ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7. Σύνθεση και επεξεργασία του RNA. Ευάγγελος Κωλέττας

Transcript

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Σύνθεση και επεξεργασία του RNA Ευάγγελος Κωλέττας Αναπληρωτής Καθηγητής Μοριακής Κυτταρικής Βιολογίας Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων και Συμβεβλημένο Μέλος ΔΕΠ Τμήμα Βιοϊατρικών Ερευνών Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας & Βιοτεχνολογίας (ΙΜΒΒ) Ίδρυμα Τεχνολογίας & Έρευνας (ΙΤΕ), Ιωάννινα Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2011 Το κύτταρο-μια Μοριακή Προσέγγιση Ιωάννινα

2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο ενός τμήματος DNA που μεταγράφεται 2

3 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ Ρύθμιση διεξάγεται σε οποιοδήποτε στάδιο της έκφρασης των ευκαρυωτικών γονιδίων. Όλες οι μορφές ρύθμισης επηρεάζουν σε διαφορετικό βαθμό την γονιδιακή έκφραση. Ρύθμιση της Αναδιαμόρφωσης της Χρωματίνης Τα ευκαρυωτικά κύτταρα τροποποιούν την χρωματίνη για να επηρεάσουν την έκφραση γονιδίων διαμέσου: 1. Τροποποιήσεων του DNA: Me σε κυτοσίνες (5mC), 5υδροξυ-mC 2. Τροποποιήσεων των Ιστονών: Me, Ac, Ph, Ub, Su, κλπ 3. Μη κωδικών RNA: pirnas, lncrnas, mirnas 4. Αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης: SWI/SNF Ρύθμιση της Μεταγραφής: Η έναρξη της μεταγραφής ρυθμίζεται από ειδικά ρυθμιστικά στοιχεία in cis όπως υποκινητές, ενισχυτές και αποσιωπητές, που δρουν ως θέσεις πρόσδεσης ρυθμιστικών πρωτεϊνών της μεταγραφής, γνωστών ως μεταγραφικοί παράγοντες (TFs). Οι TFs μπορούν να αυξήσουν το ρυθμό της μεταγραφής ενεργοποιητές της μεταγραφής (προσδένουν σε ενισχυτές) ή να μειώσουν το ρυθμό της μεταγραφής - καταστολείς της μεταγραφής (προσδένουν σε αποσιωπητές ή ενισχυτές) Αυτές οι μορφές ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης αλληλοεξαρτώνται 3

4 Το κεντρικό δόγμα δηλώνει ότι η πληροφορία μπορεί να διαιωνίζεται ή να μεταφέρεται από το ένα είδος νουκλεϊκού οξέος στο άλλο, αλλά η ροή της πληροφορίας προς την πρωτεΐνη είναι μονής κατεύθυνσης. 4

5 DNA και RNA: Τα νουκλεοσίδια (σάκχαρο+βάση) σχηματίζονται από την ένωση μιας αζωτούχου βάσης (A, T, C. G) με τη πεντόζη δεσοξυριβόζη στο DNA, ενώ στο RNA τα νουκλεοσίδια σχηματίζονται από την ένωση μιας αζωτούχου βάσης (A, T, C,U) με τη πεντόζη ριβόζη. Σε κάθε νουκλεοσίδιο η αζωτούχος βάση συνδέεται με τον 1' άνθρακα της πεντόζης. Στις πουρίνες (A, G) το 9 άτομο (N) ενώνεται με το 1' άνθρακα της πεντόζης Στις πυριμιδίνες (C, T, U) το N1 ενώνεται με το C1 της πεντόζης. Τα νουκλεοτίδια σχηματίζονται με την ένωση του νουκλεοσιδίου στον C5' της πεντόζης με φωσφορικό οξύ 5

6 1. Το πρώτο στάδιο της έκφρασης ενός γονιδίου, η μεταγραφή του DNA σε RNA, αποτελεί το αρχικό επίπεδο όπου ρυθμίζεται η γονιδιακή έκφραση τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα. 2. Τα RNA των ευκαρυωτικών κυττάρων τροποποιούνται με διάφορους τρόπους π.χ., αφαιρούνται τα ιντρόνια με το μάτισμα προκειμένου το πρωτογενές μετάγραφο να αποκτήσει τροποποιούνται τα 5 και 3 άκρα. τη λειτουργική του μορφή, και Τα διάφορα είδη του RNΑ έχουν συγκεκριμένο ρόλο στα κύτταρα: (i) Αγγελιαφόρα RNA (mrna): λειτουργούν ως εκμαγεία για τη σύνθεση πρωτεϊνών (ii) Ριβοσωμικά RNA (rrna) συμμετέχουν στη δομή των ριβοσωμάτων και στη μετάφραση του mrna (πρωτεϊνοσύνθεση). (ii) Μεταφορικά RNA (trna): συμμετέχουν στη μετάφραση του mrna. (iv) Ορισμένα μικρά RNA συμμετέχουν: στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων στο μάτισμα του mrna στην ωρίμανση του rrna και στη διαλογή των πρωτεϊνών στους ευκαρυώτες Π.χ. Μικρά μη κωδικά μόρια RNA (mirna) - ρυθμιστές της έκφρασης των γονιδίων στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το τελικό στάδιο της έκφρασης των γονιδίων, η μετάφραση του mrna σε πρωτεΐνη. 6 -

7 5 UTR 3 UTR Στα ευκαρυωτικά ένα γονίδιο κωδικοποιεί ένα RNA το οποίο μπορεί να κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη. Το γονίδιο μπορεί να εκτείνεται πέρα από τα όρια της αλληλουχίας που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη. 7

8 Η λειτουργία της RNA πολυμεράσης είναι να μεταγράφει μια αλυσίδα δίκλωνου DNA σε RNA. Η μεταγραφή δημιουργεί ένα RNA το οποίο είναι συμπληρωματικό με την αλυσίδα-εκμαγείο του DNA και έχει την ίδια αλληλουχία με την κωδική αλληλουχία του DNA. Η μετάφραση ερμηνεύει κάθε τριπλέτα βάσεων σε ένα αμινοξύ. Τρεις στροφές της δίκλωνης έλικας του DNA περιέχουν 30 bp, οι οποίες κωδικοποιούν 10 αμινοξέα. 8

9 Αλυσίδα-εκμαγείο Κωδική αλυσίδα Η σύνθεση του RNA από το DNA. Οι δύο αλυσίδες του DNA ξετυλίγονται και η μία χρησιμοποιείται ως εκμαγείο για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας RNA. Η σύνθεση του RNA γίνεται στην κατεύθυνση 5 προς 3. 9

10 Μια μεταγραφική μονάδα μεταγράφεται σε ένα ενιαίο RNA. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς η μεταγραφή διαχωρίζεται από τη μετάφραση η μεταγραφή γίνεται στον πυρήνα, ενώ η μετάφραση στο κυτταρόπλασμα. 10

