Οδηγός Εργαστηριακών Ασκήσεων Βιοτεχνολογίας

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών Οδηγός Εργαστηριακών Ασκήσεων Βιοτεχνολογίας Χαράλαμπος Σταμάτης Καθηγητής Ιωάννινα 2015

2 ii

3 O εργαστηριακός αυτός οδηγός περιλαμβάνει εργαστηριακές ασκήσεις για το μάθημα της Βιοτεχνολογίας και απευθύνεται στους φοιτητές του 3 ου έτους του Τμήματος Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων. Η επιλογή των ασκήσεων έγινε με γνώμονα τις διδακτικές ανάγκες των φοιτητών του Τμήματος, λαμβάνοντας υπόψη το επίπεδο γνώσεων που οι φοιτητές έχουν στο 3 ο έτος σπουδών τους, όπως αυτό αποτυπώνεται από το Πρόγραμμα Σπουδών. Οι ασκήσεις καλύπτουν αρκετές περιοχές της Μικροβιακής, Ενζυμικής και Περιβαλλοντικής Βιοτεχνολογίας, (όπως ανάπτυξη μικροβιακών κυττάρων και παραγωγή μεταβολικών προϊόντων σε βιοαντιδραστήρες, κάθετη επεξεργασία ενζύμων, βιοκαταλυόμενη αποδόμηση στερεών αποβλήτων και γεωργικών παραπροϊόντων και αξιοποίησή τους για την παραγωγή βιοκαυσίμων (βιοαιθανόλη), ακινητοποίηση ενζύμων και κυττάρων, βιοκατάλυση σε οργανωμένες νανοδομές για την τροποποίηση λιπιδίων και την παραγωγή βιοντήζελ), την εφαρμογή εργαλείων βιοπληροφορικής στη διερεύνηση της λειτουργίας γονιδίων και πρωτεϊνών καθώς και θέματα που αφορούν στην ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων οργανισμών με εφαρμογή στα τρόφιμα. Τέλος, στον εργαστηριακό οδηγό περιλαμβάνονται σενάρια, με βάση τα οποία οι φοιτητές καλούνται να προσεγγίσουν θέματα που αφορούν στην ηθική των νέων βιοτεχνολογιών. Ευχαριστώ τους Δρ. Μ. Καλογερή, Δρ. Μ. Κατσούρα, Δρ. Α. Πολύδερα και Δρ. Α. Χατζηκυριακίδου για την πολύτιμη βοήθειά τους κατά την ανάπτυξη και συγγραφή των ασκήσεων. Χάρης Σταμάτης Καθηγητής iii

4 iv

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή Γενικές οδηγίες για τους φοιτητές στο Εργαστήριο Αναζήτηση στη βάση δεδομένων Scopus... vii ΑΣΚΗΣΗ 1 η ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ... 1 ΑΣΚΗΣΗ 2 η ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 3 η ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΗΣ ΣΕ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΑ ΑΣΚΗΣΗ 4 η ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΕΝΖΥΜΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 5 η ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ME TH ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ PROTEIN LAB ΑΣΚΗΣΗ 6 η ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ: ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΩΝ ΣΤΕΡΕΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 7η ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΣΕ ΦΥΣΙΚΑ ΒΙΟΠΟΛΥΜΕΡΗ-EΦΑΡΜΟΓΗ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΑΣΚΗΣΗ 8 η ΕΝΖΥΜΑ ΣΕ ΟΡΓΑΝΩΜΕΝΕΣ ΝΑΝΟΔΟΜΕΣ ΒΙΟΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗ YΔΡΟΛΥΣΗ ΤΡΙΓΛΥΚΕΡΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ BIONTHZEΛ ΣΕ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΑ ΜΙΚΚΥΛΙΑ v

6 ΑΣΚΗΣΗ 9 η ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΜΕ PCR ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ ΑΣΚΗΣΗ 10 η ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΕΡΓΑΛΕΙΩΝ ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΣΚΗΣΗ 11 η απορρίμματα Η ΗΘΙΚΗ ΔΙΑΣΤΑΣΗ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ vi

7 Γενικές οδηγίες για τους φοιτητές στο Εργαστήριο Όπως για κάθε δραστηριότητα σε ένα εργαστήριο, σε όλες τις ασκήσεις απαιτείται η εφαρμογή σωστής εργαστηριακής συμπεριφοράς. Στη συνέχεια παρατίθενται συνοπτικά κάποιες οδηγίες, που έχουν σκοπό να βοηθήσουν όσους συμμετέχουν σε πειραματικές ασκήσεις να τις εκτελούν με ασφάλεια. Θυμηθείτε ότι πριν από οποιαδήποτε δραστηριότητα πρέπει να γίνεται εκτίμηση του κινδύνου που μπορεί αυτή να ενέχει. Για το λόγο αυτό, η μελέτη της θεωρίας που συνοδεύει κάθε εργαστηριακή άσκηση αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την ασφαλή εκτέλεση του πειράματος. Αν υπάρχει κάποια αμφιβολία σχετικά με τον εκτιμώμενο κίνδυνο, θα πρέπει να απευθύνεστε για συμβουλές στους υπεύθυνους των ασκήσεων. Ασφαλείς χειρισμοί μικροοργανισμών Οι δραστηριότητες που έχουν επιλεγεί στον Οδηγό Εργαστηριακών Ασκήσεων του μαθήματος Βιοτεχνολογία, καθώς και οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται, εγγυώνται πολύ μικρό κίνδυνο για τους συμμετέχοντες, εφόσον τηρηθούν οι κανόνες της σωστής εργαστηριακής συμπεριφοράς. Υπάρχουν πέντε περιοχές που πρέπει να εξετάσει κανείς όταν αντιμετωπίζει ασκήσεις με μικροοργανισμούς: Προετοιμασία και αποστείρωση του εξοπλισμού και του θρεπτικού μέσου ανάπτυξης Προετοιμασία καλλιεργειών των μικροοργανισμών για εμβολιασμό Εμβολιασμός του θρεπτικού μέσου ανάπτυξης με κύτταρα του μικροοργανισμού Επώαση των καλλιεργειών και δειγματοληψία κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης Αποστείρωση και ασφαλής απόρριψη των καλλιεργειών, καθώς και του εξοπλισμού Ο σχεδιασμός πριν την εκτέλεση, η καλή οργάνωση και η τήρηση των κανόνων διασφαλίζουν ότι κάθε δραστηριότητα εκτελείται τόσο με ασφάλεια, όσο και με επιτυχία. Γενική προσωπική ασφάλεια Κάθε φοιτητής είναι υπεύθυνος για την προσωπική του ασφάλεια, καθώς και για την ασφάλεια όσων επηρεάζονται από τις πράξεις του (φοιτητές, βοηθοί, καθηγητές) vii

8 Πριν από κάθε δραστηριότητά σας εκτιμείστε τον πιθανό κίνδυνο και σκεφτείτε τρόπους για να τον ελαχιστοποιήσετε Δείξτε ιδιαίτερη προσοχή στην ασφαλή αποθήκευση και ανάπτυξη μικροοργανισμών, στην αντιμετώπιση έκτακτων περιστατικών, όπως οι διαρροές και στην ασφαλή απόρριψη υλικών που έχουν έρθει σε επαφή με μικροοργανισμούς Ενημερώστε τον υπεύθυνο της άσκησης για κάθε ατύχημα που συνέβη, καθώς και για καταστάσεις που κατά την κρίση σας εγκυμονούν κινδύνους Προστασία Η χρήση της εργαστηριακής ποδιάς κατά τη διάρκεια των ασκήσεων είναι υποχρεωτική. Μη χρησιμοποιείτε τις ποδιές εκτός εργαστηρίου Προστατεύετε κάθε πληγή, κόψιμο ή γδάρσιμο από πιθανή επιμόλυνση χρησιμοποιώντας αδιάβροχα επικαλύμματα ή χειρουργικά γάντια μιας χρήσης Σε περίπτωση επαφής του δέρματος ή των ματιών με τοξική ουσία ξεπλύνετε την περιοχή με άφθονο νερό Πλένετε τα χέρια σας με σαπούνι (κοινό ή αντιμικροβιακό) όταν φεύγετε από το εργαστήριο Αποφύγετε να βάζετε τα χέρια σας στο πρόσωπο ή στο στόμα σας Για την απομάκρυνση σπασμένων γυάλινων αντικειμένων μη χρησιμοποιείτε τα γυμνά χέρια σας, αλλά σκούπα και φαράσι Εάν υποψιάζεστε ότι τα χέρια σας έχουν έρθει σε επαφή με κάποιον μικροοργανισμό, ή κάποιο αντιδραστήριο πρέπει να τα πλένετε αμέσως με σαπούνι Τρόφιμα και ποτά δεν πρέπει να αποθηκεύονται ή να καταναλώνονται σε εργαστήριο Μη χρησιμοποιείτε το στόμα σας για να μεταγγίσετε επικίνδυνα υγρά όταν χρησιμοποιείτε σιφώνιο Χρησιμοποιείστε τα ειδικά προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε επικίνδυνες τοξικές ουσίες ή όταν απαιτείται προστασία απέναντι σε ακτινοβολίες (UV, laser) Τεχνική ασηπτικών συνθηκών Χρησιμοποιείστε αποστειρωμένο εξοπλισμό και θρεπτικά μέσα για τη μεταφορά και την ανάπτυξη μικροοργανισμών viii

9 Εφαρμόστε ασηπτικές συνθήκες κάθε φορά που μεταφέρετε κύτταρα μικροοργανισμών από ένα δοχείο σε άλλο Αποστειρώστε τον εξοπλισμό που έχει έρθει σε επαφή με μικροοργανισμούς κατά προτίμηση σε αποστειρωτήρα με ατμό. Για τον ίδιο σκοπό μπορεί να χρησιμοποιηθεί χημική αντιμικροβιακή ουσία (π.χ. χλώριο), η οποία όμως δε διασφαλίζει τέλεια αποστείρωση Διατηρείτε τις επιφάνειες των πάγκων εργασίας και τους νιπτήρες καθαρούς Χειρισμός ηλεκτρικών συσκευών Μην εισάγετε εργαλεία ή άλλα μεταλλικά αντικείμενα σε ηλεκτρικές συσκευές Προσέξτε ώστε να μη χύνονται υγρά σε συσκευές που λειτουργούν με ηλεκτρικό ρεύμα Δείξτε μεγάλη προσοχή όταν έρχεστε σε επαφή με καλώδια, ρευματολήπτες ή πρίζες Επιστρέψτε τα όργανα ή τον υπόλοιπο εξοπλισμό στο χώρο απ όπου τα προμηθευτήκατε. ΑΠΑΓΟΡΕΥΕΤΑΙ ΑΥΣΤΗΡΑ ΤΟ ΚΑΠΝΙΣΜΑ ΣΤΟΥΣ ΧΩΡΟΥΣ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ix

10 Aναζήτηση επιστημονικών άρθρων με τη χρήση της βιβλιογραφικής βάσης δεδομένων Scopus Η Scopus, Elsevier αποτελεί μια online βιβλιογραφική βάση δεδομένων στην οποία περιέχονται περιλήψεις (abstracts) και βιβλιογραφικές αναφορές (citations), καθώς παρέχεται και η δυνατότητα αναζήτησης σε παραπάνω από τίτλους περιοδικών επιστημονικού περιεχομένου. Στη βάση δεδομένων συμπεριλαμβάνονται επιστημονικά περιοδικά ανοικτής πρόσβασης, πρακτικά συνεδρίων, εμπορικές δημοσιεύσεις και σειρές βιβλίων. Η βάση αυτή δεδομένων καλύπτει όλους σχεδόν τους επιστημονικούς τομείς: -Χημεία, Φυσική, Μαθηματικά, Βιολογία, Μηχανική -Επιστήμες Υγείας (Ιατρική) -Γεωπονικές Επιστήμες, Επιστήμες Περιβάλλοντος -Κοινωνικές Επιστήμες, Ψυχολογία, Οικονομία -Γενικές Επιστήμες Η πρόσβαση είναι δυνατή μέσω της διεύθυνσης ενώ επιπρόσθετα απαραίτητη κρίνεται η εγκατάσταση του λογισμικού Acrobat Reader καθώς τα επιστημονικά άρθρα «κατεβαίνουν» ως αρχεία pdf. Αρχική σελίδα της Scopus για βασική αναζήτηση (basic search) Στην αρχική σελίδα της Scopus υπάρχει η δυνατότητα για βασική αναζήτηση (basic search), όπου στο κελί search for πληκτρολογούνται λέξεις-κλειδιά (keywords), που σχετίζονται με το αντικείμενο της αναζήτησης, οι οποίες όταν αφορούν έναν όρο με παραπάνω από μια λέξη εισάγονται σε εισαγωγικά, ενώ όταν αφορούν λέξεις ξεχωριστών όρων διαχωρίζονται με and. Στο κελί in εισάγονται τα πεδία αναζήτησης που ενδιαφέρουν το χρήστη και προεπιλεγμένα είναι τα πεδία Article Title, Abstract, Keywords. Στην περίπτωση αυτή θα γίνει αναζήτηση της λέξης κλειδί όταν αυτή εντοπίζεται στον τίτλο (Title), την περίληψη (Αbstract) ή λέξεις κλειδιά (keywords) που σε κάθε επιστημονικό άρθρο υπάρχουν Eπίσης μπορεί να γίνει αναζήτηση με βάση το όνομα του συγγραφέα (Authors), το ίδρυμα/ φορέα συνεργασίας στο/ν οποίο εργάζεται ο συγγραφέας (affiliation), λέξεις κλειδιά (keywords) κ.λ.π. Τέλος, παρέχεται η δυνατότητα συνδυαστικής αναζήτησης λέξεων κλειδιών ενεργοποιώντας την εντολή add search field. x

11 Μετά την εισαγωγή όρων προς αναζήτηση μπορείτε να χρησιμοποιήσετε την επιλογή limit to: για χρήση περιορισμών στην αναζήτηση, που περιλαμβάνει: Date range : για περιορισμό στην ημερομηνία δημοσίευσης, ώστε η αναζήτηση να καθίσταται αποτελεσματικότερη εάν τον ερευνητή ενδιαφέρουν οι πρόσφατες δημοσιεύσεις των τελευταίων ετών. Document Type : για αναζήτηση ανά τύπο τεκμηρίου (all, review, article, editorial) Subject Areas : για αναζήτηση ανά επιστημονικό πεδίο (Life Sciences, Health Sciences, Physical Sciences, Social Sciences) Εισάγοντας μια ή περισσότερες λέξεις κλειδιά στο Search for και πατώντας την εντολή search θα ανοίξει ένα νέο παράθυρο με τα αποτελέσματα της αναζήτησης όπου εμφανίζονται όλα τα σχετικά άρθρα στη διεθνή βιβλιογραφία με χρονολογική σειρά (ξεκινώντας από το πιο σύγχρονο), Συγκριμένα εμφανίζεται ο τίτλος του άρθρου, τα ονόματα των συγγραφέων και τα στοιχεία του επιστημονικού περιοδικού στο οποίο το άρθρο δημοσιεύτηκε, xi

12 Πατώντας την επιλογή Full Text, προτιμάται πάντα το άνοιγμα του αρχείου σε PDF, ώστε το άρθρο να υπάρχει όπως υφίσταται στη μορφή της δημοσίευσής του. Αναζήτηση με βάση το συγγραφέα (author search) Στο κελί με την επιλογή Search for εισάγεται το επίθετο του ερευνητή προς αναζήτηση πλήρες, και το αρχικό γράμμα από το μικρό όνομα του συγγραφέα (π.χ Halling, P). Τέλος στο κελί Affiliation εισάγεται εάν είναι γνωστό το ίδρυμα/ φορέας συνεργασίας στο/ν οποίο/ν απασχολείται ο συγγραφέας. Επιλέγοντας Search θα εμφανιστεί μια λίστα με όλες τις εργασίες που ικανοποιούν τα παραπάνω κριτήρια αναζήτησης xii

13 ΑΣΚΗΣΗ 1 η ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ M. Καλογερής, Χ. Σταμάτης ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της άσκησης είναι η απόκτηση της γνώσης των θεωρητικών αρχών και τον τρόπο εφαρμογής των βασικών μεθόδων, με τις οποίες προσδιορίζεται ποσοτικά η ανάπτυξη των μικροοργανισμών. ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Σε διάλυμα κυττάρων της ζύμης Saccharomyces cerevisiae γίνεται ποσοτικός προσδιορισμός της κυτταρικής ανάπτυξης. Για το σκοπό αυτό εφαρμόζονται τρεις εναλλακτικές τεχνικές: μέτρηση του ξηρού βάρους κυττάρων, μέτρηση κυτταρικής συγκέντρωσης με θολοσιμετρία και μέτρηση του αριθμού κυττάρων με αιμοκυτόμετρο (hemocytometer). ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η μέτρηση της κυτταρικής συγκέντρωσης σε ένα θρεπτικό μέσο είναι πολύ σημαντική για τον υπολογισμό της κινητικής και της στοιχειομετρίας της ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση της κυτταρικής συγκέντρωσης μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κατηγορίες: άμεσες και έμμεσες. Πολλές φορές οι άμεσες μέθοδοι δεν είναι εφικτές λόγω της παρουσίας στερεών σωματιδίων ή συστατικών που περιέχονται στο θρεπτικό μέσο και παρεμποδίζουν τη μέτρηση. Με βάση την πληροφόρηση που απαιτείται και τις ιδιότητες του συστήματος είναι δυνατόν να μετρηθούν είτε ο αριθμός, είτε η μάζα των κυττάρων. Προσδιορισμός του αριθμού των κυττάρων Για την άμεση μέτρηση του αριθμού κυττάρων μιας καλλιέργειας χρησιμοποιείται συνήθως το αιμοκυτόμετρο. Το αιμοκυτόμετρο είναι κρυστάλλινη πλάκα πάνω στην οποία είναι χαραγμένο ένα μεγάλο κεντρικό τετράγωνο με εμβαδόν 1 mm 2 που βρίσκεται σε 1

14 βάθος 0.1 mm από την επιφάνεια. Το τετράγωνο αυτό υποδιαιρείται σε 25 μικρότερα τετραγωνάκια με εμβαδόν 0.04 mm 2, όπως φαίνεται στο σχήμα που ακολουθεί. Καθένα από αυτά περιβάλλεται από τρεις έντονες αυλακώσεις, που αναπαριστάνονται με τις έντονα μαύρες γραμμές και χωρίζεται με τη σειρά του σε 16 μικροσκοπικά τετραγωνίδια. Για τη μέτρηση των κυττάρων το δείγμα της καλλιέργειας τοποθετείται στην πλάκα και σκεπάζεται με μία καλυπτρίδα. Οι διαστάσεις του χώρου που περικλείεται από την καλυπτρίδα και τη βαθμονομημένη επιφάνεια είναι γνωστές, επομένως μπορεί να υπολογιστεί ο όγκος του. Με μέτρηση των κυττάρων που περιλαμβάνονται στο χώρο αυτό μπορεί να υπολογιστεί ο αριθμός των κυττάρων στο συγκεκριμένο όγκο της καλλιέργειας. κεντρικό τετράγωνο με εμβαδό 1 mm 2 Σχήμα 1. Βαθμονομημένη περιοχή του αιμοκυτόμετρου για τη μέτρηση του αριθμού των κυττάρων Για να είναι στατιστικά αξιόπιστη η μέτρηση πρέπει να μετρηθούν τουλάχιστον 20 τετράγωνα. Για τη μέτρηση κυττάρων ζύμης χρησιμοποιούνται συνήθως τα 25 τετράγωνα με εμβαδόν 0.04 mm 2. Η μέτρηση του αριθμού των κυττάρων που περιέχονται σε κάθε ένα από τα τετράγωνα αυτά γίνεται με τη βοήθεια μικροσκοπίου. Η μέτρηση πραγματοποιείται και για τα 25 τετραγωνάκια και ο μέσος όρος είναι ο αριθμός των κυττάρων ανά mm 3. Για να δώσει σωστά αποτελέσματα η μέθοδος, πρέπει το μέσο της καλλιέργειας να είναι καθαρό και ελεύθερο από στερεά σωματίδια που θα μπορούσαν να κρύψουν ή να εκληφθούν κατά λάθος ως κύτταρα. Επίσης, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν χρωστικές ουσίες για τη διάκριση ζωντανών και νεκρών κυττάρων. Η μέθοδος είναι κατάλληλη για 2

15 καλλιέργειες, στις οποίες τα κύτταρα δεν συσσωματώνονται. Η ανάπτυξη των μυκήτων με τη μορφή μυκηλίου καθιστά δύσκολη τη μέτρησή τους με μικροσκόπιο. Κατά τη διάρκεια της μέτρησης απαιτείται συγκεκριμένη μέθοδος, έτσι ώστε να μην επιμετρούνται κάποια από τα κύτταρα πάνω από μία φορά. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα επιμετρούνται σε ένα τετράγωνο αν δεν ακουμπούν τα όρια του τετραγώνου ή αν ακουμπούν τις γραμμές που ορίζουν την πάνω ή τη δεξιά πλευρά του. Τα κύτταρα που ακουμπούν την κάτω ή την αριστερή γραμμή του τετραγώνου μετρώνται στο κάτω και στο αριστερό τετράγωνο αντίστοιχα. Στο παράδειγμα που ακολουθεί ο αριθμός των μετρούμενων κυττάρων είναι ίσος με 7. Αυτά τα κύτταρα δεν μετρώνται σ αυτό το τετράγωνο 0.2 mm Σχήμα 2. Παράδειγμα προσδιορισμού του αριθμού των κυττάρων Το μεγάλο κεντρικό τετράγωνο έχει όγκο 0.1 mm 3 και το άθροισμα των κυττάρων που βρέθηκαν και στα 25 τετραγωνάκια που το αποτελούν πολλαπλασιαζόμενο x10 δίνει τον αριθμό των κυττάρων σε 1.0 mm 3 του μέσου της καλλιέργειας. Σε μία άλλη μέθοδο μέτρησης των κυττάρων, τρυβλία που περιέχουν το κατάλληλο θρεπτικό μέσο ζελατινοποιημένο με άγαρ (Petri dishes) χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση των ζωντανών κυττάρων. (Ο όρος ζωντανό κύτταρο χρησιμοποιείται στο συγκεκριμένο σημείο με την έννοια του κυττάρου που είναι ικανό να αναπαραχθεί). Δείγματα της καλλιέργειας αραιώνονται και απλώνονται πάνω στην επιφάνεια του άγαρ και στη συνέχεια επωάζονται. Μετά την περίοδο της επώασης καταμετρούνται οι αποικίες που αναπτύχθηκαν στην επιφάνεια του άγαρ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε μονάδες αποικιών που αναπτύχθηκαν (Colony Forming Units, CFU). Σε περίπτωση που τα κύτταρα δημιουργούν συσσωματώματα, υπάρχει η πιθανότητα μία αποικία να μην προέρχεται από 3

16 ένα μόνο κύτταρο. Η μέθοδος αυτή (plate counts) είναι περισσότερο κατάλληλη για βακτήρια και ζύμες και λιγότερο κατάλληλη για μύκητες. Προσδιορισμός της μάζας των κυττάρων Άμεσες μέθοδοι Ο προσδιορισμός του ξηρού βάρους των κυττάρων είναι η πιο διαδεδομένη μέθοδος για τον άμεσο υπολογισμό της συγκέντρωσης της κυτταρικής μάζας και εφαρμόζεται μόνο στην περίπτωση που τα κύτταρα αναπτύσσονται σε μέσο, το οποίο δεν περιέχει στερεά σωματίδια. Όταν εκτός από τα κύτταρα υπάρχουν και άλλα στερεά σωματίδια, όπως μελάσσα, κυτταρίνη ή απόνερα επεξεργασίας σπόρου καλαμποκιού (corn steep liquor), η μέτρηση του ξηρού βάρους είναι μη ακριβής. Συνήθως, δείγματα του μέσου της καλλιέργειας φυγοκεντρούνται ή φιλτράρονται και κατόπιν ξεπλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα ή νερό. Στη συνέχεια, τα υγρά από την έκπλυση κύτταρα ξηραίνονται στους 80 C για 24 ώρες και ακολουθεί η μέτρηση του ξηρού βάρους των κυττάρων. Η μέθοδος του όγκου των συσσωρευμένων κυττάρων (packed cell volume) χρησιμοποιείται για τη γρήγορη, αλλά προσεγγιστική εκτίμηση της συγκέντρωσης των κυττάρων στο διάλυμα της ζύμωσης (π.χ. βιομηχανικές ζυμώσεις για την παραγωγή αντιβιοτικών). Στην περίπτωση αυτή, το διάλυμα της ζύμωσης φυγοκεντρείται σε πωματισμένο και βαθμονομημένο σωλήνα υπό ελεγχόμενες συνθήκες (rpm και χρόνος φυγοκέντρησης) και μετριέται ο όγκος των κυττάρων. Μία άλλη γρήγορη μέθοδος βασίζεται στην απορρόφηση του φωτός από τα αιωρούμενα κύτταρα που περιέχονται σε δείγμα του μέσου της καλλιέργειας. Η ένταση του απορροφούμενου φωτός μετριέται με τη βοήθεια φωτόμετρου. Η μέτρηση της θολερότητας (turbidity), ή αλλιώς οπτικής πυκνότητας (OD), αποτελεί μια γρήγορη, φτηνή και απλή μέθοδο για την εκτίμηση της κυτταρικής συγκέντρωσης όταν δεν υπάρχουν άλλα στερεά σωματίδια ή ουσίες που απορροφούν το φως. Η ένταση του απορροφούμενου φωτός στην κυψελίδα που περιέχει το δείγμα εξαρτάται από την κυτταρική συγκέντρωση και το πάχος της κυψελίδας. Το φαινόμενο της μείωσης της έντασης του φωτός που διέρχεται από την κυψελίδα οφείλεται τόσο στην απορρόφηση, όσο και στη σκέδαση. Κύτταρα που περιέχουν χρωμοφόρες ουσίες δίνουν διαφορετικά αποτελέσματα σε σύγκριση με αυτά που δεν περιέχουν. Η διαταραχή στη μέτρηση της απορρόφησης από ουσίες που περιέχονται στο μέσο πρέπει να λαμβάνεται υπ όψιν. Το μέσο πρέπει να είναι ουσιαστικά απαλλαγμένο από στερεά σωματίδια. Η ορθή διαδικασία απαιτεί τη χρήση 4

17 κάποιου μήκους κύματος που ελαχιστοποιεί την απορρόφηση από ουσίες που περιέχονται στο μέσο (συνήθως χρησιμοποιείται κάποιο μήκος κύματος στην περιοχή nm), τη μέτρηση με βάση αναφοράς την απορρόφηση του λευκού δείγματος (πρόκειται για το μέσο της καλλιέργειας χωρίς κύτταρα) και τον τελικό υπολογισμό με τη χρήση καμπύλης αναφοράς. Η καμπύλη αναφοράς συνδέει την οπτική πυκνότητα με μετρήσεις του ξηρού βάρους των κυττάρων. Τέτοιου είδους καμπύλες αναφοράς μπορούν να αποκλίνουν από τη γραμμικότητα σε υψηλές τιμές οπτικής πυκνότητας και εξαρτώνται σε κάποιο βαθμό από τη φυσιολογία των κυττάρων. Έμμεσες μέθοδοι Σε πολλές διεργασίες ζυμώσεων, όπως η ζύμωση με μύκητες, δεν είναι δυνατή η χρήση άμεσων μεθόδων. Στις περιπτώσεις αυτές χρησιμοποιούνται έμμεσες μέθοδοι που βασίζονται κυρίως στην κατανάλωση του υποστρώματος και / ή στην παραγωγή προϊόντων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Εσωκυτταρικές ουσίες, όπως το RNA, το DNA και η πρωτεΐνη, μπορούν να χρησιμοποιηθούν έμμεσα για τον υπολογισμό του μεγέθους της κυτταρικής ανάπτυξης. Κατά τη διάρκεια του κύκλου ανάπτυξης σε μια διεργασία διαλείποντος έργου, οι συγκεντρώσεις αυτών των εσωκυτταρικών συστατικών μεταβάλλονται με το χρόνο. Η συγκέντρωση του εσωκυτταρικού ATP (mg ATP/mg κυττάρων) είναι κατά προσέγγιση σταθερή για κάποιο συγκεκριμένο μικροοργανισμό. Έτσι, η συγκέντρωση του ATP στο διάλυμα της καλλιέργειας μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μέτρο της συγκέντρωσης βιομάζας. Η μέθοδος βασίζεται στη δράση της λουσιφεράσης, η οποία καταλύει την οξείδωση της λουσιφερίνης με ταυτόχρονη κατανάλωση οξυγόνου και ATP και εκπομπή φωτός. Λουσιφερίνη + Ο2 + ATP Λουσιφεράση φως Όταν το οξυγόνο και η λουσιφερίνη είναι σε περίσσεια, η συνολική εκπομπή φωτός είναι ανάλογη της συνολικής ποσότητας ATP που περιέχεται στο δείγμα. Η ανίχνευση του φωτός που εκπέμπεται γίνεται με φωτόμετρα. Μικρές συγκεντρώσεις βιόμαζας μπορούν να ανιχνευθούν με αυτή τη μέθοδο, αφού πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις ATP (10-12 g ATP/l) μπορούν να μετρηθούν με φωτόμετρα ή ειδικούς ανιχνευτές. Η συγκέντρωση του ATP σε ένα τυπικό κύτταρο βακτηρίου είναι κατά προσέγγιση 1 mg ATP/ g ξηρού βάρους του κυττάρου. 5

18 Η μετατροπή της πηγής άνθρακα ή ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου μπορούν να μετρηθούν για την παρακολούθηση της κυτταρικής ανάπτυξης όταν η βιομάζα είναι το βασικό προϊόν. Τα προϊόντα του μεταβολισμού των κυττάρων μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση και ποσοτικοποίηση της κυτταρικής ανάπτυξης. Κάποια προϊόντα που παράγονται σε συνθήκες αναερόβιας ζύμωσης, όπως η αιθανόλη και το γαλακτικό οξύ, μπορούν να συνδεθούν στοιχειομετρικά με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Σε αερόβιες ζυμώσεις, το CO2 είναι ένα τυπικό προϊόν και μπορεί να συσχετιστεί με την ανάπτυξη των κυττάρων. Σε μερικές περιπτώσεις, οι αλλαγές στο ph της καλλιέργειας ή η προσθήκη οξέος-βάσης για τη ρύθμιση του ph μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση της κατανάλωσης θρεπτικών συστατικών και της ανάπτυξης των κυττάρων. Τέλος, σε ορισμένες διεργασίες ζυμώσεων, ως αποτέλεσμα της ανάπτυξης μυκηλίου ή του σχηματισμού εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών, το ιξώδες του υγρού της καλλιέργειας αυξάνεται κατά τη διάρκεια της ζύμωσης και μπορεί να αξιοποιηθεί για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης των κυττάρων ή του προϊόντος. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα Φωτόμετρο Ξηραντήρας (80 C) Αναλυτικός ζυγός Μικροσκόπιο Υλικά και Αντιδραστήρια Διάλυμα κυττάρων ζύμης Σιφώνιο του 1 ml Σιφώνιο των 10 ml Σωλήνες αραίωσης Φούσκα μετάγγισης υγρών (poire) Φίλτρο (0.45 μm) Σωλήνας Ventouri (συσκευή δημιουργίας κενού) 6

19 Κωνική φιάλη κενού Χωνί διήθησης (για φίλτρο 0.45μm) Πλάκα Neubauer Καλυπτρίδα Τριχοειδής σωλήνας Ογκομετρικός κύλινδρος των 100 ml Εκτέλεση Α. Προσδιορισμός ξηρού βάρους κυττάρων 1. Ζυγίστε ένα φίλτρο για τη συγκράτηση των κυττάρων (0.45 μm) στον αναλυτικό ζυγό. 2. Αναδεύστε την κωνική φιάλη που περιέχει τα κύτταρα της ζύμης και διαχωρίστε μια ποσότητα 100 ml με τη βοήθεια ογκομετρικού κυλίνδρου. 3. Διαχωρίστε τα κύτταρα με τη βοήθεια του φίλτρου χρησιμοποιώντας χωνί διήθησης και κωνική φιάλη κενού. Για την ταχύτερη διέλευση του υγρού συνιστάται η δημιουργία κενού με ενεργοποίηση του σωλήνα Ventouri. 4. Ξεπλύνετε τη συσκευή διήθησης με μικρή ποσότητα απιονισμένου νερού έτσι ώστε τα κύτταρα που πιθανόν έχουν συγκρατηθεί στα τοιχώματα να επικαθήσουν στο φίλτρο. 5. Μετρήστε το βάρος του φίλτρου στον αναλυτικό ζυγό έτσι ώστε να υπολογίσετε το νωπό βάρος των κυττάρων. 6. Μετά τη ζύγιση τοποθετείστε το φίλτρο στον ξηραντήρα (80 C). 7. Για να υπολογίσετε το ξηρό βάρος των κυττάρων επαναλάβατε τις ζυγίσεις του φίλτρου μέχρις ότου σταθεροποιηθεί το βάρος ανάμεσα σε δύο διαδοχικές μετρήσεις (περίπου 24 h). 7

20 Β. Προσδιορισμός κυτταρικής συγκέντρωσης με θολοσιμετρία 1. Αφού αναδεύσετε το διάλυμα των κυττάρων ζύμης, συνεχίζετε με αραίωση του δείγματος σε τελική συγκέντρωση που θα σας υποδειχθεί από τον υπεύθυνο. 2. Μεταγγίστε 0.4 ml από το αραιωμένο δείγμα κυττάρων σε δοκιμαστικό σωλήνα και στη συνέχεια προσθέστε 3.6 ml απιονισμένο νερό. Επαναλάβετε την ίδια διαδικασία σε τρεις ακόμη δοκιμαστικούς σωλήνες προσθέτοντας όμως 7.6, 11.6 και 15.6 ml νερού αντίστοιχα. 3. Τα αραιωμένα δείγματα που προκύπτουν αναδεύονται σε αναδευτήρα (Vortex) και προωθούνται στο φωτόμετρο έτσι ώστε να μετρηθεί η απορρόφησή τους. 4. Αφού επιλεγεί στο φωτόμετρο το μήκος κύματος στα 600 nm, μηδενίζεται το όργανο χρησιμοποιώντας ως λευκό δείγμα απιονισμένο νερό. Στη συνέχεια μετρώνται οι απορροφήσεις των αραιωμένων δειγμάτων. Γ. Προσδιορισμός του αριθμού κυττάρων με τη μέθοδο Neubauer 1. Καθαρίστε καλά την κρυστάλλινη πλάκα με αιθανόλη, έτσι ώστε να είναι ευδιάκριτα τα κύτταρα κατά τη διάρκεια της μέτρησης. 2. Τοποθετείστε μία καλυπτρίδα πάνω στην κρυστάλλινη πλάκα έτσι ώστε να βρίσκεται πάνω από τη χαραγμένη επιφάνεια. 3. Αφού αναδεύσετε ένα από τα αραιωμένα δείγματα του διαλύματος κυττάρων μεταγγίστε μια μικρή ποσότητα με τη βοήθεια τριχοειδούς σωλήνα. Το διάλυμα των κυττάρων μπορεί να περάσει λόγω διάχυσης στο χώρο ανάμεσα στη χαραγμένη επιφάνεια και στην καλυπτρίδα, τοποθετώντας τον τριχοειδή σωλήνα στην άκρη της καλυπτρίδας και πιέζοντάς τον ελαφρά. 4. Ο αριθμός των κυττάρων που περιέχεται σε κάθε χαραγμένο τετράγωνο μετράται οπτικά τοποθετώντας την κρυστάλλινη πλάκα σε μικροσκόπιο. 8

