura S., Kitaura S., J. Biochem., 127, 419, (2000). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

135 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 100 Ito S., Kobayashi T., Ara K., Ozaki K., Kawai S., Hatada Y., Extremophiles, 2, 185, (1998). Ito T, Kikuta H, Nagamori E, Honda H, Ogino H, Ishikawa H, Kobayashi T., J Biosci Bioeng, 91(3), 245, (2001). Izumi T., Nakamura K., Fukase T., Agric Biol Chem, 54, , (1990). Jaeger K. E., Reetz T. M., Trends Biotechnol, 16, 396, (1998). Jaeger K.E., Dijkstra B.W., Reetz M.T., Annu Rev Microbiol, 53, 315, (1999). Jaeger K.E., Eggert T., Curr Opin Biotechnol, 13(4), 390, (2002). Jaeger K.E., Ransac S., Dijkstra B.W., Colson C., van Heuvel M., Misset O., FEMS Microbiology Reviews, 15, 29, (1994). Jaeger K.E., Ransac S., Dijkstra B.W., Colson C., Vanheuvel M., Misset O., FEMS Microbiol. Rev., 15, 29-63, (1994). Jaeger K.E., Reetz M.T., Microbial lipases form versatile tools for biotechnology. Trends Biotechnol, 16, 396,(1998). Janssen P.H., Monk C.R., Morgan H.W., FEMS Microbiology Letters, 120, , (1994). Kademi A., Leblanc D., Houde A., in Concise Encyclopedia of Bioresource Technology, Pandey, A., ed., Haworth Press, Binghamton, NY, pp , (2004). Kang H., Kim J., Kim M., Park S. Oh T., Hur C., FEBS Lett., 580, , (2009). Kanwar L., Gogoi B.K., Goswami P., Bioresour Technol., 84, 207, (2002). Kazlauskas RJ, Bornscheuer UT. Biotransformations with lipases. In: Rehm HJ, Pihler G, Stadler A, Kelly PJW, editors. Biotechnology. vol. 8. New York: VCH, pp (1998). Kennedy B.W., Cereal. Chem., 46, 70 73, (1969). Khyami-Horani H., World J Microbiol Biotechnol., 12, 399, (1996). Kim H.K., Park S.Y., Lee J.K., Oh T.K., Biosci Biotechnol Biochem, 62, 66, (1998). Kiran K. R., Manohar B., Divakar S., Enzyme Microb Technol, 29, 122, (2001). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

136 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 101 Kirk O., Borchert T. V., Fuglsang C. C., Current Opinion in Biotechnology, 13, , (2002). Kiyota H., Higashi E., Koike T., Oritani T., Tetrahedron: Asymmetry, 12, 1035, (2001). Klibanov A. M., Trends Biotechnol, 15, 97, (1997). Kok R.G., Thor J.J.V., Roodzant I.M.N., Brouwer M.B.W., Egmond M.R., Nudel C.B., Vosman B., Hellingwer K.J., Mol Microbiol, 15, , (1995). Krishna S. H., Karanth N. G., Biochim Biophys Acta, 1547, 262, (2001). Kristjansson J. K., TIBTECH, 7, 349, (1989). Lagarde D., Nguyen H. K., Ravot G., Reymond J. L., Hills G., Veit T., Lefevre F., Org. Process Res. Develop., 6 (4), , (2002). Lanser A.C., Manthey L.K., Hou C.T., Curr. Microbiol. 44, 336, (2002). Lasa I., Berenguer J., Microbiologia, 9, 77, (1993). Lee D., Kok Y., Kim K., Kim B., Choi H., Kim D., Suhartono M.T., Pyun Y., FEMS Microbiol Lett, 179, , (1999). Lee S.H., Park D.H., J. Microbiol. Biotechnol., 18, , (2008). Li C.Y., Cheng C.Y., Chen T.L., Biochem. Eng. J., 19, 25-31, (2004). Lin S.F., Chiou C.M., Tsai Y.C., Biotechnol Lett, 17, , (1995). Lin S.F., Chiou C.M., Yeh C., Tsai Y.C., Appl Environ Microbiol, 62, , (1996). Linko Y.Y., Lamsa M., Wu X., Uosukainen E., Seppala J., Linko P., J. Biotechnol., 66(1), 41, (1998). Long Z.D., Xu J.H., Zhao L.L., Pan J., Yang S., Hua L., J. Mol. Catal. B. Enzym., 27, , (2007). Lotrakul P., Dharmsthiti S., Word J. Microbiol Biotechnol., 13, 163, (1997). Lotti M., Monticelli S., Montesinos J.L., Brocca S., Valero F., Lafuente J., Chem Phys Lipids, 93, 143 8, (1998). Macedo G.A., Lozano M.M.S., Pastore G.M., Enzymatic synthesis of short chain citronellyl esters by a new lipase from Rhizopus sp., J Biotechnol, 6, (2003). Madan B., Mishra P., Appl. Microbiol., Biotechnol., 85, , (2010). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

137 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 102 Mahler G.F., Kok R.G., Cordenons A., Hellingwerf K.J., Nudel B.C., J Ind Microbiol Biotechnol, 24, 25, (2000). Malcata F. X., Nato ASI Ser., Ser. E: Engineering of/with Lipases (Vol. 317), Kluwer, ed. (1996). Martinelle M., Holmquist M., Hult K., Biochim Biophys Acta, 1258, 272, (1995). Martinez C., de Geuss P., Lauwereys M., Matthyssens G., Cambilleau C., Nature, 356, 615, (1992). Masse L, Kennedy KJ, Chou SP., J Chem Technol Biotechnol,76, 629, (2001). McCoy M., Chem Eng News, 19, 23-25, (2000). McNeill G.P., Shimizu S., Yamane T., J Am Oil Chem Soc, 68, 1, (1991). Mnisi S.M., Louw M.E., Theron J., Curr. Microbiol., 50, , (2005). Mozhaev V., Trends Biotechnol, 11, 88, (1993). Nakajima M., Snape J., Khare S.K., In: Gupta MN, editor. Method in non-aqueous enzymology. Basel: Birkhauser Verlag, p , (2000). Noble M. E. M., Cleasby A., Johnson L. N., Frenken L. G. J., Egmond M. R., FEBS Lett., 331, 123, (1993). Oh B. C., Kim H. K., Lee J. K., Kang S. C., Oh T. K., FEMS Microbiol Lett., 179, 385, (1999). Ohnishi K., Yoshida Y., Sekiguchi J., J Ferment Bioeng, 77, 490 5, (1994). Okeke C.N., Okolo B.N., Biotechnol Lett, 12, , (1990). Ollis D. L., Cheah E., Cygler M., Dijkstra B., Frolow F., Franken S., Harel M., Remington S. J., Silman I., Protein Eng., 5, 197, (1992). Oshima T., Imahori K., International Journal of Systematic Bacteriology, 24, , (1974). Pabai F., Kermasha S., Morin A., Can J Microbiol., 42, 446, (1996). Pantazaki A. A., Pritsa A. A., Kyriakidis D. A., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58, 1-12 (2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

138 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 103 Papaparaskevas D., Christakopoulos P., Kekos D., Macris B.J., Biotechnol Lett, 14, , (1992). Pencreac h G., Baratti J. C., Enzyme Microb Technol, 18, 417, (1996). Pimentel M.C., Krieger N., Coelho L.C., Fontana J.O., Melo E.H., Ledingham W.M., Lima Filho J.L., Appl Biochem Biotechnol, 49, 59 74, (1994). Posorske L.H., J Am Oil Chem Soc, 61,1758, (1984). Quyen D.T., Schmidt-Dannert C., Schmid R.D., Protein Expr. Purif., 28, , (2003). Rajmohan S., Dodd C.E., Waites W.M., J Appl Microbiol, 93, 205 (2002). Ramchuran S.O., Vargas V.A., Hatti-Kaul R., Karlsson E.N., Appl. Biochem. Biotechnol., 159, , (2006). Rao P, Divakar S., Process Biochem 36, 1125, (2001). Rashid N., Shimada Y., Ezaki S., Atomi H., Imanaka T., Appl Environ Microbiol, 67, 4064, (2001). Rathi P., Saxena R.K., Gupta R., Process Biochem, 37, 187, (2001). Riaz M., Shah A.A., Hameed A., Hasan F., Ann. Microbiol., 60, (2010). Rubin B, Dennis EA, editors. Lipases: Part A. Biotechnology Methods in enzymology. vol New York: Academic Press, pp , (1997 a). Rubin B, Dennis EA, editors. Lipases: Part B. Enzyme characterization and utilization Methods in enzymology. vol New York: Academic Press, pp (1997 b). Salleh A.B., Musani R., Razak C.N.A., Can J Microbiol, 39, , (1993). Sangeetha R., Arulpandi I., Geetha A., Research Journal of Microbiology, 6, 1-24, (2011). Sangeetha R., Geetha A., Arulpandi I., Brazilian J. Microbiol., 41, , (2010a). Sangeetha R., Geetha A., Arulpandi I., Z. Naturforsch, 65, 61-65, (2010b). Saxena R.K., Sheoran A., Giri B., Davidson W.S., J Microbiol Meth, 52, 1, (2003). Schmid R. D., Verger R., Angew. Chem. Int. Ed., 37, 1608, (1998). Schmidt-Dannert C., Luisa Rua M., Schmid R.D., Methods Enzymol, 284, 194, (1997). Schrag J. D., Cygler M., J. Mol. Biol., 230, 575, (1993). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

139 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 104 Schrag J. D., Li Y., Cygler M., Lang D., Burgdorf T., Hecht H. J., Schmid R. D., Strickland L. C., Larson S. B., Day J., Mc Pherson A., Structure, 5, 187, (1997). Seitz E.W., J Am Oil Chem Soc, 51, 12, (1974). Sellek G. A., Chaudhuri J. B., Enzyme Microb. Technol., 25, , (1999). Sharma R., Christi Y., Banerjee U. C., Biotechnology Advances, 19, 627, (2001). Sharma R., Soni S.K., Vohra R.M., Jolly R.S., Gupta L.K., Gupta J.K., Ind J Microbiol, 42, 49, (2002). Sharon C., Furugoh S., Yamakido T., Ogawa H., Kato Y., J Ind Microbiol Biotechnol, 20, 304 7, (1998). Sidhu P., Sharma R., Soni S.K., Gupta J.K., Folia Microbiol, 43, 51 4, (1998a). Sidhu P., Sharma R., Soni S.K., Gupta J.K., Indian J Microbiol, 38, 9 12 (1998b). Sierra G., Anton. van Leeuw, 23, 15-22, (1957). Sigurgisladottir S., Konraosdottir M., Jonsson A., Kristjansson J.K., Matthiasson E., Biotechnol Lett, 15, , (1993) Sih C.J., Wu S.H., Resolution of enantiomers via biocatalysts. Topics Stereochem, 19, 63, (1989). Simons J.W., van Kampen M.D., Riel S., Gotz F., Egmond M.R., Verhey H.M., Eur J Biochem, 253, 675, (1998). Snellman E.A., Sullivan E.R., Colwell R.R., FEBS J., 269, 5771, (2002). Stöcklein W., Sztajer H., Menge U., Schmid R.D., Biochim Biophys Acta, 1168, 181 9, (1993). Sugihara A., Tani T., Tominaga Y., J Biochem, 109, 211, (1991). Sugihara A., Ueshima M., Shimada Y., Tsunasawa S., Tominaga Y., J Biochem (Tokyo), 112, 598, (1992). Sztajer H., Maliszewska I., Biotechnol Lett, 11, 895 8, (1989). Takamoto T, Shirasaka H, Uyama H, Kobayashi S., Chem Lett, 6, 492, (2001). Talon R., Montel M.C., Berdague J.L., Enzyme Microb. Technol., 19, , (1996). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

140 Παραγωγή ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς 105 Tanaka T., Ono E., Takinami K., Method of producing improved glyceride by lipase, United States Patent 4,275,011, (1981). Therisod M, Klibanov AM., J Am Chem Soc, 109, 3977, (1987). Trechel H., De Oliveira D., Mazutti M. A., Di Luccio M., Oliveira J. V., Food Bioprocess Technol., 3, 182, (2010) Undurraga D, Markovits A, Erazo S., Process Biochem, 36, 933, (2001). Uppenberg J., Patkar M. T., Hansen S., Jones A., Structure, 2, 293, (1994). Van Dyke M.I., Lee H., Trevors J.T., Biotechnol Adv, 9, 241, (1991). Vaysse L., Dubreucq E., Pirat J. L., Galzy P., J. Biotechnol., 53, 41, (1997). Venkateshwarlu N., Reddy S.M., Indian J Microbiol, 33, , (1993). Verger R., and de Haas G. H., Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 5, 77, (1976). Verger R., Mieras M. C. E., de Haas G. H., J. Biol. Chem., 248, 4023, (1973). Vulfson EN. Industrial applications of lipases. In: Woolley P, Peterson SB, Lipases their structure, biochemistry and applications. Cambridge: Cambridge Univ. Press, pp , (1994). Wang X., Yu X., Xu Y., Enzyme Microb. Technol., 45, , (2009). Wang Y., Srivastava K.C., Shen G.J., Wang H.Y., J Ferment Bioeng, 79, (1995). Weber N, Klein E, Mukerjee KD., Appl Microbiol Biotechnol, 51, 401, (1999). Winkler F. K., D Arcy A., Hunziker W., Nature, 343, 771, (1990). Yang J., Zhang B., Yan Y., Appl. Biochem. Biotechnol., 159, , (2009). Yeoh HH, Wong FM, Lin G., Mycologia, 78, 298, (1986). Zeikus J. G., Vieille C., Savchenko A., Extremophiles, 2, , (1998). Zhang LQ, Zhang YD, Xu L, Li XL, Yang XC, Xu GL, Wu XX, Gao HY, Du WB, Zhang XT, Zhang XZ., Enzyme Microb Technol, 29, 129, (2001). Zheng S., Effect of Pore Curvature and Surface Chemistry of Model Silica Hosts on Biocatalytic Activity of Immobilized Lipase PS, Master of Science in Department of Chemical Engineering, University of Cincinnati, China, (2005). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

141 Καθαρισμός ενζύμων 106 Κεφάλαιο 3 Καθαρισμός Ενζύμων 3.1 Μέθοδοι ανάκτησης ενζύμων Κάθετη επεξεργασία (Downstream processing) Με τον όρο κάθετη επεξεργασία εννοούμε τα διάφορα στάδια που απαιτούνται για να ανακτηθούν τα χρήσιμα προϊόντα από οποιοδήποτε είδος βιομηχανικής επεξεργασίας. Στη βιοτεχνολογία η κάθετη επεξεργασία έχει μεγάλη σημασία, διότι η τελική μορφή των προϊόντων είναι πολύ διαφορετική από αυτή με την οποία απαντώνται στο βιοαντιδραστήρα. Παράδειγμα, μια ζύμωση δίνει ένα μείγμα από στερεά (μάζα κυττάρων, συστατικά του υγρού καλλιέργειας κλπ.) και το υδατικό διάλυμα. Τα επιθυμητά προϊόντα μπορεί να βρίσκονται εντός των κυττάρων, ως ένα συστατικό του πολύπλοκου μίγματος, ή στην αραιή υδατική φάση του υγρού καλλιέργειας ή κατανεμημένο και στις δύο φάσεις. Σε οποιαδήποτε περίπτωση, η ανάκτηση ή συγκέντρωση και ο καθαρισμός απαιτούν προσεκτικές διεργασίες που πρέπει να είναι φτηνές και γρήγορες. Πολλές καθιερωμένες διεργασίες που θεωρούνται αποτελεσματικές στο εργαστήριο, μπορεί να είναι ανεφάρμοστες ή μη οικονομικές σε μεγάλη κλίμακα. Επίσης, τα βιοπροϊόντα πολλές φορές είναι ευαίσθητα και μπορούν να παραμένουν ενεργά μόνο κάτω από ορισμένες συνθήκες ph, θερμοκρασίας, ιονικής ισχύος κλπ. Επίσης δεν υπάρχει μεθοδολογία καθορισμένη ή ιδανική ή γενική η οποία μπορεί να προταθεί. Θα πρέπει για κάθε μια περίπτωση να βρεθεί η περισσότερο εφαρμόσιμη μεθοδολογία και η πλέον πρακτική ώστε να λυθεί το πρόβλημα γρήγορα και με το χαμηλότερο δυνατό κόστος. (Κυριακίδης, 2002) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

142 Καθαρισμός ενζύμων 107 Στη συνέχεια θα γίνει αναφορά στην κάθετη επεξεργασία που χρησιμοποιείται σήμερα για τον καθαρισμό των ενζύμων σε βιομηχανική κλίμακα. Οι μικροοργανισμοί παράγουν πρωτεΐνες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης τους με σκοπό να μπορέσουν να μεταβολίσουν τα θρεπτικά συστατικά που χρειάζονται για να αναπτυχθούν. Οι πρωτεΐνες αυτές βρίσκονται είτε μέσα στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου (ενδοκυττάριες πρωτεΐνες), είτε ο μικροοργανισμός τις έχει εκρύσει στο μέσο ανάπτυξης (εξωκυττάριες πρωτεΐνες). Η μέθοδος καθαρισμού των εξωκυττάριων πρωτεϊνών είναι πιο εύκολη σε σχέση με αυτή των ενδοκυττάριων καθώς δεν απαιτείται η λύση των κυττάρων. Σχήμα 3.1 Στάδια απομόνωσης και καθαρισμού ενδοκυττάριων ενζύμων Λύση των κυττάρων Η πλειοψηφία των βιομηχανικών ενζύμων είναι εξωκυττάριες πρωτεΐνες που προέρχονται από τον Aspergillus ή Bacillus και περιλαμβάνει α-αμυλάσες, β-γλυκανάσες, κυτταρινάσες, δεξτρανάσες, πρωτεάσες, γλυκοαμυλάσες κλπ. Για τα ένζυμα αυτά απαιτείται να γίνει ένας μερικός καθαρισμός και η κανονική κλίμακα καθαρισμού να ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

143 Καθαρισμός ενζύμων 108 αποδίδει τόνους πρωτεϊνικών προϊόντων. Πολλά άλλα ένζυμα απαιτούνται για μηβιομηχανική χρήση. Τέτοια είναι τα ενδοκυττάρια ένζυμα που παράγονται σε μικρότερα ποσά, για παράδειγμα η ασπαραγινάση, καταλάση, οξειδάση της χοληστερόλης, β- γαλακτοσιδάση, οξειδάση της γλυκόζης και η δεϋδρογονάση της γλυκόζης 6 P. Τα ένζυμα αυτά παράγονται σε ποσότητα κιλών από εκατοντάδες ή λίγες χιλιάδες λίτρων καλλιέργειας. Εκτός από τη διαφορετική κλίμακα καθαρισμού, η μεγαλύτερη διαφορά ανάμεσα στην απομόνωση ενός ενδοκυττάριου και ενός εξωκυττάριου ενζύμου είναι ότι απαιτείται η λύση των κυττάρων. Από τη στιγμή που θα γίνει η λύση των κυττάρων και απελευθερωθεί η ενδοκυττάρια πρωτεΐνη, μπορεί να ακολουθηθεί η μεθοδολογία καθαρισμού. Το Σχήμα 3.1 δείχνει τα κυριότερα βήματα που περιλαμβάνονται στην απομόνωση και καθαρισμό των ενδοκυττάριων ενζύμων (Κυριακίδης, 2002). Χημικοί τρόποι Αλκαλικό περιβάλλον: Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε με εξαιρετική επιτυχία σε μικρή ή μεγάλη κλίμακα εκχύλισης βακτηριδίων. Η L ασπαραγινάση απομονώθηκε εκθέτοντας τον μικροοργανισμό Erwinia σε αλκαλικό περιβάλλον ph 11 και 12.5 για 20 λεπτά. Η επιτυχία της μεθόδου αυτής εξαρτάται από τη σταθερότητα του ενζύμου σε υψηλά ph κατά την διάρκεια του καθαρισμού. Λυσοζύμη: Η λυσοζύμη είναι ένα ένζυμο που παράγεται βιομηχανικά από το λευκό του αυγού κότας και καταλύει την υδρόλυση των β(1 4) γλυκοσιδικών δεσμών των βακτηριακών κυτταρικών τοιχωμάτων. Στα Gram θετικά βακτήρια, τα οποία παρουσιάζουν κυτταρικά τοιχώματα, παρόλο που είναι τα περισσότερο ευαίσθητα στη λυσοζύμη βακτήρια, το τελικό σπάσιμο του κυτταρικού περιβλήματος γίνεται με ωσμωτική πίεση. Στα Gram αρνητικά βακτήρια το σπάσιμο του κυτταρικού τοιχώματος σπάνια επιτυγχάνεται μόνο με λυσοζύμη, συνήθως χρησιμοποιείται και EDTA που σχηματίζει χημικά σύμπλοκα με τα μεταλλικά ιόντα με αποτέλεσμα τη λύση του κυττάρου. Η τεχνική αυτή σπανίως εφαρμόζεται για μεγάλης κλίμακας εκχύλιση βακτηριακών ενζύμων, λόγω του υψηλού κόστους της λυσοζύμης, αν και πρακτικά είναι πολύ χαμηλό συγκρινόμενο με το κόστος του ενζύμου που καθαρίζεται. Απορρυπαντικά: Τα απορρυπαντικά διακρίνονται σε: Ανιονικά, όπως το θειικό δωδεκύλιο, χολικό νάτριο, Κατιονικά, όπως το βρωμιούχο σετυλδιεθυλαμμώνιο και ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

144 Καθαρισμός ενζύμων 109 Μη ιονικά, όπως το Triton X100. Και οι τρείς κατηγορίες έχουν χρησιμοποιηθεί για την λύση των κυττάρων. Τα ιονικά απορρυπαντικά είναι περισσότερο ενεργά από τα μη ιονικά απορρυπαντικά και διαχωρίζουν τις λιτοπρωτεΐνες και τελικά αποδιατάσσουν τις δομές των πρωτεϊνών. Το Triton X100 έχει χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση σε μεγάλη κλίμακα της οξειδάσεις της χοληστερόλης (Κυριακίδης, 2002). Φυσικές μέθοδοι λύσης κυττάρων Υπέρηχοι: Ο όρος υπέρηχοι χρησιμοποιείται για να δηλώσει ήχους με συχνότητες υψηλότερες των 20 khz. Αν και οι υπέρηχοι χρησιμοποιούνται με επιτυχία για το σπάσιμο μεγάλων βακτηρίων ή κυττάρων μικρής κλίμακας, η εφαρμογή τους για σπάσιμο μεγάλων ποσοτήτων βακτηρίων περιορίζεται, γιατί είναι δύσκολο να μεταφερθεί ικανοποιητική δύναμη σε μεγάλους όγκους και να απομακρυνθεί η θερμότητα που αναπτύσσεται. Ωσμωτικό σοκ: Ωσμωτικό σοκ έχει χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση ενζύμων και πρωτεϊνών εγκλωβισμένων σε περιπλασμικές μεμβράνες. Η μέθοδος περιλαμβάνει πλύσιμο των βακτηρίων σε ρυθμιστικό διάλυμα για την απομάκρυνση του υγρού καλλιέργειας και επανααιώρηση σε π.χ. 20% σουκρόζη. Παραμένοντας τα κύτταρα στο διάλυμα αυτό χάνουν νερό από το εσωτερικό τους. Στη συνέχεια απομακρύνονται από το υγρό αυτό και αμέσως αιωρούνται στο νερό στους 4 ο C. Με το ωσμωτικό σοκ μόνο το 4 8% από το σύνολο των βακτηριακών πρωτεϊνών απελευθερώνεται. Εάν το ένζυμο που επιθυμούμε να καθαρίσουμε βρίσκεται στην περιπλασμική μεμβράνη, το ωσμωτικό σοκ δίνει φορές καλύτερο καθαρισμό συγκριτικά με άλλες τεχνικές. Πάγωμα ξεπάγωμα: Η τεχνική αυτή είναι παρόμοια με αυτή του ωσμωτικού σοκ. Η δυνατότητα για απελευθέρωση είναι περιορισμένη και λιγότερο από το 10% από τις συνολικές διαλυτές πρωτεΐνες απελευθερώνονται. Αν και η τεχνική αυτή έχει το πλεονέκτημα ότι είναι απλή και γίνεται σε χαμηλή θερμοκρασία, δεν χρησιμοποιείται ευρέως γιατί απαιτεί πολύ χρόνο. Λυοτρίβηση: Αρχικά η τεχνική χρησιμοποιήθηκε για σπάσιμο κυττάρων σε γουδί παρουσία σφαιριδίων υάλου ή αλουμίνας. Σήμερα γίνονται προσπάθειες να χρησιμοποιηθούν μεγάλες συσκευές (μύλοι) με ειδικά λιπαντικά σωματίδια. Λόγω όμως της μακράς παραμονής του εκχυλίσματος στη συσκευή και των υψηλών θερμοκρασιών που αναπτύσσονται κατά τη διεργασία παρόλο που υπάρχουν ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

145 Καθαρισμός ενζύμων 110 εξωτερικοί μανδύες για την συνεχή ψύξη της συσκευής, η λυοτρίβηση προτιμάται μόνο σε περιπτώσεις νηματοειδών κυττάρων ή μικροοργανισμών πολύ ανθεκτικών σε θερμοκρασίες. Υγρή ρήξη των κυττάρων: Αυτή είναι η μηχανιστική μέθοδος που χρησιμοποιείται για μεγάλης κλίμακας θραύσης κυττάρων. Η αρχή της τεχνικής αυτής στηρίζεται στο ότι αιώρημα κυττάρων διαβιβάζεται με υψηλή πίεση μέσω ενός μικρού ανοίγματος. Ύστερα από τη λύση των κυττάρων ακολουθεί η απομάκρυνση των νουκλεϊκών οξέων, τα οποία απομακρύνονται με κατακρήμνιση με διάφορες θετικά φορτισμένες ενώσεις όπως θειική στρεπτομυκίνη, θειική πρωταμίνη, πολυαιθυλεναμίνη, πολυλυσίνη ή MgCl 2. Τελευταία η μέθοδος που χρησιμοποιείται περισσότερο είναι η κατεργασία με νουκλεάσες. Προσθήκη παγκρεατικής δεοξυριβονουκλεάσης προκαλεί σημαντικά ελαττώματα του ιξώδους του εκχυλίσματος. Όλες οι δυσκολίες για το σπάσιμο των κυττάρων με τους τρόπους που προαναφέρθηκαν θα μπορούσαν να ξεπεραστούν αν το κύτταρο απέβαλε εκλεκτικά στο περιβάλλον του την επιθυμητή πρωτεΐνη. Αυτό θεωρητικά μπορεί να γίνει εάν στην ακολουθία του DNA που κωδικοποιεί την επιθυμητή πρωτεΐνη προστεθεί μια ακολουθία υπεύθυνη για την έκφραση κάποιου ολιγοπεπτιδίου, που έχει τη δυνατότητα να διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη και έτσι να μεταφέρει την επιθυμητή πρωτεΐνη στο περιβάλλον (Κυριακίδης, 2002). 3.2 Μέθοδοι καθαρισμού ενζύμων Στις περισσότερες εμπορικές εφαρμογές των ενζύμων, δεν χρειάζεται να είναι πάντα το ένζυμο σε απόλυτα καθαρή μορφή. Ωστόσο, ανάλογα με την τελική εφαρμογή τους στη βιομηχανία απαιτείται και ο ανάλογος βαθμός καθαριότητας του ενζύμου, όπως για την παραγωγή χημικών, φαρμάκων και καλλυντικών. Εκτός από αυτό, ο καθαρισμός των ενζύμων είναι απαραίτητος για την κατανόηση της τρισδιάστατης δομής τους και την σχέση που έχει η δομή με την λειτουργία των πρωτεϊνών (Taipa et al., 1992; Saxena et al., 2003). Για τις βιομηχανικές εφαρμογές, η μέθοδος καθαρισμού που χρησιμοποιείται θα πρέπει να είναι φτηνή, γρήγορη, μεγάλης απόδοσης και να υπάγεται σε λειτουργία μεγάλης κλίμακας. Θα πρέπει να έχουν την δυνατότητα συνεχούς ανάκτησης του προϊόντος, με ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

146 Καθαρισμός ενζύμων 111 σχετικά υψηλή ικανότητα δέσμευσης και εκλεκτικότητα (capacity and selectivity) του επιθυμητού προϊόντος. (Gupta et al., 2004). Τα περισσότερα ένζυμα είναι διαλυτά και ενδοκυττάρια. Αυτά, παράγονται μαζί με πολλά άλλα ένζυμα και πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα, άλατα, χαμηλού μοριακού βάρους μεταβολίτες και συστατικά του υγρού καλλιέργειας. Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για να διαχωριστούν τα διαλυτά συστατικά είναι: Φυγοκέντριση Κατακρήμνιση Χρωματογραφία Διήθηση με μεμβράνες Φυγοκέντριση Για μικρής κλίμακας καθαρισμού ενζύμων η φυγοκέντριση αποτελεί την πιο αξιόλογη μέθοδο διαχωρισμού γιατί υπάρχουν διαφορετικοί τύποι φυγοκέντρων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν. Με την φυγοκέντριση, αναπτύσσονται τεράστιες δυνάμεις, οπότε τα διάφορα στερεά κινούνται ανάλογα με το μέγεθός τους, τη διαφορά πυκνότητας και το ιξώδες του εκχυλίσματος προς την κατεύθυνση εφαρμογής της δύναμης. (Κυριακίδης, 2002) Κατακρήμνιση Με άλατα: Γίνεται με την προσθήκη ουδέτερων αλάτων στο πρωτεϊνικό διάλυμα. Τα άλατα αφαιρούν πολλά μόρια νερού από παρακείμενες περιοχές των πρωτεϊνών. Έτσι οι υδρόφοβες περιοχές των πρωτεϊνών που ως τώρα δεν ερχόταν σε επαφή, λόγω του μεγάλου όγκου του νερού που τις περιέβαλε, μπορούν τώρα να αλληλεπιδράσουν με αποτέλεσμα η πρωτεΐνη να μετουσιωθεί και να κατακρημνισθεί. Το περισσότερο κοινό αντιδραστήριο για την κατακρήμνιση των πρωτεϊνών είναι το θειικό αμμώνιο, γιατί έχει μεγάλη διαλυτότητα, δεν παρεμποδίζει τα περισσότερα ένζυμα, είναι φτηνό και σε ορισμένες περιπτώσεις σταθεροποιεί την δραστικότητα των ενζύμων. Καθαρισμοί ενζύμων σε μεγάλη κλίμακα σε υψηλότερες συγκεντρώσεις θειικού αμμωνίου γίνονται σε μερικές περιπτώσεις καθαρισμού πρωτεϊνών, παρά το γεγονός ότι δεν πρέπει να αυξηθεί πολύ ο όγκος του εκχυλίσματος (Κυριακίδης, 2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

147 Καθαρισμός ενζύμων 112 Με οργανικούς διαλύτες: Η προσθήκη οργανικών διαλυτών σε υδατικά διαλύματα ελαττώνει την διαλυτότητα των πρωτεϊνών λόγω της ελάττωσης της διηλεκτρικής σταθεράς του διαλύματος. Θερμοκρασίες υψηλότερες των 40 ο C μπορεί να προκαλέσουν μετουσίωση των πρωτεϊνών παρουσία των οργανικών διαλυτών και έτσι είναι απαραίτητο να γίνονται όλες οι διεργασίες σε θερμοκρασίες χαμηλότερων του μηδενός. Διαλύτες που χρησιμοποιούνται είναι κυρίως η αιθανόλη, η προπανόλη-2 και η ακετόνη. Για μεγάλης κλίμακας παρασκευής ενζύμων η μέθοδος δεν χρησιμοποιείται ευρέως διότι οι διαλύτες αυτοί είναι επικίνδυνοι λόγω της εύκολης ανάφλεξης και λόγω του κόστους τους. Η βακτηριοκτόνος ιδιότητα τους των περισσότερων οργανικών διαλυτών είναι από την άλλη μεριά ένα σημαντικό πλεονέκτημα και ειδικά για ορισμένες εφαρμογές τους στην φαρμακοβιομηχανία. Αλλαγή του ph: Στο ισοηλεκτρικό σημείο, όταν η πρωτεΐνη έχει μηδενικό φορτίο, η διαλυτότητα της πρωτεΐνης είναι η ελάχιστη και μπορεί να κατακρημνισθεί. Το κυριότερο πρόβλημα για την εφαρμογή της τεχνικής αυτής είναι το περιορισμένο εύρος ph στο οποίο η πρωτεΐνη παραμένει σταθερή και η πολύ καλή ανάδευση που απαιτείται. Εξάτμιση: Η εξάτμιση είναι μία πολύ απλή τεχνική για τα ένζυμα που δεν καταστρέφονται όταν αυξάνεται η συγκέντρωση των χαμηλού μοριακού βάρους ενώσεων και όταν ανεβαίνει η θερμοκρασία. Επίσης όταν γίνεται η εξάτμιση με πίεση, ο αφρισμός του πρωτεϊνικού διαλύματος πρέπει να αποφευχθεί γιατί έχει ως αποτέλεσμα την μετουσίωση των πρωτεϊνών. Λυοφίλιση: Λυοφίλιση είναι η τεχνική που σε χαμηλές θερμοκρασίες και πίεση γίνεται η απομάκρυνση του νερού ή άλλων διαλυτών ενώ οι πρωτεΐνες παραμένουν σαν σκόνη. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται ευρέως για πολλά βιομηχανικά ένζυμα, αλλά δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για όλες τις περιπτώσεις γιατί πολλά ένζυμα, με το πάγωμα, χάνουν πλήρως τη δραστικότητα τους. Άλλες τεχνικές: Η χρησιμοποίηση πολυμερών μεγάλου μοριακού βάρους (π.χ. πολυαιθυλενογλυκόλη) είναι μια από τις προσπάθειες που γίνονται με αρκετή επιτυχία. Τα πολυμερή αυτά έχουν το πλεονέκτημα ότι δεν αντιδρούν με την πρωτεΐνη και ότι οι πρωτεΐνες κατακρημνίζονται σε μικρές συγκεντρώσεις πολυμερών. Το μειονέκτημα είναι ότι στη συνέχεια δύσκολα ξεχωρίζουν από το μείγμα των πρωτεϊνών. (Κυριακίδης, 2002) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

148 Καθαρισμός ενζύμων Χρωματογραφία Οι χρωματογραφίες μοριακής διήθησης ιονικής ανταλλαγής, υδρόφοβη και αγχιστείας έχουν χρησιμοποιηθεί για καθαρισμό ενζύμων σε μεγάλη κλίμακα. Η τακτική στις μεθόδους αυτές, είναι πρώτα να προηγείται μια στήλη ιονικής ανταλλαγής που ελαττώνει τους όγκους και διώχνει πολλές από τις μη επιθυμητές πρωτεΐνες και στη συνέχεια να χρησιμοποιούνται οι στήλες μοριακής διήθησης ή αγχιστείας (Κυριακίδης, 2002). Ιονική ανταλλαγή: Η τεχνική αυτή είναι ίσως αυτή που χρησιμοποιείται περισσότερο. Παράδειγμα, για τον καθαρισμό της L-ασπαραγινάσης από Erwinia carotovora 6 φορές καθαρισμό και 100 φορές ελάττωση του όγκου επιτυγχάνεται με απλή απορρόφηση με τον ανταλλάκτη CM-κυτταρίνη. Μοριακή διήθηση: Η μοριακή διήθηση σπάνια εφαρμόζεται σε αρχικά στάδια καθαρισμού ενός ενζύμου. Βρίσκει όμως εφαρμογές γιατί με την κατάλληλη επιλογή των σφαιριδίων της πηκτής μπορούν να διαχωριστούν εύκολα πρωτεΐνες ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Παράδειγμα αποτελεί ο διαχωρισμός της ινσουλίνης από προϊνσουλίνη και ο καθαρισμός πρωτεϊνών του γάλακτος από λακτόζη και αλάτια. Υδρόφοβη χρωματογραφία: Περισσότερο χρησιμοποιούμενα υλικά για την υδρόφοβη χρωματογραφία είναι η οκτυλο-n-φαινυλοσεφαρόζη. Στα υλικά αυτά τα ένζυμα συνήθως συνδέονται με υψηλή ιονική ισχύ. Για το λόγο αυτό η υδρόφοβη χρωματογραφία συνήθως εφαρμόζεται όταν η ιονική ισχύς του εκχυλίσματος είναι υψηλή, όπως π.χ. όταν κατακρημνίζεται με αλάτια ή από στήλη ιονικής ανταλλαγής. Η τεχνική αυτή έχει εφαρμοστεί με επιτυχία στην περίπτωση καθαρισμού της β-γλυκοσιδάσης και της αρυλοακυλαμιδάσης. Χρωματογραφία αγχιστείας: Η περισσότερο σπουδαία τεχνική που αναπτύχτηκε την προηγούμενη δεκαετία είναι η χρωματογραφία αγχιστείας. Σήμερα υπάρχει στο εμπόριο μεγάλος αριθμός ligand όπως ATP, NAD που είναι προσδεδεμένα σε διάφορα σφαιρίδια. Για εφαρμογές μεγάλης κλίμακας, η χρωματογραφία αγχιστείας είναι παρόμοια με αυτή της ιοντικής ανταλλαγής, όπου το ειδικό ligand μπορεί να προσροφά ένα ένζυμο από ένα μεγάλο όγκο εκχυλίσματος. Το προσροφημένο ένζυμο στη συνέχεια μπορεί να αποκολληθεί με διάφορους τρόπους. Παραδείγματα εφαρμογής της χρωματογραφίας αγχιστείας αποτελεί ο καθαρισμός από το αίμα θρομβίνης, αντιθρομβίνης και παραγόντων πήξης του αίματος με στήλη ηπαρίνης-αγαρόζης. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

149 Καθαρισμός ενζύμων Διήθηση με μεμβράνες Από το 1960 και μετά οι μεμβράνες υπερδιήθησης έχουν αρχίσει να τελειοποιούνται με εξαιρετικό ρυθμό. Πρόκειται για τεχνική που διαχωρίζει πρωτεΐνες χωρίς αλλαγή φάσης και μικρή κατανάλωση ενέργειας. Οι μεμβράνες είναι διαφόρων τύπων (οξική κυτταρίνη, πολυακρυλαμίδιο, πολυσουλφίδια, PVC κλπ.) και με διαφορετική διάμετρο πόρων. Η ανθεκτικότητα των μεμβρανών φτάνει μέχρι τους 93 o C και σε περιοχές ph από 0.5 μέχρι 13. Το μόνο μειονέκτημα είναι η απόφραξη των πόρων. Για την ανάπτυξη και την εφαρμογή των τεχνικών διαχωρισμού, το κυριότερο εμπόδιο είναι οι οικονομικοί παράγοντες. Ιδιαίτερα, κάθε στάδιο καθαρισμού πρέπει να περιλαμβάνει τεχνική που να είναι δοκιμασμένη αλλά και φτηνή (Κυριακίδης, 2002). 3.3 Μέθοδοι καθαρισμού λιπασών Η κάθετη επεξεργασία είναι θεμελιώδης για κάθε διεργασία ζύμωσης και περιλαμβάνει την απομόνωση και μια ακολουθία καθαρισμού για την απόκτηση ενός καθαρού και ομογενούς προϊόντος (Nandini and Rastogi, 2009). Οι περισσότερες αναφορές για τον καθαρισμό της λιπάσης εστιάζονται στον καθαρισμό μικρών ποσοτήτων του ενζύμου για τον χαρακτηρισμό τους. Λίγες πληροφορίες έχουν δημοσιευτεί για μεγάλης κλίμακας διεργασίες για εμπορικούς καθαρισμούς της λιπάσης. Οι περισσότερες εμπορικές εφαρμογές των λιπασών δεν χρειάζονται υψηλής καθαρότητας ένζυμα, καθώς ο εκτεταμένος καθαρισμός είναι ακριβός και μειώνει την ολική ανάκτηση του ενζύμου (Chisti, 1998). Γενικά, οι εμπορικές λιπάσες είναι συνήθως εξωκυττάριες, κάτι που κάνει την διεργασία καθαρισμού πιο εύκολη. Το εξωκυττάριο εκχύλισμα της καλλιέργειας, διαχωρισμένο από τα κύτταρα, αρχικά υποβάλλεται σε προκαταρτικά στάδια καθαρισμού όπως είναι η υπερδιήθηση (Quyen et al., 2003), η ξήρανση με ψεκασμό (spray-drying) χρησιμοποιώντας σκόνη γάλατος ή αραβική κόμμη (Fickers et al., 2006), κλασμάτωση με θειικό αμμώνιο (Kim et al., 2002) και / ή καθίζηση χρησιμοποιώντας παγωμένους οργανικούς διαλύτες όπως αιθανόλη, αιθέρα και ακετόνη (Chakraborty and Paulraj, 2008). Στη συνέχεια το μερικώς καθαρισμένο ένζυμο, καθαρίζεται με συνδυασμό τεχνικών χρωματογραφίας. Με ένα μόνο στάδιο καθαρισμού με χρωματογραφία, συνήθως δεν είναι αρκετό για την απόκτηση ενός ενζύμου υψηλής καθαρότητας (Saxena et al., 2003). Οι πιο συνηθισμένες μεθόδους χρωματογραφίας που έχουν αναφερθεί για τον καθαρισμό της ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

150 Καθαρισμός ενζύμων 115 λιπάσης είναι η ιοντικής ανταλλαγής (Ion Exchange) (IEC), η χρωματογραφία μοριακής διήθησης (Gel filtration, (GFC)) και υδροφοβικής αλληλεπίδρασης χρωματογραφία (Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC). H IΕC είναι η χρωματογραφική μέθοδος που συνήθως χρησιμοποιείται, και οι ιοντικoί ανταλλάκτες που χρησιμοποιείται πιο συχνά είναι οι Q-σεφαρόζη (Q-Sepharose) (Nawani and Kaur, 2000), DEAE-σεφαρόζη (DEAE- Sepharose) (Kumar et al., 2005) και CM-κυτταρίνη (CM-cellulose) (Vujaklija et al., 2003). H επόμενη μέθοδος που είναι πιο διαδεδομένη είναι η GFC, στην οποία χρησιμοποιούνται υλικά χρωματογραφίας όπως τα Sephacryl (Sharma et al., 2002), και Sephadex (Lee et al., 2001). Στη χρωματογραφία HIC έχει καθιερωθεί για τον καθαρισμό της λιπάσης, η χρήση οκτυλ- ή φαίνυλ- προσροφητικών υλικών (Saxena et al., 2003). Οι Nawani και Kaur (2007) εφάρμοσαν IEC, GEC και HIC για τον καθαρισμό δυο ισοενζυμικών λιπασών από τον Bacillus sp. Η χρωματογραφία αγχιστείας επίσης έχει εφαρμοστεί από αρκετούς ερευνητές, χρησιμοποιώντας στήλη συμπλόκου Ni 2+ - νιτρυλοοξικού οξέος (Ni-NTA) αγαρόζης (Zhang et al., 2009b; Akbari et al., 2010). Οι κοινές διεργασίες για τον καθαρισμό της λιπάσης, μερικές φορές είναι πολύπλοκες, χρονοβόρες και καταλήγουν σε χαμηλές τελικές αποδώσεις. Για αυτό καινούριες τεχνικές καθαρισμού χρειάζεται να αναπτυχθούν για να αυξήσουν τις ολικές αποδόσεις του ενζύμου και να μειώσουν τα βήματα καθαρισμού της κάθετης επεξεργασίας. Καθώς οι λιπάσες διαφέρουν από άλλα ένζυμα σε ότι αφορά την υδροφοβική φύση τους, των φαινόμενων της επιφανειακής ενεργοποίησης (interfacial activation phenomenon) και τη δραστικότητα σε μη υδατικά διαλύματα, μερικές καινοτόμες τεχνικές καθαρισμού έχουν πρόσφατα εφαρμοστεί για τον καθαρισμό της λιπάσης. Αυτές περιλαμβάνουν το σύστημα αντίστροφου μικκυλίου (reversed micellar system), διεργασίες με μεμβράνες, ανοσοκαθαρισμός (immunopurification), στήλη χρωματογραφίας χρησιμοποιώντας πηκτή πολυαιθυλενικής γλυκόλης (PEG)/Sepharose ή πολυμερές πολύ-βινυλικής αλκοόλης ως σταθερές φάσεις και υδατικό σύστημα δυο φάσεων (Saxena et al., 2003; Gupta et al., 2004) Υδατικό σύστημα δύο φάσεων Τα υδατικά συστήματα δυο φάσεων που χρησιμοποιούνται στον βιοδιαχωρισμό, αποτελούνται από δυο ασύμβατα πολυμερή (π.χ. δεξτράνη και PEG) σε υδατικό διάλυμα ή σε υψηλή συγκέντρωση άλατος (π.χ. φωσφορικού). Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών με αυτή την τεχνική εξαρτάται από τις φυσικο-χημικές ιδιότητες της πρωτεΐνης, για παράδειγμα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

151 Καθαρισμός ενζύμων 116 πόσο υδροφοβική είναι, το μέγεθος της και το φορτίο της. Ο διαχωρισμός, επηρεάζεται αλλάζοντας το πολυμερές, το μοριακό βάρος του πολυμερούς ή το ph ή με την προσθήκη αλάτων ή απορρυπαντικών στο σύστημα (Gupta et al., 2004; Ooi et al., 2009). Τα πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου βασίζονται στη μείωση του όγκου, υψηλή ικανότητα και γρήγορων διαχωρισμών και είναι ήπια προς την πρωτεΐνη. Η τεχνική αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί από τα πρώτα στάδια καθαρισμού, σε διαλύματα που περιέχουν ολόκληρα τα κύτταρα ή και κυτταρικά υπολείμματα. Ωστόσο, το αρνητικό με την τεχνική αυτή είναι ότι, σε σύγκριση με άλλες μεθόδους, είναι δύσκολο να χρησιμοποιηθεί σε μεγάλες κλίμακες (Gupta et al., 2004; Ooi et al., 2009). Το υδατικό σύστημα δυο φάσεων είναι μια ενδιαφέρουσα τεχνική με ιδιότητες κατάλληλες για το διαχωρισμό και καθαρισμό μακρομορίων και σωματιδίων που είναι δύσκολο να διαχωριστούν με άλλες υπάρχουσες τεχνικές. Υπάρχουν αρκετές αναφορές για λιπάσες που έχουν καθαριστεί με αυτή τη μέθοδο. Για τις λιπάσες, η υδροφοβική φύση του ενζύμου ερευνάται σε συστήματα δυο υδατικών φάσεων, προσθέτοντας απορρυπαντικά ή επιφανειοδραστικές ουσίες κατά τη διάρκεια του καθαρισμού. Οι Queiroz et al. (1995) εφάρμοσαν ένα PEG/φωσφορικό κάλιο δυο φάσεων υδατικά συστήματα για τον καθαρισμό της C. viscosum λιπάσης και κατέληξε ότι ο διαχωρισμός του ενζύμου μπορούσε εύκολα να ελεγχθεί τροποποιώντας τις συνθήκες διαχωρισμού. Ο Bompensieri et al. (1996) μελέτησε τον καθαρισμό της λιπάσης από τον μικροοργανισμό Acinetobacter calcoaceticus χρησιμοποιώντας PEG, δεξτράνη, άλας ή μια επιφανειοδραστική ουσία με το υδατικό σύστημα δυο φάσεων. Δύο λιπάσες από το βακτήριο Bacillus stearothermophilus SB1, μια όξινη και μία ουδέτερη, καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας PEG και άλας, λόγο της υδροφοβικής αλληλεπίδρασης με την ομάδα αιθυλενίου του πολυμερούς (Bradoo et al., 1999) Συστήματα αντίστροφου μικκυλίου (Reversed micellar systems) H υδατική/υδατική εκχύλιση των βιομορίων χρησιμοποιώντας ένα αντίστροφο μικκύλιο είναι μια υποσχόμενη μέθοδος, για όταν οι παραδοσιακές τεχνικές καθαρισμού με οργανικούς διαλύτες περιορίζονται λόγω μετουσίωσης των πρωτεϊνών και διαλυτοποιήσής τους (Castro and Cabral, 1988). Τα αντίστροφα μικκύλια είναι σταγόνες νερού μέσα σε έναν οργανικό διαλύτη ο οποίος έχει σταθεροποιηθεί με μια μονοστρωματική επιφάνεια επιφανειοδραστικών μορίων και μπορεί να σχηματιστεί όταν έρχεται σε επαφή με μία υδατική φάση μέσα σε μια αμιγής οργανική φάση που περιέχει αυτές τις ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

