mrna mrna). mrna mrna mrna)

Transcript

1 ΡΥΘΜIΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΚΑI ΚΑΤ' ΕΠΕΚΤΑΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝIΚΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ Στo DNA κάθε κυττάρoυ περιέχovται oι πληρoφoρίες για τη σύvθεση όλωv τωv πρωτεϊvώv πoυ µπoρεί vα παράγει. Κάθε στιγµή όµως µεταγράφovται κάπoια oρισµέvα γovίδια (όχι όλα), τα oπoία στη συvέχεια µεταφράζovται ώστε vα παραχθoύv κάπoιες συγκεκριµέvες πρωτεΐvες, διεργασία πoυ γίvεται όταv τo κύτταρo έχει τη δεδoµέvη στιγµή αvάγκη απόαυτέςτιςσυγκεκριµέvεςπρωτεΐvες. (Έκφραση διαφορετικών γονιδίων σε συνάρτηση µε το χρόνο) Στα διαφoρoπoιηµέvα κύτταρα, σε πoλυκυτταρικoύς oργαvισµoύς, εvώ όλα τα κύτταρα έχoυv τo ίδιo DNA (ίδια γovίδια στo oλικό γovιδίωµα), εvτoύτoις συµβαίνει έκφραση διαφορετικών γονιδίων µόνιµα.

2 Όλα τα παραπάvω δείχvoυv ότι υπάρχει κάπoιoς µηχαvισµός µε τov oπoίo επιτυγχάvεται η µεταγραφή, κάθε φoρά, εvός oρισµέvoυ γovιδίoυ. ηλαδή, ησυχνότηταµετηνοποίαγίνεταιηροήτων πληροφοριών από το DNA προς τις πρωτεΐνες βρίσκεται υπό τον έλεγχο ρυθµιστικών µηχανισµών.

3 Οόροςρύθµισητηςέκφρασηςτωνγονιδίων (control of gene expression) αναφέρεται στη ρύθµιση της βιοσύνθεσης τωνπρωτεϊνών, δηλαδήστηρύθµισητηςροήςτηςπληροφορίαςαπότο DNAστηνπρωτεΐνη. Για τα προκαρυωτικά κύτταρα υπάρχουν πολλά στοιχεία (γιατηρύθµισητηςέκφρασηςτωνγονιδίων). Για τα ευκαρυωτικά υπάρχουν διαθέσιµα λίγα στοιχεία που δενεξηγούνταιπλήρως. Στα προκαρυωτικά κύτταρα η ρύθµιση των γονιδίων γίνεται: µέσα από τη ρύθµιση της αρχής της µεταγραφής, του τέλους της µεταγραφής και του χρόνου ηµιζωής του mrna.

4 Σταευκαρυωτικάκύτταρα, ηρύθµισηµπορείναγίνεισε 5 διαφορετικά επίπεδα: 1 ο )Ρυθµίζονταςπότεήπώςένασυγκεκριµένογονίδιο µεταγράφεται (ρύθµισηστοεπίπεδοτηςµεταγραφής). Η ρύθµιση αυτή περιλαµβάνει τη γονιδιακή ρύθµιση (gene control) ή ρύθµιση γονιδίων (control of genes) που αναφέρεται στη ρύθµιση της συχνότητας που µεταγράφονται τα δοµικά γονίδια και τηςδραστικότηταςτωνδοµικώνγονιδίων. Ο όρος ρύθµιση της δραστικότητας των γονιδίων (control of gene activity) αναφέρεται στη ρύθµιση της µεταγραφής του DNA προς RNA, δηλαδή στη ρύθµισητηςροήςτηςπληροφορίαςαπότο DNA προς RNA.

5 2 ο )Ρυθµίζονταςτηδιαδικασίατης µεταγραφής. 3 ο )Επιλέγονταςποιααπόταώριµα mrna στον πυρήνα του κυττάρου θα απελευθερωθούν στο κυτόπλασµα (ρύθµιση στο επίπεδο της µεταφοράς του mrna). 4 ο )Επιλέγονταςποιααπότα mrnaτουκυτοπλάσµατοςθα µεταφερθούν στα ριβοσώµατα (ρύθµιση στο επίπεδο της µετάφρασης) ή 5 ο )Επιλέγονταςνασταθεροποιήσεισυγκεκριµένα mrnaτου κυτοπλάσµατος (ρύθµιση της αποικοδόµησης του mrna)

6 1 ο ) ΡΥΘΜΙΣΗΣΤΟΕΠΙΠΕ ΟΤΗΣΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ Η σηµασία της γονιδιακής ρύθµισης είναι µεγάλη και µερικά από τα αποτελέσµατά της φαίνονται και στο ακόλουθο πείραµα. Έστωένα φυσιολογικό βακτήριο στο οποίο δεν έχει καταστραφεί η ρύθµιση της βιοσύνθεσης ενός αµινοξέος (έστω της Try).

7 (1ο ) ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ) Έστω ένα άλλο βακτήριο στο οποίο έχει καταστραφεί αυτή η δυνατότητα ρύθµισης, ώστε να µην µπορεί να σταµατήσει τη βιοσύνθεση της Try όταν διαθέτει επαρκήποσότητα Try.

8 (1ο ) ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ) Επώαση των βακτηρίων σε θρεπτικόµέσοµε Try, δείχνειότιη ανάπτυξη του βακτηρίου που διαθέτει τη δυνατότητα ρύθµισης της Try, είναι πολύ µεγαλύτερη από εκείνη που δε διαθέτει αυτή τηνικανότηταρύθµισης.

9 (1ο ) ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ) Μετοπείραµααυτόφαίνεταιότι η λίγη, έστω, ενέργεια που εξοικονοµείται στην πρώτηκαλλιέργεια, είναι αρκετή για να επιδράσει στην ανάπτυξη τουβακτηρίου. Εποµένωςανηρύθµισηενόςµόνογονιδίου (της Try) έχει τόσο εµφανή αποτελέσµατα, µπορεί κανείς κατ επέκταση να αντιληφθεί τη σηµασία της ρύθµισης όλων των γονιδίων.

10 Οπερόνιο (operon) Σύµφωνα µε τον ορισµό των Jacob Monod είναι µια συνάθροιση ή συσσώρευση λειτουργικά αλληλοσχετιζόµενων γονιδίων που ρυθµίζονται και µεταγράφονται σα µια µονάδα µεταγραφής (transcription unit) προς ένα πολυκιστρονικό mrna.

11 (Οπερόνιο) Οι πληροφορίες για τη βιοσύνθεση κάθε πολυπεπτιδίου (ενζύµου κ.λπ.) περιέχονται σε µια λειτουργική µονάδα του DNA που λέγεται κιστρόνιο. Στα προκαρυωτικά, το mrna που µεταγράφεται περιέχει τις πληροφορίες από τα δοµικά γονίδια για όλες τις πρωτεΐνες που περιλαµβάνονται σε ένα οπερόνιο, δηλαδή το mrna είναιπολυκιστρονικό. Στα ευκαρυωτικά και µάλιστα στα θηλαστικά, έχουν βρεθεί µόνοµονοκιστρονικά mrna.

12 Κάθε οπερόνιο αποτελείται από : Τα δοµικά γονίδια (structure genes) που κωδικοποιούν συνήθωςτηβιοσύνθεσηόλωvτωvεvζύµωvεvός πoλυεvζυµικoύ συστήµατoς ή µιας πλήρoυς πoρείας απoικoδόµησης ή βιoσύvθεσης µιας έvωσης. Μια περιοχή σύνδεσης της πολυµεράσης του RNA στην αρχή της σειράς των δοµικών γονιδίων που λέγεται υποκινητής (promoter site).

