ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΑΓΓΕΛΟΣ Κ. ΚΑΝΕΛΛΗΣ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΟ ΕΤΟΣ

Transcript

1 ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΑΓΓΕΛΟΣ Κ. ΚΑΝΕΛΛΗΣ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΟ ΕΤΟΣ

2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Μηχανισμός ρύθμισης της βιοσύνθεσης Προσέγγιση και μεθοδολογία αύξησης της παραγωγής των δραστικών ουσιών συγκεκριμένων δρογών

3 Γενικοί μεταβολίτες (γενικός μεταβολισμός) Είναι μια μεταβολική ενδιάμεση ουσία ή προϊόν, που συναντάται σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς, είναι απαραίτητη(ο) για την ανάπτυξη και τη ζωή και βιο-συντίθενται από ένα περιορισμένο αριθμό βιοχημικών μονοπατιών. Δευτερογενείς Μεταβολίτες (δευτερογενής μεταβολισμός): (Bernett και Bentlet) 1. απαντώνται ως διαφοροποιημένο προϊόν σε περιορισμένες ταξινομικές ομάδες, 2. δεν είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη ή τη ζωή του οργανισμού που τα παράγει, 3. βιοσυντίθενται από έναν ή περισσότερους γενικούς μεταβολίτες και από μια ευρύτερη ποικιλία βιοχημικών μονοπατιών,

4 Δευτερογενείς Μεταβολίτες (δευτερογενής μεταβολισμός): Verpoorte και Alterman 1. ουσίες ειδικές για κάθε είδος που δεν είναι απαραίτητες για τη ζωή των οργανισμών, αλλά παίζουν ρόλο στην αλληλεπίδραση του οργανισμού με το περιβάλλον και έτσι βοηθούν τον οργανισμό να επιβιώσει. Συνεπώς οι δευτερογενείς μεταβολίτες μπορούν να θεωρηθούν βασικοί παράγοντες για την επιβίωση του οργανισμού ως είδος στο οικοσύστημά του.

5 Ρύθμιση - Σταθερή έκφραση - Επαγόμενη έκφραση - Σε επίπεδο γονιδίων - Σε επίπεδο πρωτεϊνών - Σε επίπεδο μεταβολισμού - Σε επίπεδο ουσιών - Συνάρτηση της Δράσης - Αναπτυξιακά ρυθμιζόμενη ή - Επαγόμενη από εξωτερικά ερεθίσματα ή ενδογενείς παράγοντες π.χ. σαλυκιλικό οξύ ή ιασμονικό οξύ.

6 Τα διάφορα βιοχημικά μονοπάτια που βιοσυνθέτουν τους Δ.Μ. μπορούν να εκφράζονται σε περισσότερα από ένα φυτά, όμως η ρύθμιση τους μπορεί να είναι διαφορετική:

7 ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ: η βιοσύνθεση ορισμένων σεσκιτερπενίων σε φυτά της οικογένειας Solalaceae επάγεται από μικροβιακές προσβολές ενώ σε άλλα είδη εκφράζεται συνεχώς. η βιοσύνθεση των ανθρακινονών στα φυτά της οικογένειας Rubiaceae: στη Rubia trinctorum λαμβάνει χώρα συνεχώς στη ρίζα, ενώ στα είδη του Cinchona λαμβάνει χώρα μόνο μετά από προσβολή από παθογόνα. Στη Morinda citrifolia οι ανθρακινόνες παράγονται συνεχώς και σε όλα τα μέρη του φυτού. Η συνθάση της χαλκόνης υπάρχει σχεδόν σε όλα τα φυτά και συμμετέχει στην βιοσύνθεση των φλαβανοειδών (εκτός της δράσης τους ως αντιοξειδωτικά στη διατροφή ή ως αντικαρκινικά φάρμακα, παίζουν σημαντικόρόλοστηζωήτωνφυτών: προστασία από UV, εγγενή πολλαπλασιασμό ή αλληλοεπίδραση με το περιβάλλον). Η συνθάσητης χαλκόνης ρυθμίζεται διαφορετικά στα διάφορα είδη ή κατά τη ζωή των φυτών.

8 Η Ρύθμιση στο επίπεδο των ενζύμων λαμβάνει χώρα μέσω των παρακάτω μηχανισμών: Ανατροφοδότηση (feed-back) Αλλοστερική αλληλοεπίδραση Διαθεσιμότητα συν-παράγοντα Φωσφορυλίωση

9 Η Ρύθμιση στο επίπεδο της Διαμερισματοποίησης Μεταφορά (διάχυση, ενεργός μεταφορά) Παραδείγματα Υοσκυαμίνη παράγεται στις ρίγες του Hyoscamus niger και μεταφέρεται στα φύλλα όπου μετατρέπεται σε σκοπολαμίνη με εποξείδωση. Η συσσώρευση των αλκαλοειδών του ινδολίου (βινβλαστίνη, βινκριστίνη) του Catharanthus roseus στα χυμοτόπια μπορεί να γίνει και με τα δύο είδη (διάχυση ή ενεργό μεταφορά).

10 Συνεπώς H κατανόηση του μηχανισμού βιοσύνθεσης των Δ.Μ. και ιδίως η κατανόηση του ρόλου των ρυθμιστικών (κλειδιά) ενζύμων ή των γονιδίων τους μπορεί να οδηγήσει στην αύξηση της παραγωγής τους από τα φυτά είτε με κλασικές είτε με βιοτεχνολογικές μεθόδους.

11 ΕΡΩΤΗΣΗ Σας ζητείται να μελετήσετε σε ποιο επίπεδο (μεταβολισμού, πρωτεϊνοσύνθεσης ή γονιδιακής έκφρασης) ρυθμίζεται η βιοσύνθεση των διτερπενίων του λάδανου. Αναπτύξτε την προσέγγιση που θα ακολουθήσετε και τεκμηριώστε την απάντηση σας.

12 Μεταβολική Μηχανική Το μέρος της γενετικής μηχανικής που ασχολείται με την πειραματική δυνατότητα γενετικής τροποποίησης βιοχημικών μονοπατιών είθισται τελευταία να ονομάζεται Μεταβολική Μηχανική Τελευταία η εφαρμογή μεθόδων μοριακής βιολογίας και βιοτεχνολογίας συμπεριλαμβανομένων της γενετικής μηχανικής οδήγησε στην παραγωγή διαγονιδιακών φυτών και ποικιλία νέων προϊόντων όπως: εδώδιμα ή μη εμβόλια, βιοδιασπώμενα πλαστικά, πρωτεΐνες για απολύμανση εδαφών κλπ. νωπά προϊόντα με τροποποιημένα χαρακτηριστικά μετασυλλεκτικής συμπεριφοράς φυσικά προϊόντα με φαρμακευτικό ή βιομηχανικό ενδιαφέρον, όπως: λιγνίνες με διαφορετική σύνθεση υπομονάδων που δεν εμποδίζουν την παραγωγή χαρτιού ασυνήθιστα εδώδιμα ή βιομηχανικά λάδια άμυλα με διαφορετική ποιότητα αλεύρων αύξηση στην παραγωγή ταξόλης κλπ.