11 Μεταγραφή ονομάζεται η διαδικασία σύνθεσης του RNA, την οποία καταλύει το ένζυμο RNA πολυμεράση χρησιμοποιώντας ως μήτρα το DNA. Η σύνθεση του RNA, όπως σχεδόν όλες οι βιολογικές αντιδράσεις/διεργασίες πολυμερισμού πραγματοποιείται σε 3 στάδια: 1. Έναρξη με τη βοήθεια παραγόντων έναρξης της μεταγραφής (initiation factors) 2. Επιμήκυνση με τη βοήθεια μεταγραφής (elingation factors) παραγόντων επιμήκυνσης της 3. Τερματισμός με τη βοήθεια παραγόντων τερματισμού της μεταγραφής (termination factors) 11

12 Η RNA πολυμεράση στη διεργασία αυτή έχει πολλαπλές λειτουργίες: 1. Ανιχνεύει στο DNA θέσεις έναρξης, που ονομάζονται θέσεις προαγωγέων ή υποκινητών ή απλώς προαγωγείς ή υποκινητές. Π.χ., το DNA της E. coli έχει ~2000 θέσεις υποκινητών στο γονιδίωμά της μεγέθους 4,8x106 bp. Επειδή οι αλληλουχίες αυτές βρίσκονται στο ίδιο μόριο DNA με τα μεταγραφόμενα γονίδια, ονομάζονται στοιχεία με δράση cis. 2. Ξετυλίγει ένα μικρό τμήμα δίκλωνου ελικοειδούς DNA για να δημιουργήσει ένα μονόκλωνο εκμαγείο DNA από το οποίο παίρνει οδηγίες. Σε αντίθεση προς τη σύνθεση του DNA, η σύνθεση του RNA μπορεί να αρχίσει de novo, χωρίς να χρειάζεται εκκινητής. 3. Επιλέγει το σωστό τριφωσφορικό ριβονουκλεοσίδιο και καταλύει το σχηματισμό ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού. Η διεργασία αυτή επαναλαμβάνεται πολλές φορές καθώς το ένζυμο μετακινείται προς τη μία κατεύθυνση κατά μήκος του εκμαγείου DNA. Η RNA πολυμεράση είναι ένα εντελώς επεξεργαστικό ένζυμο δηλαδή, ένα μεταγράφημα συντίθεται από την αρχή μέχρι το τέλος από ένα μόνο μόριο RNA πολυμεράσης. 4. Ανιχνεύει σήματα τερματισμού που προσδιορίζουν το πού τελειώνει ένα μεταγράφημα. 5. Αλληλεπιδρά με ενεργοποιητικές και κατασταλτικές πρωτεΐνες, που καθορίζουν την ταχύτητα της έναρξης μεταγραφής για πολύ μεγάλο παρά στα προκαρυωτικά, ονομάζονται παράγοντες μεταγραφής. Η γονιδιακή έκφραση ελέγχεται κυρίως στο επίπεδο της μεταγραφής. Η θεμελιώδης αντίδραση της σύνθεσης του RNA είναι ο σχηματισμός ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ του τελευταίου και του εισερχόμενου νουκλεοτιδίου. 12

13 Η ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΣΤΟΥΣ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 13

14 RNA πολυμεράση (RNA Pol; RNAP) και Μεταγραφή: - Κύριο ένζυμο για τη σύνθεση όλων των ειδών του RNΑ (rrna, trna, mrna) - Καταλύει τον πολυμερισμό 5'-τριφωσφορικών ριβονουκλεοσιδίων (ΝΤΡ, Nucleoside Triphosphates), με τη σειρά που υπαγορεύεται από ένα μόριο DNA το οποίο χρησιμοποιείται ως εκμαγείο. - Η RNAP, όπως και η DNA πολυμεράση, καταλύει την επιμήκυνση των αλυσίδων RNA με κατεύθυνση 5' προς 3, διαβάζοντας την αλληλουχία-εκμαγείο (3 προς 5 ). - Αντίθετα με τη DNA πολυμεράση, η RNAP δε χρειάζεται έναν προϋπάρχοντα εκκινητή για την έναρξη της σύνθεσης του RNΑ, και δεν έχει επιδιορθωτική δράση - Η μεταγραφή αρχίζει de novo από ειδικές περιοχές στην αρχή των γονιδίων, με το σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού ανάμεσα στα δύο πρώτα ΝΤΡ του υπό σύνθεση μορίου RNΑ. Η διαδικασία της έναρξης είναι ιδιαίτερα σημαντική, επειδή αποτελεί βασικό στάδιο για τη ρύθμιση της μεταγραφής. ΕΙΚΟΝΑ 7.1: Η RNA πολυμεράση (RNA polymerase) της E. coli. Το πλήρες ένζυμο ή ολοένζυμο αποτελείται από 6 υπομονάδες: 2α, 1β, 1β, 1ω και 1σ. Η υπομονάδα σ συνδέεται πιο χαλαρά και έτσι μπορεί να αποσπαστεί σχετικά εύκολα από τις υπόλοιπες υπομονάδες, που συνιστούν τη λεγόμενη κεντρική πολυμεράση, α2ββ ω (core polymerase). 14

15 Υψηλής ανάλυσης μελέτες της δομής της βακτηριακής RNAP κατέδειξαν ότι οι υπομονάδες β και β' σχηματίζουν μια δομή με σχήμα δαγκάνας καβουριού που «γραπώνει» το εκμαγείο DNA. Το ενεργό κέντρο της RNAP εντοπίζεται σε έναν εσωτερικό δίαυλο που σχηματίζεται μεταξύ των υπομονάδων β και β' και χωράει περίπου 20 ζεύγη βάσεων DNA. υπομονάδες α (rpoa) (είναι η τρίτη μεγαλύτερη υπομονάδα της RNAP) υπομονάδες ω (rpoz) (είναι η μικρότερη υπομονάδα και σταθεροποιεί την RNAP στους υποκινητές) υπομονάδα β (rpob) (είναι η δεύτερη μεγαλύτερη υπομονάδα και περιέχει μέρος του ενεργού κέντρου της RNAP) υπομονάδα β (rpoc) (είναι η μεγαλύτερη υπομονάδα και περιέχει μέρος του ενεργού κέντρου της RNAP) ΕΙΚΟΝΑ 7.5: Δομή της βακτηριακής RNA πολυμεράσης. Οι υπομονάδες α της πολυμεράσης απεικονίζονται με σκούρο πράσινο και ανοιχτό πράσινο χρώμα. Με μπλε χρώμα απεικονίζεται η υπομονάδα β, με ροζ χρώμα η υπομονάδα β και με κίτρινο χρώμα η υπομονάδα ω. 15

