ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΓΙΑ ΤΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΓΙΑ ΤΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΧΗΜΕΙΑ ΥΛΙΚΩΝ ΠΡΟΗΓΜΕΝΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ» «ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΗΣ ΜΥΚΟΤΟΞΙΝΗΣ ΖΕΑΡΑΛΕΝΟΝΗΣ (ΖΟΝ) ΣΕ ΔΗΜΗΤΡΙΑΚΑ» Νεκτάριος Αποστολόπουλος Χημικός Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Κολιαδήμα Αθανασία Τμήμα Χημείας Πάτρα 2011

2 UNIVERSITY OF PATRAS FACULTY OF SCIENCES DEPARTMENT OF CHEMISTRY DIPLOMA THESIS POSTGRADUATE STUDIES PROGRAM CHEMISTRY OF ADVANCED TECHNOLOGY MATERIALS «STUDYING THE IMPACT OF PHYSICOCHEMICAL PARAMETERS OF MYCOTOXIN ZEARALENONE(ZON) DEVELOPMENT IN CEREALS» NEKTARIOS APOSTOLOPOULOS CHEMIST SUPERVISOR: KOLIADIMA ATHANASIA DEPARTMENT OF CHEMISTRY PATRA 2011

3 Περιεχόµενα Σελ. Περίληψη... iv Abstract vi Πρόλογος... viii 1. Οι Μυκοτοξίνες Εισαγωγή Είδη Μυκοτοξινών Τριχοθυκένια Ωχρατοξίνες Είδη και ιδιότητες Ωχρατοξινών Φουµοσίνη Αφλατοξίνες Ζεαραλενόνη Εισαγωγή Χηµική δοµή Φυσικοχηµικές Ιδιότητες Ζεαραλενόνης Τοξικότητα Φυσικές πηγές µόλυνσης Παραγωγή Ζεαραλενόνης στις Συγκοµιδές Μεταβολισµός Μυκοτοξίνες: Επιπτώσεις στην υγεία του ανθρώπου και των ζώων Νοµοθεσία Ευρωπαϊκή Νοµοθεσία Παγκόσµια Νοµοθεσία Ανάλυση και προσδιορισµός µυκοτοξινών ειγµατοληψία Προετοιµασία δείγµατος Εκχύλιση Καθαρισµός Αναλυτικές Τεχνικές Γενικά για τις αναλυτικές τεχνικές. 37 i

4 1.6.2 Κλασικές Αναλυτικές Τεχνικές Υγρή Χρωµατογραφία/ Φασµατοσκοπία Μάζας (LC/MS) NP-HPLC και RP-HPLC LC/MS Μέθοδοι για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό µυκοτοξινών Ανοσοχηµικές Τεχνικές Άλλες Τεχνικές Στοιχεία Στατιστικής Εισαγωγή Μέτρα θέσης Μέτρα ιασποράς Ανάλυση Παλινδρόµησης (Regression Analysis) Ανάλυση ιασποράς (Analysis of Variance) ANOVA Ανάλυση διακύµανσης κατά ένα παράγοντα Στατιστικοί Έλεγχοι F Συντελεστής Προσδιορισµού R Επικύρωση Μεθόδου Ανάλυσης- οκιµής Παράµετροι Επικύρωσης Μεθόδου Ορθότητα(Accuracy) Καµπύλη Βαθµονόµησης(Calibration Curve) Ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιµότητα (Intralaboratory reproducibility) Όριο Ανίχνευσης (Limit of Detection) Όριο Προσδιορισµού(Limit of Quantification) Ανάκτηση (Recovery) Σχετική τυπική απόκλιση(relative standard deviation) Όριο επαναληψιµότητας (Repeatability ή Precision) Όριο αναπαραγωγιµότητας Επιλεκτικότητα(Selectivity) Ευαισθησία(Sensitivity) Εξειδίκευση(Specifity) Συστηµατικό σφάλµα(systematic Error).. 59 ii

5 Ορθότητα (Trueness) Αληθινή τιµή(true Value) Μέγιστη επιτρεπτή σχετική τυπική απόκλιση Πειραµατικό Μέρος Συσκευές Αντιδραστήρια Εργαστηριακός Εξοπλισµός Παρασκευή Προτύπων ιαλύµατων Ζεαραλενόνης Πειραµατική ιαδικασία HPLC Ανάλυση Ο Φθορισµοµετρικός Ανιχνευτής(F.L.D). 66 Αντικείµενο Μελέτης της Παρούσας Εργασίας Υπολογισµοί-Αποτελέσµατα Κατασκευή καµπύλης βαθµονόµησης Γραµµικότητα Μεθόδου Όρια ανίχνευσης και προσδιορισµού (LOD, LOQ) οκιµές ανάκτησης Έλεγχος Ενδοεργαστηριακής Αναπαραγωγιµότητας µε τη χρήση Πιστοποιηµένων Υλικών Αναφοράς, CRM Αναπαραγωγιµότητα & Επαναληψιµότητα Ανθεκτικότητα (Ruggedness-Robustness) Επιλογή των παραγόντων και των επιπέδων τους Σχεδιασµός Πειραµάτων Αποτελέσµατα-Στατιστική Επεξεργασία Περιβαλλοντικές συνθήκες που έχουν επιπτώσεις στις µυκοτοξίνες Εισαγωγή Παραγωγή εοξυνιβαλενόλης, Νιβαλενόλης, Ζεαραλενόνης Αποτελέσµατα Γενικά Συµπεράσµατα. 125 Βιβλιογραφία iii

6 Περίληψη Το πρόβληµα µε τις µυκοτοξίνες είναι σηµαντικό και δικαιολογηµένα προκαλεί ανησυχίες. Αναφέρεται ως παγκόσµιος κίνδυνος και θεωρείται ως µία από τις πλέον σοβαρές προκλήσεις για την ασφάλεια των τροφίµων, την υγεία των ανθρώπων, των ζώων, και για τη σύγχρονη τοξικολογία. Με τον «όρο» µυκοτοξίνες εννοούµε τοξίνες οι οποίες παράγονται από µύκητες. Συγκεκριµένα πρόκειται για προϊόντα δευτερογενούς µεταβολισµού των µυκήτων (Aspergillus spp Fusarium spp, Penicillium spp, κ.α). Υπάρχει µία πληθώρα από διάφορες µυκοτοξίνες οι οποίες απαντώνται σε πολλές τροφές, όπως στο γάλα, στα δηµητριακά, στους ξηρούς καρπούς, στα αποξηραµένα φρούτα, στο αλεύρι κ.α. που καταναλώνουν καθηµερινά οι άνθρωποι, αλλά και σε ζωικές τροφές. Ωστόσο µόνο για κάποιες από αυτές υπάρχουν τεκµηριωµένες µελέτες ενώ ακόµα λιγότερες είναι αυτές, για τις οποίες έχουν προσδιοριστεί τα νόµιµα επιτρεπτά όρια συγκέντρωσης στις τροφές, που καταναλώνονται καθηµερινά. Οι µυκοτοξίνες θεωρούνται γενικά επικίνδυνες ενώσεις που παράγονται από ορισµένα είδη µυκήτων, οι οποίοι αναπτύσσονται σε προϊόντα αγροτικών καλλιεργειών είτε πριν τη συγκοµιδή, είτε κατά την αποθήκευσή τους σε γεωργικές εγκαταστάσεις και παραµένουν δραστικές για µεγάλο χρονικό διάστηµα και µετά την καταστροφή των µυκήτων από τους οποίους προήλθαν. Η εµφάνισή τους στα τρόφιµα και στα ποτά έχει αναγνωριστεί ως απειλή για την υγεία τόσο του ανθρώπου όσο και των ζώων, είτε αυτή προέρχεται από την άµεση µόλυνση των φυτικών ιστών, είτε από προϊόντα που έχουν παραχθεί από αυτά, είτε από την µεταφορά των µυκοτοξινών και των µεταβολιτών τους στους ζωικούς ιστούς, και κατά συνέπεια στο γάλα, στα αυγά και αλλού. Μερικές από αυτές τις µυκοτοξίνες, όπως για παράδειγµα οι αφλατοξίνες, παρουσιάζουν εξαιρετικά υψηλή τοξικότητα, γεγονός που τις καθιστά ενώσεις που χρήζουν ιδιαίτερη προσοχή. Ως εκ τούτου κρίνεται απαραίτητο όλα τα αγροτικά προϊόντα που προορίζονται για τον άνθρωπο ή για ζωοτροφές να υποβάλλονται σε συνεχή και σχολαστικό έλεγχο. iv

7 Αντικείµενο µελέτης της παρούσας εργασίας είναι να µελετήσει τις παραµέτρους (θερµοκρασία και υγρασία) οι οποίοι επηρεάζουν την ανάπτυξη της µυκοτοξίνης ζεαραλενόνης χρησιµοποιώντας ως υπόστρωµα αλεύρι από αποθηκευµένο αραβόσιτο. Στόχος ήταν ο έλεγχος των συνθηκών καλλιέργειας, αποθήκευσης και συντήρησης των πρωτογενών γεωργικών προϊόντων έτσι ώστε να ελαττώνεται η ανάπτυξη µυκοτοξινών στα γεωργικά προϊόντα και στα τρόφιµα. Η δραστηριότητα βοήθησε στη διερεύνηση του µηχανισµού δράσης των συνθηκών που οδηγούν στην ανάπτυξη µυκοτοξινών τόσο κατά την αποθήκευση της πρώτης ύλης, όσο και κατά τα στάδια επεξεργασίας, παραγωγής και τυποποίησης του τελικού προϊόντος. v

8 Abstract The problem with mycotoxins is a significant and legitimate concern. Referred to as global risk and is considered one of the most serious challenges to food security, human health, animals, and modern toxicology. With the "average" mean toxins mycotoxins produced by fungi. It is a secondary metabolic products of fungi (Aspergillus spp Fusarium spp, Penicillium spp, etc.). There is a plethora of different mycotoxins found in many foods such as milk, cereals, nuts, dried fruits, flour, etc. consumed daily by people, but also in animal feeds. But only some of them are documented studies and even fewer are those, which have been identified, legally permissible concentration limits in foods consumed daily. The mycotoxins are generally considered harmful compounds produced by certain species of fungi which grow on agricultural products or crops before harvest or during storage in agricultural systems and remain active for a long time after the destruction of fungi of which came. Their occurrence in foods and beverages has been recognized as a health threat to both human and animal, whether it comes from direct infection of plant tissues or products derived therefrom, or the transfer of mycotoxins and their metabolites in animal tissues, and hence in milk, eggs and elsewhere. Some of these mycotoxins such as aflatoxins, are extremely high toxicity, which makes compounds that deserve particular attention. Therefore it is essential that all agricultural products intended for human or animal feed can be subjected to constant and meticulous. The subject of this paper is to study the parameters (temperature and humidity) that influence the development of the mycotoxin zearalenone using as substrate flour stored maize. The aim was to check the growing conditions, storage and maintenance of primary agricultural products and thus reduce the development of mycotoxins in agricultural products and foodstuffs. The activity helped to investigate the mechanism of action of the conditions that lead to the development of both mycotoxins during storage of raw materials and in processing, production and packaging of finished product. vi

9 Πρόλογος Πρόλογος Οι µυκοτοξίνες είναι από τις σπουδαιότερες και πιο συχνά ευρισκόµενες τοξίνες σε εισαγόµενα και εγχώρια γεωργικά προϊόντα και τρόφιµα. Αποτελούν τα προϊόντα του δευτερογενούς µεταβολισµού των µυκήτων και παράγονται συνήθως κατά το τελευταίο στάδιο της ανάπτυξής τους πάντα µετά από τη διαδικασία του σχηµατισµού των σπορίων τους. Μπορούν να βρεθούν σε προϊόντα τόσο ζωικής όσο και φυτικής προέλευσης. Για το λόγο αυτό ο προσδιορισµός τους επιβάλλεται από Κοινοτικές οδηγίες. Τα όριά τους ποικίλουν ανάλογα µε το προϊόν και την τοξίνη που προσδιορίζεται. Επειδή το πρόβληµα των µυκοτοξινών θεωρείται πάρα πολύ σοβαρό, καθώς δηµιουργούν πολλά προβλήµατα υγείας, όπως επιπλοκές στο συκώτι, την καρδιά, το αίµα, το µυελό των οστών κ.α., θεωρείται απαραίτητη τόσο η ανίχνευση όσο και ο προσδιορισµός τους. Έχει διαπιστωθεί από πειράµατα σε πειραµατόζωα, ότι επίπεδα µυκοτοξινών χαµηλότερα ακόµη και από 1 ppm είναι ικανά να προκαλέσουν συµπτώµατα δηλητηρίασης. Oι έλεγχοι που δηµιουργούνται από τις αρµόδιες υγειονοµικές αρχές σχεδόν καθηµερινά φέρνουν στην επιφάνεια κρούσµατα µη παραδεκτών συνθηκών παρασκευής, διακίνησης, αποθήκευσης και διάθεσης τροφίµων µε συνέπεια την απειλή της δηµόσιας υγείας, κλονίζοντας την εµπιστοσύνη των καταναλωτών και θέτοντας ακόµα υψηλότερα τον πήχη της ποιότητας και της ασφάλειας. Για τους λόγους αυτούς τα τελευταία χρόνια παρατηρείται ένα συνεχώς αυξανόµενο ενδιαφέρον από την πλευρά των καταναλωτών για την ποιότητα, την ασφάλεια και τη διατροφική αξία των τροφίµων. Ταυτόχρονα, µια µεγάλη µερίδα των καταναλωτών είναι πολύ καλά ενηµερωµένη σχετικά µε την ευεργετική επίδραση που µπορεί να έχουν τα τρόφιµα ή κάποια συστατικά αυτών στην ανθρώπινη υγεία, ενώ παράλληλα γίνεται όλο και περισσότερο καχύποπτη ως προς τα ενδεχόµενα προβλήµατα υγείας που πιθανόν να προκαλούν κάποια άλλα συστατικά τροφίµων (συντηρητικά). Έτσι, χρόνο µε τον χρόνο, καθίσταται περισσότερο εµφανής η σχέση τροφίµων και ανθρώπινης υγείας. Επί πλέον παρατηρείται µια στροφή των καταναλωτών

10 Πρόλογος προς τα παραδοσιακά τρόφιµα, τα οποία τις περισσότερες φορές, χαρακτηρίζονται από καλύτερες οργανοληπτικές και διατροφικές ιδιότητες απ ότι τα βιοµηχανοποιηµένα, ενώ τους αποδίδονται και ιδιαίτερα ευεργετικές ιδιότητες σε σχέση µε την υγεία του ανθρώπου. Σύµφωνα µε τις τάσεις αυτές είναι δεδοµένη η πρόκληση τόσο για τους ερευνητές που ασχολούνται µε τον τοµέα της επιστήµης και τεχνολογίας τροφίµων και διατροφής όσο και για τη βιοµηχανία τροφίµων να ανταποκριθούν στις απαιτήσεις των καιρών για οικονοµικότερη και αποδοτικότερη διεξαγωγή χηµικών διεργασιών. Η παραγωγή τροφίµων υψηλής οργανοληπτικής ποιότητας, υψηλής χηµικής και µικροβιολογικής ασφάλειας, µε ελάχιστη φυσικοχηµική επεξεργασία και βελτιωµένες φυσικοχηµικές ιδιότητες, υψηλής διατροφικής αξίας, µε συγκεκριµένες ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία του ανθρώπου, απαιτεί µια ολιστική προσέγγιση της διατροφικής αλυσίδας, όπου ο άνθρωπος, το περιβάλλον, και τα τρόφιµα θα πρέπει να θεωρηθούν ισοδύναµοι κρίκοι.

11 1. Οι Μυκοτοξίνες Θεωρητικό Μέρος 1.1 Εισαγωγή Οι µυκοτοξίνες είναι τοξικές ουσίες οι οποίες παράγονται από την ανάπτυξη µυκήτων σε τροφές και ζωοτροφές. Ο αριθµός των ειδών των µυκήτων έχει υπολογιστεί ότι είναι πάνω από , ενώ τα είδη των µυκήτων που παράγουν µυκοτοξίνες στις ζωοτροφές είναι σχετικά λίγα, περίπου 220. Ο γνωστός αριθµός των µυκοτοξινών, ανέρχεται στις 60. Οι πιο γνωστές µυκοτοξίνες είναι οι αφλατοξίνες, η Τ2 τοξίνη, η Diacetoxyscirpenol, η ζεαραλενόνη και η ωχρατοξίνη. Οι µυκοτοξίνες λοιπόν, είναι οργανικές χηµικές ουσίες, αλειφατικές ή κυκλικές, απλής σχετικά δοµής µε σχετικά απλό αριθµό ατόµων άνθρακα και χαµηλού µοριακού βάρους µε παρόµοιες µεταξύ τους χηµικές ιδιότητες. Είναι παράγωγα ή συγγενείς ενώσεις µε την κουµαρίνη, τα τερπενοειδή, ανθρακινόνες, µακρολίδια, στεροειδή, και τετρονικά οξέα. Έχουν διάφορες χηµικές δοµές και συνεπώς προκαλούν διάφορες δυσάρεστες βιολογικές επιπτώσεις τόσο στην υγεία των ανθρώπων όσων και των ζώων. Είναι εξαιρετικά επικίνδυνες ενώσεις, που παραµένουν δραστικές για µεγάλο χρονικό διάστηµα και µετά την καταστροφή των µυκήτων από τους οποίους προήλθαν. Επιπλέον, επειδή πολλές από αυτές είναι θερµοανθεκτικές, δεν καταστρέφονται σε συνήθεις συνθήκες θερµικής κατεργασίας τροφίµων. 1

12 Θεωρητικό Μέρος Η δράση τους στους ζώντες οργανισµούς είναι ηπατοτοξική, νεφροτοξική, αιµοτοξική, νευροτοξική, δερµοτοξική και πολλές έχουν καρκινογόνες ή οιστρογόνες ιδιότητες. Μερικές φορές έχουν αντιβιοτική δράση κατά των µικροβίων και καταστρέφουν την µικροβιακή χλωρίδα λ.χ. η πενικιλίνη είναι η µυκοτοξίνη του µύκητα Penicillium chrysogenum (δηλαδή της χλωραµφενικόλης). Ένα πρόβληµα που δεν έχει µελετηθεί αρκετά είναι η δράση, λόγω ενδεχόµενης συνεργίας, δυο µυκοτοξινών που υπάρχουν µαζί στην ίδια ζωοτροφή. Πιθανώς οι µυκοτοξίνες που υπάρχουν σε µη τοξικές ποσότητες στις τροφές όταν είναι µόνες, να γίνονται τοξικές όταν δρουν µαζί όπως συµβαίνει µε πολλά αντιβιοτικά. Οι συγκεντρώσεις των µυκοτοξινών οι οποίες είναι σηµαντικές για την υγεία των ζώων και των ανθρώπων, µετριούνται συνήθως σε µg/kg τροφής (ppb). Οι µυκοτοξίνες, οι οποίες όπως προαναφέρθηκε σχηµατίζονται κατά τη διάρκεια της αναπτύξεως ορισµένων µυκήτων, είτε απεκκρίνονται µέσα στο υλικό που αναπτύσσεται ο µύκητας, είτε κατακρατούνται στο εσωτερικό του κυττάρου των µυκήτων και ελευθερώνονται µετά τη θραύση του µυκηλίου[1]. 1.2 Είδη Μυκοτοξινών Τριχοθυκένια Τα Τριχοθυκένια (trichothecenes) αποτελούν ένα είδος µυκοτοξινών που παράγονται από την µούχλα που προκαλούν οι µύκητες του γένους fusarium(βλ. Σχήµα 2). Μέχρι σήµερα έχουν ανακαλυφτεί περίπου 190. Χωρίζονται σε τέσσερις τύπους όπου ο κάθε ένας χαρακτηρίζεται από ένα ιδιαίτερο γνώρισµα(βλ. Σχήµα 1). Τύπος Α: στη θέση C-8 δεν υπάρχει καρβονυλοµάδα. Τύπος Β: στη θέση C-8 υπάρχει καρβονυλοµάδα. Τύπος Γ: διαθέτει και ένα second epoxy group. Τύπος : διαθέτει µία µακροκυκλική (macrocyclic) δόµηση [2]. 2

13 Θεωρητικό Μέρος Σχήµα 1: Χηµική δοµή των Τριχοθυκένιων Σχήµα 2: α)aspergilus flavus, β)penicillium citrinum, γ)aspergillus ochraceus, δ)phomopsis, ε)trichothecium, στ)trichoderma, ζ)claviceps, η)parasiticus, θ)fusarium. 3