152 Καθαρισμός ενζύμων 117 επιφανειοδραστικές ουσίες. Ο εσωτερικός πυρήνας περιλαμβάνει μια υδατική μιρκοφάση, η οποία είναι ικανή να διαλυτοποιήσει βιοπροϊόντα όπως οι πρωτεΐνες. Ο επιλεκτικός διαχωρισμός και καθαρισμός ενός λιπολυτικού παρασκευάσματος από το μικροοργανισμό C. viscosum (Vicente et al., 1990) επιτεύχθηκε με την ανιονική επιφανειοδραστική ουσία sodium di-2-ethylhexysulphosuccinate (AOT) με την μέθοδο των αντίστροφων μικκυλίων χρησιμοποιώντας το βενζόλιο ως οργανικό διαλύτη. Η μέθοδος περιλαμβάνει μια πολύ απλή διαδικασία η οποία αποτελείται από δυο βήματα. Το πρώτο βήμα βασίζεται την ικανότητα του αντίστροφου μικκυλίου να διαλυτοποιεί πρωτεΐνες από μια υδατική επιφάνεια στην υδατική επιφάνεια των συσσωμάτων της επιφανειοδραστικής ουσίας. Στο δεύτερο βήμα, οι διαλυτοποιημένες πρωτεΐνες εξάγονται πίσω σε μια νέα υδατική φάση αλλάζοντας την αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεΐνης και του συστήματος του αντίστροφου μικκυλίου. Η επιλεκτική διαλυτοποίηση ενός μίγματος πρωτεϊνών μπορεί να επιτευχθεί χειραγωγώντας τις παραμέτρους του συστήματος, αμφότεροι στο μικκύλιο (micellar) και στην υδατική επιφάνεια, με τις πιο σημαντικές παραμέτρους να είναι το ph και η ιοντική ισχύς της υδατικής επιφάνειας. Η τιμή του ph επηρεάζει τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πολικών ομάδων της επιφανειοδραστικής ουσίας και τη φορτισμένη πρωτεΐνη. Υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις μπορούν επίσης να δράσουν στην μεταφορά των πρωτεϊνών, ειδικά οι πρωτεΐνες, όπως οι λιπάσες, που φέρουν μια υδροφοβική περιοχή στην επιφάνεια τους. Αν και το αντίστροφο μικκύλιο φαίνεται να είναι μια υποσχόμενη τεχνική για τον καθαρισμό της λιπάσης, δεν έχει αξιοποιηθεί από τους ερευνητές, λόγω ανεπάρκεια πρωτοκόλλων εξαγωγής των πρωτεϊνών πίσω στην υδατική φάση (Skagerlind et al., 1992; Yamada et al., 1993) Άλλες τεχνικές Πρόσφατα, οι Pauwels και Gelder (2008) επινόησαν μια καινούρια στρατηγική καθαρισμού της λιπάσης στην οποία εκμεταλλεύτηκαν την αρχή του μηχανισμού έκκρισης της λιπάσης. Οι βακτηριακές λιπάσες, ειδικά αυτές που ανήκουν στην οικογένεια Ι, εκκρίνονται σε μια αποδιαταγμένη κατάσταση στο περίπλασμα του κυττάρου όπου διπλώνεται και παίρνει τη φυσική της μορφή με μία εσωτερικά δεμένη πρωτεΐνη που ονομάζεται φολντάσες των λιπασών (Lif). H πρωτεΐνη αυτή έλκεται από τις λιπάσες και εμφανίζει υψηλή εξειδίκευση (Rosenau et al., 2004; Pauwels and Gelder. 2008). O καθαρισμός της λιπάσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας καθηλωμένη Lif με ουρά ιστιδινών (His-tagged Lif). To καθαρισμένο σύμπλοκο λιπάση-lif ήταν ομοιογενές και δε ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

153 Καθαρισμός ενζύμων 118 βρέθηκαν λιποπολυσακχαρίτες, οι οποίοι συνήθως βρίσκονται ως πρόσμειξη σε παρασκευάσματα λιπασών που έχουν καθαριστεί με συμβατικές τεχνικές. Ο da Silva καθάρισε μια αλκαλική λιπάση από τον P. cepacia χρησιμοποιώντας Expanded Bed Absorption (EBA) σε Amberlite ρητίνη ιον-ανταλλαγής (ion-exchanger resin) (Padilha et al., 2009). Η ΕΒΑ είναι μια καινούρια τεχνική, η οποία μπορεί να καθαρίσει παρασκευάσματα πρωτογενών ενζύμων (crude enzyme preparation) χωρίς να χρειάζονται τα πρωταρχικά στάδια καθαρισμού. Οι Chartrain et al. (1993) καθάρισαν τη λιπάση από το μικροοργανισμό P. aeruginosa MB5001 χρησιμοποιώντας μια διαδικασία τριών σταδίων. Αρχικά το εξωκυττάριο εκχύλισμα συμπυκνώθηκε με υπερδιήθηση και στη συνέχεια ο καθαρισμός πραγματοποιήθηκε με ιοντικής ανταλλαγής στήλης χρωματογραφίας και διύλιση σε πηκτή. Το καθαρισμένο ένζυμο είχε μοριακό βάρος 29 kda σε SDS-PAGE και παρουσίασε μέγιστη δραστηριότητα στους 55 ο C με βέλτιστο ph 8. Μια εξωκυττάρια λιπάση από τον μικροοργανισμό Aci. Calcoaceticus BD 413 καθαρίστηκε μέχρι να ομογενοποιηθεί χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υδροφοβικής αλληλεπίδρασης υψηλών επιδόσεων (FPLC) (Kok et al., 1995). Tο ένζυμο είχε μοριακό βάρος 32 kda σε SDS-PAGE με βέλτιστη δραστηριότητα σε τιμές ph μεταξύ (Kok et al., 1995). Oι Kim et al. (1996) καθάρισε μια αλκαλική εξωκυττάρια λιπάση από το μικροοργανισμό Proteus vulgaris με χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων. Η καθαρισμένη λιπάση είχε μέγιστη υδρολυτική δραστηριότητα σε ph 10 και το μοριακό της βάρος ήταν 31 kda σε SDS-PAGE. Μια λιπάση από Staphylococcus epidermidis RP62A καθαρίστηκε με ένα συνδυασμό απο τεχνικές καθίζησης, χρωματογραφίας μεταλλικής έλξης και διύλιση σε πηκτή (Simons et al., 1998). Το καθαρισμένο ένζυμο είχε βέλτιστο ph 6 και για την καταλυτική του δράση ήταν απαραίτητη η παρουσία ασβέστιο ως συνένζυμο (Simons et al., 1998). Οι Diogo et al. (1999) ανέφεραν τον κλασματικό διαχωρισμό της Chromobacterium viscosum λιπάσης χρησιμοποιώντας πηκτή πολυπροπυλικής γλυκόλης σεφαρόζης (polypropylene glycol-sepharose). Η προσρόφηση της λιπάσης στην πηκτή εξαρτάτο από την συγκέντρωση του άλατος και της ιονικής ισχύς της κινητής φάσης (Diogo et al. 1999). Η κινητή φάση από 20% (wt/vol) αμμωνιακού άλατος σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών επέφερε ολική κράτηση της λιπάσης στη στήλη. Η λιπάση μπορούσε να απομονωθεί εύκολα αυξάνοντας την ιονική ισχύ του ρυθμιστικού διαλύματος (Diogo et al. 1999). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

154 Καθαρισμός ενζύμων 119 Μια θερμοάντοχη λιπάση παραγόμενη από το θερμόφιλο βακτήριο Bacillus sp. J33 καθαρίστηκε 175-φορές με χρωματογραφική στήλη αμμωνιακού άλατος και φαινυλσεφαρόζης και η τελική απόδοση ήταν 15.6% (Nawani and Kaur, 2000). Η λιπάση που καθαρίστηκε είχε μοριακό βάρος 45 kda. Οι Fucinos et al. (2005) καθάρισε μερικώς δυο εξωκυττάριες λιπάσες από το θερμόφιλο βακτήριο T. thermophilus HB27 ακολουθώντας καθαρισμό τριών σταδίων. Αρχικά το εξωκυττάριο εκχύλισμα επεξεργαστικέ με χολικό νάτριο, στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε καθίζηση με αιθανόλη/αιθέρα και τέλος εφαρμόστηκε με στήλη υδροφοβικής χρωματογραφίας για περαιτέρω καθαρισμό. Οι μερικώς καθαρισμένες λιπάσες ήταν μοριακού βάρους 34 και 62 kda με βέλτιστη θερμοκρασία υδρόλυσης στους 80 ο C και ph 7. Ο Demir et al. (2010) καθάρισε μια λιπάση μοριακού βάρους 45 kda από το βακτήριο Spirulina platensis (Arthrospira). Η λιπάση καθαρίστηκε με καθίζηση με θειικό αμμώνιο, με διάλυση, με ιοντικής ανταλλαγής χρωματογραφία DEAE-Sepharose και Sepharose 6B διήθηση με πηκτή χρωματογραφία για πρώτη φορά. Η τελική διεργασία έδωσε ένα 375 φορές καθαρισμένο ένζυμο με τελική απόδοση 29.35%. Η καθαρισμένη λιπάση είχε μέγιστη υδρολυτική δραστικότητα στους 45 ο C και ph Βιοχημικά χαρακτηριστικά βακτηριακών λιπασών Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός κάθε ενζύμου είναι γίνει απαραίτητος για την κατανόηση των αναγκών του για να παρουσιάσει τις μέγιστες καταλυτικές αποδόσεις, οι οποίες είναι απαραίτητες για την καλύτερη βιομηχανική εκμετάλλευση αυτού του ενζύμου. Τα χαρακτηριστικά τα οποία συνήθως μελετώνται είναι οι βέλτιστες τιμές ph και θερμοκρασίας του ενζύμου, την επίδραση που έχει η παρουσία συνενζύμων, αναστολέων, και ενισχυτές της καταλυτικής δραστικότητας, αντοχή του ενζύμου σε οργανικούς διαλύτες και στις πρωτεάσες (Sangeetha et al., 2011) Βέλτιστες τιμές ph και θερμοκρασία Οι βακτηριακές λιπάσες είναι κυρίως αλκαλικές από τη φύση τους και οι αλκαλικές λιπάσες είναι αυτές που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως καταλύτες σε πολλές βιομηχανικές εφαρμογές (Nawani and Kaur, 2007; Ahmed et al, 2009). Παρόλο που υπάρχουν πολλές αναφορές για τις λιπάσες και την μικροβιακή παραγωγή τους, λίγες αναφέρονται στις παραγωγή όξινων λιπασών. Ωστόσο, αυτές που υπάρχουν αναφέρονται κυρίως σε όξινες λιπάσες που παράγονται από μύκητες, ειδικά τον Aspergillus niger. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

155 Καθαρισμός ενζύμων 120 Επίσης, έχει παρουσιαστεί μελέτη από τους Ramani et al. (2010), οι οποίοι ανακάλυψαν την παραγωγή όξινης λιπάσης από τον P. gessardii. Ακόμα, οι Andersson et al. (1979) εξέτασαν την λιπάση από τον P. fluorescens SIK W1, η οποία έχει όξινο βέλτιστο ph στα 4.8. Πίνακας 3.1 Βέλτιστες τιμές ph και θερμοκρασίας λιπάσης Λιπάση ph Θερμοκρασία ( o C) Αναφορά Aspergillus oryzae RIB Toida et al. (1998) Aeromonas sobria LP Lotrakul and Dharmsthiti (1997) Acinetobacter sp. CR Kasana et al. (2008) Salinivibrio sp. SA Amoozegar et al. (2008) Enterococcus faecalis Kar et al. (1996) Cryptococcus sp. S Kamini et al. (2000) Pseudomonas aeruginosa MB Chartrain et al. (1993) Bacillus thermoleovorans ID Lee et al. (1999) Rhizopus oryzae Hiol et al. (2000) Γενικά, οι περισσότερες βακτηριακές λιπάσες έχουν ουδέτερο (Dharmsthiti et al., 1998; Dharmsthiti and Luchai 1999; Lee et al. 1999) ή αλκαλικό βέλτιστο ph (Schmidt- Dannert et al., 1994; Sidhu et al., 1998a,b; Kanwar and Goswami 2002; Sunna et al., 2002). Ωστόσο, υπάρχουν μερικές βακτηριακές λιπάσες που είναι σταθερές σε ένα ευρύ φάσμα από ph 4 μέχρι ph 11 (Kojima et al. 1994; Wang et al. 1995; Khyami-Horani, 1996; Dong et al. 1999). Για παράδειγμα, οι λιπάσες από τους Bacillus stearothermophilus SB- 1, B. atrophaeus SB-2 και B. licheniformis SB-3 είναι δραστικές σε ένα μεγάλο εύρος ph από 3 μέχρι 12 (Bradoo et al. 1999). Στον Πίνακα 3.1 αναφέρονται οι βέλτιστες τιμές ph λιπάσης από διάφορους μικροοργανισμούς. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

156 Καθαρισμός ενζύμων 121 Η θερμική ανθεκτικότητα είναι ένα επιθυμητό χαρακτηριστικό για ένα βιομηχανικό ένζυμο, το οποίο υποβάλλεται σε εφαρμογές που απαιτούνται θερμοκρασίες μεγαλύτερες ή ίσες των 60 ο C. Οι λιπάσες που είναι πιο επιθυμητές, είναι αυτές που είναι θερμοσταθερές. Αυτό συμβαίνει λόγω των υψηλών θερμοκρασιών που εφαρμόζονται στις αντιδράσεις λιπόλυσης, κυρίως λόγω του υψηλού σημείου τήξης των λιπιδικών υποστρωμάτων (lipidic substrates) που συμμετέχουν στις διεργασίες (Sangeetha et al., 2011). Θερμοάντοχες λιπάσες από πολλά Pseudomonas και Bacillus sp. έχουν απομονωθεί και μελετηθεί (Νawani and Kaur, 2000; Kumar et al., 2005; Ahmed et al., 2009; Dutta and Ray, 2009). Οι βακτηριακές λιπάσες γενικά έχουν βέλτιστες θερμοκρασίες από τους 30 ο C μέχρι τους 60 ο C (Lesuisse et al. 1993; Wang et al. 1995; Dharmsthiti et al. 1998; Litthauer et al. 2002). Ωστόσο, υπάρχουν αναφορές για λιπάσες όπου έχουν τη βέλτιστη δραστικότητα σε θερμοκρασίες χαμηλότερες και υψηλότερες από αυτές τις τιμές (Dharmsthiti and Luchai 1999; Lee et al. 1999; Oh et al. 1999; Sunna et al. 2002). Η καθαρισμένη λιπάση από το βακτήριο Pseudomonas fluorescens AFT 36 εμφάνισε τη μεγαλύτερη δραστικότητα σε tributyrin σε ph 8 και στους 35 ο C (Fox and Stepaniak, 1983). Η καθαρισμένη λιπάση από τον Aspergillus terreus παρουσίασε πολύ ικανοποιητική αντοχή σε ένα μεγάλο εύρος θερμοκρασιών (15-90 ο C) και η θερμοσταθερότητά της ήταν πολύ υψηλή καθώς διατήρησε το 100% της δραστικότητας της στους 64 ο C για 24 ώρες. Επίσης, εμφάνισε καλή αντοχή σε ένα εύρος ph από 3 μέχρι 12 και ήταν σταθερή σε ph από 4 μέχρι 10 για 24 ώρες (Yadav et al., 1998). Η σταθερότητα αυτού του ενζύμου σε υψηλές θερμοκρασίες το καθιστά ιδιαίτερα χρήσιμο. Η λιπάσης ΙΙ από παράγεται από τους Penicillium cyclopium (Chahinian et al., 2000) και Penicillium wortmani (Costa and Peralta, 1999) παρουσίασε ανθεκτικότητα σε ph 7 και σε θερμοκρασίες ο C. Ωστόσο, η δραστικότητα της χάνεται σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες από τους 50 ο C. Οι λιπάσες από τον Penicillium roqueforti 141 εμφάνισαν δραστικότητα σε θερμοκρασίες μέχρι τους 55 ο C και σε ένα μεγάλο εύρος ph. H Penicillium cyclopium λιπάση επίσης βρέθηκε να είναι σταθερή στους 35 ο C για 60 λεπτά και έχει μέγιστη δραστικότητα σε ένα εύρος ph 8-10 (Ibrik et al., 1998). H βέλτιστη θερμοκρασία για την ενζυμική δραστικότητα των λιπασών από το γένος Penicillium citrinum, επίσης βρέθηκε ότι κυμαίνεται σε ένα εύρος από τους ο C. Ωστόσο, ύστερα από 30 λεπτά στους 60 ο C, το ένζυμο απενεργοποιήθηκε. Η βέλτιστη τιμή ph του ενζύμου ήταν 8. (Pimentel et al., 1994). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

157 Καθαρισμός ενζύμων 122 Η δραστικότητα της λιπάσης από τo γένος Fusarium solani FSI, ήταν σταθερή σε θερμοκρασίες χαμηλότερες των 35 ο C, καθώς σε υψηλότερες θερμοκρασίες παρατηρήθηκε απώλεια της δραστικότητας (Μaia et al., 2001). H βέλτιστη τιμή ph για την ανθεκτική σε διαλύτες λιπάση από τον Fusarium heterosporum στους 40 ο C ήταν 5.6 και η βέλτιστη θερμοκρασία σε ph 5.5 και 6 ήταν 45 και 50 ο C αντίστοιχα, όταν χρησιμοποιήθηκε ελαιόλαδο ως υπόστρωμα. Γενικά η λιπάση ήταν σταθερή σε ένα εύρος ph 4-10 σε θερμοκρασία 30 ο C για 4 ώρες, και σε θερμοκρασία 40 ο C και ph 5.6 για 30 λεπτά (Shimada et al. 1993). Στον Πίνακα 3.2 αναφέρονται η σταθερότητα της λιπάσης από διάφορους μικροοργανισμούς σε ph και θερμοκρασίες. Πίνακας 3.2 Ανθεκτικότητα λιπάσης σε ph και θερμοκρασία. Λιπάση ph και θερμοκρασία Αναφορά Aspergillus oryzae RIB128 Bacillus sp. FH5 ph σε 30 C για 24 h, και ph 5.5 σε 30 C για 1 h 98.6% και 93% για 1 h σε 40 και 45 C Toida et al. (1998) Hasan et al. (2006) Aeromonas sobria LP004 ph σε < 40 C Lotrakul and Dharmsthiti (1997) Cryptococcus sp. S-2 ph 5.0 και 9.0 σε 50 C Kamini et al. (2000) Bacillus sp. LBN4 80 C για 10 min Bora and Kalita (2007) Rhizopus oryzae 4.5 μέχρι 7.5 Hiol et al. (2000) Pseudomonas sp. 7323,. >25 C Zhang and Zeng (2008) Bacillus coagulans BTS-3 ph 8.0 και 10.5 σε 70 C Kumar et al. (2005) Επίδραση απορρυπαντικών/επιφανειοδραστικών Τα επιφανειοδραστικά αυξάνουν τη διεπιφάνεια λιπίδιο-νερό και αυτό ενισχύει το ρυθμό της λιπόλυσης. Ωστόσο αυτό δεν ισχύει για όλα τα επιφανειοδραστικά. Επίσης, η επίδραση των επιφανειοδραστικών σχετίζεται με την συγκέντρωση τους. Για παράδειγμα, υψηλές συγκεντρώσεις του Tween-80 (1% v/v) παρεμπόδισαν την παραγωγή της λιπάσης από τον B. pumilus ενώ σε συγκέντρωση 0.5% v/v Tween-80 βοήθησαν στη μέγιστη ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

158 Καθαρισμός ενζύμων 123 παραγωγή της (Zhang et al., 2009a, b). Το SDS βρέθηκε ότι δρα παρεμποδιστικά για τις λιπάσες, ενώ το Triton X-100 και το Tween ενισχύουν τους ρυθμούς της αντίδρασης (Quyen et al., 2003; Lianghua and Liming, 2005). To αντίθετο, επίσης μπορεί να ισχύει, οι Dutta και Ray (2009) παρατήρησαν ότι το SDS είχε διεγερτική επίδραση ενώ το Triton και το Tween παρεμπόδισαν την δράση της λιπάσης. H δραστικότητα της καθαρισμένης λιπάσης από τον Aspergillus terreus αναστάλθηκε στην παρουσία ιονικών απορρυπαντικών, ενώ τα μη ιονικά απορρυπαντικά ενίσχυσαν την ενζυμική δραστικότητα. Το ένζυμο, έμεινε ανεπηρέαστο από το χηλικό EDTA (Yadav et al., 1998). Επίσης, το EDTA δεν επηρέασε την δραστικότητα της λιπάσης από τον Trichosporon asteroids LP005 (Dharmisthiti and Ammaranond, 1997) Επίδραση μεταλλικών ιόντων Τα μεταλλικά ιόντα γενικά σχηματίζουν σύμπλοκα με τα ιονικά λιπαρά οξέα, αλλάζοντας τη διαλυτότητα τους και τη συμπεριφορά τους στη διεπιφάνεια. Ωστόσο, η επίδραση των μεταλλικών ιόντων εξαρτάται από την εκάστοτε λιπάση. Η επίδραση των μεταλλικών ιόντων στην ενζυμική δραστικότητα είναι πιο άμεση όταν πρόκειται για βακτηριακές λιπάσες, από ότι για λιπάσες που προέρχονται από το πάγκρεας, οι οποίες χρειάζονται ένα πρωτεϊνικό συνένζυμο. Πρόκειται για ένα πολύπλοκο φαινόμενο καθώς η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε ετερογενή σύστημα (Hasan et al., 2009). Τα μεταλλικά ιόντα ενισχύουν την καταλυτική δραστικότητα των ενζύμων και επίσης τους παρέχουν θερμοσταθερότητα (Chakraborty and Paulraj, 2008). Πολλά ένζυμα, χρειάζονται την παρουσία μεταλλικών ιόντων για να διατηρήσουν την ενεργό δομή τους (Sharma et al., 2002). Διαφορετικές λιπάσες εμφανίζουν διαφορετική ανταπόκριση σε αυτά τα μεταλλικά ιόντα και αυτά τα ιόντα που λειτουργούν ως ενεργοποιητές για μερικές λιπάσες, παρεμποδίζουν τη δραστικότητα κάποιων άλλων. Τα πιο μελετημένα μεταλλικά ιόντα είναι τα Ca 2+, Zn 2+, Mg 2+, Mn 2+, Co 2+, Hg 2+, Cu 2+, Fe 2+ κλπ. Έχουν αναφερθεί πολλές λιπάσες που η δράση τους εξαρτάται από τα μέταλλα και το Ca 2+ έχει βρεθεί ότι παρουσιάζει διεγερτική επίδραση σε όλα αυτά τα ένζυμα (Chakraborty και Paulraj, 2008; Ahmed et al., 2009; Zhang et al., 2009a, b). Αυτή η επίδραση μπορεί να οφείλεται στη δομική μεταβολή που επιβάλλεται από τον δεσμό του Ca 2+ στο ένζυμο. Το αναδιπλωμένο (folded) ένζυμο φέρει μια περιοχή με αρνητικά φορτισμένα ανιμοξέα, τα οποία προσπαθεί να απομακρύνει για να μειώσει τις ηλεκτροστατικές απωθήσεις και αυτό αποδεικνύεται να είναι καθοριστικό για τη σταθερότητα του ενζύμου. Τα μεταλλικά ιόντα, ωστόσο, δένονται ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

159 Καθαρισμός ενζύμων 124 με το ένζυμο και σχηματίζουν μια γέφυρα που διασύνδεει την πολυπετιδική αλυσίδα (παρόμοιο με ένα δεσμό δισουλφιδικού δεσμού (disulphide bond)) και το σύμπλοκο ένζυμο-μεταλλικό ιόν γίνεται σταθερό και άκαμπτο (rigid) ((Macrae and Hammond 1985; Godtfredsen 1990; Sangeetha et al., 2011). Η διέγερση των λιπασών στην παρουσία ασβεστίου έχει αναφερθεί στην περίπτωση του B. subtilis 168 (Lesuisse et al. 1993), B. thermoleovorans ID- 1 (Lee et al. 1999), P. aeruginosa EF2 (Gilbert et al. 1991b), S. aureus 226 (Muraoka et al. 1982), S. Hyicus (Van Oort et al. 1989), και Acinetobacter sp. RAG-1 (Snellman et al. 2002). Από την άλλη έχουν αναφερθεί λιπάσες που δεν επηρεάζεται η θερμοσταθερότητα τους και η δραστικότητα τους από την παρουσία Ca 2+ (Kim et al., 2002). Οι ασβεστίουανεξάρτητες λιπάσες (calcium-independent) μπορούν να λειτουργήσουν αποτελεσματικά στην παρουσία χηλικών μέσων όπως το EDTA, το οποίο συνήθως βρίσκεται σε απορρυπαντικά πλυντηρίων. Οι Chartain et al. (1993) παρατήρησαν ότι η εξωκυττάρια λιπάση της P. aeruginosa MB5001 αναστάλθηκε έντονα με 1 mm ZnSO 4 (94% αναστολή), άλλα διεγέρθηκε με την προσθήκη 10 mm CaCl 2 (1.24 φορές διέγερση). Οι Mase et al. (1995) μελέτησε την επίδραση των μεταλλικών ιόντων σε μια καθαρισμένη λιπάση από τον Pe. Roqueforti IAM7268. Η δραστικότητα τις λιπάσης δεν επηρεάστηκε από Ca +2, Mg +2, Mn +2, Na +, K +, Cu +2, EDTA, και p-χλωρο μεκρυλικό βενζοϊκό οξύ (Mase et al., 1995). Σε αντίθεση όμως το ένζυμο αναστάλθηκε με την παρουσία Ag +, Fe +2, Hg +2, και ισοπροπυλo φθoροφωσφορικό. Σε μια άλλη παρόμοια μελέτη, με μεταλλικά ιόντα η δραστικότητα της P. pseudoalcaligenes F-111 λιπάσης αναστάλθηκε κατά 60% με Fe +2 αλλά όχι με Ca +2, Hg +2, Zn +2, Mn +2, Cu +2, Mg +2, Co +2, Cd +2 και Pb +2 (Lin et al. 1996). Οι Sharon et al. (1998) ανέφεραν μια λιπάση του P. aeruginosa ΚΚΑ-5 που διατήρησε τη δραστικότητα της στην παρουσία Ca +2 και Mg +2, αλλά ανεστάλη ελαφρώς στην παρουσία Mn +2, Cu +2 και Cd +2. Άλατα βαρέων μετάλλων (Fe +2, Zn +2, Hg +2, Fe +2 ) αναστέλλουν έντονα τη λιπάση, υποδεικνύοντας ότι είναι ικανά να μεταβάλλουν τη δομή του ενζύμου (Sharon et al., 1998). Η επίδραση διάφορων μεταλλικών ιόντων στη δραστικότητα της S. epidermidis λιπάσης αναφέρθηκε από τους Simons et al. (1998) και διαπιστώθηκε ότι το ένζυμο χρειάζεται ασβέστιο ως συνένζυμο για καταλυτική δραστικότητα. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

160 Καθαρισμός ενζύμων 125 H δραστικότητα της λιπάσης από τον Rhizopus japonicus NR400 δεν επηρεάστηκε από την προσθήκη 1 mm μεταλλικών ιόντων ή άλατα χολικού οξέος. Η διέγερση της δραστικότητας της λιπάσης παρατηρήθηκε ύστερα από προσθήκη αλβουμίνης στο μείγμα της αντίδρασης (Suzuki et al., 1986). H δραστικότητα της καθαρισμένης λιπάσης από τον Bacillus coagulans BTS-3 βρέθηκε ότι παρεμποδίζεται από τα ιόντα Al 3+, Co 2+, Mn 2+ και Zn 2+, ενώ τα ιόντα K +, Fe 3+, Hg 2+ και Mg 2+ την ενισχύουν. Επίσης, το ιόν Na + δεν παρουσίασε καμία επίδραση στην δραστικότητα του ενζύμου (Kumar et al., 2005). Στον Πίνακα 3.3 αναφέρονται η επίδραση διάφορων παραγόντων στη δραστικότητα της λιπάσης Ανθεκτικότητα σε οργανικούς διαλύτες Οι οργανικοί διαλύτες πλεονεκτούν από τους ανόργανους διαλύτες ή το νερό όταν χρησιμοποιούνται σε συστήματα αντιδράσεων που περιλαμβάνει βιοκαταλύτες. Βοηθάνε στο να αυξήσουν την διαλυτότητα του υποστρώματος, την εύκολη ανάκτηση του προϊόντος και βοηθούν στην μετατόπιση της ισορροπίας προς την κατεύθυνση των συνθετικών αντιδράσεων (Zhang et al., 2009a, b). Οι λιπάσες που είναι ανθεκτικές στους οργανικούς διαλύτες ενεργούν ως αποτελεσματικοί καταλύτες στη σύνθεση των βιοπολυμερών, σε αντιδράσεις τρανσεστεροποίηση και σε παραγωγή βιοντίζελ (Dizge et al., 2009; Singh et al., 2010). H σταθερότητα και η δραστικότητα της λιπάσης συνήθως δοκιμάζεται στην παρουσία οργανικών διαλυτών όπως η ισοπροπανόλη, η μεθανόλη, η αιθανόλη, η ακετόνη, η γλυκερόλη, το n-εξάνιο, το n-επτάνιο, το n-οκτάνιο, το n-δεκάνιο, το βενζόλιο, το τολουόλιο, το ξυλόλιο, το στυρόλιο, το αιθυλοβενζόλιο, το κυκλοεξάνιο, το διμεθυλοσουλφοξείδιο, το τετραϋδροφουράνιο, το χλωροφόρμιο και το οξικό οξύ (Cadirci and Yasa, 2009; Zhang et al., 2009a, b). Η ευαισθησία των λιπασών στους διαλύτες ποικίλοι ανάλογα με την πολικότητα τους, με τους πολικούς διαλύτες να είναι οι πιο ασταθείς (destabilizing) σε σχέση με τους μη πολικούς (Ahmed et al., 2010). Οι λιπάσες από διαφορετικές πηγές εμφανίζουν διαφορετικό βαθμό ανοχής σε διαφορετικούς διαλύτες και για αυτό για την εμπορική εκμετάλλευση της λιπάσης απαιτείται μια εκτεταμένη ανάλυση ανοχής σε αυτούς τους διαλύτες.όταν μελετήθηκε η επίδραση οργανικών διαλυτών στη λιπάση από την Pseudomonas putida 3SK, το ισοοκτάνιο βρέθηκε να είναι το πιο κατάλληλο για την ενζυμική υδρόλυση λιπών σε ένα σύστημα δυο φάσεων (Lee and Rhee, 1993). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

161 Καθαρισμός ενζύμων 126 Πίνακας 3.3 Επίδραση διάφορων παραγόντων στη δραστικότητα της λιπάσης Επίδραση μεταλλικών ιόντων Bacillus thermoleovorans ID-1 Bacillus sp. FH5 Ενεργοποιητής Αναστολέας Αναφορά Ca 2+ or Zn 2+ Lee et al. (1999) Ba 2+, Fe 2+, Mn 2+, Cu 2+, Co 2+, Na + Ca 2+, Mg 2+ Hg 2+ Zn 2+ Hasan et al. (2006) Acinetobacter sp. CR9 Cu 2+, Mo 2+, Mg 2+, Zn 2+, Ca 2+ Kasana et al. (2008) Acinetobacter baumannii BD5. Ca 2+, Mg 2+, Mn 2+ Zn 2+ Cu 2+ Park et al. (2009). Pseudomonas sp Ca 2+. Zhang and Zeng (2008) Επίδραση αναστολέων Acinetobacter sp. CR9 PMSF, DTT, 2-ME EDTA Kasana et al. (2008) Bacillus thermoleovorans ID-1 SDS Lee et al. (1999) Bacillus sp. FH5 PMSF, SDS, EDTA Hasan et al. (2006) Acinetobacter baumannii BD5. Tween 20 SDS and Triton X- 100 Park et al. (2009). Επιφανειοδραστικά και άλλα Rhizopus oryzae Χολικό νάτριο Triton X-100, SDS. Hiol et al. (2000) Pseudomonas strain Bacillus sp. FH5 Staphylococcus haemolyticus L62 Μεθανόλη και διμέθυλο σουλφοξείδιο Αιθανόλη και ακετόνη Tributyrin, tripropionin, και trimyristin Choo et al. (1998) Ισοπροπανόλη Hasan et al. (2006) Oh et al. (1999) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

162 Καθαρισμός ενζύμων 127 Η δραστικότητα της λιπάσης από τον Fusarium solani FSI αυξήθηκε στην παρουσία αυξημένης συγκέντρωσης εξανίου και τολουολίου. Σε αντίθεση, η επώαση του ενζύμου σε υδροδιαλυτούς διαλύτες μείωσε τη δραστικότητα του ύστερα από συγκέντρωση του διαλύτη 10% v/v (Maia et al., 2001). H προσθήκη του DMSO και του διαιθυλαιθέρα σε συγκεντρώσεις από 0-10% v/v ενίσχυσαν σημαντικά την δραστικότητα της λιπάσης από τον Cryptococcus sp. S-2 (Kamini et al., 2000). H ανθεκτική σε διαλύτες λιπάση από τον Fusarium heterosporum δεν απενεργοποιήθηκε ακόμα και ύστερα από επώαση της στους 30 o C σε 50% διαλύτη όπως το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), το εξάνιο, το βενζόλιο και ο αιθέρας για 20 ώρες (Shimada et al., 1993). Η ομάδα του Hasan (2006) παρατήρησε ότι στην περίπτωση της δραστικότητας της λιπάσης από τον Bacillus sp. FH5 οι οργανικοί διαλύτες δρουν παρεμποδιστικά Ανθεκτικότητα στις πρωτεάσες Οι λιπάσες έχουν ένα μεγάλο εύρος εφαρμογών στις οποίες σε μερικές εφαρμόζεται η λιπάση σε συνδυασμό με άλλα ένζυμα όπως η αμυλάση και η πρωτεάση. Οι πρωτεάσες είναι υδρολυτικά ένζυμα τα οποία είναι ικανά να αυτό-πρωτεολύονται και επίσης να πρωτεολύουν άλλα ένζυμα που παράχθηκαν ταυτόχρονα (Aguilar et al., 2002). Μια εκτεταμένη μελέτη της βιβλιογραφίας αποκαλύπτει αρκετές αναφορές στις οποίες δηλώνεται ότι η παραγωγή της λιπάσης και της πρωτεάσης είναι αλληλένδετες (Rajmohan et al., 2002; Sangeetha et al., 2011). Αυτές οι μελέτες έδειξαν ότι όταν η παραγωγή της πρωτεάσης επηρεάζεται είτε λόγω της επίδρασης παραμέτρων της παραγωγής είτε λόγω γενετικής μεταβολής, η παραγωγή της λιπάσης ενισχύεται. Για παράδειγμα, οι Lopes et al. (2008) απέδειξαν ότι η αύξηση της πίεσης του αέρα κατά την διάρκεια της καλλιέργειας μείωσαν την παραγωγή της πρωτεάσης και αυξήθηκε η παραγωγή της λιπάσης. Παρόλα αυτά, υπάρχουν μερικές αναφορές πάνω στην πρωτεολυτική αντίσταση των λιπασών. Οι Zhang et al. (2008) και οι Dutta and Ray (2009) παρήγαγαν μια λιπάση από τους Streptomyces fradiae και B. cereus αντίστοιχα, η οποία ήταν ανθεκτική στην εμπορική ουδέτερη και αλκαλική πρωτεάση. Οι λιπάσες που έχουν παραχθεί από τους P. aeruginosa, B. pumilus και B. licheniformis παρουσίασαν επίσης μια ανθεκτικότητα στις συμπαραγόμενες πρωτεάσες (Ruchi et al., 2008; Sangeetha et al., 2010a, b) Εξειδίκευση υποστρώματος Οι μικροβιακές λιπάσες μπορούν να χωριστούν σε τρείς κατηγορίες: στις μηεξειδικευμένες, εξειδίκευση περιοχής και εξειδικευμένες στα λιπαρά οξέα, ανάλογα με την ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

163 Καθαρισμός ενζύμων 128 εξειδίκευση του υποστρώματος τους. Οι μη-εξειδικευμένες λιπάσες ενεργούν τυχαία πάνω στο μόριο των τριακυλογλυκεριδίων με αποτέλεσμα τον ολοκληρωτική αποσύνθεση τους σε λιπαρά οξέα και γλυκερόλη. Παραδείγματα λιπασών που ανήκουν σε αυτή την ομάδα είναι αυτές που παράγονται από τους S. aureus, S. hyicus (Davranov, 1994; Jaeger et al., 1994), Corynebacterium acnes (Hassing, 1971) και Chromobacterium viscosum (Jaeger et al., 1994). Σε αντίθεση με τις μη εξειδικευμένες λιπάσες, οι λιπάσες που έχουν εξειδίκευση περιοχής υδρολύουν μόνο τους αρχικούς εστερικούς δεσμούς (π.χ. τους εστερικούς δεσμούς των ατόμων C 1 και C 3 της γλυκερόλης). Οι εξωκυττάριες βακτηριακές λιπάσες είναι regiospecific, όπως είναι αυτές που προέρχονται από τους Bacillus sp. (Sugihara et al., 1991; Lanser et al., 2002), B. subtilis 168 (Lesuisse et al., 1993), Bacillus sp THL027 (Dharmsthiti and Luchai, 1999) Pseudomonas sp. f-b-24 (Yamamoto and Fujiwara, 1988, 1995) P. aeruginosa EF2 (Gilbert et al., 1991b) και P. alcaligenes 24 (Misset et al., 1994). Η τρίτη ομάδα αποτελείται από λιπάσες με εξειδίκευση στα λιπαρά οξέα, οι οποίες παρουσιάζουν μια προτίμηση σε λιπαρά οξέα. Το Achromobacterium lipolyticum είναι η μόνη γνωστή πηγή λιπασών που εμφανίζουν εξειδίκευση στα λιπαρά οξέα (Davranov 1994). Ωστόσο, οι λιπάσες από τους Bacillus sp. (Wang et al., 1995), P. alcaligenes EF2 (Gilbert et al., 1991a,b) και P. alcaligenes 24 (Misset et al., 1994) εμφανίζουν εκλεκτικότητα για τριακυλογλυκερίδια με μεγάλες αλυσίδες λιπαρών οξέων, ενώ οι λιπάσες από τους B. subtilis 168 (Lesuisse et al., 1993), Bacillus sp. THL027 (Dharmsthiti and Luchai, 1999), Pseudomonas sp. ATCC (Kordel et al., 1991), και Aeromonas hydrophila (Angultra et al., 1993) προτιμούν μικρότερες μεσαίων αλυσίδων λιπαρών οξέων. Μια άλλη σημαντική ιδιότητα των λιπασών είναι η εναντιο-/στερεο-επιλεκτική φύση τους, με την οποία έχουν την ικανότητα να διακρίνουν τα εναντιομερή και το ρακεμικό ζευγάρι τους. Τέτοια εναντιομερώς καθαρά ή εμπλουτισμένες οργανικές ενώσεις συνεχώς αυξάνεται η σημαντικότητα τους στη χημεία της φαρμακευτικής, της γεωργίας, των συνθετικών οργανικών και φυσικών προϊόντων (Reetz, 2001). Κυρίως οι λιπάσες από την οικογένεια των Pseudomonas ανήκουν σε αυτή την κατηγορία (Reetz and Jaeger, 1998). Η στερεοεξειδίκευση μιας λιπάσης εξαρτάται από τη δομή του υποστρώματος, τις αλληλεπιδράσεις στο ενεργό μέρος και τις συνθήκες της αντίδρασης (Lavayre et al. 1982; Cambou and Klibanov 1984; Muralidhar et al. 2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

164 Καθαρισμός ενζύμων 129 Η λιπάση από τον P. cepacia είναι ένας δημοφιλής καταλύτης στην οργανική σύνθεση για τον κινητικό διαχωρισμό των ρακεμικών μιγμάτων δευτερογενών αλκοολών στην υδρόλυση, εστεροποίηση και μετεστεροποίηση (Petschen et al. 1996; Takagi et al. 1996; Schulz et al. 2000) Κινητική μελέτη λιπάσης Σε πολλές περιπτώσεις, οι λιπάσες φαίνεται ότι υπακούουν στην κινητική των Michaelis-Menten (Guit et al., 1991; Malcata et al., 1992). H κινητική των Michaelis- Menten χαρακτηρίζεται από δυο παραμέτρους, το K m και το v max. Το τελευταίο, είναι ο μέγιστος ρυθμός της αντίδρασης και το K m είναι ένα μέτρο/κριτήριο της έλξη του ενζύμου προς ένα συγκεκριμένο υπόστρωμα. Μια χαμηλή τιμή K m αντιπροσωπεύει μια μεγάλη έλξη για το υπόστρωμα. Η τιμή του K m του ενζύμου έχει ένα μεγάλο εύρος, αλλά, για τα πιο σχετικά βιομηχανικά ένζυμα, κυμαίνεται ανάμεσα στο 10-1 και 10-5 Μ (Fullbrook, 1996). O Pabai et al. (1995) ανέφεραν τις τιμές K m και v max μιας καθαρισμένης λιπάσης από τον P. fragi CRDA 323 ίσες με 0.7 mg/ml και U/min, αντίστοιχα. Για τη λιπάση από τον P. cepacia, οι Pencreac h και Baratti (1996), παρουσίασαν τις τιμές K m και v max ίσες με 12 mm και 30 μmol/min, αντίστοιχα, όταν το υπόστρωμα ήταν p-npp. Για μια λιπάση του Rho. glutinis, η τιμή του K m ήταν 2.7 και 0.7 mm, όταν τα υποστρώματα ήταν βουτυρικός π-νιτρο-φαινυλεστέρας και δωδεκανοϊκός π-νιτρο-, αντίστοιχα (Hatzinikolaou et al., 1999). Οι τιμές K m και v max της καθαρισμένης λιπάσης από τον Bacillus sp. FH5, υπολογίστηκαν βάση της γραφικής παράστασης των Lineweaver και Burk (1934). Το καθαρισμένο ένζυμο επωάστηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος και η δραστικότητα μετρήθηκε ύστερα από μια ώρα. Παρατηρήθηκε ότι η λιπάση είχε τιμές K m 5.05 mm και v max μmol/ml/min (Hasan et al., 2006). Η σταθερά Michaelis-Menten της καθαρισμένης λιπάσης από τον Serratia marcescens ήταν 1.35 mm σε τριβουτυρίνη (Abdou, 2003). Οι τιμές των K m και v max την λιπάσης από τον Aspergillus niger F044 υπολογίστηκαν με την γραφική παράσταση των Lineweaver και Burk χρησιμοποιώντας p- NPP ως υδρολυτικό υπόστρωμα και βρέθηκαν ίσες με 7.37 mmol/l και μmol/mg/min, αντίστοιχα (Shu et al., 2007). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

165 Καθαρισμός ενζύμων Πειραματική διαδικασία Υλικά Όλα τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας των οίκων Merck (Dramstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), Riedel de Haan (Seelzer, Germany), J. T. Baker (Deventer, Holland), Gibco BRL (Karlsruhe, Germany) και Biaffin GmBH (Kassel Germany). Τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της Ισπανικής εταιρείας Panreac Quimica S.A. Η μεμβράνη διαπίδυσης ήταν της εταιρίας Sigma-Aldrich Chemie GmbH Βακτηριακό στέλεχος Στην παρούσα διδακτορική εργασία χρησιμοποιήθηκε ο κλώνος ΗΒ8 του θερμόφιλου βακτηρίου Thermus thermophilus (DSM 579) ο οποίος προμηθεύτηκε από τον οίκο Deutsche Sammlung Mikroorganismen. Το βακτήριο Thermus thermophilus ΗΒ8 αποθηκεύεται στους -20 ο C σε διάλυμα του μέσου ανάπτυξης του με προσθήκη 10 % (v/v) γλυκόζης (stock) Θρεπτικό υπόστρωμα και συνθήκες ανάπτυξης του βακτηρίου T. thermophilus. Για την παραγωγή της εξωκυττάριας λιπάσης το βακτήριο Thermus thermophilus HB8 καλλιεργήθηκε, σε πλούσιου μέσο ανάπτυξης (ΜΤ) που περιλαμβάνει στο λίτρο: 8 g τρυπτόνη, 4 g εκχύλισμα ζύμης και 3 g NaCl. Όλα τα υλικά και τα σκεύη που χρησιμοποιήθηκαν για την καλλιέργεια αποστειρώθηκαν σε κλίβανο στους 120 ο C για 20 λεπτά. Το βακτήριο αναπτύσσεται για 30 ώρες στους 67 ο C σε αναδευόμενο επωαστήρα, με ανάδευση στα 210 rpm. Ο τρόπος ανάπτυξης του μικροοργανισμού περιγράφεται στο πειραματικό μέρος του κεφαλαίου 2. Ο διαχωρισμός τον κυττάρων από το μέσο ανάπτυξης πραγματοποιείται με φυγοκέντριση στις 5,000 x g για 15 λεπτά στου 4 o C. Το υπερκείμενο συλλέγεται για περαιτέρω επεξεργασία, ενώ τα κύτταρα φυλάσσονται στου -70 ο C Στάδια καθαρισμού εξωκυττάριας λιπάσης Για τον καθαρισμό της εξωκυττάριας λιπάσης που έχει παραχθεί από τον Thermus thermophilus ακολουθήθηκαν τα εξής στάδια (Fucinos et al., 2005): Διαχωρισμό κυττάρων από το εξωκυττάριο εκχύλισμα. Συμπύκνωση εξωκυττάριου εκχυλίσματος με υπερδιήθηση. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

166 Καθαρισμός ενζύμων 131 Καθίζηση πρωτεϊνών με θειικό αμμώνιο. Καθίζηση πρωτεϊνών με αιθανόλη. Διαχωρισμός πρωτεϊνών με χρωματογραφίας υδροφοβικής αλληλεπίδρασης. Υπερδιήθηση Η υπερδιήθηση γίνεται σε συσκευή Amicon (Amicon, Beverly, MA) στους 4 ο C, με φίλτρα διαφόρων διαστάσεων πορώδους που επιτρέπουν μόνο τη δίοδο μορίων μικρότερων μεγέθους από τη διάμετρο των πόρων τους. Το εξωκυττάριο μείγμα συμπυκνώθηκε ~100 φορές, με φίλτρο πορώδους UM10. Κλασματική κατακρήμνιση με θειικό αμμώνιο Η κατακρήμνιση των πρωτεϊνών με το θειικό αμμώνιο, βασίζεται στο γεγονός ότι τα άλατα έχουν την ικανότητα να αφαιρούν πολλά μόρια νερού από παρακείμενες περιοχές των πρωτεϊνών. Έτσι οι υδρόφοβες περιοχές των πρωτεϊνών, που ως τώρα δεν ερχόταν σε επαφή λόγω του μεγάλου όγκου του νερού που τις περιέβαλε, μπορούν τώρα να αλληλεπιδράσουν με αποτέλεσμα τη μετουσίωση της πρωτεΐνης και την κατακρήμνιση της. Για τον καθαρισμό της λιπάσης με τη βοήθεια της μεθόδου της κατακρήμνισης των πρωτεϊνών με θειικό αμμώνιο, το άλας προστίθεται σίγα - σιγά στο συμπυκνωμένο εξωκυττάριο εκχύλισμα, υπό συνεχή ανάδευση στου 0 ο C, μέχρι να επιτευχθεί το επιθυμητό ποσοστό κορεσμού (50 100%). Στη συνέχεια, το διάλυμα φυγοκεντρείται για 20 λεπτά στα 17,000 x g στους 4 o C, και τo ίζημα που συλλέγεται μετά τη φυγοκέντριση επαναδιαλυτοποιείται σε 50 mm ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών, ph 7.0. Για τον υπολογισμό της ποσότητας του θειικού αμμωνίου που πρέπει να προστεθεί για να επιτευχθεί το επιθυμητό ποσοστό κορεσμού χρησιμοποιείται η εξίσωση [3.1] η οποία ισχύει για τους 0 ο C: W ( V1) ( S2 S1) = S 2 [3.1] Όπου: W: βάρος θειικού αμμωνίου (g) V 1 : S 1 : όγκος διαλύματος (ml) αρχικό ποσοστό κορεσμού του διαλύματος ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