16 Η κεντρική RNA πολυμεράση μπορεί να καταλύσει τον πολυμερισμό των ΝΤΡ στο RNΑ, που αποδεικνύει ότι η υπομονάδα σ δεν είναι απαραίτητη για τη βασική καταλυτική ενεργότητα του ενζύμου. Ωστόσο, απουσία της σ, η κεντρική πολυμεράση δεν προσδένεται με ειδικότητα, όπως συμβαίνει φυσιολογικά στις αλληλουχίες του DNA που σηματοδοτούν την έναρξη της μεταγραφής. Επομένως, η υπομονάδα σ είναι απαραίτητη για την αναγνώριση των σωστών περιοχών έναρξης της μεταγραφής - κρίσιμο στοιχείο της μεταγραφής, επειδή η σύνθεση ενός RNΑ, προκειμένου να είναι λειτουργικό, πρέπει να ξεκινάει από την αρχή του αντίστοιχου γονιδίου. Κεντρική RNAP (core enzyme): α2ββ ω Δεσμεύεται στο DNA ισχυρά αλλά μη ειδικά RNAP (holoenzyme): α2ββ ωσ Δεσμεύεται στο DNA χαλαρά αλλά ειδικά στους υποκινητές (σ επιφέρει εξειδίκευση). Οι RNA πολυμεράσες των ευβακτηρίων αποτελούνται από 4 είδη υπομονάδων: οι α, β και β έχουν σχετικά σταθερά μεγέθη σε διάφορα είδη βακτηρίων, ενώ η σ ποικίλλει σε μεγαλύτερο βαθμό. 16

17 Τα περισσότερα βακτήρια, διαθέτουν αρκετές υπομονάδες σ, καθεμία από τις οποίες κατευθύνει την RNA πολυμεράση σε διαφορετικές περιοχές έναρξης της μεταγραφής (δηλ. σε διαφορετικά γονίδια). Τα βακτήρια, χρησιμοποιώντας εναλλακτικές υπομονάδες σ κάτω από διαφορετικές (περιβαλλοντικές) συνθήκες (π.χ. ανάλογα με τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών, θερμοκρασία), ενεργοποιούν διαφορετικές ομάδες γονιδίων τους. Εκτός από τον σ70, η E. coli έχει αρκετούς παράγοντες σ που επάγονται σε συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες. Ο εκθέτης στο όνομα του παράγοντα υποδηλώνει τη μάζα του. Περίοδος ασιτίας & στατική φάση αύξησης Υψηλές θερμοκρασίες >370C Πάρα πολύ υψηλές θερμοκρασίες 17

18 σ70(rpod) ή σa (The housekeeping σ factor): Ο παράγοντας σ βασικών λειτουργιών (κύριος παράγοντας σ) εμπλέκεται στη μεταγραφή των περισσοτέρων γονιδίων στα βακτηριακά κύτταρα που πολλαπλασιάζονται και αυξάνονται, έτσι ώστε να διατηρούνται ενεργά τα απαραίτητα γονίδια και οι μεταβολικές πορείες. Τα γονίδια που αναγνωρίζονται από το σ70 περιέχουν στους υποκινητές τους τις συγκαταβατικές αλληλουχίες (στοιχεία -10 και -35). σ38(rpos) (Starvation/stationary phase σ factor): Παράγοντας σ που εμπλέκεται στη μεταγραφή γονιδίων σε περίοδο ασιτίας και κατά την στατική φάση αύξησης. σ32 (RpoH) (The heat shock sigma factor): Επάγεται όταν τα βακτήρια εκτίθενται σε υψηλές θερμοκρασίες (>370C). Ως αποτέλεσμα της επαγωγής της έκφρασης του, ο σ32 δεσμεύεται στην κεντρική πολυμεράση, η οποία με τη σειρά της μεταγράφει γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του θερμικού στρες (heat shock proteins), που θα βοηθήσουν τα βακτήρια να επιβιώσουν σε υψηλότερες θερμοκρασίες. Μερικές απ αυτές τις πρωτεΐνες που επάγονται από την ενεργοποίηση του σ32 είναι πρωτεΐνεςσυνοδοί (chaperones), πρωτεάσες και ένζυμα επιδιόρθωσης του DNA. σ24 (RpoE) ή σε (The extracytoplasmic/extreme heat stress sigma factor): Ο παράγοντας σ24 επάγεται στο κυτταρόπλασμα όταν τα βακτήρια εκτίθενται σε πάρα πολύ υψηλές θερμοκρασίες. σ54 (RpoN) (The nitrogen-limitation sigma factor): Επάγεται όταν υπάρχει έλλειψη αζώτου, και συμβάλλει στη μεταγραφή γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του αζώτου. σ28 (RpoF) (The flagellar σ factor): Συμβάλλει στη μεταγραφή μαστιγιακών γονιδίων. 18

19 Η RNAP δεσμεύεται στους υποκινητές γονιδίων για την έναρξη της μεταγραφής Η περιοχή του DNA όπου προσδένεται η RNA πολυμεράση για να αρχίσει τη μεταγραφή ενός γονιδίου ονομάζεται υποκινητής (promoter). Η περιοχή που βρίσκεται ανοδικά (προς το 5') της θέσης έναρξης της μεταγραφής περιέχει 2 μικρής έκτασης τμήματα με κοινή αλληλουχία σε πολλά γονίδια. Πρόκειται για 2 εξανουκλεοτίδια, που ονομάζονται στοιχεία -10 και -35. Η ονομασία τους υποδηλώνει τη θέση τους σε σχέση με το σημείο έναρξης της μεταγραφής, το οποίο ορίζεται ως +1. Η πρότυπη αλληλουχία του στοιχείου -10 είναι TATAAT ή πλαίσιο Pribnow (Prinbow box), ενώ του στοιχείου -35 είναι TTGACA. Όμως, σε διαφορετικούς υποκινητές, οι αλληλουχίες των στοιχείων -10 και -35 δεν είναι πανομοιότυπες, είναι όμως αρκετά όμοιες bp 5-9 bp ΕΙΚΟΝΑ 7.2: Οι χαρακτηριστικές αλληλουχίες των υποκινητών της E. coli. Οι υποκινητές της E. coli φέρουν δύο χαρακτηριστικές (συγκαταβατικές) αλληλουχίες οι οποίες βρίσκονται 10 και 35 ζεύγη βάσεων ανοδικά από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (+1). Οι πρότυπες αλληλουχίες που υποδεικνύονται εδώ αντιστοιχούν στα νουκλεοτίδια που συναντώνται συχνότερα σε κάθε θέση με βάση τη σύγκριση των αντίστοιχων αλληλουχιών από διαφορετικούς υποκινητές. 19

20 Πειραματικά δεδομένα υποστηρίζουν τον λειτουργικό ρόλο των στοιχείων -10 και 35 των υποκινητών: 1. Τα γονίδια των οποίων οι υποκινητές διαφέρουν σημαντικά από τις πρότυπες αλληλουχίες μεταγράφονται λιγότερο αποτελεσματικά από αυτά με υποκινητές που εμφανίζουν μεγαλύτερη ομολογία προς τις πρότυπες αλληλουχίες. Οι υποκινητές διαφέρουν σημαντικά ως προς τη δραστικότητάα τους. Γονίδια με ισχυρούς υποκινητές μεταγράφονται πολύ συχνά κάθε 2'' στο E. coli. Αντιθέτως, γονίδια με πολύ ασθενείς υποκινητές μεταγράφονται μία φορά κάθε ~10'. Οι περιοχές 10 και -35 των περισσότερων ισχυρών υποκινητών έχουν αλληλουχίες που αντιστοιχούν αρκετά στις συγκαταβατικές (ομόφωνες) αλληλουχίες, ενώ οι ασθενείς υποκινητές τείνουν να φέρουν πολλές αντικαταστάσεις βάσεων στις θέσεις αυτές. 20