14 Θεωρητικό Μέρος Τα Τριχοθυκένια εµφανίζονται συνήθως σε δηµητριακά, όπως ρύζι, αλεύρι, κριθάρι, βρώµη και άλλα τα οποία και µολύνουν. Οι τύποι Α και Β εµφανίζονται ευρύτατα σε πολλά προϊόντα σε αντίθεση µε τους τύπους Γ και τα οποία παρουσιάζουν υψηλότερη τοξικότητα αλλά εµφανίζονται πιο σπάνια στα τρόφιµα. Έχει διαπιστωθεί ότι ορισµένα νοσήµατα έχουν άµεση σύνδεση µε την έκθεση του ανθρώπου σε τριχοθυκένια ή και παράγωγα αυτών όπως σε δεοξυνιβαλενόλη (DON). Παρόλο που η ανθρώπινη έκθεση σε DON µπορεί να είναι µέσα στο εύρος των δόσεων που φαίνεται να προκαλούν ανοσοτοξίκωση στα τρωκτικά, οι πραγµατικές συνέπειες που προκαλεί στον άνθρωπο δεν έχουν προσδιοριστεί και χρειάζεται περαιτέρω µελέτη [3] Ωχρατοξίνες Οι Ωχρατοξίνες (ochratoxins, OT) παράγονται από διάφορα στελέχη µυκήτων των ειδών penicillium και aspergillus ssp. (Aspergillus Ochraeus και Aspergillus Carbonarius), τα οποία αναπτύσσονται σε διάφορες συνθήκες και για το λόγο αυτό λέγεται ότι είναι από τις πιο συχνά εµφανιζόµενες τοξίνες στις διάφορες τροφές. Η κύρια τοξίνη αυτής της κατηγορίας είναι η Ωχρατοξίνη Α (ΟΤΑ) (βλ. Σχήµα 3), η οποία εµφανίζεται συνήθως στο σίτο, στο καλαµπόκι, στη βρώµη, στον καφέ, στα φυστίκια, στα δηµητριακά, στα ξηρά φρούτα, στα σταφύλια, στο κακάο [4], καθώς επίσης και σε κρέας ή τυρί που έχει παραχθεί από ζώα που έχουν καταναλώσει µολυσµένες τροφές[5]. Η ΟΤΑ είναι µια τοξίνη που παράγεται φυσικά από διάφορα είδη Aspergillus και Penicillium (βλ. Σχήµα 2). Αυτά τα είδη των στελεχών Aspergillus και Penicillium βρίσκονται σε διάφορες περιοχές και ευδοκιµούν σε διαφορετικά κλίµατα και σε διάφορες εγκαταστάσεις αποθήκευσης τροφίµων και έτσι η µόλυνση των συγκοµιδών τροφίµων µε OTA µπορεί να εµφανιστεί παγκοσµίως. Η OTA µπορεί να βρεθεί σε µία µεγάλη ποικιλία τροφίµων και ποτών όπως τα δηµητριακά, η µπύρα, το κρασί, το κακάο, ο καφές, τα ξηρά φρούτα 4

15 Θεωρητικό Μέρος αµπέλων και τα καρυκεύµατα, καθώς επίσης και σε µερικά προϊόντα κρέατος, ως αποτέλεσµα της µόλυνσης της ζωικής τροφής. Η OTA είναι τοξική στα ζώα, ενώ η κύρια επίδραση της είναι η πρόκληση νεφροτοξικότητας. Θεωρείται επίσης ανοσοτοξική, υπεύθυνη για τερατογενέσεις καθώς επίσης έχει ταξινοµηθεί από τον IARC (International Agency for Research on Cancer, ιεθνής Οργανισµός για Έρευνα στον Καρκίνο) ως καρκινογόνο κατηγορίας 2Β (class 2B carcinogen), πιθανό καρκινογόνο για τον άνθρωπο[6]. Σχήµα 3: Χηµική οµή της Ωχρατοξίνης Α Οι κίνδυνοι τοξικότητας της OTA για την ανθρώπινη υγεία έχουν αξιολογηθεί σε ευρωπαϊκό και διεθνές επίπεδο από την επιστηµονική Επιτροπή της Ευρωπαϊκής Επιτροπής των τροφίµων (SCF) και τη Μικτή FAO/WHO ειδική Επιτροπή των πρόσθετων ουσιών τροφίµων (JECFA), οι οποίες έχουν καθιερώσει τα ανεκτά όρια συγκέντρωσης της OTA στα τρόφιµα (SCF, 1998 JECFA, 2001). Η Επιστηµονική Επιτροπή Τροφίµων (Scientific Committee for Food) έθεσε σαν ανώτατο όριο πρόσληψης (tolerable daily Intake, TDI) ΟΤΑ από τον άνθρωπο 5 ng/kg bw/day (ανά κιλό βάρους την ηµέρα) και ο πλέον επαρκής τρόπος ανάλυσης για την ΟΤΑ θεωρείται η χρωµατογραφία υψηλής πίεσης σε συνδυασµό µε φασµατοµετρία µάζας (LC/MS) [7]. Αυτό που κάνει ιδιαίτερα µοναδική την Ωχρατοξίνη είναι η παρουσία του χλωρίου στη δοµή της (βλ. Σχήµα 3). Μελέτες έδειξαν ότι η ΟΤΑ παραµένει ιδιαίτερα σταθερή στην αύξηση της θερµοκρασίας, αλλά οζονόλυση 5

16 Θεωρητικό Μέρος της σε υδατικά της διαλύµατα είναι ιδιαίτερα αποτελεσµατική στη καταστροφή της Είδη και ιδιότητες Ωχρατοξινών Υπάρχουν τρία είδη ωχρατοξινών: Η Ωχρατοξίνη Α, Β, και C όπως φαίνεται και στο Σχήµα 3, τα οποία παράγονται από διάφορα γένη των Aspergillus και Penicillium µυκήτων (και ιδιαίτερα του µύκητα Aspergillus ochraceus) που αναπτύσσονται σε ηµιτροπικά και θερµά κλίµατα [8]. Οι Ωχρατοξίνες είναι σχετικά σταθερές στη θερµότητα. Σχήµα 4: Χηµικοί τύποι των ωχρατοξινών Α, Β, και C Χηµικά, οι ωχρατοξίνες είναι ασθενή οργανικά οξέα που αποτελούνται από µια οµάδα διυδροϊσοκουµαρίνης (dihydroisocumarin) που ενώνεται µε πεπτιδικό δεσµό µε µια L-Φαινυλαλανίνη. οµικά, οι τρεις τοξίνες διαφέρουν ελαφρώς µεταξύ τους, εντούτοις, αυτές οι διαφορές έχουν µεγάλη σηµασία 6

17 Θεωρητικό Μέρος στη τοξικότητα της κάθε µια από αυτές. Η ωχρατοξίνη Α (OTA), είναι και η πιο συχνά απαντόµενη, αλλά και η πιο τοξική από τις τρεις. Όπως απεικονίζεται και στο σχήµα 4, αντικατάσταση του χλωρίου µε ένα άτοµο υδρογόνου µας δίνει την ωχρατοξίνη Β (OTB), η οποία είναι κατά φορές λιγότερο τοξική από την Α, τόσο in vivo όσο και in vitro. Σχήµα 5: Στάδια µετατροπής της ωχρατοξίνης. Περαιτέρω δοµικές αλλαγές παράγουν την ωχρατοξίνη C (OTC), η οποία δεν φαίνεται να έχει τοξική δράση. Εντούτοις, µια πρόσφατη δηµοσίευση υποστηρίζει ότι η OTC είναι πολύ πιο τοξική από την OTA ή την OTB στην κυτταρική σειρά THP-1 από ανθρώπινο µονοκύτταρο (µονοπύρηνο, φαγοκυτταρικό λευκοκύτταρο) [9]. 7

18 1.2.3 Φουµοσίνη Θεωρητικό Μέρος Αυτή η µυκοτοξίνη (fumonisins) παράγεται από τα παθογόνα στελέχη των µικροοργανισµών Fusarium verticillioides και Fusarium proliferatum, και σε πολύ µικρές ποσότητες, από τον µικροοργανισµό Alternaria στη ντοµάτα, στο σπαράγγι και στο σκόρδο. Οι Φουµονισίνες είναι ιδιαίτερα υδατοδιαλυτές, πολικές ενώσεις που είναι διαλυτές στο νερό και τα διαλύµατα ύδατος της µεθανόλης και του ακετονιτριλίου, αλλά δεν είναι διαλυτοί στους µη πολικούς διαλύτες και σε αντίθεση µε τις υπόλοιπες µυκοτοξίνες. εν περιέχουν αρωµατικό δακτύλιο ή χρωµοφόρες περιοχές, ώστε να είναι εύκολη η ανίχνευσή τους. Οι Φουµονισίνες παρουσιάζονται ιδιαίτερα σταθερές σε ένα πλήθος χηµικών διαδικασιών και αλλαγών στη θερµοκρασία[5]. Είναι φυσικοί µολυσµατικοί παράγοντες των σιταριών και των δηµητριακών παγκοσµίως και βρίσκονται συνήθως στο καλαµπόκι και τα προϊόντα που παράγονται από αυτό [10]. Προκαλούν σοβαρές διαταραχές στα ζώα [11], ενώ µελέτες απέδειξαν πως ευθύνονται για ασθένειες όπως το πνευµονικό οίδηµα στους χοίρους [12] καθώς επίσης και για τον καρκίνο του ήπατος και του οισοφάγου [13,14]. Τρόφιµα που περιέχουν αραβόσιτο, είναι τα πιο πιθανά να περιέχουν τοξίνες αυτής της οικογένειας και έτσι σε αυτά στρέφουν τη προσοχή τους οι βιοµηχανίες τροφίµων. Υψηλά ποσοστά περιεκτικότητας σε Φουµονισίνες έχουν καταγραφεί σε µικρής έκτασης (οικιακές) καλλιέργειες καλαµποκιού τόσο στη Κίνα όσο και στη Νότια Αφρική. Για τους λόγους αυτούς κρίθηκε αναγκαίο το FDA να θεσπίσει τα ανώτατα όρια του συνολικού περιεχοµένου fumonisin στο καλαµπόκι (2-4 ppm) και σε τροφές (5-100 ppm) που βασίζονται σε αυτό. Έτσι η Ευρωπαϊκή Επιτροπή πρότεινε µια µέγιστη ανεκτή συνολική εισαγωγή fumonisin στον οργανισµό 2 g/kg σωµατικού βάρους[15,16]. 8

19 Θεωρητικό Μέρος Σχήµα 6: Χηµικές δοµές των φουµοσινών Ειδικότερα ο τύπος FumonisinB1 (FB1) προσελκύει την περισσότερη προσοχή δεδοµένου ότι απαντάνται σε ποσοστό µεγαλύτερο του 70% της συνολικής περιεκτικότητας σε fumonisin Fusarium στα µολυσµένα δείγµατα καλαµποκιού και εκθέτει τον άνθρωπο σε υψηλό κίνδυνο εµφάνισης καρκίνου. προωθώντας τη δραστηριότητα όλων των fumonisins. Το γεγονός αυτό συνδέθηκε µε τον µεταβολισµό της µυκοτοξίνης κατά τη διάρκεια επεξεργασίας των τροφίµων, που στηρίζεται κυρίως στη µερική ή πλήρη υδρόλυση της µίας ή και των δύο εστέροµάδων[17]. Εκτός αυτού, η µερική υδρόλυση έχει παρατηρηθεί και παρουσία υγρασίας κάτω από τις υψηλές θερµοκρασίες [18]. 9

20 Θεωρητικό Μέρος Αυτή η αλυσίδα γεγονότων έθεσε το στάδιο ώστε να πολλαπλασιαστούν τα ερευνητικά προγράµµατα ανά τον κόσµο, έχοντας ως στόχο τα ακόλουθα: 1) Τον προσδιορισµό και τον χαρακτηρισµό των διαφόρων ειδών fumonisins που µολύνουν τα τρόφιµα. 2) Τον καθορισµό των παραγόντων που ευνοούν τον σχηµατισµό fumonisin 3) Τον έλεγχο µόλυνσης των τροφίµων και τον προσδιορισµό των επιτρεπτών ορίων στα τρόφιµα 4) Την ανάπτυξη των αναλυτικών µεθόδων για fumonisins 5)Την κατανόηση της βιολογικής δραστηριότητας των fumonisins στα ζώα και στους ανθρώπους Αφλατοξίνες Οι αφλατοξίνες παράγονται από διάφορα είδη Aspergillus και πιο συγκεκριµένα από aspergillus flavus και aspergillus parasiticus τα οποία πληθαίνουν στις γεωργικές καλλιέργειες κυρίως στις περιοχές µε θερµό και υγρό κλίµα. Ήταν οι πρώτες µυκοτοξίνες που προσδιορίστηκαν και θεωρήθηκαν ως πιθανός κίνδυνος για την υγεία των ανθρώπων και ζώων, αφού πέθαναν γαλοπούλες από µια οξεία νέκρωση του συκωτιού τους µετά από κατανάλωση αραχίδων οι οποίες είχαν µολυνθεί από στελέχη Aspergillus flavus[19]. Μπορούν να µολύνουν πολλές σοδειές, συµπεριλαµβανοµένων των φιστικιών, του καλαµποκιού, του βαµβακόσπορου, των καρυδιών της Βραζιλίας, των καρυκευµάτων, της copras (ξηρά καρύδα), και των σύκων. Η µόλυνση ευδοκιµεί στις ζεστές και υγρές περιοχές του κόσµου, όπως η Αφρική και µερικά µέρη της Κίνας. Είναι από τις πιο καρκινογόνες τοξίνες και µετά την εισαγωγή τους στον οργανισµό µεταβολίζονται στο συκώτι[20]. Αυτές οι µυκοτοξίνες απαντώνται σε διάφορες µορφές (13 τουλάχιστον) από τις οποίες οι πιο σηµαντικές είναι οι: B1 (πιο καρκινογόνος από τις άλλες), B2, G1,G2, M1 και Μ2 (Bλ. Σχήµα 7). Η M1 µορφή είναι ο κυρίαρχος µεταβολίτης της Αφλατοξίνης B1 (AFB1) που 10

21 Θεωρητικό Μέρος βρίσκεται στο µητρικό γάλα που µεταβιβάζεται στο παιδί µε το θηλασµό. Επίσης απαντάται και στα ζώα που καταναλώνουν AFB1-µολυσµένα τρόφιµα. Σχήµα 7: Χηµικές δοµές των αφλατοξινών Το B και G πρόθεµα αναφέρεται στο µπλε (blue) ή πράσινο (green) φθορισµό που παρατηρείται ύστερα από έκθεση της τοξίνης σε U.V. ακτινοβολία (Βλ. Πίνακα 2 & Σχήµα 8). Γνωρίζουµε ότι µερικές ενώσεις µετατρέπονται σε εξαιρετικά δραστικά µεταλλαξιγόνα δια µέσου της δράσης ενζύµων, τα οποία συνήθως παίζουν ρόλο στην αποτοξίκωση. Ένα εντυπωσιακό παράδειγµα αποτελεί και η Αφλατοξίνη Β1. Ένα ένζυµο κυτοχρώµατος P450 µετατρέπει την ένωση αυτή σε ένα εξαιρετικά αντιδραστικό εποξείδιο (Βλ. Σχήµα 9). Ο παράγοντας αυτός αντιδρά µε το άτοµο Ν-7 της γουανίνης σχηµατίζοντας µια ένωση η οποία συχνά οδηγεί σε µεταστροφή του ζεύγους βάσεων στο γενετικό υλικό από G- C σε T-A (µετάλλαξη µετάπτωσης). 11

22 Πίνακας Ι: Είδη αφλατοξινών και η προέλευσή τους [21] Θεωρητικό Μέρος ΑΦΛΑΤΟΞΙΝΗ B1 & B2 G1 & G2 M1 M2 ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ Aspergillus flavus και A. parasiticus Aspergillus parasiticus Μεταβολίτης της Β1 σε ζώα και ανθρώπους και σε µικρή ποσότητα σε µητρικό γάλα Βρίσκεται στο γάλα βοοειδών ύστερα από κατανάλωση µολυσµένης τροφής Σχήµα 8: Φθορισµός αφλατοξινών σε δείγµατα από καλαµπόκι Η ιεθνής Επιτροπή αντικαρκινικού αγώνα έχει ταξινοµήσει την αφλατοξίνη B1 (AFB1) ως καρκινογόνο ουσία και τις αφλατοξίνες B2, G1 και G2 (AFB2, AFG1 και AFG2) ως πιθανές καρκινογόνες ουσίες στους ανθρώπους [22,23]. Στην πραγµατικότητα, αποδείχθηκε ότι ανήκουν στις πιο ισχυρές νεφροτοξικές φυσικές ενώσεις και καρκινογόνες ουσίες που προσβάλλουν το συκώτι και συνεπώς, προσέλκυσε την ιδιαίτερη προσοχή προς µελέτη από την ανακάλυψή τους στις αρχές της δεκαετίας του '60' [24]. 12

23 Θεωρητικό Μέρος Λόγω της µεταφοράς τους στα τρόφιµα, και συνεπώς και στον οργανισµό µέσω της τροφικής αλυσίδας, θεωρούνται ότι µπορούν να επηρεάσουν σε µεγαλύτερο βαθµό από όλες τις υπόλοιπες µυκοτοξίνες την ανθρώπινη υγεία. Σχήµα 9: Ο µεταβολισµός της αφλατοξίνης Β1 [7] Περιοχές µε υψηλά ποσοστά ηπατοκυτταρικού καρκινώµατος (HCC) σύµφωνα µε µια έρευνα έχουν να κάνουν όχι µόνο µε την ηπατίτιδα β αλλά και µε ταυτόχρονη µόλυνση από AFB1, πράγµα που δείχνει ότι η AFB1 είναι 13

24 Θεωρητικό Μέρος ικανός παράγοντας για να προκαλέσει από µόνος του HCC στον άνθρωπο(βλ. Σχήµα 10)[5]. Σχήµα 10: Σχηµατική απεικόνιση του τρόπου µόλυνσης του ανθρώπινου οργανισµού από αφλατοξίνες Πιο πρόσφατο παράδειγµα προσβολής πληθυσµού από αφλατοξίνη είναι αυτό στην ανατολική Κένυα, όπου το 2004 προσβλήθηκαν κάποιες εκατοντάδες πληθυσµού. Ο λόγος αυτού του ξαφνικού ξεσπάσµατος ήταν η φτωχή συγκοµιδή αραβοσίτου όπου είχε «χαλάσει» και ήταν ευάλωτη στη µούχλα λόγω της ξηρασίας. Επιπλέον οι άνθρωποι, για να φρουρήσουν τη σοδειά τους ενάντια στην κλοπή, αποθήκευσαν τον αραβόσιτο στα σπίτια τους, τα οποία ήταν θερµότερα και πιο υγρά από τους σιτοβολώνες όπου αποθηκευόταν συνήθως. Από τον Ιανουάριο µέχρι τον Ιούνιο του 2004, 317 άνθρωποι εισήχθησαν σε νοσοκοµεία για νοσοκοµειακή περίθαλψη, µε συµπτώµατα ηπατικής ανεπάρκειας, εκ των οποίων 125 πέθαναν. Όταν 14

25 Θεωρητικό Μέρος εξετάστηκαν τα δείγµατα αραβοσίτου βρέθηκαν συγκεντρώσεις αφλατοξίνης B1 υψηλότερες µέχρι και 4400 µέρη ανά δισεκατοµµύριο (ppb), δηλαδή 220 φορές πάνω από το κενυατικό όριο για τα τρόφιµα[25]. Εκτός του καρκίνου του ήπατος, έκθεση σε µεγάλα ποσοστά αφλατοξίνης µπορεί να οδηγήσει σε οξεία ζηµιά του συκωτιού, οίδηµα, αλλαγή στην πέψη και στην απορρόφηση ή/και στο µεταβολισµό των θρεπτικών ουσιών. Κανένα ζωικό είδος δεν είναι άνοσο στα τοξικά αποτελέσµατα των αφλατοξινών, συµπεριλαµβανοµένων και των ανθρώπων, εντούτοις, οι άνθρωποι έχουν µια εξαιρετικά υψηλή ανοχή στην έκθεση αφλατοξίνης. Τα παιδιά, παρόλα αυτά, επηρεάζονται ιδιαίτερα από την αφλατοξίνη που οδηγεί σε καθυστέρηση στην ανάπτυξη και σε νοητική στέρηση. Ο µεταβολίτης M1 της αφλατοξίνης µπορεί να παρεµβληθεί στο DNA και να αλκυλοποιήσει τις βάσεις του, προκαλώντας καρκίνο του ήπατος. Ιατρικές έρευνες έχουν αποδείξει, ότι µια κανονική διατροφή συµπεριλαµβανοµένων λαχανικών όπως τα καρότα, το σέλινο και ο µαϊντανός, µειώνει τα καρκινογόνα αποτελέσµατα της αφλατοξίνης[20] Ζεαραλενόνη Εισαγωγή Η Ζεαραλενόνη (zearalenone, ZON), ανήκει στην κατηγορία των µυκοοιστρογόνων, και έχει προκαλέσει την έντονη προσοχή της επιστηµονικής κοινότητας, λόγω της πιθανότητας να επηρεάζει τα περιβαλλοντικά οιστρογόνα, τα οποία µπορεί να έχουν τη δυνατότητα να αναστατώνουν τις λειτουργίες των στεροειδών ορµονών που καθορίζουν το φύλο. Πρόκειται για προϊόν δευτερογενούς µεταβολισµού. Τα είδη Fusarium που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή ΖΟΝ και απαντώνται συχνότερα στις χοιροτροφικές εκµεταλλεύσεις είναι το F. graminearum και το F. culmorum και σπανιότερα, το F. equiseti και F. cerealis[26]. 15

