ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ

Transcript

1 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ ΑΝΑΣΤΡΟΦΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ (γονίδιο φαινότυπος) Πρόσθεση εξωγενών γονιδίων (διαγονιδιακά) Τροποποίηση ενδογενών γονιδίων Αφαίρεση γονιδίων (knockout) Στοχευμένη μεταλλαξογένεση γονιδίων Ελεγχόμενη έκφραση γονιδίων (conditional) ΥΠΟΘΕΣΗ ΠΡΟΣΘΙΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗ (φαινότυπος γονίδιο) Τυχαία μεταλλαξογένεση ΧΩΡΙΣ ΥΠΟΘΕΣΗ

2 Γονιδιακή κατασκευή neo tk Εισαγωγή του DNA στα ES με ηλεκτροπαλμό Επιλογή ανθεκτικών ES κλώνων Tεχνολογία κατευθυνόμενης γονιδιακής στόχευσης Καλλιέργεια ES κλώνων και εντοπισμός των ανασυνδιασμένων ES κλώνων Εισαγωγή των ανασυνδιασμένων ΕSC κλώνων σε βλαστοκύστεις Εμφύτευση των βλαστοκύστεων σε θετές μητέρες ημιουργία χιμαιρικών ποντικών και διασταύρωσή τους για την μεταβίβαση του τροποποιημένου γονιδίου ημιουργία ετερόζυγων ποντικών και διασταύρωσή τους ημιουργία και μελέτη των ομόζυγων ποντικών

3 Ρόλος του δείκτη θετικής επιλογής : 1. Επιλογή των εμβρυικών βλαστικών κυττάρων στο γονιδίωμα των οποίων έχει ενσωματωθεί η γονιδιακή κατασκευή 2. Αδρανοποίηση του γονιδίου το οποίο αντικαθιστά Απομάκρυνση δείκτη θετικής επιλογής από το γονιδίωμα ενδείκνυται όταν: Η παρουσία του μπορεί να: 1. παρεμποδίσει την έκφραση του τροποποιημένου γονιδίου (υπομορφικό αλληλόμορφο) 2. παρεμποδίσει την έκφραση γειτονικών γονιδίων

4 Περιορισμοί της τεχνολογίας Γονιδιακής Στόχευσης 15% γονιδίων που αδρανοποιούνται οδηγούν σε εμβρυική θνησιμότητα, οπότε δεν αναπτύσσονται ενήλικα άτομα. Ο ρόλος ενός γονιδίου μπορεί να είναι διαφορετικός στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια ενός οργανισμού, συνεπώς η μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων δυσχεραίνεται. Ο φαινότυπος μπορεί να ποικίλει μεταξύ των διαφορετικών καθαρόμαιμων σειρών. Συνήθως η γενετική τροποποίηση γίνεται σε περιορισμένες καθαρόαιμες σειρές οπότε μπορεί να χρειαστεί να γίνουν πολλές διασταυρώσεις ώστε να μεταφερθεί η μετάλλαξη σε άλλη σειρά. Δεν είναι εφικτή σε όλα τα ζωικά είδη όπως στον αρουραίο

6 Στοχευμένη μεταλλαξογένεση γονιδίων A loxp loxp Cre B Γονιδιακή κατασκευή Ενδογενές γονίδιο tk * neo pa Ομόλογος ανασυνδιασμός pa Cre * pa neo Μεταλλαγμένο γονίδιο * pa

7 Τροποποιήσεις του ευκαρυωτικού γονιδιώματος με τοποειδικό ανασυνδυασμό (site specific recombination) Το σύστημα Cre loxp 1) Cre: 38 kd ανασυνδυάση που κωδικοποιείται από τον βακτηριαφάγο P1 2) Αλληλουχία πρόσδεσης loxp: παλίνδρομη αλληλουχία 34 βάσεων, που αποτελείται από δύο ανεστραμμένες επαναλήψεις 13bp ηκάθεμία και μία κεντρική αλληλουχία 8bp όπου γίνεται το κόψιμο και η ανταλλαγή των αλυσίδων του DNA Η αλληλουχία και ο προσανατολισμός του loxp Cre Cre

