Μικροβιολογία Καλλιέργεια µικροοργανισµών

Transcript

1 Μικροβιολογία Καλλιέργεια µικροοργανισµών Θεωρητικό µέρος Οι µικροοργανισµοί χωρίζονται από άποψη κυτταρικής οργάνωσης σε δύο µεγάλες κατηγορίες: τους προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς. Οι προκαρυωτικοί µικροοργανισµοί είναι απλούστεροι και το γενετικό τους υλικό δεν περιβάλλεται από µεµβράνη. Όλα τα βακτήρια είναι προκαρυωτικοί µικροοργανισµοί. Αντίθετα οι ευκαρυωτικοί µικροοργανισµοί είναι περισσότερο σύνθετοι µορφολογικά, και το γενετικό τους υλικό περιβάλλεται από µεµβράνη. Τα φύκη, οι µύκητες, τα πρωτόζωα, τα ανώτερα φυτά και τα ζώα είναι ευκαρυωτικοί οργανισµοί. Τα βακτήρια είναι απλοί µονοκύτταροι προκαρυωτικοί µικροοργανισµοί µε µικρό µέγεθος της τάξης του 1 µm. Το σχήµα τους µπορεί να είναι ραβδόµορφο, σφαιρικό ή σπειροειδές. Τα βακτήρια χωρίζονται σε δύο µεγάλες κατηγορίες, τα Gram θετικά και Gram αρνητικά, ανάλογα µε το αποτέλεσµα µιας χρωστικής αντίδρασης που δίνουν κατά την βαφή µε την µέθοδο Gram. Από άποψη σπουδαιότητας τα βακτήρια διαδραµατίζουν ιδιαίτερα σηµαντικό ρόλο διότι ορισµένα από αυτά ευθύνονται για σοβαρές ασθένειες, άλλα δε είδη είναι απαραίτητα για την οµαλή λειτουργία των οικοσυστηµάτων (αποικοδοµητές, νιτροποιητικά βακτήρια κτλ.). Ανάπτυξη των µικροοργανισµών Η ανάπτυξη των µικροοργανισµών απαιτεί πρόσβαση σε πηγές ενέργειας και σε ενώσεις απαραίτητες για την σύνθεση των κυτταρικών τους δοµών. Η ανάπτυξη των οργανισµών απαιτεί διαθέσιµο άνθρακα, υδρογόνο, οξυγόνο, άζωτο, θείο, φωσφόρο και ποικιλία άλλων µεταλλικών

2 στοιχείων. Τα κύτταρα λαµβάνουν τα απαραίτητα θρεπτικά µεταφέροντας τα µέσω των µεµβρανών τους και τα µετατρέπουν µε ενζυµικές αντιδράσεις σε προϊόντα χρήσιµα για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασµό τους. Για την ανάπτυξη των µικροοργανισµών στο εργαστήριο έχει επινοηθεί ένας µεγάλος αριθµός θρεπτικών µέσων το καθένα από τα οποία ταιριάζει σε ειδικές οµάδες βακτηρίων. Μερικά από αυτά είναι αρκετά απλά και µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ανάπτυξη πολλών κοινών βακτηρίων. Η ανάπτυξη των µικροοργανισµών οδηγεί σε αύξηση του αριθµού τους όταν τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται µε διαίρεση. Στην περίπτωση αυτή τα κύτταρα αυξάνουν σε µέγεθος και διαιρούνται σε δύο θυγατρικά κύτταρα περίπου ίσου µεγέθους. Η µελέτη της ανάπτυξης των κυττάρων λοιπόν δεν ακολουθεί την παρακολούθηση του µεγέθους τους (λόγω του µικρού τους µεγέθους), αλλά την παρακολούθηση της αύξησης του αριθµού τους. Ένα εύκολος τρόπος παρατήρησης της αύξησης των µικροοργανισµών είναι η δηµιουργία αποικιών σε στερεό θρεπτικό υλικό. Αυτό κατασκευάζεται µε την προσθήκη άγαρ σε ένα υγρό θρεπτικό υλικό. Το άγαρ είναι ένας πολυσακχαρίτης που παράγεται από φύκη και έχει την ιδιότητα να ρευστοποιείται σε θερµοκρασίες µεγαλύτερες των 45 ο C ενώ στερεοποιείται σε χαµηλότερες θερµοκρασίες. Η ανάπτυξη των µικροοργανισµών σε στερεές καλλιέργειες γίνεται σε ειδικά τρυβλία Petri. Αποικίες µικροοργανισµών που αναπτύσσονται στην επιφάνεια στερεού υποστρώµατος σε τρυβλίο Petri. Κάθε διακριτή αποικία προέρχεται από ένα αρχικό κύτταρο Τεχνικές διασποράς των µικροοργανισµών στην επιφάνεια στερεού υποστρώµατος καλλιέργειας Προκειµένου να µελετηθούν οι µικροοργανισµοί ή να αποµονωθούν από πληθώρα άλλων, πολλές φορές είναι αναγκαία η ανάπτυξη τους µε την µορφή αποικιών στην επιφάνεια στερεού υποστρώµατος. Προκειµένου να διασφαλίσουµε ότι κάθε αποικία προέρχεται από ένα κύτταρο ή να διαχωρίσουµε τα κύτταρα µεταξύ τους χρησιµοποιούµε τεχνικές διασποράς αυτών στην επιφάνεια στερεού θρεπτικού υποστρώµατος. Τα ακόλουθα σχήµατα δείχνουν τη διαδικασία που ακολουθείται.