13 Μεταβολική Μηχανική Τέσσερις μεταβλητές επηρεάζουν το αποτέλεσμα της Μεταβολικής Μηχανικής : Απρόβλεπτα αποτελέσματα όταν τροποποιήσεις ένα μόνο ένζυμο σ ένα μονοπάτι (Feedback and/or feed forward controls). Η μεταβολή του μεταβολισμού μπορεί να προκαλέσει δυσμενείς επιπτώσεις στην ανάπτυξη των φυτών π.χ. νανισμός λόγω μη ελεγχόμενης αύξησης παραγωγής λυκοπενίου. Επιρροή περιβαλλοντικών παραγόντων στη γονιδιακή έκφραση των διαγονιδίων π.χ. πετούνια. Επίδραση της Διαμερισματοποίησης.

14 Αυτές οι μεταβλητές μπορούν να αντιμετωπισθούν μερικώς με προσαρμογή της στρατηγικής της Μ.Μ.: Γνώση των βιοχημικών μονοπατιών συμπεριλαμβανομένων των ενδιαμέσων προϊόντων και ενζύμων κλειδιά. Χρήση κυτταροκαλλιεργειών με διαφορετικά υποστρώματα και εκμαιευτείς (elicitors).

15 ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΕΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΣΤΑ ΦΥΤΑ Τρεις είναι οι βασικοί στόχοι της μεταβολικής μηχανικής στα φυτά: ηπαραγωγήμεγαλύτερηςποσότητας συγκεκριμένου επιθυμητού προϊόντος, η παραγωγή μικρότερης ποσότητας συγκεκριμένου ανεπιθύμητου προϊόντος και η παραγωγή ενός νέου προϊόντος για το φυτό, όπως είναι ένα μόριο που παράγεται στη φύση αλλά όχι στο συγκεκριμένο φυτό ή ακόμη και ένα εντελώς νέο προϊόν.

16 Πίνακας 1. Οι στρατηγικές που ακολουθούνται για την αύξηση ή ελάττωση ουσιών στη μεταβολική μηχανική Αύξηση Επιθυμητού Συστατικού Αύξησητηςροήςπροςτοεπιθυμητόσυστατικό Παράκαμψη βημάτων που περιορίζουν το ρυθμό (rate limiting) Ελάττωση της ροής μέσω ανταγωνιστικών μονοπατιών Υπερ-έκφραση ρυθμιστικών γονιδίων που επάγουν το ενδιαφερόμενο μονοπάτι Παρεμπόδιση του καταβολισμού Αύξηση των κυττάρων που παράγουν το συστατικό

17 Ελάττωση επιπέδων συστατικού Ελάττωση της ροής σε ένα βιοσυνθετικό μονοπάτι Αύξηση της ροής σε ανταγωνιστικά μονοπάτια Παρεμπόδιση βήματος στο βιοσυνθετικό μονοπάτι (block step out) Καταστολή ρυθμιστικών γονιδίων που επάγουν το ενδιαφερόμενο μονοπάτι Αύξηση του καταβολισμού του Νέο συστατικό Χρήση πρόδρομων για το σχηματισμό νέου συστατικού για το φυτό ή εντελώς νέου συστατικού Engineering the plant cell factory for secondary metabolite production, Verpoorte R, van der Heijden R, Memelink J, Transgenic Research 2000, 9:

18 ΚΥΡΙΟΣ ΡΥΘΜΙΣΤΗΣ π.χ. TF ΦΥΤΙΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΔΙΑΣΠΑΣΗΣ ΠΡΩΤΟΓΕΝΗΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΗΣ (Oksman-Galdentey K.M. and D.Inze. Sept Plant cell factories in the post-genomic era: new ways to produce designer secondary metabolites. Trends in Plant Science, 9: 9. ) ΕΚΛΥΟΜΕΝΟ ΠΡΟΪΟΝ Ε Σχήμα 14. Υποθετικό βιοσυνθετικό μονοπάτι του δευτερογενούς μεταβολίτη Ε. Τα γονίδια a-d εμπλέκονται στηβιοσύνθεσητουεπιθυμητούμεταβολίτηε. Το γονίδιο e εμπλέκεται στον περαιτέρω μεταβολισμό της ένωσης Ε σε F. Η λειτουργία του γονιδίου f μπορεί να αποκλειστεί χρησιμοποιώντας RNAi ή αντινοηματικές τεχνικές. Ο TF είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας με το ρόλο του κύριου ρυθμιστή. Η TP είναι μια πρωτεΐνη-μεταφορέας η οποία εμπλέκεται στη μεταφορά της ένωσης Ε από το εσωτερικό του φυτικού κυττάρου σε κενοτόπια και εξωκυτταρικούς χώρους.

19 Μεταβολική Μηχανική των μονοπατιών των δευτερογενών μεταβολιτών.* Η μηχανική των μονοπατιών των δευτερογενών μεταβολιτών απαιτεί πολύ καλή γνώση της πλήρους βιοσυνθετικής πορείας. Οι ακόλουθες στρατηγικές (1-7, σε ροζ φόντο στην Εικόνα 1) θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να ενισχύσουν ή να τροποποιήσουν την παραγωγή ενός υποθετικού φυτικού μεταβολίτη Ε. 1. Μειώνουμε τον καταβολισμό της επιθυμητής ένωσης. 2. Ενισχύουμε την έκφραση ή δραστικότητα ενός ρυθμο-καθοριστικού ενζύμου. 3. Εμποδίζουμε την αναδρασική αναστολή ενός ενζύμου-κλειδί. 4. Μειώνουμε το ρυθμό ροής μέσω ανταγωνιστικών μονοπατιών. 5. Ενισχύουμε την έκφραση ή δραστικότητα όλων των γονιδίων τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι. 6. Διαμερισματοποίηση της επιθυμητής ένωσης. 7. Μετατροπή ενός υπάρχοντος προϊόντος σε ένα νέο προϊόν. Από τις στρατηγικές αυτές, μερικές μόνο έχουν μέχρι στιγμής επιδειχθεί επιτυχώς. Οι στρατηγικές απόκτησης λειτουργικότητας και απώλειας λειτουργικότητας έχουν υιοθετηθεί για μεμονωμένα γονίδια. Η ανακάλυψη μεταγραφικών παραγόντων οι οποίοι μπορούν να ρυθμίσουν ολόκληρο το μονοπάτι έχει ανοίξει νέους δρόμους προς την ελεγχόμενη παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών, για παράδειγμα σε καλλιεργούμενα φυτικά κύτταρα. Η υπερ-έκφραση των μεταφορέων σε καλλιεργούμενα φυτικά κύτταρα επίσης έχει δείξει τη δυνατότητα να μεταφέρουμε τοξικές ενώσεις από το εσωτερικό του φυτικού κυττάρου στον εξωκυττάριο χώρο. Πρόσφατα, η ταυτόχρονηυπερ-έκφραση δύο γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν το ρυθμο-καθοριστικό ανοδικό ένζυμο τρανσφεράση της Ν-μεθυλοπουτρεσκίνης (PMT) καιτοκαθοδικόένζυμο6β-υδροξυλάση της υοσκυαμίνης (H6H) της βιοσύνθεσης των τροπανοαλκαλοειδών είχε ως αποτέλεσμα την υψηλότερη παραγωγή σκοπολαμίνης που έχει επιτευχθεί ποτέ σε καλλιεργούμενες θυσσανώδεις ρίζες. * Μετάφραση του Box 2 απότοάρθροτωνoksman-galdentey K.M. and D. Inze: Plant cell factories in the post-genomic era: new ways to produce designer secondary metabolites. Trends in Plant Science, 9: 9. Sept 2004.