167 Καθαρισμός ενζύμων 132 S 2 : επιθυμητό ποσοστό κορεσμού του διαλύματος Ο κορεσμός εκφράζεται σε κλάσμα της μονάδας (όπου 100% = 1 ή 60% = 0.6) Κατακρήμνιση με αιθανόλη Στο επόμενο στάδιο του καθαρισμού της λιπάσης, πραγματοποιήθηκε κατακρήμνιση των πρωτεϊνών με αιθανόλη η οποία βασίζεται στο γεγονός ότι η προσθήκη οργανικών διαλυτών σε υδατικά διαλύματα, βοηθάει στην ελάττωση της διαλυτότητας των πρωτεϊνών λόγω της ελάττωσης της διηλεκτρικής σταθεράς του διαλύματος. Στο επόμενο στάδιο καθαρισμού της εξωκυττάριας λιπάσης, στο διάλυμα που προέκυψε μετά την κατακρήμνιση των πρωτεϊνών με το θειικό αμμώνιο, προστίθεται με πολύ αργούς ρυθμούς διπλάσιος όγκος κρύας αιθανόλης. Το μίγμα, αναδεύεται συνεχώς κατά τη διάρκεια της προσθήκης της αιθανόλης και για μία ώρα μετά. Οι καταβυθισμένες πρωτεΐνες συλλέχτηκαν με φυγοκέντριση για 20 λεπτά στα 17,000 x g στους 4 o C και διαλύθηκαν σε 50 mm ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών, ph 7.0. Υδρόφοβη Χρωματογραφία Για τον περαιτέρω καθαρισμό της εξωκυττάριας λιπάσης, χρησιμοποιήθηκε στήλη χρωματογραφίας υδρόφοβη αλληλεπίδρασης. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στη σύνδεση των ενζύμων με το υλικό της στήλης χρωματογραφίας με υψηλή ιονική ισχύ. Οι πρωτεΐνες που έχουν συλλεχτεί ύστερα από τα δύο στάδια καθίζησης, μεταφέρθηκαν σε στήλη χρωματογραφίας βουτυλ-σεφαρόζης (21x2.6 cm), η οποία προηγούμενος είχε εξισορροπηθεί με ρυθμιστικό φωσφορικό διάλυμα 50 mm ph 7. Η έκλουση εκτελέστηκε με διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις από 0 μέχρι 1.5 Μ NaCl σε 50 mm ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών, ph Διαπίδυση Ύστερα από κάθε στάδιο καθαρισμού, με τη βοήθεια μεμβρανών διαπίδυσης, απομακρύνονται τα άλατα από το τελικό διάλυμα. Οι μεμβράνες διαπίδυσης, λειτουργούν βάσει του φαινομένου της ανάμειξης δύο αερίων ή υγρών σωμάτων μέσα από πορώδες διάφραγμα. Το διάφραγμα, μέσα από το οποίο περνούν τα μόρια, έχει πολύ λεπτούς πόρους που επιτρέπουν τη διακίνηση μόνο ουσιών σχετικά χαμηλού μοριακού βάρους, όπως είναι τα άλατα, ενώ ουσίες μεγάλου μοριακού βάρους όπως είναι οι πρωτεΐνες παραμένουν μέσα στη μεμβράνη διαπίδυσης. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

168 Καθαρισμός ενζύμων 133 Το τελικό διάλυμα με τις πρωτεΐνες μετά από την καθίζηση με το θειικό αμμώνιο ή την αιθανόλη τοποθετείται μέσα στην ημιπερατή μεμβράνη διαπίδυσης και βυθίζεται σε μεγάλο όγκο 50 mm ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών, ph 7.0. Ύστερα από ~15 ώρες ανάδευσης συλλέγεται το διάλυμα με τις πρωτεΐνες μέσα από τη μεμβράνη διαπίδυσης και συνεχίζεται περεταίρω ο καθαρισμός του ενζύμου. Ενεργοποίηση μεμβρανών διαπίδυσης Οι μεμβράνες διαπίδυσης πριν τη χρήση τους χρειάζεται να ενεργοποιηθούν. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η ακόλουθη: Για την απομάκρυνση της γλυκερίνης, τοποθετείται κάτω από τρεχούμενο νερό βρύσης με χαμηλή ροη για 3-4 ώρες. Για την απομάκρυνση των θειικών ενώσεων (sulfur compound), η μεμβράνη τοποθετείται σε διάλυμα θειούχου νάτριου 0.3% w/v σε θερμοκρασία 80 o C για 1 λεπτό. Η μεμβράνη ξεπλένεται με ζεστό απιονισμένο νερό (60 o C) για 2 λεπτά Για την οξίνιση της μεμβράνης, εμβαπτίζεται σε διάλυμα 0.2% (v/v) θειικού οξέος. Η μεμβράνη ξεπλένεται με ζεστό απιονισμένο νερό (60 o C) για μερικά λεπτά για την απομάκρυνση του οξέος. Οι μεμβράνες διατηρούν τις πρωτεΐνες με μοριακό βάρος από 12,000 Da και πάνω και διατηρούνται σε διάλυμα αιθανόλης 30% (v/v) στους 4 ο C. Πριν τη χρήση τους ξεπλένονται με απιονισμένο νερό Προσδιορισμός πρωτεϊνών Φασματοφωτομετρική μέθοδος Ο φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός των πρωτεϊνών βασίζεται στην ιδιότητά τους να απορροφούν στην υπεριώδη περιοχή, με βέλτιστο στα 280 nm. Η ιδιότητά τους αυτή οφείλεται στην παρουσία των ανιμοξέων τυροσίνης, τρυπτοφάνης και λιγότερο της φαινυλαλανίνης, στο μόριο των πρωτεϊνών (Sambrook et al., 1989). Η μέθοδος αυτή είναι εύκολη και γρήγορη χωρίς να καταστρέφει τα δείγματα, μειονεκτεί όμως στην ακρίβεια και στην εξειδίκευση αφού στην περιοχή αυτή απορροφούν και άλλες ενώσεις. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

169 Καθαρισμός ενζύμων 134 Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών κατά Bradford τροποποιημένη από τον Bearden Η μέθοδος βασίζεται στην ιδιότητα της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G 250 να συμπλέκεται με τις πρωτεΐνες σε οξικό περιβάλλον. Ο σχηματισμός του συμπλόκου έχει ως αποτέλεσμα τη μετατροπή του μέγιστου της απορρόφησης της χρωστικής από 465 nm στα 595 nm. Το αντιδραστήριο Bradford που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών παρασκευάζεται με διάλυση της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G 250 σε πυκνό φωσφορικό οξύ (85% v/v), σε συγκέντρωση 1 mg/ml. Το αντιδραστήριο αναδεύεται για 12 έως 16 ώρες και στη συνέχεια αραιώνεται με δις απιονισμένο H 2 O σε πενταπλάσιο όγκο και διηθείται. Η φύλαξη του γίνεται σε θερμοκρασία δωματίου, προστατευόμενο από το φώς (Bradford, 1976; Bearden, 1978). Για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών χρησιμοποιείται το αντιδραστήριο Bradford σε αναλογία 1:1 με το δείγμα προς μέτρηση, σε συνολικό όγκο 4 ml και μετράται η απορρόφηση στα 595 nm σε πλαστική κυψελίδα. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης γίνεται βάση πρότυπης καμπύλης αναφοράς με γνωστές ποσότητες αλβουμίνης ορού βοδιού (ΒSA). Για την παρασκευή της πρότυπης καμπύλης αναφοράς χρησιμοποιείται διάλυμα αλβουμίνης ορού βοδίου 1 mg/ml σε ποσότητες 0-80 μl. Για τη μέτρηση των εξωκυττάριων και ενδοκυττάριων πρωτεϊνών, το δείγμα προς μέτρηση αποτελείται, από μl εξυκυττάριου εκχυλίσματος και αραιώνεται με δις απιονισμένο νερό μέχρι 2 ml. Η μέθοδος αυτή πλεονεκτεί ως προς την ακρίβεια και την ευαισθησία της, ωστόσο, στην παρουσία απορρυπαντικών και σουλφυδρυλο ομάδων, η μέθοδος δεν είναι αξιόπιστη Προσδιορισμός δραστικότητας λιπάσης Ο προσδιορισμός της δραστικότητας της λιπάσης βασίζεται στην ικανότητα της να υδρολύει τους εστέρας της π-νιτροφαινόλης με λιπαρά οξέα και να ελευθερώνουν π- νιτροφαινόλη, το κίτρινο χρώμα το οποίο ανιχνεύεται φασματοφωτομετρικά στα 410 nm. Η ένταση της απορρόφησης είναι ανάλογη προς την συγκέντρωση της π-νιτροφαινόλης. Η δραστικότητα προσδιορίστηκε φασματοφοτομετρικά χρησιμοποιώντας 2.5 mm (pnpl), διαλυμένο σε αιθανόλη, σε 50 mm φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος ph 7.0 (Sigurgisladottir, 1993). H αντίδραση άρχισε με την προσθήκη μl διαλύματος του ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

170 Καθαρισμός ενζύμων 135 ενζύμου στο αντιδρών μίγμα (συνολικός όγκος 1 ml) και στη συνέχεια επωάστηκε στους 65 ο C για 20 λεπτά. Η αντίδραση σταμάτησε με την προσθήκη 0.25 ml διαλύματος Na 2 CO M, και με φυγοκέντρηση του μίγματος για 10 λεπτά στα 10,000 x g. H τιμή της οπτικής απορρόφησης προσδιορίζεται στα 410 nm. H δραστικότητα της λιπάσης εκφράζεται σε U/mg πρωτεϊνών, οπού ένα U ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που παράγει 1 μmol π- νιτροφενόλης ανά λεπτό σε συγκεκριμένες συνθήκες. Ο μοριακός συντελεστής αποσβέσεως (molar extriction coefficient) (ε) στις συγκεκριμένες συνθήκες αντίδρασης υπολογίστηκε 17.2 mm -1 cm -1, με βάση πρότυπης καμπύλης αναφοράς με γνωστές ποσότητες συγκεντρώσεων π-νιτροφενόλης Επίδραση θερμοκρασίας και ph Η δραστικότητα της μερικώς καθαρισμένης εξωκυττάρια λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB8, δοκιμάστηκε σε διαφορετικές θερμοκρασίες που κυμαίνονταν από τους 30 ο C μέχρι τους 90 ο C. Για τον προσδιορισμό της επίδρασης του ph στην ενζυμική δραστικότητα, χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα για τιμές ph 4-6 οξικού οξέος, για ph φωσφορικών και για τιμές ph Tris-HCl σε συγκέντρωση 50 mm, στο αντιδρόν μίγμα της υδρόλυσης του p-npl. Για τις διαφορετικές συνθήκες αντίδρασης (θερμοκρασία, ph), η ποσότητα π-νιτροφαινόλης που ελευθερώνεται υπολογίζεται από την αντίστοιχη πρότυπη καμπύλη αναφοράς γνωστών συγκεντρώσεων π- νιτροφαινόλης στις αντίστοιχες συνθήκες (1-20 μg/ml σε 50 mm του αντίστοιχου ρυθμιστικού διαλύματος) Επίδραση μεταλλικών ιόντων και αναστολέων στην ενζυμική δραστικότητα Η επίδραση των διαφορετικών μεταλλικών ιόντων και αναστολέων στη δραστικότητα της καθαρισμένης λιπάσης, εξετάστηκε επωάζοντας τα μέταλλα και τους αναστολείς μαζί με το ένζυμο σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 50 mm (ph 7) στους 24 ο C για 10 λεπτά Κινητική εξωκυττάριας λιπάσης Για τον υπολογισμό της κινητικής των ενζύμων, ο προσδιορισμός των σταθερών K m (Michaelis-Menten σταθερά) και v max (μέγιστος ρυθμός αντίδρασης) είναι πολύ σημαντικός. Επειδή όμως το v max είναι η ταχύτητα όταν η συγκέντρωση του υποστρώματος φτάσει στο άπειρο, στην πραγματικότητα δεν μπορεί να προσδιοριστεί με ακρίβεια. Η δυσκολία στο να προσδιοριστεί το v max οδήγησε στη μετατροπή των εξισώσεων Michaelis ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

171 Καθαρισμός ενζύμων 136 Menten σε γραμμική μορφή. Η μέθοδος η οποία είναι η πιο γνωστή είναι του διπλού αντιστρόφου των Linweaver-Burk (Εξίσωση [3.2]). 1 Km + [ S] Km 1 1 = = + [3.2] v v [ S] v [ S] v 0 max max max Όπου: v 0 : Ο ρυθμός αντίδρασης [S]: Συγκέντρωση υποστρώματος K m : Michaelis-Menten σταθερά v max : Ο μέγιστος ρυθμός αντίδρασης Για τον προσδιορισμό του μέγιστου ρυθμού αντίδρασης, πραγματοποιείται μια σειρά από πειράματα με διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος [S] στις οποίες υπολογίζεται ο ρυθμός της αντίδρασης. Στη συνέχεια, οι τιμές των ρυθμών αντίδρασης για τις διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος μπορούν να απεικονιστούν με τη βοήθεια του διπλού αντιστρόφου των Linweaver-Burk, όπου απεικονίζεται το αντίστροφο της συγκέντρωσης ως προς το αντίστροφο του ρυθμού αντίδρασης (Σχήμα 3.2). Οι τιμές των σταθερών Κ m και v max μπορούν να υπολογιστούν απευθείας από το διάγραμμα που σχηματίζεται όπως φαίνεται στο Σχήμα 3.2 Για τον υπολογισμό των κινητικών παραμέτρων K m και v max, το καθαρισμένο ένζυμο επωάστηκε για 20 λεπτά σε 50 mm φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος ph 7.0 και διαφορετικές συγκεντρώσεις p-npl στους 65 ο C. 1 v K m v max 1 K m 0 1 v max Σχήμα 3.2 Διάγραμμα διπλού αντιστρόφου κατά Lineweaver Burk και υπολογισμός των σταθερών Κ m και v max. 1 [ ] S ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

172 Καθαρισμός ενζύμων Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE) Κατά την ηλεκτροφόρηση με αποδιατακτικές συνθήκες, παρουσία SDS (μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου) οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με βάση τη μοριακή τους μάζα (Laemmli, 1970). Το SDS δεσμεύεται με υδρόφοβους δεσμούς στη ραχοκοκαλιά της πολυπεπτιδικής αλυσίδας σε αναλογία 1.4 g ανά g πρωτεΐνης, η οποία δεν εξαρτάται από τη φύση της πρωτεΐνης. Με τον τρόπο αυτό καταστρέφονται οι ανώτερες διαμορφώσεις των πρωτεϊνών και σχηματίζεται ένα σύμπλοκο SDS πρωτεΐνες, αρνητικά φορτισμένο. Το φορτίο του συμπλόκου είναι ανάλογο του μεγέθους της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, όπως ανάλογη είναι και η ηλεκτροφορητική κινητικότητά του. Για τον προσδιορισμό της μοριακής μάζας χρησιμοποιείται μίγμα πρωτεϊνών γνωστής μοριακής μάζας, το οποίο ηλεκτροφορείται μαζί με το δείγμα και το διάγραμμα του λογαρίθμου της μοριακής μάζας συναρτήσει της κινητικότητας των πρωτεϊνών αυτών προσδιορίζεται η μοριακή μάζα του άγνωστου πεπτιδίου. Στα πειράματα χρησιμοποιήθηκε σύστημα ασυνεχές κατά Laemmli (Laemmli, 1970). Για την παρασκευή της πηκτής διαχωρισμού και της πηκτής επιστοίβαξης χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω συγκεντρώσεις: Πηκτή επιστοίβαξης: 6% w/v ακρυλαμίδιο, 0.2 % w/v bis ακριλαμίδιο, 0.5% w/v SDS, M Tris HCl ph 6.8, 0.08 w/v (NH 4 ) 2 S 2 O 8 0.2% v/v και TEMED. Πηκτή διαχωρισμού: 8, 10 ή 12% w/v ακρυλαμίδιο, 0.33% w/v bis ακριλαμίδιο, 0.5 % w/v SDS, M Tris HCl ph 8.9, 0.08% w/v (NH 4 ) 2 S 2 O 8 και 0.2 % v/v TEMED. Διάλυμα επιστοίβαξης των δειγμάτων: 2% v/v SDS, 10% v/v γλυκερόλη, 62.5 mm Tris-HCl ph 6.8, 0.02% w/v κυανούν της βρωμοφαινόλης και 1% v/v β- μερκαπτοαιθανόλη. Στα δείγματα που πρόκειται να ηλεκτροφορηθούν γίνεται προσθήκη διαλύματος επιστοίβαξης σε τελική συγκέντρωση 1Χ (Sambrook et al., 1989) και β- μεκραπτοαιθανόλης σε τελική συγκέντρωση 10%v/v και ακολούθει θέρμανση στους 100 ο C για 3-4 λεπτά με στόχο την πλήρη αποδιάταξη των πρωτεϊνών. Ως διάλυμα ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται το ρυθμιστικό διάλυμα 25 mm Tris-HCl, M γλυκίνη και 0.1% w/v SDS ph 8.3. Η τάση του ρεύματος αρχικά προσαρμόζεται στα 60 V, ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

173 Καθαρισμός ενζύμων 138 μέχρι τα δείγματα να εισέλθουν στην πηκτή διαχωρισμού, ενώ στη συνέχεια αυξάνεται στα 120 V Χρώση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακριλαμιδίου Χρώση με νιτρικό άργυρο Η μέθοδος χρώσης με νιτρικό άργυρο είναι 100 φορές πιο ευαίσθητη από τη βαφή με Coommassie. Στηρίζεται στην αναγωγή των ιόντων Ag + προς μεταλλικό άργυρο, του οποίου το σκούρο χρώμα βάφει τις πρωτεΐνες. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεΐνες στερεώνονται στην πηκτή με διάλυμα 50% v/v μεθανόλης και 12% v/v οξικού οξέος για τουλάχιστον 1 ώρα. Στην συνέχεια ακολούθησαν τρία πλυσίματα της πηκτής, για 15 λεπτά το καθένα, με διάλυμα 50% v/v αιθανόλης, με σκοπό την απομάκρυνση του οξικού οξέος, που επηρεάζει τη μετέπειτα χρήση του θειοθειικού νατρίου. Ακολουθεί ενυδάτωση της πηκτής με εμβάπτιση σε διάλυμα 30% v/v αιθανόλης για τουλάχιστον 20 λεπτά και κατόπιν για 1 λεπτό σε νερό. Η πηκτή στη συνέχεια εμβαπτίζεται για 1 λεπτό σε διάλυμα θειοθειικού νατρίου (0.02% w/v) και αμέσως ακολουθούν τρείς πλύσεις με νερό με διάρκεια 20 λεπτά η κάθε μία, με στόχο την απομάκρυνση της περίσσειας του θειοθειικού νατρίου. Στη συνέχεια, η πηκτή επωάζεται με διάλυμα νιτρικού αργύρου (200 mg AgNO 3 και 75 μl φορμαλδεΰδης σε 100 ml νερού) για 20 λεπτά. Η πιθανή εμφάνιση ασθενούς κίτρινου χρώματος οφείλεται σε παρουσία θειοθειικού νατρίου. Ακολουθούν δυο πλυσίματα των 20 δευτερολέπτων το καθένα και μετά γίνεται η εμφάνιση των ζωνών με εμβάπτιση σε διάλυμα που περιέχει 6% w/v Na 2 CO 3, 0.05% v/v φορμαλδεΰδης και 0.02% w/v θειοθειικό νάτριο μέχρι εμφάνισης των επιθυμητών ζωνών. Η πηκτή ξεπλένεται δυο φορές με νερό, για 2 λεπτά την κάθε φορά, η αντίδραση τερματίζεται με τη προσθήκη διαλύματος 50% v/v μεθανόλης 12% v/v οξικού οξέος. Η πηκτή συντηρείται στους 4 ο C σε υδατικό διάλυμα 50% v/v μεθανόλης για μερικές μέρες (Blum et al., 1987) In situ προσδιορισμός ενζύμων με δράση εστεράσης / λιπάσης Η αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στην ιδιότητα των εστερασών και λιπασών να υδρολύουν το οξικό ναφθαλίνιο με αποτέλεσμα την απελευθέρωση ναφθαλινίου, το οποίο στη συνέχεια δεσμεύει διαζωνικές ενώσεις σχηματίζοντας έγχρωμες ζώνες στην περιοχή που βρίσκεται το ένζυμο (Mastropaolo and Yourno, 1981; Devonshire, 1977). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

174 Καθαρισμός ενζύμων 139 Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε το διπλό με ψευδάργυρο διαζωνιακό άλας 4- αμινο-2,5-διαιθοξυ-ν-φαιλυνοβενζαμίδιο (C 17 H 18 N 3 O 3 Cl 1/2 ZnCl 2 ) η εμπορική ονομασία του οποίου είναι Fast Blue BB. To πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ότι όλη η διαδικασία λαμβάνει χώρα σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου επιτρέποντας τον προσδιορισμό των μοριακών μαζών των ενζύμων με δράση εστεράσης ή λιπάσης. Πιο αναλυτικά τα δείγματα αναμειγνύονται με διάλυμα επιστοίβαξης σε τελική συγκέντρωση 1Χ και SDS σε τελική συγκέντρωση 4% w/v (Fucinos et al., 2005) και στη συνέχεια διαβιβάζονται σε 10% SDS-PAGE. Σημειώνεται ότι στα δείγματα δε γίνεται προσθήκη β-μερκαπτοαιθανόλης ούτε και θερμαίνονται στους 100 ο C πριν την διαβίβαση τους στην πηκτή. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης η πηκτή τοποθετείται σε ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm φωσφορικών (K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 ) ph 7.0, το οποίο περιέχει 0.5% w/v Triton X-100 και επωάζεται για 20 λεπτά στους 65 ο C. Στη συνέχεια η πηκτή τοποθετείται σε δις-απιονισμένο νερό και επωάζεται για 5 λεπτά στην ίδια θερμοκρασία. Τα δυο αυτά στάδια έχουν ως στόχο την απομάκρυνση του SDS και την επαναδιάταξη της δομής των ενζύμων με στόχο να καταστούν και πάλι δραστικά. Τα ένζυμα με δραστικότητα εστεράσης ή λιπάσης ανιχνεύονται μετά από επώαση της πηκτής στους 65 ο C για τουλάχιστον 20 λεπτά σε μίγμα διαλυμάτων Α και Β με αναλογία 1:1, η σύσταση των οποίων περιγράφεται στη συνέχεια (Sztajer et al., 1992). Διάλυμα Α: 50 mg α-οξικού ναφθαλινίου αρχικά διαλύονται σε 5 ml ακετόνης και στη συνέχεια σε 50 ml ρυθμιστικού διαλύματος 100 mμ φωσφορικών ph 8.0. Διάλυμα Β: 50 mg Fast Blue BB διαλύονται 50 ml ρυθμιστικού διαλύματος 100 mm φωσφορικών ph 8.0. Πρέπει να σημειωθεί ότι το διάλυμα Β καθίσταται ασταθές μετά τη πάροδο 30 λεπτών σε αλκαλικά διαλύματα. 3.6 Αποτελέσματα Σχολιασμός Παραγωγή εξωκυττάρια λιπάσης Με σκοπό την κινητική μελέτη της εξωκυττάριας δραστικότητας της λιπάσης, που έχει παραχθεί από τον Thermus thermophilus HB8, ο μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε στο πλούσιο μέσο ανάπτυξης ΜΤ, όπως περιγράφεται στην πειραματική διαδικασία. Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, συλλέχτηκαν δείγματα, τα οποία ύστερα από διαχωρισμό των ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

175 Καθαρισμός ενζύμων 140 κυττάρων από το εξωκυττάριο υγρό, μετρήθηκαν οι παραγόμενες πρωτεΐνες και η ειδική δραστικότητα της λιπάσης. Η παραγωγή των εξωκυττάριων πρωτεϊνών συνεχώς αυξάνεται κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, όπως φαίνεται και στο Σχήμα 3.3. Στο ίδιο Σχήμα, παρουσιάζεται και η ειδική δραστικότητα της λιπάσης σε U/mg πρωτεϊνών, η οποία αυξάνεται σχεδόν γραμμικά κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας μέχρι τις 30 ώρες και στη συνέχεια αρχίζει να μειώνεται. Η μείωση αυτή πιθανώς να οφείλεται σε πρωτεάσες που είναι γνωστό ότι παράγει το συγκεκριμένο βακτήριο (Watanabe et al., 1999). Οπτική πυκνότητα Α600nm O.D. Δραστικότητα λιπάσης Πρωτεΐνες Χρόνος καλλιέργειας (h) Δραστικότητα εξωκυττάριας λιπάσης (U/mg) Πρωτεΐνες (μg/ml) Σχήμα 3.3 Ανάπτυξη βακτηρίου T. thermophilus, παραγωγή εξωκυττάριων πρωτεϊνών και ειδική δραστικότητα εξωκυττάριας λιπάσης. Στη συνέχεια, για την εύρεση του μοριακού βάρους της εξωκυττάριας λιπάσης, το διαχωρισμένο από τα κύτταρα, εξωκυττάριο υγρό, ηλεκτροφορείται υπό μετουσιωμένες συνθήκες και μετά από επαναδιάταξη η δραστικότητα της λιπάσης/εστεράσης εντοπίστηκε με το α-οξικό ναφθαλενίο (α-naphthyl acetate) και το Fast Blue BB όπως περιγράφεται στην πειραματική διαδικασία. Η δραστικότητα της εξωκυττάριας λιπάσης/εστεράσης παρουσιάζεται στο Σχήμα 3.4, όπου διακρίνεται μια έντονη πρωτεϊνική ζώνη στα 56 kda. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

176 Καθαρισμός ενζύμων kda kda Σχήμα 3.4 Εντοπισμός λιπολυτικής δραστικότητας σε SDS-PAGE. Χρώση πηκτής με α- οξικό ναφθαλενίο και Fast Blue BB. Διαδρομή 1: εξωκυττάριο υγρό χωρίς κύτταρα, Διαδρομή 2: Μάρτυρες μοριακής μάζας Μερικώς καθαρισμός εξωκυττάριας λιπάσης Για τον καθαρισμό της εξωκυττάριας λιπάσης του T. thermophilus HB8 χρησιμοποιήθηκαν 4.2 l εξωκυττάριου υγρό από καλλιέργεια πλήρους ανάπτυξης (30 h). Ύστερα από διαχωρισμό των κυττάρων, το εξωκυττάριο υγρό συμπυκνώθηκε με τη χρήση συσκευής Amicon και φίλτρου UM10, περίπου 20 φορές, σε τελικό όγκο 202 ml. Στο παρασκεύασμα αυτό προσδιορίστηκε το ποσό των συνολικών πρωτεϊνών κατά Bradford καθώς και η ενζυμική δραστικότητα λιπάσης. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.4. Πίνακας 3.4 Προσδιορισμός πρωτεϊνών και δραστικότητα λιπάσης ύστερα από συμπύκνωση του εξωκυττάριου υγρού. Συγκέντρωση πρωτεϊνών (mg/ml) Συνολικές πρωτεΐνες (mg) 142 Δραστικότητα λιπάσης (U/ml) ± 0.02 Ειδική δραστικότητα (U/mg) 0.33 Συνολική δραστικότητα (U) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

177 Καθαρισμός ενζύμων 142 Καθαρισμός κατακρήμνιση πρωτεϊνών Στο συμπυκνωμένο διάλυμα, ακολούθησε σταδιακή κατακρήμνιση με άλας θειικού αμμωνίου ((ΝΗ 4 ) 2 SO 4 ), με αρχικό ποσοστό κορεσμού 0 50% w/v, στους 4 o C υπό συνεχή ανάδευση. Το παρασκεύασμα συγκεντρώθηκε στα 17,000 x g για 20 λεπτά και στο υπερκείμενο προστέθηκε (ΝΗ 4 ) 2 SO 4 ώστε το ποσοστό κορεσμού να γίνει 50 90% w/v. Ακολούθησε νέα φυγοκέντριση υπό τις ίδιες συνθήκες και τέλος τα δύο ιζήματα αφού διαλυτοποιήθηκαν σε 35 και 45 ml, αντίστοιχα, διαπιδύθηκαν σε 50 mm ρυθμιστικoύ διαλύματος φωσφορικών ph 7. Τα αποτελέσματα του προσδιορισμού των πρωτεϊνών και της ενζυμικής δραστικότητας της λιπάσης παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.5. Πίνακας 3.5 Προσδιορισμός πρωτεϊνών και δραστικότητα λιπάσης ύστερα από κατακρήμνιση πρωτεϊνών με θειικό αμμώνιο. Κορεσμός (% w/v) Συγκέντρωση πρωτεϊνών (mg/ml) Συνολική πρωτεΐνη (mg) Δραστικότητα λιπάσης (U/ml) 0.85 ± ± Συνολική δραστικότητα U Ειδική δραστικότητα (U/mg) Όγκος (ml) Στη συνέχεια, στο κλάσμα κορεσμού 0 50% w/v, όπου παρουσίασε ενζυμική δραστικότητα, προστέθηκαν σταδιακά 2 όγκοι (70 ml) παγωμένης αιθανόλης και αφού παρέμεινε το δείγμα υπό ανάδευση στους 4 o C για 30 min, φυγοκεντρίθηκε στα 17,000 x g για 20 λεπτά. Το ίζημα διαλυτοποιήθηκε σε 30 ml και διαπιδύθηκε σε 50 mm ρυθμιστικoύ διαλύματος φωσφορικών ph 7.0. Ο προσδιορισμός των πρωτεϊνών και της ενζυμικής δραστικότητας της λιπάσης φαίνονται στον Πίνακα 3.6 Επειδή οι δραστικότητες λιπάσης τόσο στο ίζημα όσο και στο υπερκείμενο ήταν παραπλήσιες, αλλά η ειδική και η συνολική δραστικότητα της λιπάσης στο υπερκείμενο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

178 Καθαρισμός ενζύμων 143 της κατακρήμνισης με αιθανόλη ήταν αρκετά μεγαλύτερη απ ότι στο ίζημα, ο καθαρισμός συνεχίστηκε με το υπερκείμενο υγρό. Πίνακας 3.6 Προσδιορισμός πρωτεϊνών και δραστικότητα λιπάσης ύστερα από κατακρήμνιση πρωτεϊνών με αιθανόλη στο ίζημα και στο υπερκείμενο. Ίζημα Υπερκείμενο Συγκέντρωση πρωτεϊνών (mg/ml) Συνολική πρωτεΐνη (mg) Δραστικότητα λιπάσης (U/ml) 0.13 ± ± 0.01 Συνολική δραστικότητα U Ειδική δραστικότητα (U/mg) 0.12 U 2.32 Όγκος (ml) Καθαρισμός με στήλη χρωματογραφίας Για τον καλύτερο καθαρισμό της εξωκυττάριας λιπάσης, το υπερκείμενο υγρό μετά την κατακρήμνιση με αιθανόλη, διαβιβάστηκε με ροή 0.2 ml/min σε στήλη χρωματογραφίας βουτυλ-σεφαρόζης (21x2.6 cm). Η στήλη χρωματογραφίας είχε πρώτα εξισορροπηθεί με 50 mm ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών ph 7.0. Στη συνέχεια, ακολούθησε πλύση της στήλης με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα (150 ml) και έκλουση των δεσμευμένων σε αυτή πρωτεϊνών με διαβαθμισμένη συγκέντρωση 0 1 Μ NaCl όγκου 100 ml. Ο όγκος κάθε κλάσματος που συλλέχθηκε ήταν 1 ml. Στα κλάσματα της στήλης προσδιορίστηκε η απορρόφηση στα 280 nm, για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών και την ενζυμική δραστικότητα της λιπάσης (Σχήμα 3.5). Στο Σχήμα 3.5 τα πρώτα κλάσματα της στήλης αντιστοιχούν στις πρωτεΐνες που δε δεσμεύτηκαν στη στήλη χρωματογραφίας και απομακρύνθηκαν κατά τη διάρκεια της πλύσης με το ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών. Η έκλουση της στήλης με διαβαθμισμένη συγκέντρωση NaCl σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ξεκίνησε όταν απομακρύνθηκαν όλες οι πρωτεΐνες που δε δεσμεύτηκαν στη ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

179 Καθαρισμός ενζύμων 144 στήλη χρωματογραφίας. Το σημείο αυτό αντιστοιχεί στο κλάσμα 150 της στήλης και στο Σχήμα 3.5 δηλώνεται με το βέλος. Απορρόφηση (280 nm) 3.0 Απορρόφηση Δραστικότητα έκλουση Δραστικότητα Λιπάσης (U) Αριθμός Κλασμάτων 0 Σχήμα 3.5 Προσδιορισμός πρωτεϊνών με απορρόφηση στα 280 nm και ενζυμική δραστικότητα της λιπάσης των κλασμάτων της στήλης χρωματογραφίας. Με το βέλος δηλώνεται το σημείο έναρξης της έκλουσης με το διαβαθμισμένο διάλυμα NaCl. Στη συνέχεια, τα κλάσματα 178 της στήλης ως 190, που αντιστοιχούν στα κλάσματα που εμφάνισαν δραστικότητα, συλλέχθηκαν και ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 10% w/v παρουσία αποδιατακτικών συνθηκών (SDS-PAGE) για να ελεγχθεί η καθαρότητα της λιπάσης. Η εικόνα που λάβαμε μετά από χρώση της πηκτής με νιτρικό άργυρο δίνεται στο Σχήμα 3.6. Παρατηρούμε ότι ο καθαρισμός της λιπάσης είναι ιδιαίτερα ικανοποιητικός αφού εμφανίζεται μόνο μια ζώνη στα 56 kda, παρά τη μικρή δραστικότητα που παρουσίασε. Όπως αναφέρθηκε και στην Παράγραφο με τη τεχνική του in-situ προσδιορισμού εστερασών/λιπασών, ανιχνεύτηκε ένα ένζυμο με αντίστοιχο μοριακή μάζα στο εξωκυττάριο υγρό της καλλιέργειας του Thermus thermophilus. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

180 Καθαρισμός ενζύμων 145 kda Καθαρισμένη εξωκυττάρια λιπάση (56 kda) 27 Σχήμα 3.6 SDS-ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και χρώση με AgNO 3, της μερικώς καθαρισμένης εξωκυττάριας λιπάσης. Διαδρομές: 1: Μάρτυρες μοριακής μάζας, 2: αρχικό εξωκυττάριο εκχύλισμα, 3: μερικώς καθαρισμένη λιπάση. Η μοριακή μάζα των λιπασών που προέρχονται από βακτήρια, ποικίλουν σημαντικά σε μέγεθος, καθώς έχουν αναφερθεί λιπάσες από kda. (Jaeger et al.,1994; Arpigny et al, 1999). Για παράδειγμα, η καθαρισμένη εξωκυττάρια λιπάση του Pseudomonas sp. είναι μια πρωτεΐνη με μοριακή μάζα 35 kda (Kordel et al., 1991), ενώ η λιπάση από το θερμόφιλο Geobacillus stearothermophilus έχει μοριακή μάζα 61 kda (Sifour et al., Επίσης, έχει αναφερθεί η παραγωγή δύο εξωκυττάριων λιπασών από τον Thermus thermophilus HB27 με μοριακή μάζα 62 και 34 kda, οι οποίες έχουν καθαριστεί και χαρακτηριστεί (Fucinos et al., 2005). Στον Πίνακα 3.7, παρουσιάζεται το πρωτόκολλο καθαρισμού της εξωκυττάριας λιπάσης. Όπως διαπιστώνεται από τον πίνακα, ο τελικός καθαρισμός είναι αρκετά ικανοποιητικός, καθώς το ένζυμο καθαρίστηκε 29 φορές με απόδοση 21.58%. Επίσης, η συνολικές πρωτεΐνες ήταν 0.15 mg με δραστικότητα U/mg. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

181 Καθαρισμός ενζύμων 146 Πίνακας 3.7 Πρωτόκολλο καθαρισμού της εξωκυττάριας λιπάσης σε στήλη βουτυλσεφαρόζης. Βήματα Καθαρισμού Συμπύκνωση με συσκευή Amicon Συνολικές πρωτεΐνες (mg) Συνολική δραστικότητα (U) Ειδική δραστικότητα (U/mg) Καθαρισμός (Φορές) Απόδοση (%) Καθίζηση με θειικό αμμώνιο Καθίζηση με αιθανόλη Χρωματογραφία σε Βουτυλ- σεφαρόζης Επίδραση του ph στη δραστικότητα της εξωκυττάριας λιπάσης Η επίδραση του ph στη δραστικότητα της λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus εξετάστηκε σε εύρος από 4.0 μέχρι 9.0 χρησιμοποιώντας το p-npl ως υπόστρωμα στους 70 o C. Ο τρόπος μέτρησης της δραστικότητας περιγράφεται στη πειραματική διαδικασία (Παράγραφος 3.5.8), χρησιμοποιώντας διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα για τη ρύθμιση της επιθυμητής τιμής ph. Όπως διαπιστώνεται από το Σχήμα 3.7 το καθαρισμένο ένζυμο ήταν πιο δραστικό σε ph που κυμαίνοντας από 6 9, ενώ η μέγιστη δραστικότητα παρουσιάστηκε σε τιμή ph 7.0. Επίσης, σε βασικό περιβάλλον (ph 9.0) το ένζυμο διατήρησε το 75% της μέγιστης δραστικότητας του. Οι περισσότερες μικροβιακές λιπάσες συνήθως είναι πιο δραστικές σε βασικό ph, ωστόσο, η λιπάση από το βακτήριο T. thermophilus HB8 είναι δραστική σε ένα μεγάλο εύρος ph, από ουδέτερο μέχρι πολύ βασικό. Η λιπάση από το θερμόφιλο Bacillus sp LBN 4, παρουσίασε τη μέγιστη δραστικότητα σε ph 8 (Limpon Bora et al., 2007), καθώς και η λιπάση από τα βακτήρια Bacillus thermocatenulatus και Bacillus strain 398 εμφάνισαν την μέγιστη ενζυμική δραστικότητα σε ph και ph 8.2 αντίστοιχα (Schmidt-Dannert et al., 1996; Kim et al., 1994). Επίσης, οι δυο εξωκυττάριες λιπάσες από το βακτήριο Thermus thermophilus HB27, σε τιμές ph η ενζυμική δραστικότητα δεν εμφάνισε μεταβολές, όμως η δραστικότητα συνέχισε να αυξάνεται καθώς το ph γινόταν πιο αλκαλικό (Fucinos et al., 2005). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

182 Καθαρισμός ενζύμων 147 Ειδική Δραστικότητα Λιπάσης (%) ph Σχήμα 3.7 Επίδραση του ph στην εξωκυττάρια δραστικότητα της μερικώς καθαρισμένης λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus Επίδραση θερμοκρασίας στην εξωκυττάρια δραστικότητα της λιπάσης Για τη μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας στη δραστικότητα της εξωκυττάριας καθαρισμένης λιπάσης το ένζυμο υποβλήθηκε σε θερμοκρασίες o C. Ο τρόπος μέτρησης της δραστικότητας περιγράφεται στην πειραματική διαδικασία (Παράγραφος 3.5.8). Όπως διαπιστώνεται από το Σχήμα 3.8, η υψηλότερη ενζυμική δραστικότητα παρατηρείται στου 70 ο C, ενώ όσο μειώνεται η θερμοκρασία επώασης η λιπάση χάνει αρκετή από τη δραστικότητα της με αποτέλεσμα στους 30 o C, να διατηρεί μόνο το 30% της μέγιστης δραστικότητάς της. Επίσης, στο ίδιο σχήμα παρατηρείται ότι στους 90 ο C βαθμούς επώασης η μερικώς καθαρισμένη λιπάση διατηρεί το 80% της μέγιστης δραστικότητάς της, δηλώνοντας την υψηλή θερμοανθεκτικότητα του ενζύμου. Επιπλέον, η μερικώς καθαρισμένη λιπάση επωάστηκε στους 80, 90 και 100 ο C σε συγκέντρωση 100 μg/ml και πραγματοποιήθηκε σύγκριση της δραστικότητας πριν και μετά την επώαση. Το ένζυμο διατήρησε σχεδόν 100% της δραστικότητάς της όταν επωάστηκε στους 80 ο C για 6 ώρες και στους 90 ο C για 3 ώρες, επιβεβαιώνοντας την υψηλή θερμοανθεκτικοτητά της. Στους 100 ο C βαθμούς επώασης έπειτα από 62 (±5) λεπτά απέμεινε η μισή δραστικότητά της μερικώς καθαρής λιπάσης σε σχέση με την αρχική. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

183 Καθαρισμός ενζύμων Ειδική Δραστικότητα Λιπάσης (%) Θερμοκρασία ( o C) Σχήμα 3.8 Επίδραση θερμοκρασίας στην εξωκυττάρια δραστικότητα της μερικώς καθαρισμένης λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus. Παρόμοια συμπεριφορά παρουσιάζει και η μερικώς καθαρισμένη λιπάση από το βακτήριο T. thermophilus HB27, η οποία εμφανίζει στους 80 o C βέλτιστη θερμοκρασία αντίδρασης και μεγάλη θερμοανθεκτικότητα (Fucinos et al., 2005). Επίσης, η καθαρισμένη θερμόφιλη λιπάση από τον μικροοργανισμό B. thermocatenulatus, παρουσιάζει ένα εύρος βέλτιστης θερμοκρασίας αντίδρασης από τους o C (Rua et al., 1997) Επίδραση μεταλλικών ιόντων και αναστολέων στη δραστικότητα της εξωκυττάριας λιπάσης Οι λιπάσες, γενικά, επηρεάζονται από την παρουσία μεταλλικών ιόντων, ακόμα και σε μικρή συγκέντρωση, ενώ αρκετές λιπάσης έχουν αναφερθεί ότι χρειάζονται κάποια μέταλλα για να δράσουν ή και να ενισχύσουν τη δραστικότητα και τη θερμοανθεκτικότητα τους (Nardini et al., 2000; Tyndall et al., 2002). Με σκοπό την ενίσχυση της δραστικότητας της λιπάσης μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων μεταλλικών ιόντων και αναστολέων που έχουν βρεθεί ότι αυξάνουν τη δράση της λιπάσης. Στον Πίνακα 3.8, παρουσιάζονται όλα τα ιόντα και οι αναστολείς που μελετήθηκαν, τη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκαν και πώς επηρέασαν την δραστικότητα της καθαρισμένης λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus. Αρχικά ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

184 Καθαρισμός ενζύμων 149 μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων μετάλλων και όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.8, η παρουσία των Na + και Mn 2+, δεν επηρέασαν ιδιαίτερα τη δραστικότητα του ενζύμου, ανεξαρτήτως από τη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκαν. Ωστόσο, η παρουσία 1, 5 ή 10 mm των δισθενών ιόντων Mg 2+, Ca 2+ και Hg 2+, καθώς και η παρουσία των Fe 3+ και Al 3+, ενίσχυσαν της δραστικότητα της λιπάσης, με την προσθήκη των Hg 2+, να επιφέρει τη μεγαλύτερη αύξηση της δραστικότητας. Από τον Πίνακα 3.8, επίσης, μπορεί να διακριθεί ότι η παρουσία των ιόντων Zn 2+ και Co 2+ είναι ανασταλτική για την δραστικότητα της λιπάσης καθώς τη μείωσε στο μισό και αυξάνοντας τη συγκέντρωση των ιόντων παρατηρείται περισσότερη μείωση της. Παρόμοια αποτελέσματα παρουσιάστηκαν και στην περίπτωσης της λιπάσης από τον Bacillus coagulans, όπου η προσθήκη ιόντων Hg 2+, ενίσχυσαν τη δραστικότητα της και τα ιόντα Zn 2+ και Co 2+ είχαν ανασταλτική επίδραση στην ενζυμική δραστικότητα. Επίσης, η δραστικότητα της λιπάση από τον ίδιο μικροοργανισμό, ενισχύθηκε στην παρουσία 1mM των ιόντων Mg 2+, Cu 2+, Ca 2+, Al 3+ και Fe 3+ (Kanwar et al., 2006). Στον Πίνακα 3.9 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα τη επίδραση διαφόρων αναστολέων στη δραστικότητα της μερικώς καθαρισμένης λιπάσης. Όπως φαίνεται στον πίνακα, η δραστικότητα της λιπάσης αναστάλθηκε πλήρως στην παρουσία των αναστολέων εστερασών σερίνης φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF) και EDTA σε υψηλές συγκεντρώσεις (20 mm). Η αναστολή της μερικώς καθαρισμένης λιπάσης από το PMSF δηλώνει ότι το ένζυμο είναι μια τυπική λιπάση όπου η καταλυτική της δράση είναι δράση πρωτεάσης σερίνης. Παρόμοια συμπεριφορά στην παρουσία PMSF εμφάνισαν και οι λιπάσες των μικροοργανισμών B. coagulans και P. aeroginosa όπου η αναστολή ήταν πλήρης, ενώ η λιπάση από το μικροοργανισμό P. cepacia στην παρουσία του PMSF εμφάνισαν μερική αναστολή της δραστικότητας τους. Αρκετές λιπάσες στην παρουσία του PMSF δείχνουν διαφορετικό βαθμό αναστολής, πιθανός λόγο διαφορετικότητας της δομής τους (Kanwar et al., 2005). Επιπροσθέτως, η παρουσία του EDTA σε υψηλές συγκεντρώσεις είχε ανασταλτική επίδραση στην καθαρή λιπάση από τον B. coagulans (Kanwar et al., 2005). Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση μη ιονικών απορρυπαντικών στην ενζυμική δραστικότητα. Όπως διαπιστώνεται από τον Πίνακα 3.9, η προσθήκη 0.1% (v/v) των μηιονικών απορρυπαντικών Triton X-100, Tween 20 και Τween 80, κατέληξε σε μικρή αναστολή της δραστικότητας της λιπάσης από τον Thermus thermophilus HB8. Μικρή αναστολή της ενζυμικής δραστικότητας στην παρουσία μη ιονικών απορρυπαντικών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

185 Καθαρισμός ενζύμων 150 επίσης έχει παρατηρηθεί στην περίπτωση των εξωκυττάριων λιπασών από τους μικροοργανισμούς G. stearothermophilus strain-5 (Sifour et al., 2010) και B. coagulans (Kanwar et al., 2005). Πίνακας 3.8 Επίδραση διαφορετικών ιόντων στη μερικώς καθαρισμένη εξωκυττάρια λιπάση. Προσθήκη Συγκέντρωση Δραστικότητα (%) Καμία NaCl 1 mm 101 5» » 105 ZnCl 2 1» 56 5» 32 10» 17 CaCl 2 1» 108 5» » 131 MgCl 2 1» 107 5» » 109 MnCl 2 1» 100 5» » 107 HgCl 2 1» 115 5» » 142 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

186 Καθαρισμός ενζύμων 151 Προσθήκη Συγκέντρωση Δραστικότητα (%) CoCl 2 1» 54 5» 45 10» 43 FeCl 3 1» 109 5» » 115 AlCl 3 1» 117 5» » 116 Πίνακας 3.9 Επίδραση διαφορετικών αναστολέων ή απορρυπαντικών στη μερικώς καθαρισμένη εξωκυττάρια λιπάση Προσθήκη Συγκέντρωση Δραστικότητα (%) PMSF 10» 43 15» 12 20» 0 EDTA 10» 55 15» 23 20» 5 Tween % (v/v) 85 Tween % (v/v) 98 Triton X % (v/v) 86 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

