Robust enzyme design: Bioinformatic tools for improved protein stability Dmitry Suplatov1, Vladimir Voevodin2 and Vytas Švedas1

Transcript

1 Robust enzyme design: Bioinformatic tools for improved protein stability Dmitry Suplatov1, Vladimir Voevodin2 and Vytas Švedas1 1Belozersky Institute of Physicochemical Biology and Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia 2 Research Computing Center, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia The ability of proteins and enzymes to maintain a functionally active conformation under adverse environmental conditions is an important feature of biocatalysts, vaccines, and biopharmaceutical proteins. From an evolutionary perspective, robust stability of proteins improves their biological fitness and allows for further optimization. Viewed from an industrial perspective, enzyme stability is crucial for the practical application of enzymes under the required reaction conditions. In this review, we analyze bioinformatic-driven strategies that are used to predict structural changes that can be applied to wild type proteins in order to produce more stable variants. The most commonly employed techniques can be classified into stochastic approaches, empirical or systematic rational design strategies, and design of chimeric proteins. We conclude that bioinformatic analysis can be efficiently used to study large protein superfamilies systematically as well as to predict particular structural changes which increase enzyme stability. Evolution has created a diversity of protein properties that are encoded in genomic sequences and structural data. Bioinformatics has the power to uncover this evolutionary code and provide a reproducible selection of hotspots key residues to be mutated in order to produce more stable and functionally diverse proteins and enzymes. Further development of systematic bioinformatic procedures is needed to organize and analyze sequences and structures of proteins within large superfamilies and to link them to function, as well as to provide knowledge-based predictions for experimental evaluation. 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα ένζυμα, ως καταλυτικά ενεργές πρωτεΐνες χαρακτηρίζονται από συγκεκριμένη αμινοξική αλληλουχία, συγκεκριμένη αναδίπλωση στο χώρο και συγκεκριμένες συνθήκες περιβάλλοντος στις οποίες εκτελούν αποτελεσματικά το έργο τους. Επομένως, η σταθεροτητα είναι κρίσιμη για το εκτελεστικό έργο τους. Την ικανότητα να καταλύουν ποικίλες αντιδράσεις εκμεταλλεύτηκε η βιομηχανία, που εισήγαγε στα μέσα του εικοστού αιώνα ένζυμα για τη παραγωγή χημικών ενώσεων. Ωστόσο προέκυψε το πρόβλημα της μικρής σταθερότητας των ενζύμων σε βιομηχανικές