ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ Κ. ΜΥΡΕΣΙΩΤΗΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ., M.Sc. ΥΠΟΤΡΟΦΟΣ ΤΟΥ ΚΟΙΝΩΦΕΛΟΥΣ Ι ΡΥΜΑΤΟΣ ΑΛΕΞΑΝ ΡΟΣ Σ. ΩΝΑΣΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΩΡΓΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ Κ. ΜΥΡΕΣΙΩΤΗΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ., M.Sc. ΥΠΟΤΡΟΦΟΣ ΤΟΥ ΚΟΙΝΩΦΕΛΟΥΣ Ι ΡΥΜΑΤΟΣ ΑΛΕΞΑΝ ΡΟΣ Σ. ΩΝΑΣΗΣ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΡΙΖΟΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΠΟΥ ΠΡΟΩΘΟΥΝ ΤΗ ΦΥΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ (PGPR) ΚΑΙ ΓΕΩΡΓΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ Κ. ΜΥΡΕΣΙΩΤΗΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ., M.Sc. ΥΠΟΤΡΟΦΟΣ ΤΟΥ ΚΟΙΝΩΦΕΛΟΥΣ Ι ΡΥΜΑΤΟΣ ΑΛΕΞΑΝ ΡΟΣ Σ. ΩΝΑΣΗΣ «ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΡΙΖΟΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΠΟΥ ΠΡΟΩΘΟΥΝ ΤΗ ΦΥΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ (PGPR) ΚΑΙ ΓΕΩΡΓΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ» Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στη Γεωπονική Σχολή Τοµέας Φυτοπροστασίας Ηµεροµηνία προφορικής εξέτασης: 25/06/2012 ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγήτρια Ευθυµία Παπαδοπούλου-Μουρκίδου (Επιβλέπουσα, Γεωπονική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) Λέκτορας Ζήσης Βρύζας (Μέλος, Τµήµα Αγροτικής Ανάπτυξης, ηµοκρίτειο Πανεπιστήµιο Θράκης) Λέκτορας Γεώργιος Καραογλανίδης (Μέλος, Γεωπονική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγήτρια Ευθυµία Παπαδοπούλου-Μουρκίδου (Επιβλέπουσα, Γεωπονική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) Λέκτορας Ζήσης Βρύζας (Μέλος, Τµήµα Αγροτικής Ανάπτυξης, ηµοκρίτειο Πανεπιστήµιο Θράκης) Λέκτορας Γεώργιος Καραογλανίδης (Μέλος, Γεωπονική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) Καθηγητής Αστέριος Τσιφτσόγλου (Εξεταστής, Τµήµα Φαρµακευτικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) Επ. Καθηγητής Αναστάσιος Μαρκόγλου (Εξεταστής, Τµήµα Φυτικής Παραγωγής, Γεωπονικό Πανεπιστήµιο Αθηνών) Επ. Καθηγήτρια Αναστασία Λαγοπόδη (Εξετάστρια, Γεωπονική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) Λέκτορας Ιωάννης Υψηλάντης (Εξεταστής, Γεωπονική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης)

4 Χαράλαµπος Κ. Μυρεσιώτης Α.Π.Θ. ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΡΙΖΟΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΠΟΥ ΠΡΟΩΘΟΥΝ ΤΗ ΦΥΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ (PGPR) ΚΑΙ ΓΕΩΡΓΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ISBN «Η έγκριση της παρούσης ιδακτορικής ιατριβής από τη Γεωπονική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2)

5

6 Στους γονείς µου Κωνσταντίνο και Μαρία

7 Πρόλογος ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Γεωργικών Φαρµάκων της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης κατά τα έτη 2008 έως 2012, υπό την επίβλεψη και καθοδήγηση της Καθηγήτριας της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. και ιευθύντριας του Εργαστηρίου Γεωργικών Φαρµάκων κ. Ευθυµίας Παπαδοπούλου-Μουρκίδου. Ολοκληρώνοντας τη συγγραφή της διατριβής, επιθυµώ να εκφράσω τις ειλικρινείς µου ευχαριστίες προς όλους εκείνους που συνέβαλλαν µε κάθε τρόπο στην πραγµατοποίηση της. Θέλω να ευχαριστήσω θερµά την καθηγήτριά µου κ. Ε. Παπαδοπούλου- Μουρκίδου για την υπόδειξη του θέµατος, την εµπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό µου, τη συνεχή επιστηµονική καθοδήγηση, την άψογη συνεργασία, και την αµέριστη συµπαράστασή της καθ' όλη τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της διατριβής. Θεωρώ τιµή µου το γεγονός ότι µε συµπεριέλαβε στην ερευνητική της οµάδα. Θα ήθελα επίσης να την ευχαριστήσω για την εξασφάλιση και παροχή όλων των απαραίτητων εργαστηριακών υποδοµών για την εκτέλεση και ολοκλήρωση της διατριβής. Η συνεργασία µας αποτέλεσε για µένα πηγή γνώσεων αλλά και καθοριστικό παράγοντα µιας γενικότερης θεώρησης της επιστήµης των Γεωργικών Φαρµάκων και της έρευνας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τον κ. Ζ. Βρύζα, Λέκτορα του Τµήµατος Αγροτικής Ανάπτυξης του ηµοκρίτειου Πανεπιστηµίου Θράκης και µέλος της τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, για την ανεκτίµητη βοήθεια σε όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. Τον ευχαριστώ θερµά για την άριστη συνεργασία, την ενεργή συµµετοχή, το πραγµατικό ενδιαφέρον, τις πολύτιµες συµβουλές και τη διαρκή καθοδήγηση κατά την εκτέλεση του πειραµατικού µέρους και τη συγγραφή της διατριβής. Η ευγνωµοσύνη και οι ευχαριστίες µου είναι η ελάχιστη ανταπόδοση του πολύτιµου χρόνου που διέθεσε στην ερευνητική µου αυτή προσπάθεια. Θέλω πολύ να ευχαριστήσω τον κ. Γ. Καραογλανίδη, Λέκτορα Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστήµιου Θεσσαλονίκης, µέλος της τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, καταρχάς για την αποδοχή του ρόλου του αλλά και για το µετέπειτα ενδιαφέρον του, τις εποικοδοµητικές υποδείξεις του, και την ευχάριστη συνεργασία κατά την 1

8 Πρόλογος εκτέλεση πειραµάτων του πρώτου µέρους της παρούσας διατριβής, που µας βοήθησαν στην επίτευξη των στόχων της διδακτορικής διατριβής. Επίσης, τον ευχαριστώ θερµά για την κριτική ανάγνωση του κειµένου και τις ουσιαστικές παρατηρήσεις του. Αισθάνοµαι επίσης την ανάγκη να ευχαριστήσω θερµά τα µέλη της επταµελούς εξεταστικής επιτροπής, τον Επ. Καθηγητή Α. Μαρκόγλου (Τµήµα Φυτικής Παραγωγής, Γεωπονικό Πανεπιστήµιο Αθηνών), την Επ. Καθηγήτρια Α. Λαγοπόδη (Γεωπονική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης) και τον Λέκτορα Ι. Υψηλάντη (Γεωπονική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης), που δέχτηκαν να συµµετάσχουν στην επιτροπή, καθώς επίσης και για το ενδιαφέρον τους, την άριστη συνεργασία και τη συµβολή τους, µε την κριτική ανάγνωση του κειµένου και τις ουσιαστικές υποδείξεις τους, στην άρτια εµφάνιση του τελικού κειµένου. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στον Καθηγητή Φαρµακολογίας και µέλος της επταµελούς εξεταστικής επιτροπής κ. Α. Τσιφτσόγλου, του Τµήµατος Φαρµακευτικής του Α.Π.Θ., για την αποδοχή µου στο Εργαστήριό του, τη διάθεση του εξοπλισµού του Εργαστηρίου για τις µοριακές αναλύσεις, την άριστη συνεργασία και τις εποικοδοµητικές υποδείξεις του. Κυρίως όµως τον ευχαριστώ για τη ζεστή φιλοξενία και το ειλικρινές του ενδιαφέρον για την εξέλιξη των πειραµάτων. Ένα µεγάλο ευχαριστώ στην Υποψήφια ιδάκτορα του παραπάνω Εργαστηρίου κ. Ε. Αµανατιάδου για τη συνεργασία, το πραγµατικό ενδιαφέρον, το χρόνο που αφιέρωσε, καθώς και την πολύτιµη και ουσιαστική βοήθεια που προσέφερε κατά την πειραµατική διαδικασία. Η συµβολή της στη µύησή µου στον άγνωστο µέχρι τότε κόσµο των µοριακών τεχνικών υπήρξε καθοριστική. Επίσης, ευχαριστώ όλους τους µεταπτυχιακούς φοιτητές του Εργαστηρίου Φαρµακολογίας για το πραγµατικά ευχάριστο, φιλικό και συνεργάσιµο κλίµα. Θερµές ευχαριστίες εκφράζω στον Καθηγητή κ. J.W. Kloepper του Πανεπιστηµίου Auburn (Department of Entomology and Plant Pathology, College of Agriculture, Auburn University, USA), για την διάθεση των βακτηριακών στελεχών Bacillus amyloliquefaciens IN937a και Bacillus pumilus SE34 από την συλλογή του εργαστηρίου του. Επίσης, ευχαριστώ τον Dr. D.R. Zeigler, ιευθυντή του Bacillus Genetic Stock Center (BGSC, Department of Biochemistry, The Ohio State University,USA) για την ευγενική παραχώρηση 2

9 Πρόλογος του πλασµιδιακού φορέα pad Ακόµη, θέλω να ευχαριστήσω τη ρ. Α. Γιαννακοπούλου, της Κτηνιατρικής Σχολής Α.Π.Θ. και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Ε.Ν. Παντερή, του Τµήµατος Βιολογίας Α.Π.Θ., για την απαραίτητη συµβολή τους στη χρήση των µικροσκοπίων (συνεστιακό και φθορισµού) και τη µικροσκοπική παρατήρηση των βακτηριακών δειγµάτων. Ευχαριστώ επίσης την εταιρία Syngenta Hellas Α.Ε. και ιδιαίτερα την κ. Β. Καλιακάκη για την ευγενική χορήγηση του σκευάσµατος Bion (acibenzolar-s-methyl, 50% WG) καθώς και του µεταβολίτη του CGA Ευχαριστώ την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Εδαφολογίας κ. Α. Παυλάτου- Βε, της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ., για την πολύτιµη και ουσιαστική βοήθεια που προσέφερε κατά τις εδαφολογικές αναλύσεις των δειγµάτων εδάφους, για τη διάθεση υλικών αλλά και για το χρόνο που αφιέρωσε στον προσδιορισµό των αποτελεσµάτων. Επίσης, ευχαριστώ την Επίκουρο Καθηγήτρια Εδαφολογίας κ. Σ. Κωστοπούλου, της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ., για την παραχώρηση χρήσιµων σκευών αλλά και δείγµατος εδάφους από την συλλογή του εργαστηρίου. Θέλω να ευχαριστήσω θερµά το ιευθυντή του Εργαστηρίου Ανθοκοµίας της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. Καθηγητή Α. Οικονόµου για την ευγενική διάθεση εξοπλισµού και την εξασφάλιση των απαραίτητων θερµοκηπιακών υποδοµών για την πραγµατοποίηση των πειραµάτων σε συνθήκες θερµοκηπίου. Επίσης ευχαριστώ τον κ. Σ. Κώστα και την κ. Μ. Αγγελάκη, τεχνικό προσωπικό του παραπάνω εργαστηρίου, για την ευγενική και συνεχή διαθεσιµότητα και βοήθειά τους κατά τη διάρκεια εκτέλεσης των πειραµάτων. Επιθυµώ να ευχαριστήσω θερµά τον συνάδελφο και συνεργάτη µου στο Εργαστήριο Γεωργικών Φαρµάκων ρ. Ε.Ν. Παπαδάκη για το ενδιαφέρον και την αµέριστη και πολύτιµη βοήθεια που προσέφερε σε τεχνικές χρωµατογραφίας. Επίσης, θέλω να ευχαριστήσω όλο το προσωπικό του Εργαστηρίου Γεωργικών Φαρµάκων της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ., µε τους οποίους εργαστήκαµε στον ίδιο χώρο όλα αυτά τα χρόνια, την συνάδελφο Α. Τσαµπούλα, την Κ. Κιντζίκογλου, τον Ι. Ταγγίδη για την ευχάριστη συνεργασία, βοήθεια, κατανόηση και υποµονή τους, και ιδιαίτερα την Α. Κοτοπούλου για το συνεχές ενδιαφέρον, τη συµπαράσταση, και την ουσιαστική βοήθεια που προσέφερε στην εκτέλεση των πειραµάτων. 3

10 Πρόλογος Θέλω επίσης να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την Οµότιµη Καθηγήτρια Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ., κ. Κ. Τζαβέλλα-Κλωνάρη, για το ειλικρινές ενδιαφέρον της και τις πολύτιµες συµβουλές και υποδείξεις. Θα ήθελα να τονίσω ότι η εκπόνηση της µεταπτυχιακής µου διατριβής στο εργαστήριο Φυτοπαθολογίας, υπό την επίβλεψη και καθοδήγησή της, στάθηκε η αιτία να ασχοληθώ και να εκτιµήσω το χώρο της έρευνας. Θέλω να εκφράσω ένα µεγάλο ευχαριστώ στο Κοινωφελές Ίδρυµα Αλέξανδρος Σ. Ωνάσης, που µε τίµησε µε την επιλογή του ως Υπότροφο του Ιδρύµατος και για την οικονοµική στήριξη που µου παρείχε κατά την διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω προσωπικά την κ. Φ. Παπαθάνου για την βοήθεια που µου προσέφερε και για την άριστη συνεργασία. Επιπλέον, κατά το έτος 2011 ενισχύθηκα οικονοµικά από υποτροφία αριστείας της Επιτροπής Ερευνών Α.Π.Θ., την οποία και ευχαριστώ θερµά. Τέλος, πάνω από όλους θέλω να ευχαριστήσω την αδελφή µου ήµητρα, καθώς και στον πατέρα µου Κωνσταντίνο και τη µητέρα µου Μαρία, για τη συµπαράσταση, την κατανόηση, την ενθάρρυνση και την αγάπη τους. Σαν ελάχιστο δείγµα ευγνωµοσύνης και αγάπης για όλα όσα µου έχουν προσφέρει ως τώρα, αφιερώνω στους γονείς µου την εργασία αυτή. Την προσπάθειά µου όλα αυτά τα χρόνια στήριζε και εµψύχωνε καθηµερινά η Αναστασία την οποία και ευχαριστώ ιδιαίτερα. Χαράλαµπος Κ. Μυρεσιώτης 4

11 Συντοµογραφίες ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ACC: 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (1-αµινο-κυκλοπροπάνιοκαρβοξυλικο οξύ) AFM: Antifungal Metabolites (Αντιµυκητιακοί µεταβολίτες) ARISA: Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis ASM: Acibenzolar-S-methyl Atm: Atmosphere (Ατµόσφαιρα) BABA: b-aminobutyric acid (β-αµινοβουτυρικό οξύ) BGSC: Bacillus Genetic Stock Center CDB: Czapek Dox Broth (Υγρό θρεπτικό υπόστρωµα) CFU: Colony Forming Units (Αριθµός των βιώσιµων αναπαραγωγικών µονάδων) CIPAC: Collaborative International Pesticides Analytical Council CLSM: Confocal Laser Scanning Microscopy (Συνεστιακή µικροσκοπία σάρωσης µε λέιζερ) DAD: Diode Array Detector (Ανιχνευτής µε διάταξη φωτοδιόδων) 5

12 Συντοµογραφίες DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή µε βαθµίδωση αποδιατακτικών ουσιών) DI: Disease Index ( είκτης ασθένειας) DT 50 : Time for 50% Degradation (Χρόνος ηµίσειας ζωής στο έδαφος: χρονικό διάστηµα για να µειωθεί κατά 50% η αρχική συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου) DT 90 : Time for 90% Degradation (Χρονικό διάστηµα για να µειωθεί κατά 90% η αρχική συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου) EPA: Environmental Protection Agency (Υπηρεσία προστασίας περιβάλλοντος των Η.Π.Α.) ESI: Electrospray Ionization (Ιονισµός µε ηλεκτροψεκασµό) ET: Ethylene (αιθυλένιο) FCRR: Fusarium Crown and Root Rot (Σήψη του λαιµού και των ριζών της τοµάτας) FORL: Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici GCB: Graphitized Carbon Black (Γραφιτικός άνθρακας) GFP: Green Fluorescent Protein (Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη) HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης) 6

13 Συντοµογραφίες IAA: indole-3-acetic acid (Ινδολοξικό οξύ) ICM: Integrated Crop Management (Ολοκληρωµένη διαχείριση της παραγωγής) INA: 2,6-dichloro isonicotinic acid (2,6 διχλωροισονικοτινικο οξύ) IPM: Integrated Pest Management (Ολοκληρωµένη διαχείριση παρασίτων) ISR: Induced Systemic Resistance (Επαγόµενη διασυστηµατική αντοχή) JA: Jasmonic Acid (Γιασµονικό οξύ) LB: Luria Bertani (Θρεπτικό υπόστρωµα) LC-MS/MS: Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (Υγρή χρωµατογραφία µε ανιχνευτή φασµατογράφο µάζας) LOD: Limit of Detection (Όριο ανίχνευσης αναλυτικής µεθόδου) LOQ: Limit of Quantification (Όριο ποσοτικού προσδιορισµού αναλυτικής µεθόδου) LOX: Lipoxygenase (Λιποξυγενάση) LPS: Lipopolysaccharides (Λιπο-πολυσακχαρίτες) PAL: Phenylalanine Ammonia Lyase (Αµµωνιολυάση της φαινυλαλανίνης) 7

14 Συντοµογραφίες PR proteins: Pathogenesis-Related proteins (Πρωτεΐνες που σχετίζονται µε την παθογένεση) PCR: Polymerase Chain Reaction (Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης) PDA: Potato Dextrose Agar (Στερεό θρεπτικό υπόστρωµα) PGPR: Plant Growth-Promoting Rhizobateria (Ριζοβακτήρια που προάγουν τη φυτική ανάπτυξη) PIP: Plant Incorporated Protectants PLFA: Phospholipid Fatty Acids (Λιπαρά οξέα των φωσφολιπιδίων) PSB: Phosphate Solubilizing Bacteria (Βακτήρια εδάφους που διαλυτοποιούν αδιάλυτες µορφές φωσφορικών) RG: Relative Growth (Σχετική ανάπτυξη) RI: Relative Inhibition (Σχετική αναστολή) RISA: Ribosomal Intergenic Spacer Analysis RPM: Rounds per minute (Στροφές ανά λεπτό) RSD: Relative Standard Deviation (Σχετική τυπική απόκλιση) RT: Retention Time (Χρόνος κατακράτησης) 8

15 Συντοµογραφίες SA: Salicylic Acid (Σαλικυλικό οξύ) SAR: Systemic Acquired Resistance (Επίκτητη διασυστηµατική αντοχή) TGGE: Temperature Gradient Gel Electrophoresis (Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή µε βαθµίδωση θερµοκρασίας) TMV: Tobaco Mosaic Virus (Ιός του µωσαϊκού του καπνού) TNV: Tobacco Necrosis Virus (Ιός της νέκρωσης του καπνού) T-RFLP: Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (Πολυµορφισµός µήκους περιοριστικού ακραίου τµήµατος) TSA: Tryptic Soy Agar (Στερεό θρεπτικό υπόστρωµα) TSB: Tryptic Soy Broth (Υγρό θρεπτικό υπόστρωµα) UV: Ultraviolet (Υπεριώδης) VOC: Volatile Organic Compounds (Πτητικές οργανικές ενώσεις) WHC: Water Holding Capacity (Υδατοχωρητικότητα) 9

16 10

17 Περιεχόµενα ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 1 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ.. 5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1.1 ΡΙΖΟΒΑΚΤΗΡΙΑ ΠΟΥ ΠΡΟΑΓΟΥΝ ΤΗ ΦΥΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ (PGPR) Η περιοχή της ριζόσφαιρας Αλληλεπιδράσεις µεταξύ των µικροοργανισµών στη ριζόσφαιρα Μηχανισµοί δράσης των PGPR Άµεσοι µηχανισµοί ενίσχυσης της ανάπτυξης από PGPR Έµµεσοι µηχανισµοί ενίσχυσης της ανάπτυξης από PGPR Ταξινόµηση και ονοµατολογία Σκευάσµατα PGPR και τρόποι εφαρµογής Εφαρµογή PGPR στη σύγχρονη φυτοπροστασία ΓΕΩΡΓΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΣΤΟ Ε ΑΦΟΣ Μικροβιακή αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος Παράγοντες που επηρεάζουν την µικροβιακή αποδόµηση στο έδαφος Μελέτη της ταχύτητας αποδόµησης των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος Επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στη µικροβιακή κοινότητα του εδάφους Μέθοδοι προσδιορισµού της επίδρασης των γεωργικών φαρµάκων στη µικροβιακή κοινότητα του εδάφους Συνδυασµένη εφαρµογή PGPR και γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ. 59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ PGPR ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BACILLUS ΣΤΗΝ ΠΡΟΑΓΩΓΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΗΣ ΤΟΜΑΤΑΣ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ FUSARIUM OXYSPORUM F.SP. 11

18 Περιεχόµενα RADICIS-LYCOPERSICI 2.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα PGPR του γένους Bacillus ως βιολογικοί παράγοντες Η σήψη του λαιµού και των ριζών της τοµάτας από τον εδαφογενή µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (FORL) Η καταπολέµηση του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicislycopersici στην τοµάτα Σκοπός των πειραµάτων ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ PGPR, φυτοπαθογόνος µύκητας και θρεπτικά υποστρώµατα Παραγωγή βακτηριακών κυττάρων και µολύσµατος FORL Ανάπτυξη φυτικού υλικού In vitro αλληλεπιδράσεις µεταξύ των στελεχών PGPR και του φυτοπαθογόνου µύκητα In vitro βιοδοκιµές ευαισθησίας του παθογόνου στα εµπορικά σκευάσµατα Tachigaren 36% SL και Bion 50% WG οκιµές επίδρασης των PGPR στην προαγωγή της ανάπτυξης και αντιµετώπιση του µύκητα FORL στην τοµάτα οκιµές επίδρασης της συνδυασµένης εφαρµογής PGPR και γεωργικών φαρµάκων στην καταπολέµηση του FORL στην τοµάτα οκιµές επιβίωσης και ικανότητας αποικισµού των PGPR στο ριζικό σύστηµα της τοµάτας σε σύστηµα ελεγχόµενων συνθηκών (gnotobiotic) Μετρήσεις έντασης της ασθένειας και προαγωγής της ανάπτυξης Μετρήσεις βακτηριακών πληθυσµών Επεξεργασία δεδοµένων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αλληλεπιδράσεις µεταξύ των στελεχών PGPR και του φυτοπαθογόνου µύκητα in vitro In vitro ευαισθησία του µύκητα FORL στα εµπορικά σκευάσµατα Tachigaren 36% SL και Bion 50% WG Επίδραση των επεµβάσεων PGPR στην προαγωγή της ανάπτυξης φυτών τοµάτας Επίδραση της απλής και συνδυασµένης εφαρµογής PGPR στην 12

19 Περιεχόµενα αντιµετώπιση του µύκητα FORL στην τοµάτα Επίδραση της συνδυασµένης εφαρµογής PGPR και γεωργικών φαρµάκων στην καταπολέµηση του FORL στην τοµάτα Επιβίωση και ικανότητα αποικισµού των PGPR στο ριζικό σύστηµα της τοµάτας σε σύστηµα ελεγχόµενων συνθηκών (gnotobiotic) ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΜΕΛΕΤΗ ΑΠΟ ΟΜΗΣΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΑΠΟ PGPR ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BACILLUS ΚΑΙ ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΚΑΙ Ε ΑΦΟΣ ΑΓΡΟΥ 3.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Επίδραση PGPR στην αποδόµηση ξενοβιοτικών ουσιών Εφαρµογή γεωργικών φαρµάκων και επίδραση στην ανάπτυξη των PGPR Σκοπός των πειραµάτων ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Αντιδραστήρια, θρεπτικά υποστρώµατα και άλλα υλικά PGPR και παρασκευή εµβολίων Εδαφικά δείγµατα Αναλυτικά όργανα προσδιορισµού των γεωργικών φαρµάκων (LC- MS/MS, HPLC-UV) και συνθήκες ανάλυσης Παρασκευή προτύπων διαλυµάτων Ανάλυση των εµπορικών σκευασµάτων Επεξεργασία και χαρακτηρισµός εδαφών οκιµές επίδρασης των PGPR στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων και παρακολούθηση ανάπτυξης των βακτηριακών πληθυσµών σε υγρές καλλιέργειες οκιµές επίδρασης των PGPR στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων και παρακολούθηση ανάπτυξης των βακτηριακών πληθυσµών στο έδαφος Μέθοδοι εκχύλισης των γεωργικών φαρµάκων από υγρές καλλιέργειες και έδαφος Μέθοδος προσδιορισµού των βακτηριακών πληθυσµών σε υγρές 13

20 Περιεχόµενα καλλιέργειες και έδαφος Έλεγχος αξιοπιστίας αναλυτικών µεθόδων Επεξεργασία δεδοµένων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αξιοπιστία µεθόδων ανάλυσης Επίδραση των PGPR στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων σε υγρές καλλιέργειες Επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στη βακτηριακή ανάπτυξη σε υγρές καλλιέργειες Επίδραση των PGPR στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος Επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στην ανάπτυξη των PGPR στο έδαφος ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 133 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙ ΡΑΣΗΣ PGPR ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BACILLUS ΣΤΗΝ ΑΠΟ ΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΣΛΗΨΗ ΤΟΥ ACIBENZOLAR- S-METHYL ΚΑΙ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΙΚΙΣΜΟΥ ΦΥΤΩΝ ΤΟΜΑΤΑΣ ΣΕ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΘΕΡΜΟΚΗΠΙΟΥ 4.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βενζο-θειαδιαζόλια ως ενεργοποιητές των µηχανισµών άµυνας των φυτών (SAR) Συνδυασµός βιολογικών παραγόντων και χηµικών ενεργοποιητών των φυτών µια εναλλακτική προσέγγιση φυτοπροστασίας Εµβολιασµός του εδάφους µε PGPR και ικανότητα αποικισµού της ριζόσφαιρας των φυτών Σκοπός των πειραµάτων ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Αντιδραστήρια Ανάπτυξη φυτικού υλικού Εφαρµογή των βιολογικών παραγόντων και του σκευάσµατος Bion 50% WG Συλλογή δειγµάτων Μέθοδος προσδιορισµού του acibenzolar-s-methyl και του κύριου 14

21 Περιεχόµενα µεταβολίτη του (CGA ) σε δείγµατα εδάφους Μέθοδος προσδιορισµού του acibenzolar-s-methyl και του κύριου µεταβολίτη του (CGA ) σε φυτά τοµάτας Έλεγχος αξιοπιστίας αναλυτικών µεθόδων ιαδικασία µετασχηµατισµού του PGPR στελέχους Bacillus subtilis GB03 µε πλασµιδιακό φορέα Πλασµιδιακός φορέας pad43-25 (Bacillus Genetic Stock Center, BGSC) Καλλιέργεια βακτηριακών κυττάρων Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA από υγρή καλλιέργεια E. coli µε τη χρήση του NucleoSpin Plasmid Miniprep kit Πέψη πλασµιδιακού DNA µε ένζυµα περιορισµού Προετοιµασία βακτηριακών κυττάρων Bacillus subtilis GB03 επιδεκτικών για µετασχηµατισµό (competent cells) Μετασχηµατισµός (εισαγωγή πλασµιδίου) δεκτικών κυττάρων µε τη χηµική µέθοδο Φαινοτυπική επιλογή των µετασχηµατισµένων κυττάρων Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA από µετασχηµατισµένα κύτταρα B. subtilis GB03 µε τη µέθοδο του βρασµού (Boiling prep) Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων των αντιδράσεων σε πηκτή αγαρόζης Φασµατοφωτοµετρικός ποσοτικός προσδιορισµός των νουκλεϊκών οξέων Προετοιµασία των παρασκευασµάτων και µικροσκοπική παρατήρηση ιαδικασία µέτρησης του PGPR στελέχους B. subtilis GB03 στη ρίζα φυτών τοµάτας και στο έδαφος της ριζόσφαιρας Επεξεργασία δεδοµένων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αξιοπιστία µεθόδων χρωµατογραφικής ανάλυσης Επίδραση των PGPR στην αποδόµηση του acibenzolar-s-methyl στο έδαφος της ριζόσφαιρας και σχηµατισµός του µεταβολίτη CGA

22 Περιεχόµενα Πρόσληψη και µετακίνηση του acibenzolar-s-methyl και του µεταβολίτη του CGA στο υπέργειο µέρος φυτών τοµάτας Μετασχηµατισµός των βακτηριακών κυττάρων B. subtilis GB03 µε το πλασµίδιο pad Αποικισµός του στελέχους B. subtilis GB03 στη ρίζα φυτών τοµάτας και στο έδαφος της ριζόσφαιρας ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ. 195 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I: Λεζάντες Εικόνων 221 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II: Λεζάντες Πινάκων ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III: Περιλήψεις δηµοσιεύσεων κατά την εκπόνηση της διδακτορικής διατριβής

23 Περίληψη ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα ριζοβακτήρια που προάγουν τη φυτική ανάπτυξη (Plant Growth- Promoting Rhizobacteria, PGPR) είναι ωφέλιµα βακτήρια εδάφους που µε διάφορους µηχανισµούς ενισχύουν την αύξηση των φυτών. Οι µηχανισµοί αυτοί έχουν είτε άµεση επίδραση στην ανάπτυξη των φυτών, είτε προάγουν έµµεσα τη φυτική ανάπτυξη προστατεύοντας τα φυτά από παθογόνους µικροοργανισµούς, οπότε λειτουργούν ως βιολογικοί παράγοντες. Ορισµένα στελέχη έχουν τυποποιηθεί σε εµπορικά σκευάσµατα τα οποία εφαρµόζονται στο έδαφος και αποτελούν αναµφίβολα µια σηµαντική συνιστώσα σε προγράµµατα σύγχρονης φυτοπροστασίας. Στη συνήθη όµως γεωργική πρακτική, εκτός από την εισαγωγή εµβολίων PGPR, εφαρµόζονται στο έδαφος διάφορες οµάδες γεωργικών φαρµάκων για την αντιµετώπιση εχθρών και ασθενειών αλληλεπιδρώντας µεταξύ τους και η µελέτη των αλληλεπιδράσεων αυτών αποτέλεσε το κύριο θέµα αυτής της διατριβής. Στην παρούσα έρευνα συµπεριλήφθηκαν τέσσερα PGPR τα οποία ανήκουν στο γένος Bacillus και συγκεκριµένα, τα εργαστηριακά στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34 και τα εµπορικά διαθέσιµα στελέχη B. subtilis FZB24 (FZB24 ) και B. subtilis GB03 (Companion ). Αρχικά, µελετήθηκε η επίδραση των παραπάνω στελεχών, εφαρµοζόµενων µεµονωµένα και σε µίγµατα ανά δύο, στην προαγωγή της ανάπτυξης φυτών τοµάτας και στην αντιµετώπιση του εδαφογενούς µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici που προκαλεί τη σήψη του λαιµού και των ριζών της τοµάτας. Η ασθένεια αυτή αποτελεί σηµαντικό περιοριστικό παράγοντα σε µια καλλιέργεια µεγάλης οικονοµικής σηµασίας, όπως είναι η τοµάτα, τόσο στην Ελλάδα όσο και διεθνώς. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η συνδυασµένη εφαρµογή των PGPR µε τα γεωργικά φάρµακα acibezolar-s-methyl (Bion ) και hymexazol (Tachigaren) στην αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης της ασθένειας, καθώς και η ικανότητα επιβίωσης στο έδαφος και αποικισµού των βακτηριακών στελεχών στο ριζικό σύστηµα φυτών τοµάτας. Στη συγκεκριµένη µελέτη διαπιστώθηκε ότι η εφαρµογή των PGPR βελτίωσε τα χαρακτηριστικά ανάπτυξης των φυτών που προσδιορίστηκαν σε όλες τις επεµβάσεις. Η προαγωγή της ανάπτυξης µεταξύ των επεµβάσεων ήταν 17

24 Περίληψη µέγιστη σε φυτά που έγινε εφαρµογή µε το βακτηριακό στέλεχος B. pumilus SE34. Η ένταση της ασθένειας µειώθηκε σηµαντικά σε όλες τις επεµβάσεις µε PGPR, µε εξαίρεση τα φυτά που δέχτηκαν µεταχείριση µε το στέλεχος B. amyloliquefaciens IN937a. Στις µεµονωµένες επεµβάσεις, τα εµπορικά B. subtilis στελέχη GB03 και FZB24 ήταν τα πιο αποτελεσµατικά, ενώ η συνδυασµένη µεταχείριση B. amyloliquefaciens IN937a+B. subtilis GB03 παρουσίασε τη µεγαλύτερη µείωση της ασθένειας. Η εφαρµογή acibenzolar-s-methyl οδήγησε σε µικρή µείωση της ασθένειας, ενώ το hymexazol παρουσίασε σηµαντικά υψηλότερη αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης. Τα γεωργικά φάρµακα συνδυαζόµενα µε τα στελέχη PGPR του γένους Bacillus εµφάνισαν στις περισσότερες περιπτώσεις αυξηµένο έλεγχο της ασθένειας. Πειράµατα για τη δυναµική των πληθυσµών φανέρωσαν ότι το στέλεχος B. pumilus SE34 παρέµεινε στο αρχικό επίπεδο πληθυσµού, ενώ τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03 παρουσίασαν µικρή µείωση στο έδαφος µετά από 28 ηµέρες επώασης. Επιπλέον, παρατηρήθηκε υψηλή ικανότητα αποικισµού του ριζικού συστήµατος φυτών τοµάτας από τα εµπορικά στελέχη B. subtilis FZB24 και GB03 ενώ οι πληθυσµοί των στελεχών B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34 µειώθηκαν κατά περίπου δύο λογαριθµικές τάξεις µεγέθους. Πραγµατοποιήθηκαν πειράµατα σε ελεγχόµενες συνθήκες για να διερευνηθεί η επίδραση των εµβολίων PGPR του γένους Bacillus στην αποδόµηση γεωργικών φαρµάκων σε θρεπτικά υποστρώµατα και εδάφη αγρού και να µελετηθούν οι πιθανές επιδράσεις των γεωργικών φαρµάκων στους πληθυσµούς των PGPR. οκιµάστηκαν πέντε γεωργικά φάρµακα διαφορετικών χηµικών οµάδων, που χρησιµοποιούνται ως µέσα φυτοπροστασίας στην καλλιέργεια της τοµάτας, συµπεριλαµβανοµένων των acibenzolar-s-methyl (ενεργοποιητής SAR), metribuzin και napropamide (ζιζανιοκτόνα), propamocarb hydrochloride (µυκητοκτόνο) και thiamethoxam (εντοµοκτόνο). Τα πειράµατα έγιναν σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης. Για τον προσδιορισµό των υπολειµµάτων των παραπάνω ουσιών αναπτύχθηκε νέα µέθοδος εκχύλισης και η χρωµατογραφική ανάλυση των εκχυλισµάτων πραγµατοποιήθηκε σε συστήµατα υγρής χρωµατογραφίας συνδεδεµένο µε ανιχνευτή φασµατοµετρίας µάζας τριπλού τετραπόλου (LC-MS/MS). Εναλλακτικά, χρησιµοποιήθηκε και σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας µε ανιχνευτή µε διάταξη φωτοδιόδων (HPLC-DAD). Οι 18

25 Περίληψη βακτηριακοί πληθυσµοί προσδιορίστηκαν µε τη βοήθεια διαδοχικών αραιώσεων, επιφανειακής επίστρωσης σε τρυβλία µε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα και µέτρησης των αποικιών (CFU) που αναπτύχθηκαν πάνω στο υπόστρωµα. Από τα αποτελέσµατα προκύπτει ότι η εισαγωγή εµβολίων PGPR σε αποστειρωµένες συνθήκες (υγρές καλλιέργειες και αποστειρωµένο έδαφος) αύξησε σηµαντικά την αποδόµηση ορισµένων γεωργικών φαρµάκων. Το acibenzolar-s-methyl σε υγρές καλλιέργειες των ριζοβακτηρίων αποδοµήθηκε σε 24 ώρες κατά 58 έως 100% και το στέλεχος B. pumilus SE34 παρουσίασε τη µεγαλύτερη ταχύτητα αποδόµησης. Στα υπόλοιπα γεωργικά φάρµακα, ο εµβολιασµός των υποστρωµάτων µε τα στελέχη PGPR προκάλεσε αποδόµηση των metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride και thiamethoxam που κυµάνθηκε στις διάφορες επεµβάσεις µεταξύ 8-18%, 9-11%, 15-36% και 11-22%, αντίστοιχα, µε την ολοκλήρωση του χρόνου επώασης. Σε αποστειρωµένο έδαφος, το acibenzolar-s-methyl εµφάνισε παρόµοια συµπεριφορά µε ταχεία αποδόµηση και τιµές DT 50 <16.4 ηµέρες στις επεµβάσεις µε τα PGPR σε σύγκριση µε τιµές DT 50 >34.2 ηµέρες που προσδιορίστηκαν στους µάρτυρες. Ο ρυθµός αποδόµησης των propamocarb hydrochloride και thiamethoxam αυξήθηκε σε εδαφικά δείγµατα που ενσωµατώθηκαν τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34, σε σχέση µε δείγµατα που δεν δέχτηκαν βακτηριακή µεταχείριση. Ωστόσο, ο εµβολιασµός των βακτηρίων PGPR σε φυσικό έδαφος αγρού δεν επηρέασε το ρυθµό αποδόµησης των γεωργικών φαρµάκων που µελετήθηκαν. Η βακτηριακή ανάπτυξη παρουσία των γεωργικών φαρµάκων και στα δύο επίπεδα επιφόρτισης ήταν ικανοποιητική και µάλιστα σε ορισµένες περιπτώσεις παρατηρήθηκε ακόµη και διεγερτική δράση των ουσιών στην ανάπτυξη των βακτηρίων, αυξάνοντας τους πληθυσµούς των βακτηριακών κυττάρων. Η περαιτέρω έρευνα επικεντρώθηκε στη συµπεριφορά και τύχη του acibenzolar-s-methyl στη ριζόσφαιρα φυτών τοµάτας, που αναπτύχθηκαν σε θερµοκηπιακές συνθήκες και µετά από ριζοεµβολιασµό µε τα PGPR, καθώς και στην ικανότητα πρόσληψης και διασυστηµατικής µετακίνησης των υπολειµµάτων στο υπέργειο µέρος των φυτών. Επιπλέον, µελετήθηκε η ικανότητα αποικισµού του στελέχους B. subtilis GB03 στη ρίζα των φυτών τοµάτας και στο έδαφος της ριζόσφαιρας και παράλληλα αξιολογήθηκε και η πιθανή επίδραση του acibenzolar-s-methyl στους πληθυσµούς του στελέχους. 19

26 Περίληψη Για τη µελέτη της συµπεριφοράς και τύχης του acibenzolar-s-methyl στο έδαφος αναπτύχθηκε µια νέα αναλυτική µέθοδος σε σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης συνδεδεµένο µε ανιχνευτή διάταξης φωτοδιόδων (HPLC-DAD) για τον προσδιορισµό του acibenzolar-s-methyl και του κύριου µεταβολίτη του CGA στο έδαφος της ριζόσφαιρας. Η συγκέντρωση των υπολειµµάτων προσδιορίστηκε και στο υπέργειο µέρος των φυτών τοµάτας. Από τα αποτελέσµατα προέκυψε ότι η προσθήκη των εµβολίων PGPR δεν επηρέασε το ρυθµό αποδόµησης του acibenzolar-s-methyl στο έδαφος. Επίσης, ο σχηµατισµός του µεταβολίτη CGA ήταν γρήγορος αφού ανιχνεύθηκε µία ώρα µετά την εφαρµογή και διατηρήθηκε σε υψηλά επίπεδα έως την ολοκλήρωση της δειγµατοληψίας, χωρίς να διαφοροποιείται σηµαντικά µεταξύ των βακτηριακών επεµβάσεων σε σχέση µε το µάρτυρα. Παρατηρήθηκε γρήγορη πρόσληψη και ταχεία µετακίνηση του acibenzolar-smethyl και του κύριου µεταβολίτη του στο υπέργειο µέρος των φυτών µε µέγιστες συγκεντρώσεις σε ώρες από την εφαρµογή του acibenzolar-smethyl. ιαπιστώθηκε ότι σε φυτά που έγινε µεταχείριση µε τα στελέχη B. subtilis GB03 και B. pumilus SE34 η πρόσληψη και διασυστηµατική µετακίνηση των acibenzolar-s-methyl και CGA στο υπέργειο µέρος των φυτών τοµάτας ήταν σηµαντικά υψηλότερη ως προς το µάρτυρα που δεν δέχτηκε βακτηριακή µεταχείριση. Το γεγονός αυτό µπορεί να συσχετιστεί µε την αυξηµένη αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης που παρατηρήθηκε κατά τη συνδυασµένη εφαρµογή acibenzolar-s-methyl και PGPR. Προκειµένου να µελετηθεί η ικανότητα αποικισµού του στελέχους B. subtilis GB03 στη ριζόσφαιρα φυτών τοµάτας, δοκιµάστηκε ο µετασχηµατισµός του µε πλασµιδιακό φορέα (pad43-25) εισάγοντας γενετικό υλικό που κωδικοποιεί πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP). Ο βαθµός αποικισµού του στελέχους ήταν µεγαλύτερος στο ριζικό σύστηµα των φυτών σε σύγκριση µε το έδαφος της ριζόσφαιρας, ενώ παρατηρήθηκε αρνητική επίδραση του acibenzolar-s-methyl στην ανάπτυξη του στελέχους στο έδαφος της ριζόσφαιρας. 20

27 Abstract ABSTRACT Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) are beneficial soil bacteria that use different mechanisms to promote plant growth. These mechanisms have either a direct effect on plant growth or promote indirectly plant growth while protecting plants from pathogens, thus acting as biocontrol agents. Some strains that have been marketed as commercial formulations are applied to soil and consist undoubtedly an important component in modern pest management programs. Under actual agricultural practices, apart from the introduction of PGPR inocula, different groups of pesticides are applied to soil against pests and diseases interacting with each other and the study of these interactions is the main topic of this thesis. In the present study, four PGPR strains belonging to the genus Bacillus were included and specifically, the laboratory strains B. amyloliquefaciens IN937a and B. pumilus SE34 and the commercially available strains B. subtilis FZB24 (FZB24 ) and B. subtilis GB03 (Companion ). Initially, the effect of the above strains, alone and in all possible two-strain combinations, on the tomato plant growth promotion and the control of soilborne fungus Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, the causal agent of Fusarium crown and root rot on tomato, was investigated. This disease is a major limiting factor of tomato crop with great economic importance in Greece and worldwide. In addition, the effect of the combined application of PGPR strains with the pesticides acibezolar-smethyl (Bion ) and hymexazol (Tachigaren) in controlling the disease on tomato plants was evaluated, as well as the survival and the ability of the bacterial strains to colonise the tomato plant root system. In this study it was found that the application of PGPR promoted the plant growth parameters evaluated in all treatments. The promotion of growth was highest in plants treated with the bacterial strain B. pumilus SE34. The disease index percentage was significantly reduced in all PGPR treatments, with the exception of plants treated with the strain B. amyloliquefaciens IN937a. In individual applications, the commercial B. subtilis strains GB03 and FZB24 were the most effective, while the combined treatment of B. amyloliquefaciens IN937a + B. subtilis GB03 resulted in the greatest disease reduction. The application of 21

28 Abstract acibenzolar-s-methyl provided a slight reduction of the disease, while hymexazol showed significantly higher efficacy against FORL. The pesticides combined with Bacillus PGPR strains showed in most cases increased control of the disease. Experiments on population dynamics revealed that the strain B. pumilus SE34 was maintained at the initial population level, while the strains B. amyloliquefaciens IN937a, B. subtilis FZB24 and B. subtilis GB03 showed a slight decrease in soil after 28 days of incubation. Moreover, high colonization ability on the tomato plant root system by the commercial strains B. subtilis FZB24 and GB03 was observed while the populations of B. amyloliquefaciens IN937a and B. pumilus SE34 decreased by about two log orders of magnitude. Experiments performed under controlled conditions to investigate the influence of Bacillus PGPR inocula on the degradation of pesticides in liquid cultures and field soils and to study the possible effects of pesticides on PGPR populations were undertaken. Five pesticides among different chemical groups, which are used as plant protection products in tomato plant cultivation, were evaluated including acibenzolar-s-methyl (SAR activator), metribuzin and napropamide (herbicides), propamocarb hydrochloride (fungicide) and thiamethoxam (insecticide). Experiments were performed at two application levels. For the determination of pesticide residues a new extraction method was developed and instrumental analysis of extracts was carried out by liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry (LC- MS/MS). Alternatively, a liquid chromatographic system coupled with a diode array detector (HPLC-DAD) was also used. The bacterial populations were determined using serial dilutions, plating on agar plates and counting the colonies (CFU) developed on the medium. The results revealed that the introduction of PGPR inocula in sterile conditions (liquid cultures and sterilized soil) significantly enhanced the degradation of certain pesticides. Acibenzolar-S-methyl added in liquid cultures of rhizobacteria was degraded between 58 to 100% in 24 hours and the strain B. pumilus SE34 showed the highest degradation rate. For the remaining pesticides, the inoculation with the PGPR strains degraded metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride and thiamethoxam by 8-18%, 9-11%, 15-36% and 11-22%, respectively, within 72-h incubation. In sterile soil, acibenzolar-smethyl exhibited similar behavior with rapid degradation and DT 50 values <

29 Abstract days in the PGPR treatments compared with > 34.2 days determined in the control. The degradation of propamocarb hydrochloride and thiamethoxam was increased in soil samples incorporated with B. amyloliquefaciens IN937a and B. pumilus SE34 strains in comparison to samples with no bacterial treatment. However, the inoculation of PGPR strains in natural field soil did not affect the degradation rate of the pesticides studied. Bacterial growth in the presence of pesticides in both pesticide fortification levels were satisfactory and in some cases there was even a stimulatory effect of pesticides on the growth of bacteria, increasing the populations of bacterial cells. The further investigation was focused on the behavior and fate of acibenzolar-s-methyl in the rhizosphere of tomato plants, grown under greenhouse conditions and after root application of the PGPR strains, as well its ability of uptake and systemic translocation of residues in aboveground tomato plants was also investigated. In addition, the colonization of strain B. subtilis GB03 at the tomato plant root system and rhizosphere soil was studied and the effect of acibenzolar-s-methyl on strain populations was also evaluated. For studying the behavior and fate of acibenzolar-s-methyl in the soil a new analytical method was developed for the determination of acibenzolar-s-methyl and its major metabolite CGA in the rhizosphere soil using a high performance liquid chromatographic system associated with diode array detector (HPLC-DAD). The concentration of the residues was also determined in the aboveground parts of tomato plants. The results showed that the addition of PGPR inocula did not affect the degradation rate of acibenzolar-s-methyl in rhizosphere soil. Also, the formation of metabolite CGA was rapid, since it was detected one hour after root drench and it was maintained at high levels during the sampling period without considerable variations among the bacterial treatments compared to the control. The uptake and translocation of residues from root to shoot was rapid and maximum concentrations were observed at hours after acibenzolar-s-methyl application. It was found that in plants treated with the strains B. subtilis GB03 and B. pumilus SE34 the uptake and systemic translocation of acibenzolar-s-methyl and CGA in the aerial parts of the tomato plants was significantly higher compared to the control receiving no bacterial treatment. This may be associated with the observed increased efficacy in the combined application of acibenzolar-s-methyl and 23

30 Abstract PGPR. In order to study the colonization ability of the strain B. subtilis GB03 in tomato plant rhizosphere, transformation with a plasmid vector (pad43-25) introducing genetic material translated into a green fluorescent protein (GFP) was also performed. The colonization was higher in the root system compared to the rhizosphere soil, while there was a negative effect of acibenzolar-s-methyl in the development of this strain in the rhizosphere soil. 24

31 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1.1 ΡΙΖΟΒΑΚΤΗΡΙΑ ΠΟΥ ΠΡΟΑΓΟΥΝ ΤΗ ΦΥΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ (PGPR) Τα ριζοβακτήρια (rhizobacteria) είναι βακτήρια εδάφους τα οποία αποικίζουν τη ριζόσφαιρα και αλληλεπιδρούν µε το έδαφος, τους µικροοργανισµούς και τα διάφορα φυτικά είδη. Σύµφωνα µε τον Hiltner (1904), ως ριζόσφαιρα ορίζεται η περιοχή του εδάφους η οποία επηρεάζεται από το ριζικό σύστηµα των φυτών. Η παρουσία ριζοβακτηρίων στη ριζόσφαιρα µπορεί να έχει θετική, αρνητική ή ουδέτερη επίδραση στην ανάπτυξη των φυτών (Antoun and Prévost, 2005). Περίπου 2 έως 5% των ριζοβακτηρίων, επηρεάζουν θετικά την ανάπτυξη των φυτών και ονοµάζονται ριζοβακτήρια που προάγουν τη φυτική ανάπτυξη (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR). Ο όρος "PGPR" χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1978 από τους Kloepper και Schroth για να περιγράψουν ριζοβακτήρια που προήγαν σηµαντικά τη φυτική ανάπτυξη σε ραπανάκια (Raphanus sativus), (Kloepper and Schroth, 1978). Υπάρχουν βέβαια και περιπτώσεις εδαφών, όπου τα PGPR απαντώνται σε υψηλότερα ποσοστά, όπως για παράδειγµα σε ορισµένα επισχετικά εδάφη (suppressive soils), (Antoun and Kloepper, 2001). Ως επισχετικό ορίζεται το έδαφος εκείνο στο οποίο το παθογόνο δεν µπορεί να εγκατασταθεί, είτε εγκαθίσταται προκαλώντας αµελητέα έως καθόλου προσβολή, είτε εγκαθίσταται προκαλώντας ασθένεια για κάποιο χρονικό διάστηµα, η ένταση της οποίας µειώνεται σηµαντικά µε την πάροδο του χρόνου παρόλο που το παθογόνο µπορεί να υπάρχει στο έδαφος (Cook and Baker, 1983). Τα PGPR χρησιµοποιούν έναν ή περισσότερους µηχανισµούς δράσης για να προάγουν την αύξηση των φυτών. Οι µηχανισµοί αυτοί έχουν είτε άµεση επίδραση στην ανάπτυξη των φυτών, είτε την προάγουν έµµεσα προστατεύοντας τα φυτά από παθογόνους µικροοργανισµούς, οπότε λειτουργούν ως βιολογικοί παράγοντες (Spaepen et al., 2009). Στους άµεσους τρόπους δράσης περιλαµβάνονται η έκκριση φυτοορµονών, η διαλυτοποίηση ανόργανων ουσιών που βρίσκονται σε αδιάλυτη µορφή, όπως ο φώσφορος, και η αυξηµένη πρόσληψη απαραίτητων για τα φυτά θρεπτικών στοιχείων (Vessey, 2003). Στη διεθνή βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί διάφοροι έµµεσοι µηχανισµοί προαγωγής 25

32 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση της ανάπτυξης από PGPR, όπως η παραγωγή αντιβιοτικών ουσιών, η επαγόµενη διασυστηµατική αντοχή στα φυτά (Induced Systemic Resistance, ISR) και ο ανταγωνισµός µε φυτοπαθογόνα για θρεπτικά στοιχεία και θέσεις αποικισµού (Kloepper et al., 2004). Με βάση τις ιδιότητες που παρουσιάζουν τα PGPR, ο Somers και οι συνεργάτες του (2004) ταξινόµησαν τα PGPR σε διάφορες κατηγορίες. Συγκεκριµένα, τα κατέταξαν σε βιολογικά λιπάσµατα (biofertilizers) όταν αυξάνουν τη διαθεσιµότητα των θρεπτικών στοιχείων στα φυτά, φυτοδιεγέρτες (phytostimulators) όταν προάγουν την ανάπτυξη κυρίως µέσω της παραγωγής φυτοορµονών, ριζοαποθεραπευτές (rhizoremediators) όταν αποδοµούν οργανικούς ρύπους, και βιολογικά γεωργικά φάρµακα (biopesticides) όταν παρέχουν προστασία από φυτοπαθογόνα κυρίως µέσω της παραγωγής αντιµικροβιακών ουσιών και της πρόκλησης ISR (Induced Systemic Resistance). Στελέχη PGPR µπορούµε να συναντήσουµε σε πολλά και διαφορετικά γένη βακτηρίων. Συγκεκριµένα, τα γένη Arthrobacter, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Gordonia, Klebsiella, Paenibacillus, Pseudomonas, Serratia, περιλαµβάνουν µεταξύ άλλων και PGPR (Glick, 1995). Από τα παραπάνω γένη, τα Bacillus spp. και Pseudomonas spp. είναι τα πιο ευρέως διαδεδοµένα και έχουν µελετηθεί εκτεταµένα από τους επιστήµονες. Αξίζει να αναφερθεί στο σηµείο αυτό ότι παρόλη την ονοµασία "PGPR", τα συγκεκριµένα βακτήρια δεν προάγουν πάντα την ανάπτυξη των φυτών. Ένα βακτήριο που προάγει την ανάπτυξη ενός φυτικού είδους, ενδέχεται να µην έχει καµία επίδραση ή να έχει και αρνητική επίδραση (deleterious effect) στην ανάπτυξη άλλων φυτών. Επίσης ένα βακτήριο που προάγει τη φυτική ανάπτυξη σε συγκεκριµένες περιβαλλοντικές συνθήκες µπορεί να µην έχει καµία επίδραση ή ακόµη και να µειώσει την αύξηση του ίδιου φυτού κάτω από διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης (Tuzun and Bent, 1999). Στην περίπτωση που τα ριζοσφαιρικά βακτήρια οδηγούν σε µείωση της ανάπτυξης του φυτού ονοµάζονται επιβλαβή ριζοβακτήρια (deleterious rhizobacteria), (Nehl et al., 1997). Η µείωση αυτή µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε διάφορους µηχανισµούς, όπως: παραγωγή φυτοορµονών που επιβραδύνουν την ανάπτυξη, ανταγωνισµό µε το φυτό για θρεπτικά στοιχεία, παραγωγή φυτοτοξικών ουσιών κ.α. Κάποια λοιπόν PGPR µπορεί σε διαφορετικό περιβάλλον να λειτουργήσουν ως ανασταλτικά για τα φυτά (Nehl et al., 1997). Απαραίτητη λοιπόν κρίνεται η 26

33 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση γνώση της βιοοικολογίας των βακτηρίων PGPR σε διαφορετικές συνθήκες και ξενιστές Η περιοχή της ριζόσφαιρας Ο όρος "ριζόσφαιρα" αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τον Lorenz Hiltner το 1904 (Hiltner, 1904). Στο περιβάλλον της ριζόσφαιρας, λαµβάνουν χώρα πολύ σηµαντικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ φυτών, µικροοργανισµών και εδάφους. Σύµφωνα µε τον Sorensen (1997) η ριζόσφαιρα, ο όγκος δηλαδή του εδάφους που περιβάλλει τη ρίζα και επηρεάζεται χηµικά, φυσικά και βιολογικά από αυτή, αποτελεί ένα ιδιαίτερα ευνοϊκό περιβάλλον για την ανάπτυξη διαφόρων µικροοργανισµών, επιδρώντας σηµαντικά στην ευρωστία των φυτών και στη γονιµότητα του εδάφους. Κατά τη διάρκεια βλάστησης των σπόρων και ανάπτυξης των φυταρίων, το αναπτυσσόµενο φυτό αλληλεπιδρά µε ένα µεγάλο εύρος µικροοργανισµών που βρίσκεται στο έδαφος που το περιβάλλει. Η αύξηση των ριζών και η παράλληλη έκκριση οργανικών ουσιών, τις οποίες χρησιµοποιούν οι µικροοργανισµοί της ριζόσφαιρας ως θρεπτικά στοιχεία, αποτελούν την κινητήρια δύναµη για την ανάπτυξη ενεργών µικροβιακών πληθυσµών στη ζώνη της ρίζας και του περιβάλλοντος εδάφους (Morgan and Whipps, 2001). Γενικά, υπάρχουν τρία διαφορετικά µέρη που απαρτίζουν την περιοχή της ριζόσφαιρας: η ρίζα, η επιφάνεια της ρίζας (rhizoplane) και το έδαφος που περιβάλλει άµεσα τη ρίζα (Nihorimbere et al., 2011). Το φαινόµενο της ριζικής έκκρισης (root exudation) αναφέρεται στην έκκριση οργανικών ουσιών από τις ζωντανές φυτικές ρίζες προς το περιβάλλον έδαφος και ο ρυθµός της έκκρισης διαφέρει ανάλογα µε το φυτικό είδος και τις περιβαλλοντικές συνθήκες (Jones and Darrah, 1995). Η µελέτη της χηµικής σύστασης και της συγκέντρωσης των ριζικών εκκρίσεων στο έδαφος είναι ιδιαίτερα δύσκολη σε φυσικές συνθήκες, παρουσία της ενδογενούς µικροβιακής κοινότητας. Ανάλογες εποµένως µελέτες πραγµατοποιούνται µε ανάπτυξη φυτών σε ασηπτικές συνθήκες (Stolp, 1988). 27