26 Χηµική δοµή Θεωρητικό Μέρος Η ζεαραλενόνη είναι µια λακτόνη του 6 (10-υδρόξυ-6-όξο-τρανς-1- εντενέκυλο)-β-ρεσορκυκλικού οξέος µε µοριακό τύπο C 18 H 22 O 5 και µοριακό βάρος 318,36. Οι µεταβολίτες α- και β-ζεν είναι τα δύο ισοµερή που σχηµατίζονται µε την αναγωγή της κετονο-οµάδας του άνθρακα στη θέση 6 του δακτυλίου της λακτόνης, σε υδροξυλ-οµάδα (C=O C-OH) (εικόνα που ακολουθεί) και έχουν µοριακό τύπο C 18 H 24 O 5, και µοριακό βάρος 320,36[27] Φυσικοχηµικές Ιδιότητες Ζεαραλενόνης Η Ζεαραλενόνη είναι ένα άσπρο κρυσταλλικό στερεό µε το σηµείο τήξης της να κυµαίνεται από Ο C, ενώ το µοριακό της βάρος είναι 318,36. Η διαλυτότητα της στο νερό είναι 0,002g/100ml. Είναι λιγότερο διαλυτή στο εξάνιο και παρουσιάζει σταδιακή αύξηση στο βενζόλιο, το ακετονιτρίλιο, τη µεθανόλη, την αιθανόλη και την ακετόνη. Είναι επίσης διαλυτή στα υδάτινα αλκαλικά διαλύµατα. Η χηµική της δοµή απεικονίζεται στο ακόλουθο σχήµα. Σχήµα 11: Συντακτικός τύπος της ζεαραλενόνης 16

27 Τοξικότητα Θεωρητικό Μέρος Η µέση θανατηφόρος δόση LD50 (median lethal dose) της ΖΟΝ ορίζεται µεταξύ και mg/kg σωµατικού βάρους[28]. Για τη διερεύνηση της τοξικότητας της ΖΟΝ για πρόκληση οξείας παθολογικής κατάστασης, έγιναν διάφοροι πειραµατισµοί κυρίως σε τρωκτικά. Η χορήγηση ZΟN, µε την τροφή, σε επίµυες, σε δόση 0, 0,1, 1,0, ή 3,0 mg/kg Σ.Β., ανά ηµέρα, για 104 εβδοµάδες προκάλεσε σηµαντική αύξηση του βάρους του ήπατος σε όλα τα πειραµατόζωα. Επιπλέον, στις υψηλές δόσεις παρατηρήθηκε αύξηση του βάρους της µήτρας στα θηλυκά[29]. Σε επίµυες η χορήγηση ZΟN σε δόση 1,0 ή 2,0 mg/kg Σ.Β, ανά ηµέρα, για 103 εβδοµάδες προκάλεσε µείωση του σωµατικού βάρους των πειραµατόζωων και νεφροπάθεια και επιπλέον, φλεγµονή του προστάτη αδένα, ατροφία των όρχεων και κενοτοπιώδη εκφύλιση των ηπατικών κυττάρων στα αρσενικά. Σε νεαρές σύες, που εµφανίζουν την µεγαλύτερη ευαισθησία στη µυκοτοξίκωση από ZΟN, η χορήγηση από το στόµα 0, 3,5, 7,5 ή 11,5 mg ZΟN /kg Σ.Β. προκάλεσε αιδοιοκολπίτιδα µε εξοίδηση των χειλέων του αιδοίου, µια εβδοµάδα µετά τη χορήγηση[30]. Σε in vitro πειραµατισµούς έχει αποδειχτεί ότι η προσθήκη ζεαραλενόνης σε υπόστρωµα καλλιέργειας βλαστοκύστεων επίµυ, σε συγκεντρώσεις 8,5 έως 68 µg/ml, επέδρασε αρνητικά στην ανάπτυξη των εµβρύων (κατά 50% στη συγκέντρωση των 32 µg/ml)[31]. Σε πειραµατισµό ωρίµανσης ωαρίων αγελάδας in vitro, η προσθήκη ΖΟΝ και α-ζεν στο υπόστρωµα ωρίµανσης, σε συγκέντρωση 30 µg/ml, επηρέασε αρνητικά το αποτέλεσµα. Συγκεκριµένα, ο αριθµός των ωαρίων που έφτασαν στο στάδιο της µετάφασης II ήταν σηµαντικά µικρότερος, ενώ το ποσοστό ωαρίων µε χρωµατοσωµικές ανωµαλίες ήταν σηµαντικά µεγαλύτερο σε σύγκριση µε τους µάρτυρες[32]. Σε in vitro πειραµατισµούς που χρησιµοποιήθηκαν ωάρια και έµβρυα συών η προσθήκη α- και β-ζεν, σε συγκεντρώσεις από 3,75 έως και 90µΜ, είχε ως αποτέλεσµα την αρνητική επίδραση της α-ζεν τόσο στην διαδικασία ωρίµανσης των ωαρίων όσο και στην ανάπτυξη των εµβρύων, µε βαθµό επίδρασης ανάλογο µε τη δόση της τοξίνης[33]. Οι αναφορές στη διεθνή βιβλιογραφία σχετικά µε τη διερεύνηση της τοξικής επίδρασης της ΖΟΝ 17

28 Θεωρητικό Μέρος στο γεννητικό σύστηµα του αρσενικού περιορίζονται κυρίως σε πειραµατισµούς που αφορούν σε µυς και επίµυες. Σε αρσενικούς επίµυες ηλικίας 10 εβδοµάδων η χορήγηση ΖΟΝ, σε δόση 5 mg /kg Σ.Β., ενδοπεριτοναϊκά, προκάλεσε εκφύλιση των σπερµατικών κυττάρων (στάδια I- VI) εντός 12 ωρών. Ιδιαίτερα τα σπερµατογόνια και τα δευτερογενή σπερµατοκύτταρα οδηγήθηκαν βαθµιαία σε απόπτωση[34]. Αντίθετα, σε αρσενικούς επίµυες ηλικίας 70 ηµερών η χορήγηση ΖΟΝ σε δόση 20 mg ανά kg Σ.Β., PO, για διάστηµα 5 εβδοµάδων, δεν επηρέασε το βάρος των όρχεων, τα κύτταρα του Sertoli, τα σπερµατογόνια, τα σπερµατοκύτταρα 1ης και 2ης τάξης και τις σπερµατίδες µε σφαιρικό ή επιµήκη πυρήνα[35]. Σε κριούς, η χορήγηση ΖΟΝ µε την τροφή, σε ποσότητα 12 mg/ζώο/ηµέρα, για 8 εβδοµάδες, δεν επηρέασε σηµαντικά τον όγκο και την πυκνότητα του εκσπερµατίσµατος καθώς και την κινητικότητα και τις µορφολογικές ανωµαλίες των σπερµατοζωαρίων[36]. Η µελέτη κι η εκτίµηση των πειραµατικών δεδοµένων οδήγησε τον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας στον καθορισµό ενός προσωρινού ορίου ανεκτής ηµερήσιας πρόσληψης ZΟN ίσο µε 0,5 µg/kg Σ.Β. Η απόφαση αυτή βασίστηκε στο NOEL (No-Observed-Effect Level, επίπεδο µη παρατηρούµενης δράσης) των 40 µg/kg Σ.Β, ανά ηµέρα, για χρονικό διάστηµα 15 ηµερών σε χοίρους. Στην ίδια µελέτη η επιτροπή έλαβε υπ όψιν το LOAEL (Lowest-Observed- Adverse-Effect Level, επίπεδο 29 χαµηλότερης παρατηρούµενης δυσµενούς δράσης) των 200 µg/kg Σ.Β., ανά ηµέρα και πρότεινε όπως η πρόσληψη της ZΟN συµπεριλαµβανοµένων και των µεταβολιτών της να µη υπερβαίνει τα 0,5 µg/kg Σ.Β Φυσικές πηγές µόλυνσης Η ζεαραλενόνη απαντάται (παγκοσµίως) στους δηµητριακούς καρπούς (σιτάρι, κριθάρι, σόγια, βρώµη, καλαµπόκι, κ.λπ.), όταν οι συνθήκες θερµοκρασίας και υγρασίας κατά την αποθήκευσή τους ευνοούν την ανάπτυξη µυκήτων. Οι µύκητες του γένους Fusarium παράγουν τα υψηλότερα ποσοστά ZΟN σε σχετική υγρασία 45% και θερµοκρασία C[37]. Έχουν αναφερθεί σε συνθήκες φυσικής µόλυνσης των ζωοτροφών συγκεντρώσεις 18

29 Θεωρητικό Μέρος 500 έως 600 ppm, στη Minnesota των Ηνωµένων Πολιτειών, 135 ppm, στη Φινλανδία[38], 100 ppm, στην Ουγγαρία[39], 64 ppm, στην Indiana των Ηνωµένων Πολιτειών[40], µεγαλύτερες των 803 µg/kg, στη νοτιοδυτική Γερµανία και των 120 µg/kg, στη Βουλγαρία. Σε ερευνητική εργασία κατά την οποία συλλέχθηκαν 500 δείγµατα από 19 διαφορετικές χώρες διαπιστώθηκε ότι το 44% από αυτά περιείχαν ζεαραλενόνη και η µέση συγκέντρωσή της ήταν 45 ppm[41] Παραγωγή Ζεαραλενόνης στις Συγκοµιδές Έρευνες έχουν αποδείξει ότι η µόλυνση των τροφίµων από τους µύκητες οφείλεται στο σύνολο τριών κυρίως παραγόντων[42]: Στην µόλυνση των εγκαταστάσεων µε έναν µυκητιακό εµβόλιο Στην αύξηση εκείνων των µυκήτων Στην ενδεχόµενη παραγωγή της µυκοτοξίνης. Οι κύριοι µηχανισµοί της µόλυνσης περιλαµβάνουν τη διασπορά του µολυσµατικού υλικού από το χώµα και τη βροχή κατά τη διάρκεια της άνθησης (σίτος και κριθάρι) ή (αραβόσιτος), µαζί µε τη µεταφορά του µολυσµατικού υλικού από τον αέρα. Έτσι εµποδίζεται να αναπτυχθεί η συγκοµιδή αραβόσιτου. Επιπλέον η µεταφορά του µολυσµατικού υλικού στον αραβόσιτο µπορεί να πραγµατοποιηθεί είτε από τα πουλιά είτε απο τα έντοµα, γεγονός που οδηγεί στη µετάδοση των µυκήτων του γένους graminearum F. [43]. Στο εργαστήριο, στελέχη του γένους Fusarium, αναπτύσσονται και παράγουν µυκοτοξίνες όταν η ενεργότητα του νερού είναι της τάξεως 0,98[44,45] γεγονός που ισοδυναµεί µε την περιεκτικότητα υγρασίας στο σιτάρι να ξεπερνάει το 25% σε 25 C [46]. Βάση αυτής δεδοµένης προϋπόθεσης, σχετικά µε το ποσοστό υγρασίας που εµπεριέχεται στο σιτάρι, η µεγαλύτερη δραστηριότητα των στελεχών του γένους Fusarium πραγµατοποιείται σε ορισµένες χρονικές περιόδους κυρίως κατά την διάρκεια ανάπτυξης των πυρήνων του σιταριού. 19

30 Θεωρητικό Μέρος Σχήµα 12: Σχηµατική αναπαράσταση του τρόπου µόλυνσης της παραγωγής από στελέχη του γένους Fusarium Επιπρόσθετα µελέτες στις µυκοτοξίνες[47] έχουν δείξει ότι αν και η µόλυνση των καλλιεργειών από DON εµφανίζεται σχετικά νωρίτερα πριν την ανάπτυξη των πυρήνων τόσο στο σιτάρι[48] όσο και στο καλαµπόκι [49] εντούτοις, η παραγωγή της ζεαραλενόνης στον αραβόσιτο εµφανίζεται αργότερα [50] Μεταβολισµός Ο µεταβολισµός της Ζεαραλενόνης έχει ιδιαίτερη σηµασία και αποτελεί αντικείµενο µελέτης περισσότερο από οποιαδήποτε άλλης µυκοτοξίνης, δεδοµένου ότι µερικοί από τους µεταβολίτες υπερβαίνουν αρκετά τις επιδράσεις που προκαλεί η ZON. Μάλιστα κάποιοι από αυτούς έχουν υιοθετηθεί ευρέως σαν τονωτικό από το 1969 προκειµένου να επιτευχθεί η βελτίωση των ποσοστών αύξησης βάρους των βοοειδών.λόγω των ανησυχιών για τις µακροπρόθεσµες επιπτώσεις στην υγεία τόσο των ζώων όσο και στους 20

31 Θεωρητικό Μέρος ανθρώπους, η χρήση τους καθώς επίσης και η παρουσία τους στα τρόφιµα έχουν απαγορευθεί στην Ευρωπαϊκή Ένωση από το 1985 [51]. Σχήµα 13: Χηµική δοµή της ζεαραλενόνης και των κύριων in vivo µεταβολιτών της Οι κύριοι µεταβολίτες της ζεαραλενόλης είναι η α- και η β-ζεαραλενόλη (α-ζεν και β-zen). ευτερευόντως ανιχνεύονται η α-ζεαραλανόλη (ζερανόλη) και η β-ζεαραλανόλη (ταλερανόλη). Γενικά οι µεταβολίτες της ZΟN δηµιουργούν χηµικές ενώσεις µε το γλυκουρονικό οξύ, όµως στα διάφορα είδη ζώων έχουν διαπιστωθεί ορισµένες διαφορές ως προς το µεταβολισµό της. Στα περισσότερα είδη η ZΟN και οι µεταβολίτες της απεκκρίνονται κυρίως µε τη χολή. Εξαίρεση αποτελεί το κουνέλι στο οποίο η απέκκριση γίνεται κυρίως µε το ούρο. Στο χοίρο η α-zen και οι γλυκουρονικές ενώσεις επικρατούν έναντι των άλλων µεταβολιτών. Αντιθέτως, στους επίµυες επικρατεί η ελεύθερη ZΟN και οι γλυκουρονικές ενώσεις της, ενώ στα βοοειδή[52] και στην όρνιθα[53,54] επικρατεί η β-zen. Η ZΟN απορροφάται γρήγορα από 21

32 Θεωρητικό Μέρος τον οργανισµό. Στο χοίρο ανιχνεύτηκε στο πλάσµα του αίµατος σε χρόνο µικρότερο των 30 λεπτών από την πρόσληψή της µε την τροφή[55,56]. Η ZΟN και η α-zen µπορούν να ανιχνευθούν στο πλάσµα του αίµατος έως την 5η ηµέρα και στο ούρο έως την 4η ηµέρα από το πέρας της χορήγησης[57]. Σε γαλουχούσες σύες που κατανάλωσαν µε την τροφή 40 ppm ζεαραλενόνης, η α- και η β- ZEN ανιχνεύτηκαν στο γάλα σε ποσοστό 13,4-15,7% και 82-86,1%, αντίστοιχα, ενώ το 0,5-1,3% της ZΟN δεν µεταβολίστηκε. Οι τοξίνες είναι δυνατό να ανιχνευθούν στο γάλα, ώρες µετά τη χορήγηση της µολυσµένης τροφής και συνεχίζουν να ανιχνεύονται έως και 5 ηµέρες µετά τη διακοπή της χορήγησης. Σε νεαρές σύες όταν χορηγήθηκε στην τροφή 1,1 mg ZΟN/ζώο/ηµέρα, για 18 ηµέρες, το 60% της ZΟN ανιχνεύτηκε στο ούρο ως α- και β-zen, σε αναλογία 3:1, αντίστοιχα[58]. Η ZΟN µεταβολίζεται από το ήπαρ ακολουθώντας δύο κύριες οδούς. Η πρώτη οδός είναι η δηµιουργία ενώσεων µε το γλυκουρονικό οξύ και η δεύτερη η µετατροπή της µε υδροξυλίωση (hydroxylation) σε α- και β- ισοµερή ζεαραλενόλης[59]. Όπως προαναφέρθηκε και οι µεταβολίτες της ΖΟΝ (α- και β-zen) σχηµατίζουν ενώσεις µε το γλυκουρονικό οξύ. Η δηµιουργία γλυκουρονικών ενώσεων καταλύεται από τις UDPGT-τρανσφεράσες, ενώ ο µεταβολισµός της ZΟN µέσω της δεύτερης οδού καταλύεται πιθανώς από τα ένζυµα 3α- και 3β-υδροξυστεροειδή δευδρογονάση (3α-HSD και 3β-HSD). Τα ένζυµα αυτά εµπλέκονται φυσιολογικά στο µεταβολισµό και στη βιοσύνθεση των στεροειδών στο ήπαρ και καταλύουν την µετατροπή της 5α-ανδροστεν- 3,17-διόνης σε ανδροστερόνη[60]. Το γεγονός αυτό ενισχύει την υπόθεση ότι η παρατεταµένη πρόσληψη ZΟN µπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή του µεταβολισµού των στεροειδών. Στο χοίρο έχει αποδειχθεί ότι για το µεταβολισµό της ζεαραλενόνης διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο η χολή και η εντεροηπατική κυκλοφορία. Η ΖΟΝ απεκκρίνεται µε τη χολή µε τη µορφή γλυκορουνικών µεταβολιτών. Στη συνέχεια απορροφάται εκ νέου και µεταβολίζεται περαιτέρω από τα κύτταρα του εντερικού βλεννογόνου και επιστρέφει, διαµέσου της πυλαίας κυκλοφορίας στο ήπαρ και στη συστηµατική κυκλοφορία. Ο κύκλος αυτός έχει ως συνέπεια την ανίχνευση αυξηµένων συγκεντρώσεων των µεταβολιτών της ΖΟΝ στο πλάσµα του αίµατος και αιτιολογεί τον αυξηµένο χρόνο ηµίσειας ζωής τους στο χοίρο. Ο 22

33 Θεωρητικό Μέρος κύκλος που περιγράφεται παραπάνω έχει αποδειχθεί πειραµατικά σε άνηβες σύες στις οποίες χορηγήθηκε ραδιοσηµασµένη ΖΟΝ, εφάπαξ, IV (5 mg/kg Σ.Β.) ή PO (10 mg/kg Σ.Β.). Ο χρόνος ηµίσειας ζωής ήταν 86 ώρες και 36 λεπτά, ενώ όταν αποµακρύνθηκε η χολή µε τη βοήθεια καθετήρα ο αντίστοιχος χρόνος µειώθηκε στις 3 ώρες και 18 λεπτά επιβεβαιώνοντας έτσι τον εντεροηπατικό µεταβολικό κύκλο. Στους χοίρους το 67% της χορηγούµενης από το στόµα δόσης ανιχνεύεται στο ούρο και στα κόπρανα εντός 48 ωρών, σε αναλογία 45% και 22%, αντίστοιχα. 1.3 Μυκοτοξίνες: Επιπτώσεις στην υγεία του ανθρώπου και των ζώων Σύµφωνα µε τον Οργανισµό Τροφίµων και Γεωργίας των Ηνωµένων Εθνών (FAO) στο 25% των δηµητριακών καρπών που παράγονται ετησίως σε παγκόσµιο επίπεδο, καταγράφεται µόλυνση από µυκοτοξίνες(cast 1989). Οι δηµητριακοί καρποί αποτελούν σηµαντικό µέρος τόσο του ανθρώπινου διαιτολογίου, όσο και εκείνου των αγροτικών ζώων και χρησιµοποιούνται συστηµατικά από τη βιοµηχανία ζωοτροφών. O άνθρωπος µολύνεται άµεσα από την κατανάλωση µολυσµένων προϊόντων φυτικής προέλευσης ή έµµεσα από την κατανάλωση µολυσµένων προϊόντων ζωικής προέλευσης[61,62]. Η παγκόσµια εξάπλωση του προβλήµατος των µυκοτοξικώσεων, η επικινδυνότητα για τη υγεία του ανθρώπου και των ζώων και οι οικονοµικές απώλειες της κτηνοτροφικής παραγωγής καθιστούν την έρευνα για τις µυκοτοξίνες επίκαιρη και αναγκαία. Ο όρος µυκοτοξίνη επινοήθηκε το 1962 µετά από µια επιδηµία που εκδηλώθηκε κοντά στο Λονδίνο και οδήγησε στο θάνατο γαλοπούλες, περίπου[63,64]. Η επιδηµία αποδόθηκε σε δευτερογενείς µεταβολίτες του µύκητα Aspergillus Flavus (αφλατοξίνες) και ευαισθητοποίησε την επιστηµονική κοινότητα να στραφεί στη διερεύνηση των µυκοτοξινών. Μέχρι σήµερα έχουν αναγνωριστεί 300 έως 400 µυκοτοξίνες, ενώ τουλάχιστον 300 έχουν ήδη παραχθεί εργαστηριακά από καλλιέργειες µυκήτων[65]. Τα κυριότερα γένη µυκήτων που παράγουν µυκοτοξίνες είναι τα Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria και Claviceps[66]. Τα είδη Aspergillus flavus 23