21 2. Η εισαγωγή μεταλλάξεων στις πρότυπες αλληλουχίες -35 και -10 επηρεάζει σημαντικά τη λειτουργία του υποκινητή. Η μετάλλαξη ακόμη και μίας βάσης είτε στην -10 ή στην -35 αλληλουχία μπορεί να μειώσει τη δραστικότητα του υποκινητή. 3. Η απόσταση μεταξύ των συντηρημένων αυτών αλληλουχιών είναι επίσης σημαντική. Ένας διαχωρισμός τους σε έκταση 17 νουκλεοτιδίων είναι ο βέλτιστος. Επομένως, η αποτελεσματικότητα ή η ισχύς μιας αλληλουχίας υποκινητή χρησιμεύει στη ρύθμιση της μεταγραφής. Ρυθμιστικές πρωτεΐνες οι οποίες δεσμεύονται σε ειδικές αλληλουχίες κοντά σε θέσεις υποκινητών και οι οποίες αλληλεπιδρούν με την RNA πολυμεράση επηρεάζουν επίσης σημαντικά τη συχνότητα μεταγραφής πολλών γονιδίων. 4. Η σύνδεση της RNA Pol στις περιοχές αυτές των υποκινητών διαπιστώθηκε με πειράματα ιχνηλάτησης του DNA (DNA footprinting), που χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό των περιοχών πρόσδεσης πρωτεϊνών στο DNA 21

22 ΕΙΚΟΝΑ 7.3: Ιχνηλάτηση του DNA. Μια αρχική ποσότητα του υπό έλεγχο τμήματος DNA με ραδιοσημασμένο το ένα του άκρο χωρίζεται στα δύο. Το ένα δείγμα επωάζεται με την πρωτεΐνη (π.χ. RNA Pol) που αναγνωρίζει μια συγκεκριμένη αλληλουχία του τμήματος DNA και προσδένεται σε αυτή. Κατόπιν, τα 2 δείγματα υφίστανται μερική πέψη με DNάση, ώστε κάθε μόριο να κόβεται κατά μέσο όρο σε μία θέση. Στο δείγμα που έχει επωαστεί με την πρωτεΐνη, η περιοχή του DNA στην οποία αυτή συνδέεται προστατεύεται από τη δράση της DNάσης και δεν κόβεται. Στη συνέχεια, τα σύμπλοκα DNA-πρωτεΐνης υφίστανται αποδιάταξη και τα μεγέθη των ραδιοσημασμένων μορίων που έχουν προκύψει από την πέψη με την DNάση προσδιορίζονται με ηλεκτροφόρηση των 2 δειγμάτων σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου. Στο δείγμα που επωάστηκε με την πρωτεΐνη απουσιάζουν τα κομμάτια του DNA που προκύπτουν από πέψη με την DNάση στην περιοχή πρόσδεσης της πρωτεΐνης. 22

23 Τα πειράματα κατέδειξαν ότι η RNA πολυμεράση (RNA Pol) προσδένεται σε μια περιοχή των γονιδίων μήκους ~60 bp, που εκτείνεται από τη θέση -40 έως τη θέση +20 (δηλ. από 40 nt ανοδικά μέχρι 20 nt καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής). Η υπομονάδα σ προσδένεται ειδικά στις αλληλουχίες και των 2 περιοχών -35 και -10, υποδηλώνοντας τη σημασία των στοιχείων αυτών στη λειτουργία του υποκινητή. Μερικοί υποκινητές του Ε. coli διαθέτουν μια τρίτη αλληλουχία, που βρίσκεται ανοδικά του στοιχείου -35 και λειτουργεί ως ειδική περιοχή πρόσδεσης για την υπομονάδα α της RNA Pol. 23

24 ΕΙΚΟΝΑ 7.4: Η μεταγραφή στο E. coli. Η RNAP αρχικά προσδένεται χωρίς ειδικότητα στο DNA και μετακινείται κατά μήκος του μορίου μέχρι η υπομονάδα σ να προσδεθεί στα στοιχεία -35 και 10, σχηματίζοντας το λεγόμενο κλειστό σύμπλοκο υποκινητή. Κατόπιν, η RNAP ξετυλίγει βάσεις του DNA γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (-12 ως +2) οπότε σχηματίζεται το λεγόμενο ανοικτό σύμπλοκο υποκινητή, στο οποίο η μία αλυσίδα του μονόκλωνου πλέον DNA λειτουργεί ως εκμαγείο για τη μεταγραφή, και ξεκινάει ο πολυμερισμός ελεύθερων ΝΤΡ. Η μεταγραφή ξεκινά με τη σύνδεση μέσω φωσφοδιεστερικού δεσμού 2 ελεύθερων ΝΤΡ. Μετά την προσθήκη 10 nt, η υπομονάδα σ αποδεσμεύεται από την κεντρική RNAP, που αρχίζει να κινείται καθοδικά σε σχέση με τον υποκινητή επιμηκύνοντας το υπό σύνθεση μόριο RNA. Έτσι ξετυλίγει την περιοχή που βρίσκεται μπροστά της και τυλίγει ξανά την περιοχή που βρίσκεται πίσω της. Η σύνθεση του RNA συνεχίζεται μέχρι η RNA Pol να συναντήσει ένα σήμα τερματισμού, οπότε το RNA αποδεσμεύεται από την RNAP η οποία αποσυνδέεται από το εκμαγείο DNA. 24

25 Η RNAP ξετυλίγει ~17 βάσεις του εκμαγείου DNA Η RNAP χωρίς τον παράγοντα σ (κεντρική RNAP) μπορεί να αρχίσει τη μεταγραφή (σύνθεση RNA) από τα άκρα του DNA, εγκοπές, κενά διαστήματα, και από περιοχές μονόκλωνου DNA. H επιμήκυνση πραγματοποιείται στις φυσαλίδες μεταγραφής που μετακινούνται κατά μήκος του εκμαγείου DNA: Σχηματική αναπαράσταση της φυσαλίδας μεταγραφής κατά την επιμήκυνση ενός μεταγραφήματος RNA. Το δίκλωνο DNA ξετυλίγεται στο πρόσθιο άκρο της RNA πολυμεράσης και ξανατυλίγεται στο οπίσθιο. Το υβρίδιο RNA-DNA περιστρέφεται κατά την επιμήκυνση. 25

