ιαγονιδιακή τεχνολογία G. Patrinos

Transcript

1 ιαγονιδιακή τεχνολογία

2 Αντίστροφη γενετική Οργανισμός Γονιδίωμα ιαγονίδιο Γονίδιο

3 Forward genetics Επαγόμενη Οργανισμός μεταλλαξογένεση Μεταλλαγμένος οργανισμός Εύρεση και μελέτη του υπεύθυνου γονιδίου για τον παρατηρούμενο φαινότυπο Γενετική χαρτογράφηση

4 Εφαρμογές της αντίστροφης γενετικής Παραγωγή πρωτεϊνών σε μεγάλη κλίμακα Ρύθμιση λειτουργίας (modulation-of-function): Αλλαγή κλωνοποιημένου DNA Επιπλέον λειτουργία (gain-of-function): Εκτοπική έκφραση Τροποποίηση λειτουργίας (change-of-function): Τροποποιηση ενδογενούς γονιδίου Απώλεια λειτουργίας (loss-of-function): Αδρανοποίηση ενδογενούς γονιδίου

5 Περιορισμοί των in vitro κυτταροκαλλιεργειών Οι κυτταρικές σειρές δεν μπορούν όλες να καλλιεργηθούν in vitro, Η γονιδιακή έκφραση είναι συχνά κυτταροειδική, εν είναι δυνατό να αναπαραχθούν με επιτυχία οι αλληλεπιδράσεις ενός οργανωμένου, δομικά και λειτουργικά, ιστού, Λειτουργίες όπως εμβρυογένεση, οργανογένεση, ανοσολογική απόκριση, κ.λπ. δεν μπορούν να αναπαραχθούν με επιτυχία σε συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας,

6 ιαγονιδιακή τεχνολογία Μεταφορά γονιδίου(ων) σε έναν οργανισμό (στο πρώιμο εμβρυϊκό στάδιο) και παρακολούθηση της έκφρασής του(ς) κατά την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση ιαγονιδιακά ζώα Νηματώδεις (π.χ. C. elegans), Drosophila sp., ποντίκι, επίμυς, κουνέλι, αγελάδα, πρόβατο, κατσίκα, χοίρος, κοτόπουλο, ψάρι.

7 Γιατί το ποντίκι είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο είδος στη βιοτεχνολογία Χαμηλό κόστος (περίπου 2-3 EUR/εβδομάδα) Ευκολία χειρισμών Μικρός χρόνος αναπαραγωγής (19,5 ημέρες) Μεγάλος αριθμός ομόμικτων (inbred) γενετικών σειρών (σειρές στις οποίες το 99,99% των γενετικών τόπων είναι σε ομοζυγωτία) Μεγάλος αριθμός μεταβολικών οδών και φυσιολογικών διεργασιών είναι ΟΜΟΙΟΣ με τον άνθρωπο => Μοντέλα για ανθρώπινες ασθένειες

8 Χρήσεις διαγονιδιακών ποντικών Γονιδιακή ρύθμιση Αναπτυξιακή βιολογία Ογκολογία Ανοσολογία Μοντέλα ανθρώπινων νόσων

9 ιαγονιδιακή τεχνολογία στα ποντίκια Συμβατική διαγένεση Μεταφορά με μικροένεση ενός διαγονιδίου σε γονιμοποιημένα ωοκύτταρα. Το εξωγενές DNA ενσωματώνεται ΤΥΧΑΙΑ στο γονιδίωμα του ζώου. Τα ωοκύτταρα επανεισάγονται σε μητέρατροφό, ηοποίαγεννάτην1 η διαγονιδιακή σειρά. Τα ζώα που φέρουν το διαγονίδιο αναγνωρίζονται με συμβατική γονοτύπιση (στύπωση Southern ή PCR). Εφαρμογές: Εκτοπική ή ιστο-ειδική έκφραση in vivo; Επιπλέον λειτουργία.