20 Διαφορική διαμόρφωση πολυγονιδιακής οικογενείας (Differential modulation of a multigene family) Η διαφορική διαμόρφωση μιας πολυγονιδιακής οικογένειας είναι ένα φαινόμενο που μπορεί να δημιουργήσει προβλήματα στους χειρισμούς της μεταβολικής μηχανικής: π.χ. Καταστολή ενός ή περισσοτέρων από τα γονίδια αυτά από ένα αντινοηματικό γονίδιο αντισταθμίζεται από υπερ-έκκφραση των άλλων γονιδίων της οικογενείας (συνθάση της χαλκόνης)

21 Βιοσύνθεση των τερπενίων Λειτουργίες : Διατήρηση της ρευστότητας της κυτταρικής μεμβράνης (στεροειδή) Μεταφορά ηλεκτρονίων (ουμπικινόνη, μενακινόνη, πλαστοκινόνη) Γλυκοσυλίωση των πρωτεϊνών Ρύθμιση της κυτταρικής μεμβράνης (ορμόνες, κτλ) Χρησιμοποίηση από τα φυτά για ειδικευμένους σκοπούς: τοξίνες για αμυντικούς σκοπούς (φυτοαλεξίνες: σεσκιτερπένια ή διτερπένια) σήματα αμυντικού χαρακτήρα σε αέριο μορφή (μονοτερπένια και σεσκιτερπένια) γονιμοποιητές σε άνθη (μονοτερπένια) φωτο-προστατευτετικές ουσίες (ισοπρένια ή καροτενοειδή) Έχουν οικονομική σημασία: σημαντικά φαρμακευτικά προϊόντα: (ταξόλη-διτερπένιο, βινκριστίνη, καμποθεσίνη-αλκαλοειδή του ινδολίου από μονοτερπένια) αρωματικές ουσίες: πολλές εμπορικές σημαντικές αρωματικές ουσίες είναι μονοτερπένια ή σεσκιτερπένια

22 Στρατηγικές για βιο-μηχανική στα τερπένια: Ανθεκτικότητα σε έντομα ή ασθένειες εισαγωγή νέων συστατικών τερπενοειδούς χαρακτήρα ανα-εισαγωγή αμυντικών ουσιών σε καλλιέργειες που τις έχασαν λόγω γενετικής βελτίωσης. Βελτίωση στην παραγωγή σημαντικών τερπενίων φαρμακευτικών ουσιών αρωματικών ουσιών

23 Isoprene (short for isoterpene), or 2-methyl-1,3-butadiene, is a common organic compound with the formula CH2=C(CH3)CH=CH2. Under standard conditions it is a colorless liquid. However, this compound is highly volatile because of its low boiling point. FIVE-CARBON MOLECULE ISOPRENE

24 Isoprene (C5H8) is the monomer of natural rubber and also a common structure motif to an immense variety of other naturally occurring compounds, collectively termed the isoprenoids. Molecular formula of isoprenoids are multiples of isoprene in the form of (C5H8)n, and this is termed the isoprene rule. The functional isoprene units in biological systems are dimethylallyl diphosphate (DMADP) and its isomer isopentenyl diphosphate (IDP). The singular terms isoprene and terpene are synonymous whereas the plurals isoprenes or terpenes refer to terpenoids (isoprenoids).

25 FIVE-CARBON MOLECULE ISOPRENE

26

27 Cellular Topology of the Isoprenoid Metabolic Network in Plant Cells as Deduced from the Compartmentalization of A. thaliana Enzymes.Mt, mitochondria; Chl, chloroplasts; ER, endoplasmic reticulum; AACT, acetoacetyl-coa thiolase; HMGS, 3-hydroxy-3-methylglutaryl- CoA (HMG-CoA) synthase; HMGR, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase; MVA, mevalonate; MK, mevalonate kinase; MVAP, Mevalonate-5P; PMK, phosphomevalonate kinase; MVAPP, mevalonate-5pp; MPDC, diphosphomevalonate decarboxylase; GA-3P, D- glyceraldehyde 3-phosphate; DXS, 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate (DXP) synthase; DXR, DXP reductoisomerase; MEP, 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate; MCT, MEP cytidyltransferase; CDP-ME, 4-(cytidine 5'-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol; CMK, CDP-ME kinase; CDP-ME2P, 2-Phospho-4-(cytidine 5'-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol; MCS, 2-Cmethyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate (ME-2,4cPP) synthase; HDS, 1-hydroxy-2-methyl-2- butenyl 4-diphosphate (HMBPP) synthase; HDR, HMBPP reductase; IPPI, isopentenyl diphosphate (IPP,C5) Delta-isomerase; DMAPP (C5), dimethylallyl diphosphate; GPS, geranyl diphosphate (GPP,C10) synthase; FPS, farnesyl diphosphate (FPP,C15) synthase; GGPS, geranylgeranyl diphosphate (GGPP,C20) synthase; OPS, oligoprenyl diphosphate (HOPP, C25-C45) synthase; SPS, solanesyl diphosphate (SPP,C45) synthase; PPS, polyprenyl diphosphate (PPP,C50) synthase; SQS, squalene synthase; PSY, phytoene synthase; IPT, isopentenyl transferase; SS, sesquiterpenoid synthase; MS, monoterpenoid synthase; DS, diterpenoid synthase; HPT, homogentisate phytyl transferase; HST, homogentisate solanesyl transferase; DHNAPT, 1,4-dihydroxy-2-naphtoate phytyl transferase; HBPT, 4- hydroxybenzoate polyprenyltransferase; GGR, geranylgeranyl reductase; CHS, chlorophyll synthase. Vranová E et al. Mol. Plant 2012;5: The Author Published by the Molecular Plant Shanghai Editorial Office in association with Oxford University Press on behalf of CSPB and IPPE, SIBS, CAS.

28 Overview of isoprenoid metabolic pathways localized to the cytosol and to plastids in plants. The symbol for anabolic reactions is a solid arrow, whereas catabolic reactions are indicated by arrows with dotted lines. Multiple steps are characterized by an open arrow. Known enzymes involved in IPP biosynthesis are numbered: 1, DXP synthase; 2, DXP reductoisomerase: 3, 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyltransferase; 4, 4-(cytidine 50-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase; 5, 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-C-cyclodiphosphate synthase; 6, (E)-4-hydroxy-3-methylbut- 2-enyl diphosphate synthase; 7, (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase; 8, acetoacetyl-coa thiolase; 9, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase; 10, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase; 11, MVA kinase; 12, phosphomevalonate kinase; 13, MVA diphosphate decarboxylase.