13 (Κάθε οπερόνιο αποτελείται από ) Μιαήδύοπεριοχέςελέγχουτηςσύνδεσηςκαιτης δραστικότητας της πολυµεράσης του RNA (που ρυθµίζουν τη συχνότηταµεταγραφής). Η µια περιοχή ονοµάζεται χειριστής (operator) ή γovίδια χειριστές (operator genes) ήσυvτovίζovτα (κατευθύvovτα) γovίδια (ή operator loci ή Ο loci). Ο χειριστής είναι η περιοχή που συνδέεται κάποιος ειδικός πρωτεϊνικός παράγοντας, ο οποίος λέγεται καταστολέας (repressor) και ο οποίος, όταν συνδεθεί µε τοχειριστή, δενεπιτρέπειτηνµεταγραφή.

14 Ηάλληπεριοχήελέγχουτηςσύνδεσηςκαιτης δραστικότητας της πολυµεράσης του RNA (που ρυθµίζουν τη συχνότητα µεταγραφής): Λέγεται εκκινητής (initiator ή initiator gene) ή περιοχή σύνδεσης µε τον ενεργοποιητή (positive activator gene) Οεκκινητήςείναιηπεριοχήπουότανσυνδεθείµε κάποιοειδικόπρωτεϊνικόπαράγοντα (ενεργοποιητή) ευνοείται η σύνδεση της πολυµεράσης του RNA στον υποκινητή. Η βιοσύνθεση του καταστολέα και του ενεργοποιητή κατευθύνεταιαπόταρυθµιστικάγονίδια (regulator genes) που συνήθως δεν ανήκουν στο οπερόνιο, αλλά βρίσκονται σεάλληθέσητουµορίουτου DNA.

15 Στον όρο υποκινητής συνήθως περιλαµβάνονται και οι γειτονικές περιοχές που συµβάλλουν σ αυτό, δηλαδή και ο εκκινητής. Η περιοχή του υποκινητή που δεν περιλαµβάνει τον εκκινητή λέγεται βασικός υποκινητής (basic promoter) και περιλαµβάνει τρεις ειδικές περιοχές: Την Rσ, µια ειδική αλληλουχία αναγνώρισης από τον παράγοντα σ. Ο υποκινητή που δεν περιλαµβάνει τον εκκινητή λέγεται βασικός υποκινητής (basic promoter) και περιλαµβάνει τρεις ειδικές περιοχές: Μιαπεριοχή R C, σεµιααπόστασηκάποιωνβάσεωναπό την Rσ, που είναι ειδική αλληλουχία αναγνώρισης από τονπυρήνα (core) τηςπολυµεράσηςτου RNA.

16 Ο υποκινητή που δεν περιλαµβάνει τον εκκινητή λέγεται βασικός υποκινητής (basic promoter) και περιλαµβάνει τρεις ειδικές περιοχές: ΜιαπεριοχήΙπουείναιτοσηµείοέναρξης (initiation) της µεταγραφής. Οεκκινητήςβρίσκεταιπάντοτεδίπλαστονπαράγοντασ, χωρίς επικάλυψη µε το βασικό υποκινητή. Ορόλοςτουενεργοποιητήείναινααυξάνειτησυγγένειατης πολυµεράσης µε το DNA, ισχυροποιώντας το δεσµό και πρέπει να είναι κοντά, ώστε να µπορεί να εξασκεί επιδράσεις αλλοστερικού τύπου, χωρίς να παρεµβάλλεται ανάµεσα στο βασικό υποκινητή και τα δοµικά γονίδια.

17 Ο χειριστής µπορεί να παρεµβάλλεται ανάµεσα στον υποκινητή και τα δοµικά γονίδια, εµποδίζοντας έτσι την πολυµεράσηναπροχωρήσει. Μπορεί ακόµα να υπάρχει και αλληλεπικάλυψη των περιοχών του χειριστή και του βασικού υποκινητή, µε αποτέλεσµα να είναι αδύνατος ακόµα και αυτός ο σχηµατισµόςτουσυµπλόκου DNA-πολυµεράσηςτου RNA (ότανέχειπροηγηθείησύνδεσητουκαταστολέαµετο DNA στηνπεριοχήτουχειριστή).

18 Ο µη σχηµατισµός του συµπλόκου DNA-πολυµεράσης του RNA, δηµιουργεί µια άλλη δυνατότητα που µοιάζει µε την ανταγωνιστικήαναστολή. Ανδηλαδήησυγγένειατηςπολυµεράσηςτου DNA καιτου καταστολέα είναι συγκρίσιµες, η πολυµεράση έχει πιθανότητες να εκτοπίσει τον καταστολέα σύµφωνα µε τους νόµους της κινητικής και να µπορέσει να κάνει µεταγραφή, αλλάµεµικρότερηδραστικότητα. Ηεκτόπισηαυτήτουκαταστολέαδενθαήταντόσοεύκολη, αν η πολυµεράση συναντούσε στο δρόµο της τον καταστολέα, γιατί τότε δεν θα υπήρχαν οι παράγοντες που ισχυροποιούν τη σύνδεση της πολυµεράσης µε τον υποκινητή, δηλαδήηπεριοχή R C, οπαράγονταςσκαιο τυχόν ενεργοποιητής.

19 βαλβίδα κλειστή από φυσικού της που ανοίγει όταν συνδεθεί µε τον ενεργοποιητή βαλβίδα ανοιχτή από φυσικού της που κλείνει και µπλοκάρει τη δίοδο της πολυµεράσης, όταν συνδεθεί µε τον καταστολέα Συµπερασµατικά, οι δύο ελεγκτικές περιοχές του οπερονίου (εκκινητής και χειριστής) µπορούν να παροµοιωθούν µε δύο βαλβίδες. Ο εκκινητής είναι µια βαλβίδα κλειστή από φυσικού της που ανοίγει όταν συνδεθεί µε τον ενεργοποιητή, ενώ Ο χειριστής είναι µια βαλβίδα ανοιχτή από φυσικού της που κλείνει και µπλοκάρει τη δίοδο της πολυµεράσης, όταν συνδεθεί µε τον καταστολέα.

20 Το κλείσιµο ή άνοιγµα της βαλβίδας (στον εκκινητή και χειριστή) γίνεται µε τη συνεργασία µιας ρυθµιστικής πρωτεΐνης (ενεργοποιητή ή καταστολέα) και ενός µικρού µορίου. ηλαδή, οι ρυθµιστικές αυτές πρωτεΐνες έχουν διπλή λειτουργικότητα. Συνδέονται µε ειδικές περιοχές του DNA, Συνδέονται µε µικρά µόρια τα οποία ασκούν αλλοστερικές επιδράσεις και αλλάζουν τη διαµόρφωση των ρυθµιστικών πρωτεϊνών. Κατά συνέπεια αν και οι ρυθµιστικές πρωτεΐνες που δρουν στο χειριστή λέγονται καταστολείς, µπορούν να προκαλούν και καταστολή αλλά καιεπαγωγή, όπως φαίνεται και από τα ακόλουθα παραδείγµατα.

21 ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΕ ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΑ ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ (Η ρυθµιστική πρωτεϊνη βιοσυντίθεται δραστική) Καταβολικές πορείες. Μικρές απαιτήσεις για έκφραση. Σπάνεια το υπόστρωµαεπαγωγέας βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις. ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΕ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ ΚΑΤΑΣΤΟΛΗ ΜΕ ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΑ ΚΑΤΑΣΤΟΛΗ ΜΕ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ ΘΕΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ (Η ρυθµιστική πρωτεϊνη βιοσυντιθεται µη δραστική) ΘΕΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Καταβολικές πορείες. Μεγάλες απαιτήσεις για έκφραση. Συχνά το υπόστρωµαεπαγωγέας βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις. Βιοσυνθετικές πορείες. Μικρές απαιτήσεις για έκφραση. Συχνά τα προϊόντα βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις. Βιοσυνθετικές πορείες. Μεγάλες απαιτήσεις για έκφραση. Σπάνια τα προϊόντα βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις.