21 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Με βάση τις μετρήσεις στον αναλυτικό ζυγό υπολογίστε το νωπό και το ξηρό βάρος των κυττάρων που περιέχονται στα 100 ml του διαλύματος των κυττάρων. Το νερό που συγκρατεί το φίλτρο είναι περίπου ίσο με 4.3 φορές το βάρος του. 2. Κατασκευάστε την καμπύλη αναφοράς της κυτταρικής συγκέντρωσης όπως προκύπτει από τις μετρήσεις θολοσιμετρίας (διάγραμμα δύο αξόνων με την απορρόφηση στα 600 nm και την κυτταρική συγκέντρωση (g ξηρού βάρους κυττάρων / lt). Ποια είναι η βέλτιστη ευθεία που περνά από τα ζεύγη τιμών του προηγούμενου διαγράμματος (χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των ελάχιστων τετραγώνων) και ποιος ο συντελεστής συσχέτισης (R 2 ); 3. Υπολογίστε την απόλυτη κυτταρική συγκέντρωση (αριθμός κυττάρων / lt) με βάση το μέσο όρο των μετρήσεων της μεθόδου Neubauer (λάβετε υπόψη την αραίωση). 4. Ποια είναι η σταθερά που συνδέει την κυτταρική συγκέντρωση (g ξηρού βάρους κυττάρων / lt) με την απόλυτη κυτταρική συγκέντρωση (αριθμός κυττάρων / lt) αν τα δύο μεγέθη χαρακτηρίζονται από γραμμική σχέση; 5. Με βάση την προηγούμενη σχέση υπολογίστε το μέσο όγκο και τη μέση διάμετρο των κυττάρων. Να γίνει η παραδοχή ότι τα κύτταρα της ζύμης έχουν σφαιρικό σχήμα και πυκνότητα 1.1 g/cm Ποια είναι τα σημαντικότερα μειονεκτήματα της θολοσιμετρίας και της μεθόδου Neubauer; 7. Θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν οι προηγούμενες μέθοδοι για τον προσδιορισμό της ανάπτυξης κυττάρων ζύμης σε θρεπτικό μέσο που περιέχει ως πηγή άνθρακα πίτυρο σίτου; Δικαιολογήστε την απάντησή σας. Αναφέρατε τρεις εναλλακτικές μεθόδους προσδιορισμού της κυτταρικής ανάπτυξης. 9

22 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (1998). A. Doyle, J. Griffiths, J. Whiley & Sons, West Sussex 2. Biotechnology A laboratory course (1996). J. Becker, G. Caldwell, E. Zachgo, 2 nd edition, Academic Press, San Diego 3. Microbiology & Biotechnology (1995). A. Cadogan & J. Hanks, Thomas Nelson and Sons Ltd, Surrey, UK 4. Biochemical Engineering Fundamentals (1986). J. Bailey & F. Ollis, 2nd edition, McGraw-Hill, Singapore 5. Fermentation and Enzyme Technology (1979). D. Wang, John Wiley & Sons Inc., New York 6. Biochemistry (1988). Streyer L., 3 rd edition, editors W. Freeman and Co, New York 7. Solid Substrate Cultivation (1992). H. Doelle, D. Mitchell, C. Rolz, Elsevier Applied Science, Essex, England 8. Measurements of cell biomass concentration (1998). Nam Sun Wang, Department of Chemical Engineering, University of Maryland 9. Βιοτεχνολογία (2000). Δ. Κυριακίδη, Εκδόσεις Ζήτη. Θεσσαλονίκη 10. Εργαστηριακές Ασκήσεις του Μαθήματος Βασική Βιοτεχνολογία (1998). Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π. 10

23 ΑΣΚΗΣΗ 2 η ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Μ. Καλογερής, Χ. Σταμάτης ΣΚΟΠΟΣ Στο τέλος της άσκησης οι φοιτητές θα γνωρίζουν τι είναι οι βιοαντιδραστήρες, ποια είναι τα κύρια σημεία της λειτουργίας τους, καθώς και τον τρόπο με τον οποίο υλοποιείται και παρακολουθείται μία ζύμωση διαλείποντος έργου. ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Κύτταρα της ζύμης Saccharomyces cerevisiae αναπτύσσονται σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου υγρής καλλιέργειας. Κατά τη διάρκεια της εργαστηριακής ημέρας παρουσιάζονται οι ακολουθούμενες τεχνικές και τα βασικά μέρη της λειτουργίας του συστήματος. Επίσης, μελετώνται οι βασικές παράμετροι της ανάπτυξης των κυττάρων (βιομάζα, κατανάλωση υποστρώματος) και διερευνάται η προσαρμογή των θεωρητικών μοντέλων στα πειραματικά δεδομένα. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Οι βιοαντιδραστήρες (bioreactors) είναι διατάξεις με τις οποίες εξασφαλίζονται οι απαιτούμενες προϋποθέσεις για τη δράση ζωντανών κυττάρων ή συστατικών τους (κυρίως ένζυμα) με στόχο τη μετατροπή των τροφοδοτούμενων υποστρωμάτων σε επιθυμητά προϊόντα. Οι βασικές λειτουργίες που επιτελούν οι βιοαντιδραστήρες που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη κυττάρων (ζυμωτήρες) είναι οι ακόλουθες: o Διασφαλίζουν την τροφοδότηση των κυττάρων με τα απαραίτητα για την επιβίωσή τους συστατικά o Διατηρούν τις κρίσιμες συνθήκες του περιβάλλοντος των κυττάρων στο επιθυμητό επίπεδο o Περιορίζουν την ανταλλαγή μικροοργανισμών ανάμεσα στο χώρο της ζύμωσης και το περιβάλλον (μολύνσεις) 11

24 o Επιτρέπουν την παρακολούθηση παραμέτρων που είναι ενδεικτικές της πορείας της διεργασίας o Εγγυώνται την ασφάλεια των χειριστών κατά τη διάρκεια λειτουργίας της συσκευής Ένας τυπικός ζυμωτήρας υγρής καλλιέργειας απεικονίζεται στο σχήμα που ακολουθεί. Αποτελείται από ένα στεγανοποιημένο δοχείο, στο οποίο έχουν γίνει οι κατάλληλες προσαρμογές, έτσι ώστε να γίνεται εύκολα και αποτελεσματικά o ο εμβολιασμός του μέσου ανάπτυξης o η ρύθμιση της θερμοκρασίας και του ph o η παροχή και διασπορά του απαραίτητου για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών οξυγόνου o η παραλαβή δειγμάτων από το υγρό της καλλιέργειας o η αποφυγή ανεπιθύμητων φαινομένων, όπως ο αφρισμός και οι μολύνσεις Δοχείο ζύμωσης 2. Μετακινούμενο σκέπασμα Είσοδος υποστρώματος 4. Σύστημα εισόδου αέρα 5. Θυρίδες αισθητηρίων 6. Μανδύας ελέγχου Τ 8 7. Θυρίδες οξέος - βάσεως 8. Αναδευτήρας 5 9. Έξοδος αέρα 10. Θυρίδα εξόδου 11. Βαλβίδα εκτόνωσης πίεσης 10 Σχήμα 1. Τυπικός ζυμωτήρας υγρής καλλιέργειας 12

25 Το δοχείο του βιοαντιδραστήρα είναι συνήθως εφοδιασμένο με γυάλινο τοίχωμα που επιτρέπει την άμεση οπτική επαφή με το υγρό της ζύμωσης, ενώ διαθέτει επίσης πλευρικές υποδοχές για τα αισθητήρια όργανα μέτρησης του ph, της θερμοκρασίας και του διαλυμένου Ο2. Το στεγανοποιημένο καπάκι του δοχείου διαθέτει ειδικά ανοίγματα, έτσι ώστε να εισέρχονται τα κύτταρα του μικροοργανισμού που αποτελούν το εμβόλιο, οι απαραίτητες για τη ρύθμιση του ph ποσότητες οξέος ή βάσεως, καθώς και αντιαφριστικές ουσίες σε περίπτωση που παρατηρείται πρόβλημα αφρισμού. Ο αέρας εισέρχεται συνήθως κοντά στον πυθμένα του δοχείου μέσα από κατάλληλης διαμέτρου οπές, ενώ η ανάδευση πραγματοποιείται με τη βοήθεια συστήματος μετάδοσης της κίνησης από τον κινητήρα σε εφοδιασμένο με πτερύγια άξονα. Η θερμοκρασία του μέσου ανάπτυξης ρυθμίζεται είτε με εξωτερικό μανδύα, είτε με εσωτερικό σπείρωμα, στo εσωτερικό των οποίων κυκλοφορεί το θερμαντικό μέσο. Τέλος, η έξοδος του αέρα πραγματοποιείται μέσα από φίλτρο για την αποφυγή απελευθέρωσης κυττάρων του μικροοργανισμού στο περιβάλλον, ενώ η συλλογή του υγρού μετά την ολοκλήρωση της ζύμωσης πραγματοποιείται με ειδική θυρίδα στον πυθμένα του δοχείου. Διεργασίες διαλείποντος έργου Με τον όρο διεργασίες διαλείποντος έργου (batch system) χαρακτηρίζονται οι διεργασίες, στις οποίες τα αντιδρώντα συστατικά (στην περίπτωση των βιοδιεργασιών ονομάζονται υποστρώματα) εισάγονται στον αντιδραστήρα στην αρχή της διεργασίας, ενώ τα παραγόμενα προϊόντα απομακρύνονται απ αυτόν μόνο μετά το τέλος της. Οι διεργασίες διαλείποντος έργου χαρακτηρίζονται από μια σειρά πλεονεκτημάτων όπως: σχετική απλότητα και χαμηλότερο κόστος εξοπλισμού αυξημένη γενετική σταθερότητα των αναπτυσσόμενων κυττάρων χαμηλότερος κίνδυνος επιμολύνσεων μεγαλύτερη ευελιξία στον προγραμματισμό της βιομηχανικής παραγωγής μικρότερη ευαισθησία σε έκτακτα περιστατικά και διαταραχές του περιβάλλοντος Για όλους τους λόγους που αναφέρθηκαν προηγουμένως, εφαρμόζονται συχνά τόσο σε βιομηχανικό, όσο και σε εργαστηριακό επίπεδο για την παραλαβή χρήσιμων μεταβολικών προϊόντων που παράγονται κατά την ανάπτυξη μικροοργανισμών. 13

26 Όπως είναι γνωστό, η ανάπτυξη κυττάρων σε διεργασίες διαλείποντος έργου χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση διακριτών φάσεων. Οι φάσεις αυτές είναι κατά σειρά: φάση επώασης, εκθετική φάση, στατική φάση και φάση θανάτου. Μία τυπική καμπύλη ανάπτυξης ενός μικροοργανισμού σε διεργασία διαλείποντος έργου απεικονίζεται στο Σχήμα 2, ενώ τα βασικά χαρακτηριστικά των επιμέρους φάσεων παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Κυτταρική ανάπτυξη Φάση επώασης Εκθετική Φάση Στατική Φάση Φάση θανάτου Χρόνος Σχήμα 2. Καμπύλη κυτταρικής ανάπτυξης σε διεργασία διαλείποντος έργου. Πίνακας 1. Φάσεις κυτταρικής ανάπτυξης σε διεργασία διαλείποντος έργου Φάση ανάπτυξης Χαρακτηριστικά Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (μ) Φάση επώασης Τα κύτταρα προσαρμόζονται στο νέο περιβάλλον, μηδενική ή πολύ μικρή μ 0 ανάπτυξη Εκθετική φάση Η ανάπτυξη έχει το μέγιστο δυνατό ρυθμό μ = μmax Στατική φάση Η ανάπτυξη σταματά μ = 0 Φάση θανάτου Τα κύτταρα αρχίζουν να πεθαίνουν και παρατηρείται αυτόλυση μ < 0 Σε συνθήκες διαλείποντος έργου και μετά τη φάση της προσαρμογής του μικροοργανισμού (lag phase), η συγκέντρωση της κυτταρικής μάζας σε βιοαντιδραστήρα δίνεται από τη σχέση: 14

27 dx. X dt όπου: Χ: κυτταρική συγκέντρωση (g DCW/l), [DCW: Dry Cell Weight] μ: ειδικός ρυθμός μικροβιακής ανάπτυξης (h -1 ) t: χρόνος καλλιέργειας (h) Για τη μαθηματική περιγραφή της ανάπτυξης των μικροοργανισμών έχουν προταθεί αρκετά μοντέλα, αλλά το πιο διαδεδομένο είναι αυτό που έχει προταθεί από τον Monod. Σύμφωνα με αυτό, ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (μ) αποτελεί συνάρτηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος (S) και δίνεται από τη σχέση: max Ks S S (1) όπου: μmax: ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (h -1 ) Κs: σταθερά Monod ή κορεσμού (g/1) Ο σχηματισμός ενός μικροβιακού προϊόντος μπορεί να κατηγοριοποιηθεί ως σχετιζόμενος ή μη με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Ο σχετιζόμενος με την ανάπτυξη σχηματισμός προϊόντων είναι ανάλογος της ταχύτητας παραγωγής της βιομάζας και παρατηρείται σε ευνοϊκές συνθήκες ανάπτυξης. Αφορά κυρίως σε ενώσεις που συμμετέχουν σε μεταβολικά μονοπάτια, με τα οποία παράγεται ενέργεια. Δεδομένου ότι η ανάπτυξη των κυττάρων είναι η σημαντικότερη κυτταρική λειτουργία που καταναλώνει ενέργεια, εφόσον ο σχηματισμός μιας ουσίας συνδέεται με τον ενεργειακό μεταβολισμό, η ουσία αυτή θα παράγεται όποτε παρατηρείται κυτταρική ανάπτυξη. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αυτής της κατηγορίας μικροβιακών προϊόντων αποτελούν η αιθανόλη, τα οργανικά οξέα, σημαντικός αριθμός βιομηχανικών ενζύμων, κάποια βιοπολυμερή, καθώς και προϊόντα αναερόβιων ζυμώσεων. Αντίθετα με τον προηγούμενο τύπο μικροβιακών προϊόντων, ο μη σχετιζόμενος με την ανάπτυξη σχηματισμός προϊόντος δεν είναι ανάλογος της ταχύτητας ανάπτυξης. 15

28 Διακρίνεται σε δύο κατηγορίες: σχηματισμός προϊόντος μη σχετιζόμενος με την κυτταρική ανάπτυξη λόγω μεταβολικής αποσύνδεσης (metabolic uncoupling) σχηματισμός δευτερογενών μεταβολικών προϊόντων (secondary metabolites) Στην περίπτωση της μεταβολικής αποσύνδεσης, η κατανάλωση υποστρώματος δεν οδηγεί υποχρεωτικά στην παραγωγή βιομάζας. Η ενέργεια που δημιουργείται από το μεταβολισμό του υποστρώματος χρησιμοποιείται κυρίως για τη διατήρηση της ομοιόστασης του οργανισμού και όχι για την αύξηση της μάζας ή το διπλασιασμό των κυττάρων. Ως αποτέλεσμα, η κατανάλωση του υποστρώματος συνδέεται μόνο με το σχηματισμό του προϊόντος και όχι της βιομάζας, ενώ με την εξάντληση του υποστρώματος σταματά και η παραγωγή του προϊόντος. Τα δευτερογενή μεταβολικά προϊόντα παράγονται συνήθως από μύκητες και αρκετά σπανιότερα από βακτήρια. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η παραγωγή τους ξεκινά όταν η ενεργός ανάπτυξη των κυττάρων έχει σταματήσει, ως αποτέλεσμα της μείωσης της συγκέντρωσης του περιοριστικού για την ανάπτυξη υποστρώματος σε τιμή που πλησιάζει αυτήν της Κs. Κατά το δευτερογενή μεταβολισμό αξιοποιούνται πρωτογενείς μεταβολίτες και παράγονται προϊόντα που εξαρτώνται από το συγκεκριμένο μικροοργανισμό και δεν είναι ουσιώδη για την ανάπτυξή του. Η παραγωγή τους απαιτεί την ενεργοποίηση μεταβολικών μονοπατιών, που δεν ήταν ενεργά κατά τη φάση της ανάπτυξης των κυττάρων, τουλάχιστον όχι κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης ανάπτυξης. Τα περισσότερα από αυτά τα προϊόντα δεν έχει βρεθεί να έχουν κάποιον ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο για το μικροοργανισμό που τα παράγει. Στα προϊόντα για τα οποία έχει αναγνωριστεί συγκεκριμένος ρόλος περιλαμβάνονται σιδεραμίνες και αντιβιοτικά με ιοντικές ομάδες (μακροτετραλίδια), που εμπλέκονται στην απομάκρυνση κατιόντων. Άλλα δευτερογενή προϊόντα παρεμποδίζουν ανταγωνιστικούς μικροοργανισμούς ή σχετίζονται με το σχηματισμό σπορίων. Πολλά δευτερογενή μεταβολικά προϊόντα έχουν χρήσιμες ιδιότητες και έχουν αναδειχθεί σε σημαντικά βιομηχανικά προϊόντα (Πίνακας 2). 16

29 Πίνακας 2. Δευτερογενή μεταβολικά προϊόντα με βιομηχανική εφαρμογή Προϊόν Μικροοργανισμός Χρήση Κεφαλοσπορίνη Acremonium chrysogenum Αντιβιοτικό Ερυθρομυκίνη Saccharapolyopora erythraea Αντιβιοτικό Πενικιλλίνη Penicillium chrysogenum Αντιβιοτικό Στρεπτομυκίνη Streptomyces griseus Αντιβιοτικό Τοξίνη της διφθερίτιδας Corynebacterium diphtheriae Εμβόλιο Τοξίνη του τετάνου Clostridium tetani Εμβόλιο Καροτενοειδή Blakeslea trispora Χρωστικές ουσίες Γκιμπερελλίνες (gibberellins) Fusarium moliniform Φυτικές ορμόνες Κλαβίνες (clavine alkaloids) Claviceps purpurea Αναλγητικά Η σύνθεση δευτερογενών μεταβολικών προϊόντων υπόκειται συνήθως σε πολύ ισχυρή ρύθμιση από το κύτταρο. Οι πηγές C που οδηγούν σε υψηλούς ρυθμούς ανάπτυξης δρουν συνήθως ως παρεμποδιστές (καταβολική ρύθμιση), όπως στην περίπτωση της παραγωγής αντιβιοτικών (πενικιλλίνη, χλωραμφενικόλη) από γλυκόζη. Ο ρυθμός κατανάλωσης του υποστρώματος σε συνθήκες διαλείποντος έργου δίνεται από τη σχέση: όπου: ds dt 1 Y X / S (2) Υ X/S: σταθερά κατανάλωσης του υποστρώματος για την κυτταρική ανάπτυξη (g DCW/g υποστρώματος) (ΥΧ/S =ΔΧ/ΔS) Στο σημείο αυτό θα πρέπει να αναφερθεί ότι, οι τιμές των σταθερών μικροβιακής ανάπτυξης που εμφανίζονται στις παραπάνω εξισώσεις εξαρτώνται από το είδος του μικροοργανισμού και τις συγκεκριμένες συνθήκες ανάπτυξης. Στη συγκεκριμένη άσκηση μελετάται η διεργασία διαλείποντος έργου για την ανάπτυξη κυττάρων της ζύμης Saccharomyces cerevisiae σε ελεγχόμενες συνθήκες. Ο βιοαντιδραστήρας που χρησιμοποιείται έχει ονομαστικό όγκο 2.5 l, ενώ ο ενεργός του όγκος (working volume) είναι 2.0 l και είναι εφοδιασμένος με κατάλληλα συστήματα, έτσι ώστε να είναι δυνατή η ρύθμιση της θερμοκρασίας, του ph, της ταχύτητας ανάδευσης, της παροχής αέρα και του αφρισμού. 17

30 Το μέσο ανάπτυξης περιέχει ως υπόστρωμα γλυκόζη με αρχική συγκέντρωση 20 g/l. Επίσης περιέχει τις ακόλουθες ποσότητες αλάτων ανά l απιονισμένου νερού: (ΝΗ4)2SΟ4 8 g, ΚΗ2ΡΟ4 6 g, ΜgSΟ4 7Η2Ο 0.4 g, CaC12 2Η2Ο 0.1 g, ΝαCl 0.1 g. Τέλος, για την υποβοήθηση της ανάπτυξης του μικροοργανισμού έχουν προστεθεί στο μέσο οι κατάλληλες ποσότητες διαλύματος βιταμινών και ιχνοστοιχείων από εκχύλισμα κυττάρων ζύμης (1.5 g/l). Η θερμοκρασία του μέσου ανάπτυξης ρυθμίζεται στους 30 C και το αρχικό ph στο 5. Ο βιοαντιδραστήρας εμβολιάζεται με 200 ml προκαλλιέργειας της ζύμης που έχει αναπτυχθεί στο ίδιο μέσο σε αναδευόμενες κωνικές φιάλες για περίπου 24 ώρες. Σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές λαμβάνονται δείγματα από το υγρό της καλλιέργειας αξιοποιώντας την ειδική διάταξη και εφαρμόζοντας, όπως πάντα, ασηπτικές συνθήκες. Σε κάθε ένα από τα δείγματα προσδιορίζεται η συγκέντρωση του υποστρώματος (γλυκόζης), καθώς και η συγκέντρωση των κυττάρων της ζύμης. Με βάση τα ζεύγη τιμών κυτταρικής συγκέντρωσης και συγκέντρωσης υποστρώματος που προκύπτουν, θα πρέπει να προσδιοριστούν οι σταθερές του μοντέλου Monod που περιγράφει την ανάπτυξη της ζύμης Saccharomyces cerevisiae στις συγκεκριμένες συνθήκες. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα Βιοαντιδραστήρας Φυγόκεντρος Αναδευτήρας (Vortex) Δοχείο βρασμού Φωτόμετρο Σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης - ΗPLC (εναλλακτικά) Υλικά και Αντιδραστήρια Σιφώνιο του 1 ml Σιφώνιο των 10 ml Φούσκα μετάγγισης υγρών (poire) 18

31 Σωλήνες αραίωσης Διάλυμα δινιτροσαλυκιλικού οξέος (DNSA) Εκτέλεση 1. Κάθε μισή ώρα περίπου λαμβάνεται δείγμα (περίπου 80 ml) από το βιοαντιδραστήρα. Η διαδικασία δειγματοληψίας είναι περίπλοκη και, για την αποφυγή μόλυνσης του βιοαντιδραστήρα από βακτήρια της ατμόσφαιρας γίνεται από τον υπεύθυνο της άσκησης. 2. Πραγματοποιείται αραίωση του δείγματος 10 φορές με απιονισμένο νερό (πραγματοποιείται διπλή μέτρηση για κάθε δείγμα). Επιλέγεται στο φωτόμετρο το μήκος κύματος των 600 nm και μηδενίζεται το όργανο με απιονισμένο νερό. Στη συνέχεια μετράται η απορρόφηση (θολερότητα) του δείγματος (όριο απορρόφησης 0.4). 3. Τοποθετούνται 2 ml από το υπόλοιπο δείγμα του βιοαντιδραστήρα σε δοκιμαστικό σωλήνα. Σε ένα δεύτερο σωλήνα τοποθετούνται 2 ml νερό. Οι δύο σωλήνες τοποθετούνται στη φυγόκεντρο (σε αντιδιαμετρικές θέσεις) και φυγοκεντρούνται για 10 λεπτά. 4. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης συλλέγεται το υπερκείμενο υγρό, το οποίο είναι διαυγές, αφού η κυτταρική μάζα έχει κατακαθίσει στον πυθμένα του σωλήνα. 5. Αραιώνεται το υπερκείμενο υγρό 8 φορές με απιονισμένο νερό. Ακολουθεί μέτρηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης στο αραιωμένο δείγμα με τη μέθοδο DNSA (βλέπε Παράρτημα). 6. Επαναλαμβάνονται τα βήματα 2 έως 5 για κάθε δείγμα που λαμβάνεται από το βιοαντιδραστήρα. 19

32 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Υπολογίστε την κυτταρική συγκέντρωση στο βιοαντιδραστήρα για κάθε χρονική στιγμή με βάση την απορρόφηση στα 600 nm. Χρησιμοποιείστε την καμπύλη αναφοράς της κυτταρικής συγκέντρωσης (ξηρού βάρους κυττάρων) που υπολογίστηκε στην ερώτηση 2 της προηγούμενης άσκησης (λάβετε υπ' όψιν την αραίωση). 2. Υπολογίστε τη συγκέντρωση της γλυκόζης στο βιοαντιδραστήρα για κάθε χρονική στιγμή με βάση τη χημική μέθοδο του δινιτροσαλυκιλικού οξέος (DNSA) ή με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC). Καμπύλη αναφοράς γλυκόζης: Γλυκόζη (g/l)=1.72 x Απορρόφηση (να λάβετε υπόψη την αραίωση). 3. Να κατασκευαστεί το διάγραμμα της κυτταρικής συγκέντρωσης και της συγκέντρωσης της γλυκόζης ως συνάρτηση του χρόνου και να προσδιοριστούν τα σημεία στα οποία τα κύτταρα βρίσκονται σε φάση εκθετικής ανάπτυξης. 4. Από τα παραπάνω στοιχεία (συγκέντρωση κυτταρικής μάζας ως προς το χρόνο), υπολογίστε το μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (μmax) με βάση την παραδοχή ότι στην εκθετική φάση ανάπτυξης μ=σταθερό=μmax. 5. Yπολογίστε τη σταθερά κατανάλωσης του υποστρώματος ΥX/S. 6. Κατά την ανάπτυξη ενός μύκητα σε διεργασία διαλείποντος έργου με υπόστρωμα γλυκόζη, παρατηρήθηκαν τα ακόλουθα δεδομένα Χρόνος (h) Συγκέντρωση κυττάρων (g/l) Συγκέντρωση γλυκόζης (g/l) α. Να υπολογιστεί ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (μmax) και η σταθερά κατανάλωσης του υποστρώματος (Υ X/S). 20

33 β. Ποια είναι η μέγιστη συγκέντρωση κυττάρων που αναμένεται, αν χρησιμοποιηθεί αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 150 g/l με το ίδιο εμβόλιο (παραδοχή: πλήρης κατανάλωση υποστρώματος); ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 11. Basic Biotechnology (2001). C. Ratledge & B. Kristiansen, 2 nd edition, Cambridge University Press 12. Bioprocess Engineering (1992). M. Schuler & F. Kargi, Prentice Hall PTR, New Jersey 13. Bioprocess Engineering Principles (1995). P. Doran, Academic Press, San Diego 14. Biotechnology (1993). H. Reim, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler, 2nd edition, VCH, Weinheim 15. Biochemical Engineering Fundamentals (1986). J. Bailey & F. Ollis, 2nd edition, McGraw-Hill, Singapore 16. Microbial Growth Dynamics (1990). R. Poole, M. Bazin, C. Keevil, IRL Press 17. Practical Fermentation (1999). J. Schollar & B. Watmore, National Centre for Biotechnology Education, University of Reading, UK, published by The Society for General Microbiology, UK 18. Σημειώσεις Βιοχημικής Μηχανικής (1999). Δ. Κέκου, Ν. Παπαγιαννάκου, Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π. 19. Βιοτεχνολογία (2000). Δ. Κυριακίδη, Εκδόσεις Ζήτη. Θεσσαλονίκη 20. Στοιχεία Βασικής Βιοτεχνολογίας (1993). Β. Μακρή, Δ. Κέκου, Αθήνα 21

34 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΜΕΘΟΔΟΣ DNSA ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΑΝΑΓΩΓΙΚΩΝ ΣΑΚΧΑΡΩΝ - ΚΑΜΠΥΛΗ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ Η συγκέντρωση των σακχάρων αποτελεί παράμετρο που παρακολουθείται πολύ συχνά στις διεργασίες ανάπτυξης μικροοργανισμών, δεδομένου ότι τα κύτταρα χρησιμοποιούν τα σάκχαρα ως υπόστρωμα και η κατανάλωσή τους συνδέεται στενά με τη μικροβιακή ανάπτυξη. Ανάμεσα στα σάκχαρα που χρησιμοποιούνται ως πηγή άνθρακα, η γλυκόζη είναι ίσως η πλέον διαδεδομένη. Υπάρχουν αρκετές μέθοδοι που έχουν αναπτυχθεί για τη μέτρηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης, τόσο χημικές όσο και ενζυμικές. Μία από τις μεθόδους προσδιορισμού της γλυκόζης πραγματοποιείται με τη βοήθεια διαλύματος δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNSA). Η μέθοδος του δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNSA) είναι φωτομετρική και χρησιμοποιείται για τη μέτρηση των αναγωγικών σακχάρων. Τα σάκχαρα χαρακτηρίζονται ως αναγωγικά (αν οξειδώνονται από ήπια οξειδωτικά) ή μη αναγωγικά. Γενικά οι αλδόζες (οποιοδήποτε σάκχαρο όπου στη μοριακή του σύνθεση περιέχει μια ομάδα αλδεΰδης προσκολλημένη στο πρώτο άτομο του άνθρακα) είναι αναγωγικά σάκχαρα. Όμως και μερικές κετόζες (μονοσακχαρίτες που περιέχουν τη χαρακτηριστική ομάδα καρβονύλιο (C=Ο) στην αλυσίδα τους) είναι αναγωγικά σάκχαρα, όπως για παράδειγμα η φρουκτόζη, η οποία σε αλκαλικές συνθήκες ισομερίζεται προς αλδοεξόζη. Η μέθοδος στηρίζεται στο σχηματισμό συμπλόκου ανάμεσα στο δεύτερο ημιακεταλικό υδροξύλιο υδροξύλιο του σακχάρου και στο μόριο του δινιτροσαλικυλικού οξέος. Η αντίδραση αυτή πραγματοποιείται σε αλκαλικό περιβάλλον και σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των 70 ºC. Το μέγιστο της απορρόφησης του συμπλόκου εμφανίζεται στα 540 nm. Στην παρούσα άσκηση κατασκευάζεται καμπύλη αναφοράς της γλυκόζης, η οποία αποτελεί αναγωγικό σάκχαρο, με τη μέθοδο DNSA. 22

35 Όργανα ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Αναδευτήρας (Vortex) Δοχείο βρασμού Φωτόμετρο Υλικά και Αντιδραστήρια Πρότυπο διάλυμα γλυκόζης (2.0 g/l) Διάλυμα άγνωστης συγκέντρωσης γλυκόζης Σιφώνιο του 1 ml Σιφώνιο των 10 ml Φούσκα μετάγγισης υγρών (poire) Σωλήνες αραίωσης Διάλυμα DNSA Εκτέλεση 1. Χρησιμοποιώντας το πρότυπο διάλυμα γλυκόζης με συγκέντρωση 2.0 g/l, πραγματοποιείστε τις κατάλληλες αραιώσεις, έτσι ώστε να προκύψουν διαλύματα γλυκόζης τελικής συγκέντρωσης 0.25, 0.5, 0.75, 1 και 1.5 g/l. 2. Σε 15 δοκιμαστικούς σωλήνες (δύο για κάθε συγκέντρωση γλυκόζης, δύο για το διάλυμα άγνωστης συγκέντρωσης γλυκόζης και ένα για το λευκό) προσθέστε από 0.5 ml διαλύματος DNSA και 0.5 ml από το κάθε διάλυμα γλυκόζης. Στην περίπτωση του λευκού, αντί για διάλυμα γλυκόζης προστίθεται 0.5 ml απιονισμένου νερού. 3. Τα μείγματα που προκύπτουν αναδεύονται σε αναδευτήρα (Vortex) και τοποθετούνται σε δοχείο βρασμού, έτσι ώστε να παραμείνουν σε θερμοκρασία πάνω από 100 ºC για 5 λεπτά. 4. Στη συνέχεια, οι δοκιμαστικοί σωλήνες απομακρύνονται από το νερό που βράζει και σε καθέναν από αυτούς προστίθενται 4 ml απιονισμένου νερού. 5. Τα μείγματα αναδεύονται εκ νέου και προωθούνται στο φωτόμετρο, έτσι ώστε να μετρηθεί η απορρόφησή τους. 6. Αφού επιλεγεί στο φωτόμετρο το μήκος κύματος στα 540 nm, μηδενίζεται το όργανο με το λευκό δείγμα και μετρώνται οι απορροφήσεις των διαλυμάτων γνωστής και άγνωστης συγκέντρωσης γλυκόζης. 23

36 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Υπολογίστε τους μέσους όρους των απορροφήσεων για κάθε συγκέντρωση και κατασκευάστε την καμπύλη αναφοράς της γλυκόζης (διάγραμμα δύο αξόνων με την απορρόφηση στα 540 nm και τη συγκέντρωση της γλυκόζης). 2. Ποια είναι η βέλτιστη ευθεία (καμπύλη αναφοράς της γλυκόζης) που περνά από τα ζεύγη τιμών του προηγούμενου διαγράμματος (χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των ελάχιστων τετραγώνων) και ποιος ο συντελεστής συσχέτισης (R 2 ); 3. Να υπολογιστεί η συγκέντρωση του άγνωστου διαλύματος γλυκόζης. 4. Για ποια από τα παρακάτω σάκχαρα μπορεί να χρησιμοποιηθεί η μέθοδος του δινιτροσαλικυλικού οξέος; φρουκτόζη, ξυλόζη, αραβινόζη, μαννόζη, λακτόζη, σακχαρόζη, κελλοβιόζη, μαλτόζη, ραφινόζη, σταχυόζη. 5. Να αναφέρετε δύο ακόμη αναλυτικές μεθόδους (εκτός της μεθόδου DNSA) που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης σακχάρων. 6. Σε 9 ml διαλύματος σακχαρόζης πραγματοποιείται όξινη υδρόλυση με προσθήκη 1 ml HCl 1 Ν. Μετά από εξουδετέρωση του οξέος με προσθήκη 1 ml διαλύματος ΝαΟΗ 1 Ν, προσδιορίζεται η συγκέντρωση των αναγωγικών σακχάρων με τη μέθοδο του δινιτροσαλικυλικού οξέος. Αν η απορρόφηση του δείγματος στα 540 nm είναι 0.265, να υπολογιστεί η συγκέντρωση του αρχικού διαλύματος σακχαρόζης. Γίνεται η παραδοχή ότι η καμπύλη αναφοράς που υπολογίσατε ισχύει τόσο για τη συγκέντρωση της γλυκόζης, όσο και της φρουκτόζης. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Miller, G., (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Analytical Chemistry, 31(3), Carbohydrate Analysis (1994). M. Chaplin J. Kennedy, IRL at Oxford 3. Fengel, D. & Wegener G. (1984). Polyoses (Hemicelluloses) In: Wood, chemistry, ultrastructure, reactions. Walter de Gruyter (ed.), Berlin, New York, pp (Leksikon-δομή σακχάρων) 24