29 Ημιτερπένια: C 5 C 5 Διφωσφορικό ισοπεντενύλιο (IPP) Διφωσφορικό διμεθυλαλλύλιο (DMAPP) Κυτοκινίνες Μονοτερπένια: C 10 Διφωσφορικό γερανύλιο Σεσκιτερπένια: CC Διφωσφορικό φαρνεσύλιο Διτερπένια: C 20 C 20 Διφωσφορικό γερανυλγερανύλιο Γιβερελλίνες ent-καουρένιο Τριτερπένια: Τριτερπένια: C C Σκουαλένιο Τετρατερπένια: C 40 Φυτοένιο Αψισικό οξύ Σχήμα 9. Βιοσυνθετικό μονοπάτι των τερπενίων όπου φαίνονται όλες οι κατηγορίες (Buchanan et al., 2000).

30 Πυρήνας Στερόλες C30 Τριτερπένια ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΜΕΒΑΛΟΝΙΚΟΥ Ακετυλο-CoA Πρενυλίωση Σεσκιτερπένια Φαρνεσυλίωση Πολυπρενόλες Κυτταρόπλασμα Πυροσταφυλικό + PGAL ΜΟΝΟΠΑΤΙ MEP Ισοπρένιο Χλωροπλάστης Μονοτερπένια Διτερπένια C40 Καροτενοειδή C45 Φυτόλες Current Opinion in Plant Biology Σχήμα 8. Σχηματική αναπαράσταση του βιοσυνθετικού μονοπατιού των τερπενίων (Chappell, 2002)

31 MYA Πυροσταφυλικό / 3-φωσφορική γλυκεραλδεΰδη Πρόωρη συνθάση του CPP, συνθάση-κ IPP IPP GGPP Κυτταρόπλασμα Ώριμη συνθάση του CPP CPP Συνθάση-Κ Προπλαστίδιο ent-καουρένιο ent-καουρένιο Μονοξυγονάση/ες του κυτοχρώματος P450 GA 12 -αλδεΰδη «Φυσιολογικά αδρανείς GA» Υδροξυλίωση-28 Φυτικές ορμόνες GA Οξείδωση-20 Υδροξυλίωση-28 Οξείδωση-20 Υδροξυλίωση-38 GA 12 Οξείδωση-7 Ενδοπλασματικό Δίκτυο Σχήμα 10. Σχηματική αναπαράσταση της σύνθεσης των γιβερελλινών και η ενδοκυτταρική διαμερισματοποίηση στα ανώτερα φυτά (Lange, 1998).

32 Πυροσταφυλική ομάδα 1-δεοξυ-5-φωσφοξυλουλόζη 2 Ακετυλο- CoA Πυροσταφυλική ομάδα 4-φωσφορική-2- μεθυλο-dερυθριτόλη Ακετυλο- CoA Μεβαλονικό οξύ Σχήμα 7. Παραγωγή του IPP δια μέσω των πλαστιδιακού και κυτοπλασματικού βιοσυνθετικών μονοπατιών των τερπενίων (Buchanan et al., 2000).

33 Ακετυλο-CoA Θειολάση Ακετυλο-CoA Ακετοακετυλο-CoA Συνθάση του HMG-CoA Ακετυλο-CoA 3-Υδροξυ-3-μεθυλογλουταρυλο-CoA (HMG-CoA) Αναγωγάση του HMG-CoA Κινάση του MVA Κινάση του MVAP Αποκαρβοξυλάση του MVAPP Μεβαλονικό οξύ (MVA) 5-Φωσφορικό μεβαλονικό οξύ (MVAP) 5-Διφωσφορικό μεβαλονικό οξύ (MVAPP) Διφωσφορικό ισοπεντενύλιο (IPP) Σχήμα 6. Σχηματική αναπαράσταση της βιοσύνθεσης των τερπενίων στο κυτταρόπλασμα (Buchanan et al., 2000).

34 Πυροσταφυλικό οξύ ακετυλο-coa ακετοακετυλο-coa Ρεδουκτάση του 3-υδροξυ-3-μεθυλο-γλουταρυλο- CoA (HMGR) 2 NADH Μεβαλονικό οξύ 3-υδροξυ-3-μεθυλο-γλουταρυλο- CoA Φωσφορικό μεβαλονικό οξύ Πυρο-φωσφορικό μεβαλονικό οξύ πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο (ΙΡΡ)

35 Στερόλες ΕΔ Φυτοαλεξίνες Γλυκοζυλίωση Αυλός Αυλός Κυτταρόπλασμα Καταλυτική περιοχή Ν-τελική ακολουθία Ακολουθία συνδέτη Μεμβρανική πρόσφυση Σχήμα 11. Απεικονίζεται ένα πρόσφατο μοντέλο για την τοπολογία και το στόχο της αναγωγάσης του 3-υδροξυ-3-μεθυλο-γλουταρυλο-CoA (HMGR) (McCaskill, D. and Croteau, R. Some caveats for bioengineering terpenoid metabolism. Trends in Biotechnology 16: , 1998).

36 Examples of Environmental and Developmental Factors that Affect the Isoprenoid Pathway Network.(A) Effect of de-etiolation. Vranová E et al. Mol. Plant 2012;5: The Author Published by the Molecular Plant Shanghai Editorial Office in association with Oxford University Press on behalf of CSPB and IPPE, SIBS, CAS.

37

38

39 A schematic representation for several natural product biosynthetic pathways in plants to illustrate how coordinate interactions between intracellular compartments are important for the biosynthesis of these diverse and complex molecules. TCA, tricarboxylic acid cycle; IPP, isopentenyl diphosphate; Phe, phenylalanine; G3P, glyceraldehyde 3 phosphate.