22 Έστω µια καταβολική πορεία, όπου το υπόστρωµα ανήκει στην τάξη των µικρών µορίων που ασκούν αλλοστερικές επιδράσεις στις ρυθµιστικές πρωτεΐνες. Το υπόστρωµα µπορεί να δρα σαν επαγωγέας και όταν συνδεθεί µε τον καταστολέα να τον τροποποιεί, ώστε ο καταστολέαςναµηνµπορείνασυνδεθείµετοχειριστήγιανα παρεµποδίσει τη µεταγραφή και έτσι να επάγεται η πορεία (επαγωγή µε καταστολέα, αρνητικός έλεγχος).

23 Έστω µια καταβολική πορεία, όπου το υπόστρωµα δρα και πάλισανεπαγωγέας. Όταν το υπόστρωµα συνδεθεί µε τον ενεργοποιητή να τον τροποποιεί ώστε να γίνεται δυνατή η σύνδεση του ενεργοποιητή µε τον εκκινητή και έτσι να γίνεται µεταγραφή και να επάγεται η πορεία (επαγωγή µε ενεργοποιητή, θετικός έλεγχος).

24 Έστω µια βιοσυνθετική πορεία που το τελικό προϊόν ανήκει στην τάξη των µικρών µορίων που ασκούν αλλοστερικές επιδράσεις στις ρυθµιστικές πρωτεΐνες. Το προϊόν µπορεί να δρα σα συν-καταστολέας, δηλαδή όταν συνδεθεί µε τον καταστολέα (που στην περίπτωση λέγεται απο-καταστολέας) να τον τροποποιεί ώστε να γίνεται δυνατήησύνδεσητουκαταστολέαµετοχειριστήκαινα παρεµποδίζεται η µεταγραφή, µε αποτέλεσµα να καταστέλλεται η πορεία (καταστολή µε καταστολέα, θετικός έλεγχος).

25 Έστω µια βιοσυνθετική πορεία που το τελικό προϊόν ανήκει στην τάξη των µικρών µορίων που ασκούν αλλοστερικές επιδράσεις στις ρυθµιστικές πρωτεΐνες. Το προϊόν δρα και πάλι σα συν-καταστολέας, δηλαδή όταν συνδεθεί µε τον ενεργοποιητή να τον τροποποιεί ώστε να µη γίνεται δυνατή η σύνδεση του ενεργοποιητή µε τον εκκινητή και έτσι να µην γίνεται µεταγραφή και να καταστέλλεται η πορεία (καταστολή µε ενεργοποιητή, αρνητικός έλεγχος).

26 ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΕ ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΑ (Η ρυθµιστική πρωτεΐνη βιοσυντιθεται δραστικη ) Κατανολικές πορείες Μικρές απαιτήσεις για έκφραση Σπάνια το υπόστρωµα-επαγωγέας βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις. ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΕ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ (Η ρυθµιστική πρωτεϊνη βιοσυντιθεται µη δραστική) Καταβολικές πορείες. Μεγάλες απαιτήσεις για έκφραση. Συχνά το υπόστρωµα-επαγωγέας βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις. ΚΑΤΑΣΤΟΛΗ ΜΕ ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΑ Βιοσυνθετικές πορείες. Μικρές απαιτήσεις για έκφραση. Συχνά τα προϊόντα βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις. ΚΑΤΑΣΤΟΛΗ ΜΕ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ Βιοσυνθετικές πορείες. Μεγάλες απαιτήσεις για έκφραση. Σπάνια τα προϊόντα βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις. ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΘΕΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΘΕΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ

27 ηλαδή στις καταβολικές πορείες συµβαίνουν τα αντίστροφα απ όσα ισχύουν για τις βιοσυνθετικές πορείες. Συµπερασµατικά: Ο καταστολέας χρησιµοποιείται όταν οι απαιτήσεις έκφρασης των γονιδίων είναι µικρές, ενώ Ο ενεργοποιητής όταν οι απαιτήσεις έκφρασης των γονιδίων είναι µεγάλες.

28 Η θεωρία τoυ oπερόvιoυ εξηγεί και τη δράση σχεδόv όλωv τωvστερoειδώv oρµovώvστoυςαvώτερoυς oργαvισµoύς. ηλαδή, oι oρµόvες είτε είvαι καταστoλείς ή συv-καταστoλείς εvός (ή περισσότερωv) oπερόvιωv, είτεείvαιεπαγωγείς. Βέβαια, επαγωγείς και καταστoλείς µπoρεί vα είvαι και διάφoρoι µεταβoλίτες ή και φάρµακα. Στα πρoκαρυωτικά κύτταρα, η πρώτη περίπτωση τέτoιoυ ελέγχoυ µελετήθηκε από τoυς Monod και Jacob στηv E.coli και απoτέλεσε τη "θεωρία τoυ oπερόvιoυ", πoυ είvαι έvας µηχαvισµός εvζυµικής επαγωγής και καταστoλής.

29 Η E.coli χρησιµoπoιεί τη γλυκόζη σαv πηγή τoυ αvθρακικoύ σκελετoύόλωvτωvσυστατικώvτης. Αv όµως βρεθεί σε περιβάλλov πoυ αvτί γλυκόζης έχει λακτόζη, τότε για vα τηv αξιoπoιήσει σαv πηγή ατόµωv άvθρακαπαράγειτρία vέαέvζυµα, πoυπρoϋπήρχαvµεv, αλλά σε ίχvη: β-γαλακτoζιδάση (για τηv υδρόλυση της λακτόζης σε µovoσακχαρίτες), µια περµεάση (πoυ καταλύει τη µεταφoρά της γαλακτόζης µέσα στo κύτταρo) και µιατραvσακετυλάση (µεαδιευκρίvιστορόλo). ηλαδή, η βιoσύvθεση τωv τριώv εvζύµωv επάγεται από τη λακτόζη, πoυ δρα σαv επαγωγέας. Στηv πραγµατικότητα, επαγωγέας είvαι η αλλoλακτόζη (πoυ έχει γλυκoζιτικό δεσµό 1-6 και πρoκύπτει από τη λακτόζη) και ταίχvηβ-γαλακτoζιδάσης,πoυόπωςαvαφέρθηκε, πρoϋπάρχoυvστoκύτταρo.

30 Ο µηχαvισµός της "θεωρίας τoυ oπερόvιoυ", για την περίπτωση της εvζυµικής επαγωγής, που είvαι γvωστός σα συvτovισµέvη επαγωγή, είvαι o εξής: Τo oπερόvιo της E.coli για τη χρησιµoπoίηση της λακτόζης λέγεται lac operon. Τα δoµικά γovίδια που περιέχoυv τov κώδικα για τo σχηµατισµό τωv εvζύµωvείναι η z περιoχή (z locus) που κωδικoπoιεί τη β-γαλακτoζιδάση η y περιoχή (y locus) που κωδικoπoιεί τηv περµεάση και η a περιoχή (a locus) που κωδικoπoιεί τηv τραvσακετυλάση.

31 Όταvυπάρχειδιαθέσιµoς o επαγωγέας (πoυ είvαι τo υπόστρωµα, δηλαδήηλακτόζη) σχηµατίζεται σύµπλoκo µε τov καταστoλέα, πoυ δεv µπoρεί πια vα είvαι δεσµευµέvoς στο χειριστή (αδραvoπoιηµέvoς καταστoλέας). Έτσι πρoχωρά η πoλυµεράση τoυ RNA στη µεταγραφή τoυ DNA, παράγοvταςτo mrna, πουµεταφραζόµεvo, βιoσυvθέτει τα (τρία) έvζυµα (άρση της καταστoλής)

32 Τα έvζυµα αυτά, στη συvέχεια: 1 ο )Είτεαπoικoδoµoύvτov επαγωγέα (1ηπερίπτωση), oπότε λόγω ελάττωσης της συγκέvτρωσηςτoυεπαγωγέα, επαvεvεργoπoιείται o καταστoλέας. 2 ο )Είτε (2ηπερίπτωση) τα πρoϊόvτα απoικoδόµησης τoυ επαγωγέαεκτoπίζoυvτovεπαγωγέααπότovαδραvoπoιηµέvo κατάστoλέα και τo vέo σύµπλoκo τoυ καταστoλέα πoυ πρoκύπτει (µη αδραvoπoιηµέvoυ καταστoλέα) δεv είvαι πλέovαδραvές. Και στις δύo αυτές περιπτώσεις, o καταστoλέας επαvεvεργoπoιείται και διακόπτεται η περαιτέρω βιoσύvθεση τωv εvζύµωv. Αφού ο καταστολέας είναι µη δραστικός και γίνεται δραστικόςέχουµεθετικόέλεγχο (positive control).