37 ΑΣΚΗΣΗ 3 η Μ. Κατσούρα, Α. Πολύδερα, Χ. Σταμάτης ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΤΗΣ ΠΕΝΙΚΙΛΙΝΗΣ ΣΕ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΑ Μία κατηγορία ενώσεων με μεγάλο ενδιαφέρον, οι οποίες παράγονται από μικροοργανισμούς, αποτελούν τα αντιβιοτικά. Τα αντιβιοτικά, όπως η πενικιλίνη, είναι προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού των μικροοργανισμών (αποτελούν δηλαδή μεταβολίτες οι οποίοι δεν χρησιμοποιούνται για την παραγωγή ενέργειας από τον μικροοργανισμό). Νηματοειδείς μύκητες του είδους Penicillium χρησιμοποιούνται ευρέως για την εμπορική παραγωγή της πενικιλίνης. Η σύνθεση του αντιβιοτικού δεν συνδέεται με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού, και για τον λόγο αυτό η διαδικασία που ακολουθείται είναι αρχικά η ανάπτυξη του μικροοργανισμού μέσω μίας διεργασίας διαλείποντος έργου (batch process) και στη συνέχεια η εφαρμογή μίας διεργασίας ημιδιαλείποντος έργου (fed-batch process), η οποία επάγει την παραγωγή του αντιβιοτικού. Κατά το πρώτο στάδιο δίνεται έμφαση στον πρωτογενή μεταβολισμό του μικροοργανισμού, και με στόχο την μέγιστη ανάπτυξη και την παραγωγή βιομάζας (biomass), το υπόστρωμα (συνήθως χρησιμοποιείται ως πηγή άνθρακα η γλυκόζη) προστίθεται στον βιοαντιδραστήρα. Στο επόμενο στάδιο, εφόσον έχει παραχθεί η επιθυμητή ποσότητα βιομάζας, πρέπει να περιοριστεί η ποσότητα του υποστρώματος ώστε η επαγωγή συνθηκών στρες του μικροοργανισμού να οδηγήσουν στην παραγωγή του αντιβιοτικού. Εξαιτίας του μεγάλου ενδιαφέροντος για την πενικιλίνη έχουν αναπτυχθεί διάφορα μοντέλα σχετικά με την παραγωγή του αντιβιοτικού αυτού. Τα μαθηματικά μοντέλα περιλαμβάνουν διάφορες μεταβλητές δεδομένων (input variables), για παράδειγμα συγκέντρωση υποστρώματος, ph, θερμοκρασία κ.α., οι οποίες συσχετίζονται με διάφορες μεταβλητές εξόδου (output variables), όπως για παράδειγμα τη βιομάζα, την παραγόμενη συγκέντρωση της πενικιλίνης κ.α. Τα μοντέλα αυτά είναι ιδιαίτερα σημαντικά καθώς συμβάλλουν στην κατανόηση της επίδρασης των διαφόρων παραμέτρων (μεταβλητών), στον αποτελεσματικό έλεγχο καθώς και στη βελτιστοποίηση της διεργασίας παραγωγής της πενικιλίνης. 25

38 Τα μαθηματικά μοντέλα μπορούν να διακριθούν σε δύο κύριες κατηγορίες, τα δομημένα και τα μη-δομημένα μοντέλα. Τα δομημένα μοντέλα λαμβάνουν υπόψη την επίδραση της φυσιολογίας και διαφοροποίησης των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Αντίθετα στα μη δομημένα μοντέλα, όλες οι πληροφορίες σχετικά με τη φυσιολογία των κυττάρων αποδίδονται μέσω μίας μοναδικής παραμέτρου, της βιομάζας, με αποτέλεσμα το μοντέλο να απλοποιείται σημαντικά. Με βάση τα παραπάνω, σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η εφαρμογή ενός μηδομημένου μοντέλου για τη μελέτη της παραγωγής της πενικιλίνης μέσω μίας διεργασίας ημιδιαλείποντος έργου. Για το σκοπό αυτό η προσομοίωση της διεργασίας ζύμωσης θα πραγματοποιηθεί μέσω του προγράμματος PENSIM [Birol et al., 2002] το οποίο διατίθεται ελεύθερα στο διαδίκτυο. Η σχηματική απεικόνιση της διεργασίας αποδίδεται στην Εικόνα 1. Εικόνα 1. Διάγραμμα ροής της διεργασίας παραγωγής της πενικιλίνης. Σύμφωνα με τη διαδικασία προσομοίωσης η μετάβαση από μία διεργασία διαλείποντος έργου σε ημιδιαλείποντος έργου καθορίζεται από τη μείωση της ποσότητας της πηγής άνθρακα (γλυκόζη). Το πρόγραμμα ορίζει ότι η μετάβαση αυτή θα πραγματοποιείται όταν η συγκέντρωση της γλυκόζης στον βιοαντιδραστήρα θα ισούται με 0.3 g/l. Το πρόγραμμα PENSIM παρέχει τη δυνατότητα προσομοίωσης της διεργασίας είτε με προκαθορισμένες τιμές των μεταβλητών (Εικόνα 2), είτε επιτρέπει τη ρύθμιση της τιμής των μεταβλητών από τον χρήστη. Οι μεταβλητές δεδομένων του μοντέλου περιλαμβάνουν: Τις αρχικές συνθήκες δηλαδή, τη συγκέντρωση του υποστρώματος (substrate concentration), τη συγκέντρωση του οξυγόνου (dissolved oxygen concentration), τη 26

39 συγκέντρωση της βιομάζας (biomass concentration), τη συγκέντρωση της πενικιλίνης (penicillin concentration), τον όγκο της καλλιέργειας (culture volume), τη συγκέντρωση του διοξειδίου του άνθρακα (carbon dioxide concentration), το ph, τη θερμοκρασία του βιοαντιδραστήρα (fermentor temperature), τη παραγόμενη θερμότητα (generated heat) και άλλα. Τα σημεία ελέγχου (ρυθμό αερισμού-aeration rate, ανάδευση-agitator power, ρυθμό ροής υποστρώματος-substrate feed flow rate, θερμοκρασία παροχής υποστρώματοςsubstrate feed temperature, σημείο ελέγχου θερμοκρασίας-temperature set point, σημείο ελέγχου ph-ph set point). Επιπλέον οι χρήστες μπορούν να ορίσουν το χρονικό διάστημα δειγματοληψίας (sampling interval) και τον χρόνο της προσομοίωσης (simulation time). Οι προκαθορισμένες από τον προσομοιωτή τιμές απεικονίζονται στην Εικόνα 2. Εικόνα 2. Φόρμα καθορισμού των συνθηκών προσομοίωσης για την παραγωγή της πενικιλίνης. Η ρύθμιση των τιμών των προαναφερόμενων παραμέτρων καθορίζει τις μεταβλητές εξόδου. Ο καθορισμός βασίζεται φυσικά σε πειραματικά δεδομένα. Με βάση τα δεδομένα αυτά, η εξάρτηση των μεταβλητών εξόδου από τις μεταβλητές εισόδου περιγράφεται από μαθηματικές εξισώσεις. Για παράδειγμα το PENSIM αποδίδει την αύξηση της βιομάζας συναρτήσει της συγκέντρωσης της γλυκόζης και του οξυγόνου μέσω 27

40 της κινητικής Contois (και όχι μέσω του κλασικού μοντέλου Monod), έτσι ώστε να λαμβάνει υπόψη και την αναστολή της βιομάζας (Εξίσωση 1): 28 d X dt X V dv dt (Εξίσωση 1), όπου, Χ η συγκέντρωση της βιομάζας (g/l), V ο όγκος της καλλιέργειας (L) και μ o ειδικός ρυθμός ανάπτυξης ο οποίος περιγράφεται από την Εξίσωση 2: S CL x ( KxX S) ( KoxX CL) (Εξίσωση 2), όπου, Χ η συγκέντρωση της βιομάζας (g/l), S η συγκέντρωση της γλυκόζης (g/l), CL η συγκέντρωση του οξυγόνου (g/l), μx ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (ανά h), Κx η σταθερά κορεσμού Contois (g/l) και Κox η σταθερά περιορισμού του οξυγόνου. Μπορείτε να βρείτε τις εξισώσεις καθώς και τις τιμές των σταθερών που χρησιμοποιούνται από το μοντέλο μέσω του ακόλουθου συνδέσμου Η εξάρτηση των μεταβλητών εξόδου από τις μεταβλητές εισόδου μετά το τέλος της προσομοίωσης αποδίδονται με τη μορφή διαγραμμάτων συναρτήσει του χρόνου. Το πρόγραμμα επιτρέπει επίσης τη συλλογή και την αποθήκευση των δεδομένων. Άσκηση Μεταβείτε στην ιστοσελίδα του Ινστιτούτου Τεχνολογίας του Ιλινόις. Επιλέξτε το σύνδεσμο PENSIM. Προκειμένου να ξεκινήσετε την προσομοίωση επιλέξτε το σύνδεσμο Simulator. Χρησιμοποιώντας τον προσομοιωτή μπορείτε να εισάγετε τις τιμές των μεταβλητών εισόδου. Μετά την εισαγωγή των δεδομένων επιλέξτε Execute Simulation. Πατήστε το πλήκτρο αυτό μία μόνο φορά. Το πρόγραμμα θα σας οδηγήσει σε μία νέα σελίδα όπου οι διάφορες παράμετροι του μοντέλου αποδίδονται διαγραμματικά, συναρτήσει του χρόνου της προσομοίωσης. Το πρόγραμμα παρέχει επίσης τη δυνατότητα αποθήκευσης των δεδομένων. Προκειμένου να αποθηκεύσετε τα δεδομένα επιλέξτε τον σύνδεσμο Output.txt data file. Το πρόγραμμα σας οδηγεί σε μία νέα σελίδα με τις τιμές των διαφόρων παραμέτρων. Αποθηκεύστε αυτή την σελίδα στον υπολογιστή σας ως text document (*.txt). Μετά την αποθήκευση επιλέξτε να ανοίξετε το αρχείο αυτό με το πρόγραμμα Microsoft Excel. ΠΡΟΣΟΧΗ! Για να εμφανιστούν σωστά οι τιμές στο Excel θα πρέπει αρχικά να ρυθμίσουμε το Excel ώστε να δέχεται την τελεία ως διαχωριστικό των δεκαδικών και το κόμμα ως διαχωριστικό των χιλιάδων. Για αυτό ανοίγουμε το Excel και επιλέγουμε

41 «Εργαλεία» «Επιλογές» «Διεθνείς ρυθμίσεις» Απενεργοποίηση του «χρήση διαχωριστικών συστήματος» Πληκτρολόγηση της τελείας στο πλαίσιο «Διαχωριστικό Δεκαδικών» και του κόμματος στο πλαίσιο «Διαχωριστικό χιλιάδων» «ΟΚ». H διαδικασία αυτή θα πρέπει να γίνει μόνο μια φορά σε κάθε υπολογιστή. ΑΝΑΛOΓΑ ΜΕ ΤΗΝ ΕΚΔΟΣΗ ΤΟΥ OFFICE ΠΟΥ ΕΙΝΑΙ ΔΙΑΘΕΣΙΜΗ ΣΤΟΝ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΗ ΣΑΣ, Η ΠΑΡΑΠΑΝΩ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΕΙΝΑΙ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΗ Άσκηση 1. Πραγματοποιήστε την προσομοίωση με τις προκαθορισμένες από το πρόγραμμα τιμές. Αποθηκεύστε το αρχείο στον υπολογιστή και με βάση τις τιμές του αρχείου απεικονίστε στο ίδιο διάγραμμα τη μεταβολή της συγκέντρωσης της γλυκόζης (6 η στήλη), την μεταβολή της βιομάζας (8 η στήλη) και την παραγωγή της πενικιλίνης (9 η στήλη) συναρτήσει του χρόνου της προσομοίωσης (1 η στήλη). α) Όταν ξεκινά η παραγωγή της πενικιλίνης, ποια είναι η τιμή συγκέντρωσης του υποστρώματος; β) Σε ποια φάση ανάπτυξης βρίσκονται τα κύτταρα του μικροοργανισμού κατά τη διαδικασία παραγωγής της πενικιλίνης; γ) Κατά την φάση παραγωγή της πενικιλίνης ο βιοαντιδραστήρας λειτουργεί ως διαλείποντος ή ημιδιαλείποντος έργου; Άσκηση 2. Σύμφωνα με τις προκαθορισμένες συνθήκες η προσομοίωση πραγματοποιείται σε τιμή ph ίση με 5. Προκειμένου να μελετήσετε την επίδραση αυτής της παραμέτρου εισάγετε στα πεδία ph και ph set point την τιμή 3. Μετά το τέλος της προσομοίωσης αποθηκεύστε το αρχείο στον υπολογιστή και χρησιμοποιώντας τις τιμές του Excel, απεικονίστε στο ίδιο διάγραμμα τη μεταβολή της συγκέντρωσης της γλυκόζης, τη μεταβολή της βιομάζας και την παραγωγή της πενικιλίνης συναρτήσει του χρόνου της προσομοίωσης. Τι παρατηρείτε; Πώς μπορείτε να εξηγήσετε τα παρατηρούμενα αποτελέσματα; Άσκηση 3. Προκειμένου να μελετήσετε την επίδραση της συγκέντρωσης του υποστρώματος εισάγετε στο πεδίο Substrate concentration τις τιμές 1, 25 και 55. Μετά το τέλος της προσομοίωσης αποθηκεύστε κάθε ένα αρχείο στον υπολογιστή και κατασκευάστε διάγραμμα μεταβολής της συγκέντρωσης γλυκόζης συναρτήσει του χρόνου της προσομοίωσης για τιμές αρχικής συγκέντρωσης υποστρώματος ίσες με 1, 15 (χρησιμοποιείστε τα δεδομένα της Άσκησης 1), 25 και 55 g/l. Συγκρίνετε σε νέο διάγραμμα τη μεταβολή της βιομάζας συναρτήσει του χρόνου της 29

42 προσομοίωσης για τιμές συγκέντρωσης υποστρώματος ίσες με 1, 15 (χρησιμοποιείστε τα δεδομένα της Άσκησης 1), 25 και 55 g/l. Τι παρατηρείτε σχετικά με την επίδραση της αύξησης της συγκέντρωσης της γλυκόζης στην αύξηση της βιομάζας; Απεικονίστε σε νέο διάγραμμα την συγκέντρωση της πενικιλίνης συναρτήσει του χρόνου της προσομοίωσης για κάθε μία από τις προηγούμενες τιμές συγκέντρωσης. Τι παρατηρείτε σχετικά με την επίδραση της αύξησης της συγκέντρωσης της γλυκόζης στην παραγωγή της πενικιλίνης; Σημείωση: Στην περίπτωση που προκύψουν αρνητικές τιμές, θεωρείστε ότι η παραγωγή πενικιλίνης είναι μηδενική. Άσκηση 4. Με την αλλαγή της διαδικασίας από διαλείποντος σε ημιδιαλείποντος έργου (όταν η συγκέντρωση της γλυκόζης ισούται με 0.3 g/l), ο βιοαντιδραστήρας τροφοδοτείται με γλυκόζη με ρυθμό ίσο με L/h (προκαθορισμένη τιμή). Αντί για την τιμή αυτή επιλέξτε στο πεδίο Substrate Feed Flow rate την τιμή 0.5 L/h. Μετά το τέλος της προσομοίωσης αποθηκεύστε το αρχείο στον υπολογιστή και χρησιμοποιώντας τις τιμές του Excel, απεικονίστε στο ίδιο διάγραμμα τη μεταβολή της συγκέντρωσης της γλυκόζης, τη μεταβολή της βιομάζας και την παραγωγή της πενικιλίνης συναρτήσει του χρόνου της προσομοίωσης. Ποια είναι η επίδραση της αύξησης της παροχής του υποστρώματος, κατά τη διαδικασία ημιδιαλείποντος έργου, στην βιομάζα και την παραγωγή πενικιλίνης; Εξηγήστε. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Biochemical Engineering Fundamentals (1986). J. Bailey & F. Ollis, 2nd edition, McGraw-Hill, Singapore 2. Bioprocess Engineering Principles (1995). P. M. Doran, Academic Press Ltd, London, UK 3. Microbiology: an introduction (2002). B. L. Batzing, Brooks/Cole, Thomson Learning Inc., USA 4. Bioprocess Engineering (1992). M. Schuler & F. Kargi, Prentice Hall PTR, New Jersey 5. Wayne Lee Forday (1992). FERMISYM A program for teaching microbial kinetics and bioreactor design, Instructions guide. Department of Biotechnology, Ngee Ann Polytechnic, Singapore. 6. Μ. Καλογερή, Χ. Σταμάτη (2007). "Στοιχεία Ενζυμικής & Μικροβιακής Τεχνολογίας", Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών & Τεχνολογιών, Παν. Ιωαννίνων. 30

43 ΑΣΚΗΣΗ 4 η KAΘΑΡΙΣΜΟΣ ΕΝΖΥΜΩΝ Α. Πολύδερα, Π. Καταπόδης, Χ Σταμάτης ΣΚΟΠΟΣ Στο τέλος των ασκήσεων 4 & 5 οι φοιτητές θα γνωρίζουν ένα ολοκληρωμένο πρωτόκολλο για την απομόνωση ενζύμων, που παράγονται κατά την ανάπτυξη μικροοργανισμών σε θρεπτικά υποστρώματα, από υγρά διαλύματα. ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Yγρό καλλιέργειας που περιέχει τα εξωκυτταρικά ένζυμα όπως κυτταρινάσες και β- γλυκοζιδάση (από το εξωκυτταρικό διήθημα του μύκητα Aspergillus niger) υφίσταται κατεργασία με σκοπό την απομόνωση των ενζύμων. Η κατεργασία περιλαμβάνει τη μεταβολή της ιοντικής ισχύος του διαλύματος με προσθήκη θειϊκού αμμωνίου [(NH4)2SO4] και οδηγεί στην καταβύθιση των ενζύμων. Τα ένζυμα στη συνέχεια καθαρίζονται μερικώς με την εφαρμογή της τεχνικής χρωματογραφίας μοριακής διήθησης. Η αποτελεσματικότητα της διεργασίας απομόνωσης των ενζύμων υπολογίζεται μετά από προσδιορισμό της ενεργότητας του ενζύμου β-γλυκοζιδάση. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η καταβύθιση αποτελεί ένα από τα αρχικά στάδια της διεργασίας καθαρισμού και απομόνωσης των πρωτεϊνών, το οποίο συνήθως ακολουθείται από μεθόδους υγρής χρωματογραφίας. Η καταβύθιση μπορεί επίσης να εφαρμοστεί και για τη συμπύκνωση ενός πρωτεϊνικού διαλύματος. Η διαλυτότητα ενός πρωτεϊνικού μορίου σε υδατικό μέσο καθορίζεται από την κατανομή των φορτισμένων υδρόφοβων και υδρόφιλων ομάδων στην επιφάνειά του. Οι φορτισμένες αυτές ομάδες αλληλεπιδρούν με τα ιόντα του διαλύματος, όπως φαίνεται στο επόμενο σχήμα. Η καταβύθιση μιας πρωτεΐνης μπορεί να πραγματοποιηθεί με πολλούς τρόπους, όπως: 31

44 o αλλαγή του pη του διαλύματος o αλλαγή της ιοντικής του ισχύος o προσθήκη οργανικών διαλυτών o προσθήκη μη πολικών διαλυτών ή πολυμερών Ανιόν Αρνητικά φορτισμένη περιοχή Κατιόν Θετικά φορτισμένη περιοχή Μόριο νερού Υδρόφοβη περιοχή Σχήμα 1. Αλληλεπίδραση μορίου πρωτεΐνης με τα ιόντα υδατικού διαλύματος Ανεξάρτητα από τη μέθοδο που χρησιμοποιείται, η θερμοκρασία αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα που επηρεάζει το βαθμό καταβύθισης των πρωτεϊνών. 1. Καταβύθιση στο ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης Μία από τις απλούστερες μεθόδους καταβύθισης πρωτεϊνών είναι αυτή που επιτυγχάνεται με ρύθμιση του pη του πρωτεϊνικού διαλύματος σε τιμή κοντά σε αυτή του ισοηλεκτρικού σημείου (pi) της πρωτεΐνης. Η επιφάνεια του πρωτεϊνικού μορίου καλύπτεται από θετικά και αρνητικά φορτισμένες ομάδες. Για τιμές pη κάτω του ισοηλεκτρικού σημείου η επιφάνεια της πρωτεΐνης είναι θετικά φορτισμένη, ενώ για τιμές pη άνω του ισοηλεκτρικού σημείου η επιφάνεια της πρωτεΐνης είναι αρνητικά φορτισμένη. Και στις δύο περιπτώσεις, λόγω της άπωσης μεταξύ των όμοια φορτισμένων πρωτεϊνικών μορίων, αυτά βρίσκονται σε διασπορά. Όμως, για pη = pi το πρωτεϊνικό 32

45 μόριο είναι ουδέτερα φορτισμένο, με αποτέλεσμα την ηλεκτροστατική έλξη μεταξύ των πρωτεϊνικών μορίων, η οποία προκαλεί την καταβύθισή τους. 2. Καταβύθιση με οργανικούς διαλύτες Πολλές πρωτεΐνες καταβυθίζονται με προσθήκη οργανικών διαλυτών, όπως ακετόνη και αιθανόλη. Η προσθήκη οργανικού διαλύτη μειώνει τη διηλεκτρική σταθερά του διαλύματος, με αποτέλεσμα τη μείωση της διαλυτότητας των πρωτεϊνικών μορίων, τα οποία συσσωματώνονται λόγω ηλεκτροστατικής έλξης. Η καταβύθιση διευκολύνεται όταν η τιμή του pη είναι κοντά σε αυτήν του ισοηλεκτρικού σημείου, ενώ η διατήρηση της θερμοκρασίας σε χαμηλά επίπεδα βοηθά στη σταθερότητα των ενζύμων. Μία παράμετρος που επηρεάζει την καταβύθιση είναι και το μέγεθος των πρωτεϊνικών μορίων. Οι μεγάλου μεγέθους πρωτεΐνες καταβυθίζονται σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις οργανικού διαλύτη συγκριτικά με τις μικρότερου μεγέθους και με παρόμοιες ιδιότητες πρωτεΐνες. 3. Καταβύθιση με πολυμερή Η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) είναι ένα από το πολυμερή που χρησιμοποιούνται για τον ίδιο σκοπό. Ο μηχανισμός καταβύθισης είναι παρόμοιος με αυτόν της καταβύθισης με οργανικούς διαλύτες. Χρησιμοποιούνται συγκεντρώσεις μικρότερες του 20%, εφόσον υψηλότερες συγκεντρώσεις οδηγούν σε διαλύματα με υψηλό ιξώδες και η ανάκτηση του ιζήματος είναι αρκετά δύσκολη. 4. Μετουσίωση και καταβύθιση Η καταβύθιση μετά από μετουσίωση πρωτεϊνικών μορίων μπορεί να εφαρμοστεί ως στάδιο καθαρισμού μόνο στην περίπτωση που η επιθυμητή πρωτεΐνη δεν μετουσιώνεται με την κατεργασία. Η μετουσίωση επιτυγχάνεται με αλλαγή της θερμοκρασίας, του pη ή με προσθήκη οργανικών διαλυτών. Κατά τη μετουσίωση, καταστρέφεται η τριτοταγής δομή της πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα τη δημιουργία συσσωματωμάτων στο πρωτεϊνικό διάλυμα. 5. Καταβύθιση με αύξηση της ιοντικής ισχύος (εξαλάτωση, salting-out) Η καταβύθιση με προσθήκη ανόργανων αλάτων είναι η πλέον χρησιμοποιούμενη μέθοδος κλασμάτωσης των πρωτεϊνών. Η καταβυθιζόμενη πρωτεΐνη συνήθως δε μετουσιώνεται και η ενεργότητά της ανακτάται με επαναδιάλυση του ιζήματος. Επιπλέον, τα ανόργανα άλατα "προστατεύουν" τις πρωτεΐνες από μετουσίωση και πρωτεόλυση. Η εξαλάτωση εξαρτάται από τον υδρόφοβο χαρακτήρα της επιφάνειας της 33

46 πρωτεΐνης. Η πλειοψηφία των υδρόφοβων περιοχών μιας πρωτεΐνης εντοπίζονται στο εσωτερικό της, μερικές όμως από αυτές εκτίθενται και στην εξωτερική της επιφάνεια. Τα μόρια του νερού γύρω από τις περιοχές αυτές είναι πολύ πιο "τακτοποιημένα" απ' οπουδήποτε αλλού στο διάλυμα. Με την προσθήκη κάποιου άλατος στο διάλυμα τα μόρια του νερού απομακρύνονται από το περιβάλλον της πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα να εκτίθενται περισσότερες υδρόφοβες περιοχές. Έτσι, τα εκτιθέμενα υδρόφοβα τμήματα του ενός πρωτεϊνικού μορίου αλληλεπιδρούν με τα αντίστοιχα μιας άλλης πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα τη συσσωμάτωση. Κατά συνέπεια, οι πρωτεΐνες με μεγαλύτερες ή περισσότερες επιφανειακές υδρόφοβες περιοχές συσσωματώνονται και καταβυθίζονται νωρίτερα, έναντι αυτών με μικρότερες ή λιγότερες υδρόφοβες περιοχές. Η φύση του διαλύματος επηρεάζει τη συγκέντρωση του άλατος που απαιτείται για την καταβύθιση της επιθυμητής πρωτεΐνης. Η αύξηση της θερμοκρασίας αυξάνει το βαθμό της καταβύθισης. Παρ όλα αυτά, η εξαλάτωση πραγματοποιείται στους 4 C, προκειμένου να αποφευχθεί ο κίνδυνος απενεργοποίησης (π.χ. από πρωτεάσες). Η αποτελεσματικότητα του χρησιμοποιούμενου άλατος καθορίζεται από τη φύση του ανιόντος. Τα πολλαπλά φορτισμένα ανιόντα είναι τα περισσότερο αποτελεσματικά. Η σειρά αποτελεσματικότητας είναι: φωσφορικά > θειικά > οξικά > χλωρικά. Τα μονοσθενή κατιόντα είναι τα πλέον αποτελεσματικά και η σειρά αποτελεσματικότητας είναι ΝΗ4 + > Κ + > Νa +. Το άλας που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί πρέπει να έχει σχετικά χαμηλό κόστος και ποσοστό προσμίξεων. Στην πράξη το (NH4)2SO4 είναι το άλας που χρησιμοποιείται περισσότερο (άλλα άλατα που χρησιμοποιούνται σε ειδικές εφαρμογές είναι το οξικό αμμώνιο, το θειϊκό νάτριο και το κιτρικό νάτριο). Η ποσότητα του (NH4)2SO4 (g) που πρέπει να προστεθεί σε ένα λίτρο πρωτεϊνικού διαλύματος στους 20 C προκειμένου να επιτευχθεί η επιθυμητή συγκέντρωση υπολογίζεται με την παρακάτω εξίσωση: 34

47 ΠΙΝΑΚΑΣ ΚΟΡΕΣΜΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ ΣΕ ΘΕΙΪΚΟ ΑΜΜΩΝΙΟ (Ποσότητα (NH4)2SO4 που πρέπει να προστεθεί στο διάλυμα για να δώσει τον επιθυμητό βαθμό κορεσμού στους 0 ºC) Τελική συγκέντρωση (NH 4) 2SO 4, % κορεσμός στους 0 ºC) Αρχική συγκέντρωση (NH 4) 2SO 4 g (NH 4) 2SO 4 ανά 100 ml πρωτεϊνικού διαλύματος

48 g 533*( S2 S1) * S 2 όπου S1, S2: αρχική και τελική συγκέντρωση (NH4)2SO4 (%) αντίστοιχα. Η συγκεκριμένη εξίσωση λαμβάνει υπόψη και την αύξηση του όγκου του διαλύματος λόγω της προσθήκης του άλατος. Εναλλακτικά, η ποσότητα (NH4)2SO4 βρίσκεται από τον Πίνακα Κορεσμού Διαλυμάτων σε (NH4)2SO4. Η τάση ενυδάτωσης ενός ιόντος αυξάνεται με το μέγεθος και το φορτίο του. Το (NH4)2SO4 χρησιμοποιείται κατά κόρον στην κλασματική καθίζηση πρωτεϊνών, αφού τα ιόντα του είναι από τα πιο ογκώδη και επιπλέον, παρουσιάζει υψηλή διαλυτότητα, είναι μη τοξικό, οικονομικό και σε μερικές περιπτώσεις συντελεί στη σταθεροποίηση των ενζύμων. Κατά τη διάρκεια της άσκησης επιτυγχάνεται η ταυτόχρονη απομόνωση των εξωκυτταρικών ενζύμων που παράγονται από το μύκητα Aspergillus niger. Η ανάπτυξη του μικροοργανισμού πραγματοποιήθηκε σε βιοαντιδραστήρα βυθισμένης καλλιέργειας με πηγή άνθρακα το πίτυρο σίτου και πηγή αζώτου το (ΝΗ4)2HPO4. Μετά την ολοκλήρωση της ζύμωσης η κυτταρική μάζα απομακρύνθηκε με φυγόκεντρηση και το διήθημα που προέκυψε αποτελεί την πηγή των ενζύμων που χρησιμοποιούνται στην άσκηση. Διαχωρισμός πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία Με την υγρή χρωματογραφία επιτυγχάνεται διαχωρισμός χημικά και φυσικά ανάλογων ουσιών από το υγρό, στο οποίο είναι διαλυμένες. Όπως όλες οι χρωματογραφικές μέθοδοι, περιλαμβάνει μία στάσιμη (στερεή) φάση, την οποία διαπερνά μία κινητή (υγρή) φάση. Για την εφαρμογή της μεθόδου χρησιμοποιούνται συνήθως ειδικές χρωματογραφικές στήλες που πληρώνονται με τη στάσιμη φάση. Το μήκος της στήλης επηρεάζει την αποτελεσματικότητα του διαχωρισμού, ενώ η διάμετρός της καθορίζει το φορτίο (ποσότητα) που μπορεί να διαχωρίσει. Στο κάτω άκρο της στήλης τοποθετείται πορώδες διάφραγμα, που επιτρέπει τη δίοδο μόνο του διαλύτη και όχι των υλικών της στάσιμης φάσης. Οι κυριότερες χρωματογραφικές μέθοδοι για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών βασίζονται στις διαφορές των πρωτεϊνικών μορίων ως προς: 36

49 1. Φυσικό μέγεθος. Η παράμετρος αυτή χρησιμοποιείται στο διαχωρισμό με χρωματογραφία πηκτής ή μοριακής διήθησης (gel filtration). Η μέθοδος στηρίζεται στην ικανότητα ορισμένων πηκτών από ειδικά υλικά (δεξτράνες, πολυακρυλαμίδια, κ.ά.) να διαχωρίζουν τα μόρια με βάση το μέγεθος και το σχήμα τους. Δρουν δηλαδή οι πηκτές αυτές σαν μοριακά κόσκινα. Όταν σωματίδια της πηκτής τοποθετηθούν στο νερό διογκώνονται. Ένας ορισμένος όγκος νερού κατακρατείται στον εσωτερικό τους χώρο, ενώ νερό υπάρχει επίσης και στον εξωτερικό χώρο των σωματιδίων ανάμεσα στις αλυσίδες της πηκτής. Η κατανομή ουσιών μεταξύ του εσωτερικού και εξωτερικού υδατικού χώρου της πηκτής γίνεται με βάση το μέγεθος και το σχήμα των μορίων τους. Αυτό σημαίνει ότι, μόρια με διάμετρο μικρότερη από εκείνη των πόρων των σωματιδίων της πηκτής θα κατανεμηθούν στον εξωτερικό και εσωτερικό χώρο. Αντίθετα, τα μόρια με μεγαλύτερη διάμετρο θα παραμείνουν στον εξωτερικό υδατικό χώρο, με αποτέλεσμα να εξέλθουν πρώτα από τη στήλη, ακολουθούμενα από μόρια με μικρότερο μέγεθος που κάνουν μεγαλύτερη διαδρομή και επομένως θα εξέλθουν αργότερα. Από τα συνηθέστερα χρωματογραφικά υλικά είναι το εμπορικό παρασκεύασμα Sephadex της σουηδικής εταιρείας Pharmacia. Αποτελείται από πήγμα σφαιριδίων δεξτράνης, διακλαδωμένης με επιχλωρυδρίνη. Ο μεγάλος αριθμός ομάδων υδροξυλίου συντελεί στην υδροφιλικότητα του πήγματος, με αποτέλεσμα το Sephadex να διογκώνεται εύκολα σε νερό ή διαλύματα ηλεκτρολυτών. Οι διάφοροι τύποι Sephadex G διαφέρουν στο βαθμό διακλάδωσης των αλυσίδων της δεξτράνης, άρα και στο βαθμό διόγκωσης και διαχωρισμού που μπορούν να επιφέρουν. Μεγαλύτερος αριθμός G αντιστοιχεί σε μικρότερο βαθμό διακλάδωσης και μικρότερη αντοχή του πήγματος. Κάθε τύπος G χρησιμοποιείται για διαφορετικό εύρος μοριακών βαρών. Υλικά για χρωματογραφία πηκτής ή μοριακής διήθησης (gel filtration) Όνομα Κωδικός Εύρος διαχωρισμού kda 37

50 2. Ηλεκτρικό φορτίο. Η παράμετρος αυτή χρησιμοποιείται στο διαχωρισμό με χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων (ion exchange). Η αρχή της χρωματογραφικής μεθόδου στηρίζεται στις ηλεκτροστατικές δυνάμεις που αναπτύσσονται μεταξύ φορτισμένων ομάδων του ιονανταλλάκτη και αντίθετα φορτισμένων ομάδων των προς διαχωρισμό βιομορίων (π.χ. πρωτεϊνών). Η αλληλεπίδραση των φορτίων των ομάδων αυτών προσδιορίζει τη διαχωριστική ικανότητα της μεθόδου και επηρεάζεται κυρίως από το pη και την ιοντική ισχύ του διαλύματος της υγρής φάσης, καθώς και τη φύση των μορίων που θα διαχωριστούν. Υπάρχουν τρεις τύποι ιονανταλλακτικών ουσιών: Ιονανταλλακτικές ρητίνες που περιέχουν ανιοντικές (κατιοντικοί ανταλλάκτες RΗ - ) ή κατιοντικές ομάδες (ανιοντικοί ανταλλάκτες RΟΗ + ) Ιονανταλλακτικές κυτταρίνες Άλλες ιονανταλλακτικές ουσίες. Οι πιο κοινοί ιοντοανταλλάκτες Κυτταρίνη ή αγαρόζη + C 2 H 5 CH 2 CH 2 NH C 2 H 5 Διαιθυλοαμινοαιθυλο (DEAE) ομάδα Κυτταρίνη ή αγαρόζη CH 2 C O - O Kαρβοξυμεθυλο (CM) ομάδα 38

51 Χαρακτηριστικές ομάδες ιονανταλλακτών Εύρος ph σταθερότητας Η επίδραση του ph στη σύνδεση πρωτεΐνης σε ιονανταλλάκτη Ο τρόπος έκλουσης των βιομορίων από τη χρωματογραφική στήλη, στην οποία έχουν προσροφηθεί με ιοντικούς δεσμούς, είναι θεμελιώδους σημασίας. Όταν αυξηθεί η ιοντική ισχύς του ρυθμιστικού διαλύματος της έκλουσης, ο ανταγωνισμός για τις περιοχές του ιονανταλλάκτη που καταλαμβάνονται από το βιομόριο αυξάνεται και όταν ξεπεράσει κάποιο όριο το ένζυμο ελευθερώνεται από τη στήλη. Από την άλλη πλευρά, αλλάζοντας το pη του ρυθμιστικού διαλύματος της έκλουσης σε μία κατιοντική στήλη από όξινο σε αλκαλικό, τα φορτία του ανταλλάκτη και του βιομορίου ελαττώνονται με αποτέλεσμα τη σχάση των ηλεκτροστατικών δεσμών και την ελευθέρωση του βιομορίου. Ο συνδυασμός αλλαγών pη και ιοντικής ισχύος εφαρμόζεται στις περιπτώσεις εκείνες, που το βιομόριο είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο στις αλλαγές μόνο του ενός από τους παράγοντες αυτούς. 3. Τρισδιάστατη δομή. Η μέθοδος χρωματογραφίας συγγένειας (affinity chromatogrphy) βρίσκει εφαρμογή στην απομόνωση βιομορίων σε μεγάλη κλίμακα και στηρίζεται στην τάση που υπάρχει για ομοιοπολική σύνδεση μεταξύ βιομορίου και μιας ακινητοποιημένης ουσίας που ονομάζεται σύνδεμα. Η σύνδεση βιομορίου με το σύνδεμα γίνεται στην 39