3 Τρόπος διασποράς µικροοργανισµών στην επιφάνεια στερεού υποστρώµατος και διάφορες µορφές διασποράς µικροοργανισµών. Παράµετροι που καθορίζουν την ανάπτυξη των µικροβίων Η ανάπτυξη των µικροβίων καθορίζεται από συγκεκριµένους παράγοντες όπως το είδος του θρεπτικού διαλύµατος, τη θερµοκρασία, το ph, την παρουσία ή την απουσία οξυγόνου καθώς και από την παρουσία στην καλλιέργεια ουσιών που παρεµποδίζουν κάποια διαδικασία του µεταβολισµού των µικροοργανισµών, όπως τα αντιβιοτικά. Όσον αφορά το ph τα περισσότερα µικρόβια αναπτύσσονται σε σχεδόν ουδέτερο ph ενώ σε πολύ όξινο ή βασικό ph η ανάπτυξή τους αναστέλλεται. Τα αντιβιοτικά είναι χηµικές ουσίες µε αντιµικροβιακή δράση που παράγονται από βακτήρια, µύκητες και φυτά. Από τα βακτήρια παράγεται το 50% των αντιβιοτικών που κυκλοφορούν στο εµπόριο, ενώ από τους µύκητες παράγεται το 20% των γνωστών αντιβιοτικών. Από τους µύκητες παράγονται οι πενικιλίνες. Η δράση των αντιβιοτικών συνίσταται στην αναστολή κάποιας ειδικής βιοχηµικής αντίδρασης του οργανισµού (π.χ. παρεµποδίζουν τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώµατος και αναστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση των βακτηρίων κτλ.). Πειραµατικό µέρος Όργανα και υλικά Λύχνος Bunsen Τρίποδο µε πλέγµα Ηλεκτρονικός ζυγός Ποτήρι ζέσης των 500 ml Ποτήρι ζέσης των 50ml 6 αποστειρωµένα τρυβλία petri Σπάτουλα Αναπτήρας Γυάλινη ράβδος Σύρµα εµβολιασµού Ανεξίτηλος µαρκαδόρος για την αρίθµηση των τρυβλίων Αλουµινόχαρτο Απεσταγµένο νερό 200 ml Άγαρ σε σκόνη 3 g Θρεπτικό υλικόlb (Luria Broth) 4 g Λίγο χώµα Ξύδι ιάλυµα αντιβιοτικού (αµπικιλίνη) Σαπούνι για τα χέρια Προετοιµασία του χώρου Καθαρίζουµε και απολυµαίνουµε την επιφάνεια εργασίας µε χαρτί κουζίνας και οινόπνευµα. Καθ όλη τη διάρκεια της εκτέλεσης του πειράµατος έχουµε αναµµένο το λύχνο Bunsen και όλες οι εργασίες γίνονται κοντά στη φλόγα ώστε να διατηρηθούν συνθήκες ασηψίας.