26 Υπάρχουν δύο εναλλακτικοί μηχανισμοί τερματισμού της μεταγραφής στο Ε. Coli Rho-ανεξάρτητος μηχανισμός τερματισμού της μεταγραφής Ο απλούστερος και πιο κοινός τύπος σήματος τερματισμού αποτελείται από μια ανάστροφα επαναλαμβανόμενη αλληλουχία πλούσια σε GC που ακολουθείται από ~7 νουκλεοτίδια αδενίνης (Α) στην αλυσίδα-εκμαγείο. Η παρουσία καταλοίπων (Α) καθοδικά των ανάστροφων επαναλήψεων θεωρείται ότι διευκολύνει το διαχωρισμό του RNA από το εκμαγείο του, επειδή μεταξύ A-U αναπτύσσονται 2 μόνο δεσμοί-η αντί των 3 που αναπτύσσονται μεταξύ G-C. Rho-εξαρτώμενος μηχανισμός τερματισμού της μεταγραφής Εναλλακτικά, η μεταγραφή ορισμένων γονιδίων σταματά από πρωτεΐνες τερματισμού Rho που προσδένονται στο RNA. Η πρόσδεση των Rho γίνεται σε τμήματα (>60 νουκλεοτιδίων) μονόκλωνου RNA. Επειδή τα βακτηριακά mrna συνδέονται με τα ριβοσώματα και μεταφράζονται ενώ ακόμα εξελίσσεται η μεταγραφή τους, τέτοια μεγάλα μονόκλωνα τμήματα υπάρχουν μόνο στην 3' μη μεταφραζόμενη περιοχή των mrna. 26

27 * GC ΑΤ GC Παλινδρομική αλληλουχία πλούσια σε GC που ακολουθείται από μια αλληλουχία πλούσια σε ζεύγη AT. Το μεταγράφημα του RNA αυτής της παλινδρομικής αλληλουχίας του DNA είναι αυτοσυμπληρωματικό. Επομένως, οι βάσεις του ζευγαρώνουν σχηματίζοντας μια δομή φουρκέτας με ένα βραχίονα και μια θηλιά, μια δομή που ευνοείται από την υψηλή περιεκτικότητα καταλοίπων G & C. Τα ζεύγη GC είναι πιο σταθερά από τα ζεύγη AT λόγω του επιπλέον δεσμού υδρογόνου που περιέχουν. ΑΤ Αυτή η σταθερή δομή φουρκέτας ακολουθείται από μια αλληλουχία 4 ή περισσότερων καταλοίπων U, που είναι επίσης κρίσιμα για τον τερματισμό. Το μεταγράφημα του RNA τελειώνει μέσα ή λίγο μετά από αυτά τα κατάλοιπα. ΕΙΚΟΝΑ 7.6: Τερματισμός της μεταγραφής. Ο τερματισμός της μεταγραφής σηματοδοτείται από μια ανάστροφα επαναλαμβανόμενη αλληλουχία πλούσια σε GC, η οποία ακολουθείται από ~7 νουκλεοτίδια αδενίνης (Α) στην αλυσίδα-μήτρα. Η μεταγραφή της ανάστροφης επανάληψης οδηγεί στον σχηματισμό μιας δομής στελέχους-βρόχου στο μόριο του RNA, που αποσταθεροποιεί τη 27 σύνδεση του μεταγράφου με εκμαγείο DNA προκαλώντας την απελευθέρωσή του.

28 Ο παράγοντας Rho είναι μια εξαμερής πρωτεΐνη πανομοιότυπων υπομονάδων που σχηματίζουν δακτύλιο με ΜΒ 275 στα βακτήρια E. coli, ο οποίος έχει ενεργότητα ATPάσης και ελικάσης. Η Rho λειτουργεί ως παράγοντας τερματισμού της μεταγραφής. Οι αλληλουχίες τερματισμού που αναγνωρίζονται από την Rho είναι πλούσιες σε κυτοσίνες (C), π.χ. θέσεις ruta & rutb Η Rho δεσμεύεται σε συγκεκριμένη θέση στο RNA και μετακινείται στην κατεύθυνση 5 προς 3 μέχρι να συναντήσει την RNAP η οποία έχει σταματήσει σε μια θέση τερματισμού. Η Rho καταλύει το ξετύλιγμα διπλών ελικών DNA-RNA ή RNA-RNA στη φυσαλίδα μεταγραφής και απελευθερώνει το RNA. 28

29 Rho-dependent termination of transcription. (A) Schematic representation of the termination process. Putative contacts between Rho and RNAP (74) are not depicted. Transcriptional R-loops, sometimes formed behind RNAPs, are also dissociated by the Rho factor. (B) Genomic regions encoding Rhodependent terminators usually contain a C>G bubble upstream from the termination sites. The case of the pgaa terminator from E. coli is shown as a representative example. (C) Configuration of the RNA interaction network within the Rho hexamer based on crystal structures of E. coli s Rho. The tethered tracking mechanism used by Rho implies that PBS-RNA contacts are preserved while other contacts change as the RNA chain is translocated within the SBS, leading to the progressive lengthening of the PBS SBS linker. [Nadiras et al (2018) A multivariate prediction model for Rho-dependent termination of transcription. Nucleic Acids Res] 29

30 Ρύθμιση της έκφρασης προκαρυωτικών γονιδίων σε επίπεδο μεταγραφής Τα προκαρυωτικά κύτταρα ρυθμίζουν την έκφραση πολλών γονιδίων ταυτόχρονα. Τα προκαρυωτικά γονίδια συχνά οργανώνονται σε σειρά με αποτέλεσμα να μεταγράφονται ταυτόχρονα. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι το οπερόνιο Lac. Σε αντίθεση, στα ευκαρυωτικά τα περισσότερα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες μεταγράφονται ως μονάδες. 30

31 ΟΠΕΡΟΝΙΟ Lac: Καταστολείς και αρνητικός έλεγχος της μεταγραφής Η μεταγραφή ρυθμίζεται στα στάδια της έναρξης και της επιμήκυνσης, αλλά η μεταγραφική ρύθμιση στα βακτήρια συμβαίνει κυρίως στο στάδιο της έναρξης. Οι πρώτες μελέτες της γονιδιακής ρύθμισης στο Ε. coli έγιναν από τους Francois Jacob και Jacques Monod (1950). Η λακτόζη επάγει τη σύνθεση ενζύμων που συμμετέχουν στον μεταβολισμό της. Εκτός από τη β-γαλακτοζιδάση που υδρολύει τη λακτόζη σε γαλακτόζη και γλυκόζη, στην αξιοποίηση της λακτόζης συμμετέχουν τα προϊόντα δύο ακόμα στενά συνδεδεμένων γονιδίων: της περμεάσης της λακτόζης, που μεταφέρει τη λακτόζη μέσα στο κύτταρο, και της τρανσακετυλάσης, η οποία θεωρείται ότι απενεργοποιεί τους τοξικούς θειογαλακτοζίτες που μεταφέρονται στο κύτταρο μαζί με τη λακτόζη από την περμεάση. ΕΙΚΟΝΑ 7.7: Μεταβολισμός της λακτόζης. Η β-γαλακτοζιδάση καταλύει την υδρόλυση της λακτόζης σε γλυκόζη και γαλακτόζη. 31