52 επιφάνεια μεγαλομοριακών ουσιών (αγαρόζης), με τις οποίες είναι συνδεδεμένο με ομοιοπολικό δεσμό το σύνδεμα. Το βιομόριο που πρόκειται να απομονωθεί διέρχεται μέσα από χρωματογραφική στήλη, στην οποία έχει τοποθετηθεί η μεγαλομοριακή ένωση με το σύνδεμα. Το βιομόριο αντιδρά με το τελευταίο με αποτέλεσμα να συγκρατηθεί στη στήλη, ενώ όλες οι άλλες ουσίες διέρχονται χωρίς να συγκρατηθούν. Η έκλουση του βιομορίου από τη στήλη γίνεται με τη βοήθεια διαλύματος που περιέχει το ελεύθερο σύνδεμα. 4. Υδρόφοβες περιοχές. Στην περίπτωση αυτή, οι υδρόφοβες ομάδες του φορέα (στατική φάση) αλληλεπιδρούν με τις υδρόφοβες ομάδες των βιομορίων (χρωματογραφία προσρόφησης, adsorption chromatography). Μία απλοποιημένη άποψη της αντίδρασης αυτής είναι η υπόθεση ότι, αρυλικά ή αλκυλικά τμήματα του φορέα εισχωρούν στους υδρόφοβους θύλακες του βιομορίου δημιουργώντας πρόσδεση σε πολλαπλά σημεία. Συγκεντρωτικός πίνακας μεθόδων διαχωρισμού με υγρή χρωματογραφία Χρωματογραφική μέθοδος Χρωματογραφία πηκτής ή μοριακής διήθησης (gel filtration) Χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων (ion exchange) Χρωματεστίαση (chramatofocusing) Χρωματογραφία συγγένειας (affinity) Χρωματογραφία υδρόφοβων περιοχών (hydrophobic interaction) Χρωματογραφία ομοιοπολικών δεσμών (covalent) Παράμετρος Διαχωρισμού Φυσικό μέγεθος Ηλεκτρικό φορτίο Ηλεκτρικό φορτίο Τρισδιάστατη δομή Υδροφοβικότητα Ελεύθερες SH ομάδες 40

53 ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΤΗΛΗΣ _ _ Οι πρωτεΐνες χαρακτηρίζονται από μεγάλη ποικιλία. Διαφέρουν ως προς το μέγεθος, το σχήμα, το ηλεκτρικό φορτίο, την υδροφοβικότητα και τη συγγένειά τους προς άλλα μόρια. Όλες αυτές οι ιδιότητες μπορούν να αξιοποιηθούν έτσι ώστε να διαχωριστούν η μία από την άλλη και να μελετηθούν μεμονωμένα. μείγμα πρωτεϊνών Συνεχής παροχή διαλύτη έκλουσης ΧΡΟΝΟΣ 3 ΒΑΣΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ Υπάρχουν αρκετά είδη πληρωτικών υλικών για υγρή χρωματογραφία. Ένας τυπικός διαχωρισμός πρωτεϊνών περιλαμβάνει συνδυασμό των τριών ειδών χρωματογραφίας που περιγράφονται στη συνέχεια. πληρωτικό υλικό. πορώδες διάφραγμα δοκ. σωλήνας.... Ροή διαλύτη έκλουσης Ροή διαλύτη έκλουσης Ροή διαλύτη έκλουσης _ + _ + _ _ + _ _ _ + + _ _ + _ Θετικά φορτισμένο σωμάτιο Αρνητικά φορτισμένο μόριο που έχει προσδεθεί Ελεύθερο θετικά φορτισμένο μόριο Πορώδες σωμάτιο Μικρό μόριο με επιβράδυνση Μεγάλο μόριο χωρίς επιβράδυνση Σωμάτιο με προσδεδεμένο υπόστρωμα Προσδεδεμένο μόριο ενζύμου Άλλες πρωτεϊνες που δεν προσδένονται ΙΟΝΑΝΤΑΛΛΑΓΗ Οι στήλες αυτού του είδους πληρώνονται με μικρά σωματίδια που φέρουν θετικό ή αρνητικό φορτίο και καθυστερούν τις πρωτεΐνες με αντίθετο φορτίο. Η αλληλεπίδραση πληρωτικού υλικού και πρωτεΐνης εξαρτάται από το ph και την ιοντική ισχύ του διαλύτη έκλουσης τα οποία μπορούν να μεταβάλλονται με ελεγχόμενο τρόπο. ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΗΘΗΣΗ Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με βάση το μέγεθός τους. Το πληρωτικό υλικό αποτελείται από πορώδη σφαιρίδια. Οι μικρού μεγέθους πρωτεΐνες μπαίνουν στους πόρους και περνούν από τη στήλη πιο αργά. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες που δεν μπορούν να μπουν στους πόρους εκλoύονται πρώτες. Με τη μέθοδο είναι δυνατή η εκτίμηση του μεγέθους των πρωτεϊνών. ΣΥΓΓΕΝΕΙΑ Οι στήλες αυτού του είδους περιέχουν πληρωτικό υλικό συνδεδεμένο με μόριο που αντιδρά επιλεκτικά με την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Οι πρωτεΐνες που προσδένονται στη στήλη μπορεί να απελευθερωθούν με μεταβολή του ph ή με πυκνό διάλυμα αλάτων και παραλαμβάνονται σε πολύ καθαρή μορφή. 41

54 Σε κάθε στάδιο του διαχωρισμού πρέπει να απομακρύνονται σταδιακά οι άλλες πρωτεΐνες και να παραμένει το ένζυμο που θέλουμε να απομονώσουμε. Πρέπει δηλαδή να αυξάνει ο λόγος της ενεργότητας του προς διαχωρισμό ενζύμου προς τη συνολική πρωτεΐνη που έχει απομείνει. Στην περίπτωση του ταυτόχρονου διαχωρισμού δύο ενζύμων, θα πρέπει σε κάποιο στάδιο να παραληφθεί επιλεκτικά το ένα ένζυμο, διαχωρισμένο από το άλλο. Οι μεταβλητές που επιτρέπουν την παρακολούθηση της πορείας του διαχωρισμού των ενζυμικών μορίων σε κάθε στάδιο είναι: Ενζυμική δραστικότητα: Μια διεθνής μονάδα (International Unit, IU ή απλά Unit, U) ενζυμικής δραστικότητας αντιστοιχεί στο ποσό ενζύμου που καταλύει τη μετατροπή ενός μmol (ή mmol) του υποστρώματος (ή την παραγωγή ενός μmol (ή mmol προϊόντος) σε ένα λεπτό (ή σε ένα sec) κάτω από καθορισμένες συνθήκες. Η θερμοκρασία, το ph και οι λοιπές συνθήκες, στις οποίες γίνεται η ενζυμική αντίδραση, πρέπει πάντα να ορίζονται. Ειδική ενεργότητα: ο λόγος της ολικής ενεργότητας του ενζύμου (Units) ανά mg συνολικής πρωτεΐνης Απόδοση της ενεργότητας ενζύμου: ο λόγος της ολικής ενεργότητας του εξεταζόμενου σταδίου προς την αντίστοιχη ενεργότητα του ακατέργαστου διηθήματος Εμπλουτισμός ενζύμου: ο λόγος της ειδικής ενεργότητας του εξεταζόμενου σταδίου προς την ειδική ενεργότητα του ακατέργαστου διηθήματος Η μέτρηση της ποσότητας ενός ενζύμου που περιέχεται σε ένα διάλυμα δεν αποτελεί εύκολη υπόθεση, αφού τις περισσότερες φορές αυτό βρίσκεται μαζί με ένα μίγμα άλλων πρωτεϊνών. Με βάση το γεγονός αυτό, η ποσοτικοποίηση του περιεχομένου ενός διαλύματος σε κάποιο ένζυμο γίνεται έμμεσα μέσω της μέτρησης της ενεργότητάς του. Η εξαγωγή ποσοτικών αποτελεσμάτων πραγματοποιείται με σύγκριση της μετρούμενης ενζυμικής ενεργότητας με μια μονάδα μέτρησης, το Unit. Το Unit ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που απελευθερώνει ορισμένη ποσότητα προϊόντος ή καταναλώνει ορισμένη ποσότητα υποστρώματος στη μονάδα του χρόνου κάτω από αυστηρά ελεγχόμενες συνθήκες. Στη συγκεκριμένη άσκηση ως Unit ενζυμικής ενεργότητας ορίζεται η ποσότητα του ενζύμου που απελευθερώνει 1 μmol προϊόντος ανά min, στους 50ºC. 42

55 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα Αναλυτικός ζυγός Πλάκα ανάδευσης Φυγόκεντρος Αναδευτήρας (Vortex) Υδατόλουτρο (50 ºC) Παγόλουτρο Φωτόμετρο Υλικά και Αντιδραστήρια Ποτήρι ζέσεως με εξωκυτταρικό διήθημα ενζύμων 3 σιφώνια του 1 5 και 10 ml Μαγνήτης ανάδευσης Ογκομετρικός κύλινδρος (25 ml) Ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέος 0.02 Μ, ph 4.0 Φούσκα μετάγγισης υγρών (poire) Σωλήνες αραίωσης Διάλυμα o-νιτροφαινυλο β-d-γλυκόζης (p-npg) Διάλυμα Bradford Εκτέλεση 1. Από το εξωκυτταρικό διήθημα των ενζύμων (διάλυμα Α), μετά από σύντομη ανάδευση, μεταγγίζεται ποσότητα 0.1 ml σε ένα σωληνάριο eppendorf, που περιέχει 0.9 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος 0.02 Μ με ph 5.0 (ΔΕΙΓΜΑ 1). 2. Σε σωληνάριο eppendorf, που περιέχει 1 ml από το διάλυμα Α, θα πρέπει να προστεθεί ποσότητα άλατος (NH4)2SO4, έτσι ώστε να οδηγήσει το διήθημα σε κορεσμό 70%. Η ποσότητα του (NH4)2SO4 που απαιτείται, υπολογίζεται από τον Πίνακα κορεσμού ή την αντίστοιχη εξίσωση που περιγράφεται στο θεωρητικό μέρος και ζυγίζεται με τη βοήθεια του αναλυτικού ζυγού. 43

56 3. Η ποσότητα του (NH4)2SO4 που υπολογίσθηκε προστίθεται στο εξωκυτταρικό διήθημα αργά και σταδιακά, με περιοδική ανάδευση και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. 4. Μετά το πέρας της προσθήκης του άλατος, το ενζυμικό διάλυμα φυγοκεντρείται για 10 min σε 5000g. 5. Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης συλλέγεται σε δοκιμαστικό σωλήνα (ΔΕΙΓΜΑ 2) και φυλάσσεται σε θερμοκρασία <4 ο C. 6. Το ίζημα της φυγοκέντρησης αναδιαλύεται με τη σταδιακή προσθήκη 3 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος 0.02 Μ με ph 5.0 (διάλυμα Β) και αναδεύεται σε Vortex. Στη συνέχεια, 0.1 ml του διαλύματος Β αραιώνεται με 0.4 ml ρυθμιστικού διαλύματος σε δοκιμαστικό σωλήνα (ΔΕΙΓΜΑ 3) και φυλάσσεται σε θερμοκρασία <4 ο C. 7. Η στήλη μοριακής διήθησης PD-10 πηκτής Sephadex G-25 εξισορροπείται με ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέος 0.02 Μ με ph 5.0. Για το σκοπό αυτό 2.5 ml από το ρυθμιστικό διάλυμα διαβιβάζονται στη στήλη. 8. Όταν σταματήσει η ροή του ρυθμιστικού διαλύματος από τη στήλη, ποσότητα 2.5 ml του διαλύματος Β διαβιβάζεται στη στήλη PD-10 πηκτής Sephadex G Όταν μετά την εισαγωγή του δείγματος σταματήσει η ροή, η στήλη τοποθετείται πάνω από δοκιμαστικό σωλήνα και προστίθενται 3.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος 0.02 Μ με ph 5.0, ώστε να ξεκινήσει η διαδικασία της έκλουσης. 10. Το υγρό έκλουσης συλλέγεται σε δοκιμαστικό σωλήνα, αραιώνεται 5 φορές (ΔΕΙΓΜΑ 4) και φυλάσσεται σε θερμοκρασία <4 ο C. 11. Στα Δείγματα 1-4 γίνεται προσδιορισμός της ενζυμικής ενεργότητας για το ένζυμο β-γλυκοζιδάση, καθώς και προσδιορισμός πρωτεΐνης, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα αναλύσεων που παρουσιάζονται στο Παράρτημα. 12. Το Δείγμα 4, μετά από κατάλληλη επισήμανση, δίδεται στον υπεύθυνο της άσκησης για φύλαξη υπό κατάψυξη (θα χρησιμοποιηθεί από την ομάδα στην επόμενη εργαστηριακή άσκηση). 44

57 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 1. ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ β-γλυκοζιδασησ Εκτέλεση 1. Το διάλυμα με άγνωστη ενεργότητα ενζύμου αραιώνεται με απιονισμένο νερό (εφόσον απαιτείται). 2. Σε τέσσερις δοκιμαστικούς σωλήνες που τοποθετούνται σε παγόλουτρο, προστίθενται ml ρυθμιστικού διαλύματος oξικών 0.02 M ph 5.0, το οποίο περιέχει pnpg (π-νιτροφαινυλο γλυκόζη) συγκέντρωσης 0.5 mm. 3. Σε κάθε έναν από τους δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθενται από ml του αραιωμένου διαλύματος ενζύμου από κάθε δείγμα. (ΔΕΙΓΜΑ 1-4) 4. Τα βήματα 1 και 2 επαναλαμβάνονται για έναν ακόμη δοκιμαστικό σωλήνα που θα χρησιμοποιηθεί ως λευκό (αντί ενζύμου προστίθενται ml απιονισμένου νερού. 5. Οι σωλήνες αναμειγνύονται σε Vortex και τοποθετούνται σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 50ºC, όπου παραμένουν για 10 min. 6. Αμέσως μετά την πάροδο του προαναφερθέντος χρονικού διαστήματος, οι σωλήνες μεταφέρονται στο παγόλουτρο. 7. Στη συνέχεια, σε καθέναν από τους δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθενται από 0.2ml διαλύματος Na2CO3 30%. 8. Αφού επιλεγεί στο φωτόμετρο το μήκος κύματος στα 410 nm, μηδενίζεται το όργανο χρησιμοποιώντας το λευκό δείγμα. Στη συνέχεια, μετρώνται οι απορροφήσεις για όλους τους δοκιμαστικούς σωλήνες μετά από ανάδευσή τους σε Vortex στο παραπάνω μήκος κύματος. 2. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Σε πολλές βιοτεχνολογικές διεργασίες απαιτείται η γνώση της περιεκτικότητας ενός δείγματος σε πρωτεΐνη. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται διάφορες αναλυτικές μέθοδοι όπως η απορρόφηση στην περιοχή του υπεριώδους (συνήθως σε μήκος κύματος 280 nm) ή άλλες στις οποίες αξιοποιείται η δυνατότητα πρόσδεσης κάποιας χρωστικής ουσίας στο μόριο των πρωτεϊνών. Η μέθοδος Bradford ανήκει στην τελευταία κατηγορία 45

58 και θα χρησιμοποιηθεί στην παρούσα άσκηση για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας των δειγμάτων σε πρωτεΐνη. Η μέθοδος Bradford αναπτύχθηκε το 1976 και είναι αρκετά δημοφιλής λόγω της απλότητας και της ταχύτητας που τη χαρακτηρίζουν. Βασίζεται στην αλληλεπίδραση της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 με βασικά (κυρίως αργινίνη) και αρωματικά αμινοξέα των πρωτεϊνών προς σχηματισμό έγχρωμων συσσωματωμάτων που απορροφούν στα 595 nm. Η πρόσδεση της χρωστικής στην πρωτεΐνη πραγματοποιείται πολύ γρήγορα και είναι σταθερή τουλάχιστον για μία ώρα. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Το διάλυμα με άγνωστη περιεκτικότητα πρωτεΐνης αραιώνεται με απιονισμένο νερό (εφόσον απαιτείται). 2. Σε 4 δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθενται ml διαλύματος Bradford. 3. Σε κάθε έναν από τους δοκιμαστικούς σωλήνες προστίθενται από ml του κάθε διαλύματος πρωτεΐνης (ΔΕΙΓΜΑΤΑ 1-4) υπό ανάδευση. 4. Τα βήματα 1 και 2 επαναλαμβάνονται για έναν ακόμη δοκιμαστικό σωλήνα που θα χρησιμοποιηθεί ως λευκό, αλλά αντί του δείγματος προστίθενται ml απιονισμένου νερού. 5. Οι σωλήνες αναμειγνύονται σε Vortex και αφήνονται σε ηρεμία για 10 min. 6. Αφού επιλεγεί στο φωτόμετρο το μήκος κύματος στα 595 nm, μηδενίζεται το όργανο χρησιμοποιώντας το λευκό δείγμα. Στη συνέχεια, μετρώνται οι απορροφήσεις για όλους τους δοκιμαστικούς σωλήνες, αφού προηγηθεί ανάδευσή τους σε Vortex. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΣΚΗΣΗ 4 1. Θα μπορούσαμε να εφαρμόσουμε την τεχνική της καταβύθισης με (NH4)2SO4 για να διαχωρίσουμε πρωτεΐνες; Πώς θα μπορούσε να γίνει αυτό; 2. Να συμπληρωθεί ο παρακάτω πίνακας (όπου χρειάζεται) για τα υδρολυτικά ένζυμα (β-γλυκοζιδάση και κυτταρινάσες) μετά τον μερικό καθαρισμό τους Δίνεται η καμπύλη αναφοράς της p-νιτροφαινόλης: C=1.23*A410 όπου C=συγκέντρωση νιτροφαινόλης (mm) στο μίγμα της ενζυμικής αντίδρασης (πριν την προσθήκη του Na2CO3 ) και A410=απορρόφηση δείγματος στα 410 nm. 46

59 Δίνεται η καμπύλη αναφοράς της πρωτεΐνης: C=0.36* A595, όπου C=συγκέντρωση πρωτεΐνης (mg/ml) στο δείγμα (πριν την προσθήκη του δ/τος Bradford) και A595=απορρόφηση του δείγματος στα 595 nm.. Στάδιο Ακατέργαστο ΔΙΗΘΗΜΑ (ΔΕΙΓΜΑ 1) Καταβύθιση 90% ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΟ (ΔΕΙΓΜΑ 2) Ολικό Ολική Συνολική Ειδική Απόδοση Εμπλου- όγκος ενεργότητα ς πρωτεΐνη ενεργότητα ενεργότητας τισμός (ml) (Units) (mg) (U/mg (%) ενζύμου τα πρωτ.) καταβύθιση 90% ΙΖΗΜΑ (ΔΕΙΓΜΑ 3) Χρωματογραφία μοριακής διήθησης (ΔΕΙΓΜΑ 4) 3. Που οφείλεται η έλξη των υδρόφοβων περιοχών των πρωτεϊνών που έχει ως συνέπεια τη συσσωμάτωσή τους; 4. Αν είναι γνωστό το ισοηλεκτρικό σημείο των πρωτεϊνών, η καταβύθιση θα πρέπει να γίνεται σε ph μικρότερο, μεγαλύτερο ή ίσο του ισοηλεκτρικού σημείου; 5. Ποιος ο ρόλος του προστιθέμενου διαλύματος Na2CO3 στη διαδικασία προσδιορισμού της ενζυμικής δραστικότητας; 6. Ποια είναι τα βασικά πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της μέτρησης της πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford; Ποια η ευαισθησία (χαμηλότερη συγκέντρωση στην οποία μπορεί να προσδιοριστεί η πρωτεΐνη) της μεθόδου Bradford; Πώς συγκρίνεται με την ευαισθησία άλλων μεθόδων προσδιορισμού της πρωτεΐνης; Για την απάντηση ανατρέψτε σε πηγές στο διαδίκτυο 47

60 7. Γιατί μετά την καταβύθιση με (NH4)2SO4 και πριν από τη χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων είναι απαραίτητη η χρωματογραφία μοριακής διήθησης; 8. Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης έδειξαν ότι σε ένα πρωτεϊνικό διάλυμα υπάρχουν δύο πρωτεΐνες με μοριακό βάρος ΜΒ1= και ΜΒ2= Να αναφέρετε τη χρωματογραφική μέθοδο, καθώς και το χρωματογραφικό υλικό που θα χρησιμοποιούσατε για το διαχωρισμό τους. 9. Για τον καθαρισμό ενζύμου που έχει ισοηλεκτρικό σημείο ίσο με 6.0 χρησιμοποιείται στήλη DEAE Trisacryl Weak Anion Exchange της Pharmacia. Το ένζυμο απενεργοποιείται σε ph εκτός της περιοχής Ποιο θα πρέπει να είναι το ph της κινητής (υγρής) φάσης, έτσι ώστε το ένζυμο να προσδεθεί στη ρητίνη; Ποιο συγκεκριμένο είδος ρυθμιστικού διαλύματος θα χρησιμοποιήσετε; Δικαιολογείστε την απάντησή σας με βάση τη βιβλιογραφία. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ -Protein Purification Methods A Practical Approach (1989). E. Harris & S. Angal, IRL at Oxford University Press, Slough, UK -Handbook of Enzyme Biotechnology (1985). A. Wiseman, 2 nd edition, Ellis Horwood Limited -Biotechnology (1993). G. Stephanopoulos, 2 nd edition, VCH Publishers.Weinheim -Biochemistry (1988). Streyer L., 3 rd edition, editors W. Freeman and Co, New York -Biotechnology: Proteins to PCR (1995). D. Burden & D. Whitney, Birkhauser, Boston -Enzyme purification by salt (ammonium sulfate) precipitation (1998). Nam Sun Wang, Department of Chemical Engineering, University of Maryland -Βιοτεχνολογία (2000). Δ. Κυριακίδη, Εκδόσεις Ζήτη. Θεσσαλονίκη -Ασκήσεις Ενζυμολογίας (2000). Δ. Κυριακίδη, Εκδόσεις Ζήτη. Θεσσαλονίκη -Ενζυμική Βιοτεχνολογία (1997). I. Κλώνης, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο -Bradford, M. (1976).. Analytical Chemistry, 72, Biotechnology A laboratory course (1996). J. Becker, G. Caldwell, E. Zachgo, 2nd edition, Academic Press, San Diego -Enzyme Assays: A Practical Approach (1991). R. Eisenthal & M. Danson, IRL at Oxford 48

61 University Press, Bath, UK 49

62 ΑΣΚΗΣΗ 5 η ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ME ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ PROTEIN LAB Α. Πολύδερα Χ. Σταμάτης Το σενάριο Εργάζεστε σε ένα ερευνητικό εργαστήριο και σας έχει δοθεί ως αντικείμενο η απομόνωση και o καθαρισμός ενός ή περισσοτέρων ενζύμων με έναν όσο το δυνατόν ποιο οικονομικό τρόπο. Σας έχει διατεθεί όλος ο απαραίτητος εξοπλισμός και τα υλικά που είναι πιθανό να χρειαστείτε. Πρέπει να πάρετε όλες τις αποφάσεις και να κατασκευάσετε ένα πρωτόκολλο καθαρισμού. Στρατηγική Οποιοδήποτε κύτταρο, είτε προκαρυωτικό είτε ευκαρυωτικό, περιέχει δεκάδες χιλιάδων διαφορετικές πρωτεΐνες με ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων. Ο καθαρισμός των μεμονωμένων πρωτεϊνών είναι επομένως θεμελιώδους σημασίας σε οποιαδήποτε λεπτομερή βιολογική ανάλυση της δομής και της λειτουργίας των βιομορίων. Δεν υπάρχει μια καθορισμένη και καθολική διαδικασία με την οποία οποιαδήποτε πρωτεΐνη μπορεί να απομονωθεί σε καθαρή μορφή, αλλά ένα σύνολο διαδικασιών σκοπός των οποίων είναι να διακρίνουν την πρωτεΐνη στόχο μέσα από ένα σύνολο πρωτεϊνών με βάση τη διαφοροποίηση σε συγκεκριμένα δομικά ή λειτουργικά χαρακτηριστικά της. Με τη σωστή επιλογή των κατάλληλων διαδικασιών και τεχνικών και την εφαρμογή αυτών σε ένα σωστά δομημένο πρωτόκολλο καθαρισμού, είναι δυνατό να επιτευχθεί ένας υψηλός βαθμός καθαρισμού της πρωτεΐνης-στόχου σε μια οικονομικά αποδεκτή διαδικασία. Όπως αναφέρθηκε, δεν υπάρχει κάποιο τυποποιημένο πρωτόκολλο επίτευξης βέλτιστου καθαρισμού πρωτεϊνών. Λόγω των δομικών και λειτουργικών διαφορών μεταξύ των πρωτεϊνών, μια ιδανική σειρά σταδίων καθαρισμού για μια πρωτεΐνη δεν θα είναι το ίδιο αποτελεσματική για μια άλλη. Η γνώση της θεωρητικής βάσης κάθε διαδικασίας επιτρέπει στον ερευνητή να επιλέξει μια αρχική ακολουθία τεχνικών με την οποία να προσπαθήσει να επιτύχει το στόχο του. Εντούτοις, η ανάπτυξη ενός βελτιστοποιημένου πρωτοκόλλου βασίζεται στο δίπτυχο δοκιμή/λάθος, ώστε να αξιολογηθεί σωστά η δυνατότητα κάθε βήματος. 50

63 Ανεξάρτητα από το σχέδιο καθαρισμού που υιοθετείται, είναι ουσιαστικό να συνειδητοποιηθεί ότι οι περισσότερες πρωτεΐνες είναι αρκετά εύθραυστα μόρια. Έκθεση ακόμη και στις μέτριες θερμοκρασίες (π.χ. 37 C) προκαλεί την αργή μετουσίωσή τους γεγονός που σημαίνει ότι όλα τα βήματα καθαρισμού πρέπει να πραγματοποιηθούν σε χαμηλή θερμοκρασία (0-4 C), εκτός αν διευκρινίζεται αλλιώς. Οι πρωτεΐνες εμφανίζουν επίσης ευαισθησία σε ακραίες τιμές ph. Έτσι, οι διαδικασίες καθαρισμού πραγματοποιούνται πάντα σε ρυθμιστικά διαλύματα τέτοια, ώστε να αποφεύγονται οι ακραίες τιμές ph. Τέλος, δεδομένου ότι πολλές πρωτεΐνες είναι ασταθέστερες σε αραιότερα διαλύματα, θα πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε η πρωτεϊνική συγκέντρωση κατά τη διαδικασία καθαρισμού να μην πέσει σε πολύ χαμηλό επίπεδο. Απομόνωση της πρωτεΐνης σε διαλυτή μορφή Η αφετηρία για τον πρωτεϊνικό καθαρισμό είναι συνήθως κύτταρα μικροβιακά, φυτικά ή ζωικά (αν και αυτό το πρόγραμμα προσομοιάζει τον καθαρισμό των πρωτεϊνών σε διάλυμα δηλ. μετά τη λύση των κυττάρων). Πρωταρχικός στόχος είναι να απελευθερωθεί η πρωτεΐνη από τα κύτταρα χωρίς πρόκληση της απώλειας της βιολογικής δραστικότητάς της. Μια ευρέως διαδεδομένη ήπια διαδικασία για την απελευθέρωση των πρωτεϊνών από τα ζωικά κύτταρα είναι η ομογενοποίηση. Η λύση των κυττάρων των βακτηρίων, των ζυμών και των φυτικών κυττάρων απαιτεί τη χρήση ισχυρότερων μέσων, όπως η εφαρμογή υπερήχων, υψηλής πίεσης κ.ά. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της ομογενοποίησης, εάν μπορεί να χρησιμοποιηθεί, είναι ότι διατηρείται η ακεραιότητα των περισσότερων ενδοκυτταρικών οργανιδίων. Κατά συνέπεια, αν η πρωτεΐνη στόχος εντοπίζεται σε κάποιο συγκεκριμένο οργανίδιο (πυρήνας, μιτοχόνδρια κλπ), η απομόνωση της πρωτεΐνης επιτυγχάνεται μετά το διαχωρισμό αυτών των ενδοκυτταρικών οργανιδίων. Μια συνήθης τεχνική για το διαχωρισμό των σωματιδίων είναι η φυγόκεντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας και η διαφορική φυγοκέντρηση (differential centrifugation). Εάν η πρωτεΐνη στόχος εντοπίζεται σε διαλυτή μορφή στο εσωτερικό των απομονωμένων σωματιδίων, μπορεί να απομονωθεί μετά τη διάρρηξη των σωματιδίων είτε με την εφαρμογή υπερήχων, είτε με τη χρήση μη ιοντικών επιφανειοενεργών, όπως το Triton X-100. Εάν η πρωτεΐνη είναι άμεσα συνδεδεμένη της μεμβράνης του οργανιδίου ή του κυττάρου, τότε η απελευθέρωσή της μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση επιφανειοενεργών (απορρυπαντικών). 51

64 Η επιλογή των μεθόδων καθαρισμού Υπάρχουν πολυάριθμες πρωτεϊνικές διαδικασίες καθαρισμού διαθέσιμες, μερικές από τις οποίες χρησιμοποιούνται συχνότερα από άλλες. Το βέλτιστο πρωτόκολλο καθαρισμού για μια πρωτεΐνη εξαρτάται κυρίως από τις δομικές και λειτουργικές ιδιότητες της επιθυμητής πρωτεΐνης, καθώς και από τη φύση των παραγόντων (π.χ. άλλες πρωτεΐνες) που συνυπάρχουν στο διάλυμα της πρωτεΐνης στόχου. Στη συνέχεια, θα δούμε ορισμένες βασικές οδηγίες για τη δημιουργία ενός αποτελεσματικού πρωτοκόλλου καθαρισμού. Θα πρέπει βέβαια να σημειώσουμε ότι, σε κάθε περίπτωση, η αποτελεσματικότητα των μεθόδων βασίζεται στο δίπτυχο δοκιμή / λάθος. (α) Τα πρόωρα βήματα σε ένα πρωτόκολλο καθαρισμού είναι συνήθως εκείνα που έχουν τη χαμηλότερη διαχωριστική ικανότητα και βασίζονται σε τεχνικές, όπως η καταβύθιση με θειικό αμμώνιο, ή με βάση την επιλεκτική μετουσίωση των πρωτεϊνών με θερμική επεξεργασία. Αυτές οι τεχνικές χαρακτηρίζονται από το πλεονέκτημα ότι μειώνουν σε σημαντικό βαθμό τη συνολική ποσότητα της πρωτεΐνης στο δείγμα, έτσι ώστε οι χρωματογραφικές τεχνικές που ακολουθούν να μπορούν να εφαρμοστούν ευκολότερα. Σε αντίθεση με τα παραπάνω, οι τεχνικές πολύ υψηλής ευκρίνειας, αλλά με δυνατότητα εφαρμογής μόνο σε μικρή κλίμακα, όπως η ισοηλεκτρική εστίαση, εφαρμόζονται μόνο στα τελικά στάδια καθαρισμού, όταν η συνολική ποσότητα της πρωτεΐνης είναι σχετικά μικρή και οι προσμίξεις βρίσκονται στο διάλυμα σε αρκετά χαμηλή συγκέντρωση. (β) Είναι σημαντικά αποδοτικότερο να επιλεγεί μια σειρά μεθόδων που βασίζονται σε διαφορετικές φυσικές ή λειτουργικές ιδιότητες των πρωτεϊνών, παρά μια σειρά βημάτων (τεχνικών) που εκμεταλλεύονται την ίδια ιδιότητα. Κατά συνέπεια, τα πρωτόκολλα καθαρισμού που περιλαμβάνουν τη χρωματογραφία στηλών, περιλαμβάνουν συνήθως τουλάχιστον μια χρωματογραφία πηκτής μοριακού ηθμού (gel filtration), όπου ο διαχωρισμός γίνεται με βάση τη διαφορά στο μέγεθος των πρωτεϊνών και τουλάχιστον μια χρωματογραφία ιονανταλλαγής (ion-exchange chromatography), όπου ο διαχωρισμός γίνεται με βάση τη διαφορά στο φορτίο των πρωτεϊνών. (γ) Κατά τη διάρκεια της χρωματογραφίας συχνά αποτελεί κοινή πρακτική η «θυσία» μιας ποσότητας της πρωτεΐνης-στόχου, με σκοπό την αύξηση της καθαρότητάς της στο τελικό σκεύασμα. Με άλλα λόγια, αποφεύγουμε να ανακτήσουμε και το τελευταίο μικρογραμμάριο της επιθυμητής πρωτεΐνης, εάν αυτό σημαίνει ότι θα συμπεριληφθούν και κλάσματα τα οποία είναι εμπλουτισμένα με ανεπιθύμητες προσμίξεις. Τα κλάσματα που 52

65 συγκεντρώνονται μετά από μια χρωματογραφία και τα οποία θα ενωθούν για να χρησιμοποιηθούν για το επόμενο βήμα καθαρισμού, πρέπει να επιλεγούν βάσει της υψηλότερης καθαρότητας στα πλαίσια μιας ικανοποιητικής απόδοσης. (δ) Μερικές τεχνικές διαχωρισμού, όπως η SDS ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, η ισοηλεκτρική εστίαση και η δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση, δεν χρησιμοποιούνται ως παρασκευαστικές τεχνικές για τον πρωτεϊνικό καθαρισμό, αλλά κυρίως για τον έλεγχο της προόδου του καθαρισμού. Οι τεχνικές αυτές θεωρούνται ως υψηλής ευκρίνειας αναλυτικές τεχνικές. (Εντούτοις, συχνά σήμερα για ερευνητικούς λόγους είναι αρκετό να καθαριστούν μόνο μερικά μικρογραμμάρια της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει, οπότε οι τεχνικές αυτές μπορούν να εφαρμοστούν για την απομόνωση μιας μικρής ποσότητας πρωτεΐνης). (ε) Σημαντικό στοιχείο που θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά τη δημιουργία ενός πρωτοκόλλου καθαρισμού είναι το κόστος. Τόσο τα υλικά που θα χρησιμοποιηθούν, όσο και ο χρόνος προσωπικού που απαιτείται, θα πρέπει να ληφθούν υπόψη. Μερικές τεχνικές είναι σχετικά φτηνές και γρήγορες, όπως η κλασμάτωση με θειικό αμμώνιο ή με θερμική επεξεργασία, ενώ άλλες τείνουν να είναι υψηλού κόστους και χρονοβόρες. Ιδιαίτερα υψηλού κόστους είναι εκείνες οι τεχνικές που χρησιμοποιούν αμφολύτες, όπως η παρασκευαστική ισοηλεκτρική εστίαση. Επομένως, ενώ διάφορες τεχνικές φαίνονται εκ πρώτης όψεως να είναι πολύ ελκυστικές ως προς τη δυνατότητα διαχωρισμού, τα πλεονεκτήματα τείνουν να αντισταθμιστούν από το κόστος τους, όταν εφαρμόζονται σε μεγάλου όγκου δείγματα. Συχνά, εξίσου ικανοποιητικά αποτελέσματα μπορούν να επιτευχθούν μέσω του συνδυασμού διαφόρων λιγότερο ακριβών τεχνικών. Έλεγχος του καθαρισμού Κάθε διαδικασία καθαρισμού υποδιαιρεί το πρωτεϊνικό μίγμα σε διάφορα κλάσματα, εκ των οποίων ένα ή περισσότερα περιέχουν την πρωτεΐνη-στόχο, ενώ άλλα κλάσματα περιέχουν άλλες πρωτεΐνες. Προφανώς, χρειάζεται μια συγκεκριμένη τεχνική, η οποία θα πρέπει να είναι σε θέση να ανιχνεύσει και να ποσοτικοποιήσει την πρωτεΐνηστόχο. Εάν αυτή η πρωτεΐνη είναι ένα ένζυμο, τότε απαιτείται μια συγκεκριμένη και ευαίσθητη δοκιμή (assay) για τον προσδιορισμό της καταλυτικής δραστικότητας. Εάν η πρωτεΐνη δεν είναι ένζυμο, τότε άλλες εξειδικευμένες τεχνικές απαιτούνται, που 53