34 Θεωρητικό Μέρος και parasiticus παράγουν τις αφλατοξίνες Β1, Β2, G1, G2, P1, Q1, B2a και G2a. Σηµαντικότερη από αυτές θεωρείται η αφλατοξίνη Β1 µε ηπατοτοξικές και καρκινογόνες ιδιότητες για τον άνθρωπο και τα ζώα[67]. Μετά την κατανάλωσή της µε την τροφή µεταβολίζεται και ανιχνεύεται στο γάλα ως αφλατοξίνη Μ1 [68]. Ο µύκητας Penicillium citrinum και µερικά είδη Aspergillus (A. terreus και A. niveus) παράγουν τη µυκοτοξίνη κιτρινίνη (citrinin) η οποία είναι νεφροτοξική[69]. Η ωχρατοξίνη Α (ΟΤΑ) ανακαλύφθηκε το 1965 ως µεταβολίτης του µύκητα Aspergillus ochraceus[70]. Παράγεται κυρίως από είδη Aspergillus (A. alliaceus, A. carbonarius, A. glausus, A. niger) αλλά εµπλέκονται στην παραγωγή της και είδη Penicillium (P. verrucosum)[71]. Η ωχρατοξίνη Α θεωρείται ηπατοτοξική, τερατογόνος και καρκινoγόνος[72], αλλά τα κύρια όργανα που προσβάλει είναι οι νεφροί[73]. Η ευρεία χρήση του Aspergillus niger για την παρασκευή κιτρικού οξέος και ενζύµων για ανθρώπινη κατανάλωση καθιστά πολύ σηµαντικό τον έλεγχο για πιθανή παραγωγή ωχρατοξίνης Α[74]. Από είδη του µύκητα Claviceps παράγεται η µυκοτοξίνη εργοτίνη που έχει συσχετιστεί µε γάγγραινα και προσβολή του κεντρικού νευρικού συστήµατος στον άνθρωπο και στα ζώα[75,76]. Οι φουµονισίνες αποτελούν µια οικογένεια µυκοτοξινών που παράγονται από µύκητες των γενών Fusarium και Alternaria, µε κυριότερο µέλος τη φουµονισίνη Β1[77]. Η τοξικότητα των φουµονισινών οφείλεται στο ότι επηρεάζουν το µεταβολισµό των σφιγγολιπιδίων[78,79]. Έχουν ηπατοτοξική και καρκινογόνο δράση και στον άνθρωπο σχετίζονται µε την εκδήλωση καρκίνου του οισοφάγου[80]. Μύκητες των γενών Fusarium, Mycothecium, Phomopsis, Trichoderma, Trichothecium και άλλων, παράγουν µια οµάδα µυκοτοξινών που αριθµεί περισσότερα από 60 είδη και καλούνται τριχοθεσίνες. Από αυτά η δεοξυνιβαλενόλη (DON), η διακετοξυσκιρπενόλη (DAS) και η Τ-2, οι οποίες έχουν µελετηθεί περισσότερο, παράγονται από το γένος Fusarium και προκαλούν αιµορραγία, διάρροια, εµετό, ανορεξία, καθυστέρηση της ανάπτυξης, νευροµυϊκή διεγερσιµότητα και δερµατίτιδες µετά τη µόλυνση[81]. 24

35 Θεωρητικό Μέρος H ζεαραλενόνη (ΖΟΝ) είναι µια µη στεροειδής µυκοτοξίνη µε οιστρογονική δράση. Παράγεται από ορισµένα είδη µυκήτων του γένους Fusarium, ανιχνεύεται συχνά στις µολυσµένες από µύκητες ζωοτροφές και έχει παγκόσµια εξάπλωση[82]. Έχει την ιδιότητα να συνδέεται µε τους υποδοχείς οιστρογόνων στους διάφορους ιστούς και να προκαλεί διαταραχές της αναπαραγωγικής δραστηριότητας στα παραγωγικά ζώα και κυρίως στις σύες[83]. Στον άνθρωπο η παρουσία της ΖΟΝ συνδέθηκε σε αδενοκαρκίνωµα και υπερπλασία του ενδοµητρίου[84]. Επίσης, ανιχνεύθηκε στο πλάσµα του αίµατος νεαρών κοριτσιών µε πρώιµη ψευδο-ενήβωση (pseudopuberty)[85]. Η ΖΟΝ µεταβολίζεται κυρίως στο ήπαρ, είναι ηπατοτοξική και προκαλεί καρκίνο του ήπατος[86]. Οι αυξηµένες πιθανότητες µόλυνσης του ανθρώπου από µυκοτοξίνες µέσω της τροφής του, και οι ακόλουθοι κίνδυνοι για την υγεία του, έχουν κινητοποιήσει την επιστηµονική κοινότητα στη µελέτη των µυκοτοξινών. Ιδιαίτερα επιβαρυντική για τον άνθρωπο είναι η αφλατοξίκωση (κυρίως η χρόνια έκθεση σε αφλατοξίνες), η οποία συνδέεται µε την εµφάνιση καρκίνου του ήπατος και νεφροπάθειες. Ως τοξίνες µε πιθανή καρκινογόνο δράση έχουν θεωρηθεί η ωχρατοξίνη Α (νεοπλασίες του ουροποιητικού συστήµατος), οι φουµονισίνες (καρκίνος του οισοφάγου) και η ΖΟΝ (νεοπλασίες του ενδοµητρίου)[87]. Τα αλκαλοειδή εργοτίνης (ergot alcaloids) προκαλούν οίδηµα των άκρων, γάγγραινα και θάνατο[88] ή προσβάλουν το κεντρικό νευρικό σύστηµα και προκαλούν παραισθήσεις και παράλυση[89]. Η υγεία και η παραγωγικότητα των ζώων επηρεάζεται από τις µυκοτοξίνες σε διαφορετικό βαθµό, ανάλογα µε το είδος τους. Τα µηρυκαστικά είναι πιο ανθεκτικά στην επίδραση των µυκοτοξινών σε σύγκριση µε άλλα είδη ζώων (χοίροι, πτηνά) διότι η µικροβιακή χλωρίδα της µεγάλης κοιλίας έχει την ικανότητα να µειώνει την τοξικότητά τους[90]. Το πρόβατο θεωρείται ανθεκτικότερο της αγελάδας. Στην τελευταία, η κατανάλωση αφλατοξίνης Β1 έχει ως επακόλουθο την απέκκρισή της µε το γάλα ως Μ1, σε ποσοστό 0,5 έως 3% της συγκέντρωσής της στις ζωοτροφές. Το γεγονός ότι το γάλα είναι ένα προϊόν που απευθύνεται στο ευρύ καταναλωτικό κοινό (στο οποίο περιλαµβάνονται και ευπαθείς οµάδες), σε συνδυασµό µε τις καρκινογόνες ιδιότητες των αφλατοξινών, 25

36 Θεωρητικό Μέρος καθιστούν ιδιαίτερα σηµαντικό τον έλεγχο των αφλατοξινών Β1 και Μ1 στα µηρυκαστικά. Η δεοξυνιβαλενόλη σύµφωνα µε ορισµένους συγγραφείς συνδέεται µε µείωση της γαλακτοπαραγωγής στα βοοειδή[91], παρότι υπάρχουν και αντίθετες απόψεις[92]. Τέλος, η Τ-2 αναφέρθηκε ότι στα µεγάλα µηρυκαστικά προκαλεί αποβολές (προς το τέλος της κύησης), αιµορραγικό σύνδροµο και ανοσοκαταστολή µέσω της µείωσης της συγκέντρωσης των IgM, IgG και IgA στον ορό του αίµατος[93,94]. Στα ιπποειδή ο µεγαλύτερος κίνδυνος µόλυνσης προέρχεται από τη φουµονισίνη Β1 η οποία είναι νευροτοξική και προκαλεί εκφυλιστική εγκεφαλοπάθεια (leukoencephalomalacia) µε συµπτώµατα όπως πάρεση, ευερεθιστότητα, αταξία και αλλοιώσεις της λευκής ουσίας και του φλοιού του εγκεφάλου[95]. Επίσης η αφλατοξίκωση Β1 εκδηλώνεται µε ανορεξία, νωθρότητα, χωλότητα ή ακόµη και θάνατο[96]. Οι µυκοτοξικώσεις αναφέρονται εδώ και πολλά χρόνια ως αιτιολογικοί παράγοντες απωλειών στην πτηνοτροφία. Τα πτηνά είναι ευαίσθητα στη µόλυνση κυρίως u945 από τις αφλατοξίνες, την ΟΤΑ καθώς και τις τριχοθεσίνες Τ-2 και την DAS. Η αφλατοξίνη Β1, µόνη της ή σε συνδυασµό µε την ΟΤΑ, διαταράσσει την ανάπτυξη και αυξάνει τη θνησιµότητα των εµβρύων στις όρνιθες[97]. Επιπλέον, προκαλεί απώλεια βάρους, καθυστέρηση της ανάπτυξης των ορνιθίων, διαταράσσει τη δραστηριότητα των ηπατικών ενζύµων, προκαλεί αύξηση του βάρους του ήπατος και των νεφρών, αιµορραγίες και νεκρώσεις ιστών[98]. Η ανίχνευση Β1, ΟΤΑ και τριχοθεσινών στο σιτηρέσιο των πτηνών συνδυάζεται µε αυξηµένα περιστατικά σαλµονέλωσης και κοκκιδίωσης λόγω ανοσοκαταστολής. Η κατανάλωση τροφής µολυσµένης µε Τ-2 και DAS προκαλεί στα νεαρά πτηνά ανορεξία, απώλεια βάρους καθώς και έλκη στις παρειές και στη στοµατική κοιλότητα[99]. Ο χοίρος και ιδιαίτερα οι σύες συγκαταλέγονται µεταξύ των πλέον ευπαθών ζώων στη µόλυνση από µυκοτοξίνες. Παχυνόµενοι χοίροι που κατανάλωσαν σιτηρέσιο µε αφλατοξίνες (κυρίως Β1 και ίχνη G1, G2 και Β2) σε συγκεντρώσεις από 0,02 έως 1,48 mg/kg τροφής παρουσίασαν µείωση της ηµερήσιας αύξησης βάρους και βλάβες στα ηπατικά κύτταρα[100]. Ο Huff και οι συνεργάτες του[101] διαπίστωσαν µείωση της ηµερήσιας αύξησης βάρους 26

37 Θεωρητικό Μέρος των παχυνόµενων χοίρων των οποίων το σιτηρέσιο ήταν µολυσµένο µε αφλατοξίνη ή/και ΟΤΑ (2 mg/kg τροφής). Μάλιστα η µείωση του ρυθµού αύξησης του σωµατικού βάρους ήταν µεγαλύτερη όταν συνυπήρχαν και οι δύο τοξίνες, γεγονός που επιβεβαιώνει την αθροιστική δράση τους. Στις σύες, η ωχρατοξίκωση προκαλεί διαταραχές της νεφρικής λειτουργίας, πολυδιψία, πολυουρία, ανορεξία αδυναµία και κινητική δυσλειτουργία. Η µυκοτοξίκωση από φουµονισίνη Β1 χαρακτηρίζεται από ηπάτωση και οξύ πνευµονικό οίδηµα που εκδηλώνεται µε δύσπνοια, κυάνωση και τελικά, θάνατο. Από τις τριχοθεσίνες η DON προκαλεί άρνηση λήψης τροφής από τους χοίρους, καθυστέρηση στο ρυθµό αύξησης του σωµατικού βάρους και σε µεγάλες συγκεντρώσεις εµετό, ενώ η Τ-2, προκαλεί δερµατίτιδα και αυξηµένη ευαισθησία στις λοιµώξεις[102]. Η ζεαραλενόνη συνδέεται άµεσα µε διαταραχές της λειτουργίας του αναπαραγωγικού συστήµατος των συών (κυρίως των νεαρών άνηβων). Η µυκοτοξίνη αυτή και οι µεταβολίτες της (α- και β-ζεν) λόγω της χηµικής οµοιότητάς τους µε την οιστραδιόλη 17-β, έχουν την ικανότητα να δεσµεύουν τους υποδοχείς των οιστρογόνων[103]. Μάλιστα, η α-ζεν έχει 10 έως 20 φορές µεγαλύτερη ικανότητα σύνδεσης µε τους υποδοχείς της οιστραδιόλης 17-β από τη ΖΟΝ και περίπου, 100 φορές µεγαλύτερη από τη β-ζεν[104]. Σύµφωνα µε άλλους συγγραφείς η α-ζεν έχει 3 έως 4 φορές µεγαλύτερη οιστρογονική δράση από τη ΖΟΝ[105]. Γενικά η υδροξυλίωση της ΖΟΝ σε α- ΖΕΝ αποτελεί διαδικασία ενεργοποίησης της τοξικότητας, ενώ η παραγωγή της β-ζεν καταλήγει σε απενεργοποίηση της τοξικότητας. Πειράµατα σε επίµυες έδειξαν ότι τα «cis-ισοµερή» της ΖΟΝ είναι πιο δραστικά από τα «trans-ισοµερή» σε ό,τι αφορά στην οιστρογονική δράση τους, ενώ στην περίπτωση της α-ζεν δεν παρατηρήθηκε ανάλογη διαφορά[106]. Στις σύες η κλινική εικόνα προσβολής από ΖΟΝ περιλαµβάνει συµπτώµατα υπεροιστρογονισµού όπως εξοίδηση των χειλέων του αιδοίου, οίδηµα των µαστών, επιστροφές σε οίστρο σε σύντοµα µεσοδιαστήµατα, αναφροδισία, αποβολή, καθώς και γέννηση χοιριδίων µε απαγωγή των οπισθίων άκρων (splay-leg) που αδυνατούν να θηλάσουν[107]. Σε νεαρές άνηβες σύες, η µικρότερη δόση ΖΟΝ που οδήγησε σε συµπτώµατα υπεροιστρογονισµού ήταν 1 mg, PO, για 8 ηµέρες[108]. Σε ενήλικες σύες η 27

38 Θεωρητικό Μέρος χορήγηση µg ΖΟΝ/g τροφής προκάλεσε αιδοιοκολπίτιδα, πρόπτωση κόλπου, καθυστέρηση εκδήλωσης οίστρου, αγονιµότητα, ψευδοκύηση ή/και αποβολή. Στον κάπρο τα βιβλιογραφικά δεδοµένα σχετικά µε την επίδραση της ζεαραλενόνης είναι ανεπαρκή. Νεαροί κάπροι που λάµβαναν µε την τροφή, ppm ζεαραλενόνης, για τρεις µήνες, παρουσίασαν µείωση του βάρους των όρχεων κατά 30%, σε σύγκριση µε µάρτυρες[109]. Νεαροί κάπροι που λάµβαναν 40 ppm ζεαραλενόνης, ανά ηµέρα, για τέσσερις εβδοµάδες, παρουσίασαν µείωση της γενετήσιας ορµής και της συγκέντρωσης της τεστοστερόνης στο πλάσµα του αίµατος[110]. Ανάλογα προβλήµατα παρατηρήθηκαν σε ενήλικες κάπρους που έλαβαν 200 ppm ζεαραλενόνης, ανά ηµέρα, για χρονικό διάστηµα οκτώ εβδοµάδων[111]. Σε αντίθεση µε την τελευταία αναφορά, ο Osweiler αναφέρει ότι η λήψη 200 ppm ζεαραλενόνης προκάλεσε µείωση της γενετήσιας ορµής σε νεαρούς κάπρους, αλλά στους ενήλικες δεν παρατηρήθηκε κανένα σύµπτωµα µυκοτοξίκωσης. 1.4 Νοµοθεσία Ευρωπαϊκή Νοµοθεσία Η Ευρωπαϊκή νοµοθεσία κατατάσσει τις µυκοτοξίνες στους επιµολυντές των τροφίµων (Καν. 1881/2006)[112]. Οι τρέχουσες επιστηµονικές και τεχνικές γνώσεις καθώς και οι εφαρµοζόµενες πρακτικές παραγωγής και αποθήκευσης, δεν µπορούν να αποκλείσουν την ανάπτυξη των διαφόρων µυκήτων και κατά συνέπεια δεν είναι δυνατό να απαλειφθούν πλήρως οι µυκοτοξίνες από τα τρόφιµα και τις ζωοτροφές[112]. Συνιστάται εποµένως να περιορίζεται η παρουσία τους στο κατώτατο εφικτό επίπεδο[112]. Η µείωση της έκθεσης του ανθρώπου σε αυτού του είδους τις τοξικές ουσίες αποτελεί µέγιστη προτεραιότητα µε ταυτόχρονη µείωση των ορίων. Λαµβάνοντας υπ όψιν τις παραπάνω επιπτώσεις στον άνθρωπο θεωρείται σκόπιµο να περιοριστεί τόσο η συνολική περιεκτικότητα σε µυκοτοξίνες στα τρόφιµα, όσο και η περιεκτικότητα σε κάποιες συγκεκριµένες τοξίνες (αφλατοξίνη Β1). Επιπλέον, παρά το γεγονός ότι η αφλατοξίνη Μ1 θεωρείται ως γονοτοξική καρκινογόνος ουσία ίση[113] ή λιγότερο επικίνδυνη από ότι η 28

39 Θεωρητικό Μέρος αφλατοξίνη Β1[112], είναι απαραίτητο να αποφευχθεί η περιεκτικότητά της στο γάλα και στα γαλακτοκοµικά προϊόντα που προορίζονται για κατανάλωση από ανθρώπους και ιδίως από µικρά παιδιά[112]. Αναµφίβολα πρέπει να ληφθούν υπ όψιν και οι πιο ευαίσθητες οµάδες του πληθυσµού και κυρίως τα βρέφη. Η θέσπιση των µέγιστων ορίων για την παρουσία των µυκοτοξινών στα τρόφιµα αποτελεί µια σύνθετη υπόθεση. Για την οριοθέτηση των µέγιστων συγκεντρώσεων απαιτείται συνυπολογισµός και εκτίµηση πολλών παραγόντων όπως τα τοξικολογικά δεδοµένα, ο µεταβολισµός αυτών των ουσιών, η οξεία και χρόνια τοξικότητα. Παράλληλα πρέπει να υπάρχει σύνδεση των παραπάνω µε την παρουσία των τοξινών στα τρόφιµα και την ποσότητα στην οποία εκτίθενται οι καταναλωτές. Σήµερα δεν είναι γνωστό κάποιο όριο κάτω από το οποίο να µην παρατηρούνται αρνητικές επιδράσεις στην υγεία του καταναλωτή από τις µυκοτοξίνες, συνεπώς δεν µπορεί να οριστεί ανεκτή ηµερήσια πρόσληψη[112]. Συνεπώς, η Ε.Ε. έχει θεσπίσει νοµοθετικά όρια στα υλικά που προορίζονται για χρήση ως τρόφιµα ή ως ζωοτροφές[114]. Για τη θέσπιση των µέγιστων ορίων λαµβάνονται υπ όψιν πολλοί διαφορετικοί επιστηµονικοί οργανισµοί, αρχές και άλλα σώµατα, τα οποία συµπεριλαµβάνονται σε αυτή τη διαδικασία. Μία περίληψη για την τοξικολογική εκτίµηση των µυκοτοξινών µε αναφορά στην επίδρασή τους στην υγεία του ανθρώπου και στο περιβάλλον πραγµατοποιείται µε τη συνεργασία µεταξύ των ακόλουθων οργανισµών: ιεθνές Πρόγραµµα για την Χηµική Ασφάλεια (International Programm on Chemical Safety IPCS, ιεθνής Οργανισµός για την Έρευνα του Καρκίνου (International Agency on Research on Cancer IARC, Κοινή FAO/WHO Επιτροπή για τα Πρόσθετα και τους Επιµολυντές των Τροφίµων (Joint FAO/WHO Committee on Food Additives and Contaminants JECFA, Εντός της Ευρωπαϊκής Ένωσης αυτή η εκτίµηση διεξάγεται υπ ευθύνη της Επιστηµονικής Επιτροπής για τα Τρόφιµα [115]. Επιπρόσθετα αρκετές οµάδες εργασίας και ειδικές επιτροπές µε εξουσιοδότηση από όλα τα κράτη µέλη προετοιµάζουν τις προτάσεις. Η µέγιστη τιµή που έχει θεσπιστεί από την 29