συνθήκες. Έτσι δημιουργήθηκε η ανάγκη παραγωγής ενζυμικών παραλλαγών ώστε να εξασφαλιστεί η σταθερότητα και η λειτουργία τους. Πέραν της σημασίας της στη βιομηχανία, η σταθερότητα είναι μια ιδιότητα, που επηρεάζει την δομή και την λειτουργία των πρωτεϊνών( σταθερότητα=περιορισμός στην εμφάνιση νέων λειτουργιών), αλλά επίσης καθορίζει την βιολογική τους καταλληλότητα(η απώλεια σταθερότητα περιορίζει την εξέλιξη ). Προκειμένου να βελτιωθεί η πρωτεινικη σταθερότητα, εφαρμόστηκαν πειραματικές και υπολογιστικές τεχνικές που αποτελούνται από δύο συνιστώσες: i) επιλογή hotspots για μεταλλαξογένεση ii) δημιουργία βιβλιοθηκών με τις παραλλαγές και επιλογή των επιθυμητών φαινοτύπων. Σήμερα, η βιοπληροφορική συμμετέχει στη προσπάθεια αξιοποιώντας δύο βασικά προτερήματα : i) σύγκριση και ομαδοποίηση δεδομένων για εύρεση τυχόν ομοιοτήτων και άρα εύρεση των σχέσεων μεταξύ τους, ii) ανάλυση ενός τύπου δεδομένων για την κατανόηση ή αλλαγή άλλου τύπου δεδομένων. Οι περισσότερο κοινές εφαρμοσμένες πειραματικές τεχνικές έχουν

2 κατηγοριοποιηθεί σε : i) στοχαστικές προσεγγίσεις ii)εμπειρικές, ορθολογικές στρατηγικές σχεδίασης iii) συστηματικές μέθοδοι πρωτεϊνικού σχεδιασμού iv) σχεδιασμός χιμαιρικών πρωτεϊνών. 2.ΣΤΟΧΑΣΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ Μια μέθοδος για την δημιουργία ενζύμων με βελτιωμένες ιδιότητες είναι η κατευθυνόμενη εξέλιξη. Μιμείται τη Δαρβινική θεωρία σε συνδυασμό με τυχαίες μεταλλαξιγενεσεις ώστε να γίνει διαλογή και επιλογή των επιθυμητών φαινοτύπων. Η κλασσική εκδοχή λέει ότι οι μεταλλαγές εισάγονται στη τύχη, και δε συμπεριλαμβάνει καμιά τεχνική με υπολογιστή ή βιοπληροφορική. Οι αρχικές εφαρμογές έγιναν με βιβλιοθήκες των μεταλλαγμάτων, αλλά προσδιορίστηκαν μόνο λίγες επιθυμητές παραλλαγές. Πιο πρόσφατες τυχαίες προσεγγίσεις με μοντέρνες πειραματικές τεχνικές, ανέλυσαν ακόμα μεγαλύτερες βιβλιοθήκες- περισσότεροι από κλώνοι της εστεράσης της κεφαλοσπορίνης από τη Burkholderia gladioli σκαναρίστηκαν, αλλά προσδιορίστηκαν μόνο 11 επιθυμητές παραλλαγές. Επομένως, οι τελείως τυχαίες προσεγγίσεις πάσχουν από υψηλής συχνότητας βλαβερές μεταλλαγές και χαμηλής συχνότητας λειτουργικά ωφέλιμες. Μια τεχνική που μειώνει τα εξεταζόμενες παραλλαγές είναι η ProSAR. Προσεγγίζει τη σχέση πρωτεϊνικής αλληλουχίας-δομής και λειτουργεί σε κύκλους μέχρι να παραχθούν οι επιθυμητές παραλλαγές. Χρησιμοποιήθηκε για τη βελτίωση της λειτουργίας και σταθερότητας του Agrobacterium radiobacter halohydrin dehalogenase. Η αρχική ομάδα μεταλλαγών παραχθηκε από τυχαία μεταλλαξογένεση(47%), από κατευθυνόμενη εξέλιξημέσω μιας τεχνικής που παράγει μεταλλαγματα που περιέχουν όλα τα πιθανά αμινοξέα σε μια θέση(saturation mutagenesis-33%), από