34 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Οι ριζικές εκκρίσεις συνήθως ταξινοµούνται σε δύο κατηγορίες ουσιών. Σε µικρού µοριακού βάρους ουσίες, όπως για παράδειγµα αµινοξέα, οργανικά οξέα, σάκχαρα, φαινόλες και άλλους δευτερογενείς µεταβολίτες, µεγάλου και µοριακού βάρους εκκρίσεις όπως πολυσακχαρίτες και πρωτεΐνες (Bais et al., 2006). Η ποιοτική και ποσοτική σύσταση των ριζικών εκκρίσεων εξαρτάται από διάφορους παράγοντες όπως το φυτικό είδος, η ποικιλία και η ηλικία του φυτού, από πολλούς περιβαλλοντικούς Εικόνα 1.1 Παράγοντες που επηρεάζουν τις εκκρίσεις των ριζών στο έδαφος και τον αποικισµό της ριζόσφαιρας από ωφέλιµα ριζοβακτήρια ( παράγοντες, όπως ph εδάφους, τύπο εδάφους, συγκέντρωση οξυγόνου, ένταση φωτός, θερµοκρασία εδάφους, διαθεσιµότητα θρεπτικών στοιχείων καθώς και τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ φυτών και µικροοργανισµών (Εικόνα 1.1). Οι ριζικές εκκρίσεις έχουν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του φυτού, αφού περιλαµβάνουν ουσίες που µειώνουν την τριβή µεταξύ ακροριζίου (καλύπτρα) και εδάφους, βελτιώνουν την επαφή µεταξύ ρίζας και εδαφικού διαλύµατος, αυξάνουν τη διαλυτοποίηση ή και την απορρόφηση διαφόρων ανόργανων στοιχείων κ.α. Παράλληλα όµως προσελκύουν και διάφορους µικροοργανισµούς του εδάφους τόσο ωφέλιµους όσο και παθογόνους και συνεπώς καθορίζουν τη µικροβιακή σύσταση της ριζόσφαιρας. Ένα µεγάλο ποσοστό του συνόλου των προϊόντων της φωτοσύνθεσης εκκρίνεται από τις ρίζες των φυτών προς το έδαφος (Brimecombe et al., 2007). Εξαιτίας των ριζικών εκκρίσεων, η περιοχή της ριζόσφαιρας είναι πλουσιότερη σε θρεπτικά στοιχεία σε σύγκριση µε τον κύριο όγκο του εδάφους. Έχει αναφερθεί ότι ο πληθυσµός των βακτηρίων στη ριζόσφαιρα είναι από φορές µεγαλύτερος από τον πληθυσµό στο υπόλοιπο έδαφος και ότι έως 15% της 28

35 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση επιφάνειας της ρίζας µπορεί να καλύπτεται από αποικίες διαφόρων βακτηριακών στελεχών (Spaepen et al., 2009; Van Loon, 2007). Η µικροχλωρίδα της ριζόσφαιρας περιλαµβάνει βακτήρια, µύκητες, νηµατώδεις, πρωτόζωα, φύκη και µικροαθρόποδα (Raaijmakers et al., 2001). Τα βακτήρια αποτελούν την πολυπληθέστερη κατηγορία µικροοργανισµών της ριζόσφαιρας. Παρόλο που οι µύκητες αποτελούν το µεγαλύτερο ποσοστό της µικροβιακής βιοµάζας του εδάφους, τα βακτήρια θεωρούνται το ενεργότερο κλάσµα λόγω των µικροσκοπικών τους διαστάσεων σε συνδυασµό µε τον υψηλό πληθυσµό και την υψηλή ταχύτητα πολλαπλασιασµού τους. Το µέγεθος και η σύνθεση της µικροβιακής κοινότητας της ριζόσφαιρας εξαρτάται τόσο από την ποσότητα και τη σύσταση των ριζικών εκκρίσεων όσο και από τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των µικροοργανισµών (Somers et al., 2004). Ο ανταγωνισµός στην περιοχή της ριζόσφαιρας είναι ιδιαίτερα έντονος, εξαιτίας της ύπαρξης µεγάλου αριθµού µικροοργανισµών. Οι µικροοργανισµοί της ριζόσφαιρας αλληλεπιδρούν µεταξύ τους µε διάφορους µηχανισµούς, οι οποίοι µάλιστα παίζουν σηµαντικό ρόλο στη βιολογική καταπολέµηση φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών Αλληλεπιδράσεις µεταξύ των µικροοργανισµών στη ριζόσφαιρα Στην περιοχή της ριζόσφαιρας, στα ανώτερα φυτά, αναπτύσσονται σηµαντικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ φυτού, εδάφους και µικροοργανισµών. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές έχουν τεράστια σηµασία για τη γεωργική παραγωγή, αφού στην περιοχή αυτή υπάρχουν όχι µόνο τα απαραίτητα θρεπτικά στοιχεία για την ανάπτυξη των φυτών αλλά και σηµαντικός αριθµός παθογόνων µικροοργανισµών. Οι µικροοργανισµοί λοιπόν του εδάφους αναπτύσσουν διάφορους µηχανισµούς τους οποίους αξιοποιούν τα φυτά περιορίζοντας τις επιδράσεις των εδαφογενών παθογόνων και οι οποίοι παίζουν καταλυτικό ρόλο στη βιολογική καταπολέµηση φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών. Στην περίπτωση εδαφογενών παθογόνων, η βιολογική καταπολέµηση έχει οριστεί ως "η µείωση της ποσότητας ενός παθογόνου ή παρασίτου ή η εξασθένιση των λειτουργιών οι οποίες σχετίζονται µε την προσβολή, σε οποιοδήποτε στάδιο του βιολογικού του κύκλου, από έναν ή περισσότερους οργανισµούς, µε τρόπο φυσικό, ή µε χειρισµούς στο περιβάλλον, τον ξενιστή ή τον ανταγωνιστή, ή µε µαζική εισαγωγή ενός ή περισσότερων ανταγωνιστών" 29

36 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση (Cook and Baker, 1983). Οι οργανισµοί αυτοί ονοµάζονται βιολογικοί παράγοντες (biocontrol agents ή biological control agents). Οι κύριοι µηχανισµοί που εµπλέκονται στη βιολογική καταπολέµηση εδαφογενών φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών είναι οι ακόλουθοι: I) Ανταγωνισµός Ο ανταγωνισµός µεταξύ βιολογικών παραγόντων και παθογόνων είναι γνωστός εδώ και πολλά χρόνια ως µηχανισµός βιολογικού ελέγχου των ασθενειών (Duijff et al., 1993). Η ανταγωνιστική αυτή σχέση µεταξύ των µικροοργανισµών µπορεί να αφορά τη διαθεσιµότητα σε χώρο, ανόργανα στοιχεία και άλλους αβιοτικούς παράγοντες οι οποίοι βρίσκονται σε περιοριστικές συγκεντρώσεις στο εδαφικό διάλυµα. Ο παράγοντας βιολογικού ελέγχου καταλαµβάνει την οικοθέση του παθογόνου, την οποία και εξαντλεί από συστατικά απαραίτητα για την αύξηση του παθογόνου παρεµποδίζοντας την εγκατάστασή του. Αρκετοί µη παθογόνοι µικροοργανισµοί, παρέχουν προστασία στα φυτά εξαιτίας της ικανότητάς τους να αποικίζουν γρηγορότερα την περιοχή της ριζόσφαιρας σε σύγκριση µε τα φυτοπαθογόνα και να εκµεταλλεύονται σηµαντικά στοιχεία της ριζόσφαιρας. Για παράδειγµα, ο ανταγωνισµός για θρεπτικά στοιχεία, και ιδιαίτερα άνθρακα, έχει βρεθεί ότι επιδρά στη µολυσµατική ικανότητα του παθογόνου, αναστέλλοντας τη βλάστηση σπορίων µυκήτων στο έδαφος, αφού δεν µπορούν να προσλάβουν τις ουσίες που απαιτούνται για τη διέγερση της βλάστησης (Alabouvette et al., 2006). II) Υπερπαρασιτισµός και παραγωγή υδρολυτικών ενζύµων Ορισµένοι βιολογικοί παράγοντες έχουν την ικανότητα να εµποδίζουν την εξάπλωση µιας ασθένειας παρασιτώντας τον φυτοπαθογόνο οργανισµό. Στην περίπτωση αυτή ο παράγοντας του βιολογικού ελέγχου παρασιτεί άµεσα και καταστρέφει είτε το παθογόνο είτε τις µονάδες αναπαραγωγής του (σπόρια, σκληρώτια κ.α.), αντλώντας απαραίτητα θρεπτικά συστατικά. Έχουν αναφερθεί διάφοροι υπερπαράσιτοι µύκητες οι οποίοι προσβάλλουν φυτοπαθογόνους µύκητες, όπως για παράδειγµα µύκητες του γένους Trichoderma οι οποίοι παρασιτούν διάφορους εδαφογενείς µύκητες (Rey et al., 2001; Sivan et al., 1987) καθώς και στελέχη του είδους Coniothirium minitans τα οποία παρασιτούν υφές και σκληρώτια του φυτοπαθογόνου µύκητα Sclerotinia sclerotiorum (De Vrije et 30

37 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση al., 2001). Σύµφωνα µε τον Papaviza (1985), περιέλιξη και είσοδος των υφών του παρασίτου εντός των υφών του ξενιστή και εκροή ή συγκέντρωση πρωτοπλάσµατος στο κέντρο των υφών είναι φαινόµενα που συνήθως παρατηρούνται σε περιπτώσεις παρασιτισµού µεταξύ µυκήτων. Επιπλέον τα παράσιτα παράγουν ένζυµα, όπως πρωτεάσες, χιτινάσες, γλουκανάσες, και τοξίνες µε σκοπό τη λύση των υφών ή των ληθαργικών µορφών, όπως είναι τα σκληρώτια. Τα ένζυµα και οι τοξίνες συνήθως δρουν συνεργιστικά και ο µύκητας που δέχεται την επίθεση σύντοµα υφίσταται αποδιοργάνωση του κυτταρικού τοιχώµατος, απώλεια του πρωτοπλάσµατος και τελικά καταστρέφεται (Chiu and Tzean, 1995). III) Παραγωγή αντιβιοτικών ουσιών Τα αντιβιοτικά είναι χηµικές ουσίες που παράγονται από µικροοργανισµούς και µπορούν να µειώσουν ή να αναστείλουν την ανάπτυξη άλλων µικροοργανισµών. Με την παραγωγή αντιβιοτικών ουσιών, ένας µικροοργανισµός, παρεµποδίζει την ανάπτυξη παθογόνων και προφυλάσσει την απαραίτητη για την επιβίωσή του οικοθέση. Η παραγωγή αντιβιοτικών ουσιών από ορισµένα βακτήρια του εδάφους έχει ιδιαίτερη σηµασία στη βιολογική καταπολέµηση εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων. Το φαινόµενο αυτό έχει µελετηθεί εκτεταµένα σε βακτήρια του γένους Bacillus spp. και Pseudomonas spp. Έχει προσδιοριστεί πληθώρα αντιβιοτικών που παράγονται από συγκεκριµένους µικροοργανισµούς οι οποίοι χρησιµοποιούνται ως βιολογικοί παράγοντες, όπως για παράδειγµα ετεροκυκλικές αρωµατικές ενώσεις (phenazine-1-carboxylic acid), πυρρόλες (pyoluteorin, pyrrolnitrin), φαινόλες (2,4-diacetylphloroglucinol) και κυκλικά λιποπεπτίδια (iturin A), (Chin-A- Woeng et al., 1998; Kinsella et al., 2009). Σε ορισµένες περιπτώσεις η επίδραση της αντιβίωσης στην καταπολέµηση εδαφογενών φυτοπαθογών αµφισβητείται. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι ουσίες αυτές σπάνια ανιχνεύονται στο έδαφος είτε επειδή δεσµεύονται ισχυρά στα κολλοειδή του εδάφους είτε επειδή αποδοµούνται από τη µικροχλωρίδα του εδάφους. Επιπλέον το µέγεθος της επίδρασης των αντιβιοτικών ουσιών στους παθογόνους µικροοργανισµούς είναι δύσκολο να διαχωριστεί από την επίδραση άλλων µηχανισµών όπως ο ανταγωνισµός για θρεπτικά στοιχεία (Whipps, 2001). Παρόλα αυτά, σε πολλές βιβλιογραφικές αναφορές η επίδραση της παραγωγής 31

38 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση αντιβιοτικών ουσιών από βακτήρια in vitro έχει επαληθευτεί και σε in vivo πειράµατα. Οι δοκιµές αυτές περιλαµβάνουν σύγκριση της αποτελεσµατικότητας καταπολέµησης στο έδαφος µεταξύ του βιολογικού παράγοντα που παράγει το αντιβιοτικό και µεταλλαγµένων ατόµων αυτού, που δεν παράγουν ή υπερεκφράζουν την παραγωγή αντιβιοτικού (Chin-A-Woeng et al., 1998), καθώς και αποµόνωση του αντιβιοτικού παράγοντα και δοκιµή της αποτελεσµατικότητάς του στο έδαφος σε σχέση µε το στέλεχος που το παράγει (Howell and Stipanovic, 1979) Μηχανισµοί δράσης των PGPR Η ευεργετική επίδραση των PGPR εκδηλώνεται στα διάφορα φυτικά είδη µε προαγωγή της αύξησης συγκεκριµένων βιολογικών χαρακτηριστικών ανάπτυξης των φυτών (π.χ. µήκος, διάµετρος, νωπό και ξηρό βάρος βλαστού, αριθµός φύλλων, νωπό και ξηρό βάρος ρίζας) καθώς επίσης και της απόδοσής τους. Τα PGPR χρησιµοποιούν έναν ή ακόµη και περισσότερους διαφορετικούς µηχανισµούς δράσης για να προάγουν την αύξηση των φυτών. Οι µηχανισµοί αυτοί είτε επιδρούν άµεσα στην ανάπτυξη των φυτών (direct plant growth promotion mechanisms), µε την παραγωγή για παράδειγµα φυτοορµονών, είτε έµµεσα (indirect plant growth promotion mechanisms) προστατεύοντας τα φυτά από παθογόνους µικροοργανισµούς, όπως για παράδειγµα µε την παραγωγή αντιβιοτικών ουσιών (Podile and Kishore, 2006). Στην περίπτωση µάλιστα αυτή λειτουργούν ως παράγοντες βιολογικού ελέγχου. Οι άµεσοι αλλά και οι έµµεσοι µηχανισµοί δράσης των PGPR περιγράφονται λεπτοµερώς στις επόµενες παραγράφους Άµεσοι µηχανισµοί ενίσχυσης της ανάπτυξης από PGPR I) Παραγωγή φυτοορµονών Οι φυτοορµόνες ή φυτικές ορµόνες (phytohormones ή plant hormones), οργανικές ενώσεις που σε µικρές συγκεντρώσεις λειτουργούν ως χηµικά σήµατα και ρυθµίζουν την αύξηση και ανάπτυξη των φυτών, µπορούν να συντίθενται τόσο από τα ίδια τα φυτά όσο και από µικροοργανισµούς που βρίσκονται στην περιοχή της ριζόσφαιρας. Υπάρχουν πολλές αναφορές στη διεθνή βιβλιογραφία για βακτήρια που έχουν την ικανότητα να παράγουν φυτικές ορµόνες στη ζώνη 32

39 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση της ρίζας και να αυξάνουν εποµένως την πυκνότητα και το µήκος του ριζικού συστήµατος και συνεπώς τη συνολική βιοµάζα των φυτών (Πίνακας 1.1). Η αύξηση αυτή στην επιφάνεια της ρίζας καθιστά αποτελεσµατικότερη την πρόσληψη νερού και θρεπτικών στοιχείων αφού εκµεταλλεύονται µεγαλύτερο όγκο εδάφους. Το ινδολοξικό οξύ (indole-3-acetic acid, IAA) είναι ίσως η πιο γνωστή φυτοορµόνη (αυξίνη) που παράγεται από PGPR και µάλιστα σε υψηλές συγκεντρώσεις (Barazani and Friedman, 1999). Φυτά που υπέστησαν µεταχείριση µε στελέχη PGPR, που παράγουν IAA παρουσίασαν πλουσιότερο ριζικό σύστηµα και µεγαλύτερη φυτική ανάπτυξη (Barazani and Friedman, 1999). Έχει αναφερθεί η παραγωγή και άλλων φυτοορµονών από PGPR αλλά σε µικρότερη έκταση. Ριζοβακτήρια που ανήκουν στα γένη Azospirillum και Pseudomonas spp. παράγουν κυτοκινίνες και γιββερελίνες (γιββερελλικό οξύ, gibberellic acid, GA), (Gaudin et al., 1994) Τα βακτήρια Bacillus pumilus και licheniformis έχουν την ικανότητα παραγωγής γιββερελλικού οξέος (Gutierrez- Manero et al., 2001). Ωστόσο, δεν είναι ακόµη σαφής ο ρόλος των κυτοκινίνων και γιββερελινών που παράγονται από PGPR στην προαγωγή της ανάπτυξης. Το αιθυλένιο είναι µια άλλη φυτική ορµόνη και η παραγωγή αιθυλενίου στα φυτά διεγείρεται σε συνθήκες καταπόνησης και προκαλεί µεταξύ άλλων και αναστολή στην ανάπτυξη των ριζών. Ο Glick και οι συνεργάτες του (1998) αναφέρουν ότι ορισµένα PGPR παράγουν το ένζυµο απαµινάση (deaminase) του 1-άµινοκυκλοπρόπανο-1-καρβοξυλικού οξέος (ACC), το οποίο υδρολύει το ACC (πρόδροµη ουσία του αιθυλενίου) και εποµένως µειώνεται η παραγωγή αιθυλενίου στη ρίζα και προάγεται έτσι η ανάπτυξή της. 33

40 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Πίνακας 1.1 Παραδείγµατα ριζοβακτηρίων προωθητικών της φυτικής ανάπτυξης (PGPR) που παράγουν φυτικές ορµόνες (Vessey, 2003). Φυτική ορµόνη PGPR Ξενιστής Βιβλιογραφική αναφορά IAA a Aeromonas veronii Ρύζι Mehnaz et al., 2001 Agrobacterium sp. Μαρούλι Barazani and Friedman, 1999 Azospirillum brasilense Σιτάρι Kaushik et al., 2000 Enterobacter cloacae Ρύζι Mehnaz et al., 2001 Κυτοκινίνες Paenibacillus polymyxa Σιτάρι Timmusk et al., 1999 Pseudomonas fluorescens Σόγια De Salamone et al., 2001 Γιββερελίνες Bacillus sp. Alnus Gutierez-Manero et al., glutinosa 2001 ACC απαµινάση b Bacillus pumillus Brassica Belimov et al., 2001 napus Pseudomonas cepacia Σόγια Cattelan et al., 1999 Pseudomonas putida Φασολιά Mayak et al., 1999 Pseudomonas sp. a IAA: Indole-3-acetic acid (ινδολοξικό οξύ, αυξίνη). Brassica napus Belimov et al., 2001 b ACC απαµινάση b : ένζυµο που διασπά το ACC (πρόδροµη ουσία του αιθυλενίου). II) ιαλυτοποίηση φωσφορικών Ο φώσφορος, µετά το άζωτο, είναι το δεύτερο σηµαντικότερο µακροστοιχείο απαραίτητο για την αύξηση και ανάπτυξη των φυτών. Ακόµη και σε πλούσια εδάφη η µεγαλύτερη ποσότητα φωσφόρου είναι σε αδιάλυτη µορφή και µόνο ένα µικρό ποσοστό (<5%) είναι διαθέσιµο στα φυτά. Στο έδαφος υπάρχουν βακτήρια (Phosphate Solubilizing Bacteria, PSB) που εκκρίνουν οργανικά οξέα και φωσφατάσες για να µετατρέψουν αδιάλυτες µορφές 34

41 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση φωσφορικών αλάτων σε διαλυτές. Η διεργασία αυτή στη ριζόσφαιρα οδηγεί σε αύξηση του διαθέσιµου φωσφόρου στα φυτά και σε αύξηση της πρόσληψης. ιάφορα βακτήρια που ανήκουν στα γένη Bacillus, Pseudomonas, Erwinia και Enterobacter spp. είναι πολύ αποτελεσµατικά στη διαλυτοποίηση φωσφορικών αλάτων. Εντούτοις, οι αναφορές για διαλυτοποίηση φωσφορικών ενώσεων από PGPR προς όφελος συγκεκριµένων φυτικών ειδών είναι περιορισµένες (Gyaneshwar et al., 2002; Idriss et al., 2002). Οι Idriss et al. (2002) για παράδειγµα αναφέρουν ότι η διαλυτοποίηση φωσφορικών αλάτων από το στέλεχος FZB45 του Bacillus amyloliquefaciens ενίσχυσε την ανάπτυξη του καλαµποκιού. III) Πρόσληψη σιδήρου (Fe) Παρόλο που ο σίδηρος είναι σε αφθονία στο έδαφος, η διαθεσιµότητά του στο εδαφικό διάλυµα είναι ιδιαίτερα µικρή. Τα βακτήρια λοιπόν έχουν αναπτύξει ένα µηχανισµό για αποτελεσµατική πρόσληψη σιδήρου παράγοντας και εκκρίνοντας ουσίες που δηµιουργούν χηλικές ενώσεις σιδήρου (iron-chelating) χαµηλού µοριακού βάρους, γνωστές ως σιδηροφόρους (siderophores). Οι ουσίες αυτές δεσµεύουν Fe 3+ από το έδαφος και το µεταφέρουν στο εσωτερικό του κυττάρου. Η πρόσληψη σιδήρου µε τη βοήθεια σιδηροφόρων έχει µελετηθεί ιδιαίτερα σε PGPR του γένους Pseudomonas spp. αλλά και σε είδη Azospirillum spp. (Wang et al., 1993). Πολλά φυτικά είδη µπορούν να δεσµεύσουν το σίδηρο που προσλαµβάνεται µε τη βοήθεια βακτηριακών σιδηροφόρων οι οποίοι µπορούν να αποτελέσουν πηγή σιδήρου για το φυτό, προάγοντας την ανάπτυξή του (Wang et al., 1993; Masalha et al., 2000). IV) Πρόσληψη αζώτου (N) Η επίδραση των PGPR στην πρόσληψη αζώτου και συνεπώς στην προαγωγή της ανάπτυξης έχει αναφερθεί από πολλούς ερευνητές (Abbasi et al., 2011; Adesemoye and Kloepper, 2009; Adesemoye et al., 2010). Πιθανότατα η προαγωγή της φυτικής ανάπτυξης οφείλεται σε εναλλακτικές επιδράσεις των βακτηρίων που οδηγούν σε αυξηµένη συγκέντρωση αζώτου στο φυτό εξαιτίας της αύξησης της επιφάνειας του ριζικού συστήµατος και όχι στην άµεση δέσµευση αζώτου από το έδαφος µέσω των PGPR. Σε πρόσφατη έρευνα που έγινε µε τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus T4, οι 35

42 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Adesemoye et al. (2009) κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι τα PGPR προήγαν την ανάπτυξη των φυτών, αύξησαν την επιφάνεια των ριζών και βελτίωσαν τη δοµή τους. Το πλουσιότερο ριζικό σύστηµα παρήγαγε µεγαλύτερες ριζικές εκκρίσεις οπότε υπήρχε και αυξηµένη µικροβιακή δραστηριότητα έτσι ώστε τελικά µετά από µια σειρά γεγονότων περισσότερη ποσότητα αζώτου ήταν διαθέσιµη για πρόσληψη µέσω του ριζικού συστήµατος. Τα ίδια όµως στελέχη δεν είχαν την ικανότητα να δεσµεύσουν άζωτο σε δοκιµές που έγιναν σε θρεπτικό υπόστρωµα JNFb Έµµεσοι µηχανισµοί ενίσχυσης της ανάπτυξης από PGPR I) Παραγωγή αντιµυκητιακών µεταβολιτών (Antifungal Metabolites, AFMs) Πρόκειται για οργανικές ουσίες, µικρού µοριακού βάρους οι οποίες αναστέλλουν την ανάπτυξη ορισµένων µικροοργανισµών. Στους αντιµυκητιακούς µεταβολίτες ανήκουν και τα αντιβιοτικά. Ένας µεγάλος αριθµός βακτηρίων έχει βρεθεί ότι παράγει αντιβιοτικά δραστικά έναντι πολλών φυτοπαθογόνων µυκήτων τα οποία µπορούν να χρησιµοποιηθούν σαν βιολογικοί παράγοντες. Συγκεκριµένα, έχει βρεθεί ότι τα Gram(-) βακτήρια παράγουν τα αντιβιοτικά φεναζίνη-1-καρβοξυλικό οξύ (phenazine-1-carboxylic acid), φεναζίνη-1-καρβοξαµίδιο (phenazine-1-carboxamide), 2,4-διακέτυλο φλωρογλυκινόλη (2,4-diacetyl phloroglucinol), πυολουτεορίνη (pyoluteorin) και πυρολνιτρίνη (pyrrolnitrin), (Lugtenberg and Kamilova, 2009). Επίσης, οι ουσίες zwittermycin A και kanosamine που παράγονται από βακτήρια του είδους Bacillus cereus έχουν αντιµικροβιακή δράση. Επιπλέον σε έρευνες που έγιναν πρόσφατα βρέθηκε ότι τα αντιβιοτικά D-gluconic acid (Kaur et al., 2006) και 2- hexyl-5-propyl resorcinol (Cazorla et al., 2006) που παράγονται από είδη του γένους Pseudomonas ήταν αποτελεσµατικά έναντι σηµαντικών εδαφογενών ασθενειών. II) Ανταγωνισµός για θρεπτικά στοιχεία και θέσεις αποικισµού Ο ανταγωνισµός µεταξύ βιολογικών παραγόντων και παθογόνων για θρεπτικά στοιχεία και θέσεις αποικισµού στην περιοχή της ριζόσφαιρας είναι γνωστός εδώ και δεκαετίες ως µηχανισµός βιολογικού ελέγχου. Τα PGPR ανταγωνίζονται µε τους φυτοπαθογόνους µικροοργανισµούς για την κατάληψη 36

43 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση κατάλληλων θέσεων αποικισµού και θρεπτικών στοιχείων. Η εγκατάσταση υψηλών πληθυσµών PGPR στη ριζόσφαιρα θα πρέπει να συνοδεύεται από εκµετάλλευση των διαθέσιµων θρεπτικών στοιχείων από τα ίδια, περιορίζοντας τη διαθεσιµότητά τους για τα παθογόνα και συνεπώς την ικανότητα αποικισµού. Ο µηχανισµός αυτός χρησιµοποιείται κυρίως από PGPR του γένους Pseudomonas επειδή αναπτύσσουν πολύ υψηλούς πληθυσµούς στη ριζόσφαιρα και παρουσιάζουν µεγάλη προσαρµοστικότητα ως προς τις θρεπτικές τους απαιτήσεις (Walsh et al., 2001). Οι Kamilova et al. (2005) κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι δεν αρκεί µόνο ο αποτελεσµατικός αποικισµός της ρίζας από PGPR για επιτυχή βιολογική καταπολέµηση. Τα PGPR θα πρέπει να ανταγωνίζονται αποτελεσµατικά τα παθογόνα και για θρεπτικά στοιχεία. Έρευνες έδειξαν ότι τα PGPR που παράγουν σιδηροφόρους, δεσµεύουν το διαθέσιµο Fe 3+ του εδάφους και το σύµπλοκο που προκύπτει ευνοεί την ανάπτυξη του βακτηρίου και του φυτού-ξενιστή, ενώ παράλληλα η περιορισµένη διαθεσιµότητα σιδήρου αναστέλλει την ανάπτυξη των παθογόνων (O' Sullivan and O' Gara, 1992). III) Παρασιτισµός και λύση κυττάρων Ορισµένα PGPR έχουν τη δυνατότητα να παράγουν υδρολυτικά ένζυµα και να αποδοµούν βασικά δοµικά συστατικά των κυτταρικών τοιχωµάτων παθογόνων µυκήτων, διαδικασία που είναι γνωστή ως παρασιτισµός. Τα σηµαντικότερα υδρολυτικά ένζυµα των βακτηρίων είναι οι χιτινάσες και οι γλουκανάσες. Για παράδειγµα, τα βακτήρια του είδους Pseudomonas cepacia παράγουν γλουκανάσες και αναστέλλουν την ανάπτυξη σηµαντικών εδαφογενών µυκήτων, όπως Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii και Pythium ultimum (Fridlender et al., 1993). Χιτινάσες µε δράση έναντι µυκήτων έχουν αποµονωθεί από τα είδη Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Streptomyces plymuthica και Pseudomonas chlororaphis (Chin-A-Woeng et al., 1998). IV) Επαγόµενη διασυστηµατική αντοχή (Induced Systemic Resistance, ISR) Η αλληλεπίδραση ορισµένων PGPR µε τις ρίζες των φυτών µπορεί να ενεργοποιήσει την ανάπτυξη διασυστηµατικής αντοχής των φυτών σε παθογόνους µύκητες, βακτήρια και ιούς (Choudhary and Johri, 2009; Kloepper et al., 2004; Ryu et al., 2004; Vallad and Goodman, 2004). Το φαινόµενο αυτό 37

44 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση ονοµάζεται επαγόµενη διασυστηµατική αντοχή (Induced Systemic Resistance, ISR). Τόσο το γιασµονικό οξύ (jasmonic acid, JA) όσο και το αιθυλένιο (ethylene, ET) παίζουν πρωταρχικό ρόλο στην ISR, η οποία, σε αντίθεση µε τη SAR (Systemic Acquired Resistance) είναι ανεξάρτητη από τη συσσώρευση σαλικυλικού οξέος στα φυτά ή την παραγωγή πρωτεϊνών που σχετίζονται µε την παθογένεση (Pathogenesis Related proteins, PR proteins), (Van Loon, 2007). Το φαινόµενο της ISR ανακαλύφθηκε όταν οι λιπο-πολυσακχαρίτες (lipopolysaccharides, LPS) που αποµονώθηκαν από το ριζοβακτήριο Pseudomonas sp. στέλεχος WCS417r κατάφεραν να ελέγξουν τη φουζαρίωση σε φυτά γαρυφαλλιάς (Van Peer et al., 1991). Αρκετές ουσίες που παράγονται από PGPR µπορούν να προκαλέσουν ISR, όπως για παράδειγµα λιποπολυσακχαρίτες, σαλικυλικό οξύ (salicylic acid, SA) και σιδηροφόροι (Van Loon, 2007). Πρόσφατα διάφορα κυκλικά λιποπεπτίδια, ο αντιµυκητιακός µεταβολίτης 2,4-διακέτυλο φλωρογλυκινόλη, µόρια AHLs (Acyl homoserine lactones) και πτητικές ουσίες όπως η 2,3-βουτανεδιόλη (2,3-butanediol) και ακετοΐνη (acetoin=3-hydroxy-2-butanone) έχουν προστεθεί στη λίστα των ουσιών που προκαλούν ISR (Ryu et al., 2004). Σε αντίθεση µε τους υπόλοιπους µηχανισµούς, δεν απαιτείται υψηλή ικανότητα αποικισµού των ριζών από το βακτήριο για την πρόκληση της ISR. Για τα βακτήρια που δεν αποικίζουν αποτελεσµατικά τη ριζόσφαιρα και παράγουν αντιµυκητιακούς µεταβολίτες, ο βιολογικός έλεγχος των παθογόνων οφείλεται κυρίως στην πρόκληση ISR και λιγότερο στην αντιβίωση (Choudhary and Johri, 2009) Ταξινόµηση και ονοµατολογία Η αντιµετώπιση διαφόρων φυτοπαθογόνων µε την εφαρµογή βιολογικών παραγόντων χρήζει ιδιαίτερης προσοχής στις µέρες µας εξαιτίας των προβληµάτων που απορρέουν από την αλόγιστη χρήση γεωργικών φαρµάκων. Τα τελευταία λοιπόν χρόνια υπάρχει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον για αναγνώριση και χαρακτηρισµό ωφέλιµων βακτηρίων εδάφους που προάγουν τη φυτική ανάπτυξη και συµβάλλουν στο βιολογικό έλεγχο φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών. Αποτέλεσµα αυτού του γεγονότος είναι η ανακάλυψη και καταγραφή νέων PGPR που ανήκουν σε πολλά και διαφορετικά γένη. Σε αυτό βέβαια συµβάλλει και η εξέλιξη στη συστηµατική ταξινόµηση των βακτηρίων καθώς και η πληρέστερη κατανόηση των διαφορετικών µηχανισµών δράσης. Ο 38

45 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση αριθµός εποµένως των στελεχών PGPR αυξάνει συνεχώς, αφού πολυάριθµες µελέτες λαµβάνουν χώρα παγκοσµίως σε ένα µεγάλο εύρος φυτικών ειδών. Ενδεικτικά λοιπόν αναφέρουµε ότι στελέχη PGPR µπορούµε να συναντήσουµε στα ακόλουθα γένη: Arthrobacter, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Gordonia, Klebsiella, Paenibacillus, Pseudomonas και Serratia (Glick, 1995). Τα PGPR που ανήκουν στα γένη Bacillus και Pseudomonas είναι τα πιο µελετηµένα και ευρέος γνωστά. Οι πρώτες αναφορές για επίδραση ωφέλιµων βακτηρίων στην προαγωγή της ανάπτυξης έγιναν για Gram (-) βακτήρια του γένους Pseudomonas (P. fluorescens και P. putida), (Burr et al., 1978), τα οποία παραµένουν µέχρι και σήµερα σηµαντικοί βιολογικοί παράγοντες. Το γένος Bacillus περιλαµβάνει Gram (+), ραβδόµορφα βακτήρια που ταξινοµούνται στο φύλο Firmicutes (Πίνακας 1.2). Μπορούν να σχηµατίσουν σπόρια (ενδοσπόρια) και να επιβιώσουν για µεγάλο χρονικό διάστηµα σε διάφορες περιβαλλοντικές συνθήκες. Στο γένος Bacillus ανήκουν πολυάριθµα διαφορετικά είδη και περιλαµβάνουν τόσο ωφέλιµα όσο και παθογόνα βακτήρια. Τα είδη B. pumilus, B. amyloliquefaciens, B. polymyxa, B. subtilis και B. megaterium περιλαµβάνουν τα πιο γνωστά στελέχη PGPR. Από αυτά τα στελέχη του B. subtilis χρησιµοποιούνται ευρέος ως βιολογικοί παράγοντες, επειδή παρουσιάζουν υψηλή ικανότητα αποικισµού, παράγουν αντιβιοτικές ουσίες και είναι αποτελεσµατικά έναντι πολλών παθογόνων µικροοργανισµών (Cazorla et al., 2007). Πίνακας 1.2 Η συστηµατική ταξινόµηση του γένους Bacillus. Βασίλειο Φύλο Κλάση Τάξη Οικογένεια Γένος Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus 39

46 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Σκευάσµατα PGPR και τρόποι εφαρµογής Στα πλαίσια της έρευνας για την ανακάλυψη νέων προϊόντων φυτοπροστασίας και θρέψης φυτών, πιο φιλικών στον άνθρωπο και το περιβάλλον, σηµαντικό ρόλο µπορούν να παίξουν τα σκευάσµατα PGPR. Για το σκοπό αυτό έχουν διερευνηθεί πολλά είδη PGPR ως προς τη βιολογική τους δράση σε διάφορα παθοσυστήµατα. Οι πειραµατικές δοκιµές γίνονται σε φυτοδοχεία σε εργαστηριακές συνθήκες, στο θερµοκήπιο αλλά και στον αγρό. Ορισµένα από αυτά αναπτύχθηκαν σε εµπορικά σκευάσµατα και χρησιµοποιούνται σε εµπορική κλίµακα κυρίως για την καταπολέµηση εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων (Πίνακας 1.3). Για παράδειγµα το στέλεχος B. subtilis GB03, ως δραστικός παράγοντας του εµπορικού σκευάσµατος Companion, µε διάφορους µηχανισµούς παρέχει προστασία έναντι φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών ενώ παράλληλα παράγει και φυτοορµόνες που προάγουν την ανάπτυξη των φυτών (Ryu et al., 2003 και 2004). Τα πλεονεκτήµατα από τη χρήση σκευασµάτων PGPR έναντι των συµβατικών σκευασµάτων είναι η µικρότερη τοξικότητα, η εκλεκτικότητα, η περιορισµένη χρήση επικίνδυνων συνθετικών γεωργικών φαρµάκων και ο χαµηλός κίνδυνος ανάπτυξης ανθεκτικότητας. Σύµφωνα µε την EPA (Environmental Protection Agency, USA), τα παραπάνω χαρακτηριστικά καθιστούν τα σκευάσµατα αυτά χαµηλότερου κινδύνου έναντι των συµβατικών µέσων φυτοπροστασίας. Μειονεκτήµατα των σκευασµάτων PGPR µπορούν να θεωρηθούν η µειωµένη αποτελεσµατικότητα σε σχέση µε τα συµβατικά φυτοπροστατευτικά προϊόντα, γεγονός που επιβάλλει την επανάληψη των εφαρµογών, η παραλλακτικότητα της αποτελεσµατικότητας στον αγρό, η µικρή διάρκεια ζωής κατά την αποθήκευση και συντήρηση, η αργή τους δράση και η µικρή υπολειµµατική διάρκεια δράσης. Τα εµπορικά διαθέσιµα σκευάσµατα PGPR συναντώνται σε διάφορες µορφές ανάλογα µε το υλικό-φορέα που περιέχουν. Έτσι, τα υγρά σκευάσµατα περιέχουν µεταξύ άλλων φυτικά έλαια όπως φοινικέλαιο, καστορέλαιο και έλαιο κράµβης. Στην περίπτωση των στερεών σκευασµάτων, τα πιο γνωστά είναι σκόνες ή κόκκοι και χρησιµοποιούνται ποικίλα υλικά-φορείς µεταξύ των οποίων τύρφη, ταλκ, βερµικουλίτης και διάφορα υλικά κοµποστοποίησης. (Podile and Kishore, 2006). Από τα υλικά αυτά, η τύρφη είναι ο καταλληλότερος φορέας εξαιτίας της υψηλής υδατοχωρητικότητας και περιεκτικότητας σε θρεπτικά 40

47 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση στοιχεία. Η έρευνα στην τυποποίηση των PGPR σκευασµάτων έχει επικεντρωθεί στην ανακάλυψη νέων υλικών-φορέων ή στη βελτίωση των ιδιοτήτων διαθέσιµων υλικών µε την προσθήκη θρεπτικών ή συνθετικών προϊόντων στο φορέα του σκευάσµατος που θα αυξάνει την επιβίωση των PGPR και εποµένως την αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης του σκευάσµατος. Για το σκοπό αυτό έχουν χρησιµοποιηθεί προϊόντα όπως η χιτίνη (chitin) και η χιτοζάνη (chitosan), (Domenech et al., 2006). Τα PGPR και τα σκευάσµατά τους συνήθως εφαρµόζονται µε επένδυση των σπόρων (seed-treatment), εµβάπτιση της ρίζας πριν τη µεταφύτευση (root-dip), ενσωµάτωση στο έδαφος (soil-amendment) και ριζοπότισµα (root-drench). Πίνακας 1.3 Εµπορικά σκευάσµατα PGPR. Εµπορικό όνοµα Εταιρία Βιολογικός παράγοντας Serenade AgraQuest Bacillus subtilis QST713 Companion Growth Bacillus Products subtilis GB03 YieldShield Gustafson Bacillus pumilus GB34 FZB24 li Abitep Bacillus subtilis FZB24 EcoGuard Novozymes Bacillus licheniformis SB3086 Subtilex Becker Bacillus Underwood subtilis MB1600 (Choudhary and Johri, 2009) Στόχος, ξενιστής ή παθοσύστηµα Μύκητες, βακτήρια σε διάφορες καλλιέργειες Rhizoctonia, Pythium, Fusarium, Phytophthora Εδαφογενείς µύκητες Οπωροκηπευτικά, καλλωπιστικά, φράουλες, πατάτες Sclerotinia homoeocarpa σε χλοοτάπητα Μύκητες σε βαµβάκι, σόγια, όσπρια 41

48 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Εφαρµογή PGPR στη σύγχρονη φυτοπροστασία Οι ετήσιες απώλειες στη γεωργική παραγωγή από φυτικές ασθένειες έχουν εκτιµηθεί πως ξεπερνούν τα 200 δισεκατοµµύρια ευρώ (Agrios, 2005). Η χρήση ανθεκτικών ποικιλιών και η εφαρµογή συνθετικών γεωργικών φαρµάκων είναι οι συνηθέστεροι τρόποι για την αντιµετώπιση των ασθενειών των φυτών. Ωστόσο, η ανάπτυξη ανθεκτικών ποικιλιών έχει επιτευχθεί για περιορισµένο αριθµό ασθενειών και συνήθως απαιτεί µακροχρόνιες ερευνητικές προσπάθειες. Επιπλέον, η παραγωγή και διάθεση στην αγορά προϊόντων φυσικής προέλευσης απαλλαγµένων από επικίνδυνες χηµικές ουσίες αποτελεί στις µέρες µας πρωταρχικό παράγοντα τόσο για τους καταναλωτές όσο και για τις κυβερνητικές αποφάσεις. Στα πλαίσια αυτής της θεώρησης, η εύρεση νέων εναλλακτικών τρόπων καταπολέµησης εχθρών και ασθενειών καθίσταται απαραίτητη, και αυτό το ρόλο µπορούν να παίξουν τα εµπορικά σκευάσµατα PGPR. Τα περισσότερα σκευάσµατα PGPR χρησιµοποιούνται ως παράγοντες βιολογικής καταπολέµησης και συµβάλλουν εποµένως έµµεσα στην προαγωγή της ανάπτυξης των φυτών (Glick et al., 1999). Τα σκευάσµατα PGPR υπάγονται στην µεγάλη κατηγορία των βιολογικών γεωργικών φαρµάκων (biopesticides). Τα biopesticides είναι φυσικής προέλευσης σκευάσµατα και οι δραστικές ουσίες τους προέρχονται από φυτά (biochemical pesticides), µικροοργανισµούς (microbial pesticides), και γενετικώς τροποποιηµένα φυτά (plant-incorporated protectants, PIPs), (EPA). Μέχρι το τέλος του 2001, ο αριθµός των εγκεκριµένων δραστικών παραγόντων αυτής της κατηγορίας ήταν παγκοσµίως 195 και των αντίστοιχων σκευασµάτων 780 (EPA). Η χρήση µικροβιακών σκευασµάτων, όπως τα PGPR, αποτελεί αναµφίβολα µια νέα προσέγγιση φυτοπροστασίας. Πρόσφατα, διάφοροι ωφέλιµοι µικροοργανισµοί αποτέλεσαν τους δραστικούς παράγοντες µιας νέας γενιάς µικροβιακών σκευασµάτων (Montesinos, 2003). Η προαγωγή της ανάπτυξης, µε την προσθήκη PGPR, περιλαµβάνει µεταξύ άλλων αυξήσεις σε βλαστική ικανότητα, ανάπτυξη ρίζας, απόδοση, φυλλική επιφάνεια, χλωροφύλλη, περιεκτικότητα αζώτου, φωσφόρου και σιδήρου, µήκος και βάρος βλαστού και ρίζας (Lucy et al., 2004). Η χρήση PGPR µε σκοπό την αύξηση της απόδοσης των καλλιεργειών είναι περιορισµένη εξαιτίας της παραλλακτικότητας και της αστάθειας των αποτελεσµάτων που παρατηρείται σε πειράµατα εργαστηρίου, θερµοκηπίου και αγρού (Mishustin and Naumova, 1962). Το έδαφος είναι αναµφίβολα ένα πολυσύνθετο περιβάλλον και διάφοροι 42

49 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση παράγοντες µπορούν να επηρεάσουν το προσδοκώµενο αποτέλεσµα. Για παράδειγµα η εδαφική υγρασία, ο τύπος του εδάφους, το ph, και οι περιβαλλοντικές συνθήκες µπορούν να επηρεάσουν την ικανότητα αποικισµού των ριζών µετά τον εµβολιασµό και συνεπώς την αποτελεσµατικότητα των PGPR. Η εφαρµογή εµπορικά διαθέσιµων PGPR στη σύγχρονη γεωργική πρακτική αποτελεί µια εναλλακτική πρόταση φυτοπροστασίας και θρέψης. Τα PGPR µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως παράγοντες σε προγράµµατα ολοκληρωµένης διαχείρισης της παραγωγής (Integrated Crop Management, ICM), µειώνοντας σηµαντικά τη χρήση συµβατικών γεωργικών φαρµάκων και λιπασµάτων χωρίς ωστόσο να επηρεάζεται η απόδοση των καλλιεργειών (Antoun and Kloepper, 2001). Επιπλέον, η εναλλαγή µεταξύ συµβατικών προϊόντων φυτοπροστασίας και PGPR µπορεί να συµβάλλει στην αποφυγή ανάπτυξης ανθεκτικότητας στα παθογόνα, στα πλαίσια της ολοκληρωµένης διαχείρισης της παραγωγής. Τέλος, η ανάγκη χρησιµοποίησης τέτοιων προϊόντων αυξάνεται τα τελευταία χρόνια, εξαιτίας του ότι πολλά συνθετικά σκευάσµατα έχουν ήδη αποσυρθεί και αναµένεται και περαιτέρω µείωση. 43

50 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση 1.2 ΓΕΩΡΓΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΣΤΟ Ε ΑΦΟΣ Η παρουσία γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος οφείλεται κυρίως στην απευθείας εφαρµογή τους σε αυτό (π.χ. ψεκασµοί εδάφους, ριζοπότισµα, εφαρµογή κοκκωδών σκευασµάτων, επενδυτικά σπόρων), αλλά και στην έµµεση απόθεση σηµαντικού ποσοστού της αρχικής συγκέντρωσης κατά την εφαρµογή διαφυλλικών ψεκασµών. Προσπαρτικά, προφυτρωτικά και µεταφυτρωτικά ζιζανιοκτόνα, νηµατωδοκτόνα, διασυστηµατικά εντοµοκτόνα και µυκητοκτόνα που εφαρµόζονται στο έδαφος είναι µεταξύ των κυριότερων γεωργικών φαρµάκων που ανιχνεύονται στο έδαφος. ιάφορες διεργασίες λαµβάνουν χώρα στο έδαφος και επηρεάζουν την παρουσία των γεωργικών φαρµάκων σε αυτό. Συγκεκριµένα, οι διεργασίες µπορούν να ταξινοµηθούν σε τρεις βασικές κατηγορίες: προσρόφηση (adsorption), διεργασίες µεταφοράς [εξάτµιση (volatilization), επιφανειακή απορροή (runoff), έκπλυση (leaching), πρόσληψη από τα φυτά (uptake)] και διεργασίες αποδόµησης [φωτοαποδόµηση (photodegradation), χηµική αποδόµηση (chemical degradation), µικροβιακή αποδόµηση (microbial degradation)], (Fisher, 1997). Η αποµάκρυνση των γεωργικών φαρµάκων από το έδαφος µε µικροβιακή αποδόµηση αποτελεί διεργασία πρωταρχικής σηµασίας Μικροβιακή αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος Με τον όρο µικροβιακή αποδόµηση (microbial degradation) ή βιοαποδόµηση (biodegradation) εννοούµε την διάσπαση µιας ουσίας σε µικρότερα µόρια ως αποτέλεσµα της δράσης των µικροοργανισµών ή των ενζύµων που αυτοί παράγουν (Atlas, 1988). Ο όρος αυτός χρησιµοποιείται για να εκφράσει την αποδόµηση τόσο φυσικών όσο και συνθετικών οργανικών ουσιών από µικροοργανισµούς, στο έδαφος αλλά και στο νερό. Οι µικροοργανισµοί συµµετέχουν µε πολλούς µηχανισµούς στο µεταβολισµό ουσιών σε χερσαία και υδάτινα οικοσυστήµατα λόγω της ικανότητάς τους να µεταβολίζουν κάτω από αερόβιες ή/και αναερόβιες συνθήκες. Ειδικότερα, η βιοαποδόµηση γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος αποτελεί τη σηµαντικότερη διεργασία αποδόµησης. Το φαινόµενο της αποδόµησης των γεωργικών φαρµάκων από µικροοργανισµούς του εδάφους έχει αναφερθεί από µεγάλο αριθµό ερευνητών (Karpouzas et al., 2005; Singh and Walker, 2006). Στη διαδικασία αυτή συµµετέχουν διάφορες οµάδες µικροοργανισµών όπως µύκητες, 44

51 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση βακτήρια και φύκη. Ωστόσο, η επίδραση των βακτηρίων στη µικροβιακή αποδόµηση είναι κυρίαρχη. ιάφορα βακτηριακά στελέχη που ανήκουν µεταξύ άλλων στα γένη Agrobacterium, Bacillus, Flavobacterium, Pseudomonas, Serratia, Sphingomonas έχουν βρεθεί ότι είναι ικανά να αποσυνθέσουν γεωργικά φάρµακα που εφαρµόζονται στο έδαφος (Aislable and Lloyd-Jones, 1995). Η µικροβιακή αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος οφείλεται στη δράση ενός µικροοργανισµού ή συχνότερα πραγµατοποιείται από οµάδες µικροοργανισµών (consortia), (Aislable and Lloyd-Jones, 1995). Προκειµένου να πραγµατοποιηθεί η αποδόµηση ενός γεωργικού φαρµάκου, οι µικροοργανισµοί του εδάφους ή τα καταβολικά ένζυµα που παράγουν πρέπει να έρθουν σε επαφή µε την ουσία και στη συνέχεια αυτή ή τα προϊόντα του µεταβολισµού της να εισέλθουν στο εσωτερικό του κυττάρου (Aislable and Lloyd-Jones, 1995). Το φαινόµενο της µικροβιακής αποδόµησης επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες. Οι σπουδαιότεροι παράγοντες που επιδρούν στην ανάπτυξη των µικροοργανισµών και κατ' επέκταση στη µικροβιακή αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων είναι η θερµοκρασία, η υγρασία, το ph, το οξυγόνο, και η περιεκτικότητα σε οργανική ουσία του εδάφους. Εκτός από τους εδαφικούς αυτούς παράγοντες, η χηµική σύσταση και η συγκέντρωση της ουσίας που εφαρµόζεται καθώς επίσης και η συχνότητα των εφαρµογών έχει βρεθεί ότι επηρεάζουν την εµφάνιση και την ένταση του φαινοµένου (Chowdjury et al., 2008). Οι κύριοι µηχανισµοί αποδόµησης των γεωργικών φαρµάκων από τους µικροοργανισµούς του εδάφους είναι η ανοργανοποίηση (mineralization) και ο συµµεταβολισµός (cometabolism). Κατά τη διαδικασία της ανοργανοποίησης τα γεωργικά φάρµακα διασπώνται σε απλούστερα οργανικά µόρια, τα οποία µεταβολίζονται περαιτέρω από τους µικροοργανισµούς µέχρι την πλήρη αποδόµηση των οργανικών µορίων σε ανόργανα (π.χ. CO 2, NH 3 ). Παράλληλα οι µικροοργανισµοί χρησιµοποιούν την παραγόµενη ενέργεια και τον άνθρακα (ή το άζωτο) των προϊόντων ως πηγή ενέργειας και θρεπτικών στοιχείων για την αύξηση και την ανάπτυξή τους. Στην περίπτωση δηλαδή αυτή, η µείωση της συγκέντρωσης της ουσίας συµβαδίζει µε ταυτόχρονη αύξηση του πληθυσµού των µικροοργανισµών που την αποδοµούν. Αφοµοιώνοντας τον C και την παραγόµενη ενέργεια για βιοσύνθεση, αυξάνεται ο πληθυσµός των µικροοργανισµών σε αριθµό και βιοµάζα (Felsot, 1989). Η ανοργανοποίηση 45

52 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση περιλαµβάνει µια αρχικά βραδεία φάση αποδόµησης, γνωστή ως φάση υστέρησης ή προσαρµογής (lag phase), η οποία συµβαίνει αµέσως µετά την εφαρµογή των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος και ακολουθείται από µια φάση ταχείας αποδόµησης. Κατά τη φάση υστέρησης, όπως πολλοί αναφέρουν, οι αποδοµητικοί µικροοργανισµοί παράγουν τα κατάλληλα ένζυµα για την αποσύνθεση των γεωργικών φαρµάκων ή αυξάνουν σε µέγεθος. Σε ορισµένες περιπτώσεις η φάση υστέρησης δεν υπάρχει ή η διάρκειά της είναι πολύ µικρή. Κατά τη διαδικασία του συµµεταβολισµού, η αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων πραγµατοποιείται από µικροοργανισµούς που παράγουν µη εξειδικευµένα ένζυµα συνήθως τυχαία, χωρίς ωστόσο οι ουσίες που αποδοµούν να αποτελούν πηγές άνθρακα ή ενέργειας για τους αποδοµητικούς οργανισµούς. ηλαδή η αποδόµηση του γεωργικού φαρµάκου δεν συνοδεύεται από αύξηση του πληθυσµού των µικροοργανισµών που το διασπούν. Στην περίπτωση αυτή, οι µικροοργανισµοί που συµµεταβολίζουν ένα γεωργικό φάρµακο συνήθως χρησιµοποιούν άλλα υποστρώµατα ως πηγές άνθρακα ή ενέργειας, που είναι άφθονα στο έδαφος (Karpouzas and Giannakou, 2002). Στο συµµεταβολισµό η αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων γίνεται αργά υπό την επίδραση των µικροοργανισµών και δεν παρατηρείται αύξηση του ρυθµού αποδόµησης µε την πάροδο του χρόνου (Felsot, 1989) Παράγοντες που επηρεάζουν την µικροβιακή αποδόµηση στο έδαφος Η ταχύτητα µικροβιακής αποδόµησης των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος επηρεάζεται από πολυάριθµες και πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις που συµβαίνουν µεταξύ µικροοργανισµών, γεωργικών φαρµάκων, εδαφικών και κλιµατικών παραγόντων (Chowdjury et al., 2008). Παράγοντες όπως η θερµοκρασία, η υγρασία, το ph, και η περιεκτικότητα του εδάφους σε οργανική ουσία επηρεάζουν άµεσα το ρυθµό της µικροβιακής αποδόµησης εξαιτίας της επίδρασης που ασκούν στη σύνθεση και τη δραστηριότητα του µικροβιακού πληθυσµού. Το έδαφος είναι αναµφίβολα ένα σύνθετο υπόστρωµα στο οποίο χαρακτηριστικά όπως το ph, η οργανική ουσία, η δοµή και η θρεπτική κατάσταση αποτελούν σηµαντικές µεταβλητές. Μεταβολή σε ένα από τα χαρακτηριστικά του εδάφους µπορεί να επηρεάσει σηµαντικά την διαδικασία της αποδόµησης. Από τα εδαφικά χαρακτηριστικά, το ph και η περιεκτικότητα σε 46

53 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση οργανική ουσία αποτελούν τους πιο καθοριστικούς παράγοντες της µικροβιακής αποδόµησης. ιάφοροι ερευνητές έχουν αναφερθεί στην επίδραση του εδαφικού ph στην µικροβιακή αποδόµηση (Burns, 1976). Το ph του εδάφους καθορίζει τα είδη των µικροοργανισµών που θα αναπτυχθούν και τη σχετική αναλογία των πληθυσµών τους. Γενικά, έχει διαπιστωθεί ότι τα περισσότερα είδη µυκήτων εδάφους αναπτύσσονται καλύτερα σε ελαφρώς όξινα έως ουδέτερα εδάφη, ενώ τα βακτήρια ευνοούνται και επικρατούν σε ουδέτερα και αλκαλικά εδάφη (Burns, 1976). Επίσης, το ph µπορεί να επιδράσει στην προσρόφηση των γεωργικών φαρµάκων από τα κολλοειδή του εδάφους και στη χηµική διάσπασή τους και συνεπώς έµµεσα να επηρεάσει τη βιοδιαθεσιµότητά τους. Ο ρόλος της οργανικής ουσίας του εδάφους στη µικροβιακή αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων είναι διττός. Το µέγεθος και η δραστηριότητα της µικροχλωρίδας του εδάφους είναι συχνά υψηλότερα σε εδάφη µε µεγαλύτερη περιεκτικότητα σε οργανική ουσία. Γενικά, εδάφη µε υψηλή περιεκτικότητα οργανικής ουσίας χαρακτηρίζονται από µεγαλύτερη µικροβιακή δραστηριότητα και υψηλότερη ταχύτητα µικροβιακής αποδόµησης κυρίως λόγω συµµεταβολισµού (Thom et al., 1997). Η αυξηµένη όµως περιεκτικότητα του εδάφους σε οργανική ουσία συνεπάγεται και την αύξηση της προσρόφησης των περισσότερων γεωργικών φαρµάκων από το έδαφος, µε αποτέλεσµα τη µείωση της διαθεσιµότητάς τους για αποδόµηση από τους µικροοργανισµούς του εδάφους (Perucci et al., 2000). Η επίδραση της θερµοκρασίας και της υγρασίας του εδάφους στη µικροβιακή αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων είναι λιγότερο σύνθετη από την επίδραση των εδαφικών χαρακτηριστικών. Η διεθνής βιβλιογραφία αναφέρει ότι η µικροβιακή δραστηριότητα και κατά συνέπεια η µικροβιακή αποσύνθεση ευνοείται µε την αύξηση της θερµοκρασίας, εντός βέβαια κάποιων ορίων. Είναι γενικά παραδεκτό ότι στους 4 ο C αναστέλλεται η ανάπτυξη των µικροοργανισµών, ενώ η µέγιστη ανάπτυξη και δραστηριότητα των µικροοργανισµών του εδάφους παρατηρείται στους ο C (Alexander, 1977). Οι Karpouzas και Walker (2000) παρατήρησαν µειωµένη αποδόµηση του ethoprophos στους 5 ο C σε έδαφος που εµβολιάσθηκε µε αποδοµητικούς οργανισµούς, ενώ οι ρυθµοί αποδόµησης αυξάνονταν σηµαντικά στους 20 και 35 ο C. Η εδαφική υγρασία επηρεάζει τη φυσιολογική κατάσταση των µικροοργανισµών και εποµένως τη µικροβιακή αποδόµηση. Η έλλειψη υγρασίας 47