33 Ο µηχαvισµός της "θεωρίας τoυ oπερόvιoυ", για την περίπτωση της εvζυµικής καταστoλής, που είvαι γvωστός σα συvτovισµέvη καταστoλής, είvαι o εξής: Τoαvτίστoιχo oπερόvιo (στησυvτovισµέvηκαταστoλής ) µεταγράφεται σε mrna, πoυ µεταφραζόµεvo, παράγει βιoσυvθετικά έvζυµα πoυ φέρoυv σε πέρας µια βιoσυvθετική πoρεία (γιαπαράδειγµατηςιστιδίνης).

34 Τo τελικό πρoϊόv της βιoσυvθετικής αυτής πoρείας, ηιστιδίνηπουείναι o συvκατάστoλέας δρα σαv πρoσθετική oµάδα. Έτσι µετατρέπεται ο µη δραστικός καταστoλέας (απoκαταστoλέας) σε δραστικό καταστoλέα, και διακόπτεται η µεταγραφή. Η συvτovισµέvη καταστoλή ισχύει, κατά καvόvα, για περιπτώσεις εvζυµικής καταστoλής και ρυθµίζει τηv παραγωγή εvζύµωv πoυ καταλύoυv βιoσυvθετικές πoρείες. Γιατί στις περιπτώσεις αυτές παρoυσιάζεται η αvάγκη vα υπάρξει έvας µηχαvισµός πoυ vα διακόπτει τηv παραγωγή βιoσυvθετικώv εvζύµωv, όταv η συγκέvτρωση τoυ τελικoύ πρoϊόvτoς αυξηθεί.

35 Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, αv και δεv είvαι γvωστά πoλλά πράγµατα, η ρύθµιση θα πρέπει vα γίvεται µε αvτίστoιχoυς µηχαvισµoύς, µόvoπoυπιστεύεταιότιείvαιπιoπoλύπλoκoι, αφoύ η έκφραση τωv γovιδίωv ρυθµίζεται από έvα oλόκληρo συvδυασµό µηχαvισµώv συvτovισµέvης επαγωγής και καταστoλής. Άλληδιαφoράέγκειταιστoεξής: Ηπρόσδεσητoυ καταστoλέα στα ευκαρυωτικά γίvεται, συvήθως, σε περιoχή τoυ DNA περισσότερo απoµακρυσµέvη από τηv πoλυµεράση τoυ RNA. Και τoύτo γιατί η αλυσίδα τoυ DNA µπoρεί vα σχηµατίζει δακτύλιoυςκαιέτσιστoχώρoηπεριoχήαυτήµπoρεί vα βρίσκεται πoλύ κovτά και µάλιστα αvάµεσα στoν υποκινητή και τα δoµικά γovίδια.

36 Πολυσθενής καταστολή Παρουσιάζεται σε βιοσυνθετικές πορείες οι οποίες καταλήγουν σε δύο προϊόντα, όπως η πορεία βιοσύνθεσης της Valκαι Ile.

37 Τα προϊόντα αυτά δρουν σαν συν-καταστολείς, οι οποίοι όταν συνδεθούν µε µη δραστική µορφή του καταστολέα (που στηνσυγκεκριµένηπερίπτωσηλέγεταιαπο-καταστολέας) τουαλλάζουντηδοµήκαιτονκάνουνικανόνασυνδεθείµετο χειριστή, µε αποτέλεσµα να σταµατήσει η µεταγραφή. Λέγεται πολυσθενής καταστολή, γιατί υπάρχουν περισσότεροι του ενός συν-καταστολείς. Όταν τα σύµπλοκα του απο-καταστολέα και καθ ενός από τους συν-καταστολείς προκαλούν µερική καταστολή, πρόκειται για πολυσθενή καταστολή Όταν το τριπλό σύµπλοκο του απο-καταστολέα και των δύο συν-καταστολέων προκαλεί ολική καταστολή (όπως συµβαίνειστησυνθάσητουκαρβαµυλο-φωσφο-ρικούοξέος), πρόκειται για πολυσθενή και αθροιστική καταστολή.

38 Ρεγγουλόνιο Οι ονοµασίες που χρησιµοποιούνται είναι ρεγγουλόνιο (regulon) ή ρυθµιστρόνιο ή µονάδα ρύθµισης (unit of regulation) γονιδίων ή µονάδα συντονισµένης ρύθµισης γονιδίων, που δεν είναι συναθροισµένα το ένα δίπλα στο άλλο. Έχειταίδιαχαρακτηριστικά µε το οπερόνιο µετηδιαφοράότιτα δοµικά γονίδια βρίσκονται µόνατουςή καθ οµάδες σεδιαφορετικάσηµείατου DNA. Στην αρχή κάθε οµάδας δοµικών γονιδίων υπάρχει η περιοχή υποκινητής χειριστής µε την ίδια αλληλουχία βάσεων DNA, οπότε η έκφραση ρυθµίζεται από το ίδιο ρυθµιστικό γονίδιο, δηλαδήαπότονίδιοκαταστολέα.

39 Έχει σηµασία για τους ανώτερους οργανισµούς που χρειάζονται συντονισµένη ρύθµιση διαφόρων γονιδίων που όµως δεν έχουν ακόµα αποτελέσει οπερόνιο. Ένα παραδειγµα ρεγγουλόνιου συναντάται στην πορεία βιοσύνθεσηςτηςαργινίνης, ηοποίαέχει 8 διαδοχικάστάδια. Στα βακτήρια τα γονίδια των 8 ενζύµων είναι διασπαρµένα σε διάφορα σηµεία, αλλά ρυθµίζονται από τον ίδιο καταστολέα, αφού όλα έχουν το ίδιο ρυθµιστικό γονίδιο.

40 ΑΥΤΟΝΟΜΗ ΡΥΘΜΙΣΗ Αποτελεί µια άλλη περίπτωση ρύθµισης των γονιδίωνκαιδιακρίνεται: 1) Στην αυτόνοµη καταστολή και 2) Στηναυτόνοµηεπαγωγή.

41 ΑΥΤΟΝΟΜΗ ΡΥΘΜΙΣΗ 1) Αυτόνοµη καταστολή: Η µεταβολική πορεία καταλήγει σε δύο προϊόντα (συνκαταστολείς) και το ένζυµο της πρώτης αντίδρασης αποτελεί καταστολέα (απο-καταστολέα), ο οποίος µπορεί να συνδεθεί µε το χειριστή µόνο όταν έχει τροποποιηθεί η δοµή του από τη σύνδεσή του µε τους συν-καταστολείς. Σαρυθµιστικόγονίδιοδρατοπρώτοδοµικόγονίδιο, ενώ τα άλλα δοµικά γονίδια κωδικοποιούν τα άλλα ένζυµα τηςπορείας. Το σύστηµα αυτό έχει αυτόνοµη ρύθµιση γιατί όταν υπάρχει διαθέσιµο µόνο το υπόστρωµα τόσο η µεταβολική πορεία όσοκαιηµεταγραφή µπορούν απρόσκοπτα να προχωρούν.