187 Καθαρισμός ενζύμων Εξειδίκευση υποστρώματος εξωκυττάριας λιπάσης. Για τον προσδιορισμό της εξειδίκευσης του υποστρώματος και την εκλεκτικότητα της ανθρακικής αλυσίδας, χρησιμοποιήθηκε μια ποικιλία από εστέρες π-νιτροφαινόλης. O προσδιορισμός έγινε φασματοφωτομετρικά, χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο δραστικότητας της λιπάσης, με τη διαφορά ότι εκτός από το p-npl χρησιμοποιήθηκαν στη θέση του τα υποστρώματα p-npb και p-npo. Όπως διακρίνεται στο Σχήμα 3.9, η μερικώς καθαρισμένη λιπάση από το βακτήριο T thermophilus έχει υψηλή εξειδίκευση έναντι σε εστέρες με μεγάλες ανθρακικές αλυσίδες (p-npl) ενώ η εξειδίκευση για τους εστέρες με μεσαίες (p-npb) και μικρές (p-npo) ανθρακικές αλυσίδες ήταν πολύ μικρότερη. 45 Δραστικότητα της Λιπάσης (U/l) C4 (pnpb) C8 (pnpo) C12(pNPL) Υπόστρωμα Σχήμα 3.9 Εξειδίκευση υποστρώματος μερικώς καθαρισμένης λιπάσης του T. thermophilus. Παρόμοια επιλεκτική εξειδίκευση για υποστρώματα με μεγάλη ανθρακική αλυσίδα έδειξαν και οι λιπάσες από τον B. coagulans BTS-3 (Kumar et al., 2005) και από το θερμόφιλο Bacillus sp. (Nawani et al., 2000). Ωστόσο, η καθαρισμένη λιπάση από τον B. coagulans έδειξε υψηλή εξειδίκευση σε εστέρες με μεσαίο μήκος ανθρακικής αλυσίδας (Kanwar et al., 2006), ενώ η λιπάση από την Pseudomonas sp. εμφάνισε την υψηλότερη δραστικότητα σε ομάδες ακυλίων C-10 εστέρων π-νιτροφαινόλης (Rashid et al., 2001). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

188 Καθαρισμός ενζύμων Κινητική μερικώς καθαρισμένης εξωκυττάριας λιπάσης Με σκοπό να μελετηθεί η κινητική της εξωκυττάριας λιπάσης, μετρήθηκε η δραστικότητα του ενζύμου σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος p-npl. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3.10, ο ρυθμός της υδρόλυσης της p-npl είναι γραμμικός μέχρι τα 2.5 mm, ενώ μέχρι τα 4 mm, δεν παρατηρείται αύξηση του ρυθμού υδρόλυσης του υποστρώματος Δραστικότητα της λιπάσης (U/ml) Συγκέντρωση pnpl (mm) Σχήμα 3.10 Μεταβολή της δραστικότητας της μερικώς καθαρισμένης εξωκυττάριας λιπάσης σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος (pnpl). Με τη βοήθεια της μεθόδου του διπλού αντιστρόφου κατά Lineweaver Burk (Σχήμα 3.11) προσδιορίστηκε η σταθερά Michaelis-Menten (K m ) του ενζύμου καθώς και η μέγιστη ταχύτητα της αντίδρασης (v max ). Οι τιμές K m και v max που υπολογίστηκαν για τη μερικώς καθαρισμένη λιπάση είναι 1mM και U/ml/min αντίστοιχα. Το Km της μερικώς καθαρισμένης λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus είναι αρκετά χαμηλότερο σε σχέση με αυτό του ενζύμου που προέρχεται από τον Bacillus coagulans (18 mm) (Kanwar et al., 2006). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

189 Καθαρισμός ενζύμων /v (Units/ml) /S (mm) -1 Σχήμα 3.11 Καμπύλη διπλού αντιστρόφου κατά Lineweaver Burk της λιπάσης. 3.7 Συμπεράσματα Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν ο καθαρισμός και ο χαρακτηρισμός της εξωκυττάριας παραγόμενης λιπάσης από το βακτήριο T. thermophilus HB8. H λιπάση καθαρίστηκε 29 φορές διατηρώντας το 21.58% της αρχικής της δραστικότητας, με τη βοήθεια δυο τεχνικών καθίζησης πρωτεϊνών (με θειικό αμμώνιο και με αιθανόλη), και με στήλη χρωματογραφίας βουτυλ-σεφαρόζης. Η εξωκυττάρια λιπάση που παράγεται έχει μοριακό βάρος 56 kda, και αποδίδει τη μέγιστη δραστικότητα της σε θερμοκρασία 70 o C, ph 7.0 και υπόστρωμα p-npl. Επίσης, η δραστικότητα της ενισχύεται στην παρουσία των δισθενών μετάλλων Mg 2+, Ca 2+ και Hg 2+, καθώς και στην παρουσία των Fe 3+ και Al 3+. Αυτά τα βιοχημικά χαρακτηριστικά της λιπάσης δηλώνουν ότι έχει κοινές ιδιότητες με άλλες λιπάσες που έχουν καθαριστεί από άλλα βακτήρια. Λόγω της θερμοανθεκτικοτητάς της, η εξωκυττάρια λιπάση που παράγεται από το βακτήριο T. thermophilus HB8, μπορεί να θεωρηθεί ένας καλός καταλύτης για αρκετές βιομηχανικές διεργασίες, όπου εφαρμόζονται υψηλές θερμοκρασίες και ακραίες συνθήκες. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

190 Καθαρισμός ενζύμων 155 Βιβλιογραφία 3 ου Κεφαλαίου Abdou A.M., J Dairy Sci, 86(1), , (2003). Aguilar C.N., Torres E.F., Gonzalez G.V., Augur C., Appl. Biochem. Biotechnol., 102, , (2002). Ahmed E.H., Raghavendra T., Madamwar D., Appl. Biochem. Biotechnol., 160, , (2009). Ahmed E.H., Raghavendra T., Madamwar D., Bioresour. Technol., 101, , (2010). Akbari N., Khajeh K., Rezaie S., Mirdamadi S., Shavandi M., Ghaem N., Protein Expr. Purif., 70, 75-80, (2010). Amoozegar M.A., Salehghamari E., Khajeh K., Kabiri M., Naddaf S., J Basic Microbiol, 48(3), 160 7, (2008). Andersson R.E., Hedlund G.B., Jensson V., J Dairy Sci, 62, , (1979). Angultra J., Rodrigue Z., Aparicio LB., Naharrao G., Appl Environ Microbiol, 59, , (1993). Arpigny J.L., Jaeger K.E., Biochem. J., 343, , (1999). Bearden J.C., Biochim. Biophys. Acta., 553, , (1978). Blum H., Beir H., Gross H.J., Electrophoresis, 8, 93-99, (1987). Bompensieri S., Gonzalez R., Kok R., Miranda M.V., Nutgeren-Eoodzant I., Hellingwerf K.J., Cascone O., Nudel B.C., Biotechnol Appl Biochem, 23, 77 81, (1996). Bora L., Kalita M.C., Production and optimization of thermostable lipase from a thermophilic Bacillus sp LBN 4. The Internet Journal of Microbiology, 4(1), (2007). Bradford M.M, Anal. Biochem., 72, , (1976). Bradoo S., Saxena R.K., Gupta R., World J Microbiol Biotechnol, 15, 87 91, (1999). Cadirci B.H., Yasa I., J. Mol. Catal. B. Enz., 64, , (2009). Cambau B., Klibanov A.M., J Am Chem Soc, 106, , (1984). Castro M.J.M., Cabral J.M.S., Biotechol Adv, 6, , (1988). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

191 Καθαρισμός ενζύμων 156 Chahinian H., Vanot G., Ibrik A., Rugani N., Sarda L., Comeau L.C., Biosci Biotechnol Biochem, 62, 15 22, (2000). Chakraborty K., Paulraj R., Food Chem., 109, , (2008). Chartrain M., Katz L., Marcin C., Thien M., Smith S., Fisher F., Goklen K., Salmon P., Brix T., Price K., Greasham R., Enzyme Microb Technol, 15, , (1993). Chisti Y. Strategies in downstream processing. In: Subramanian G, editor. Bioseparation and bioprocessing: a handbook, vol. 2. New York: Wiley-VCH, pp. 3 30, (1998). Choo D.W., Kurihara T., Suzuki T., Soda K., Esaki N., Appl Environ Microbiol, 64(2), , (1998). Costa M.A., Peralta R.M., J Basic Microbiol, 39, 11 5, (1999). Davranov K., Appl Biochem Microbiol, 30, , (1994). Demir B.S., Tukel S.S., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 64, , (2010). Devonshire A.L., Biochem. J., 167, , (1977). Dharmsthiti S., Ammaranond P., Biotechnol Appl Biochem, 26, 111 6, (1997). Dharmsthiti S., Kuhasuntisuk B., J Ind Microbiol Biotechnol, 21, 75 80, (1998). Dharmsthiti S., Luchai S., FEMS Microbiol Lett, 179, , (1999). Diogo M.M., Silva M.M., Cabral J.M., Queiroz J.A., J Chromatogr A, 849, 413 9, (1999). Dizge N., Aydiner C., Imer D.Y., Bayramoglu M., Tanriseven A., Keskinler B., Bioresour. Technol., 100, , (2009). Dong H., Gao S., Han S., Cao S., Appl Microbiol Biotechnol, 30, , (1999). Dutta S., Ray L., Appl. Biochem. Biotechnol., 159, , (2009). Fickers P., Ongena M., Destain J., Weekers F., Thonart P., Enzyme Microb.Technol., 38, , (2006). Fox P.F., Stepaniak L., J Dairy Res, 50, 77 89, (1983). Fucinos P., Abidin C.M., Sanroman A., Longo M.A., Pastrana L., Rua M.L., J. Biotechnol., 117, , (2005). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

192 Καθαρισμός ενζύμων 157 Fullbrook P.D., Practical applied kinetics. In: Godfrey T, West S, editors. Industrial enzymology. 2nd ed. New York: Stockton Press, pp , (1996). Gilbert E.J., Cornish A., Jones C.W., J Gen Microbiol, 137, , (1991b). Gilbert E.J., Drozd J.W., Jones C.W., J. Gen. Microbiol., 137, , (1991a). Godfrey T., West S., The application of enzymes in industry. In: Godfrey T, Reichelt J (eds) Industrial enzymology, 2nd edn. The Nature Press, New York, p. 512, (1996). Guit R.P.M., Kloosterman M., Mindersma G.W., Mayer M., Meijer E.M., Biotechnol Bioeng, 38,727 32, (1991). Gupta R., Gupta N., Rathi P., Appl Microbiol Biotechnol, 64, , (2004). Hames B. D. and Rickwood D., Gel electrophoresis. A practical approach, IRL Press, Oxford Washington D. C., (1985). Hasan F., Shah A. A., Hameed A., Biotechnology Advances, 27, , (2009). Hasan F., Shah A.A., Abul-Hameed A., Ann Microbiol, 56(3), , (2006). Hassing G.S., Biochem Biophys Acta, 242, 331, (1971). Hatzinikolaou D.G., Kourentzi E., Stamatis H., Christakopoulos P., Kolisis F.N., Kekos D., Macris B.J., J Biosci Bioeng, 88, 53 6, (1999). Hiol A., Jonzo M.D., Rugani N., Druet D., Sarda L., Comeau L.C., Enzyme Microb Technol, 26, , (2000). Ibrik A., Chahinian H., Rugani N., Sarda L., Comeau L.C., Lipids, 33, , (1998). Jaeger K.E., Ransac S., Dijkstra B.W., Colson C., Vanheuvel M., Misset O., FEMS Microbiol. Rev., 15, 29-63, (1994). Kamini N.R., Fujii T., Kurosu T., Iefuji H., Process Biochem, 36, , (2000). Kanwar L., Goswami P., Enzyme Microb. Technol., 31, , (2002). Kanwar S.S., Ghazi I.A., Chimni S.S., Joshi G.K., Rao G.V., Kaushal R.K., Gupta R., Punj V., Protein Expr. Purif., 46, , (2006). Kanwar S.S., Kaushal R.K., Gupta R., Chimni S.S., Indian J. Biochem. Biophys., 42, , (2005). Kar M.K., Ray L., Chattopadhyay P., Indian J Exp Biol, 34, 535 8, (1996). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

193 Καθαρισμός ενζύμων 158 Kasana R.C., Kaur B., Yadav S.K., J Basic Microbiol, 48 (3), , (2008). Khyami-Horani H., World J Microbiol Biotechnol, 12, , (1996). Kim E.K., Song M.H., Kim H.M., Oh T.K., Biosci Biotechnol Biochem, 58, , (1994). Kim H.K., Choi H.J., Kim M.H., Oh T.K., Biochim. Biophys. Acta., 1583, , (2002). Kim H.K., Lee J.K., Kim H., Oh T.K., FEMS Microbiol Lett, 135, , (1996). Kojima Y., Yokoe M., Mase T., Biosci Biotechnol Biochem, 58, , (1994). Kok R.G., Thor J.J.V., Roodzant I.M.N., Brouwer M.B.W., Egmond M.R., Nudel C.B., Vosman B., Hellingwer K.J., Mol Microbiol, 15, , (1995). Kordel M., Hofmann B., Schomburg D., Schmid R.D., J. Bacteriol., 173, , (1991). Kumar S., Kikon K., Upadhyay A,. Kanwar S.S., Gupta R., Protein Expr Purif, 41(1), 38 44, (2005). Kumura H., Mikawa K., Saito Z., Milchwissenschaft-Milk Sci Int, 48, 431 4, (1993). Laemmli U.K., Nature, 227, , (1970). Lanser A.C., Manthey L.K., Hou C.T., Curr Microbiol, 44, , (2002). Lavayre J., Verrier J., Baratti J., Biotechnol Bioeng, 24, , (1982). Lee D.W., Kim H.W., Lee K.W., Kim B.C., Choe E.A., Enzyme Microb. Technol., 29, , (2001). Lee O.W., Koh Y.S., Kim K.J., Kim B.C., Choi H.J., Kim D.S., Suhartono M.T., Pyun Y.R., FEMS Microbiol Lett, 179, , (1999). Lee S,Y,, Rhee J,S., Enzyme MicrobTechnol, 15, , (1993). Lesuisse E., Schanck K., Colson C., Eur J Biochem, 216, , (1993). Lianghua T., Liming X., Applied Biochem. Biotechnol., 125, , (2005). Limpon Bora, Kalita M.C., Production and Optimization of Thermostable lipase from a Thermophilic Bacillus sp LBN 4. The Internet Journal of Microbiology. 4, Number 1 (2007). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

194 Καθαρισμός ενζύμων 159 Lin S.F., Chiou C.M., Yeh C.M., Tsai Y.C., Appl Environ Microbiol, 62, , (1996). Lineweaver H., Burk D., J. Am. Chem. Soc., 56, , (1934). Litthauer D., Ginster A., Skein E.V.E., Enzyme Microb Technol, 30, , (2002). Lopes M., Gomes N., Goncalves C., Coelho M.A.Z., Mota M., Belo I., Lett. Appl. Microbiol., 46, , (2008). Lotrakul P., Dharmsthiti S., J Biotechnol, 54, , (1997). Macrae A.R., Hammond R.C., Biotech Genet Eng Rev, 3, , (1985). Maia M.M., Heasley A., Camargo de Morais M.M., Melo E.H., Morais Jr. M.A., Ledingham W.M., Bioresour Technol, 76, 23 7, (2001). Malcata F.X., Reyes H.R., Garcia H.S., Hill C.G., Amundson C.H., Enzyme Microb Technol, 14, , (1992). Mase T., Matsumiya Y., Akiba T., Biosci Biotechnol Biochem, 59, 1771, (1995). Mastropaolo W. and Yourno J., Anal. Biochem., 115, , (1981). Misset O., Gerritse G., Jaeger K.E., Winkler U., Colson C., Schanchk K., Lesuisse E., Dartois Y., Blaawoo M., Ransac S., Dijkstra B.W., Protein Eng, 7, , (1994). Muralidhar R.V., Chirumamilla R.R., Marchant R., Ramachandran V.N., Ward O.P., Nigam P., World J Microbiol Biotechnol, 18, 81 97, (2002). Muraoka T., Ando T., Okuda H., J Biochem, 92, , (1982). Nandini K.E., Rastogi N.K., Process Biochem., 44, , (2009). Nardini M., Lang D.A., Jaeger K.E., Dijkstra B.W., J. Biol. Chem., 275, , (2000). Nawani N., Kaur J., Enzyme Microb. Technol., 40, , (2007). Nawani N., Kaur J., J. Mol. Cell. Biochem., 206, 91-96, (2000). Oh B.C., Kim H.K., Lee J.K., Kang S.C., Oh T.K., FEMS Microbiol Lett, 179, , (1999). Ooi C.W., Tey B.T., Hii S.L., Kamal S.M.M., Lan J.C.W., Ariffe A., Ling T.C., Process. Biocehm., 44, , (2009). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

195 Καθαρισμός ενζύμων 160 Pabai F., Kermasha S., Morin A., Appl Microbiol Biotechnol, 43, 42 51, (1995b). Padilha G.S., Curvelo-Santano J.C., Alegre R.M., Tambourgi E.B., J. Chromatogr. B., 877, , (2009). Park I.H., Kim S.H., Lee Y.S., Lee S.C., Zhou Y., Kim C.M., J Microbiol Biotechnol, 19(2), , (2009). Pauwels K., Gelder P.V., Protein Expr. Purif., 59, , (2008). Pencreac h G., Baratti J.C., Enzyme Microb Technol, 18, , (1996). Petschen I., Malo E.A., Bosch M.P., Guerrero A., Tetrahedron Asymmetry, 7, , (1996). Pimentel M.C., Krieger N., Coelho L.C., Fontana J.O., Melo E.H., Ledingham W.M., Appl Biochem Biotechnol, 49, 59 74, (1994). Queiroz J.A., Garcia F.A.P., Cabral J.M.S., J Chromatogr A, 707, , (1995). Quyen D.T., Schmidt-Dannert C., Schmidt R.D., Protein Expr. Purif., 28, , (2003). Rajmohan S., Dodd C.E., Waites W.M., J. Applied. Microbiol., 93, , (2002). Ramani K., Chockalingam E., Sekaran G., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 37, , (2010). Rashid N., Shimada Y., Ezaki S., Atomi H., Immaake T., Appl. Environ. Microb., 67, , (2001). Reetz M.T., Angew Chem Int Ed, 40, , (2001). Reetz M.T., Jaeger K.E., Chem Phys Lipids, 93, 3 14, (1998). Rosenau F., Tommassen J., Jaeger K.E., Chem. Biochem., 5, , (2004). Rua M.L., Schmidt-Dannert C., Wahl S., Sprauer A., Schmid R.D., J. Biotechnol., 56, , (1997). Ruchi G., Gupta A., Khare S.K., Bioresour.Technol., 99, , (2008). Sambrook J., Fritich E.F., Maniatis T., Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Sangeetha R., Arulpandi I., Geetha A., Research Journal of Microbiology, 6, 1-24, (2011). Sangeetha R., Geetha A., Arulpandi I., Brazilian J. Microbiol., 41, , (2010a). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

196 Καθαρισμός ενζύμων 161 Sangeetha R., Geetha A., Arulpandi I., Z. Naturforsch, 65, 61-65, (2010b). Saxena R. K., Sheoran A., Giri B., Davidson S., J Microbiol Methods, 52, 1-18, (2003). Schmidt-Dannert C., Rúa M. L., Atomi H., Schmid R. D, Biochim. Biophys. Acta, 1301, , (1996). Schmidt-Dannert C., Sztajer H., Stocklein W., Menge U., Schmid R.D., Biochim Biophys Acta, 1214, 43 53, (1994). Schulz T., Plesis J., Schmid R.D., Protein Sci, 9, , (2000). Sharma R., Soni S.K., Vohra R.M., Gupta L.K., Gupta J.K., Process Biochem., 37, , (2002). Sharon C., Furugoh S., Yamakido T., Ogawa H.I., Kato Y., J IndMicrobiol Biotechnol, 20, , (1998). Shimada Y., Koga C., Sugihara A., Nagao T., Takada N., Tsunasawa S., J Ferment Bioeng, 75, , (1993). Shu Z.Y., Yan Y.J., Yang J.K., Xu L., Biotechnol Lett, 29(12), , (2007). Sidhu P., Sharma R., Soni S.K., Gupta J.K., Folia Microbiol, 43, 51 54, (1998b). Sidhu P., Sharma R., Soni S.K., Gupta J.K., Ind. J. Microbiol., 38, 9 14, (1998a). Sifour M., Saeed H.M., Zaghhloul T.I., Berekaa M.M., Abdel-Fattal Y.R., Int. J. Biol. Chem., 4, , (2010). Sigurgisladottir S., Konraosdottir M., Jonsson A., Kristjansson J.K., Matthiasson E., Biotechnol Lett, 15, , (1993) Simons J.W., van Kampen M.D., Riel S., Gotz F., Egmond M.R., Verhey H.M., Eur J Biochem, 253, 675, (1998). Singh M., Singh R.S., Banerjee U.C., Process Biochem., 45, 25-29, (2010). Skagerlind P., Jansson M., Hult K., J Chem Tech Biotechnol, 54, (1992). Snellman E.A., Sullivan E.R., Colwell R.R., Eur J Biochem, 269, , (2002). Sugihara A., Tani T., Tominaga Y., J Biochem, 109, , (1991). Sunna A., Hunter L., Hutton C.A., Bergquist P.L., Enzyme. Microb. Technol., 31, , (2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

197 Καθαρισμός ενζύμων 162 Suzuki M., Yamamoto H., Mizugaki M., J Biochem (Tokyo), 100, , (1986). Sztajer H., Lunsdorf H., Erdmann H., Menge U., Schmid R., Biochim. Biophys. Acta, 1124, , (1992). Taipa M. A., Aires-Barros M. R., Cabral J. M. S., J. Biotechnol, 26, 111, (1992). Takagi Y., Teramoto J., Kihara H., Itoh T., Tsukube H., Tetrahedron Lett, 37, , (1996). Terstappen G.C., Geerts A.J., Kula M.R., Biotechnol Appl Biochem, 16, , (1992). Toida J., Arikawa Y., Kondou K., Fukuzawa M., Sekiguchi J., Biosci Biotechnol Biochem, 62, , (1998). Tyndall J.D., Sinchaikul S., Fothergill-Gilmore L.A., Taylor P., Walkinshaw M.D., J. Mol. Biol., 323, , (2002). Van Kampen M.D., Rosenstein R., Götz F., Egmond M.R., Biochim Biophys Acta, 1544, , (2001). Van Oort M.G., Deever A.M.T.J., Dijkman R., Tjeenk M.L., Verheij H.M., Haas G.H., de Wenzig E., Gotz F., Biochemistry, 28, , (1989). Vicente M.L.C., Aires Barres M.R., Cabral J.M.S., Biotechnol Techn, 4, 137 1, (1990). Vujaklija D., Abramic M., Lescic I., Marsic T., Pigac J., Food Technol. Biotechnol., 41, 89-94, (2003). Wang Y., Srivastava K.C., Shen G.J., Wang H.Y., J Ferment Bioeng, 79, (1995). Watanabe S, Muramatsu T, Ao H, Hirayama Y, Takahashi K, Tanokura M, Kuchino Y., Eur J Biochem, 266, , (1999). Yadav R.P., Saxena R.K., Gupta R., Davidson W.S., Biotechnol Appl Biochem, 28, (1998). Yamada Y., Kuboi R., Komasawa I., Biotechnol Prog, 9, , (1993).Wang Y., Srivastava K.C., Shen G.J., Wang H.Y., J Ferment Bioeng, 79, , (1995). Yamamoto K., Fujiwara N., Biol Chem, 52, , (1988). Yamamoto K., Fujiwara N., Biosci Biotechnol Biochem, 59, , (1995). Zhang A., Gao R., Diao N., Xie G., Gao G., Cao S., J. Mol. Catal. B. Enzym., 56, 78-84, (2009a) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

198 Καθαρισμός ενζύμων 163 Zhang H., Zhang F., Li Z., World J. Microbiol. Biotechnol., 25, , (2009b). Zhang J.W., Zeng R.Y., Mar Biotechnol (NY), 10(5),612 21, (2008). Zhang Y., Menga K., Wang Y., Luo H., Yang P., Enzyme Microb.Technol, 42, , (2008). Κυριακίδη Δ. Α., Βιοτεχνολογία, εκδόσεις Ζήτη, Β έκδοση, (2002). Παπανεοφύτου Χ.Φ., «Μελέτη ρύθμισης της παραγωγής και της δομής πολυμερών στο βακτήριο Thermus thermophilus: νανοτεχνολογικές εφαρμογές», Διδακτορική Διατριβή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Θεσσαλονίκη, Ελλάδα, (2008). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

199 Καθήλωση ενζύμων 164 Κεφάλαιο 4 Καθήλωση Ενζύμων 4.1 Εισαγωγή Τα ένζυμα είναι ευπροσάρμοστοι βιοκαταλύτες και οι εφαρμογές τους σε αρκετά πεδία συνεχώς αυξάνεται συμπεριλαμβανομένου του πεδίου της οργανικής σύνθεσης. Τα κύρια πλεονεκτήματα της χρήσης ενζύμων στις βιοκαταλυτικές μετατροπές είναι η χημιο-, η τόπο- και η στερεο-εξειδίκευση όπως και ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ήπιες συνθήκες αντίδρασης. Ωστόσο, ακόμα και όταν ένα ένζυμο θεωρηθεί κατάλληλο για μια συγκεκριμένη αντίδραση, η εφαρμογή του συχνά εμποδίζεται λόγω έλλειψης μεγάλου χρονικού διαστήματος σταθερότητας στις συνθήκες της διεργασίας και επίσης λόγω δυσκολίας ανάκτησης και επαναχρησιμοποίησης. Αυτά τα προβλήματα μπορούν να ξεπεραστούν μέσω της καθήλωσης (Bornscheuer, 2003). Γενικά, η καθήλωση του ενζύμου ορίζεται ως «ένζυμα φυσικά περιορισμένα ή τοποθετημένα σε μια συγκεκριμένη καθορισμένη περιοχή του χώρου διατηρώντας την καταλυτική τους δραστικότητα και τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν επαναλαμβανόμενα και συνεχόμενα» (Jagannathan et al., 2008; Tan et al., 2010). Το ένζυμο εγκλωβίζεται ή καθηλώνεται σε συγκεκριμένο υλικό (φορέα) με τρόπο ώστε να μπορεί να έρχεται σε επαφή με την κυρίως φάση που είναι το υπόστρωμα, οι ενεργοποιητές ή οι αναστολείς. Ωστόσο, η κινητικότητα των εγκλωβισμένων μορίων του ενζύμου είναι περιορισμένη στο χώρο. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

200 Καθήλωση ενζύμων 165 Η καθήλωση ενζύμου σε βιομηχανική κλίμακα άρχισε στα τέλη της δεκαετίας του 70. Από τότε έχει γίνει σημαντική πρόοδος, γιατί, αφ ενός μεν η μέθοδος αυτή άνοιξε νέους δρόμους για φυσικοχημικές αντιδράσεις στα μόρια του ενζύμου, αφ ετέρου δε έγινε φανερό ότι πολλές in vitro ιδιότητες των πρωτεϊνών διατηρούνται και όταν βρίσκονται σε καθηλωμένη μορφή (Kυριακίδης, 2002). 4.2 Βιομηχανική εφαρμογή καθηλωμένων ενζύμων H πρώτη βιομηχανική χρήση καθηλωμένων ενζύμων αναφέρεται το 1967 από τον Chibata και τους συνεργάτες του από την εταιρία Tanaka Seiyaku Company στην Ιαπωνία, η οποία ανέπτυξε κολόνες καθηλωμένης Aspergillus oryzac άμινο-ακιλάση (aminoacylase), για την διάλυση συνθετικού, ρακεμικού DL-αμινο οξέων στα αντίστοιχα οπτικός ενεργά εναντιομερή του. Περίπου το 1970, δυο άλλα συστήματα καθήλωσης μεταφέρθηκαν σε κλίμακα πιλοτικής μονάδας. Στην Αγγλία, όπου η καθηλωμένη ακιλάση πενικιλίνης (penicillin acylase), χρησιμοποιήθηκε για την προετοιμασία του 6-αμινοπενικιλανικού οξέος από πενικιλίνη G ή V, και στις Η.Π.Α., όπου η καθηλωμένη ισομεράση γλυκόζης χρησιμοποιήθηκε για τη μετατροπή της γλυκόζης σε φρουκτόζη. Αυτές οι επιτυχημένες βιομηχανικές εφαρμογές προώθησαν την εκτεταμένη έρευνα στην τεχνολογία των ενζύμων, οδηγώντας στη σταθερή αύξηση των αριθμών των βιομηχανικών διεργασιών που είναι βασισμένες σε εξελιγμένους καθηλωμένους ενζύμων αντιδραστήρες (Katchalski-Katzir, 1993). Σήμερα, καθώς είναι αρκετοί οι καθηλωμένοι βιοκαταλύτες που χρησιμοποιούνται στο παραγωγικό σύστημα των βιομηχανικών διεργασιών, υπάρχουν αρκετές εταιρίες που τους παράγουν, οι σημαντικότεροι από τους οποίους είναι: Amano Pharmaceutical (Ιαπωνία), Biocatalysts (UK), Boehringer (Roche Diagnostics, Γερμανία/Ελβετία), Genencor (USA), Meito Sangyo (Ιαπωνία), Nagase (Ιαπωνία) και Novozymes (Δανία) (End and Schoning, 2004). 4.3 Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα χρήσης καθηλωμένων ενζύμων Τα καθηλωμένα ένζυμα είναι αντικείμενα αξιοσημείωτου ενδιαφέροντος λόγω των πλεονεκτημάτων τους απέναντι στα διαλυτά ένζυμα ή τις εναλλακτικές τεχνολογίες και λόγω του σταθερά αυξανόμενου αριθμού των εφαρμογών των καθηλωμένων ενζύμων. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

201 Καθήλωση ενζύμων 166 Ωστόσο, από πειραματικές μελέτες έχουν προκύψει αναπάντεχα αποτελέσματα, όπως είναι η σημαντική μείωση ή ακόμα και αύξηση της δραστικότητας του ενζύμου σε σχέση με τα μη καθηλωμένα ομολογά τους. Για παράδειγμα, οι σταυροδεσμευμένοι κρύσταλλοι της σουμπτιλισίνης υδρόλυσε τον εστέρα του αμινο οξέος με 27 φορές χαμηλότερη δραστικότητα από ότι το ελεύθερο ένζυμο. Όμως, η χρήση της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης ως καταλύτης για σύνθεση εστέρα, σε καθηλωμένη μορφή, αύξησε 40 φορές τη δραστικότητα του ενζύμου σε σχέση με το ελεύθερο ένζυμο (Tischer and Kasche, 1999). Εκτός από την πιθανή αύξηση της δραστικότητας του ενζύμου, υπάρχουν αρκετοί άλλοι λόγοι για τη χρήση των καθηλωμένων ενζύμων. Επιπρόσθετα με τον άνετο χειρισμό της προετοιμασίας του ενζύμου, τα δυο κύρια πλεονεκτήματα είναι: ο εύκολος διαχωρισμός του ενζύμου από το προϊόν και η επαναχρησιμοποίηση του ενζύμου. Ο εύκολος διαχωρισμός του ενζύμου από το προϊόν απλοποιεί την εφαρμογή των ενζύμων και επιτρέπει αξιόπιστη και ικανοποιητική τεχνολογία αντίδρασης. Η επαναχρησιμοποίηση του ενζύμου βοηθάει στη μείωση του κόστους της διεργασίας, το οποίο συχνά είναι προαπαιτούμενο για τη θέσπιση μιας οικονομικής και βιώσιμης ενζυμικής κατάλυσης διεργασίας. (Tischer and Kasche, 1999). Συνοπτικά, τα πλεονεκτήματα που συσχετίζονται με την καθήλωση των βιοκαταλυτών είναι (Katchalski-Katzir, 1993; End and Schoning, 2004; Bornscheuer, 2003): Επαναλαμβανόμενη ή συνεχής χρήση του βιοκαταλύτη Εύκολος διαχωρισμός του προϊόντος και του βιοκαταλύτη από το μέσο αντίδρασης (ευκολότερη κάθετη διεργασία) Πιο εύκολη ανάπτυξη συνεχόμενων διεργασιών Υψηλότερη αντοχή σε διατρητική τάση (shear stress) Πρόληψη της μόλυνσης των πρωτεϊνών στο προϊόν Ενίσχυση της σταθερότητας σε ότι αφορά τη θερμοκρασία, το ph και τη μόλυνση του καταλύτη Υψηλότερη δραστικότητα λόγω καλύτερης διαθεσιμότητας του ενεργού κέντρου του ενζύμου Γρηγορότεροι ρυθμοί αντίδρασης λόγω της υψηλής συγκέντρωσης του καταλύτη (για ορισμένα είδη αντίδρασης) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

202 Καθήλωση ενζύμων 167 Πιθανή διαμόρφωση των καταλυτικών ιδιοτήτων Ευκολότερη πρόληψη της μικροβιακής μόλυνσης Ευρύτερη επιλογή αντιδραστηρίων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν Ευκολότερη λειτουργία και έλεγχο του αντιδραστήρα Παρόλα αυτά υπάρχουν επίσης μερικά μειονεκτήματα όπως (Katchalski-Katzir, 1993;End and Schoning, 2004): Την ανάγκη ανάπτυξης μια διεργασίας καθήλωσης Το επιπρόσθετο κόστος που επιφέρει ο φορέας και τα επιπρόσθετα αντιδραστήρια Η ύπαρξη αντιστάσεων της μεταφοράς μάζας (περιορισμοί διάχυσης) Απώλεια της δραστικότητας σε ορισμένες περιπτώσεις 4.4 Τεχνικές καθήλωσης ενζύμων Η συγκεκριμένη δομή και το ενεργό κέντρο του ενζύμου είναι δυο απαραίτητα στοιχεία για την καταλυτική του δράση. Το ενεργό κέντρο αποτελείται από δυο περιοχές με διαφορετικές λειτουργικότητες. Μια είναι η αντιδρώσα ή καταλυτική θέση που συμμετέχει στην καταλυτική δράση, ενώ η άλλη είναι η ειδική θέση δέσμευσης του υποστρώματος που ελέγχει την εξειδίκευση του ενζύμου ως προς το υπόστρωμα. Οι δυο αυτές περιοχές αποτελούνται από πολλά αμινοξέα που βρίσκονται σε συγκεκριμένες θέσεις στο χώρο. Συνεπώς για να διατηρήσει ένα ένζυμο την δραστικότητά του όταν καθηλωθεί, είναι απαραίτητο να διατηρεί τη φυσική του δομή όσο το δυνατό περισσότερο. Για να παρασκευασθούν καθηλωμένα ένζυμα που να συνεχίζουν να διατηρούν τη δραστικότητά τους, θα πρέπει η καθήλωσή τους να γίνεται με ήπιες και ελεγχόμενες συνθήκες (Κυριακίδης, 2002). Λειτουργικές ομάδες που συμμετέχουν συνήθως στην καθήλωση των ενζύμων είναι οι ελεύθερες αμινο- και καρβοξυ- ομάδες, η σουλφυδρυλομάδα της κυστεϊνής, το ιμιδαζόλιο της ιστιδίνης, οι φαινολικές ομάδες και οι υδροξυλομάδες της σερίνης και θρεονίνης. Όταν γίνει η καθήλωση ενός ενζύμου είναι απαραίτητο αυτές οι λειτουργικές ομάδες του ενεργού κέντρου που οδηγούν στη σύνθεση του ενζύμου με τον αδιάλυτο φορέα να μη συμμετέχουν στην αντίδραση. Επίσης αντιδράσεις σε υψηλές θερμοκρασίες ή με ισχυρά οξέα ή βάσεις πρέπει να αποφεύγονται γιατί οι ασθενείς δευτερεύοντες δεσμοί (υδρογόνου, ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

203 Καθήλωση ενζύμων 168 υδρόφοβοι, ιονικοί) που διατηρούν την τεταρτογενή δομή του ενζύμου καταστρέφονται, με αποτέλεσμα τη μείωση ή και την εξαφάνιση της δραστικότητας του ενζύμου. Οι μέθοδοι καθήλωσης των ενζύμων μπορεί να ταξινομηθεί στις παρακάτω κατηγορίες (Σχήμα 4.1) (Κυριακίδης, 2002): Σύνθεση με ιονικούς δεσμούς Σύνθεση με ομοιοπολικούς δεσμούς Διαμοριακή σύνθεση Εγκλωβισμός ενζύμων σε πηκτές πολυμερών Εγκλωβισμός ενζύμων σε μικροκάψουλες Εγκλωβισμός ενζύμων σε λιποσώματα Σύνδεση με ιονικούς δεσμούς Σύνδεση με ομοιοπολικούς δεσμούς Διαμοριακή σύνδεση Εγκλωβισμός ενζύμων σε πηκτές πολυμερών Εγκλωβισμός ενζύμων σε μικροκάψουλες Εγκλωβισμός ενζύμων σε λιποσώματα Σχήμα 4.1 Απεικόνιση μεθόδων καθήλωσης ενζύμων. 4.5 Σύνδεση ενζύμων σε αδιάλυτους φορείς Η μέθοδος αυτή είναι η πρώτη που χρησιμοποιήθηκε για την καθήλωση των ενζύμων. Όταν τα ένζυμα καθηλώνονται με τον τρόπο αυτό, το ποσό του ενζύμου που συνδέεται με ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

204 Καθήλωση ενζύμων 169 τον φορέα και τη δραστικότητά του μετά την καθήλωση εξαρτάται επίσης από τη φύση του φορέα. Αν και η επιλογή του φορέα εξαρτάται από την ίδια τη φύση του ενζύμου, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη τα εξής (Κυριακίδης, 2002): Το μέγεθος των σφαιριδίων του φορέα Η επιφάνεια του φορέα Η χημική σύσταση του φορέα Και ο λόγος των υδρόφοβων προς τις υδρόφιλες ομάδες που περιέχει ο φορέας. Έχει αποδειχθεί ότι όταν οι υδρόφιλες ομάδες στην επιφάνεια του φορέα είναι αυξημένες το ποσό του ενζύμου που συνδέεται ανά μονάδα φορέα είναι μεγαλύτερο και η δραστικότητα του ενζύμου είναι αυξημένη. Ως φορείς για την καθήλωση των ενζύμων έχουν περισσότερο χρησιμοποιηθεί κυτταρίνη, δεξτράνια, αγαρόζη και πολυακρυλαμίδιο (Κυριακίδης, 2002). Η μέθοδος της καθήλωσης των ενζύμων σε αδιάλυτους φορείς μπορεί σύμφωνα με τον τρόπο σύνδεσης του ενζύμου να χωριστούν στις κατηγορίες που περιγράφονται στη συνέχεια Σύνθεση ενζύμων με ιονικούς δεσμούς Μέθοδος φυσικής προσρόφησης Η μέθοδος αυτή βασίζεται στη φυσική προσρόφηση του ενζύμου στην επιφάνεια του αδιάλυτου φορέα και έχει το πλεονέκτημα ότι προκαλεί ελάχιστη ή σχεδόν καμία αλλαγή στη δομή της πρωτεΐνης ή του ενεργού κέντρου του ενζύμου. Το μειονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι ότι μπορεί το προσροφημένο ένζυμο να αποκολλάται εύκολα γιατί οι δυνάμεις προσρόφησης είναι πολύ ασθενείς. Μέθοδοι ιονικής σύνδεσης Η μέθοδος ιονικής σύνδεσης βασίζεται στην ηλεκτροστατική σύνδεση ενζύμων με αδιάλυτους φορείς που φέρουν ομάδες με αντίθετο φορτίο. Φορείς για ιονικές συνδέσεις είναι πολυσακχαρίδια ή άλλα συνθετικά πολυμερή με ομάδες ανταλλαγής. Όπως αναφέρθηκε και στην προηγούμενη περίπτωση ή σύνθεση ενζύμου φορέα γίνεται με δυνάμεις μη ομοιοπολικές κάτω από ήπιες συνθήκες, η δε αποκόλληση γίνεται με διαλύματα υψηλής ιονικής ισχύος ή διαφορετικού ph (Κυριακίδης, 2000). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

205 Καθήλωση ενζύμων Μέθοδος ομοιοπολικής σύνδεσης Η μέθοδος ομοιοπολικής σύνδεσης βασίζεται στη σύνδεση του ενζύμου με τον αδιάλυτο φορέα με ομοιοπολικό δεσμό. Οι ομάδες που συμμετέχουν στην ομοιοπολική σύνδεση του ενζύμου με το φορέα είναι η α- ή ε- αμινο-ομάδα, η α, β-καρβοξυ-ομάδα, η σουλφυδρυλομάδα, η υδροξυλομάδα, η ιμιδαζολική και η φαινολική ομάδα. Η σύνθεση μεταξύ του φορέα και των ενζύμων μπορεί να γίνει είτε απευθείας είτε μέσω ενός βραχίονα διαφορετικού μεγέθους (Σχήμα 4.2). Ο βραχίονας δίνει μεγαλύτερο βαθμό κινητικότητας στο ένζυμο, ώστε η δραστικότητα του να είναι υψηλότερη από ότι εάν συνδεόταν απευθείας με το φορέα. Στις αντιδράσεις σύνδεσης οι ομάδες αυτές αντιδρούν με ομάδες του φορέα όπως διαζωνική, αζιδίου, ισοκυανικού και υλιδίου. Η μέθοδος αυτή πάλι μπορεί να χωρισθεί ανάλογα με τον τρόπο σύνδεσης σε διαζωπέπτιδο μέθοδο και μέθοδο αλκυλίωσης. Η μέθοδος αυτή είναι αρκετά πολύπλοκη και τις περισσότερες φορές χρησιμοποιούνται όχι ήπια αντιδραστήρια με σημαντική απώλεια ενζυμικής δράσης. Πάντως, η σύνδεση ενζύμου - φορέα είναι ισχυρή και το ένζυμο δεν αποκολλάται από τον φορέα στην παρουσία αλάτων, αλλαγές του ph ή στην παρουσία του υποστρώματος (Κυριακίδης, 2002). Σχήμα 4.2 Ομοιοπολική σύνδεση ενζύμων σε φορέα, με και χωρίς βραχίονα Διαμοριακή σύνδεση ενζύμων (σταυροσύνδεση) Η μέθοδος αυτής της καθήλωσης των ενζύμων βασίζεται στο σχηματισμό χημικού δεσμού όπως και στην περίπτωση της σύνδεσης με ομοιοπολικό δεσμό, αλλά δε ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

206 Καθήλωση ενζύμων 171 χρησιμοποιούνται φορείς που είναι αδιάλυτοι στο νερό. Η καθήλωση του ενζύμου γίνεται με διαμοριακή σύνδεση ανάμεσα στα μόρια των ενζύμων και των δι- ή πολυλειτουργικών αντιδραστηρίων. Οι ομάδες του ενζύμου που συμμετέχουν στην αντίδραση μπορεί να είναι η α-αμινο-ομάδα της λυσίνης, η φαινολική ομάδα της τυροσίνης, ή η σουλφυδρυλομάδα της κυστείνης, ή το ιμιδαζόλιο της ιστιδίνης. Η αντίδραση γίνεται συνήθως σε μη ήπιες συνθήκες και κατά κανόνα οδηγεί σε σημαντική απώλεια της δραστικότητας του ενζύμου. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται συνήθως στη μέθοδο αυτή είναι η γλουταραλδεΰδη, η οποία είναι το περισσότερο χρησιμοποιημένο αντιδραστήριο, τα ισοκυανικά παράγωγα και η δις-διαζωβενζιδίνη (Κυριακίδης, 2002) Εγκλωβισμός ενζύμων σε δικτυωτά πολυμερή ή μικροκάψουλες Η μέθοδος αυτή βασίζεται στον εγκλωβισμό ενζύμων είτε σε δικτυωτά πολυμερή ή σε ημιδιαπερατές μεμβράνες. Διαφέρει από τις προηγούμενες γιατί το ένζυμο δεν συνδέεται με την πηκτή ή την μεμβράνη. Πάντως όταν ο πολυμερισμός της πηκτής γίνεται μαζί με το ένζυμο για να εγκλωβιστεί, απαιτούνται σχετικά ισχυρές συνθήκες και πολλές φορές η δραστικότητα των ενζύμων ελαττώνεται σημαντικά (Κυριακίδης, 2002). Εγκλωβισμός σε δικτυωτά πολυμερή Για τον εγκλωβισμό ενζύμων σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή χρησιμοποιούνται συνθετικά πολυμερή όπως πολυακριλαμίδιο, πολυβινυλοαλκοόλη, ή φυσικά πολυμερή όπως το άμυλο με το πολυακριλαμίδιο είναι αυτό το πιο χρησιμοποιημένο (Κυριακίδης, 2002). Εγκλωβισμός σε μικροκάψουλες Η μέθοδος εγκλωβισμού σε μικροκάψουλες γίνεται με ημιδιαπερατή μεμβράνες πολυμερών. Η διάμετρος της μικροκάψουλας είναι συνήθως μm (Σχήμα 4.3). Πολλά ένζυμα έχουν εγκλωβιστεί με αυτή τη μέθοδο όπως λιπάση, καταλάση, ουριάση, ιμβερτάση, ασπαραγινάση. Η τεχνική της μεθόδου φαίνεται στο Σχήμα 4.4. Ένα υδατικό διάλυμα ενζύμου και ένα υδρόφιλο μονομερές γαλακτωματοποιούνται. Στο γαλάκτωμα, προστίθεται υδρόφοβο μονομερές διάλυμα με τον ίδιο οργανικό διαλύτη. Πολυμερισμός των δυο μονομερών γίνεται στην ενδιάμεση επιφάνεια μεταξύ του οργανικού και του υδατικού διαλύτη. Με την τεχνική αυτή δεδομένου ότι το ένζυμο είναι στην υδατική φάση εγκλωβίζεται στη μεμβράνη του πολυμερούς. Ως υδρόφιλα μονομερή έχουν χρησιμοποιηθεί πολυαμίνες, γλυκόζη και πολυφαινόλη. Ως υδρόφοβο μονομερές έχει χρησιμοποιηθεί πολυισοκυανικό. Τα πολυμερή που προκύπτουν τελικά είναι πολυαμίδια, πολυουρεθάνη, πολυουρία και πολυεστέρες (Κυριακίδης, 2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

207 Καθήλωση ενζύμων 172 Σχήμα 4.3 Σχηματική παράσταση εγκλωβισμένων ενζύμων σε μικροκάψουλες Σχήμα 4.4 Μέθοδος εγκλωβισμού σε μικροκάψουλες Εγκλωβισμός ενζύμων σε λιποσώματα ή άλλα υδρόφοβα πολυμερή Τελευταία η μελέτη αλληλεπίδρασης μεμβρανών πρωτεϊνών έχει τραβήξει την προσοχή των ερευνητών. Προσπάθειες έχουν γίνει να μιμηθούν, σε πειράματα in vitro, τις συνθήκες που δρουν τα ένζυμα in vivo με τη σκέψη ότι τα ένζυμα δεν είναι διαλυτά στο νερό αλλά σε κολλοειδή υδατικά διαλύματα με οργανικούς διαλύτες. Στα συστήματα αυτά, ένζυμα εγκλωβίζονται με σουλφακτάνες και λικιθίνες (Κυριακίδης, 2002). Στον Πίνακα 4.1 πραγματοποιείται σύγκριση των τεσσάρων βασικών τεχνικών καθήλωσης. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

208 Καθήλωση ενζύμων 173 Πίνακας 4.1 Σύγκριση μεθόδων καθήλωσης ενζύμων Μέθοδος Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Προσρόφηση Οι συνθήκες προετοιμασίας είναι ήπιες και εύκολες με χαμηλό κόστος. Ο φορέας μπορεί να αναγεννηθεί για επαναλαμβανόμενη χρήση. Η αλληλεπίδραση μεταξύ ενζύμου και φορέα είναι ασθενής, με αποτέλεσμα το καθηλωμένο ένζυμο να είναι ευαίσθητο στο ph, ιονική ισχύ, θερμοκρασία κλπ. Η ικανότητα προσρόφησης είναι χαμηλή και η πρωτεΐνη μπορεί να αφαιρεθεί από τον φορέα. Ομοιοπολικός δεσμός Το καθηλωμένο ένζυμο είναι σχετικά σταθερό λόγω των ισχυρών δυνάμεων ανάμεσα στην πρωτεΐνη και το φορέα. Οι συνθήκες προετοιμασίας δεν είναι ήπιες, για αυτό, το ένζυμο μπορεί να χάσει τη δραστικότητά του κατά τη διαδικασία καθήλωσης. Μερικά από τα αντιδραστήρια σύζευξης είναι τοξικά. Σταυροσύνδεση Η αλληλεπίδραση ανάμεσα στο ένζυμο και το φορέα είναι ισχυρή και το καθηλωμένο ένζυμο είναι σταθερό. Εγκλεισμός Οι συνθήκες εγκλεισμού είναι σχετικά ήπιες και η μέθοδος καθήλωσης είναι εφαρμόσιμη και σε ένα μεγάλο εύρος φορέων και ενζύμων. Οι συνθήκες σταυροσύνδεσης είναι έντονες και η μηχανική αντοχή του καθηλωμένου ενζύμου είναι χαμηλή. Αυτού του είδος καθηλωμένα ένζυμα έχουν πάντα τον περιορισμό της μαζικής μεταφοράς κατά τη διάρκεια της καταλυτικής διεργασίας, έτσι το ένζυμο είναι αποτελεσματικό για χαμηλού μοριακού βάρους υποστρώματα. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