54 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση προκαλεί λήθαργο ή θάνατο στους περισσότερους µικροοργανισµούς. Έχει βρεθεί ότι χαµηλά επίπεδα εδαφικής υγρασίας µειώνουν σηµαντικά την αποικοδοµητική ικανότητα των µικροοργανισµών (Karpouzas and Walker, 2000). Από όσα προαναφέρθηκαν προκύπτει ότι ένα έδαφος υγρό, θερµό, γόνιµο και χωρίς ακραίες τιµές ph ευνοεί την ανάπτυξη µικροοργανισµών που είναι υπεύθυνοι για την αποδόµηση γεωργικών φαρµάκων. Εκτός από τους παραπάνω παράγοντες, την ταχύτητα της µικροβιακής αποδόµησης µπορούν να επηρεάσουν και παράγοντες που έχουν σχέση µε το γεωργικό φάρµακο που εφαρµόζεται. Η χηµική δοµή του οργανικού µορίου καθορίζει τις φυσικές και χηµικές ιδιότητες της ουσίας και επηρεάζει διεργασίες όπως η προσρόφηση και έκπλυση και εποµένως τη διαθεσιµότητα του γεωργικού φαρµάκου για βιοαποδόµηση (Chowdjury et al., 2008). Επίσης, η δόση εφαρµογής επιδρά στη σύσταση και λειτουργία της µικροβιακής κοινότητας του εδάφους. Υψηλές συγκεντρώσεις ορισµένων γεωργικών φαρµάκων µπορεί να είναι τοξικές και να µειώσουν τον πληθυσµό των µικροοργανισµών που τα αποδοµούν (Ros et al., 2006). Τέλος η συχνότητα των εφαρµογών έχει βρεθεί ότι επηρεάζει τη διεργασία της µικροβιακής αποδόµησης. Η επαναλαµβανόµενη εφαρµογή της ίδιας δραστικής ουσίας, στο ίδιο έδαφος και υπό ορισµένες συνθήκες, είναι πιθανό να οδηγήσει στην ανάπτυξη πολύ δραστικών µικροβιακών πληθυσµών, και ιδίως βακτηρίων, που µπορούν να αποδοµούν ταχύτερα την ουσία. Το φαινόµενο αυτό είναι γνωστό ως επιταχυνόµενη βιοαποδόµηση (enhanced biodegradation), (Chapman and Harris, 1990). Η επιταχυνόµενη βιοαποδόµηση έχει αναφερθεί σε περιπτώσεις επανειληµµένης χρήσης αλλά και µετά από µία µόνο προηγούµενη εφαρµογή (Felsot and Shelton, 1993). Σε τέτοια εδάφη παρατηρείται σηµαντική επιτάχυνση της µικροβιακής αποδόµησης των γεωργικών φαρµάκων που µπορεί να οδηγήσει στη µείωση ή στην απώλεια της αποτελεσµατικότητας των εν λόγω ουσιών (Walker and Roberts, 1993). 48

55 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Μελέτη της ταχύτητας αποδόµησης των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος Η αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος επηρεάζεται, όπως προαναφέρθηκε, από πολλές διεργασίες και εποµένως η εκτίµηση της σταθερότητάς τους είναι αρκετά σύνθετη. Συνήθως, η µελέτη της ταχύτητας αποδόµησης των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος γίνεται µε τον προσδιορισµό των τιµών ηµιπεριόδου αποδόµησης (DT 50 ) και σπανιότερα των DT 90. Η τιµή DT 50 αντιστοιχεί στο χρονικό διάστηµα που απαιτείται για να µειωθεί κατά 50% η αρχική συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου που εφαρµόζεται και εκφράζεται σε µονάδες χρόνου (ηµέρες). Υπάρχουν πολυάριθµες αναφορές στη βιβλιογραφία στις οποίες έχει µελετηθεί η ταχύτητα αποδόµησης στο έδαφος διαφόρων γεωργικών φαρµάκων και έχουν προσδιοριστεί τιµές DT 50. Τα πειραµατικά αυτά δεδοµένα αφορούν µελέτες που έχουν γίνει κυρίως σε εργαστηριακές συνθήκες αλλά και στον αγρό και τέτοιες τιµές µπορούν να χρησιµοποιηθούν και σε θεωρητικά µοντέλα πρόβλεψης του χρόνου παραµονής ενός γεωργικού φαρµάκου στο περιβάλλον (Beulke and Brown, 2001). Η µείωση της συγκέντρωσης των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος σε συνάρτηση µε το χρόνο παριστάνεται γραφικά συνήθως µε τη µορφή καµπυλών αποδόµησης (degradation curves). Οι τιµές προκύπτουν από τη µέτρηση των υπολειµµάτων σε διάφορα χρονικά διαστήµατα, µε τη βοήθεια συστηµάτων χρωµατογραφίας, σε πειράµατα αποδόµησης. Ένα βασικό πρόβληµα που προκύπτει στις δοκιµές αποδόµησης είναι η σύνδεση των σηµείων που προσδιορίστηκαν, τα οποία στις περισσότερες περιπτώσεις είναι σχετικά λίγα, µέσω µια συγκεκριµένης καµπύλης. Έχουν προταθεί διάφορες εξισώσεις για το σκοπό αυτό (FOCUS, 2006). Η πιο γνωστή και ευρέως χρησιµοποιούµενη από αυτές είναι η εξίσωση κινητικής πρώτης τάξης (first-order kinetics). Εποµένως γίνεται συνήθως η παραδοχή ότι η αποδόµηση ακολουθεί έναν κινητικό νόµο πρώτης τάξης. Η εξίσωση κινητικής πρώτης τάξης έχει την παρακάτω µορφή: C t = C 0 e -kt όπου C t = η συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου σε χρόνο t (mg/kg) C 0 = η αρχική συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου (mg/kg) K = η σταθερά του ρυθµού αποδόµησης του γεωργικού φαρµάκου (days -1 ) t = ο χρόνος (days). 49

56 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση Σε περιπτώσεις που η πορεία αποδόµησης αποτελείται από δύο στάδια (φάσεις), µε το πρώτο στάδιο να εµφανίζει ταχύτερη αποδόµηση απ' ότι στο δεύτερο, τότε έχουµε τις καµπύλες κινητικής δύο φάσεων (bi-phasic patterns). Σε ανάλογες περιπτώσεις γεωργικών φαρµάκων µε διφασική πορεία αποδόµησης γίνεται χρήση κυρίως του διεκθετικού µοντέλου (bi-exponential model), (Beulke and Brown, 2001). Η διεκθετική εξίσωση έχει την ακόλουθη µορφή: C t = C 1 * e -k1t + C 2 * e -k2t όπου C t = η συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου σε χρόνο t (mg/kg) C 1 = η συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου στο στάδιο 1 τη χρονική στιγµή t = 0 (mg/kg) C 2 = η συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου στο στάδιο 2 τη χρονική στιγµή t = 0 (mg/kg) C 1 + C 2 = C 0 = η συνολική συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου τη χρονική στιγµή t = 0 (mg/kg) k 1 και k 2 = οι σταθερές του ρυθµού αποδόµησης του γεωργικού φαρµάκου στο πρώτο και δεύτερο στάδιο αντίστοιχα (days -1 ) t = ο χρόνος (days). Εκτός από τις δυο προαναφερθείσες εξισώσεις µπορούν να χρησιµοποιηθούν και άλλα πρότυπα σε ειδικές περιπτώσεις όπου παρατηρείτε υστέρηση στην έναρξη της αποδόµησης, ή όταν πολυωνυµικές εξισώσεις βαθµού ανωτέρου του δευτέρου περιγράφουν πιο αποτελεσµατικά τα πειραµατικά δεδοµένα (FOCUS, 2006) Επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στη µικροβιακή κοινότητα του εδάφους Η επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στη µικροβιακή κοινότητα του εδάφους έχει αποτελέσει αντικείµενο έρευνας από επιστήµονες ανά τον κόσµο. Στο γεγονός αυτό έχει συντελέσει τόσο η εντατικοποίηση της γεωργίας και η εκτεταµένη χρήση αγροχηµικών όσο και η γνώση της σπουδαιότητας της µικροβιακής κοινότητας ως σηµαντικής οικολογικής παραµέτρου και ο άµεσος συσχετισµός της µε την ποιότητα του εδάφους (Doran and Parkin, 1994). Το µέγεθος, η σύσταση και η δραστηριότητα της µικροβιακής βιοµάζας είναι 50

57 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση συνήθως οι παράγοντες που προσδιορίζονται στα πειράµατα αξιολόγησης των επιδράσεων των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος. ιάφορες µέθοδοι χρησιµοποιούνται για το σκοπό αυτό οι οποίες βασίζονται στην καλλιέργεια των µικροοργανισµών σε διάφορα θρεπτικά υποστρώµατα και µέτρηση των πληθυσµών (Topp, 2001), καθώς και σε βιοχηµικές και µοριακές τεχνικές, οι οποίες προσδιορίζουν απευθείας τη σύσταση και το µέγεθος της µικροβιακής κοινότητας (Zelles et al., 1999). Πολυάριθµες έρευνες µαρτυρούν την επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στη µικροβιακή βιοµάζα του εδάφους. Οι Wardle και Parkinson (1990) µελέτησαν τις επιδράσεις του ζιζανιοκτόνου glyphosate στη µικροχλωρίδα του εδάφους εφαρµόζοντας αυξανόµενες συγκεντρώσεις του ζιζανιοκτόνου (0, 2, 20, 200 µg/g) και παρατήρησαν τις µεταβολές σε διάφορες οµάδες µικροοργανισµών σε διάστηµα 27 ηµερών. Οι πληθυσµοί των βακτηρίων αυξήθηκαν στις δύο µεγαλύτερες δόσεις εφαρµογής ενώ ο αριθµός µυκήτων δεν επηρεάστηκε από την προσθήκη του glyphosate. Οι ίδιοι επιστήµονες ερεύνησαν την επίδραση των ζιζανιοκτόνων 2,4-D και glyphosate στη µικροβιακή κοινότητα του εδάφους στον αγρό και έδειξαν ότι τα ζιζανιοκτόνα ήταν ικανά να µειώσουν τη µικροβιακή βιοµάζα µέσα σε διάστηµα λίγων ηµερών από την εφαρµογή αλλά µόνο σε τεµάχια που περιείχαν ζιζάνια (Wardle and Parkinson, 1992). Ο Βρύζας (2005) µελέτησε την επίδραση των ζιζανιοκτόνων atrazine και metolachlor στο µέγεθος και τη σύσταση της βιοµάζας του εδάφους. Στα δείγµατα που εφαρµόστηκε metolachlor η βιοµάζα µειώθηκε σταδιακά µε την πάροδο του χρόνου. Η εφαρµογή atrazine αύξησε ελάχιστα τη βιοµάζα έως τις 14 ηµέρες από την εφαρµογή και στη συνέχεια αυτή µειώθηκε φθάνοντας επίπεδα όµοια µε αυτά που βρέθηκαν στα αντίστοιχα δείγµατα που εφαρµόστηκε metolachlor. Επιπλέον, κατά την έρευνα αυτή ο ρυθµός αποδόµησης της atrazine σχετίστηκε θετικά µε την ύπαρξη υψηλών πληθυσµών Gram (-) βακτηρίων ενώ ο ρυθµός διάσπασης του metolachlor σχετίστηκε µε την ύπαρξη υψηλών πληθυσµών µυκήτων. Οι Perucci και Scarponi (1994) µελέτησαν την επίδραση του ζιζανιοκτόνου imazethapyr στη µικροβιακή κοινότητα του εδάφους σε πειράµατα αγρού και σε συνθήκες εργαστηρίου στη συνιστώµενη δόση εφαρµογής, καθώς και σε δόσεις 10 και 100 φορές µεγαλύτερες της συνιστώµενης. Στη συνιστώµενη δόση εφαρµογής το ζιζανιοκτόνο imazethapyr δεν επηρέασε τη µικροβιακή βιοµάζα σε 51

58 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση συνθήκες αγρού και εργαστηρίου, αλλά στις υψηλές δόσεις προκάλεσε µείωση της βιοµάζας των µικροοργανισµών του εδάφους. Οι Cycon και Piotrowska-Seget (2007) διερεύνησαν την επίδραση των linuron (ζιζανιοκτόνο), diazinon (εντοµοκτόνο) και mancozeb+dimethomorph (µυκητοκτόνα) στη µικροβιακή κοινότητα του εδάφους. Η εφαρµογή των ουσιών αυτών οδήγησε σε σηµαντική αύξηση των ετερότροφων βακτηρίων ενώ αντιθέτως µειώθηκαν τα νιτροποιητικά βακτήρια ιδιαίτερα στις υψηλές δόσεις (x100 της συνιστώµενης). Τα linuron και diazinon δεν επηρέασαν τον πληθυσµό των µυκήτων, σε αντίθεση µε τη συνδυασµένη εφαρµογή των µυκητοκτόνων mancozeb+dimethomorph που προκάλεσε σηµαντική µείωση στον πληθυσµό των µυκήτων. Οι Wang et al. (2008) µελέτησαν την επίδραση του οργανοφωσφορικού εντοµοκτόνου methamidophos σε συγκεντρώσεις 0.5 και 5.0 mg/g στη µικροβιακή κοινότητα του εδάφους σε πειράµατα εργαστηρίου. Η υψηλή συγκέντρωση methamidophos µείωσε σηµαντικά τη συνολική µικροβιακή βιοµάζα και τη βιοµάζα των µυκήτων, αλλά αύξησε τα Gram (-) βακτήρια, χωρίς να επηρεάσει σηµαντικά τα Gram (+) βακτήρια. Μείωση της µικροβιακής βιοµάζας προκάλεσε και η χαµηλή δόση εφαρµογής σε µικρότερο όµως βαθµό. Η µείωση της µικροβιακής βιοµάζας αποδίδεται στην αναστολή της ανάπτυξης ή στο θάνατο ορισµένων ειδών της µικροβιακής κοινότητας υπό την επίδραση του εντοµοκτόνου. Η επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στη µικροβιακή κοινότητα του εδάφους δεν σχετίζεται µόνο µε την άµεση τοξική αντίδραση των µικροοργανισµών εξαιτίας της έκθεσής τους σε υψηλές ή χαµηλές συγκεντρώσεις (Nowak et al., 1999). Έχει αναφερθεί ότι ορισµένα ζιζανιοκτόνα επιδρούν έµµεσα στους πληθυσµούς των µικροοργανισµών περιορίζοντας τη βλάστηση, συµπεριλαµβανοµένων και των ριζών, οι οποίες αποτελούν σηµαντικές θέσεις αποικισµού και θρέψης των µικροοργανισµών (Badalucco et al., 1996). Η επίδραση των µυκητοκτόνων στους µικροοργανισµούς του εδάφους έχει αναφερθεί πως είναι διαφορετική σε σχέση µε τα ζιζανιοκτόνα. Η εφαρµογή µυκητοκτόνων µπορεί να αυξήσει τον πληθυσµό των βακτηρίων χρησιµοποιώντας τα άµεσα σαν πηγή ενέργειας και θρέψης, είτε έµµεσα περιορίζοντας τον ανταγωνισµό από εδαφογενείς µύκητες ή αυξάνοντας τη διαθεσιµότητα των θρεπτικών στοιχείων µετά από το θάνατο των ευαίσθητων 52

59 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση µυκήτων. Επιπρόσθετα, η τοξική επίδραση ορισµένων µυκητοκτόνων εδάφους σε ευαίσθητους πληθυσµούς µυκήτων µπορεί να ευνοήσει την ανάπτυξη των υπόλοιπων µελών της µικροβιακής κοινότητας αξιοποιώντας τα οργανικά συστατικά που απελευθερώνονται από τα νεκρά κύτταρα των µυκήτων (Sigler and Turco, 2002) Μέθοδοι προσδιορισµού της επίδρασης των γεωργικών φαρµάκων στη µικροβιακή κοινότητα του εδάφους ιάφορες µέθοδοι έχουν αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία για τη µελέτη των επιδράσεων των γεωργικών φαρµάκων στη µικροβιακή κοινότητα του εδάφους. Οι τεχνικές αυτές βασίζονται είτε στην καλλιέργεια των µικροοργανισµών σε διάφορα θρεπτικά υποστρώµατα και στην µέτρηση των πληθυσµών που αναπτύσσονται (plate count technique), είτε σε µοριακές και βιοχηµικές µεθόδους, οι οποίες είναι ανεξάρτητες από την καλλιέργεια µικροοργανισµών (Nannipieri et al., 2003). Κατά το παρελθόν, η ανάλυση της µικροβιακής κοινότητας του εδάφους βασιζόταν σε τεχνικές καλλιέργειας µικροοργανισµών και µέτρησης των πληθυσµών. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε µια µεγάλη ποικιλία θρεπτικών µέσων καλλιέργειας έτσι ώστε να µεγιστοποιηθεί η ικανότητα ανίχνευσης διαφόρων µικροβιακών οµάδων. Υπάρχει επίσης και η δυνατότητα της µέτρησης του πληθυσµού συγκεκριµένων ειδών ή ακόµη και στελεχών µε τη χρήση εκλεκτικών υποστρωµάτων (Kinsella et al., 2009; Turner and Backman, 1991). Τα κυριότερα µειονεκτήµατα των µεθόδων που στηρίζονται στην καλλιέργεια των µικροοργανισµών είναι ότι περιορισµένος αριθµός µικροοργανισµών του εδάφους µπορεί να καλλιεργηθεί στο εργαστήριο και επίσης οι τεχνικές αυτές είναι συνήθως επίπονες και χρονοβόρες. Έχει αναφερθεί ότι οι µέθοδοι καλλιέργειας µικροοργανισµών προσδιορίζουν ένα µικρό ποσοστό της συνολικής µικροχλωρίδας του εδάφους που κυµαίνεται µεταξύ 1-10% (Nannipieri et al., 2003). Ορισµένα µικροβιακά είδη του εδάφους αδυνατούν να σχηµατίσουν αποικίες κάτω από τις συνθήκες της καλλιέργειας και επιπλέον κάποια µικροβιακά κύτταρα απαιτούν συγκεκριµένες συνθήκες ως προς τη φυσιολογία για να καλλιεργηθούν (Bakken, 1997). Έχει τέλος διαπιστωθεί ότι η άµεση παρατήρηση σε µικροσκόπιο φθορισµού αποδίδει βακτηριακούς 53

60 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση πληθυσµούς από 100 έως 1000 φορές περισσότερους σε σχέση µε τις τεχνικές καλλιέργειας (Johnsen et al., 2001). Εξαιτίας των περιορισµών που προαναφέρθηκαν, αναπτύχθηκαν νέες τεχνικές που δεν βασίζονται στην καλλιέργεια των µικροοργανισµών. Οι τεχνικές αυτές στηρίζονται στην ανάλυση βιοδεικτών όπως είναι τα λιπαρά οξέα των φωσφολιπιδίων που βρίσκονται στις κυτταρικές µεµβράνες (Phospholipid Fatty Acids, PLFA) είτε στον προσδιορισµό των νουκλεϊκών οξέων των µικροοργανισµών που εκχυλίστηκαν από το έδαφος και τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR), (PCR-based technique). Η τεχνική της ανάλυσης των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων (Phospholipid Fatty Acids, PLFA) χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό της µικροβιακής σύστασης του εδάφους (Zelles, 1999). Τα φωσφολιπίδια είναι βασικά συστατικά των κυτταρικών µεµβρανών όλων των ζωντανών κυττάρων και αποσυντίθενται γρήγορα όταν τα κύτταρα πεθάνουν. Επιπλέον τα φωσφολιπίδια αποτελούν ένα σχετικά σταθερό ποσοστό της βιοµάζας των µικροοργανισµών (Zelles, 1999). ιαφορετικές µικροβιακές οµάδες χαρακτηρίζονται από συγκεκριµένα προφίλ PLFA στις κυτταρικές τους µεµβράνες και κάθε οµάδα συνεισφέρει, ανάλογα µε τη βιοµάζα της, στο αποτύπωµα της µικροβιακής κοινότητας του εδάφους. Εποµένως, αλλαγές στη σύσταση των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων συσχετίζονται µε µεταβολές στη σύσταση της µικροβιακής κοινότητας του εδάφους. Η τεχνική περιλαµβάνει την εκχύλιση και παραλαβή όλων των λιπαρών οξέων που περιέχονται στα εδαφικά δείγµατα, ακολουθεί χηµική επεξεργασία ώστε να προκύψουν οι αντίστοιχοι µεθυλεστέρες (µεθυλίωση) και στη συνέχεια τα πτητικά αυτά προϊόντα διαχωρίζονται και προσδιορίζονται ποιοτικά και ποσοτικά µε τη βοήθεια συστηµάτων αέριας χρωµατογραφίας. Τα χρωµατογραφήµατα των αγνώστων δειγµάτων συγκρίνονται µε πρότυπα διαλύµατα των λιπαρών οξέων. Η µέθοδος έχει εφαρµοστεί για τη µελέτη µεταβολών της µικροβιακής κοινότητας από την επίδραση αγρονοµικών πρακτικών, βαρέων µετάλλων, και γεωργικών φαρµάκων (Βρύζας, 2005). Οι τεχνικές της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή µε βαθµίδωση αποδιατακτικών ουσιών (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) και θερµοκρασίας (Temprature Gradient Gel Electrophoresis, TGGE) είναι από τις πρώτες µοριακές 54

61 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση τεχνικές που χρησιµοποιήθηκαν µε επιτυχία για τον προσδιορισµό της µικροβιακής ποικιλότητας σε εδάφη (Heuer et al., 2001). Οι τεχνικές αυτές βασίζονται στην εκχύλιση του DNA των µικροοργανισµών και στην ενίσχυση µε PCR και χρησιµοποιούνται ευρέως για τον χαρακτηρισµό βακτηριακών πληθυσµών σε περιβαλλοντικά δείγµατα. Τµήµατα DNA µε το ίδιο µήκος αλλά διαφορετική αλληλουχία νουκλεοτιδίων διαχωρίζονται εξαιτίας της διαφορετικής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας που παρουσιάζουν σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου µε βαθµίδωση αποδιατακτικών παραγόντων (ουρία, φορµαµίδη) (DGGE) ή θερµοκρασίας (TGGE). Ο διαχωρισµός βασίζεται στη µειωµένη ηλεκτροφορητική κινητικότητα ενός µερικώς αποδιαταγµένου µορίου DNA σε πήκτωµα, σε σύγκριση µε την κινητικότητα της πλήρως δίκλωνης µορφής του µορίου. Άλλες µοριακές τεχνικές που χρησιµοποιούνται για τη µελέτη µικροβιακών κοινοτήτων είναι οι T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism), RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) και ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis). Οι συγκεκριµένες µέθοδοι συµπεριλαµβάνουν την εκχύλιση των νουκλεϊκών οξέων των µικροοργανισµών και την ενίσχυση του γονιδίου ενδιαφέροντος µε την τεχνική της PCR. Γενικά, οι περισσότερες µοριακές τεχνικές έχουν ενδιάµεση ευαισθησία και επιτρέπουν τον προσδιορισµό µικροβιακών οµάδων και όχι συγκεκριµένων ειδών ή στελεχών. Επίσης, οι µέθοδοι που βασίζονται στο DNA των µικροοργανισµών, παρά τη µεγάλη δυναµική τους, παρουσιάζουν προβλήµατα στην εκχύλιση των νουκλεϊκών οξέων και στην εκλεκτικότητα του σταδίου της PCR (Soderberg, 2004) Συνδυασµένη εφαρµογή PGPR και γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος Ο εµβολιασµός του εδάφους µε PGPR µε σκοπό την προαγωγή της ανάπτυξης των φυτών και την προστασία έναντι σηµαντικών φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών αποτελεί αναµφίβολα µια περιβαλλοντικά φιλική πρόταση. Η εναλλακτική αυτή προσέγγιση συγκεντρώνει σηµαντικά πλεονεκτήµατα, όπως µειωµένες εισροές επικίνδυνων συνθετικών γεωργικών φαρµάκων και λιπασµάτων στο περιβάλλον, διατήρηση και βελτίωση της γονιµότητας των εδαφών, µειωµένο κόστος παραγωγής, ασφάλεια παραγωγού και καταναλωτή (Singh et al., 2011). Ωστόσο, η παραλλακτικότητα και η αστάθεια της 55

62 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση αποτελεσµατικότητας καταπολέµησης σε διαφορετικές συνθήκες αποτελεί τον σηµαντικότερο περιοριστικό παράγοντα για την πρακτική εφαρµογή των PGPR στο γεωργικό τοµέα. Απαιτείται λοιπόν περαιτέρω έρευνα, και µάλιστα πιο στοχοποιηµένη, έτσι ώστε να προσπελαστεί η παραλλακτικότητα καταπολέµησης που παρατηρείται µε την εφαρµογή εµβολίων PGPR. Προς αυτή την κατεύθυνση συντελεί η εφαρµογή µιγµάτων διαφόρων στελεχών PGPR. Μέχρι πρόσφατα, οι περισσότερες έρευνες βιολογικού ελέγχου διαφόρων φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών περιορίζονταν στην εφαρµογή µεµονωµένων βιολογικών παραγόντων, προκαλώντας συχνά την εµφάνιση φαινοµένων µειωµένης αποτελεσµατικότητας. Πιθανές αιτίες τέτοιων φαινοµένων είναι η µειωµένη πιθανότητα ενός και µόνου βιολογικού παράγοντα να είναι εξίσου αποτελεσµατικός σε εδάφη ποικίλης σύστασης, σε διαφορετικούς ξενιστές ή περιβαλλοντικές συνθήκες και έναντι ποικίλων φυτοπαθολογικών προβληµάτων (Kloepper et al., 2004). Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι η εφαρµογή συνδυασµών διαφόρων στελεχών PGPR, µε διαφορετικούς µηχανισµούς δράσης, είχε ως αποτέλεσµα τον αυξηµένο έλεγχο αρκετών φυτοπαθογόνων (Raupach and Kloepper, 1998). Επιπλέον, η συνδυασµένη εφαρµογή PGPR και συµβατικών γεωργικών φαρµάκων µπορεί να µειώσει την παραλλακτικότητα των αποτελεσµάτων και να αυξήσει σηµαντικά την αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών σε σχέση την απλή εφαρµογή εµβολίων PGPR (Choudhary and Johri, 2009). Η στρατηγική αυτή µπορεί να αποτελέσει βασική συνιστώσα σε προγράµµατα ολοκληρωµένης καταπολέµησης, περιορίζοντας ταυτόχρονα τις χρησιµοποιούµενες δόσεις των συνθετικών γεωργικών φαρµάκων. Για παράδειγµα, οι Omar et al. (2006) ανέφεραν ότι η συνδυασµένη εφαρµογή του βιολογικού παράγοντα Bacillus megaterium c96 και µειωµένης συγκέντρωσης του µυκητοκτόνου carbendazim στο έδαφος, προκάλεσε σηµαντικά µεγαλύτερη µείωση της εδαφογενούς ασθένειας της σήψης του λαιµού και των ριζών της τοµάτας σε σύγκριση µε την απλή εφαρµογή µυκητοκτόνου ή βιολογικού παράγοντα. Οι µειωµένες εισροές συνθετικών γεωργικών φαρµάκων συµβάλλουν περαιτέρω στη µείωση των ανεπιθύµητων υπολειµµάτων και στην αποφυγή ανάπτυξης φαινοµένων ανθεκτικότητας. Εκτός από την εισαγωγή εµβολίων PGPR, διάφορα συνθετικά γεωργικά φάρµακα εφαρµόζονται απευθείας στο έδαφος για την αντιµετώπιση πολλών 56

63 Κεφάλαιο 1 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση εχθρών (ζιζάνια, έντοµα, νηµατώδεις) και φυτοπαθογόνων οργανισµών σε προγράµµατα συµβατικής ή ολοκληρωµένης φυτοπροστασίας. Στη συνήθη γεωργική πρακτική, διαφορετικές οµάδες γεωργικών φαρµάκων, όπως εντοµοκτόνα, µυκητοκτόνα, ζιζανιοκτόνα, νηµατοδωκτόνα και εµπορικά διαθέσιµα PGPR εφαρµόζονται στο έδαφος ταυτόχρονα ή διαδοχικά, αλληλεπιδρώντας µεταξύ τους. Τέλος, σηµαντική είναι και η έµµεση επιβάρυνση του εδάφους µε γεωργικά φάρµακα εξαιτίας της εναπόθεσης ψεκαστικού διαλύµατος εκτός στόχου κατά την εφαρµογή ψεκασµών φυλλώµατος, που µπορεί να επηρεάσει τις αλληλεπιδράσεις αυτές. 57

64 58

65 Σκοπός της ιδακτορικής ιατριβής 1.3 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση της επίδρασης συγκεκριµένων στελεχών PGPR του γένους Bacillus (B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24, B. subtilis GB03) στην αποδόµηση γεωργικών φαρµάκων διαφορετικών χηµικών οµάδων και η µελέτη των πιθανών επιδράσεων των γεωργικών φαρµάκων στους βακτηριακούς πληθυσµούς. Για την επίτευξη του σκοπού τέθηκαν οι κάτωθι στόχοι: Μελέτη της επιβίωσης των στελεχών PGPR στο έδαφος και της ικανότητας αποικισµού του ριζικού συστήµατος της τοµάτας, ξενιστής που αποτέλεσε τη βάση για την επιλογή των γεωργικών φαρµάκων. Μελέτη της επίδρασης του εµβολιασµού µε τα στελέχη PGPR στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride, acibenzolar-s-methyl, thiamethoxam σε ελεγχόµενες συνθήκες (υγρές καλλιέργειες, φυσικό και αποστειρωµένο έδαφος αγρού). Ανάπτυξη κατάλληλων χρωµατογραφικών µεθόδων σε συστήµατα LC- MS/MS και HPLC-UV για την ανάλυση των υπολειµµάτων των παραπάνω γεωργικών φαρµάκων σε υγρές καλλιέργειες και έδαφος. ιερεύνηση των επιδράσεων των γεωργικών φαρµάκων στους πληθυσµούς των PGPR σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης. Μελέτη της επίδρασης του ριζοεµβολιασµού φυτών τοµάτας µε τα στελέχη PGPR στην αποδόµηση του acibenzolar-s-methyl στο έδαφος και σχηµατισµός του κύριου µεταβολίτη του CGA ιερεύνηση της επίδρασης των στελεχών στην πρόσληψη και διασυστηµατική µετακίνηση του acibenzolar-s-methyl και του κύριου µεταβολίτη του CGA στο υπέργειο µέρος φυτών τοµάτας. Ανάπτυξη αναλυτικής µεθόδου για τον προσδιορισµό του acibenzolar-smethyl και του µεταβολίτη του CGA στο έδαφος σε σύστηµα HPLC-UV. 59

66 Σκοπός της ιδακτορικής ιατριβής Μελέτη της ικανότητας αποικισµού του στελέχους B. subtilis GB03 στη ρίζα φυτών τοµάτας και στο έδαφος της ριζόσφαιρας και επίδραση του acibenzolar-s-methyl στη βακτηριακή ανάπτυξη. Ωστόσο, παράλληλα µε τους ανωτέρω στόχους κρίθηκε αναγκαία η αξιολόγηση της ικανότητας των στελεχών PGPR στην προαγωγή της ανάπτυξης φυτών τοµάτας και τη βιολογική αντιµετώπιση του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici στην τοµάτα και σε συνδυασµό µε το χηµικό ενεργοποιητή των µηχανισµών άµυνας των φυτών Bion (acibenzolar-s-methyl) καθώς και µε το µοναδικό εγκεκριµένο για την ασθένεια σκεύασµα στην Ελλάδα Tachigaren (hymexazol) στην αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης της ασθένειας. 60

67 Κεφάλαιο 2 Εισαγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ PGPR ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BACILLUS ΣΤΗΝ ΠΡΟΑΓΩΓΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΗΣ ΤΟΜΑΤΑΣ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ FUSARIUM OXYSPORUM F.SP. RADICIS-LYCOPERSICI 2.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα PGPR του γένους Bacillus ως βιολογικοί παράγοντες Ένας µεγάλος αριθµός PGPR του γένους Bacillus έχει αναφερθεί ότι µπορεί να προάγει την ανάπτυξη και να ελέγξει σηµαντικούς φυτοπαθογόνους µικροοργανισµούς σε διάφορους ξενιστές (Choudhary and Johri, 2009), (Πίνακας 2.1). Τα περισσότερα από αυτά τα στελέχη ανήκουν στα είδη B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B. licheniformis, B. subtilis, B. pasteurii, B. cereus, B. pumilus, B. mycoides και B. sphaericus και επηρεάζουν την ένταση της ασθένειας χρησιµοποιώντας διάφορους µηχανισµούς (Ryu et al., 2004). Ορισµένα µάλιστα στελέχη έχουν τυποποιηθεί, διατίθενται στην αγορά ως εµπορικά σκευάσµατα και χρησιµοποιούνται σε µεγάλη κλίµακα για την καταπολέµηση κυρίως εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων (Brannen and Kenney, 1997). Τα PGPR του γένους Bacillus χρησιµοποιούνται για την αντιµετώπιση ασθενειών φυλλώµατος µυκητολογικής και βακτηριολογικής αιτιολογίας, ιολογικών ασθενειών, νηµατωδών και εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων. Τα δεδοµένα αφορούν δοκιµές που έγιναν σε εργαστηριακές, θερµοκηπιακές αλλά και συνθήκες αγρού σε καλλιέργειες µεταξύ άλλων τοµάτας, πιπεριάς, µελιτζάνας, καπνού, βαµβακιού, αγγουριάς, ζαχαροτεύτλων και Arabidopsis sp. (Kloepper et al., 2004). Τα PGPR του γένους Bacillus είναι ίσως από τους σηµαντικότερους παράγοντες βιολογικού ελέγχου, σε σχέση µε ριζοβακτήρια άλλων γενών, αφού χαρακτηρίζονται από υψηλή ικανότητα επιβίωσης στο έδαφος και αποικισµού του ριζικού συστήµατος των φυτών (Kinsella et al., 2009; Yan et al., 2003). Επίσης, είναι εξαιρετικοί ανταγωνιστές όσον αφορά την κατανάλωση των διαθέσιµων θρεπτικών στοιχείων της ριζόσφαιρας και την κατάληψη των διαθέσιµων οικοθέσεων στο ριζικό σύστηµα των φυτών (Benhamou et al., 1998b; Zheng and Sinclair, 2000). Επιπλέον, τα PGPR του γένους 61

68 Κεφάλαιο 2 Εισαγωγή Πίνακας 2.1 Παραδείγµατα βιολογικού ελέγχου φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών µε PGPR του γένους Bacillus. Ξενιστής Φυτοπαθογόνο PGPR στέλεχος Βιβλιογραφική Αναφορά Arabidopsis sp. Erwinia carotovora B. amyloliquefaciens IN937a Ryu et al. (2004) Τοµάτα Ralstonia solanacearum Bacillus sp. Jetiyanon and Kloepper (2002) Arabidopsis sp. Erwinia carotovora B. subtilis GB03 Ryu et al. (2003) Ζαχαρότευτλα Cercospora beticola B. pumilus & Bargabus et al. (2004) Αγγούρι Colletotrichum orbiculare, Pseudomonas B. pumilus INR7+B. subtilis Raupach and Kloepper (1998) syringae pv. lachrymans, Erwinia tracheiphila GB03 Arabidopsis sp. Pseudomonas syringae pv. maculicova B. pumilus SE34 Ryu et al. (2003) Κολοκυθιά Phytophthora capsici Bacillus sp. Zhang et al. (2010) Τοµάτα Ralstonia solanacearum B. amyloliquefaciens IN937a + Anith et al. (2004) B. subtilis GB03 Τοµάτα Phytophthora infestans B. pumilus SE34 Yan et al. (2002) Βαµβάκι Rhizoctonia sp., Fusarium sp. B. subtilis GB03 Brannen and Kenney (1997) Τοµάτα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici B. pumilus SE34 Benhamou et al. (1998) 62

69 Κεφάλαιο 2 Εισαγωγή Bacillus παράγουν ένα ευρύ φάσµα αντιβιοτικών που είναι δραστικά έναντι πολλών φυτοπαθογόνων µυκήτων (Yu et al., 2002). Συγκεκριµένα, στελέχη του είδους B. subtilis παράγουν λιποπεπτίδια (lipopeptides) ως αντιβιοτικά, όπως ιτουρίνες Α-Ε (iturins A-E), σουρφακτίνες (surfactins), φενγκισίνες (fengycins), πλιπαστατίνες (plipastatins) που εµφανίζουν µυκητοτοξική και µυκητοστατική δράση (Cazorla et al., 2007; Kinsella et al., 2009). Σηµαντικό επίσης ρόλο παίζουν τα ριζοβακτήρια του γένους Bacillus στην επαγόµενη διασυστηµατική αντοχή (ISR), (Pieterse et al., 2000). Η πρόκληση ISR, που αποτελεί διασυστηµατικό µηχανισµό άµυνας των φυτών, ενισχύει την αντοχή των φυτικών ειδών έναντι διαφόρων ασθενειών (Kloepper et al., 2004). Οι Ryu et al. (2004) ανέφεραν ότι το στέλεχος B. subtilis GB03 παράγει µίγµα πτητικών οργανικών ενώσεων (volatile organic compounds, VOCs), κυρίως 2,3- βουτανεδιόλη (2,3-butanediol) και ακετοίνη (acetoin), και προστάτεψε φυτά Arabidopsis thaliana από το βακτήριο Erwinia carotovora µέσω πρόκλησης ISR. Σε προγενέστερη έρευνα, οι ίδιες ουσίες είχαν βρεθεί ότι παράγονται από τα PGPR B. amyloliquefaciens IN937a και B. subtilis GB03 προωθώντας την ανάπτυξη φυτών Arabidopsis sp. (Ryu et al., 2003). Ο βιολογικός έλεγχος διαφόρων φυτοπαθογόνων οργανισµών που επιτυγχάνεται στη φύση είναι αποτέλεσµα συνήθως µιγµάτων βιολογικών παραγόντων παρά ενός και µόνο παράγοντα. Για το λόγο αυτό, η εφαρµογή συνδυασµών διαφόρων στελεχών PGPR µπορεί να αυξήσει την αποτελεσµατικότητα, το φάσµα δράσης και την επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων αφού οι συνθήκες αυτές προσεγγίζουν περισσότερο τις πραγµατικές (Jetiyanon and Kloepper, 2002). Σε πολλές έρευνες έχει διαπιστωθεί αυξηµένη αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης και µεγαλύτερη προαγωγή στην ανάπτυξη από συνδυασµένη εφαρµογή PGPR σε σύγκριση µε την απλή εφαρµογή (Jetiyanon and Kloepper, 2002; Raupach and Kloepper, 1998). Οι Raupach and Kloepper (1998) ανέφεραν ότι το γεγονός αυτό οφείλεται στους διαφορετικούς µηχανισµούς δράσης του κάθε στελέχους. 63

70 Κεφάλαιο 2 Εισαγωγή Η σήψη του λαιµού και των ριζών της τοµάτας από τον εδαφογενή µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (FORL) Η σήψη του λαιµού και των ριζών της τοµάτας (Fusarium crown and root rot, FCRR) είναι µία από τις πιο καταστροφικές ασθένειες της τοµάτας (Lycopersicon esculentum Mill.) παγκοσµίως και οφείλεται στον εδαφογενή µύκητα Fusarium oxysporum Schlecht. f.sp. radicis-lycopersici (FORL) (Jarvis, 1988). Η ασθένεια αναφέρθηκε για πρώτη φορά το 1974 στην Ιαπωνία (Yamamoto et al., 1974) και αργότερα αναγνωρίστηκε και στις Η.Π.Α. (Sonoda, 1976). Έχει επίσης αναφερθεί στον Καναδά, Μεξικό, Ισραήλ, Τουρκία (Can, et al., 2004), σε πολλές Ευρωπαϊκές χώρες (Αγγλία, Ολλανδία, Βέλγιο, Γαλλία), (Jarvis, 1988) καθώς και σε πολλές ακόµη πολιτείες της Αµερικής (Καλιφόρνια, Οχάιο, Νέα Υόρκη, Πενσυλβάνια, Τέξας), (Roberts et al., 2001). Η ασθένεια αποτελεί περιοριστικό παράγοντα σε θερµοκηπιακές και υπαίθριες καλλιέργειες τοµάτας παγκοσµίως και προκαλεί σηµαντικές απώλειες στην παραγωγή. Έχουν Εικόνα 2.1 Φυτά τοµάτας προσβεβληµένα από το µύκητα Fusarium oxysporum f.s. radicis-lycopersici αναφερθεί απώλειες στην παραγωγή τοµάτας που κυµαίνονται από 20% έως και 60% (Jarvis et al., 1983). Στην Ελλάδα η ασθένεια αυτή αναφέρθηκε για πρώτη φορά σε θερµοκήπια της Κρήτης το 1985 (Malathrakis 1985). Η ασθένεια είναι συνδεδεµένη µε µεγάλο εύρος συµπτωµάτων. Το πρώτο χαρακτηριστικό σύµπτωµα που παρουσιάζεται σε ώριµα φυτά είναι ένα περιφερειακό κιτρίνισµα των παλαιότερων φύλλων λίγο πριν την ωρίµανση των πρώτων καρπών. Το κιτρίνισµα αυτό σύντοµα ακολουθείται από νέκρωση και τα φύλλα τελικά ξεραίνονται και πέφτουν (Εικόνα 2.1). Τα συµπτώµατα αυτά εµφανίζονται προοδευτικά και στα νεαρότερα φύλλα, αλλά η εξέλιξη των συµπτωµάτων είναι βραδύτερη σε σύγκριση µε τα παλαιότερα φύλλα. Μερικά φυτά µπορεί να εµφανίσουν νανισµό και να µαραθούν πολύ γρήγορα. Σε άλλα πάλι γηραιότερα, ο µαρασµός µπορεί να είναι αργός και τα φυτά να παραµείνουν 64

71 Κεφάλαιο 2 Εισαγωγή ζωντανά µέχρι το τέλος της καλλιεργητικής περιόδου (Jones et al., 1991). Η µάρανση αρχικά εµφανίζεται κατά τις θερµές ώρες της ηµέρας και τα φυτά φαίνεται να ανακτούν το βράδυ. Τα προσβεβληµένα φυτά µπορεί να παραµείνουν νάνα, να µαραθούν πλήρως και να νεκρωθούν, είτε να παραµείνουν σε ασθενή κατάσταση και να αποδώσουν µικρή και ποιοτικά υποβαθµισµένη παραγωγή (Roberts et al., 2001). Το ριζικό σύστηµα των φυτών προσβάλλεται εξολοκλήρου και παρατηρείται ξηρή καστανή σήψη του ξυλώµατος και του φλοιώµατος. Ένα άλλο χαρακτηριστικό σύµπτωµα της ασθένειας είναι η εµφάνιση καστανής σήψης τόσο στο λαιµό των ασθενών φυτών αλλά και πάνω ή κάτω από την επιφάνεια του εδάφους, η οποία επεκτείνεται έως τα αγγεία του ξύλου. Η καστανή σήψη του φλοιώδους ιστού συνήθως γίνεται αντιληπτή µόνο µετά από εγκάρσια τοµή του φλοιού στην περιοχή του λαιµού και της ρίζας (Εικόνα 2.2). Επίσης, στο λαιµό έως και cm πάνω από την επιφάνεια του εδάφους Εικόνα 2.2 Συµπτώµατα προσβολής του λαιµού της τοµάτας από το µύκητα Fusarium oxysporum f.s. radicislycopersici ( παρατηρείται καστανός µεταχρωµατισµός και στα αγγεία του ξύλου. Στις περισσότερες περιπτώσεις µια επιµήκης νεκρωτική κηλίδα εµφανίζεται κοντά στην περιοχή του λαιµού. Με βροχερό και υγρό καιρό πάνω στην κηλίδα παρατηρείται το ροζ µυκήλιο του µύκητα (Jones et al., 1991). Τα παθογόνο αίτιο της ασθένειας είναι ο µύκητας Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici. Ο µύκητας κατά τη διάρκεια του βιολογικού του κύκλου παράγει τρεις τύπους σπορίων: µακροκονίδια, µικροκονίδια και χλαµυδοσπόρια. Τα µικροκονίδια σχηµατίζονται σε µεγάλους αριθµούς πάνω στους νεκρούς ιστούς και µεταφέρονται σε αµόλυντες περιοχές µε τη βοήθεια του ανέµου και τα χλαµυδοσπόρια συµβάλλουν στην επιβίωση του µύκητα για µεγάλο χρονικό διάστηµα στο έδαφος. Το παθογόνο εισέρχεται αρχικά στην κύρια ρίζα του φυτού και µετακινείται αργά προς τις δευτερεύουσες ρίζες και την περιοχή του 65

72 Κεφάλαιο 2 Εισαγωγή λαιµού, κυρίως µε τη βοήθεια µεσοκυττάριων µυκηλιακών υφών µέσω του φλοιώµατος και δευτερευόντως µέσω του ξυλώµατος. Η ασθένεια είναι πολυκυκλική και ευνοείται σε σχετικά χαµηλές θερµοκρασίες εδάφους (20-22 ο C), (Rekah et al., 1999). Το παθογόνο µεταδίδεται µε τα υπολείµµατα της καλλιέργειας, το έδαφος, τα µολυσµένα σπορόφυτα, τα µολυσµένα ρούχα και παπούτσια, και τα καλλιεργητικά εργαλεία. Το εύρος ξενιστών του παθογόνου περιλαµβάνει σολανώδη (τοµάτα, πιπεριά, µελιτζάνα) και µη σολανώδη φυτά (σπανάκι, φασόλι, κ.α.) Η καταπολέµηση του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicislycopersici στην τοµάτα ιάφορα µέτρα έχουν χρησιµοποιηθεί για την καταπολέµηση του εδαφογενούς µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici σε θερµοκηπιακές και υπαίθριες καλλιέργειες τοµάτας. Συγκεκριµένα, η χρήση ανθεκτικών ποικιλιών, η αµειψισπορά, η ηλιοαπολύµανση του εδάφους, η εφαρµογή µυκητοκτόνων εδάφους και καπνιστικών σκευασµάτων, είναι δυνατόν να περιορίσουν τις προκαλούµενες ζηµιές από την ασθένεια (Ozbay and Newman, 2004). Παρόλα αυτά, η αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης της ασθένειας µε τη χρήση των ανωτέρω µέτρων είναι στις περισσότερες περιπτώσεις περιορισµένη, καθιστώντας τη σήψη του λαιµού και των ριζών της τοµάτας µια σηµαντικότατη ασθένεια τόσο στην Ελλάδα όσο και παγκοσµίως. Η αµειψισπορά, µε φυτικά είδη που δεν αποτελούν ξενιστές του φυτοπαθογόνου µύκητα, είναι µικρής σηµασίας ως µέτρο καταπολέµησης καθώς ο µύκητας µπορεί να επιβιώσει στο έδαφος για µεγάλο χρονικό διάστηµα και επίσης σπόρια που σχηµατίζονται πάνω σε µολυσµένους φυτικούς ιστούς µπορούν να µεταφερθούν µε τη βοήθεια του ανέµου σε γειτονικές καλλιέργειες (Rekah et al., 1999). Η καλλιέργεια ανθεκτικών ποικιλιών αποτελεί ένα σηµαντικό µέτρο αντιµετώπισης της ασθένειας και ιδίως σε προγράµµατα ολοκληρωµένης διαχείρισης παρασίτων (Integrated Pest Management, IPM). Εντούτοις, το υψηλό κόστος των ανθεκτικών ποικιλιών (Horinouchi et al., 2008), τα υποβαθµισµένα βοτανικά χαρακτηριστικά (McGovern et al., 1993) και η έντονη παραλλακτικότητα του παθογόνου ως προς την παθογόνο ικανότητα (Elmhirst 1997), αποτελούν τους σηµαντικότερους παράγοντες που καθιστούν περιορισµένη τη χρήση τους στις µέρες µας. 66

73 Κεφάλαιο 2 Εισαγωγή Χηµική καταπολέµηση της ασθένειας αυτής έχει αναφερθεί µε την εφαρµογή των µυκητοκτόνων εδάφους benomyl και captafol (Mihuta-Grimm 1990; Rowe and Farley, 1978). Ωστόσο, η ανάκληση της άδειας κυκλοφορίας των σκευασµάτων των παραπάνω ουσιών τα καθιστά ικανά να χρησιµοποιηθούν σε πειραµατική αλλά όχι σε εµπορική κλίµατα. Η εφαρµογή του βρωµιούχου µεθυλίου ως απολυµαντικού εδάφους είναι η πιο αποτελεσµατική και ευρέως χρησιµοποιούµενη µέθοδος για την καταπολέµηση της ασθένειας (Ozbay and Newman, 2004). Εξαιτίας όµως των σοβαρών προβληµάτων που επιφέρει η χρήση του (καταστροφή του όζοντος, υπολείµµατα σε έδαφος και εδώδιµα Εικόνα 2.3 Χηµική δοµή του µυκητοκτόνου hymexazol. προϊόντα, υψηλή τοξικότητα, κ.α.), έχει αποσυρθεί στις αναπτυγµένες χώρες από το 2005 και δεν συµπεριλήφθηκε στο παράρτηµα Ι της κοινοτικής οδηγίας 414/91/EEC (European Commission, Decision 2008/753/EC). Στην Ελλάδα, το µοναδικό µυκητοκτόνο που έχει σήµερα έγκριση κυκλοφορίας για χηµική καταπολέµηση της ασθένειας είναι το hymexazol (Εικόνα 2.3). Πρόκειται για ένα ισοξαζόλιο που αναστέλλει την βιοσύνθεση νουκλεικών οξέων και πιθανόν του RNA. Είναι διασυστηµατικό µυκητοκτόνο, µε προληπτική και θεραπευτική δράση για την καταπολέµηση του µύκητα FORL στην τοµάτα και εφαρµόζεται στο έδαφος (FOOTPRINT, 2011). Ελάχιστα όµως δεδοµένα είναι διαθέσιµα στη διεθνή βιβλιογραφία για την επίδραση του hymexazol στην αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης της ασθένειας (Hibar et al., 2007; Song et al., 2004). Η απαγόρευση της χρήσης του βρωµιούχου µεθυλίου και πολλών άλλων µυκητοκτόνων εδάφους, ο µικρός αριθµός ανθεκτικών ποικιλιών και η σχετικά µικρή αποτελεσµατικότητα των ανωτέρω συµβατικών µεθόδων καταπολέµησης, οδήγησε τους επιστήµονες στην ανάπτυξη εναλλακτικών και πιο φιλικών προς το περιβάλλον µεθόδων. Για τους λόγους αυτούς, τα τελευταία χρόνια έχει δοθεί ιδιαίτερη έµφαση στην ανάπτυξη και εφαρµογή βιολογικών παραγόντων. Ο υπερπαράσιτος µύκητας Trichoderma harzianum είναι ένας αποτελεσµατικός βιολογικός παράγοντας της ασθένειας τόσο σε θερµοκήπια όσο και στον αγρό (Sivan et al., 1987). Σηµαντική µείωση της έντασης της ασθένειας 67

74 Κεφάλαιο 2 Εισαγωγή παρατηρήθηκε επίσης και από το συνδυασµό του T. harzianum µε τον µύκητα Glomus intraradices (Datnoff et al., 1995). Βιολογική καταπολέµηση έχει επίσης επιτευχθεί από µη παθογόνες φυλές του γένους Fusarium (Komada, 1994), καθώς και από τους µύκητες Penicillium funiculosum και Aspergillus ochraceus (Marrois et al., 1981). Προσπάθειες βιολογικής καταπολέµησης της σήψης του λαιµού και των ριζών της τοµάτας έγιναν και µε τη χρήση βακτηρίων που προάγουν την ανάπτυξη των φυτών (PGPR). Τα τελευταία χρόνια υπάρχουν πολλές δηµοσιευµένες έρευνες µε PGPR του γένους Pseudomonas ως επιτυχή παραδείγµατα βιολογικής αντιµετώπισης της ασθένειας (Bolwerk et al., 2003; M'piga et al., 1997; Validov et al., 2009). Αντιθέτως, η επίδραση PGPR του γένους Bacillus στο παθοσύστηµα FORL-τοµάτα δεν έχει µελετηθεί ιδιαίτερα. Πρόσφατα, ο Cazorla και οι συνεργάτες του (2007) αποµόνωσαν δύο στελέχη Bacillus subtilis, τα PCL1608 και PCL1612, από τη ριζόσφαιρα αβοκάντο µε ανασταλτική δράση έναντι του FORL και ο Baysal µε την ερευνητική του οµάδα (2008) ανέφεραν ότι το στέλεχος B. subtilis EU07 ήταν ικανό να µειώσει της ένταση της ασθένειας. Μια εναλλακτική προσέγγιση για την αντιµετώπιση ασθενειών των φυτών, η οποία τα τελευταία χρόνια κερδίζει το ενδιαφέρον των επιστηµόνων παγκοσµίως, είναι ο συνδυασµός βιολογικών παραγόντων µε χηµικούς ενεργοποιητές των µηχανισµών άµυνας των φυτών (SAR) καθώς και µε συµβατικά γεωργικά φάρµακα (Abo-Elyousr et al., 2009; Anith et al., 2004; Omar et al., 2006; Vallad and Goodman, 2004; Verhagen et al., 2006). Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η αύξηση της αποτελεσµατικότητας καταπολέµησης έναντι των φυτοπαθογόνων. ιάφορες ενώσεις που ανήκουν σε διαφορετικές χηµικές οµάδες, όπως για παράδειγµα το 2,6 διχλωροισονικοτινικο οξυ (INA), το β-αµινοβουτυρικό οξύ (BABA) και το acibenzolar-s-methyl (ASM) έχουν χρησιµοποιηθεί ως ενεργοποιητές των αµυντικών µηχανισµών των φυτών. Το ASM είναι µία συνθετική ουσία που ανήκει στα βενζο-θειαδιαζόλια, είναι εµπορικά διαθέσιµη και έχει χρησιµοποιηθεί για την καταπολέµηση βακτηρίων και µυκήτων συµπεριλαµβανοµένου και του FORL (Benhamou and Bélanger, 1998). Εντούτοις, δεν έχει µελετηθεί η συνδυασµένη εφαρµογή βιολογικών παραγόντων και ASM στην αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης της ασθένειας. 68

75 Κεφάλαιο 2 Εισαγωγή Σκοπός των πειραµάτων Παράλληλα µε τους κύριους στόχους της διδακτορικής διατριβής και µε σκοπό τόσο την εξοικείωση µε το χειρισµό των βακτηρίων όσο και τη µελέτη των βασικών ιδιοτήτων των PGPR στις περιβαλλοντικές συνθήκες της χώρας µας, κρίθηκε αναγκαία η αξιολόγηση των στελεχών στην προαγωγή της ανάπτυξης φυτών τοµάτας και την αντιµετώπιση σηµαντικού φυτοπαθογόνου µύκητα. Οι στόχοι των δοκιµών που αναφέρονται στο συγκεκριµένο κεφάλαιο είναι: α) η διερεύνηση της επίδρασης τεσσάρων στελεχών PGPR του γένους Bacillus (2 εκ των οποίων είναι εµπορικά διαθέσιµα), εφαρµοζόµενων µεµονωµένα ή σε συνδυασµό ανά δύο, στην προαγωγή της ανάπτυξης φυτών τοµάτας, β) η αξιολόγηση της δυνατότητας εφαρµογής τους, µεµονωµένα ή σε συνδυασµό, στη βιολογική καταπολέµηση του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicislycopersici στην τοµάτα, γ) η µελέτη της επιβίωσης των βακτηριακών στελεχών στο έδαφος και της ικανότητας αποικισµού του ριζικού συστήµατος της τοµάτας και δ) η αξιολόγηση της συνδυασµένης εφαρµογής των στελεχών µε τον χηµικό ενεργοποιητή των µηχανισµών άµυνας των φυτών acibenzolar-s-methyl καθώς και µε το hymexazol, το µοναδικό εγκεκριµένο για την ασθένεια µυκητοκτόνο στην Ελλάδα, στην αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης της ασθένειας. 69

76 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι 2.2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ PGPR, φυτοπαθογόνος µύκητας και θρεπτικά υποστρώµατα Στην παρούσα έρευνα χρησιµοποιήθηκαν τέσσερα ριζοβακτήρια που προάγουν τη φυτική ανάπτυξη τα οποία ανήκουν στο γένος Bacillus. Συγκεκριµένα, επελέγησαν τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03. Τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34 παραχωρήθηκαν από τον Καθηγητή Joseph W. Kloepper (Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, AL, USA), ενώ τα εµπορικά διαθέσιµα στελέχη B. subtilis FZB24 (FZB24 ) και B. subtilis GB03 (Companion ) αγοράστηκαν από τις παρασκευάστριες εταιρίες ABiTEP GmbH (Berlin, Germany) και Growth Products Ltd. (New York, USA), αντίστοιχα. Χρησιµοποιήθηκε η αποµόνωση CBS του φυτοπαθογόνου µύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (FORL) η οποία παραχωρήθηκε από το Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. Το παθογόνο αποµονώθηκε από προσβεβληµένο µε το µύκητα φυτό τοµάτας και διατηρήθηκε σε θρεπτικό υπόστρωµα Potato Dextrose Agar (PDA) στους 4 0 C. Προκαταρκτικές δοκιµές έδειξαν την υψηλή µολυσµατική ικανότητα της αποµόνωσης σε φυτά τοµάτας ποικιλίας ACE 55. Τα θρεπτικά υποστρώµατα καλλιέργειας του µύκητα Czapek Dox Broth (CDP) και PDA λήφθηκαν από τους οίκους Duchefa (Haarlem, The Netherlands) και Merck (Darmstadt, Germany), αντίστοιχα. Η σύσταση των θρεπτικών µέσων (g/l απεσταγµένο νερό) είναι η ακόλουθη: Czapek Dox Broth (CDA) Potato Dextrose Agar (PDA) NaFeEDTA 0.01 Εκχύλισµα πατάτας 4.0 (από 200 g πατάτας) Γλυκονικό µαγνήσιο 0.5 D(+) Γλυκόζη 20.0 Χλωριούχο κάλιο 0.5 Άγαρ 15.0 Θειικό κάλιο 0.35 Νιτρικό νάτριο 2.0 Σουκρόζη