8 Ανασυνδυασμός σε ειδικές αλληλουχίες DNA χωρίς συμμετοχή άλλων παραγόντων Cre Πιθανότητα εμφάνισης στο γονιδίωμα: Γονιδίωμα θηλαστικών: 3 x10 9 Flp (S. cerevisiae) 1. Κόψιμο 2. Ανταλλαγή 3. Σύνδεση

9 Εφαρμογές Έντομα Καλλιέργειες κυττάρων θηλαστικών Ποντίκι Έκφραση: Παροδική (στον προπυρήνα) Σταθερή (κυτταροειδική έκφραση Cre σε διαγονιδιακά ζώα) Αφαίρεση/ενσωμάτωση (loxp σε σειρά) Αντιστροφή (loxp σε αντίθετη φορά ) Αμοιβαία μετατόπιση μη ομόλογων χρωμοσωμάτων (loxp σε άλλα χρωμοσώματα)

10 Στοχευμένη μεταλλαξογένεση γονιδίων A loxp loxp Cre B Γονιδιακή κατασκευή Ενδογενές γονίδιο tk * neo pa Ομόλογος ανασυνδιασμός pa Cre * pa neo Μεταλλαγμένο γονίδιο * pa

12 In vivo υπό όρους γονιδιακές τροποποιήσεις ΘΝΗΣΙΓΟΝΟΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ?? Κυτταροειδικές Επαγώμενες γονιδιακές τροποποιήσεις

13 Κυτταροειδική έκφραση γονιδίων In vivo υπό όρους γονιδιακές τροποποιήσεις Cre 1 3 Cre 1 2 3

14 Κυτταροειδική απενεργοποίηση γονιδίου The 3 loxp strategy targeting vector tk neo pa mutnf locus pa HR targeted TNF locus neo pa null allele Cre (transient) pa conditional allele Tg-Cre neo null allele inactivated TNF locus

15

16 Κυτταροειδική ενεργοποίηση γονιδίου targeting vector mutnf locus tk neo HR targeted TNF locus neo Tg-Cre activated TNF locus

17 Βασικότερο πρόβλημα στην κατασκευή των Cre διαγονιδιακών οργανισμών Οι περισσότεροι υποκινητές δεν έχουν χαρακτηριστεί πλήρως και δεν είναι πλήρεις οπότε συχνά αποτυγχάνουν να δώσουν ιστοειδική έκφραση στην Cre. Η θέση ενσωμάτωσης επίσης μπορεί να οδηγήσει σε εκτοπική έκφραση. Λύση Δημιουργία knock in οργανισμών δηλαδή οργανισμών που έχουν δημιουργηθεί με γονιδιακή στόχευση ώστε η έκφραση της Cre να ελέγχεται από ένα ενδογενή υποκινητή (η Cre έχει έχει αντικαταστήσει το αντίστοιχο ενδογενές γονίδιο)

18 Πιστοποίηση της κυτταροειδικής έκφρασης της Cre Tg Cre Χ Reporter line ROSA26 LacZ gene trapping line Promoter Stop B galactosidase Ιστοειδικότητα Αποτελεσματικότητα - PCR for recombination - LacZ staining on sections - Southern blot - FACS analysis with FDG (Fluorescein digalactoside)

20 Επαγόμενες γονιδιακές τροποποιήσεις: Μετα-μεταφραστικό επίπεδο Hsp90 (Heat shock protein) Cre HBD Inactive (cytoplasm) + Ligand Hsp90 (Heat shock protein) Cre HBD Μελέτη ενός γονιδίου στο ώριμο ποντίκι Active (nucleus)