40 Η βιοσυνθετική οδός των τερπενίων Δευτερογενείς μετατροπές: Υδροξυλιώσεις Αναγωγές Γλυκοσυλιώσεις διφωσφορικό (-)-ent-κοπαλύλιο ent-καζα-12,15-διένιο διφωσφορικό (+)-ent-κοπαλύλιο Tholl, Current Opinion in Plant Biology, 2006

41 Η βιοσυνθετική οδός των τερπενίων Tholl, Current Opinion in Plant Biology, 2006

42 Τα λαβδανικά διτερπένια του Cistus creticus subsp. creticus Λαβδ-13-εν-8α-15-διόλη Οξικός εστέρας της λαβδ-13-εν-8α-15-διόλης Λαβδ-7,13-διέν-15-όλη Οξικός εστέρας της λαβδ-7,13-διέν-15-όλης Παράγωγα οξειδίου της μανοόλης

43 Η βιοσύνθεση λαβδανικών διτερπενίων Δευτερογενής μεταβολισμός Πρωτογενής μεταβολισμός αβιενόλη σκλαρεόλη λαβδαδιενόλη αβιεταδιένιο??? syn-διφωσφορικό κοπαλλύλιο GGPP ent-διφωσφορικό κοπαλλύλιο syn-στεμάρ-13-ένιο syn-πιμαρα-7,15-διένιο ent-σανδαρακοπιμαραδιένιο ent-καζα-12, 15-διένιο ent-καουρένιο oρυζαλεξίνες S μομιλακτόνες Α και Β oρυζαλεξίνες A-F φυτοκαζάνες A-Ε γιββερελλίνες Guo and Wagner, Planta, 2005; Prisic et al, Plant Physiol, 2004

44 Proposed pathway to labdane type diterpenes predominant in C. creticus resin Συνθάση της διφωσφορικής κοπαλόλης labd 7,13 dien 15 ol acetate? cdna???? labd 7,13 dien 15 ol Συνθάση της σκλαρεόλης cdna? sclareol labd 13 ene 8a ol 15 yl acetate

45

46 ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΦΛΑΒΟΝΟΕΙΔΩΝ Περισσότερες από 4500 ενώσεις φλαβονοειδών είναι γνωστές μέχρι σήμερα: οι χαλκόνες, οι αουρόνες, οι κατεχίνες, οι φλαβονόνες, τα ισοφλαβονοειδή, οι φλαβόνες, οι φλαβονόλες, οι λευκοανθοκυανίνες και οι ανθοκυανίνες

47 Φυτικές-ζωικές αλληλεπιδράσεις και φλαβονοειδή Το χρώμα των ανθέων (ανθοκυανίνες) ελκύει τους επικονιαστές. Οι φλαβόνες, οι φλαβονόλες, οι χαλκόνες και οι αουρόνες επηρεάζουν επίσης το χρωματισμό. Εξειδικευμένα φλαβονοειδή έχουν την ιδιότητα να προστατεύουν τα φυτά από την UV-B ακτινοβολία, ιδιότητα που αποδίδεται στην καμφερόλη. Οι προανθοκυανίνες ευθύνονται για την πικρή γεύση και τη στυπτικότητα ορισμένων φυτών. Επίσης τα ισοφλαβονοειδή είναι υπεύθυνα για την αντιμυκητιασική δράση ορισμένων φυτών. Ακόμηέχειαποδειχθείότιχρησιμεύουν στην προστασία της υγείας του ανθρώπου και έχουν φαρμακολογικές ιδιότητες. Τα φλαβονοειδή θεωρείται ότι είναι ρυθμιστές της ανοσοποιητικής και φλεγμονώδους απόκρισης του οργανισμού. Έχουν ακόμη αντικαρκινικές, αντιικές, αντιτοξικές και ηπατοπροστατευτικές ιδιότητες. Διατροφή πλούσια σε ισοφλαβονοειδή, όπως είναι η διατροφή με σόγια, μειώνει αισθητά τη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του μαστού και του προστάτη.

48

49 p-κουμαρυλο-coa + 3-μηλονυλο-CoA Συνθάση της χαλκόνης Αναγωγάση του NADPH Συνθάση της χαλκόνης Ισπιδόλη (αουρόνη) Ισολικουιριτιγενίνη (χαλκόνη) 4,2, 4, 6 -Τετραϋδροξυχαλκόνη (χαλκόνη) 4,4,6 -Τριυδροξυαουρόνη (αουρόνη) 2-Υδροξυισοφλαβονόνη Λικουιριτιγενίνη (φλαβονόνη) Ναρινγενίνη (φλαβονόνη) 2-Υδροξυισοφλαβονόνη Δαιζδεΐνη (ισοφλαβονοειδές) Γενισταΐνη (ισοφλαβονοειδές) Φορμονονετίνη 2 -Υδροξυφορμονονετίνη 2,4,5 -Τριμεθοξυφορμονονετίνη Αναγωγάση της βεστιτόνης 9-Απομεθυλομυνδοσερόνη (ροτενοειδές) Αφυδατάση της DMI Βιοχανίνη Α Σχήμα 12. Βιοσυνθετικό μονοπάτι για την παραγωγή εξειδικευμένων υποκατηγοριών των φλαβονοειδών (χαλκόνες, αουρόνες, φλαβονόνες και ισοφλαβονοειδή). (Buchanan et al., 2000). (-)-Βεστιτόνη 7,2 -Διυδροξυ-4 -μεθοξυισοφλαβονόλη (DMI) (-)-Μεδικαρπίνη

50 Ναρινγενίνη (φλαβονόνη) Απιγενίνη (φλαβόνη) Υδροξυλίωση του δακτυλίου Β Διυδροκερσετίνη (διυδροφλαβονόλη) Κερσετίνη (φλαβονόλη) Κατεχίνες Φλαβονο- 3,4-διόλες Ολιγομερείς / πολυμερείς προανθοκυανιδίνες Φλοβαφένια, κλπ. Διυδροκαμπφερόλη (φλαβονόλη) Λευκοπελαργονιδίνη (λευκοανθοκυανιδίνη) Πελαργονιδίνη (ανθοκυανίνη) Φλαβονο- 3,4-διόλες Ολιγομερείς / πολυμερείς ανθοκυανιδίνες Καμπφερόλη (φλαβονόλη) Κατεχίνες Σχήμα 13. Κύριες ενζυματικές αντιδράσεις των φλαβονοειδών. Περιλαμβάνονται τα εξής ένζυμα: FNS: Συνθάση των φλαβονών, FHT: 3- υδροξυλάση των φλαβονονών, FLS: Συνθάση των φλαβονολών, DFR: 4- αναγωγάση των διυδροφλαβονολών, ANS: Συνθάση των ανθοκυανινών, FGT: 3- Ο-γλυκοτρανσφεράση των φλαβονοειδών (Buchanan et al., 2000). 3-Γλυκοζίτης πελαργονιδίνης (ανθοκυανίνη)

51 Φαινυλαλανίνη Κινναμικό p-κουμαρικό Σιναπικοί εστέρες p-κουμαρυλικό-coa 3x Μαλονυλο-CoA Χαλκόνη Φλαβονόνες Φλαβον-4-όλες Διυδροφλαβονόλες Φλοβαφένια Σχήμα 15. Ρύθμιση της βιοσύνθεσης των φλαβονοειδών από μεταγραφικούς παράγοντες (Gantet, P. and Memelink J Trends in Pharmacological Sciences 23: ). Φλαβον-3-όλες Λευκοανθοκυανιδίνες Εισαγωγή σε κενοτόπιο Συμπολυμερισμός 3-ΟΗ-Ανθοκυανιδίνες Ανθοκυανίνες Συμπυκνωμένες ταννίνες Εισαγωγή σε κενοτόπιο