77 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι Τα θρεπτικά µέσα καλλιέργειας των βακτηρίων tryptic soy agar (TSA) και tryptic soy broth (TSB) λήφθηκαν από τον οίκο Becton, Dickinson and Company (Sparks, USA), ενώ η γλυκερόλη ήταν προϊόν της Panreac (Barcelona, Spain). Η σύσταση των υποστρωµάτων (g/l απεσταγµένο νερό) είναι η ακόλουθη: Tryptic Soy Agar (TSA) Tryptic Soy Broth (TSB) Παγκρεατική πέψη καζεΐνης 15.0 Παγκρεατική πέψη καζεΐνης 17.0 (pancreatic digest of casein) (pancreatic digest of casein) Προϊόν ενζυµικής πέψης της 5.0 Προϊόν ενζυµικής πέψης της 3.0 σόγιας (papaic digest of σόγιας (papaic digest of soybean) soybean) Χλωριούχο νάτριο 5.0 εξτρόζη 2.5 Άγαρ 15.0 Χλωριούχο νάτριο 5.0 Φωσφορικό κάλιο 2.5 Τα θρεπτικά υποστρώµατα ανασυστάθηκαν από σκόνη µε την προσθήκη απεσταγµένου νερού και αποστειρώθηκαν σε αυτόκαυστο στους C, υπό πίεση 1 atm, για 20 λεπτά. Τα στερεά θρεπτικά υλικά µετά την ελάττωση της θερµοκρασίας στους 50 ο C περίπου, αποχύνονταν σε τρυβλία Petri, διαµέτρου 9 cm, όπου και στερεοποιούνταν. Τα τρυβλία επωάζονταν στους 30 ο C για 24 ώρες και στη συνέχεια διατηρούνταν στους 4 ο C Παραγωγή βακτηριακών κυττάρων και µολύσµατος FORL Η διατήρηση των βακτηρίων για µεγάλο χρονικό διάστηµα γινόταν µε την τοποθέτηση αιωρήµατος βακτηριακών κυττάρων σε υγρό θρεπτικό υπόστρωµα TSB που περιείχε 20% (v/v) γλυκερόλη στους -80 o C. Για την καλλιέργεια των κυττάρων, κάθε βακτηριακό στέλεχος εµβολιάστηκε µε τη βοήθεια κρίκου εµβολιασµού σε στερεό θρεπτικό υλικό TSA µε επιφανειακή επίστρωση (streaking) και επωάστηκε στους 30 o C για 24 ώρες. Μετά την ανάπτυξη των αποικιών και τον έλεγχο της καθαρότητας, αποµονωµένες αποικίες εµβολιάστηκαν µε αποστειρωµένο κρίκο σε φρέσκο θρεπτικό υλικό TSB και επωάστηκαν σε αναδευτήρα (incubator shaker) στις 120 στροφές/λεπτό και 71

78 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι θερµοκρασία 30 0 C. Οι καλλιέργειες φυγοκεντρήθηκαν για 15 λεπτά στις 6000 στροφές/λεπτό και αφού αποµακρύνθηκε το υπερκείµενο, το ίζηµα επαναδιαλύθηκε σε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση να προσαρµοστεί στα 1 x 10 8 CFU/mL. Για τη µέτρηση της συγκέντρωσης των βακτηριακών κυττάρων, µετρήθηκε µακροσκοπικά ο αριθµός των αποικιών και εκφράσθηκε σε αριθµό βιώσιµων αναπαραγωγικών µονάδων (Colony Forming Units, CFU) ανά ml υγρής καλλιέργειας (CFU/mL), όπως περιγράφεται στην παράγραφο Για την παραγωγή µολύσµατος FORL, τέσσερα κυκλικά εµβόλια υποστρώµατος µε µυκήλιο, από την περιφέρεια αναπτυσσόµενων αποικιών (7 ηµερών) σε PDA, διαµέτρου 5 mm, µεταφέρθηκαν µε τη βοήθεια ενός φελλοτρυπητή (cork-borer), (Εικόνα 2.4) σε φιάλες που περιείχαν 250 ml υγρού θρεπτικoύ υποστρώµατος CDB. Στη συνέχεια, οι κωνικές φιάλες επωάστηκαν στους 28 o C σε αναδευτήρα (150 στροφές/λεπτό) για τρεις ηµέρες. Μετά την διήθηση του αιωρήµατος µε ειδικό αποστειρωµένο τουλουπάνι (miracloth, Calbiochem, USA), η συγκέντρωση των σπορίων µετρήθηκε σε οπτικό µικροσκόπιο µε τη βοήθεια αιµατοκυτταροµέτρου. Εικόνα 2.4 Μεταφορά εµβολίων µε τη βοήθεια φελλοτρυπητή (cork-borer) Ανάπτυξη φυτικού υλικού Σε όλα τα in planta πειράµατα χρησιµοποιήθηκαν φυτά τοµάτας (Lycopersicon esculentum Mill.), ποικιλίας ACE 55, η οποία είναι ευπαθής στην προσβολή από το φυτοπαθογόνο µύκητα FORL (Τζελέπης, 2008). Οι σπόροι 72

79 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι απολυµάνθηκαν επιφανειακά µε εµβάπτιση σε διάλυµα υποχλωριώδους νατρίου 5% (v/v) για 5 λεπτά. Μετά το πέρας των 5 λεπτών, οι σπόροι ξεπλύθηκαν τρεις φορές ανά 20 λεπτά σε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό. Στη συνέχεια, οι απολυµασµένοι σπόροι τοποθετήθηκαν σε τρυβλία Petri τα οποία περιείχαν διηθητικό χαρτί σε θάλαµο κάθετης νηµατικής ροής (laminar flow cabinet) για να στεγνώσουν. Οι σπόροι της τοµάτας σπάρθηκαν σε πλαστικά φυτοδοχεία (8 x 8 cm) που περιείχαν 5:1 µείγµα τύρφης και περλίτη σε βάθος περίπου 2 cm. Σε κάθε φυτοδοχείο τοποθετήθηκε 1 σπόρος. Τα φυτά αναπτύσσονταν σε συνθήκες εργαστηρίου στους 25 ο C, φωτοπερίοδο 14 ωρών και ποτίζονταν τρεις περίπου φορές την εβδοµάδα µε συγκεκριµένο όγκο νερού. Πραγµατοποιήθηκαν δύο χρονικές επαναλήψεις µε 20 φυτά ανά επέµβαση In vitro αλληλεπιδράσεις µεταξύ των στελεχών PGPR και του φυτοπαθογόνου µύκητα Οι in vitro δοκιµές πραγµατοποιήθηκαν σε τρυβλία Petri µε θρεπτικό υπόστρωµα PDA και περιελάµβαναν διπλές καλλιέργειες µεταξύ του βιολογικού παράγοντα και του φυτοπαθογόνου µύκητα, προκειµένου να µελετηθεί η δράση που ασκεί στη µυκηλιακή ανάπτυξη του µύκητα. Οι διπλές καλλιέργειες πραγµατοποιήθηκαν µε εµβολιασµό ενός στελέχους PGPR και του παθογόνου σε αντιδιαµετρικά σηµεία του τρυβλίου, σε απόσταση περίπου 10 mm από την περιφέρεια του τρυβλίου. Τα βακτηριακά στελέχη επιστρώθηκαν στην επιφάνεια του στερεού υποστρώµατος σε µορφή γραµµής, λαµβάνοντας µια ποσότητα βακτηριακών κυττάρων µε τη βοήθεια κρίκου εµβολιασµού από νεαρές καλλιέργειες σε TSB. Τα τρυβλία εµβολιάσθηκαν µε κυκλικά (5 mm) εµβόλια υποστρώµατος µε µυκήλιο του µύκητα, από την περιφέρεια νεαρών αποικιών σε PDA. Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 25 ο C, στο σκοτάδι, για δέκα ηµέρες. Τρυβλία που αναπτύσσονταν µόνο ο παθογόνος µύκητας, χωρίς την παρουσία PGPR στελέχους, χρησιµοποιήθηκαν ως αρνητικός µάρτυρας. Κάθε µεταχείριση (συνδυασµός παθογόνου- στελέχους PGPR) αποτελούταν από πέντε τρυβλίαεπαναλήψεις και το πείραµα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Μετά την ολοκλήρωση της επώασης, µετρήθηκε η µυκηλιακή ανάπτυξη του µύκητα (διάµετρος, mm) και η ποσοστιαία αναστολή (%) της αύξησης προσδιορίστηκε από την εξίσωση: Αναστολή (%) = [1 (µυκηλιακή ανάπτυξη/αρνητικός µάρτυρας)] x 100 (Baysal 73

80 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι et al., 2008). Η ανταγωνιστική δράση προσδιορίστηκε µετρώντας τη ζώνη αναστολής (mm) µεταξύ του παθογόνου µύκητα και των βακτηριακών στελεχών In vitro βιοδοκιµές ευαισθησίας του παθογόνου στα εµπορικά σκευάσµατα Tachigaren 36% SL και Bion 50% WG Κατά την εκτέλεση in vitro δοκιµών, προσδιορίσθηκε η επίδραση των σκευασµάτων Tachigaren (hymexazol, 36% SL, Χελλαφάρµ Α.Ε.) και Bion (acibenzolar-s-methyl, 50% WG, Syngenta S.A.) στη µυκηλιακή ανάπτυξη του µύκητα FORL. Τα σκευάσµατα διαλύθηκαν σε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό και παρασκευάσθηκαν πυκνά διαλύµατα (stock solutions). Οι βιοδοκιµές έγιναν σε θρεπτικά υποστρώµατα PDA, µετά από προσθήκη κατάλληλων όγκων πυκνών διαλυµάτων, σε διάφορες συγκεντρώσεις (0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 200 µg/ml hymexazol και 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 250, 500 µg/ml acibenzolar-smethyl). Στο µάρτυρα δεν γινόταν προσθήκη µυκητοκτόνου. Τα θρεπτικά υποστρώµατα παρασκευάσθηκαν µία ηµέρα πριν την εκτέλεση των βιοδοκιµών. Κυκλικά εµβόλια (5 mm) µεταφέρθηκαν από την περιφέρεια αναπτυσσόµενων αποικιών (7 ηµερών) στα θρεπτικά υποστρώµατα που περιείχαν τα µυκητοκτόνα και στους µάρτυρες. Τα εµβόλια τοποθετήθηκαν ανεστραµµένα στο κέντρο των τρυβλίων Petri, έτσι ώστε το µυκήλιο να εφάπτεται στο υπόστρωµα. Στη συνέχεια, τα τρυβλία επωάστηκαν στους 28 ο C, για 7 ηµέρες, σε συνθήκες σκότους. Σε κάθε συγκέντρωση χρησιµοποιήθηκαν 5 τρυβλία και το πείραµα επαναλήφθηκε 2 φορές. Μετά την ολοκλήρωση της επώασης, µετρήθηκε η διάµετρος (mm) των αποικιών σε κάθε συγκέντρωση και στη συνέχεια η µέση τιµή των διαµέτρων εκφράσθηκε σε εκατοστιαία αναλογία ως προς τη µέση τιµή του µάρτυρα. Με τον τρόπο αυτό υπολογίσθηκε η σχετική αύξηση (Relative Growth, RG) του µύκητα σε κάθε συγκέντρωση και έπειτα έγινε ο υπολογισµός της σχετικής αναστολής (Relative Inhibition, RI) της αύξησης µε τη βοήθεια της εξίσωσης: RI (%) = (100 RG) %. Η σχετική αναστολή σε κάθε συγκέντρωση των µυκητοκτόνων που µελετήθηκαν, χρησιµοποιήθηκε για τον υπολογισµό των τιµών EC

81 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι οκιµές επίδρασης των PGPR στην προαγωγή της ανάπτυξης και αντιµετώπιση του µύκητα FORL στην τοµάτα Στην παρούσα δοκιµή µελετήθηκε η επίδραση των στελεχών PGPR στην προαγωγή της ανάπτυξης φυτών τοµάτας και στην καταπολέµηση του εδαφογενούς µύκητα FORL. Συνολικά πραγµατοποιήθηκαν δύο εφαρµογές µε τα ριζοβακτήρια. Η πρώτη εφαρµογή έγινε αµέσως µετά τη σπορά ριζοποτίζοντας κάθε γλαστράκι µε 10 ml (1 x 10 8 CFU/mL) αιωρήµατος βακτηριακών κυττάρων. Η δεύτερη εφαρµογή πραγµατοποιήθηκε 20 ηµέρες αργότερα, στο δεύτερο πραγµατικό φύλλο, µε ριζοπότισµα κάθε φυτού τοµάτας µε 50 ml βακτηριακού αιωρήµατος (1 x 10 8 CFU/mL). Οι τέσσερις βιολογικοί παράγοντες εφαρµόστηκαν µεµονωµένα και σε όλους τους δυνατούς συνδυασµούς ανά δύο. Για τις συνδυασµένες εφαρµογές, αναµίχθηκαν ίσοι όγκοι από τα αιωρήµατα των δύο βακτηρίων συγκέντρωσης 1 x 10 8 CFU/mL. Στο µάρτυρα πραγµατοποιήθηκε ριζοπότισµα µε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό. Η µόλυνση των φυτών τοµάτας µε τον φυτοπαθογόνο µύκητα FORL έγινε όταν τα σπορόφυτα ήταν 4 εβδοµάδων. Μετά την παραγωγή άφθονου µολύσµατος του παθογόνου (όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 2.2.2) η εφαρµογή πραγµατοποιήθηκε ριζοποτίζοντας κάθε φυτό τοµάτας µε 10 ml διαλύµατος κονιδίων συγκέντρωσης 5 x 10 5 κονίδια/ml. Οι µάρτυρες δέχτηκαν µεταχείριση µε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό οκιµές επίδρασης της συνδυασµένης εφαρµογής PGPR και γεωργικών φαρµάκων στην καταπολέµηση του FORL στην τοµάτα Στη δοκιµή αυτή αξιολογήθηκε η εφαρµογή των acibenzolar-s-methyl (Bion 50% WG, Syngenta S.A.) και hymexazol (Tachigaren 36% SL, Χελλαφάρµ Α.Ε.) στην αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης του µύκητα FORL στην τοµάτα. Τα µυκητοκτόνα εφαρµόστηκαν ξεχωριστά αλλά και σε όλους τους δυνατούς συνδυασµούς µε κάθε ένα από τα τέσσερα PGPR. Η εφαρµογή των βιολογικών παραγόντων και η µόλυνση των φυτών τοµάτας µε το παθογόνο έγιναν όπως ακριβώς περιγράφεται στην προηγούµενη παράγραφο. Τα σκευάσµατα διαλύθηκαν σε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό πριν χρησιµοποιηθούν και παρασκευάσθηκαν πυκνά διαλύµατα. Η εφαρµογή των 75

82 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι µυκητοκτόνων έγινε µε ριζοπότισµα των σποροφύτων µε 50 ml διαλύµατος acibenzolar-s-methyl (28 µg/ml) ή hymexazol (0.8 µg/ml) ανά φυτοδοχείο, 5 ηµέρες πριν τον εµβολιασµό του παθογόνου. Οι συγκεντρώσεις που χρησιµοποιήθηκαν αντιστοιχούν στις συνιστώµενες δόσεις αγρού των ουσιών. Οι µάρτυρες δέχτηκαν µεταχείριση µε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό. Χρησιµοποιήθηκε το πειραµατικό σχέδιο των πλήρως τυχαιοποιηµένων οµάδων, µε 20 φυτά ανά επέµβαση και δύο χρονικές επαναλήψεις οκιµές επιβίωσης και ικανότητας αποικισµού των PGPR στο ριζικό σύστηµα της τοµάτας σε σύστηµα ελεγχόµενων συνθηκών (gnotobiotic) Σε αυτές τις δοκιµές µελετήθηκε η επιβίωση των στελεχών PGPR στο έδαφος και η ικανότητα αποικισµού του ριζικού συστήµατος της τοµάτας σε σύστηµα ελεγχόµενων συνθηκών (gnotobiotic). Το σύστηµα gnotobiotic που χρησιµοποιήθηκε, ήταν παραλλαγή αυτού που περιγράφηκε από τον Τζελέπη (2008). Έδαφος αγρού αποστειρώθηκε σε αυτόκαυστο στους C, υπό πίεση 1 atm, τρεις διαδοχικές ηµέρες, για 60 λεπτά η κάθε µία (Benimeli et al., 2008). Τα αιωρήµατα των βακτηριακών κυττάρων παρασκευάστηκαν από ολονύχτιες καλλιέργειες σε TSB (όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 2.2.2) και ενσωµατώθηκαν, ξεχωριστά το κάθε στέλεχος, στο αποστειρωµένο έδαφος (ph 7.7, άµµος 35.6%, ιλύς 24,8% και άργιλος 39.6%), έτσι ώστε η τελική πυκνότητα του βακτηριακού πληθυσµού να είναι 2 x 10 7 CFU/g εδάφους. Ακολούθησε ήπια αναµόχλευση του εδάφους, σε ασηπτικές συνθήκες, για οµοιόµορφη κατανοµή του εµβολίου. Στο µάρτυρα εφαρµόστηκε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό. Στη συνέχεια, τα δείγµατα εδάφους που είχαν εµβολιαστεί µε στελέχη PGPR καθώς και ο µάρτυρας τοποθετήθηκαν σε αποστειρωµένους γυάλινους κυλινδρικούς σωλήνες ύψους 20 cm και εσωτερικής διαµέτρου 2.5 cm. Το άνοιγµα του σωλήνα σφραγίστηκε µε ανυδρόφιλο βαµβάκι και καλύφθηκε µε αλουµινόχαρτο. Μία σειρά σωλήνων χρησιµοποιήθηκε για µέτρηση του βακτηριακού πληθυσµού στο έδαφος και µια ακόµη για προσδιορισµό της ικανότητας αποικισµού των PGPR στο ριζικό σύστηµα της τοµάτας. Στις δοκιµές αποικισµού ένας σπόρος τοµάτας (ποικιλία ACE 55) σπάρθηκε σε κάθε σωλήνα υπό ασηπτικές συνθήκες, σε βάθος περίπου 2 cm, αφού προηγουµένως είχε αποστειρωθεί επιφανειακά σε διάλυµα υποχλωριώδους νατρίου. Η επώαση πραγµατοποιήθηκε σε αυτό το αποµονωµένο σύστηµα για 28 ηµέρες, σε θάλαµο 76

83 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι ανάπτυξης (22-25 ο C, 70% σχετική υγρασία, 12 h φωτοπερίοδο). Σε κάθε επέµβαση χρησιµοποιήθηκαν 10 σωλήνες Μετρήσεις έντασης της ασθένειας και προαγωγής της ανάπτυξης Στις δοκιµές προαγωγής της ανάπτυξης προσδιορίσθηκε η επίδραση των τεσσάρων PGPR, εφαρµοζόµενων µεµονωµένα και σε όλους τους δυνατούς συνδυασµούς ανά δύο, σε διάφορα χαρακτηριστικά ανάπτυξης των φυτών. Συγκεκριµένα µετρήθηκε το ύψος βλαστού, το νωπό βάρος βλαστού και το ξηρό βάρος βλαστού στο τέλος του χρόνου επώασης. Για τη µέτρηση του ξηρού βάρους, οι φυτικοί ιστοί ξεράθηκαν στους 60 ο C για 72 ώρες και στη συνέχεια ζυγίστηκαν. Οι µετρήσεις έντασης της ασθένειας έγιναν 15 ηµέρες µετά τη µόλυνση των φυτών µε το παθογόνο. Τα φυτά αφαιρέθηκαν από τα γλαστράκια και µετά από καλό πλύσιµο της ρίζας κάτω από τρεχούµενο νερό βρύσης παρατηρήθηκαν µακροσκοπικά τα συµπτώµατα στην περιοχή του λαιµού και της ρίζας. Τα συµπτώµατα ανάλογα µε τη σοβαρότητά τους κατηγοριοποιήθηκαν σε κλίµακα ασθένειας που κυµαινόταν από 0 έως 3, όπου 0 = φυτά υγιή ή φαινοµενικά υγιή, 1 = ελαφρά ή µέτρια σήψη σε κύρια και δευτερεύουσες ρίζες, 2 = έντονη σήψη σε κύρια και δευτερεύουσες ρίζες, 3 = νεκρά φυτά (Vakalounakis and Fragkiadakis, 1999). Από τα φαινοµενικά υγιή φυτά έγιναν αποµονώσεις του παθογόνου για να διαπιστωθεί η απουσία µόλυνσης. Το επί τοις εκατό ποσοστό προσβολής (Disease Index, DI%) προσδιορίσθηκε από την εξίσωση: DI% = [(0 x a + 1 x b + 2 x c + 3 x d)/3 x n] x 100 όπου a, b, c and d ο αριθµός των φυτών µε δείκτες ασθένειας 0, 1, 2 και 3, αντίστοιχα, και n το σύνολο των φυτών (n = a + b + c + d) Μετρήσεις βακτηριακών πληθυσµών Η παρακολούθηση του πληθυσµού των βακτηριακών στελεχών στο έδαφος, στο σύστηµα gnotobiotic πραγµατοποιήθηκε µε τη βοήθεια διαδοχικών αραιώσεων και µακροσκοπικής παρατήρησης των αποικιών σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA σε 0, 7, 14, 21, και 28 ηµέρες επώαση. Για το σκοπό αυτό, µεταφέρθηκαν δείγµατα εδάφους του 1 g από κάθε γυάλινο σωλήνα σε αποστειρωµένη κωνική φιάλη (50 ml) που περιείχε 9 ml διαλύµατος εξαµεταφωσφορικού νατρίου (NaPO 3 ) 6 (1.66 g/l, ph 7). Μετά από ανάδευση 77

84 Κεφάλαιο 2 Υλικά και Μέθοδοι στις 150 στροφές/λεπτό για 1 ώρα, ακολούθησαν 1:10 διαδοχικές αραιώσεις και 0.1 ml από τις αραιώσεις εµβολιάστηκαν και επιστρώθηκαν σε τρυβλία Petri που περιείχαν στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA εις τριπλούν. Τα τρυβλία µεταφέρθηκαν σε θάλαµο επώασης και επωάστηκαν στους 30 o C για 48 h. Κατόπιν µετρήθηκε µακροσκοπικά ο αριθµός των αποικιών και εκφράσθηκε σε CFU/g. Ο υπολογισµός του αποικισµού του ριζικού συστήµατος έγινε σε εβδοµαδιαία διαστήµατα µέχρι τις πρώτες 4 εβδοµάδες από τη σπορά από το ακραίο τµήµα της ρίζας (1 cm) µε τη µέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων και εκφραζόταν σε CFU/cm ρίζας (Bardas et al., 2009; Simons et al., 1996) Επεξεργασία δεδοµένων Για τον έλεγχο της οµοιογένειας της διακύµανσης των δεδοµένων µεταξύ των επαναλήψεων χρησιµοποιήθηκε η δοκιµή Levene. Επειδή δεν βρέθηκε σηµαντική αλληλεπίδραση µεταξύ των επεµβάσεων και του χρόνου πραγµατοποίησης των πειραµάτων, παρουσιάζονται οι µέσοι όροι των δύο χρονικών επαναλήψεων του κάθε πειράµατος. Η επεξεργασία των δεδοµένων από τα πειράµατα καταπολέµησης βασίστηκε στην ανάλυση παραλλακτικότητας (One-way ANOVA) σύµφωνα µε το πειραµατικό σχέδιο των πλήρως τυχαιοποιηµένων οµάδων. Οι διαφορές µεταξύ των επεµβάσεων αξιολογήθηκαν µε το κριτήριο Duncan σε επίπεδο σηµαντικότητας P = Η σύγκριση των βακτηριακών πληθυσµών έγινε µε τη δοκιµή Student's t-test. Η στατιστική επεξεργασία των δεδοµένων έγινε µε τη χρήση του προγράµµατος στατιστικής ανάλυσης SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, USA). Η EC 50 εκφράζει την συγκέντρωση του µυκητοκτόνου η οποία προκαλεί αναστολή κατά 50% σε κάποια φυσιολογική λειτουργία του µύκητα. Στην παρούσα µελέτη, οι τιµές EC 50 υπολογίσθηκαν µε κριτήριο την αναστολή της µυκηλιακής ανάπτυξης του µύκητα που επέφεραν τα υπό εξέταση µηκητοκτόνα. Ο υπολογισµός έγινε µε τη βοήθεια του προγράµµατος στατιστικής ανάλυσης JMP (JMP, SAS Institute, Inc, Cary, NC, USA), µε συσχέτιση των λογαριθµοποιηµένων συγκεντρώσεων των µυκητοκτόνων που δοκιµάστηκαν µε τις αντίστοιχες τιµές σχετικής αναστολής της αύξησης που επέφεραν στο µύκητα (Myresiotis et al., 2007). 78

85 Κεφάλαιο 2 Αποτελέσµατα 2.3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αλληλεπιδράσεις µεταξύ των στελεχών PGPR και του φυτοπαθογόνου µύκητα in vitro Όταν ο φυτοπαθογόνος µύκητας αναπτυσσόταν στο τρυβλίο χωρίς την παρουσία PGPR στελέχους (µάρτυρας), το µυκήλιο είχε καταλάβει σχεδόν ολόκληρη την επιφάνεια του τρυβλίου στο τέλος της πειραµατικής δοκιµής (84 mm µέση διάµετρος). Τα στελέχη B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03 µείωσαν στατιστικώς σηµαντικά τη διάµετρο των αποικιών του παθογόνου κατά 54% και 38%, αντίστοιχα, στα τρυβλία των διπλών καλλιεργειών (Πίνακας 2.2). Αντιθέτως, τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34 δεν επηρέασαν σηµαντικά την µυκηλιακή ανάπτυξη του φυτοπαθογόνου µύκητα, µε αποτέλεσµα οι µέσοι όροι των διαµέτρων των αποικιών να εµφανίζουν τιµές 82 και 81 mm, αντίστοιχα. Η ανασταλτική δράση των βακτηρίων B. subtilis FZB24 και GB03 στην ανάπτυξη του παθογόνου παρατηρήθηκε µέχρι το τέλος του χρόνου επώασης. Το στέλεχος B. subtilis FZB24 ήταν ισχυρά ανταγωνιστικό έναντι του µύκητα FORL και σχηµατίστηκε ζώνη αναστολής µεγαλύτερη από 10 mm µεταξύ των δύο αποικιών. Μεταξύ του βακτηριακού στελέχους B. subtilis GB03 και του FORL η ζώνη αναστολής που δηµιουργήθηκε ήταν < 10 mm (Πίνακας 2.2) In vitro ευαισθησία του µύκητα FORL στα εµπορικά σκευάσµατα Tachigaren 36% SL και Bion 50% WG Μετά την in vitro έκθεση του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicislycopersici σε διάφορες συγκεντρώσεις των µυκητοκτόνων acibenzolar-smetrhyl και hymexazol, µετρήθηκε η διάµετρος (mm) των αποικιών σε κάθε συγκέντρωση και από τον υπολογισµό της αναστολής της µυκηλιακής αύξησης του παθογόνου, προσδιορίστηκαν οι τιµές EC 50. Το µυκητοκτόνο ASM δεν επηρέασε την in vitro µυκηλιακή αύξηση του µύκητα (EC 50 >500 µg/ml), καθώς δεν παρατηρήθηκε καµία αναστολή της αύξησης του µυκηλίου ακόµη και στην υψηλότερη δόση που δοκιµάστηκε (500 µg/ml). Αντιθέτως, ο µύκητας FORL παρουσίασε αρκετά µεγάλη ευαισθησία στο µυκητοκτόνο hymexazol µε τιµή EC µg/ml. 79

86 Κεφάλαιο 2 Αποτελέσµατα Πίνακας 2.2 In vitro επίδραση των PGPR στη µυκηλιακή ανάπτυξη του µύκητα F. oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (FORL) σε διπλές καλλιέργειες σε PDA. Επέµβαση a ιάµετρος Αναστολή ιάµετρος ζώνης αποικιών (mm) (%) αναστολής (mm) Control (FORL) 84a b 0a IN937a + FORL 82a 2a - c SE34 + FORL 81a 4a - FZB24 + FORL 39c 54c ++ GB03 + FORL 52b 38b + a Control = FORL, IN937a = B. amyloliquefaciens, SE34 = B. pumilus, FZB24 = B. subtilis (FZB24 ), GB03 = B. subtilis (Companion ). b Τιµές εντός των στηλών που ακολουθούνται από το ίδιο γράµµα δεν διαφέρουν σηµαντικά µεταξύ τους σύµφωνα µε το κριτήριο Duncan (P = 0.05). c ιάµετρος ζώνης αναστολής (mm) µεταξύ του µυκηλίου του µύκητα FORL και των PGPR σε τρυβλία µε PDA. όχι σχηµατισµός ζώνης αναστολής µεταξύ PGPR και FORL, + ζώνη αναστολής < 10 mm, + + ζώνη αναστολής > 10 mm (Zhang et al., 2010) Επίδραση των επεµβάσεων PGPR στην προαγωγή της ανάπτυξης φυτών τοµάτας Η επίδραση των βακτηριακών στελεχών στην ανάπτυξη των φυτών τοµάτας εκφράστηκε αριθµητικά µε τη µέτρηση συγκεκριµένων βιολογικών χαρακτηριστικών ανάπτυξης των φυτών (µήκος βλαστού, νωπό βάρος βλαστού, ξηρό βάρος βλαστού), (Πίνακας 2.3). Κάθε ένα από τα παραπάνω χαρακτηριστικά ανάπτυξης αυξήθηκαν στατιστικώς σηµαντικά (P < 0.05) υπό την επίδραση των βακτηριακών µεταχειρίσεων, σε σύγκριση µε τα φυτά στα οποία δεν εφαρµόστηκαν καθόλου τα συγκεκριµένα βακτηριακά στελέχη. Συγκεκριµένα, µήκος βλαστού, νωπό και ξηρό βάρος βλαστού αυξήθηκαν σε όλες τις επεµβάσεις 18-57%, 22-55% και 23-78%, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε το µάρτυρα. Στις συνδυασµένες επεµβάσεις, η αύξηση κυµαινόταν από 18 έως 25% στο µήκος βλαστού, 22 έως 26% στο νωπό βάρος βλαστού και 22 έως 44% στο ξηρό βάρος βλαστού, συγκρινόµενα µε τα φυτά στα οποία δεν εφαρµόσθηκε κάποιο βακτηριακό στέλεχος. Η αύξηση που παρατηρήθηκε στο µήκος βλαστού και στο νωπό βάρος βλαστού υπό την επίδραση του µίγµατος των ριζοβακτηρίων 80

87 Κεφάλαιο 2 Αποτελέσµατα ήταν µικρότερη από εκείνη που επιτεύχθηκε από τη µεµονωµένη εφαρµογή. Από όλες τις επεµβάσεις, φυτά που δέχτηκαν µεταχείριση µε το βακτηριακό στέλεχος B. pumilus SE34 παρουσίασαν την πιο σηµαντική αύξηση στα τρία χαρακτηριστικά ανάπτυξης που µετρήθηκαν. Πίνακας 2.3 Επίδραση των στελεχών PGPR, εφαρµοζόµενων µεµονωµένα ή σε συνδυασµό ανά δύο, σε χαρακτηριστικά ανάπτυξης φυτών τοµάτας cv. ACE 55. Επέµβαση a Μήκος βλαστού (cm) b Νωπό βάρος βλαστού (g) b Ξηρό βάρος βλαστού (g) b Control 9.94a c 1.16a 0.09a IN937a 14.47c 1.65c 0.14de SE d 1.80d 0.16f FZB c 1.61c 0.14cde GB cd 1.66c 0.15e IN937a + SE b 1.45b 0.12bc IN937a + FZB b 1.42b 0.11b IN937a + GB b 1.42b 0.11b SE34 + FZB b 1.43b 0.12bcd SE34 + GB b 1.44b 0.13bcd FZB24 + GB b 1.46b 0.12bc a Control = φυτά χωρίς βακτηριακή επέµβαση, IN937a = B. amyloliquefaciens, SE34 = B. pumilus, FZB24 = B. subtilis (FZB24 ), GB03 = B. subtilis (Companion ). b Μέσες τιµές δύο επαναλήψεων µε 20 φυτά ανά επέµβαση. c Τιµές εντός των στηλών που ακολουθούνται από διαφορετικά γράµµατα διαφέρουν στατιστικώς σηµαντικά µεταξύ τους σύµφωνα µε το κριτήριο Duncan (P = 0.05). 81

88 Κεφάλαιο 2 Αποτελέσµατα Επίδραση της απλής και συνδυασµένης εφαρµογής PGPR στην αντιµετώπιση του µύκητα FORL στην τοµάτα Η ένταση της ασθένειας των φυτών µειώθηκε σηµαντικά σε όλες τις επεµβάσεις µε τα PGPR σε σχέση µε το µάρτυρα, µε εξαίρεση τα φυτά που δέχτηκαν µεταχείριση µε το στέλεχος B. amyloliquefaciens IN937a (Εικόνα 2.5). Τα ποσοστά προσβολής (%) σε φυτά που εφαρµόστηκαν µεµονωµένα τα στελέχη B. subtilis GB03, B. subtilis FZB24 και B. pumilus SE34 ήταν 50%, 73% και 87%, αντίστοιχα. Οι τιµές αυτές είναι σηµαντικά µικρότερες (P<0.05) από το 97% που µετρήθηκε σε φυτά του µάρτυρα. Η απλή εφαρµογή B. amyloliquefaciens IN937a δεν παρουσίασε σηµαντική διαφορά (P>0.05) ως προς την ένταση της ασθένειας σε σχέση µε το µάρτυρα. Από τις συνδυασµένες επεµβάσεις, η µεταχείριση B. amyloliquefaciens IN937a+B. subtilis GB03 παρουσίασε τη µεγαλύτερη µείωση της ασθένειας (60%), ακολουθούµενη από τις B. subtilis FZB24+B. subtilis GB03 και B. pumilus SE34+B. subtilis GB03 µε 40% και 33% µείωση, αντίστοιχα. Εντούτοις, αξίζει να αναφερθεί ότι η αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης στις περισσότερες συνδυασµένες εφαρµογές ήταν παρόµοια ή ακόµη και µικρότερη σε σύγκριση µε την απλή εφαρµογή ριζοβακτηρίων. Μόνο οι επεµβάσεις B. amyloliquefaciens IN937a+B. subtilis GB03 και B. amyloliquefaciens IN937a+B. pumilus SE34 παρουσίασαν αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης υψηλότερη από αυτή που επιτεύχθηκε από το κάθε βακτηριακό στέλεχος χωριστά Επίδραση της συνδυασµένης εφαρµογής PGPR και γεωργικών φαρµάκων στην καταπολέµηση του FORL στην τοµάτα Το ASM όταν εφαρµόστηκε µόνο του µείωσε σηµαντικά την ασθένεια ως προς το µάρτυρα, ωστόσο το ποσοστό προσβολής ήταν πολύ υψηλό (87%). Φυτά τοµάτας που υπέστησαν µεταχείριση µε το ASM συνδυασµό µε τα PGPR παρουσίασαν σηµαντικά µικρότερα ποσοστά προσβολής σε σχέση µε το θετικό µάρτυρα (97%) σε όλες τις επεµβάσεις. Εντούτοις, η αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης που επιτεύχθηκε ήταν στις περισσότερες περιπτώσεις σχετικά µικρή. Η µεγαλύτερη µείωση της ασθένειας πραγµατοποιήθηκε από τη συνδυασµένη εφαρµογή ASM και B. subtilis GB03 (Πίνακας 2.4). Φυτά στα οποία έγινε απλή εφαρµογή µε το µυκητοκτόνο hymexazol παρουσίασαν ποσοστό προσβολής (53%) σηµαντικά χαµηλότερο (P<0.05) συγκρινόµενα µε το 82

89 Κεφάλαιο 2 Αποτελέσµατα Disease index (%) g fg ef d b d d a de c bc 0 Control IN937a SE34 FZB24 GB03 IN937a + SE34 IN937a + FZB24 IN937a + GB03 SE34 + FZB24 SE34 + GB03 FZB24 + GB03 PGPR στέλεχος Εικόνα 2.5 Επίδραση της απλής και συνδυασµένης εφαρµογής PGPR στη βιολογική καταπολέµηση του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (FORL) σε φυτά τοµάτας cv. ACE 55. Control = φυτά χωρίς βακτηριακή µεταχείριση, IN937a = Bacillus amyloliquefaciens, SE34 = Bacillus pumilus, FZB24 = Bacillus subtilis (FZB24 ), GB03 = Bacillus subtilis (Companion ). ιαφορετικά γράµµατα υποδηλώνουν στατιστικώς σηµαντική διαφορά σύµφωνα µε το κριτήριο Duncan (P = 0.05). Οι κάθετες γραµµές αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου. µάρτυρα (Πίνακας 2.4). Επιπλέον, όλες οι συνδυασµένες επεµβάσεις του hymexazol µε τα PGPR παρουσίασαν σηµαντικά µικρότερα ποσοστά προσβολής σε σύγκριση µε την απλή εφαρµογή PGPR. Το µυκητοκτόνο hymexazol, εφαρµοζόµενο µόνο του ή σε συνδυασµό µε τα PGPR, παρουσίασε σηµαντικά µικρότερα ποσοστά προσβολής σε σχέση µε τις αντίστοιχες επεµβάσεις του ASM. Από όλες τις επεµβάσεις, το µικρότερο ποσοστό προσβολής (33%) παρουσίασαν φυτά που δέχτηκαν µεταχείριση µε hymexazol και το βιολογικό παράγοντα B. subtilis GB03 (Πίνακας 2.4). 83

90 Κεφάλαιο 2 Αποτελέσµατα Πίνακας 2.4 Καταπολέµηση του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici σε φυτά τοµάτας (cv. ACE55), µετά από απλή εφαρµογή PGPR ή σε συνδυασµό µε τα µυκητοκτόνα acibenzolar-s-methyl και hymexazol. Επέµβαση a Εµφάνιση ασθένειας b Ένταση ασθένειας c Ποσοστό προσβολής (%) Control g d ASM f H b IN937a fg IN937a + ASM ef IN937a + H de SE f SE34 + ASM ef SE34 + H bc FZB e FZB24 + ASM de FZB24 + H cd GB b GB03 + ASM b GB03 + H a a Control = φυτά που δέχτηκαν µόνο την επέµβαση του FORL, ASM = acibenzolar-s-methyl, H = hymexazol, IN937a = B. amyloliquefaciens, SE34 = B. pumilus, FZB24 = B. subtilis (FZB24 ), GB03 = B. subtilis (Companion ). b Αριθµός προσβεβληµένων φυτών 15 ηµέρες µετά τον εµβολιασµό του παθογόνου. c Η ένταση της ασθένειας αξιολογήθηκε µε τη βοήθεια κλίµακας ασθένειας που κυµαίνονταν από 0-3 (Vakalounakis and Fragkiadakis, 1999). d Τιµές που ακολουθούνται από διαφορετικά γράµµατα διαφέρουν στατιστικώς σηµαντικά µεταξύ τους σύµφωνα µε το κριτήριο Duncan (P = 0.05). 84

91 Κεφάλαιο 2 Αποτελέσµατα Επιβίωση και ικανότητα αποικισµού των PGPR στο ριζικό σύστηµα της τοµάτας σε σύστηµα ελεγχόµενων συνθηκών (gnotobiotic) Ο υπολογισµός του αριθµού των βακτηρίων πραγµατοποιήθηκε µε τη βοήθεια διαδοχικών αραιώσεων, επίστρωσης και τελικής παρατήρησης των αποικιών σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA. Στις Εικόνες 2.6 και 2.7 παρουσιάζονται οι πληθυσµοί των βακτηριακών στελεχών, εφαρµοζόµενων µεµονωµένα, στο έδαφος και στο ακραίο τµήµα της ρίζας, αντίστοιχα, µετά από 0, 7, 14, 21, και 28 ηµέρες επώασης. Τα βακτηριακά στελέχη ενσωµατώθηκαν στο έδαφος σε αρχική συγκέντρωση περίπου 2.0 x 10 7 CFU/g εδάφους. Γενικά παρατηρήθηκε σηµαντική ικανότητα επιβίωσης στο έδαφος των PGPR στο χρονικό διάστηµα των µετρήσεων. Πιο συγκεκριµένα, οι πληθυσµοί των στελεχών B. amyloliquefaciens IN937a, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03 παρουσίασαν µικρή αλλά στατιστικώς σηµαντική (P<0.05) µείωση από αρχική συγκέντρωση 1.95 x 10 7, 2.10 x 10 7 και 2.20 x 10 7 CFU/g σε 1.39 x 10 7, 1.54 x 10 7 και 1.53 x 10 7 CFU/g, αντίστοιχα, µετά από 28 ηµέρες επώασης. Αντιθέτως, ο πληθυσµός του στελέχους B. pumilus SE34 παρέµεινε στο ίδιο επίπεδο σε σχέση µε την αρχική πυκνότητα πληθυσµού (P>0.05), (Εικόνα 2.6). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2.7, όλα τα PGPR που µελετήθηκαν παρουσίασαν υψηλή ικανότητα αποικισµού στο ακραίο τµήµα του ριζικού συστήµατος της τοµάτας. Τα δείγµατα συλλέγονταν σε εβδοµαδιαία διαστήµατα και εµφάνιζαν σε όλες τις περιπτώσεις βακτηριακούς πληθυσµούς σε επίπεδα πάνω από 10 5 CFU/cm ρίζας. Οι πληθυσµοί των στελεχών B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34 µειώθηκαν περίπου δύο λογαριθµικές τάξεις µεγέθους σε 28 ηµέρες επώαση, ενώ τα εµπορικά στελέχη B. subtilis FZB24 και GB03 εµφάνισαν µικρή µείωση του πληθυσµού τους. Παρόλα αυτά, το βακτηριακό στέλεχος B. subtilis GB03 φαίνεται να αποικίζει µε µεγαλύτερη αποτελεσµατικότητα το ακραίο τµήµα του ριζικού συστήµατος σε σύγκριση µε το B. subtilis FZB24, αφού παρουσίασε σηµαντικά υψηλότερες συγκεντρώσεις βακτηριακών κυττάρων (1.08 x 10 7 και 5.15 x 10 6 CFU/cm, αντίστοιχα), (Εικόνα 2.7). 85

92 Κεφάλαιο 2 Αποτελέσµατα Bacillus amyloliquefaciens IN937a Bacillus subtilis FZB24 Bacillus subtilis GB03 Bacillus pumilus SE34 CFU/g (x 10 7 ) a a a a a a a a a a a a a ab a a b b b a Χρόνος (ηµέρες) Εικόνα 2.6 Επιβίωση των PGPR στο έδαφος µετά από 28 ηµέρες επώαση. Τα PGPR ενσωµατώθηκαν µεµονωµένα σε αρχική συγκέντρωση περίπου 2.0 x 10 7 CFU/g εδάφους. Οι κάθετες γραµµές αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου. Τα διαφορετικά γράµµατα πάνω στις γραµµές υποδηλώνουν στατιστικώς σηµαντική διαφορά για το ίδιο στέλεχος στους διάφορους χρόνους δειγµατοληψίας σύµφωνα µε τη δοκιµή Student's t-test (P = 0.05). 1,0E+08 B. amyloliquefaciens IN937a B. pumilus SE34 B. subtilis FZB24 B. subtilis GB03 Log CFU/cm ρίζας 1,0E+06 1,0E+04 1,0E Χρόνος (ηµέρες) Εικόνα 2.7 Ικανότητα αποικισµού του ριζικού συστήµατος της τοµάτας από τα PGPR σε σύστηµα ελεγχόµενων συνθηκών (gnotobiotic). Η µέτρηση των βακτηρίων στο ακραίο τµήµα της ρίζας (1 cm) πραγµατοποιήθηκε µε τη βοήθεια διαδοχικών αραιώσεων και µακροσκοπικής παρατήρησης των αποικιών σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA. Οι κάθετες γραµµές αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου. 86

93 Κεφάλαιο 2 Συζήτηση Αποτελεσµάτων 2.4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Στην παρούσα µελέτη διερευνήθηκε η ικανότητα των στελεχών B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24 (FZB24 ) και GB03 (Companion ), εφαρµοζόµενων µεµονωµένα ή σε µίγµατα ανά δύο, σε συνδυασµό ή όχι µε γεωργικά φάρµακα, στην αντιµετώπιση του µύκητα F. oxysporum f.sp. radicis-lycopersici. Είναι µία από τις λίγες έρευνες που έχουν γίνει µε βιολογικούς παράγοντες του γένους Bacillus µε σηµαντική επίδραση στην αντιµετώπιση της σήψης του λαιµού και των ριζών της τοµάτας (Myresiotis et al., 2012a). Σε προγενέστερες έρευνες, οι Baysal et al. (2008) ανέφεραν σηµαντική µείωση της ασθένειας από τα στελέχη B. subtilis EU07 και B. subtilis QST713 (Serenade ), ενώ οι Benhamou et al. (1998) έδειξαν ότι το στέλεχος B. pumilus SE34, µεµονωµένα ή σε συνδυασµό µε χιτοζάνη, ανάστειλε την ανάπτυξη της ασθένειας. Από τα αποτελέσµατα της έρευνας προκύπτει ότι η απλή εφαρµογή των ριζοβακτηρίων µείωσε σηµαντικά την ένταση της ασθένειας, σε σχέση µε το µάρτυρα, µε εξαίρεση τα φυτά που δέχτηκαν µεταχείριση µε το στέλεχος B. amyloliquefaciens IN937a. Μεταξύ των στελεχών, τα εµπορικά B. subtilis στελέχη GB03 και FZB24 ήταν πιο αποτελεσµατικά από το B. pumilus SE34 στην καταπολέµηση της ασθένειας. Η υψηλότερη αποτελεσµατικότητα των B. subtilis GB03 και FZB24 θα µπορούσε να συσχετιστεί µε την ανασταλτική δράση των στελεχών έναντι του FORL που παρατηρήθηκε στις in vitro δοκιµές. Παρόλο που ο µηχανισµός δράσης αυτών των στελεχών δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως, η αναστολή αυτή οφείλεται πιθανώς στην παραγωγή αντιβιοτικών. ιάφορα B. subtilis στελέχη έχουν αναφερθεί πως παράγουν ένα ευρύ φάσµα µυκητοστατικών ουσιών, δραστικών έναντι πολλών φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών. Πρόκειται για αντιβιοτικά λιποπεπτίδια όπως ιτουρίνες Α-Ε, σουρφακτίνες και φενγκισίνες (Cazorla et al., 2007; Kinsella et al., 2009). Συγκεκριµένα, έχει διαπιστωθεί ότι τα στελέχη B. subtilis GB03 και B. subtilis FZB24 παράγουν αντιβιοτικά που ανήκουν στις ιτουρίνες και αναστέλλουν την ανάπτυξη πολλών εδαφογενών µικροοργανισµών (Brannen and Kenney, 1997; Kilian et al., 2000; Krebs et al., 1998). Σε αντίθεση τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34 δεν εµφάνισαν ανασταλτική δράση στην in vitro ανάπτυξη του µύκητα και συνεπώς η αντιβίωση δεν είναι ο κύριος µηχανισµός δράσης τους. Σε προηγούµενες έρευνες, η προστασία σε 87

94 Κεφάλαιο 2 Συζήτηση Αποτελεσµάτων διάφορες ασθένειες αποδόθηκε στην πρόκληση ISR από τα συγκεκριµένα στελέχη (Benhamou et al., 1998; Kloepper et al., 2004). Μέχρι τώρα, τα ριζοβακτήρια B. subtilis GB03 και B. subtilis FZB24 είχαν αναφερθεί ως βιολογικοί παράγοντες για τον επιτυχή έλεγχο εδαφογενών ασθενειών σε καλλιέργειες όπως το βαµβάκι και η φράουλα (Brannen and Kenney, 1997; Tahmatsidou et al., 2006), αλλά αυτή είναι η πρώτη αναφορά για προστασία από το µύκητα FORL στην τοµάτα. Η συνδυασµένη εφαρµογή B. amyloliquefaciens IN937a µε B. subtilis GB03 και B. pumilus SE34 προκάλεσε σηµαντικά µεγαλύτερη αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης της ασθένειας σε σχέση µε την απλή εφαρµογή των στελεχών. Στην επέµβαση B. amyloliquefaciens IN937a+B. subtilis GB03 η αυξηµένη αποτελεσµατικότητα µπορεί να οφείλεται στο συνδυασµό διαφορετικών µηχανισµών δράσης. Αντιθέτως, το B. subtilis GB03 εφαρµοζόµενο σε συνδυασµό µε B. pumilus SE34 ή B. subtilis FZB24 παρουσίασε αποτελεσµατικότητα παρόµοια έως και µικρότερη σε σύγκριση µε την απλή εφαρµογή B. subtilis GB03, γεγονός που υποδηλώνει ανταγωνιστική αλληλεπίδραση µεταξύ των στελεχών. Η εφαρµογή βιολογικών παραγόντων σε µείγµατα µπορεί να οδηγήσει σε µεγαλύτερη και ευρύτερη µείωση της έντασης µιας ασθένειας (Guetsky et al., 2001; Kloepper et al., 2004). Αυτό µπορεί να οφείλεται σε διαφορετικούς µηχανισµούς δράσης ή σε διαφορετικές θέσεις δράσης των PGPR στη ριζόσφαιρα (Raupach et al., 1998; Roberts et al., 2005). Ωστόσο, τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης έδειξαν ότι η ανάµειξη διαφορετικών στελεχών PGPR δεν οδηγεί πάντα σε υψηλότερη αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης. Ως εκ τούτου, η εφαρµογή µιας τέτοιας στρατηγικής προϋποθέτει την ακριβή γνώση των αλληλεπιδράσεων µεταξύ των µεµονωµένων βακτηριακών στελεχών. Η προαγωγή της ανάπτυξης των φυτών από ριζοσφαιρικά βακτήρια έχει αναφερθεί προγενέστερα σε διάφορες καλλιέργειες (Adesemoye et al., 2009; Bardas et al., 2009; Domenech et al., 2006; Vessey et al., 2003). Εντούτοις, ελάχιστα δεδοµένα είναι διαθέσιµα για την επίδραση των συγκεκριµένων στελεχών και των συνδυασµών τους στην προαγωγή της ανάπτυξης φυτών τοµάτας σε εργαστηριακές συνθήκες (Domenech et al., 2006). Στην παρούσα έρευνα, όλα τα χαρακτηριστικά ανάπτυξης που µετρήθηκαν αυξήθηκαν σηµαντικά υπό την επίδραση των βακτηριακών µεταχειρίσεων, σε σύγκριση µε 88

95 Κεφάλαιο 2 Συζήτηση Αποτελεσµάτων τα φυτά στα οποία δεν εφαρµόστηκαν καθόλου τα συγκεκριµένα βακτηριακά στελέχη. Ωστόσο, η προαγωγή της ανάπτυξης ποικίλλει σηµαντικά µεταξύ των επεµβάσεων. Η επέµβαση µε το στέλεχος Β. pumilus SE34 ήταν η πιο αποτελεσµατική και προκάλεσε την µεγαλύτερη αύξηση σε όλες τις παραµέτρους που µελετήθηκαν (µήκος βλαστού, νωπό βάρος βλαστού, ξηρό βάρος βλαστού). Όµως, όταν τα PGPR εφαρµόστηκαν συνδυασµένα, η επίδραση στην ανάπτυξη των φυτών ήταν µικρότερη σε σχέση µε την απλή εφαρµογή για ορισµένα χαρακτηριστικά ανάπτυξης, όπως το ύψος και το νωπό βάρος των βλαστών. Τα αποτελέσµατα αυτά δείχνουν ότι η ανταγωνιστική δράση µεταξύ των στελεχών ίσως να εκδηλώνεται και στην προαγωγή της ανάπτυξης. Ωστόσο, απαιτούνται ειδικά πειράµατα µε πρωτεωµική ανάλυση (proteomic analysis) του πρωτεϊνικού προφίλ του ξενιστή ώστε να διασαφηνιστούν τέτοιες αλληλεπιδράσεις (Kandasamy et al., 2009). Έχει διαπιστωθεί ότι ο αποικισµός της ριζόσφαιρας από τα PGPR είναι ιδιαίτερα σηµαντικός για την προαγωγή της ανάπτυξης και το βιολογικό έλεγχο φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών (Kloepper and Beauchamp, 1992). Η σχετικά µικρή αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης σε προγενέστερες έρευνες συχνά συσχετιζόταν µε τη µειωµένη ικανότητα αποικισµού των προστιθέµενων ριζοβακτηρίων (Benizri et al., 2001). Στην παρούσα έρευνα, µελετήθηκε η ικανότητα αποικισµού του ακραίου τµήµατος της ρίζας φυτών τοµάτας, συγκεκριµένων στελεχών PGPR του γένους Bacillus, µε παραλλαγή του συστήµατος gnotobiotic που περιγράφηκε από τον Τζελέπη (2008). Επίσης, προσδιορίστηκε η επιβίωση των στελεχών αυτών στο έδαφος. Τα δεδοµένα των πειραµατικών δοκιµών φανέρωσαν ότι η συγκέντρωση του στελέχους B. pumilus SE34 παρέµεινε στο ίδιο επίπεδο σε σχέση µε την αρχική πυκνότητα πληθυσµού που εµβολιάστηκε, ενώ οι πληθυσµοί των στελεχών B. amyloliquefaciens IN937a, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03 παρουσίασαν µικρή µείωση από την αρχική συγκέντρωση, µετά από 28 ηµέρες επώασης. Παρόµοια αποτελέσµατα αναφέρουν και οι Yan et al. (2003) για το PGPR στέλεχος B. pumilus SE34, το οποίο εφαρµοζόµενο σε διάφορες συγκεντρώσεις σε υπόστρωµα τύρφης-περλίτη-βερµικουλίτη, παρέµεινε στο αρχικό επίπεδο σε χρονικό διάστηµα 4 εβδοµάδων. Επιπλέον, από τα αποτελέσµατα προκύπτει υψηλή ικανότητα αποικισµού του ριζικού συστήµατος της τοµάτας από τα εµπορικά στελέχη B. subtilis FZB24 και GB03, µάλιστα το B. subtilis GB03 89

96 Κεφάλαιο 2 Συζήτηση Αποτελεσµάτων αποικίζει σε µεγαλύτερο βαθµό, ενώ οι πληθυσµοί των στελεχών B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34 µειώθηκαν περίπου δύο λογαριθµικές τάξεις µεγέθους κατά την επώαση. Σε ανάλογη έρευνα των Kinsella et al. (2009) διαπιστώθηκε µικρή µείωση του αρχικού πληθυσµού που εµβολιάστηκε, του εµπορικά διαθέσιµου PGPR στελέχους B. subtilis QST713, στη ριζόσφαιρα φυτών αγγουριάς κατά το χρόνο επώασης. Είναι σηµαντικό να αναφέρουµε ότι η ικανότητα αποικισµού της ριζόσφαιρας σε ελεγχόµενες συνθήκες µπορεί να διαφέρει σηµαντικά σε σχέση µε τις πραγµατικές συνθήκες ανάπτυξης των φυτών. Συνεπώς, απαιτούνται περαιτέρω πειραµατικές δοκιµές ώστε να διερευνηθεί η ικανότητα αποικισµού του ριζικού συστήµατος της τοµάτας από τα συγκεκριµένα ριζοβακτήρια σε φυσικό έδαφος. Ο ρόλος του acibenzolar-s-methyl στην πρόκληση SAR και στην προστασία έναντι φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών σε διάφορους ξενιστές, συµπεριλαµβανοµένου και του παθοσυστήµατος FORL-τοµάτα, έχει αναφερθεί (Benhamou and Bélanger, 1998; Ishii et al., 1999). Παρόλο που το ASM δεν ανέστειλε, όπως αναµενόταν, την in vitro µυκηλιακή αύξηση του µύκητα, φάνηκε να είναι ελάχιστα αποτελεσµατικό στον έλεγχο του FORL όταν εφαρµόστηκε στο έδαφος µε ριζοπότισµα. Ωστόσο, η αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης αυξήθηκε σηµαντικά όταν εφαρµόστηκε σε συνδυασµό µε τα στελέχη Bacillus και ιδίως µε εκείνα που έδειξαν ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη του παθογόνου (B. subtilis FZB24 και GB03). Η µικρή αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης του ASM, πιθανότητα να οφείλεται στην υψηλή πίεση του µολύσµατος κάτω από τις συγκεκριµένες πειραµατικές συνθήκες. Η αυξηµένη αποτελεσµατικότητα όταν συνδυάστηκε µε τα ανταγωνιστικά PGPR µπορεί να αποδοθεί στον περιορισµό του παθογόνου από την ανταγωνιστική δράση των στελεχών και στην υψηλή ικανότητα αποικισµού των ριζών τοµάτας από τα στελέχη αυτά. Πιο σηµαντική µείωση της ασθένειας επιτεύχθηκε στις συνδυασµένες επεµβάσεις των PGPR µε το µυκητοκτόνο hymexazol. Η σηµαντική ανασταλτική δράση του µυκητοκτόνου στην in vitro µυκηλιακή αύξηση του µύκητα έχει διαπιστωθεί σε προηγούµενες έρευνες (Hibar et al., 2007; Song et al., 2004). Οι Hibar et al. (2007) ανέφεραν ότι µεταξύ διαφόρων συµβατικών µυκητοκτόνων που αξιολογήθηκαν ως προς την αντιµετώπιση της σήψης του λαιµού και των ριζών της τοµάτας, το hymexazol ήταν το πιο αποτελεσµατικό. 90

97 Κεφάλαιο 2 Συζήτηση Αποτελεσµάτων Το µυκητοκτόνο hymexazol εφαρµοζόµενο σε συνδυασµό µε τα Bacillus PGPR οδήγησε σε σηµαντικά µειωµένο δείκτη ασθένειας σε σχέση µε την απλή εφαρµογή ριζοβακτηρίων σε όλες τις περιπτώσεις. Οι Omar et al. (2006) σε ανάλογη έρευνα αναφέρουν ολοκληρωµένη αντιµετώπιση της ασθένειας όταν το στέλεχος B. megaterium c96 συνδυάστηκε µε το µυκητοκτόνο carbendazim. Μέχρι τώρα, δεν έχει αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία ολοκληρωµένη αντιµετώπιση ασθένειας µε τη χρήση PGPR του γένους Bacillus και hymexazol. Συµπερασµατικά, τα αποτελέσµατα που παρουσιάζονται στην παρούσα µελέτη δείχνουν ότι η ολοκληρωµένη αντιµετώπιση της σήψης του λαιµού και των ριζών της τοµάτας µπορεί να επιτευχθεί µε τη συνδυασµένη εφαρµογή Bacillus PGPR και χηµικών ενεργοποιητών SAR ή συµβατικών µυκητοκτόνων. Αναγκαία βέβαια κρίνεται η συνέχιση της έρευνας για την διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων µεταξύ των παραγόντων του ολοκληρωµένου ελέγχου και την αξιολόγηση της δυνατότητας ελέγχου του παθογόνου σε συνθήκες αγρού, ώστε να αποτελέσει µια πραγµατικά εναλλακτική πρόταση αντιµετώπισης της ασθένειας. 91