66 βασίζονται στις επιμέρους ιδιότητες και χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών. Στο λογισμικό προσομοίωσης που θα χρησιμοποιηθεί, θεωρείται ότι η πρωτεΐνη που καθαρίζεται είναι ένα ένζυμο. Εκτός από τη μέτρηση της ποσότητας της πρωτεΐνης-στόχου σε όλα τα κλάσματα σε κάθε στάδιο του καθαρισμού, είναι επίσης απαραίτητο να προσδιοριστεί και η συνολική ποσότητα των πρωτεϊνών που βρίσκονται στα κλάσματα αυτά. Αυτές οι πληροφορίες είναι αναγκαίες, όχι μόνο για να βοηθήσουν στην απόφαση ως προς τα κλάσματα που πρέπει να συγκεντρωθούν για τα επόμενα στάδια καθαρισμού, αλλά παράλληλα επιτρέπουν στον ερευνητή να προσδιορίσει το βαθμό καθαρισμού σε κάθε στάδιο, έτσι ώστε να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα κάθε διαδικασίας που εφαρμόζεται. Ποσοτικοποίηση της συνολικής πρωτεΐνης Δύο προσεγγίσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το σκοπό αυτό. Η πρώτη βασίζεται στη μέτρηση της απορρόφησης στα 280 nm. Η μέτρηση αυτή μπορεί να γίνει σε συνεχή ροή με την κατάλληλη πειραματική διάταξη, η οποία, για παράδειγμα, μπορεί να προσδιορίζει και να καταγράφει συνεχώς τη συνολική ποσότητα πρωτεΐνης, καθώς αυτή εξέρχεται από μια χρωματογραφική στήλη. Η δεύτερη προσέγγιση αφορά στον προσδιορισμό της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης σε κάθε επιμέρους κλάσμα, με βάση μια συγκεκριμένη φωτομετρική δοκιμασία, όπως η μέθοδος κατά Lowry ή η μέθοδος κατά Bradford. Προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας Η ποσότητα του ενζύμου σε κάθε επιμέρους κλάσμα μπορεί να καθοριστεί ακριβώς με τη μέτρηση της καταλυτικής δραστικότητάς του, δηλ. του ποσού υποστρώματος που καταναλώνεται ή του προϊόντος που παράγεται στη μονάδα του χρόνου. Στην ιδανική περίπτωση, ο προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας πρέπει να επιτελεστεί σε ένα μίγμα αντίδρασης, όπου το ph είναι βέλτιστο για το συγκεκριμένο ένζυμο και όπου οποιοσδήποτε αναγκαίος συμπαράγοντας ή συνένζυμο εμπεριέχονται στο μίγμα αυτό. Παράλληλα, η συγκέντρωση του υποστρώματος θα πρέπει να είναι τέτοια, ώστε να εξασφαλιστεί ο κορεσμός του ενζύμου. Στις συνθήκες αυτές, η αρχική ταχύτητα της 54

67 αντίδρασης είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ενζύμου που βρίσκεται στο μίγμα της αντίδρασης. Προκειμένου να ελεγχθεί η ταχύτητα της αντίδρασης, είναι αναγκαία μια απλή, και εξειδικευμένη αναλυτική μέθοδος για τον προσδιορισμό της κατανάλωσης του υποστρώματος ή του σχηματισμού των προϊόντων. Πιο ακριβής μέθοδος συχνά θεωρείται αυτή που βασίζεται στον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του προϊόντος, παρά της συγκέντρωσης του υποστρώματος, καθώς το υπόστρωμα πρέπει συνήθως να είναι παρόν στο μίγμα της αντίδρασης σε αρκετά υψηλή συγκέντρωση ώστε να εξασφαλιστεί ο κορεσμός του ενζύμου. Η απλούστερη μέθοδος είναι αυτή στην οποία το υπόστρωμα ή το προϊόν απορροφά το φως ενός συγκεκριμένου μήκους κύματος και έτσι η μεταβολή της συγκέντρωσής τους μπορεί να προσδιοριστεί με μέτρηση της απορρόφησης σε εκείνο το μήκος κύματος χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο. Στην περίπτωση όπου το υπόστρωμα ή προϊόν δεν μπορεί να προσδιοριστεί φασματοφωτομετρικά, ο προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας μπορεί να επιτευχθεί μέσω της σύζευξης της αντίδρασης με μια άλλη αντίδραση, η οποία οδηγεί στο σχηματισμό ενός προϊόντος που απορροφά το φως και μπορεί έτσι να μετρηθεί (συζευγμένος προσδιορισμός). Πολλές άλλες μέθοδοι ενζυμικής δοκιμής υπάρχουν, πέρα από αυτές που βασίζονται σε φασματοφωτομετρικούς προσδιορισμούς. Εντούτοις, σε όλες τις μεθόδους οι αρχές του προσδιορισμού της ενζυμικής δραστικότητας είναι οι ίδιες. Ειδική δραστικότητα, εμπλουτισμός και απόδοση Η ενζυμική δραστικότητα είναι ένα μέτρο μόνο του ποσού του ενζύμου που είναι παρόν σε ένα κλάσμα και βέβαια δεν εμπεριέχει πληροφορίες για την παρουσία άλλων πρωτεϊνών. Αντίθετα, η ειδική δραστικότητα μας δίνει τέτοιες πληροφορίες. Με τον όρο ειδική δραστικότητα, αναφερόμαστε στις μονάδες ενζυμικής δραστικότητας ανά mg πρωτεΐνης. Για τα καθαρά ένζυμα, αρκεί να προσδιοριστεί η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης, καθώς και το ποσό της πρωτεΐνης (δηλαδή του ενζύμου) που προκαλεί την αντίδραση. Στα μη καθαρά ενζυμικά παρασκευάσματα, όπως εκχυλίσματα σε διάφορα στάδια καθαρισμού, προσδιορίζεται η ειδική δραστικότητα του ενζυμικού παρασκευάσματος. Η ειδική δραστικότητα του ενζύμου-στόχου αναμένεται να είναι χαμηλή στα αρχικά στάδια καθαρισμού και αναμένεται να αυξάνεται καθώς ο καθαρισμός προχωρά. 55

68 Για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας ενός ενζυμικού καθαρισμού, δεν έχει μεγάλη σημασία η απόλυτη τιμή της ειδικής δραστικότητας, αλλά πως η ειδική δραστικότητα μεταβάλλεται κατά την πορεία καθαρισμού. Ο βαθμός εμπλουτισμού του ενζύμου που επιτυγχάνεται σε οποιοδήποτε στάδιο καθαρισμού μπορεί να υπολογιστεί ως εξής: Εμπλουτισμός =ειδική δραστικότητα του κλάσματος/ αρχική ειδική δραστικότητα Ένα επιτυχές βήμα καθαρισμού πρέπει όχι μόνο να οδηγεί σε αύξηση της ειδικής δραστικότητας του ενζύμου, αλλά θα πρέπει να εξασφαλίζει και την υψηλή απόδοση, δηλ. την ανάκτηση ικανής ποσότητας του ενζύμου. Η απόδοση μπορεί να υπολογιστεί ως εξής: μονάδες ενζυμικής δραστικότητας μετά από κάθε στάδιο Απόδοση = x 100% μονάδες ενζυμικής δραστικότητας στο αρχικό παρασκεύασμα Σημειώστε ότι, η απόδοση του ενζύμου μετά από μια ιδιαίτερη διαδικασία καθαρισμού μπορεί να είναι χαμηλή, όχι επειδή η διαδικασία αποτυγχάνει να οδηγήσει στον καθαρισμό της συγκεκριμένης πρωτεΐνης, αλλά επειδή προκαλεί μερική αδρανοποίηση του ενζύμου. Αξιολόγηση της καθαρότητας του πρωτεϊνικού παρασκευάσματος Υπάρχουν σχετικά απλές αναλυτικές τεχνικές, οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να παρέχουν μια καλή ένδειξη του βαθμού καθαρότητας του πρωτεϊνικού παρασκευάσματος. Μια τέτοια τεχνική είναι η ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, η οποία είναι γρήγορη και υψηλής ευκρίνειας και διαχωρίζει τα πολυπεπτίδια με βάση το μέγεθος. Μια άλλη τεχνική είναι αυτή του ισοηλεκτρικού εστιασμού, η οποία βασίζεται στο διαχωρισμό με βάση τη διαφορά στο φορτίο. Στην ιδανική περίπτωση, ο έλεγχος της καθαρότητας γίνεται με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση, όπου ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών γίνεται τόσο με βάση τη διαφορά στο μέγεθος, όσο και με βάση τη διαφορά στο φορτίο. 56

69 Κόστος τεχνικών Το ενδεικτικό κόστος σε ανθρωποώρες κάθε διαδικασίας είναι ως ακολούθως: Αραίωση κλασμάτων 1.0 Θερμική επεξεργασία 1.0 Προσδιορισμός ενζυμικής δραστικότητας 2.0 Κλασμάτωση με θειϊκό αμμώνιο 2.0 Ηλεκτροφόρηση SDS PAGE 3.0 Δισδιάστατη SDS PAGE 5.0 Χρωματογραφία μοριακού ηθμού 5.0 Χρωματογραφία ιονανταλλαγής 5.0 Χρωμ/ια υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων 5.0 Ισοηλεκτρική εστίαση 25.0 Χρωματογραφία συγγένειας 25.0 Στάδια προσομοίωσης ξεκινήστε την προσομοίωση από το επιλέξτε το begin (start from the beginning), στην ερώτηση start from stored material απαντήστε όχι δώστε έναν αριθμό για την πρωτεΐνη (από 1-20), όπως θα σας υποδειχτεί από τον διδάσκοντα στο παράθυρο εμφανίζονται ορισμένες χαρακτηριστικές ιδιότητες της πρωτεΐνης, οι οποίες θα πρέπει να ληφθούν υπόψη για την επιλογή των τεχνικών και μεθόδων καθαρισμού που θα χρησιμοποιηθούν Με την εντολή separation από το main menu μπορείτε να επιλέξετε μια από τις τεχνικές καθαρισμού για να ξεκινήσει η προσομοίωση. ΠΡΟΣΟΧΗ: ΟΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΟΥ ΜΠΟΡΕΙΤΕ ΝΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΣΕΤΕ ΣΤΑ ΠΛΑΙΣΙΑ ΤΗΣ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗΣ ΑΥΤΗΣ ΕΙΝΑΙ ΟΛΕΣ ΟΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΚΑΤΑΒΥΘΙΣΗΣ, Η ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΔΙΗΘΗΣΗΣ, ΙΟΝΑΝΤAΛΛΑΓΗΣ, ΥΔΡΟΦΟΒΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΚΑΙ Η ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ SDS ΜΕ ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΑ ΧΡΩΣΗΣ ΜΕ COOMASIE BLUE 57

70 Σε κάθε στάδιο εμφανίζεται νέος πίνακας, ο οποίος μας πληροφορεί για τη δραστικότητα και την ολική συγκέντρωση της πρωτεΐνης σε κάθε κλάσμα. Σε κάθε βήμα μπορείτε να λάβετε πληροφορίες για τη μέθοδο επιλέγοντας το Info Σταδιακά προχωρήστε σε χρωματογραφικές τεχνικές. Στις τεχνικές αυτές θα λάβετε διάγραμμα, το οποίο θα παριστάνει την ολική συγκέντρωση πρωτεϊνών σε κάθε κλάσμα. Από την επιλογή Fraction και το assay enzyme activity μπορείτε να προσδιορίσετε την ενζυμική δραστικότητα σε κάθε κλάσμα. Παράλληλα, με την εντολή pool (από την επιλογή Fraction) μπορείτε να συμπυκνώσετε τα δείγματα που επιδεικνύουν δραστικότητα και να τα υποβάλετε σε περαιτέρω καθαρισμό ή σε ηλεκτροφόρηση για να ελέγξετε την αποτελεσματικότητα καθαρισμού. Κατά την ηλεκτροφόρηση μπορείτε να δείτε, με δυνατότητα χρώσης (coomasie blue), τις «μπάντες» που αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες διαφορετικού μοριακού βάρους που βρίσκονται στο δείγμα σας. Σε κάθε βήμα μπορείτε να δείτε την πορεία του καθαρισμού από το Help menu και το progress report Περιγράψτε το πρωτόκολλο καθαρισμού που σχεδιάσατε και σχολιάστε τις επιλογές σας. Δώστε σε πίνακα στοιχεία που αφορούν στην απόδοση, τη δραστικότητα, την ειδική δραστικότητα κάθε σταδίου. Οι φοιτητές που έχουν υπολογιστή στα 64 bit και δεν μπορούν να εγκαταστήσουν το λογισμικό για την άσκηση 5 μπορούν να εργαστούν με την on line εκδοχή του προγράμματος PRORLAB που βρίσκεται στην ιστοσελίδα Εκεί θα επιλέξουν το START START FROM BEGINNING Example Mixture και στη συνέχεια θα επιλέξουν μια περίπτωση σύμφωνα με την υπόδειξη του καθηγητή για να εργαστούν σύμφωνα με τις οδηγίες του εργαστηριακού οδηγού. 58

71 59

72 ΑΣΚΗΣΗ 6 η ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ: ΒΙΟΚΑΤΑΛΥΟΜΕΝΗ ΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΝΟΥΧΩΝ ΣΤΕΡΕΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ Μ. Καλογερής, Α. Πολύδερα, Χ. Σταμάτης ΣΚΟΠΟΣ Στο τέλος της άσκησης οι φοιτητές θα γνωρίζουν τον τρόπο εφαρμογής και παρακολούθησης μιας βιοκαταλυτικής διεργασίας, όπως είναι η ενζυμική υδρόλυση λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων, με στόχο την αποικοδόμηση στερεών αποβλήτων και αγροτικών ή δασικών παραπροϊόντων. ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Με τη βοήθεια κυτταρινολυτικών ενζύμων πραγματοποιείται υδρόλυση στερεών υποστρωμάτων (π.χ. κυτταρίνη, χαρτί εφημερίδας) που περιέχουν φυσικούς πολυσακχαρίτες. Ο βαθμός υδρόλυσης των υποστρωμάτων παρακολουθείται με μέτρηση της γλυκόζης και των άλλων αναγωγικών σακχάρων που απελευθερώνονται.. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η προστασία του περιβάλλοντος σχετίζεται άμεσα με την αξιοποίηση ανανεώσιμων πηγών ενέργειας, όπως η φυτική βιομάζα, και την ανακύκλωση των οικιακών και βιομηχανικών αποβλήτων, τα οποία περιέχουν σε σημαντικό ποσοστό χαρτί. Η φυτική βιομάζα αποτελεί άφθονη, φθηνή και ανανεώσιμη πηγή ενέργειας. Η χρησιμοποίησή της συνιστά έναν αποτελεσματικό τρόπο αύξησης των ενεργειακών αποθεμάτων, ενώ παράλληλα μπορεί να επιλύσει προβλήματα που σχετίζονται με την επιβάρυνση του περιβάλλοντος από διάφορα αγροτικά ή δασικά παραπροϊόντα. Το χαρτί έχει πολύ διαδεδομένη χρήση με αποτέλεσμα να αποτελεί ένα σημαντικό ποσοστό των απορριμμάτων. Παρότι τα τελευταία χρόνια εντείνονται οι προσπάθειες για την ανακύκλωσή του, ένα μικρό μόνο ποσοστό από τον συνολικό απορριπτόμενο όγκο 60

73 ανακυκλώνεται. Το μεγαλύτερο μέρος παραμένει ανεκμετάλλευτο ή καίγεται, γεγονός που επιβαρύνει επιπρόσθετα το περιβάλλον. Συστατικά λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων Η πρώτη ύλη για την παραγωγή χαρτιού είναι το ξύλο, που αποτελεί τυπική φυτική βιομάζα. Όπως κάθε λιγνινοκυτταρινούχο υπόστρωμα, το ξύλο αποτελείται από κυτταρίνη (40%), καθώς και από ημικυτταρίνη (33%) και λιγνίνη (23%). Η κυτταρίνη είναι ο πιο διαδεδομένος δομικός πολυσακχαρίτης και η ετήσια παραγωγή της στη βιόσφαιρα ανέρχεται σε ένα τρισεκατομμύριο τόνους. Είναι πολυμερές μεγάλου μοριακού βάρους που αποτελείται από μονάδες D-γλυκόζης ενωμένες με β-1,4- γλυκοζιτικούς δεσμούς. Ο βαθμός πολυμερισμού της κυτταρίνης κυμαίνεται από 500 έως 10000, με αποτέλεσμα το μοριακό βάρος της να ξεκινά από και να υπερβαίνει το ένα εκατομμύριο. Η κυτταρίνη αποτελείται από μεγάλες γραμμικές αλυσίδες, οι οποίες τοποθετούνται παράλληλα σχηματίζοντας δέσμες (ινίδια) και συνδέονται μεταξύ τους με δεσμούς υδρογόνου. HO C4 H CH 2 OH H O OH H H OH H C1 OH HO H H OH C1 H O C4 H CH 2OH H O Σχήμα 1. Μόριο κελλοβιόζης: δομική μονάδα της κυτταρίνης Τα μόρια της κυτταρίνης διακλαδίζονται με τα μόρια της ημικυτταρίνης, τα οποία είναι πολυσακχαρίτες που αποτελούνται από μονάδες D-σακχάρων. Σε αντίθεση με την κυτταρίνη, οι μοριακές αλυσίδες της ημικυτταρίνης αποτελούνται από διάφορα δομικά σάκχαρα, έχουν μικρότερο μήκος και χαρακτηρίζονται από διακλαδώσεις της κεντρικής αλυσίδας. Οι περισσότερες ημικυτταρίνες δε βρίσκονται με τη μορφή ομοπολυσακχαριτών, αλλά ετεροπολυσακχαριτών, που περιέχουν διαφορετικού τύπου σάκχαρα στην κύρια αλυσίδα και την πλάγια αλυσίδα ή τις διακλαδώσεις. Η πλήρης υδρόλυση των ημικυτταρινών δίνει πεντόζες, όπως D-ξυλόζη, L-αραβινόζη, εξόζες, όπως D-μαννόζη, D-γλυκόζη, D-γαλακτόζη 61

74 ουρονικά οξέα, όπως D-γλυκουρονικό οξύ, D-4-Ο-μεθυλ-γλυκουρονικό οξύ, D-γαλακτουρονικό οξύ πιο σπάνια δεοξυ εξόζες, όπως L-ραμνόζη και L-φουκόζη Ο-ακετυλομάδες και εστέρες του φερουλικού και κουμαρικού οξέος Η λιγνίνη είναι πολυμερές που σχηματίζει σύμπλοκα με την κυτταρίνη και την ημικυτταρίνη και θεωρείται υπεύθυνη για τη δομική συνοχή του φυτικού ιστού. Οι ισχυροί δεσμοί της λιγνίνης με την ημικυτταρίνη αποτελούν τον κύριο παρεμποδιστικό παράγοντα στην απομόνωσή της. Η λιγνίνη διαθέτει πολύπλοκη δομή, η οποία αποτελείται κυρίως από αρωματικές αλκοόλες (κουμαρόλη, κονιφερόλη, σιναπόλη). Η λιγνίνη που απομονώνεται με τη μέθοδο Bjorkman θεωρείται ότι προσεγγίζει περισσότερο τη φυσική λιγνίνη, έχει μοριακό βάρος και αντιστοιχεί περίπου σε 60 μονάδες φαινυλπροπανίου. Περιέχει τουλάχιστον δώδεκα διαφορετικούς τύπους δεσμών που συνδέουν αρωματικούς δακτυλίους. Η διαλυτοποίηση της λιγνίνης αποτελεί στόχο των αρχικών σταδίων παρασκευής του χαρτιού, κατά τα οποία το αρχικό λιγνινοκυτταρινούχο υπόστρωμα (συνήθως ξύλο) υποβάλλεται σε χημική επεξεργασία. Με τον τρόπο αυτό, επιτυγχάνεται η απελευθέρωση των ινών της κυτταρίνης και η παραγωγή λευκότερου χαρτοπολτού. Η σύσταση του παραγόμενου χαρτιού ποικίλει κατά περίπτωση. Το χαρτί της εφημερίδας αποτελείται κατά 61% από κυτταρίνη και κατά 16% από ημικυτταρίνη, γεγονός που το καθιστά μια καλή πηγή για την παραγωγή απλών ζυμώσιμων σακχάρων. Ενζυμική υδρόλυση της κυτταρίνης Όπως επισημάνθηκε αρχικά, ένας τεράστιος όγκος από κυτταρίνη παράγεται κάθε χρόνο από τη φωτοσύνθεση των φυτών. Δεδομένου ότι δεν παρατηρείται συσσώρευσή της στο περιβάλλον, είναι προφανές ότι η ποσότητα αυτή αποικοδομείται. Ένα σημαντικό ποσοστό της αποικοδόμησης συντελείται από οργανισμούς (κυρίως μύκητες και βακτήρια), που χρησιμοποιούν τα λιγνινοκυτταρινούχα υποστρώματα ως πηγή άνθρακα. Οι οργανισμοί αυτοί παράγουν ένα σύνολο από ένζυμα, τα οποία ονομάζονται κυτταρινάσες και τα οποία καταλύουν την υδρόλυση της κυτταρίνης. 62

75 Η μικροβιακή αποικοδόμηση της κυτταρίνης είναι το αποτέλεσμα της συνεργιστικής δράσης τριών τύπων υδρολασών: α. Ενδογλυκανάσες. Υδρολύουν εσωτερικούς β-1,4-γλυκοσιτικούς δεσμούς της κυτταρίνης με αποτέλεσμα την απελευθέρωση άκρων επιδεκτικών στη δράση άλλων ενζύμων. Δεν απελευθερώνουν μικρομοριακές ενώσεις. Κωδικός αριθμός: Συστηματικό όνομα: 1,4 (1,3:1,4)-β-D-γλυκαν-4-γλυκανο-υδρολάση. β. Εξωγλυκανάσες. Καταλύουν την απελευθέρωση μονάδων κελλοβιόζης ή γλυκόζης από τα άκρα κυτταρίνης ή αλυσίδων κυτταρίνης που δημιουργούνται από τη δράση του πρώτου ενζύμου. Απελευθέρωση κελλοβιόζης: Κωδικός αριθμός: Συστηματικό όνομα: 1,4 -β-d-γλυκαν-κελλοβιοϋδρολάση. Απελευθέρωση γλυκόζης: Κωδικός αριθμός: Συστηματικό όνομα: 1,4 -β-d-γλυκαν-γλυκοϋδρολάση. γ. β-γλυκοζιδάση. Καταλύει την υδρόλυση της κελλοβιόζης σε δύο μόρια γλυκόζης. Κωδικός αριθμός: Συστηματικό όνομα: β-d-γλυκοζιδιο -γλυκοϋδρολάση. Η ενζυμική προσβολή της κυτταρίνης εξαρτάται από τη φύση του υποστρώματος. Η επίδραση της δομής της κυτταρίνης στην επιδεκτικότητά της σε ενζυμική υδρόλυση έχει μελετηθεί εκτενώς. Τα δομικά στοιχεία που επηρεάζουν την ενζυμική προσβολή κυτταρινούχων υλικών είναι τα ακόλουθα: α. διόγκωση των ινών της κυτταρίνης που είναι συνάρτηση των προσροφημένων μορίων νερού β. βαθμός κρυσταλλικότητας της κυτταρίνης γ. κατανομή των πόρων στο εσωτερικό τριχοειδές δίκτυο της κυτταρίνης δ. βαθμός πολυμερισμού της κυτταρίνης ε. ύπαρξη υποκαταστατών στο μόριο της κυτταρίνης στ. είδος και ποσότητα των συστατικών που συνυπάρχουν με την κυτταρίνη στα λιγνινοκυτταρινούχα υποστρώματα. 63

76 O CH 2 OH H O H OH H H OH H CH 2 OH O H O H OH H H H OH Κυτταρίνη O CH 2 OH O H H OH H H H OH O CH 2 OH O H H OH H H H OH O Η 2 Ο Κυτταρινάση Η CH 2 OH O H Η ΗΟ ΗΟ H ΟΗ H OH Γλυκόζη Η ΗΟ CH 2 OH CH O 2 OH O H H ΟΗ ΗΟ O H H H OH H Η H OH H OH Κελλοβιόζη Σχήμα 2. Ενζυμική υδρόλυση της κυτταρίνης Εφαρμογές Η υδρόλυση της κυτταρίνης σε ολιγοσακχαρίτες είναι δύσκολη διαδικασία, καθώς το μεγαλομοριακό αυτό υπόστρωμα είναι αδιάλυτο. Η χρησιμοποίηση της φυτικής βιομάζας σε βιομηχανική κλίμακα περιλαμβάνει την ενζυμική ή χημική υδρόλυση της κυτταρίνης και στη συνέχεια τη μετατροπή των προϊόντων υδρόλυσης με μικροβιακά ένζυμα, που διασπούν τους β-1,4 γλυκοζιδικούς δεσμούς σε απλά σάκχαρα κατάλληλα για βιομετατροπή. Για παράδειγμα, η γλυκόζη μετατρέπεται μέσω της αλκοολικής ζύμωσης σε αιθανόλη τόσο από ζύμες (Saccharomyces cerevisiae), όσo και από βακτήρια (Pseudomonas mobilis). Η στοιχειομετρία της μετατροπής προσδιορίζεται με βάση την αντίδραση C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 64

77 Η βιοαιθανόλη αποτελεί σπουδαίο εναλλακτικό καύσιμο, καθώς μπορεί να αναμιχθεί με πετρέλαιο σε αναλογία 85% και να χρησιμοποιηθεί σε τροποποιημένους κινητήρες, ή σε αναλογία 5-25% σε μη τροποποιημένους κινητήρες. Σήμερα για την παραγωγή βιοαιθανόλης χρησιμοποιούνται σακχαρότευτλα, σακχαροκάλαμα, σόργο, καλαμπόκι ή σιτάρι. Η παγκόσμια παραγωγή βιοαιθανόλης το 2001 ήταν 20 δισεκατομμύρια λίτρα, με το μεγαλύτερο ποσοστό (60%) να προέρχεται από τη Βραζιλία. Η γλυκόζη μπορεί επίσης να αποτελέσει πηγή άνθρακα για την ανάπτυξη κυττάρων (βιομάζας), με κυριότερη εφαρμογή στις ζωοτροφές. Δεν λείπουν βέβαια οι περιπτώσεις, στις οποίες η παραγόμενη μονοκυτταρική πρωτεΐνη (single cell protein) προορίζεται ως τρόφιμο σε ανθρώπους. Παράλληλα, η βιομετατροπή της γλυκόζης με τη δράση συγκεκριμένων μικροοργανισμών (π.χ. Clostridium acetobutylicum) μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή οργανικών διαλυτών, όπως η ακετόνη ή η βουτανόλη. Τέλος, η υδρόλυση της κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης παίζει σπουδαίο ρόλο στη διεργασία παραγωγής λιπάσματος μέσω κομποστοποίησης (composting). Πρόκειται για ζύμωση στερεάς κατάστασης, στην οποία χρησιμοποιούνται αγροτικά υποπροϊόντα ή αστικά απόβλητα. Κατά τη διεργασία, προϋπάρχοντες μικροοργανισμοί αναπτύσσονται στο αρχικό οργανικό υπόστρωμα και παράγουν διοξείδιο του άνθρακα, νερό και σταθεροποιημένη οργανική ύλη, που επιδρά ευεργετικά στην ανάπτυξη των φυτών. Αυτή η βιοοξειδωτική διαδικασία είναι εξώθερμη και συντελείται με ελεγχόμενη παροχή αέρα, που συντηρεί τη θερμοκρασία στα επιθυμητά επίπεδα, αλλά και αποτρέπει την απομάκρυνση της παραγόμενης αμμωνίας. Η συνολική διεργασία όχι μόνο αντιμετωπίζει προβλήματα μόλυνσης του περιβάλλοντος, αλλά ταυτόχρονα παράγει ένα χρήσιμο στη γεωργία προϊόν. Όργανα ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Αναλυτικός ζυγός Παγόλουτρο Αναδευτήρας (Vortex) Υδατόλουτρο (60 ºC) Υδατόλουτρο με δυνατότητα ανάδευσης (60 ºC) Φυγόκεντρος Δοχείο βρασμού 65

78 Φωτόμετρο Σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης - ΗPLC (εναλλακτικά) Υλικά και Αντιδραστήρια Διηθητικό χαρτί τύπου Whatman No 1 Ενζυμικό διάλυμα κυτταρινασών (Cellubrix της Novozymes) Ρυθμιστικό διάλυμα οξικών ιόντων 0.1 Μ με ph σιφώνια του 1 ml Σιφώνιο των 2 ml 3 σιφώνια των 5 ml Σωλήνες μετάγγισης & αραίωσης Φούσκα μετάγγισης υγρών (poire) Διάλυμα δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNSA) Λιγνινοκυτταρινούχο υπόστρωμα (πίτυρο σίτου wheat bran) Φιάλη των 25 ml με αεροστεγές πώμα Εκτέλεση Α. Υδρόλυση απορριμμάτων χαρτιού 1. Περίπου 50 mg χαρτιού (π.χ διηθητικό χαρτί τύπου Whatman No 1 ή ότι άλλο σας υποδείξει ο υπεύθυνος της άσκησης) τεμαχίζεται σε μικρά κομμάτια (1x1 cm) και τοποθετείται σε δοκιμαστικό σωλήνα. 2. Σε καθέναν από τους δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν χαρτί, καθώς και σε έναν κενό που θα χρησιμεύσει ως λευκό, προστίθενται αρχικά 2 ml ρυθμιστικού διαλύματος με ph 5.0 και στη συνέχεια 1 ml ενζυμικού διαλύματος κυτταρινασών (που προέκυψαν στην άσκηση 4). 3. Μετά από ανάδευση σε αναδευτήρα (Vortex), οι δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετούνται σε υδατόλουτρο στους 60 ο C και το μίγμα επωάζεται για 24h. 4. Μετά την παρέλευση του προαναφερθέντος χρονικού διαστήματος, οι δοκιμαστικοί σωλήνες υποβάλλονται σε φυγοκέντρηση για 10 min. 66

79 5. Για καθέναν από τους δοκιμαστικούς σωλήνες λαμβάνεται ποσότητα 2 ml από το υπερκείμενο υγρό και προσδιορίζεται η συγκέντρωση των αναγωγικών σακχάρων τόσο με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC), όσο και με τη μέθοδο DNSA (βλέπε Παράρτημα). Β. Ανάλυση των προϊόντων της ενζυμικής υδρόλυσης λιγνινοκυτταρινούχων υλικών 1. Ποσότητα πίτυρου σίτου ίση με 200 mg ζυγίζεται και τοποθετείται σε φιαλίδιο που περιέχει 2ml ρυθμιστικού διαλύματος ph 5.0 και στη συνέχεια 0.5 ml ενζυμικού διαλύματος κυτταρινασών (που προέκυψε από την πειραματική διαδικασία της άσκησης 4). 2. Η κωνική φιάλη πωματίζεται και τοποθετείται σε αναδευόμενο υδατόλουτρο στους 60 ο C. 3. Μετά την παρέλευση του προαναφερθέντος χρονικού διαστήματος, οι δοκιμαστικοί σωλήνες υποβάλλονται σε φυγοκέντρηση για 10 min. 4. Ποσότητα 2 περίπου ml από το υπερκείμενο υγρό μεταγγίζεται σε δοκιμαστικό σωλήνα. Μικρή ποσότητα από αυτό χρησιμοποιείται για την ανάλυση των προϊόντων με τη μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας (βλέπε Παράρτημα), ενώ η υπόλοιπη ποσότητα αραιώνεται σύμφωνα με τις υποδείξεις του υπεύθυνου της άσκησης. 5. Σε καθένα από τα αραιωμένα δείγματα προσδιορίζεται η συγκέντρωση των αναγωγικών σακχάρων με τη μέθοδο DNSA (βλέπε Παράρτημα) και η συγκέντρωση της γλυκόζης με την ενζυμική μέθοδο της οξειδάσης της γλυκόζης (βλέπε Παράρτημα). ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Από τους μέσους όρους των απορροφήσεων που προκύπτουν με τη μέθοδο DNSA, υπολογίστε τη συγκέντρωση των παραγόμενων αναγωγικών σακχάρων για κάθε είδος χαρτιού, χρησιμοποιώντας την καμπύλη αναφοράς της γλυκόζης που έχετε υπολογίσει στο Παράρτημα. 67

80 2. Ποιός ο βαθμός υδρόλυσης (%) για κάθε είδος χαρτιού; Ποιά είναι κατά την άποψή σας τα πιθανά αίτια για τις παρατηρούμενες διαφοροποιήσεις στο βαθμό υδρόλυσης; 3. Κατά την υδρόλυση του πίτυρου σίτου, να υπολογίσετε τη συγκέντρωση των συνολικών αναγωγικών σακχάρων και της γλυκόζης για κάθε χρονική στιγμή που πραγματοποιήθηκε δειγματοληψία. Τα αποτελέσματα να παρουσιαστούν σε διάγραμμα με τετμημένη το χρόνο υδρόλυσης. 4. Ποιά είναι σύμφωνα με τη βιβλιογραφία η περιεκτικότητα σε κυτταρίνη του πίτυρου σίτου; Με βάση τη σύσταση αυτή να υπολογίσετε τη μέγιστη δυνατή συγκέντρωση γλυκόζης κατά την υδρόλυση πίτυρου σίτου με συγκέντρωση 15% (w/v). 5. Να υπολογίσετε την απελευθερούμενη ενέργεια από την καύση της βιοαιθανόλης που θα μπορούσε να παραχθεί, αν αξιοποιούνταν το ένα εκατοστό της ετήσιας παραγωγής κυτταρίνης στη βιόσφαιρα. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Biochemical Engineering Fundamentals (1986). J. Bailey & F. Ollis, 2nd edition, McGraw-Hill, Singapore 2. Fan, L.T., Lee, Y.H. & Beardmore, D.H. (1980). Major chemical and physical features of cellulosic materials as substrates for enzymatic hydrolysis. In: Advances in Biochemical Engineering, Springer, Verlag (eds), Berlin, Heidelberg, New York. 3. Kirk, T.K. (1983). Degradation and conversion of lignocelluloses. In: Filamentous fungi, Fungal Technology. Smith, J., Berry, D. & Kristiansen, B. (eds), Edward Arnold Limited (publishers), Vol. IV, pp Puls, J. & Poutanen, K. (1989). Mechanisms of enzymic hydrolysis of hemicelluloses (xylans) and procedures for determination of the enzyme activities involved. In: Coughlan, M.P. (ed.) Enzyme Systems for Lignocellulose Degradation, Elsevier Applied Science, London, pp Fengel, D. & Wegener G. (1984). Polyoses (Hemicelluloses) In: Wood, chemistry, ultrastructure, reactions. WaLter de Gruyter (ed.), Berlin, New York, pp Cowling, E.B. (1975). Physical and chemical constraints in the hydrolysis of cellulose and lignocellulosic materials. Biotechnol. Bioeng. Symposium 5,