4 Παρασκευή θρεπτικού υλικού Σε κωνική φιάλη των 500 ml ζεσταίνουµε 200 ml νερό (λίγο πριν αρχίσει να βράζει) και διαλύουµε 3 g άγαρ σιγά σιγά. Στη συνέχεια προσθέτουµε 4 g θρεπτικό υλικό LB. Αφήνουµε το διάλυµα να βράσει για 10 λεπτά ώστε να αποστειρωθεί. Κατεβάζουµε από τη φωτιά και καλύπτουµε µε αλουµινόχαρτο το στόµιο της κωνικής φιάλης. ΠΡΟΣΟΧΗ. Κατά το βρασµό το διάλυµα φουσκώνει απότοµα και µπορεί να ξεχειλίσει. Προετοιµασία των τρυβλίων Petri Αριθµούµε τα τρυβλία Petri στη βάση τους µε ανεξίτηλο µαρκαδόρο από 1 έως 6. Το τρυβλίο Νο 3 το χωρίζουµε στη µέση µε µια γραµµή και µαρκάρουµε τις περιοχές µε τις λέξεις «µε» και «χωρίς». Μόλις κρυώσει για λίγο το θρεπτικό υλικό και αρχίσει να στερεοποιείται (θερµοκρασία ο C) µεταφέρουµε ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ το θρεπτικό υλικό στα πλαστικά προ-αποστειρωµένα τρυβλία Pertri. Στο τρυβλίο Νο 2 προσθέτουµε λίγες σταγόνες ξυδιού (οξικό οξυ). Στο τρυβλίο Νο 5 προσθέτουµε λίγες σταγόνες αµπικιλίνης (αντιβιοτικό) και αναδεύουµε ελαφρά. Κλείνουµε τα τρυβλία και αφήνουµε το υλικό να κρυώσει. Εµβολιασµός Αφού κρυώσουν αρκετά τα τρυβλία Petri, κάνουµε τις εξής ενέργειες: 1. στο τρυβλίο 1: το αφήνουµε ανοιχτό µέσα στο εργαστήριο για 5 min, 2. στο τρυβλίο 2: το αφήνουµε ανοιχτό µέσα στο εργαστήριο για 5 min, 3. στο τρυβλίο 3: Στο µισό που είναι µαρκαρισµένο «χωρίς», ένας φοιτητής το ανοίγει και το αγγίζει µε τα δάχτυλά του. Στη συνέχεια ο ίδιος φοιτητής πλένει τα χέρια του µε σαπούνι και χωρίς να τα σκουπίσει, αγγίζει το άλλο µισό («µε») µε τα δάχτυλά του ξανά. 4. στο τρυβλίο 4: προσθέτουµε λίγο χώµα µε τη βοήθεια ενός σύρµατος εµβολιασµού (το οποίο έχουµε προηγουµένως αποστειρώσει στη φωτιά). 5. στο τρυβλίο 5: προσθέτουµε λίγο χώµα µε τη βοήθεια ενός σύρµατος εµβολιασµού (το οποίο έχουµε προηγουµένως αποστειρώσει στη φωτιά). 6. στο τρυβλίο 6 (µάρτυρας): το αφήνουµε κλειστό ώστε να χρησιµοποιηθεί για σύγκριση µε τα άλλα τρυβλία. Επώαση Τοποθετούµε τα τρυβλία σε θερµοκρασία δωµατίου και µακριά από το ηλιακό φως. Μετά από 1 εβδοµάδα περίπου παρατηρούµε σε ποιά από τα τρυβλία έχουν εµφανιστεί αποικίες. Καταγράφουµε τις παρατηρήσεις µας στο φύλο εργασίας ως προς τις διαφορές στον αριθµό, το µέγεθος και το χρώµα των αποικιών στα διαφορά τρυβλία. Σηµείωση: κατά τη διεξαγωγή του πειράµατος πιθανόν να δηµιουργηθούν και αποικίες από µύκητες. Για να διακρίνουµε τις αποικίες βακτηρίων από αυτές των µυκήτων, αναζητούµε την παρουσία υφών (νηµάτων) στις αποικίες των µυκήτων.

5 ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Μικροβιολογία Καλλιέργεια µικροοργανισµών Όνοµα : Τµήµα: Ηµεροµηνία : Ζωγραφίστε τις παρατηρήσεις σας (διαφορετικές µορφολογίες αποικιών κτλ.) στα 6 τρυβλία. _

6 Που εµφανίστηκαν οι περισσότερες αποικίες και που οι λιγότερες; Αιτιολογήστε τις απαντήσεις σας.