98 92

99 Κεφάλαιο 3 Εισαγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΜΕΛΕΤΗ ΑΠΟ ΟΜΗΣΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΑΠΟ PGPR ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BACILLUS ΚΑΙ ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΚΑΙ Ε ΑΦΟΣ ΑΓΡΟΥ 3.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Επίδραση PGPR στην αποδόµηση ξενοβιοτικών ουσιών Μέχρι πρόσφατα, οι εφαρµογές των PGPR αφορούσαν κυρίως την προαγωγή της ανάπτυξης των φυτών και το βιολογικό έλεγχο σηµαντικών φυτοπαθογόνων εχθρών και ασθενειών (Lucy et al., 2004). Πολυάριθµες έρευνες έχουν γίνει σε σχέση µε τους µηχανισµούς που προάγουν τη φυτική ανάπτυξη και την αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης διαφόρων φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών (Kloepper et al., 2004; Van Loon, 2007). Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια δίνεται ιδιαίτερη έµφαση στη δυνατότητα χρήσης των PGPR για την απορρύπανση εδαφών, από οργανικούς και ανόργανους ρύπους (Zhuang et al., 2007). Τα γένη Pseudomonas, Azospirillum, Agrobacterium, Bacillus, Enterobacter και Flavobacterium είναι µεταξύ αυτών που περιλαµβάνουν PGPR ικανά να χρησιµοποιηθούν για την αποκατάσταση ρυπασµένων εδαφών. Στους ρύπους µεταξύ άλλων συµπεριλαµβάνονται υδρογονάνθρακες, χλωριωµένες ενώσεις, γεωργικά φάρµακα και βαρέα µέταλλα (Jiang et al., 2008; Khan et al., 2009; Zhuang et al., 2007). Η προσθήκη PGPR έχει αναφερθεί ότι µπορεί να συµβάλλει στην προαγωγή της αύξησης φυτών που αναπτύσσονται σε ρυπασµένα εδάφη (Hong et al., 2011; Lucy et al., 2004), τεχνολογία που εφαρµόζεται για την αποκατάσταση ρυπασµένων εδαφών και είναι γνωστή ως φυτοαποκατάσταση (phytoremediation), (Glick, 2010). Τα χαρακτηριστικά των φυτών που προάγονται µε την εισαγωγή των PGPR εµβολίων είναι η βιοµάζα των φυτών, η θρεπτική κατάσταση και ευρωστία των φυτών καθώς και ο ρυθµός πρόσληψης των ρυπογόνων ουσιών (Lucy et al., 2004). Επίσης, ορισµένα από αυτά τα ριζοβακτήρια εκτός από προωθητική επίδραση στην ανάπτυξη των φυτών µπορούν να έχουν και απευθείας βιοαποικοδοµητική δραστηριότητα στην περίπτωση οργανικών ρύπων (Glick, 2010; Hong et al., 2011). Ωστόσο, µέχρι σήµερα, περιορισµένα πειραµατικά δεδοµένα είναι διαθέσιµα στη βιβλιογραφία 93

100 Κεφάλαιο 3 Εισαγωγή σχετικά µε την in vitro αποδόµηση γεωργικών φαρµάκων από καλλιέργειες PGPR (Askar et al., 2007; Myresiotis et al., 2012c; Osman et al., 2008) Εφαρµογή γεωργικών φαρµάκων και επίδραση στην ανάπτυξη των PGPR Με στόχο την προστασία της φυτικής παραγωγής, γεωργικά φάρµακα που ανήκουν σε διαφορετικές χηµικές οµάδες, µε διαφορετικές βιολογικές δράσεις χρησιµοποιούνται συνήθως στη σύγχρονη γεωργική πρακτική για την προστασία της ίδιας καλλιέργειας. Έχει ωστόσο αναφερθεί ότι µόνο 0.1% των γεωργικών φαρµάκων που εφαρµόζονται φθάνει στους οργανισµούς στόχους ενώ το υπόλοιπο ποσοστό (99.9%) επηρεάζει το περιβάλλον (Pimentel, 1995). Τα γεωργικά φάρµακα και τα προϊόντα µεταβολισµού αλληλεπιδρούν µε το έδαφος και τους µικροοργανισµούς της ριζόσφαιρας επηρεάζοντας ακόµη και µικροοργανισµούς τους εδάφους που είναι ωφέλιµοι για την ανάπτυξη των φυτών (Lewis et al., 1996). Στην κατηγορία αυτή ανήκουν µεταξύ άλλων και τα ριζοβακτήρια που προάγουν τη φυτική ανάπτυξη (PGPR). Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ γεωργικών φαρµάκων και µικροοργανισµών του εδάφους αποτελεί αντικείµενο µελέτης τα τελευταία χρόνια. Εντούτοις, η συντριπτική πλειοψηφία των ερευνών αφορά τις επιδράσεις των γεωργικών φαρµάκων στην ενδογενή µικροβιακή κοινότητα του εδάφους (Saeki and Toyota 2004; Bending et al. 2007; Wang et al. 2008). Τα ερευνητικά δεδοµένα που είναι διαθέσιµα στη διεθνή βιβλιογραφία για την επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στους προστιθέµενους µικροοργανισµούς, συµπεριλαµβανοµένων και των αυξητικών ριζοβακτηρίων, είναι περιορισµένα, γεγονός που αποτέλεσε το έναυσµα για την πραγµατοποίηση των πειραµάτων αυτών. Επιπλέον, η αυξανόµενη εισαγωγή PGPR εµβολίων στο έδαφος σε προγράµµατα ολοκληρωµένης καταπολέµησης µε τη ταυτόχρονη χρήση γεωργικών φαρµάκων καθιστά επιτακτική την ανάγκη µελέτης και επιλογής των κατάλληλων συνδυασµών µε το µεγαλύτερο οικονοµικό αποτέλεσµα (Anith et al., 2004; Obradovic et al., 2005). Σε πρόσφατη έρευνα, οι Ahemad και Khan (2011a) µελέτησαν την επίδραση των εντοµοκτόνων fipronil, pyriproxyfen, imidacloprid και thiamethoxam, στη συνιστώµενη και σε υψηλότερες δόσεις εφαρµογής, στην επιβίωση του PGPR στελέχους Klebsiella sp. PS19, καθώς και στην in vitro 94

101 Κεφάλαιο 3 Εισαγωγή βιοσυνθετική ικανότητα συγκεκριµένων ουσιών, που επηρεάζουν την προαγωγή της ανάπτυξης των φυτών (π.χ. η αυξίνη ινδολοξικό οξύ, σιδηροφόρων ουσιών, πολυσακχαρίτες). Στη συνιστώµενη δόση, η τοξική επίδραση των εντοµοκτόνων στη παραγωγή των παραπάνω χαρακτηριστικών προαγωγής της ανάπτυξης ήταν µικρότερη σε σχέση µε τις µεγαλύτερες δόσεις που δοκιµάστηκαν και τo στέλεχος αναπτύχθηκε ικανοποιητικά στις διάφορες συγκεντρώσεις των εντοµοκτόνων που µελετήθηκαν. Η ίδια ερευνητική οµάδα µελέτησε την επίδραση των εντοµοκτόνων fipronil και pyriproxyfen στην ανάπτυξη του αρνητικού κατά Gram PGPR στελέχους Pseudomonas aeruginosa PS1 (Ahemad and Khan, 2011b). Το βακτηριακό στέλεχος µπορούσε να ανεχτεί τα εντοµοκτόνα ακόµη και στο υψηλότερο επίπεδο συγκέντρωσης (1600 µg/ml). Η βιοσύνθεση συγκεκριµένων ουσιών προωθητικών της ανάπτυξης προσδιορίστηκε παρουσία και απουσία των εντοµοκτόνων. Ωστόσο, η συγκέντρωση των περισσότερων παραγόµενων ουσιών επηρεάστηκε αρνητικά από τις αυξανόµενες συγκεντρώσεις των εντοµοκτόνων ουσιών. Οι δραστικές ουσίες fipronil και pyriproxyfen δοκιµάστηκαν επίσης και στο PGPR στέλεχος Rhizobium sp. MRL3, σε τρία επίπεδα συγκέντρωσης (Ahemad and Khan, 2011c). Το στέλεχος µπορούσε να αναπτυχθεί ικανοποιητικά ακόµη και στην υψηλοτερη συγκέντρωση τόσο σε στερεό όσο και σε υγρό θρεπτικό υλικό. Ωστόσο, στις υψηλότερες συγκεντρώσεις παρατηρήθηκαν µικρότερες πυκνότητες βακτηριακών κυττάρων. Οι Wani et al. (2005) ανέφεραν ότι η εφαρµογή του εντοµοκτόνου phorate (100 και 500 µg/ml) µείωσε σηµαντικά τη βιοσύνθεση ινδολοξικού οξέος από PGPR που ανήκουν στα γένη Serratia, Pseudomonas και Bacillus, ενώ η διαλυτοποίηση φωσφορικών από τα συγκεκριµένα ριζοβακτήρια ελάχιστα επηρεάστηκε από την εφαρµογή του phorate. Σε έρευνα που έγινε για την επίδραση των ζιζανιοκτόνων (metribuzin, glyphosate), εντοµοκτόνων (imidacloprid, thiamethoxam) και µυκητοκτόνων (hexaconazole, metalaxyl, kitazin) στο PGPR στέλεχος Rhizobium sp. MRL3, παρατηρήθηκε ικανοποιητική ανάπτυξη του βακτηρίου στις συνιστώµενες δόσεις των γεωργικών φαρµάκων (Ahemad and Khan, 2011d). Εντούτοις, όταν δοκιµάστηκαν συγκεντρώσεις διπλάσιες και τριπλάσιες της συνιστώµενης, το στέλεχος εµφάνισε µειωµένη συγκέντρωση βακτηριακών κυττάρων, µε 95

102 Κεφάλαιο 3 Εισαγωγή µεγαλύτερη µείωση στο υψηλότερο επίπεδο φόρτισης. Η επίδραση των παραπάνω δραστικών ουσιών εκτιµήθηκε και στην ικανότητα του στελέχους Bradyrhizobium sp. MRM6 να παράγει ουσίες που προάγουν τη φυτική ανάπτυξη. Η τοξικότητα ήταν µέγιστη όταν το στέλεχος αναπτύχθηκε σε συγκεντρώσεις των glyphosate, imidacloprid, hexaconazole τριπλάσιες των συνιστώµενων (Ahemad and Khan, 2011e). Επιπλέον, το PGPR στέλεχος Pseudomonas putida PS9 παρουσίασε µειωµένη ικανότητα παραγωγής συγκεκριµένων ουσιών που προάγουν την ανάπτυξη των φυτών υπό την επίδραση των µυκητοκτόνων tebuconazole, hexaconazole, metalaxyl και ketazin, σε βαθµό ανάλογο της συγκέντρωσης που εφαρµόστηκε (Ahemad and Khan, 2012) Σκοπός των πειραµάτων Ο σκοπός των εργασιών που αναφέρονται στο συγκεκριµένο κεφάλαιο ήταν η διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων µεταξύ των Bacillus PGPR εµβολίων και των γεωργικών φαρµάκων acibenzolar-s-methyl (ενεργοποιητής SAR), metribuzin και napropamide (ζιζανιοκτόνα), propamocarb hydrochloride (µυκητοκτόνο) και thiamethoxam (εντοµοκτόνο). Κριτήρια για τη µελέτη των συγκεκριµένων γεωργικών φαρµάκων αποτέλεσαν η επιλογή δραστικών ουσιών διαφορετικών κατηγοριών, που εφαρµόζονται στο έδαφος και χρησιµοποιούνται ως µέσα φυτοπροστασίας στην τοµάτα, καλλιέργεια µε µεγάλη οικονοµική σηµασία τόσο στην Ελλάδα όσο και παγκοσµίως. Για την επίτευξη του σκοπού, πραγµατοποιήθηκε: 1. Ανάπτυξη κατάλληλων χρωµατογραφικών µεθόδων σε συστήµατα LC- MS/MS και HPLC-UV για την ανάλυση των υπολειµµάτων των παραπάνω γεωργικών φαρµάκων σε υγρές καλλιέργειες και έδαφος. 2. Έλεγχος της περιεκτικότητας σε δραστική ουσία των εµπορικών σκευασµάτων που χρησιµοποιήθηκαν σε σύστηµα HPLC-UV. 3. Μελέτη της επίδρασης του εµβολιασµού µε συγκεκριµένα στελέχη PGPR στην αποδόµηση συνθετικών γεωργικών φαρµάκων σε ελεγχόµενες συνθήκες. 4. ιερεύνηση των πιθανών επιδράσεων των γεωργικών φαρµάκων στους PGPR πληθυσµούς που εµβολιάστηκαν σε υγρές καλλιέργειες και έδαφος σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης. 96

103 Κεφάλαιο 3 Εισαγωγή 5. Εισαγωγή των PGPR σε φυσικό έδαφος αγρού και µελέτη της επίδρασης του εµβολιασµού στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων. 97

104 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι 3.2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Αντιδραστήρια, θρεπτικά υποστρώµατα και άλλα υλικά Το ακετονιτρίλιο, η µεθανόλη και το νερό ήταν υψηλής καθαρότητας (HPLC grade) και ο οξικός αιθυλεστέρας (καθαρότητας 99.5%, pro analysis) προµηθεύτηκαν από τον οίκο Merck (Darmstadt, Germany). Το φορµικό οξύ (καθαρότητας 99%) ήταν της Carlo Erba (Milano, Italy). Το χλωριούχο νάτριο (καθαρότητας 99.8%) ήταν προϊόν του οίκου Riedel-de Haën (Seelze, Germany). Το άνυδρο θειικό µαγνήσιο (96%), το ένυδρο κιτρικό τρι-νάτριο (>99%) και το ένυδρο κιτρικό δι-νάτριο (>99%) ήταν των οίκων Panreac (Barcelona, Spain), Merck (Darmstadt, Germany) και Sigma-Aldrich (Seelze, Germany), αντίστοιχα. Για τον καθαρισµό των δειγµάτων χρησιµοποιήθηκαν µίγµα πρωτοταγών και δευτεροταγών αµινών Bondesil-PSA του οίκου Varian (Harbor City, USA) και γραφιτικός άνθρακας Graphitized Carbon Black (GCB) της Supelco (Bellefonte, USA). Τα θρεπτικά υποστρώµατα tryptic soy agar (TSA) και tryptic soy broth (TSB), (Becton, Dickinson and Company, Sparks, USA) ανασυστάθηκαν από σκόνη µε την προσθήκη απεσταγµένου νερού και αποστειρώθηκαν σε αυτόκαυστο στους 121 ο C, για 20 λεπτά. Το αποστειρωµένο θρεπτικό υλικό TSA, και µετά την ελάττωση της θερµοκρασίας του στους 50 ο C περίπου, αποχύνονταν σε τρυβλία Petri, διαµέτρου 9 cm, όπου και στερεοποιούνταν. Τα τρυβλία επωάζονταν στους 30 ο C για 24 ώρες και στη συνέχεια διατηρούνταν στους 4 ο C. Στα in vitro πειράµατα αποδόµησης σε υγρές καλλιέργειες χρησιµοποιήθηκαν οι δραστικές ουσίες acibenzolar-s-methyl, metribuzin, napropamide, thiamethoxam και propamocarb hydrochloride. Η πρότυπη ουσία acibenzolar-s-methyl (99.5% καθαρότητα) προµηθεύτηκε από τον οίκο Wako Pure Chemical (Osaka, Japan) ενώ οι πρότυπες ουσίες metribuzin (99.8%), napropamide (99.9%), thiamethoxam (99.7%) και propamocarb hydrochloride (98%) προέρχονταν από τους οίκους Riedel-de Haën (Seelze, Germany) και Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany), αντίστοιχα. Στις δοκιµές που έγιναν στο έδαφος χρησιµοποιήθηκαν τα εµπορικά σκευάσµατα αυτών (Πίνακας 3.1). Η φόρτιση των δειγµάτων πραγµατοποιήθηκε στα ακόλουθα επίπεδα: acibenzolar- S-methyl (1.0 και 10.0 mg/l ή mg/kg), metribuzin (0.25 και 2.50 mg/l ή 98

105 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι mg/kg), napropamide (2.0 και 20.0 mg/l ή mg/kg), propamocarb hydrochloride (60.0 και mg/l ή mg/kg) και thiamethoxam (0.2 και 2.0 mg/l ή mg/kg). Οι συγκεντρώσεις που εφαρµόσθηκαν αντιστοιχούν στις συνιστώµενες και στις δεκαπλάσιες αυτών δόσεις αγρού των ουσιών, όταν παραµένουν στα 10 πρώτα cm της επιφάνειας του εδάφους. Πίνακας 3.1 Εµπορικά σκευάσµατα των γεωργικών φαρµάκων που χρησιµοποιήθηκαν στις δοκιµές αποδόµησης στο έδαφος. Κοινό όνοµα Acibenzolar-Smethyl Εµπορικό όνοµα Bion 50 WG Οµάδα Ενεργοποιητής SAR Metribuzin Sencor 70 WG Ζιζανιοκτόνο Napropamide Devrinol 45 SC Ζιζανιοκτόνο Propamocarb hydrochloride Previcur N 72.2 SL Μυκητοκτόνο Thiamethoxam Actara 25 WG Εντοµοκτόνο Εταιρία Syngenta Crop Protection Inc. Bayer Hellas ΑΒΕΕ ΑΛΦΑ ΓΕΩΡΓΙΚΑ ΕΦΟ ΙΑ ΑΕΒΕ Bayer Hellas ΑΒΕΕ Syngenta Hellas ΑΕΒΕ PGPR και παρασκευή εµβολίων Στα πειράµατα αποδόµησης και παρακολούθησης της ανάπτυξης του βακτηριακού πληθυσµού χρησιµοποιήθηκαν τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34 (Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, AL, USA) και τα εµπορικά διαθέσιµα στελέχη B. subtilis FZB24 (FZB24, ABiTEP GmbH, Berlin, Germany) και B. subtilis GB03 (Companion, Growth Products Ltd., New York, USA). Η διατήρηση των στελεχών για µεγάλο χρονικό διάστηµα γινόταν µε την τοποθέτηση αιωρήµατος βακτηριακών κυττάρων σε υγρό θρεπτικό υπόστρωµα TSB που περιείχε 20% (v/v) γλυκερόλη στους -80 o C. Η καλλιέργεια των κυττάρων πραγµατοποιήθηκε σε φρέσκο θρεπτικό υγρό TSB σε επωαστήρα καλλιεργειών στις 120 στροφές/λεπτό και θερµοκρασία 30 0 C, µετά από µεταφορά αποµονωµένων αποικιών που αναπτύχθηκαν σε τρυβλία µε στερεό θρεπτικό υλικό TSA. Στη συνέχεια οι καλλιέργειες φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στις

106 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι στροφές/λεπτό και αφού αποµακρύνθηκε το υπερκείµενο, το ίζηµα επαναδιαλύθηκε σε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση προσαρµόστηκε στα 1 x 10 9 CFU/mL. Η µέτρηση της συγκέντρωσης των βακτηριακών κυττάρων πραγµατοποιήθηκε µε διαδοχικές αραιώσεις και µακροσκοπική παρατήρηση των αποικιών σε στερεό θρεπτικό υλικό TSA, όπως περιγράφεται λεπτοµερώς στην παράγραφο Εδαφικά δείγµατα Η συλλογή των δειγµάτων εδάφους για την πραγµατοποίηση των πειραµάτων έγινε το Σεπτέµβριο του 2008 από αγροτεµάχιο συνολικής έκτασης 20 στρεµµάτων στην περιοχή Αµούρι Φθιώτιδας (38 ο ' Β, 22 o ' Ε). Στο συγκεκριµένο αγρό δεν είχε γίνει καµία εφαρµογή µε φυτοπροστατευτικά προϊόντα τα τελευταία οκτώ έτη και χρησιµοποιούνταν για καλλιέργεια σιταριού. Η ακριβής γεωγραφική θέση του αγροτεµαχίου παρουσιάζεται στην Εικόνα 3.1. Μόνο στην περίπτωση των πειραµάτων αποικοδόµησης σε φυσικό έδαφος αγρού χρησιµοποιήθηκε και ένας επιπλέον τύπος εδάφους που προερχόταν από αγροτεµάχιο της περιοχής Βάβδου Χαλκιδικής (40 o ' B, 23 o ' E), (πηγή: Εργαστήριο Εδαφολογίας Α.Π.Θ.). Τα δείγµατα συλλέχθηκαν από ένα βάθος (0-20 cm από την επιφάνεια του εδάφους) µε τη βοήθεια χειροκίνητου δειγµατολήπτη εδάφους τύπου Auger, από 5 σηµεία ανά στρέµµα και τοποθετήθηκαν σε νάιλον σακούλες. Μετά τη µεταφορά των δειγµάτων στο εργαστήριο, διατηρήθηκαν διασπαρµένα επάνω σε χαρτόνι σε καλά αεριζόµενο (18-25 ο C) και προφυλαγµένο από σκόνες χώρο ώστε να στεγνώσουν. Αφού έγινε αεροξήρανση του εδάφους, αποµακρύνθηκαν οι µεγάλες πέτρες και τα φυτικά υπολείµµατα και στη συνέχεια θρυµµατίσθηκε µε τη βοήθεια γουδιού πορσελάνης και οµογενοποιήθηκε µε κοσκίνισµα σε κόσκινο µε ανοίγµατα οπών 2 mm. Μια µικρή ποσότητα εδάφους χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό της µηχανικής σύστασης και των φυσικοχηµικών ιδιοτήτων και το υπόλοιπο τοποθετήθηκε σε πλαστικές σακούλες και συντηρήθηκε εντός ψυχρού θαλάµου (4-6 ο C) µέχρι περαιτέρω πειραµατισµού. 100

107 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 3.1 Αγροτεµάχιο στο οποίο έγινε η συλλογή των δειγµάτων εδάφους στην περιοχή Αµούρι Φθιώτιδας (Α). Κάτοψη της ευρύτερης περιοχής δειγµατοληψίας (Β), (πηγή Google Earth) Αναλυτικά όργανα προσδιορισµού των γεωργικών φαρµάκων (LC- MS/MS, HPLC-UV) και συνθήκες ανάλυσης Η χρωµατογραφική ανάλυση όλων των εκχυλισµάτων που προέκυψαν από τις υγρές καλλιέργειες και το αποστειρωµένο έδαφος πραγµατοποιήθηκε σε σύστηµα υγρού χρωµατογράφου συζευγµένου µε ανιχνευτή φασµατογράφο 101

108 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι µάζας µε τριπλό τετράπολο (LC-MS/MS, Thermo Finnigan, USA), (Εικόνα 3.2). Το σύστηµα αποτελούνταν από αυτόµατο δειγµατολήπτη τύπου Surveyor (Thermo Finnigan, USA), αντλία τύπου Surveyor και ανιχνευτή φασµατογράφο µάζας µε τριπλό τετράπολο τύπου TSQ Quantum (San Jose, CA, USA). Η χρωµατογραφική στήλη στην οποία πραγµατοποιήθηκε ο χρωµατογραφικός διαχωρισµός ήταν τύπου Hypurity-C18 (4.6 mm x 150 mm, 5 µm), (Thermo Finnigan, USA). Η κινητή φάση αποτελούνταν από ισοκρατικό σύστηµα µε σύσταση ακετονιτρίλιο:νερό (50:50, v/v) και 0.15% (v/v) φορµικό οξύ. Η ροή ήταν 0.4 ml/min, ο Εικόνα 3.2 Σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας µε ανιχνευτή φασµατογράφο µάζας µε τριπλό τετράπολο (LC-MS/MS, Thermo Finnigan, USA). όγκος της έγχυσης 10 µl και η χρωµατογραφική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε σε θερµοκρασία 30 o C. Η ανάλυση στο φασµατογράφο της µάζας πραγµατοποιούνταν σε συνθήκες θετικού ιονισµού µε ηλεκτροψεκασµό (Electrospray Ionization, ESI+). Οι παράµετροι λειτουργίας της µάζας ήταν οι ακόλουθοι: spray voltage 4000 V; capillary temperature 380 o C; nitrogen as the sheath gas 35 kpa; auxiliary gas pressure 20 kpa. Στον Πίνακα 3.2 παρατίθενται οι χρόνοι κατακράτησης των ουσιών, καθώς και τα ιόντα (πρόδροµα και θραύσµατα των µορίων) που χρησιµοποιήθηκαν για ποσοτικό προσδιορισµό και ταυτοποίηση των ουσιών στις LC-MS/MS αναλύσεις. Η ρύθµιση των παραµέτρων της ανάλυσης και η επεξεργασία των αποτελεσµάτων πραγµατοποιήθηκε µε το λειτουργικό σύστηµα Xcalibur (Thermo Fisher Scientific). 102

109 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 3.2 Χρόνοι κατακράτησης, πρόδροµα ιόντα και προϊόντα θραυσµατοποίησης που χρησιµοποιήθηκαν για ποσοτικό προσδιορισµό και ταυτοποίηση των ουσιών στις LC-MS/MS αναλύσεις. ραστική ουσία R.T. a (min) Πρόδροµο ιόν (m/z) Ιόν ποσοτικού προσδιορισµού (m/z) Ιόν ταυτοποίησης (m/z) Acibenzolar-S-methyl Metribuzin Napropamide Propamocarb hydrochloride Thiamethoxam a R.T.: Χρόνος κατακράτησης. Η ανάλυση των δειγµάτων από τα πειράµατα αποδόµησης στο φυσικό έδαφος έγινε σε σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) TSP Spectra System (Thermo Separation Products, Austin, TX, USA) αποτελούµενο από αντλία P4000 τριών διαλυτών, απαερωτή διαλυτών TSP, αυτόµατο δειγµατολήπτη AS3000 µε βρόγχο έγχυσης χωρητικότητας 100 µl και συνδεδεµένο µε ανιχνευτή διάταξης φωτοδιόδων UV6000LP (DAD), (Thermo Finnigan, USA), (Εικόνα 3.3). Η ροή της Εικόνα 3.3 Σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας µε ανιχνευτή διάταξης φωτοδιόδων (HPLC-UV (DAD), Thermo Finnigan, USA). κινητής φάσης ήταν 1 ml/min, ο όγκος της έγχυσης 20 µl και η χρωµατογραφική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε στην ίδια χρωµατογραφική στήλη που αναφέρθηκε στην προηγούµενη παράγραφο στους 30 o C. Οι συνθήκες λειτουργίας του συστήµατος υγρής χρωµατογραφίας παρουσιάζονται συνοπτικά στον Πίνακα 3.3. Το λειτουργικό σύστηµα που χρησιµοποιήθηκε για την εισαγωγή των παραµέτρων της ανάλυσης και την επεξεργασία των 103

110 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι αποτελεσµάτων ήταν το ChromQuest software program έκδοση 4.2 (ThermoQuest, Milano, Italy). Πίνακας 3.3 Συνθήκες λειτουργίας του συστήµατος HPLC-UV για την ανάλυση υπολειµµάτων acibenzolar-s-methyl (ASM), metribuzin και thiamethoxam σε δείγµατα εδάφους. TSP Spectra System (Thermo Separation Products, USA) Αυτόµατος AS3000 Ροή 1 ml/min δειγµατολήπτης Ανιχνευτής UV6000LP diode array detector Θερµοκρασία 30 ο C στήλης Αντλία P4000 tertiary solvent pump Όγκος έγχυσης 20 µl Στήλη Hypurity-C18 (4.6 mm x 150 mm, 5 µm), (Thermo, USA) Μήκος κύµατος ανίχνευσης 254 nm (ASM) 294 nm (metribuzin) 251 nm(thiamethoxam) Κινητή φάση acetonitrile:water (50:50, v/v)=> ASM acetonitrile:water (40:60, v/v) => metribuzin acetonitrile:water (20:80, v/v) => thiamethoxam Χρόνος έκλουσης 7.07 min (ASM) 4.51 min (metribuzin) 3.94 min (thiamethoxam) Παρασκευή προτύπων διαλυµάτων Λαµβάνοντας υπόψη την καθαρότητα της κάθε πρότυπης ουσίας παρασκευάστηκαν πυκνά πρότυπα διαλύµατα (stock solutions) µε διάλυση της κατάλληλης ποσότητας κάθε ουσίας στον ανάλογο όγκο µεθανόλης ώστε να προκύψουν διαλύµατα συγκέντρωσης 1000 µg/ml. Η διατήρηση των πυκνών προτύπων διαλυµάτων γινόταν σε ειδικά γυάλινα φιαλίδια, σφραγισµένα αεροστεγώς µε πώµα από ανθεκτικό σε οργανικούς διαλύτες υλικό (Teflon) σε θερµοκρασία -25 o C. Τα πρότυπα διαλύµατα εργασίας (working standard solutions) παρασκευάστηκαν µε ανάµιξη κατάλληλων όγκων των παραπάνω πυκνών προτύπων διαλυµάτων σε µεθανόλη για τη φόρτιση των δειγµάτων ανάκτησης και σε κινητή φάση για την κατασκευή των προτύπων καµπυλών αναφοράς. 104

111 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι Ανάλυση των εµπορικών σκευασµάτων Όλα τα εµπορικά σκευάσµατα, πριν χρησιµοποιηθούν, ελέγχθηκαν ως προς την περιεκτικότητά τους σε δραστική ουσία. Οι αναλύσεις πραγµατοποιήθηκαν σε σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) TSP Spectra System (Thermo Separation Products, Austin, TX, USA) συνδεδεµένο µε ανιχνευτή µε διάταξη φωτοδιόδων UV6000LP (DAD), (Thermo Finnigan, USA). Η χρωµατογραφική στήλη ήταν τύπου Hypurity-C18 (4.6 mm x 150 mm, 5 µm) του οίκου Thermo. Ο όγκος της έγχυσης ήταν 20 µl και η έκλουση ήταν ισοκρατική µε ροή κινητής φάσης 1 ml/min και θερµοκρασία της στήλης 30 o C. Το λειτουργικό σύστηµα που χρησιµοποιήθηκε για την ρύθµιση των παραµέτρων της ανάλυσης και την επεξεργασία των δεδοµένων ήταν το ChromQuest software program έκδοση 4.2 (ThermoQuest, Milano, Italy). Οι παράµετροι που αξιολογήθηκαν αναφέρονται σε επίσηµες µεθόδους του CIPAC (Collaborative International Pesticides Analytical Council) και EU Directive 91/414/EEC (CIPAC, 1999; EU Directive 91/414/EEC). Η ακρίβεια του χρωµατογραφικού συστήµατος προσδιορίστηκε µε τον υπολογισµό της επαναληψιµότητας (intra-day repeatability), µε την πραγµατοποίηση δέκα εγχύσεων του ίδιου πρότυπου διαλύµατος εργασίας γνωστής συγκέντρωσης την ίδια ηµέρα, καθώς και µε εκτίµηση της αναπαραγωγιµότητας (inter-day reproducibility), σε χρονικό διάστηµα µιας εβδοµάδας, του χρόνου έκλουσης και της επιφάνειας της κορυφής. Η γραµµικότητα προσδιορίστηκε στα επίπεδα που αντιστοιχούν στην ονοµαστική συγκέντρωση του σκευάσµατος ± 20%. Επίσης εκτιµήθηκε η επαναληψιµότητα της µεθόδου υπολογίζοντας τη σχετική τυπική απόκλιση δέκα επαναλήψεων. Όλες οι παράµετροι που προσδιορίστηκαν για την αξιολόγηση της µεθόδου βασίζονται σε επίσηµους κανονισµούς (CIPAC, 1999; EU Directive 91/414/EEC). Μάλιστα στην περίπτωση του thiamethoxam (Actara, 25% WG) έγινε επικύρωση της αναλυτικής µεθόδου, ακολουθώντας τη συνολική διαδικασία επιβεβαίωσης της καταλληλότητας της µεθόδου µε βάση τις Ευρωπαϊκές απαιτήσεις (Myresiotis et al., 2012b). 105

112 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι Επεξεργασία και χαρακτηρισµός εδαφών Όλες οι εδαφολογικές αναλύσεις πραγµατοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Εδαφολογίας της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. Τα εδαφολογικά χαρακτηριστικά των εδαφών που προσδιορίστηκαν ήταν το ph, η περιεκτικότητα σε οργανική ουσία, η υδατοχωρητικότητα, η υγρασία και η µηχανική σύσταση (Παυλάτου-Βε κ.ά., 2001). Όλες οι αναλύσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τρεις επαναλήψεις για κάθε δείγµα αγρού. Α. Προσδιορισµός ph Χρησιµοποιήθηκε αναλογία εδάφους:νερό (1:2.5, β/ο) και η µέτρηση του ph έγινε µε τη χρήση πεχάµετρου υψηλής ανάλυσης (Crison 2002) και ηλεκτρόδιο Mettler. Β. Προσδιορισµός της οργανικής ουσίας Ο προσδιορισµός της οργανικής ουσίας έγινε µε τη µέθοδο της υγρής καύσης και στηρίζεται στην καύση της οργανικής ουσίας και στην οξείδωση του άνθρακα µε διχρωµικό κάλι παρουσία θειικού οξέος. Γ. Προσδιορισµός της υδατοχωρητικότητας Η υδατοχωρητικότητα των εδαφών µετρήθηκε µε κατάκλιση µιας προζυγισµένης ποσότητας εδάφους που βρίσκεται σε γυάλινο χωνί µε διηθητικό χαρτί. Μετά το πέρας 24 h, ζυγίστηκε το έδαφος µαζί µε το χωνί και το φίλτρο. Η υδατοχωρητικότητα (%) προσδιορίστηκε από την εξίσωση: Υδατοχωρητικότητα (%) = [(30 Α) + (Β-Γ)]/Α x 100, όπου Α η ποσότητα ξηρού εδάφους στα 30 g φρέσκου εδάφους, και Β και Γ το βάρος του χωνιού, φίλτρου και εδάφους µετά και πριν την κατάκλιση, αντίστοιχα.. Προσδιορισµός του ποσοστού υγρασίας Προσδιορίσθηκε µε ξήρανση προζυγισµένων ποσοτήτων εδάφους µέχρι σταθερού βάρους σε κλίβανο στους 105 ο C. Η διαφορά βάρους πριν και µετά την ξήρανση χρησιµοποιείται για τον υπολογισµό της υγρασίας του εδάφους, σύµφωνα µε την εξίσωση: Υγρασία (%) = ((Α+Β Γ)/Β) Χ

113 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι, όπου Α= το βάρος της κάψας πριν την ξήρανση, Β= το βάρος του εδάφους πριν την ξήρανση και Γ= το συνολικό βάρος της κάψας και του εδάφους µετά την ξήρανση. Σε όλους τους υπολογισµούς των περαιτέρω πειραµατισµών, το ποσοστό υγρασίας του εδάφους λαµβάνονταν υπόψη και γινόταν πάντα οι απαραίτητες διορθώσεις. Ε. Προσδιορισµός της µηχανικής σύστασης Ο προσδιορισµός της µηχανικής σύστασης των εδαφών (εκατοστιαία κατανοµή της άµµου, της ιλύος και της αργίλου στη λεπτή γη) έγινε µε την εφαρµογή της µεθόδου του Πυκνόµετρου Βουγιούκου. Με βάση τα ποσοστά των κλασµάτων και µε τη βοήθεια του τριγώνου της µηχανικής ανάλυσης, προσδιορίσθηκε και η κλάση του εδάφους. Στον Πίνακα 3.4 παρουσιάζονται οι µέσες τιµές των φυσικοχηµικών ιδιοτήτων που προσδιορίστηκαν και η µηχανική σύσταση των εδαφών. Το έδαφος που συλλέχθηκε από την περιοχή Αµούρι Φθιώτιδος ανήκει στα αργιλώδη και χαρακτηρίζεται ως ουδέτερο, αργιλοπηλώδες (clay loam), µε µικρή περιεκτικότητα σε οργανική ουσία. Αντίθετα το έδαφος από τη Βάβδο Χαλκιδικής ανήκει στα πηλώδη ή µέσης σύστασης εδάφη, είναι πιο όξινο, µε περισσότερη οργανική ουσία και χαρακτηρίζεται ως ιλυοαργιλοπηλώδες (silty clay loam). Πίνακας 3.4 Μηχανική σύσταση και φυσικοχηµικές ιδιότητες των εδαφών που µελετήθηκαν. Τοποθεσία Άµµος Ιλύς Άργιλος ph Οργανική Υδατοχω (%) (%) (%) (1:2.5 H 2 O) ουσία ρητικότη (%) τα (%) Αµούρι Φθιώτιδας Βάβδος Χαλκιδικής 107

114 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι οκιµές επίδρασης των PGPR στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων και παρακολούθηση ανάπτυξης των βακτηριακών πληθυσµών σε υγρές καλλιέργειες Στα πειράµατα αυτά µελετήθηκε η αλληλεπίδραση µεταξύ των συγκεκριµένων στελεχών PGPR και των γεωργικών φαρµάκων σε υγρές καλλιέργειες. Οι συγκεντρώσεις των δραστικών ουσιών που δοκιµάστηκαν ήταν οι ακόλουθες: acibenzolar-s-methyl (1.0 και 10.0 mg/l), metribuzin (0.25 και 2.50 mg/l), napropamide (2.0 και 20.0 mg/l), propamocarb hydrochloride (60.0 και mg/l) και thiamethoxam (0.2 και 2.0 mg/l). Όγκος 1.0 ml υγρής καλλιέργειας του κάθε βακτηριακού στελέχους εµβολιάστηκε σε αποστειρωµένες γυάλινες κωνικές φιάλες που περιείχαν 99 ml θρεπτικού υποστρώµατος TSB και στη συνέχεια προστέθηκε 0.1 ml από το κατάλληλο διάλυµα εργασίας των γεωργικών φαρµάκων σε µεθανόλη έτσι ώστε να προκύψουν οι παραπάνω τελικές συγκεντρώσεις. Μη εµβολιασµένες κωνικές φιάλες στις οποίες έγινε φόρτιση µε τα υπό εξέταση γεωργικά φάρµακα και εµβολιασµένες κωνικές φιάλες χωρίς φόρτιση χρησιµοποιήθηκαν σαν µάρτυρες. Όλες οι φιάλες επωάστηκαν στους 30 ο C υπό ανάδευση (150 στροφές/λεπτό). Σε τακτά χρονικά διαστήµατα (0, 10, 24, 30, 48 και 72 ώρες) πραγµατοποιήθηκαν δειγµατοληψίες και µετρήθηκαν η αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων και η συγκέντρωση των βακτηριακών πληθυσµών οκιµές επίδρασης των PGPR στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων και παρακολούθηση ανάπτυξης των βακτηριακών πληθυσµών στο έδαφος Η διαδικασία φόρτισης των δειγµάτων εδάφους µε τα υπό µελέτη γεωργικά φάρµακα και επιµόλυνσης µε τα βακτηριακά στελέχη πραγµατοποιήθηκε ως εξής: Ποσότητα 200 g εδάφους µεταφέρθηκε σε γυάλινη κωνική φιάλη (Erlenmeyer) των 500 ml και προετοιµάστηκε ο απαραίτητος για κάθε βιοδοκιµή αριθµός δειγµάτων. Στη συνέχεια προστέθηκαν οι κατάλληλοι όγκοι από υδατικά διαλύµατα των γεωργικών φαρµάκων ώστε να προκύψει επιφόρτιση των δειγµάτων στα επίπεδα acibenzolar-s-methyl (1.0 και 10.0 mg/kg), metribuzin (0.25 και 2.50 mg/kg), napropamide (2.0 και 20.0 mg/kg), propamocarb hydrochloride (60.0 και mg/kg) και thiamethoxam (0.2 και 2.0 mg/kg). Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκαν εµπορικά σκευάσµατα των 108

115 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι γεωργικών φαρµάκων από τα οποία παρασκευάστηκαν σε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό τα αναλόγου συγκεντρώσεως διαλύµατα. Ακολούθησε αναµόχλευση του εδάφους ώστε τα γεωργικά φάρµακα να έχουν οµοιόµορφη κατανοµή σε όλη τη µάζα του εδάφους. Έπειτα, πραγµατοποιήθηκε επιµόλυνση των δειγµάτων, µε την τοποθέτηση αιωρήµατος βακτηριακών κυττάρων του κάθε στελέχους ώστε η τελική συγκέντρωση ήταν περίπου 2 x 10 7 CFU/g και ακολούθησε ήπια ανάδευση του εδάφους. Επιπλέον όγκος αποστειρωµένου και απεσταγµένου νερού προστέθηκε στα εδάφη ώστε η υγρασία τους να προσαρµοστεί στο 50% της υδατοχωρητικότητας (Water Holding Capacity, WHC). Πριν τη µεταφορά των κωνικών φιαλών στο θάλαµο επώασης, έγινε η πρώτη δειγµατοληψία που αντιστοιχούσε στη χρονική στιγµή µηδέν από την εφαρµογή των γεωργικών φαρµάκων και βακτηριακών εµβολίων. Στη συνέχεια τοποθετήθηκε στο στόµιο της κάθε φιάλης ανυδρόφιλο βαµβάκι και καλύφθηκε µε αλουµινόχαρτο. Το σύνολο των δειγµάτων µεταφέρθηκε σε θάλαµο επώασης και διατηρήθηκε στους 30 o C στο σκοτάδι µέχρι τη στιγµή της δειγµατοληψίας (Εικόνα 3.4). Το ποσοστό εδαφικής υγρασίας διατηρήθηκε σταθερό στο 50% της WHC µε την περιοδική προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας αποστειρωµένου και απεσταγµένου νερού. Οι δοκιµές αυτές πραγµατοποιήθηκαν σε Εικόνα 3.4 Επώαση των δειγµάτων εδάφους σε αποστειρωµένο έδαφος αγρού θάλαµο επώασης. προκειµένου να µην υπάρχει επίδραση του ενδογενούς µικροβιακού πληθυσµού. Όλα τα σκεύη που χρησιµοποιήθηκαν στη διαδικασία ήταν αποστειρωµένα και η προετοιµασία των δειγµάτων γινόταν ασηπτικά, σε θάλαµο κάθετης νηµατικής ροής (Scanlaf, UK). 109

116 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι Σε καθορισµένα χρονικά διαστήµατα πραγµατοποιήθηκε συλλογή δειγµάτων εδάφους σε ασηπτικές συνθήκες και προσδιορίστηκαν τα υπολείµµατα των γεωργικών φαρµάκων και οι βακτηριακοί πληθυσµοί όπως περιγράφεται παρακάτω. Τα υπολείµµατα προσδιορίστηκαν σε 0, 1, 3, 10, 17, 38, 54, 95 ηµέρες (acibenzolar-s-methyl), 0, 7, 14, 21, 33, 61, 75, 120, 140, 180 ηµέρες (metribuzin), 0, 7, 14, 28, 45, 60, 90, 135, 180, 210, 240 ηµέρες (napropamide), 0, 11, 20, 30, 50, 95, 110, 140 ηµέρες (propamocarb hydrochloride), 0, 12, 22, 32, 45, 95, 120, 150, 180, 220, 250, 280 ηµέρες (thiamethoxam) και οι πληθυσµοί των βακτηρίων σε εβδοµαδιαία διαστήµατα. Η επίδραση των PGPR στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων acibenzolar-s-methyl, metribuzin και thiamethoxam µελετήθηκε και σε φυσικό έδαφος αγρού. Στην περίπτωση µάλιστα αυτή χρησιµοποιήθηκε και ένας επιπλέον τύπος εδάφους διαφορετικής σύστασης. Οι µετρήσεις έγιναν σε 0, 1, 4, 8, 12, 24, 30 ώρες (acibenzolar-s-methyl), 0, 8, 16, 21, 40, 50, 70 ηµέρες (metribuzin), 0, 8, 16, 21, 40, 70, 150, 180, 210, 230 ηµέρες (thiamethoxam) Μέθοδοι εκχύλισης των γεωργικών φαρµάκων από υγρές καλλιέργειες και έδαφος Υγρές καλλιέργειες: 5 ml υγρής καλλιέργειας µεταφέρθηκαν σε γυάλινο φιαλίδιο των 30 ml που περιείχε 1 g NaCl, σε θάλαµο κάθετης νηµατικής ροής. Στη συνέχεια, τα δείγµατα εκχυλίστηκαν δύο φορές µε 10 και 5 ml οξικού αιθυλεστέρα, αντίστοιχα, µε ανάδευση για 2 λεπτά στο vortex. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 4000 στροφές/λεπτό για 5 λεπτά και 10 ml από το υπερκείµενο µεταφέρθηκαν σε άλλο φιαλίδιο. Η αποµάκρυνση του διαλύτη πραγµατοποιήθηκε κάτω από ρεύµα αζώτου και θερµοκρασία 32 ο C σε συσκευή TurboVap LV (Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA, USA). Τα δείγµατα επαναδιαλύθηκαν σε 1 ml µίγµατος ακετονιτρίλιο:νερό (50:50, v/v) και µεταφέρθηκαν σε φιαλίδια αυτόµατου δειγµατολήπτη για ανάλυση σε σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας. Έδαφος: 5 g (ξηρό βάρος) εδάφους µεταφέρθηκαν σε σωλήνα φυγοκέντρου των 50 ml και προστέθηκαν 10 ml ακετονιτριλίου. Αφού ανακινήθηκαν στο vortex για 2 λεπτά, στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στις 8000 στροφές/λεπτό για 5 λεπτά και 5 ml από το υπερκείµενο µεταφέρθηκαν σε γυάλινο φιαλίδιο. Ακολούθησε δεύτερη εκχύλιση µε 5 ml ακετονιτρίλιο και 110

117 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι µετά από φυγοκέντρηση, 5 ml από τη φάση του ακετονιτριλίου µεταφέρθηκαν στο γυάλινο φιαλίδιο. Τελικά τα 10 ml εκχυλίσµατος συµπυκνώθηκαν µέχρι ξηρού κάτω από ρεύµα αζώτου σε θερµοκρασία 32 ο C και επαναδιαλύθηκαν σε 1 ml µίγµατος ακετονιτρίλιο:νερό (50:50, v/v). Ακολούθησε διήθηση από PTFE φίλτρα (0.45 µm, 13 mm) της Waters-Millipore (Milford, MA, USA) και µεταφορά σε φιαλίδια του αυτόµατου δειγµατολήπτη για την περαιτέρω χρωµατογραφική ανάλυση. Οι παραπάνω µέθοδοι εκχύλισης χρησιµοποιήθηκαν για όλα τα γεωργικά φάρµακα, εκτός του propamocarb hydrochloride. Η εκχύλιση αυτής της δραστικής ουσίας έγινε µε µικρές παραλλαγές της µεθόδου QuEChERS που περιγράφηκε από τους Anastassiades et al. (2007). Συγκεκριµένα, 5 ml υγρής καλλιέργειας ή 5 g εδάφους µεταφέρθηκαν σε σωλήνα φυγοκέντρου των 50 ml, προστέθηκαν 10 ml ACN και στη συνέχεια ο σωλήνας σφραγίστηκε και ακολούθησε ανάδευση µε το χέρι για 1 λεπτό. Στα δείγµατα εδάφους έγινε προσθήκη 10 g πάγου πριν την εκχύλιση. Έπειτα, προστέθηκε το ρυθµιστικό µίγµα αλάτων (4.0 g άνυδρο θειικό µαγνήσιο g χλωριούχο νάτριο g ένυδρο κιτρικό τρι-νάτριο g ένυδρο κιτρικό δι-νάτριο) και αµέσως ακολούθησε ανάδευση µε το χέρι για περίπου 1 λεπτό και φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 5000 στροφές/λεπτό. 6 ml από τη φάση του ACN µεταφέρθηκαν σε σωλήνα φυγοκέντρου των 15 ml ο οποίος περιέχει 0.9 g από το προσροφητικό µίγµα (Graphitized Carbon Black/άνυδρο θειικό µαγνήσιο σε πούδρα:1/19) και 0.15 g Bondesil-PSA. Ακολούθησε σφράγισµα του σωλήνα, ανάδευση για περίπου 1 λεπτό και φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 4000 στροφές/λεπτό. 1 ml από το υπερκείµενο οξινίζεται µε 12 µl διαλύµατος 5% (v/v) φορµικού οξέος σε ACN και τοποθετείται σε φιαλίδια του αυτόµατου δειγµατολήπτη για χρωµατογραφική ανάλυση Μέθοδος προσδιορισµού των βακτηριακών πληθυσµών σε υγρές καλλιέργειες και έδαφος Οι βακτηριακοί πληθυσµοί προσδιορίστηκαν µε τη βοήθεια διαδοχικών αραιώσεων, επιφανειακής επίστρωσης σε τρυβλία µε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA και µακροσκοπικής παρατήρησης των αποικιών (CFUs) που αναπτύχθηκαν πάνω στο υπόστρωµα. Σε κάθε δειγµατοληψία (0, 10, 24, 30, 48 και 72 ώρες) 1 ml από την υγρή καλλιέργεια µεταφέρθηκε, υπό ασηπτικές 111

118 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι συνθήκες, σε δοκιµαστικό σωλήνα που περιείχε 9 ml ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (0.01 M, ph 7.0). Μετά από ανάδευση στο vortex ακολούθησαν άλλες πέντε διαδοχικές αραιώσεις 1:10, ώστε δηµιουργήθηκαν 6 διαλύµατα ( ). Στη συνέχεια, 100 µl από τις τρεις υψηλότερες αραιώσεις ( ) εµβολιάστηκαν και επιστρώθηκαν σε τρυβλία που περιείχαν στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA. Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 28 o C µέχρι να αναπτυχθούν οι αποικίες και µετρήθηκε µακροσκοπικά ο αριθµός των αποικιών. Ο αριθµός (Ν) των βακτηρίων ανά ml υποστρώµατος (CFU/mL) προσδιορίστηκε µε τη βοήθεια της εξίσωσης: N = CFU που µετρήθηκαν/όγκος που επιστρώθηκε (ml) x αραίωση. Οι πληθυσµοί των βακτηριακών στελεχών που ενσωµατώθηκαν σε αποστειρωµένο έδαφος προσδιορίστηκαν σε 0, 7, 14, 21, 28 και 35 ηµέρες επώαση και εκφράστηκαν σε CFU/g εδάφους. Συγκεκριµένα, ποσότητα 1 g εδάφους µεταφέρθηκε σε γυάλινη κωνική φιάλη των 50 ml που περιείχε 9 ml αποστειρωµένου διαλύµατος Na 6 P 6 O 18 (1.66 g/l, ph 7), (Jézéquel et al., 2005). Μετά από 1 ώρα ανάδευση στις 150 στροφές/λεπτό, ακολούθησαν 1:10 διαδοχικές αραιώσεις και 100 µl από τις υψηλότερες αραιώσεις εµβολιάστηκαν και επιστρώθηκαν σε τρυβλία Petri που περιείχαν στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA. Τα τρυβλία µεταφέρθηκαν σε θάλαµο επώασης και επωάστηκαν στους 28 o C για περίπου 48 ώρες (Yan et al., 2003). Μετά την ολοκλήρωση της επώασης µετρήθηκε µακροσκοπικά ο αριθµός των αποικιών και εκφράσθηκε σε CFU/g Έλεγχος αξιοπιστίας αναλυτικών µεθόδων Οι µέθοδοι που αναπτύχθηκαν δοκιµάστηκαν ως προς την ακρίβεια (accuracy) και την επαναληψηµότητα (repeatability). Η εκτίµηση της ακρίβειας πραγµατοποιήθηκε µε τον υπολογισµό της µέσης τιµής της ανάκτησης σε διάφορα επίπεδα και η επαναληψιµότητα υπολογίζοντας τη σχετική τυπική απόκλιση (RSD) τριών επαναλήψεων ανά επίπεδο. Ως "ανάκτηση" ορίζεται το ποσοστό της πραγµατικής ποσότητας µιας ουσίας, που ανακτάται κατά την αναλυτική διαδικασία, εκφρασµένο σε ποσοστό %. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκαν, δείγµατα υγρού θρεπτικού υποστρώµατος TSB φορτισµένα στα επίπεδα 0.005, 0.05, 0.5, 1.0, 10.0 mg/l και δείγµατα εδάφους σε πέντε επίπεδα ανάκτησης (0.005, 0.05, 0.1, 2.0 και 10.0 mg/kg). Σε κάθε επίπεδο πραγµατοποιήθηκαν τρεις επαναλήψεις. Με βάση επίσηµο έγγραφο της 112

119 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι Ευρωπαϊκής Ένωσης (SANCO/10684/2009), που σχετίζεται µε την επικύρωση αναλυτικών µεθόδων και χρησιµοποιείται από την πλειονότητα των εργαστηρίων, η υπολογισθείσα µέση τιµή των ανακτήσεων θα πρέπει να κυµαίνεται από % της πραγµατικής και η σχετική τυπική απόκλιση των επαναλήψεων θα πρέπει να είναι <20%. Η γραµµικότητα της πρότυπης καµπύλης κάθε ουσίας εκτιµήθηκε µε βάση το συντελεστή συσχέτισης r 2, ο οποίος στις αναλύσεις υπολειµµάτων γεωργικών φαρµάκων πρέπει να είναι µεγαλύτερος από Επίσης προσδιορίστηκαν τα όρια ανίχνευσης (LOD) και όρια ποσοτικού προσδιορισµού (LOQ) της κάθε εξεταζόµενης ουσίας. Ως "όριο ανίχνευσης" ορίζεται η χαµηλότερη συγκέντρωση της αναλυόµενης ουσίας, που µπορεί να ανιχνευθεί µε αποδεκτή βεβαιότητα χωρίς να απαιτείται ακρίβεια στον ποσοτικό προσδιορισµό. Το LOD εκτιµήθηκε χρωµατογραφικά ως η µικρότερη συγκέντρωση της ουσίας που εµφάνιζε απόκριση τριπλάσια του θορύβου στο συγκεκριµένο σηµείο της γραµµής βάσης. Το όριο ποσοτικού προσδιορισµού προσδιορίσθηκε ως η µικρότερη συγκέντρωση της ουσίας που µπορεί να ποσοτικοποιηθεί µε αποδεκτή ακρίβεια (RSD<20%), (Vryzas and Papadopoulou-Mourkidou, 2002) Επεξεργασία δεδοµένων Οι τιµές που προέκυψαν από τη µέτρηση των υπολειµµάτων των γεωργικών φαρµάκων στους διάφορους χρόνους δειγµατοληψίας χρησιµοποιήθηκαν για την κατασκευή των καµπυλών αποδόµησης. Στα πειράµατα αποδόµησης στο έδαφος, από τα δεδοµένα προσδιορίστηκαν οι τιµές DT 50 (χρονικό διάστηµα που απαιτείται για να µειωθεί κατά 50% η αρχική συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου που εφαρµόζεται). Ο προσδιορισµός των τιµών DT 50 έγινε µε τη χρήση εξισώσεων κινητικής πρώτης τάξης, δεδοµένου ότι η κατανοµή των σηµείων ήταν κατάλληλη και ο συντελεστής συσχέτισης (r 2 ) ήταν αρκετά υψηλός (>0.914). Η εξίσωση κινητικής πρώτης τάξης που χρησιµοποιήθηκε είχε τη µορφή, C t = C 0 e -kt, όπου C t η συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου σε χρόνο t (mg/kg), C 0 η αρχική συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου (mg/kg), K η σταθερά του ρυθµού αποδόµησης του γεωργικού φαρµάκου (days -1 ), και t ο χρόνος (days). Οι τιµές DT 50 υπολογίστηκαν από τη γραµµική εξίσωση που προέκυψε από την ανάλυση παλινδρόµησης µεταξύ των υπολειµµάτων και του χρόνου, µε τη βοήθεια του 113

120 Κεφάλαιο 3 Υλικά και Μέθοδοι προγράµµατος στατιστικής ανάλυσης JMP (JMP, SAS Institute, Cary, NC, USA). Η εξίσωση κινητικής πρώτης τάξης δεν µπόρεσε να αποδώσει την αποδόµηση του ζιζανιοκτόνου metribuzin, το οποίο εµφάνισε διφασική αποδόµηση (η πρώτη φάση (ή στάδιο) παρουσίαζε ταχύτερη αποδόµηση απ' ότι η δεύτερη) και για το λόγο αυτό χρησιµοποιήθηκε η εξίσωση C t = C 1 * e -k1 t + C 2 * e -k2 t, όπου C t η συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου σε χρόνο t (mg/kg), C 1 η συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου στο στάδιο 1 τη χρονική στιγµή t = 0 (mg/kg), C 2 η συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου στο στάδιο 2 τη χρονική στιγµή t = 0 (mg/kg), C 1 + C 2 = C 0 η συνολική συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου τη χρονική στιγµή t = 0 (mg/kg), k 1 και k 2 οι σταθερές του ρυθµού αποδόµησης του γεωργικού φαρµάκου στο πρώτο και δεύτερο στάδιο αντίστοιχα (days -1 ) και t ο χρόνος (days), (FOCUS, 2006). Η επεξεργασία των αποτελεσµάτων βασίστηκε στην ανάλυση παραλλακτικότητας (One-way ANOVA). Οι διαφορές µεταξύ των επεµβάσεων αξιολογήθηκαν µε το κριτήριο Duncan σε επίπεδο σηµαντικότητας P = Η στατιστική επεξεργασία των δεδοµένων έγινε µε τη χρήση του προγράµµατος στατιστικής ανάλυσης SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, USA). 114