209 Καθήλωση ενζύμων 174 Πρέπει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχει μόνο μια μέθοδος καθήλωσης η οποία να είναι καλύτερη για όλα τα καθηλωμένα ένζυμα ή για όλες τις εφαρμογές ενός συγκεκριμένου ενζύμου. Η επιλογή μιας συγκεκριμένης διαδικασίας, ένας κατάλληλος φορέας, ή ακόμα το κατάλληλο ένζυμο εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την επιλεγμένη διεργασία και πρέπει να εκτιμηθεί για κάθε περίπτωση ξεχωριστά. Η ανάπτυξη μιας καθηλωμένης εκδοχής ενός υπάρχοντος ενζύμου μπορεί ωστόσο να είναι κοπιαστική και μπορεί να είναι πολύ ακριβή σε περιπτώσεις όπου το ένζυμο είναι πολύ δραστικό ή εξαιρετικά φτηνό (End and Schoning, 2004). 4.6 Ιδιότητες των καθηλωμένων ενζύμων Η καθήλωση, όπως ήδη έχει αναφερθεί μεταβάλλει συνήθως τη συμπεριφορά των ενζύμων. Οι σπουδαιότεροι παράγοντες που επηρεάζουν τα καθηλωμένα ένζυμα είναι (Κυριακίδης, 2002): Η κατανομή Οι περιορισμοί διάχυσης Οι στερεοχημικές παρεμποδίσεις Η σταθερότητα Κατανομή Όταν καθηλωθούν τα ένζυμα παρουσιάζουν διαφορετικές ιδιότητες γιατί το σύνολο ενζύμου-υποστρώματος και συμπαραγόντων που απαιτούνται για την αντίδραση δεν είναι ένα ομογενές και ισοτροπικό ενζυμικό σύστημα. Αντίθετα, παρουσιάζουν μια φάση που διαχωρίζεται από το εξωτερικό διάλυμα. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες αυτής της νέας φάσης του ενζύμου (π.χ. ένα ένζυμο συνδεδεμένο σε ανιονικό ανταλλάκτη ή σε πολυμερισμένη πηκτή) διαφέρουν από αυτήν του διαλύματος. Συνεπώς, όλα τα συστατικά της ενζυμικής αντίδρασης, όπως ιόντα υδρογόνου, υποστρώματα, προϊόντα, αναστολείς, ενεργοποιητές, συνένζυμα κλπ., βρίσκονται κατανεμημένα μεταξύ της φάσης του εγκλωβισμένου ενζύμου και της υδατικής φάσης. Αυτό επηρεάζει σημαντικά την ενζυμική αντίδραση ακόμα και αν το ένζυμο δεν τροποποιείται με την καθήλωση. Μια θεωρία σχετικά με την επίδραση του μικροπεριβάλλοντος στις καταλυτικές ιδιότητες των καθηλωμένων ενζύμων, αναπτύχτηκε από τον Katchalski-Katzir (2000) και ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

210 Καθήλωση ενζύμων 175 τους συνεργάτες του. Οι ερευνητές υποθέτουν ότι ένα ένζυμο είναι καθηλωμένο σε ένα αρνητικά φορτισμένο φορέα. Λόγω των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων, η συγκέντρωση των κατιόντων υδρογόνου στο μικροπεριβάλλον του ενζύμου θα είναι πάντα υψηλότερη απ ότι στο διάλυμα και έτσι το ph θα είναι χαμηλότερο. Αυτό θα έχει ως αποτέλεσμα τη μετατόπιση του βέλτιστου της καμπύλης ph του ενζύμου σε περισσότερο αλκαλική περιοχή. Το αντίθετο θα συμβεί όταν ένα ένζυμο είναι καθηλωμένο σε ένα θετικά φορτισμένο φορέα (Κυριακίδης, 2002) Περιορισμοί διάχυσης Η καθήλωση καθιστά τα ένζυμα από ομογενείς σε ετερογενείς καταλύτες με αποτέλεσμα την εμφάνιση νέων χαρακτηριστικών. Για παράδειγμα, η μεταφορά των υποστρωμάτων γίνεται με όλους τους περιορισμούς διάχυσης. Η κλασική περίπτωση μεταφοράς μάζας σε καταλυτικές χημικές διεργασίες εφαρμόζεται επιτυχώς στα καθηλωμένα ένζυμα. Οι περιορισμοί διάχυσης είναι οι εξής (Κυριακίδης, 2002): Εξωτερικοί περιορισμοί διάχυσης που προκύπτουν από το γεγονός ότι υποστρώματα πρέπει να μεταφέρονται από την μεγάλη επιφάνεια των καθηλωμένων βιοκαταλυτών διαμέσου της διαχωριστικής στοιβάδας του νερού, και Εσωτερικοί περιορισμοί διάχυσης που οφείλονται στο ότι τα υποστρώματα διαχέονται πριν αρχίσει η αντίδραση ανάμεσα στα σωματίδια που είναι καθηλωμένα τα ένζυμα. Κάτω από τις συνθήκες αυτές γίνονται ταυτόχρονα διάχυση του υποστρώματος και ενζυμικές αντιδράσεις έτσι ώστε να δημιουργούνται διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις υποστρώματος και προϊόντων γύρω και μέσα στα σφαιρίδια, ειδικά όταν χρησιμοποιούνται πολύ δραστικά ένζυμα (Κυριακίδης, 2002). Οι περιορισμοί διάχυσης που έχουν σχέση με την δραστικότητα του ενζύμου είναι μεγάλης σημασίας διότι ελαττώνουν την ικανότητα των καθηλωμένων βιοκαταλυτών και συνεπώς θα πρέπει να περιοριστούν όσο το δυνατόν περισσότερο. Ο περιορισμός αυτός μπορεί να ξεπεραστεί με ελάττωση του μεγέθους και βελτιστοποιώντας την γεωμετρία των σωματιδίων που είναι καθηλωμένοι οι βιοκαταλύτες, αυξάνοντας τη συγκέντρωση του υποστρώματος, αυξάνοντας την ροή της στήλης, αυξάνοντας το πορώδες και βελτιστοποιώντας την κατανομή των ενζύμων στα σφαιρίδια που καθηλώνονται (Κυριακίδης, 2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

211 Καθήλωση ενζύμων Στερεοχημικές παρεμποδίσεις Αναφέρθηκε προηγουμένως ότι κάθε ένζυμο μπορεί να καθηλωθεί διατηρώντας την ικανότητα του για κατάλυση. Αν και αυτό ισχύει για περιπτώσεις ενζύμων που καταλύουν χαμηλού μοριακού βάρους υποστρώματα, φαίνεται ότι δεν ισχύει πάντα για ένζυμα που καταλύουν μεγάλου μοριακού βάρους υποστρώματα. Για παράδειγμα, πολλές υδρολάσες καθηλωμένες σε αδιάλυτους φορείς παρουσιάζουν αξιοσημείωτα χαμηλή δράση για μεγαλομοριακά υποστρώματα (πρωτεΐνες πολυσακχαρίτες, νουκλεϊνικά οξέα) από ότι αναμενόταν συγκεκριμένα με τη δραστικότητα που παρουσιάζουν για χαμηλού μοριακού βάρους υποστρώματα. Η διαφορά αυτή οφείλεται σε στερεοχημικές παρεμποδίσεις που μπορούν να ελαττωθούν αν τα ένζυμα πριν από την καθήλωσή τους συνδεθούν με τον αδιάλυτο φορέα με τους μεγαλύτερους βραχίονες. Επίσης οι αλληλεπιδράσεις των καθηλωμένων ενζύμων σε πηκτές πολυμερών με μακρομόρια περιορίζονται σημαντικά λόγω της χαμηλής διάχυσης των μεγαλομορίων στις πηκτές, με αποτέλεσμα τη μειωμένη δραστικότητα του ενζύμου (Κυριακίδης, 2002). 4.7 Παράμετροι επιρροής ιδιοτήτων του καθηλωμένου ενζύμου Οι ιδιότητες του παρασκευάσματος του καθηλωμένου ενζύμου κατευθύνονται από τις ιδιότητες και του ενζύμου αλλά και το υλικό του φορέα. Η αλληλεπίδραση ανάμεσα στα δύο παρέχει ένα καθηλωμένο ένζυμο με συγκεκριμένες χημικές, βιοχημικές, μηχανικές και κινητικές ιδιότητες (Σχήμα 4.5) (Tischer and Kasche, 1999). Σε ότι αφορά το κόστος κατασκευής, η απόδοση της δραστικότητας του καθηλωμένου ενζύμου καθορίζεται από τη μέθοδο καθήλωσης σε σχέση με την ποσότητα του ελεύθερου ενζύμου που χρησιμοποιήθηκε. Κάτω από τις συνθήκες της διεργασίας η τελική δραστικότητα μπορεί να μειωθεί κι άλλο λόγω φαινομένων παρεμπόδισης της μεταφοράς μάζας. Για αυτό το λόγο, η απόδοση της δραστικότητας του ενζύμου ύστερα από ακινητοποίηση δεν εξαρτάται πάντοτε από απώλειες που προκλήθηκαν από τη διαδικασία δέσμευσης αλλά μπορεί να μειωθεί κι άλλο ως αποτέλεσμα της μειωμένης διαθεσιμότητας τον μορίων του ενζύμου μέσα από τους πόρους ή λόγω αργής διάχυσης των μορίων του υποστρώματος. Τέτοιοι περιορισμοί οδηγούν στη μείωση της ικανότητας (efficiency). Ωστόσο, η βελτιωμένη σταθερότητα υπό συνθήκες εργασίας, μπορεί να αντισταθμίσει αυτό το μειονέκτημα καταλήγοντας σε ένα συνολικό όφελος (Tischer and Kasche, 1999). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

212 Καθήλωση ενζύμων 177 Γενικά, ένα καθηλωμένο ένζυμο μπορεί να θεωρηθεί ως ένας σύνθετος καταλύτης που αποτελείται από δυο μέρη (Cao, 2005;Cao et al., 2003): το μη-καταλυτικό δομικό κομμάτι (ο φορέας), το οποίο έχει σχεδιαστεί για να βοηθήσει στο διαχωρισμό, στην επαναχρησιμοποίηση του καταλύτη και στη διευκόλυνση του έλεγχου της διεργασίας και το καταλυτικό λειτουργικό κομμάτι (το ένζυμο), το οποίο είναι σχεδιασμένο να μετατρέπει τα υποστρώματα στα επιθυμητά προϊόντα. Σχήμα 4.5 Παράμετροι που σχετίζονται με τις τελικές ιδιότητες του καθηλωμένου ενζύμου. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

213 Καθήλωση ενζύμων 178 Πίνακας 4.2 Κριτήρια για ένα υγιές/γερό (robust) καθηλωμένο ένζυμο Παράμετρος Απαιτήσεις Πλεονεκτήματα Μη-καταλυτική λειτουργία Καταλυτικές λειτουργίες Κατάλληλο μέγεθος σωματιδίου και σχήματος Εύκολη κατασκευή Υψηλή μηχανική σταθερότητα Υψηλή χημική σταθερότητα Υψηλή ογκομετρική δραστικότητα (U/g) Υψηλή εκλεκτικότητα Βοηθάει στο διαχωρισμό, εύκολος έλεγχος της αντίδρασης Ευελιξία στο σχεδιασμό του αντιδραστήρα Μη σημαντική αλλαγή στην εσωτερική δομή Δεν διασπάται ο στερεός καταλύτης, δε μολύνεται το προϊόν Υψηλή παραγωγικότητα και απόδοση χώρου-χρόνου Λιγότερες παράπλευρες αντιδράσεις, ευκολότερη κάθετη διεργασία και διαχωρισμό των προϊόντων, λιγότερη μόλυνση Ευρεία εξειδίκευση υποστρώματος Ανοχή στις δομικές μεταβολές των υποστρωμάτων Καθηλωμένο ένζυμο Σταθερότητα σε οργανικούς διαλύτες Θερμοσταθερότητα Λειτουργική σταθερότητα Δομική σταθερότητα Επαναχρησιμοποίηση Ευρεία εφαρμοσιμότητα Αναπαραγωγή καθηλωμένου ενζύμου με τις ίδιες ιδιότητες Αλλαγή της ισορροπίας της αντίδρασης με την χρήση οργανικών διαλυτών Μείωση του χρόνου αντίδρασης με αύξηση της θερμοκρασίας Οικονομικά αποτελεσματική και χαμηλότερη συνεισφορά κόστους για το προϊόν Διαμόρφωση των ενζυμικών ιδιοτήτων Χαμηλή συνεισφορά κόστους του καταλύτη Ανοχή σε ποικίλες διεργασίες Εγγυάται την ποιότητα του προϊόντος ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

214 Καθήλωση ενζύμων 179 Παράμετρος Απαιτήσεις Πλεονεκτήματα Καθηλωμένο ένζυμο Οικονομική και οικολογική μέριμνα Δικαιώματα πνευματικής ιδιοκτησίας Εύκολος και γρήγορος σχεδιασμός Μειωμένους όγκους Εύκολη διάθεση (disposal) Ορθολογικό σχεδιασμό Ασφαλές στη χρήση Καινοτόμο Ελκυστικό Ανταγωνίσιμο Πρώιμη διορατικότητα της ανάπτυξης της διεργασίας Μειωμένο κόστος για το στερεό χειρισμό (solid handling) Μικρότερη περιβαλλοντική επίπτωση Αποφυγή κοπιαστικών ελέγχων Πληρούν τους κανονισμούς ασφαλείας Προστασία των δικαιωμάτων πνευματικής ιδιοκτησίας Δικαίωμα άδειας Ενίσχυση της εμπορικής του θέσης Επομένως, ένα καθηλωμένο ένζυμο μπορεί να περιγραφεί με δυο μεταβλητές τις μη καταλυτικές παραμέτρους και τις καταλυτικές παραμέτρους. Οι μη καταλυτικές παράμετροι σχετίζονται με την φυσική και χημική φύση του μη καταλυτικού κομματιού, καθώς και η γεωμετρία του όπως είναι το Σχήμα, το μέγεθος και το μάκρος, ενώ οι καταλυτικοί παράμετροι σχετίζονται με τις καταλυτικές λειτουργίες, όπως είναι η δραστικότητα, η επιλεκτικότητα και η σταθερότητα (Πίνακας 4.2) (Cao et al., 2003). Πρακτικά οι καταλυτικές λειτουργίες είναι σχεδιασμένες για να επιτύχουν την επιθυμητή δραστικότητα, επιλεκτικότητα, εξειδίκευση υποστρώματος, παραγωγικότητα και απόδοση ως προς το χρόνο και χώρο της αντίδρασης. Ο σκοπός είναι η επίτευξη λιγότερων παράπλευρων αντιδράσεων, υψηλότερη ανθεκτικότητα δομικών παραλλαγών των υποστρωμάτων, υψηλή παραγωγικότητα και απόδοση ως προς το χρόνο και χώρο και την υψηλή ανθεκτικότητα του καταλύτη. Η κριτήρια επιλογής των μη καταλυτικών λειτουργιών, ειδικά των γεωμετρικών παραμέτρων, εξαρτώνται κατά πολύ από τον σχεδιασμό της σύνθεσης του αντιδραστήρα (ασυνεχή, αναδευώμενο, στήλης, plug-flow), το είδος του μέσου αντίδρασης (υδατικό, οργανικός διαλύτης ή σύστημα δυο φάσεων), το σύστημα αντίδρασης (υγρό-σε-υγρό, υγρό-σε-στερεό ή στερεό-σε-στερεό) και οι συνθήκες τις αντίδρασης (ph, θερμοκρασία και πίεση). Οι παράμετροι επιλέγονται με σκοπό να ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

215 Καθήλωση ενζύμων 180 επιτευχθεί εύκολος διαχωρισμός του καθηλωμένου ενζύμου από το μείγμα της αντίδρασης, την ευελιξία σχεδιασμού του αντιδραστήρα και την ευρεία εφαρμογή σε ποικίλα μέσα και συστήματα αντίδρασης. Οι επιλεγμένοι παράμετροι θα πρέπει να διευκολύνουν την κάθετη διεργασία και συγκεκριμένα τον έλεγχο της διεργασίας (Cao et al., 2003). Εκτός από αυτές τις λειτουργικές απαιτήσεις, όπως πολύ άλλοι βιομηχανικοί βιοκαταλύτες (π.χ. ελεύθερα ένζυμα ή ολόκληρα κύτταρα), ένα ιδανικό βιομηχανικό καθηλωμένο ένζυμο πρέπει να πληροί και άλλα κριτήρια, όπως να είναι ανακυκλώσιμο, ευρέως εφαρμόσιμο, να συμφέρει οικονομικά και να είναι ασφαλές στη χρήση. Επιπλέον, οι καταλύτες πρέπει να είναι ανταγωνιστικοί και καινοτόμοι αρκετά για να προστατέψουν τα δικαιώματα πνευματικής ιδιοκτησίας και να είναι ελκυστικοί για τους τελικούς χρήστες (Cheetham, 1998; Cao et al., 2003). Επιπλέον, ένα καθηλωμένο ένζυμο πάντα έχει μια περιορισμένη διάρκεια ζωής, για αυτό η απενεργοποίηση του ενζύμου δεν είναι αναπόφευκτη. Συνεπώς, πρέπει πάντοτε να λαμβάνεται υπόψη η εύκολη προμήθευση των καθηλωμένων ενζύμων, ειδικά για μια μεγάλης κλίμακας βιομηχανικής διεργασίας, στην οποία χρειάζονται ετησίως τόνους καθηλωμένων ενζύμων σε φορείς (Katchalski-Katzir and Kraemer, 2000; Cao et al., 2003). Από τα παραπάνω συμπεραίνεται ότι δεν υπάρχει μια γενικευμένη εφαρμοσμένη μέθοδος καθήλωσης ενζύμων. Η κύρια αποστολή είναι η επιλογή του κατάλληλου φορέα (ορισμένο ως το μη καταλυτικό μέρος ενός καθηλωμένου ενζύμου, πάνω στο οποίο δομείται το καταλυτικό κομμάτι), οι συνθήκες (ph, θερμοκρασία και φύση του μέσου), και το ίδιο το ένζυμο (πηγή, φύση, και καθαρότητα) για το σχεδιασμό ενός καθηλωμένου βιοκαταλύτη. Η επιλεγμένη τεχνική θα πρέπει να πληροί και τις καταλυτικές ανάγκες (εκφρασμένες στην παραγωγικότητα, στην απόδοση χρόνου και τόπου, την σταθερότητα και την εκλεκτικότητα) και τις μη καταλυτικές ανάγκες (π.χ. το διαχωρισμό, τον έλεγχο, την κάθετη επεξεργασία) που απαιτούνται για τη συγκεκριμένη διεργασία. Ως αποτέλεσμα, ένα καθηλωμένο ένζυμο μπορεί να ονομάζεται ως αυτοδύναμο/υγειές (robust), όταν και οι καταλυτικές και οι μη καταλυτικές λειτουργίες πληρούν τις απαιτήσεις μια συγκεκριμένης εφαρμογής (Cao, 2005; Bornscheuer, 2003). 4.8 Υλικά ακινητοποίησης ενζύμων Όπως ειπώθηκε στην παράγραφο 4.7 του κεφαλαίου, οι ιδιότητες των καθηλωμένων ενζύμων εξαρτώνται και από τις ιδιότητες του ενζύμου και από το υλικό του φορέα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

216 Καθήλωση ενζύμων 181 (Kenedy et al., 1983; Tischer et al., 1999). Η αλληλεπίδραση μεταξύ τους προσαρμόζει τις ειδικές φυσικο-χημικές και κινητικές ιδιότητες του καθηλωμένου ενζύμου, οι οποίες μπορεί να είναι οριστικές για την εφαρμογή του. Για αυτό, ένας φορέας προσεκτικά διαλεγμένος μπορεί να ενισχύσει σημαντικά τη λειτουργική απόδοση του καθηλωμένου συστήματος. Παρ όλο που δεν υπάρχει ένας κοινός φορέας καθήλωσης για όλα τα ένζυμα και τις εφαρμογές τους, υπάρχουν κάποια κοινά επιθυμητά χαρακτηριστικά για κάθε υλικό που προορίζεται για φορέας καθήλωσης ενζύμων, τα οποία είναι : Υψηλή συγγένεια με τις πρωτεΐνες (high affinity to proteins) Διαθεσιμότητα δραστικών ομάδων για απευθείας αντίδραση με το ένζυμο και για χημική τροποποίηση Να είναι υδροφιλικά Να έχει μηχανική σταθερότητα και ακαμψία Να μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί Να είναι εύκολο στην παρασκευή του σε διαφορετικές γεωμετρικές διαμορφώσεις που προσφέρουν στο σύστημα με διαπερατότητα και επιφάνεια κατάλληλη για την επιλεγμένη βιομετατροπή. Επίσης, είναι λογικό πως για τις εφαρμογές που αφορούν τα τρόφιμα, τη φαρμακοβιομηχανία, την ιατρική και τη γεωργία τα υλικά καθήλωσης θα πρέπει να είναι μη τοξικά και βιοσυμβατά. Επιπλέον, τα υλικά αυτά θα πρέπει να είναι βιοδιασπώμενα και οικονομικά. (Krajewska, 2004) Οι στερεοί φορείς που χρησιμοποιούνται σήμερα ανήκουν στους οργανικούς και ανόργανους, όπως φαίνονται στον Πίνακα 4.3, και διαφοροποιούνται ανάλογα με την τεχνική καθήλωσης που εφαρμόζεται (End and Schoning, 2004). Αρκετοί από τους φορείς που αναφέρονται στον Πίνακα 4.3 μπορούν να βρεθούν σε βιομηχανικές εφαρμογές είτε λόγω της ευκολίας της καθήλωσης είτε λόγω οικονομικών αιτιών. Αυτοί που αξίζουν να αναφερθούν είναι οι: Eupergit (σωματίδια ακριλικού οξυρανίου, Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Germany), Accurel (σκόνη πολυπροπυλενίου, Membrana GmbH, Obernburg, Germany) και Celite (End and Schoning, 2004). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

217 Καθήλωση ενζύμων 182 Πίνακας 4.3 Φορείς καθήλωση ενζύμων. Οργανικός Ανόργανος Ομοιοπολική σύνδεση Προσρόφηση Πολυακρλαμίδιο, πολυστυρένιο (Tentagel), πολυολεφίνες Κυτταρίνη, χιτίνη (χιτοζάνη), νάιλον, ίνες πολυπροπυλενίου, πολυμερικά δίχτυα και μεμβράνες, ξύλο, λιγνίνη, ρητίνη ιονικής ανταλλαγής, αφρώδες πολυακριλαμίδια Πορώδες γυαλί Γυαλί, πυλός, ζεόλιθοι, κεραμικά, μεσοπορώδες διοξείδιο του πυριτίου, μεταλλικά οξείδια (Fe, Ti, Mg), μεταλλικά φωσφορικά, σκόνη ορυκτών. Εγκλεισμός Αγαρόζη, δεξτράνη, αλγινικό, καραγενάνη, κολλαγόνο, πολυακρυλικό, πολυσιλοξάνιο, πολυβινυλική αλκοόλη, πολυαιθυλενική γλυκόλη Ζελατίνη φωσφορικού ασβεστίου Στη συνέχεια, γίνεται περιγραφή μερικών από τους πολλούς φορείς καθήλωσης που έχουν μελετηθεί Χιτοζάνη Η χιτοζάνη είναι ένας ιδανικός φορέας καθήλωσης ενζύμων λόγω του ότι είναι ένα βιοσυμβατό, βιοδιασπώμενο και μη τοξικό πολυμερές το οποίο το κάνει να είναι ελκυστικό για εφαρμογές στην ιατρική και στη φαρμακευτική (Muzzarelli, 1985; Chandy. et al., 1990; Shigemasa et al., 1995). Μπορεί να διασπαστεί με τη λυσοζίμη και τη chitosanase (Sashiwa et al., 1997). Η χιτοζάνη είναι ένα γραμμικό κατιονικό πολυμερές που αποτελείται κατά κύριο λόγο από το β(1 4) συνδεδεμένο με μονάδες γλυκοζαμίνης μαζί με κάποιο ποσοστό μονάδων Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης (Σχήμα 4.6). Η χιτοζάνη συναντάται σπάνια στη φύση. Κυρίως λαμβάνεται από εκτενής αποακετυλίωση (deacetylation) της χιτίνης, ένα ομοπολυμερές το β(1 4) συνδεδεμένο Ν-ακετυλο-D-γλυκοζαμίνη, που βρίσκεται στο κέλυφος ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

218 Καθήλωση ενζύμων 183 οστρακόδερμων, στα μαλάκια, στο κυτταρικό τοίχωμα μυκήτων και στην επιδερμίδα εντόμων (Muzzarelli, 1977). (α) (β) Σχήμα 4.6 Δομική μονάδα χιτοζάνης (α) μονάδα Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη, (β) μονάδα γλυκοζαμίνης. Εμπορικά, η χιτίνη και η χιτοζάνη λαμβάνονται σε σχετικά χαμηλό κόστος από κελύφη (κυρίως καβούρια, γαρίδες και αστακούς), και απόβλητα της βιομηχανίας επεξεργασίας θαλασσινών (Hudson, et al., 1998; Tharanathan, et al., 2003; Paul, et al., 2000; Singla, et al., 2001; Dutta, et al., 2002; Shahidi, et al., 1999). Ως φορείς καθήλωσης ενζύμων, τα υλικά που βασίζονται στη χιτίνη και στη χιτοζάνη χρησιμοποιούνται σε μορφή σκόνης, νιφάδων και πηκτής (gel) σε διαφορετικούς γεωμετρικούς σχηματισμούς. H χιτοζάνη, είναι ένα ευρέος χρησιμοποιούμενος φορέας καθήλωσης με την τεχνική της προσρόφησης, καθώς οι αλυσίδες της αμυνο- (-ΝΗ 2 ) και / ή της υδροξυ- (-ΟΗ) ομάδες της μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως τα ενεργά κέντρα αντίδρασης του δεσμού με το ένζυμο (Juang et al., 2001) Αλγινικό και αλγινικό-πολυβινυλική αλκοόλη Το αλγινικό ανήκει στην οικογένεια των γραμμικών πολυσακχαρίτων που αποτελούνται από το μανουρονικό οξύ (mannuronic acid) (Μ) και το γουλουρονικό οξύ (guluronic acid) (G) (Σχήμα 4.7) (Skjik-Braek, et al., 1991). Το αλγινικό έχει την ικανότητα να δεσμεύει πολυσθενή κατιόντα, οδηγώντας στο σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών και αδιάλυτες υδροπηκτές. Αυτός ο ανιονικός πολυσακχαρίτης με Ca 2+, δημιουργεί μικροσφαίρες με καλή δύναμη και ελαστικότητα. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

219 Καθήλωση ενζύμων 184 Τέτοια σταυροσύνδεση σκληραίνει και κάνει το πολυμερές πιο τραχύ, μειώνοντας το φούσκωμα μέσα στο νερό και σε οργανικούς διαλύτες (De Queiroz et al., 2005). (α) (β) (γ) Σχήμα 4.7 Δομή των (α) β-d- μανουρονικό οξύ, (β) α-l-γουλουρινικό οξύ (guluronic acid) και (γ) αλγινικό οξύ. Η πολυβινυλική αλκοόλη (PVA) είναι ένα συνθετικό, μη τοξικό, υψηλής αντοχής πολυμερές, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα στην βιοτεχνολογία για καθήλωση ενζύμων και κυττάρων, λόγω της ιδιότητας του να σταθεροποιεί και να διατηρεί τη βιολογική δραστικότητα των πρωτεϊνών (Uhlich et al., 1996; De Queiroz et al., 2005). Οι υδρόπηκτες του PVA και του αλγινικού νατρίου έχουν βρει εκτεταμένες εφαρμογές ως υλικά φορέων για την καθήλωση ενζύμων και κυττάρων, ωστόσο, οι φυσικοχημικές τους ιδιότητες χρειάζονται περισσότερη βελτίωση για να μπορέσουν να χρησιμοποιηθούν σε βιομηχανικές εφαρμογές. H αστάθεια των αλγινικών μικροσωματιδίων σε κιτρικό ή σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα του ph και η χαμηλή μεταφορά μάζας στα σωματίδια PVA έχουν περιορίσει την εφαρμογή αυτών των φορέων σε ασυνεχής και συνεχής λειτουργίας βιοαντιδραστήρες (De Queiroz et al., 2005). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

220 Καθήλωση ενζύμων Eupergit C Το Eupergit C είναι ένας φορέας καθήλωσης ενζύμων με την ομοιοπολική μέθοδο, κατάλληλος για βιομηχανικές εφαρμογές. Η ανάπτυξη του έγινε μεταξύ το 1974 και 1980 από τους Roehm, Darmstadt, Germany ( Kraemer et al., 1975; Kraemer et al., 1985). Η εταιρία αυτή, ήταν η πρώτη που εισήγαγε την τεχνολογία των ενζύμων, περίπου πριν από 100 χρόνια, σε εφαρμογές όπως στην βυρσοδεψία δέρματος, στα απορρυπαντικά πλυσίματος και στην επούλωση πληγών. Το Eupergit C αποτελείται από μακροπορώδες χάντρες (beads), με διάμετρο μm, και φτιάχτηκε από τον συμπολυμερισμό των Ν,Ν -μεθυλένιο-δις-(μεθακρυλαμίδιο), (N,N -methylene-bis-(meth-acrylamide)), γλυκιδυλ-μεθακριλικό, (glycidyl methacrylate), allyl glycidyl ether και μεθακρυλαμίδιο (Σχήμα 4.8) Σχήμα 4.8 Δομή του Eupergit C και η ομοιοπολική σύνδεση με ένα ένζυμο. Η διαδικασία αυτή βασίστηκε σε μία καινοτόμα μέθοδο πολυμερισμού σωματιδίων, που ανατήχθηκε από τον Roehm το 1970 (Pennewiss et al., 1970), στην οποία εφαρμόστηκαν δυο άμεικτες οργανικές φάσεις. Λόγω της κατασκευής του, το Eupergit C είναι σταθερό και χημικά και μηχανικά σε ένα εύρος ph από 0 μέχρι 14 και δε συρρικνώνεται ή διογκώνεται ακόμα και σε δραστική αλλαγή του ph μέσα σε αυτό το εύρος. Η μηχανική του σταθερότητα είναι αξιοσημείωτη, καθώς δε δείχνει σημαντικές φθορές μετά από 650 κύκλους σε αναδευόμενο αντιδραστήρα με όγκο υποστρώματος ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

221 Καθήλωση ενζύμων 186 μεγαλύτερο των 1000 l. Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στη διανομή του μεγέθους των σωματιδίων, όταν το Eupergit C αναδεύτηκε κάτω από αυτές τις συνθήκες. Το Eupergit C είναι συμβατό με τους αντιδραστήρες καθώς σχεδόν με κάθε τύπο αντιδραστήρα με ανάδευση ή σταθερής κλίνης μπορεί να χρησιμοποιηθεί, με την προϋπόθεση να είναι εξοπλισμένος με ένα κόσκινο για το διαχωρισμό των σωματιδίων. Ειδικοί βιοαντιδραστήρες δεν χρειάζονται. Στο Eupergit C οι πρωτεΐνες ενώνονται μέσω των ομάδων οξιρανίου (oxirane-group) οι οποίες αντιδρούν σε ουδέτερο και αλκαλικό pη με τις αμινοομάδες των μορίων των πρωτεϊνών, π.χ. για ένα ένζυμο για να σχηματίσει ένα ομοιοπολικό δεσμό ο οποίος να είναι για μεγάλο διάστημα σταθερός σε ένα εύρος ph από 1-12 (Σχήμα 4.8). Το Eupergit C μπορεί επίσης να ενωθεί με τα μόρια των ενζύμων μέσω των σουλφιδρικών (sulfhydril) ομάδων και μέσω των καρβοξιλικών ομάδων τους σε όξινο, ουδέτερο και βασικό εύρος ph (Turkova J. et al., 1978). Για αυτό το λόγο, στο Eupergit C μπορούν να ενωθούν ομοιοπολικά τα μόρια των ένζυμων με ph από 1-12, δηλαδή, μπορεί να ενώσει το ένζυμο στο ph όπου είναι σταθερό και δεν χάνει τη δραστικότητα του. Λόγω της μεγάλης πυκνότητας των ομάδων οξιρανίου στην επιφάνεια των σωματιδίων (600 μmol / g ξυρού Eupergit C), τα ένζυμα καθηλώνονται σε διάφορες μεριές της δομής τους. Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται «πολλαπλό σημείο σύνδεσης» (multi-pointattachment), το οποίο θεωρείται ένας πολύ σημαντικός παράγοντας για υψηλή λειτουργική σταθερότητα των δεσμευμένων ενζύμων στο Eupergit C (Katchalski-Katzir et al., 2000). 4.9 Καθήλωση της λιπάσης Η χρήση των ενζύμων ως βιομηχανικοί καταλύτες είναι χρήσιμη εάν η όλη διεργασία είναι οικονομική μαζί με το κόστος της διεργασίας που περιλαμβάνει την παραγωγή του βιοκαταλύτη. Για αυτό το λόγο η ανάκτηση των καταλυτών για επαναλαμβανόμενη χρήση έγινε αναγκαία. Τα ελεύθερα ένζυμα είναι ασταθή και ευάλωτα σε διάσπαση κατά τη διάρκεια της διεργασίας ανάκτησης των χρησιμοποιημένων ενζύμων. Επίσης, οι περισσότερες λιπάσες παρουσιάζουν χαμηλή σταθερότητα και δραστικότητα σε οργανικά μέσα (Lee et al., 2010; Sangeetha et al., 2011). Αυτά τα μειονεκτήματα μπορούν να ξεπεραστούν με τη χρήση καθηλωμένων ενζύμων. Η ακινητοποίηση βελτιώνει την σταθερότητα του ενζύμου κάτω από της συνθήκες της αντίδρασης και έτσι ενισχύει τη δραστικότητα, κάνει την επαναλαμβανόμενη χρήση του ενζύμου εφικτή, επιτρέπει τη ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

222 Καθήλωση ενζύμων 187 χρήση του ενζύμου σε μια ποικιλία εφαρμογών και έτσι μειώνεται το κόστος παραγωγής (Guncheva et al., 2009; Liu et al., 2009; Sangeetha et al., 2011). Οι λιπάσες είναι εμπορικά διαθέσιμες και στην φυσική τους μορφή και καθηλωμένες. Οι λιπάσες που χρησιμοποιούνται σε απορρυπαντικά και σε αρκετές άλλες εφαρμογές δεν είναι καθηλωμένες, ωστόσο, σε ένα αυξανόμενο αριθμό ειδικών εφαρμογών, στη σύνθεση και στις βιομετατροπές, απαιτείται ένας καθηλωμένος βιοκαταλύτης για την αποδοτικότητα της χρήσης. Η καθήλωση βελτιώνει την ανακύκλωση ακριβών λιπασών και ενισχύει επίσης την σταθερότητα του ενζύμου και τη δραστικότητά του. (Sharma et al., 2001). Αρκετοί μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για την καθήλωση της λιπάσης, όπως είναι η προσρόφηση πάνω σε υδροφοβικά υλικά (Wisdom et al., 1984; Minovska et al., 2005), ή σε μακροπορώδους ρητίνες ανιονικής ανταλλαγής (Rizzi et al., 1992), η ομοιοπολική δέσμευση σε λειτουργικές ομάδες (Shaw et al., 1990), ο εγκλεισμό σε πηκτές (gel) πολυμερούς (Τelefoncu et al., 1990), κλπ. Μια ποικιλία υλικών όπως ρητίνες ιοντικής ανταλλαγής (Amberlite IRC-50), ανόργανα υλικά (άμμος, διοξείδιο του πυριτίου (silica)), βιοπολυμερή όπως αλγινικό νάτριο (Cheirsilp et al., 2009), συνθετικά πολυμερή όπως πολυπροπυλένιο, πολυαιθυλένιο, πολυμεθακριλικό (Salis et al., 2009), κεραμικά (Al-Zuhair et al., 2009), και άλλα υλικά χρησιμοποιήθηκαν για την καθήλωση της λιπάσης (Sangeetha et al., 2011). Βιβλιογραφικά, υπάρχουν πολλές αναφορές για ακινητοποίηση της λιπάσης από διαφορετικούς μικροοργανισμούς και σε διαφορετικούς φορείς. Η Candida rugoga λιπάση καθηλώθηκε με προσρόφησε σε πορώδη σωματίδια χιτοζάνης και η δραστικότητα της δοκιμάστηκε στην ενζυμική υδρόλυση του ελαιόλαδου. Συγκρίνοντας τις ιδιότητες της καθηλωμένης με την ελεύθερη λιπάση διαπιστώθηκε ότι η βέλτιστη τιμή ph μειώθηκε από 7 σε 6, και η βέλτιστη θερμοκρασία αντίδρασης αυξήθηκε από τους 37 ο C στους 50 ο C (Pereira et al., 2001). Με τη μέθοδο του εγκλεισμού καθηλώθηκε η Candida rugoga λιπάση σε πολυμερικά σωματίδια πολυβινυλικής αλκοόλης, αλγινικού και βορικού οξέος. Η ικανότητα εστεροποιήσης του καθηλωμένου ενζύμου βελτιώθηκε σε σχέση με το ελεύθερο, όπως και η θερμική σταθερότητά του η οποία βελτιώθηκε 10 φορές. Επίσης, το καθηλωμένο ένζυμο διατήρησε σχεδόν πλήρη τη δραστικότητα του σε επαναχρησιμοποίηση 10 κύκλων και η διάρκεια ζωής του ήταν περίπου 10 μήνες (Dave and Madamwar, 2006). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

223 Καθήλωση ενζύμων 188 Διαφορετικές λιπάσες από Candida rugosa, Pseudomonas fluorescens και Candida antarctica B καθηλώθηκαν σε σκόνη χιτοζάνης και σε προεπεξεργασμένη με γλουταραλδεϋδη σκόνη χιτοζάνης. Από της τρείς λιπάσες η Candida antarctica B ήταν η πιο δραστική για την εστεροποίηση του ελαϊκού οξέος και της αιθανόλης, και η καθήλωσή της στην μη επεξεργασμένη χιτοζάνη οδήγησε σε 75% μετατροπή του λιπαρού οξέος μέσα σε 24 ώρες αντίδραση. Η σταθερότητα αυτού του καταλύτη επίσης αποδείχτηκε πολύ ελκυστική με 5 συνεχόμενες χρήσης μέσα σε 24 ώρες με υπολειπόμενη δραστικότητα 90-95% (Foresti and Ferreira, 2007). Οι Miletic et al., (2010), καθήλωσαν την Candida antarctica B λιπάση με την μέθοδο της φυσικής προσρόφησης σε νανο-σωματίδια πολυστυρενίου. Το καθηλωμένο ένζυμο, παρουσίασε υψηλότερη υδρολυτική δραστικότητα από το ελεύθερο ομόλογό του αλλά και από το εμπορικό καθηλωμένο ένζυμο Novozyme 435. Οι Wilson et al., (2006), κατάφεραν να βελτιώσουν τις ιδιότητες της θερμοάντοχης Alcaligenes sp. λιπάσης, ακινητοποιώντας την με τη μέθοδο της προσρόφησης σε υδροφοβικό φορέα, octadecyl-sepabeads. Συγκρίνοντας τις ιδιότητες του με το ελεύθερο ομόλογό του, οι δραστικότητά του αυξήθηκε μαζί με τις θερμικές του ιδιότητες. Η βέλτιστη θερμοκρασία του αυξήθηκε από τους 50 ο C στους 70 ο C και η θερμοανθεκτικότητα του βελτιώθηκε αρκετά, καθώς διατήρησε τη μισή του δραστικότητα ύστερα από 12 ώρες επώασης στους 80 ο C και σε ph 8.5. To καθηλωμένο ένζυμο έγινε 25 φορές πιο σταθερό σε σχέση με το ελεύθερο. Οι Kramera et al., (2010), βελτίωσαν τη σταθερότητα της Candida antarctica B λιπάση σε υψηλές θερμοκρασίες, μέχρι 70 ο C, σε διαλύτες και το χρονικό διάστημα που παραμένει ενεργεί, καθηλώνοντάς την σε σίλικα Πειραματική διαδικασία Υλικά Το ένζυμο που χρησιμοποιήθηκε για την καθήλωση στους διάφορους φορείς είναι η υψηλής καθαρότητας λιπάση Β από το μικροοργανισμό Candida antarctica (CA), προμηθεύτηκε από τον οίκο Biocatalytics και χρησιμοποιήθηκε χωρίς περεταίρω επεξεργασία. Η Candida antarctica λιπάση Β είναι μια ενδιαφέρουσα λιπάση, με πιθανές εφαρμογές σε βιομηχανικές διεργασίες όπως είναι η σύνθεση τριγλυκεριδίων, η εστεροποιήση αλκοολών κ.α. και έχει χρησιμοποιηθεί συχνά στην οργανική χημεία (Arroyo et al., 1999; Volden et al., 2009). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

224 Καθήλωση ενζύμων 189 Όλα τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας των οίκων Fluka Biochemical, Sigma Aldrich Chemie GmbH και Panreac Quimica S.A Παρασκευή σωματιδίων χιτοζάνης Τα σωματίδια χιτοζάνης παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο της τεχνικής του ιοντοτροπικού σχηματισμού πηκτής (ionotropic geletion) και η χιτοζάνη που χρησιμοποιήθηκε είναι χαμηλού μοριακού βάρους (70,000 g/mol). Για την παρασκευή των σωματιδίων, η χιτοζάνη διαλύθηκε σε οξικό οξύ 1% (v/v) σε συγκέντρωση 20 mg/ml και στη συνέχεια με τη βοήθεια σύριγγας έπεσε σε μορφή σταγόνων σε 20 ml διαλύματος τριφωσφορικού πενταβασικού νατρίου (sodium triphosphate pentabasic) (ΤΡΡ) M. Τα σωματίδια χιτοζάνης σχηματίστηκαν κατευθείαν μόλις οι σταγόνες του διαλύματος έπεσαν στο ΤΡΡ διάλυμα. Στη συνέχεια διηθήθηκαν υπό κενό και πριν την συλλογή τους έμεινα για ώρες να στεγνώσουν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος Καθήλωση λιπάσης σε σωματίδια χιτοζάνης 40 mg λιπάσης CA διαλύθηκαν σε 1 ml αποσταγμένου νερού. Στη συνέχεια το διάλυμα της λιπάσης προστέθηκε σε 2 ml φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος ph 7.0, 0.5 M, που περιείχε 200 mg σωματιδίων χιτοζάνης. Το διάλυμα αυτό έμεινε για ώρες υπό ανάδευση στους 4 ο C (Kılınc, 2006). Τα σωματίδια χιτοζάνης με την καθηλωμένη λιπάση συλλέχτηκαν με διήθηση υπό κενό, ξεπλύθηκαν δυο φορές με 10 ml αποσταγμένο νερό και αποθηκεύτηκαν στους 4 ο C μέχρι περεταίρω χρήση του. Τα διαλύματα διήθησης και πλύσης κρατήθηκαν για τον προσδιορισμό της ικανότητας καθήλωσης του φορέα (loading efficiency) Καθήλωση λιπάσης σε σωματίδια Eupergit C 500 mg Eupergit C αναμείχθηκαν με 50 ml διαλυμένης λιπάσης (1 mg/ml) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου 0.6 Μ (ph 7) στους 4 ο C. Μετά από ανάδευση 48 ωρών τα σωματίδια (beads) συλλέχθηκαν με διήθηση υπό κενό. Η μη-καθηλωμένη ποσότητα ενζύμου απομακρύνθηκε από τον φορέα με τρεις διαδοχικές πλύσεις με 20 ml ΝaCl 1Μ και στη συνέχεια με άλλες τρείς με 20 ml ρυθμιστικού διαλύματος 0.6 Μ (ph 7) φωσφορικού νατρίου και στη συνέχεια τα σωματίδια Eupergit C αποθηκεύτηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα στους 4 ο C μέχρι περαιτέρω χρήση τους. Για τον προσδιορισμό της ικανότητας καθήλωσης του φορέα χρησιμοποιήθηκε το ενζυμικό διάλυμα πριν και μετά την καθήλωση καθώς και τα διαλύματα πλύσης (Knezevic et al., 2006). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

225 Καθήλωση ενζύμων Εγκλεισμός λιπάσης σε σωματίδια αλγινικού Για τον εγκλεισμό της Candida antarctica λιπάσης σε σωματίδια αλγινικού, παρασκευάστηκε, 1 ml διαλύματος λιπάσης (10 mg/ml) και αναμίχθηκε με 8 ml διαλύματος αλγινικού νατρίου (2% w/v) (η ανάμιξη των διαλυμάτων κράτησε τόσο ώστε το τελικό διάλυμα να έχει πλήρης ομοιογένεια). Στη συνέχεια, με τη βοήθεια σύριγγας σχηματίστηκαν σταγόνες του διαλύματος αλγινικού νατρίου - λιπάσης οι οποίες μόλις ήρθαν σε επαφή με διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου 200 mm, σχηματίστηκαν τα σωματίδια αλγινικού ασβεστίου με την εγκλεισμένη λιπάση. Ύστερα από 20 λεπτά σκλήρυνσης των σωματιδίων, διαχωρίστηκαν από το διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου με διήθηση υπό κενό και πλύθηκαν δύο φορές με 5 ml 50 mm Trizma ρυθμιστικό διάλυμα ph 7.0. Όλα τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν για τον εγκλεισμό της λιπάσης, χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της ικανότητας καθήλωσης του φορέα (Won et al., 2005) Εγκλεισμός λιπάσης σε σωματίδια αλγινικού-πολυβινυλικής αλκοόλης Για την καθήλωση του ενζύμου, αρχικά παρασκευάστηκε υδατικό διάλυμα PVA (Mw 150,000) 2% (w/v). Το διάλυμα αυτό θερμάνθηκε στους 75 ο C μέχρι την πλήρη διαλυτοποίηση του PVA. Στη συνέχεια παρασκευάστηκε 20 ml διαλύματος αλγινικού νατρίου 2% (w/v) και αναμείχθηκε με το διάλυμα του PVA. Ύστερα από 12 ώρες ανάδευσης σε θερμοκρασία δωματίου προστέθηκε στο πολυβινυλικό- αλγινικό διάλυμα 10 mg λιπάσης και αναδεύτηκε για ακόμα 2 ώρες στους 4 ο C, μέχρι πλήρους ομοιογένειας του διαλύματος. Στη συνέχεια, το πολυμερικό διάλυμα με τη λιπάση με τη βοήθεια σύριγγας σχηματίστηκαν σταγόνες οι οποίες όταν ήρθαν σε επαφή με διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου βορικού οξέως (4.3% w/v το καθένα) σχηματίστηκαν τα αλγινικούπολυβινυλικής αλκοόλης σωματίδια. Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης σταυροσύνδεσης (cross-linking), τα σωματίδια συλλέχτηκαν με διήθηση και ύστερα από την πλύση τους με απεσταγμένο νερό, για αφαίρεση των αλάτων και μη καθηλωμένου ενζύμου, λυοφιλοποιήθηκαν. Για τον προσδιορισμό της ικανότητας καθήλωσης του φορέα χρησιμοποιήθηκε το ενζυμικό διάλυμα πριν και μετά την καθήλωση καθώς και τα διαλύματα πλύσης (De Queiroz et al., 2005) Προσδιορισμός πρωτεϊνών Η ποσότητα των πρωτεϊνών στα ενζυμικά παρασκευάσματα και διαλύματα πλύσης προσδιορίστηκαν με την χρωστική Coomasie Brilliant Blue C 250, βάση της μεθόδου Bradford όπως περιγράφηκε στην πειραματική διαδικασία του κεφαλαίου 2. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