32 Ρυθμιστικό γονίδιο Τα γονίδια που κωδικοποιούν τη β-γαλακτοζιδάση (lacz), την περμεάση (lacy) και την τρανσακετυλάση (laca) εκφράζονται ως μια μονάδα, που ονομάζεται οπερόνιο lac (Lac operon). Οι Jacob, Monod & Lwoff, μελετώντας μεταλλάγματα που αδυνατούν να ρυθμίσουν την έκφραση αυτών των γονιδίων, εντόπισαν 2 διαφορετικούς γενετικούς τόπους: το χειριστή Ο (operator) και τον καταστολέα i, (inhibitor) που ελέγχουν την έκφραση του οπερονίου Lac. Ο χειριστής Ο είναι ένα τμήμα DNA 20 bp που βρίσκεται πριν από τη θέση έναρξης της μεταγραφής του οπερονίου. Το γονίδιο i, που βρίσκεται σε κάποια άλλη περιοχή του γονιδιώματος, κωδικοποιεί μια κατασταλτική πρωτεΐνη που ρυθμίζει τη μεταγραφή του οπερονίου μέσω της πρόσδεσης της στον χειριστή. Τα μεταλλάγματα που αποτυγχάνουν να συνθέσουν λειτουργικό προϊόν του γονιδίου i εκφράζουν το οπερόνιο ιδιοστατικά (ανεξαρτήτως συνθηκών), δηλ. ακόμα και όταν δεν υπάρχει διαθέσιμη λακτόζη. Αυτό αποδεικνύει ότι το φυσιολογικό προϊόν του γονιδίου i είναι ένας καταστολέας (repressor), που αναστέλλει τη μεταγραφή όταν προσδένεται στον γενετικό τόπο Ο. Η προσθήκη λακτόζης οδηγεί στην επαγωγή του οπερονίου, καθώς η λακτόζη προσδένεται στον καταστολέα και τον παρεμποδίζει να προσδεθεί στο χειριστή Ο (Πειράματα ιχνηλάτησης DNA). Ο υποκινητής P περιέχει μια περιοχή δέσμευσης της RNAP και μια περιοχή δέσμευσης της ρυθμιστικής πρωτείνης CAP. François Jacob, André Lwoff & Jacques Monod: Nobel Prize in Physiology or Medicine 1965 "for their discoveries concerning genetic control of enzyme and virus synthesis". 32

33 Τα δομικά γονίδια του οπερονίου lac μεταγράφονται σε ένα ενιαίο πολυσιστρονικό mrna, που μεταφράζεται ταυτόχρονα από πολλά ριβοσώματα ώστε να συντεθούν τα 3 ένζυμα που κωδικοποιούνται από το οπερόνιο. ΕΙΚΟΝΑ 7.8: Αρνητική ρύθμιση του οπερονίου lac. Το γονίδιο i κωδικοποιεί έναν καταστολέα ο οποίος, όταν δεν υπάρχει λακτόζη (επάνω τμήμα της εικόνας), προσδένεται στο χειριστή (O) και εμποδίζει την RNA πολυμεράση να μεταγράψει τα τρία δομικά γονίδια του οπερονίου (Z: βγαλακτοζιδάση, Y: περμεάση και A: τρανσακετυλάση). Όταν υπάρχει λακτόζη (κάτω τμήμα της εικόνας), αυτή προσδένεται στον καταστολέα και τον εμποδίζει να προσδεθεί στον χειριστή, με αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης του οπερονίου. P = υποκινητής, Pol = RNA πολυμεράση. 33

34 Από τη μελέτη του οπερονίου της λακτόζης προκύπτει μια κεντρική αρχή σχετικά με τη γονιδιακή ρύθμιση που ισχύει τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα: Ο έλεγχος της μεταγραφής επιτυγχάνεται μέσω της αλληλεπίδρασης ρυθμιστικών πρωτεϊνών με ειδικές ρυθμιστικές αλληλουχίες του DNA. Οι ρυθμιστικές αλληλουχίες του DNA, όπως ο χειριστής, ονομάζονται cis-δραστικά ρυθμιστικά στοιχεία (cis-acting control elements), επειδή επηρεάζουν την έκφραση συνδεδεμένων γονιδίων που βρίσκονται στο ίδιο μόριο DNA με αυτές. Οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες, όπως ο καταστολέας, ονομάζονται transδραστικοί παράγοντες (trans-acting factors), επειδή μπορούν να επηρεάζουν την έκφραση γονιδίων που βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα του κυττάρου (ή εντοπίζονται μακριά από ένα γόνίδιο ή οπερόνιο). Το οπερόνιο lac αποτελεί παράδειγμα αρνητικού ελέγχου, καθώς η πρόσδεση του καταστολέα εμποδίζει τη μεταγραφή. Αυτό ωστόσο δεν αποτελεί το μοναδικό δυνατό σενάριο. Πολλοί trans-δραστικοί παράγοντες λειτουργούν ως ενεργοποιητές και όχι ως αναστολείς της μεταγραφής. 34

35 Οργάνωση του οπερονίου lac και η απόκριση του παρουσία ή απουσία της λακτόζης 35

36 Το καλύτερο παράδειγμα θετικού ελέγχου στο Ε. coli αφορά την επίδραση της γλυκόζης στην έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα του καταβολισμού άλλων σακχάρων, όπως της λακτόζης. Τα σάκχαρα αυτά αποτελούν εναλλακτικές πηγές άνθρακα και ενέργειας. Επειδή όμως η γλυκόζη αποτελεί την προτιμώμενη από το κύτταρο πηγή άνθρακα και ενέργειας, όταν είναι διαθέσιμη δε συντίθονται τα ένζυμα που συμμετέχουν στον καταβολισμό άλλων σακχάρων. Αν το Ε. coli αναπτύσσεται σε θρεπτικό μέσο που περιέχει και γλυκόζη και λακτόζη, δεν επάγεται το οπερόνιο lac και τα βακτήρια χρησιμοποιούν μόνον τη γλυκόζη. Επομένως, η παρουσία της γλυκόζης εμποδίζει / αναστέλλει την επαγωγή του οπερονίου lac ακόμα και παρουσία του επαγωγέα του (δηλ. της λακτόζης). Αυτό ονομάζεται καταβολική καταστολή, και επιτυγχάνεται με τη βοήθεια ενός συστήματος θετικού ελέγχου, που συνδέεται με το ενδοκυτταρικό επίπεδο του κυκλικού AMP (camp, cyclic AMP). 36

37 ΕΙΚΟΝΑ 7.9: Θετική ρύθμιση του οπερονίου lac από τη γλυκόζη. Όταν τα επίπεδα γλυκόζης είναι μειωμένα, ενεργοποιείται η αδενυλική κυκλάση, που μετατρέπει το ATP σε camp. Το camp προσδένεται στον ενεργοποιητή καταβολικών γονιδίων (CAP) και διεγείρει την πρόσδεση του σε ρυθμιστικές αλληλουχίες διαφόρων οπερονίων. Τα οπερόνια που ενεργοποιούνται από τον CAP κωδικοποιούν ένζυμα του μεταβολισμού άλλων, πέραν της γλυκόζης, εναλλακτικών σακχάρων, για παράδειγμα της λακτόζης. Η πρωτεΐνη CAP διευκολύνει την πρόσδεση της RNA πολυμεράσης στον υποκινητή μέσω αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσει με την υπομονάδα α του ενζύμου. Όταν τα επίπεδα της γλυκόζης είναι χαμηλά και κατά συνέπεια τα επίπεδα του camp υψηλά, η CAP μπορεί να προσδεθεί στο οπερόνιο lac περίπου 60 βάσεις ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Κατόπιν, η CAP αλληλεπιδρά με την υπομονάδα α της RNA πολυμεράσης και ενεργοποιεί τη μεταγραφή διευκολύνοντας την πρόσδεση του ενζύμου στον υποκινητή. 37