21 Επαγώμενες γονιδιακές τροποποιήσεις tet-on + τετρακυκλίνη έκφραση TSP rtta TRE γονίδιο tet-off TSP tta TRE γονίδιο

23 Εναλλακτικές τεχνολογίες αδρανοποίησης γονιδίων Νουκλεάσες δακτύλου ψευδαργύρου (Zinc finger), TALENs: κόψιμο της διπλής έλικας του DNA σε συγκεκριμένες θέσεις και είτε απομάκρυνση της περιοχής που εμπεριέχεται είτε αντικατάσταση από ξένο DNA. Τυχαία χημική μεταλλαξογένεση: εισαγωγή σημειακών μεταλλάξεων Μεταθετά στοιχεία: εισαγωγή σε τυχαίες θέσεις

24 Νουκλεάσες δακτύλου ψευδαργύρου ( zinc finger nucleases) Πρωτοπεριγράφηκαν το 1996 (Kim et al., 1996) «Μοριακά ψαλίδια», δρουν σαν τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες αλλά δεν αναγνωρίζουν παλλίδρομες αλληλουχίες και κόβουνμίαφοράστογονιδίωμα στην περιοχή που μας ενδιαφέρει. Ανάλογα με την αλληλουχία του DNA στόχου, επιλέγεται ένα συγκεκριμένο ζευγάρι ZFN που έχει σχεδιαστεί να αναγνωρίζει και να κόβει ειδικά την περιοχή αυτή. Μετά τη διάσπαση του DNA, επιλέγοντας διαφορετικούς τρόπους επιδιόρθωσης του DNA που διαθέτει ο οργανισμός, μπορεί να επιτευχθεί η επιθυμητή γονιδιωματική τροποποίηση, είτε με την επαγωγή μεταλλαγών μέσω μη ομόλογου ανασυνδυασμού (non homologous end joining, NHEJ) είτε με την εισαγωγή ενός εξωγενούς τμήματος DNA μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού (homology directed repair, HDR).

25 Δομή νουκλέασης zinc finger (ZNF) Οι ZNF αποτελούνται από: α) μια περιοχή δακτύλου ψευδαργύρου που δεσμεύεται ειδικά στο DNA, και β) την περιοχή της νουκλεάσης που προέρχεται από την FokI περιοριστική ενδονουκλεάση και διασπά μη ειδικά το DNA.

26 Αναγνώριστη αλληλουχίας στόχου από νουκλεάσες zinc finger Ένα μοτίβο δακτύλου ψευδαργύρου (ZF) αναγνωρίζει 3 νουκλεοτίδια και αποτελείται από: μια α έλικα, δύο β πτυχωτά φύλλα, και ένα μόριο ψευδαργύρου που σταθεροποιεί τη δομή Πολλαπλά μοτίβα ZF μπορούν να σχεδιαστούν έτσι καθένα να συνδέεται σε κάθε τριπλέτα. Με τον τρόπο αυτό μπορεί να συνδυαστούν αρκετά ZFs που να αναγνωρίζουν μια συγκεκριμένη αλληλουχία του DNA στόχου.

27 Κόψιμο αλληλουχίας στόχου από νουκλέαση zinc finger (ZNF) Εάν υποθέσουμε ότι θέλουμε να κόψουμε μία αλληλουχία 30 bp τότε πρέπει να: σχεδιαστεί μια ZFN που να αναγνωρίζει ειδικά τα πρώτα 12bp (4 μοτίβα ZF), και μια άλλη ZFN που να αναγνωρίζει τα τελευταία 12bp (4 μοτίβα ZF) Η κεντρική περιοχή 6 bp κόβεται από διμερή μόρια FokI νουκλεάσης (μη ειδική αναγνώριση)

28 Γονιδιωματικές τροποποιήσεις με ZNF Περίπτωση Α: επιδιόρθωσητηςδιάσπασηςτηςδιπλήςέλικας(dsb) με το σύστημα μη ομόλογου ανασυνδυασμού NHEJ (non homologous end joining) Το σύστημα μη ομόλογου ανασυνδυασμού NHEJ είναι ένας εγγενής μηχανισμός επιρρεπής σε λάθη και ο οποίος συχνά δημιουργεί εισαγωγές ή ελλείψεις μερικών ζευγών βάσεων στο προς επιδιόρθωση χρωμόσωμα προκαλώντας διαταραχή στο αναγνωστικό πλαίσιο με αποτέλεσμα συχνά την καταστροφή του γονιδίου (knockout).