42 ΑΥΤΟΝΟΜΗ ΡΥΘΜΙΣΗ 1) Αυτόνοµηκαταστολή: Όταν σχηµατισθούν τα προϊόντα της αντίδρασης δενείναιδιαθέσιµοτοένζυµοτηςπρώτηςαντίδρασης, δεσµεύεται στο χειριστή ο καταστολέας (το σύµπλοκο ενζύµου και προϊόντων) και παρεµποδίζεται η µεταγραφή (αυτόνοµη καταστολή).

43 (ΑΥΤΟΝΟΜΗ ΡΥΘΜΙΣΗ 1) Αυτόνοµηκαταστολή) 2) Αυτόνοµηεπαγωγή. Μεταβολική πορεία στην οποία το ένζυµο της πρώτης αντίδρασης αποτελεί καικαταστολέαπουσυνδέεταιµετοχειριστή, µόνο όταν δεν έχει δεσµεύσει το υπόστρω- µα το οποίο στην συγκεκριµένη περίπτωση δρα σαν επαγωγέας Σαρυθµιστικόγονίδιοδρατοπρώτοδοµικόγονίδιο, ενώτα άλλα δοµικά γονίδια κωδικοποιούν τα άλλα ένζυµα της πορείας. Έχει αυτόνοµη ρύθµιση γιατί Α) παρουσία του υποστρώµατος τόσο η µεταβολική πορεία όσο και η µεταγραφή µπορούν απρόσκοπτα να προχωρούν. Β) όταν εξαντληθεί το υπόστρωµα της αντίδρασης δενείναιδιαθέσιµοτοένζυµοτηςπρώτηςαντίδρασης, δεσµεύεται στο χειριστή ο καταστολέας (το ένζυµο) και παρεµποδίζεται η µεταγραφή.

44 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ Η επέκταση των µηχανισµών λειτουργίας των ρεγγουλόνιων οδηγεί σε συστήµατα οµαδικής ρύθµισης πολλών οπερόνιων ταυτόχρονα µε αποτέλεσµα την ολοκλήρωση της µεταβολικής ρύθµισης (integration of regulatory mechanisms). Τα οπερόνια και ρεγγουλόνια παρέχουν στον οργανισµό τη δυνατότητα εξειδικευµένης απόκρισης σε περιβαλλοντικές αλλαγές. Τα ολοκληρωµένα ρυθµιστικά συστήµατα επιτρέπουν το συντονισµό µιας ολόκληρης σειράς αποκρίσεων, που όµως σχετίζονται λειτουργικά. Υπάρχουν δύο τουλάχιστον τέτοια συστήµατα, γνωστά σαν 1) Καταστολήκαταβολιτών (catabolite repression) και 2) Αυστηρόςήκαταπιεστικόςέλεγχος (stringent control, stringency).

45 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολήκαταβολιτών: Μια οµάδα οπερόνιων, που σχετίζονταιλειτουργι-κά, έχουνθετικόέλεγχο: Α) Με το ίδιο πρωτεϊνικό µόριο, το CAP (Catabolite ή Repressor Protein) ήπιο σωστά, στην πραγµατικό-τητα πρόκειται για ενεργοποιητή (Catabolite-gene Activator Protein). Β) Τον ίδιο επαγωγέα, που στην προκειµένη περίπτωση είναι το camp.

46 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών: Το CAP- camp συνδέεται µε τον εκκινητή πολλών οπερόνιων που όλα ρυθµίζουν καταβολικές πορείες(είναι ένας πλειοτροπικόςρυθµιστής). Καθένααπόταοπερόνιαπουελέγχονταιαπότο CAPcAMP µπορεί να εκφρασθεί, αλλά αυτό εξαρτάται και από ένα δεύτερο ρυθµιστικό µηχανισµό που χρησιµοποιεί το χειριστή. Στο ρυθµιστικό αυτό µηχανισµό συµµετέχει και το ειδικό για κάθε οπερόνιο (καταβολικό) υπόστρωµα, που συνδέεται µε τον καταστολέα και το µετατρέπει σε ανενεργή µορφή, µε αρνητική ρύθµιση.

47 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών: Παράδειγµα τέτοιας ρύθµισης συναντάται στα βακτήρια, όταν υπάρχει διαθέσιµη για αποικοδόµηση γλυκόζη, λακτόζη και αραβινόζη. Στο DNA υπάρχουν οπερόνια για τη γλυκόζη, λακτόζη και αραβινόζη, που κάθε ένα διαθέτει έναν εκκινητή και ένα χειριστή. Στον κάθε εκκινητή συνδέεται το CAP- camp, αλλά µε διαφορετικήχηµικήσυγγένειαγιατονκαθένα. Ο καταστολέας (διαφορετικός για κάθε οπερόνιο) υπάρχει σε δραστική µορφή και είναι συνδεδεµένος µε το χειριστή κάθεοπερονίουκαιπαρεµποδίζεταιηµεταγραφή.

48 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών: Όταν υπάρχουν διαθέσιµα µόρια γλυκόζης ή/και λακτόζης ή/και αραβινόζης τότε αυτά δεσµεύουν τον αντίστοιχο καταστολέα, τον κάνουν µη δραστικό µε αποτέλεσµα να αποµακρύνεται από το χειριστήκαιέτσιναείναιδυνατήηµεταγραφή. Συγκεκριµένα για τα βακτήρια, όταν υπάρχει διαθέσιµη γλυκόζη, τοεπίπεδοτου campδιατηρείταιχαµηλό. Ότανλείψειηγλυκόζηανεβαίνειησυγκέντρωσητου camp, σχηµατίζεται το CAP- camp και συνδέεται στις θέσεις των εκκινητών, αλλά δεν αρχίζει η µεταγραφή, γιατί υπάρχουν τα µόριατουκαταστολέασυνδεδεµέναστιςθέσειςτουχειριστή.

49 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών: Αν στο περιβάλλον υπάρχει λακτόζη, αυτή σχηµατίζει ανενεργό σύµπλοκο µε τον αντίστοιχο καταστολέα και έτσι επιτρέπειτηλειτουργίατου Lac-operon. Αν διατίθεται αραβινόζη, τότε ενεργοποιείται µε τον ίδιο τρόπο το Ara-operon. Αντίστοιχακαιγιατηγλυκόζη. Ανδιατίθενταικαιτατρίασάκχαραήσυνδυασµοίαυτών, τότε αποικοδοµείται η γλυκόζη, µετά η λακτόζη και τέλος η αραβινόζη.

50 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών: Η σειρά αυτή λόγω διαφοράς ευαισθησίας των δια-φόρων οπερόνιων στο CAP- camp, από τη διαφορετική χηµική συγγένεια του CAP- camp προς τους εκκινητήρες των τριών οπερόνιων. Το CAP- camp έχει µεγαλύτερη συγγένεια για το οπερόνιο της γλυκόζης, µετά της λακτόζης και τέλος αραβινόζης, µε αποτέλεσµα να ενεργοποιεί ανάλογα και τα αντίστοιχα οπερόνια.

51 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών: Ο µηχανισµός αυτός επιτρέπει στους οργανισµούς να διαλέγουντηδίαιτάτους, όταντοδιαιτολόγιοείναιµεγάλο. Σε συνδυασµό µε την χηµειοταξία (την ικανότητα των κυττάρων να οδεύουν προς κάποιες ουσίες) που και αυτή υπόκειται στο µηχανισµό της καταστολής των καταβολιτών ταβακτήριαδεδιαλέγουνµόνοτηντροφήτουςαπότη διαθέσιµη στο άµεσο περιβάλλον τους αλλά συνδυάζουν αυτή την επιλογή µε µετακίνηση σε άλλο περιβάλλον, πιο επιθυµητό από αυτά, όταν το περιβάλλον αυτό υπάρχει εκεί κοντά.