121 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα 3.3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αξιοπιστία µεθόδων ανάλυσης Με σκοπό τη διακρίβωση της ακρίβειας και της επαναληψηµότητας των αναλυτικών µεθόδων που αναπτύχθηκαν, πραγµατοποιήθηκαν εκχυλίσεις δειγµάτων ανάκτησης σε πέντε επίπεδα συγκεντρώσεων, µε τρεις επαναλήψεις ανά επίπεδο. Συγκεκριµένα, ελέγχθηκαν τα επίπεδα 0.005, 0.05, 0.5, 1.0 και 10.0 mg/l σε δείγµατα υγρού θρεπτικού υποστρώµατος TSB και τα επίπεδα 0.005, 0.05, 0.1, 2.0 και 10.0 mg/kg σε δείγµατα εδάφους. Τα αποτελέσµατα των δοκιµών παρατίθενται αναλυτικά στους Πίνακες 3.5 και 3.6. Η µέση τιµή των ανακτήσεων για τα acibenzolar-s-methyl, metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride και thiamethoxam ήταν 85, 97, 95, 86, 114% και 80, 91, 90, 81, 89 % για το TSB και το έδαφος, αντίστοιχα. Η σχετική τυπική απόκλιση (RSD%) ήταν <11% στα επίπεδα 0.05 έως 10.0 mg/kg (ή mg/l) και <15% στη συγκέντρωση mg/kg (ή mg/l). Η ακρίβεια και η επαναληψηµότητα των αναλυτικών µεθόδων ήταν αποδεκτές, αφού σε όλα τα επίπεδα και για όλες τις δραστικές ουσίες οι µέσες ανακτήσεις κυµάνθηκαν από 80 έως 118%, ενώ η σχετική τυπική απόκλιση ήταν <15% σε όλες τις περιπτώσεις (SANCO/10684/2009). Στις περιπτώσεις όπου η ενόργανη ανάλυση πραγµατοποιήθηκε σε σύστηµα LC-MS/MS, το όριο ποσοτικού προσδιορισµού (LOQ) για όλες τις ουσίες και στα δύο υποστρώµατα (έδαφος και TSB) ήταν mg/kg (ή mg/l) και το όριο ανίχνευσης (LOD) κυµάνθηκε από (metribuzin και napropamide) έως mg/kg (ή mg/l) (acibenzolar-s-methyl, propamocarb hydrochloride και thiamethoxam). Στην Εικόνα 3.5 παρουσιάζονται χρωµατογραφήµατα εκχυλίσµατος εδάφους, φορτισµένο σε επίπεδο 0.1 mg/kg, από τα πειράµατα διακρίβωσης της µεθόδου. Η γραµµικότητα των καµπυλών αναφοράς των ουσιών εκτιµήθηκε µε βάση το συντελεστή συσχέτισης r 2, ο οποίος σε όλες τις περιπτώσεις ήταν µεγαλύτερος από Για τις δραστικές ουσίες metribuzin και thiamethoxam πραγµατοποιήθηκαν δοκιµές ανάκτησης, στα ίδια επίπεδα, και σε έδαφος από την περιοχή Βάβδος Χαλκιδικής (1.5% οργανική ουσία), αφού τα πειράµατα αποδόµησης σε φυσικό έδαφος έγιναν και στο συγκεκριµένο έδαφος. Οι µέσες ανακτήσεις κυµάνθηκαν από 83 έως 104% µε RSD<7%. Οι αναλυτικές µέθοδοι ελέγχθηκαν και σε δείγµατα εδάφους επιφορτισµένα µε τα υπό µελέτη γεωργικά 115

122 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα φάρµακα για µεγάλο χρονικό διάστηµα (bound ή aged residues). Στα δείγµατα αυτά δεν παρατηρήθηκε σηµαντική µείωση των ανακτήσεων (<3%), γεγονός που υποδηλώνει ότι η επίδραση της προσρόφησης στη διαδικασία της εκχύλισης είναι αµελητέα. Πίνακας 3.5 Μέσες ανακτήσεις (και σχετικές τυπικές αποκλίσεις) των ουσιών που µελετήθηκαν, µε τη µέθοδο προσδιορισµού υπολειµµάτων σε δείγµατα υγρού θρεπτικού υποστρώµατος TSB, σε πέντε επίπεδα συγκεντρώσεων. Επίπεδο Ανάκτησης (mg/l) ραστική ουσία mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l Acibenzolar-S-methyl 81 (3) 82 (4) 87 (5) 88 (1) 89 (1) Metribuzin 94 (2) 95 (1) 97 (3) 98 (1) 99 (1) Napropamide 93 (3) 91 (2) 94 (1) 97 (2) 98 (1) Propamocarb 82 (12) 84 (8) 85 (7) 87 (9) 90 (7) hydrochloride Thiamethoxam 109 (7) 111 (5) 113 (4) 117 (3) 118 (2) Πίνακας 3.6 Μέσες ανακτήσεις (και σχετικές τυπικές αποκλίσεις) των ουσιών που µελετήθηκαν, µε τη µέθοδο προσδιορισµού υπολειµµάτων σε δείγµατα εδάφους, σε πέντε επίπεδα συγκεντρώσεων. Επίπεδο Ανάκτησης (mg/kg) ραστική ουσία mg/kg 0.05 mg/kg 0.1 mg/kg 2.0 mg/kg 10.0 mg/kg Acibenzolar-S-methyl 80 (2) 80 (1) 80 (2) 81 (3) 80 (2) Metribuzin 88 (1) 89 (3) 90 (2) 92 (3) 94 (2) Napropamide 86 (3) 88 (2) 92 (3) 91 (2) 94 (2) Propamocarb 80 (15) 80 (11) 80 (9) 82 (7) 84 (5) hydrochloride Thiamethoxam 84 (2) 87 (1) 89 (1) 89 (2) 94 (1) 116

123 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα RT: Relative Abundance RT: 3.37 RT: 5.01 propamocarb hydrochloride thiamethoxam RT: 7.93 metribuzin acibenzolar-s-methyl napropamide RT: RT: Time (min) Εικόνα 3.5 LC-MS/MS χρωµατογραφήµατα εκχυλίσµατος εδάφους, φορτισµένο σε επίπεδο συγκέντρωσης 0.1 mg/kg, από τα πειράµατα διακρίβωσης της µεθόδου. Με βάση τα αποτελέσµατα της χηµικής ανάλυσης των σκευασµάτων, η περιεκτικότητα των σκευασµάτων βρέθηκε ότι είναι σύµφωνη µε την αναγραφόµενη από τον παρασκευαστή, και εποµένως τα σκευάσµατα πληρούν τις προδιαγραφές τους. Η µέση συγκέντρωση της δραστικής ουσίας thiamethoxam στο σκεύασµα Actara προσδιορίστηκε στα g/kg, η οποία είναι εντός των αποδεκτών ορίων (± 6.0%) σε σχέση µε την ονοµαστική συγκέντρωση του σκευάσµατος (250 g/kg), σύµφωνα µε διεθνείς οργανισµούς (FAO/WHO). Σε όλους τους περαιτέρω υπολογισµούς η απόκλιση αυτή της συγκέντρωσης λήφθηκε υπόψη. 117

124 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα Επίδραση των PGPR στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων σε υγρές καλλιέργειες Η επίδραση των στελεχών B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03 στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων acibenzolar-s-methyl, metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride και thiamethoxam µελετήθηκε σε υγρές καλλιέργειες TSB σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης (Εικόνα 3.6). Οι αναλύσεις των υπολειµµάτων πραγµατοποιήθηκαν σε 0, 10, 24, 30, 48 και 72 ώρες επώαση. Η αποδόµηση του acibenzolar-s-methyl σε TSB θρεπτικό υπόστρωµα από τα τέσσερα PGPR του γένους Bacillus παρουσιάζεται στην Εικόνα 3.6 (a1, a2). Μετά από 24 ώρες επώαση, το acibenzolar-s-methyl αποδοµήθηκε από τα 4 ριζοβακτήρια κατά 58 έως 100%, σε σύγκριση µε ποσοστό 5-7% που προσδιορίστηκε στο µη εµβολιασµένο µάρτυρα (control). Ειδικότερα, το στέλεχος B. pumilus SE34 παρουσίασε τη µεγαλύτερη ταχύτητα αποδόµησης, µε 100% αποδόµηση του acibenzolar-s-methyl σε 24 ώρες επώαση και στις δύο συγκεντρώσεις που δοκιµάστηκαν. Τα PGPR B. amyloliquefaciens IN937a και B. subtilis FZB24 εµφάνισαν παρόµοιο ρυθµό αποδόµησης του acibenzolar-s-methyl µε ποσοστά που κυµάνθηκαν µεταξύ και 71-74%, αντίστοιχα. Τα ποσοστά αποδόµησης του acibenzolar-s-methyl από το βακτήριο B. subtilis GB03 ήταν 58 και 60%, σε επίπεδο φόρτισης 1.0 και 10.0 mg/l, αντίστοιχα. Μετά από επώαση 48 ωρών, περισσότερο από 98% της αρχικής συγκέντρωσης acibenzolar- S-methyl αποδοµήθηκε από τα PGPR. Κατά την ίδια χρονική περίοδο, στις µη εµβολιασµένες καλλιέργειες, η αβιοτική αποδόµηση του acibenzolar-s-methyl ήταν 17% σε επίπεδο συγκέντρωσης 1.0 mg/l και 16% σε επίπεδο 10.0 mg/l. Οι αρχικές συγκεντρώσεις του acibenzolar-s-methyl αποδοµήθηκαν πλήρως σε όλες τις επεµβάσεις µε τα PGPR στο τέλος του χρόνου επώασης. Οι καµπύλες αποδόµησης των ουσιών metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride και thiamethoxam σε υγρές καλλιέργειες TSB εµβολιασµένες µε τα PGPR και στις µη εµβολιασµένες καλλιέργειες παριστάνονται στην Εικόνα 3.6 (b1, b2, c1, c2, d1, d2, e1, e2). Κατά το χρόνο επώασης, δεν παρατηρήθηκε σηµαντική αποδόµηση στις µη επιµολυσµένες καλλιέργειες όλων των ουσιών. Η δραστική ουσία metribuzin, 72 ώρες µετά τον εµβολιασµό, αποδοµήθηκε µεταξύ 14-18% και 8-12% από τις καλλιέργειες των στελεχών B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03, αντίστοιχα, ενώ το 118

125 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα napropamide κατά 9-11% από το στέλεχος B. subtilis FZB24 (Εικόνα 3.6 b1, b2, c1, c2). Τα ποσοστά αποδόµησης των ζιζανιοκτόνων metribuzin και napropamide στις υπόλοιπες βακτηριακές επεµβάσεις δεν διέφεραν σηµαντικά σε σχέση µε τους µη εβολιασµένους µάρτυρες. Το propamocarb hydrochloride αποδοµήθηκε σε ποσοστό 15% της αρχικής συγκέντρωσης (60 mg/l) από το στέλεχος B. amyloliquefaciens IN937a και 22% από το B. pumilus SE34 (Εικόνα 3.6 d1). Στο υψηλό επίπεδο συγκέντρωσης, τα συγκεκριµένα στελέχη ήταν ικανά να µειώσουν τα επίπεδα του propamocarb hydrochloride κατά 19% και 36%, αντίστοιχα (Εικόνα 3.6 d2). Τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34 και B. subtilis FZB24 αποδόµησαν 16-18%, 19-22%, και 11-14% των αρχικών συγκεντρώσεων thiamethoxam, αντίστοιχα, µετά από 72 ώρες επώαση (Εικόνα 3.6 e1, e2). 119

126 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα 1,0 control B. amyloliquefaciens IN937a B. pumilus SE34 B. subtilis FZB24 B. subtilis GB ,8 0,6 0,4 0, (a1) 0, ,24 (a2) ,4 0,22 2,2 0,20 2,0 0,18 (b1) 0, ,2 1,8 (b2) 1, Συγκέντρωση (mg/l) 2,0 1,8 1,6 (c1) 1, (c2) (d1) , (d2) ,60 0,24 2,40 0,22 2,20 0,20 2,00 0,18 (e1) 0, ,80 (e2) 1, Χρόνος επώασης (ώρες) Εικόνα 3.6 Αποδόµηση των acibenzolar-s-methyl (1.0 (a1) και 10.0 mg/l (a2)), metribuzin (0.25 (b1) και 2.50 mg/l (b2)), napropamide (2.0 (c1) και 20.0 mg/l (c2)), propamocarb hydrochloride (60.0 (d1) και mg/l (d2)), και thiamethoxam (0.2 (e1) και 2.0 mg/l (e2)) από τέσσερα PGPR του γένους Bacillus, σε υγρές καλλιέργειες TSB. Κάθε τιµή αντιστοιχεί στη µέση τιµή τριών επαναλήψεων. Οι κάθετες µπάρες εκφράζουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου. 120

127 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα 2,0E+09 control acibenzolar-s-methyl (1 mg/l) B. amyloliquefaciens IN937a 2,0E+09 acibenzolar-s-methyl (10 mg/l) B. subtilis FZB24 1,6E+09 1,6E+09 1,2E+09 1,2E+09 8,0E+08 8,0E+08 4,0E+08 4,0E+08 CFU/mL 0,0E+00 2,0E B. pumilus SE34 0,0E+00 2,5E B. subtilis GB03 1,5E+09 2,0E+09 1,0E+09 1,5E+09 1,0E+09 5,0E+08 5,0E+08 0,0E+00 0,0E Χρόνος (ώρες) Εικόνα 3.7 Βακτηριακή ανάπτυξη τεσσάρων PGPR του γένους Bacillus σε θρεπτικό υπόστρωµα TSB, επιφορτισµένο µε acibenzolar-s-methyl σε επίπεδα συγκέντρωσης 1.0 mg/l και 10.0 mg/l, και σε µη επιφορτισµένο µάρτυρα. Οι κάθετες µπάρες εκφράζουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου Επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στη βακτηριακή ανάπτυξη σε υγρές καλλιέργειες Η ανάπτυξη των βακτηριακών στελεχών, σε θρεπτικό υλικό TSB επιφορτισµένο ή όχι µε τα υπό µελέτη γεωργικά φάρµακα, προσδιορίστηκε µε τη µέτρηση των βιώσιµων αναπαραγωγικών µονάδων (CFUs) που αναπτύχθηκαν επάνω σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA, µετά από 1:10 διαδοχικές αραιώσεις και επιφανειακή επίστρωση σε τρυβλία µε TSA. Οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε 0, 10, 24, 30, 48 και 72 ώρες επώαση. Οι καµπύλες ανάπτυξης όλων των στελεχών PGPR, σε δείγµατα επιφορτισµένα µε το acibenzolar-s-methyl σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης (1.0 και 10.0 mg/l) αλλά και στους µη φορτισµένους µάρτυρες, παριστάνονται σχηµατικά στην Εικόνα 3.7. Αµέσως µετά τον εµβολιασµό των στελεχών στο υγρό θρεπτικό υλικό TSB (0 ώρες), ο αρχικός βακτηριακός πληθυσµός προσδιορίστηκε µεταξύ x 10 7 CFU/mL σε όλες τις επεµβάσεις. Στη συνέχεια, τα PGPR, µετά από µια µικρή φάση υστέρησης, εµφάνισαν εκθετική 121

128 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα αύξηση και ο αριθµός των αποικιών παρουσίασε µέγιστη τιµή ( x 10 9 CFU/mL) µέσα σε ώρες επώαση. Μετά από αυτή την απότοµη αύξηση του αριθµού των αποικιών, η βακτηριακή ανάπτυξη µειώθηκε σταδιακά σε x 10 9 CFU/mL και x 10 9 CFU/mL µετά από 48 και 72 ώρες επώαση, αντίστοιχα. Η καµπύλη ανάπτυξης του B. pumilus SE34 παρουσία 1.0 mg/l acibenzolar-s-methyl ήταν σχεδόν πανοµοιότυπη µε εκείνη του µάρτυρα. Στο υψηλό επίπεδο επιφόρτισης (10.0 mg/l) η προσθήκη της ουσίας προκάλεσε διεγερτική δράση στην ανάπτυξη του στελέχους, καθώς ο αριθµός των αποικιών ήταν σταθερά υψηλότερος σε σχέση µε το µάρτυρα. Επίσης, ο αριθµός των αποικιών στις επεµβάσεις µε τα B. amyloliquefaciens IN937a και B. subtilis FZB24 αυξήθηκε ελαφρώς σε σύγκριση µε τον µη επιφορτισµένο µάρτυρα, µετά από 72 ώρες επώαση. Στην περίπτωση του B. subtilis GB03, η προσθήκη acibenzolar-s-methyl δεν προκάλεσε καµία σηµαντική επίδραση στην ανάπτυξη των βακτηρίων. Στις βιοδοκιµές µε τα υπόλοιπα γεωργικά φάρµακα, η κινητική ανάπτυξης των βακτηριακών στελεχών παρουσίασε εκθετική αύξηση και ο αριθµός των αποικιών αυξήθηκε έως µία µέγιστη τιµή και στη συνέχεια παρατηρήθηκε µια µικρή µείωση µέχρι την 72 η ώρα επώασης σε όλες τις επεµβάσεις, ανεξάρτητα από την εφαρµογή γεωργικού φαρµάκου. Ειδικότερα, τα πειραµατικά δεδοµένα έδειξαν ότι όλα τα Bacillus στελέχη σε TSB θρεπτικό υπόστρωµα που επιφορτίστηκε µε metribuzin, στη συνιστώµενη δόση εφαρµογής και στη δεκαπλάσια αυτής, παρουσίασαν ανάπτυξη που δεν διέφερε σε σχέση µε το µάρτυρα, µε εξαίρεση το στέλεχος B. pumilus SE34 στην υψηλή δόση (2.5 mg/l), που οδήγησε σε χαµηλότερες τιµές ανάπτυξης µέχρι το τέλος της βιοδοκιµής (Εικόνα 3.8). Η προσθήκη 0.2 και 2.0 mg/l thiamethoxam προκάλεσε µείωση στη βακτηριακή ανάπτυξη του στελέχους B. subtilis GB03 και µικρή αύξηση στην ανάπτυξη των υπολοίπων στελεχών (Εικόνα 3.9). Επιπλέον, η επίδραση του ζιζανιοκτόνου napropamide, και στις δύο συγκεντρώσεις, στην ανάπτυξη των PGPR ήταν αµελητέα σε σύγκριση µε τους αντίστοιχους µάρτυρες που δεν έγινε εφαρµογή του ζιζανιοκτόνου (Εικόνα 3.10). Το καρβαµιδικό µυκητοκτόνο propamocarb hydrochloride στα επίπεδα 60 και 600 mg/l προκάλεσε διεγερτική δράση στους πληθυσµούς των B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34 και καµία επίδραση στους πληθυσµούς των B. subtilis FZB24 και GB03 (Εικόνα 3.11). 122

129 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα control metribuzin (0.25 mg/l) metribuzin (2.5 mg/l) 2,8E+09 B. amyloliquefaciens IN937a 2,0E+09 B. subtilis FZB24 2,4E+09 2,0E+09 1,6E+09 1,6E+09 1,2E+09 1,2E+09 8,0E+08 8,0E+08 4,0E+08 4,0E+08 CFU/mL 0,0E+00 2,5E B. pumilus SE34 0,0E B. subtilis GB03 2,5E+09 2,0E+09 2,0E+09 1,5E+09 1,5E+09 1,0E+09 1,0E+09 5,0E+08 5,0E+08 0,0E+00 0,0E Χρόνος (ώρες) Εικόνα 3.8 Βακτηριακή ανάπτυξη τεσσάρων PGPR του γένους Bacillus σε θρεπτικό υπόστρωµα TSB, επιφορτισµένο µε metribuzin σε επίπεδα συγκέντρωσης 0.25 mg/l και 2.5 mg/l, και σε µη επιφορτισµένο µάρτυρα. Οι κάθετες µπάρες εκφράζουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου. control thiamethoxam (0.2 mg/l) thiamethoxam (2 mg/l) 2,4E+09 B. amyloliquefaciens IN937a 2,0E+09 B. subtilis FZB24 2,0E+09 1,6E+09 1,6E+09 1,2E+09 1,2E+09 8,0E+08 8,0E+08 4,0E+08 4,0E+08 CFU/mL 0,0E+00 2,5E B. pumilus SE34 0,0E+00 2,4E B. subtilis GB03 2,0E+09 2,0E+09 1,5E+09 1,6E+09 1,2E+09 1,0E+09 8,0E+08 5,0E+08 4,0E+08 0,0E ,0E+00 Χρόνος (ώρες) Εικόνα 3.9 Βακτηριακή ανάπτυξη τεσσάρων PGPR του γένους Bacillus σε θρεπτικό υπόστρωµα TSB, επιφορτισµένο µε thiamethoxam σε επίπεδα συγκέντρωσης 0.2 mg/l και 2.0 mg/l, και σε µη επιφορτισµένο µάρτυρα. Οι κάθετες µπάρες εκφράζουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου. 123

130 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα 3,2E+09 control B. amyloliquefaciens IN937a napropamide (2 mg/l) 2,4E+09 napropamide (20 mg/l) B. subtilis FZB24 2,8E+09 2,4E+09 2,0E+09 2,0E+09 1,6E+09 CFU/mL 1,6E+09 1,2E+09 8,0E+08 4,0E+08 0,0E+00 4,5E+09 1,2E+09 8,0E+08 4,0E+08 0,0E ,0E+09 2,5E+09 3,5E+09 3,0E+09 2,0E+09 2,5E+09 1,5E+09 2,0E+09 1,5E+09 1,0E+09 1,0E+09 5,0E+08 5,0E+08 0,0E+00 0,0E Χρόνος (ώρες) B. pumilus SE34 B. subtilis GB03 3,0E Εικόνα 3.10 Βακτηριακή ανάπτυξη τεσσάρων PGPR του γένους Bacillus σε θρεπτικό υπόστρωµα TSB, επιφορτισµένο µε napropamide σε επίπεδα συγκέντρωσης 2 mg/l και 20 mg/l, και σε µη επιφορτισµένο µάρτυρα. Οι κάθετες µπάρες εκφράζουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου. control propamocarb hydrochloride (60 mg/l) propamocarb hydrochloride (600 mg/l) 2,4E+09 B. amyloliquefaciens IN937a 2,0E+09 B. subtilis FZB24 2,0E+09 1,6E+09 1,6E+09 1,2E+09 1,2E+09 8,0E+08 8,0E+08 4,0E+08 4,0E+08 CFU/mL 0,0E+00 4,0E+09 3,5E B. pumilus SE34 0,0E+00 2,5E B. subtilis GB03 3,0E+09 2,0E+09 2,5E+09 2,0E+09 1,5E+09 1,5E+09 1,0E+09 1,0E+09 5,0E+08 5,0E+08 0,0E ,0E+00 Χρόνος (ώρες) Εικόνα 3.11 Βακτηριακή ανάπτυξη τεσσάρων PGPR του γένους Bacillus σε θρεπτικό υπόστρωµα TSB, επιφορτισµένο µε propamocarb hydrochloride σε επίπεδα συγκέντρωσης 60 mg/l και 600 mg/l, και σε µη επιφορτισµένο µάρτυρα. Οι κάθετες µπάρες εκφράζουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου. 124

131 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα Επίδραση των PGPR στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος Κατά την πραγµατοποίηση των πειραµάτων αποδόµησης των γεωργικών φαρµάκων, τα εδαφικά δείγµατα συλλέγονταν σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα και η ανάλυση των υπολειµµάτων γινόταν στα συστήµατα υγρής χρωµατογραφίας που προαναφέρθηκαν. Οι µέσες τιµές των υπολειµµάτων σε συνάρτηση µε τους χρόνους δειγµατοληψίας χρησιµοποιήθηκαν για την κατασκευή των καµπυλών αποδόµησης. Από τις καµπύλες αποδόµησης προσδιορίστηκαν οι τιµές DT 50 (χρονικό διάστηµα που απαιτείται για να µειωθεί κατά 50% η αρχική συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου). Για τον προσδιορισµό των τιµών DT 50 χρησιµοποιήθηκε η εξίσωση κινητικής πρώτης τάξης (C t = C 0 e -kt ) σε όλες τις επεµβάσεις, µε εξαίρεση το ζιζανιοκτόνο metribuzin. Οι εξισώσεις κινητικής πρώτης τάξης έδιναν και στα δύο επίπεδα συγκέντρωσης συντελεστές συσχέτισης (r 2 ) µεγαλύτερους από Το ζιζανιοκτόνο metribuzin παρουσίασε αποδόµηση δύο σταδίων, µε το πρώτο στάδιο να εµφανίζει ταχύτερη αποδόµηση από ότι το δεύτερο και για το λόγο αυτό χρησιµοποιήθηκε το µοντέλο C t = C 1 * e -k1t + C 2 * e -k2t, µε συντελεστές συσχέτισης (r 2 ) πάνω από Οι τιµές DT 50 των γεωργικών φαρµάκων που δοκιµάστηκαν (acibenzolar- S-methyl, metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride, thiamethoxam) σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης, µετά από τον εµβολιασµό αποστειρωµένου εδάφους µε τα Bacillus PGPR, παριστάνονται στον Πίνακα 3.7. Οι συγκεκριµένες δοκιµές πραγµατοποιήθηκαν σε αποστειρωµένο έδαφος προκειµένου να διερευνηθεί η επίδραση των PGPR εµβολίων στην αποδόµηση των ουσιών, χωρίς την επίδραση του ενδογενούς µικροβιακού πληθυσµού. Η ενσωµάτωση των εµβολίων B. amyloliquefaciens IN937a, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03 σε αποστειρωµένα εδαφικά δείγµατα οδήγησε σε παρόµοιες καµπύλες αποδόµησης του acibenzolar-s-methyl. Η διεργασία της αποδόµησης εµφάνισε, µε την προσθήκη των παραπάνω στελεχών, µέσες σταθερές του ρυθµού αποδόµησης (K) 0.046, και d -1, αντίστοιχα. Η ανάλυση των αποτελεσµάτων έδειξε επίσης ότι ο εµβολιασµός αποστειρωµένων δειγµάτων εδάφους µε το PGPR στέλεχος B. pumilus SE34 αύξησε την ταχύτητα αποδόµησης του acibenzolar-s-methyl σε σύγκριση µε τα υπόλοιπα βακτηριακά στελέχη και το µάρτυρα. Η µέση τιµή της σταθεράς του ρυθµού αποδόµησης (K) 125

132 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα του acibenzolar-s-methyl παρουσία του B. pumilus SE34 ήταν d -1. Το χρονικό διάστηµα κατά το οποίο η αρχική συγκέντρωση του acibenzolar-smethyl µειώθηκε κατά 50% ήταν 15.1, 10.3, 15.9, 16.4 ηµέρες και 14.5, 9.2, 14.7, 15.9 ηµέρες για τα B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03 σε επίπεδα συγκέντρωσης 1.0 mg/kg, και 10.0 mg/kg, αντίστοιχα (Πίνακας 3.7). Στους µάρτυρες που δεν εφαρµόστηκαν βακτηριακά στελέχη, οι τιµές DT 50 ήταν 38.8 ηµέρες και 34.2 ηµέρες στην µικρή και µεγάλη συγκέντρωση, αντίστοιχα, σηµαντικά υψηλότερες σε σχέση µε τις άλλες επεµβάσεις (Πίνακας 3.7). Τα ζιζανιοκτόνα metribuzin και napropamide παρουσίασαν αρκετά µικρότερους ρυθµούς διάσπασης και οι τιµές DT 50 κυµάνθηκαν από έως ηµέρες και µεταξύ έως ηµέρες, αντίστοιχα (Πίνακας 3.7). Η καµπύλες αποδόµησης του metribuzin εµφάνισαν δύο στάδια, αποτελούµενες από ένα πρώτο στάδιο ταχύτερης αποδόµησης κατά τη διάρκεια των πρώτων 14 ηµερών επώασης, ακολουθούµενο από ένα δεύτερο στάδιο µε βραδύτερο ρυθµό αποδόµησης. Οι τιµές DT 50 της metribuzin στη µικρή δόση εφαρµογής ήταν 129.8, 128.1, και ηµέρες σε δείγµατα εδάφους που εµβολιάστηκαν µε τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03 και στη µεγάλη δόση 139.0, 140.6, και ηµέρες, αντίστοιχα (Πίνακας 3.7). Στους µάρτυρες που δεν δέχτηκαν βακτηριακή επέµβαση οι τιµές DT 50 της metribuzin ήταν και ηµέρες στη µικρή και µεγάλη συγκέντρωση, αντίστοιχα. Στο ζιζανιοκτόνο napropamide οι τιµές DT 50 κυµάνθηκαν µεταξύ ηµέρες και ηµέρες στα επίπεδα 2.0 και 20.0 mg/kg, αντίστοιχα, στις διάφορες PGPR µεταχειρίσεις σε σχέση µε και ηµέρες που προσδιορίστηκαν στους αντίστοιχους µάρτυρες (Πίνακας 3.7). Και στα δύο ζιζανιοκτόνα, δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές (P>0.05) στις τιµές DT 50 µεταξύ των PGPR επεµβάσεων και τους µάρτυρες, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο εµβολιασµός του εδάφους µε τα PGPR δεν είχε επίδραση στην αποδόµηση αυτών των ουσιών (Πίνακας 3.7). Η αποδόµηση του µυκητοκτόνου propamocarb hydrochloride από το βακτηριακό στέλεχος B. amyloliquefaciens IN937a ήταν ταχύτερη, ακολουθούµενη από το βακτήριο B. pumilus SE34, µε αντίστοιχες τιµές DT 50 από ηµέρες και ηµέρες. Μεταξύ των δειγµάτων που εµβολιάστηκαν µε τα στελέχη B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03 και των 126

133 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα εδαφών που δεν δέχτηκαν βακτηριακή µεταχείριση δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές (P>0.05) στην ταχύτητα αποδόµησης του propamocarb hydrochloride. Τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34 και B. subtilis FZB24 ήταν ικανά να αποδοµήσουν το εντοµοκτόνο thiamethoxam και εµφάνισαν τιµές DT 50 από ηµέρες, ηµέρες και ηµέρες σε δόσεις 0.2 και 2 mg/kg, αντίστοιχα. Μη σηµαντικές διαφορές στο ρυθµό αποδόµησης του thiamethoxam βρέθηκαν µεταξύ δειγµάτων χωρίς βακτηριακή επέµβαση και εδαφών που εµβολιάστηκαν µε B. subtilis GB03 και οι αντίστοιχες τιµές DT 50 κυµάνθηκαν από έως ηµέρες και έως ηµέρες στα δύο επίπεδα συγκέντρωσης (Πίνακας 3.7). Τα PGPR ενσωµατώθηκαν επίσης στο ίδιο έδαφος, χωρίς προηγουµένως να έχει αποστειρωθεί, µε σκοπό να µελετηθεί η πιθανή επίδρασή τους στην αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων acibenzolar-s-methyl, metribuzin και thiamethoxam σε φυσικό έδαφος. Από την ανάλυση των αποτελεσµάτων διαπιστώθηκε ότι σε όλες τις περιπτώσεις δεν υπήρχαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των εδαφών που εµβολιάστηκαν µε τα PGPR και των δειγµάτων χωρίς προσθήκη εµβολίου (Πίνακας 3.8). Ωστόσο, οι τιµές DT 50 µειώθηκαν σηµαντικά σε σχέση µε τις τιµές που προσδιορίστηκαν στις πειραµατικές δοκιµές µε το αποστειρωµένο έδαφος και κυµάνθηκαν µεταξύ ώρες, ηµέρες και ηµέρες για τα acibenzolar-s-methyl, metribuzin και thiamethoxam, αντίστοιχα (Πίνακας 3.8). Χρησιµοποιήθηκε και ένας επιπλέον τύπος εδάφους διαφορετικής σύστασης, που προερχόταν από αγροτεµάχιο της περιοχής Βάβδου Χαλκιδικής, για να ελεγχθεί η επίδραση των βακτηριακών στελεχών σε διαφορετικές εδαφικές συνθήκες. Στα συγκεκριµένα πειράµατα δοκιµάστηκαν οι δραστικές ουσίες metribuzin (0.25 mg/kg) και thiamethoxam (0.2 mg/kg) στις µικρές δόσεις εφαρµογής. Οι τιµές DT 50 κυµάνθηκαν από 28.7 έως 31.3 ηµέρες (metribuzin) και από έως ηµέρες (thiamethoxam), ενώ δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των βακτηριακών επεµβάσεων και των µαρτύρων. 127

134 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα Πίνακας 3.7 Τιµές DT 50 (ηµέρες) των γεωργικών φαρµάκων σε αποστειρωµένο έδαφος αγρού που εµβολιάστηκε µε τα PGPR του γένους Bacillus σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης. DT 50 (ηµέρες) Propamocarb Επέµβαση Acibenzolar-S-methyl Metribuzin Napropamide hydrochloride Thiamethoxam mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg Control x 38.8a y 34.2a 133.5a 141.3a 182.2a 228.9a 117.8a 123.1a 236.3a 268.9a IN937a 15.1b 14.5b 129.8a 139.0a 180.3a 226.5a 91.8c 94.9c 219.1b 251.0b SE c 9.2c 128.1a 140.6a 176.7a 225.2a 104.9b 110.8b 212.9b 255.1b FZB b 14.7b 131.9a 138.4a 179.1a 225.7a 118.2a 121.9a 216.1b 253.5b GB b 15.9b 132.7a 138.0a 178.3a 222.4a 115.0a 123.9a 233.6a 265.5a x control: αποστειρωµένο έδαφος χωρίς βακτηριακή µεταχείριση; IN937a: αποστειρωµένο έδαφος εµβολιασµένο µε το στέλεχος B. amyloliquefaciens IN937a; SE34: αποστειρωµένο έδαφος εµβολιασµένο µε το στέλεχος B. pumilus SE34; FZB24: αποστειρωµένο έδαφος εµβολιασµένο µε το στέλεχος B. subtilis FZB24; GB03: αποστειρωµένο έδαφος εµβολιασµένο µε το στέλεχος B. subtilis GB03. y Οι τιµές εντός των στηλών που ακολουθούνται από διαφορετικά γράµµατα διαφέρουν σηµαντικά µεταξύ τους σύµφωνα µε το κριτήριο Duncan, σε επίπεδο σηµαντικότητας P =

135 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα Πίνακας 3.8 Τιµές DT 50 των acibenzolar-s-methyl, metribuzin, thiamethoxam σε φυσικό έδαφος αγρού που εµβολιάστηκε µε τα PGPR του γένους Bacillus σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης. DT 50 Acibenzolar-S-methyl x Metribuzin y Thiamethoxam y Επέµβαση 1 mg/kg 10 mg/kg 0.25 mg/kg 2.5 mg/kg 0.2 mg/kg 2 mg/kg Control z 8.8a w 8.6a 34.7a 41.3a 177.8a 184.0a IN937a 8.3a 7.9a 35.7a 42.0a 176.9a 182.7a SE34 8.2a 7.6a 37.0a 41.3a 172.1a 182.1a FZB24 8.4a 8.6a 34.7a 40.7a 174.8a 185.6a GB03 8.5a 8.5a 34.0a 40.3a 176.9a 183.5a x τιµές DT 50 εκφρασµένες σε ώρες. y τιµές DT 50 εκφρασµένες σε ηµέρες. z control: έδαφος χωρίς βακτηριακή µεταχείριση; IN937a: έδαφος εµβολιασµένο µε το στέλεχος B. amyloliquefaciens IN937a; SE34: έδαφος εµβολιασµένο µε το στέλεχος B. pumilus SE34; FZB24: έδαφος εµβολιασµένο µε το στέλεχος B. subtilis FZB24; GB03: έδαφος εµβολιασµένο µε το στέλεχος B. subtilis GB03. w Οι τιµές εντός των στηλών που ακολουθούνται από το ίδιο γράµµα δεν διαφέρουν σηµαντικά µεταξύ τους σύµφωνα µε το κριτήριο Duncan, σε επίπεδο σηµαντικότητας P = Επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στην ανάπτυξη των PGPR στο έδαφος Η συλλογή των δειγµάτων εδάφους, για τον προσδιορισµό του πληθυσµού των βακτηριακών στελεχών, πραγµατοποιήθηκε σε 0, 7, 14, 21, 28 και 35 ηµέρες επώαση. Οι αποικίες µετρήθηκαν µακροσκοπικά και εκφράστηκαν σε CFU/g εδάφους. Κάθε PGPR στέλεχος ενσωµατώθηκε ξεχωριστά σε αποστειρωµένα εδαφικά δείγµατα, έτσι ώστε η αρχική συγκέντρωση των βακτηρίων ήταν περίπου 2.0 x 10 7 CFU/g εδάφους. Οι πληθυσµοί των στελεχών B. amyloliquefaciens IN937a, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03 στους µάρτυρες εµφάνισαν µικρή αύξηση τις πρώτες 14 ηµέρες επώασης και στη συνέχεια µειώθηκαν σταδιακά και διαµορφώθηκαν στα 1.80 x 10 7, 1.63 x 10 7 και 1.50 x 10 7 CFU/g, αντίστοιχα, µετά από 35 ηµέρες επώαση. Στην περίπτωση του 129

136 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα PGPR στελέχους B. pumilus SE34 ο αριθµός των αποικιών διατηρήθηκε στο ίδιο επίπεδο σε σχέση µε την αρχική πυκνότητα εµβολιασµού µε την ολοκλήρωση του χρόνου επώασης (Εικόνα 3.12). control acibenzolar-s-methyl (1 mg/kg) acibenzolar-s-methyl (10 mg/kg) 3,5E+07 B. amyloliquefaciens IN937a 3,0E+07 B. subtilis FZB24 3,0E+07 2,5E+07 2,5E+07 2,0E+07 1,5E+07 1,0E+07 5,0E+06 2,0E+07 1,5E+07 1,0E+07 5,0E+06 CFU/g 0,0E ,0E ,0E+07 B. pumilus SE34 3,0E+07 B. subtilis GB03 2,5E+07 2,5E+07 2,0E+07 2,0E+07 1,5E+07 1,5E+07 1,0E+07 1,0E+07 5,0E+06 5,0E+06 0,0E+00 0,0E Χρόνος (ηµέρες) Εικόνα 3.12 Βακτηριακή ανάπτυξη τεσσάρων PGPR του γένους Bacillus που ενσωµατώθηκαν σε αποστειρωµένο έδαφος, επιφορτισµένο µε acibenzolar-s-methyl σε επίπεδα συγκέντρωσης 1.0 mg/kg και 10.0 mg/kg, και σε µη επιφορτισµένο µάρτυρα. Οι κάθετες µπάρες εκφράζουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου. Η εφαρµογή του acibenzolar-s-methyl σε συγκέντρωση 1.0 mg/kg προκάλεσε µικρή αύξηση στους πληθυσµούς όλων των στελεχών, ενώ σε δεκαπλάσια συγκέντρωση (10.0 mg/kg) παρατηρήθηκε περαιτέρω αύξηση του πληθυσµού των βακτηριακών στελεχών, µετά από 35 ηµέρες επώαση (Εικόνα 3.12). Μη σηµαντικές διαφορές στους αριθµούς των αποικιών µεταξύ των PGPR επεµβάσεων και τους µάρτυρες προέκυψαν στα ζιζανιοκτόνα metribuzin και napropamide. Συγκεκριµένα, τα δεδοµένα έδειξαν ότι οι πληθυσµοί των PGPR εµβολίων µετά από 35 ηµέρες επώαση σε δείγµατα εδάφους που δέχτηκαν 130

137 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα µεταχείριση µε τις συνιστώµενες και τις δεκαπλάσιες δόσεις των metribuzin και napropamide δεν διέφεραν σηµαντικά σε σχέση µε τους πληθυσµούς στους µάρτυρες. Επιπλέον, η εφαρµογή 60 mg/kg propamocarb hydrochloride προκάλεσε αύξηση όλων των βακτηριακών πληθυσµών σε 35 ηµέρες επώαση. Ειδικότερα, ο αριθµός των PGPR αποικιών, µε την ολοκλήρωση του χρόνου επώασης, ήταν αυξηµένος και κυµάνθηκε µεταξύ x 10 7 CFU/g σε δείγµατα εδάφους που έγινε εφαρµογή του µυκητοκτόνου propamocarb hydrochloride στη συνιστώµενη δόση (Εικόνα 3.13). Παροµοίως, η προσθήκη thiamethoxam προκάλεσε αύξηση του αριθµού των αποικιών σε όλα τα PGPR που µελετήθηκαν. Μετά από επώαση 35 ηµερών, οι βακτηριακοί πληθυσµοί των στελεχών B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24, B. subtilis GB03 ήταν 2.05, 2.10, 3.74, 4.27 x 10 7 CFU/g και 2.13, 2.22, 4.07, 4.52 x 10 7 CFU/g στα δείγµατα εδάφους που επιφορτίστηκαν µε thiamethoxam σε µικρό (0.2 mg/kg) και µεγάλο (2.0 mg/kg) επίπεδο συγκέντρωσης, αντίστοιχα, σε σχέση µε τους µη επιφορτισµένους µάρτυρες ( x 10 7 CFU/g), (Εικόνα 3.14). control propamocarb hydrochloride (60 mg/kg) propamocarb hydrochloride (600 mg/l) 3,0E+07 B. amyloliquefaciens IN937a 3,5E+07 B. subtilis FZB24 2,5E+07 3,0E+07 2,0E+07 1,5E+07 1,0E+07 2,5E+07 2,0E+07 1,5E+07 1,0E+07 5,0E+06 5,0E+06 CFU/g 0,0E+00 3,0E B. pumilus SE34 0,0E+00 3,0E B. subtilis GB03 2,5E+07 2,5E+07 2,0E+07 2,0E+07 1,5E+07 1,5E+07 1,0E+07 1,0E+07 5,0E+06 5,0E+06 0,0E+00 0,0E Χρόνος (ηµέρες) Εικόνα 3.13 Βακτηριακή ανάπτυξη τεσσάρων PGPR του γένους Bacillus που ενσωµατώθηκαν σε αποστειρωµένο έδαφος, επιφορτισµένο µε propamocarb hydrochloride σε επίπεδα συγκέντρωσης 60 mg/kg και 600 mg/kg, και σε µη επιφορτισµένο µάρτυρα. Οι κάθετες µπάρες εκφράζουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου. 131

138 Κεφάλαιο 3 Αποτελέσµατα control thiamethoxam (0.2 mg/kg) thiamethoxam (2 mg/kg) 3,0E+07 B. amyloliquefaciens IN937a 5,0E+07 B. subtilis FZB24 2,5E+07 4,0E+07 2,0E+07 1,5E+07 3,0E+07 1,0E+07 2,0E+07 5,0E+06 1,0E+07 CFU/g 0,0E+00 3,0E B. pumilus SE34 0,0E+00 5,0E B. subtilis GB03 2,5E+07 4,0E+07 2,0E+07 3,0E+07 1,5E+07 1,0E+07 2,0E+07 5,0E+06 1,0E+07 0,0E+00 0,0E Χρόνος (ηµέρες) Εικόνα 3.14 Βακτηριακή ανάπτυξη τεσσάρων PGPR του γένους Bacillus που ενσωµατώθηκαν σε αποστειρωµένο έδαφος, επιφορτισµένο µε thiamethoxam σε επίπεδα συγκέντρωσης 0.2 mg/kg και 2.0 mg/kg, και σε µη επιφορτισµένο µάρτυρα. Οι κάθετες µπάρες εκφράζουν την τυπική απόκλιση του µέσου όρου. 132

139 Κεφάλαιο 3 Συζήτηση Αποτελεσµάτων 3.4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Στο συγκεκριµένο κεφάλαιο µελετήθηκε η πιθανή επίδραση τεσσάρων εξωγενών PGPR του γένους Bacillus (B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24, B. subtilis GB03) στην αποδόµηση πέντε συνθετικών γεωργικών φαρµάκων (acibenzolar-s-methyl, metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride, thiamethoxam) που ανήκουν σε διαφορετικές χηµικές οµάδες. Οι δοκιµές πραγµατοποιήθηκαν σε υγρές καλλιέργειες TSB αλλά και σε έδαφος αγρού αποστειρωµένο και φυσικό, σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης. Επίσης, διερευνήθηκε και η επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στους PGPR πληθυσµούς. Επισηµαίνεται στο σηµείο αυτό ότι οι πειραµατικές δοκιµές πραγµατοποιήθηκαν µε σκοπό να µελετηθούν οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ PGPR εµβολίων και γεωργικών φαρµάκων, ως βασικές συνιστώσες σε προγράµµατα ολοκληρωµένης καταπολέµησης και όχι για να διερευνηθεί η δυνατότητα χρησιµοποίησης των συγκεκριµένων στελεχών για την απορρύπανση εδαφών από γεωργικά φάρµακα. Τα δεδοµένα έδειξαν ότι η εισαγωγή PGPR εµβολίων σε ασηπτικές συνθήκες (υγρές καλλιέργειες και αποστειρωµένο έδαφος) µπορεί να αυξήσει σε σηµαντικό βαθµό την αποδόµηση ορισµένων γεωργικών φαρµάκων. Συγκεκριµένα, το acibenzolar-s-methyl σε υγρή καλλιέργεια TSB αποδοµήθηκε από τα 4 ριζοβακτήρια από 58 έως 100%, σε σύγκριση µε ποσοστό 5-7% που προσδιορίστηκε στους µη εµβολιασµένους µάρτυρες, σε 24 ώρες επώαση. Μεταξύ των στελεχών το B. pumilus SE34 παρουσίασε τη µεγαλύτερη ταχύτητα αποδόµησης, µε 100% αποδόµηση του acibenzolar-s-methyl σε 24 ώρες και στις δύο συγκεντρώσεις που δοκιµάστηκαν. Μετά από επώαση 48 ωρών, περισσότερο από 98% της αρχικής συγκέντρωσης acibenzolar-s-methyl αποδοµήθηκε από τα PGPR σε σύγκριση µε 16-17% στις µη εµβολιασµένες καλλιέργειες. Είναι εµφανές ότι η αυξηµένη αποδόµηση του acibenzolar-smethyl συνδέεται µε την προσθήκη των ριζοβακτηρίων. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά Bacillus PGPR µε δυνατότητα αποδόµησης του acibenzolar-s-methyl σε υγρές καλλιέργειες. Η αποδόµηση του acibenzolar-s-methyl εξαιτίας της µείωσης του ph από την βακτηριακή ανάπτυξη αποκλείσθηκε, αφού το ph στις καλλιέργειες µειώθηκε ελαφρώς (από 7.4 µέχρι 6.6). Μάλιστα, όλα τα γεωργικά φάρµακα της παρούσας µελέτης είναι πιο σταθερά σε ph µεταξύ 5 και 7, όπως προκύπτει από τις ιδιότητες των συγκεκριµένων δραστικών ουσιών της βάσης 133

140 Κεφάλαιο 3 Συζήτηση Αποτελεσµάτων δεδοµένων του University of Hertfordshire (FOOTPRINT). Παρόµοια συµπεριφορά του acibenzolar-s-methyl παρατηρήθηκε και στο αποστειρωµένο έδαφος, µε ταχεία αποδόµηση και τιµές DT 50 µικρότερες από 16.4 ηµέρες στις επεµβάσεις µε τα PGPR σε σύγκριση µε τιµές DT 50 >34.2 ηµέρες που προσδιορίστηκαν στους µάρτυρες που δεν εφαρµόστηκαν βακτηριακά στελέχη. Όπως και στο TSB, το στέλεχος B. pumilus SE34 προκάλεσε το µεγαλύτερο ρυθµό αποδόµησης του acibenzolar-s-methyl µεταξύ των ριζοβακτηρίων που δοκιµάστηκαν. Σε σχέση µε τη συνολική µάζα των διαθέσιµων βιοαποδοµήσιµων θρεπτικών στοιχείων του εδάφους, τα γεωργικά φάρµακα που ενσωµατώθηκαν αποτελούν µικρή συγκέντρωση θρεπτικών και µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως δευτερεύον υπόστρωµα από τα PGPR. Αυτό συνεπάγεται ότι πιθανότατα ο µηχανισµός αποδόµησης των γεωργικών φαρµάκων που εξετάζονται είναι ο συµµεταβολισµός (FOCUS 2006). Στα υπόλοιπα γεωργικά φάρµακα, ο εµβολιασµός των υποστρωµάτων µε τα στελέχη PGPR προκάλεσε αποδόµηση των metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride και thiamethoxam που κυµάνθηκε στις διάφορες επεµβάσεις µεταξύ 8-18%, 9-11%, 15-36% και 11-22%, αντίστοιχα, µε την ολοκλήρωση του χρόνου επώασης. Ωστόσο, στις µη εµβολιασµένες καλλιέργειες όλων των ουσιών δεν παρατηρήθηκε σηµαντική αποδόµηση. Σε προγενέστερη έρευνα βιοαποδόµησης του metribuzin σε υγρές καλλιέργειες, από 53 είδη µυκήτων που αποµονώθηκαν από έδαφος ρυπασµένο ή όχι µε metribuzin, µόνο τρία είδη µπόρεσαν να αποδοµήσουν πάνω από το 50% του metribuzin σε 5 ηµέρες επώαση (Bordjiba et al., 2001). Η πλειονότητα των ειδών αποδόµησε την ουσία κατά 15-40% και ορισµένα είδη παρουσίασαν πολύ χαµηλά ποσοστά αποδόµησης (κάτω από 20%). Οι Schilling et al. (1985) ανέφεραν επίσης αποδόµηση του metribuzin από καλλιέργειες πέντε µυκήτων, ενώ ο Grigg και οι συνεργάτες του (1997) διαπίστωσαν την αδυναµία αποδόµησης του metribuzin από µικροοργανισµούς που αποµονώθηκαν από το έδαφος σε υγρές καλλιέργειες. Η µελέτη της µικροβιακής αποδόµησης του napropamide είναι πολύ περιορισµένη. Μέχρι τώρα, δεν έχουν περιγραφεί στη διεθνή βιβλιογραφία καλλιέργειες µικροοργανισµών µε δυνατότητα αποδόµησης του ζιζανιοκτόνου napropamide. Μικρή αποδόµηση του propamocarb από όλους τους µικροοργανισµούς του εδάφους που µελετήθηκαν, προσδιορίστηκε σε ανάλογη έρευνα από τους Knowles και Benezet (1981). Σε πρόσφατη έρευνα, οι Pandey et 134

141 Κεφάλαιο 3 Συζήτηση Αποτελεσµάτων al. (2009) ανέφεραν την αποµόνωση των Pseudomonas sp. στελεχών 1G, 1W και GP2 που ήταν ικανά να αποδοµούν περίπου το 70% του thiamethoxam σε 14 ηµέρες επώαση. Μέχρι σήµερα, περιορισµένα πειραµατικά δεδοµένα είναι διαθέσιµα στη βιβλιογραφία σχετικά µε την in vitro αποδόµηση γεωργικών φαρµάκων που εφαρµόζονται στο έδαφος από καλλιέργειες PGPR. Συγκεκριµένα, οι Osman et al. (2008) προσδιόρισαν αποδόµηση του dicofol από PGPR που κυµάνθηκε µεταξύ 26-33% σε χρονικό διάστηµα 3 ηµερών. Επιπλέον, τα ποσοστά αποδόµησης του bromoxynil σε υγρές καλλιέργειες που εµβολιάστηκαν µε 7 διαφορετικά PGPR κυµάνθηκαν από 30 έως 72% σε 72 ώρες επώαση (Askar et al., 2007). Όπως προκύπτει από την ανάλυση των αποτελεσµάτων, παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές στο ρυθµό αποδόµησης των propamocarb hydrochloride και thiamethoxam σε εδάφη που ενσωµατώθηκαν τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34, σε σχέση µε δείγµατα που δεν δέχτηκαν βακτηριακή επέµβαση. Επιπλέον, η προσθήκη των PGPR εµβολίων σε αποστειρωµένα εδαφικά δείγµατα δεν επηρέασε την αποδόµηση των ζιζανιοκτόνων metribuzin και napropamide, αφού δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές (P>0.05) στις τιµές DT 50 µεταξύ των PGPR επεµβάσεων και τους µάρτυρες χωρίς βακτηριακή µεταχείριση. Και τα δύο ζιζανιοκτόνα παρουσίασαν µικρούς ρυθµούς διάσπασης µε τιµές DT 50 που κυµάνθηκαν µεταξύ ηµέρες (metribuzin) και ηµέρες (napropamide). Στην περίπτωση του metribuzin, η αποδόµηση της ουσίας στο έδαφος περιγράφηκε µε την εξίσωση δύο σταδίων, µε ταχύ ρυθµό αποδόµησης στην αρχή που ακολουθείται από µια πιο αργή αποδόµηση, γεγονός που είναι σε συµφωνία µε προηγούµενη έρευνα (Henriksen et al., 2004). Οι υπολογιζόµενες τιµές DT 50 του metribuzin ήταν εντός του εύρους ( ηµέρες) που αναφέρθηκε σε προγενέστερη µελέτη αποδόµησης σε αποστειρωµένα δείγµατα εδάφους (Khoury et al., 2006). Επιπλέον, οι τιµές DT 50 του napropamide που προσδιορίστηκαν ήταν γενικά σε συµφωνία µε τους Guo et al. (2008), οι οποίοι αναφέρουν ότι ο χρόνος DT 50 του napropamide σε αποστειρωµένο έδαφος ήταν περίπου τριπλάσιος αυτού σε φυσικό. Η αποδόµηση του napropamide σε φυσικό έδαφος είναι αργή, µε χρόνο DT 50 που κυµαίνεται µεταξύ ηµέρες σε εργαστηριακές συνθήκες (Wauchope et al., 1992). 135

142 Κεφάλαιο 3 Συζήτηση Αποτελεσµάτων Ωστόσο, τα αποτελέσµατα της έρευνας διαφοροποιούνται σηµαντικά όταν ο εµβολιασµός των PGPR πραγµατοποιήθηκε σε φυσικό έδαφος αγρού. Συγκεκριµένα, στα γεωργικά φάρµακα acibenzolar-s-methyl, metribuzin και thiamethoxam που πραγµατοποιήθηκε η µελέτη, διαπιστώθηκε ότι δεν υπήρχαν σηµαντικές διαφορές, ως προς το ρυθµό αποδόµησης, µεταξύ των εδαφών που εµβολιάστηκαν µε τα στελέχη PGPR και των δειγµάτων χωρίς βακτηριακή µεταχείριση σε όλα τα γεωργικά φάρµακα και στα δύο επίπεδα συγκέντρωσης. Όµως, οι τιµές DT 50 που προσδιορίστηκαν ήταν σηµαντικά µειωµένες σε σχέση µε τις τιµές που προσδιορίστηκαν στις πειραµατικές δοκιµές µε το αποστειρωµένο έδαφος και κυµάνθηκαν µεταξύ ώρες (acibenzolar-smethyl), ηµέρες (metribuzin) και ηµέρες (thiamethoxam). Ακόµη και στην περίπτωση που τα συγκεκριµένα στελέχη ενσωµατώθηκαν σε έδαφος διαφορετικής σύστασης δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές στο ρυθµό αποδόµησης των metribuzin και thiamethoxam µεταξύ των PGPR επεµβάσεων και τους µάρτυρες. Από τα αποτελέσµατα προκύπτουν σηµαντικές διαφορές ως προς την επίδραση των προστιθέµενων αυξητικών ριζοβακτηρίων στην αποδόµηση γεωργικών φαρµάκων σε αποστειρωµένο περιβάλλον και σε φυσικό έδαφος, όπου υπάρχει η ενδογενής µικροβιακή κοινότητα. Τέτοιες διαφοροποιήσεις έχουν αναφερθεί και σε ανάλογες µελέτες αποδόµησης που έγιναν µε βακτηριακά στελέχη που αποµονώθηκαν από το έδαφος (Goswami and Singh 2009). Το γεγονός αυτό µπορεί να οφείλεται µεταξύ άλλων στο ότι το φυσικό περιβάλλον µπορεί να περιέχει ουσίες που εµποδίζουν την ανάπτυξη και τη δραστηριότητα του εµβολίου, στον ανταγωνισµό που δέχονται οι προστιθέµενοι πληθυσµοί των βακτηρίων από τους ενδογενείς πληθυσµούς µικροβίων και στην αρχική πυκνότητα του εµβολίου (Cycoń et al., 2009; Goswami and Singh 2009; Goswami et al., 2009). Εκτός από τους βιολογικούς παράγοντες, διάφοροι αβιοτικοί παράγοντες έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την βακτηριακή αποδόµηση των γεωργικών φαρµάκων στο έδαφος. Χαρακτηριστικά του εδάφους, όπως η περιεκτικότητα σε οργανική ύλη, το ph, η θερµοκρασία, η υφή του εδάφους, και η συγκέντρωση των γεωργικών φαρµάκων µπορεί να επηρεάσει την διαδικασία της βιοαποδόµησης (Liu et al., 1990; Singh et al., 2006). 136