10 ιαγένεση (transgenesis) Αποτέλεσμα σύνθεσης μοριακής γενετικής και πειραματικής εμβρυολογίας ΣΤΑ ΙΑ Γενετική μηχανική Γενετική τροποποίηση εμβρύου

11 Μεταγραφική ρύθμιση Γονίδιο Ετεροχρωματίνη Ευχρωματίνη Ετεροχρωματίνη Υ: Υποκινητής Α: Αποσιωπητής E: Eνισχυτής P: Promoter, S: Silencer, E: Enhancer LCR: Locus Control Control Region Region

12 Τι πρέπει να λαμβάνεται υπόψην στον σχεδιασμό των διαγονιδίων Υποκινητής Ενισχυτής Εσώνια α. Αυτόλογος: Κυτταροειδική έκφραση β. Ετερόλογος: Εκτοπική έκφραση α. Αυξημένη έκφραση β. Κυτταροειδική έκφραση α. Αυτόλογα (ενδογενές γονίδιο) β. Ετερόλογα: Επαρκής παραγωγή mrna 3 άκρο α. Μη-μεταφραζόμενη περιοχή: Σταθερότητα του mrna LCR β. Αλληλουχία polya Έκφραση του διαγονιδίου ανεξάρτητα από την θέση ενσωμάτωσης του στο ενδογενές γονιδίωμα του οργανισμού.

13 Παραδείγματα διαγονιδίων

14 Το ποντίκι εργαστηρίου: Προεμφυτευτικά αναπτυξιακά στάδια From: Manipulating the mouse embryo

15 Το ποντίκι εργαστηρίου: Προεμφυτευτικά αναπτυξιακά στάδια From: Manipulating the mouse embryo

16 Ανασκόπηση συμβατικής διαγένεσης ιασταύρωση Μικροένεση DNA στον αρσενικό προπυρήνα Μικροχειρουργική μεταφορά ωοκυττάρων σε ψευδο-έγκυο θηλυκό ζώο 1η διαγονιδιακή σειρά

17 Απομόνωση γονιμοποιημένων ωοκυττάρων Μήτρα Ωοθήκες Ωαγωγός

18 Απομόνωση γονιμοποιημένων ωοκυττάρων Ωοκύτταρο

19 Απομόνωση γονιμοποιημένων ωοκυττάρων Ωαγωγός Ωοκύτταρο

20 Απομόνωση γονιμοποιημένων ωοκυττάρων Τροφικά κύτταρα Ωοκύτταρα

21 Γονιμοποιημένα ωοκύτταρα ποντικού ιαφανής ζώνη Πυρήνας Πυρηνίσκος

22 Παραγωγή συρίγγων μικροένεσης

23 Σταθμός εργασίας διαγένεσης

24 Εξαρτήματα διαγένεσης Σύριγγα μικροένεσης Πιπέττα συγκράτησης

25 Με βάση ποιό χαρακτηριστικό του διακρίνουμε τον αρσενικό από τον θηλυκό προπυρήνα και γιατί;

26 Έμβρυα σε στάδιο 2 κυττάρων

27 Εμφύτευση εμβρύων μετά από τη γονιδιακή μεταφορά

28 Εμφύτευση εμβρύων μετά από τη γονιδιακή μεταφορά

29 Εμφύτευση εμβρύων μετά από τη γονιδιακή μεταφορά

30 Χαρακτηριστικά Χρήση μικροσκοπίου με οπτική διαφορικής αντίθεσης (Nomarski optics). Μεγέθυνση: X Συνολικό κόστος εξοπλισμού: ± 200,000 EUR Μεγέθη: Ωοκύτταρο: ± 85 μm ιάμετρος αρσενικού προπυρήνα: 20 μm ιάμετροςανοίγματοςπιπέτταςμικροένεσης: 0.5 μm Όγκος μικροένεσης: 1-2 picoliters Συνολικός αριθμός μορίων DNA σε κάθε γεγονός μικροένεσης: ± 100 Περίπου 20-30% των ζώων που γεννιούνται είναι διαγονιδιακά

31 Περιορισμοί συμβατικής διαγένεσης Τυχαία ενωμάτωση Πιθανή διαταραχή της δομής ενδογενών γονιδίων, με αποτέλεσμα καρκινογένεση ή θνησιμότητα σε εμβρυϊκό στάδιο Μεταβλητό πρότυπο γονιδιακής έκφρασης, συναφές με το σημείο ενσωμάτωσης του διαγονιδίου στο ενδογενές γονιδίωμα Πολλαπλά γονιδιακά αντίγραφα Μεταβλητή γονιδιακή έκφραση