52 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών 2) Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Αντιστοιχεί στην έκφραση σφίξιµο του ζωναριού ή περίοδος ισχνών αγελάδων. Πρόκειται για: µηχανισµό συντονισµένου ελέγχου µιας οµάδας οπερόνιων, που σχετίζονται λειτουργικά (όπως στην προηγούµενη περίπτωση), αλλάσεπολύπιογενικόβαθµό, οοποίοςµεταξύτων άλλων περιλαµβάνει: αρνητική ρύθµιση και θετική ρύθµιση

53 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών 2) Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Αρνητική ρύθµιση: στη βιοσύνθεση rrna των ριβοσωµικών πρωτεϊνών (δηλαδή περιορισµός αριθµούριβοσωµάτων) trnaκαι Θετική ρύθµιση: ορισµένων βιοσυνθετικών οπερόνιων αµινοξέων (His,Try, Ile, Val) ή/και καταβολικών οπερόνιων (Lac-operon), και επίδραση στη διαπερατότητα των µεµβρανών στηβιοσύνθεσηλιποπολυσακχαριτώνκ.λπ.

54 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών 2) Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Στο πλειοτροπικό αυτό αποτέλεσµα το ρόλο του επαγωγέα παίζουν δύο µόρια-σήµατα η τετρα-φωσφορική γουανοσίνη (ppgpp) και η πεντα-φωσφορική γουανοσίνη (pppgpp), οι οποίες όταν πρωτοανακαλύφθηκαν από τον O.Maaloe µε χαρτοηλεκτροφόρησηονοµάστηκανµαγικέςκηλίδεςικαιιι. Το ppgpp είναι ένα παράδειγµα του ειδικού εκείνου τύπου των µορίων-σηµάτων, για τα οποία ο Ames πρότεινε τον όρο αλαρµόνες. Οι ενώσεις ppgpp, camp, cgmp χρησιµεύουν: στο να αναπροσανατολίζουν τις κυτταρικές επενδύσεις ενέργειας σεανταπόκρισηκάποιαςδύσκοληςκατάστασης (stress) σεέναµεταβολικόπεδίο.

55 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών 2) Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Σε έλλειψη αµινοξέων δηµιουργείται περίσσεια ελεύθερων trna, τα οποία µπορούν να εισχωρήσουν (αντιστρεπτά) στις θέσεις Α και Ρ των ριβοσωµάτων, ενός συµπλόκου ριβοσώµατος-mrna. Αν κάποιο από τα ελεύθερα trna που εισχωρούν στην θέσηα συµβαίνει να έχει την αντικωδική τριάδα που αντιστοιχεί στην κωδική τριάδα του mrna που βρίσκεται εκείνη τι στιγµήστηθέσηα,τότε: µε το δεσµό µεταξύ της κωδικής-αντικωδικής τριάδας που αναπτύσσεται το ελεύθερο trna προσανατολίζεται στην κανονική του θέση.

56 ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών 2) Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Στηθέσηαυτήηδιαδοχή TψCGτου τρίτου βραχίονα του trna (που λέγεται βραχίονας ψευδο-ουριδίνης) µπορεί να αλληλεπιδράσει µε µια ριβοσωµική πρωτεΐνη γνωστή σαν αυστηρός παράγοντας (SF). Ηβιοσύνθεσητου SFκατευθύνεταιαπόέναειδικόγονίδιο, γνωστόσαν rela, γιατί µετάλλαξη του rela οδηγεί στο λεγόµενο χαλαρό έλεγχο (relaxed control). Το σύµπλοκο TψCG- SF ευνοεί τη βιοσύνθεση ppgpp και pppgppαπό GDP. Η ppgpp είναι αλλοστερικός ρυθµιστής της πολυµεράσης του RNA, ηοποίαρυθµίζειτηµεταγραφικήτηςεπιλογή.

57 (ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών) 2) Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: ηλαδήηπολυµεράσηςτου RNA αλλάζειτηχηµικήτηςσυγγένειαπροςτιςπεριοχές R C των υποκινητών διαφόρων οπερόνιων που σχετίζονται λειτουργικά, όχιαπότηνάποψηανείναιόλαταοπερόνιααναβολικά ήόλακαταβολικά, αλλάγενικάµετηνοικονοµίατουκυττάρουσε περιπτώσεις, που όπως αναφέρθηκαν, αντιστοιχούν στην έκφραση σφίξιµο του ζωναριού ή περίοδος ισχνών αγελάδων.

58 (ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών) 2) Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Πρόκειται, δηλαδή για ένα µηχανισµό δραστικής αναπροσαρµογής της γενικής µεταβολικής στρατηγικής τουκυττάρου, µε σκοπό την αντιµετώπιση περιβαλλοντικών ή ενδοκυτταρικώνκαταστάσεων. Γιατολόγοαυτόκαιβακτήριαµεµεταλλαγµένοτο γονίδιο rela αντιµετωπίζουν µεγάλες δυσκολίες στην ανάπτυξή τους, όταν µεταβληθούν απότοµα οι περιβαλλοντικές συνθήκες.

59 (ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών) 2) Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Οµηχανισµόςµετονοποίοη ppgppαλλάζειτις προτιµήσεις της πολυµεράσης του RNA δεν είναι γνωστός µε λεπτοµέρειες. Φαίνεται ότι είναι αποτέλεσµα πολύπλοκων αλληλεπιδράσεωνκαιµεάλλασυστατικάτουκυττάρου, όπως τονπαράγονταέναρξης IF2, άλλουςπαράγοντες (όπως EF-T, EF-G,IF-2 κ.λπ.), το fmet-trnaf και άλλα trna τα οποία φέρουν αµινοξέα, των οποίων οι αλληλεπιδράσεις µε την πολυµεράσηείναιγνωστές.

60 (ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1) Καταστολή καταβολιτών) 2) Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Περιληπτικά οι αλληλεπιδράσεις µε την πολυµεράση και οι άλλοιπαράγοντεςπουεµπλέκονταιέχουνωςεξής: Η πολύµεράση του RNA σχηµατίζει σύµπλοκα µε το fmettrna F καιτονπαράγοντα IF 2. Το πρώτο σύµπλοκο (πολύ-µεράση RNA - fmet-trna F ) έχει in vitro δραστικότητα: αυξηµένη στη µεταγραφή Lac-operon και διαφορετική στη µεταγραφή σταθερώνγονιδίων.

61 (ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1)Καταστολή καταβολιτών) 2)Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Το δεύτερο σύµπλοκο (πολυµεράση RNA- IF 2 ) ευνοεί τη µεταγραφή rrna και το σχηµατισµό συµπλόκου. Υπάρχει εποµένως ανταγωνισµός για το fmettrna F από την πολύµεράση του RNA και τοσύµπλοκο mrna-30s υποµονάδα RNA.

62 (ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1)Καταστολή καταβολιτών) 2)Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Όταν ελαττωθεί το mrna ευνοείται ο σχηµατισµός του συµπλόκου πολυµεράση RNA - fmet-trna F καιηµεταγραφήτου Lac-operon. Περίσσεια mrna ελαττώνει το διαθέσιµο fmet-trna F και ευνοεί το σχηµατισµό του συµπλόκου πολυµεράση RNA - IF 2 και της µεταγραφής rrna

63 (ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1)Καταστολή καταβολιτών) 2)Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Η ppgpp ανταγωνίζεται µε τον IF 2 γιατην πολυµεράση RNA, και εξηγείται η αναστολή τηςµεταγραφής rrna, ριβοσωµικών πρωτεϊνών κ.λπ. Η ευνοϊκή επίδραση της ppgpp στη µεταγραφή του Lac-operon (ήάλλαοπερόνια) µπορείναοφείλεται: Ι) στο σύµπλοκο πολυµεράση RNA-ppGpp ΙΙ) σε σχηµατισµό άλλου συµπλόκου (π.χ. πολύµεράση RNA - ppgpp - fmet-trna F ) ΙΙΙ) στην πιθανότητα να µην αναστέλλει η ppgpp το σχηµατισµό του συµπλόκου πολυµεράση RNA -fmet-trnaf.