38 Συστηματική μεταλλαξιγένεση στις ρυθμιστικές περιοχές υποκινητών Έχει πραγματοποιηθεί σε κυτταρικές σειρές και σε μικροβιακά συστήματα όπως στο E. coli, συστηματική μεταλλαξιγένεση στις ρυθμιστικές περιοχές υποκινητών που μπορούν να επηρεάζουν την γονιδιακή έκφραση, ώστε να προσδιοριστούν ποιά νουκλεοτίδια μίας ακολουθίας είναι πραγματικά σημαντικά στη γονιδιακή ρύθμιση. Το συγκεκριμένο παράδειγμα αναφέρεται στην πορεία σύνθεσης της λακτόζης στο Ε. coli. Συστηματική μεταλλαξιγένεσης στη ρυθμιστική περιοχή του υποκινητή lac του E. coli. (Α) Mεταλλαγμένοι υποκινητές lac στην περιοχή [-75: -1] για να οδηγήσουν την έκφραση της GFP. (Β) Τα πλασμίδια που περιέχουν μεταλλαγμένο υποκινητή lac που οδηγεί την έκφραση της GFP μετασχηματίστηκαν σε βακτηριακά κύτταρα Ε. coli, και στη συνέχεια τα κύτταρα επιλέχθηκαν μέσω κυτταρομετρία ροής (ανάλυση με FACS; Fluorescence Activated Cell Sorting). Αλληλούχιση των μεταλλαγμένων υποκινητών σε κάθε FACS έδωσε μια μακρά λίστα των ακολουθιών σ με αντίστοιχες μετρήσεις μ).

39 Καταβολική καταστολή του οπερονίου Lac (α) Κατά την απουσία γλυκόζης, τα επίπεδα της camp αυξάνονται, γεγονός που οδηγεί στον σχηματισμό του συμπλόκου camp-cap, που προσδένεται στη θέση CAP στον υποκινητή και επάγει τη μεταγραφή. (β) Κατά την παρουσία γλυκόζης, τα επίπεδα της camp μειώνονται, δε σχηματίζονται σύμπλοκα camp-cap και δεν παρατηρείται επαγωγή της μεταγραφής. 39

40 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Η συμπεριφορά του οπερονίου lac στην απουσία/παρουσία λακτόζης σε ένα βακτήριο που φέρει τη μεταλλαγή laci, lacιs ή τη μεταλλαγή lacoc : 1.Τι θα συμβεί στην έκφραση του οπερονίου lac απουσία λακτόζης, αν μια μετάλλαξη στο γονίδιο lacι, γνωστή ως laci, επηρεάζει τη θέση δέσμευσης του καταστολέα i στο DNA? 2.Τι θα συμβεί στην έκφραση του οπερονίου lac απουσία λακτόζης, αν μια μετάλλαξη στο χειριστή laco, γνωστή ως lacoc, παρεμποδίζει τη δέσμευση του καταστολέα i στο στο χειριστή? 3. Τι θα συμβεί στην έκφραση του οπερονίου lac παρουσία λακτόζης, αν μια μετάλλαξη στο γονίδιο lacι, γνωστή ως lacιs, τροποποιεί τη δέσμευση της λακτόζης στον καταστολέα i? 40

41 Η ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 41

42 Η μεταγραφή βασίζεται στους ίδιους θεμελιώδεις μηχανισμούς σε όλα τα κύτταρα Είναι πιο πολύπλοκη στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς απ' ότι στα βακτήρια. Αυτό οφείλεται σε 3 διαφορές ανάμεσα τους: 1. Ενώ στα βακτήρια όλα τα γονίδια μεταγράφονται από μια κεντρική RNA πολυμεράση, τα ευκαρυωτικά κύτταρα διαθέτουν διαφορετικές RNA πολυμεράσες που μεταγράφουν διαφορετικά είδη γονιδίων (RNAP I, II & III). 2. Οι ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες πρέπει να αλληλεπιδράσουν με ποικίλες άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες στο πλαίσιο της έναρξης και της ρύθμισης της μεταγραφής. 3. Σε αντίθεση με το προκαρυωτικά, το ευκαρυωτικά DNA είναι οργανωμένο σε χρωματίνη και σε μεγάλο βαθμό η μεταγραφική ενεργότητα των ευκαρυωτικών γονιδίων ρυθμίζεται στο επίπεδο της δομής της χρωματίνης τους. Η αυξημένη πολυπλοκότητα της ευκαρυωτικής μεταγραφής προσφέρει επιπλέον δυνατότητες ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης, γεγονός που διευκολύνει τη δημιουργία πολλών διαφορετικών κυτταρικών τύπων με χαρακτηριστικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης στους πολυκύτταρους οργανισμούς. Σε αντίθεση με τα προκαρυωτικά. στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η μεταγραφή και η μετάφραση διαχωρίζονται στο χώρο (διαμερισματοποίηση). Η μεταγραφή διεξάγεται στον πυρήνα, ενώ η πρωτεϊνοσύνθεση στο κυτταρόπλασμα. 42

43 ΠΙΝΑΚΑΣ 7.1: Κατηγορίες γονιδίων που μεταγράφονται από τις ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες. RNAP I: συνθέτει rrna - 5.8S, 18S, 28S RNAP II: συνθέτει mrna και mirna (snrna & scrna) RNAP III: 5S rrna και trna (snrna & scrna) Οι ευκαρυωτικές RNAP Ι, ΙΙ, ΙΙΙ δεν έχουν έναn παράγοντα σ όπως η προκαρυωτική RNAP, αλλά στρατολογούνται σε θέσεις έναρξης της μεταγραφής από βοηθητικές πρωτεΐνες (γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες) που αναγνωρίζουν υποκινητές. Καθεμιά ευκαρυωτική RNAP αναγνωρίζει ένα διαφορετικό υποκινητή. *Μερικά μικρά πυρηνικά RNA (small nuclear; snrna) και μικρά κυτταροπλασματικά (small cytoplasmic; scrna μεταγράφονται από την RNA Pol II, ενώ άλλα μεταγράφονται από την RNA Pol IIΙ. **Οι μιτοχονδριακές και χλωροπλαστικές RNA πολυμεράσες μοιάζουν με τα αντίστοιχα βακτηριακά ένζυμα 43