40 Θεωρητικό Μέρος Ευρωπαϊκή Ένωση πχ. για κελυφωτά φιστίκια που προορίζονται για άµεση κατανάλωση ή για χρήση ως συστατικά σε τρόφιµα είναι 2,0 µg/kg (ppb) για την αφλατοξίνη Β1 και 4,0 µg/kg (ppb) για το άθροισµα των αφλατοξινών Β1, Β2, G1 και G2[112,116]. Για την αφλατοξίνη Β1 έχει θεσπιστεί ξεχωριστό όριο[114,116]. Η Ευρωπαϊκή νοµοθεσία αναγνωρίζει ότι οι µέθοδοι διαλογής ή άλλες φυσικές διαδικασίες επιτρέπουν να µειωθεί η περιεκτικότητα σε µυκοτοξίνες σε διάφορα τρόφιµα όπως: στα αράπικα φιστίκια, στους ξηρούς καρπούς µε κέλυφος, στα ξηρά φρούτα και στον αραβόσιτο. Έτσι, προκειµένου να ελαχιστοποιηθούν οι επιπτώσεις στο εµπόριο, γίνονται αποδεκτές υψηλότερες περιεκτικότητες από τις προαναφερόµενες σε µυκοτοξίνες για τα εν λόγω προϊόντα, εφόσον αυτά δεν προορίζονται για άµεση κατανάλωση από τον άνθρωπο ή για χρήση ως συστατικά τροφίµων. Εποµένως, στις περιπτώσεις αυτές, τα µέγιστα επιτρεπτά επίπεδα για τις µυκοτοξίνες έχουν καθοριστεί λαµβανοµένης υπόψη της αποτελεσµατικότητας των διαδικασιών που ακολοθούνται και ειδικά για τα κελυφωτά φιστίκια είναι 5,0 µg/kg (ppb) για την Β1 και 10,0 µg/kg (ppb) για το άθροισµα των Β1, Β2, G1 και G2[112]. Στις παρτίδες που ανιχνεύθηκαν µυκοτοξίνες µέσα στα όρια που προορίζονται για διαλογή ή άλλη φυσική κατεργασία θα πρέπει να υπάρχει και η ανάλογη σήµανση. Σε περίπτωση µη συµµόρφωσης των τροφίµων µε τα καθορισµένα µέγιστα επιτρεπτά επίπεδα αφλατοξίνης, σύµφωνα µε την Ευρωπαϊκή νοµοθεσία τα τρόφιµα αυτά θεωρούνται ακατάλληλα για ανθρώπινη κατανάλωση και απαγορεύεται η χρήση τους ως συστατικά τροφίµων. Επιπλέον, απαγορεύεται να αναµειγνύονται µε καθαρά από µυκοτοξίνες τρόφιµα, αλλά και να υπόκεινται σε χηµικές κατεργασίες για την αποµάκρυνσή τους Παγκόσµια Νοµοθεσία Τα πορίσµατα των επιστηµονικών µελετών από όλο τον κόσµο συντείνουν στο ότι η παρουσία µυκοτοξινών στα τρόφιµα θέτει σε σοβαρό κίνδυνο την υγεία των καταναλωτών. Αυτό έχει οδηγήσει τόσο σε εντατικούς ελέγχους όσον αφορά την παρουσία τους στα διάφορα τρόφιµα όσο και στην καθιέρωση ορίων, όπως και στην Ε.Ε. Νοµοθετικοί κανονισµοί για τις 30

41 Θεωρητικό Μέρος µυκοτοξίνες υπάρχουν σε πάνω από 100 χώρες παγκοσµίως[116,117]. Στις ανεπτυγµένες χώρες του κόσµου, όπου η διάρκεια ζωής έχει αυξηθεί σε συνδυασµό µε την βελτίωση της ποιότητας ζωής παρατηρείται µεγαλύτερη προσπάθεια όσον αφορά τον έλεγχο των αφλατοξινών[118]. Αντίθετα στο µεγαλύτερο ποσοστό των αναπτυσσόµενων χωρών, κύριο µέληµα αποτελεί η καταπολέµηση της φτώχειας και των ασθενειών µε αποτέλεσµα να µην έχουν καθιερωθεί, ευρέως, κανονισµοί για τις µυκοτοξίνες γενικότερα ή να µην είναι το ίδιο αυστηροί[116,118]. Εντούτοις, αν και η θέσπιση των ανώτερων ορίων είναι αποτέλεσµα συνεργασίας πολλών φορέων παρατηρούνται διαφορετικά όρια ανάµεσα στα διάφορα κράτη[117]. Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι στις Η.Π.Α. το µέγιστο επιτρεπτό όριο για την παρουσία αφλατοξινών ανέρχεται στα 20 ppb για τρόφιµα και ζωοτροφές[118], ενώ για τα κελυφωτά φιστίκια στα κράτη της Ε.Ε. στα 2 ppb για την AFB 1 και 4 ppb για το άθροισµα των αφλατοξινών, όπως προαναφέρθηκε. Αυτό σηµαίνει ότι στην ΕΕ τα όρια είναι 5 φορές χαµηλότερα απ ότι στις Η.Π.Α[117]. Παράλληλα ο αρµόδιος αµερικανικός φορέας έχει θέσει ως όριο για την AFM 1 στο γάλα και τα συναφή προϊόντα την τιµή 0.5 µg/lt, ενώ στην Ε.Ε. η αντίστοιχη τιµή είναι 0.05 µg/lt. Στην πράξη, τα διαφορετικά όρια, που έχουν θεσπιστεί στις διάφορες χώρες του κόσµου προκαλούν ενδεχόµενα προβλήµατα στο διεθνές εµπόριο, εις βάρος συνήθως των λιγότερο αναπτυγµένων χωρών. 1.5 Ανάλυση και προσδιορισµός µυκοτοξινών Η ανίχνευση των µυκοτοξινών παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον λαµβάνοντας υπόψη τις συνέπειες που επιφέρουν στην υγεία ανθρώπων και ζώων η ύπαρξή τους στα τρόφιµα ή τις ζωοτροφές. Όταν οι έλεγχοι διεξάγονται µε σκοπό να επιβεβαιωθεί η συµµόρφωση των προϊόντων µε τα θεσµοθετηµένα µέγιστα επιτρεπτά όρια είναι ζωτικής σηµασίας το τελικό αναλυτικό αποτέλεσµα να εκφράζει την πραγµατική τιµή ώστε οι µέθοδοι ανάλυσης να είναι ακριβής, αξιόπιστες και επικυρωµένες[117]. Εάν δεν επιτυγχάνεται κάτι τέτοιο είναι δυνατό πολλά προϊόντα να απορρίπτονται χωρίς λόγο ή αντίστροφα, προβληµατικές παρτίδες να γίνονται 31

42 Θεωρητικό Μέρος αποδεκτές δηµιουργώντας κινδύνους στην υγεία και την ασφάλεια των καταναλωτών, καθώς επίσης και σοβαρές επιπτώσεις στην οικονοµία και το παγκόσµιο εµπόριο. Νοµοθετικά (Καν. 882/2004 Παρ.3), στις γενικές απαιτήσεις για τις µεθόδους ανάλυσης που χρησιµοποιούνται για τον έλεγχο των τροφίµων αναφέρεται ότι οι µέθοδοι ανάλυσης πρέπει να χαρακτηρίζονται από τα ακόλουθα κριτήρια: α) ορθότητα, β) ευκολία εφαρµογής, γ) όριο ανίχνευσης, δ) όριο προσδιορισµού, ε) ακρίβεια (λαµβάνεται από διεργαστηριακή δοκιµή), στ) επαναληψιµότητα, ζ) αναπαραγωγιµότητα, η) ανάκτηση, θ) επιλεκτικότητα, ι) ευαισθησία, ια) γραµµικότητα, ιβ) αβεβαιότητα. Για την ανάλυση των µυκοτοξινών στα τρόφιµα υπάρχουν διαθέσιµες στη βιβλιογραφία διάφορες µέθοδοι, καθώς και οι επίσηµες µέθοδοι του ΑΟΑC (Association of Analytical Communities) [117, ]. Επιπλέον, είναι απαραίτητη η ανάπτυξη και επικύρωση των αναλυτικών µεθόδων που θα χρησιµοποιηθούν στον προσδιορισµό των µυκοτοξινών[117] λαµβάνοντας υπ όψιν τα θεσµοθετηµένα όρια. Είναι επίσης αναγκαίο τα εργαστήρια να χρησιµοποιούν µεθόδους µε ποσοστά απόδοσης όπως απαιτούνται από τη νοµοθεσία (Καν 401/2006) [123]. Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί αρκετά πρωτόκολλα προσδιορισµού, η χρήση των οποίων εξαρτάται από την υλικοτεχνική υποδοµή που έχουν τα διάφορα εργαστήρια, τις οικονοµικές τους δυνατότητες, τον χρόνο της ανάλυσης και την ευαισθησία της[124]. Πριν από την ανάλυση των τροφίµων για τον έλεγχο της ύπαρξης µυκοτοξινών προηγούνται µία σειρά πολλών και σύνθετων λειτουργιών, στις οποίες περιλαµβάνονται: η δειγµατοληψία[125], η προετοιµασία του δείγµατος, η εκχύλιση των µυκοτοξινών από το δείγµα, ο καθαρισµός του δείγµατος και τέλος ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισµός[124, ], µε διάφορες µεθόδους. Στα Σχήµατα 14 και 15 παρουσιάζονται οι διαδικασίες που ακολουθούνται για τον προσδιορισµό των µυκοτοξινών σε κάποιο δείγµα και η κατανοµή του χρόνου στα διάφορα στάδια της διαδικασίας. 32

43 Θεωρητικό Μέρος Σχήµα 14: Τυπικό διάγραµµα ροής προσδιορισµού µυκοτοξινών 27% Επεξ. εδοµένων 6% Συλλογή 6% Ανάλυση 61% Επεξ. είγµατος Σχήµα 15: Κατανοµή χρόνου σε µια ανάλυση µυκοτοξινών ειγµατοληψία Η δειγµατοληψία[124,125] αφορά την επιλογή ενός αντιπροσωπευτικού δείγµατος από το σύνολο της παρτίδας, στο οποίο θα γίνει και η ανάλυση. Η δειγµατοληψία είναι το πιο σηµαντικό στοιχείο της ανάλυσης δεδοµένου ότι οι µυκοτοξίνες είναι ανοµοιόµορφα κατανεµηµένες στα τρόφιµα[126,129]. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι ένας στους καρπούς είναι µολυσµένος µε αφλατοξίνη[129]. Στον ευρωπαϊκό κανονισµό που καθορίζεται ο τρόπος δειγµατοληψίας για τον έλεγχο των µυκοτοξινών στα τρόφιµα αναφέρεται επίσης ότι η δειγµατοληψία διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στην ακρίβεια µε την οποία καθορίζονται τα επίπεδα των µυκοτοξινών, 33

44 Θεωρητικό Μέρος τα οποία κατανέµονται κατά τρόπο ανοµοιόµορφο σε µία παρτίδα[123] και ότι οι αφλατοξίνες κατανέµονται κατά τρόπο πολύ ανοµοιογενή σε µια παρτίδα, ειδικότερα σε παρτίδα τροφίµων µε σωµατίδια µεγάλου µεγέθους[123] όπως είναι τα κελυφωτά φιστίκια Προετοιµασία δείγµατος Η προετοιµασία[124] αποσκοπεί στη µείωση του µεγέθους των σωµατιδίων των τροφίµων έτσι ώστε να αυξηθεί η επιφάνεια, να υπάρχει καλύτερη εκχύλιση από τον διαλύτη[126]. Η άλεση του δείγµατος και η δηµιουργία µικρών σωµατιδίων οµογενοποιεί το δείγµα, στάδιο το οποίο αν και χρονοβόρο είναι απολύτως απαραίτητο και βασικό στην ανάλυση[117] Εκχύλιση Η εκχύλιση[124] είναι ένα σηµαντικό στάδιο στον προσδιορισµό των µυκοτοξινών στα διάφορα υποστρώµατα ή τρόφιµα[127]. Λόγω της διαφορετικής φύσης των προϊόντων που είναι δυνατό να µολυνθούν από µυκοτοξίνες, δεν υπάρχει µία µοναδική µέθοδος κατάλληλη για όλα τα προϊόντα[126]. Η εκχύλιση υγρού-στερεού είναι µία από τις συνήθης διαδικασίες στην ανάλυση µυκοτοξινών σε γεωργικά προϊόντα[127]. Η εκχύλιση, κατά ένα µεγάλο µέρος εξαρτάται από τις φυσικο-χηµικές ιδιότητες των υλικών που έχουν µολυνθεί µε µυκοτοξίνες [126,127] και ουσιαστικά βασίζεται στη διαλυτότητα των µυκοτοξινών σε διαφορετικούς οργανικούς διαλύτες[127]. Για παράδειγµα, υλικά µε υψηλή περιεκτικότητα σε λίπος και χρωστικές απαιτούν µία πιο εκλεκτική εφαρµογή, η οποία ακολουθείται από εκτεταµένες µεθόδους καθαρισµού[126] για τον προσδιορισµό της µυκοτοξίνης. Ο διαλύτης θα πρέπει να είναι τέτοιος ώστε να εκχυλίζει µόνο αυτό που θέλουµε να αναλύσουµε µυκοτοξίνη- µε την προσθήκη όσο το δυνατό λιγότερων χηµικών ενώσεων, έτσι ώστε να αποφεύγεται η αλληλεπίδρασή τους στο τελικό στάδιο της ανάλυσης[127]. Για την εκχύλιση, χρησιµοποιούνται συνήθως οργανικοί διαλύτες ή µίγµατά τους όπως ακετόνη, χλωροφόρµιο ή µεθανόλη, λόγω του ότι οι µυκοτοξίνες είναι διαλυτές σε 34

45 Θεωρητικό Μέρος µετρίως ή ελαφρώς πολικούς διαλύτες[126,130]. Επίσης, η χρήση µικρών ποσοτήτων νερού σε συνδυασµό µε τους προαναφερόµενους διαλύτες υγραίνει το υπόστρωµα αυξάνοντας έτσι τη διείσδυση των οργανικών διαλυτών στο δείγµα άρα βελτιώνει την εκχύλιση της µυκοτοξίνης[126]. Οι πιο συνήθεις διαλύτες για την εκχύλιση µυκοτοξινών σε διάφορα τρόφιµα είναι µίγµατα χλωροφορµίου-νερού, µεθανόλης-νερού, µεθανόλης-ακετονιτριλίουνερού και ακετονιτριλίου νερού[117, ,127]. Ο διαλύτης µεθανόληνερό έχει το πλεονέκτηµα ότι είναι λιγότερο τοξικός σε σχέση µε τα µίγµατα ακετονιτριλίου. Σε τρόφιµα µε υψηλή περιεκτικότητα σε λίπος, όπως τα κελυφωτά φιστίκια (περισσότερο από 50%)[127], συστήνεται η προσθήκη µη-πολικών διαλυτών, όπως το εξάνιο, για το διαχωρισµό του λίπους[126], [127]. Σε τελευταίες δηµοσιεύσεις αναφέρεται και η εκχύλιση µε πεπιεσµένο υγρό (Pressurized Fluid Extraction PFE) µε την εµπορική ονοµασία εκχύλιση επιταγχυνόµενου διαλύτη (Accelerated Solvent Extraction ASE) [127]. Σε αυτή χρησιµοποιούνται διαλύτες σε υψηλές πιέσεις και θερµοκρασίες έτσι ώστε να επιτευχθεί πλήρης εκχύλιση του αναλύτη από στερεά ή ηµι-στερεά υποστρώµατα µε µικρότερες ποσότητες διαλυτών σε µικρότερο χρόνο[127]. Η αύξηση της θερµοκρασίας κατά την εκχύλιση αυξάνει την απόδοση λόγω του ότι µειώνεται το ιξώδες των οργανικών διαλυτών και αυξάνει η διαλυτική τους ικανότητα, αλλά εξασθενεί και η ισχυρή σύνδεση µυκοτοξίνης-υλικού υποστρώµατος[127]. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα οργανικός διαλύτης να διεισδύει περισσότερο στο υπόστρωµα και να βελτιστοποιείται η εκχύλιση[127]. Η αύξηση της θερµοκρασίας πρέπει να είναι µέχρι ενός κατάλληλου ορίου ώστε να µην µειωθεί η εκλεκτικότητα του διαλύτη και συµπαρασύρει και άλλες ουσίες[127]. Η PFE µέθοδος έχει εφαρµοστεί για πολλούς αναλύτες σε διάφορα δείγµατα, µεταξύ των άλλων για την ανάλυση µυκοτοξινών σε κελυφωτά φιστίκια µε τη χρήση κατάλληλης συσκευής[127]. Τα αποτελέσµατα αυτής της µεθόδου έδειξαν διάφορα πλεονεκτήµατα σε σχέση µε τις παραδοσιακές µεθόδους εκχύλισης, όπως υψηλότερη απόδοση, χαµηλότερο όριο ποσοτικοποίησης και µικρότερο όγκο διαλύτη[127]. 35

46 1.5.4 Καθαρισµός Θεωρητικό Μέρος Οι περισσότερες µέθοδοι που κυρίως χρησιµοποιούνται για την ανάλυση µυκοτοξινών βασίζονται συνήθως σε µία διαδικασία καθαρισµού [124,131], ο οποίος πραγµατοποιείται µετά την εκχύλιση. Γενικότερα, όπου ο καθαρισµός αποτελεί απαραίτητο στάδιο της διαδικασίας, όπως στα κελυφωτά φιστίκια, χρησιµοποιούνται διαχωριστές υγρού-υγρού (φίλτρα) ή πιο πρόσφατα συσκευές εκχύλισης στερεής φάσης (solid phase extraction cartridges) και στήλες ανοσοσυγγένειας (ΙAC) [117,126,132].Οι τελευταίες, αποτελούν το πιο σύγχρονο εργαλείο καθαρισµού για τις αναλύσεις µυκοτοξίνης[126,132] (Βλ. Σχήµα 16) Μονοκλωνικά αντισώµατα τα οποία είναι πολύ εξειδικευµένα για µυκοτοξίνες ακινητοποιούνται επάνω σε σεφαρόζη και στη συνέχεια ενσωµατώνονται σε µικρές στήλες[132]. Η προς εξέταση τοξίνη συλλέγεται µε έκλουση µε κατάλληλο διαλύτη. Έτσι, τα εκχυλίσµατα από το δείγµα του τροφίµου περνούν µέσα από τη στήλη και τελικά παραλαµβάνεται ένα εντελώς καθαρό εκχύλισµα ελεύθερο από άλλες ουσίες[132]. Σχήµα 16: Στήλες Ανοσοσυγγένειας Οι στήλες ανοσοσυγγένειας έχουν δείξει πολλά πλεονεκτήµατα στην εφαρµογή τους σε διάφορα τρόφιµα[117] λόγω του ότι δίνουν τη δυνατότητα µεγαλύτερων όγκων εκχυλίσµατος του δείγµατος µε αποτέλεσµα 36

47 Θεωρητικό Μέρος να αυξάνεται η ευαισθησία της µεθόδου[117,124]. Επιπλέον, δεν είναι απαιτητικές όσον αφορά την ικανότητα και την εµπειρία που απαιτείται από το χρήστη[117]. Ως µοναδικό µειονέκτηµα είναι το κόστος[117], λόγω του ότι είναι µιας χρήσης. Ο ρυθµός ροής του υγρού της εκχύλισης από τα διάφορα φίλτρα καθαρισµού είναι πολύ σηµαντικός για την απόδοση της εκχύλισης και την παραλαβή όσο το δυνατό πιο καθαρής µυκοτοξίνης. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι όσο µειώνεται ο ρυθµός ροής και αυξάνει έτσι ο χρόνος του καθαρισµού, αυξάνεται η απόδοση της εκχύλισης λόγω του ότι ο χρόνος επαφής του διαλύτη και του υποστρώµατος είναι µεγαλύτερος[127]. Το διάλυµα που εκχυλίζεται µετά και τον καθαρισµό συλλέγεται και συµπυκνώνεται για την περαιτέρω ανάλυση[126]. 1.6 Αναλυτικές Τεχνικές Γενικά για τις αναλυτικές τεχνικές ιάφορες µέθοδοι για την ανάλυση µυκοτοξινών σε διάφορα τρόφιµα είναι διαθέσιµες και αναφέρονται στη βιβλιογραφία[127] (TLC, HPLC, RIA, ELISA, SPR και ανοσοδοκιµές[130]). Η τεχνική ανάλυσης µε Χρωµατογραφία Λεπτής Στοιβάδας (TLC-Thin Layer Chromatography) χρησιµοποιούνταν εκτενέστατα για ανάλυση µυκοτοξίνης[126,127] και είχε προταθεί ως επίσηµη µέθοδος ανάλυσης αφλατοξινών για κελυφωτά φιστίκια από τον ΑΟΑC7. Αργότερα, σηµειώθηκε µία σηµαντική αύξηση στη χρήση της Χρωµατογραφίας Λεπτής Στοιβάδας Υψηλής Απόδοσης (HPTLC), η οποία έδωσε παρόµοια αποτελέσµατα µε την µέθοδο της Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Απόδοσης-HPLC[126,127]. Πλέον, η σύγχρονη τάση είναι να χρησιµοποιείται η HPLC για την ανάλυση αφλατοξίνης[131], αλλά και άλλων µυκοτοξινών (π.χ. πατουλίνης σε χυµό µήλου, ωχρατοξίνης σε αραβόσιτο) [131], λόγω της µεγαλύτερης ακρίβειας σε σχέση µε την TLC και της σταθερότητας των αποτελεσµάτων σε σχέση µε την µέθοδο της ELISA (Enzyme-Linked Immunosrbent) [126]. Οι τεχνικές ανοσοδιαγνωστικής όπως η ELISA και η RIA επιδεικνύουν ταχύτητα και αξιοπιστία αποτελεσµάτων, 37