226 Καθήλωση ενζύμων Ικανότητα καθήλωσης φορέα Η ικανότητα καθήλωσης/δέσμευσης (loading efficiency) των φορέων υπολογίζεται βάση της εξίσωσης [4.1] όπου προσδιορίζεται το ποσοστό του ενζύμου που καθηλώθηκε στο φορέα (Won, 2005) : Ci V i Ct V t Ι καν ότητα καθ ήλωσης (% κ. β ) = 100 C V i i [4.1] Όπου : C i : V i : C t : V t : Αρχική ποσότητα συγκέντρωσης πρωτεϊνών (mg / ml) Αρχικός όγκος του ενζυμικού διαλύματος (ml) Συνολική συγκέντρωση πρωτεϊνών στα διαλύματα πλύσης και διήθησης (mg / ml) Συνολικός όγκος των διαλυμάτων πλύσης και διήθησης (ml) Μέτρηση δραστικότητας της λιπάσης Η δραστικότητα της λιπάσης προσδιορίστηκε φασματοφωτομετρικά στα 420 nm, χρησιμοποιώντας 70 μg ελεύθερης και καθηλωμένης λιπάσης, 0.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος Tris-HCl 50 mm (ph 7), 50 μl PNP-L 1 mm διαλυμένο σε αναλυτικής καθαρότητας αιθανόλη και με δις-αποσταγμένο νερό μέχρι τελικό όγκο 1 ml. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε στου 30 ο C για 30 λεπτά. Η αντίδραση τερματίστηκε με την προσθήκη 0.25 ml 0.1 M Na 2 CO 3 και η δραστικότητα προσδιορίστηκε σε φασματοφωτόμετρο στα 420 nm. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν τρείς φορές και υπολογίστηκε ο μέσος όρος τους. Η δεσμευμένη ποσότητα του ενζύμου σε κάθε φορέα υπολογίζεται από την ικανότητα καθήλωσης του φορέα. Η απόδοση καθήλωσης του ενζύμου ορίζεται με τον τύπο [4.2]: α im Α πόδοση καθήλωσης (%) = 100 a free [4.2] Όπου: α im : α free : δραστικότητα καθηλωμένου ενζύμου (U/mg λιπάσης) δραστικότητα ελεύθερου ενζύμου (U/mg λιπάσης) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

227 Καθήλωση ενζύμων Αποτελέσματα σχολιασμός Καθήλωση λιπάσης στους διάφορους φορείς Με σκοπό να αυξηθεί η δραστικότητας της εμπορικής λιπάσης Candida antarctica Β, μελετήθηκε η καθήλωση της. Οι τεχνικές καθήλωσης που εφαρμόστηκαν ήταν καθήλωση με φυσική προσρόφηση σε σωματίδια χιτοζάνης, με ομοιοπολικό δεσμό σε σωματίδια Eupergit C και με εγκλεισμό σε σωματίδια αλγινικού και αλγινικού-πολυβινυλικής αλκοόλης. Οι αποδόσεις αυτών των τεχνικών καθήλωσης συγκρίθηκαν ως προς την απόδοση καθήλωσης του ένζυμου στους διάφορους φορείς και τη δραστικότητας της καθηλωμένης και της ελεύθερης λιπάσης. Η δραστικότητα της ελεύθερης λιπάσης είναι U/mg λιπάσης. Με την πρώτη τεχνική, το ένζυμο προσροφάτε φυσικά (με δεσμούς υδρογόνου και van der Walls) πάνω στα σωματίδια της χιτοζάνης. Το πλεονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι ότι δεν προκαλεί σχεδόν καμιά αλλαγή στη δομή του ενζύμου και του ενεργού του κέντρου. Το μειονέκτημα της μεθόδου, ωστόσο, είναι ότι η προσροφημένη λιπάση μπορεί να αποκολληθεί εύκολα από το φορέα, γιατί οι δυνάμεις της φυσικής προσρόφησης (δεσμοί υδρογόνου και van der Walls) είναι πολύ ασθενείς. Το ποσοστό του ενζύμου που προσροφήθηκε πάνω στο φορέα ήταν περίπου 70% κ.β. και η δραστικότητα του καθηλωμένου ενζύμου U/mg λιπάσης. Στη δεύτερη τεχνική, η λιπάση συνδέεται απευθείας με το φορέα Εupergit C μέσω των ομάδων οξιρανίου (oxirane-group) του (Σχήμα 4.9). Η μέθοδος αυτή σε σχέση με την τεχνική καθήλωσης με προσρόφηση, έχει το πλεονέκτημα ότι η σύνδεση ενζύμου - φορέα είναι αρκετά ισχυρή και το ένζυμο δε μπορεί να αποκολληθεί εύκολα από τον φορέα. Η απόδοση καθήλωσης των ενζύμων στο φορέα είναι 87% κ.β., με δραστικότητα U/mg λιπάσης. Σχήμα 4.9 Ομοιοπολική καθήλωση λιπάσης σε σωματίδια Εupergit 2006). C (Knezevic, ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

228 Καθήλωση ενζύμων 193 Τέλος, η μέθοδος καθήλωσης της λιπάσης με εγκλεισμό διαφέρει από τις προηγούμενες γιατί το ένζυμο δεν συνδέεται απευθείας με τον φορέα, και έτσι δεν προκαλείται αλλαγή στη δομή του ενζύμου και του ενεργού του κέντρου. Παρ όλα αυτά, όταν ο πολυμερισμός της πηκτής γίνεται μαζί με το ένζυμο για να εγκλωβιστεί, απαιτούνται σχετικά ισχυρές συνθήκες και πολλές φορές η δραστικότητα των ενζύμων ελαττώνεται σημαντικά. Αρχικά, η λιπάση, με την τεχνική αυτή, εγκλωβίστηκε σε σωματίδια αλγινικού και το ποσοστό εγκλωβισμού του φορέα ήταν 90% κ.β. με ενζυμική δραστικότητα U/ mg λιπάσης. Με σκοπό την περαιτέρω αύξηση του ποσοστού καθήλωσης και της ενζυμικής δραστικότητας, η λιπάση εγκλωβίστηκε σε αλγινικού-πολυβινυλικής αλκοόλης σωματίδια. Το ποσοστό του ενζύμου που εγκλωβίστηκε σε αυτά τα σωματίδια αυξήθηκε στο 95% κ.β., η δραστικότητα όμως της λιπάσης μειώθηκε, σε σχέση με τον εγκλεισμό σε σωματίδια αλγινικού, στα U/ mg ενζύμου. Στον Πίνακα 4.4 παρουσιάζεται η δραστικότητα ίσης ποσότητας ελεύθερης και καθηλωμένης λιπάσης στους διάφορους φορείς. Πίνακας 4.4 Ειδική δραστικότητα ελεύθερης και καθηλωμένης λιπάσης στους τέσσερις φορείς. Φορέας καθήλωσης λιπάσης Ειδική δραστικότητα (U/mg πρωτεϊνών) Ελεύθερη Σωματίδια χιτοζάνης Εupergit C Σωματίδια αλγινικού Σωματίδια αλγινικού - πολυβινυλικής αλκοόλης Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4.10 τα σωματίδια της χιτοζάνης παρουσιάζουν τη μικρότερη ικανότητα καθήλωσης της λιπάσης, σε αντίθεση με τα σωματίδια αλγινικούπολυβινυλικής αλκοόλης που εμφανίζουν τη μεγαλύτερη ικανότητα καθήλωσης του ενζύμου, και ακολουθούν τα σωματίδια αλγινικού και Εupergit C. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

229 Καθήλωση ενζύμων 194 Όπως διαπιστώνεται από το Σχήμα 4.11, η απόδοση καθήλωσης της λιπάσης στα σωματίδια χιτοζάνης ήταν μόλις 60% κ.β. Παρόμοια αποτελέσματα προκύπτουν και στη βιβλιογραφία (Foresti, 2007), όπου η δραστικότητα της λιπάσης CA μειώθηκε κατά 35% όταν καθηλώθηκε σε χιτοζάνη. Ωστόσο, η καθήλωση της Candida rugosa λιπάσης σε σωματίδια χιτοζάνης με φυσική προσρόφηση δεν επηρέασαν σημαντικά τη δραστικότητα της, η οποία ήταν παρόμοια με την ελεύθερη ομόλογη της (Nasratun et al., 2009). Ικανότητα καθήλωσης (% wt.) Eupergit C Chitosan Alginate Alginate-PVA Σχήμα 4.10 Ικανότητα καθήλωσης των τεσσάρων φορέων (Εupergit αλγινικού και αλγινικού ΡVA σωματίδια). C, χιτοζάνη, Στην περίπτωση της καθηλωμένης λιπάσης σε σωματίδια Εupergit C, η δραστικότητα του ενζύμου δεν επηρεάστηκε σημαντικά και παρουσίασε μια ελάχιστη αύξηση. Τα αποτελέσματα αυτά είναι αντίθετα με την περίπτωση της Candida rugosa λιπάση η οποία όταν καθηλώθηκε με την ίδια τεχνική σε σωματίδια Εupergit C, όπου η δραστικότητά της μειώθηκε στο 20% σε σχέση με την ελεύθερη (Knezevic et al., 2006). Επίσης από το Σχήμα 4.11 παρατηρείται ότι η απόδοση καθήλωση της λιπάσης όταν εγκλωβίστηκε σε σωματίδια αλγινικού ήταν 150%, που υποδηλώνει την αύξηση της δραστικότητας του καθηλωμένου ενζύμου σε σχέση με το ελεύθερο. Στην περίπτωση της Candida rugosa λιπάσης, η οποία καθηλώθηκε με την ίδια τεχνική σε σωματίδια αλγινικού, η δραστικότητά μετά την καθήλωση ήταν μειωμένη σε σχέση με το ελεύθερο ένζυμο (Won et al., 2005). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

230 Καθήλωση ενζύμων 195 Ωστόσο, όταν το ένζυμο εγκλωβίστηκε σε αλγινικού-πολυβινυλικής αλκοόλης σωματίδια αν και είχαν τη μεγαλύτερη ικανότητα καθήλωσης η δραστικότητα της λιπάσης δεν επηρεάστηκε σε σχέση με την ελεύθερη. Όταν η λιπάση από την Candida rugosa εγκλωβίστηκε με παρόμοια τεχνική σε σωματίδια πολυβινυλικού- αλγινικής αλκοόλης, η δραστικότητα του ενζύμου αυξήθηκε κατά 43% σε σχέση με αυτή του μη καθηλωμένου ενζύμου (Dave and Madamwar, 2006). Αντίστοιχα, η λιπάση από την Candida cylindracea, ύστερα από εγκλωβισμό της σε αλγινικού-πολυβινυλικής αλκοόλης σωματίδια, με την ίδια τεχνική εγκλεισμού που χρησιμοποιήθηκε για στην παρούσα διδακτορική διατριβή, η δραστικότητά της επίσης αυξήθηκε (De Queiroz et al., 2005) Απόδοση καθήλωσης (%) Eupergit C Chitosan Alginate Alginate-PVA Σχήμα 4.11 Απόδοση καθήλωσης της λιπάσης στους τέσσαρις φορείς (Εupergit C, χιτοζάνη, αλγινικού και αλγινικού ΡVA σωματίδια) Μορφολογία και μέγεθος φορέων καθήλωσης Με σκοπό τον έλεγχο της μορφολογίας και το μέγεθος των σωματιδίων που χρησιμοποιήθηκαν ως φορείς για την καθήλωση της λιπάσης, χρησιμοποιήθηκαν στερεοσκοπικό μικροσκόπιο για τα σωματίδια αλγινικού και χιτοζάνης και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) για τα σωματίδια αλγινικού-πολυβινυλικής αλκοόλης και Εupergit C. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

231 Καθήλωση ενζύμων 196 Από το Σχήμα 4.12 (α), (β) έχουμε ότι η μορφολογία των σωματιδίων αλγινικού και χιτοζάνης είναι παρεμφερή, είναι σφαιρικά με διάμετρο περίπου 1 mm και η επιφάνεια τους παρουσιάζει μερικές ανομοιομορφίες (μικρά βαθουλώματα και διογκώσεις). Όπως φαίνεται από το Σχήμα 4.12 (γ) τα σωματίδια αλγινικού-πολυβινυλικής αλκοόλης είναι σχεδόν σφαιρικά με διάμετρο 1.5 mm και η επιφάνεια τους παρουσιάζει μεγάλα βαθούλωμα και διογκώσεις, που την κάνουν να είναι τραχιά και δύσμορφη. Τέλος, η επιφάνεια του εμπορικού φορέα Εupergit C είναι λεία, και το σχήμα του είναι σφαιρικό με διάμετρο 0.1 mm (Σχήμα 4.12 (δ)). (α). (β) (γ) (δ) Σχήμα 4.12 Μορφολογία και μέγεθος σωματιδίων χιτοζάνης (α), αλγινικού (β), αλγινικούπολυβινυλικής αλκοόλης (γ) και Εupergit C (δ) Συμπεράσματα Με σκοπό την αύξηση της δραστικότητας της λιπάσης και την πιθανή επαναχρησιμοποίηση της, μελετήθηκαν διαφορετικοί φορείς καθήλωσης και διαφορετικές τεχνικές ακινητοποίησης ενζύμων. Στα πλαίσια αυτής της μελέτης, η εμπορική λιπάση της ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

232 Καθήλωση ενζύμων 197 Candida antarctica καθηλώθηκε αρχικά με τη μέθοδο της φυσικής προσρόφησης σε σωματίδια χιτοζάνης, που παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο του ιοντοτροπικού σχηματισμού πηκτής, στη συνέχεια με τη μέθοδο της ομοιοπολικής καθήλωσης ακινητοποιήθηκε στον εμπορικό φορέα Εupergit C και τέλος πραγματοποιήθηκε εγκλεισμός του ενζύμου σε σωματίδια αλγινικού και αλγινικού-πολυβινυλικής αλκοόλης. Ύστερα από μέτρηση του ποσοστού του ενζύμου που καθηλώθηκε στον κάθε φορέα και από τη μετέπειτα μέτρηση της ειδικής δραστικότητας της λιπάσης και σύγκριση της με τη δραστικότητα της ελεύθερης λιπάσης, διαπιστώθηκε ότι τα σωματίδια χιτοζάνης είχαν τη χαμηλότερη απόδοσης καθήλωσης και ως προς το ποσοστό καθήλωσης και ως προς τη δραστικότητα. Η καθήλωση της λιπάσης στα σωματίδια αλγινικού, αλγινικούπολυβινυλικής αλκοόλης και Εupergit C είχαν αρκετά καλές αποδόσεις ως προς το ποσοστό καθήλωσης, φτάνοντας μέχρι το 95% κ.β.. Επίσης, η δραστικότητα της λιπάσης σε σχέση με το ελεύθερο ένζυμο αυξήθηκε και στους τρεις φορείς, με τα σωματίδια αλγινικού να εμφανίζουν τη μεγαλύτερη αύξηση. Στην περίπτωση του εγκλεισμού της λιπάσης στα σωματίδια αλγινικού-πολυβινυλικής αλκοόλης, αν και το ποσοστό καθήλωσης ήταν ικανοποιητικό και η δραστικότητα της λιπάσης αυξήθηκε, η μορφολογία τους τα κάνει να μην είναι ένας ελπιδοφόρος φορέας. Σε περίπτωση επαναχρησιμοποίησης τους, υπάρχει κίνδυνος μεγάλης διαφυγής του εγκλωβισμένου ενζύμου από τις μικρές οπές που διακρίνονται στην επιφάνεια του σωματιδίου. Βιβλιογραφία 4 ου Κεφαλαίου Al-Zuhair S., Dowaidar A., Kamal H., Biochemical Engineering Journal, 44, (2009). Arroyo M., Sanchez-Montero J. M., Sinisterra J. V., Enzyme and Microbial Technology, 24, 3 12, (1999). Bornscheuer U. T., Angew. Chem. Int. Ed., 42, , (2003). Cao L., Current Opinion in Chemical Biology, 9, , (2005). Cao L., van Langeny L., Sheldon R. A., Current Opinion in Biotechnology, 14, , (2003). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

233 Καθήλωση ενζύμων 198 Chandy T., Charma C. P., Artif. Cells, Artif. Org., 18, 1, (1990). Cheetham P. S. J., Journal of Biotechnology, 66, 3 10, (1998).Dave R., Madamwar D., Process Biochemistry, 41, , (2006). Cheirsilp B., Jeamjounkhaw P., H-Kittikun A., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 59, , (2009) De Queiroz A.A.A., Passos E.D., De Brito Alves S., Silva G.S., Olga Z. Higa, Vitolo M., Journal of Applied Polymer Science, 102, , (2005). Dutta P.K., Ravikumar M.N.V., Dutta J., J Macromol Sci, C42, , (2002). End N., Schoning K.-U., Topics in Current Chemistry, 242, , (2004). Foresti M.L., Ferreira M.L., Enzyme and Microbial Technology, 40, , (2007). Guncheva M., Zhiryakova D., Radchenkova N., Kambourova M., World J Microbiol Biotechnol, 25, , (2009). Hudson SM, Smith C. Polysaccharides: chitin and chitosan: chemistry and technology of their use as structural materials. In: Kaplan DL, editor. Biopolymers from renewable resources. Berlin: Springer, p (1998). Jegannathan K.R., Abang S., Poncelet D., Chan E.S., Ravindra P., Crit Rev Biotechnol., 28(4), , (2008). Juang R.-S., Wu F.-C., Tseng R.-L., Bioresource Technology, 80, , (2001). Katchalski-Katzir, TIBETCH, 11, , (1993). Katchalski-Katzir E., Kraemer D. M., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 10, 157, (2000). Kılınc A., Teke M., Onal S. and Telefoncu A., Preparative Biochemistry & Biotechnology, 36, , (2006). Knezevic Z., Milosavic N., Bezbradica D., Jakovljevic Z., Prodanovic R., Biochemical Engineering Journal, 30, , (2006). Kraemer D. M., Lehmann K., Pennewiss M., Plainer H., Photo-beads and oxirane-beads as solid supports for catalysis and biospecific adsorption, in: H. Peeters _Ed.., Protides of Biological Fluids, 23rd Colloquium, Pergamon, Oxford, pp (1975). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

234 Καθήλωση ενζύμων 199 Kraemer D. M., Pennewiss H., Plainer H., Schnee R., Schleier W., Roehm, United States Patent , (1985). Kramera M., Cruza J. C., Pfromma P. H., Rezaca M. E., Czermak P., Journal of Biotechnology, 150, 80 86, (2010). Krajewska B., Enzyme and Microbial Technology, 35, 126, (2004). Lee D.G., Ponvel K.M., Kim M., Hwang S., Ahn I.S., Lee C.H., J. Mol. Catal. B. Enz., 57, 62-66, (2009). Lee H.K., Lee J.K., Kim M.J., Lee C.J., Bull. Korean Chem. Soc., 31, 3, (2010). Liu C.-H., Lin Y.-H., Chen C.-Y., Chang J-.S., Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 40, , (2009). Miletic N., Abetz V., Ebert K., Loos K., Macromol. Rapid Commun., 31, 71 74, (2010). Minovska V., Winkelhausen E. and Kuzmanova S., J. Serb. Chem. Soc., 70 (4), (2005). Muzzarelli R. A. A., Chitin, in: The Polysacharides, Vol. 3, G. O. Aspinal, Ed., Academic Press, New York (1985). Muzzarelli R. A. A., Chitin, Pergamon Press, Oxford, (1977). Nasratun M., Said H.A., Noraziah A., Abd Alla A.N., American Journal of Applied Sciences, 6 (9), , (2009). Palomo L. W. J. M., Fernandez-Lorente G., Illanes A., Guisan J. M., Fernandez-Lafuente R., Enzyme and Microbial Technology, 38, , (2006). Paul W., Sharma C.P., STP Pharmaceut Sci, 10, 5 22, (2000). Pennewiss M., Knoell H., Masanek H., Roehm, German Patent DE C3, Pereira E. B., De Castro H. F., De Moraes F. F., Zanin G.M., Applied Biochemistry and Biotechnology, 91-93, , (2001). Rizzi M, Stylos P, Rick A, Reuss M., Enzyme Microb Technol, 14, , (1992). Salis A., Bhattacharyya M. S., Monduzzi M., Solinas V., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 57, , (2009). Sangeetha R., Arulpandi I., Geetha A., Reasearch Journal of Microbiology, 6, 1-24, (2011). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

235 Καθήλωση ενζύμων 200 Sashiwa H., Saito K., Saimoto H., Minami S., Okamoto Y., Matsuhashi A., Shigemasa Y., in: Chitin Enzymology, Muzzarelli R. A. A., Ed., European Chitin Society, Lyon and Ancona, p. 177, (1997). Shahidi F., Arachchi J.K.V., Jeon Y.J., Food Sci Technol, 10, 37 51, (1999). Shaw J.F., Chang R.C., Wang H.J., Biotechnol Bioeng, 35, 132 7, (1990). Shigemasa Y., Minami S., Biotechnol. Gen. Eng. Rev., 13, 383, (1995). Singla A.K., Chawla M., Pharm Pharmacol, 53, , (2001). Skjik-Braek G., Martinsen A., In Seaweed Resources in Europe: Uses and Potential, ed. M. D. Guiry and G. Blunden, p. 219, (1991). Tan T., Lu J., Nie K., Deng L., Wang F., Biotechnology Advances, 28, , (2010). Telefoncu A., Dinekaya E., Vorlop K.D., Appl Biochem Biotechnol, 26, 311 7, (1990). Tharanathan R.N., Kittur F.S., Crit Rev Food Sci Nutr, 43, 61 87(2003). Tischer W., Kasche V., TIBETCH, 17, , (1999). Turkova J., Blaha K., Malanikova M., Vancurova D., Svec F., Kalal J., Biochim. Biophys. Acta, 524, 162, (1978). Uhlish T., Ulbricht M., Tomaschewski G., Enzyme Microb. Technol., 19, 124, (1996). Volden S., Moen A. R., Glomm W. R., Anthonsen T., Sjoblom J., Journal of Dispersion Science and Technology, 30, , (2009). Wisdom R.A., Dunnill P., Lilly M.D., Macrae R.A., Enzyme Microb Technol, 6, (1984). Won K., Kim S., Kim K.-J., Park H.W., Moon S.-J., Process Biochemistry, 40, (2005). Κυριακίδη Δ. Α., Βιοτεχνολογία, εκδόσεις Ζήτη, Β έκδοση, (2002). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

236 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 201 Κεφάλαιο 5 Μικροβιακή Παραγωγή Βιοπολυμερών 5.1 Συνθετικά πολυμερή Ανάμεσα από πολλά διαφορετικά υλικά που χρησιμοποιεί η ανθρωπότητα σε καθημερινή βάση, το πλαστικό είναι αναμφισβήτητα το πιο σημαντικό, λαμβάνοντας υπόψη την ευρεία χρήση τους σε διάφορες εφαρμογές, όπως είναι η συσκευασία τροφίμων, ο ρουχισμός, η επικοινωνία, η μεταφορά, τα κατασκευαστικά υλικά, η υγειονομική περίθαλψη και τα είδη αναψυχής/άνεσης. Η βιομηχανία πλαστικών είναι μια από τις πιο κερδοφόρες επιχειρήσεις και αναμένεται να αναπτυχθεί περαιτέρω, ειδικά λόγο της αύξησης της ζήτησης τους στις αναπτυσσόμενες χώρες όπως είναι η Κίνα και η Ινδία καθώς και άλλες χώρες της νοτιοανατολικής Ασίας. Μέχρι πρόσφατα, σχεδόν όλα τα πλαστικά που χρησιμοποιούνται ευρέως σε διάφορους τομείς, παράγονται από πετροχημικά προϊόντα (Sudesh and Iwata, 2008). Τα συνθετικά πολυμερή, γνωστά και ως πλαστικά, αποτελούν, από το 1940, ένα πολύ σημαντικό κομμάτι των υλικών καθημερινής χρήσης. Από τότε που ανακαλύφθηκαν έχουν αντικαταστήσει πολλά υλικά όπως είναι το γυαλί, το ξύλο και άλλα κατασκευαστικά υλικά, ακόμα και μέταλλα σε πολλές βιομηχανικές, οικιακές και περιβαλλοντικές εφαρμογές (Ojumu et al., 2004; Keshavarz and Roy, 2010). Αυτές οι ευρέως διαδεδομένες εφαρμογές δεν οφείλονται μόνο στις ευνοϊκές μηχανικές και θερμικές τους ιδιότητες, αλλά ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

237 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 202 κυρίως λόγω τη σταθερότητας τους και την αντοχής τους (Rivard et al., 1995). Τα πλαστικά, επίσης παίζουν ένα σημαντικό ρόλο για πολλές εφαρμογές «σύντομης ζωής» όπως είναι οι συσκευασίες πακεταρίσματος, κάτι που αποτελεί την κύρια προέλευση των πλαστικών αποβλήτων (Witt et al., 1997; Muller et al., 2001, Ojumu et al., 2004). Ωστόσο, τα υλικά που προέρχονται από συνθετικά πολυμερή δεν είναι βιοδιασπώμενα, καθώς παρασκευάζονται από πλαστικά που είναι παράγωγα της βιομηχανίας πετρελαίου. Η γρήγορη ανάπτυξη της επιστήμης των υλικών, δημιούργησε καινούρια πλαστικά προϊόντα με ευνοϊκές μηχανικές ιδιότητες και με μεγάλη αντοχή. Παρόλα αυτά, τα πλαστικά προϊόντα συνήθως έχουν εφαρμογές μιας χρήσεως, ειδικά στις συσκευασίες τροφίμων και στα ιατρικά υλικά. Καθώς αυτά τα πλαστικά υλικά δεν είναι βιοδιασπώμενα, καταλήγουν να συσσωρεύονται στο οικοσύστημα. Η συνολική παγκόσμια αγορά των πλαστικών προϊόντων είχε μια δραματική αύξηση από τα 1.5 εκατομμύρια τόνους το 1950 στα 245 εκατομμύρια τόνους το 2008, ένας ετήσιος ρυθμός αύξησης της τάξης του 9%. Οι περιοχές με τη μεγαλύτερη αύξηση κατανάλωσης πλαστικών υλικών είναι στις ταχέως αναπτυσσόμενες ασιατικές χώρες (με εξαίρεση την Ιαπωνία), όπου η τρέχουσα κατανάλωση πλαστικών ανά άτομο είναι περίπου 20 kg (Chanprateep, 2010). Στη δυτική Ευρώπη το 2007, 43% όλων των πλαστικών χρησιμοποιήθηκε στη συσκευασία, 21% στην κατασκευή κτηρίων, 8% στην αυτοκινητοβιομηχανία, 5% για ηλεκτρικές και ηλεκτρονικές συσκευές και το υπόλοιπο 23% χρησιμοποιήθηκε για διάφορες άλλες εφαρμογές. Η πλειοψηφία των πολυμερών που χρησιμοποιούνται είναι πολυολεφίνες για παράδειγμα πολυαιθυλένιο (ΡΕ), πολυπροπυλένιο (ΡΡ), τα οποία μαζί αντιπροσωπεύουν το 53% και ακολουθεί το πολυβινυλοχλωρίδιο (PVC) 14%, το οποίο χρησιμοποιείται κυρίως στον κατασκευαστικό τομέα και το τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο (ΡΕΤ) 8% (Shen et al., 2010). H συσσώρευση των πλαστικών στο περιβάλλον έχει γίνει ένα παγκόσμιο πρόβλημα. Λύσεις για τη διαχείριση των πλαστικών αποβλήτων περιλαμβάνουν την αποτέφρωση, την ανακύκλωση και την βιο- ή φώτο-διάσπαση. Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές έχουν προβλήματα που συσχετίζονται με αυτά. Η αποτέφρωση των πλαστικών είναι πιθανόν επικίνδυνη και μπορεί να είναι ακριβή. Κατά τη διάρκεια της καύσης των πλαστικών αποβλήτων μπορεί να σχηματιστεί υδροκυάνιο από ακρυλονιτριλιούχα πλαστικά και μπορεί να προκαλέσουν σοβαρά προβλήματα υγείας. Η ανακύκλωση μπορεί να επιτευχθεί αλλά η διεργασία είναι πολύπλοκη και οικονομικά ασύμφορη. Η διαλογή της ευρείας ποικιλίας των απορριφθέντων πλαστικών υλικών είναι επίσης μια πολύ χρονοβόρα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

238 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 203 διαδικασία. Επιπλέον, η παρουσία μιας μεγάλης ποικιλίας προσθετικών ουσιών όπως οι χρωστικές, οι επιστρώσεις, τα πληρωτικά περιορίζουν την χρήση των ανακυκλωμένων υλικών (Khanna and Srivastava, 2005). Εκτός από τα περιβαλλοντικά προβλήματα που προκαλούν τα πετροχημικά πλαστικά, πρόσφατα δημιουργήθηκε η επιθυμία να μειωθεί η εξάρτηση του πετρελαίου με τα υλικά που χρησιμοποιούνται καθημερινά από τον άνθρωπο, λόγω της μελλοντικής πρόβλεψης έλλειψης αυτών των φτηνών ορυκτών πόρων. Η εκτεταμένη χρήση του πετρελαίου επίσης συνεισφέρει στην αύξηση των εκπομπών του CO 2 στην ατμόσφαιρα, κάτι που θεωρείται μια από τις κυριότερες αιτίες για το φαινόμενο του θερμοκηπίου και την κλιματολογική αλλαγή. (Sudesh and Iwata, 2008). Καθώς, όμως, είναι πολύ δύσκολο να μειωθεί η κατανάλωση των πλαστικών προϊόντων λόγω των πολλαπλών εφαρμογών τους, γίνονται προσπάθειες αντικατάστασης των συνθετικών πλαστικών με εναλλακτικά υλικά που έχουν παρόμοιες ιδιότητες με τα πολυμερή και διασπόνται αμέσως μετά την απόρριψη τους. Όλα αυτά τα θέματα, παρέχουν ένα ισχυρό κίνητρο για την ανάπτυξη τεχνολογιών για την παραγωγή βιοδιασπώμενων πλαστικών, τα οποία προσφέρουν την καλύτερη λύση για τους περιβαλλοντικούς κίνδυνους που προέρχονται από τα πετροχημικά πλαστικά. 5.2 Βιοπολυμερή Ο όρος «βιοπολυμερές» αναφέρεται όχι μόνο στα φυσικά πολυμερικά υλικά αλλά επίσης και στις φυσικές ουσίες που έχουν πολυμεριστεί σε υψηλού μοριακού βάρους υλικά με χημικές και / ή βιολογικές μεθόδους. Για αυτό το λόγο, στα βιοπολυμερή περιλαμβάνονται μια ποικιλία συνθετικών πολυμερών που προέρχονται από ανανεώσιμες πηγές και CO 2, όπως είναι τα πολυνουκλεοτίδια, τα πολυαμίδια, οι πολυσακχαρίτες, οι πολυανυδρίτες, και οι πολυφαινόλες, τα παράγωγα τους και συνθετικά μείγματα τους (Sudesh and Iwata, 2008). Η ιστορία των βιοπολυμερών είναι πιο παλιά από αυτή των πετροχημικών πλαστικών. Το πρώτο τεχνητό θερμοπλαστικό, η ζελατίνη (celluloid), εφευρέθηκε στην δεκαετία του Από τότε αρκετές εφευρέσεις έχουν κατοχυρωθεί με διπλώματα ευρεσιτεχνίας από καινούρια συστατικά και υλικά που έχουν κατασκευαστεί από βιολογικούς πόρους, όπως είναι η παραγωγή του αιθυλενίου από την αφαίρεση του υδροξυλίου της αιθανόλης το Ωστόσο, πολλές εφευρέσεις που έγιναν από το 1930 μέχρι το 1940 έμειναν στα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

239 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 204 εργαστήρια και δεν εκμεταλλεύτηκαν εμπορικά, λόγω της ανάπτυξης φτηνών συνθετικών πολυμερών από αργό πετρέλαιο το Η πετρελαιοχημική βιομηχανία από τότε απογειώθηκε και τα πλαστικά έγιναν μια καθημερινή ανάγκη (Shen et al., 2009, 2010). Παρόλα αυτά, το πρόβλημα της αύξησης των στερεών αποβλήτων η ανησυχία του κόσμου για το περιβάλλον, οι κλιματολογικές αλλαγές και τα περιορισμένα αποθέματα ορυκτών καυσίμων έγιναν οι κυριότεροι λόγοι για να επανέλθουν τα βιοπλαστικά στο προσκήνιο την τελευταία δεκαετία (Shen et al., 2010). Οι εξελίξεις τα τελευταία δέκα χρόνια στα αναδυόμενα βιοπλαστικά είναι εντυπωσιακές. Αρκετές παλιές τεχνικές επανήλθαν στο προσκήνιο, όπως είναι η χημική αφαίρεση του υδροξυλίου της αιθανόλης που οδηγεί σε αιθυλένιο, ένα σημαντικό ενδιάμεσο χημικό προϊόν, το οποίο μπορεί στην συνέχεια να μετατραπεί σε πολυαιθυλένιο (ΡΕ), πολυβινυλοχλωρίδιο (PVC) και άλλα πλαστικά Άλλα παραδείγματα είναι το PLA, το οποίο μπορεί να παραχθεί από γαλακτικό οξύ από ζύμωση σακχάρων και τα ΡΗΑs, τα οποία μπορούν να παραχθούν με τη βοήθεια μικροοργανισμών από φυτικά λάδια ή άλλες φυσικές πρώτες ύλες (Shen et al., 2010). Οι μέθοδοι παραγωγής των βιοπολυμερών μπορούν να κατηγοριοποιηθούν στις ακόλουθες τρείς κύριες κατηγορίες, οι οποίες είναι βασισμένες στη διαδικασία παραγωγής και το είδος του πολυμερούς (Sudesh and Iwata, 2008). Χημικός πολυμερισμός μονομερών που προέρχονται από βιολογικές πρώτες ύλες, π.χ. PLA Απευθείας βιοσύνθεση των πολυμερών σε μικροοργανισμούς, π.χ. πολύυδροξυαλκανοϊκά (ΡΗΑ) Τροποποίηση φυσικών πολυμερών π.χ. άμυλο και κυτταρίνη. Αντίθετα με τα PLA και PHA τα αμυλούχα πολυμερή χρειάζεται να τροποποιηθούν χημικά με σκοπό να αντικατασταθούν κάποιες υδροξυλικές ομάδες από άλλες χημικές ομάδες όπως οι ομάδες του εστέρα ή του αιθέρα. Άλλη μορφή χημικής τροποποίησης συμπεριλαμβάνει την σταυροσύνδεση (cross-linking) δυο υδροξυλικών ομάδων από γειτονικά μόρια του αμύλου. Για τις περισσότερες εφαρμογές, το τροποποιημένο άμυλο αναμειγνύεται με συνθετικά ή βιο-διασπώμενα πολυμερή, με σκοπό να μειωθεί η υδροφιλικότητα και να βελτιωθεί η επεξεργασιμότητά τους (Bastioli, 2005; Sudesh and Iwata, 2008). Οι μικροοργανισμοί του εδάφους αποικοδομούν εύκολα τον άμυλο, διαχωρίζοντας το πολυμερές στα μονομερή του. Αυτό καταλήγει σε σημαντική μείωση του χρόνου αποικοδόμησης. Όμως, αυτού του είδους πλαστικών είναι μόνο μερικώς ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

240 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 205 αποικοδομήσιμα. Τα κομμάτια που μένουν μετά την αφαίρεση του αμύλου μένουν στο περιβάλλον για μεγάλο χρονικό διάστημα (Khanna and Srivastava, 2005). Οι τεχνολογίες για την μεταποίηση του φυσικού αμύλου σε θερμοπλαστικά υλικά μέσω χημικών, θερμικών και/ ή μηχανικών μέσων είναι σχετικά καλά εδραιωμένες και επιτυχώς εμπορευματοποιημένες. Σε αντίθεση, τα PLA και ΡΗΑ είναι ανερχόμενα θερμοπλαστικά υλικά που έχουν τραβήξει την προσοχή ως βιοπλαστικά της επόμενης γενιάς (Sudesh and Iwata, 2008). Το PLA χρησιμοποιείται σε κλινικές συσκευές λόγω της υψηλής μηχανικής του αντοχής, της βιοσυμβατοτητάς του καθώς και της απουσίας τοξικότητας τόσο του ίδιου όσο και των προϊόντων αποικοδομησής του, η οποία δεν πραγματοποιείται με ενζυμικό τρόπο (Shimao, 2001). Τα ΡΗΑs είναι τα μόνο 100% βιοδιασπώμενα πολυμερή, τα οποία συντίθενται ενδοκυτταρικά από αρκετούς μικροοργανισμούς ως αποθήκευση ενέργειας. Έχουν ιδιότητες παρόμοιες με αυτές αρκετών συνθετικών θερμοπλαστικών όπως του πολυπροπυλενίου και για αυτό μπορούν να τα αντικαταστήσουν. Επίσης είναι τελείως διασπώμενα σε νερό και διοξείδιο του άνθρακα υπό αερόβιες συνθήκες και σε μεθανόλη υπό αναερόβιες συνθήκες από μικροοργανισμούς που βρίσκονται στο έδαφος, σε υδάτινους πόρους, καθώς και σε απόνερα (Khanna and Srivastava, 2005). Στον Πίνακα 5.1 αναφέρονται τα εμπορικής σημασίας βιοπολυμερή, καθώς και σημερινοί και παλαιότεροι παραγωγή τους. 5.3 Βιοπολυμερή στη βιομηχανία Αναλογίζοντας ότι η αγορά των βιοπλαστικών είναι σχετικά καινούρια, θα περίμενε κανείς ότι οι εταιρίες που ασχολούνται με αυτόν τον τομέα είναι περιορισμένες. Ωστόσο, το 2009 περίπου 180 εταιρίες παγκοσμίως έχουν ταξινομηθεί στην βιομηχανία των βιοπλαστικών. Από αυτές τις 180 εταιρίες, μια ομάδα των 45, παράγει συνολικά 400 χιλιάδες τόνους το χρόνο βιοπλαστικών σε 14 διαφορετικές χώρες, με την υψηλότερη συγκέντρωση υμενίων (films) στις Η.Π.Α., στη γερμάνια και την Ιαπωνία όπως φαίνεται και στο Σχήμα 5.1. Από την άλλη μεριά, εκτός από τις 45 βιομηχανίες, 11 παράγουν περισσότερο από μια ομάδα βιοπλαστικών σε κλίμακες περισσότερες από 10 χιλιάδες τόνους τον χρόνο. Στο Σχήμα 5.2 παρουσιάζεται η κατανομή των αριθμών των εταιριών σε ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

241 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 206 όλο τον κόσμο, σε σχέση με τις ομάδες των βιοπλαστικών (Queiroz and Collares-Queiroz, 2009). Πίνακας 5.1 Εμπορικά πολυμερή και η προέλευση τους (Sudesh and Iwata, 2008). Κατηγορία Βιοπολυμερή Παραγωγός Εμπορική ονομασία Βιο- Χημιοσυνθετικά πολυμερή Πολυ-γαλακτικό οξύ NatureWorks, U.S. NatureWorks Hycail, Netherlands Hycail HM; Hycail LM Mitsui Chemicals, Japan Lacea Toyota, Japan U'z Βιοσυνθετικό πολυμερές Πολύ-υδροξυαλκανοϊκός εστέρας Biomer, Germany Biomer Telles, USA Mirel TM Mitsubishi Gas, Japan Biogreen PHB Industrial S/A, Brazil Biocycle Metabolix, U.S. Biopol Kaneka, Japan Τροποποιημένο φυσικό πολυμερές Αμυλούχα πολυμερή Novamont, Italy Mater-Bi Κυτταρινικά παράγωγα BIOP, Germany Japan Corn Starch, Japan Daicel Chemical Industries, Japan BIOpar Cornpol Cellgreen ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

242 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 207 Ιαπωνία 6 Αγγλία 3 Γαλλία 3 Ιταλία 2 Καναδάς 2 Βραζιλία 2 Γερμανία 8 Άλλες 9 Η.Π.Α. 10 Σχήμα 5.1 Κατανομή αριθμών εταιριών που παράγουν βιοπλαστικά ανά χώρα (Queiroz and Collares-Queiroz, 2009). PHA 9 PLA 9 SBT 12 CEL 5 BPA 3 Άλλα 6 BPE 3 PBS 2 PTT 3 PCL 3 BPUR 2 LIG 2 Σχήμα 5.2 Κατανομή αριθμών εταιριών ανά είδος παραγόμενου βιοπολυμερούς (Queiroz and Collares-Queiroz, 2009). H ανερχόμενη αγορά των βιοπλαστικών αναπτύσσεται ραγδαία, καθώς ανάμεσα στις χρονικές περιόδους 2003 και 2007 ο μέσος ετήσιος ρυθμός ανάπτυξης έφτανε κοντά στο 40% παγκοσμίως και κοντά 50% στις χώρες της Ευρώπης (Shen et al., 2010). Το 2005 η συνολική ζήτηση των βιοδιασπώμενων πολυμερών στη βόρεια Αμερική, στη δυτική Ευρώπη και Ασία έφτασε τους τόνους, τα οποία εκτιμούνται στα $280 εκατομμύρια, ενώ έχει υπολογιστεί ότι η κατανάλωση των βιοδιασπώμενων πολυμερών σε αυτές τις τρείς περιοχές, το 2010 θα αυξηθεί στα 230,000 τόνους με μια αύξηση που θα αντιπροσωπεύει το 22% αυτά τα 5 χρόνια (Akaraonye et al., 2010). Σύμφωνα με ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

243 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 208 ανακοινώσεις των εταιριών παραγωγής βιοπολυμερών, η παγκόσμια δυναμικότητα των βιοπλαστικών αναμένεται να αυξηθεί από 0.36 Mt το 2007 σε 2.32 Mt το 2013 και σε 3.45 Mt το 2020 (Σχήμα 5.3 ). Ωστόσο, η ανάπτυξη των ανερχόμενων βιοπλαστικών τα τελευταία 5 χρόνια είναι θεαματική από τεχνολογικής απόψεως. Το 2003 τα μόνα βιοπλαστικά που παράγονταν σε μεγάλη κλίμακα, ήταν τα αμυλούχα πλαστικά και τα PLA, πού ήταν και τα πρωτοπόρα στην αναγέννηση των βιοπλαστικών (Σχήμα 5.4). Σήμερα, τα αμυλούχα πλαστικά και τα PLA εξακολουθούν να είναι τα πιο σημαντικά βιοπλαστικά στην αγορά, ωστόσο, και άλλα βιοπλαστικά, όπως το ΡΕ και το ΡΗΑ, έχουν αρχίσει να παράγονται σε μεγάλη κλίμακα. (Shen et al., 2010). Δυναμικότητα (εκατομμύρια τόνους ετησίως) Αλλα Βιομονομερή ΡΗΑ Βιοαιθυλένιο PLA Αμυλούχα πλαστικά (υποθετική) 2020(υποθετική) Σχήμα 5.3 Παγκόσμια δυναμικότητα βιοπλαστικών μέχρι το 2020 βασισμένη σε ανακοινώσεις εταιριών (Shen et al., 2010). Επίσης, πρόσφατα τεχνολογικά επιτεύγματα, επέτρεψαν τη σημαντική βελτίωση στις ιδιότητες των βιοπλαστικών, όπως είναι η ανθεκτικότητα στη θερμότητα (π.χ. για τα PLA) και αντοχή σε εφελκυσμό (π.χ. για τα ΡΗΑ). Αυτό κάνει τα βιοπλαστικά πιο ελκυστικά για ένα μεγαλύτερο εύρος εφαρμογών. (Shen et al., 2010). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

244 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών :100 kt 2007: 360 kt Αμυλούχα πλαστικά 25% PLA 75% Ανάπτυξη 38% ανά χρόνο Κυτταρίνη/PHA/ PTT/PA/PUR 11% Βιο-μονομερή (π.χ. αιθυλένιο,ech ) 3% Αμυλούχα πλαστικά 43% PLA 42% Σχήμα 5.4 Παγκόσμια δυναμική παραγωγής ανερχόμενων βιοπολυμερών στα έτη 2003 και Πολύ-υδροξυαλκανοϊκοί εστέρες (ΡΗΑs) Τα πολύ-υδροξυαλκανοϊκά (ΡΗΑs) είναι γνωστά ως μια κατηγορία βιοδιασπώμενων πολυεστέρων που έχουν προωθηθεί ως φιλικά προ το περιβάλλον εναλλακτικά των πετροχημικών πλαστικών (Lenz and Merchessault, 2005), τα οποία είναι γραμμικοί πολυεστέρες του τύπου κεφαλή-ουρά. Τα ΡΗΑs συντίθενται από μονομερή υδροξυλιπαρών οξέων, όπου δυο διαφορετικά μονομερή σχηματίζουν εστερικό δεσμό με την καρβοξυ-ομάδα και την υδροξυομάδα (Madisson and Huisman, 1999; Verlinder et al., 2007). Μια μεγάλη ποικιλία βακτηρίων Gram-αρνητικών και θετικών όπως Pseudomonas, Bacillus, Rastonia, Aeromonas, Rhodobacter, μπορούν να συνθέσουν πολύυδροξυαλκανοϊκά, τα οποία λειτουργούν ως συστατικά αποθήκευσης άνθρακα και ενέργειας και βρίσκονται στο εσωτερικό του κυττάρου ως αδιάλυτοι κόκκοι μέσα στο κυτταρόπλασμα (Αnderson and Dawes, 1990). Μέχρι στιγμής έχουν ανακαλυφθεί περισσότεροι από 300 μικροοργανισμοί όπου έχουν αυτή την ικανότητα (Salehizadeh and Van Loosdrecht, 2004). Τα βακτήρια αρχίζουν τη συσσώρευση του ΡΗΑ συνήθως ως ανταπόκριση σε κάποιο μεταβολικό στρες, όπως είναι οι συνθήκες έλλειψης διατροφικών συστατικών οι οποίες είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη του βακτηρίου, π.χ. το άζωτο, ο φώσφορος, το θείο, το οξυγόνο ή το μαγνήσιο, ενώ παράλληλα βρίσκεται σε περίσσεια κάποια πηγή άνθρακα (Lee, 1996; Αnderson and Dawes, 1990). Ωστόσο, τη στιγμή που το διατροφικό συστατικό ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

245 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 210 που λείπει προμηθεύεται στο κύτταρο, το παραγόμενο ΡΗΑ διασπάται και χρησιμοποιείται για τις ανάγκες του βακτηρίου (Khanna and Srivastava, 2005). Μέχρι στιγμής, έχουν ανακαλυφθεί περισσότερα από 150 διαφορετικά είδη ΡΗΑs, ομοπολυμερή και συμπολυμερή, ενώ ο αριθμός αυτός συνεχώς αυξάνεται (Lu et al., 2009). Στον Πίνακα 5.2 παρουσιάζονται μερικά από τα σημαντικότερα ΡΗΑs. Σε όλα τα ΡΗΑs που έχουν χαρακτηριστεί μέχρι στιγμής, η στερεοχημική διαμόρφωση των μονομερών τους είναι πάντοτε R(-), λόγω της στερεοειδικότητας των υπεύθυνων για την παραγωγή ενζύμων (Verlinden et al., 2007; Akaraonye et al., 2010). Ωστόσο, μόνο στην περίπτωση της σύνθεσης από το μικροοργανισμό Rhodococcus sp., ανιχνεύτηκαν μονομερή με S(-) στερεοχημική διαμόρφωση (Πενλόγλου, 2010). Η πιο συνηθισμένη μορφή των PHAs είναι αυτή όπου η υδροξυ-ομάδα εμφανίζεται στο τρίτο άτομο άνθρακα της μονάδας του μονομερούς, οπότε και για αυτό αναφέρονται ως πολύ(3-υδροξυαλκανοϊκά). Υπάρχουν όμως και περιπτώσεις όπου η πλευρική αλυσίδα βρίσκεται στο τέταρτο, πέμπτο ή έκτο άτομο άνθρακα, με αποτέλεσμα το σχηματισμό των πολύ-(4- ή 5- ή 6- υδροξυαλκανοϊκών) εστέρων αντίστοιχα (Mandisson and Huisman, 1999; Verlinden et al., 2007). Τα ΡΗΑs ανάλογα με τον αριθμό των ατόμων άνθρακα στην αλυσίδα τους μπορούν να χωριστούν σε δυο κατηγορίες: Στα μικρού μήκους αλυσίδας (SCL), στην οποία αποτελούνται τα ΡΗΑs με 3-5 άτομα άνθρακα και Στα μεσαίου μήκους αλυσίδας (MCL), στην οποία αποτελούνται τα ΡΗΑs με 6-14 άτομα άνθρακα. Ο διαχωρισμός αυτός οφείλεται κυρίως στην εξειδίκευση του υποστρώματος της ΡΗΑσυνθάσης, η οποία μπορεί να συνθέσει 3ΗΑs ενός συγκεκριμένου εύρους μήκους αλυσίδας. Η ΡΗΑ συνθάση του Alcaligenes eutrophus μπορεί να πολυμερίσει 3ΗΑs που αποτελείται από 3-4 άτομα άνθρακα, ενώ στο βακτήριο Pseudomonas oleovorans μπορεί να πολυμερίσει μόνο 3ΗΑs που αποτελείται από 6-14 άτομα άνθρακα (Khanna and Srivastava, 2005). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