52 Φαινυλαλανίνη Κινναμικό p-κουμαρικό Σιναπικοί εστέρες p-κουμαρυλικό-coa 3x Μαλονυλο-CoA Χαλκόνη Φλαβονόνες Φλαβον-4-όλες Διυδροφλαβονόλες Φλοβαφένια Σχήμα 15. Ρύθμιση της βιοσύνθεσης των φλαβονοειδών από μεταγραφικούς παράγοντες (Gantet, P. and Memelink J Trends in Pharmacological Sciences 23: ). Φλαβον-3-όλες Λευκοανθοκυανιδίνες Εισαγωγή σε κενοτόπιο Συμπολυμερισμός 3-ΟΗ-Ανθοκυανιδίνες Ανθοκυανίνες Συμπυκνωμένες ταννίνες Εισαγωγή σε κενοτόπιο

53 Διακλαδώσεις και σύνδεση διαφορετικών μονοπατιών (Some enzymes catalyze pathway branch-points) Διακλαδώσεις και σύνδεση διαφορετικών μονοπατιών

54 Μονοπάτι του σικιμικού Πυροφωσφορικό και 3- φωσφο-γλυκεραλδεΰδη Χορισμικό Δεοξυξυλουλόζη Γερανιόλη Ανθρανυλικό Τρυπτοφάνη Τρυπταμίνη 10-Υδροξυ-γερανιόλη Σεκολογανίνη Στρικτοσιδίνη Αϊμαλισίνη Σερπεντίνη Καθεναμίνη Ταμπερσονίνη Δεσακετοξυβινδολίνη Δεακετυλοβινδολίνη Βινδολίνη Καθαρανθίνη Σχήμα 14. Βιοσύνθεση των αλκαλοειδών του ινδολίου. Συντμήσεις: AS: συνθάση του ανθρανυλικού οξέως, CPR: αναγωγάση του κυτοχρώματος P450, DAT: ακετυλοτρανσφεράση της δεακετυλοβινδολίνης, D4H: 4- υδροξυλάση της δεσακετυλοξυβινδολίνης, DXS: συνθετάση της 5-φωσφορικήςd-1-δεσοξυξυλουλόζης, G10H: υδροξυλάση της γερανι-10- όλης, SGD: β-d-γλυκοσιδάση της στρικτοσιδίνης, STR: συνθετάση της στρικτοσιδίνης, TDC: αποκαρβοξυλάση της τρυπτοφάνης. (Gantet and Memelink Transcription factors: tools to engineer the production of pharmacologically active plant metabolites. Trends in Pharmacological Sciences 23: ). Βινβλαστίνη

55 Σχήμα 12. Απεικονίζονται οι αλλαγές στο περιεχόμενο των μονοτερπενίων (Α), στο βάρος των φύλλων (Β), και στο ρυθμό βιοσύνθεσης των μονοτερπενίων (C) κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των φύλλων μέντας (Plant Physiology 122: , 2000).

56 Σχήμα 13. Σύγκριση στη σύσταση μεταξύ των αποθηκευμένων (μαύρες στήλες) και εκπεμπόμενων (λευκές στήλες) μονοτερπενίων στους βλαστούς μέντας.

57 Σχήμα 14. Χρονική ρύθμιση της συνθάσης του λιμονενίου στις αδενικές τρίχες κατά τη διάρκεια ανάπτυξης των φύλλων της μέντας. Α: ανοσολογική ανίχνευση της πρωτεΐνης. Β: In vitro μονάδες της ενζυματικής δραστηριότητας (Ο), οι αντίστοιχες σχετικές ποσότητες της πρωτεΐνης (από τα δεδομένα του Α) ( ) και οι αντίστοιχες σχετικές ποσότητες της mrna της συνθάσης του (-)- λιμονενίου ( ). Σχήμα 15. Ανάλυση κατά northern. Χρονικέ αλλαγές στα επίπεδα των mrna των βιοσυνθετικών ενζύμων των μονοτερπενίων στι αδενικές τρίχες κατά τη διάρκεια ανάπτυξης τω φύλλων της μέντας. Β: Συνθάση του geranyl diphosphate, C: συνθάση του (-)-λιμονενίου, D: Cyt P450 Υδροξυλάση λιμονενίου-3, και E: NADPH-dependent Cyt P450 αναγωγάση. A: Ριβοσομικά RNA για την πιστοποίηση της ίδιας ποσότητας ολικών RNA. F, Γράφημα των σχετικών ποσοτήτων mrna μετά την ποσοτικοποίηση των μηνυμάτων που αναλύθηκαν κατά northern. [geranyl diphosphat synthase ( ), limonene synthase (Ο), limonene 3-hydroxylase ( ), and Cyt P450 reductase ( )]

58 Γράφημα της διαδικασίας της Λειτουργικής Γονιδιακής Ανάλυσης ή Functional Genomics για την αποτίμηση των εκφρασμένων αλληλουχιών (Expressed Sequence Tags -ESTs) από μια cdna βιβλιοθήκη, που κατασκευάσθηκε από mrna, που απομονώθηκαν από αδενικές τρίχες φύλλων μέντας 15 ημερών (Lange et al., PNAS 97: , 2000).

59 Ταξινόμηση των ESTs σε λειτουργικές ομάδες γονιδίων (Lange et al. PNAS 97: , 2000). Ο δευτερογενής μεταβολισμός είναι περίπου το 35% του συνολικού μεταβολισμού.

60 Trichomes are hair-like structures that extend from the epidermis of aerial tissues, and are present on the surface of most terrestrial plants Nonglandular Glandular Trichomes (glandular and not glandular) from leaves of Cistus creticus ssp. creticus Apparent function Protect from insects and pathogens Minimize water loss Reduce mechanical abrasion Regulate temperature Help in pollen collection and dispersal

61 Gland metabolism is a target towards improving properties of exudates (e.g. flavour and aroma in herbs) and allowing commercial production of useful compounds (molecular farming). Commercially important products produced by simple trichomes cotton fibres, medicinals (e.g. the sesquiterpene antidepressant and antiviral, hypericin, and the sesquiterpene lactone antimalarial, artemisinin), spice principals (e.g. the monoterpenes of mints) and cosmeceuticals (e.g. sclareol). Other commercial products are produced by other secretory structures (e.g. turpentine components of conifer oleoresins and latex of lacticifers).