81 7. Stentiford, E.I. & Dods C.M. (1992). Composting. In: Solid Substrate CuLtivation, Doelle, H.W., Mitchell, D.A. & Rolz, C.E. (eds), Elsevier Applied Science, London & New York, pp Bioethanol, Novozymes, Presentation at Handelsbanken Securities, 18 January 2002, in 9. Textbook of Biotechnology (1995). G. Chhatwal, Anmol Publications PVT Ltd, New Delhi, India 10. Lee, J. (1997). Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol. Journal of Biotechnology, 56,

82 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΑΝΑΛΥΣΗ ΟΛΙΓΟΣΑΚΧΑΡΙΤΩΝ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΙΒΑΔΑΣ Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (thin layer chromatography TLC) αποτελεί χρωματογραφική τεχνική που χρησιμοποιείται για τον ποιοτικό προσδιορισμό των συστατικών ενός δείγματος. Πρόκειται για αρκετά διαδεδομένη τεχνική με βασικότερα πλεονεκτήματα την απλότητα των χειρισμών, την ταχύτητα εξαγωγής αποτελεσμάτων, το μικρό κόστος λειτουργίας και εξοπλισμού και τη δυνατότητα εφαρμογής σε σημαντικό εύρος προϊόντων. Η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί με επιτυχία για το διαχωρισμό μορίων όπως αμινοξέα, πρωτεΐνες ή σάκχαρα. Βασικό εργαλείο της μεθόδου είναι η ειδική πλάκα χρωματογραφίας, που αποτελείται συνήθως από γυαλί, μέταλλο ή πλαστικό, του οποίου η μία επιφάνεια επικαλύπτεται από λεπτό στρώμα απορροφητικού στερεού (συνήθως SiO2 ή Al2O3). Μία μικρή ποσότητα του μίγματος που πρόκειται να αναλυθεί τοποθετείται υπό μορφή κηλίδων (spots) σε σημείο που βρίσκεται κοντά στην κάτω μεριά της πλάκας. Στη συνέχεια, η πλάκα τοποθετείται σε ειδικό δοχείο (με αεροστεγές σκέπασμα) που περιέχει μικρή ποσότητα διαλύτη, έτσι ώστε μόνο η περιοχή που βρίσκεται πολύ κοντά στην κάτω μεριά της πλάκας να είναι βυθισμένη στον υγρό διαλύτη. Ο διαλύτης αποτελεί την κινητή φάση και ανέρχεται μέσω του απορροφητικού στερεού της πλάκας με μικρή ταχύτητα λόγω τριχοειδών δυνάμεων. Καθώς ο διαλύτης περνά από το σημείο εφαρμογής του δείγματος, για κάθε συστατικό του μίγματος αποκαθίσταται ισορροπία ανάμεσα στα μόρια που απορροφώνται από το στερεό και σε αυτά που βρίσκονται στην υγρή φάση. Τα συστατικά εξαιτίας της διαφορετικής διαλυτότητάς τους και του διαφορετικού βαθμού απορρόφησης από το στερεό ανεβαίνουν στην πλάκα με διαφορετική ταχύτητα. Όταν ο διαλύτης φτάσει κοντά στην κορυφή της πλάκας, η πλάκα απομακρύνεται από το ειδικό δοχείο και ξηραίνεται. Η εμφάνιση των συστατικών του μίγματος πραγματοποιείται συνήθως μετά από ψεκασμό με ειδικά διαλύματα, ενώ μερικές φορές απαιτείται η χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας UV. Για την ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιείται ο συντελεστής συγκράτησης (retention factor Rf) ενός συστατικού, που ορίζεται ως ο λόγος της απόστασης που διανύει το συστατικό προς την απόσταση που διανύει ο διαλύτης. 70

83 Για παράδειγμα, αν το συστατικό διανύει 2.1 cm και ο διαλύτης 2.8 cm, ο συντελεστής συγκράτησης του συστατικού είναι Rf=0.75. Μέτωπο διαλύτη Θέση εμφάνισης συστατικού Σημείο εφαρμογής δείγματος Ο συντελεστής συγκράτησης ενός συστατικού είναι σταθερός μόνο όταν διατηρούνται οι ακόλουθες χρωματογραφικές συνθήκες: Διαλύτης έκλουσης Απορροφητικό στερεό Πάχος απορροφητικού στερεού Ποσότητα δείγματος Θερμοκρασία Στη συγκεκριμένη άσκηση, τα προϊόντα της υδρόλυσης των λιγνινοκυτταρινούχων υλικών αναλύονται με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας σε μικροκρυσταλλική κυτταρίνη (DC-Alufolien Cellulose, Merck). Ο διαλύτης που χρησιμοποιείται αποτελείται από αιθυλοξικό οξύ/οξικό οξύ/νερό σε αναλογία 3:2:1, αντίστοιχα. Μετά το διαχωρισμό τους, τα αναγωγικά σάκχαρα εμφανίζονται με μίγμα ανιλίνης/φθαλικού. 71

84 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα Αναδευτήρας (Vortex) Ειδική πλάκα χρωματογραφίας Δοχείο χρωματογραφίας Ψεκαστήρας Ξηραντήρας (120 ºC) Υλικά και Αντιδραστήρια Χάρακας και μολύβι Πρότυπο διάλυμα γλυκόζης και κελλοβιόζης (standard) Δείγματα από την υδρόλυση λιγνινοκυτταρινούχων υλικών Αυτόματη πιπέτα (5 μl) Διαλύτης έκλουσης Διάλυμα εμφάνισης Εκτέλεση 1. Στο δοχείο της χρωματογραφίας προστίθεται ποσότητα διαλύτη έκλουσης, τέτοια ώστε να έχει ύψος περίπου 1 cm. Το δοχείο κλείνεται με το αεροστεγές σκέπασμα και αφήνεται σε ηρεμία, έτσι ώστε να κορεστεί με τους ατμούς του διαλύτη. 2. Σε απόσταση 1.5 cm από την κάτω πλευρά της πλάκας χρωματογραφίας σημειώνουμε με το μολύβι και το χάρακα μία ευθεία γραμμή. Επάνω στην ευθεία και σε απόσταση 2 cm μεταξύ τους σημειώνουμε τόσα σημεία, όσα και τα δείγματα της υδρόλυσης. Σημειώνουμε επίσης δύο ακόμη σημεία (που προορίζονται για το πρότυπο διάλυμα γλυκόζης και κελλοβιόζης) εκατέρωθεν των προηγουμένων, διατηρώντας την ίδια απόσταση (2 cm) και προσέχοντας έτσι ώστε η απόσταση των ακραίων σημείων από το περιθώριο της πλάκας να μην είναι μικρότερη από 2 cm. 3. Για κάθε ένα από τα δείγματα της υδρόλυσης, καθώς και για το πρότυπο διάλυμα γλυκόζης και κελλοβιόζης πραγματοποιείται εφαρμογή πάνω στα σημεία που 72

85 δημιουργήθηκαν στο προηγούμενο στάδιο. Για το σκοπό αυτό, μετά από ανάδευση κάθε δείγματος, λαμβάνεται με τη βοήθεια αυτόματης πιπέτας ποσότητα ίση με 5 μl. Στη συνέχεια, και χωρίς να προκληθεί φθορά στην επιφάνεια του απορροφητικού στερεού, έρχεται σε επαφή με την άκρη του ρύγχους της αυτόματης πιπέτας. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται μια μικρή κηλίδα, η οποία δεν πρέπει να υπερβαίνει σε διάμετρο τα 3 mm. Αν απαιτείται μεγαλύτερη ποσότητα δείγματος, αυτή εφαρμόζεται μετά το στέγνωμα της προηγούμενης κηλίδας και πάνω ακριβώς στο ίδιο σημείο. 4. Μετά την εφαρμογή των δειγμάτων και των προτύπων, η πλάκα χρωματογραφίας τοποθετείται με γρήγορες κινήσεις μέσα στο δοχείο της χρωματογραφίας με τα σημεία εφαρμογής των δειγμάτων προς την κάτω πλευρά. Αφού σφραγιστεί το δοχείο αφήνεται σε ηρεμία. 5. Όταν το μέτωπο του διαλύτη πλησιάσει στην κορυφή της πλάκας, η πλάκα απομακρύνεται και αφού σημειωθεί γρήγορα με μολύβι το υψηλότερο σημείο που ανέβηκε ο διαλύτης, αφήνεται να στεγνώσει. 6. Η επιφάνεια της στεγνής πλέον πλάκας ψεκάζεται με το διάλυμα εμφάνισης. 7. Με σκοπό την εμφάνιση των δειγμάτων, η πλάκα τοποθετείται στον ξηραντήρα για περίπου 5 λεπτά. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Προσδιορίστε τους συντελεστές συγκράτησης των συστατικών που εμφανίστηκαν στην πλάκα χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας του σχήματος που ακολουθεί. 73

86 Μέτωπο διαλύτη Γραμμή εφαρμογής δειγμάτων 2. Κατά την εμφάνιση των προϊόντων μιας υδρόλυσης μετά την εφαρμογή χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας, παρουσιάζεται μία μόνο κηλίδα. Τι συμπέρασμα εξάγεται σχετικά με τη σύσταση του δείγματος; 3. Ποιο νομίζετε ότι θα ήταν το αποτέλεσμα, αν στο μίγμα ανάλυσης των παραγόμενων σακχάρων με τη μέθοδο υγρής χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας, χρησιμοποιούσαμε διπλάσια συγκέντρωση νερού; 4. Ποια τα συμπεράσματά σας από την ανάλυση των παραγόμενων σακχάρων; Να σχολιάσετε τη μεταβολή των προϊόντων (ως προς τη συνολική συγκέντρωση και το μοριακό τους βάρος) σε συνάρτηση με το χρόνο. 5. Με βάση τα αποτελέσματα της ανάλυσης των παραγόμενων σακχάρων, ποια είναι η άποψή σας σχετικά με την ύπαρξη ενεργότητας β-γλυκοζιδάσης στο εμπορικό σκεύασμα των κυτταρινασών (Cellubrix) που χρησιμοποιείται στην άσκηση; 74

87 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Thin Layer Chromatography: a laboratory handbook (1988). E.Stahl & M. Ashworth, 2 nd edition, Springer-Verlag, Berlin. 2. Applied Thin-Layer Chromatography Best Practice and Avoidance of Mistakes (2000). E. Hahn-Deinstrop, WileyVCH Publishers 3. Carbohydrate Analysis (1994). M. Chaplin & J. Kennedy, 2 nd Edition, IRL at Oxford University Press, London Εργαστηριακές Ασκήσεις του Μαθήματος Βασική Βιοτεχνολογία (1998). Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π. 75

88 ΑΣΚΗΣΗ 7 η ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΣΕ ΦΥΣΙΚΑ ΒΙΟΠΟΛΥΜΕΡΗ- -ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΒΙΟΑΙΘΑΝΟΛΗΣ Α. Πολύδερα Χ. Σταμάτης ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της άσκησης είναι η εξοικείωση με μια από τις βασικότερες τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την ακινητοποίηση βιοκαταλυτικών συστημάτων (ενζύμων και κυττάρων). Η τεχνική αφορά στη φυσική μέθοδο ακινητοποίησης κυττάρων ζύμης Saccharomyces cerevisiae, καθώς και του ενζύμου β-γλυκοζιδάση σε πήκτωμα (γέλη-gel) αλγινικού ασβεστίου. Στην πρώτη περίπτωση, τα ακινητοποιημένα κύτταρα ζύμης θα χρησιμοποιηθούν για τη μετατροπή της γλυκόζης σε αιθανόλη, ενώ στη δεύτερη περίπτωση, θα μελετηθεί η δυνατότητα της ακινητοποιημένης γλυκοζιδάσης να διατηρεί τις καταλυτικές της ικανότητες μετά την ακινητοποίησή της καταλύοντας την αντίδραση υδρόλυσης της π-νιτροφαινυλο γλυκόζης (p-npg). ΓΕΝΙΚΑ Τα ένζυμα σαν βιολογικοί καταλύτες παραμένουν αναλλοίωτα μετά το τέλος της αντίδρασης την οποία καταλύουν, γεγονός που επιτρέπει την επαναχρησιμοποίησή τους. Παρά τη δυνατότητα όμως αυτή, η πλειοψηφία των βιομηχανικών, αναλυτικών και κλινικών εφαρμογών των ενζύμων βασίζεται στην ανάμιξη του ενζύμου σε διάλυμα, στο οποίο περιέχεται το υπόστρωμα της αντίδρασης. Το γεγονός αυτό δεν επιτρέπει την εύκολη και οικονομικά συμφέρουσα ανάκτηση και επαναχρησιμοποίηση του ενζύμου. Η ανάγκη για την επίλυση του παραπάνω προβλήματος οδήγησε στην ανάπτυξη μεθοδολογίας με σκοπό την ακινητοποίηση των ενζύμων σε στερεό φορέα. Ο βιοκαταλύτης διαχωρίζεται εύκολα με τον τρόπο αυτό από την υγρή φάση του συστήματος (η οποία περιέχει τα προϊόντα και τα υποστρώματα), γεγονός που επιτρέπει τη συνεχή επαναχρησιμοποίηση του ενζύμου σε μια βιοκαταλυτική διαδικασία. Με τον όρο ακινητοποίηση ή καθήλωση βιοκαταλύτη (ενζύμου, πολυενζυμικού συστήματος ή κυττάρου) αναφερόμαστε στον περιορισμό του σε τεχνητή στερεά φάση, η 76

89 οποία διακρίνεται από την κύρια υγρή φάση στην οποία βρίσκονται τα υποστρώματα της αντίδρασης. Τα κύρια πλεονεκτήματα που προσφέρει η τεχνολογία της ακινητοποίησης των βιοκαταλυτών συνοψίζονται ως εξής: α) αύξηση της σταθερότητας του βιοκαταλύτη σε παράγοντες όπως οι ακραίες τιμές ph και θερμοκρασίας, καθώς και παρουσία οργανικών διαλυτών. β) εύκολη ανάκτηση του προϊόντος (που συνήθως βρίσκεται στην υγρή φάση του συστήματος) γ) εύκολη ανάκτηση και επαναχρησιμοποίηση του βιοκαταλύτη δ) δυνατότητα συνεχούς λειτουργίας της βιοκαταλυτικής αντίδρασης Οι μέθοδοι ακινητοποίησης διακρίνονται σε δύο βασικές κατηγορίες: α) σε χημικές, οι οποίες χαρακτηρίζονται από τη δημιουργία ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ του ενζύμου και του φορέα ή μεταξύ των μορίων του ενζύμου β) σε φυσικές, όπου ο βιοκαταλύτης προσροφάται στον φορέα ή εγκλωβίζεται στο εσωτερικό ης δομής ενός πολυμερούς ή ενός μικροκαψυλλίου. Στο σχήμα 1 παρουσιάζονται σχηματικά οι κυριότερες μέθοδοι ακινητοποίησης βιοκαταλυτών. Στην άσκηση αυτή παρουσιάζεται μια φυσική μέθοδος ακινητοποίησης βιοκαταλυτών που βασίζεται στον εγκλωβισμό τους σε φυσικά βιοπολυμερή, όπως είναι το αλγνικό ασβέστιο. Α) Β) Γ) β) γ) Σχήμα 1. Σχηματική απόδοση χαρακτηριστικών τρόπων ακινητοποίησης βιοκαταλυτών (ενζύμων ή κυττάρων): α) σύνδεση με δυνάμεις ηλεκτροστατικής φύσης β) εγκλωβισμός σε πολυμερή γ) εγκαψυλλίωση. 77

90 Ακινητοποίηση ενζύμων και κυττάρων σε αλγινικό ασβέστιο Το αλγινικό οξύ προέρχεται από κυανοφύκη και έχει ως δομικές μονάδες β-dμαννοπυρανοζυλο-ουρονικό οξύ και α-l-γλυκοπυρανοζυλο-ουρονικό οξύ. Η διαλυτότητα του αλγινικού οξέος στο νερό εξαρτάται από το είδος του άλατός του. Άλατα του οξέος με Νa ή άλλα αλκαλικά μέταλλα, καθώς και με αμμωνία, είναι διαλυτά στο νερό, ενώ τα αντίστοιχα άλατα με δισθενή ή πολυσθενή ιόντα, όπως του Ca είναι δυσδιάλυτα (εξαίρεση αποτελεί το άλας μαγνησίου). Τα ιόντα αυτά συνδέονται με δύο γειτονικά υπολείμματα α- L-γλυκοπυρανοζυλο-ουρονικού οξέος. Η διαδικασία δημιουργίας πηκτώματος του αλγινικού οξέος βασίζεται ουσιαστικά στην ανταλλαγή των ιόντων Νa + από τα ιόντα Ca ++, η οποία επιτυγχάνεται κάτω από ήπιες συνθήκες σύμφωνα με την αντίδραση: 2 (R--COO - )Na + + Ca ++ (R--COO - ) 2 Ca Na + Αρχικά διαλυτοποιείται ο πολυσακχαρίτης, προστίθεται ο βιοκαταλύτης (ένζυμο ή ολόκληρα κύτταρα), ενώ το υδατικό διάλυμα εισάγεται στάγδην σε διάλυμα χλωριούχου ασβεστίου, οπότε και πηκτωματοποιείται αμέσως. Η δομή της γέλης είναι σταθερή σε θερμοκρασία έως 100 C και κατά συνέπεια η θέρμανσή της δεν ρευστοποιεί το πήκτωμα. Αντίθετα, η παρουσία ιόντων Na +, K +, Mg ++ θα πρέπει να αποφεύγεται, όπως επίσης και η παρουσία φωσφορικών και κιτρικών ανιόντων, τα οποία σχηματίζουν σύμπλοκα με τα ιόντα ασβεστίου και οδηγούν σε διαλυτοποίηση του πηκτώματος. Στο σχήμα 2 εμφανίζεται η εικόνα (από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο) ακινητοποιημένων κυττάρων ζύμης σε πήκτωμα αλγινικού ασβεστίου. Σχήμα 2. Φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο κυττάρων ζύμης ακινητοποιημένων σε πήκτωμα αλγινικού ασβεστίου (φωτογραφία από Grunwald P., Biochemical. Education. 28, 96-99, 2000) 78

91 Αλκοολική ζύμωση Η μικροβιακή ζύμωση για παραγωγή αιθανόλης αποτελεί μια παραδοσιακή διεργασία, κατά την οποία σάκχαρα (εξόζες) μετατρέπονται από μικροβιακά στελέχη της ζύμης Saccharomyces cerevisiae (ανθεκτικά στην αιθανόλη) σε αιθυλική αλκοόλη με αναερόβια ζύμωση (Σχήμα 3). Οι εξόζες μετατρέπονται σε αιθανόλη και CO2 σύμφωνα με την αντίδραση: C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 Στον πίνακα 1 παρουσιάζονται οι αποδόσεις της ιδανικής ζύμωσης γλυκόζης κατά τον Pasteur. Η παρουσία περισσότερων προϊόντων οφείλεται στο οξυγόνο και τα θρεπτικά υλικά εξωτερικών πηγών απαραίτητων για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Στη βιομηχανική πρακτική, όπου δεν χρησιμοποιούνται ιδανικά υποστρώματα, οι αποδόσεις κυμαίνονται στην περιοχή του 90% της θεωρητικά μέγιστης απόδοσης. Μία τυπική συγκέντρωση των προϊόντων ανά 100 γραμμάρια ζυμωμένης γλυκόζης από ζύμη για την παραγωγή αιθανόλης δίνεται στον πίνακα 1. Πίνακας 1. Αποδόσεις στην ιδανική κατά Pasteur αλκοολική ζύμωση Βάρος % Αιθανόλη 48.4 Διοξείδιο άνθρακα 46.0 Γλυκερόλη 3.3 Ηλεκτρικό οξύ 0.6 Κύτταρα 1.2 Σάκχαρα που ζυμώνονται από τη ζύμη αυτή είναι η γλυκόζη, φρουκτόζη, μαννόζη, γαλακτόζη, σακχαρόζη, μαλτόζη και ραφινόζη. Μελάσσα ή υδρολυμένο άμυλο είναι οι κύριες πηγές υδατανθράκων. Μειονέκτημα της ζύμης αυτής είναι ότι δεν ζυμώνει τις πεντόζες, που παράγονται από τη σύγχρονη υδρόλυση των ημικυτταρινών που περιέχονται στα περισσότερα κυτταρινούχα υλικά, καθώς και το γεγονός ότι παρεμποδίζεται από προϊόντα καταστροφής των σακχάρων κατά τη χημική υδρόλυση των πολυσακχαριτών. Σημαντικές προσπάθειες γίνονται σήμερα για την παραγωγή νέων στελεχών ζύμης με 79

92 μεθόδους της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA, που να μπορούν να ζυμώνουν μεγαλύτερο εύρος υδατανθράκων. Εκτός της ζύμης S. cerevisiae χρησιμοποιείται σήμερα και το βακτήριο Zymomonas mobilis, το οποίο παρουσιάζει υψηλότερη παραγωγικότητα και αντοχή σε αλκοόλη. Η αιθανόλη που χρησιμοποιείται στα τρόφιμα και ποτά, σύμφωνα με την Ελληνική νομοθεσία, πρέπει να είναι προϊόν ζύμωσης σακχάρων με S. cerevisiae. Γλυκόζη 6-Φωσφορική γλυκόζη Φωσφοενολοπυροσταφυλικό Πυροσταφυλικό Πυροσταφυλικό CoA NAD + ακετυλο-coa NADH Πυροσταφυλικό Ακεταλδεϋδη + ΝΑDH + H NAD + Αιθανόλη Παρουσία Ο 2 Απουσία Ο 2 Σχήμα 3. Πορεία του μεταβολισμού της γλυκόζης παρουσία ή απουσία Ο2 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα Αναλυτικός ζυγός Αναδευτήρας (Vortex) Υδατόλουτρο (37 ºC) Δοχείο βρασμού ή υδατόλουτρο (95 ο C) Φωτόμετρο Mαγνητικός αναδευτήρας 80

93 Υλικά-Παρασκευή διαλυμάτων - Ξηρά κύτταρα ζύμης Saccharomyces cerevisiae ή νωπά κύτταρα ζύμης (μαγιά αρτοποιίας). Στην περίπτωση των ξηρών κυττάρων απαιτείται η ανάμιξη 1g κυττάρων με 5 ml απεσταγμένου νερού για την πλήρη ενυδάτωση των κυττάρων (δημιουργία νωπής πάστας). - Ενζυμικό διάλυμα β-γλυκοζιδάσης (20mg/ml) σε Τris-HCl 0.02M ph 7.5-2% (ή 1%) w/v διάλυμα αλγινικού νατρίου σε απεσταγμένο νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα (βλ. σημείωση 1). Η διαδικασία διαλυτοποίησης είναι αργή και βασίζεται στην σταδιακή προσθήκη του αλγινικού νατρίου σε απεσταγμένο νερό υπό συνεχή ανάδευση για 4-5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (βλ. σημείωση 2). Μετά την πλήρη διαλυτοποίηση του αλγινικού νατρίου είναι απαραίτητη η (σταδιακή) ανάδευση για min, με σκοπό την απομάκρυνση του εγκλωβισμένου αέρα. Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία 4 ο C M διαλύματος CaCl2 (1 l) Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου mm pnpg (π-νιτροφαινυλο γλυκόζης) σε Τris-HCl 0.02M ph Αντιδραστήρια για τον προσδιορισμό της γλυκόζης με τη μέθοδο DNSA και την ενζυμική μέθοδο όπως περιγράφεται στο Παράρτημα της άσκησης 2. - Ρυθμιστικό διάλυμα 0.02M οξικών ph Σιφώνια των 1 ml - Σιφώνια των 5, 10 ml - Διαβαθμισμένη σύριγγα (μιας χρήσης) των 100ml - Σωλήνες μετάγγισης & αραίωσης - Διάλυμα δινιτροσαλυκιλικού οξέος (DNSA) - Ποτήρια ζέσης 250 ml - Κωνική φιάλη των 50 ml - ΗPLC Εκτέλεση Πειράματος 1. Ακινητοποίηση κυττάρων ζύμης 1. Ακινητοποίηση κυττάρων ζύμης 1) Αναμίξτε 1 g νωπών κυττάρων με 10 ml διαλύματος άλατος αλγινικού οξέος σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml (A). Χρησιμοποιήστε μαγνητικό αναδευτήρα και μικρό μαγνητάκι (το 81

94 οποίο δεν πρέπει να χάσετε!!!) 2) Μεταφέρετε στάγδην από ύψος cm τo αλγινικό μίγμα (A) σε 20 ml διαλύματος CaCl2. Καθ όλη τη διάρκεια της προσθήκης το μίγμα αναδεύεται ήπια σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεταφορά μπορεί να επιτευχθεί με διαβαθμισμένη σύριγγα (μιας χρήσης) των ml. O ρυθμός προσθήκης του μίγματος θα πρέπει να είναι περίπου 2ml/min. H δημιουργία του πηκτώματος (υπό μορφή σφαιριδίων) γίνεται αμέσως μόλις η σταγόνα του αλγινικού μίγματος έρθει σε επαφή με το διάλυμα του χλωριούχου ασβεστίου. Το μέγεθος των σφαιριδίων εξαρτάται από τη διάμετρο της βελόνας της σύριγγας αλλά και την πίεση που εφαρμόζεται. Η συνηθισμένη υποδερμική βελόνα παράγει σφαιρίδια με διάμετρο 2-5 mm. (Η πειραματική διάταξη που χρησιμοποιείται εικονίζεται στο σχήμα 4). 3) Μετά την ολοκλήρωση της προσθήκης του αλγινικού μίγματος, αφήστε το τελικό μίγμα να αναδευτεί για 5-10 min και στο διάστημα αυτό προχωρήστε στα επόμενα στάδια. Μίγμα αλγινικού οξέος και κυττάρων ζύμης Διάλυμα 0.15 Μ CaCl2 Σχήμα 4. Σχηματική παράσταση της πειραματικής διάταξης για την ακινητοποίηση κυττάρων ζύμης σε αλγινικό ασβέστιο 4) Μεταφέρετε σε κωνική φιάλη που περιέχει 10 ml διαλύματος γλυκόζης συγκέντρωσης 50g/L τα σφαιρίδια με τα ακινητοποιημένα κύτταρα ζύμης. 5) Επωάστε το μίγμα σε υδατόλουτρο στους 37 ο C. Σε χρονικά διαστήματα 0, 10, 20, 30 min αφαιρέστε 200 μl διαλύματος αντίδρασης και προσθέστε τα σε 5 ml H2O. Σε καθένα από τα αραιωμένα δείγματα προσδιορίζεται η συγκέντρωση της γλυκόζης με τη μέθοδο DNSA (όπως θα σας υποδείξει ο υπεύθυνος της άσκησης) 6) Η συγκέντρωση της γλυκόζης μπορεί να προσδιοριστεί με υγρή χρωματογραφία 82

95 υψηλής πίεσης HPLC χρησιμοποιώντας στήλη ανάστροφης φάσης C18, σύστημα έκλουσης μεθανόλη:νερό:οξικό οξύ: 80:20:0.1 κ.ό. Ο πρoσδιoρισμός της συγκέντρωσης της γλυκόζης γίνεται με τη βoήθεια καμπύλης αναφoράς. Συγκεκριμένα, στις ίδιες πειραματικές συνθήκες πoυ αναφέρoνται παραπάνω, αναλύoνται δείγματα τα oπoία περιέχoυν καθoρισμένες πoσότητες γλυκόζης (όπως θα σας υποδείξει ο υπεύθυνος της άσκησης). Η συγκέντρωση της αιθανόλης μπορεί να προσδιοριστεί με αεριοχρωματογραφική ανάλυση όπως θα σας υποδείξει ο υπεύθυνος της άσκησης 2. Ακινητοποίηση ενζύμου β-γλυκοζιδάση Ακολουθήστε τα στάδια ακινητοποίησης των κυττάρων ζύμης με τις εξής διαφοροποιήσεις. 1) Αναμίξτε 200 μl ενζυμικού διαλύματος με 10 ml διαλύματος άλατος αλγινικού οξέος σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml (A). 2,3) Εργαστείτε στα στάδια 2 και 3 όπως προηγουμένως. 4) Προσθέστε 2.5 ml ρυθμιστικού διαλύματος oξικών 0.02M ph 5.0, το οποίο περιέχει pnpg (π-νιτροφαινυλο γλυκόζη) συγκέντρωσης 0.2 mm σε δοκιμαστικό σωλήνα. Αυτό αποτελεί το μίγμα της αντίδρασης για το ακινητοποιημένο ένζυμο. Μεταφέρετε 8 σφαιρίδια με το ακινητοποιημένο ένζυμο στον παραπάνω δοκιμαστικό σωλήνα. 5) Επωάστε το μίγμα στους 50 o C. Σε χρονικά διαστήματα 0, 2, 5, 10 και 20 min αφαιρέστε 200 μl διαλύματος αντίδρασης και προσθέστε τα σε 1 ml διαλύματος 30% Νa2CO3 για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της π-νιτροφαινόλης που παράγεται από την ενζυμική αντίδραση. Μετρείστε την απορρόφηση στα 410nm (όπως στην άσκηση 3 και 4). Σημειώσεις 1. Αρκετά αντιδραστήρια και ρυθμιστικά διαλύματα δεν είναι συμβατά με το αλγινικό ασβέστιο, καθώς είναι δυνατό να δεσμεύσουν (σχηματίζοντας σύμπλοκα) τα ιόντα Ca οδηγώντας σε αποσταθεροποίηση της δομής του πηκτώματος. Για το λόγο αυτό θα πρέπει να αποφεύγονται ρυθμιστικά διαλύματα κιτρικού και φωσφορικού. 2. Η διαλυτοποίηση του αλγινικού νατρίου πρέπει να γίνει σταδιακά και υπό συνεχή ανάδευση. Η ανάδευση θα πρέπει να συνεχιστεί τουλάχιστον για μια ώρα μετά την ολοκλήρωση της προσθήκης του αλγινικού νατρίου. 83

96 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Ποια πιστεύετε ότι θα είναι η επίδραση του μεγέθους των σφαιριδίων του αλγινικού ασβεστίου στην ταχύτητα μετατροπής της γλυκόζης σε αιθανόλη; 2. Προτείνετε μια πειραματική διάταξη που θα επέτρεπε τη συνεχή μετατροπή της γλυκόζης σε αιθανόλη με τη χρησιμοποίηση ακινητοποιημένων κυττάρων ζύμης. 3. Παρουσιάστε γραφικά την πορεία των δύο αντιδράσεων που μελετήσατε με το χρόνο. Προσδιορίστε την ταχύτητα των δύο αντιδράσεων. 4. Ποια πιστεύετε ότι είναι η επίδραση της ακινητοποίησης στην ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης (σε σχέση με την ταχύτητα μη ακινητοποιημένου ενζύμου); Αιτιολογείστε την απάντησή σας. 5. Θα μπορούσε το ακινητοποιημένο βιοκαταλυτικό σύστημα που παρασκευάσατε στην εργαστηριακή άσκηση να χρησιμοποιηθεί α) σε θερμοκρασία μεγαλύτερη από 50 ο C; β) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ph 8.5; Αιτιολογείστε την απάντησή σας. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Grunwald P (2000), Experimental treatment of the laws of heterogeneous catalysis with immobilized yeast cells Biochemical. Education. 28, Frase J.E. and Bickerstaff G.F (1998). Entrapment in calcium alginate. In Methods in biotechnology Vol 1., Humana Press, Totowa N.J. pp Nilsson K (1985) Methods for immobilizing animal cells. Trends in biotechnology, 5, Δ. Κυριακίδης, (2000) Βιοτεχνολογία, Εκδόσεις Ζήτη. Θεσσαλονίκη. 5. Β. Μακρής, Δ. Κέκος (1993) Στοιχεία Βασικής Βιοτεχνολογίας, Αθήνα 6. H.W. Blanch and D.S. Clark, (1996) Biochemical Engineering, Marcel Dekker Inc. New York. 7. X. Σταμάτης (2003) Στοιχεία ενζυμικής βιοτεχνολογίας και παραγωγής βιοτεχνολογικών προϊόντων Ιωάννινα. 8. C. Ratledge and B. Kristiansen (2001), Basic Biotechnology, Cambridge University Press, Cambridge. 84

97 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ENZYMIKH ΜΕΘΟΔΟΣ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΓΛΥΚΟΖΗΣ Η συγκεκριμένη μέθοδος βασίζεται στη μετατροπή της γλυκόζης σε προϊόν ερυθρού χρώματος, το οποίο είναι αποτέλεσμα της διαδοχικής δράσης των ενζύμων οξειδάση της γλυκόζης και υπεροξειδάση. Αρχικά, η γλυκόζη με τη δράση της οξειδάσης της γλυκόζης μετατρέπεται σε γλυκονικό οξύ, παράγοντας ταυτόχρονα υπεροξείδιο του υδρογόνου. Στη συνέχεια, το υπεροξείδιο του υδρογόνου με τη δράση της υπεροξειδάσης μετατρέπεται παρουσία αμινοαντιπυρίνης και φαινόλης σε προϊόν ερυθρού χρώματος, που παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης σε μήκος κύματος 510 nm. Γλυκόζη + FAD + Η 2O + ½ Ο 2 Γλυκονικό οξύ + FADH 2 + Η 2Ο 2 2Η 2Ο 2+Αμινοαντιπυρίνη+Φαινόλη Οξειδάση της γλυκόζης Υπεροξειδάση 4(4-βενζοκινονο-μονοϊμινο)φαιναζόνη+ 4Η 2O Στην παρούσα άσκηση, η μέτρηση της γλυκόζης θα πραγματοποιηθεί με τη βοήθεια εμπορικού διαγνωστικού σκευάσματος. Το σκεύασμα αυτό χρησιμοποιείται εκτεταμένα για τον προσδιορισμό του επιπέδου γλυκόζης στο ανθρώπινο αίμα. Το διάλυμα εργασίας που χρησιμοποιείται είναι σταθερό για 45 ημέρες στους 4 ο C και αποτελείται από ρυθμιστικό διάλυμα με ph 8 που περιέχει: οξειδάση της γλυκόζης: 18 U/ml υπεροξειδάση: 10 U/ml αμινοφαιναζόνη: 0.25 mm φαινολικό παράγωγο: 10 mm ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα Υδατόλουτρο (37 ºC) Παγόλουτρο Αναδευτήρας (Vortex) Φωτόμετρο 85