143 Κεφάλαιο 3 Συζήτηση Αποτελεσµάτων Η ανάπτυξη των βακτηριακών στελεχών σε θρεπτικό υλικό TSB παρουσίασε µια µικρή φάση υστέρησης αµέσως µετά τον εµβολιασµό των PGPR και στη συνέχεια εµφάνισε εκθετική αύξηση και ο αριθµός των αποικιών παρουσίασε µέγιστη τιµή µέσα σε ώρες επώαση. Μετά από αυτή την απότοµη αύξηση του αριθµού των αποικιών, η βακτηριακή ανάπτυξη µειώθηκε σταδιακά µετά από 48 και 72 ώρες επώαση. Παρόµοια κινητική ανάπτυξης των βακτηρίων έχει αναφερθεί και από τους Kim et al. (2004), οι οποίοι παρατήρησαν µέγιστη αύξηση του Sphingomonas sp. SB5 σε 24 ώρες επώαση και στη συνέχεια µείωση της ανάπτυξης µε το χρόνο σε µελέτη αποδόµησης του carbofuran. Γενικά, η ανάπτυξη των βακτηριακών κυττάρων παρουσία των γεωργικών φαρµάκων και στα δύο επίπεδα φόρτισης ήταν ικανοποιητική και µάλιστα σε ορισµένες περιπτώσεις παρατηρήθηκε ακόµη και διεγερτική δράση των ουσιών στην ανάπτυξη των βακτηρίων. Σε παρόµοια έρευνα, οι Ahemad και Khan (2011a) µελέτησαν την επίδραση των εντοµοκτόνων fipronil, pyriproxyfen, imidacloprid και thiamethoxam, στη συνιστώµενη και σε υψηλότερες δόσεις εφαρµογής, στην επιβίωση του PGPR στελέχους Klebsiella sp. PS19. Τo στέλεχος αναπτύχθηκε ικανοποιητικά στις διάφορες συγκεντρώσεις των εντοµοκτόνων που µελετήθηκαν και µπορούσε να επιβιώσει σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις που κυµαίνονταν από 1200 µg/ml (pyriproxyfen) έως 2000 µg/ml (thiamethoxam). Μόνο στην περίπτωση των στελεχών B. pumilus SE34 και B. subtilis GB03 παρουσία των metribuzin (2.5 mg/l) και thiamethoxam, αντίστοιχα, παρατηρήθηκε µικρή ανασταλτική δράση. Ανάλογη συµπεριφορά των metribuzin και thiamethoxam στο PGPR στέλεχος Rhizobium sp. MRL3, σε δόσεις πολλαπλάσιες της συνιστώµενης, έχει αναφερθεί πρόσφατα (Ahemad and Khan, 2011d). Αποστειρωµένα εδαφικά δείγµατα που εµβολιάστηκαν µε τα στελέχη PGPR B. amyloliquefaciens IN937a, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03 εµφάνισαν µικρή αύξηση τις πρώτες 14 ηµέρες επώασης και στη συνέχεια µειώθηκαν σταδιακά έως την ολοκλήρωση του χρόνου επώασης (35 ηµέρες). Στο στέλεχος B. pumilus SE34 ο αριθµός των αποικιών διατηρήθηκε στο ίδιο επίπεδο σε σχέση µε την αρχική πυκνότητα εµβολιασµού. Σταθερή πυκνότητα πληθυσµού του PGPR στελέχους B. pumilus SE34 µετά από 28 ηµέρες επώαση έχει αναφερθεί και από τους Yan et al. (2003). Σε όλες τις επεµβάσεις, τα PGPR αναπτύχθηκαν ικανοποιητικά και στις δύο συγκεντρώσεις που δοκιµάστηκαν και 137

144 Κεφάλαιο 3 Συζήτηση Αποτελεσµάτων σε καµία περίπτωση δεν παρατηρήθηκε ανασταλτική επίδραση των γεωργικών φαρµάκων στους πληθυσµούς των βακτηρίων. Σε ορισµένες µάλιστα περιπτώσεις η προσθήκη των γεωργικών φαρµάκων προκάλεσε αύξηση στους πληθυσµούς των βακτηριακών κυττάρων. ιεγερτική δράση εντοµοκτόνων εδάφους στους πληθυσµούς στελεχών PGPR έχει διαπιστωθεί και σε προηγούµενη µελέτη (Martinez-Toledo et al., 1988). Επίσης, οι Lakshmi et al. (2009) σε πείραµα βιοαποδόµησης ανέφεραν ότι οι πληθυσµοί των Bacillus cereus, Klebsiella sp., Serratia marcescnes, και Pseudomonas aeruginosa αυξήθηκαν σε δείγµατα εδάφους επιφορτισµένα µε chlorpyrifos (50 mg/kg) σε 30 ηµέρες επώαση. 138

145 Κεφάλαιο 4 Εισαγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙ ΡΑΣΗΣ PGPR ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ BACILLUS ΣΤΗΝ ΑΠΟ ΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΣΛΗΨΗ ΤΟΥ ACIBENZOLAR-S-METHYL ΚΑΙ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΙΚΙΣΜΟΥ ΦΥΤΩΝ ΤΟΜΑΤΑΣ ΣΕ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΘΕΡΜΟΚΗΠΙΟΥ 4.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Βενζο-θειαδιαζόλια ως ενεργοποιητές των µηχανισµών άµυνας των φυτών (SAR) Τα φυτά κατά την µακρόχρονη εξελικτική τους πορεία έχουν αναπτύξει πολύπλοκους µηχανισµούς άµυνας που τους επιτρέπουν να αµύνονται σε φυτοπαθογόνους οργανισµούς του περιβάλλοντος. Συγκεκριµένα, τα φυτά διαθέτουν προϋπάρχοντες ή παθητικούς µηχανισµούς άµυνας και εγγενείς ή ενεργητικούς µηχανισµούς άµυνας (Παπαδοπούλου-Μουρκίδου, 2008). Οι παθητικοί µηχανισµοί άµυνας των φυτών περιλαµβάνουν φυσικούς (κηροί, κυτταρικά τοιχώµατα, στοµάτια, επιφανειακά τριχίδια) και χηµικούς (φαινολικές ενώσεις-τανίνες, σαπονίνες, γλυκοαλκαλοειδή) φραγµούς που εµποδίζουν την είσοδο πολλών παθογόνων. Στους ενεργητικούς µηχανισµούς άµυνας, τα φυτά αντιδρούν στην προσβολή από τα παθογόνα µε την ενεργοποίηση αµυντικών βιοχηµικών αντιδράσεων. Για να αποφύγουν την προσβολή, τα φυτά βασίζονται στον αµυντικό µηχανισµό κάθε µεµονωµένου κυττάρου καθώς και στην παραγωγή διασυστηµατικών σηµάτων που προέρχονται από το σηµείο της αρχικής προσβολής. Ο πιο χαρακτηριστικός διεγειρόµενος µηχανισµός διασυστηµατικής αντοχής των φυτών είναι η επίκτητη διασυστηµατική αντοχή (Systemic Acquired Resistance, SAR). H επίκτητη διασυστηµατική αντοχή είναι η βιολογική, βιοχηµική ή χηµική διέγερση των µηχανισµών αντοχής του φυτού, ώστε ένα φυτό ευπαθές σε ένα συγκεκριµένο παθογόνου να καθίσταται ανθεκτικό µετά τη δράση των παραγόντων διέγερσης (Ryals et al., 1996). Ο όρος SAR χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά από τον Ross (1961) για να περιγράψει την επαγόµενη αντοχή που εκδηλώθηκε στα πάνω φύλλα φυταρίων καπνού, στα κάτω φύλλα των οποίων είχαν αναπτυχθεί νεκρωτικές κηλίδες µετά από µόλυνση µε τον ιό του µωσαϊκού του καπνού (TMV). Περίπου 30 χρόνια αργότερα, δύο 139

146 Κεφάλαιο 4 Εισαγωγή ερευνητικές οµάδες ανακάλυψαν τον κεντρικό ρόλο του σαλικυλικού οξέος (Salicylic Acid, SA) στο φαινόµενο αυτό (Malamy et al., 1990; Metraux et al., 1990). Συγκεκριµένα, οι µελέτες αυτές ανέφεραν ότι το σαλικυλικό οξύ συσσωρεύτηκε σε φύλλα καπνού τόσο τοπικά όσο και διασυστηµατικά λίγο µετά τη µόλυνση µε τον ιό TMV. Η εκδήλωση της επίκτητης διασυστηµατικής αντοχής έχει επαληθευτεί σε διάφορα δικοτυλήδονα και µονοκοτυλήδονα είδη και η ανθεκτικότητα που προσδίδει είναι αποτελεσµατική ενάντια σε ένα ευρύ φάσµα ιών, βακτηρίων και µυκήτων (Vallad and Goodman, 2004). Κλασσικά παραδείγµατα βιολογικής διέγερσης της επίκτητης διασυστηµατικής αντοχής αποτελούν πειράµατα που έγιναν σε φυτά αγγουριάς µε τον ιό της νέκρωσης του καπνού (Tobacco Necrosis Virus, TNV) ή το µύκητα Colletotrichum lagenarium (Kuć, 1982; Kuć, 1984), καθώς και τον ιό του µωσαϊκού του καπνού (TMV), (Ross, 1961). Στις περισσότερες µέχρι σήµερα περιπτώσεις, η βιολογική διέγερση SAR συνοδεύεται από συσσώρευση ενδογενούς σαλικυλικού οξέος και συσχετίζεται µε την αυξανόµενη έκφραση µεγάλου αριθµού γονιδίων που σχετίζονται µε την παθογένεση, όπως είναι αυτά που κωδικοποιούν PR πρωτεΐνες (Pathogenesis-Related (PR) proteins), (Buonaurio et al., 2002; Oostendorp et al., 2001). Οι PR πρωτεΐνες αναφέρθηκαν για πρώτη φορά από τους Van Loon και Van Kammen το 1970, οι οποίοι προσδιόρισαν το σχηµατισµό διαφόρων άγνωστων µέχρι τότε πρωτεϊνών µετά από τη µόλυνση καπνού µε τον ιό TMV. Ορισµένες PR πρωτεΐνες, όπως οι γλουκανάσες (PR-2) και οι χιτινάσες (PR-3), έχουν in vitro αντιµικροβιακή δράση, ωστόσο ο ρόλος της κάθε µίας στην αµυντική λειτουργία δεν έχει ακόµη πλήρως διευκρινιστεί. Γενικά, η έκφραση της SAR είναι αποτέλεσµα της κοινής δράσης πολλών PR πρωτεϊνών παρά µιας µεµονωµένης πρωτεΐνης (Kessmann et al., 1994; Ryals et al., 1996). Εποµένως, το σαλικυλικό οξύ αποτελεί το ενδογενές σήµα της αµυντικής απόκρισης των φυτών ενάντια σε παθογόνους µικροοργανισµούς, καθώς παίζει βασικό ρόλο στη µεταφορά του σήµατος κατά τη µόλυνση από τον παθογόνο µικροοργανισµό. Επίσης, ενεργοποιεί την έκφραση των PR γονιδίων τα οποία συνδέονται µε την αντοχή των φυτών σε παθογόνους µικροοργανισµούς (Hammerschmidt et al., 2001). Τα τελευταία έτη η έρευνα έχει προσανατολιστεί προς την κατεύθυνση της εξεύρεσης ουσιών που να µην επηρεάζουν άµεσα το παθογόνο αλλά να 140

147 Κεφάλαιο 4 Εισαγωγή προκαλούν την ενίσχυση της φυσικής άµυνας των φυτών έτσι ώστε να αποτρέπεται η εκδήλωση ασθένειας. Εκτός από την επίδραση των µικροοργανισµών στη βιολογική πρόκληση SAR, διάφορες χηµικές ενώσεις, συµπεριλαµβανοµένου των 2,6 διχλωροισονικοτινικο οξύ (INA), β- αµινοβουτυρικό οξύ (BABA), probenazole, φωσφορικά άλατα, σαλικυλικό οξύ, καθώς και συνθετικά ανάλογα του σαλικυλικού οξέος όπως το acibenzolar-smethyl (ASM), [S-methyl benzo[1,2,3]thiadiazole-7-carbothioate, CGA ] µπορούν να ενεργοποιήσουν αµυντικούς µηχανισµούς των φυτών και να προκαλέσουν SAR (Kunz et al., 1997; Walters et al., 2005). Η εξωγενής παροχή σαλικυλικού οξέος µπορεί να επάγει µηχανισµούς αντοχής του φυτού και να διεγείρει SAR. Εντούτοις, η εφαρµογή αυτή είναι πρακτικά αδύνατη και οικονοµικά ασύµφορη, διότι σε συνθήκες έλλειψης προσβολής από κάποιο παθογόνο, τα φυτά καθίστανται µη ανταγωνιστικά, αφού διάφορα χαρακτηριστικά ανάπτυξης των φυτών και η καρποφορία είναι µειωµένα (Friedrich et al., 1996; Παπαδοπούλου-Μουρκίδου, 2008). Επιπλέον, η εφαρµογή σαλικυλικού οξέος µπορεί να προκαλέσει και φαινόµενα φυτοτοξικότητας. Οι παραπάνω λόγοι έχουν αποτρέψει την ανάπτυξή του ως προϊόν φυτοπροστασίας (Friedrich et al., 1996). Το acibenzolar-s-methyl ανήκει στα βενζο-θειαδιαζόλια και είναι η µοναδική εµπορικά διαθέσιµη συνθετική χηµική ένωση που ενεργοποιεί µηχανισµούς SAR στα φυτά (plant activator), (Kessmann et al., 1996). Η δραστική αυτή ουσία ανακαλύφθηκε από την εταιρία Syngenta και κυκλοφόρησε εµπορικά µε τις ονοµασίες Bion, Actigard και Boost. Στην Ελλάδα έχει πάρει έγκριση κυκλοφορίας από το 2005 και διατίθεται µε το εµπορικό όνοµα Bion MX (Syngenta Hellas ΑΕΒΕ) σε µίγµα µε το µυκητοκτόνο metalaxyl-m για την καταπολέµηση του περονόσπορου (Peronospora tabacina) στην καλλιέργεια του καπνού. Το acibenzolar-s-methyl είναι συνθετικά ανάλογο του σαλικυλικού οξέος, δεν έχει καθαυτό αντιµικροβιακή δράση, διεγείρει όµως επίκτητη διασυστηµατική αντοχή στα φυτά. Έχει ευρύ φάσµα δράσης προστατεύοντας από µύκητες, βακτήρια και ιούς και µπορεί να εφαρµοστεί στο φύλλωµα, στο έδαφος αλλά και ως επενδυτικό σπόρων (Benhamou and Bélanger 1998; Buonaurio et al., 2002; Buzi et al., 2004; Rohilla et al., 2001; Scarponi et al., 2001; Vallad and Goodman, 2004). εν προκαλεί φαινόµενα φυτοτοξικότητας 141

148 Κεφάλαιο 4 Εισαγωγή και αυτός είναι ένας επιπλέον λόγος της ευρείας αποδοχής του σε προγράµµατα φυτοπροστασίας. Ο όξινος µεταβολίτης του acibenzolar-s-methyl, benzo[1,2,3]thiadiazole-7-carboxylic acid (CGA ), (Εικόνα 4.1), παράγεται στους φυτικούς ιστούς µε υδρόλυση και έχει αναφερθεί ότι µπορεί να παρέχει διασυστηµατική προστασία στα φυτά (Buonaurio et al., 2002; Scarponi et al., 2001). Πιθανότατα, η συµπεριφορά του acibenzolar-s-methyl στα φυτά είναι ανάλογη διαφόρων γεωργικών φαρµάκων που εφαρµόζονται ως εστέρες, αλλά ασκούν τη δράση τους στη όξινή τους µορφή (Scarponi et al., 2001). Σε φυτά Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) και καπνού (Nicotiana tabacum) η εφαρµογή acibenzolar-s-methyl προκάλεσε το ίδιο φάσµα ανθεκτικότητας καθώς και την έκφραση των ίδιων χαρακτηριστικών PR γονιδίων σε σχέση µε τη βιολογική πρόκληση SAR (Friedrich et al., 1996; Lawton et al., 1996). Η εφαρµογή acibenzolar-s-methyl διεγείρει την πρόκληση SAR χωρίς ωστόσο να προκαλεί την συσσώρευση σαλικυλικού οξέος (Friedrich et al., 1996). ASM CGA Εικόνα 4.1 οµή του χηµικού ενεργοποιητή επίκτητης διασυστηµατικής αντοχής (SAR) acibenazolar-s-methyl (ASM) και του κύριου µεταβολίτη του CGA Συνδυασµός βιολογικών παραγόντων και χηµικών ενεργοποιητών των φυτών µια εναλλακτική προσέγγιση φυτοπροστασίας Η χρήση συνθετικών γεωργικών φαρµάκων αποτελεί στις µέρες µας τη συνηθέστερη µέθοδο για την καταπολέµηση εχθρών και ασθενειών των φυτών. Εντούτοις, η ανάπτυξη ανθεκτικών πληθυσµών σε µεγάλο αριθµό δραστικών ουσιών (Karaoglanidis et al., 2000; Myresiotis et al., 2007; Παπαδοπούλου- Μουρκίδου, 2008), η ανάκληση της άδειας κυκλοφορίας ορισµένων από τα πιο 142

149 Κεφάλαιο 4 Εισαγωγή αποτελεσµατικά προϊόντα φυτοπροστασίας (European Commission, Decision 2008/753/EC) και η ανίχνευση υπολειµµάτων γεωργικών φαρµάκων αποτελούν σηµαντικούς περιοριστικούς παράγοντες στη χρήση τους. Επιπλέον, τα τελευταία χρόνια η ευαισθητοποίηση του κόσµου για θέµατα περιβαλλοντικής µόλυνσης που σχετίζονται µε τη χρήση γεωργικών φαρµάκων και επηρεάζουν την υγεία των ανθρώπων, καθώς και η προτίµηση του καταναλωτικού κοινού για προϊόντα απαλλαγµένα από επικίνδυνα υπολείµµατα έχει οδηγήσει την επιστηµονική κοινότητα στη διερεύνηση νέων µεθόδων φυτοπροστασίας πιο φιλικών στον άνθρωπο και το περιβάλλον. Ως προς την κατεύθυνση αυτή κινείται η χρησιµοποίηση βιολογικών παραγόντων, συµπεριλαµβανοµένων και των ριζοβακτηρίων που προάγουν τη φυτική ανάπτυξη. Ένας µεγάλος αριθµός PGPR έχει αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία ότι µπορεί να ελέγξει αποτελεσµατικά σηµαντικούς φυτοπαθογόνους µικροοργανισµούς τόσο εδαφογενείς όσο και φυλλώµατος (Anith et al., 2004; Baysal et al., 2008; Bardas et al., 2009; Benhamou et al., 1998; Cazorla et al., 2007; Domenech et al., 2006). Επιπλέον, η διέγερση διασυστηµατικής επίκτητης αντοχής (SAR) είναι νέα τάση για την αντιµετώπιση διαφόρων φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών είναι. ιάφορες χηµικές ενώσεις, όπως για παράδειγµα το σαλικυλικό οξύ, 2,6 διχλωροισονικοτινικο οξυ (INA), β-αµινοβουτυρικό οξύ (BABA), acibenzolar-s-methyl (ASM) και probenazole, δρουν ως ενεργοποιητές των µηχανισµών άµυνας των φυτών (Oostendorp et al., 2001). Ο συνδυασµός βιολογικών παραγόντων µε χηµικούς ενεργοποιητές SAR αποτελεί τα τελευταία χρόνια µια εναλλακτική πρόταση φυτοπροστασίας που απασχολεί πολλούς ερευνητές παγκοσµίως (Abo-Elyousr and El-Hendawy, 2008; Abo-Elyousr et al., 2009; Anith et al., 2004; Gent and Schwartz, 2005; Obradovic et al., 2005; Vallad and Goodman; Van Wees 2000; Verhagen et al., 2006). Μάλιστα σε αρκετές περιπτώσεις διαπιστώθηκε ότι η συνδυασµένη εφαρµογή βιολογικών παραγόντων και του συνθετικού ενεργοποιητή SAR acibenzolar-s-methyl έχει παρουσιάσει συνεργιστική δράση στην καταπολέµηση της ασθένειας, επιτυγχάνοντας αυξηµένη αποτελεσµατικότητα καταπολέµησης (Abo-Elyousr et al., 2009; Anith et al., 2004; Gent and Schwartz, 2005; Myresiotis et al., 2012a; Van Wees 2000). Για παράδειγµα, οι Anith et al. (2004) ανέφεραν ότι η εφαρµογή acibenzolar-s-methyl σε φυτά τοµάτας δεν παρείχε 143

150 Κεφάλαιο 4 Εισαγωγή προστασία από το παθογόνο Ralstonia solanacearum, όµως η συνδυασµένη εφαρµογή acibenzolar-s-methyl και PGPR προκάλεσε σηµαντική µείωση στην ένταση της ασθένειας. Η επίδραση της συνδυασµένης εφαρµογής βιολογικών παραγόντων και acibenzolar-s-methyl στην αντιµετώπιση εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων έχει ελάχιστα µελετηθεί (Abo-Elyousr et al., 2009; Myresiotis et al., 2012a). Προκύπτει ωστόσο το συµπέρασµα ότι στις συνδυασµένες επεµβάσεις η µείωση της ασθένειας ήταν µεγαλύτερη από την µεµονωµένη εφαρµογή acibenzolar-smethyl και σε αρκετές επεµβάσεις η µείωση αυτή ήταν σηµαντική, παρέχοντας έτσι τη µέγιστη προστασία έναντι του παθογόνου. Οι Abo-Elyousr et al. (2009) µάλιστα αναφέρουν ότι τα δεδοµένα µεταξύ των πειραµατικών δοκιµών που πραγµατοποιήθηκαν στον αγρό και το θερµοκήπιο ήταν σε συµφωνία, γεγονός που ενισχύει τη δυνατότητα χρήσης των βιολογικών παραγόντων και χηµικών ενεργοποιητών SAR ως βασικών συνιστωσών σε προγράµµατα ολοκληρωµένης καταπολέµησης. Επιβάλλεται ωστόσο ο έλεγχος της συµβατότητας των παραγόντων αυτών στα διάφορα παθοσυστήµατα που µελετώνται Εµβολιασµός του εδάφους µε PGPR και ικανότητα αποικισµού της ριζόσφαιρας των φυτών Ο βαθµός αποικισµού του ριζικού συστήµατος και του εδάφους της ριζόσφαιρας, από τα εµβολιασµένα PGPR, αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για τις µετέπειτα αλληλεπιδράσεις µε τα φυτά και τους φυτοπαθογόνους µικροοργανισµούς (Kamilova et al., 2005). Ο αποικισµός των εξωγενών ριζοβακτηρίων µπορεί να επηρεάσει σηµαντικά το βιολογικό έλεγχο εδαφογενών µικροοργανισµών και την προαγωγή της ανάπτυξης των φυτών (Kloepper and Beauchamp, 1992). Η παράµετρος αυτή έχει ιδιαίτερη σηµασία σε βιολογικούς παράγοντες όπου ο έλεγχος των παθογόνων οφείλεται κυρίως στην παραγωγή αντιβιοτικών ουσιών και τον ανταγωνισµό. Σε πολλές περιπτώσεις, ο ανεπιτυχής βιολογικός έλεγχος φυτοπαθογόνων έχει αποδοθεί στην περιορισµένη ικανότητα αποικισµού των προστιθέµενων ριζοβακτηρίων (Weller, 1988). Κατά τη µελέτη του αποικισµού της ριζόσφαιρας από εµβόλια PGPR βασικός περιοριστικός παράγοντας αποτελεί ο διαχωρισµός των προστιθέµενων ριζοβακτηρίων από τον ενδογενή βακτηριακό πληθυσµό. Ο περιορισµός αυτός δεν υφίσταται σε πειραµατικές δοκιµές που πραγµατοποιούνται σε 144

151 Κεφάλαιο 4 Εισαγωγή αποστειρωµένα υποστρώµατα µε ελεγχόµενες συνθήκες ανάπτυξης των φυτών (Bardas et al., 2009; Simons et al., 1996). Η άµεση παρατήρηση των δειγµάτων µε τη χρήση ηλεκτρονικού µικροσκοπίου είναι µικρής σηµασίας, δεδοµένου ότι τα περισσότερα βακτήρια δεν διαθέτουν διακριτά µορφολογικά χαρακτηριστικά και εποµένως δεν µπορούν να διαχωριστούν από την ενδογενή βιοκοινότητα (Gray and Williams, 1971). Η πιο κοινές µέθοδοι χρησιµοποιούν στελέχη των ριζοβακτηρίων ανθεκτικά σε συγκεκριµένα αντιβιοτικά (antibiotic-resistant strains) για τη µελέτη του αποικισµού του ριζικού συστήµατος σε φυσικές συνθήκες (Kokalis- Burelle et al., 2006; Yan et al, 2003). Γίνεται δηλαδή ενσωµάτωση στο έδαφος του επισηµασµένου ανθεκτικού στελέχους και στη συνέχεια εκ νέου αποµόνωσή του. Η αντοχή των στελεχών πιθανότατα οφείλεται σε τυχαίες χρωµοσωµικές µεταλλάξεις που προκαλούνται µε την επίδραση του αντιβιοτικού (Paulitz, 2000). Μεταξύ άλλων, το αντιβιοτικό ριφαµπικίνη (rifampicin) είναι το συνηθέστερο για την επισήµανση των ριζοβακτηρίων (Kokalis-Burelle et al., 2006; Yan et al, 2003). Ο υπολογισµός της ικανότητας αποικισµού των φυτών γίνεται µε τη βοήθεια διαδοχικών αραιώσεων, επίστρωσης σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό και τελικής µέτρησης των αποικιών που αναπτύσσονται (dilution plating and antibiotic-resistance technique). Ωστόσο, έχει αναφερθεί ότι η µέθοδος αυτή µπορεί σε ορισµένες περιπτώσεις να υποεκτιµήσει τον πραγµατικό πληθυσµό του βακτηριακού στελέχους στο έδαφος, εξαιτίας της δέσµευσης των ριζοβακτηρίων στα εδαφικά σωµατίδια από δηµιουργία συσσωµατωµάτων εδάφους, της µειωµένης προσαρµοστικής ικανότητας των ανθεκτικών στελεχών στο έδαφος, της δυσµενούς επίδρασης των διαλυµάτων διαδοχικών αραιώσεων και της αδυναµίας ανάπτυξης του στελέχους σε θρεπτικό υλικό λόγω αλλαγών στη φυσιολογία του βακτηρίου στο έδαφος. Μια άλλη τεχνική που χρησιµοποιείται τα τελευταία χρόνια για την µελέτη της ικανότητας αποικισµού των εξωγενών PGPR είναι η επισήµανση του βακτηριακού εµβολίου µε πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein, GFP) και η παρατήρηση του αποικισµού µε τη χρήση συνεστιακής µικροσκοπίας σάρωσης µε ακτίνες λέιζερ (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM) ή µικροσκοπίας φθορισµού (Fluorescent Microscopy), (Εικόνα 4.2). Ο Ιάπωνας επιστήµονας Osamu Shimomura ανακάλυψε την GFP στη µέδουσα 145

152 Κεφάλαιο 4 Εισαγωγή Aequorea victoria το 1962 και για το λόγο αυτό κατέκτησε το νόµπελ Χηµείας το Η εν λόγω πρωτεΐνη έχει την ιδιότητα να φθορίζει όταν δέχεται υπεριώδη ακτινοβολία, γνώρισµα που την έκανε ένα από τα σπουδαιότερα µέσα για την παρατήρηση διαφόρων βιολογικών φαινοµένων. A B Εικόνα 4.2 Μετασχηµατισµένα κύτταρα µε GFP του PGPR στελέχους B. amyloliquefaciens FZB42 (Α) και αποικισµός ριζών µπανάνας από το µετασχηµατισµένο στέλεχος B. subtilis N11 (Β) κάτω από συνεστιακό µικροσκόπιο σάρωσης µε ακτίνες λέιζερ (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM), (Fan et al., 2011; Zhang et al., 2011). Από το 1997, οι Bloemberg et al. ανέφεραν την κατασκευή πλασµιδίων ικανών να εκφράζουν σταθερά GFP σε βακτήρια του γένους Pseudomonas (Bloemberg et al., 1997). Επίσης, οι Itaya et al. (2001) κατασκεύασαν πλασµιδιακό φορέα που κωδικοποιεί GFP και προκαλεί φθορισµό σε αποικίες του Bacillus subtilis. Σε διάφορα άλλα είδη του γένους Bacillus, όπως B. megaterium, B. cereus, B. amyloliquefaciens µελετήθηκε η ικανότητα αποικισµού της ριζόσφαιρας µετά από µετασχηµατισµό των βακτηριακών κυττάρων µε πλασµιδιακό φορέα ικανό να παράγει GFP (Fan et al., 2011; Liu et al., 2006; Tian et al., 2004). Ο µετασχηµατισµός (εισαγωγή πλασµιδίου) των βακτηρίων επιτυγχάνεται είτε µετά από χηµική επεξεργασία των κυττάρων κατά την οποία διαστέλλονται οι πόροι της κυτταρικής µεµβράνης επιτρέποντας στα εξωγενή πλασµίδια να 146

153 Κεφάλαιο 4 Εισαγωγή εισέλθουν στα βακτηριακά κύτταρα ή µε τη µέθοδο της ηλεκτροδιάτρησης (electroporation), που οδηγεί στον παροδικό σχηµατισµό πόρων στην κυτταρική µεµβράνη των βακτηρίων µε την εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου (Liu et al., 2006). Η χρήση GFP έχει τη δυνατότητα άµεσης και γρήγορης παρατήρησης του αποικισµού των βακτηρίων επάνω στο φυτικό ιστό ή ακόµη και στο εσωτερικό του, χωρίς να απαιτούνται χρονοβόρα πρωτόκολλα για την αποµόνωση και παρατήρηση των αποικιών. Βασικοί περιοριστικοί παράγοντες παραµένουν η µειωµένη ένταση φθορισµού σε ορισµένες περιπτώσεις, ο αυτοφθορισµός του υποστρώµατος στο οποίο θα παρατηρηθούν τα βακτήρια (Εικόνα 4.3) και η αστάθεια του εξωγενούς πλασµιδίου σε βακτήρια κυρίως του γένους Bacillus σε συνθήκες περιβάλλοντος (Bloemberg, 2007; Ehrlich et al., 1986). Ο αποικισµός του ριζικού συστήµατος των φυτών από Gram (-) PGPR και ειδικότερα του γένους Pseudomonas sp. έχει µελετηθεί εκτεταµένα (Bloemberg, 2007). Αντιθέτως, λίγα πειραµατικά δεδοµένα είναι διαθέσιµα για τον αποικισµό των Gram (+) ριζοβακτηρίων (Itaya et al., 2001). Μεταξύ των Gram (+) ριζοβακτηρίων η µελέτη των ειδών Bacillus έχει ιδιαίτερη σπουδαιότητα στη γεωργική παραγωγή επειδή παράγουν αντιµικροβιακούς µεταβολίτες Εικόνα 4.3 Αυτοφθορισµός ριζών αποτελεσµατικούς εναντίον διαφόρων τοµάτας σε συνεστιακό µικροσκόπιο φυτοπαθογόνων µικροοργανισµών και σάρωσης µε ακτίνες λέιζερ (CLSM). εξαιτίας της δυνατότητάς τους να παράγουν ενδοσπόρια ανθεκτικά σε στρεσογόνες συνθήκες (πολύ υψηλές ή πολύ χαµηλές θερµοκρασίες, περιορισµένη υγρασία), (Choudhary and Johri, 2009; Ryu et al., 2003). 147

154 Κεφάλαιο 4 Εισαγωγή Σκοπός των πειραµάτων Στο κεφάλαιο αυτό οι πειραµατικές δοκιµές πραγµατοποιήθηκαν σε φυτά τοµάτας που αναπτύχθηκαν σε συνθήκες θερµοκηπίου και τέθηκαν οι παρακάτω στόχοι: 1) Αναπτύχθηκε για πρώτη φορά νέα αναλυτική µέθοδος για τον προσδιορισµό του acibenzolar-s-methyl και του κύριου µεταβολίτη του (CGA ) στο έδαφος. Ο χρωµατογραφικός προσδιορισµός των υπολειµµάτων έγινε σε σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης µε ανιχνευτή διάταξης φωτοδιόδων (HPLC-UV6000LP). 2) ιερευνήθηκε η επίδραση του ριζοεµβολιασµού φυτών τοµάτας µε τα συγκεκριµένα στελέχη PGPR στην αποδόµηση του ενεργοποιητή SAR acibenzolar-s-methyl µετά από εφαρµογή στο έδαφος, ενώ παράλληλα προσδιορίστηκε και η συγκέντρωση του κύριου µεταβολίτη του CGA ) Μετρήθηκε η διασυστηµατική ικανότητα του acibenzolar-s-methyl και του κύριου µεταβολίτη του CGA στο υπέργειο µέρος των φυτών τοµάτας µετά το ριζοεµβολιασµό τους. 4) Επιχειρήθηκε µετασχηµατισµός των κυττάρων του βακτηρίου B. subtilis GB03 µε τον πλασµιδιακό φορέα pad43-25, που παράγει πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), µε τη βοήθεια της χηµικής µεθόδου, για τη µελέτη του βαθµού αποικισµού της ριζόσφαιρας στην τοµάτα. 5) Προσδιορίστηκε η ικανότητα αποικισµού του αποτελεσµατικότερου PGPR στελέχους B. subtilis GB03 στη ρίζα φυτών τοµάτας και στο έδαφος της ριζόσφαιρας, παρουσία και απουσία του acibenzolar-s-methyl. 148

155 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι 4.2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Αντιδραστήρια Οι οργανικοί διαλύτες ακετονιτρίλιο και µεθανόλη καθώς και το νερό που χρησιµοποιήθηκαν στις χρωµατογραφικές αναλύσεις των δειγµάτων ήταν υψηλής καθαρότητας (HPLC grade, Merck, Darmstadt, Germany). Χρησιµοποιήθηκε οξικό οξύ (καθαρότητας 99.5%, Carlo Erba, Milano, Italy), δισόξινο φωσφορικό κάλιο (99.5%) και χλωριούχο νάτριο (99.8%), (Riedel-de Haën, Seelze, Germany). Για τον καθαρισµό των δειγµάτων χρησιµοποιήθηκαν φυσίγγια Lichrolut EN (200 mg, 3mL), (Merck, Darmstadt, Germany). Η πρότυπη ουσία acibenzolar-s-methyl (CGA ; ASM), (99.5% καθαρότητα) προµηθεύτηκε από τον οίκο Wako Pure Chemical (Osaka, Japan) και ο µεταβολίτης της CGA (benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carboxylic acid; BTC), (99.2% καθαρότητα) παραχωρήθηκε από την εταιρία Syngenta (Basel, Switzerland). Η παρασκευή των προτύπων διαλυµάτων έγινε όπως περιγράφηκε ήδη στην παράγραφο Για τη διαδικασία του µετασχηµατισµού χρησιµοποιήθηκαν: µονόξινο φωσφορικό κάλιο και διένυδρο χλωριούχο ασβέστιο (Panreac, Barcelona, Spain), θειϊκό αµµώνιο, κιτρικό τρι-νάτριο, θειικό µαγνήσιο επταυδρικό και χλωριούχο µαγνησιο εξαυδρικο (Merck, Darmstadt, Germany), γλυκόζη και L-τρυπτοφάνη (Alfa Aesar, Karlsruhe, Germany), τρυπτόνη (Scharlau) και εκχύλισµα ζύµης (Lab M). Τα ένζυµα περιορισµού EcoR1, Xbal και Sacl (Epoch Biolabs), αγαρόζη (Gibco), αντιβιοτικό επιλογής χλωραµφαινικόλη (Lab M) και ο µάρτυρας (DNA ladder) µοριακού µεγέθους 10.0 Kb (Nippon Genetics) Ανάπτυξη φυτικού υλικού Σε όλα τα πειράµατα που πραγµατοποιήθηκαν σε θερµοκηπιακές συνθήκες χρησιµοποιήθηκαν σπόροι τοµάτας (Lycopersicon esculentum Mill.) ποικιλίας ACE 55. Οι σπόροι απολυµάνθηκαν επιφανειακά µε εµβάπτιση και ελαφρά ανάδευση σε διάλυµα υποχλωριώδους νατρίου συγκέντρωσης 5% (v/v) για 5 λεπτά. Ακολουθούσε ξέπλυµα των σπόρων σε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό ανά 30 λεπτά για τις επόµενες δύο ώρες (Τζελέπης, 2008). Στη συνέχεια, οι απολυµασµένοι σπόροι τοµάτας τοποθετήθηκαν σε πλαστικά φυτοδοχεία (8 x 8 cm) που περιείχαν φυσικό έδαφος αγρού σε βάθος περίπου 2 cm. Το έδαφος που χρησιµοποιήθηκε στα πειράµατα αυτά συλλέχθηκε από αγροτεµάχιο της 149

156 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι περιοχής Αµούρι Φθιώτιδας, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 3.2.3, και οµογενοποιήθηκε σε κόσκινο µε ανοίγµατα οπών 4 mm. Σε κάθε γλαστράκι τοποθετήθηκε 1 σπόρος. Τα φυτά αναπτύσσονταν σε θερµοκήπιο του Εργαστηρίου Ανθοκοµίας της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. Κατά τη διάρκεια των πειραµάτων τα φυτά διατηρούνταν σε θερµοκρασία 25±2 ο C, σε φυσικό φωτισµό (φωτοπερίοδος 14 ωρών) και ποτίζονταν τρεις περίπου φορές την εβδοµάδα µε συγκεκριµένο όγκο νερού. Κάθε επέµβαση περιλάµβανε 40 φυτά και το πείραµα επαναλήφθηκε χρονικά δύο φορές Εφαρµογή των βιολογικών παραγόντων και του σκευάσµατος Bion 50% WG Τα βακτηριακά στελέχη του γένους Bacillus spp. (B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03) δοκιµάστηκαν µεµονωµένα. Η εφαρµογή των βακτηρίων έγινε µε επικάλυψη των σπόρων της τοµάτας µε αιώρηµα βακτηριακών κυττάρων (συγκέντρωσης 1x10 8 CFU/mL) σε µεθυλική σελλουλόζη 5% (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany). Παράλληλα, αµέσως µετά τη σπορά έγινε και ριζοπότισµα σε κάθε γλαστράκι µε 5 ml (1 x 10 8 CFU/mL) αιωρήµατος βακτηριακών κυττάρων. Τα αιωρήµατα των βακτηρίων παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στην παράγραφο Χρησιµοποιήθηκαν ίσοι όγκοι από το κάθε βακτηριακό αιώρηµα και από τη µεθυλική σελλουλόζη και στο οµοιογενές µίγµα που δηµιουργήθηκε εµβαπτίστηκαν οι σπόροι τοµάτας για χρονικό διάστηµα 20 λεπτών υπό ασηπτικές συνθήκες. Έπειτα, οι σπόροι αφέθηκαν να στεγνώσουν σε διηθητικό χαρτί για 30 λεπτά. Στο στάδιο του δεύτερου πραγµατικού φύλλου, ακολούθησε δεύτερη εφαρµογή των βακτηριακών στελεχών µε ριζοπότισµα κάθε φυτού τοµάτας µε 20 ml βακτηριακού αιωρήµατος (1 x 10 8 CFU/mL). Στα φυτά µάρτυρες πραγµατοποιήθηκε ριζοπότισµα µε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό. Η εφαρµογή του acibenzolar-s-methyl (Bion 50% WG, Syngenta S.A.) πραγµατοποιήθηκε µε ριζοπότισµα των σποροφύτων µε κατάλληλο όγκο διαλύµατος acibenzolar-s-methyl δύο ηµέρες µετά τη δεύτερη εφαρµογή των PGPR. Το σκεύασµα διαλύθηκε σε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό πριν χρησιµοποιηθεί και παρασκευάσθηκε πυκνό διάλυµα (300 µg/ml). όθηκε ιδιαίτερη προσοχή ώστε όλος ο όγκος του διαλύµατος του µυκητοκτόνου να 150

157 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι παραµένει στο έδαφος της ριζόσφαιρας, χωρίς να παρατηρείται το φαινόµενο της έκλπυσης Συλλογή δειγµάτων Συνολικά πραγµατοποιήθηκαν οκτώ δειγµατοληψίες σε διαστήµατα 1, 4, 8, 24, 48, 96, 168 και 240 ωρών από την εφαρµογή του acibenzolar-s-methyl, µε σκοπό τον προσδιορισµό των υπολειµµάτων αυτού και του κύριου µεταβολίτη του στο υπέργειο µέρος των φυτών τοµάτας και στο έδαφος της ριζόσφαιρας. Τα φυτά αφαιρέθηκαν από τα φυτοδοχεία, οι βλαστοί κόπηκαν στην περιοχή του λαιµού και στη συνέχεια µετρήθηκε το βάρος του υπέργειου µέρους των φυτών. Παράλληλα συλλέχθηκαν και δείγµατα εδάφους βάρους 5 g από την περιοχή της ριζόσφαιρας. Το ποσοστό υγρασίας των εδαφικών δειγµάτων προσδιορίσθηκε µε ξήρανση του εδάφους µέχρι σταθερού βάρους σε κλίβανο στους 105 ο C (δες παράγραφο 3.2.7). Τα δείγµατα κατά την δειγµατοληψία τοποθετούνταν σε ειδικά φιαλίδια (Falcon tubes) των 50 ml και αναλύονταν άµεσα είτε αποθηκεύονταν σε βαθιά κατάψυξη (-25 ο C) έως την ανάλυσή τους Μέθοδος προσδιορισµού του acibenzolar-s-methyl και του κύριου µεταβολίτη του (CGA ) σε δείγµατα εδάφους Για τον προσδιορισµό του acibenzolar-s-methyl και του µεταβολίτη του CGA στο έδαφος αναπτύχθηκε νέα χρωµατογραφική µέθοδος, η οποία παρουσιάζει πολύ ικανοποιητικά δεδοµένα επικύρωσης σε όλες τις παραµέτρους που αξιολογήθηκαν (Myresiotis et al., 2011a). Αναλυτικά η µέθοδος που αναπτύχθηκε έχει ως εξής: σε σωλήνα φυγοκέντρου των 50 ml, µε βιδωτό πώµα, µεταφέρθηκαν 5 g εδάφους και στη συνέχεια προστέθηκαν 10 ml ακετονιτριλίου. Οι σωλήνες σφραγίστηκαν και αναδεύτηκαν σε vortex (Velp Scientifica, Milano, Italy) για 2 λεπτά. Τα εκχυλίσµατα φυγοκεντρήθηκαν στις 8000 στροφές/λεπτό για 5 λεπτά και 5 ml από το υπερκείµενο µεταφέρθηκαν σε γυάλινα φιαλίδια των 15 ml. Αφού προστέθηκαν 5 ml ακετονιτριλίου ακόµη στο αρχικό διάλυµα, πραγµατοποιήθηκε δεύτερη εκχύλιση και µετά από φυγοκέντρηση, 5 ml από τη φάση του ακετονιτριλίου µεταφέρθηκαν στο γυάλινο φιαλίδιο. Τα 10 ml που προέκυψαν συµπυκνώθηκαν µέχρι ξηρού µε τη βοήθεια ρεύµατος αζώτου σε θερµοκρασία 30 ο C. Τα υπολείµµατα επαναδιαλύθηκαν σε 1 ml κινητής φάσης και αφού φιλτραρίστηκαν σε PTFE 151

158 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι φίλτρα (0.45 µm, 13 mm) της Waters-Millipore (Milford, MA, USA) µεταφέρθηκαν σε φιαλίδια του αυτόµατου δειγµατολήπτη για την περαιτέρω χρωµατογραφική ανάλυση. Ο όξινος µεταβολίτης CGA εκχυλίστηκε δύο φορές µε 10 και 5 ml µίγµατος φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος (0.5 M KH 2 PO 4, ph 3):ακετονιτρίλιο (70:30, v/v), αντίστοιχα. Τα τελικά εκχυλίσµατα (10 ml) φιλτραρίστηκαν και ακολούθησε απευθείας ανάλυση σε HPLC σύστηµα. Η ανάλυση των υπολειµµάτων πραγµατοποιήθηκε σε σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) της εταιρίας Thermo (TSP Spectra System, Austin, TX, USA) και αποτελούνταν από αντλία P4000 τριών διαλυτών, απαερωτή διαλυτών TSP, αυτόµατο δειγµατολήπτη AS3000 µε βρόγχο χωρητικότητας 100 µl και ανιχνευτή µε διάταξη φωτοδιόδων UV6000LP (DAD), (Thermo Finnigan, USA), (Εικόνα 3.3). Το λειτουργικό σύστηµα που πραγµατοποιήθηκε η ρύθµιση των συνθηκών λειτουργίας του χρωµατογράφου και η επεξεργασία των δεδοµένων ήταν το ChromQuest έκδοση 4.2 (ThermoQuest, Milano, Italy). Ο χρωµατογραφικός διαχωρισµός πραγµατοποιήθηκε σε στήλη τύπου Hypurity-C18 (4.6 mm x 150 mm, 5 µm), (Thermo Finnigan, USA) στους 30 o C. Ο όγκος της έγχυσης ήταν 20 µl και η έκλουση πραγµατοποιούνταν ισοκρατικά µε ροή 1 ml/min. Η κινητή φάση ήταν µίγµα ακετονιτρίλιο:νερό (40:60, v/v) µε 0.6 ml/l οξικό οξύ Μέθοδος προσδιορισµού του acibenzolar-s-methyl και του κύριου µεταβολίτη του (CGA ) σε φυτά τοµάτας Η εκχύλιση του acibenzolar-s-methyl και του µεταβολίτη του CGA από φυτά τοµάτας πραγµατοποιήθηκε µε µικρές παραλλαγές της µεθόδου που περιγράφηκε από τους Scarponi et al. (2001). Συγκεκριµένα, το υπέργειο µέρος κάθε φυτού τοµάτας τοποθετήθηκε σε σωλήνα φυγοκέντρου των 50 ml µε βιδωτό πώµα και προστέθηκαν 25 ml παγωµένου ακετονιτριλίου. Η οµογενοποίηση του δείγµατος πραγµατοποιήθηκε σε οµογενοποιητή Polytron (Kinematika) για περίπου 1 λεπτό. Έπειτα ο σωλήνας σφραγίστηκε και αναδεύτηκε σε vortex για 2 λεπτά. Το εκχύλισµα που προέκυπτε φυγοκεντρήθηκε στις 7000 στροφές/λεπτό για 6 λεπτά και το υπερκείµενο µεταφέρθηκε σε γυάλινη σφαιρική φιάλη των 100 ml. H αποµάκρυνση του διαλύτη πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση περιστροφικού συµπυκνωτήρα (Büchi), 152

159 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι υπό µειωµένη πίεση, στους 40 ο C. Τα υπολείµµατα της σφαιρικής φιάλης επαναδιαλύθηκαν µε 2 x 4.5 ml µίγµατος φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος (0.5 M KH 2 PO 4, ph 3):ακετονιτρίλιο (70:30, v/v). Ακολούθησε καθαρισµός του δείγµατος µε την τεχνική της εκχύλισης υγρής-στερεάς φάσης (SPE) επάνω σε φυσίγγια Lichrolut EN (200 mg, 3mL), αφού προηγουµένως είχαν ενεργοποιηθεί µε τη διέλευση 6 ml ακετονιτριλίου και 6 ml φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος (0.5 M KH 2 PO 4, ph 3), τα οποία απορρίπτονταν. Το δείγµα εφαρµοζόταν επάνω σε κάθε φυσίγγιο SPE, το οποίο βρισκόταν υπό κενό, ακολουθούσε πλύσιµο µε 6 ml φωσφορικού ρυθµιστικού διαλύµατος (0.5 M KH 2 PO 4, ph 3), τα οποία απορρίπτονταν και στέγνωµα του φυσιγγίου µε ροή αέρα για περίπου 20 λεπτά. Η έκλουση των ουσιών πραγµατοποιήθηκε µε τη διέλευση 2 x 3 ml ακετονιτριλίου και το εκλουόµενο εκχύλισµα συλλέχθηκε σε γυάλινο φιαλίδιο των 10 ml. Ακολούθησε συµπύκνωση µέχρι ξηρού µε τη βοήθεια ρεύµατος αζώτου σε θερµοκρασία 30 ο C και επαναδιάλυση του ιζήµατος σε 0.5 ml ακετονιτριλίου. Τα δείγµατα φιλτραρίστηκαν σε PTFE φίλτρα (0.45 µm, 13 mm) και τοποθετήθηκαν σε φιαλίδια του αυτόµατου δειγµατολήπτη για χρωµατογραφική ανάλυση (Myresiotis et al., 2011b). Η χρωµατογραφική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε στο ίδιο σύστηµα και µε βάση τις παραµέτρους που αναφέρθηκαν στην παράγραφο Έλεγχος αξιοπιστίας αναλυτικών µεθόδων Οι µέθοδοι που αναπτύχθηκαν δοκιµάστηκαν ως προς την ακρίβεια µέτρησης (accuracy) και την επαναληψηµότητα (repeatability). Για το σκοπό αυτό πραγµατοποιήθηκαν δοκιµές ανάκτησης σε διάφορα επίπεδα και η επαναληψιµότητα προσδιορίστηκε ως σχετική τυπική απόκλιση (RSD) των επαναλήψεων ανά επίπεδο. Σε κάθε επίπεδο πραγµατοποιήθηκαν τρεις επαναλήψεις. Τα δείγµατα εδάφους ήταν φορτισµένα στα επίπεδα 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 10 και 60 mg/kg για το acibenzolar-s-methyl και 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 και 4 mg/kg για το µεταβολίτη CGA Η γραµµικότητα της πρότυπης καµπύλης κάθε ουσίας εκτιµήθηκε µε βάση το συντελεστή συσχέτισης r 2. Επίσης προσδιορίστηκαν τα όρια ανίχνευσης (LOD) και όρια ποσοτικού προσδιορισµού (LOQ) της κάθε εξεταζόµενης ουσίας. Η µέθοδος ανάλυσης των υπολειµµάτων στο υπέργειο µέρος των φυτών τοµάτας αξιολογήθηκε σε πέντε επίπεδα 153

160 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι ανάκτησης (0.05, 0.1, 0.5, 1 και 30 mg/kg). Η επαναληψιµότητα της µεθόδου εκτιµήθηκε υπολογίζοντας τη σχετική τυπική απόκλιση των τριών επαναλήψεων σε κάθε επίπεδο ιαδικασία µετασχηµατισµού του PGPR στελέχους Bacillus subtilis GB03 µε πλασµιδιακό φορέα Στις παραγράφους που ακολουθούν περιγράφεται η διαδικασία που ακολουθήθηκε για το µετασχηµατισµό του PGPR στελέχους B. subtilis GB03 µε το πλασµίδιο pad43-25 που φέρει το γονίδιο που κωδικοποιεί GFP, µε σκοπό τη µελέτη της ικανότητας αποικισµού στη ριζόσφαιρα φυτών τοµάτας Πλασµιδιακός φορέας pad43-25 (Bacillus Genetic Stock Center, BGSC) Εικόνα 4.4 Ο χάρτης του πλασµιδιακού φορέα pad43-25 (Ευγενική παραχώρηση του Dr. Daniel R. Zeigler, Director of the Bacillus Genetic Stock Center, BGSC, Department of Biochemistry, The Ohio State University, USA). 154

161 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκε ο πλασµιδιακός φορέας pad43-25, ο οποίος παραχωρήθηκε από τον Dr. Daniel R. Zeigler, διευθυντή του Bacillus Genetic Stock Center (BGSC, Department of Biochemistry, The Ohio State University, USA) σε βακτηριακά κύτταρα Escherichia coli DH5a (BGSC No. ECE166), απ' όπου και αποµονώθηκε. Πρόκειται για ένα δίκλωνο, κυκλικό µόριο DNA µε µέγεθος 7262 ζεύγη βάσεων (bps), (Εικόνα 4.4). Περιέχει το γονίδιο gfpmut3a που κωδικοποιεί την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein, GFP) υπό τον έλεγχο του P upp προαγωγέα (promoter) ο οποίος επιτρέπει την σταθερή µεταγραφή του γονιδίου in vitro. Το πλασµίδιο pad43-25 έχει τη δυνατότητα αναπαραγωγής τόσο σε Escherichia coli (E. coli) όσο και σε γένη Bacillus (shuttle vector). Φέρει γονίδια αντοχής στα αντιβιοτικά αµπικιλλίνη (bla) και χλωραµφαινικόλη (cat). Το γονίδιο bla κωδικοποιεί το ένζυµο β-λακταµάση και επιτρέπει την αποµόνωση και συντήρηση µετασχηµατισµένων βακτηριακών κυττάρων E. coli, τα οποία εµφανίζουν ικανότητα ανάπτυξης παρουσία του αντιβιοτικού αµπικιλλίνη. Αντίστοιχα το γονίδιο cat κωδικοποιεί το ένζυµο ακετυλοτρανσφεράση της χλωραµφαινικόλης και προσδίδει έτσι ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό χλωραµφαινικόλη σε βακτήρια E. coli και Bacillus subtilis τα οποία φέρουν το πλασµίδιο (φαινοτυπική επιλογή) Καλλιέργεια βακτηριακών κυττάρων Για τη διατήρηση και αποµόνωση του πλασµιδιακού φορέα pad43-25 χρησιµοποιήθηκε το στέλεχος E. coli DH5a. Το στέλεχος αναπτύχθηκε σε θρεπτικό υπόστρωµα Luria Bertani (LB), του οποίου η σύσταση φαίνεται στον Πίνακα 4.1. Το θρεπτικό υπόστρωµα αποστειρώθηκε σε αυτόκαυστο στους 121 ο C, υπό πίεση 1 Atm, για 20 λεπτά και διατηρήθηκε σε θερµοκρασία δωµατίου. Η προσθήκη του αντιβιοτικού επιλογής (χλωραµφαινικόλη, 5 µg/ml) έγινε λίγο πριν τη χρησιµοποίηση του υποστρώµατος. Η ανάπτυξη των βακτηριακών κυττάρων σε υγρές καλλιέργειες πραγµατοποιήθηκε υπό 37 ο C σε ανακινούµενο επωαστήρα. 155

162 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 4.1 Η σύσταση του θρεπτικού υποστρώµατος LB που χρησιµοποιήθηκε για την ανάπτυξη των βακτηριακών κυττάρων E. coli. Θρεπτικό υπόστωµα LB Τρυπτόνη Εκχύλισµα ζύµης Χλωριούχο νάτριο (NaCl) Άγαρ (στερεό υπόστρωµα) 1.0% w/v 0.5% w/v 1.0% w/v 1.5% w/v Η ανάπτυξη των βακτηριακών κυττάρων E. coli σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα LB που περιείχε κατάλληλη ποσότητα αντιβιοτικού επιλογής, πραγµατοποιήθηκε σε επωαστικό θάλαµο στους 37 ο C. Για την παρασκευή στερεού υποστρώµατος LB, προστέθηκε στο θρεπτικό υλικό 1.5% άγαρ και αποστειρώθηκε όπως προαναφέρθηκε. Μετά την πτώση της θερµοκρασίας του αποστειρωµένου υποστρώµατος στους 50 ο C περίπου, έγινε η προσθήκη του αντιβιοτικού και αυτό αποχύθηκε προσεκτικά σε τρυβλία. Τα τρυβλία καλλιέργειας επωάζονταν σε θάλαµο επώασης στους 37 ο C για ώρες και στη συνέχεια διατηρούνταν στους 4 ο C, το ανώτερο για 30 ηµέρες, µέχρι να χρησιµοποιηθούν. Ο χρόνος ανάπτυξης των βακτηριακών καλλιεργειών σε στερεά και υγρά θρεπτικά υποστρώµατα εξαρτάται από το είδος των κυττάρων και ήταν περίπου 16 ώρες. Η διατήρηση των βακτηρίων για µεγάλα χρονικά διαστήµατα πραγµατοποιήθηκε σε ειδικά φιαλίδια (Eppendorf tubes, 1.5 ml), µε την τοποθέτηση 0.5 ml υγρής καλλιέργειας βακτηριακών κυττάρων σε 0.5 ml αποστειρωµένης γλυκερόλης (50% v/v) και άµεση ψύξη στους -80 ο C Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA από υγρή καλλιέργεια E. coli µε τη χρήση του NucleoSpin Plasmid Miniprep kit Η αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA από βακτηριακά κύτταρα E. coli πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση του NucleoSpin Plasmid Miniprep kit της εταιρίας Macherey-Nagel (Düren, Germany). Με τη χρήση του συγκεκριµένου kit η αποµόνωση του πλασµιδίου επιτυγχάνεται µε τη µέθοδο της αλκαλικής λύσης (alkaline lysis). Η µέθοδος περιλαµβάνει την ανάπτυξη, συλλογή των βακτηριακών κυττάρων µε φυγοκέντρηση και ακολούθως τη λύση των κυττάρων 156

163 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι µετά από επώαση µε αλκαλικό διάλυµα. Στη συνέχεια γίνεται καθαρισµός του πλασµιδιακού DNA, τα κυτταρικά υπολείµµατα και το χρωµοσωµικό DNA κατακρηµνίζονται και αποµακρύνονται, ενώ το πλασµιδιακό DNA συλλέγεται από τη στήλη κατακράτησης µε έκλουση σε κατάλληλο διάλυµα (Macherey- Nagel, NucleoSpin Plasmid Miniprep kit, Handbook, 2010). Συγκεκριµένα για την αποµόνωση και καθαρισµό του πλασµιδιακού DNA µε το kit ακολουθήθηκε το παρακάτω πρωτόκολλο: Σε 10 ml υγρό θρεπτικό υλικό LB, παρουσία αντιβιοτικού επιλογής, προστέθηκε µία βακτηριακή αποικία και επωάστηκε µε ανάδευση στους 37 ο C για ώρες. Μετά την ανάπτυξη της καλλιέργειας, µεταφέρθηκε µέρος αυτής (7 ml) σε σωλήνα φυγοκέντρου (falcon, 15 ml), φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά σε x g και αποµακρύνθηκε το υγρό θρεπτικό µέσο, αφήνοντας το ίζηµα των βακτηριακών κυττάρων όσο πιο στεγνό γίνεται. Ακολούθησε αιώρηση των κυττάρων σε 250 µl διαλύµατος Α1 και µεταφορά σε σωλήνα µικροφυγοκέντρου (eppendorf, 1.5 ml). Στη συνέχεια, έγινε προσθήκη 250 µl διαλύµατος Α2 και ήπια ανάδευση µε αναστροφή του σωλήνα 6-8 φορές. Μετά από παραµονή 5 λεπτών σε θερµοκρασία δωµατίου, προστέθηκαν 300 µl διαλύµατος Α3 και αφού έγινε ήπια ανάδευση, αναστρέφοντας το σωλήνα 6-8 φορές, ακολούθησε φυγοκέντρηση σε x g για 5 λεπτά. Μέρος από το υπερκείµενο (750 µl) µεταφέρθηκε στη στήλη NucleoSpin Plasmid και έγινε φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g. Το πλασµιδιακό DNA συγκρατείται στη στήλη, ενώ τα υπόλοιπα προϊόντα της λύσης των κυττάρων διέρχονται από τη στήλη χωρίς να συγκρατηθούν. Ακολούθησαν διαδοχικές πλύσεις της στήλης µε 500 µl διαλύµατος AW (προθερµασµένου στους 50 ο C) και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g, και ακολούθως µε 600 µl διαλύµατος A4 σε x g για 1 λεπτό. Το στέγνωµα της στήλης έγινε µε φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε x g. Η έκλουση του πλασµιδιακού DNA από τη στήλη πραγµατοποιήθηκε µε προσθήκη 35 µl διαλύµατος ΑΕ, επώαση για 1 λεπτό σε θερµοκρασία δωµατίου και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g. Το πλασµιδιακό DNA αποθηκεύτηκε στους -20 ο C Πέψη πλασµιδιακού DNA µε ένζυµα περιορισµού Τα ένζυµα περιορισµού (ενδονουκλεάσες περιορισµού) διασπούν τον σακχαροφωσφορικό σκελετό του DNA εκλεκτικά, σε εξειδικευµένα σηµεία 157