48 Θεωρητικό Μέρος εντούτοις η χρήση τους µπορεί να χαρακτηριστεί ως συµπληρωµατική. Τα τελευταία χρόνια, η χρήση της HPLC έχει αυξηθεί µε αποτέλεσµα να έχουν δηµοσιευθεί πολλές µελέτες για την εφαρµογή της στην ανάλυση αφλατοξινών[126], αλλά και έχει γίνει αποδεκτή από τις επίσηµες µεθόδους ανάλυσης ΑΟΑC για µυκοτοξίνες [132]. Το κυριότερο πλεονέκτηµα της µεθόδου ανάλυσης µε HPLC φαίνεται να είναι η δυνατότητα αυτοµατοποίησης[126] όπως επίσης η ταχύτητα και η υψηλή ανάλυση[131]. Είναι γενικά αποδεκτό ότι η υπεροχή και επικράτηση της HPLC ως µεθόδου για την ανάλυση µυκοτοξινών σε σύγκριση µε τις άλλες µεθόδους και ιδιαίτερα τις ανοσοχηµικές είναι ο υψηλός βαθµός εκλεκτικότητας και ακρίβειάς της[126] [ ]. Η µέθοδος ανάλυσης µε HPLC έχει εφαρµοστεί σε µια σειρά υποστρωµάτων και τροφίµων για τον έλεγχο της παρουσίας σε αφλατοξίνες όπως σιτηρά, µυκηλιακά εκχυλίσµατα, βαµβακόσπορο, κρασί, αραβόσιτο, ξηροί καρποί, µπαχαρικά κ.α. [131] Παρ όλα αυτά η µέθοδος ανάλυσης µε HPLC έχει κόστος και απαιτεί πιο εξειδικευµένο και έµπειρο εργαστηριακό προσωπικό[133] Κλασικές Αναλυτικές Τεχνικές Ο όρος κλασική τεχνική συνήθως αναφέρεται σε χρωµατογραφικούς διαχωρισµούς οι οποίοι είναι συνδυασµένοι µε τον κατάλληλο ανιχνευτή. Οι ποσοτικές µέθοδοι που χρησιµοποιούνται για τον προσδιορισµό µυκοτοξινών σε τρόφιµα περιλαµβάνουν ανοσοχηµικές στήλες, Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλή Απόδοσης (HPLC) ή Αέρια Χρωµατογραφία (G.C) σε συνδυασµό µε µια µεγάλη ποικιλία ανιχνευτών όπως ανιχνευτές φθορισµού(fld), ιονισµού φλόγας (FID), συλλήψεως ηλεκτρονίων (ECD), ανιχνευτές υπεριώδους(uv) ή ακόµα και φασµατοσκοπία µάζας(ms)[ ]. 38

49 Θεωρητικό Μέρος Υγρή Χρωµατογραφία/ Φασµατοσκοπία Μάζας (LC/MS) NP-HPLC και RP-HPLC Τα πρώτα χρόνια εφαρµογής της µεθόδου χρησιµοποιούνταν η HPLC κανονικής φάσης µε σύστηµα ανίχνευσης για απορρόφηση στο UV. Γρήγορα αποδείχθηκε ότι δεν ήταν ικανοποιητική για τον προσδιορισµό αφλατοξίνης σε επίπεδα νανογραµµαρίων (ng). Λόγω του ότι οι αφλατοξίνες φθορίζουν, ένα σύστηµα φθορισµοµετρικής ανίχνευσης θεωρήθηκε καταλληλότερο, αυξάνοντας έτσι την ευαισθησία της µεθόδου. Ένα όµως από τα πιο σηµαντικά προβλήµατα είναι η εξάρτηση της ικανότητας φθορισµού των κυρίων αφλατοξινών (B1, B2, G1, G2) από τη σύνθεση του διαλύτη. Η NP- HPLC από την δεκαετία του 70 σταµάτησε να χρησιµοποιείται µετά την ανάπτυξη της χρωµατογραφίας ανάστροφης φάσης, λόγω µειωµένης επαναληψιµότητας των χρόνων συγκράτησης όταν το νερό ή οργανικοί διαλύτες µεταβάλλουν την υγρασία του χρωµατογραφικού µέσου (silica ή αλουµίνα). Σήµερα, η ΗPLC ανάστροφης φάσης (RP-HPLC) είναι η πιο διαδεδοµένη µέθοδος υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης και πολλές φορές αναφέρεται απλά ως HPLC χωρίς να επεξήγεται ιδιαίτερα. Η RP-HPLC αποτελείται από µία µη-πολική στατική φάση (συνήθως silica στο οποίο έχει εφαρµοστεί RMe 2 SiCl, όπου R είναι αλκύλιο όπως C 18 H 37 ή C 8 H 17 ) και µία υδατική µέτρια πολική κινητή φάση. Το σύστηµα RP-HPLC αποτελεί την πιο συχνά χρησιµοποιούµενη µέθοδο λόγω της ευκολίας στο χειρισµό και της µικρότερης τοξικότητας των διαλυτών που χρησιµοποιούνται στην κινητή φάση LC/MS Την τελευταία δεκαετία η LC/MS αποτελεί την πιο διαδεδοµένη µέθοδο για την ποιοτική ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισµό των µυκοτοξινών. 39

50 Θεωρητικό Μέρος Παρόλα αυτά η σηµαντική αυτή εξέλιξη δε συνέβη µέχρι τα µέσα της δεκαετίας του Συγκρινόµενη µε τις κλασικές χρωµατογραφικές µεθόδους ανίχνευσης όπως UV, η φασµατοσκοπία µάζας µπορεί να προσφέρει αυξηµένη ευαισθησία και επιλεκτικότητα (αν και ο ανιχνευτής φθορισµού µπορεί να είναι πολύ πιο ευαίσθητος για τις αφλατοξίνες). Επιπροσθέτως είναι δυνατό να διερευνήσει τη µοριακή δοµή µεταβολιτών (κρυµµένες µυκοτοξίνες-masked mycotoxins) [138] και να παρακάµψει τελείως τα στάδια της παραγοντοποίησης και του καθαρισµού που είναι εξαιρετικά χρονοβόρα και ελλοχεύουν κινδύνους για εργαστηριακά λάθη. Το µεγαλύτερο µειονέκτηµα της µεθόδου αποτελεί η µικρή ποσότητα του αρχικού προπαρασκευαστικού δείγµατος. Υπάρχει κίνδυνος µείωσης της ακρίβειας της µεθόδου εξαιτίας της τελείως απρόβλεπτης επίδρασης των συστατικών που συνυπάρχουν στο αρχικό δείγµα µε την αναλυόµενη ουσία. Στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχει µεγάλος αριθµός µεθόδων που έχουν σαν βάση την LC/MS[139,140] Μέθοδοι για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό µυκοτοξινών Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει πολλές προσπάθειες για την ανάπτυξη µεθόδων που αφορούν τον ταυτόχρονο προσδιορισµό µυκοτοξινών χρησιµοποιώντας LC-MS/MS. Αυτή η τάση ήταν αποτέλεσµα της ανακάλυψης ότι πολλές µυκοτοξίνες µπορούσαν να συνυπάρχουν σε ένα υπόστρωµα καθώς επίσης και ότι παρουσίαζαν συνεργιστική δράση µε αποτέλεσµα να θέτουν σε κίνδυνο την υγεία του ανθρώπου[ ]. Επιπροσθέτως ήταν εξαιρετικά επιθυµητή η ανάπτυξη µιας µεθόδου που θα επέτρεπε τον ταυτόχρονο προσδιορισµό όλων σχεδόν των µυκοτοξινών πραγµατοποιώντας µια και µόνο ανάλυση. Αυτό θα µείωνε εξαιρετικά το κόστος αλλά και τον χρόνο της ανάλυσης. Αν και η φασµατοσκοπία µάζας συχνά προσφέρει επαρκή επιλεκτικότητα και ευαισθησία, η εφαρµογή της στην ταυτόχρονη ανάλυση πολλών µυκοτοξινών, παρεµποδίστηκε µόνο από την διαφορετικότητα που παρουσιάζουν στις χηµικές ιδιότητες τους οι τοξίνες όπως (οξύτητα, βασικότητα, πολικότητα). Για αυτό τον λόγο έπρεπε να 40

51 Θεωρητικό Μέρος υπάρξουν συµβιβασµοί ως προς την επιλογή της κινητής φάσης, του µέσου εκχύλισης αλλά και για τις πειραµατικές συνθήκες(θερµοκρασία). Το αρχικό ερέθισµα για την ταυτόχρονη ανάλυση µυκοτοξινών χρησιµοποιώντας LC/MS προήλθε από τον τοµέα της µυκητολογίας. Εκεί η φασµατοσκοπία µάζας χρησιµοποιήθηκε για να αναγνωρίσει συγκεκριµένα είδη χρησιµοποιώντας τους µεταβολίτες τους[143]. Η τεράστια ανάπτυξη των βάσεων δεδοµένων για την ποιοτική ανίχνευση µυκοτοξινών στην LC/MS[144], οδήγησε στην ανάπτυξη και ποσοτικών µεθόδων για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό τοξινών σε υλικά κατασκευής κτηρίων[145] αλλά και σε είδη διατροφής [146]. Ενώ η προηγούµενη µέθοδος είχε το µειονέκτηµα της µικρής ανάκτησης για κάποιες αναλυόµενες ουσίες, η συγκεκριµένη µέθοδος παρουσίασε εξαιρετική ακρίβεια και επαναληψιµότητα. Το γεγονός αυτό αποδίδεται στην επεξεργασία που υφίσταται η πρώτη ύλη, αλλά και στην δηµιουργία µιας καµπύλης βαθµονόµησης µε το υπόστρωµα, έχοντας σαν σκοπό την αντιστάθµιση των επιδράσεων που οφείλονται σε αυτό. Μερικά χρόνια αργότερα η συγκεκριµένη µέθοδος εφαρµόσθηκε µε µεγάλη επιτυχία στον ταυτόχρονο προσδιορισµό αφλατοξινών, ωχρατοξινης Α, µετά από µια πολύ µικρή τροποποίηση του διαλύτη εκχύλισης[147]. Μετά από αυτή την αρχική φάση οι επιστήµονες στόχευσαν στην ανάλυση τοξινών που προέρχονταν από τον Fusarium. Ο Royer και οι συνεργάτες του [148] ανέπτυξαν µια µέθοδο για την ταυτόχρονη ποσοτική ανάλυση ζεαραλενόνη, φουµοσίνη Β1, δεοξυνιβαλενόλη σε καλαµπόκι. Το όριο ανίχνευσης ήταν πολύ κατώτερο από αυτό που πρότεινε η Ευρωπαϊκή Ένωση. Υπήρχε όµως το πρόβληµα της χαµηλής ανάκτησης της ζεαραλενόνης. Όλες οι προαναφερθείσες µέθοδοι εξαρτώνται άµεσα από τον τρόπο καθαρισµού αλλά και από το µέσο εκχύλισης. Υπάρχουν όµως κάποιες κατηγόριες τοξινών που δεν είναι συµβατές µε τις συγκεκριµένες πειραµατικές συνθήκες(πχ οι φουµοσίνες δεν προσδιορίζονται από τις µεθόδους των Tanaka και Ren[ ]. Συγκεκριµένα στις συγκεκριµένες εργασίες δεν είναι δυνατόν να προσδιοριστούν ούτε αλκαλοειδή εργοτίνης ούτε κρυµµένες µυκοτοξίνες. Για να ξεπεράσουν αυτό το εµπόδιο, κάποιες από τις υπάρχουσες µεθόδους παρακάµπτουν το στάδιο του καθαρισµού και εισάγουν στο LC/MS 41

52 Θεωρητικό Μέρος ακατέργαστο εκχύλισµα. Αυτό προφανώς αυξάνει τις απαιτήσεις για την επιλεκτικότητα του ανιχνευτή καθώς επίσης και την ανάγκη για έρευνα των επιδράσεων του υποστρώµατος, κυρίως όταν αναλύονται τρόφιµα. Ο Spanjer και οι συνεργάτες του [151] προσδιόρισαν 22 µυκοτοξίνες σε διαφορετικά υποστρώµατα τροφίµων. Τα δείγµατα εκχειλίστηκαν χρησιµοποιώντας ένα µίγµα ακετονιτρίλιο/νερό και στη συνέχεια αραιώθηκαν µε νερό λίγο πριν την εισαγωγή τους στο LC/MS. Επίσης πραγµατοποιήθηκε ενδελεχής έλεγχος για κάθε συνδυασµό αναλυόµενης ουσίας/υποστρώµατος. Με αυτό τον τρόπο συγκεντρώθηκαν επαρκή στοιχεία που υπέδειξαν ότι η συγκεκριµένη ανάλυση είναι πράγµατι εφικτή και ταυτόχρονα αρκετά ευαίσθητη για τον προσδιορισµό της ποσότητας των περισσοτέρων µυκοτοξινών που προβλέπεται από την νοµοθεσία Ανοσοχηµικές Τεχνικές Ταχείς µέθοδοι οι οποίες βασίζονται σε ανοσοχηµικές τεχνικές έχουν το πλεονέκτηµα ότι δεν απαιτούν στάδια καθαρισµού ή στάδια εµπλουτισµού της αναλυόµενης ουσίας. Η ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) είναι µια τεχνική η οποία χρησιµοποιείται ευρέως για το γρήγορο έλεγχο των περισσότερων µυκοτοξινών, ειδικά για τον έλεγχο των πρώτων υλών[ ]. Αν και οι δοκιµές ELISA εµφανίζουν υψηλή εξάρτηση από το υπόστρωµα, τα πλεονεκτήµατα της είναι η µεγάλη ταχύτητα, η ευκολία της λειτουργίας της και η ευαισθησία. Οι δοκιµές ELISA είναι διαθέσιµες στο εµπόριο για τις περισσότερες από τις σηµαντικότερες µυκοτοξίνες. Εναλλακτικές της ELISA αποτελούν µέθοδοι που αποτελούνται από ένα αριθµό ανοσοαισθητήρων ή µέθοδοι που χρησιµοποιούν ανοσοχηµικές πλατφόρµες[ ] Άλλες Τεχνικές Οπτικές µέθοδοι, όπως η φασµατοσκοπία FT-Raman αποτελεί µία αρκετά αποτελεσµατική τεχνική όσον αφορά την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισµό των διαφόρων κρυσταλλικών µορφών[156]. Αυτό 42

53 Θεωρητικό Μέρος οφείλεται στο γεγονός ότι απαιτεί πολύ µικρή προετοιµασία δείγµατος, µε αποτέλεσµα να ελαχιστοποιείται η πιθανότητα εµφάνισης µετασχηµατισµών στερεής κατάστασης των µετασταθών κρυσταλλικών µορφών, καθώς το σχήµα και το µέγεθος των σωµατιδίων του δείγµατος έχουν πολύ µικρή επίδραση. Οι συγκεκριµένες τεχνικές παρουσιάζονται να είναι πολύ υποσχόµενες για την γρήγορη και µη καταστροφική ανάλυση µυκοτοξινών σε σιτηρά[157]. Οι συγκεκριµένες προσεγγίσεις επιτρέπουν την ελαχιστοποίηση του δείγµατος εισαγωγής. Εντούτοις µειονεκτήµατα της µεθόδου αποτελούν η έλλειψη υλικών αναφοράς αλλά και η µεγάλη επίδραση του υποστρώµατος. Μια διαφορετική προσέγγιση επιχείρησε ο Logrieco και οι συνεργάτες του[158]. Πτητικές οργανικές ενώσεις, µικρού µοριακού βάρους, που ελευθερώθηκαν σαν προϊόντα του δευτερεύοντος µεταβολισµού των µυκήτων προσροφούνται σε µια σειρά από ειδικούς χηµικούς αισθητήρες και µετρώνται µε αισθητήρες οξειδίων µετάλλου. 43

54 2. Στοιχεία Στατιστικής Θεωρητικό Μέρος 2.1 Εισαγωγή Ως Στατιστική ορίζεται ο κλάδος των εφαρµοσµένων µαθηµατικών, ο οποίος βασίζεται σε ένα σύνολο αρχών και µεθοδολογιών που εφαρµόζονται για τον σχεδιασµό της διαδικασίας συλλογής δεδοµένων (data), για τη συνοπτική και αποτελεσµατική παρουσίαση των δεδοµένων αλλά και για την ανάλυση και εξαγωγή συµπερασµάτων από τα δεδοµένα. Η στατιστική είναι µια ατελής επαγωγή. Από τις ιδιότητες του µέρους εξάγει συµπεράσµατα για το όλον. Για τη σωστή επεξεργασία των δεδοµένων δηµιουργείται η ανάγκη να προσδιοριστούν κάποια µεγέθη, τα οποία µετά από σωστή µελέτη µπορούν να οδηγήσουν σε πολύ χρήσιµες παρατηρήσεις και συµπεράσµατα. Τα πιο σηµαντικά µεγέθη είναι: Πληθυσµός (Population). Είναι ένα σύνολο, τα στοιχεία του οποίου εξετάζονται ως προς ένα ή περισσότερα χαρακτηριστικά τους. Μεταβλητή (Variable). Μεταβλητή ενός πληθυσµού είναι το χαρακτηριστικό ως προς το οποίο εξετάζεται ο πληθυσµός. Μεταβλητές είναι δύο ειδών, ποιοτικές ή ποσοτικές. Οι ποσοτικές µεταβλητές διακρίνονται σε διακριτές και συνεχείς. Συχνότητα (Frequency). Ως συχνότητα µιας τιµής χ ι της µεταβλητής Χ µεγέθους νxν είναι ο φυσικός αριθµός ν ι XΝ, µε ν ι ν, που δείχνει το πλήθος εµφάνισης της τιµής χ ι. Προφανώς ισχύει ότι ν 1 +ν ν µ =ν Σχετική συχνότητα : Σχετική συχνότητα µιας τιµής χ ι της µεταβλητής Χ είναι ο αριθµός f = ν (1) i ν i Όπου i=1,2,..., µ όπου µ ν Ισχύει προφανώς f f f 1 (2) µ = Η σχετική συχνότητα εκφράζεται και επί τοις εκατό, οπότε 44

55 Θεωρητικό Μέρος i f%=100f i (3) Αθροιστική συχνότητα, Ν i : είναι το πλήθος των παρατηρήσεων που είναι µικρότερες ή ίσες της τιµής χ i. Με τον ίδιο τρόπο ορίζεται και η σχετική αθροιστική συχνότητα F i. 2.2 Μέτρα θέσης Average): Αριθµητικός µέσος ή µέση τιµή (First moment or Mean or x + x x x = (4) ν 1 2 ν 1 = x i ν ν i= 1 εάν οι τιµές χ i έχουν συχνότητες ν i, i=1, 2,..., µ τότε η µέση τιµή δίνεται από τον τύπο: δοθέντος ότι f = i ν x + ν x ν x µ µ µ µ 1 x= = νi xi = ν ν i= 1 i= 1 ν i ν x f Εύκολα αποδεικνύεται ότι εάν στις τιµές της µεταβλητής Χ προσθέσουµε έναν αριθµό αxr τότε και η µέση τιµή µεταβάλλεται κατά α. ηλαδή µε αxr. X + a= X+ a Επίσης εάν οι τιµές της Χ πολλαπλασιασθούν επί κxr τότε και η µέση τιµή πολλαπλασιάζεται επί κ. ηλαδή µε κ XR. i i (5) (6) κ Χ= κ Χ (7) ιάµεσος, δ (Median): ενός δείγµατος παρατηρήσεων, οι οποίες έχουν διαταχθεί κατά αύξουσα τάξη, είναι η µεσαία παρατήρηση εάν το πλήθος των παρατηρήσεων είναι περιττό ή ο µέσος όρος των δύο µεσαίων παρατηρήσεων εάν το πλήθος είναι άρτιο. 45

56 Θεωρητικό Μέρος Στην περίπτωση οµαδοποιηµένων µεταβλητών η διάµεσος βρίσκεται από το ιστόγραµµα των αθροιστικών συχνοτήτων. Αλγεβρικά η διάµεσος δίνεται από τον τύπο: δ = l i ν Ν + 2 ν i i 1 c i (8) Όπου i l το κατώτερο όριο της κλάσης που περιέχει την διάµεσο, ν i η συχνότητα c i το πλάτος της κλάσης αντίστοιχα, Ν i-1 η αθροιστική συχνότητα της προηγούµενης κλάσης και ν το µέγεθος του δείγµατος. ηλαδή η διάµεσος είναι το σηµείο τοµής του ευθυγράµµου τµήµατος, που ενώνει το άνω δεξί άκρο της κλάσης που περιέχει τη διάµεσο µε το άνω δεξί άκρο της προηγούµενης κλάσης, και της ευθείας y=ν/2 Σχήµα 17: Σχηµατική απεικόνιση της έννοιας της διαµέσου ενός δείγµατος παρατηρήσεων Επικρατούσα τιµή, Μ 0 (Mode). Ως επικρατούσα τιµή ορίζεται η παρατήρηση µε την µεγαλύτερη συχνότητα. Εάν έχουµε οµαδοποιηµένη µεταβλητή τότε είναι το σηµείο τοµής των ευθυγράµµων τµηµάτων τα οποία ορίζονται από α) ΑΒ, όπου Α το άνω δεξί άκρο της κλάσης µε τη µεγαλύτερη συχνότητα και Β το άνω δεξί άκρο της 46