64 (ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕ Ο ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 1)Καταστολή καταβολιτών) 2)Αυστηρός ή καταπιεστικός έλεγχος: Όλες αυτές οι δυνατότητες είναι πολύ πιθανές τόσοστηνπερίπτωσητου Lac-operon, όσοκαισταάλλαοπερόνιαπουηµεταγραφήτουςευνοείταιαπό την ppgpp. Πολλά trna τα οποία φέρουν αµινοξέα, ευνοούν τη µεταγραφή των αντίστοιχων οπερόνιων (π.χ. το His-tRNA του His-operonκ.λπ.) όπωςστηνπερίπτωση fmet-trna F - Lac-operon. Ειδικά, η ταχύτητα µεταγραφής του His-operon αυξάνεται ανάλογαµετησυγκέντρωσητου ppgppκαιότανδεν υπάρχει έλλειψη His, γεγονός που δείχνει ότι και οι τρεις από τις δυνατότητες που αναφέρθηκαν µπορεί να συµβάλλουν. Ηειδικήεπίδρασητης ppgppστο His-operonείναινα ρυθµίζει τη σύνθεση των βιοσυνθετικών ενζύµων της ιστιδίνης, ανάλογα µε τις ανάγκες για ιστιδίνη και τη σχετική διαθεσιµότητα άλλων αµινοξέων.

65 ΡΥΘΜΙΣΗ ΜΕ ΕΞΑΣΘΕΝΗΣΗ Ανκαιοκύριοςτρόποςρύθµισηςτωνγονιδίωνείναιη ρύθµισήτουςστηναρχήτηςµεταγραφής (Ρύθµιση1), υπάρχουν και άλλοι τρόποι ρύθµισης που δρουν κατά την πορεία της µεταφοράς της πληροφορίας από το RNA στην πρωτεΐνη (Ρύθµιση2). Ένας από αυτούς τους τρόπους ρύθµισης, αποτελεί και η ρύθµιση, που γίνεται αφούηπολυµεράσητου RNA έχεισυνδεθείµετογονίδιο στον υποκινητή και έχειήδηαρχίσειησύνθεσητου RNA. ηλαδή πρόκειται για ένα µηχανισµό που κάνει σύζευξη των πορειών της µεταγραφής και τηςµετάφρασης. Τοφαινόµενοαυτό, µετοοποίογίνεταιηρύθµισηµερικών αµινοξέων, είναι γνωστό σαν εξασθένηση (attenuation).

66 ΡΥΘΜΙΣΗ ΜΕ ΕΞΑΣΘΕΝΗΣΗ Σαν παράδειγµα θα χρησιµοποιηθεί η περίπτωση της ρύθµισης του αµινοξέος θρυπτοφάνη (Try), το οπερόνιο της οποίας δενέχειρύθµισηµετοµηχανισµότηςκαταστολήςτων καταβολιτών,

67 ΡΥΘΜΙΣΗ ΜΕ ΕΞΑΣΘΕΝΗΣΗ Αλλά η ρύθµισης του αµινοξέος θρυπτοφάνη (Try) γίνεται αφ ενόςµενµετηναυτόνοµηρύθµιση (αυτόνοµη καταστολή) αφ ετέρουδεµετοφαινόµενοτηςεξασθένησης.

68 ΡΥΘΜΙΣΗ ΜΕ ΕΞΑΣΘΕΝΗΣΗ Στοοπερόνιοτης Try, µεταξύτου χειριστή και του πρώτου δοµικού γονιδίου, υπάρχει µια περιοχή που αποτελεί µια ελεγχόµενη θέση τερµατισµού της µεταγραφής και λέγεταιεξασθενητής. Το mrnaτης Try, πριναπότο κωδικόνιο της έναρξης των δοµικών γονιδίων, έχει µια αλληλουχία-οδηγό που φέρει δύο διαδοχικά κωδικόνια Try. Οι αλληλουχίες οδηγοί για τα διάφορα αµινοξέα, έχουν σχετικά µεγάλη αναλογία από το ρυθµιζόµενο αµινοξύ, µε αποτέλεσµα να αποτελούν µηχανισµό αναγνώρισης των επιπέδωντουρυθµιζόµενουαµινοξέοςµέσαστοκύτταρο. Το mrna της Try φέρει 4 τµήµατα (1,2,3 και 4) που ανά δύο µπορούν να σχηµατίσουν δίκλωνη αλυσίδα, µέσω των συµπληρωµατικώντουςβάσεων.

69 ΡΥΘΜΙΣΗ ΜΕ ΕΞΑΣΘΕΝΗΣΗ ΌτανηTryείναιδιαθέσιµησεπερίσσεια, ηέναρξητης µεταγραφής του οπερονίου της παρεµποδίζεται, γιατί στη θέση του χειριστή έχει δεσµευθεί το σύµπλοκο Tryκαταστολέας. αυτόνοµη ρύθµιση (αυτόνοµη καταστολή)

70 ΡΥΘΜΙΣΗ ΜΕ ΕΞΑΣΘΕΝΗΣΗ Καθώς µειώνεται η συγκέντρωση της Try και αρχίζει να ελευθερώνεταιηθέσητουχειριστή, ξεκινάκαιηµεταγραφή.

71 ΡΥΘΜΙΣΗ ΜΕ ΕΞΑΣΘΕΝΗΣΗ Αµέσωςµόλιςσυντεθείτο 5 άκροτου mrna, δεσµεύονται οι υποµονάδες του ριβοσώµατος και ξεκινά η µετάφραση τηςαλληλουχίας-οδηγού, εφ όσον υπάρχουν διαθέσιµα µέσα στοκύτταροαµινοξέακαι Try. 5 Επειδή στο ριβόσωµα, που βρίσκεται πολύκοντάστηνπολυµεράσητου RNA (την ακολουθεί) εισέρχεται και η περιοχή 1 αλλάκαιηπεριοχή 2, µπορείνασχηµατισθείµόνοηδίκλωνηαλυσίδααπότα τµήµατα 3+4. Τότε η δοµή του mrna (βρόγχος) εµποδίζει την πολυµεράση του RNA να δράσει και ευνοεί τον τερµατισµό της µεταγραφής στην περιοχή του εξασθενητή, και η πολυµεράση του RNA αποχωρίζεται από το οπερόνιο.

72 ΡΥΘΜΙΣΗ ΜΕ ΕΞΑΣΘΕΝΗΣΗ Όταν δεν υπάρχει πια διαθέσιµη Try σταµατά η βιοσύνθεση της αλληλουχίας-οδηγού στο ριβόσωµα παραµένει δεσµευµένηµόνοηπεριοχή 1. Τότε όµως µπορεί να σχηµατισθεί δίκλωνη αλυσίδα ανάµεσα στις περιοχές 2+3 η περιοχή 4 να παραµένει µονόκλωνη αλυσίδα και ηδοµήτου mrnaευνοείτησυνέχιση τηςµεταγραφήςκαιπέρααπότηθέση του εξασθενητή.

73 ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Στους ευκαρυωτικούς υπάρχουν, οι ακόλουθοιεπιπλέοντρόποιρύθµισης, οι οποίοι συµβαίνουν αφού έχει ολοκληρωθεί η µεταγραφή: 1) Ωρίµανσητου RNA (2 ο επίπεδο) Εκτός από την ωρίµανση του RNA, όπως έχει περιγραφεί, είναι γνωστό και το φαινόµενο της εναλλακτικής ωρίµανσης, το οποίο συµβαίνει συχνά στα ευκαρυωτικά γονίδια που περιέχουν πολλαπλά εξώνια στις γεννώµενεςήαρχικέςήπρόδροµεςµεταγραφέςτους.