246 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 211 Πίνακας 5.2 Δομή σημαντικότερων ομοπολυμερών των ΡΗΑs. (scl-phas: μικρού μήκους αλυσίδας ΡΗΑs, mcl-phas: μεσαίου μήκους αλυσίδας ΡΗΑs). n = m R Ονομασία εστέρα Τύπος scl-phas 1 H Πολυ (3-υδροξυ προπιονικός) P(3HP) 1 CH 3 Πολυ (3-ύδροξυ βουτυρικός) P(3HB) 1 C 2 H 5 Πολυ (3-ύδροξυ βαλερικός) P(3HB) 2 H Πολυ (4-ύδροξυ βουτυρικός) P(4HB) 3 H Πολυ (5-υδροξυ βαλερικός) P(5HV) mcl-phas 1 C 3 H 7 Πολυ (3-ύδροξυ εξανοϊκός) P(3HHx) 1 C 4 H 9 Πολυ (3-ύδροξυ επτανοϊκός) P(3HHp) 1 C 5 H 11 Πολυ (3-ύδροξυ οκτανοϊκός) P(3HO) 1 C 6 H 13 Πολυ (3-ύδροξυ εννεανοϊκός) P(3HN) 1 C 7 H 15 Πολυ (3-ύδροξυ δεκανοϊκός) P(3HD) 1 C 9 H 17 Πολυ (3-ύδροξυ δωδεκανοϊκός) P(3DD) Ένας παράγοντας που επηρεάζει κατά πολύ τις φυσικές ιδιότητες των πολυμερών, όπως το σημείο τήξης, η θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης και η κρυσταλλικότητα, είναι τo μήκος της πλευρικής αλυσίδας και οι λειτουργικές της ομάδες. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να μην έχουν όλα τα είδη ΡΗΑs τις ίδιες φυσικές ιδιότητες. Έτσι, τα ΡΗΑ μικρού μήκους αλυσίδας είναι σκληρά και εύθραυστα με υψηλό ποσοστό κρυσταλλικότητας, με υψηλό σημείο τήξης και χαμηλή θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης. Ενώ τα ΡΗΑ μεσαίου μήκους αλυσίδας είναι ελαστικά με χαμηλή κρυσταλλικότητα και αντοχή σε εφελκυσμό όμως με υψηλή επιμήκυνση κατά τη θραύση. Επίσης, έχουν χαμηλό σημείο τήξης και θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης σε σχέση με ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

247 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 212 τα scl-ρηαs (Gagnon et al., 1992; Philip et al., 2007; Akaraonye et al., 2010). Οι φυσικές ιδιότητες των ΡΗΑs συνοψίζονται στον Πίνακα 5.3 και συγκρίνονται με αυτές του πολυπροπυλενίου (PP). Πίνακας 5.3 Σύγκριση φυσικών ιδιοτήτων scl-phas και mcl-phas με το πολυπροπυλένιο (PP) (Akaraonye et al., 2010). Ιδιότητες scl-phas mcl-phas Πολυπροπυλένιο Κρυσταλλικότητα (%) Σημείο τήξης ( o C) Θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης ( o C) Πυκνότητα (g/cm 3 ) Αντοχή σε εφελκυσμό (MPa) Επιμήκυνση κατά τη θραύση (%) Ανθεκτικότητα σε ακτίνες UV Καλή Καλή Χαμηλή Ανθεκτικότητα σε διαλύτες Χαμηλή Χαμηλή Καλή Βιοαποικοδομησιμότητα Καλή Καλή Μηδενική Τα ΡΗΑs έχουν ελκυστικό εμπορικό ενδιαφέρον ως πλαστικά υλικά λόγω της μεγάλης τους ομοιότητας με τις φυσικές ιδιότητες με αυτές των συνθετικών πολυμερών όπως αυτή του πολυπροπυλενίου, όπως διαπιστώνεται και από τον Πίνακα 5.3. Το κυριότερο πλεονέκτημα των PHAs είναι ότι και οι φυσικές τους ιδιότητες και ο ρυθμός αποικοδόμησής τους μπορεί να μεταβληθεί αλλάζοντας τη βακτηριακή πηγή του πολυμερούς και τις αντίστοιχες συνθήκες καλλιέργειας. Τα ΡΗΑs είναι οπτικά ενεργοί βιολογικοί πολυεστέρες, οι οποίοι είναι αδιάλυτοι στο νερό και παρουσιάζουν ένα υψηλό βαθμό πολυμερισμού που κυμαίνεται σε μοριακά βάρη από 10 5 έως 10 7 Da. Οι μηχανικές ιδιότητές τους και η βιοσυμβατότητα τους μπορούν να βελτιωθούν αναμειγνύοντάς τα με άλλα πολυμερή, τροποποιώντας την επιφάνεια τους ή συνδυάζοντάς τα με άλλα ανόργανα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

248 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 213 υλικά, μετατρέποντας τα χρήσιμα για εύρη φάσμα εφαρμογών (Kang et al., 2001; Scandola et al., 1997; Akaraonye et al., 2010). 5.5 ΡΗΑs στη Βιομηχανία Τα πολύ-υδροξυαλκανοϊκά τα οποία ανήκουν στην κατηγορία των βιο-πολυεστέρων έχουν ιδιαίτερα ελκυστικές ιδιότητες για εφαρμογές θερμικών διεργασιών, βρίσκονται στην ακμή της μαζικής παραγωγής τους. Η ιστορία της εμπορευματοποίησης των PHAs ξεκίνησε το 1959 όπου η W.R. Grace and Company παρήγαγαν ΡΗΒ στις Η.Π.Α. για πιθανές εμπορικές εφαρμογές (Baptist, J.N., (Assignor to W.R. Grace & Co., New York) U.S. Patent No , 1965). Παρόλα αυτά, η εταιρία σταμάτησε τη διεργασία αυτή λόγω της χαμηλής παραγωγικότητας και της έλλειψης ικανοποιητικών μεθόδων καθαρισμού. Από τότε αρκετές βιομηχανίες προσπάθησαν να εμπορευματοποιήσουν τα ΡΗΑs, οι περισσότερες από τις οποίες ήταν ανεπιτυχείς, μέχρι το 2000, όπου η πρώτη πιλοτική μονάδα του ΡΗΑ (ΡΗBV) ξεκίνησε από την ΡΗΒ Industrial στην Βραζιλία με δυναμικότητα των 50 t.p.a. Στη συνέχεια, το 2003, η πρώτη βιομηχανική μονάδα για ΡΗΑ (ΡΗBV) παραγωγή σε κλίμακα κιλοτόνων πραγματοποιήθηκε στην Κίνα από την εταιρία Tianna Biological Material Co. Ltd στο Ningbo, και το 2007 η δυναμικότητα της παραγωγής αυξήθηκε στα 2000 t.p.a. (Shen et al., 2009; Chanprateep, 2010). Πρόσφατα, έχουν αναφερθεί αρκετές μονάδες μαζικής παραγωγής ΡΗΑs. Η Telles μια Αμερικάνικη εταιρία που σχηματίστηκε από τις εταιρίες Metabolix και ADM (Archer Daniels Midland) ανακοίνωσαν μια μεγάλης κλίμακας επένδυση στην παραγωγή του ΡΗΑ στο Clinton, Iowa. Η μονάδα αναμένεται να ξεκινήσει στα μέσα του 2009 με ετήσια παραγωγή περίπου τόνους. Η εταιρία Tianan επίσης, ανακοινώσε την αύξηση της δυναμικότητα της από τους 2000 τόνους στους τόνους τον χρόνο, μέσα στο Η Γερμανική χημική εταιρία DSM ανακοίνωσε ότι θα επενδύσει σε μονάδες ΡΗΑ μαζί με την Κινέζικη εταιρία βιοπλαστικών, Tianjin Green Bio-Science Co. Η εταιρία θα ξεκινήσει την παραγωγή του ΡΗΑ με ετήσια δυναμική τόνους το χρόνο το Η Γιαπωνέζικη εταιρία Kaneka σκοπεύει να παράγει t.p.a PHBHx το 2010 (Shen et al., 2009). Ένα σημαντικό μειονέκτημα για την εμπορευματοποίηση των PHAs είναι η πολύ υψηλή τιμή τους σε σχέση με τα υλικά των πετροχημικών πλαστικών. Μέχρι το 1997 η Zeneca Bio Products (Billingham, UK), παρήγαγε περίπου 1000 τόνους το χρόνο το ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

249 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 214 συμπολυμερές PHB/V του οποίου η εμπορική ονομασία ήταν BIOPOL TM με τιμή πώλησης 16 $/kg. Η τιμή, όμως, ενός πετροχημικού πλαστικού όπως είναι το πολυαιθυλένιο ή το πολυπροπυλένιο, ήταν λιγότερο από 1 $/kg. Συγκρίνοντας αυτές τις τιμές τα ΡΗΑs μπορούν να θεωρηθούν πολύ ακριβά και ασύμφορα για οποιαδήποτε χρήση τους. Ωστόσο, είναι άδικο να γίνεται σύγκριση της τιμής των ΡΗΑs με το πολυαιθυλένιο ή το πολυπροπυλένιο καθώς τα τελευταία δεν είναι βιοδιασπώμενα. Για αυτό η σύγκριση τιμών θα πρέπει να γίνεται με άλλα βιοδιασπώμενα πλαστικά όπως είναι το PLA και τα αμυλούχα πλαστικά που η τιμή τους κυμαινόταν το 1997 στα 5-12 $/kg (Choi and Lee, 1997). Από τότε, αρκετές μελέτες έχουν γίνει για τη μείωση του κόστους παραγωγής του ΡΗΑ ειδικά σε ότι αφορά τις πρώτες ύλες που χρησιμοποιούνται στη διεργασία παραγωγής καθώς και για τον καθαρισμό του πολυμερούς (Jacquel et al., 2008). Το 2006 η τιμή του ΡΗΒ ήταν στο εύρος των /kg. Αυτή η τιμή, ωστόσο, εξακολουθούσε να είναι πολύ πιο υψηλή από σε σχέση με αυτή των αμυλούχων πολυμερών και άλλων βιοπολυεστέρων, λόγω της υψηλής τιμής των πρώτων υλών, τους μικρούς όγκους παραγωγής και το υψηλό κόστος της διεργασίας, ειδικά για τον καθαρισμό του προϊόντος. Με το πέρασμα των χρόνων και τη γρήγορη ανάπτυξη της τεχνολογίας στις μέρες μας η τιμή των ΡΗΑs έχει μειωθεί αρκετά σε σχέση με πριν πέντε χρόνια. Χρησιμοποιώντας το τροποποιημένο βακτήριο E. coli ως παραγωγό του ΡΗΑ η τιμή του μειώθηκε στα 2-3 /kg, η οποία είναι πολύ κοντά με αυτή άλλων βιοδιασπώμενων πλαστικών όπως τα PLA και των αλιφατικών πολυεστέρων (Reddy et al., 2003). H εταιρία Tianan αναμένει ότι η τιμή του ΡΗΑ θα πέσει από τα 4 $/kg που είναι σήμερα στα 3.52 $/kg το 2020 μαζί με την επέκταση της δυναμικότητας της παραγωγής. Ενώ η Kaneka προβλέπει την μείωση της τιμής του PHBHx στα 3.4 /kg το (Shen et al., 2009). Από τα παραπάνω συνεπάγεται ότι για μια επιτυχημένη διεργασία απαιτούνται υψηλά επίπεδα ποσοστού ΡΗΑ ως προς τη ξηρή μάζα κυττάρων και τον υψηλό ρυθμό παραγωγής ως προς γραμμάρια προϊόντος ανά όγκο και χρόνο καλλιέργειας (de Koning and Witholt, 1997; de Koning et al., 1997). Οπότε, για την υλοποίηση μιας επιτυχημένης διεργασίας παραγωγής ΡΗΑ, αναγκαία προϋπόθεση είναι η σταθεροποίηση όλων των συνθηκών της καλλιέργειας. Επίσης, καθώς μέχρι στιγμής, η τιμή των πρώτων υλών υπολογίζεται ότι αντιστοιχεί στο 40-50% του συνολικού κόστους παραγωγής του ΡΗΑ, η χρήση φτηνών πηγών άνθρακα και η γενετική τεχνολογία μπορεί να οδηγήσει στη μείωση του κόστους παραγωγής του ΡΗΑ (Shen, 2009; Reddy et al., 2003; Lee, 1996). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

250 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 215 Πίνακας 5.4 Τιμή και παραγωγή εμπορικών ΡΗΑs (Jacquel et al., 2008). Εμπορική ονομασία Ομοπολυμερή Είδος ΡΗΑ Εταιρία Τιμή Παραγωγή (t/y) Biomer P(3HB) Biotechnoly Co., Germany 20 /kg (2003) 3 5 /kg (2010) 50 (2003) Biocycle P(3HB) PHB Industrial S/A company, Brazil 60 Biogreen P(3HB) Mitsubishi GAS Chemical, Japan /kg(2003) /kg(2010) 1400 (2003) (2010) - P(3HB) - P(3HB) - P(3HO) Συμπολυμερή Metabolix, USA (BASF, ADM) Jiangsu Nantian Group, China Metabolix, USA (BASF, ADM) ~2.20 /kg(2010) ~2.20 /kg(2010) - Biopol P(3HB-co-3HV) Metabolix, USA (BASF, AMD) /kg(2003) 3 5 /kg (2010) 1100 (2003) - P(3HB-co-3HV) PHB Industrial S/A company, Brazil 50 (2003) (2006) ENMAT P(3HB-co-3HV) Tianan Biologic Material, China 1000 Nodax P(3HB-co- 3HHx) Procter & Gamble, USA (Kaneka) 2.50 /kg (2010) 250 (2003) (2010) - P(3HB-co- 3HHx) Jiangsu Nantian Group, China P(3HB-co- 3HHx) Lianyi Biotech, China >5 US$/kg 2000 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

251 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 216 Στον Πίνακα 5.4 παρουσιάζονται μερικά εμπορικά ΡΗΑs, η εταιρία που τα παράγει και η εμπορική τους ονομασία, καθώς και η τιμή πώλησης τους και η δυναμικότητα της εταιρίας που τα παράγει (Jacquel et al., 2008). 5.6 Μεταβολικοί οδοί σύνθεσης των ΡΗΑs Η σύνθεση του ΡΗΑ τα τελευταία χρόνια έχει μελετηθεί πάρα πολύ. Μέχρι στιγμής, η βιοσύνθεση των ΡΗΑ μπορεί να συνοψιστεί σε τέσσερα βασικά μεταβολικά μονοπάτια (Chen, 2010; Philip et al., 2007, Παπανεοφύτου, 2008; Πενλόγλου, 2010). Το πρώτο μεταβολικό μονοπάτι περιλαμβάνει τρείς βασικές ενζυμικές αντιδράσεις: 1. τη συμπύκνωση δύο μορίων ακέτυλ-coa σε ακετοακέτυλο-coa 2. την αναγωγή του ακετοακέτυλο-coa σε (R)-3-υδροξυβουτύρυλο-CoA και 3. τον πολυμερισμό του (R)-3-υδροξυβουτύρυλο-CoA σε πολύ-(3-υδροξυβουτυρικό εστέρα). Τα τρία αυτά στάδια λαμβάνουν χώρα με τη βοήθεια τριών ενζύμων, της β- κετοακέτυλο-coa θειολάσης, της NADPH- εξαρτώμενης ακετοακέτυλο-coa αναγωγάσης και της PHB-αποπολυμεράσης. Για το λόγο αυτό το μονοπάτι αυτό ονομάζεται μεταβολικό μονοπάτι τριών σταδίων. Με τη βοήθεια αυτού του μεταβολικού μονοπατιού, το παραγόμενο ΡΗΑ είναι κυρίως μικρού μήκους αλυσίδας (scl-pha) και αντιπροσωπευτικοί μικροοργανισμοί που το ακολουθούν είναι οι Ralstonia eutropha, Zuglear ramigena και Alcaligenes sp. Για τη σύνθεση του ΡΗΑ μεσαίας ανθρακικής αλυσίδας χρησιμοποιούνται κυρίως δύο μονοπάτια είτε της β-οξείδωσης (Μονοπάτι ΙΙ) είτε της μεταβολικής οδού (de novo) σύνθεσης των λιπαρών οξέων (Μονοπάτι ΙΙΙ). Στην πρώτη περίπτωση, τα λιπαρά οξέα ή οι αντίστοιχες αλειφατικές πηγές άνθρακα εισάγονται στο κυτταρόπλασμα και σε κάθε κύκλο της β-οξείδωσης αφαιρείται διαδοχικά ένα ακέτυλο-coa. Με αυτό τον τρόπο παράγεται συνεχώς ένα λιπαρό οξύ με δύο λιγότερα άτομα άνθρακα, ενώ η τελική σύσταση του παραγόμενου πολυμερούς εξαρτάται από το είδος της πηγής άνθρακα. Στη δεύτερη περίπτωση δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ των υδατανθράκων που χρησιμοποιούνται ως πηγή άνθρακα και της σύστασης του παραγόμενου ΡΗΑ (Lu et al., 2009; Παπανεοφύτου, 2008; Πενλόγλου, 2010). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

252 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 217 H σύνθεση των mcl-phas από πηγές άνθρακα όπως είναι η γλυκόζη και άλλοι υδατάνθρακες, καθώς επίσης γλυκονικό, οξικό ή αιθανόλη, τα οποία μεταβολίζονται σε ακέτυλο-coa, έχει μελετηθεί σε μέλη των Pseudomonas sp. Το σχηματιζόμενο πολυμερές αποτελείται συνήθως από μονομερή με C 8 και C 10, τόσο κορεσμένα όσο και ακόρεστα, τα οποία προφανώς πηγάζουν από ενδιάμεσα προϊόντα κατά τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων. Τα μεταβολικά μονοπάτια βιοσύνθεσης και β-οξείδωσης των λιπαρών οξέων μπορεί να λειτουργούν ταυτόχρονα για τη συσσώρευση των mcl-ρηαs ανάλογα με την πηγή άνθρακα που παρέχεται (Μονοπάτι IV). Στο μεταβολικό αυτό μονοπάτι, το ακέτυλο-coa μετατρέπεται σε άκυλο CoA σε τέσσερα στάδια μέσω του μονοπατιού σύνθεσης των λιπαρών οξέων ως εξής: Το ακέτυλο-coa συμπυκνώνεται με ένα μόριο μηλόνυλο-acp και παράγεται ένα μόριο 3-κετοάκυλο-ACP με μία συνθάση (συνθετάση) του β-κετοάκυλο-acp. Το 3-κετοάκυλο-ACP μετατρέπεται σε 3-υδροξυάκυλο-ΑCP με μία μετοάκυλοαναγωγάση. Το R-3-υδροξυάκυλο-ΑCP με μια υδρατάση μετατρέπεται σε μια 2-trans ενόυλο-acp To 2-trans ενόυλο-acp μεταβολίζεται σε άκυλο-acp με μία αναγωγάση του ενόυλο- ACP. Στη συνέχεια, το άκυλο-acp με τη δράση της θειολεστεράσης υδρολύεται στο αντίστοιχο λιπαρό οξύ, το οποίο ενεργοποιείται από μία άκυλο-coa συνθάση στο αντίστοιχο άκυλο-coa. Το άκυλο-coa μετατρέπεται στο αντίστοιχο 2-trans ενόυλο- CoA με μια άκυλο-coa αφυδρογονάση και καταλήγει στο S-3-υδροξυάκυλο-CoA με τη δράση της υδροτάσης του ενόυλο-coa. Τα 2-trans ενόυλο- και S-3-υδροξυάκυλο-CoA μπορούν να μετατραπούν σε R-3-υδροξυάκυλο-CoA είτε με ισομεράση είτε με μια R-ειδική υδροτάση. Στη συνέχεια με τη δράση της ΡΗΑ-συνθάσης μετατρέπονται στα αντίστοιχα ΡΗΑs (Σχήμα 5.5) (Παπανεοφύτου, 2008). Τέλος, παράλληλα με τα πολύπλοκα μεταβολικά μονοπάτια που περιγράφονται παραπάνω λαμβάνει χώρα και ο κύκλος του κιτρικού οξέος (κύκλος του Krebs), υπεύθυνος ουσιαστικά για την ανάπτυξη της μη-πολυμερικής βιομάζας των κυττάρων (Verlinden et al., 2007; Πενλόγλου, 2010). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

253 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 218 Σχήμα 5.5 Μεταβολικοί οδοί σύνθεσης των ΡΗΑs. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

254 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 219 Πίνακας 5.5 Ένζυμα κατάλυσης μεταβολικών αντιδράσεων του Σχήματος 5.5. Μεταβολικό μονοπάτι Αριθμός Ένζυμο Μονοπάτι Ι 1 β-κετοθειολάση (PhbA) 2 Ακετοακέτυλο-CoA αφυδρογονάση (PhbB) 3 ΡΗΑ-πολυμεράση (συνθάση) (PhbC) Μονοπάτι ΙΙ 4 1-μονο-οξυγενάση των αλκανίων 5 Αλκοολική δεϋδρογονάση 6 Αλδεϋδική δεϋδρογονάση 7 Άκυλο-CoA συνθετάση 8 Άκυλο-CoA δεϋδρογονάση 9 Ενόυλο-CoA υδρατάση 10 3-υδροξυάκυλο-CoA δεϋδρογονάση 11 3-κετοακέτυλο-CoA θειολάση 12 3-υδροξυάκυλο-CoA επιμεράση 13 ΡΗΑ συνθάση 14 3-κετοάκυλο-CoA ρεδουκτάση 15 R-ενόυλο-CoA υδρατάση Μονοπάτι ΙΙΙ 16 Ακέτυλο-CoA καρβοξυλάση 17 ACP-μηλόνυλο τρανσφεράση 18 3-κετοάκυλο-ACP συνθάση 19 3-κετοάκυλο-ACP ρεδουκτάση 20 3-υδροξυάκυλο-ACP αφυδρογονάση 21 Ενόυλο-ACP ρεδουκτάση 22 R-3-υδροξυάκυλο-ACP-CoA τρανσακυλάση 23 Άκυλο-ACP θειολάση Άλλα μεταβολικά μονοπάτια 24 4-,5-,6- υδροξυαλκανοϊκή CoA συνθάση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

255 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 220 Μεταβολικό μονοπάτι Αριθμός Ένζυμο Κύκλος του Κιτρικού Οξέος 25 Κιτρική συνθάση 26 Ακοτινάση 27 Ισοκιτρική αφυδρογονάση Στο Σχήμα 5.5 παρουσιάζονται οι σημαντικότεροι μεταβολικοί οδοί σχηματισμού ΡΗΑs και τα ένζυμα που καταλύουν τις μεταβολικές αντιδράσεις εμφανίζονται στον Πίνακα Βιοσύνθεση και δομή κόκκων ΡΗΑ Το κύριο ένζυμο το οποίο είναι υπεύθυνο για τη βιοσύνθεση των ΡΗΑs είναι η ΡΗΑ πολυμεράση (συνθάση), η οποία καταλύει τη στερεο-εκλεκτική μετατροπή των (R)-3- υδροξυάκυλο-coa υποστρωμάτων με την ταυτόχρονη απελευθέρωση του CoA όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.6 (Rehm, 2003). Σχήμα 5.6 Καταλυτική αντίδραση ΡΗΑ-συνθάσης. Τα γονίδια της συνθάσης, έχουν απομονωθεί από διάφορους μικροοργανισμούς και έχει παρατηρηθεί ότι παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές μεταξύ τους. Οπότε, ανάλογα με την εξειδίκευση του ενζύμου και την σύσταση των υπομονάδων του οι ΡΗΑ-συνθάσες κατατάσσονται σε τέσσερεις βασικές κατηγορίες: PHA συνθάση τύπου Ι: απομονώθηκε από το βακτήριο Rastonia eutropha και αναφέρεται και ως πρότυπη συνθάση. Αποτελείται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα μοριακού βάρους ~ 65 kda (PhaC) (Wodzinska et al., 1996; Peoples and Sinskey ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

256 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών ). Είναι λειτουργική με τη μορφή διμερούς και αναγνωρίζει ως υποστρώματα ΗΒ- CoA και ΗV-CoA (S.C.L) (Peoples and Sinskey, 1989). PHA συνθάση τύπου ΙΙ: απομονώθηκε από το βακτήριο P. oleovorans και αποτελείται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα μοριακού βάρους ~ 63 kda (PhaC) και αναγνωρίζει υδροξυακυλοcoa μεσαίας αλυσίδας (C6-C14). Πολλές φορές κωδικοποιείται από δυο γονίδια PhaC (Huisma et al., 1991). ΡΗΑ συνθάση τύπου ΙΙI: απομονώθηκε από το βακτήριο Chromaticum. Vinosum και αποτελείται από δύο πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Την υπομονάδα PhaC με μοριακή μάζα περίπου 40 kda που εμφανίζει μικρή ομολογία με τις συνθάσες των δυο πρώτων τύπων και την υπομονάδα PhaE, με μοριακή μάζα περίπου 40 kda, που δεν εμφανίζει ομολογία με τις συνθάσες των δυο άλλων τύπων. Η εξειδίκευση του ενζύμου για τα υποστρώματα είναι παρόμοια με τη συνθάση του τύπου Ι (Liebergesell and Steinbüchel, 1992). PΗΑ συνθάση τύπου IV: απομονώθηκε από το Bacillus megaterium. Μοιάζει με τις συνθάσες του τύπου III με τη διαφορά ότι η υπομονάδα PhaE αντικαθίσταται από την PhaR, με μοριακή μάζα περίπου 20 kda ( McCool and Cannon, 2001). Φάση Ι (Πρωτεΐνες δεσμευμένες στις μεμβράνες) Φάση ΙΙ (Υδροδιαλυτές πρωτεΐνες) Φάση ΙΙΙ (Πρωτεΐνες δεσμευμένες στους κόκκους) Αναβολικές αντιδράσεις Πηγή άνθρακα Πηγή άνθακα Υδροξυάκυλο-CoA CoA-SH ΡΗΑ- Συνθάση Ρ(ΗΑ) n Ρ(ΗΑ) n + 1 Καταβολικές αντιδράσεις Σχήμα 5.7 Αρχή βιοσύνθεσης ΡΗΑ στα βακτήρια, τριών φάσεων. Στη πρώτη φάση οι πρωτεΐνες δεσμεύονται στην κυτταρική μεμβράνη, στη δεύτερη οι πρωτεΐνες γίνονται διαλυτές και μέσω αναβολικού ή καταβολικού μονοπατιού μετατρέπονται σε υδροξυακέτυλο-coa, που με τη δράση της ΡΗΑ συνθάσης στο τρίτο στάδιο μετατρέπεται σε πολυμερές. (Steinbüchel and Valentin, 1995). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

257 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 222 Για τη βιοσύνθεση των ΡΗΑs με δράση της συνθάσης διακρίνονται τρεις βασικές μεταβολικές φάσεις (Σχήμα 5.7). Αρχικά, στην πρώτη φάση, μια πηγή άνθρακα κατάλληλη για την βιοσύνθεση του πολυμερούς πρέπει να εισέλθει μέσα στο κύτταρο. Αυτό επιτυγχάνεται είτε με ειδικό μηχανισμό μεταφοράς από το κυτταρόπλασμα του βακτηρίου είτε με διάχυση της πηγής του άνθρακα μέσα στο κύτταρο. Στη δεύτερη φάση, αναβολικές ή καταβολικές αντιδράσεις (ή και οι δύο τύποι αντιδράσεων) μετατρέπουν την πηγή άνθρακα σε θειοεστέρα του υδροξυακυλ-coa. Στην τρίτη φάση, η ΡΗΑ συνθάση που είναι βασικό ένζυμο της βιοσύνθεσης του πολυμερούς χρησιμοποιεί τους θειοεστέρες αυτούς ως υπόστρωμα και καταλύει το σχηματισμό εστερικών δεσμών ελευθερώνοντας το συνένζυμο-α. Από αυτές τις τρείς φάσεις, η δεύτερη φαίνεται να είναι η πιο σημαντική, εφόσον στη φάση αυτή η πηγή του άνθρακα μετατρέπεται στο κατάλληλο υπόστρωμα για τη δράση της ΡΗΑ συνθάσης (Steinbüchel and Valentin, 1995). Γενικά τα PHAs συσσωρεύονται στο εσωτερικό των κυττάρων σε μορφή κόκκων με διάμετρο από 0.2 ± 0.5 mm (Zin et al., 2001; Khanna and Srivastava, 2005). Ο αριθμός των κόκκων που συσσωρεύονται σε κάθε κύτταρο φαίνεται ότι δεν είναι ο ίδιος για όλους τους μικροοργανισμούς. Για παράδειγμα, στον R. eutropha δημιουργούνται 8-12 κόκκοι διαφόρων μεγεθών ενώ στον P. putida εκτιμάται ότι συσσωρεύονται ένα ή δυο μεγάλοι κόκκοι (Zin et al., 2001). Η δομή των κόκκων του ΡΗΑ παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον, καθώς έχει προταθεί ότι οι κόκκοι που συγκρατούν τα scl-phas και τα mcl-phas έχουν τελείως διαφορετική δομή. Οι κόκκοι που περιέχουν scl-phas και απομονώθηκαν από τον B. megaterium αποδείχθηκε ότι περιβάλλονται από ένα στρώμα λιπιδίων (0.5% w/w) και πρωτεΐνες (2% w/w) (Σχήμα 5.8). Ωστόσο, κανένα στοιχείο δε βρέθηκα για την ύπαρξη λιπιδίων ή πρωτεϊνών στο εσωτερικό του κόκκου του ΡΗΑ. Οι κόκκοι που περιέχουν mcl-phas βρέθηκε ότι έχουν μεγαλύτερο μέγεθος και ότι έχουν διαφορετική δομή. Από εικόνες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου παρουσιάστηκε ότι η επιφάνια τους από μια στοιβάδα φωσφολιπιδίων η οποία διαχωρίζει δυο πρωτεϊνικές περιοχές κρυσταλλικής δομής (Zin et al., 2001). Στο Σχήμα 5.9 παρουσιάζονται οι κόκκοι πολυεστέρα από το βακτήριο Pseudomonas aeruginosa όπως φαίνονται από ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

258 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 223 Δομική πρωτεΐνη Συνθάση του πολυεστέρα Aποπολυμεράση Ρυθμιστική πρωτεΐνη Φωσφολιπίδια Πυρήνας του πολυεστέρα nm Σχήμα 5.8 Σχηματική απεικόνιση κόκκου πολυεστέρα (Zinn et al., 2001). Κόκκος πολυεστέρα Σχήμα 5.9 Εικόνα από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο κόκκου πολυεστέρα από το βακτήριο Pseudomonas aeruginosa (Zinn et al., 2001). Οι σημαντικότερες πρωτεΐνες που σχετίζονται και με τα δύο είδη κόκκων μπορούν κα χωριστούν σε τέσσερεις κατηγορίες (Zin et al., 2001; Jendrossek and Handrick, 2002, Jendrossek, 2009): 1. ΡΗΑ-πολυμεράσες οι οποίες συμμετέχουν στον σχηματισμό των κόκκων του ΡΗΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

259 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών ΡΗΑ-αποπολυμεράσες οι οποίες συμμετέχουν στην αποικοδόμηση των κόκκων του ΡΗΑ 3. Φασίνες οι οποίες βοηθούν στη σταθεροποίηση της δομής και αποτρέπουν τη συνένωση των κόκκων 4. Πρωτεΐνες με άγνωστη λειτουργία (πιθανώς ένζυμα που καταλύουν τον αρχικό σχηματισμό των κόκκων και ρυθμιστικές πρωτεΐνες). 5.8 Μοντέλο δημιουργίας κόκκων ΡΗΑ στα βακτήρια Για την δημιουργία των κόκκων του ΡΗΑ το σημαντικότερο ρόλο τον έχει το ένζυμο ΡΗΑ-συνθάση. Σύμφωνα με το μοντέλο των Gerngross και Martin (1995) (Σχήμα 5.10) η διαλυτή αρχικά ΡΗΑ-συνθάση αλληλεπιδρά με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του 3- υδροξυβουτύρυλ-coa στο κυτταρόπλασμα. Το γεγονός αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την έναρξη μηχανισμού πολυμερισμού με τρόπο που δεν είναι ακόμη γνωστός. Ακολουθεί μια λανθάνουσα φάση όπου με αργό ρυθμό δημιουργούνται ΗΒ ολιγομερή τα οποία παραμένουν συνδεδεμένα με το ένζυμο (στάδιο 1). Στη συνέχεια σε ένα κρίσιμης συγκέντρωσης ολιγομερούς-ενζύμου τα ΗΒ ολιγομερή δημιουργούν μικκύλια, με το ένζυμο να βρίσκεται στην επιφάνεια, διαχωρίζοντας έτσι το πολυμερές από το κυτταρόπλασμα (στάδιο 2) ενώ τα ολιγομερή αυξάνονται σε μέγεθος και υδροφοβικότητα. Η αντίδραση πολυμερισμού σε αυτό το στάδιο επιταχύνεται επειδή το υδρόφοβο πολυμερές εκτείνεται στο εσωτερικό του υδρόφοβου περιβάλλοντος του μικκυλίου και όχι στο υδατικό περιβάλλον του κυτταροπλάσματος. Τα μικκύλια σ αυτή τη φάση εμφανίζονται σαν ενδοκυττάριοι κόκκοι που είναι ορατοί σε μικροσκόπιο αντίθετης φάσης (στάδιο 3). Καθώς ο αριθμός των κόκκων μεγαλώνει, αυτοί συγχωνεύονται και συνασπίζονται σε μεγάλα συσσωματώματα (στάδιο 4) (Madison and Huisman, 1999). Η ΡΗΒ-πολυμεράση εμφανίζεται και στις δύο μορφές, δηλαδή διαλυτή στο κυτταρόπλασμα και δεσμευμένη στους κόκκους. Οι δύο αυτές μορφές διαχωρίζονται εύκολα με φυγοκέντριση αλλά η συνύπαρξη των δύο μορφών έχει κάνει δύσκολη τη διευκρίνηση βασικών κινητικών παραμέτρων. Η διαλυτή συνθάση εμφανίζει μικρότερη δραστικότητα από τη δεσμευμένη στους κόκκους και άρα μεγαλύτερη συσσώρευση πολυμερούς παρουσιάζεται όταν το ένζυμο βρίσκεται σ αυτή τη μορφή (Madison and Huisman, 1999). Με in vitro πειράματα αποδείχθηκε ότι η λανθάνουσα φάση που παρατηρείται κατά τη δημιουργία ολιγομερών (ΗΒ) προκαλείται από το γεγονός ότι η ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

260 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 225 συνθάση που είναι ήδη δεσμευμένη στους κόκκους, είναι αυτή που μετατρέπει τη διαλυτή σε πλήρως δραστική μορφή ένζυμου (Gerngross et al., 1995) και ότι ο χρόνος της λανθάνουσας φάσης εξαρτάται από το αρχικό στάδιο της αλκυλίωσης (Wodiska et al., 1996). Σχήμα 5.10 Μηχανισμός σχηματισμού των κόκκων ΡΗΑ προτεινόμενος από τους Gerngross και Martin. Επίσης οι Gerngross και Martin (1995) παρατήρησαν ότι η διατήρηση της ωφέλιμης επιφάνειας των κόκκων είναι κρίσιμη για την αποδοτική παραγωγή των Ρ(3ΗΒ) και ότι το μέγεθος των κόκκων που συνθέτονται (in vitro) επηρεάζεται από την ποσότητα της πρωτεΐνης που προστίθεται στο μίγμα ανεξάρτητα αν αυτή είναι ΡΗΑ συνθάση ή κάποια άσχετη πρωτεΐνη όπως η αλβουμίνη (Madison and Huisman, 1999). 5.9 Στάδια απομόνωσης και καθαρισμού των ΡΗΑs Αρκετοί πρόοδοι έχουν γίνει για τη βελτίωση των τεχνικών διαχωρισμού του ΡΗΑ από το κύτταρο. Για αυτό το λόγο για τους παραγωγούς των ΡΗΑs είναι σημαντικό να έχουν χαμηλό κόστος εξαγωγής τους για λόγους ανταγωνισμού. Το κύριο βήμα της διεργασίας διαχωρισμού είναι η εξαγωγή των κόκκων ΡΗΑ. Ωστόσο, με σκοπό την καλύτερη ανάκτηση του πολυμερούς θα μπορούσε να προστεθεί ένα στάδιο προεπεξεργασίας. Ο σκοπός της προσθήκης αυτού του σταδίου είναι η βελτίωση της διάσπασης των κυττάρων. Επιπρόσθετος για την απόκτηση μίας υψηλής καθαρότητας προϊόντος, θα μπορούσε να προστεθεί στην διεργασία και ένα στάδιο καθαρισμού του ΡΗΑ. Στο Σχήμα 5.11 παρουσιάζονται συνοπτικά μερικές από τις διαφορετικές στρατηγικές που έχουν μελετηθεί για την ανάκτηση του πολυμερούς (Jacquel et al.,2008; Jiang et al., 2006). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

261 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 226 Κύτταρα που περιέχουν ΡΗΑ Προεπεξεργασία Θέρμανση Ψύξη Άλατα Απομόνωση Διαλύτες Καθαρισμός Πρωτεόλυση Κυττάρων Μηχανική διάρρηξη Υπεροξείδιο του υδρογόνου Υπερκρίσιμο CO 2 Επεξεργασία με όζον Υψηλή καθαρότητα απομονωμένο ΡΗΑ Σχήμα 5.11 Στάδια απομόνωσης και καθαρισμού των ΡΗΑs Προεπεξεργασία κυττάρων Πριν το στάδιο της κύριας επεξεργασίας των κυττάρων για την απομόνωση του ΡΗΑ με κάποια από τις μεθόδους που περιγράφονται στην ενότητα ή και συνδυασμός τους, συνήθως, τα κύτταρα υφίστανται σε ένα στάδιο προεπεξεργασίας για την ευκολότερη διάρρηξη τους. Το στάδιο αυτό της προεπεξεργασίας μπορεί να κατηγοριοποιηθεί στα ακόλουθα (Jacquel et al.,2008): Προεπεξεργασία με θερμότητα. Μια αρχική επεξεργασία με θέρμανση έχει μια επίπτωση στη διαλυτότητα των κυττάρων. Στην πραγματικότητα, απενεργοποιεί ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

262 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 227 γενετικά υλικά και πρωτεΐνες, και επίσης αποσταθεροποιεί την εξωτερική κυτταρική μεμβράνη. Αλκαλική προεπεξεργασία. Σε αυτού του είδους επεξεργασίας χρησιμοποιείται ένα διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου. Χρησιμοποιώντας τη βέλτιστη συγκέντρωση υδροξειδίου οι περισσότερες πρωτεΐνες της κυτταρικής μεμβράνης μπορούν να απελευθερωθούν. Προεπεξεργασία με άλατα. Καθώς το νερό ελκύεται από υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων, μια υψηλή διάλυση θα ωθήσει το νερό να εξέλθει από τα κύτταρα κάνοντας τα να συρρικνωθούν και να αφυδατωθούν. Η επεξεργασία με το άλας καθώς δεν είναι τόσο αποτελεσματική συνήθως συνδυάζεται με μια αλκαλική προεπεξεργασία. Ψύξη. Προεπεξεργασία παγώματος επίσης βοηθάει την απομόνωση του ΡΗΑ από τα κύτταρα σε μικρότερο χρονικό διάστημα με την πρωτεόλυση με SDS και NaClO Απομόνωση ΡΗΑs Οι κυριότερες μέθοδοι που έχουν αναπτυχθεί για την εξαγωγή των βακτηριακών ΡΗΑs είναι η ανάκτηση με διαλύτες, η πρωτεόλυση (digestiοn) των κυττάρων με χημικό και ενζυμικό τρόπο, η λύση των κυττάρων με μηχανικές μεθόδους και κάποιες καινούριες τεχνικές (Jacquel et al.,2008; Jiang et al., 2006). Ανάκτηση με διαλύτες Η χρήση των διαλυτών για την ανάκτηση του ΡΗΑ είναι μια από τις παλαιότερες και τις πιο απλές μέθοδους, από άποψη αριθμών βημάτων που εφαρμόζονται (Jiang et al., 2006). Γενικά, η δράση των διαλυτών μπορεί να χωριστεί σε δύο βήματα, αρχικά τροποποιεί τη διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης και στη συνέχεια διαλύει το ΡΗΑ. Η χρήση των διαλυτών ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά από τους Lemoigne ( ) και Baptist (1967) από τα βακτήρια Bacillus megaterium και Rhodospirillum rubrum, αντίστοιχα, οι οποίοι χρησιμοποίησαν αρκετούς χλωριωμένους διαλύτες υδρογονανθράκων όπως το χλωροφόρμιο, 1,2- διχλωροαιθάνιο, μεθυλενοχλωρίδιο ή μερικούς κυκλικούς ανθρακικούς διαλύτες όπως το προπυλένιο ή ανθρακικό αιθυλένιο για την διάλυση του ΡΗΑ. Ο Baptist επίσης ήταν ο πρώτος που χρησιμοποίησε τη μίξη διαλυτών όπως χλωροφόρμιο/μεθανόλη και δυχλωρομεθάνιο/αιθανόλη. Ο διαχωρισμός του Ρ(3ΗΒ), το πρώτο ΡΗΑ που διαχωρίστηκε με αυτή τη μέθοδο, από τον διαλύτη πραγματοποιήθηκε με εξάτμιση του διαλύτη ή με κατακρήμνιση από ένα μη διαλύτη του ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

263 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 228 πολυμερούς. H Noda (Protect & Gamble) πρότεινε μια διεργασία που περιλάμβανε, αρχικά, μια επεξεργασία της βιομάζας με ένα μείγμα διαλύτη του ΡΗΑ και έναν μη διαλύτη, και τον μετέπειτα διαχωρισμό της αδιάλυτης βιομάζας και τέλος η αφαίρεση του διαλύτη του ΡΗΑ οδηγεί στην κατακρήμνιση του ΡΗΑ στον μη διαλύτη. Η Austrian Company Chemie Linz GmbH επίσης εφάρμοσε μια μέθοδο απομόνωσης με διαλύτη για το ΡΗΒ από τα κύτταρα του βακτηρίου Alcaligenes latus με μεθυλενοχλωρίδιο, το διαλυμένο πολυμερές στον διαλύτη κατακρημνίστηκε με την προσθήκη νερού. Όπως και η Chemie Linz η Imperial Chemical Industries (ICI) της Αγγλίας (Ηνωμένο Βασίλειο), αρχικά χρησιμοποίησε για την απομόνωση του ΡΗΑ διαλύτη, αλλά αυτή η διεργασία θεωρήθηκε ακριβή. Το απομονωμένο διάλυμα του πολυμερούς που περιέχει περισσότερο από 5% (w/v) Ρ(3ΗΒ) είναι πολύ ιξώδης και η αφαίρεση των κυτταρικών υπολειμμάτων είναι πολύ δύσκολη. Για αυτό και χρειάζεται για την απομόνωση ενός κομματιού πολυμερούς εικοσαπλάσια ποσότητα διαλύτη. Αυτή η μεγάλη ποσότητα του διαλύτη οδηγεί σε ένα υψηλό παραγωγικό κόστος αν δε σκοπεύετε η ανακύκλωση του διαλύτη. Η χρήση των διαλυτών καταστρέφει τη φυσική μορφολογία των κόκκων του ΡΗΑ κάτι που είναι χρήσιμο σε εφαρμογές όπως είναι η παραγωγή ισχυρών ινών. Σε αντίθεση με άλλες τεχνικές ανάκτησης δεν αποικοδομεί το πολυμερές και μπορεί να είναι χρήσιμο σε κάποιες ιατρικές εφαρμογές λόγω της εξάλειψης των ενδοτοξινών οι οποίες μπορεί να βρεθούν σε Gram αρνητικά βακτήρια. Ωστόσο, η μέθοδος αυτή έχει μικρή σχετικά αποτελεσματικότητα ανάκτησης. Ένα άλλο πρόβλημα που συνδέεται με τη χρήση διαλυτών είναι οι κίνδυνοι που δημιουργούν για τον χειριστή και για το περιβάλλον. Για αυτό το λόγο χρησιμοποιούνται ευρέως, σε εργαστηριακή κλίμακα, άλλα ελάχιστη σε πιλοτικές μονάδες και σε μεγάλης κλίμακας διεργασίες (Jacquel et al.,2008) Μέθοδοι πρωτεόλυσης Χημική πρωτεόλυση Πρωτεόλυση με επιφανειοδραστικές ουσίες. Οι επιφανειοδραστικές ουσίες όπως είναι το ανιονικό θειικό δωδεκιλικό νάτριο (SDS) διασπάει τα κύτταρα καθώς έχουν την ικανότητα να ενσωματώνονται στην λιπιδιακή διπλοστοιβάδα της κυτταρικής μεμβράνης. Όσο περισσότερη επιφανειοδραστική ουσία προστίθεται τόσο περισσότερη εισέρχεται στη μεμβράνη αυξάνοντας τον όγκο του κυττάρου μέχρι να κορεστεί. Η περαιτέρω προσθήκη ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

264 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 229 σπάει την κυτταρική μεμβράνη παράγοντας μικκύλια (micelles) επιφανειοδραστικών ουσιών και φωσφολιπιδίων μεμβράνης, οδηγώντας στην απελευθέρωση των κόκκων ΡΗΑs στο διάλυμα, περικυκλωμένο με κυτταρικά υπολείμματα. Το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι οι επιφανειοδραστικές ουσίες λύουν τα κύτταρα χωρίς να αποικοδομούν το πολυμερικό κόκκο. Ένα άλλο κύριο πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι επιτρέπει την ανάκτηση του ΡΗΑ απευθείας από υψηλές συγκεντρώσεις κυττάρων ( g ξηρής μάζας κυττάρων/l). Παρόλα αυτά, η χρήση μόνο των επιφανειοδραστικών ουσιών δε μπορούν να αποφέρουν ένα υψηλής καθαρότητας ΡΗΑ (> 97%), γι αυτό χρειάζονται και άλλα μέσα όπως είναι οι υποχλωρίτες και το υδροξείδιο του νατρίου. Επιπλέον μια υψηλή δόση επιφανειοδραστικών (5% wt) αυξάνει το κόστος ανάκτησης και προκαλεί προβλήματα στην επεξεργασία των απόνερων και την επαναχρησιμοποίηση τους (Jacquel et al., 2008). Πρωτεόλυση με υποχλωρήτες: Μια άλλη μέθοδος ανάκτησης του ΡΗΑ είναι η χρήση υποχλωριτών όπως είναι το υποχλωριώδες νάτριο για την πρωτεόλυση κυτταρικών υλικών εκτός από το ΡΗΑ. Με αυτή τη μέθοδο, το ΡΗΑ που ανακτάται είναι αρκετά υψηλής καθαρότητας, αλλά, προκαλεί διάσπαση του πολυμερούς με αποτέλεσμα τη μείωση του μοριακού βάρους μέχρι και 50% (Jacquel et al.,2008) Πρωτεόλυση με ένζυμα. Η ενζυμική πρωτεόλυση είναι μια εναλλακτική μέθοδος της μεθόδου απομόνωσης με διαλύτες. Μερικά είδη ενζύμων όπως είναι τα πρωτεολυτικά ένζυμα (π.χ. λυσοζίμη) έχουν υψηλή δράση στη διάλυση πρωτεϊνών αλλά μικρή επίδραση στην διάσπαση του ΡΗΑ (Jacquel et al.,2008). Μηχανική διάρρηξη Η μηχανική κυτταρική διάρρηξη χρησιμοποιείται ευρέως για την ανάκτηση ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών και έχει περιγραφεί στο κεφάλαιο 3. Συνοπτικά οι μέθοδοι μηχανικής διάρρηξης των κυττάρων αποτελούνται από τους ομογενοποιητές υψηλής πίεσης, περιστρεφόμενοι μύλοι με σφαιρίδια και υπέρηχοι. Αυτές οι μέθοδοι απαιτούν πολλά στάδια δράσης, χωρίς όμως τη χρησιμοποίηση κάποιου διαλύτη. Άλλες μεθόδους Άλλοι μέθοδοι που έχουν χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση του ΡΗΑ είναι η χρήση υπερκρίσιμου ρευστού καθώς έχει μοναδικές φυσικοχημικές ιδιότητες, όπως υψηλή ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