57 Θεωρητικό Μέρος προηγούµενης κλάσης. β) Γ, όπου Γ το άνω αριστερό άκρο της κλάσης µε τη µεγαλύτερη συχνότητα και το άνω αριστερό άκρο της επόµενης κλάσης[159]. Σχήµα 18: Σχηµατική απεικόνιση της έννοιας της επικρατούσας τιµής (Mode) 2.3 Μέτρα ιασποράς α. Εύρος, R: είναι η διαφορά µεταξύ της ελαχίστης παρατήρησης από την µεγίστη. ηλαδή R=X max X min (9) β. ιακύµανση ή ιασπορά, s 2 (Second Moment or Variation): Oρίζεται από την σχέση 1 ( ν 2 2 s = xi x) (10) ν i = 1 O τύπος αυτός µπορεί να µετασχηµατισθεί κάνοντας τις πράξεις και ως εξής: ν ν s = x i ( x i ) ν (11) i= 1 ν i= 1 ή s ν = xi x ν i= 1 (12) εάν οι παρατηρήσεις έχουν συχνότητες ν i οι τύποι γράφονται ως εξής: s 2 µ 1 = ( x i x) ν i= 1 2 ν i (13) 47

58 Θεωρητικό Μέρος ν ν s = x i νi ( xi νi ) ν (14) i= 1 ν i= 1 s ν = xi νi x ν i= 1 (15) γ. Τυπική απόκλιση, s (Standard Deviation): είναι η τετραγωνική ρίζα της διασποράς. ηλαδή 2 s= s (16) Η τυπική απόκλιση έχει ευρύτερη χρήση διότι εκφράζεται µε την ίδια µονάδα που εκφράζονται και οι παρατηρήσεις. Η τυπική απόκλιση δεν µεταβάλλεται εάν στις τιµές της µεταβλητής Χ προστεθεί µια σταθερά αxr. ηλαδή αν Υ=Χ+α τότε s x =s y. Εάν οι τιµές µιας µεταβλητής πολλαπλασιασθούν επί µια σταθερά αxr τότε η διασπορά πολλαπλασιάζεται επί την απόλυτη τιµή της σταθεράς α. ηλαδή αν Υ=Χα τότε s y =s x α δ. Συντελεστής Μεταβολής,CV. Ορίζεται ως το πηλίκο της τυπικής απόκλισης δια της µέσης τιµής. ηλαδή s CV = (17) x Ο συντελεστής µεταβολής εκφράζεται επί τοις εκατό και είναι ανεξάρτητος από τις µονάδες µέτρησης. Εκφράζει ένα µέτρο σχετικής διασποράς των τιµών της µεταβλητής. Ένα δείγµα τιµών µιας µεταβλητής είναι οµοιογενές όταν ο CV είναι µικρότερος ή ίσος από το 10%. ε. Τυπικό σφάλµα, SE (Standard error). Το τυπικό σφάλµα, SE (standard error of the mean) υπολογίζεται από τον τύπο: 1 S. E. = n ( Xi X) i= n( n 1) 2 (18) Όπου S η τυπική απόκλιση (standard deviation) n το µέγεθος του δείγµατος. 48

59 Θεωρητικό Μέρος 2.4 Ανάλυση Παλινδρόµησης (Regression Analysis) Είναι ο κλάδος της στατιστικής ο οποίος εξετάζει τη σχέση µεταξύ δύο ή περισσοτέρων µεταβλητών, ώστε να είναι δυνατή η πρόβλεψη της µιας από τις υπόλοιπες. i) Γραµµική Παλινδρόµηση (Linear Regression): Ως Γραµµική Παλινδρόµηση µιας εξαρτηµένης µεταβλητή Υ από την εξαρτηµένη µεταβλητή Χ ορίζεται η σχέση Υ=α+βΧ (19) Όπου α και β είναι παράµετροι Ο προσδιορισµός των α και β δίνει µια προσεγγιστική ευθεία, που συνδέει τις τιµές της Υ δοθέντων των τιµών της Χ. Η ευθεία που προκύπτει λέγεται ευθεία παλινδρόµησης της Υ πάνω στην Χ. Η ευθεία αυτή µπορεί να κατασκευασθεί εµπειρικά ή µέσω µαθηµατικών µεθόδων, όπως είναι η µέθοδος ελαχίστων τετραγώνων. Σκοπός της είναι το άθροισµα των τετραγώνων των κατακορύφων αποστάσεων των σηµείων (Χ,Υ) από την ευθεία να είναι ελάχιστο. Σχήµα 19: Η ευθεία παλινδρόµησης της Υ πάνω στην Χ όπως προκύπτει από την µέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων 49

60 Θεωρητικό Μέρος ii) Μέθοδος Ελαχίστων Τετραγώνων (Method of Least Squares). Mε την µέθοδο αυτή προσδιορίζονται οι συντελεστές α και β από τους τύπους: ˆ β ν ν ν ν x y ( xi )( i i i= 1 i= 1 i= 1 = ν ν 2 2 ν xi ( xi ) i= 1 i= 1 y ) i (20) και ˆ α = y ˆ β x (21) η ευθεία ελαχίστων τετραγώνων θα είναι η: yˆ = ˆ α+ ˆ β x (22) Το αˆ είναι η τεταγµένη του σηµείου στο οποίο η ευθεία τέµνει τον άξονα y y ενώ το βˆ, που είναι ο συντελεστής διεύθυνσης της ευθείας, εκφράζει την µεταβολή της µεταβλητής Υ όταν η µεταβλητή Χ µεταβληθεί κατά µια µονάδα. iii) Συντελεστής Γραµµικής Συσχέτισης, r (Linear Correlation Coefficient). Αποτελεί το µέτρο που εκφράζει την συγκέντρωση των σηµείων ενός διαγράµµατος διασποράς γύρω από την ευθεία παλινδρόµησης. Αν Χ και Υ δύο µεταβλητές µεγέθους ν τότε ο συντελεστής γραµµικής συσχέτισης είναι ο εξής: ν ( x x)( y y) i i r ( X, Y ) = r = i= 1 (23) ν ν 2 2 ( xi x) ( yi y) i= 1 i= 1 Εάν οι µέσες τιµές δεν είναι ακέραιοι αριθµοί, τότε ο συντελεστής γραµµικής συσχέτισης r δίνεται από τον τύπο: 2 xi ( i= 1 i= 1 xi ).( ν xiyi ( yi ) i= 1 i= 1 i= 1 r = (24) ν ν ν ν ν ν x ) i 2 ν ν ν 2 yi ( i= 1 i= 1 Ιδιότητες του r: Εάν 0<r<1 τότε οι Χ και Υ είναι θετικά γραµµικά συσχετισµένες. Εάν -1<r <0 τότε οι Χ και Υ είναι αρνητικά γραµµικά συσχετισµένες. y ) i 2 50

61 Θεωρητικό Μέρος Εάν r=1 τότε έχουµε τέλεια θετική γραµµική συσχέτιση και όλα τα σηµεία βρίσκονται πάνω στην ευθεία y=α+βχ y και β>0. Αντίστοιχα αν r=-1 και β<0. Εάν r=0 τότε δεν υπάρχει γραµµική συσχέτιση µεταξύ των µεταβλητών Χ και Υ. Οπότε λέµε ότι είναι γραµµικά ασυσχέτιστες. iv) Συσχέτιση. Το εργαλείο ανάλυσης "Συσχέτιση" µετρά τη σχέση µεταξύ δύο συνόλων δεδοµένων, τα οποία έχουν κλιµάκωση, ώστε να είναι ανεξάρτητα από µονάδα µετρήσεως. Ο υπολογισµός της συσχέτισης πληθυσµού επιτρέπει τη συνδιακύµανση των δύο συνόλων δεδοµένων, διαιρούµενη δια του γινοµένου των τυπικών τους αποκλίσεων, βάσει των ακόλουθων τύπων. Μπορεί να χρησιµοποιηθεί το εργαλείο ανάλυσης "Συσχέτιση" για να καθορίσει κατά πόσο δύο περιοχές δεδοµένων µεταβάλλονται µαζί, δηλαδή κατά πόσο µεγάλες τιµές του ενός συνόλου σχετίζονται µε µεγάλες τιµές του άλλου (θετική συσχέτιση), κατά πόσο µικρές τιµές του ενός συνόλου σχετίζονται µε µεγάλες τιµές του άλλου (αρνητική συσχέτιση) ή κατά πόσο οι τιµές και των δύο συνόλων είναι άσχετες µεταξύ τους (σχεδόν µηδενική συσχέτιση). v) Συνδιακύµανση (Covariance of the two variables). Aποτελεί ένα µέτρο της σχέσης µεταξύ δύο περιοχών δεδοµένων. Το εργαλείο ανάλυσης "Συνδιακύµανση" αποδίδει το µέσο όρο του γινοµένου των αποκλίσεων των σηµείων δεδοµένων από τις αντίστοιχες µέσες τιµές τους, βάσει του παρακάτω τύπου. ν 1 cov( X, Y ) = ( x x)( y y) (25) ν i= 1 Μπορεί να χρησιµοποιηθεί το εργαλείο "Συνδιακύµανση" για να καθορισθεί κατά πόσο δύο περιοχές δεδοµένων µεταβάλλονται µαζί, δηλαδή κατά πόσο µεγάλες τιµές του ενός συνόλου σχετίζονται µε µεγάλες τιµές του άλλου (θετική συνδιακύµανση), κατά πόσο µικρές τιµές του ενός συνόλου σχετίζονται µε µεγάλες τιµές του άλλου (αρνητική συνδιακύµανση) ή κατά πόσο οι τιµές και των δύο συνόλων είναι άσχετες µεταξύ τους (σχεδόν µηδενική συνδιακύµανση). i i 51

62 Θεωρητικό Μέρος 2.5 Ανάλυση ιασποράς (Analysis of Variance) ANOVA Εξετάζει τη σχέση της εξαρτηµένης µεταβλητής µε την ανεξάρτητη, υπολογίζοντας στην ουσία το αν η µεταβλητότητα των τιµών της εξαρτηµένης µεταβλητής Υ εξηγείται από την ανεξάρτητη µεταβλητή Χ. Η ανάλυση της διασποράς για το απλό γραµµικό µοντέλο µπορεί να παρουσιασθεί ως εξής: Πίνακας ΙΙ: Περιέχει την ανάλυση της διασποράς για το απλό γραµµικό µοντέλο Πηγή Μεταβλητότητας Βαθµοί Ελευθερίας Άθροισµα Τετραγώνων Μέσο τετράγωνο F-test Παλινδρόµηση 1 SSR = ( yˆ i y) ν i= 1 2 SSR MSR= 1 F = MSR MSE Υπόλοιπα ν-2 SSE = ( y i yˆ) i= 1 Ολική ν-1 SST = ( y i y) ν ν i= MSE = S 2 SSE = ν 2 Σε κάθε άθροισµα τετραγώνων αντιστοιχούν ορισµένοι βαθµοί ελευθερίας, που ισοδυναµούν µε το πλήθος των ανεξαρτήτων συναρτήσεων των y i, οι οποίοι απαιτούνται για τον υπολογισµό του εν λόγω αθροίσµατος. Οπότε το SST έχει ν 1 βαθµούς ελευθερίας διότι: ν i= 1 ( y ) = 0 (26) i y Το SSR έχει έναν βαθµό ελευθερίας, διότι µπορεί να υπολογισθεί από µία συνάρτηση των y i την βˆ δοθέντος ότι: ν i= 1 ν SSR = ( yˆ y) = ˆ β ( x x) (27) i i= 1 Ενώ το SSE έχει ν 2 βαθµούς ελευθερίας διότι: ν i= 1 ν i ( y i yˆ i ) = 0 και x i ( yi yˆ i ) = 0 (28) i= 1 52

63 Θεωρητικό Μέρος Τα εργαλεία ανάλυσης Anova προσφέρουν διαφορετικά είδη ανάλυση της διακύµανσης. Το εργαλείο που θα χρησιµοποιήσετε εξαρτάται από τον αριθµό των συντελεστών και τον αριθµό των δειγµάτων που έχετε από τους πληθυσµούς τους οποίους θέλετε να ελέγξετε. 2.6 Ανάλυση διακύµανσης κατά ένα παράγοντα Αυτό το εργαλείο εκτελεί µια απλή ανάλυση διακύµανσης, επαληθεύοντας την υπόθεση ότι οι µέσες τιµές δύο ή περισσοτέρων δειγµάτων είναι ίσες (εφόσον λαµβάνονται από πληθυσµούς µε την ίδια µέση τιµή). Η τεχνική αυτή επεκτείνεται στις δοκιµές δύο µέσων τιµών, όπως ο έλεγχος t. Α. Ανάλυση διακύµανσης δύο παραγόντων µε αλληλεπίδραση. Αυτό το εργαλείο ανάλυσης εκτελεί µια παραλλαγή, δύο παραγόντων µε αναπαραγωγή, της ανάλυσης διακύµανσης ενός παράγοντα, που περιλαµβάνει περισσότερα από ένα δείγµατα για κάθε οµάδα δεδοµένων. Β. Ανάλυση διακύµανσης δύο παραγόντων χωρίς αλληλεπίδραση. Αυτό το εργαλείο ανάλυσης εκτελεί µια ανάλυση διακύµανσης δύο παραγόντων, η οποία δεν περιλαµβάνει περισσότερες από µία δειγµατοληψίες ανά οµάδα, κάνοντας δοκιµή της υπόθεσης ότι οι µέσες τιµές δύο ή περισσοτέρων δειγµάτων είναι ίσες (εφόσον λαµβάνονται από πληθυσµούς µε την ίδια µέση τιµή). Η τεχνική αυτή επεκτείνεται σε δοκιµές για δύο µέσες τιµές, όπως ο έλεγχος t. 2.7 Στατιστικοί Έλεγχοι F Οι στατιστικές συναρτήσεις SSR και SSE είναι ανεξάρτητες µεταξύ τους και τα µέσα τετράγωνα ακολουθούν την Χ 2 κατανοµή µε βαθµούς ελευθερίας τους αντίστοιχους των αθροισµάτων τετραγώνων. Εποµένως η συνάρτηση F ακολουθεί την F 1,n-2 κατανοµή και µπορεί να χρησιµοποιηθεί, για να ελέγξουµε την σηµαντικότητα της παλινδρόµησης, δηλαδή της υπόθεσης Η 0 :β=0 έναντι της Η α : β 0. Ουσιαστικά ελέγχουµε την ισχύ της υπόθεσης, 53

64 Θεωρητικό Μέρος ότι τα δεδοµένα µας µπορούν να περιγραφούν ικανοποιητικά από το γραµµικό µοντέλο. 2.8 Συντελεστής Προσδιορισµού R 2 Είναι το πηλίκο 2 SSR R = SST (29) µε 0 R 2 1 µε το οποίο µπορούµε να ελέγξουµε την αξία του απλού γραµµικού µοντέλου, το οποίο προσαρµόζουµε στα δεδοµένα. Ο συντελεστής προσδιορισµού εκφράζει το ποσοστό της µεταβλητότητας της µεταβλητής Υ που εξηγείται από την µεταβλητή Χ. Όσο πιο κοντά βρίσκεται η τιµή του R 2 στην µονάδα, τόσο πιο ισχυρή γίνεται η γραµµική σχέση εξάρτησης των µεταβλητών Υ και Χ. 2.9 Επικύρωση Μεθόδου Ανάλυσης- οκιµής Κατά την πραγµατοποίηση µιας εργαστηριακής δοκιµής πολλοί είναι οι παράγοντες που επιδρούν στα αποτελέσµατα αυτής. Είναι δυνατόν να οµαδοποιηθούν σε τρεις βασικές κατηγορίες: 1. Άνθρωπος. Ο ανθρώπινος παράγοντας σχετίζεται µε την επιδεξιότητα του ανθρώπινου δυναµικού, την µόρφωση, την εκπαίδευση, την εξάσκηση του αλλά και µε την ύπαρξη δοκιµής για την επάρκεια και την ικανότητα του ανθρωπίνου δυναµικού. 2. Περιβάλλον. Κάθε δοκιµή που πραγµατοποιείται είναι άρρηκτα συνδεδεµένη µε το περιβάλλον. Επιβάλλεται συστηµατικός έλεγχος στην θερµοκρασία, στην πίεση, στην υγρασία, στην µόλυνση αλλά και σε άλλα χαρακτηριστικά όπως η ηλεκτροµαγνητική ακτινοβολία. 3. Οργανολογία. Εξασφαλίζοντας τον κατάλληλο εξοπλισµό, την σωστή περιγραφή της δοκιµής, την βαθµονόµηση των οργάνων, τον έλεγχο αυτών αλλά και την ιχνηλασιµότητα της µεθόδου, καθίσταται δυνατή η σωστή λειτουργία των οργάνων και εκτέλεση της δοκιµής. 54

65 Θεωρητικό Μέρος Η ορθότητα και η ακρίβεια της µεθόδου (αξιοπιστία) επηρεάζεται σε τεράστιο βαθµό από τους παραπάνω παράγοντες. Η µη σωστή τήρησή τους έχει σαν αποτέλεσµα την εµφάνιση σφαλµάτων τα οποία όµως µε την σειρά τους δεν πρέπει να συγχέονται µε τα λάθη που πραγµατοποιούνται. Τα σφάλµατα που εµφανίζονται σε κάθε µέτρηση ενός µεγέθους χωρίζονται σε τυχαία ή συστηµατικά. Τα τυχαία σφάλµατα συνοδεύουν κάθε µέτρηση, προέρχονται από µη µόνιµες αιτίες και δρουν ακαθόριστα στο αποτέλεσµα. Για να εξουδετερωθεί πλήρως η επίδρασή τους απαιτείται άπειρος αριθµός µετρήσεων[160]. Τα συστηµατικά ή καθορισµένα σφάλµατα επιδρούν στο αποτέλεσµα µόνο κατά µια κατεύθυνση και παραµένουν σταθερά για µια σειρά µετρήσεων που διεξάγονται κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Η εύρεση και ο προσδιορισµός τους είναι δυνατός και κατά συνέπεια ο αναλυτής µπορεί να τα ελέγχει ή να τα εξουδετερώσει πλήρως. Τα συστηµατικά σφάλµατα µπορούν να είναι ή σταθερά όταν το απόλυτο µέγεθος του σφάλµατος είναι το ίδιο σε όλα τα δείγµατα ή αναλογικά όταν το απόλυτο σφάλµα είναι ανάλογο µε την ποσότητα του συστατικού. Τα συστηµατικά σφάλµατα διακρίνονται σε σφάλµατα µεθόδου, σφάλµατα οργάνων αλλά και προσωπικά σφάλµατα Παράµετροι Επικύρωσης Μεθόδου Για την επικύρωση της µεθόδου πρέπει να προσδιοριστούν κάποιες παράµετροι όπως: Ορθότητα(Accuracy) Ως ορθότητα ορίζεται η συµφωνία που υπάρχει µεταξύ πειραµατικής και πραγµατικής τιµής. Μπορεί να εκφραστεί µε πολλούς τρόπους: 1. Απόλυτο σφάλµα(absolute error). 2. Σχετικό σφάλµα(relative error). 3. Μεροληψία(bias). 55

66 Καµπύλη Βαθµονόµησης(Calibration Curve) Θεωρητικό Μέρος Κάνοντας γραφική παράσταση του λαµβανόµενου σήµατος από τον ανιχνευτή συναρτήσει της γνωστής συγκέντρωσης της αναλυόµενης ουσίας παίρνουµε την καµπύλη βαθµονόµησης Ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιµότητα (Intralaboratory reproducibility) Ως ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιµότητα ορίζεται ο βαθµός συµφωνίας των αποτελεσµάτων που λαµβάνονται χρησιµοποιώντας την ίδια µέθοδο και το ίδιο δείγµα αλλά σε διαφορετικούς χρόνους µε διαφορετικό αναλυτή. Για να προσδιοριστεί χρησιµοποιείται ως µέτρο η τυπική απόκλιση(standard deviation) S L ( xi x) s= ( N 1) 2 (30) H ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιµότητα σε στάθµη εµπιστοσύνης 95% και αν ο αριθµός µετρήσεων δεν είναι µικρός ορίζεται από τον τύπο R L =2,8 S L (31) Όριο Ανίχνευσης (Limit of Detection) Ως όριο ανίχνευσης ορίζεται η χαµηλότερη συγκέντρωση της αναλυόµενης ουσίας η οποία µπορεί να θεωρηθεί στατιστικά πραγµατική. Υπολογίζεται µε την πραγµατοποίηση 10 διαδοχικών αναλύσεων σε λευκό δείγµα. Η συγκέντρωση που αντιστοιχεί τρεις φορές στην τυπική απόκλιση αποτελεί και το όριο ανίχνευσης. Επειδή όµως ο παραπάνω τρόπος παρουσιάζει πολλές δυσκολίες(δύσκολη εύρεση λευκών δειγµάτων) συνήθως ακολουθείται η εξής διαδικασία: Από την καµπύλη βαθµονόµησης προσδιορίζεται η τεταγµένη επί την αρχή, η κλίση και η τυπική απόκλιση της τεταγµένης επί την αρχή, Στην συνέχεια το όριο ανίχνευσης υπολογίζεται από τον εξής τύπο: 56