98 Υλικά και Αντιδραστήρια Πρότυπο διάλυμα γλυκόζης (1.0 g/l) Διάλυμα άγνωστης συγκέντρωσης γλυκόζης Σιφώνιο του 0.5 ml Σιφώνιο των 5 ml Φούσκα μετάγγισης υγρών (poire) Σωλήνες αραίωσης Διάλυμα εργασίας Εκτέλεση 1. Σε 5 δοκιμαστικούς σωλήνες (δύο για το πρότυπο διάλυμα γλυκόζης, δύο για το διάλυμα άγνωστης συγκέντρωσης γλυκόζης και ένα για το λευκό) που βρίσκονται σε παγόλουτρο προσθέστε από 2 ml διαλύματος εργασίας και 0.1 ml από το κάθε διάλυμα γλυκόζης. Στην περίπτωση του λευκού, αντί για διάλυμα γλυκόζης προστίθεται 0.1 ml απιονισμένου νερού. 2. Τα μείγματα που προκύπτουν αναδεύονται σε αναδευτήρα (Vortex) και τοποθετούνται σε υδατόλουτρο στους 37ºC για 15 λεπτά. 3. Στη συνέχεια οι δοκιμαστικοί σωλήνες απομακρύνονται από το υδατόλουτρο, τα μείγματα αναδεύονται εκ νέου και προωθούνται στο φωτόμετρο, έτσι ώστε να μετρηθεί η απορρόφησή τους. 4. Αφού επιλεγεί στο φωτόμετρο το μήκος κύματος στα 510 nm, μηδενίζεται το όργανο με το λευκό δείγμα και μετρώνται οι απορροφήσεις των διαλυμάτων γνωστής και άγνωστης συγκέντρωσης γλυκόζης. 86

99 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Να υπολογιστεί η συγκέντρωση του άγνωστου διαλύματος γλυκόζης. Για τον υπολογισμό θεωρείστε ότι η καμπύλη αναφοράς της μεθόδου είναι μια ευθεία, η οποία ισχύει για συγκεντρώσεις γλυκόζης στο διάστημα 0-5 g/l. 2. Σε περίπτωση κατά την οποία θα θέλατε να προσδιορίσετε το επίπεδο της γλυκόζης στο αίμα σας με το εμπορικό διαγνωστικό σκεύασμα της ενζυμικής μεθόδου που χρησιμοποιείται στη συγκεκριμένη άσκηση, σε ποιο επίπεδο θα αραιώνατε το δείγμα; Δικαιολογήστε την απάντησή σας. 3. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης σακχαρόζης σε ένα υδατικό διάλυμα πραγματοποιείται με όξινη υδρόλυση του δισακχαρίτη στα συστατικά του σάκχαρα και μέτρηση των αναγωγικών σακχάρων με τη χημική μέθοδο του δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNSA). Είναι δυνατόν, αντί της χημικής μεθόδου του DNSA, να γίνει χρήση της εξεταζόμενης ενζυμικής μεθόδου μέτρησης της γλυκόζης; Δικαιολογήστε την απάντησή σας. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Συνοδευτικό φυλλάδιο του διαγνωστικού σκευάσματος Ενζυματική μέθοδος GOD-PAP για τη μέτρηση σακχάρων της εταιρείας Biosis, Αγ. Δημήτριος, Αθήνα. 2. Εργαστηριακές Ασκήσεις του Μαθήματος Βασική Βιοτεχνολογία (1998). Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π. 3. Ενζυμική Βιοτεχνολογία (1997). I. Κλώνης, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο. 87

100 ΑΣΚΗΣΗ 8 η ΕΝΖΥΜΑ ΣΕ ΟΡΓΑΝΩΜΕΝΕΣ ΝΑΝΟΔΟΜΕΣ ΒΙΟΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗ YΔΡΟΛΥΣΗ ΤΡΙΓΛΥΚΕΡΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗ BIONTHZEΛ ΣΕ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΑ ΜΙΚΚΥΛΙΑ Α. Πολύδερα, Χ. Σταμάτης ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της άσκησης είναι η γνωριμία με τη δυνατότητα των ενζύμων να διατηρούν τις καταλυτικές τους ιδιότητες σε ένα μη συμβατικό βιοκαταλυτικό σύστημα, αυτό των αντίστροφων μικκυλίων, και την εφαρμογή τους για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Συγκεκριμένα, θα προσδιοριστεί η δυνατότητα της λιπάσης από Ηumicola lanuginosa (1,3 ειδικευμένη λιπάση) σε σύστημα αντίστροφων μικκυλίων που σχηματίζει το επιφανειοενεργό ΑΟΤ σε ισοοκτάνιο, να καταλύει: Α) την εκλεκτική υδρόλυση τριγλυκεριδίων που οδηγεί στη παραγωγή μονο και διεστέρων, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως γαλακτωματοποιητές σε τρόφιμα, φαρμακευτικά σκευάσματα ή σκευάσματα καλλυντικών. Β) την παραγωγή, μέσω αντιδράσεων διεστεροποίησης, εστέρων, οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως καύσιμα (βιοντήζελ). ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Όπως είναι γνωστό, η βέλτιστη καταλυτική δράση των ενζύμων έχει άμεση σχέση με τη διαμόρφωσή τoυς. Η θερμoδυναμικά ευνooύμενη διαμόρφωση των πρωτεϊνικών μoρίων καθoρίζεται από ένα δίκτυo δεσμών υδρoγόνoυ, ηλεκτρoστατικών και υδρόφoβων αλληλεπιδράσεων, oι oπoίες εκφράζoνται κατάλληλα μόνo στην περίπτωση πoυ τo ενζυμικό μόριo περιβάλλεται από ένα στρώμα μoρίων νερoύ. Η απώλεια τoυ υδατικoύ στρώματoς ή η διατάραξη της δoμής τoυ είναι δυνατό να οδηγήσει στη διατάραξη της φυσικής διαμόρφωσης των ενζύμων και κατ επέκταση στην απώλεια της ενζυμικής δραστικότητας. Η διατάραξη της δομής του υδατικού στρώματος που περιβάλει ένα ενζυμικό μόριο μπορεί να οφείλεται στην παρoυσία μoρίων oργανικoύ διαλύτη. Λαμβάνoντας υπόψη τo παραπάνω, φαίνεται ότι εκ πρώτης όψεως, η διατήρηση 88

101 των καταλυτικών ιδιoτήτων των ενζύμων, σε συστήματα των oπoίων η περιεκτικότητα σε νερό είναι σημαντικά περιoρισμένη, είναι μάλλoν ανέφικτη. Τo γεγoνός αυτό, απoτέλεσε τoν κύριo ανασταλτικό παράγoντα στo να χρησιμoπoιηθoύν τα ένζυμα για την κατάλυση αντιδράσεων με τη συμμετoχή υδρόφoβων υπoστρωμάτων. H ανάγκη όμως να γίνει εκμεταλλεύσιμη τόσo η τεράστια καταλυτική ικανότητα των ενζύμων, όσo και η χαρακτηριστική τoυς εξειδίκευση ως πρoς τα δoμικά χαρακτηριστικά των υπoστρωμάτων, είχε σαν απoτέλεσμα την εντατικoπoίηση της έρευνας πρoς την κατεύθυνση της εφαρμογής της ενζυμικής κατάλυσης σε συστήματα των οποίων η περιεκτικότητα σε νερό θα ήταν περιoρισμένη, ενώ παράλληλα τα ένζυμα θα διατηρoύσαν τις καταλυτικές τoυς ικανότητες. Tα τελευταία χρόνια σημειώθηκε εντυπωσιακή αύξηση τoυ ερευνητικoύ ενδιαφέρoντoς πρoς την κατεύθυνση αυτή. Απoτέλεσμα της έρευνας πoυ επιτελέσθηκε ήταν να πρoταθoύν διάφoρα συστήματα, γνωστά με τoν όρo μη συμβατικά συστήματα (non-conνentional media), τα oπoία επιτρέπoυν τη διατήρηση της ενζυμικής δραστικότητας σε μέσα πολύ μικρής περιεκτικότητας σε νερό,. Τα συστήματα αυτά μπoρoύν να διαχωρισθoύν σε τρεις βασικές κατηγoρίες: α) τα διφασικά συστήματα υγρού-υγρού, στα οποία η μία φάση είναι υδατική, ενώ η άλλη μη υδατική, αποτελούμενη από π.χ. μη πολικό οργανικό διαλύτη, υπεκρίσιμα ρευστά, ιοντικά υγρά κ.ά. Στην περίπτωση αυτή το ένζυμο μπορεί να βρίσκεται ελεύθερο στην υδατική φάση ή και ακινητοποιημένο σε κάποιο στερεό φορέα. β) τα διφασικά συστήματα υγρού-στερεού, στα οποία λυοφιλιωμένη σκόνη του ενζύμου ή ακόμη και ακινητοποιημένο ένζυμο σε κάποιον στερεό φορέα τοποθετούνται σε μια μη υδατική φάση (π.χ. μη πολικό οργανικό διαλύτη). γ) το ψευδοομογενές διφασικό σύστημα των μικρογαλακτωμάτων νερού σε έλαιο (waterin-oil microemulsions) ή σύστημα αντίστροφων μικκυλίων, όπου το ένζυμο βρίσκεται εγκλωβισμένο στα μικροσταγονίδια νερού που σχηματίζονται, όπως θα δούμε στη συνέχεια. Στο σχήμα 1 παρουσιάζονται οι κυριότερες κατηγορίες μη συμβατικών συστημάτων. Στην εργαστηριακή άσκηση θα εξοικειωθείτε με την εφαρμογή των βιοκαταλυτών σε αντίστροφα μικκύλια για την κατάλυση αντιδράσεων σύνθεσης προϊόντων υψηλής αξίας. 89

102 Α} E E Β) Γ) E E E E E E E E E E E E Δ) Ε) E E E E E E E E E Οργανική φάση Φορέας ακινητοποίησης Υδατική φάση E Ένζυμο Σχήμα 1. Σχηματική παράσταση μη συμβατικών συστημάτων: α και β) διφασικά υγρά συστήματα νερού/οργανικού μη πολικού διαλύτη, γ) ο βιοκαταλύτης είναι σε μoρφή λυoφυλιωμένης σκόνης σε οργανικό μη πολικό διαλύτη, δ) ο βιοκαταλύτης είναι ακινητοποιημένος σε στερεό φορέα ή ε) ο βιοκαταλύτης είναι εγκλωβισμένος στο εσωτερικό αντίστροφων μικκυλίων. Μικρογαλακτώματα και αντίστροφα μικκύλια Με τον γενικό όρο μικρογαλάκτωμα (microemulsions) αναφερόμαστε σε συστήματα, τα οποία αποτελούν λεπτότατες διασπορές νερού μέσα σε έλαιο, ή και το αντίστροφο, σταθεροποιημένες από επιφανειοενεργά μόρια. Ο όρος έλαιο αναφέρεται σε οποιονδήποτε οργανικό μη πολικό διαλύτη. Η οπτική διαύγεια του συστήματος των μικρογαλακτωμάτων οφείλεται στη λεπτότατη διασπορά της υδατικής φάσης στην οργανική (ή και το αντίστροφο). Η διασπορά αυτή οδηγεί στο σχηματισμό 90

103 μικροσταγονιδίων, διαστάσεων μικρότερων του ενός τετάρτου του μήκους κύματος του φωτός. Η δομή των μικρογαλακτωμάτων εξαρτάται άμεσα τόσο από τη φύση των συστατικών, όσο και από την αναλογία τους στο σύστημα. Έτσι, όταν το σύστημα είναι πλούσιο σε νερό αλλά φτωχό σε έλαιο, τότε αναφερόμαστε σε μικρογαλακτώματα ελαίου σε νερό (oil-in-water microemulsions), ενώ όταν το σύστημα είναι πλούσιο σε έλαιο αλλά φτωχό σε νερό, τότε μιλάμε για μικρογαλακτώματα νερού σε έλαιο (water-in-oil microemulsions). Στην πρώτη περίπτωση έχουμε το σχηματισμό μικροσταγονιδίων ελαίου σε νερό, τα οποία περικλείονται από τα μόρια του επιφανειοενεργού (κανονικά μικκύλια), ενώ στη δεύτερη περίπτωση σχηματίζονται μικροσταγονίδια νερού τα οποία περικλείονται από μόρια του επιφανειοενεργού, ενώ την εξωτερική συνεχή φάση του συστήματος αποτελεί το έλαιο (αντίστροφα μικκύλια, reverse micelles). Το ανιοντικό επιφανειοενεργό δις-(2-αιθυλεξυλ)σουλφοηλεκτρικό νάτριο (ΑΟΤ) έχει την ικανότητα να σχηματίζει αντίστροφα μικκύλια σε διάφορους οργανικούς διαλύτες. Τα αντίστροφα μικκύλια που σχηματίζονται στο σύστημα ΑΟΤ/ νερό/ οργανικός διαλύτης έχουν την ικανότητα να ενσωματώνουν στο εσωτερικό τους σημαντικές ποσότητες νερού (βλ. σχήμα 2). Η διάμετρος των ενυδατωμένων αντίστροφων μικκυλίων κυμαίνεται από 15 έως και πάνω από 100 Å, στο εσωτερικό των οποίων είναι δυνατό να εγκλωβισθούν ιόντα, πολικά μόρια, αλλά και βιομόρια (ένζυμα, πρωτεΐνες, καταλυτικά αντισώματα, DNA αλλά και κύτταρα). Κύριο χαρακτηριστικό αποτελεί το γεγονός ότι τόσο η διάμετρος, όσο και η γενικότερη μορφή των αντίστροφων μικκυλίων εξαρτάται άμεσα από το βαθμό ενυδάτωσης του συστήματος, όπως εκφράζεται από το μοριακό λόγο του νερού ως προς το επιφανειοενεργό wo: w o =[H2O]/[AOT] Η δυνατότητα ενζυμικής τροποποίησης τόσο υδρόφιλων, όσο και υδρόφοβων υποστρωμάτων στο ίδιο σύστημα αποτελεί ένα σημαντικό πλεονέκτημα των αντίστροφων μικκυλίων έναντι άλλων μη συμβατικών συστημάτων. Η δυνατότητα αυτή πηγάζει από το γεγονός ότι, ανάλογα με τη φύση τους, τα υποστρώματα έχουν την ικανότητα να εντοπίζονται είτε στην υδατική διεσπαρμένη μικροφάση του συστήματος, είτε στην μικκυλιακή μεσεπιφάνεια, είτε ακόμη και στον εξωτερικό οργανικό διαλύτη στην περίπτωση που πρόκειται για υδρόφοβα υποστρώματα. Σε γενικές γραμμές, η δράση των ενζύμων στα αντίστροφα μικκύλια εξαρτάται από την τιμή του λόγου wο εμφανίζοντας τη μέγιστη δραστικότητα για τιμές wο =

104 Οργανικός διαλύτης S Η 2Ο P Σχήμα 2. Ενζυμικά καταλυόμενη αντίδραση σε αντίστροφα μικκύλια: Το υπόστρωμα S είναι υδατοδιαλυτό ενώ το προϊόν Ρ είναι περισσότερο υδρόφοβο και κατανέμεται μεταξύ της συνεχούς οργανικής και της διεσπαρμένης υδατικής φάσης του συστήματος. Γενικά χαρακτηριστικά των λιπασών Οι λιπάσες (Ε.C ) είναι ένζυμα υδρολυτικά, τα οποία χαρακτηρίζονται από την ικανότητα τους να καταλύουν αντιδράσεις υδρόλυσης των εστερικών δεσμών των τριγλυκεριδίων προς λιπαρά οξέα και γλυκερόλη. Τα ένζυμα αυτά έχουν απομονωθεί από ζώα, φυτά, βακτήρια ή μύκητες, ενώ πολλά από αυτά παράγονται εξαιτίας του βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος σε μεγάλη κλίμακα. 92

105 Ανάλογα με τη θέση υδρόλυσης των εστερικών δεσμών των τριγλυκεριδίων, οι λιπάσες διακρίνονται σε: α) 1,3 τοπo-ειδικευμένες λιπάσες, oι oπoίες υδρoλύoυν τoυς εστερικoύς δεσμoύς των τριγλυκεριδίων στις θέσεις 1 και 3 αντίστoιχα. β) μη ειδικευμένες λιπάσες, όπου δεν παρoυσιάζoυν κάπoια συγκεκριμένη εξειδίκευση ως πρoς τη θέση υδρόλυσης των εστερικών δεσμών των τριγλυκεριδίων 1 OCOR Λιπάση OH 2 OCOR + Η 2 Ο OCOR + 2 RCOOH 3 OCOR OH Τριλαυρίνη 2-Μονολαυρίνη Λαυρικό οξύ R:CH 3 (CH 2 ) 10 - Κύριο χαρακτηριστικό της δράσης των λιπασών αποτελεί το γεγονός ότι, σε αντίθεση με άλλα υδρολυτικά ένζυμα, τα φυσικά τους υποστρώματα είναι αδιάλυτα στο νερό, ενώ η βέλτιστη καταλυτική τους δράση παρατηρείται μόνο όταν εντοπίζονται σε μεσεπιφάνειες μεταξύ ελαίου και νερού, όπως συμβαίνει στην περίπτωση των αντίστροφων μικκυλίων. Το βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον για τη δυνατότητα των λιπασών να καταλύουν αντιδράσεις σε μη συμβατικά συστήματα, που οδηγούν στη σύνθεση ενώσεων υψηλής προστιθέμενης αξίας (μονο και δι-γλυκερίδια, εστέρες λιπαρών οξέων, σακχαροεστέρες κλπ), αφορά στην επίτευξη αντιδράσεων υδρόλυσης, εστεροποίησης και διεστεροποίησης λιπιδίων, αλλά και άλλων ενώσεων. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όργανα Φωτόμετρο (715nm), Vortex, υδατόλουτρο 30 o C φυγόκεντρος, σιφώνια του 1, 2 και 5 ml, αυτόματη πιπέτα μl, υάλινη πιπέτα Pasteur, σωλήνες με βιδωτό πώμα. Αέριος χρωματογράφος (GC), Υγρός χρωματογράφος υψηλής πίεσης (HPLC) 93

106 Διαλύματα Α. 5% υδατικό διάλυμα οξικού χαλκού σε πυριδίνη pη 6.2 Β. Διάλυμα λαυρικού οξέος σε ισοοκτάνιο 30 mμ Γ. Διάλυμα 50 mm ΑΟΤ και 100 mμ τριλαυρίνης σε ισοοκτάνιο. Δ. Υδατικό διάλυμα λιπάσης από Ηumicola lanuginosa Ε. Ρυθμιστικό διάλυμα Τris/HCl pη=7.5 α) Κατασκευή καμπύλης αναφοράς για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης των ελεύθερων λιπαρών οξέων 1. Σε 5 δοκιμαστικούς σωλήνες με βιδωτό πώμα προσθέστε με σιφώνιο 0.5 ml διαλύματος Α (οξικού χαλκού pη=6.2) και τις αντίστοιχες ποσότητες ισοοκτανίου και διαλύματος Β (30 mμ λαυρικό οξύ σε ισοοκτάνιο), σύμφωνα με τον πίνακα που ακολουθεί. Σωλήνας Διάλυμα Α Ισοοκτάνιο Διάλυμα Β μmol λαυρικού (ml) (ml) (ml) οξέος * * Συμπληρώστε την τελευταία στήλη του πίνακα σύμφωνα με τα δεδομένα που σας δίνονται. 2. Τα διαλύματα αναδεύονται για 30 sec και παραμένουν σε ηρεμία για 5 min τουλάχιστον, με σκοπό το διαχωρισμό των φάσεων. 3. Επιλέξτε στο φωτόμετρο μήκος κύματος 715 nm. Μηδενίστε το όργανο με ισοοκτάνιο. Για τη μέτρηση της απορρόφησης των δειγμάτων, παίρνετε προσεκτικά (με τη βοήθεια γυάλινης πιπέτας) 1 ml της οργανικής φάσης (υπερκείμενη φάση) από κάθε σωλήνα. 94

107 β) Προσδιορισμός της δράσης της λιπάσης σε αντίστροφα μικκύλια κατά την υδρόλυση της τριλαυρίνης- Επίδραση του βαθμού ενυδάτωσης w0. 1. Σε 5 δοκιμαστικούς σωλήνες (B1-B5) με βιδωτό πώμα προσθέστε με σιφώνιο 0.5 ml διαλύματος οξικού χαλκού pη =6.2 και 2 ml ισοοκτανίου. 2. Σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα (Α) με πώμα προσθέστε 2 ml διαλύματος Γ (50 mμ ΑΟΤ/100 mμ τριλαυρίνης σε ισοοκτάνιο). 3. Στον σωλήνα Α προσθέστε 10 μl ρυθμιστικού διαλύματος Ε. Αναδεύστε αμέσως το μίγμα σε Vortex, έως ότου το διάλυμα γίνει διαυγές. Προσθέστε 8 μl ενζυμικού διαλύματος και αναδεύστε αμέσως. Η προσθήκη του ενζυμικού διαλύματος σηματοδοτεί την έναρξη της αντίδρασης t=0. 4. Σε χρόνους t = 1, 4, 8, 12 και 20 min 0.2 ml δείγματος λαμβάνονται με αυτόματη πιπέτα και μεταφέρονται στους αντίστοιχους σωλήνες B1-B5. Οι σωλήνες αναδεύονται για 30 sec και φυγοκεντρούνται σε 2500 rpm για 5 min. 5. Μετρήστε την απορρόφηση της οργανικής φάσης στα 715 nm, όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως. Η πιο πάνω διαδικασία επαναλαμβάνεται για διαφορετικό βαθμό ενυδάτωσης wο. Συγκεκριμένα στο στάδιο 3 (σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα Β που περιέχει 2 ml διαλύματος Γ 50 mμ ΑΟΤ/100 mμ τριλαυρίνης σε ισοοκτάνιο) προσθέστε 28 μl ρυθμιστικού διαλύματος (αντί για 10 μl) και 8 μl ενζυμικού διαλύματος. Προσδιορίστε την ενζυμική δραστικότητα με τον ίδιο τρόπο (για χρονικά διαστήματα t = 1, 4, 8, 12 και 20 min) όπως προηγουμένως. γ) Σύνθεση εστέρων λιπαρών οξέων (βιοντήζελ) σε αντίστροφα μικκύλια Στη συνέχεια, θα μελετήσουμε την ικανότητα της λιπάσης να καταλύει αντιδράσεις διεστεροποίησης που οδηγούν στην παραγωγή εστέρων, οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως καύσιμα (βιοντήζελ). Mε τον όρο βιοντήζελ αναφερόμαστε σε εστέρες (συνήθως μεθυλ- και αιθυλ εστέρες λιπαρών οξέων) που προκύπτουν με διεστεροποίηση φυτικών ελαίων ή ζωικών λιπών με χημικό ή βιοτεχνολογικό τρόπο. Η βιοκαταλυτική αυτή διεργασία που θα εξετάσουμε στην παρούσα άσκηση θα γίνει στο ίδιο σύστημα αντίστροφων μικκυλίων που χρησιμοποιήσαμε για την εκλεκτική υδρόλυση της 95

108 τριλαυρίνης. Συγκεκριμένα, θα μελετηθεί η ικανότητα της λιπάσης να καταλύει τη διεστεροποίηση τριγλυκεριδίων με αλκοόλες, όπως η αιθανόλη, σύμφωνα με την αντίδραση: 1 2 OCOR OCOR OH Λιπάση + CH 3 CH 2 OH OCOR + 2 RCOOCH 2 CH 3 3 OCOR OH H παραπάνω αντίδραση οδηγεί στη σύνθεση αιθυλεστέρων λιπαρών οξέων (RCOOCH2CH3), οι οποίοι χρησιμοποιούνται ως βιοντήζελ. Εκτέλεση πειράματος 1. Τοποθετείστε σε δοκιμαστικό σωλήνα με βιδωτό καπάκι 1 ml διαλύματος 50 mm ΑΟΤ σε ισοοκτάνιο, στο οποίο περιέχεται 200 mm αιθανόλης και 100 mm τριγλυκεριδίου (π.χ. τριελαΐνης ή ελαιόλαδο). Αφαιρέστε ποσότητα περίπου 50 μl, με σκοπό την ανάλυση του δείγματος με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC). Τοποθετήστε (όπως θα σας δείξει ο υπεύθυνος της άσκησης) μια σταγόνα από το δείγμα στην πλάκα χρωματογραφίας. 2. Στο παραπάνω διάλυμα προσθέστε 10 μl υδατικού διαλύματος της λιπάσης από Ηumicola lanuginosα (που βρίσκεται σε ρυθμιστικό διάλυμα Τris/HCl pη=7.5). 3. Αναδεύστε αμέσως το σύστημα σε Vortex για 30 sec, έως ότου το διάλυμα γίνει διαυγές. (Τι συμπεραίνετε από αυτό;) 4. Επωάστε το μείγμα σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 25 ο C). Σε χρονικά διαστήματα 10 και 30 min αφαιρέστε ποσότητα περίπου 50 μl, με σκοπό την ανάλυση του δείγματος με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC). Τοποθετήστε μια σταγόνα από το δείγμα στην πλάκα χρωματογραφίας. 5. Σε τακτά χρονικά διαστήματα (π.χ. 10 λεπτά) αφαιρέστε με μικροσύριγγα από το 96

109 σύστημα της αντίδρασης δείγμα όγκου 1-2 μl και αναλύστε το περιεχόμενό του στον αέριο χρωματογράφο ή στον υγρό χρωματογράφο HPLC, σύμφωνα με τις υποδείξεις του υπεύθυνου. Σημείωση Η ανάλυση γίνεται με τη βoήθεια αέριoυ χρωματoγράφoυ, o oπoίoς είναι εφoδιασμένoς με γυάλινη στήλη τύπoυ 1%-Dexsil 300 (Supelco) μήκoυς ενός μέτρoυ. To φέρoν αέριo είναι άζωτo, τoυ oπoίoυ η ταχύτητα ρoής είναι 20 ml/min. H θερμoκρασία της στήλης διατηρείται σταθερή στoυς 185 C για χρoνικό διάστημα 2 min από την εισαγωγή τoυ δείγματoς και στη συνέχεια αυξάνεται με ρυθμό 10 C/min έως τoυς 300 C, όπoυ και διατηρείται σταθερή μέχρι τo τέλoς της ανάλυσης. Η θερμoκρασία τoυ ανιχνευτή ιoνισμoύ φλόγας (FID) και τoυ θαλάμoυ εισαγωγής δείγματoς είναι 300 C. Ο πρoσδιoρισμός της συγκέντρωσης των σχηματιζόμενων εστέρων γίνεται με τη βoήθεια καμπύλης αναφoράς. Συγκεκριμένα, στις ίδιες πειραματικές συνθήκες πoυ αναφέρoνται παραπάνω, αναλύoνται δείγματα τα oπoία περιέχoυν καθoρισμένες πoσότητες (από 5 έως 50 mm) του τριγλυκεριδίου και του παραγόμενου εστέρα. Τo εμβαδόν της επιφάνειας κάτω από τις αντίστoιχες κoρυφές στo χρωματoγράφημα υπoλoγίζεται και καταγράφεται με τη βoήθεια αυτόματoυ oλoκληρωτή. H ανάλυση της σύστασης του μίγματος της αντίδρασης γίνεται με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης HPLC χρησιμοποιώντας στήλη μbondapack C18, σύστημα έκλουσης ακετονιτρίλιο:χλωρομεθάνιο:τετραϋδροφουράνιο:οξικό οξύ (70:20:20:0.8 κ.ό.) με ροή 1 ml/min. Η ανίχνευση των κορυφών γίνεται με ανιχνευτή διάθλασης του φωτός ή με ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας UV στα 220 nm. Ο πρoσδιoρισμός της συγκέντρωσης των σχηματιζόμενων εστέρων γίνεται με τη βoήθεια καμπύλης αναφoράς, όπως προηγουμένως. Χρωματογραφία Λεπτής Στιβάδας (ΤLC) -Αναλύστε χρωματογραφικά, παράλληλα με τα δείγματα από την αντίδραση και δείγμα που περιέχει 50 mm ελαϊκό οξύ σε 50 mm AOT σε ισοοκτάνιο. -Αναπτύξτε την πλάκα χρωματογραφίας σε σύστημα εξανίου:αιθέρα:οξικού οξέος (70:30:1 κ.ό.). 97

110 -Στεγνώστε την πλάκα στον απαγωγό με τη βοήθεια ρεύματος αέρα. -Εμφανίστε το χρωματογράφημα εκθέτοντας την χρωματογραφική πλάκα σε ατμούς ιωδίου (όπως θα σας δείξει ο υπεύθυνος της άσκησης). Σημείωση: Καθώς η εμφάνιση του χρωματογραφήματος με ατμούς ιωδίου χάνεται μετά την απομάκρυνση της χρωματογραφικής πλάκας από το περιβάλλον ιωδίου, θα πρέπει να σημειώσετε με μολύβι τα όρια κάθε κηλίδας που εμφανίζεται στο χρωματογράφημα. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1) Κατασκευάστε την καμπύλη αναφοράς για τον προσδιορισμό της ποσότητας του ελεύθερου λιπαρού οξέος συναρτήσει της απορρόφησης στα 715 nm. Ποιος ο συντελεστής συσχέτισης (R 2 ) της ευθείας του παραπάνω διαγράμματος; 2) Ποιος είναι ο μοριακός λόγος wο (βλ. εξίσωση 1) στα δείγματα Α και Β αντίστοιχα; 3) Υπολογίστε την ταχύτητα δράσης της λιπάσης στις δύο περιπτώσεις Α και Β σε μmol λιπαρού οξέος ανά 1 min ανά 1 μl ενζυμικού διαλύματος. 4) Λαμβάνοντας υπόψη ότι η λιπάση από Ηumicola lanuginosα είναι 1,3 ειδικευμένη λιπάση, ποια είναι τα πιθανά προϊόντα της αντίδρασης υδρόλυσης της τριλαυρίνης; 5) Πώς πιστεύεται κατανέμονται τα προϊόντα της αντίδρασης υδρόλυσης τριγλυκεριδίων στις μικροφάσεις του συστήματος; 6) Σε ένα μικρογαλάκτωμα που σχηματίζει 50 mm ΑΟΤ σε ισοοκτάνιο με wo=10 και στο οποίο εξελίσσεται μια ενζυμικά καταλυόμενη αντίδραση εστεροποίησης ενός λιπαρού οξέος με αρχική συγκέντρωση 100 mm και μια αλκοόλης με αρχική συγκέντρωση 50 mm, πόσο θα μεταβληθεί η τιμή του λόγου wo όταν η απόδοση της αντίδρασης εστεροποίησης φτάσει 80%; 7) Αν υποτεθεί ότι η ενζυμική δραστικότητα δεν μεταβάλλεται από το βαθμό ενυδάτωσης wo, τότε πώς θα εξαρτάται η απόδοση της υδρόλυσης της τριλαυρίνης στα αντίστροφα μικκύλια από το μοριακό λόγο wo; 98

111 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Ballesteros, Β. U. Bornscheuer, A. Capewell, D. Combes, J-S. Condoret, K. Koening, F.N. Kolisis, A. Marty, U. Menge, T. Scheper, H. Stamatis, A. Xenakis.(1995) Reνiew Article: Enzymes in non-conνetional phases. Biocatalysis and Biotransfomations, 13, Luisi, P.L. and Magid, L., (1986) Solubilization of enzymes and nucleic acids in hydrocarbon micellar solutions, CRC Crit. Reν. Biochem., 20, Lowry, R.R., Tinsley, J.(1976) Rapid colorimetric determination of free fatty acids. J.Am.Oil Chem.Soc., 53, Stamatis, Η., Xenakis, Α. and Kolisis, F.Ν. (2001). Synthesis of esters catalyzed by lipases in w/o microemulsions In: Methods in Biotechnology, Εnzymes in Nonaqueous Solνents, (Νulfson et al. Eds), Νol. 15, Chapter 28, Humana Press Inc. Totowa, NJ, pp Stamatis, Η., Xenakis, Α. and Kolisis, F.Ν. (1999), Reνiew Article: Bioorganic reactions in microemulsions: The case of lipase. Biotechnology Adνances, 17(3), X. Σταμάτης (2007) Στοιχεία ενζυμικής βιοτεχνολογίας και παραγωγής βιοτεχνολογικών προϊόντων Ιωάννινα 7. Cho S-W, Rhee, J.S., 1993 Immobilization of lipase for effective interesterification of fats and oils in organic solvent. Biotechnology and Bioengineering 41,

112 ΑΣΚΗΣΗ 9 η ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΜΕ PCR - ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ Α. Χατζηκυριακίδου Χ. Σταμάτης Εισαγωγή Οι ΓΤΟ είναι οργανισμοί, των οποίων το γενετικό υλικό δεν έχει τροποποιηθεί με πολλαπλασιασμό ή /και φυσικό ανασυνδυασμό, αλλά με την εισαγωγή τροποποιημένου γονιδίου ή γονιδίου που προέρχεται από άλλη ποικιλία ή είδος. H ανάπτυξη της βιοτεχνολογίας και της γενετικής μηχανικής τα τελευταία χρόνια οδήγησε στη δημιουργία Γενετικά Τροποποιημένων Οργανισμών, με στόχο τη χρήση τους για την παραγωγή προϊόντων για κατανάλωση. Η επανάσταση αυτή αποτελεί σήμερα επίκεντρο διεθνών συζητήσεων, δημιουργώντας φανατικά αντίθετα στρατόπεδα, που συνηγορούν υπέρ ή κατά της χρήσης των οργανισμών αυτών ή των προϊόντων τους. Ανησυχία υπάρχει όταν Γενετικά Τροποποιημένοι Οργανισμοί απελευθερώνονται σε ένα μη ελεγχόμενο περιβάλλον. Η αλληλεπίδραση των Γενετικά Τροποποιημένων Οργανισμών με άλλα σύνθετα βιολογικά συστήματα, όπως το ανθρώπινο σώμα ή τα φυσικά οικοσυστήματα, δε μπορεί, σε πολλές περιπτώσεις, να προβλεφθεί ή να εξεταστεί πλήρως, χωρίς να υπάρχει σωστό σχέδιο διαχείρισης που να λαμβάνει υπόψη όλα τα δεδομένα του περιβάλλοντος ελευθέρωσης. Αβεβαιότητες που περιβάλλουν τη διαδικασία της γενετικής τροποποίησης και τη χρήση γενετικά τροποποιημένων προϊόντων έχουν οδηγήσει πολλές χώρες, συμπεριλαμβανομένων και των κρατών-μελών της Ευρωπαϊκής Ένωσης, να ρυθμίσουν την ανάπτυξη και χρήση των Γενετικά Τροποποιημένων Οργανισμών. Η ΕΕ επιχείρησε να αντιμετωπίσει το θέμα αρκετά νωρίς με την υιοθέτηση συγκεκριμένων Οδηγιών 1 και Κανονισμών, ώστε να εξασφαλιστεί ότι οι Γενετικά Τροποποιημένοι Οργανισμοί δε θα εκθέσουν σε κινδύνους την υγεία ή το περιβάλλον. 1 Όλα τα τρόφιμα και τροφές, που αποτελούνται, περιέχουν, ή παράγονται από Γ.Τ.Ο., πρέπει να έχουν την κατάλληλη σήμανση, σύμφωνα με πρόσφατη οδηγία της Ε.Ε.. Ο σκοπός είναι να ενημερωθούν οι καταναλωτές και οι αγρότες για την ακριβή φύση και τα χαρακτηριστικά των τροφίμων ή τροφών, έτσι ώστε να μπορούν να κάνουν ενημερωμένες επιλογές. Έχει δημοσιευτεί σχετικός Κανονισμός της ΕΕ που καθορίζει ως κατώτατο όριο ανιχνευσιμότητας Γ.Τ.Ο. το 0.9% για τη σήμανση. 100