265 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 230 πυκνότητα και χαμηλό ιξώδες, που τα κάνει κατάλληλα όπως η εξαγωγή με διαλύτες. Για αυτό το σκοπό το CO 2 χρησιμοποιείται ευρέως λόγω της χαμηλής του τοξικότητας και αντιδραστικότητας, των μέτριων κρίσιμων θερμοκρασιών και πίεσης (31 ο C και 73 atm), τη διαθεσιμότητα, το χαμηλό κόστος και ευφλεκτότητα. Άλλη μια μέθοδος είναι η ελευθέρωση των κόκκων ΡΗΑs λόγω αυθόρμητης διάρρηξης των κυτταρικών μεμβρανών, κάτι που πραγματοποιείται με την βοήθεια της γενετικής μηχανικής. Αυτές οι μέθοδοι έχουν σχετικά μικρή αποτελεσματικότητα ανάκτησης αλλά είναι φιλικότερες προς το περιβάλλον (Jacquel et al.,2008) Καθαρισμός του απομονωμένου ΡΗΑ Ο καθαρισμός του απομονωμένου ΡΗΑ μπορεί να πραγματοποιηθεί επεξεργάζοντας το απομονωμένο ΡΗΑ με υπεροξειδίου του υδρογόνου, όζοντος, διαιθυλαιθέρα κ.α. Επίσης, μπορεί να επιτευχθεί συνδυάζοντας τη δράση του υπεροξείδιο του υδρογόνου με την ενζυμική δράση ή με χηλικούς παράγοντες (chelating agents) (Jacquel et al.,2008) Παραγωγή των ΡΗΑs Τα βιοπολυμερή (PHAs) μπορούν να παραχθούν είτε μέσω μικροβίων είτε μέσω φυτών. Επίσης, τα ΡΗΑs μπορούν να παραχθούν και με χημική σύνθεση (πολυμερισμός διάνοιξης δακτυλίου των β-λακτονών), η οποία, όμως, δεν είναι και τόσο διαδεδομένη. Με τη χημική σύνθεση τα μονομερή της πολυμερικής αλυσίδας που σχηματίζονται είναι τόσο με (R-) όσο και με (S-) διαμόρφωση. Το αρνητικό της μικτής στερεοϊσομέρειας των ΡΗΑs είναι ότι δεν παρουσιάζουν πλήρη βιοαποικοδόμηση, σε αντίθεση με την περίπτωση της αποκλειστικής (R-) διαμόρφωσης. Μέχρι στιγμής, τα μικρόβια θεωρούνται ως η κύρια πηγή παραγωγής των ΡΗΑs (Poirier, 1999; Keshavarz and Roy, 2010; Jacquel et al., 2008; Πενλόγλου, 2010). Τα βακτήρια που έχουν την ικανότητα να βιοσυνθέτουν ΡΗΑs και να το συσσωρεύουν στο κυτόπλασμα ως πηγή ενέργειας και άνθρακα σε σχήμα κόκκων αποτελούνται από μια μεγάλη ποικιλία Gram θετικών και Gram αρνητικών βακτηρίων (περισσότερα από 300 είδη βακτηρίων, μερικά από τα οποία είναι τα Pseudomonas sp., Bacillus sp., και Methylobacterium sp.) (Reddy et al., 2003; Keshavarz and Roy, 2010). Τα βακτήρια αυτά, μπορούν να χωριστούν σε δυο κατηγορίες ανάλογα με της συνθήκες της καλλιέργειας που απαιτούνται για τη σύνθεση του ΡΗΑ. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν τα βακτήρια που χρειάζονται την έλλειψη ενός σημαντικού θρεπτικού συστατικού για την παραγωγή των ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

266 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 231 PHAs. Στα βακτήρια αυτής της κατηγορίας περιλαμβάνονται τα Cupriavidus necator, Rhodopseudomonas palustris, Pseudomonas sp. και Methylobacterium organophilum. Η δεύτερη κατηγορία βακτηρίων έχει την ικανότητα της ταυτόχρονης σύνθεσης του ΡΗΑ κατά τη διάρκεια της ανάπτυξής τους στο μέσο ανάπτυξης της καλλιέργειας. Βακτήρια αυτής της κατηγορίας είναι τα A. eutrophus, Alcaligenes latus και το γενετικά τροποποιημένο E. coli που περιέχει το γονίδιο του ΡΗΑ βιοσύνθεσης (Keshavarz and Roy, 2010; Akaraonye et al., 2010). Μέχρι στιγμής έχουν ανακαλυφθεί περισσότερα από 150 είδη ΡΗΑs, από διάφορα βακτήρια και συνεχώς ο αριθμός αυτός αυξάνεται. Ωστόσο, μόνο μερικά από αυτά έχουν παραχθεί σε μεγάλες ποσότητες, περιλαμβανομένου των P(3HB), P(3HB-co-3HV), P(3HV), P(4HB), P(3HB-co-3HHx) και P(3HHx-co-3HO). Αρκετά διαφορετικά βακτήρια έχουν την ικανότητα να παράγουν μεγάλες ποσότητες ΡΗΑs, ωστόσο, η πλήρης δυναμική αυτών των βακτηρίων από άποψη παραγωγής του ΡΗΑ δεν έχει πλήρως χρησιμοποιηθεί. Για την αύξηση της συσσώρευσης του ΡΗΑ στο κυτταρόπλασμα αυτών των οργανισμών, διάφορες στρατηγικές παραγωγής έχουν βελτιωθεί για να ενισχύσουν μεγάλες ποσότητες συσσώρευσης πολυμερούς από τον οργανισμό σε συντομότερο χρονικό διάστημα. Επίσης, το εύρος των υποστρωμάτων που παρέχονται στα βακτήρια έχει διευρυνθεί, ανακαλύπτοντας τη χρήση καινούριων πηγών άνθρακα διαθέσιμων σε μεγάλη ποσότητα και χαμηλό κόστος. Μια ποικιλία ειδών καλλιέργειας έχει χρησιμοποιηθεί για την βελτιστοποίηση της απόδοσης παραγωγής του ΡΗΑ, όπως σε ασυνεχείς (batch), ημισυνεχείς (fed-batch) ή συνεχείς (continuous) συνθήκες. (Akaraonye et al., 2010). Ασυνεχείς καλλιέργειες: Οι ασυνεχείς καλλιέργειες εφαρμόστηκαν για την εξέταση και την βελτιστοποίηση λειτουργικών μεσαίου μήκους αλυσίδας ΡΗΑs. Ημισυνεχείς καλλιέργειες: Οι ημισυνεχείς καλλιέργειες είναι μια από τις καλύτερες μεθόδους για την επίτευξη υψηλής πυκνότητας κυττάρων που περιέχουν την υψηλότερη πιθανή ποσότητα ΡΗΑ. Ωστόσο, η ανάπτυξη των κυττάρων και η συσσώρευση του ΡΗΑ πρέπει να είναι σε μια ισορροπία για την αποφυγή ημιτελής ΡΗΑ συσσώρευσης ή τον πρόωρο τερματισμό της καλλιέργειας σε χαμηλή συγκέντρωση κυττάρων. Συνεχείς καλλιέργειες: Ως μια στρατηγική καλλιέργειας, οι συνεχείς καλλιέργειες είναι μεγάλου ενδιαφέροντος λόγω της πιθανότητας επίτευξης υψηλής παραγωγικότητας, ειδικά για τα γένη με υψηλό μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης. Η συνεχείς καλλιέργειες ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

267 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 232 μπορούν να λειτουργήσουν ως μονά ή πολλαπλά στάδια διεργασίας. Στις συνεχείς καλλιέργειες ενός σταδίου, βρέθηκε ότι η βιομάζα αυξάνεται ενώ το ποσοστό του συσσωρευμένου ΡΗΑ μειώνεται με αύξηση του ρυθμού αραίωσης (dilution rate). Για τη συσσώρευση ενός λογικού ποσοστού ΡΗΑ στα κύτταρα στις συνεχείς διεργασίες ενός σταδίου χρειάζεται να γίνει ένας συμβιβασμός μεταξύ του ποσοστού του ΡΗΑ, την συγκέντρωση των κυττάρων και την παραγωγικότητα. Στις ημισυνεχείς καλλιέργειες η βέλτιστη στρατηγική τροφοδότησης του υπολειπόμενου θρεπτικού συστατικού ανάπτυξης κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας είναι να τροφοδοτείται με τον ίδιο ρυθμό που καταναλώνεται από το βακτήριο. Με αυτό τον τρόπο, διασφαλίζεται ότι παρα-προϊόντα που γενικά σχετίζονται με την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων του υποστρώματος αποφεύγονται περιορίζοντας την ποσότητα του ποσού που χρειάζεται για την παραγωγή του επιθυμητού προϊόντος. Η υψηλή συγκέντρωση του υποστρώματος μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή περισσότερων από ένα προϊόν, έτσι περιορίζεται η ικανότητα της ροής άνθρακα ως προς την παραγωγή του ΡΗΑ (Akaraonye et al., 2010) Παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή του ΡΗΑ Για τη βακτηριακή παραγωγή του ΡΗΑ έχουν παρατηρηθεί αρκετοί παράγοντες που επηρεάζουν την συσσώρευση του πολυμερούς στα κύτταρα του βακτηρίου. Οι κυριότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την βιοσύνθεση των ΡΗΑs στα βακτήρια είναι οι ακόλουθοι: O τύπος του βακτηρίου Η πηγή του άνθρακα που θα χορηγηθεί Η έλλειψη ορισμένων θρεπτικών συστατικών π.χ. αζώτου, φωσφόρου, οξυγόνου κ.λ.π Τύπος βακτηρίου Ανάλογα με το βακτήριο που χρησιμοποιείται και της συνθήκες ανάπτυξης του, έχει την ικανότητα να παράγει ομοπολυμερή, στατιστικά (random) συμπολυμερή και συσταδικά (block) συμπολυμερή (He et al., 1999). Ο μικροοργανισμός που θα επιλεχθεί για την παραγωγή του ΡΗΑ εξαρτάται από διάφορους παράγοντες όπως είναι η ικανότητα του μικροοργανισμού να καταναλώνει μια φτηνή πηγή άνθρακα, το κόστος του μέσου ανάπτυξης που είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη του, ο ρυθμός ανάπτυξής του και σύνθεσης του πολυμερούς, καθώς και το είδος και η ποσότητα του πολυμερούς που παράγει (Chanprateep, 2010). Αν και πάνω από 300 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

268 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 233 διαφορετικά είδη μικροοργανισμών είναι γνωστοί ότι έχουν την ικανότητα να συνθέσουν ΡΗΑ, μόνο λίγα από αυτά είναι ικανά να παράγουν ικανοποιητική ποσότητα για μεγάλης κλίμακας παραγωγή. Μερικά από αυτά τα βακτήρια είναι Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas oleovorans και τα τροποποιημένα E. coli (Chanprateep, 2010). Οι μεικτές καλλιέργειες έχουν, επίσης, αποδειχτεί ότι είναι αποτελεσματικές για την παραγωγή των PHAs. Για παράδειγμα, το βακτήριο Cupriavidus necator δεν έχει την ικανότητα να μεταβολίσει σάκχαρα, τυρόγαλα ή αμυλούχα απόβλητα. Συνεπώς, μια μεικτή καλλιέργεια με βακτήρια που παράγουν γαλακτικό οξύ όπως είναι τα Lactobacillus lactis, Priopionibacterium και L. delbrueckii μαζί με το βακτήριο C. necator μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή του ΡΗΑ. Το αρχικό υπόστρωμα σακχάρων μετατρέπεται σε γαλακτικό οξύ το οποίο στη συνέχεια μεταβολίζεται από το C. necator για την παραγωγή του ΡΗΑ (Akaraonye et al., 2010). Πηγή άνθρακα Η διαθέσιμη πηγή άνθρακα αποτελεί ίσως τη σημαντικότερη παράμετρο στη βιοσύνθεση των ΡΗΑs καθώς επηρεάζει τόσο την ανάπτυξη των βακτηρίων, όσο και τη συσσώρευση και το είδος του παραγόμενου πολυμερούς και κυρίως το είδος των μονομερών που απαρτίζουν το πολυμερές. Σημαντικός φαίνεται να είναι ο ρόλος της πηγής του άνθρακα και στην απόδοση της παραγωγής ΡΗΑ καθώς και στην ανάπτυξη των κυττάρων του βακτηρίου (Doi et al., 1990; Gross et al., 1989). Οι πηγές άνθρακα έχουν κατηγοριοποιηθεί σε δυο κατηγορίες στις «συναφείς» πηγές και στις «άσχετες» πηγές. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι πηγές άνθρακα που δημιουργούν μονομερή που είναι δομικά όμοια με τη συγκεκριμένη πηγή άνθρακα που χρησιμοποιήθηκε. Στην δεύτερη κατηγορία ανήκουν οι πηγές άνθρακα που παράγουν μονομερή που είναι τελείως διαφορετικά από την πηγή άνθρακα που τροφοδοτήθηκε. Η αιτία για αυτή την διαφοροποίηση μπορεί να διευκρινιστεί από τα μεταβολικά μονοπάτια που λειτουργούν στο μικροοργανισμό (Philil et al., 2007). Η ομάδα του Brandl (1988), μελέτησε την επίδραση της πηγής άνθρακα και συγκεκριμένα το μήκος της ανθρακικής της αλυσίδας, στην παραγωγή της βιομάζας και στην απόδοση της παραγωγής του ΡΗΑ από το βακτήριο P. oleovorans. Οι πηγές άνθρακα που μελετήθηκαν ήταν άλατα του κ-αλκανοϊκών οξέων, από το οξικό μέχρι το δωδεκανοϊκό. Οι καλλιέργειες που περιείχαν άλατα του οκτανοϊκού ή εννεανοϊκού οξέος ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

269 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 234 ήταν αυτές στις οποίες παρατηρήθηκε η μέγιστη ανάπτυξη των βακτηρίων καθώς και η μέγιστη απόδοση της παραγωγής του ΡΗΑ. Επίσης, για κάθε πηγή άνθρακα, τα είδη των μονομερών του παραγόμενου πολυμερούς διαφοροποιόντουσαν σημαντικά (Brandl et al., 1988). Παρόμοια παρατήρηση έκανε και η ομάδα του Sun (2007), όπου καλλιέργησαν το βακτήριο Pseudomonas putida KT2440 για την παραγωγή ΡΗΑ τροφοδοτώντας γλυκόζη ή εννεανοϊκό οξύ ή και τα δύο μαζί ως πηγή άνθρακα. Με γλυκόζη ως πηγή άνθρακα τα μονομερή του παραγόμενου ΡΗΑ ήταν 3-υδροξυοκτανοϊκό και 3-υδροξυδεκανοϊκό, ενώ όταν χρησιμοποιήθηκε ως πηγή άνθρακα το εννεανοϊκό οξύ, τα μονομερή του παραγόμενου ΡΗΑ ήταν 3-υδροξυεπτανοϊκό και 3-υδροξυεννεανοϊκό. Στην περίπτωση που χρησιμοποιήθηκαν ταυτόχρονα και τα δύο ως πηγή άνθρακα, τα μονομερή του πολυμερούς που σχηματίστηκαν ήταν και τα τέσσερα. Επίσης, παρατηρήθηκε στην περίπτωση όπου χρησιμοποιήθηκαν και οι δυο πηγές άνθρακα ότι το βακτήριο έδειξε μια προτίμηση κατανάλωσης του οξέος από τη γλυκόζη (Sun et al., 2007). H παραγωγή του συμπολυμερούς P(3HB-3HV) κάτω από συνθήκες έλλειψης αμμωνιακών ιόντων στο R. eutropha R3 παρουσία διαφόρων πηγών άνθρακα μελετήθηκε από τους Steinbuchel και Pieper (1992). Η απόδοση της παραγωγής του πολυμερούς στο στέλεχος αυτό ήταν 43, 35.7, 29.5, 21.5 και 42.3% (gpha/gdcw)όταν χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα οι ακόλουθες πηγές άνθρακα: φρουκτόζη, γλυκονικό, οξικό, ηλεκτρικό και λακτόζη. Σε όλες τις περιπτώσεις το ποσοστό του PHV στο συμπολυμερές κυμαινόταν μεταξύ 4 και 7 (mol %). Η πηγή άνθρακα επηρεάζει και τα μονομερή του παραγόμενου πολυμερούς από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus thermophilus. Οι πηγές άνθρακα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το γλυκονικό ή το οκτανοϊκό νάτριο, και η συσσώρευση του πολυμερούς ήταν 35% και 40% της ξηρής βιομάζας αντίστοιχα. Τα μονομερή του παραγόμενου πολυμερούς και το τελικό μοριακό βάρος για τις δυο αυτές πηγές άνθρακα ήταν διαφορετικά. Στην πρώτη περίπτωση όπου η πηγή άνθρακα ήταν το γλυκονικό νάτριο ο πολυεστέρες που παράχθηκε είχε μοριακό βάρος (Μw) 480,000 g/mol και αποτελείτο κυρίως από 3-υδροξυδεκανοϊκό (3HD) σε ποσοστό 64%, και το υπόλοιπο 36% ήταν 3-υδροξυοκτανοϊκό (3HO), 3- υδροξυβαλερικό (3HV), και 3-υδροξυβουτυρικό (3HB). Στην περίπτωση όμως που η πηγή άνθρακα ήταν το οκτανοϊκό νάτριο, το μοριακό βάρος του παραχθέντος πολυμερούς μειώθηκε στα 391,000 g/mol και η σύσταση του αποτελείτο από 24.5 mol% 3- υδροξυβουτυρικό (3HB), 5.4 mol% 3-υδροξυοκτανοϊκό (3HO), 12.3 mol% 3- ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

270 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 235 υδροξυεννεανοϊκό (3HN), 14.6 mol% 3-υδροξυδεκανοϊκό (3HD), 35.4 mol% 3- υδροξυενδεκανοϊκό (3HUD) και 7.8 mol% 3-ύδροξυδωδεκανοϊκός (3HDD) (Pantazaki et al., 2003). Επίδραση έλλειψης θρεπτικών συστατικών. Συνήθως, τα βακτήρια συνθέτουν τα ΡΗΑs όταν βρεθούν σε κατάσταση «διατροφικού stress», όταν δηλαδή οι μικροοργανισμοί υφίστανται έλλειψη από κάποιο από τα κύρια θρεπτικά συστατικά του μέσου ανάπτυξης όπως π.χ. οξυγόνο για τους αερόβιους οργανισμούς, άζωτο,, φώσφορο, θείο, και ιχνοστοιχεία (Lee et al., 2000, Hazenberg and Witholt, 1997). Ανάλογα με τον μικροοργανισμό και τις συνθήκες ανάπτυξης η βέλτιστη συγκέντρωση καθώς και η παρουσία ή απουσία ενός από τα πιο πάνω συστατικών ποικίλουν. Η έλλειψη ενός ή περισσότερων θρεπτικών συστατικών έχει άμεση επίδραση στη συσσώρευση και στη σύσταση των παραγόμενων PHAs. Η απουσία (NH 4 ) 2 SO 4 ή MnSO 4 καθώς και η απουσία CaCl 2, FeSO 4 και ZnSO 4 είχε αρνητική επίδραση στην παραγωγή βιομάζας και στον ρυθμό ανάπτυξης του Methylobacterium extrorquens (Bourque et al., 1995). Υψηλές συγκεντρώσεις (ΝΗ 4 ) 2 SO 4 ήταν τοξικές για τον μικροοργανισμό, ενώ αύξηση στη συγκέντρωση του MgSO 4, FeSO 4 βελτίωσαν τον ρυθμό ανάπτυξης των βακτηρίων. Σε συνθήκες έλλειψης φωσφορικών ή αμμωνιακών ιόντων, η συσσώρευση πολυμερούς στο βακτήριο P. oleovorans επάγεται σε μεγαλύτερο βαθμό από ότι σε συνθήκες έλλειψης άλλου συστατικού (Jung et al., 2001). Όταν ο μικροοργανισμός αναπτύχθηκε παρουσία οκτανοϊκού νατρίου και σε συνθήκες περιορισμένου αζώτου ή φωσφόρου ή μαγνησίου ή σιδήρου ή οξυγόνου, η απόδοση της παραγωγής του πολυμερούς ήταν αντίστοιχα 33%, 17%, 5-10%, 5-8% και 5-10% g PHA/ g ξηρής βιομάζας. Η έλλειψη αζώτου ή φωσφόρου προκαλεί τη γρήγορη σύνθεση του ΡΗΑ στα περισσότερα μελετημένα βακτήρια που παράγουν scl-pha, όπως είναι το Ralstonia eutropha. Για αυτό το λόγο οι περισσότερες διεργασίες παραγωγής scl-pha εφαρμόζουν αρχικά ένα στάδιο γρήγορης ανάπτυξης των κυττάρων ακολουθώντας από ένα στάδιο συσσώρευσης ΡΗΑ, στο οποίο σχεδόν πάντα είναι σε συνθήκες έλλειψης αζώτου ή φωσφόρου. Πιθανώς, λόγω της υπόθεσης ότι τα mcl-pha παράγονται στα βακτήρια με παρόμοιο τρόπο με τα scl-pha, σχεδόν όλες οι αναφορές για την παραγωγή mcl-pha ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

271 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 236 συσχετίζονται με έλλειψη αζώτου και φωσφόρου (Preusting et al., 1993; Huijberts and Eggink 1996; Dufresne and Samain 1998; Jung et al., 2001; Kim 2002; Sun et al., 2007b). Στο βακτήριο P. oleovorans βρέθηκε ότι η έλλειψη αμμωνιακών ιόντων έχει αρνητική επίδραση τόσο στην ανάπτυξή του όσο και στην συσσώρευση του πολυμερούς (Brandl et al., 1988). Ωστόσο, η ομάδα του Ramsay (1992) πρότεινε ότι υπάρχει μια κρίσιμη τιμή στο λόγο συγκέντρωσης άνθρακα/άζωτο (20 mol/mol) που ευνοεί την παραγωγή του πολυμερούς στο βακτήριο P. oleovorans. Ο λόγος αυτός φτάνει ή όχι στην κρίσιμη τιμή ανάλογα με την αρχική συγκέντρωση τόσο της πηγής άνθρακα όσο και των αμμωνιακών ιόντων και για αυτό παρατηρήθηκαν διακυμάνσεις στην παραγωγή του πολυμερούς (Ramsay et al., 1992). Οι Hazenberg και Witholt (1997) παρατήρησαν ότι οι πολύ χαμηλές αρχικές συγκεντρώσεις φωσφορικών ιόντων (1-2 mm) φαίνεται να μην ευνοούν τόσο την ανάπτυξη των βακτηρίων όσο και την συσσώρευση του ΡΗΑ στο βακτήριο P. oleovorans όταν αναπτύχθηκε παρουσία οκτανοϊκού ως πηγή άνθρακα. Αντίθετα, με αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης των φωσφορικών στα 4 και 6 mm παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της βιομάζας καθώς και της συσσώρευσης του πολυμερούς Παραγωγή mcl-phas από το είδος Pseudomonas Όπως έχει ήδη αναφερθεί, περισσότερα από 40 διαφορετικά είδη βακτηρίων, από τα οποία τα πιο διαδεδομένα ανήκουν στην οικογένεια των Pseudomonas, έχουν αναφερθεί ότι παράγουν ΡΗΑs από σύνθετες πηγές άνθρακα όπως είναι τα αλκάνια, τα οξέα, οι αλκοόλες, και οι αρωματικές ενώσεις όταν υποβληθούν σε περιβαλλοντικό στρες (Zinn et al., 2004; Sun et al., 2007). Μερικά από τα πιο μελετημένα βακτήρια αυτής της οικογένειας για την παραγωγή διαφόρων ειδών mcl-phas είναι τα P. oleovorans, P. putida GPo1, P. putida KT2440 και P. putida KT2442 (rifampicin ανθεκτικό τροποποιημένο). Η παραγωγή των mcl-phas από τους μικροοργανισμούς της οικογένειας των Pseudomonas έχει πραγματοποιηθεί σε καλλιέργειες συνεχούς και ημισυνεχούς λειτουργίας. Μέχρι στιγμής, η μεγαλύτερη συγκέντρωση κυττάρων με υψηλό ποσοστό συγκέντρωσης ΡΗΑ που έχει αναφερθεί είναι από το βακτήριο P. putida KT2442 με πηγή άνθρακα το ολεϊκό οξύ. Σε συνθήκες έλλειψης φωσφόρου, η τελική συγκέντρωση των κυττάρων ήταν 141 g/l και το συσσωρευμένο ΡΗΑ ήταν 51% wt, επίσης, ο ρυθμός παραγωγής ήταν 1.9 g PHA/l/h και είναι ο υψηλότερος που έχει αναφερθεί μέχρι τώρα (Lee et al., 2000). Αρκετά υψηλοί ρυθμοί παραγωγής ΡΗΑ έχουν αναφερθεί και σε άλλες ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

272 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 237 περιπτώσεις. Σε ημισυνεχείς καλλιέργειες με περιορισμένη συγκέντρωση της πηγής άνθρακα, η ομάδα του Sun (2007) αναφέρει την μέχρι τώρα υψηλότερη συσσώρευση mcl- ΡΗΑ (75% wt) σε κύτταρα του βακτηρίου Pseudomonas putida KT2440, με συγκέντρωση κυττάρων 70 g/l. Η ίδια ομάδα σε μια προσπάθεια βελτιστοποίησης του κόστους παραγωγής, δοκίμασε την ταυτόχρονη τροφοδοσία δύο πηγών άνθρακα (γλυκόζης και εννεανοϊκό οξύ) για την αύξηση της παραγωγής του ΡΗΑ από το εννεανοϊκό οξύ. Αυτή η προσπάθεια είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή 71 g/l τελικής συγκέντρωσης κυττάρων με 56% wt. συσσωρευμένο ΡΗΑ (Sun et al., 2009a). Οι Huijberts και Eggink (1996) καλλιέργησαν τον Ρ. putida KT2442 σε συνεχείς συνθήκες περιορισμένου οξυγόνου με τη βέλτιστη συγκέντρωση C/N ίση με 20 mol/mol, είχε ως αποτέλεσμα συγκέντρωση βιομάζας ίση με 30 g/l με 23% gρηα/gdcw, με πηγή άνθρακα το ολεϊκό οξύ Παράγοντες που επηρεάζουν το μοριακό βάρος των ΡΗΑs Το μοριακό βάρος των ΡΗΑs είναι ένας πολύ σημαντικός παράγοντας των ιδιοτήτων τους, καθώς παίζει ένα σημαντικό ρόλο για τον καθορισμό των τελικών μηχανικών ιδιοτήτων τους και για τις εφαρμογές τους όπως είναι τα εμπορικά υλικά. Παρόλα αυτά, λεπτομερείς έρευνες πάνω στο μοριακό βάρος του συσσωρευμένου πολυμερούς στα βακτήρια είναι σπάνιες. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι σημαντικές ποσότητες πολυμερούς συνήθως χρειάζεται να καθαριστούν από τα βακτηριακά κύτταρα για την ανάλυση του μοριακού βάρους. Μέχρι στιγμής, ενα ευρύ φάσμα μοριακών βαρών του ΡΗΑ έχει συντεθεί από διάφορους μικροοργανισμούς καθώς και από διαφορετικά στάδια και συνθήκες της καλλιέργειας. Επίσης, το είδος της πηγής άνθρακα που τροφοδοτείται έχει δείξει ότι επηρεάζει το μοριακό βάρος του παραγόμενου ΡΗΑ. (Sudesh et al., 2000). Από τα παραπάνω διαπιστώνεται ότι το μοριακό βάρος των συσσωρευμένων στα κύτταρα ΡΗAs εξαρτάται από αρκετούς παράγοντες οι οποίοι είναι οι ακόλουθοι (Anderson and Dawes, 1990; Choi and Lee, 2004; Rehm, 2003; Rehm and Steinbuchel, 1999; Sudesh et al., 2000; Πενλόγλου, 2010): Το μοριακό βάρος του ΡΗΑ εξαρτάται από τον οργανισμό που παράγει το πολυμερές, Διαφορετικά είδη βακτηρίων παράγουν πολυμερές διαφορετικών μοριακών βαρών. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

273 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 238 Το είδος της συνθάσης που παράγει το βακτήριο. Τα ΡΗΑs που παράγονται από τη συνθάση τύπου Ι έχουν πολύ μεγαλύτερο μοριακό βάρος από αυτά που παράγονται από τη συνθάση τύπου ΙΙ. Στην πρώτη περίπτωση το μοριακό βάρος κυμαίνεται από 500,000 μέχρι μερικά εκατομμύρια ενώ στην δεύτερη από 50,000 μέχρι 500,000. Η συνθάση τύπου ΙΙΙ συνθέτη ΡΗΑ με μοριακά βάρη κάπου ενδιάμεσα στις δυο άλλες συνθάσες. Το μεταβολικό υπόβαθρο σε ότι αφορά την διάταξη του 3-υδροξυάκυλο-CoA θειοεστέρων, δηλαδή, η συγκέντρωση του υποστρώματος της ΡΗΑ συνθάσης σε σχέση με τα διαθέσιμα ένζυμα που υδρολύουν τα ΡΗΑs όπως είναι η αποπολυμεράση ή μη συγκεκριμένες εστεράσες και λιπάσες. Αν το φυσιολογικό υπόβαθρό δεν περιλαμβάνει αυτά τα ένζυμα τότε παράγεται ΡΗΑ με μεγάλο μοριακό βάρος. Γενετικά τροποποιημένα βακτήρια τα οποία στερούνται των γονιδίων της αποπολυμεράσης παράγουν ΡΗΑs με υψηλό μοριακό βάρος. Το πόσο δραστική είναι η πρωτεΐνη της ΡΗΑ συνθάσης μέσα στα κύτταρα. Όσο πιο υψηλή είναι η συγκέντρωση των ενεργών πρωτεϊνών της ΡΗΑ συνθάσης μέσα στο κύτταρο τόσο πιο χαμηλό είναι το μοριακό βάρος του ΡΗΑ. Η μεγάλη τιμή της συγκέντρωσης της ενδοκυττάριας συνθάσης δείχνει να ελαττώνει την τιμή του μοριακού βάρους, λόγω ταυτόχρονης έναρξης του πολυμερισμού σε πολλά ενεργά κέντρα του κυτταροπλάσματος ή της κυτταρικής μεμβράνης. Αντίθετα, κύτταρα με χαμηλή συγκέντρωση της συνθάσης παράγουν ΡΗΑs με υψηλότερο μοριακό βάρος Η σύσταση του ΡΗΑ είναι αυστηρώς εξαρτημένη με την σύσταση του υποστρώματος της ΡΗΑ συνθάσης και η μεταβολική ικανότητα του αντίστοιχου οργανισμού να παρέχει (R)- 3- υδροξυάκυλο-coa θειοεστέρα από την παρεχόμενη πηγή άνθρακα. Για παράδειγμα, το μήκος της ανθρακικής αλυσίδας της πηγής άνθρακα επηρέασε το μοριακό βάρος του παραγόμενου πολυμερούς από τον μικροοργανισμό P. oleovorans. Με την αύξηση του μήκους της ανθρακικής αλυσίδας μειωνόταν το μοριακό βάρος του πολυμερούς χωρίς όμως να επηρεάζεται η πολυδιασπορά. Το είδος του ΡΗΑ που σχηματίζεται επηρεάζει το τελικό μοριακό βάρος του βιοπολυμερούς. Γενικά τα scl-phas εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερα ΜΒ από τα mcl-phas, λόγω των μεγάλων διακλαδώσεων των τελευταίων κατά μήκος της κύριας αλυσίδας και γενικότερα της στερεοχημείας του πολυμερούς. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

274 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 239 Η μέθοδο απομόνωσης επίσης επηρεάζει το τελικό μοριακό βάρος του παραγόμενου ΡΗΑ. Το γεγονός ότι η εξαγωγή με ουδέτερους διαλύτες αποδίδει υψηλότερα μοριακά βάρη από ότι με τη χρήση υποχλωριώδους νατρίου είναι γνωστό εδώ και αρκετά χρόνια Πιθανώς οι συνθήκες ανάπτυξης. Γενικά, οι περιβαλλοντικές συνθήκες ανάπτυξης που επιτρέπουν τη ραγδαία ανάπτυξη της υπολειπόμενης βιομάζας και τη συσσώρευση πολυμερούς, ευνοούν το σχηματισμό περισσότερων αλυσίδων ΡΗΑ με μικρότερο ΜΒ. Το αντίθετο μπορεί να παρατηρηθεί σε συνθήκες περιορισμού της ανάπτυξης και ισχυρής συσσώρευσης βιοπολυμερούς. Κατά την εφαρμογή συνεχούς τροφοδοσίας πηγής άνθρακα υπό ημισυνεχείς συνθήκες λειτουργίας έχει παρατηρηθεί μικρή αύξηση των μέσων μοριακών βαρών, ενώ σε περίπτωση ασυνεχούς λειτουργίας έχει εντοπιστεί μικρή μείωση των τιμών με την πάροδο της καλλιέργειας ανεξαρτήτως των υπόλοιπων συνθηκών 5.12 Εφαρμογές Οι αναμενόμενες εφαρμογές των ΡΗΑs είναι η αντικατάσταση των πετροχημικών πολυμερών. Το εκτεταμένο εύρος των φυσικών ιδιοτήτων της οικογένειας των ΡΗΑs και των εκτεταμένων αποδόσεων που αποκτούν με χημική τροποποίηση ή μίξη παρέχουν ένα ευρύ εύρος πιθανών εφαρμογών (Zinn and Hany 2005; Zhang et al., 1997; Avella et al., 2000; Lee and Park 2002; Wang et al., 2005; Gao et al., 2006; Kunze et al., 2006; Verlinden et al., 2007). Το ΡΗΑ είναι μη τοξικά, βιοσυμβατά, βιοδιασπώμενα θερμοπλαστικά που μπορούν να παραχθούν από ανανεώσιμους πόρους. Έχουν ένα υψηλό βαθμό πολυμερισμού, είναι υψηλής κρυσταλλικότητας, οπτικός ενεργά και ισοτακτικά, πιεζοηλεκτρικά και αδιάλυτα στο νερό. Αυτά τα χαρακτηριστικά τα κάνουν πολύ ανταγωνιστικά σε σχέση με το πολυπροπυλένιο (Reddy et al., 2003). Βάσει αυτών των χαρακτηριστικών, τα πλαστικά που χρησιμοποιούνται σήμερα για συσκευασία και εφαρμογές επικάλυψης μπορούν να αντικατασταθούν μερικώς ή πλήρως από τα ΡΗΑs. Τα ΡΗΑs λόγω των ιδιοτήτων τους μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ένα μεγάλο εύρος εφαρμογών το οποίο αποτελείται από δυο κύριες κατηγορίες τις βιοϊατρικές εφαρμογές και τις βιομηχανικές εφαρμογές. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

275 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών Βιοϊατρικές εφαρμογές Τα ΡΗΑs έχουν επίσης αρκετές ιατρικές εφαρμογές. Το κύριο πλεονέκτημα στον ιατρικό τομέα είναι ότι το βιοδιασπώμενο πλαστικό μπορεί να εισέλθει στο ανθρώπινο σώμα χωρίς να χρειάζεται να αφαιρεθεί ξανά. Το ΡΗΑ έχει μια ιδανική βιοσυμβατότητα καθώς είναι ένα προϊόν μεταβολισμού των κυττάρων και επίσης, το 3-υδροξυβουτυρικό οξύ (προϊόν διάσπασης) συνήθως βρίσκεται στο αίμα σε συγκεντρώσεις μεταξύ 0.3 και 1.3 mmol/l (Zinn et al., 2001). Σε καθαρή μορφή ή σε συνδυασμό με άλλα υλικά, τα PHAs χρησιμοποιούνται σε χειρουργικά ράμματα, στη μηχανική ιστών, ως ελάσματα οστών, οστεοσυνθετικά υλικά, συσκευές επιδιόρθωσης του μηνίσκου, σε γάζες, κ.α. Έρευνες έδειξαν ότι τα υλικά των ΡΗΑs μπορούν να είναι χρήσιμα σε διεργασίες θεραπείας οστών (Chen, 2010). Επίσης, τα πολυμερικά εμφυτεύματα για στοχευόμενη μεταφορά φαρμάκων (targeted drug delivery), μια αναδυόμενη ιατρική εφαρμογή, μπορούν να παρασκευαστούν από ΡΗΑs (Chen and Wu, 2005b; Park et al., 2005b). Ωστόσο, λόγω των υψηλών επίπεδων εξειδίκευσης για τα πλαστικά που χρησιμοποιούνται στο ανθρώπινο σώμα, δεν μπορούν όλα τα ΡΗΑs να χρησιμοποιηθούν σε ιατρικές εφαρμογές. Τα ΡΗΑs που έρχονται σε επαφή με το αίμα πρέπει να είναι απελευθερωμένα από βακτηριακές ενδοτοξίνες και κατά συνέπεια υψηλές απαιτήσεις μεθόδων εξαγωγής και καθαρισμού είναι απαραίτητες για τα ιατρικά ΡΗΑs (Verlinden et al., 2007). Τα PHAs που κυρίως χρησιμοποιούνται στις ιατρικές εφαρμογές, λόγω της ευρείας διαθεσιμότητας τους σε μεγάλες ποσότητες, είναι τα ΡΗΒ, PHBV, P4HB, PHBHHx και PHO. Για αυτό το λόγο, οι περισσότερες έρευνες που αφορούν την εφαρμογή τους, συμπεριλαμβανομένης της μηχανικής των ιστών και την ελεγχόμενη αποδέσμευση φαρμάκων, βασίζεται στα προαναφερθέντα ΡΗΑ (Chen, 2010). Ωστόσο, η μεγαλύτερη συνεισφορά των ΡΗΑs στις βιοϊατρικές εφαρμογές, μέχρι τώρα, θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι βρίσκεται στον τομέα της καρδιαγγειακής ιατρικής. Η αμερικάνικη εταιρία Τepha Inc. παράγει ήδη εμπορικά υποκατάστατα αρτηριών, αγγειακά μοσχεύματα καρδιακές βαλβίδες, χειρουργικά νήματα, επιδέσμους και άλλα βιοϊατρικά προϊόντα με βάση τα ΡΗΑs (Williams and Martin, 2002). Όσο αφορά τη μηχανική ιστών, διαφορετικοί τύποι ΡΗΑs βρίσκουν εφαρμογή σε αναγεννήσεις καρδιαγγειακών ιστών, σε αποκατάσταση νευρικών ανωμαλιών, στη μηχανική οστών και χόνδρων, κ.α. (Wu et al., 2009). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

276 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών Βιομηχανικές εφαρμογές Τα ΡΗΑs λόγω τον χαρακτηριστικών τους, μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών. Οι πρώτες εφαρμογές των PHAs ήταν για την παρασκευή υμενίων περιτυλίγματος κυρίως σε σακούλες, δοχεία και για επένδυση χαρτιού. Επίσης, έχουν χρησιμοποιηθεί και για παρόμοιες εφαρμογές με αυτές των συμβατών εμπορικών πλαστικών περιλαμβάνουν τα αντικείμενα καθημερινής χρήσης όπως είναι τα ξυραφάκια, τα οικιακά σκεύη, σε ταπετσαρία, χαλί, οι πάνες, τα προϊόντα γυναικείας υγιεινής, τα δοχεία καλλυντικών, μπουκάλια και καπάκια των σαμπουάν καθώς και τα υλικά συσκευασίας. (Reddy et al., 2003; Chen, 2010). Το πιο ευρέως χρησιμοποιημένο ΡΗΑ είναι το ΡΗΒ το οποίο έχει αξιοποιηθεί προς την παραγωγή χτενών, στυλό και άλλων σκληρών πλαστικών με την εμπορική ονομασία Biomer (Σχήμα 5.12). Επίσης, ένα άλλο εμπορικό ΡΗΑ με την εμπορική ονομασία Mirel έχει εγκριθεί από τον οργανισμό τροφίμων και φαρμάκων των ΗΠΑ για εφαρμογές σε συσκευασίες τροφίμων. Ακόμα, από το προϊόν Kaneka παρασκευάζονται συνθετικά χαρτιά, ελαστικά φιλμ περιτυλίγματος και γενικότερα θερμοπλαστικά προϊόντα (Philip et al., 2007). Σχήμα 5.12 Παρασκευασμένα αντικείμενα από βιοαποκοδομήσιμο ΡΗΒ, διαφορετικών εφαρμογών, τα οποία μπορούν να βιοδιασπαστούν μέσα σε τρείς εβδομάδες. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

277 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών Άλλες εφαρμογές Εκτός από της βιοϊατρικές και βιομηχανικές εφαρμογές, τα ΡΗΑs μπορούν να χρησιμοποιηθούν και σε άλλες εφαρμογές χάρις το μεγάλο εύρος ιδιοτήτων τους. Για παράδειγμα, τα πιεζοηλεκτρικά χαρακτηριστικά τους τα κάνουν ικανά να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αισθητήρες πίεσης π.χ. σε πληκτρολόγια Η/Υ, σε μετρητικά πίεσης και ελαστικότητας, σε ηχεία κ.α. (Philip et al., 2007). Επίσης, τα βιοπλαστικά σε συνδυασμό με άλλα υλικά, χρησιμοποιούνται ήδη σε ηλεκτρονικά προϊόντα, όπως τα κινητά τηλέφωνα (NEC Corporation and UNITIKA Ltd. 2006). Ακόμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν και σε μερικές γεωργικές εφαρμογές όπως είναι ο εγκλεισμό σπόρων και λιπασμάτων για αργή αποδέσμευση, βιοαποικοδομήσιμα πλαστικά υμένια για προστασία των καλλιεργειών και σε εγκαταστάσεις θερμοκηπίου. (Verlinden et al., 2007). Πρόσφατα, μονομερή των ΡΗΑs χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή νέων βιοκαυσίμων με κόστος παραγωγής 1200 US$/tn (Zhang et al., 2009). Συνοπτικά, οι περισσότερες εφαρμογές των ΡΗΑs είναι οι ακόλουθες: Συσκευασία Πλαστικά σκεύη μιας χρήσης Οικιακά σκεύη και εργαλεία Βιομηχανικά υλικά Προϊόντα αισθητικής και υγιεινής Θερμοευαίσθητες κόλλες Συγκολλητικά, βαφές και υλικά επίστρωσης Δομικές χειραλικές (chiral) μονάδες για σύνθετα λειτουργικά υλικά Βιο-εμφυτεύσιμα υλικά Φορείς μεταφοράς φαρμάκων Βιοϊατρικά υλικά Ιατρικά εργαλεία Αγροτικά προϊόντα Βιοκαύσιμα Ηλεκτρικές και ηλεκτρονικές εφαρμογής 5.13 Βιοαποικοδόμηση των ΡΗΑs Η ιδιότητα που ξεχωρίζει τα ΡΗΑs από τα πετροχημικά πλαστικά είναι η πλήρης βιοαποικοδόμηση τους στο περιβάλλον καθώς μπορούν να αποικοδομηθούν σε έδαφος, σε θαλάσσιο περιβάλλον, σε λιπάσματα και σε αστικά λύματα. (Akaraonye et al., 2010; ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

278 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 243 Reddy et al., 2003; Khanna and Srivastana, 2005). Ο ρυθμός αποικοδόμησης επηρεάζεται από ένα αριθμό παραγόντων όπως είναι: η μικροβιακή δραστικότητα και ο αριθμός των μικροβιακών αποικιών στο περιβάλλον, η θερμοκρασία, τα επίπεδα υγρασία, το ph και η παροχή θρεπτικών συστατικών, Επίσης, η αποικοδόμηση του ΡΗΑ επηρεάζεται από το ίδιο το πολυμερές καθώς διαφοροποιείται ανάλογα με (Lee, 1996; Khanna and Srivastana, 2005): το είδος του μονομερούς, τη κρυσταλλικότητα, το μοριακό βάρος, τα προσθετικά, και την επιφάνεια του ίδιου του πολυμερούς. Για παράδειγμα, συμπολυμερή που περιέχουν ΡΗΒ μονομερή βρέθηκαν ότι αποικοδομούνται πιο γρήγορα από είτε το ΡΗΒ είτε από το 3HB-co-3HV συμπολυμερή. (Reddy et al., 2003) Οι μικροοργανισμοί στη φύση είναι ικανοί να αποικοδομούν τα PHAs χρησιμοποιώντας τις ΡΗΑ-υδρολάσες και τις ΡΗΑ αποπολυμεράσες (Jendrossek and Handrick, 2002; Choi et al., 2004). Οι μικροοργανισμοί εκκρίνουν ένζυμα που αποσυνθέτουν το πολυμερές σε μοριακές δομικές μονάδες, τα ονομαζόμενα υδροξυοξέα, τα οποία χρησιμοποιούνται ως πηγή άνθρακα για την ανάπτυξη τους. Το κύριο ένζυμο για την αποικοδόμηση του ΡΗΒ και τα ολιγομερή που προέρχονται από το πολυμερή είναι η ΡΗΒ αποπολυμεράση. Η βιοαποικοδόμηση του ΡΗΑ κάτω από αερόβιες συνθήκες καταλήγει σε διοξείδιο του άνθρακα και σε νερό. Ενώ σε αναερόβιες συνθήκες τα προϊόντα αποικοδόμησης είναι διοξείδιο του άνθρακα και σε μεθανόλη. H δραστικότητα αυτών των ενζύμων ποικίλει και εξαρτάται από τη σύσταση του πολυμερούς και τις περιβαλλοντολογικές συνθήκες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Reddy et al., 2003). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

279 Μικροβιακή παραγωγή βιοπολυμερών 244 Για παράδειγμα, ο ρυθμός αποικοδόμησης του ΡΗΒ συνήθως κυμαίνεται από μερικές εβδομάδες (σε αναερόβια λύματα) μέχρι χρόνια (σε θαλασσινό νερό) (Madisson and Huisman, 1999). Ωστόσο, με τη βοήθεια του υπεριώδες φωτός μπορεί να επιταχυνθεί η αποικοδόμηση των ΡΗΑs (Shangguan et al., 2006; Verlinden et al., 2007). Επίσης, τα PHAs λιπασματοποιούνται σε ένα μεγάλο εύρος θερμοκρασιών, ακόμα και σε υψηλές θερμοκρασίες, όπως τους ~60 ο C με επίπεδα υγρασίας 55%, όπου μελέτης έδειξαν ότι το ΡΗΑ αποικοδομήθηκε σε 7 εβδομάδες (Johnstone, 1990; Flechter, 1993). Τα PHAs έχουν αναφερθεί ότι αποικοδομούνται και σε υδατικό περιβάλλον μέσα σε 254 μέρες, ακόμα και σε χαμηλές θερμοκρασίες που δεν ξεπερνούν τους 6 ο C (Johnstone, 1990; Reddy et al., 2003). Στο Σχήμα 5.13, παρουσιάζεται μία διαδικασία αποικοδόμησης μπουκαλιών κατασκευασμένα από το συμπολυμερές P(3HB-3HV), σε χρονικό διάστημα 10 εβδομάδων (Madison and Huisman, 1999). Σχήμα 5.13 Βιοαποικοδόμηση του Ρ(3ΗΒ-3ΗV) σε αερόβια απόβλητα. Τα μπουκάλια που αποτελούνται από βιοαποικοδομήσιμο πλαστικό έχουν υποστεί επώαση σε μέση θερμοκρασία 20 ο C για 0. 2, 4, 6, 8 και 10 εβδομάδες (από αριστερά προς τα δεξιά) (Madison and Huisman, 1999). ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5