ανάλυση των αντικαταστάσεων σε ομόλογες αλληλουχίες που συμβαίνουν φυσιολογικά(14%), και από δομική ανάλυση(6%). Εξετάστηκαν παραλλαγές σε 18 επαναλήψεις. Οι τελικές παραλλαγές περιείχαν τουλάχιστον 35 υποκατεστημένα κατάλοιπα( από τα 254 ), που βελτίωσαν τη δραστικότητα και τη σταθερότητα. Σε σχέση με τις τυχαίες προσεγγίσεις, μειώνει την πειραματική προσπάθεια, ενώ αφήνει περιθώρια για περαιτέρω βελτίωση. Άλλη μια μέθοδος που προσπαθεί να δημιουργήσει βιβλιοθήκες που φέρουν μόνο εκείνες τις μεταλλάξεις που θα επιφέρουν τον επιθυμητό φαινότυπο είναι η επαναληπτική μεταλλαξογένεση κορεσμού σε συνδυασμό με δομική ανάλυση. Αρχικά επιλέγονται αμινοξέα με υψηλή τιμή b factor (σχετίζεται με θερμική κίνηση και ευλυγισία). Αυτή η στρατηγική βασίζεται στη παρατήρηση ότι οι δομές των θερμόφιλων ένζυμων είναι περισσότερο άκαμπτες σε σχεση με τα μεσόφιλα ενζυμα. Εφαρμόστηκε στη μεσοφιλικη λιπαση Α του Bacillus subtilis. 10 αμινοξεα με τη μεγαλύτερη τιμή b value επιλεχθηκαν για μεταλλαξογένεση κορεσμού για μια θέση. Τα καλύτερα hits για κάθε πλευρά ανασυνδυαστηκαν ένα προς ένα σε μια σταδιακή διαδικασία. Έπειτα από διαλογή 8000 κλώνων παραχθηκε 1 μεταλλαγμα με Τ₅₀⁶⁰(η απαιτουμένη θερμοκρασία για τη μείωση της αρχικής ενζυμικής ενεργότητας κατά 50% σε 60 λεπτά) στους 93 ⁰C (48 ⁰C ο άγριος τύπος). Άλλες 2 συχνά χρησιμοποιούμενες τεχνικές που περιλαμβάνουν πολλαπλές ευθυγραμμίσεις αλληλουχιών είναι η κατά γενική παραδοχή προσέγγιση και η μέθοδος των προγονικών μεταλλαγών. Στη πρώτη περίπτωση, εντοπιζονται σε κάθε στηλη της πολλαπλής στοίχισης τα αμινοξέα που εμφανιζονται συχνότερα και θεωρούνται ως τα σταθεροποιητικά αμινοξικά καταλοιπα που επιλεχθηκαν από τη φυσικη επιλογη. Σε μια μελέτη, έγινε ευθυγράμμιση

3 ομόλογων αλληλουχιών και το αποτέλεσμα διέφερε σε 29 θέσεις σε σχέση με το στόχο- β λακταμαση του Enterobacter cloacae(10⁸ συνδυασμοί). Περαιτέρω εξέταση 90 τυχαία επιλεγμένων στελεχών εντόπισε 15 παραλλαγές με αυξημένη θερμοσταθερότητα. Οι ευεργετικές μεταλλάξεις ανασυνδυάστηκαν για τη δεύτερη επανάληψη τυχαίας διαλογής. Η καλύτερη παραλλαγή εμφάνισε αύξηση 9,1 C στο μέσο της θερμικής μετουσίωσης και περιείχε οκτώ μεταλλάξεις συναίνεσης. Αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι η εισαγωγή συναινετικών υπολειμμάτων μπορεί να βελτιώσει τη σταθερότητα της πρωτεΐνης. Ωστόσο, αυτή η προσέγγιση δεν βοηθά στον εντοπισμό ενός περιορισμένου συνόλου θέσεων στόχου που πρέπει να μεταλλαχθούν εκ των προτέρων και συνεπώς οι αντικαταστάσεις συναίνεσης πρέπει να εξετάζονται πειραματικά για ευεργετικές αλλαγές. Το γενικό πρόβλημα με τις προσεγγίσεις «προς συσχέτιση» είναι ότι το πιο συχνά εμφανιζόμενο αμινοξύ σε μια ορισμένη θέση δεν