113 Πως επιτυγχάνεται η γενετική τροποποίηση σε φυτά; To πρώτο βήμα στη γενετική τροποποίηση αφορά στον εντοπισμό της πρωτεΐνης, που έχει τη δυναμική να βελτιώσει τη λειτουργία ή κάποιο χαρακτηριστικό του φυτού. Ευρύτερα διαδεδομένη είναι η κατηγορία ΓΤ φυτών, στα οποία έχει εισαχθεί ένα γονίδιο από το βακτήριο Bacillus thuringiensis (Bt) που απομονώνεται από το έδαφος, το οποίο παράγει μια πρωτεΐνη γνωστή με το όνομα δέλτα-ενδοτοξίνη, η οποία είναι υπεύθυνη για τη θανάτωση της κάμπιας που προσβάλλει καλλιέργειες καλαμποκιού. Το δεύτερο βήμα αφορά στην απομόνωση του γονιδίου που κωδικεύει την πρωτεΐνη. Το γονίδιο αυτό θα πρέπει να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του οργανισμού στόχου με τη βοήθεια ενός φορέα κλωνοποίησης. Το τρίτο βήμα αφορά στη μηχανική του γονιδίου, ώστε να εξασφαλιστεί η έκφρασή του στο κύτταρο του ξενιστή. Εδώ θα πρέπει να αφαιρεθούν οι μη κωδικοποιητικές αλληλουχίες (ιντρόνια) από το γονίδιο και να προστεθούν ή να τροποποιηθούν οι αλληλουχίες υποκινητή ή /και τερματισμού, που είναι υπεύθυνες για την σύνδεση της RNA πολυμεράσης και την έναρξη της μεταγραφής ή τον τερματισμό της μεταγραφής, αντίστοιχα. Κατά συνέπεια, οι αλληλουχίες αυτές διασφαλίζουν την αποτελεσματική έκφραση του γονιδίου στο κύτταρο-στόχο. Ο πλέον συνηθισμένος υποκινητής που χρησιμοποιείται είναι ο υποκινητής (προαγωγέας) 35S από τον ιό μωσαϊκής του κουνουπιδιού (CaMV 35S). Ο φυσικός αυτός υποκινητής ενεργοποιεί τη διαδικασία της μεταγραφής σε όλα τα φυτικά κύτταρα. Παράλληλα, η πλέον διαδεδομένη αλληλουχία τερματισμού που χρησιμοποιείται στα ΓΤ φυτά είναι αυτή της nopaline synthase (NOS) από το Agrobacterium tumefaciens. Η μία ή και οι δύο αυτές αλληλουχίες εντοπίζονται στο 85% των ΓΤ φυτών. Ανίχνευση Γενετικά Τροποποιημένων Οργανισμών Δύο μέθοδοι χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων γονιδίων σε τρόφιμα και φυτά. Η πρώτη μέθοδος βασίζεται στην εφαρμογή της ενζυμοσύνδετης ανοσοπροσροφητικής μέτρησης (enzyme-linked immunosorbent assay) ELISA για τον προσδιορισμό συγκεκριμένων πρωτεϊνών, που παράγονται από γενετικά τροποποιημένα φυτά. Η μέθοδος ELISA μπορεί να εφαρμοσθεί μόνο σε υλικό που δεν έχει υποστεί κατεργασία, η οποία είναι δυνατό να οδηγήσει σε μετουσίωση και υδρόλυση των προς ανίχνευση πρωτεϊνών. Καθώς η μέθοδος ELISA ανιχνεύει συγκεκριμένες πρωτεΐνες 101

114 που παράγονται από ΓΤ φυτά, η μέθοδος θα πρέπει να εξειδικεύεται για κάθε ΓΤ είδος. Για παράδειγμα, η μέθοδος Βt ELISA μπορεί να ανιχνεύσει μόνο καλαμπόκι που περιέχει το γονίδιο Βt (γονίδιο από το βακτήριο Bacillus thuringiensis (Bt) και όχι άλλο ΓΤ τύπο καλαμποκιού (π.χ που εμφανίζει ανθεκτικότητα σε ζιζάνια). Παρ όλα αυτά, η μέθοδος ELISA είναι μια οικονομική και αξιόπιστη μέθοδος. Η δεύτερη μέθοδος βασίζεται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), με την οποία ανιχνεύονται αλληλουχίες DNA που έχουν εισαχθεί σε ΓΤ φυτά. Σε αντίθεση με τις πρωτεΐνες, το DNA είναι ένα σχετικά σταθερό μόριο, γεγονός που επιτρέπει την απομόνωση άθικτων τμημάτων DNA, ακόμη και από τρόφιμα που έχουν υποβληθεί σε υψηλού βαθμού κατεργασία. Τα τμήματα αυτά του DNA μπορούν να ενισχυθούν με PCR και έτσι να ανιχνευθούν και να χαρακτηριστούν. Η εφαρμογή της τεχνικής της PCR σε πραγματικό χρόνο (real-time PCR) μπορεί επίσης να ποσοτικοποιήσει το ΓΤ υλικό σε ένα δείγμα. Σε αντίθεση με τη μέθοδο ELISA, η μέθοδος ανίχνευσης ΓΤ υλικού με βάση την PCR μπορεί να ανιχνεύσει το 85% των ΓΤ φυτών. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι, η γενετική μηχανική χρησιμοποιεί ένα μικρό αριθμό ρυθμιστικών αλληλουχιών (του προαγωγέα και αυτή του τερματισμού) για να καταστεί εφικτός ο έλεγχος της έκφρασης των εισαγόμενων γονιδίων. Οι αλληλουχίες αυτές είναι κοινές στα περισσότερα ΓΤ φυτά. Οι δύο από τις πλέον κοινές αλληλουχίες, ο υποκινητής (προαγωγέας) 35S από τον ιό μωσαϊκής του κουνουπιδιού και η αλληλουχία τερματισμού της nopaline synthase (NOS) από Agrobacterium tumefaciens, ανιχνεύονται στα πλαίσια της παρούσας άσκησης. 102

115 Δείγμα τροφίμου προς ανάλυση Ανίχνευση ΓΤO με PCR Ανίχνευση ΓΤO με ELISA Eκχύλιση DNA Επιβεβαίωση απομόνωσης φυτικού DNA. Ανίχνευση με PCR του γονιδίου χλωροπλάστη (PSII) Ναι. To φυτικό DNA μπορεί περαιτέρω να αναλυθεί Οχι. To φυτικό DNA δεν μπορεί περαιτέρω να αναλυθεί Είναι το DNA ΓΤ; Ανίχνευση με PCR για τον υποκινητή 35S και την αλληλουχία τερματισμού της nopaline synthase (NOS) Δεν μπορεί να εξαχθεί συμπέρασμα Ναι. Ανιχνεύθηκε ΓΤ DNA Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε τροποποιημένο γενετικό υλικό με real time PCR Σχηματική απεικόνιση της μεθοδολογίας ανίχνευσης ΓΤΟ σε φυτά 103

116 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η μέθοδος επιτρέπει την ταχύτατη παραγωγή εκατομμυρίων αντιγράφων της επιθυμητής αλληλουχίας του DNA και βασίζεται στη δράση μιας θερμοσταθερής DΝΑ πολυµεράσης, που αποµονώνεται από το θερµόφιλο βακτήριο Τhermus aquaticus. Το ένζυμο αυτό είναι σταθερό σε υψηλότερες θερµοκρασίες από ότι οι ευκαρυωτικές DΝΑ πολυμεράσες και για το λόγο αυτό, δεν µετουσιώνεται με θέρµανση. Στο μίγμα της αντίδρασης είναι απαραίτητη η παρουσία i) της δίκλωνης αλληλουχίας του DNA που πρόκειται να ενισχυθεί (μήτρα), ii) δύο συνθετικών DΝΑ ολιγονουκλεοτιδίων (primers), το καθένα από τα οποία θα είναι συµπληρωματικό με την αλληλουχία ενός κλώνου της δίκλωνης έλικας του υπό ενίσχυση τμήματος DΝΑ στα δύο αντίθετα άκρα της επιλεγμένης περιοχής, iii) τεσσάρων 5 -τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοσιδίων (dntps), iv) ιόντων μαγνησίου. Η αυτοµατοποίηση της όλης διεργασίας επιτρέπει τον πολλαπλασιασμό ενός κλάσματος DΝΑ µέσα σε λίγες ώρες. Οι γνώσεις σχετικά µε την αλληλουχία του DNA που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί χρησιµοποιούνται για το σχεδιασµό των δύο συνθετικών DΝΑ ολιγονουκλεοτιδίων (primers) μεγέθους bp, το καθένα από τα οποία θα είναι συµπληρωματικό με τα άκρα του υπό ενίσχυση τμήματος. Τα συγκεκριµένα ολιγονουκλεοτίδια λειτουργούν ως εκκινητές για την in vitro σύνθεση και καθορίζουν το τµήµα του DΝΑ που θα πολλαπλασιασθεί. Η PCR ξεκινά µε ένα δίκλωνο µόριο DΝΑ και κάθε κύκλος της αντίδρασης αρχίζει µε βραχεία θέρµανση στους 95 ο C, ώστε να διαχωριστούν οι δύο κλώνοι. Ακολουθεί το στάδιο υβριδισμού των εκκινητών στα άκρα του υπό ενίσχυση τμήματος DNA, με τα οποία οι εκκινητές είναι συμπληρωματικοί λόγω του κατάλληλου σχεδιασμού της αλληλουχίας τους. Η θερμοκρασία υβριδισμού κυμαίνεται μεταξύ των τιμών ο C. Στη συνέχεια, σε θερμοκρασία 72 ο C πραγματοποιείται η σύνθεση της θυγατρικής αλυσίδας βάσει της συμπληρωματικότητας από τη δράση της DNA πολυμεράσης. Τα παραπάνω 3 στάδια επαναλαμβάνονται φορές, ώστε να προκύψουν εκατομμύρια αντίγραφα της υπό ενίσχυση αλληλουχίας DNA. 104

117 5 3 Αλληλουχία στόχος δίκλωνου DNA 3 5 Θέρμανση στους 95 ο C-Αποδιάταξη Υβριδισμός εκκινητών Στάδιο πολυμερισμού από την DNA πολυμεράση για την 5 3 σύνθεση του DNA Επανάληψη της διαδικασίας φορές Εκατομμύρια αντίτυπα της αρχικής αλληλουχίας Παρατηρήσεις Καθώς το ένζυμο DΝΑ πολυµεράση δεν µετουσιώνεται με θέρµανση, δεν είναι απαραίτητο να προστίθεται ξανά µετά από κάθε κύκλο της αντίδρασης. Καθώς η όλη διεργασία διεξάγεται επαναληπτικά, τα νεοσυντεθειµένα κλάσµατα λειτουργούν µε τη σειρά τους ως εκµαγεία και µέσα σε λίγους κύκλους το επικρατέστερο DΝΑ είναι παρόµοιο µε την αλληλουχία που περιορίζεται από τους εκκινητές στο αρχικό εκµαγείο. Ο κάθε κύκλος διπλασιάζει την ποσότητα του DΝΑ που είχε συντεθεί στον προηγούµενο κύκλο. 105

118 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Απαιτούμενα υλικά για την PCR-αντίδραση Δείγμα DNA Εκκινητές PCR για το γονίδιο PSII Εκκινητές PCR για ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων οργανισμών Διάλυμα dntps (A, T, G, C) Ρυθμιστικό διάλυμα 10x PCR, απουσία Μg ++ (200 mm Tris-HCl ph 8,4, 500 mm KCl) Διάλυμα MgCl2 Taq DNA πολυμεράσης Απεσταγμένο και απιονισμένο Η2Ο Αυτόματες πιπέτες 2-20 μl. Αποστειρωμένα tips. Σωλήνες eppendorf 0,5 ml για PCR Σωλήνες eppendorf 0,5 ml για PCR Παγόλουτρο Θερμικός κυκλοποιητής PCR Πειραματική πορεία A. PCR-αντίδραση Κάθε αντίδραση PCR θα έχει τελικό όγκο 25 μl και προστίθενται τα ακόλουθα αντιδραστήρια σε σωλήνα eppendorf για την πραγματοποίησή της: 100 ng DNA 2 pmols έκαστου εκκινητή 200 μμ έκαστου dntp (A, T, G, C) 2,5 μl ρυθμιστικού διαλύματος 10x PCR buffer, απουσία Μg ++ 1 mm MgCl2 1,25 U Taq DNA πολυμεράσης Συμπληρώνουμε με dd Η2Ο σε τελικό όγκο 25 μl 106

119 Το θερμοκρασιακό πρόγραμμα για την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR είναι το εξής: 1. Αρχική αποδιάταξη στους 95 o C για 10 min 2. Aποδιάταξη στους 95 o C για 30 sec 3. Υβριδοποίηση των εκκινητών στους 59 o C για 30 sec 4. Επιμήκυνση των θυγατρικών κλώνων στους 72 o C για 1 min και 30 sec 5. Επανάληψη των σταδίων 2-4 για 30 κύκλους 6. Τελική επιμήκυνση στους 72 o C για 10 min Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, προσθέστε σε κάθε δείγμα 10 μl διαλύματος φόρτωσης 5x. Τοποθετήστε μl από κάθε δείγμα σε πηκτή αγαρόζης 1,5% και ηλεκτροφορείστε στα V. Το προϊόν της αντίδρασης από τους εκκινητές για το γονίδιο PSII αναμένεται να έχει Μοριακό Βάρος 420 bp. Το προϊόν της αντίδρασης από τους εκκινητές για την ανίχνευση των γενετικά τροποποιημένων οργανισμών αναμένεται να έχει Μοριακό Βάρος 150 bp. 400bp 300bp 200bp 100bp 107

120 ΑΣΚΗΣΗ 10 η ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΕΡΓΑΛΕΙΩΝ ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Μαρία Κατσούρα Χαράλαμπος Σταμάτης Εισαγωγή Οι βιολογικές βάσεις δεδομένων αποτελούν ένα πολύτιμο επιστημονικό εργαλείο για την συλλογή πληροφοριών για γονιδιώματα οργανισμών, συγκεκριμένα γονίδια, για τη δομή και λειτουργία πρωτεϊνών, την εξελικτική σχέση οργανισμών κ.α. Παραδείγματα ευρέως χρησιμοποιούμενων βάσεων δεδομένων αποτελούν η Swiss-Prot ( η οποία παρέχει πληροφορίες σχετικές με τη λειτουργία, τις δομικές περιοχές και τις μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών, η Protein Data Bank PDB ( η οποία παρέχει πληροφορίες σχετικές με τη 3-D δομή μακρομορίων όπως πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, η PROSITE, ( μία βάση δεδομένων πρωτεϊνικών περιοχών, λειτουργικών περιοχών και μοντέλων (patterns) που επιτρέπουν την ταυτοποίηση της πρωτεϊνικής οικογένειας στην οποία ανήκει μία νέα πρωτεϊνική αλληλουχία κ.α. Οι βάσεις δεδομένων εμπλουτίζονται συνεχώς καθώς αναλύονται τα γονιδιώματα νέων οργανισμών. Το επόμενο βήμα μετά την ανάλυση του γονιδιώματος ενός οργανισμού είναι η αναζήτηση γονιδίων και φυσικά ο καθορισμός της λειτουργίας τους μέσω της κατανόησης της δομής και της λειτουργίας των γονιδιακών προϊόντων που κωδικοποιούνται από αυτά τα γονίδια. Για το σκοπό αυτό, οι επιστήμονες εκμεταλλεύονται κατά κόρον τα εργαλεία της βιοπληροφορικής. Με σκοπό την εξοικείωσή σας με βασικά και ευρύτατα χρησιμοποιούμενα εργαλεία της βιοπληροφορικής στην παρούσα άσκηση καλείστε: Ι. Να βρείτε αν μία αλληλουχία DNA αντιστοιχεί σε γονίδιο και ποια είναι η λειτουργία του γονιδίου μέσω της εύρεσης ομολογίας με γονίδια γνωστής λειτουργίας άλλων οργανισμών. ΙΙ. Να καθορίσετε τη λειτουργία μίας άγνωστης πρωτεΐνης που έχει μεταφραστεί από αλληλουχίες γονιδιωματικού DNA ή cdna μέσω της αναγνώρισης συγκεκριμένων ομάδων αμινοξέων, γνωστών ως μοτίβων (motifs) ή μοντέλων (patterns). 108

121 Η άσκηση Μετά από αρκετές ώρες στο εργαστήριο καταφέρατε να αναλύσετε την αλληλουχία ενός κλωνοποιημένου τμήματος DNA που προέρχεται από γονιδιωματικό DNA ενός μικροοργανισμού καθώς και την αλληλουχία μίας άγνωστης πρωτεΐνης. Ο καθηγητής σας, σας ζητάει να συλλέξετε πληροφορίες για τις αλληλουχίες αυτές. Για το σκοπό αυτό θα χρειαστείτε: - Tην άγνωστη αλληλουχία DNA (θα δοθεί από τον υπεύθυνο) - Την άγνωστη πρωτεϊνική αλληλουχία (θα δοθεί από τον υπεύθυνο) - Έναν υπολογιστή με πρόσβαση στο διαδίκτυο Ακολουθώντας τα βήματα που καταγράφονται στη συνέχεια καλείστε να απαντήσετε στις σχετικές ερωτήσεις. Ι. Αναγνώριση άγνωστου γονιδίου Το να καθοριστεί κατά πόσο μία νουκλεοτιδική αλληλουχία αντιστοιχεί σε γονίδιο (δηλαδή το αν κωδικοποιεί κάποια πρωτεΐνη) δεν είναι μία απλή διαδικασία. Το πρώτο πρόβλημα σχετίζεται με το αν η πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα είναι η κωδική (δηλαδή αν η συμπληρωματική της αλυσίδα θα μεταγραφεί σε mrna) ή μη κωδική (αυτή η αλυσίδα θα μεταγραφεί σε mrna). Το δεύτερο πρόβλημα αφορά το πλαίσιο ανάγνωσης (την αλληλουχία των κωδικονίων), δηλαδή με το αν η αλληλουχία θα διαβαστεί ανά τρία νουκλεοτίδια ξεκινώντας από το πρώτο, το δεύτερο ή το τρίτο νουκλεοτίδιο. Τα προβλήματα αυτά αντιμετωπίζονται με την μετάφραση και των δύο αλυσίδων χρησιμοποιώντας και τα τρία πλαίσια ανάγνωσης, πρακτικά δηλαδή υπάρχουν για κάθε δίκλωνο μόριο DNA 6 πιθανά πλαίσια ανάγνωσης. Μόνο ένας από τους συνδυασμούς θα κωδικοποιεί ένα λειτουργικό πολυπεπτίδιο. Αναζητούμε λοιπόν τη μεγαλύτερη αμινοξική αλληλουχία που περιέχει ένα μοναδικό κωδικόνιο λήξης στο τέλος του πλαισίου (stop codon) και ξεκινά συνήθως με μεθειονίνη (Met). Αυτό το πλαίσιο καλείται πλαίσιο ανοιχτής ανάγνωσης (Open Reading Frame, ORF). Στο επόμενο σχήμα βλέπετε τα κωδικόνια για τα 20 αμινοξέα των πρωτεϊνών. 109

122 Μετάφραση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του mrna σε αλληλουχία αμινοξέων Το mrna μεταφράζεται με κατεύθυνση 5 3 Η διαδικασία αυτή μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη βοήθεια ενός πολύ βασικού εργαλείου της βιοπληροφορικής, του Translate tool που παρέχεται από την ExPASy (μία ιστοσελίδα η οποία παρέχει τη δυνατότητα πρόσβασης σε διάφορες βάσεις δεδομένων και εργαλεία βιοπληροφορικής). Το εργαλείο αυτό μπορείτε να το βρείτε ακολουθώντας τον παρακάτω σύνδεσμο: Translate tool Αντιγράψτε την αλληλουχία DNA που σας έχει δοθεί στο πλαίσιο και πατήστε TRANSLATE SEQUENCE. Σχήμα

123 Το πρόγραμμα θα σας οδηγήσει σε νέα σελίδα όπου θα εμφανίζονται έξι διαφορετικά πλαίσια ανάγνωσης (5'3' Frame 1, 5'3' Frame 2, 5'3' Frame 3, 3'5' Frame 1, 3'5' Frame 2 και 3'5' Frame 3). Ποιο από τα παραπάνω θεωρείτε ότι είναι το κατάλληλο πλαίσιο ανάγνωσης και γιατί; Με βάση τα αποτελέσματα πιστεύετε ότι η αλληλουχία DNA που σας δόθηκε αντιστοιχεί ολόκληρη σε γονίδιο ή περιέχει γονίδιο; Επιλέξτε το κατάλληλο πλαίσιο ανάγνωσης (κάνοντας κλικ στη λέξη Frame πάνω από το πλαίσιο ανάγνωσης που επιλέξατε) και θα οδηγηθείτε σε νέα σελίδα όπου μπορείτε να επιλέξετε την μεθειονίνη του αμινοτελικού άκρου (Μ) και να ανοίξετε την αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης σε νέο παράθυρο. Επιλέξτε να ανοίξετε την αμινοξική αλληλουχία σε μορφή FASTA πατώντας στο Sequence in FASTA format. Αντιγράψτε και επικολλήστε στο MS Word την αλληλουχία σε μορφή FASTA. Εφόσον είδατε ότι η αλληλουχία DNA που ανακαλύψατε περιέχει ή αποτελεί ένα νέο γονίδιο στη συνέχεια θα προσπαθήσετε να ανακαλύψετε τη λειτουργία του. Η δυνατότητα αυτή παρέχεται μέσω ενός ευρέος χρησιμοποιούμενου εργαλείου της βιοπληροφορικής, του BLAST (Basic Local Alignment Tool). Η χρήση του συγκεκριμένου εργαλείου στηρίζεται στην εξής λογική, αν διαθέτουμε μία αλληλουχία με άγνωστη λειτουργία, τότε αυτό που πρέπει να κάνουμε προκειμένου να προσδιορίσουμε τη λειτουργία της είναι να βρούμε μία ομόλογη αλληλουχία με γνωστή λειτουργία. Ως ομόλογες (homologs) χαρακτηρίζονται αλληλουχίες ή δομές, οι οποίες έχουν προέλθει από ένα κοινό πρόγονο μέσα από την εξελικτική διαφοροποίηση. Κατ αυτόν τον τρόπο δύο ομόλογες αλληλουχίες διατηρούν κοινά χαρακτηριστικά, χωρίς όμως να είναι πανομοιότυπες, ενώ γνώση της λειτουργίας της μίας αποτελεί πολύτιμο οδηγό στον καθορισμό της λειτουργίας της άλλης. Η ομολογία (homology) δεν μπορεί να προσδιοριστεί άμεσα, αλλά πρέπει να διαπιστωθεί μέσω της ομοιότητας των εν λόγω αλληλουχιών. Το BLAST είναι ένας υπολογιστικός αλγόριθμος, ο οποίος αναζητεί το βαθμό ομοιότητας μεταξύ μίας αλληλουχίας DNA ή πρωτεΐνης και των διαφόρων αλληλουχιών που έχουν καταχωρηθεί σε βάσεις δεδομένων. 111

124 Υπάρχουν διάφοροι τύποι BLAST (BLASTn, BLASTp, BLASTx, tblastn, tblastx). Εσείς θα χρησιμοποιήσετε το BLASTn, μέσω του οποίου μία νουκλεοτιδική αλληλουχία στοιχίζεται με βάσεις δεδομένων νουκλεοτιδίων. Το εργαλείο αυτό θα το βρείτε ακολουθώντας τον παρακάτω σύνδεσμο: BLAST Στην κεντρική σελίδα του BLAST επιλέξτε το nucleotide blast. Σχήμα 2. Θα οδηγηθείτε σε νέα σελίδα όπου θα πρέπει να εισάγετε τη νουκλεοτιδική αλληλουχία σας σε FASTA μορφή (δηλαδή στη μορφή που σας έχει δοθεί από τον υπεύθυνο). Αντιγράψτε την αλληλουχία DNA και επικολλήστε τη στο αντίστοιχο πεδίο. Αφήστε τα υπόλοιπα πεδία όπως φαίνονται στο Σχήμα 3. Σχήμα

125 Στο τέλος της σελίδας στο πεδίο Program Selection επιλέξτε Somewhat similar sequences (blastn). Σχήμα 4. Πατήστε BLAST και περιμένετε τα αποτελέσματά σας (η διαδικασία διαρκεί περίπου 1 λεπτό). Τα αποτελέσματά σας εμφανίζονται ως εξής: Σχήμα 5. Αρχικά δίνεται μία περιγραφή της αλληλουχίας που καταθέσατε (πεδίο Nucleotide Sequence), ακολουθεί μία γραφική απεικόνιση των στοιχίσεων (πεδίο Graphic Summary) (Σχήμα 5), στη συνέχεια μία περιγραφή των αλληλουχιών οι οποίες οδήγησαν σε σημαντικές στοιχίσεις (πεδίο Descriptions) και τέλος αναλυτικά οι στοιχίσεις με τις κατατεθειμένες σε βάσεις δεδομένων αλληλουχίες (πεδίο Alignments) (Σχήμα 6). 113

126 Σχήμα 6. Με βάση τα αποτελέσματα του BLAST θα πρέπει να αξιολογήσετε τη στοίχιση και να συλλέξετε τις απαραίτητες πληροφορίες για την αλληλουχία σας. Μία αρχική αξιολόγηση μπορεί να γίνει από τη γραφική απεικόνιση με βάση έναν χρωματικό κώδικα. Στην απεικόνιση αυτή η αλληλουχία που καταθέσατε (query) στοιχίζεται με αλληλουχίες κατατεθειμένες σε βάσεις δεδομένων και πάνω σε αυτές επισημαίνονται με διαφορετικό χρώμα περιοχές στοίχισης (με κόκκινο χρώμα απεικονίζονται περιοχές με σκορ στοίχισης μεγαλύτερο από 200, με μωβ χρώμα περιοχές με σκορ στοίχισης μεταξύ , με πράσινο χρώμα περιοχές με σκορ στοίχισης μεταξύ 50-80, με μωβ χρώμα περιοχές με σκορ στοίχισης μεταξύ , με μπλε χρώμα περιοχές με σκορ στοίχισης μεταξύ και με μαύρο περιοχές με χαμηλό σκορ στοίχισης μικρότερο από 40). Όλες οι λεπτομέρειες που χρειάζεστε και απεικονίζονται γραφικά δίνονται στο πεδίο Descriptions. Στο πεδίο αυτό δίνεται στην πρώτη στήλη η περιγραφή της αλληλουχίας με την οποία έχει γίνει στοίχιση (η οποία είναι γνωστή και έχει κατατεθεί σε βάσεις δεδομένων). Συγκεκριμένα θα βρείτε τον οργανισμό από τον οποίο προέρχεται η 114

127 αλληλουχία και σε κάποιες περιπτώσεις το γονίδιο που αντιστοιχεί σε αυτή την αλληλουχία. Η πλήρης περιγραφή της αλληλουχίας μπορεί να βρεθεί μέσω του κωδικού πρόσβασης (Accession number) που δίνεται στην τελευταία στήλη. Οι στήλες που χρειάζεστε για να αξιολογήσετε κάθε στοίχιση είναι οι εξής: Max score: Δείχνει την έκταση και ποιότητα της στοίχισης. Όσο πιο εκτεταμένη και καλύτερη είναι η στοίχιση τόσο μεγαλύτερο είναι και το σκορ. Η παράμετρος αυτή δεν δείχνει αν η στοίχιση είναι στατιστικά σημαντική. Query coverage: Δείχνει σε ποιο ποσοστό η δική σας αλληλουχία στοιχίζεται με την κατατεθειμένη αλληλουχία. Φυσικά όσο μεγαλύτερο το ποσοστό τόσο μεγαλύτερος ο αριθμός των στοιχισμένων νουκλεοτιδίων. Expect value (E-value): Περιγράφει τον αριθμό ομοιοτήτων που αναμένεται να είναι τυχαίος στην αναζήτηση μιας βάσης δεδομένων συγκεκριμένου μεγέθους. Όταν το Ε-value πάρει την τιμή 1 για μία στοίχιση, αυτό δείχνει ότι στην τρέχουσα έρευνα, αναμένεται μόνο από τύχη να βρεθεί μια ομοιότητα με ίδιο αποτέλεσμα. Μια τιμή 0 δηλώνει ότι καμία στοίχιση δεν αναμένεται να είναι τυχαία, δηλ. είναι απίθανο η στοίχιση να είναι από τυχαία ομοιότητα. Πρακτικά η τιμή αυτή δείχνει πόσο στατιστικά σημαντική είναι η στοίχιση. Όσο πιο κοντά στο 0 είναι η τιμή τόσο μεγαλύτερη είναι η πιθανότητα η στοίχιση να είναι σημαντική (να έχει κάποιο νόημα) και να μην είναι απλά τυχαία. Maximum identity: Δείχνει την ομοιότητα μεταξύ των δύο αλληλουχιών. Αλληλουχίες με μεγάλο βαθμό ομοιότητας αποτελούν και καλύτερες στοιχίσεις. Με βάση τα παραπάνω στοιχεία να αναφέρετε το όνομα του οργανισμού από τον οποίο προέρχεται η αλληλουχία που έδωσε α) μία σημαντική και β) μία τυχαία στοίχιση. Σε ποια τιμή στηριχθήκατε για να εξάγετε το παραπάνω συμπέρασμα; Δείξτε ποιες είναι οι 10 καλύτερες στοιχίσεις (χρησιμοποιείστε την εντολή Prt Sc, Print Screen). Από ποιο οργανισμό πιστεύετε ότι προέρχεται η αλληλουχία που σας δόθηκε; Σε ποια τιμή στηριχθήκατε για να εξάγετε το παραπάνω συμπέρασμα; Ποια πιστεύετε ότι θα μπορούσατε να είναι η λειτουργία του άγνωστου γονιδίου που ανακαλύψατε (δηλαδή ποια πρωτεΐνη πιστεύετε ότι κωδικοποιεί); ΙΙ. Αναγνώριση άγνωστης πρωτεΐνης Η μετάφραση αλληλουχιών που προέρχονται από γονιδιωματικές ή cdna βιβλιοθήκες μπορεί να οδηγήσει στη σύνθεση πρωτεϊνών με άγνωστη δομή και λειτουργία. Ακόμα και 115

128 αν η αλληλουχία αμινοξέων της πρωτεΐνης είναι γνωστή, πολλές φορές είναι δύσκολο να ανιχνευτεί η ομολογία της με άλλες γνωστές πρωτεΐνες με την εφαρμογή προγραμμάτων στοίχισης (όπως το BLASTp). Σε αυτές τις περιπτώσεις υπάρχει η δυνατότητα να συλλέξουμε πληροφορίες για τη λειτουργία της άγνωστης πρωτεΐνης μέσω της αναγνώρισης συγκεκριμένων ομάδων αμινοξέων, γνωστών ως μοντέλων (patterns), μοτίβων (motifs), υπογραφών (signatures) ή αποτυπωμάτων (fingerprints). Τα μοντέλα αυτά υπάρχουν επειδή οι πρωτεΐνες διαθέτουν ειδικές περιοχές που σχετίζονται, για παράδειγμα, με την ικανότητα πρόσδεσης ενώσεων ή με την καταλυτική τους δράση. Οι ειδικές αυτές περιοχές είναι γενικά μικρές σε μέγεθος αλλά ταυτόχρονα βιολογικά πολύ σημαντικές και «υποβάλλονται» σε πολύ αυστηρούς εξελικτικούς περιορισμούς. Η δυνατότητα αναγνώρισης συγκεκριμένων των μοντέλων και μέσω αυτών της λειτουργίας άγνωστων πρωτεϊνών, παρέχεται μέσω βάσεων δεδομένων, όπως είναι η PROSITE. Η PROSITE είναι μία δευτεροταγής βάση δεδομένων βιολογικά σημαντικών περιοχών (όπως είναι τα καταλυτικά κέντρα ενζύμων, οι περιοχές σύνδεσης προσθετικών ομάδων, αμινοξέα που σχετίζονται με τη σύνδεση μεταλλικών ιόντων, κυστεΐνες που συμμετέχουν σε δισουλφιδικούς δεσμούς κ.α.) και μοντέλων και επιτρέπει στον χρήστη, μέσω κατάλληλων εργαλείων, να αναγνωρίσει σε ποια γνωστή πρωτεϊνική οικογένεια ανήκει μία άγνωστη αλληλουχία. Εσείς θα χρησιμοποιήσετε το εργαλείο ScanProsite, μέσω του οποίου απεικονίζονται μοντέλα που έχουν βρεθεί εντός της κατατεθειμένης άγνωστης πρωτεΐνης. Το εργαλείο αυτό θα το βρείτε ακολουθώντας τον παρακάτω σύνδεσμο: PROSITE Στην κεντρική σελίδα της PROSITE επιλέξτε το ScanProsite. Σχήμα

129 Θα μεταφερθείτε σε νέα σελίδα όπου θα πρέπει να εισάγετε την αλληλουχία της πρωτεΐνης που σας έχει δοθεί από τον υπεύθυνο, στο πεδίο Sequence(s) to be scanned. Επιλέξτε Exclude patterns with high propability of occurance Σχήμα 8. Αφήστε όλα τα υπόλοιπα πεδία ως έχουν και στο τέλος της σελίδας πατήστε START THE SCAN. Τα αποτελέσματα θα εμφανιστούν σε νέα σελίδα με τη μορφή Graphical Rich View: Σχήμα

130 Αρχικά δίνεται η αλληλουχία της πρωτεΐνης που καταθέσατε (πεδίο USERSEQ), ακολουθεί μία γραφική απεικόνιση των ευρισκόμενων μοντέλων, δηλαδή των επιτυχιών (πεδίο hits by pattern) και στη συνέχεια μία περιγραφή των επιτυχιών που βρέθηκαν. Για να ερμηνεύσετε τα αποτελέσματα της αναζήτησης θα πρέπει να λάβετε υπόψη σας τα εξής στοιχεία: Οι επιτυχίες που έχουν βρεθεί απεικονίζονται κατά σειρά από το αμινοτελικό άκρο της αλληλουχίας σας. Στην γραφική απεικόνιση εμφανίζονται τα μοντέλα που έχουν βρεθεί με τη μορφή έγχρωμων ράβδων (Σχήμα 10). Αν περάσετε τον κέρσορα (χωρίς να κάνετε κλικ) επάνω από κάθε ράβδο τότε χρωματίζεται με κίτρινο χρώμα η αντίστοιχη ομάδα αμινοξέων του μοντέλου στην αλληλουχία του πεδίου USERSEQ. Σχήμα 10. Το πεδίο hits by pattern δίνει πληροφορίες για τις επιτυχίες που έχουν βρεθεί. Πιο συγκεκριμένα εμφανίζονται τα εξής: - Ένας κωδικός που αντιστοιχεί στην τεκμηρίωση (documentation) κάθε ευρισκόμενου μοντέλου (Σχήμα 11). Σχήμα 11. Αν πατήσετε στον κωδικό αυτό θα μεταφερθείτε σε νέα σελίδα με πληροφορίες σχετικά με το μοντέλο. Συγκεκριμένα δίνεται μία περιγραφή του μοντέλου, μία λίστα πρωτεϊνών στις οποίες υπάρχει αυτό το μοντέλο και οι λόγοι για τους οποίους ισχύει το συγκεκριμένο μοντέλο (πεδίο Description). Στη συνέχεια στο πεδίο Technical section δίνεται η συναινετική αλληλουχία (consensus pattern, τα σύμβολα που χρησιμοποιούνται φαίνονται στον ακόλουθο πίνακα) και παρέχεται η δυνατότητα να αναζητήσετε στοιχίσεις σε βάσεις δεδομένων, όπως η Swiss Prot, και να βρείτε δομές που περιέχουν αυτό το μοντέλο στην PDB (Protein Data Bank). Στο τέλος της σελίδας μπορείτε να βρείτε τη σχετική βιβλιογραφία. 118