67 Θεωρητικό Μέρος τυπικήαπόκλισητεταγµ ένηςεπί την αρχή LOD= 3 (32) κλσηευθε ί ίας Όριο Προσδιορισµού(Limit of Quantification) Το όριο προσδιορισµού ορίζεται ως η χαµηλότερη συγκέντρωση της αναλυόµενης ουσίας που θεωρείται πραγµατική στατιστικά και έχει προσδιοριστεί χρησιµοποιώντας την αναλυτική µέθοδο. Υπολογίζεται από την σχέση: LOQ= 3, 3 LOD (33) Ανάκτηση (Recovery) Εµβολιάζεται δείγµα µε την αναλυόµενη ουσία και εφαρµόζεται η αναλυτική µέθοδος. Στη συνέχεια πραγµατοποιείται σύγκριση της προσδιοριζόµενης τιµής της συγκέντρωσης µε αυτή που έχει αρχικά εισαχθεί. Με αυτό τον τρόπο καθίσταται δυνατή η δοκιµή της ανάκτησης. Τα επιτρεπόµενα όρια παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας ΙΙΙ: Περιέχει την ελάχιστη % ανάκτηση καθώς και την περιεκτικότητα της αναλυόµενης ουσίας στο προς ανάλυση δείγµα Περιεκτικότητα αναλυόµενης ουσίας στο δείγµα (mg/kg) Ελάχιστη % ανάκτηση 0, >1 > Σχετική τυπική απόκλιση(relative standard deviation) Είναι η τυπική απόκλιση εκφρασµένη % στη µέση µετρηθείσα τιµή. 57

68 Όριο επαναληψιµότητας (Repeatability ή Precision) Θεωρητικό Μέρος Ο βαθµός συµφωνίας µεταξύ των πειραµατικών µετρήσεων που έλαβαν χώρα κάτω από ακριβώς τις ίδιες συνθήκες ορίζεται ως επαναληψιµότητα[161]. Εάν οι µετρήσεις έχουν γίνει από τον ίδιο αναλυτή συνεχόµενα την ίδια µέρα, κάτω από τις ίδιες εργαστηριακές συνθήκες τότε αναφερόµαστε σε repeatability της µεθόδου. Εάν όµως οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε διαφορετικές µέρες που ενδεχοµένως οι συνθήκες να διαφέρουν ελαφρώς τότε αναφερόµαστε σε αναπαραγωγιµότητα (reproducibility). Για την µέτρηση της επαναληψιµότητας, απαιτείται µια σειρά πειραµάτων µε αριθµό µεγαλύτερο του 10, χρησιµοποιείται η τυπική απόκλιση ενώ το όριο της µπορεί να βρεθεί από την σχέση επαναληψιµ ότητα= 2, 8 τυπικήαπόκλιση (34) σε στάθµη εµπιστοσύνης 95% Όριο αναπαραγωγιµότητας Ως όριο αναπαραγωγιµοτητας ορίζεται ο βαθµός συµφωνίας µεταξύ των αποτελεσµάτων που επιτεύχθηκαν µε την ίδια µέθοδο, µε το ίδιο δείγµα σε διαφορετικές συνθήκες. Η τυπική απόκλιση αποτελεί ένα τρόπο µέτρησης της αναπαραγωγιµότητας. όπως και η σχετική τυπική απόκλιση. Τα όριο µπορεί να υπολογίζεται από τον τύπο: όριοαναπαραγωγιµ ότητας = 2, 8 τυπικήαπόκλιση (35) Επιλεκτικότητα(Selectivity) Ως επιλεκτικότητα ορίζεται ο βαθµός µε τον οποίο µια δεδοµένη αναλυτική µέθοδος επιτρέπει το διαχωρισµό της αναλυόµενης ουσίας από οποιαδήποτε άλλη ουσία που περιέχεται µέσα στο δείγµα της δοκιµής Ευαισθησία(Sensitivity) Η αλλαγή που επέρχεται στο σήµα του ανιχνευτή όταν αλλαχθεί η 58

69 συγκέντρωση της αναλυόµενης ουσίας κατά µια µονάδα. Θεωρητικό Μέρος Εξειδίκευση(Specifity) Η ικανότητα της χρησιµοποιούµενης µεθόδου να δίνει απόκριση µόνο στην ουσία που µετρείται Συστηµατικό σφάλµα(systematic Error) Η διαφορά µεταξύ της µέσης τιµής που επιτεύχθηκε από ένα µεγάλο αριθµό αποτελεσµάτων και της αληθινής τιµής. Η αξιοπιστία µπορεί να µετρηθεί από την παρακάτω σχέση Όπου χ η µετρούµενη τιµή X w η αληθινή τιµή δ συστηµατικό σφάλµα ε τυχαίο σφάλµα x =xw+δ +ε (36) Το άθροισµα δ+ε, δηλαδή ορθότητα+ακρίβεια δίνει την αξιοπιστία της µεθόδου Ορθότητα (Trueness) Ως ορθότητα ορίζεται ο βαθµός συµφωνίας µεταξύ της αληθινής τιµής και της µέσης που επιτεύχθηκε όµως για αριθµό µετρήσεων µεγαλύτερο του 10. Η διαφορά των δύο αυτών τιµών αποτελεί την ορθότητα. Για να προσδιοριστεί ως µέγεθος µε µεγαλύτερη βεβαιότητα χρησιµοποιούνται διάφορες τεχνικές α) Πιστοποιηµένα υλικά αναφοράς(crm) β) Εµβολιασµένα δείγµατα σε λευκά δείγµατα γ) Μέθοδος αναφοράς 59

70 Αληθινή τιµή(true Value) Θεωρητικό Μέρος Είναι η τιµή που χαρακτηρίζει τη συγκέντρωση και είναι πλήρως καθορισµένη στις συνθήκες προσδιορισµού της. Η χρήση του CRM αποτελεί µια πάρα πολύ καλή προσέγγιση της αληθινής τιµής Μέγιστη επιτρεπτή σχετική τυπική απόκλιση Τα επιτρεπτά όρια αυτής αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα Πίνακας IV: Περιέχει τα επιτρεπόµενα όρια για τη µέγιστη επιτρεπτή σχετική τυπική απόκλιση Μέση τιµή του µέρους της αναλυόµενης ουσίας στο δείγµα Σχετική τυπική απόκλιση % , , ,

71 3. Πειραµατικό Μέρος Πειραµατικό Μέρος 3.1 Συσκευές 1. Υγρός χρωµατογράφος(thermo Fisher Scientific Inc.). Ο υγρός χρωµατογράφος αποτελείται από τα παρακάτω τµήµατα: 2. Αυτόµατος ειγµατολήπτης 200 θέσεων. Στην κατάλληλη θέση τοποθετείται το φιαλίδιο µε το προς ανάλυση δείγµα και µετά από κατάλληλη ενεργοποίηση του λογισµικού το δείγµα εγχύεται αυτόµατα. Ο δειγµατολήπτης έχει σταθερή θερµοκρασία 30 0 C. Ο όγκος της ένεσης είναι 100µL. 3. Στήλη Χρωµατογραφίας (Supercosil C-18). Η αναλυτική στήλη είναι µεταλλική, από ανοξείδωτο χάλυβα, µε διαστάσεις 250 x 4.6mm (ID) προπληρωµένη µε silica και υποκατεστηµένη µε δεκαοκτύλια. Το µέγεθος των σωµατιδίων πλήρωσης είναι 5µm. Η στήλη θερµοστατείται στους 40 o C. 4. Φθορισµοµετρικός Ανιχνευτής. Στη στήλη συνδέεται φθορισµοµετρικός ανιχνευτής και το µήκος κύµατος διέγερσης ορίζεται στα 274nm ενώ το µήκος κύµατος εκποµπής ορίζεται στα 455nm. 61

72 Πειραµατικό Μέρος 5. Υπολογιστής. Η επεξεργασία των αποτελεσµάτων γίνεται µε τη βοήθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή. Ο ανιχνευτής FLD παρέχει γραµµική απόκριση µε επαρκή ευαισθησία στις συγκεντρώσεις εργασίας (3-300ppb). 6. Λογισµικό. Οι υπολογισµοί επιτυγχάνονται µε τη βοήθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή. Το όργανο παρέχει γραµµική απόκριση µε επαρκή ευαισθησία, καθώς και ικανοποιητική διόρθωση, όσον αφορά την απόκλιση της γραµµής βάσεως. Το πρόγραµµα που χρησιµοποιήθηκε ήταν της ίδιας εταιρείας σε συνεργασία µε την Microsoft Corporation, το Xcalibur. Σχήµα 20: Πειραµατική διάταξη για την ανίχνευση ζεαραλενόνης µέσω HPLC/FLD. 3.2 Αντιδραστήρια Όλοι οι αναφερόµενοι διαλύτες πρέπει να είναι κατάλληλοι για HPLC ανάλυση. Το νερό πρέπει να είναι τριπλά απεσταγµένο ή κατάλληλο για HPLC ανάλυση. 1. Χλωριούχο Νάτριο (NaCl) pro analysis (>99,5% ). 2. Όξινο Φωσφορικό Νάτριο (Νa 2 HPO 4 ) pro analysis(min 99,0% ). 62

73 Πειραµατικό Μέρος 3. Ένυδρο ισόξινο Φωσφορικό Νάτριο (ΝaH 2 PO 4 xh 2 O) pro analysis (99,5%). 4. Ακετονιτρίλιο (CH 3 CN) H.P.L.C GRADE. 5. Νερό κατάλληλο για HPLC ανάλυση (νερό για χρήση σε αναλυτικό εργαστήριο). 6. Παγόµορφο οξικό οξύ (Glacial CH 3 COOH, 100% for analysis). 7. ιάλυµα εκπλύσεων PBS (ph=7,2-7,4). Ζυγίζουµε 29,2g NaCl (5.1), 5,68g Νa 2 HPO 4 (5.2) και 1,32g ΝaH 2 PO 4 xh 2 O σε ζυγό ακριβείας (±0,01) τα διαλύουµε και συµπληρώνουµε µέχρι τη χαραγή σε ογκοµετρική φιάλη του ενός λίτρου τύπου Α (1L) (±0,6). Φυλάσσεται σε γυάλινο δοχείο µε πώµα. 8. ιάλυµα εκχύλισης [ακετονιτρίλιο/νερό (CH 3 CN/H 2 O) (75:25,v/v)]. Λαµβάνουµε 250mL νερό και 750 ml CH 3 CN µε την χρήση ογκοµετρικών φιαλών τύπου Α των 250mL (±0,15), 500 ml (±0,1) και τα προσθέτουµε σε ογκοµετρική φιάλη του ενός λίτρου τύπου Α (1L) (±0,6). Φυλάσσεται σε γυάλινο δοχείο µε πώµα. 9 Κινητή Φάση [Νερό/Ακετονιτρίλιο, (40:60 v/v µε 12mL οξικό οξύ/l)]. Λαµβάνουµε 600mL ακετονιτρίλιο και 400 ml νερό µε την χρήση ογκοµετρικών φιαλών τύπου Α των 250mL(±0,15), 100 ml(±0,1) και τα προσθέτουµε σε ογκοµετρική φιάλη του ενός λίτρου τύπου Α(±0,6). Αναµειγνύονται σε κατάλληλο γυάλινο δοχείο. Αφαιρούµε 12mL από το ανωτέρω διάλυµα και προσθέτουµε 12mL οξικό οξύ. 10. Πιστοποιηµένο υλικό αναφοράς: ιάλυµα Ζεαραλενόνης 100µg/mL σε ακετονιτρίλιο 100% της Εταιρίας BIOPURE LOT L09033C ή ανάλογο αυτού. 3.3 Εργαστηριακός Εξοπλισµός Ο εργαστηριακός εξοπλισµός είναι ο συνήθης εργαστηριακός εξοπλισµός και πιο συγκεκριµένα περιλαµβάνει: 1. Γυάλινοι δοκιµαστικοί σωλήνες. 2. Στατώ στήριξης των στηλών ανοσοσυγγένειας. 3. Στήλες ανοσοσυγγένειας ειδικές για Ζεαραλενόνη (EASI EXTRACT ZEARALENONE της εταιρείας R-Biopharm RHONE LTD). Για κάθε παρτίδα γίνεται έλεγχος καταλληλότητας σε µία στήλη µε πρότυπο διάλυµα 63

74 Πειραµατικό Μέρος Ζεαραλενόνης 75 ng/ml και υπολογισµός της ανάκτησης σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. 4. Γυάλινες σύριγγες (reservoir) προσδεµένες στις στήλες ανοσοσυγγένειας. 5. Πλαστικές σύριγγες για την άσκηση πίεσης στις στήλες ανοσοσυγγένειας. 6.Μηχανική πιπέτα µL. 7.Ογκοµετρική φιάλη τύπου Α 10mL(±0,02). 8.Ογκοµετρικός κύλινδρος τύπου Α 10mL(±0,5). 9. Ζυγός ακριβείας 0,0001g Παρασκευή Προτύπων ιαλύµατων Ζεαραλενόνης Παρασκευάζουµε τα πρότυπα διαλύµατα Ζεαραλενόνης από το Πρότυπο ιάλυµα Ζεαραλενόνης (2.10) 100µg/mL σύµφωνα µε την µέθοδο παρασκευής προτύπων διαλυµάτων που περιγράφεται στο συνοδευτικό έντυπο το οποίο συνοδεύει το πρότυπο διάλυµα Ζεαραλενόνης. Η δε σταθερότητά του ελέγχεται περιοδικά κάθε 4 µήνες, µετρώντας σε µία συγκέντρωση 75ppb. Η µέθοδος που χρησιµοποιήθηκε για την παρασκευή των πρότυπων διαλυµάτων ήταν αυτή των διαδοχικών αραιώσεων όπως φαίνεται και από το παρακάτω σχήµα, ενώ οι συγκεντρώσεις που επιλέχθηκαν παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. Σχήµα 21: Σχηµατική αναπαράσταση της µεθόδου των διαδοχικών αραιώσεων που χρησιµοποιήθηκε για την παρασκευή των προτύπων διαλυµάτων 64

75 Πειραµατικό Μέρος Πίνακας V: Συγκεντρώσεις Προτύπων ιαλυµάτων Ζεαραλενόνης. STD C/ppb ZON Πειραµατική ιαδικασία 1. Ζυγίζονται 25g αλεσµένου δηµητριακού σε ζυγό ακριβείας (±0,0001g) και προσθέτονται στον µεταλλικό κάδο (blender). 2. Προσθέτεται µε ογκοµετρική φιάλη τύπου Α των 100mL(±0.1) και των 25mL(±0.3) διάλυµα ακετονιτρίλιου/νερού (75:25,v/v) και πραγµατοποιείται οµογενοποίηση στην υψηλή ταχύτητα του blender για 2min. 3. ιηθείται το µίγµα από διηθητικό χαρτί Whatman No4 ή Νο113 και συλλέγεται το διήθηµα σε γυάλινη κωνική φιάλη ή γυάλινο ποτήρι. 4. Λαµβάνονται 20mL από το διήθηµα µε πιπέτα τύπου Α 20mL (±0.02) και αραιώνονται µε 80mL δ/τος PBS. Στη συνέχεια λαµβάνονται 25mL από το διάλυµα αυτό (αντιστοιχούν σε 1g δείγµατος). Εισάγονται στη στήλη ανοσοσυγγένειας µε ροή 5mL/min µε τη βοήθεια σύριγγας ή µε τη βαρύτητα. 5. Εκπλένεται η στήλη ανοσοσυγγένειας µε 10mL (±0.1) PBS µε ροή 5mL/min. 6. Εκλούεται η Ζεαραλενόνη από τη στήλη µε 1,5mL ακετονιτρίλιο (διακριβωµένη µηχανική πιπέτα) µε ταχύτητα ροής 1 σταγόνα/s ή µε τη βαρύτητα. Κατά τη διάρκεια της έκλουσης αναστρέφεται η ροή τρεις τουλάχιστον φορές µε τη βοήθεια σύριγγας (backflush). Το έκλουσµα συλλέγεται σε γυάλινο σωλήνα. Κατόπιν εκπλένεται η στήλη µε 1,5mL νερό (διακριβωµένη µηχανική πιπέτα) και συλλέγεται το έκπλυµα στον ίδιο σωλήνα 65

76 Πειραµατικό Μέρος µε το έκλουσµα του ακετονιτριλίου(συνολικός όγκος µίγµατος 3mL). Πιέζοντας το έµβολο της σύριγγας συλλέγεται και η τελευταία σταγόνα. 7. Με τον αυτόµατο δειγµατολήπτη εισάγονται 100µL από το ανωτέρω διάλυµα στον υγρό χρωµατογράφο HPLC-FLD. 8. Τέλος η ολοκλήρωση των κορυφών του χρωµατογραφήµατος γίνεται χειρονακτικά(manually) HPLC Ανάλυση Χρησιµοποιώντας τον αυτόµατο δειγµατολήπτη γίνεται ένεση όγκου 100µL από το φιαλίδιο το οποίο περιέχει το προς ανάλυση δείγµα. Η ροή καθορίζεται στο 1mL/min Η κινητή φάση είναι το διάλυµα Νερό:Ακετονιτρίλιο, (60:40, v/v) µε 12mL οξικό οξύ/l]. Τα µήκη κύµατος στον φθορισµοµετρικό ανιχνευτή έχουν οριστεί ως εξής: Μήκος κύµατος διέγερσης (excitation wavelength=274nm) Μήκος κύµατος εκποµπής (emission wavelength=455nm) 3.7. Ο Φθορισµοµετρικός Ανιχνευτής(F.L.D) Απλός φθορισµός, ή φθορισµός συνήχησης, ή α είδους, λέγεται εκείνος κατά τον οποίο µια ουσία φωτιζόµενη από µια φωτεινή δέσµη εκπέµπει ακτινοβολία του αυτού µήκους κύµατος µε την ακτινοβολία που απορροφά από την δέσµη. Τυπικό παράδειγµα αποτελούν οι ατµοί νατρίου. Ο ανιχνευτής φθορισµού(f.l.d) χρησιµοποιείται σχεδόν αποκλειστικά στην υγρή χρωµατογραφία και είναι ένας εξειδικευµένος ανιχνευτής που ανιχνεύει µόνο εκείνες τις ουσίες που φθορίζουν. Μια κυψελίδα ροής χρησιµοποιείται ως αισθητήρας µέσω του οποίου το φως διέγερσης περνά αξονικώς. Ένα φωτοκύτταρο είναι τοποθετηµένο στην πλευρά της κυψελίδας για να λάβει το ακτινικώς εκπεµπόµενο φως. Ο κυψελοειδής τοίχος είναι κατασκευασµένος από γυαλί Pyrex για να αποτρέψει το φως διέγερσης (συνήθως UV) να φθάσει στο φωτοκύτταρο. Όταν µια ουσία που φθορίζει στο φως διέγερσης, τοποθετηθεί στη κυψελίδα, το φθορισµένο φως περνά κατευθείαν από τα τοιχώµατα της κυψελίδας στο φωτοκύτταρο, η παραγωγή 66

77 Πειραµατικό Μέρος του οποίου υποβάλλεται σε επεξεργασία ηλεκτρονικά και τελικά περνά µέσα στον υπολογιστή. Το φως διέγερσης µπορεί να είναι στα 254 nm (UV) και παράγεται από το λαµπτήρα υδραργύρου ή µπορεί να είναι φως οποιουδήποτε µήκους κύµατος και προέρχεται από το φως που παράγεται από έναν λαµπτήρα δευτέριου χρησιµοποιώντας έναν µονοχρωµάτορα. Για να βελτιώσει την εξειδίκευση µιας ανάλυσης LC, ένα φθορισµένο παράγωγο της ουσίας που µας ενδιαφέρει µπορεί να προετοιµαστεί (χρησιµοποιώντας ένα κατάλληλο αντιδραστήριο φθορισµού). Η ουσία µπορεί έπειτα να ανιχνευθεί επιλεκτικά από άλλες διαλυτές ουσίες που, (εάν δεν φθορίζουν) δεν χρειάζονται να διαχωριστούν µεταξύ τους από τη χρωµατογραφική στήλη. Το σήµα του F.L.D. µπορεί να δοθεί από τη σχέση: I Όπου f kcl ( e ) = φ I 1 (37) 0 f ο λόγος των αριθµών των φωτονίων που εκπέµπονται προς τον αριθµό των φωτονίων που απορροφώνται I 0 η ένταση του φωτός που προσπίπτει C η συγκέντρωση της ουσίας k η µοριακή απορροφητικότητα l το µήκος της κυψελίδας Σχήµα 22: Σχηµατική αναπαράσταση ενός Φθορισµοµετρικού Ανιχνευτή(F.L.D) 67