29 Oμόλογος ανασυνδυασμός HDR (homology directed repair)

30 Γονιδιωματικές τροποποιήσεις με ZNF Περίπτωση Β: επιδιόρθωσητηςδιάσπασηςτηςδιπλήςέλικας(dsb) μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού HDR (homology directed repair) Το HDR σύστημα επιδιόρθωσης του DNA συμβαίνει συνήθως όταν το κύτταρο χρησιμοποιεί την αδελφή χρωματίδα ως μήτρα για να επιδιορθώσει τη διάσπαση του δίκλωνου DNA. Αντί της αδελφής χρωματίδας μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα εξωγενές μόριο DNA που να περιλαμβάνει ομόλογες περιοχές και με τις δυο πλευρές της DSB. Με το τρόπο αυτό μπορεί να επιδιορθωθούν γενετικά λάθη ή να ενσωματωθεί ένα τμήμα DNA στην περιοχή αυτή

31 Γονιδιωματικές τροποποιήσεις με ZNF

32 Πλεονεκτήματα γονιδιωματικών τροποποιήσεων με ZNF Απουσία, της τοπο ειδικής διάσπασης, το εξωγενές DNA πρέπει να περιλαμβάνει μια μεγάλη ομόλογη περιοχή περίπου 6kb με την περιοχή στόχο, ώστε να αυξηθεί η πιθανότητα να συμβεί μια σπάνια και αυθόρμητη διάσπαση στην περιοχή αυτή του γονιδιώματος επιτρέποντας έτσι την αντικατάσταση. Αντίθετα, η στρατηγική που βασίζεται στις ZFNs είναι συμβατή με σημαντικά μικρότερα κομμάτια ομόλογου DNA, όπως bp, ακόμα και 50bp σε κάθε πλευρά μπορεί να επαρκούν για τοπο ειδική ενσωμάτωση. Οι ZFNs προσδένονται στις θέσεις στόχους και προκαλούν DSB στην επιθυμητή γονιδιωματική περιοχή. Με 4 6 ZF ανά μόριο ZFN, αναγνωρίζονται βάσεις, καθιστώντας το πολύ απίθανο να υπάρχει η ίδια αλληλουχία αλλού στο γονιδίωμα. Γενετική τροποποίηση και στα 2 αλληλόμορφα.

33 Εφαρμογές Νουκλεάσης Zinc Finger Δροσόφιλα (2002) Zebrafish Βάτραχος Νηματώδης Ποντίκι, γονιδιακή θεραπεία για αιμοροφιλία Β (παράγοντας πήξης αίματος ΙΧ) (2012) Αρουραίος!!! Κουνέλι Χοίρος Βοοειδή 2011 Ανθρώπινα κύτταρα Arapidopsis thaliana Καπνός Αραβόσιτος Γενετική τροποποίηση και στα 2 αλληλόμορφα!!!

34 Συμπεράσματα Εργαλείο Λειτουργία γονιδίου Διαγονιδικά ποντίκια Knockout ποντίκια Conditional ποντίκια υπερέκφραση (ασθένεια) απώλεια έκφρασης (φυσιολογικός ρόλος) ελεγχόμενη έκφραση (κυτταροειδικά, επαγώμενη χρονικά) ENU μεταλλαγμένα ποντίκια εύρεση νέων θεραπευτικών στόχων