164 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι βάση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας που αναγνωρίζουν σε αυτές τις θέσεις. Βάση αυτής της ιδιότητάς τους αποτελούν ένα πολύτιµο εργαλείο στην τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA. Προκειµένου να γίνει πέψη πλασµιδιακού DNA µε περιοριστικά ένζυµα, το µίγµα της αντίδρασης περιλαµβάνει το DNA του πλασµιδιακού φορέα, το κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα στο οποίο τα ένζυµα περιορισµού εµφανίζουν τη βέλτιστη δράση και τα ένζυµα περιορισµού. Για αποτελεσµατικότερη πέψη ορισµένων περιοριστικών ενζύµων απαιτείται αλβουµίνη (BSA). Συνήθως, ο συνολικός όγκος του µίγµατος κυµαίνεται από 20 έως 50 µl και η αντίδραση γίνεται στους 37 ο C για δύο ώρες. Στις πέψεις των πλασµιδιακών DNA, το ρυθµιστικό διάλυµα είναι συνήθως 10% v/v του συνολικού όγκου της αντίδρασης και η ποσότητα των ενζύµων που χρησιµοποιούνται δεν πρέπει να ξεπερνά το 10% v/v του συνολικού όγκου. ιαφορετικά η πέψη µπορεί να µην είναι επιτυχής ή να γίνει µη εξειδικευµένη πέψη. Οι πέψεις του πλασµιδιακού DNA έγιναν µε σκοπό να ελεγχθεί το µέγεθος και η ακεραιότητα του πλασµιδίου. Πραγµατοποιήθηκαν δύο πέψεις µε ένα (απλή πέψη) και δύο (διπλή πέψη) ένζυµα περιορισµού. Οι συνθήκες των αντιδράσεων πέψης φαίνονται παρακάτω: Απλή πέψη 1 µg πλασµίδιο pad µl EcoR1 ρυθµιστικό διάλυµα 1 µl EcoR1 ένζυµο περιορισµού 11.5 µl H 2 O ιπλή πέψη 1 µg πλασµίδιο pad µl Buffer 4 3 µl BSA 1 µl Sacl ένζυµο περιορισµού 1 µl Xbal ένζυµο περιορισµού 16.6 µl H 2 O 158

165 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι Τα δείγµατα κατά την πέψη επωάστηκαν στους 37 ο C για 2 ώρες. Μετά το τέλος των αντιδράσεων πέψης, ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων των πέψεων σε πηκτή αγαρόζης. Η παρασκευή της πηκτής και η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων έγινε όπως περιγράφεται στην παράγραφο Προετοιµασία βακτηριακών κυττάρων Bacillus subtilis GB03 επιδεκτικών για µετασχηµατισµό (competent cells) Η τεχνική που περιγράφεται στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε µε σκοπό να γίνουν τα βακτηριακά κύτταρα Bacillus subtilis GB03 δεκτικά (επιδεκτικά) στην πρόσληψη εξωγενούς πλασµιδιακού DNA. Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε περιγράφεται στο Bacillus Genetic Stock Center ( για την προετοιµασία επιδεκτικών κυττάρων και µετασχηµατισµό βακτηρίων Bacillus subtilis και βασίζεται σε µια πρωτοποριακή έρευνα των Anagnostopoulos και Spizizen (1961). Πολλές παραλλαγές της βασικής αυτής τεχνικής έχουν αναφερθεί και µία από αυτές χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα έρευνα (Yasbin et al., 1975). Πριν την έναρξη της διαδικασίας προετοιµάστηκαν τα ακόλουθα διαλύµατα: 10 X Medium A base: Εκχύλισµα ζύµης 10 g Τρυπτόνη 2 g Απεσταγµένο νερό έως 900 ml Αποστείρωση σε αυτόκαυστο, και µετά προσθήκη 50% γλυκόζη, αποστειρωµένη µε φιλτράρισµα 100 ml 10 X Bacillus salts: Θειϊκό αµµώνιο ((NH 4 ) 2 SO 4 ) 20 g Άνυδρο µονόξινο φωσφορικό κάλιο (K 2 HPO 4 )139.7 g ισόξινο φωσφορικό κάλιο (KH 2 PO 4 ) 60 g Κιτρικό τρι-νάτριο (Tri-sodium citrate) 10 g Θειικό µαγνήσιο επταυδρικό (MgSO 4 * 7H 2 O) 2 g Αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό έως 1000 ml 159

166 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι Medium A: Αποστειρωµένο νερό 81 ml 10 X Medium A base 10 ml 10 X Bacillus salts 9 ml L-Τρυπτοφάνη (11 mg/ml) 0.1 ml Medium B: Medium A 10 ml 50 mm Χλωριούχο ασβέστιο διένυδρο (CaCl 2 * 2H 2 O) 0.1 ml 250 nm Χλωριούχο µαγνήσιο εξαυδρικό (MgCl 2 * 6H 2 O) 0.1 ml Τα διαλύµατα 10 X Medium A base και 10 X Bacillus salts µοιράστηκαν σε σωλήνες φυγοκέντρου (falcon, 15 ml), 10 και 9 ml, αντίστοιχα, και διατηρήθηκαν στους 4 ο C µέχρι να χρησιµοποιηθούν. Η τεχνική που εφαρµόστηκε περιγράφεται αναλυτικά στη συνέχεια: 1) Τρυβλίο που περιέχει στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA επιστρώνεται επιφανειακά µε βακτηριακά κύτταρα B. subtillis GB03 και επωάζεται στους 37 ο C για 20 ώρες. 2) Από το τρυβλίο αυτό λαµβάνονται αποικίες και εµβολιάζονται σε 12 ml υγρού θρεπτικού µέσου (Μedium A). Μετά από ανάδευση, µετράται η οπτική απορρόφηση (OD) στα 650 nm, έτσι ώστε η αρχική τιµή να είναι µεταξύ 0.1 και ) Ακολουθεί επώαση στους 37 ο C υπό ανάδευση και µέτρηση της οπτικής πυκνότητας (OD 650 ) κάθε 20 λεπτά. 4) Οι λογαριθµοποιηµένες τιµές OD 650 σε συνάρτηση µε το χρόνο αποδίδονται σε σύστηµα αξόνων xy. Μετά από µια µικρή φάση υστέρησης (lag phase) παρατηρείται εκθετική αύξηση (exponential phase). Αµέσως µετά την εκθετική φάση ανάπτυξης, θεωρούµε τη χρονική εκείνη στιγµή σαν t 0. Απαιτούνται περίπου 100 λεπτά και η οπτική απορρόφηση (OD 650 ) έχει φθάσει σε εύρος τιµών ) Από τη χρονική στιγµή t 0 ακολουθεί επώαση στους 37 ο C υπό ανάδευση για 90 λεπτά. 160

167 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι 6) 0.05 ml της προηγούµενης καλλιέργειας εµβολιάζονται σε 0.45 ml προθερµασµένου υποστρώµατος (Μedium B), που περιέχεται σε σωλήνα µικροφυγοκέντρου (eppendorf, 1.5 ml). 7) Ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 ο C υπό ανάδευση για 90 λεπτά. Μετά την ολοκλήρωση της επώασης τα κύτταρα είναι επιδεκτικά για µετασχηµατισµό (highly competent). 8) Τα επιδεκτικά πλέον κύτταρα είναι έτοιµα να µετασχηµατιστούν ή εναλλακτικά µπορούν να διατηρηθούν για µεγάλο χρονικό διάστηµα στους -80 ο C. Για µακρά συντήρηση, η καλλιέργεια φυγοκεντρείται και αφού αποµακρυνθεί το υπερκείµενο, γίνεται αιώρηση του ιζήµατος των βακτηριακών κυττάρων σε 500 µl γλυκερόλης (60% v/v) Μετασχηµατισµός (εισαγωγή πλασµιδίου) δεκτικών κυττάρων µε τη χηµική µέθοδο Η µέθοδος προϋποθέτει την ύπαρξη δεκτικών κυττάρων. Το αιώρηµα των επιδεκτικών βακτηριακών κττάρων (500 µl) φυγοκεντρείται και 400 µl από το υπερκείµενο θρεπτικό υγρό αποµακρύνονται. Στη συνέχεια τα κύτταρα του βακτηριακού ιζήµατος επαναιωρούνται στο εναποµένον θρεπτικό υλικό (100 µl) και ακολουθεί προσθήκη πλασµιδιακού DNA (0.2/0.6/1.0 µg). Το µίγµα των επιδεκτικών κυττάρων µε το πλασµιδιακό DNA επωάζεται για 30 λεπτά στους 37 ο C υπό ανακίνηση. Μετά το τέλος της επώασης, το αιώρηµα µε τα µετασχηµατισµένα βακτηριακά κύτταρα επιστρώνεται σε τρυβλίο µε θρεπτικό υλικό TSA που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής (χλωραµφαινικόλη) και ακολουθεί επώαση στους 37 ο C µέχρι την εµφάνιση των αποικιών. Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε περιγράφεται στο Bacillus Genetic Stock Center για µετασχηµατισµό κυττάρων Bacillus subtilis ( Φαινοτυπική επιλογή των µετασχηµατισµένων κυττάρων Η επιλογή των κυττάρων που µετασχηµατίστηκαν έγινε µε βάση την παρατηρούµενη ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό επιλογής. Η χλωραµφαινικόλη (5 µg/ml) αναστέλλει την ανάπτυξη του βακτηρίου B. subtilis GB03. Σε δοκιµή που έγινε µε εµβολιασµό του στελέχους B. subtilis GB03 σε TSA και TSB παρουσία του αντιβιοτικού επιλογής δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη του 161

168 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι βακτηρίου. Παρόλα αυτά κύτταρα που έχουν προσλάβει το πλασµίδιο µπορούν να αναπτυχθούν παρουσία του αντιβιοτικού καθώς το γονίδιο cat κωδικοποιεί ένζυµο που διασπά το αντιβιοτικό. Συνεπώς, εάν καλλιεργηθούν τα µετασχηµατισµένα βακτηριακά κύτταρα παρουσία του αντιβιοτικού επιλογής, θα αναπτυχθούν µόνο όσα έχουν ενσωµατώσει το πλασµίδιο. Για το λόγο αυτό, 100 µl από τα αιωρήµατα µε τα µετασχηµατισµένα βακτηριακά κύτταρα επιστρώθηκαν σε τρυβλία Petri (9 cm) µε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA, το οποίο περιείχε το αντιβιοτικό επιλογής (χλωραµφαινικόλη, 5 µg/ml). Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 37 ο C για περίπου 24 ώρες, ώστε να αναπτυχθούν τα µετασχηµατισµένα βακτηριακά κύτταρα του στελέχους B. subtilius GB03 που περιέχουν τον πλασµιδιακό φορέα. Από τις αποικίες που αναπτύχθηκαν, επιλέχθηκαν µεµονωµένες και εµβολιάστηκαν η κάθε µία σε 10 ml φρέσκου θρεπτικού υλικού TSB παρουσία του αντιβιοτικού επιλογής. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν υπό ανακίνηση στους 37 ο C για ώρες. Επόµενα βήµατα στην πιστοποίηση του µετασχηµατισµού των βακτηριακών κυττάρων, εκτός από την ανάπτυξη αντίστασης στο αντιβιοτικό, είναι η εκ νέου αποµόνωση πλασµιδιακού DNA από τα κύτταρα ώστε να επιβεβαιωθεί η ύπαρξη του πλασµιδίου ενδοκυττάρια µε διαγνωστικές πέψεις µε ένζυµα περιορισµού ή µε αλληλούχισή του. Η διατήρηση των µετασχηµατισµένων βακτηριακών κυττάρων για µεγάλα χρονικά διαστήµατα πραγµατοποιήθηκε σε φιαλίδια eppendorf, µε την τοποθέτηση 0.5 ml υγρής καλλιέργειας βακτηριακών κυττάρων σε 0.5 ml αποστειρωµένης γλυκερόλης (50% v/v) και άµεση ψύξη στους -80 ο C Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA από µετασχηµατισµένα κύτταρα B. subtilis GB03 µε τη µέθοδο του βρασµού (Boiling prep) Η µέθοδος του βρασµού (boiling prep) χρησιµοποιούνταν κατά κόρον από τους ερευνητές πριν την αυτοµατοποιηµένη αποµόνωση του πλασµιδίου από βακτήρια µε kit. Αποτέλεσµα της διαδικασίας είναι η αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA που όµως περιέχει και ποσότητα RNA, καθώς διέρχεται και αυτό από τους πόρους που δηµιουργεί η λυσοζύµη στο βακτηριακό τοίχωµα. Για το λόγο αυτό απαιτείται η κατεργασία του αποµονωµένου πλασµιδίου µε RΝΑάση. Η λυσοζύµη έχει την ικανότητα να διασπά τον β-1,4 γλυκοσιδικό δεσµό του βακτηριακού τοιχώµατος και να δηµιουργεί µικρούς πόρους από τους 162

169 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι οποίους διέρχεται το πλασµίδιο, όχι όµως το χρωµοσωµικό DNA. Στην παρούσα µελέτη, χρησιµοποιήθηκε για την αποµόνωση πλασµιδίου από ένα µεγάλο αριθµό διαφορετικών κλώνων που προέκυψαν από το µετασχηµατισµό καθώς και από τη µητρική καλλιέργεια B. subtilis GB03. Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε έχει ως εξής (Sambrook et al., 1989): 1) 10 ml θρεπτικού υλικού TSB, που περιέχει το αντιβιοτικό επιλογής, εµβολιάζονται µε µια µεµονωµένη αποικία µετασχηµατισµένων κυττάρων και ακολουθεί επώαση µε ανακίνηση στους 37 ο C για περίπου 16 ώρες. 2) Από την καλλιέργεια αυτή 1.5 ml µεταφέρονται σε σωλήνα eppendorf και φυγοκεντρούνται στις στροφές/λεπτό για 4 λεπτά. 3) Το υπερκείµενο αποµακρύνεται σχολαστικά αφήνοντας το ίζηµα των κυττάρων όσο το δυνατόν στεγνό. 4) Το ίζηµα των κυττάρων επαναδιαλύεται σε 150 µl διαλύµατος STET buffer (8% sucrose, 0.5% Triton X-100, 50 mm EDTA, 10 mm Tris). 5) Ακολουθεί προσθήκη 1 µl λυσοζύµης (50 mg/ml) και ανακίνηση µε σύρσιµο σε στατώ. 6) Τα δείγµατα τοποθετούνται για 1 λεπτό σε νερό που βράζει έτσι ώστε να αδρανοποιηθεί η λυσοζύµη και να µην δράσει περαιτέρω. 7) Στη συνέχεια γίνεται φυγοκέντρηση στις στροφές/λεπτό για 20 λεπτά και το ίζηµα, που αποτελείται από τα κυτταρικά υπολείµµατα, αποµακρύνεται µε τη βοήθεια αποστειρωµένης οδοντογλυφίδας. 8) Ακολουθεί προσθήκη 180 µl ισοπροπανόλης στο υπερκείµενο για την κατακρήµνιση του πλασµιδιακού DNA (καθιζάνει το πλασµίδιο ως αδιάλυτο) και ανακίνηση µε αναποδογύρισµα των eppendorfs. 9) Έπειτα γίνεται φυγοκέντρηση στις στροφές/λεπτό για 7 λεπτά και απόρριψη του υπερκείµενου. 10) Στο ίζηµα προστίθενται 300 µl αιθανόλης (70%) και αµέσως µετά ανακίνηση µε σύρσιµο σε στατώ. 11) Αφού γίνει φυγοκέντρηση στις στροφές/λεπτό για 5 λεπτά και απόρριψη του υπερκείµενου, τα eppendorfs αφήνονται ανοιχτά για 15 λεπτά προκειµένου να εξατµιστούν τα τελευταία ίχνη αιθανόλης. 12) Ακολουθεί επαναδιάλυση σε 20 µl αποστειρωµένου και απεσταγµένου νερού και αποθήκευση του πλασµιδιακού DNA στους -20ºC. 163

170 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι Πριν την ηλεκτροφόρηση, στα δείγµατα προστέθηκαν 2.5 µl RΝAάση (10 mg/ml) και επωάστηκαν για 10 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων των αντιδράσεων σε πηκτή αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης θεωρείται από τις πιο αξιόπιστες τεχνικές για το διαχωρισµό, καθαρισµό και ταυτοποίηση µορίων νουκλεϊκών οξέων (DNA και RNA), (Sambrook et al., 1989). Η µέθοδος βασίζεται στη µετακίνηση των αρνητικά φορτισµένων µορίων DNA, σε ουδέτερο ph, προς την άνοδο. Έτσι, µε την εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου στα άκρα της πηκτής, το DNA, ως αρνητικά φορτισµένο σε ουδέτερο ph, µετακινείται προς την άνοδο και διαµέσου των πόρων της πηκτής µε βάση το µοριακό του µέγεθος. Έτσι DNA µόρια µικρότερου µοριακού µεγέθους µετακινούνται στην πηκτή πιο γρήγορα από αυτά µεγαλύτερου µεγέθους. Η παρατήρηση του DNA γίνεται µε τη χρήση βρωµιούχου αιθιδίου, το οποίο δεσµεύεται στη διπλή έλικα του DNA και κάτω από υπεριώδες φως φθορίζει. Η παρασκευή πηκτών γίνεται µε τήξη της αγαρόζης, η οποία είναι ένας πολυσακχαρίτης υψηλού µοριακού µεγέθους, και επιτυγχάνεται µε θέρµανση σε κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των τµηµάτων DNA επηρεάζεται από διάφορες παραµέτρους που πρέπει να λαµβάνονται υπόψη κατά την παρασκευή µιας πηκτής αγαρόζης. Συγκεκριµένα, το µέγεθος των τµηµάτων DNA που πρόκειται να διαχωριστούν, η διαµόρφωση του µορίου DNA (κυκλικό, γραµµικό ή υπερελικωµένο), η συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωµα, το ηλεκτρικό δυναµικό που εφαρµόζεται στα άκρα της πηκτής και η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος ηλεκτροφόρησης είναι µεταξύ άλλων οι σηµαντικότεροι παράγοντες (Σκούρας,1993). Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν πηκτές µε συγκέντρωση αγαρόζης 0.8% w/v, σε ρυθµιστικό διάλυµα TAE 1X, παρουσία βρωµιούχου αιθιδίου (EtBr) σε συγκέντρωση 0.5 µg/ml (Πίνακας 4.2). Για την παρασκευή πηκτής αγαρόζης, σε 50 ml διαλύµατος ηλεκτροφόρησης (TAE 1X) διαλύθηκε µε θέρµανση στους 100 ο C για 2-4 λεπτά η αντίστοιχη ποσότητα αγαρόζης (0.4 g). Το διάλυµα αφέθηκε να κρυώσει µέχρι τους 50 ο C περίπου και αφού προστέθηκε βρωµιούχο αιθίδιο, τοποθετήθηκε σε ειδικό εκµαγείο οριζόντιας συσκευής ηλεκτροφόρησης. Πριν πήξει το διάλυµα, τοποθετήθηκε σε αυτό 164

171 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι πλαστική οδοντωτή µήτρα για το σχηµατισµό θέσεων εισαγωγής των δειγµάτων, η οποία αφαιρέθηκε µετά την στερεοποίηση της πηκτής. Το πήκτωµα παρέµεινε για τουλάχιστον 20 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου µέχρι να στερεοποιηθεί καλά. Μετά την πήξη της, η πηκτή τοποθετήθηκε στην υποδοχή της ηλεκτροφορητικής συσκευής και στη συνέχεια έγινε προσθήκη του ρυθµιστικού διαλύµατος ηλεκτροφόρησης TAE 1X, του οποίου η σύσταση φαίνεται στον Πίνακα 4.2. Στα δείγµατα προστέθηκε, πριν εισαχθούν στην πηκτή, το διάλυµα φόρτωσης των δειγµάτων (10X), (Takara, TAK-9157). Το διάλυµα αυτό περιέχει γλυκερόλη η οποία επιτρέπει στο DNA να τοποθετηθεί στις ειδικές εσοχές που δηµιουργήθηκαν στην πηκτή, χωρίς να διαχυθεί στο διάλυµα της ηλεκτροφόρησης, ενώ οι χρωστικές συµβάλλουν στην παρακολούθηση της πορείας της ηλεκτροφόρησης. Σε µία θέση εισαγωγής δείγµατος τοποθετήθηκε µάρτυρας που περιέχει τµήµατα DNA γνωστού µοριακού µεγέθους. Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης πραγµατοποιήθηκε σε συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης της εταιρείας Thermo Scientific (Owl Separation Systems), σε σταθερή τάση 65 Volt, για περίπου 1 ώρα. Πίνακας 4.2 Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος ηλεκτροφόρησης TAE 1X. Ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης (TAE 1X) 40 mm Tris Base 11.4 mm παγόµορφο οξικό οξύ 1 mm EDTA ph Φασµατοφωτοµετρικός ποσοτικός προσδιορισµός των νουκλεϊκών οξέων Η αρχή του φωτοµετρικού προσδιορισµού της ποσότητας του DNA ή του RNA σε υδατικά διαλύµατα, βασίζεται στο γεγονός ότι όλες οι βάσεις πουρίνης και πυριµιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσµατος. Έτσι, τα διαλύµατα νουκλεϊκών οξέων απορροφούν στο υπεριώδες, µε µέγιστο στα 260 nm. Με βάση το γεγονός ότι µια µονάδα οπτικής πυκνότητας στα 260 nm αντιστοιχεί µε 40 µg/ml διαλύµατος RNA και 50 µg/ml διαλύµατος DNA 165

172 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι προσδιορίζεται η ποσότητα του αντίστοιχου νουκλεϊκού οξέος στο άγνωστο δείγµα (Sambrook et al., 1989). Ο βαθµός καθαρότητας των δειγµάτων εκτιµάται από τον λόγο των οπτικών τους πυκνοτήτων στα 260 nm και στα 280 nm, αφού τα δείγµατα υψηλής καθαρότητας νουκλεϊκών οξέων έχουν λόγο OD260/OD280 περίπου 2. Στην παρούσα εργασία ο φασµατοφωτοµετρικός ποσοτικός προσδιορισµός των νουκλεϊκών οξέων πραγµατοποιήθηκε σε φασµατοφωτόµετρο Nanodrop 2000 της εταιρίας Thermo Scientific Προετοιµασία των παρασκευασµάτων και µικροσκοπική παρατήρηση Μετά τη διαδικασία του µετασχηµατισµού, οι κλώνοι που αποµονώθηκαν και ύστερα από κατάλληλη προετοιµασία, παρατηρήθηκαν σε συνεστιακό µικροσκόπιο σάρωσης µε λέιζερ και σε µικροσκόπιο φθορισµού, µε σκοπό να διαπιστωθεί η πράσινη φθορίζουσα χρωστική της GFP. Η παρατήρηση των βακτηριακών κυττάρων έγινε σε παρασκευάσµατα που προέκυψαν από υγρές και στερεές καλλιέργειες των κυττάρων παρουσία του αντιβιοτικού επιλογής. Συγκεκριµένα, βακτηριακά κύτταρα του κάθε κλώνου επιστρώθηκαν επιφανειακά µε τη βοήθεια κρίκου εµβολιασµού σε στερεό θρεπτικό υλικό TSA που περιείχε χλωραµφαινικόλη και επωάστηκαν στους 37 o C µέχρι την εµφάνιση των αποικιών. Αποµονωµένες αποικίες εµβολιάστηκαν σε θρεπτικό υλικό TSB παρουσία χλωραµφαινικόλης και επωάστηκαν σε ανακινούµενο επωαστήρα στους 37 0 C. Οι υγρές καλλιέργειες φυγοκεντρήθηκαν και αφού αποµακρύνθηκε το υπερκείµενο, ακολούθησε επαναδιάλυση του ιζήµατος σε µικρό όγκο ρυθµιστικού διαλύµατος 1x PBS (ph 7.4). Τα βακτηριακά κύτταρα συλλέχθηκαν κατά τη λογαριθµική φάση ανάπτυξης των κυττάρων, όπου ήταν αναµενόµενη η σταθερά επαγόµενη και σε υψηλά επίπεδα έκφραση της GFP (BGSC, No. ECE166). Η παράµετρος αυτή έχει ιδιαίτερη σηµασία για το στέλεχος B. subtilis GB03, καθώς αυτό εµφανίζει δυνατότητα σποριοποίησης. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν µε τη βοήθεια αυτόµατης πιπέτας σε αντικειµενοφόρους πλάκες που περιείχαν 10 µl αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό και καλύφθηκαν µε καλυπτρίδες. Η παρατήρηση των παρασκευασµάτων έγινε στο Εργαστήριο Ανατοµικής Ιστολογίας και Εµβρυολογίας της Κτηνιατρικής Σχολής Α.Π.Θ. σε µικροσκόπιο 166

173 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι φθορισµού Nikon D-Eclipse 80i (Nikon Upright Fluorescence Microscope D- Eclipse 80i), στο οποίο ήταν προσαρτηµένα τα εξής: α) λάµπα για τον φθορισµό, υψηλής πίεσης λάµπα υδραργύρου της Nikon (Epi-illuminator for fluorescence: high pressure mercury lamp of Nikon), β) ψηφιακή φωτογραφική βιντεοκάµερα DS-Fi1-L2 της Nikon, για τη λήψη φωτογραφιών στο µικροσκόπιο φθορισµού και γ) ένα σύστηµα συνεστιακής µικροσκοπίας σάρωσης µε λέιζερ (Confocal Laser Scanning Mycroscopy, CLSM) Nikon D-ECLIPSE C1. Το σύστηµα αυτό ήταν 2 διόδων (two-channel confocal system C1 (Nikon)) µε 2 ανεξάρτητους φωτοπολλαπλασιαστισκούς PMT (Photomultiplier Tube) ανιχνευτές για τις δέσµες laser. Οι δύο διαθέσιµες δέσµες (lasers) στο confocal system C1 ήταν οι Argon-Ion Laser 488 και 543 nm. Η δέσµη laser που χρησιµοποιήθηκε για την παρατήρηση των µικροβίων, ήταν η πρώτη, δηλαδή προκαλούσε διέγερση (excitation) στα 488nm ενώ η εκποµπή (emission) ανιχνευόταν στα nm ιαδικασία µέτρησης του PGPR στελέχους B. subtilis GB03 στη ρίζα φυτών τοµάτας και στο έδαφος της ριζόσφαιρας Οι συγκεκριµένες πειραµατικές δοκιµές πραγµατοποιήθηκαν µε σκοπό τη µέτρηση της ικανότητας αποικισµού του PGPR στελέχους B. subtilis GB03 στη ριζόσφαιρα φυτών τοµάτας, ανεπτυγµένων σε φυσικό έδαφος και επίσης µελετήθηκε η πιθανή επίδραση του acibenzolar-s-methyl στους PGPR πληθυσµούς που εµβολιάστηκαν. Οι µετρήσεις έγιναν στη ρίζα των φυτών τοµάτας και στο έδαφος της ριζόσφαιρας. Για το διαχωρισµό των προστιθέµενων PGPR από τα ενδογενή ριζοβακτήρια του εδάφους, χρησιµοποιήθηκε στέλεχος B. subtilis GB03-G7 chlor+ µε ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό χλωραµφαινικόλη. Συγκεκριµένα, επιλέχθηκε ο κλώνος G7 που προέκυψε από το µετασχηµατισµό των κυττάρων B. subtilis GB03, του οποίου η αντοχή στη χλωραµφαινικόλη ήταν χρωµοσωµική και δεν οφειλόταν στην εισαγωγή του πλασµιδίου, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Η σταθερότητα της ανθεκτικότητας ελέγχθηκε µε διαδοχικές ανακαλλιέργειες του ανθεκτικού κλώνου B. subtilis GB03-G7 chlor+ σε θρεπτικό υλικό TSB, παρουσία της χλωραµφαινικόλης σε συγκέντρωση 5 µg/ml. Για µακρά αποθήκευση, µεταφέρθηκε 0.5 ml υγρής καλλιέργειας βακτηριακών κυττάρων σε 0.5 ml αποστειρωµένης γλυκερόλης (50% v/v) και ακολούθησε άµεση ψύξη στους -80 ο C. Για την παραγωγή µολύσµατος, επιστρώθηκαν βακτηριακά κύτταρα σε στερεό θρεπτικό 167

174 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι υπόστρωµα TSA, το οποίο περιείχε χλωραµφαινικόλη και µετά από επώαση επιλέχθηκαν µεµονωµένες αποικίες και επωάστηκαν υπό ανακίνηση σε θρεπτικό µέσο TSB παρουσία του αντιβιοτικού. Η ανάπτυξη των φυτών τοµάτας (cv. ACE 55) πραγµατοποιήθηκε σε φυτοδοχεία σε θερµοκηπιακές συνθήκες και η εφαρµογή του PGPR στελέχους και του acibenzolar-s-methyl (Bion 50% WG, Syngenta S.A.) έγινε όπως περιγράφηκε στις παραγράφους και Η παρακολούθηση του πληθυσµού του βακτηριακού στελέχους B. subtilis GB03-G7 chlor+ στην περιοχή της ριζόσφαιρας πραγµατοποιήθηκε µε τη βοήθεια διαδοχικών αραιώσεων και µακροσκοπικής παρατήρησης των αποικιών σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA παρουσία χλωραµφαινικόλης σε 0, 2, 4, 7, 12 και 21 ηµέρες από την εφαρµογή του acibenzolar-s-methyl. Για τη συλλογή των δειγµάτων, τα σπορόφυτα αφαιρέθηκαν από τα φυτοδοχεία και ακολούθησε ήπια ανακίνηση των ριζών µε το χέρι ώστε να αποµακρυνθεί η περίσσεια του εδάφους (Εικόνα 4.5). Τα δείγµατα εδάφους (3 g) από την περιοχή της ριζόσφαιρας µεταφέρθηκαν σε αποστειρωµένες κωνικές φιάλες (250 ml) που περιείχαν 100 ml αποστειρωµένου και αποσταγµένου νερού µε 0.05% (v/v) Tween 20 (Sigma- Aldrich, Steinheim, Germany), (Kinsella et al., 2009). Μετά από ανάδευση στις 140 στροφές/λεπτό για 1 ώρα, ακολούθησαν 1:10 διαδοχικές αραιώσεις ( ) και 100 µl από τις αραιώσεις εµβολιάστηκαν και επιστρώθηκαν σε τρυβλία που περιείχαν στερεό θρεπτικό υλικό TSA, παρουσία χλωραµφαινικόλης. Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 30 o C για 72 ώρες. Μετά την ολοκλήρωση της επώασης, µετρήθηκε µακροσκοπικά ο αριθµός των αποικιών και εκφράσθηκε σε CFU/g εδάφους. Ο υπολογισµός του αποικισµού στο ριζικό σύστηµα της τοµάτας πραγµατοποιήθηκε µετά από καλό πλύσιµο των ριζών σε τρεχούµενο νερό βρύσης και στέγνωµα σε διηθητικό χαρτί (Εικόνα 4.5). Συγκεκριµένα, 0.2 g του ακραίου τµήµατος της ρίζας οµογενοποιήθηκαν σε γουδί πορσελάνης παρουσία 1.8 ml (10 mm) ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών (Zhang et al., 2011). Στο προϊόν οµογενοποίησης πραγµατοποιήθηκαν διαδοχικές 1:10 αραιώσεις και από τα διαλύµατα που προέκυψαν 100 µl επιστρώθηκαν σε τρυβλία µε θρεπτικό υλικό TSA, το οποίο περιείχε χλωραµφαινικόλη. Μετά από επώαση 72 ωρών 168

175 Κεφάλαιο 4 Υλικά και Μέθοδοι στους 30 o C µετρήθηκε ο αριθµός των αποικιών και εκφράσθηκε σε CFU/g ρίζας. Εικόνα 4.5 Έδαφος της ριζόσφαιρας και ρίζες φυτών τοµάτας όπου πραγµατοποιήθηκαν οι µετρήσεις αποικισµού του PGPR στελέχους B. subtilis GB03- G7 chlor Επεξεργασία δεδοµένων Ο προσδιορισµός των τιµών DT 50 (χρονικό διάστηµα κατά το οποίο η αρχική συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου µειώνεται κατά 50%) έγινε µε τη χρήση της εξίσωσης κινητικής πρώτης τάξης C t = C 0 e -kt, όπου C t η συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου σε χρόνο t (mg/kg), C 0 η αρχική συγκέντρωση του γεωργικού φαρµάκου (mg/kg), K η σταθερά του ρυθµού αποδόµησης του γεωργικού φαρµάκου (days -1 ), και t ο χρόνος (days), (FOCUS, 2006). Οι τιµές DT 50 υπολογίστηκαν µε τη βοήθεια του προγράµµατος στατιστικής ανάλυσης JMP (JMP, SAS Institute, Cary, NC, USA). Η επεξεργασία των πειραµατικών δεδοµένων βασίστηκε στην ανάλυση παραλλακτικότητας (One-way ANOVA). Οι διαφορές µεταξύ των επεµβάσεων αξιολογήθηκαν µε το κριτήριο Duncan σε επίπεδο σηµαντικότητας P = Η στατιστική επεξεργασία των δεδοµένων έγινε µε τη χρήση του στατιστικού προγράµµατος SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, USA). 169

176 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα 4.3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αξιοπιστία µεθόδων χρωµατογραφικής ανάλυσης Το acibenzolar-s-methyl παρουσίασε µέγιστη απορρόφηση στα 254 nm και ο µεταβολίτης CGA στα 235 nm, και οι χρόνοι κατακράτησής τους ήταν και 2.78 min, αντίστοιχα (Εικόνα 4.6). Η εξίσωση της πρότυπης καµπύλης του acibenzolar-s-methyl είχε σε όλες τις περιπτώσεις συντελεστή συσχέτισης r 2 µεγαλύτερο από και το CGA µεγαλύτερο από , γεγονός που δείχνει ότι υπάρχει ευθύγραµµη συσχέτιση µεταξύ της ποσότητας της ουσίας (Χ) και της χρωµατογραφικής απόκρισης (Y). a) CGA ASM Minutes b) CGA ASM Minutes Overlaid Spectra λ max =254 nm (ASM) λ max = 235 nm (CGA ) Intensity (mau) Wavelength (nm) nm Εικόνα 4.6 HPLC-UV χρωµατογραφήµατα των ουσιών acibenzolar-s-methyl (ASM) και του µεταβολίτη του CGA σε πρότυπο διάλυµα συγκέντρωσης 0.5 mg/l (a) και σε επιφορτισµένο δείγµα τοµάτας σε επίπεδο 0.2 mg/kg (b). UV φάσµατα απορρόφησης των ουσιών µε µέγιστες τιµές στα 254 (ASM) και 235 nm (CGA 21007), που πάρθηκαν στο υψηλότερο σηµείο των κορυφών. 170

177 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα Η µέθοδος ανάλυσης των δειγµάτων εδάφους ελέγχθηκε ως προς την ακρίβεια και την επαναληψηµότητα στα επίπεδα 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 10 και 60 mg/kg για το acibenzolar-s-methyl και 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 και 4 mg/kg για το µεταβολίτη CGA Τα αποτελέσµατα των δοκιµών ανάκτησης παρατίθενται συγκεντρωτικά στον Πίνακα 4.3. Η ακρίβεια και η επαναληψηµότητα της µεθόδου ήταν αποδεκτή, µε µέσες ανακτήσεις για το acibenzolar-s-methyl από 90 έως 120% και RSD <6%, ενώ για το CGA κυµάνθηκαν από 74 έως 96% µε RSD <11% (SANCO/10684/2009). Το όριο ανίχνευσης (LOD) του acibenzolar-s-methyl προσδιορίστηκε στα mg/kg και του µεταβολίτη CGA στα 0.01 mg/kg, ενώ το όρια ποσοτικού προσδιορισµού (LOQ) ήταν 0.02 mg/kg και 0.05 mg/kg, αντίστοιχα. Η µέθοδος ανάλυσης των υπολειµµάτων στο υπέργειο µέρος των φυτών τοµάτας αξιολογήθηκε σε πέντε επίπεδα ανάκτησης (0.05, 0.1, 0.5, 1 και 30 mg/kg), µε τρεις επαναλήψεις ανά επίπεδο. Οι ανακτήσεις κυµάνθηκαν µεταξύ 81-96% (acibenzolar-s-methyl) και 76-82% (CGA ), και η σχετική τυπική απόκλιση ήταν <8% σε όλες τις περιπτώσεις. Τα LOD και LOQ προσδιορίστηκαν στα 0.02 και 0.05 mg/kg για το acibenzolar-s-methyl και στα 0.03 και 0.05 mg/kg για το CGA , αντίστοιχα. Πίνακας 4.3 Ανακτήσεις και σχετικές τυπικές αποκλίσεις των ουσιών acibenzolar-s-methyl και CGA σε δείγµατα εδάφους (0.8% οργανική ουσία). Acibenzolar-S-methyl CGA Επίπεδο Ανάκτηση a RSD b Επίπεδο Ανάκτηση RSD (mg/kg) (%) (%) (mg/kg) (%) (%) a Μέσος όρος τριών επαναλήψεων. b RSD= σχετική τυπική απόκλιση τριών επαναλήψεων. 171

178 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα Επίδραση των PGPR στην αποδόµηση του acibenzolar-s-methyl στο έδαφος της ριζόσφαιρας και σχηµατισµός του µεταβολίτη CGA Η συλλογή των δειγµάτων εδάφους από την περιοχή της ριζόσφαιρας έγινε σε 1, 4, 8, 24, 48, 96, 168 και 240 ώρες από την εφαρµογή του acibenzolar-smethyl και µετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις των υπολειµµάτων της µητρικής ουσίας και του µεταβολίτη της. Με τη βοήθεια της εξίσωσης κινητικής πρώτης τάξης (C t = C 0 e -kt ) προσδιορίστηκαν οι τιµές DT 50 σε όλες τις επεµβάσεις. Συγκεκριµένα, στη ριζόσφαιρα φυτών τοµάτας που εµβολιάστηκαν µε τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24 και B. subtilis GB03, οι τιµές DT 50 του acibenzolar-s-methyl ήταν 7.7, 7.7, 8.9 και 8.3 ώρες, αντίστοιχα. Στο µάρτυρα που δεν έγινε ριζοεµβολιασµός µε ριζοβακτήρια, η αρχική συγκέντρωση του acibenzolar-s-methyl µειώθηκε κατά 50% σε διάστηµα (7.8 ώρες) που δεν διέφερε σηµαντικά από τις βακτηριακές µεταχειρίσεις (P>0.05). Οι συγκεντρώσεις του CGA , κύριος µεταβολίτης του acibenzolar- S-methyl, αυξήθηκαν σταδιακά έως τις πρώτες ώρες από την εφαρµογή του acibenzolar-s-methyl (Πίνακας 4.4). Συγκεκριµένα, από mg/kg που ανιχνεύθηκαν 1 ώρα µετά την εφαρµογή του σκευάσµατος, ο µεταβολίτης παρουσίασε µέγιστες συγκεντρώσεις στο έδαφος της ριζόσφαιρας που κυµαίνονταν στις διάφορες επεµβάσεις από 3.1 έως 3.4 mg/kg, 24 έως 48 ώρες από την εφαρµογή. Στις επόµενες δειγµατοληψίες, οι συγκεντρώσεις που ανιχνεύθηκαν ήταν ελαφρώς µειωµένες ώστε τελικά σε διάστηµα 10 ηµερών προσδιορίστηκαν µέσες συγκεντρώσεις µεταξύ 2.2 και 2.8 mg/kg (Πίνακας 4.4). Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν µεταξύ των επεµβάσεων ως προς το σχηµατισµό του CGA ήταν µη σηµαντικές (P>0.05) σε κάθε δειγµατοληψία (Πίνακας 4.4). 172

179 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα Πίνακας 4.4 Μέσες συγκεντρώσεις (mg/kg) του κύριου προϊόντος µεταβολισµού του acibenzolar-smethyl (CGA ) στο έδαφος της ριζόσφαιρας φυτών τοµάτας. CGA (mg/kg) Επέµβαση 1 h 4 h 8 h 24 h 48 h 96 h 168 h 240 h Control x 0.9a y 1.7a 2.0a 3.1a 3.4a 3.0a 2.8a 2.8a IN937a 0.9a 1.8a 2.2a 3.1a 3.1a 2.9a 2.3a 2.2a SE34 0.8a 1.7a 2.4a 3.1a 3.2a 3.0a 2.9a 2.8a FZB24 0.8a 1.9a 2.4a 3.4a 3.2a 2.7a 2.5a 2.2a GB03 0.7a 1.7a 2.2a 3.3a 2.8a 2.8a 2.6a 2.2a x Control: φυτά που δεν δέχτηκαν βακτηριακή µεταχείριση; IN937a: φυτά εµβολιασµένα µε το στέλεχος B. amyloliquefaciens IN937a; SE34: φυτά εµβολιασµένα µε το στέλεχος B. pumilus SE34; FZB24: φυτά εµβολιασµένα µε το στέλεχος B. subtilis FZB24; GB03: φυτά εµβολιασµένα µε το στέλεχος B. subtilis GB03. y Τιµές εντός των στηλών που ακολουθούνται από ίδια γράµµατα δεν διαφέρουν σηµαντικά µεταξύ τους σύµφωνα µε το κριτήριο Duncan, σε επίπεδο σηµαντικότητας P = Πρόσληψη και µετακίνηση του acibenzolar-s-methyl και του µεταβολίτη του CGA στο υπέργειο µέρος φυτών τοµάτας Τα φυτά τοµάτας αφαιρέθηκαν στην περιοχή του λαιµού σε χρονικά διαστήµατα 1, 4, 8, 24, 48, 96, 168 και 240 ωρών από την εφαρµογή του acibenzolar-s-methyl και αφού µετρήθηκε το βάρος του υπέργειου µέρους προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις των υπολειµµάτων acibenzolar-s-methyl και του κύριου µεταβολίτη του CGA Τα συγκεκριµένα αποτελέσµατα αφορούν πειράµατα που πραγµατοποιήθηκαν σε θερµοκηπιακές συνθήκες. Αµέσως µετά την εφαρµογή του acibenzolar-s-methyl πραγµατοποιήθηκε συλλογή δειγµάτων, χωρίς όµως να ανιχνευθούν υπολείµµατα των ουσιών acibenzolar-s-methyl και CGA Η µετακίνηση ωστόσο των υπολειµµάτων από το ριζικό σύστηµα στο υπέργειο µέρος των φυτών ήταν γρήγορη, καθώς ανιχνεύθηκαν συγκεντρώσεις των υπολειµµάτων που κυµάνθηκαν µεταξύ mg/kg και mg/kg για το acibenzolar-smethyl και CGA , αντίστοιχα, 1 ώρα µετά την εφαρµογή του 173

180 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα σκευάσµατος. Στις επόµενες δειγµατοληψίες η συγκέντρωση του acibenzolar-smethyl µειώθηκε σταδιακά, ενώ η συγκέντρωση του µεταβολίτη CGA παρουσίασε σηµαντική αύξηση. Στην Εικόνα 4.7 παρουσιάζονται οι συνολικές συγκεντρώσεις των υπολειµµάτων, ως άθροισµα των υπολειµµάτων acibenzolar- S-methyl και του κύριου προϊόντος µεταβολισµού (CGA ), στο υπέργειο µέρος φυτών τοµάτας, µετά το ριζοπότισµα των φυτών µε διάλυµα του σκευάσµατος Bion (50% WG, acibenzolar-s-methyl) στις διάφορες PGPR µεταχειρίσεις. Σηµαντικές διαφοροποιήσεις µεταξύ των επεµβάσεων παρατηρήθηκαν 8 ώρες από την εφαρµογή του σκευάσµατος και µέχρι την ολοκλήρωση της πειραµατικής δοκιµής (Εικόνα 4.7). Η µέγιστη µετακίνηση υπολειµµάτων παρατηρήθηκε µεταξύ 48 και 96 ωρών. Φυτά που δέχτηκαν µεταχείριση µε το PGPR στέλεχος B. subtilis GB03 παρουσίασαν τη µεγαλύτερη συγκέντρωση υπολειµµάτων (37.9 mg/kg), ακολουθούµενα από τα B. pumilus SE34 (35.5 mg/kg) και B. subtilis FZB24 (27.4 mg/kg) ενώ η µέγιστη συγκέντρωση των υπολειµµάτων σε φυτά χωρίς βακτηριακή µεταχείριση ήταν σηµαντικά µικρότερη (19.6 mg/kg). Η µέγιστη συγκέντρωση στην επέµβαση B. amyloliquefaciens IN937a ήταν 22.3 mg/kg. Μετά τις πρώτες 8 ώρες, στις επεµβάσεις µε τα ριζοβακτήρια B. subtilis GB03 και B. pumilus SE34 οι συγκεντρώσεις των υπολειµµάτων που ανιχνεύθηκαν ήταν σηµαντικά υψηλότερες (P<0.05) ως προς το µάρτυρα. Φυτά που δέχτηκαν µεταχείριση µε το στέλεχος B. amyloliquefaciens IN937a εµφάνισαν συγκεντρώσεις υπολειµµάτων σε όλες τις δειγµατοληψίες στατιστικώς µη σηµαντικές ως προς το µάρτυρα (P>0.05). 174

181 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα 40,0 ccontrol B. amyloliquefaciens IN937a 2B. pumilus SE34 FB. subtilis FZB24 GB. subtilis GB03 c 35,0 c c c Συγκέντρωση (mg/kg) 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 a a a a a b a c a c a a b ab b ab a bc ab a bc a a b a b a a b a b 5,0 a a a a a 0, Χρόνος (ώρες) Εικόνα 4.7 Συνολικές συγκεντρώσεις (mg/kg) των υπολειµµάτων acibenzolar-s-methyl και του κύριου µεταβολίτη του CGA στο υπέργειο µέρος φυτών τοµάτας στις διάφορες PGPR επεµβάσεις, µετά από εφαρµογή του Bion (50% WG, acibenzolar-smethyl) µε ριζοπότισµα. Η ανάπτυξη των φυτών πραγµατοποιήθηκε σε συνθήκες θερµοκηπίου. Tιµές που ακολουθούνται µε το ίδιο γράµµα δεν είναι στατιστικώς σηµαντικές σύµφωνα µε το κριτήριο Duncan, σε επίπεδο σηµαντικότητας P= Μετασχηµατισµός των βακτηριακών κυττάρων B. subtilis GB03 µε το πλασµίδιο pad43-25 Ο µετασχηµατισµός των PGPR µε πλασµιδιακό φορέα που κωδικοποιεί την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) είναι µια τεχνική που χρησιµοποιείται για τη µελέτη της ικανότητας αποικισµού της ριζόσφαιρας από εξωγενή PGPR. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η επισήµανση του βακτηριακού εµβολίου, αφού τα ζωντανά κύτταρα αποκτούν πράσινο φθορίζον χρώµα, και η διάκρισή του από τους ενδογενείς µικροβιακούς πληθυσµούς του εδάφους. Η παρατήρηση του αποικισµού στην περίπτωση αυτή γίνεται µε τη χρήση ειδικών µικροσκοπίων (φθορισµού ή συνεστιακό). Στην παρούσα έρευνα, επιχειρήθηκε ο µετασχηµατισµός του PGPR στελέχους B. subtilis GB03 µε το πλασµίδιο pad43-25 που κωδικοποιεί GFP (gfpmut3a), ώστε να µελετηθεί η ικανότητα αποικισµού του στελέχους µετά από ριζοεµβολιασµό φυτών τοµάτας. Ο πλασµιδιακός φορέας pad

182 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα παραχωρήθηκε από το BGSC (Bacillus Genetic Stock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University, USA). Η διατήρηση και αναπαραγωγή του πλασµιδιακού φορέα επιτεύχθηκε σε κύτταρα του στελέχους Escherichia coli DH5a (BGSC, No. ECE166). Σε πρώτο στάδιο πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA από τα βακτηριακά κύτταρα E. coli µε τη χρήση του kit NucleoSpin Plasmid Miniprep (βλέπε παράγραφο ) και ακολούθησαν διαγνωστικές πέψεις µε ένζυµα περιορισµού για να ελεγχθεί το µέγεθος και η ακεραιότητά του. Στην Εικόνα 4.8 φαίνεται η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (0.8%) του πλασµιδίου pad43-25 πριν τις διαγνωστικές πέψεις (διαδροµή 2) και µετά από απλή (διαδροµή 3), (Εκόνα 4.8Α) και διπλή πέψη (διαδροµή 2), (Εικόνα 4.8Β) µε τα ένζυµα περιορισµού EcoR1 και Sacl, Xbal, αντίστοιχα. Κατά την ηλεκτροφόρηση διαπιστώθηκε η ύπαρξη ζώνης του πλασµιδιακού DNA στη γραµµική του µορφή µετά από απλή πέψη (µέγεθος περίπου 7262bp) ενώ αποτέλεσµα της διπλής πέψης ήταν η εµφάνιση δύο διακριτών ζωνών σε µεγέθη περίπου 1200 bp και 6000 bp όπως και ήταν αναµενόµενο. Επιπρόσθετα, τα βακτηριακά κύτταρα E. coli, απ' όπου έγινε η αποµόνωση του πλασµιδίου pad43-25, παρατηρήθηκαν σε συνεστιακό µικροσκόπιο σάρωσης µε λέιζερ και σε µικροσκόπιο φθορισµού όπου διαπιστώθηκε έντονος φθορισµός των κυττάρων (Εικόνα 4.9) Kb Kb 8.0 Αναµενόµενο 6.0 µέγεθος: 7262bp Αναµενόµενο µέγεθος: 6000bp Αναµενόµενο µέγεθος: 1200bp 1.0 A B Εικόνα 4.8 A) Hλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (0.8%) του πλασµιδίου pad43-25 πριν την πέψη (διαδροµή 2) και µετά από απλή πέψη µε το ένζυµο περιορισµού EcoR1 (διαδροµή 3). B) ιπλή πέψη (διαδροµή 2) του πλασµιδίου pad43-25 µε τα ένζυµα περιορισµού Sacl και Xbal. Μάρτυρες µοριακού µεγέθους 10.0 Kb (διαδροµή 1). 176

183 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα Εικόνα 4.9 GFP+ κύτταρα E. coli DH5a που περιέχουν το πλασµίδιο pad43-25 κάτω από µικροσκόπιο φθορισµού. Στη συνέχεια έγινε εισαγωγή του αποµονωµένου πλασµιδίου σε επιδεκτικά για µετασχηµατισµό κύτταρα B. subtilis GB03, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Μετά τη διαδικασία του µετασχηµατισµού, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ο C σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα TSA, παρουσία του αντιβιοτικού χλωραµφαινικόλη, στο οποίο παρουσίαζαν ανθεκτικότητα και µε τον τρόπο αυτό έγινε η επιλογή των θετικών αποικιών. Από τις βακτηριακές αποικίες που αναπτύχθηκαν, επιλέχθηκαν δεκαπέντε (15) µοναδιαίες θετικές αποικίες και ακολούθησε ανακαλλιέργεια των αποικιών σε θρεπτικό υλικό TSB παρουσία χλωραµφαινικόλης, ενώ ένα µικρό µέρος της κάθε υγρής καλλιέργειας διατηρήθηκε σε στοκ γλυκερόλης. Στους δεκαπέντε αυτούς κλώνους που προέκυψαν από το µετασχηµατισµό των βακτηριακών κυττάρων του B. subtilis GB03 δόθηκαν οι κωδικοί αριθµοί G1 έως G15. Αξίζει να αναφερθεί στο σηµείο αυτό ότι σε δοκιµή που έγινε µε εµβολιασµό του στελέχους B. subtilis GB03 σε θρεπτικό µέσο TSA και TSB παρουσία του αντιβιοτικού επιλογής δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη του βακτηρίου, γεγονός που σηµαίνει ότι το µητρικό στέλεχος δεν είναι ανθεκτικό στη χλωραµφαινικόλη. Εποµένως, η αντίσταση που απέκτησαν οι κλώνοι στο αντιβιοτικό επιλογής µετά το µετασχηµατισµό ήταν η πρώτη σηµαντική ένδειξη µετασχηµατισµού των κυττάρων. Για τον έλεγχο της ύπαρξης του πλασµιδίου έγινε αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA από όλους τους κλώνους µε τη µέθοδο του βρασµού (boiling 177

184 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα prep), όπως περιγράφεται στην παράγραφο Μετά από ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης (0.8%) προέκυψαν χαρακτηριστικές ζώνες µε µέγεθος µεγαλύτερο από 10 Kb (Εικόνα 4.10). Οι ζώνες αυτές δεν παρουσιάζουν χαρακτηριστική εικόνα πλασµιδιακού DNA, το οποίο αναλύεται µετά από ηλεκτροφόρηση σε διακριτές ζώνες που αντιστοιχούν στην ελεύθερη αλλά και σε περισσότερο ελικωµένες µορφές του (ανώτερες διαµορφώσεις). Παρόλα αυτά, όπως φαίνεται στην Εικόνα 4.11 οι ζώνες από τις βακτηριακές καλλιέργειες G4, G5 και G7 εµφανίζουν µέγεθος πολύ κοντά στην ελεύθερη διαµόρφωση του πλασµιδιακού φορέα. Λαµβάνοντας υπόψη ότι τα Gram (+) βακτήρια έχουν παχύ κυτταρικό τοίχωµα που µπορεί να δυσκολεύει τη λύση των κυττάρων, το γεγονός ότι πολλά στελέχη Bacillus εκκρίνουν µεγάλες ποσότητες νουκλεασών στο θρεπτικό µέσο καθώς και ότι το στέλεχος B. subtillis GB03 εµφανίζει σποριοποίηση µετά τη λογαριθµική φάση ανάπτυξης, πραγµατοποιήθηκε επιλεκτικά για τους κλώνους G6 και G8 αποµόνωση του πλασµιδιακού DNA και µε εναλλακτική µέθοδο αποµόνωσης (χρήση του NucleoSpin Plasmid Miniprep kit). Η προσέγγιση αυτή χρησιµοποιήθηκε ώστε να επιβεβαιωθεί ότι οι ζώνες αντιστοιχούν σε πλασµιδιακό DNA και να αποµονωθεί σε άρτια κατάσταση. Αποτέλεσµα ήταν η εµφάνιση των ζωνών στο ίδιο µέγεθος αλλά µε έντονη εικόνα κατακερµατισµού (Εικόνα 4.12). M G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 M G10 G11 G12 G13 G14 G15 Kb 10.0 Χακτηριστικές ζώνες Εικόνα 4.10 Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης (0.8%) των προϊόντων που αποµονώθηκαν από τους δεκαπέντε κλώνους (G1-G15) µε τη µέθοδο του βρασµού (boiling prep). Μάρτυρες µοριακού µεγέθους 10.0 Kb (M). 178

185 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα Kb pad43-25 pad43-25 M G4 G5 G7 Απλή Απλή πέψη πέψη Εικόνα 4.11 Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης (0.8%) του πλασµιδίου pad43-25 (διαδροµή 2) και µετά από απλή πέψη µε το ένζυµο περιορισµού EcoR1 (διαδροµή 3) και των προϊόντων που αποµονώθηκαν από τους κλώνους G4 (διαδροµή 4), G5 (διαδροµή 5) και G7 (διαδροµή 6) µε τη µέθοδο του βρασµού (boiling prep). Μάρτυρες µοριακού µεγέθους 10.0 Kb (M) Χαρ 4 Kb Εικόνα 4.12 Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης (0.8%) του πλασµιδίου pad43-25 (διαδροµή 2) και των προϊόντων που αποµονώθηκαν από τους κλώνους G6 (διαδροµή 3) και G8 (διαδροµή 4) µε τη χρήση του NucleoSpin Plasmid Miniprep kit. Μάρτυρες µοριακού µεγέθους 10.0 Kb (διαδροµή 1). 179

186 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσµατα Για επιβεβαίωση ότι οι χαρακτηριστικές ζώνες αντιστοιχούν στο φορέα pad43-25, µε τον οποίο µετασχηµατίστηκαν τα βακτηριακά κύτταρα, έγιναν πέψεις περιορισµού µε τα κατάλληλα ένζυµα EcoR1 (απλή πέψη) και Sacl, Xbal (διπλή πέψη). Στον πολυσύνδεσµο του πλασµιδίου pad43-25 υπάρχουν οι προαναφερθείσες θέσεις περιορισµού και εποµένως τα ένζυµα µπορούν να αναγνωρίσουν και να κόψουν τον πλασµιδιακό φορέα στις εξειδικευµένες αυτές θέσεις, βοηθώντας την ταυτοποίησή του. Ωστόσο, όπως προέκυψε από την ηλεκτροφορητική ανάλυση των προϊόντων πέψης σε πηκτή αγαρόζης, διαπιστώθηκε αδυναµία πέψης του πλασµιδίου (Εικόνα 4.13). Για τους ίδιους λόγους δεν ήταν δυνατή και η αλληλούχιση των δειγµάτων µετά από αποµόνωση πλασµιδιακού DNA, η οποία εξυπηρετεί εναλλακτικά την πιστοποίηση του µετασχηµατισµού βακτηριακών κυττάρων Kb Εικόνα 4.13 Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης (0.8%) των προϊόντων που αποµονώθηκαν από τον κλώνο G6 µετά από απλή (διαδροµή 2) και διπλή πέψη (διαδροµή 3) µε τα ένζυµα περιορισµού EcoR1 και Sacl, Xbal, αντίστοιχα. Μάρτυρες µοριακού µεγέθους 10.0 Kb (διαδροµή 1). 180