χρειάζεται να είναι υπεύθυνο για μια βελτιωμένη ιδιότητα. Συνεπώς, ακόμη και στα επιτυχημένα παραδείγματα, μόνο μερικές από τις συναινετικές μεταλλάξεις συμβάλλουν στη σταθερότητα της πρωτεΐνης, ενώ άλλες αποσταθεροποιούν ή είναι ουδέτερες. H τελευταία μέθοδος είναι αυτή των προγονικών μεταλλάξεων (βασίστηκε στην ιδέα ότι οι πρόγονοι των πρωτεϊνών ήταν θερμόφιλοι). Καθώς οι προγονικές πρωτεΐνες δεν υπάρχουν σήμερα, οι αλληλουχίες τους δεν μπορούν να προσδιοριστούν. Επομένως, χρησιμοποιούνται βιοπληροφορικές μέθοδοι για την πρόβλεψη αλληλουχιών των κοινών προγόνων των πρωτεϊνών. Γενικά δύο τύποι μεθόδων χρησιμοποιούνται-φειδωλότητα και η Bayesian πιθανότητα. Η μέγιστη φειδωλότητα ελαχιστοποιεί το κόστος της εξελικτικής αλλαγής κατά μήκος κάθε κλάδου ενός δέντρου. Αντίθετα, οι μέθοδοι μέγιστης πιθανότητας ενσωματώνουν μια μαθηματική υπόθεση που περιγράφει τον τρόπο με τον οποίο μια προγονική αλληλουχία εξελίχθηκε στις σύγχρονες ακολουθίες. Οι δύο προσεγγίσεις μπορούν να παράγουν παρόμοια αποτελέσματα, ωστόσο η ανοικοδόμηση με βάση την πιθανότητα έχει ένα πλεονέκτημα έναντι της φειδωλότητας- εκτιμά την στατιστική σημασία των ανακατασκευασμένων προγονικών καταστάσεων. Η αξιοπιστία της ανοικοδόμησης in silico των υποτιθέμενων προγονικών πρωτεϊνών είναι θέμα συνεχούς συζήτησης. Ένα παράδειγμα είναι με την γλυκελο-trna συνθετάση από το Thermophilus thermophiles. Επιλέχθηκαν 11 προγονικές μεταλλάξεις με βάση 28 πρωτεϊνικές αλληλουχίες. Υποκαταστάσεις που ήταν κοντά μεταξύ τους στην πρωτογενή αλληλουχία εισήχθησαν ταυτόχρονα σε πολλαπλές σημειακές μεταλλάξεις. Άλλα προγονικά μεταλλάγματα εισήχθησαν σε ξεχωριστά απλά μεταλλάγματα. Από τις οκτώ μονές και διπλές παραλλαγές που παράχθηκαν, οι έξι εμφάνισαν έως 4,7 C αύξηση της θερμοκρασίας ημιμετουσιώσεως. Γενικά, ο αξιόπιστος προσδιορισμός των προγονικών καταλοίπων δεν είναι πάντα δυνατός και η επιλογή συγκεκριμένων θέσεων για μετάλλαξη παραμένει πρόκληση. Οι στοχαστικές προσεγγίσεις αποδείχτηκαν επιτυχείς σε πολλές περιπτώσεις, ειδικά όταν χρησιμοποιήθηκε βιοπληροφορική και στατιστική ανάλυση. Ωστόσο, διατηρούν υψηλό βαθμό στοχαστικής αβεβαιότητας, απαιτούν μεγαλύτερες μεταλλαγμένες βιβλιοθήκες και αποτελεσματικές τεχνικές διαλογής. Ένα άλλο πρόβλημα είναι ότι οι στοχαστικές προσεγγίσεις δεν μπορούν πάντα να παρέχουν βιολογική ερμηνεία των εισαγόμενων μεταλλάξεων. 3.ΕΜΠΕΙΡΙΚΟΣ ΟΡΘΟΛΟΓΙΚΟΣ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ Μια μελέτη ξεκινά με μια οπτική επιθεώρηση των δεδομένων( αλληλουχία ή δομή) από έναν εμπειρογνώμων. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σύγκριση μιας πρωτεΐνης με μια περισσότερο σταθερής ομόλογής της. Ως απόδειξη, μια σύγκριση δύο πρωτεϊνών που παράγονται σε χαμηλές θερμοκρασίες έδειξε ότι διέφεραν μόνο σε 12 από τα 67 αμινοξικά