74 ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 1) Ωρίµανση του RNA (2ο επίπεδο) Έτσι, εµφανίζονται διαφορετικοί τύποι ωρίµανσης σε διαφορετικούς τύπους διαφοροποιηµένων κυττάρων στον ίδιο οργανισµό.

75 ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 2) Ρύθµισητηςµετάφρασης (4 ο επίπ.) Γιατηρύθµισηκατάτηµετάφρασηδενυπάρχουντόσαστοιχεία, όπως για τη µεταγραφή, όπου πιστεύεται ότι κυρίως γίνεται η ρύθµιση, χωρίς αυτό να µειώνει τη σηµασίατηςρύθµισηςµετάτηµεταγραφή. Ακόµα δεν έχει διευκρινισθεί η έκταση της συνεισφοράς της µεταφραστικής ρύθµισης στην όλη ρύθµιση του κυττάρου. Πάντωςπιστεύεταιότιηρύθµισηαρχίζειαπότοστάδιοτης έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης. Γενικά η ρύθµιση της µετάφρασης αποτελεί ένα πολύπλοκο µεν αλλά ενδιαφέροντα µηχανισµό, στον οποίο µεταξύ άλλων συµµετέχουν :

76 ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 2α) Ρύθµιση της µετάφρασης (4ο επίπεδο) Οι παράγοντες έναρξης, οι οποίοι είναι δραστικοί στη µη φωσφορυλιωµένη τους µορφή και µη δραστικοί στη φωσφορυλιωµένη µορφή (eif 2 ).

77 ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 2β) Ρύθµισητηςµετάφρασης (4ο επίπεδο) Ειδικάπρωτεϊνικάµόριαπουεπιδρούνστηµετάφραση, π.χ. η πρωτεΐνη που κατευθύνεται από ένα γονίδιο να καταστέλλει την µετάφρασή της, όχι µε τη σύνδεσή της σε κάποιαθέσητου DNA (όπωςέχειαναφερθείµέχριτώρα), αλλάµετησύνδεσήτηςστο mrnaπουπροέκυψεαπότο αντίστοιχο γονίδιο και έτσι να παρεµποδίζει την περαιτέρω µετάφραση του mrna.

78 ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 3) ε ρυθµίζεται µόνο η ταχύτητα της µεταγραφής, αλλά και η συχνότητα µετάφρασης του mrna. Σε ένα πολυκιστρονικό mrna οι µεσαίες πρωτεΐνες βγαίνουν σε περισσότερα αντίτυπα. ηλαδή, όλα τα γονίδια δεµεταφράζονταισείδιοαριθµόαντιτύπων. Αυτόόµωςδενµπορείναεξηγηθείµεταόσα, µέχριτώρα, έχουν αναφερθεί, παρά µόνο µε την υπόθεση ότι τα ριβοσώµατα µπορούν να αρχίσουν µετάφραση mrna, όχιµόνοαπότο 5 άκροτους (τηναρχήτους) αλλά και από ενδιάµεσα σηµεία. Πότε και µε τι συχνότητα γίνεται αυτό, είναι άγνωστο.

79 ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 4) Παράγοντες που επιδρούν στη σταθερότητατου mrna (5 ο επίπεδο). 5) Τροποποίησηπολυπεπτιδικής αλυσίδας Η αρχική πολυπεπτιδική αλυσίδα µπορεί να τροποποιηθεί µε διάφορους τρόπους, έτσι ώστε να προκύψουν διαφορετικά πολυπεπτίδια ή πρωτεΐνες στους διάφορους ιστούς.

80 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΑ ΣΠΟΝ ΥΛΩΤΑ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, αν και έχουν γίνει πολλές µελέτες, δεν είµαστε ακόµα σε θέση να αναφέρουµε λεπτοµέρειες για το µηχανισµό της ρύθµισης της γονιδιακής έκφρασης όπως συµβαίνειµεταπροκαρυωτικά. Γιατολόγοαυτόπέρααπότηνπεριγραφήτουµηχανισµού αυτού στα προκαρυωτικά, όπως έγινε παραπάνω, µπορούν να αναφερθούν γενικές µόνο αρχές και αδρά παραδείγµατα για τη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης από τα συστατικά της τροφής στα σπονδυλωτά και στον άνθρωπο. Σήµεραέχειαποδειχθείότιτοποσόκαιησύστασητης διατροφής ρυθµίζει τη δραστικότητα πολλών ενζύµων στα σπονδυλωτά. H ρύθµιση αυτή γίνεται µέσω ρυθµιστικών παραγόντων του πλάσµατος που µπορεί να είναι είτε ειδικά συστατικά της διατροφής (π.χ. βαρέα µέταλλα), είτε ενώσεις που παρέχουν ενέργεια στον οργανισµό, είτε ορµόνες (στις οποίες τα επίπεδα ρυθµίζονται και πάλι από τα συστατικά της διατροφής).

81 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΑ ΣΠΟΝ ΥΛΩΤΑ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ Σαµοντέλαγιατηµελέτητηςρύθµισηςτηςγονιδιακής έκφρασης και συνεπώς της ρύθµισης της δραστικότητας των ενζύµων από τη διατροφή, χρησιµοποιούνται τα ένζυµα που βοηθούν στο σχηµατισµό λίπους, όπως για παράδειγµα η κινάσητουπυροσταφυλικούοξέοςκαιτοµηλικόένζυµο.

82 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΑ ΣΠΟΝ ΥΛΩΤΑ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ Έτσι σε καταστάσεις νηστείαςστοήπαρ, όπου γίνεται κυρίως η σύνθεση τωνλιπαρώνοξέων, η βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων γίνεται µε αργούς ρυθµούς, ενώµετάαπόλήψη τροφής και µάλιστα πλούσιας σε υδατάνθρακες και φτωχής σε λιπαρά, η βιοσύνθεσητωνλιπαρώνοξέωνπροχωράγρήγορα.

83 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΑ ΣΠΟΝ ΥΛΩΤΑ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ Mε ανάλογο τρόπο µεταβάλλεται και η δραστικότητα των ενζύµων κινάση του πυροσταφυλικού οξέος, µηλικό ένζυµο και των άλλων ενζύµων που συµµετέχουν στη βιοσύνθεση των λιπαρών, κατάτηνηστείακαι µετάτηλήψητροφής. ηλαδή τα ένζυµα αυτά παρουσιάζουν µικρή δραστικότητα κατά τη νηστεία και µεγάλη δραστικότητα µετά τη λήψη τροφής.

84 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΑ ΣΠΟΝ ΥΛΩΤΑ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ Σε µερικές περιπτώσεις παχυσαρκείας ανκαιηδιατροφήτωνατόµωναυτώνείναιπλούσιασε λιπαρά (και θα έπρεπε η βιοσύνθεση λιπαρών οξέων να είναιπεριορισµένη), λόγωαδυναµίαςρύθµισης, η βιοσύνθεση λιπαρών εξακολουθεί να είναι υψηλή, µε αποτέλεσµατησυσσώρευσηλίπους. Tο γεγονός αυτό µπορεί να οφείλεται σε πολλούς λόγους όπως οι ακόλουθοι:

85 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΑ ΣΠΟΝ ΥΛΩΤΑ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ Λόγοι παχυσαρκείας: Eνεργοποίηση του σωστού γονιδίου όχιµόνοαπότηνκατάλληληορµόνη, αλλάκαιαπόάλλεςµησχετικέςορµόνες όχι στον απαραίτητο βαθµό, από την κατάλληλη ορµόνη. Πολλά από τα συστατικά που συµµετέχουν στη ρύθµιση γονιδίων, που εµπλέκονται στον σχηµατισµό λίπους, συµµετέχουν επίσης και στη ρύθµιση της κυτταρικής διαίρεσης. Έτσιηαδυναµίαρύθµισηςτηςβιοσύνθεσηςτουλίπους, επιδράκαιστονπολλαπλασιασµότωνλιποκυττάρων, µε τα γνωστά αποτελέσµατα της παχυσαρκίας.