62 Why Cistus? Indigenous species Labdane type diterpenes exhibit antimicrobial and cytotoxic activities against a number of human leukemic cell lines Unexplored biosynthetic pathway

63 Trichome types on leaf surface of Cistus creticus Falara et al., Plant Molecular Biology (2008) 68:

64 Cistus creticus Trichomes Type I capitate trichomes (Sudan- Hematoxylin staining) Single stellate hairs with 6-12 branches Type II capitate trichomes (Sudan III staining) Ljaljević et al., 2011

65 Φαρμακολογική δράση λαβδανικών διτερπενίων του φυτού Αντιμικροβιακή και αντιμυκητική δράση Κυτταροστατική και κυτταροτοξική δράση Αντιλεϊσμανιακή δράση Anastasaki T, Demetzos C, Perdetzoglou D, Gazouli M, Loukis A, Harvala C (1999) Analysis of labdane-type diterpenes from Cistus creticus (subsp creticus and subsp ericephalus) by GC and GC-MS. Planta Med 65: Demetzos C, Harvala C, SM P (1990) A new labdane-type diterpene and other compounds from the leaves of Cistus incanus subsp creticus. J Nat Prod 53: Demetzos C, Loukis A, Spiliotis V, Zoakis N, Stratigakis N, Katerinopoulos H (1994) Composition and antimicrobial activity of the essential oil of Cistus creticus L. J Ess Oil Res 7: Demetzos C, Mitaku S, Couladis M, Harvala C, Kokkinopoulos D (1994) Natural metabolites of ent-13-epi-manoyl oxide and other cytotoxic diterpenes from the resin "Ladano" of Cistus creticus. Planta Med 60: Demetzos C, Mitaku S, Loukis A, Harvala C (1994) A new Drimane sesquiterpene, isomers of manoyl oxide and other volatile constituents from the resin "ladano" of Cistus incanus subsp creticus(l) Heywood. J Essent Oil Res 6: Demetzos C, Mitaku S, Hotellier F, Harvala A (1989) [Polyphenolic glycosides from Cistus creticus L. leaves]. Ann Pharm Fr 47: Dimas C, Demetzos C, Marsellos M, Sotiriadou R, Malamas M, Kokkinopoulos D (1998) Cytotoxic activity of labdane type diterpenes against human leukemic cell lines in vitro. Planta Med 64: Dimas K, Demetzos C, Vaos V, Ioannidis P, Trangas T (2001) Labdane type diterpenes down-regulate the expression of c- Myc protein, but not of Bcl-2, in human leukemia T-cells undergoing apoptosis. Leuk Res 25: Dimas K, Papadaki A, Tsimplouli C, Hatziantoniou S, Alevizopoulos K, Pantazis P, C D (2006) Labd-14-ene-8,13-diol (sclareol) induces cell cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells and enhances the activity of anticancer drugs. Biomedicine & Pharmacotherapy 60:

66 Η βιοσυνθετική οδός των τερπενίων Δευτερογενείς μετατροπές: Υδροξυλιώσεις Αναγωγές Γλυκοσυλιώσεις διφωσφορικό (-)-ent-κοπαλύλιο ent-καζα-12,15-διένιο διφωσφορικό (+)-ent-κοπαλύλιο Tholl, Current Opinion in Plant Biology, 2006

67 Η βιοσυνθετική οδός των τερπενίων Tholl, Current Opinion in Plant Biology, 2006

68 Τα λαβδανικά διτερπένια του Cistus creticus subsp. creticus Λαβδ-13-εν-8α-15-διόλη Οξικός εστέρας της λαβδ-13-εν-8α-15-διόλης Λαβδ-7,13-διέν-15-όλη Οξικός εστέρας της λαβδ-7,13-διέν-15-όλης Παράγωγα οξειδίου της μανοόλης

69 Cistus creticus ssp. creticus labdane type diterpenes Hexane 8,13 epoxy 15,16 dinorlabdane 8,13 epoxy 15,16 dinorlabd-12ene labdadiene 15,16 dinorlabd-8 (20)en-13-one manoyl oxide 13 epi manoyl oxide (4%) manool sclareolide 13(16)14 labdien-8-ol Sclareol (1%) 3 beta hydroxy manoyl oxide labda,7-13(e) dien-15-ol (22%) 3 beta acetoxy-13-epi manoyl oxide labda,7-13(e) dien-15-yl acetate (47%) drim 8 en 7 one 3 keto manoyl oxide labda,13(e) en-8a-15-diol labda,13(e) en-8a-ol 15yl acetate (13%) labd-13-en-8-ol labd-13-en-8-yl acetate methyl labd 8 (17)en-15 oate Anastasaki, T., Msc Thesis, Univ. of Athens

70 Η βιοσύνθεση λαβδανικών διτερπενίων Δευτερογενής μεταβολισμός Πρωτογενής μεταβολισμός αβιενόλη σκλαρεόλη λαβδαδιενόλη αβιεταδιένιο??? syn-διφωσφορικό κοπαλλύλιο GGPP ent-διφωσφορικό κοπαλλύλιο syn-στεμάρ-13-ένιο syn-πιμαρα-7,15-διένιο ent-σανδαρακοπιμαραδιένιο ent-καζα-12, 15-διένιο ent-καουρένιο oρυζαλεξίνες S μομιλακτόνες Α και Β oρυζαλεξίνες A-F φυτοκαζάνες A-Ε γιββερελλίνες Guo and Wagner, Planta, 2005; Prisic et al, Plant Physiol, 2004

71 ΑΥΞΗΣΗ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΤΩΝ ΑΔΕΝΙΚΩΝ ΤΡΙΧΩΜΑΤΩΝ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΑ ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝΤΑ ΤΗΣ ΟΜΑΔΑΣ H αποκρυπτογράφηση των μηχανισμών, σε μοριακό επίπεδο, που συμμετέχουν, ρυθμίζουν και ελέγχουν τη συσσώρευση των δευτερογενών μεταβολιτών στα αδενικά τριχώματα του Cistus creticus subsp. creticus Εξερεύνηση του μηχανισμού μορφογένεσης των αδενικών τριχωμάτων ΑΥΞΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΩΝ ΛΑΒΔΑΝΙΚΩΝ ΔΙΤΕΡΠΕΝΙΩΝ ΣΤΑ ΑΔΕΝΙΚΑ ΤΡΙΧΩΜΑΤΑ ΚΑΙ

72 Πειραματική προσέγγιση EST ανάλυση (Expressed Sequence Tags Analysis): α) Απομόνωση τριχωμάτων από τα φύλλα του φυτού β) Κατασκευή cdna βιβλιοθήκης γ) Αλληλούχηση τυχαία επιλεγμένων κλώνων δ) Βιοπληροφορική ανάλυση των αλληλουχιών Λειτουργικός χαρακτηρισμός γονιδίων συνθετασών τερπενίων Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης συνθετασών λαβδανικών διτερπενίων Απομόνωση γονιδίων που υπεισέρχονται στη μορφογένεση των αδενικών τριχωμάτων

73 Terpenoid content of Cistus creticus ssp. creticus trichomes at different leaf developmental stages μg/g trichome fresh wt Labdane diterpenes Sesquiterpenes Other diterpenes 0 XS (~0.5 cm) S (1-2 cm) M (2-3 cm) L (3-4 cm) 1 : 2 : 1 Leaf developmental stages Falara et al., Plant Molecular Biology (2008) 68:

74 EST ανάλυση (2022 αλληλουχίες υψηλής ποιότητας) blastx MIPS FunCat (A. thaliana) ( απόκριση σε καταπόνηση 4% άλλες λειτουργίες 13% βιογένεση ριβοσωμάτων 13% δευτερογενής μεταβολισμός 5% αναδίπλωση και σταθεροποίηση πρωτεϊνών 2% φωτοσυνθετικές λειτουργίες 13% μεταβολισμός λιπιδίων 3% άγνωστης λειτουργίας 38% μεταβολισμός υδρογονανθράκων 3% παραγωγή ενέργειας 3% αποικοδόμηση πρωτεϊνών 3% Falara et al., Plant Molecular Biology (2008) 68:

75 Δευτερογενής μεταβολισμός Βιοσύνθεση τερπενίων Βιοσύνθεση φλαβονοειδών Ομολογία ESTs Αναγωγάση του 3-υδρόξυ- 3-μέθυλο-γλουτάρυλο συνένζυμο Α 2 Συνθετάση της 1-δεόξυ-5-D-φωσφορικής ξυλουλόζης 2 Συνθετάση σεσκιτερπενίου 1 1 Συνθετάση σεσκιτερπενίου 2 2 Συνθετάση σεσκιτερπενίου 3 1 Συνθετάση σεσκιτερπενίου 4 2 Συνθετάση διτερπενίου 2 Κυκλάση τριτερπενίου 1 Οξειδοαναγωγάση της 10-υδρόξυ γερανιόλης 1 Ακετυλοτρανσφεράση της γερανιόλης/κιτρινελλόλης 1 Συνθετάση της χαλκόνης 1 2 Συνθετάση της χαλκόνης 2 2 Συνθετάση φλαβονόλης/υδροξυλάση φλαβανόνης 2 Αναγωγάση της 2-υδρόξυ-ισοφλαβόνης/διυδροφλαβονόλης 1 Αναγωγάση ισοφλαβόνης 1 4 Αναγωγάση ισοφλαβόνης 2 1 Αναγωγάση ισοφλαβόνης 3 1 Αναγωγάση ανθοκυανιδίνης 1

76 Βιοσύνθεση τερπενίων MVA Ακετυλοσυνένζυμο A AACT Ακετο-ακετυλοσυνένζυμο A HMGS HMG-CoA HMGR (2) Mεβαλονικό οξύ MVK 5-φωσφορικό μεβαλονικό οξύ PMK 5-διφωσφορικό μεβαλονικό οξύ PMD MEP D-γλυκερυναλδεύδη D-glyceraldehyde πυροσταφυλικού Pyruvate οξέος DXPS (1) (2) 5-φωσφορική 1 deoxy-d-1-δεόξυ-d xylose 5 phosphate ξυλουλόζη DXR 2-C-methyl-D-erythritol 4-φωσφορικής μέθυλο 4-phosphate D-ερυθριτόλη CMS 4-(κυανιδίν-5 4-(Cyadine 5-diphospho)-2-C-methyl- διφωσφορικής μέθυλο D-erythritol D-ερυθριτόλη CMK 2-phospho-4-(Cyadine Διφωσφορική 4-(κυανιδίν- 5-diphospho) 5 διφωσφορικής - 2-C-methyl- μέθυλο D-erythritol D-ερυθριτόλη MCS 2,4 2-C-methyl- κυκλοδιφωσφορική D-erythritol-2,4-cyclo-diphosphate μεθυλο-d-ερυθριτόλη HDS 4-διφωσφορικό-1-υδροξυ-2-μεθυλο-2-(E)-βουτενυλίο 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butanyl-phosphate- HDR Διφωσφορικό ισοπεντενύλιο Isopentenyl- diphosphate Διφωσφορικό διμεθυλαλλύλιο IPPI Dimethylallyl-diphosphate GPS IPPI Geranyl-diphosphate Διφωσφορικό γερανύλιο plastid CcTPS1 (1) πλαστίδιο (2) GGPS CcTPS1 Διφωσφορικό Geranyl-geranyl-diphosphate γερανυλ-γερανύλιο diterpene CcTPS1 Διφωσφορικό-ισοπεντενύλιο - IPPI Διφωσφορικό - διμεθυλαλλύλιο κυτταρόπλασμα FPS Διφωσφορικό φαρνεσύλιο CcTPS2 (1) CcTPS3 (2) CcTPS4 (1) CcTPS5 (2)

77 Potential Trichome Specific Genes Falara et al., Plant Molecular Biology (2008) 68:

78 Potential Trichome Specific Genes of Cistus creticus ssp. creticus Falara et al., Plant Molecular Biology (2008) 68:

79 RT-PCR expression profile of trichome specific genes Leaves Leaves minus trichomes Trichomes Buds Petals Sepals Roots Seeds Stems Reproductive organs thaumatin-like protein short-chain alcohol dehydrogenase (-)-germacrene synthase CcEF1α Falara et al., Plant Molecular Biology (2008) 68:

80 RT-PCR expression profile of trichome specific genes Leaves Leaves minus trichomes Stems Stems minus trichomes Trichomes Roots Buds Petals Sepals Seeds Reproductive organs putative P450 unknown protein CcEF1α Falara et al., Plant Molecular Biology (2008) 68:

81 Functional characterization of terpene synthases ORF isolation cloning in gene expression vector ATGAATCTGAAATTTGCAAAGATACC GTTGGACTTAATGCACAATGTACCGA CGTCATTACTCAATAGCTTGGAGGGG ATGACAGGAGTGGAATTGGACTGGG AAAAGCTTCTGAAATTGCAGAGCCAA GATGGTTCATTTATCACTTCCCCGTCC TCCACTGCTTTCGCTTTGATGCAGAC CAATGACACAAAGTGTTTGGGTTACT TGAAATTTGTGGTCCAAAAGTTCAAC GGCGGTGCCCCAGGTCAGTACCCTGT AGAAATCTTCGAGCGTATTTGGGTTG TTGATCGCCTACAACGTCTAGGGATT TCAAGATATTTCCAGCTGGAGATTAG ACTCTTTACAGGATGCCCGTATTTGA cell culture induction of protein synthesis Induced Not induced 30 ο C SP A SP A 97.2kD 82kD D 66.4kD

82 Functional characterization of the CcGer encoding cdna in E. coli Falara et al., Plant Molecular Biology (2008) 68:

83 Functional characterization of sesquiterpene synthases β-caryophyllene synthase germacrene B synthase β-farnesene synthase E-nerolidol synthase

84 Phylogenetic relatedness of CcCLS to other plant diterpene synthases Falara V et al. Plantphysiol 2010;154: by American Society of Plant Biologists

85 Recombinant CcCLS protein Falara V et al. Plantphysiol 2010;154: by American Society of Plant Biologists

86 GC-MS chromatograph of the labdane-type diterpene product of CcCLS Falara V et al. Plantphysiol 2010;154: by American Society of Plant Biologists

87 Comparison of the mass spectra of the product of the CcCLScatalyzed reaction and labd-13-ene-8α,15-diol authentic standard Falara V et al. Plantphysiol 2010;154: by American Society of Plant Biologists

88 Change in CcCLS RNA levels and labdane-type diterpenes during leaf development 2010 by American Society of Plant Biologists Falara V et al. Plantphysiol 2010;154:

89 Change in CcCLS RNA levels and labdane-type diterpenes in wounded leaves Falara V et al. Plantphysiol 2010;154: by American Society of Plant Biologists

90 Proposed pathway to labdane-type diterpenes predominant in C. creticus resin Falara V et al. Plantphysiol 2010;154: by American Society of Plant Biologists