4 κατάλοιπα, ενώ η σημαντική διαφορά στη θερμοσταθερότητα που βρέθηκε οφειλόταν σε μόνο 2 αμινοξικά κατάλοιπα, οπότε μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή σταθερότερων πρωτεϊνικών παραλλαγών. Ωστόσο το παράδειγμα αυτό δεν μπορεί να γενικευθεί καθώς οι πρωτεΐνες είναι συνήθως μεγαλύτερες σε μέγεθος και όχι τόσο πανομοιότυπες μεταξύ τους. Σύγκριση διαφορετικών πρωτεϊνών έδειξε ότι η υψηλή θερμοσταθερότητα σχετίζεται με μεγαλύτερο αριθμό προλίνης, αργινίνης, τυροσίνης, περισσότερες α έλικες, γέφυρες άλατος, και δεσμοί υδρογόνου και με λίγη ποσότητα κυστείνης και σερίνης. Παρομοίως, η προσαρμογή σε αλκαλικό ph σχετίζεται με μείωση του αριθμού αρνητικά φορτισμένων αμινοξέων και καταλοίπων λυσίνης και αυξημένο αριθμό αργινινης και ουδέτερων υδρόφιλων καταλοίπων, όπως η γλουταμινη, η ασπαραγινη και η ιστιδινη. Μεγαλύτερος αριθμός γεφυρών άλατος προτάθηκε ως «το κλειδί» για τη σταθερότητα κάτω από ακραίο ph. Συνεπώς, η αλλαγή από βασικά σε όξινα αμινοξέα χρησιμοποιήθηκε για τη βελτίωση του ισοζυγίου φορτίων και της σταθερότητας κάτω από όξινες συνθήκες, και αντίστροφα, σε ποίκιλα ενζυμα- α αμυλάση του B.subtilis κλπ. Οι εμπειρικές μελέτες χαρακτηρίζονται από μια αδυναμία: η επιλογή των hot spots για τη μεταλλαξογένεση είναι υποκειμενική. Μπορούν να περιορίσουν τη πειραματική εκτίμηση σε ένα μικρό αριθμό μεταλλαγμάτων, ωστόσο η αποτελεσματικότητα τους εξαρτάται σημαντικά από την εμπειρία του ερευνητή. Γενικά, η όλη διαδικασία είναι δύσκολα αναπαραγωγίσιμη και αποτελεί πρόκληση η ανάπτυξη περισσότερο συστηματικών μεθόδων. 4.ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΟΣ ΚΑΙ ΟΡΘΟΛΟΓΙΚΟΣ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ Η εξέλιξη των πρωτεϊνικών λειτουργιών γίνεται μέσω φυσικών μοτίβων μετάλλαξης που επιδρούν τόσο στην λειτουργία όσο και στην σταθερότητα των πρωτεϊνών. Η μελέτη αυτών είναι δύσκολο να γίνει με μια απλή ευθυγράμμιση αλληλουχιών από ομόλογες πρωτεΐνες, οπότε σε αυτές τις περιπτώσεις γίνεται εκτεταμένη χρήση των βιοπληροφορικών τεχνικών. Ρόλο κλειδί στην κατανόηση ιδιοτήτων που είναι κοινές για ολόκληρη την οικογένεια πρωτεϊνών παίζουν οι διατηρούμενες θέσεις. Αυτές καταλαμβάνονται από έναν τύπο καταλοίπου ή καταλοίπων με παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες. Με βάση το βαθμό διατήρησης αλλά και την μακρομοριακή γεωμετρία γίνεται η επιλογή ωφέλιμων μεταλλάξεων που μπορούν να οδηγήσουν σε μια βελτιωμένη παραλλαγή της πρωτεΐνης. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η παραλλαγή της αφυδρογονάσης της γλυκόζης από το B.subtilis που δημιουργήθηκε με την παραπάνω διαδικασία και παρουσίασε τόσο αύξηση της θερμοσταθερότητας όσο και της αντίστασης σε υψηλές συγκεντρώσεις κοσμοτροπικών και χαοτροφικών αλάτων. Οι θέσεις υποοικογένειας των πρωτεϊνών (SSPs- Subfamily Specific Positions) διατηρούνται σε λειτουργικές υποοικογένειες και φαίνεται να είναι υπεύθυνες για τη λειτουργική διάκριση μεταξύ ομοιογενών πρωτεϊνών. Συνδέονται κατά προτίμηση με καταλυτικές και ρυθμιστικές θέσεις στα ένζυμα, ωστόσο η εφαρμογή τους σε πειράματα πρωτεϊνικής μηχανικής είναι ακόμα περιορισμένη μιας και οι μεταλλάξεις στα SSPs μπορούν να οδηγήσουν σε καταλυτική ασυμφωνία, όπως στην περίπτωση της Candida antarctica lipase B. Για τον εντοπισμό τους χρησιμοποιούνται βασικά βιοπληροφορικές διαδικασίες μιας και τα πειραματικά δεδομένα που έχουμε στην διάθεσή μας είναι ελάχιστα. Μεταλλάξεις στις SSPs μπορούν να οδηγήσουν σε βελτιωμένες παραλλαγές μιας πρωτεΐνης όπως στην περίπτωση της ακυλάσης της πενικιλλίνης στην E.coli, όπου επιτεύχθηκε η αύξηση της σταθερότητας της πρωτεΐνης σε αλκαλικό περιβάλλον. Στην ουσία εντοπίστηκαν δύο κατάλοιπα χαρακτηριστικά της υποοικογένειας που βρίσκονται σε διαφορετική κατάσταση ιονισμού σε αλκαλικό και όξινο ph. Συγκεκριμένα ο ιονισμός τους στο αλκαλικό ph προήγαγε τη

5 συσσώρευση ενός θαμμένου δικτύου σταθεροποιητικών αντιδράσεων που ως συνέπεια κατέστρεφε τη λειτουργική διαμόρφωση της πρωτεΐνης. Μετά την αποκάλυψη του μηχανισμού μπορέσαμε να οδηγηθούμε σε μια παραλλαγή πρωτεΐνης με αυξημένη σταθερότητα σε αλκαλικές συνθήκες. Οι συν-εξελισσόμενες θέσεις σε μια οικογένεια πρωτεϊνών είναι αυτές όπου η εμφάνιση μεταλλάξεων σε μια περιοχή αντισταθμίζεται από μεταλλάξεις σε άλλη περιοχή. Οι θέσεις συν-εξέλιξης δεν αντιστοιχούν αναγκαστικά σε αμινοξέα που βρίσκονται σε στενή δομική εγγύτητα ενώ μπορούν να επισημάνουν πιο πολύπλοκους βιολογικούς περιορισμούς ως αποτέλεσμα εξελικτικής προσαρμογής. Εντοπίζονται βασικά με βιοπληροφορικές μεθόδους όπου εφαρμόζονται μετρήσεις εντροπίας ενώ φαίνεται να παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην σταθερότητα της πρωτεΐνης. Τα συν-εξελισσόμενα κατάλοιπα συμμετέχουν σε σταθεροποιητικές αλληλεπιδράσεις και η μετάλλαξη τέτοιων καταλοίπων μπορεί να διακόψει την λειτουργική διαμόρφωση της πρωτεΐνης. Ωστόσο, σε μια διαφορετική στοχαστική μελέτη η θερμοσταθερότητα της α αμυλάσης από το B. Subtilis βελτιώθηκε σημαντικά μετά από μεταλλαγές στις συν-εξελισσόμενες θέσεις με κόστος βέβαια της δραστικότητάς της. Μπορούμε λοιπόν να πούμε ότι τα συν-εξελισσόμενα κατάλοιπα εμπλέκονται σε μια πολύπλοκη αλληλεπίδραση μεταξύ της καταλυτικής δραστηριότητας και της δομικής σταθερότητας. Αυτή η σχέση απαιτεί εκτενέστερη πειραματική μελέτη. 5.ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΧΙΜΑΙΡΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Μελέτες έδειξαν ότι οι ιδιότητες μιας πρωτεΐνης μπορούν να εισαχθούν σε ομόλογο σκελετό για να αναμειχθεί η λειτουργία και η σταθερότητα και των δυο ενζύμων. Η συστηματική προσέγγιση SCHEMA επιχειρεί να προβλέψει τις πιο ευνοϊκές θέσεις διασταύρωσης μεταξύ των πρωτεϊνικών περιοχών προκειμένου να σχεδιαστούν βιβλιοθήκες πρωτεϊνών με αυξημένη θερμοσταθερότητα. Η ιδέα είναι να ανασυνδυαστούν οι πρωτεΐνες χωρίς να διαταραχθεί η ακεραιότητα της τρισδιάστατης δομής. Το SCΗEMA υπολογίζει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ καταλοίπων και στη συνέχεια καθορίζει τον αριθμό των αλληλεπιδράσεων που διαταράσσονται στη δημιουργία μιας υβριδικής πρωτεΐνης. Η επιλογή διασταυρώσεων που ελαχιστοποιούν τον αριθμό των συμβιβασμένων δομικών επαφών αυξάνει την πιθανότητα ότι μια χίμαιρα θα διπλωθεί σε ένα λειτουργικό υβρίδιο. Μια διαφορετική προσέγγιση έχει προταθεί για τη σχέση αλληλουχίας-λειτουργίας με βάση διαδικασία Gauss και την επιτηρούμενη μηχανική μάθηση. Το μοντέλο εκπαιδεύεται με αρκετές χιμαιρικές αλληλουχίες και μετά από κάποιους κύκλους βελτιστοποίησης μπορούμε να λάβουμε την καλύτερη χιμαιρική παραλλαγή. Τα μοντέλα αυτά μπόρεσαν να εντοπίσουν τις αλληλεπιδράσεις των μπλοκ αμινοξέων και πως αυτά επιδρούν στην θερμοσταθερότητα του μορίου, ωστόσο δεν κατάφεραν να εξηγήσουν τους μοριακούς μηχανισμούς που οδήγησαν στην παρατηρούμενη αύξηση της σταθερότητας. 6. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η σημασία της βιοπληροφορικής στις μεθόδους της πρωτεϊνικής μηχανικής είναι πολύ μεγάλη καθώς μπορεί να μειώσει σημαντικά την πειραματική εργασία. Πολλές βιοπληροφορικές μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί για την βελτίωση της σταθερότητας μιας πρωτεΐνης και τα αποτελέσματα τους είναι πολύ ενθαρρυντικά. Μέχρι στιγμής φαίνεται πως η πιο ρεαλιστική στρατηγική για τον σχεδιασμό πιο βελτιωμένων παραλλαγών πρωτεϊνών

6 είναι οι συστηματικά επιλεγμένες μεταλλάξεις στον WT, οι οποίες διαλέγονται με την βοήθεια βιοπληροφορικών τεχνικών. Ωστόσο είναι σημαντικό να αναφέρουμε πως οι βιοπληροφορικές προσεγγίσεις βασίζονται σε μεγάλο βαθμό στην ποιότητα και την ποικιλομορφία των πολλαπλών ευθυγραμμίσεων που χρησιμοποιούνται ως εισροές. Κανονικά πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο λειτουργικές πληροφορίες που έχουν επαληθευτεί πειραματικά και έχουν σχολιαστεί, βέβαια αυτά τα δεδομένα είναι λίγα και όχι πάντα διαθέσιμα. ΟΜΑΔΑ 17 ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΧΑΡΙΤΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΑΓΚΟΥ Υπεύθυνος καθηγητής: κ. Βοργιάς Ημερομηνία παρουσίασης: 25/04/18