44 Οι τρεις RNA πολυμεράσες του πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων είναι σύνθετα ένζυμα, που αποτελούνται από υπομονάδες. Αν και αναγνωρίζουν διαφορετικούς υποκινητές και μεταγράφουν διαφορετικά είδη γονιδίων, μοιράζονται αρκετά κοινά χαρακτηριστικά τόσο μεταξύ τους όσο και με τις βακτηριακές RNA πολυμεράσες. Συγκεκριμένα, περιέχουν 9 συντηρημένες υπομονάδες, 5 από τις οποίες είναι όμοιες με τις υπομονάδες α, β, β' και ω της βακτηριακής RNAP. Η δομή της RNAPII του σακχαρομύκητα μοιάζει ιδιαίτερα με αυτή του βακτηριακού ενζύμου γεγονός που υποδεικνύει ότι ο βασικός μηχανισμός λειτουργίας όλων των RNAP είναι εξελικτικά συντηρημένος. ΕΙΚΟΝΑ 7.10: Δομή της RNA πολυμεράσης ΙΙ του σακχαρομύκητα. Οι διαφορετικές υπομονάδες απεικονίζονται με διαφορετικά χρώματα (Kramer PD, et al., Science 292:1863) 44

45 ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΙ ΥΠΟΚΙΝΗΤΕΣ Διαφορές των υποκινητών μεταξύ των ευκαρυωτικών και προκαρυωτικών γονιδίων που αναγνωρίζονται από τις RNA πολυμεράσες Καθεμιά ευκαρυωτική RNAP αναγνωρίζει ένα διαφορετικό υποκινητή Τα ευκαρυωτικά γονίδια, εκτός από τους υποκινητές, έχουν και ενισχυτές: Οι ενισχυτές είναι αλληλουχίες που αυξάνουν σημαντικά την αποτελεσματικότητα των υποκινητών και επομένως την ισχύ και το ρυθμό της μεταγραφής. Οι ενισχυτές παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης ενός γονιδίου σε ένα συγκεκριμένο ιστό (ιστοειδική ρύθμιση) ή κατά την ανάπτυξη. Η θέση των ενισχυτών στο DNA διαφέρει σε σχέση με τους υποκινητές. Μεταγραφικοί παράγοντες διευκολύνουν τις ευκαρυωτικές RNAP να αναγνωρίσουν τις θέσεις έναρξης της μεταγραφής των γονιδίων που μεταγράφουν. Π.χ., Μεταγραφικοί παράγοντες κατηγορίας Ι για την RNAP I; Κατηγορίας ΙΙ για την RNAP II, και κατηγορίας ΙΙΙ για την RNAP III. Τα ρυθμιστικά στοιχεία που εντοπίζονται στη ίδια αλυσίδα του DNA ονομάζονται ρυθμιστικά στοιχεία in cis, τα οποία αναγνωρίζονται από μεταγραφικούς παράγοντας που κωδικοποιούνται από άλλα γονίδια που εντοπίζονται είτε κοντά στο γονίδιο ή σε διαφορετικές θέσεις του γονιδιώματος, και επομένως οι μεταγραφικοί παράγοντες λειτουργούν είτε in cis ή in trans. 45

46 Γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες και έναρξη της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση II (RNAP II) Η RNA πολυμεράση II είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση του mrna των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Αρχικές μελέτες του ενζύμου κατέδειξαν ότι συμπεριφέρεται διαφορετικά από την προκαρυωτική RNAP. Η προκαρυωτική RNAP μπορεί να μεταγράψει in vitro τις αλληλουχίες ενός μορίου DNA που βρίσκονται καθοδικά από κάποιον υποκινητή τον οποίο αναγνωρίζει. Δεν ισχύει όμως το ίδιο για την ευκαρυωτική RNΑ Pol II, καθώς αρχίζει τη μεταγραφή μόνο αν προστεθούν στην αντίδραση επιπλέον πρωτεΐνες (Robert Roeder, 1979). Επομένως, η μεταγραφή στα ευκαρυωτικά συστήματα χρειάζεται παράγοντες έναρξης, που (σε αντίθεση με τους βακτηριακούς παράγοντες σ) δεν αποτελούν συστατικά της πολυμεράσης. Μεταγενέστερα, με βιοχημική κλασμάτωση πυρηνικών εκχυλισμάτων, εντοπίστηκε μια σειρά από πρωτεΐνες που ονομάστηκαν μεταγραφικοί παράγοντες (transcription factors) και είναι απαραίτητες για την έναρξη της μεταγραφής από την RNAP II. Οι γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες (ΓΜΠ) συμμετέχουν στη μεταγραφή από όλους τους υποκινητές της RNAP II και συνεπώς αποτελούν στοιχεία του βασικού μηχανισμού της μεταγραφής από το ένζυμο αυτό. Επιπρόσθετα, ειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες προσδένονται ο καθένας σε ρυθμιστικές αλληλουχίες συγκεκριμένων γονιδίων και ελέγχουν την έκφραση τους. Έχει υπολογιστεί ότι περίπου το 10% των γονιδίων του ανθρώπινου γονιδιώματος κωδικοποιεί μεταγραφικούς παράγοντες, γεγονός ενδεικτικό της σημασίας αυτών των πρωτεϊνών. 46

47 ΓΕΝΙΚΗ ΔΟΜΗ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ ΕΝΟΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ RNAP II Τα στοιχεία κεντρικού υποκινητή εντοπίζονται συνήθως ανάμεσα στις θέσεις 40 και +40 νουκλεοτίδια σε σχέση με το σημείο έναρξης της μεταγραφής, που αντιστοιχεί στο σημείο +1. Το στοιχείο BRE αναγνωρίζεται από το γενικό μεταγραφικό παράγοντα TFIIB και μπορεί να εντοπίζεται σε οποιαδήποτε πλευρά του πλαισίου TATA ή πλαισίου Hogness (Hogness box) όπου προσδένεται ο ΓΜΠ TFIID Το εναρκτήριο στοιχείο Inr συναντάται σε όλους τους υποκινητές και περιλαμβάνει το νουκλεοτίδιο +1. Καθοδικά από το σημείο έναρξης βρίσκονται το στοιχείο 10 βάσεων (MTE; Motif Ten Element) και το καθοδικό στοιχείο υποκινητή (DPE; Downstream Promoter Element). Όταν το ΜΤΕ εντοπίζεται μεταξύ +18 & +27 nt του Inr, τότε προάγει τη μεταγραφή. Ενώ το ΜΤΕ λειτουργεί ανεξάρτητα από το πλαίσιο ΤΑΤΑ, το DPE συνεργάζεται με τον Inr για την έναρξη της μεταγραφής σε υποκινητές που δε φέρουν πλαίσιο ΤΑΤΑ για την πρόσδεση του TFIID. 47

48 Γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες και έναρξη της μεταγραφής από την RNA Pol II Οι υποκινητές των γονιδίων που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση II περιέχουν αρκετά διαφορετικά ρυθμιστικά στοιχεία γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Το πρώτο που εντοπίστηκε ήταν μια αλληλουχία παρόμοια με το ΤΑΤΑΑ, νουκλεοτίδια ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, που ονομάζεται πλαίσιο TATA (TATA box), που μοιάζει με το στοιχείο -10 των βακτηριακών υποκινητών. Αρχικά θεωρήθηκε ότι χαρακτηρίζει όλους τους υποκινητές των γονιδίων που μεταγράφονται από την RNA Pol II, αλλά μελέτες σε επίπεδο γονιδιώματος κατέδειξαν ότι το πλαίσιο TATA υπάρχει μόνο στο 10-20% των υποκινητών της RNA Pol II. Άλλες ρυθμιστικές αλληλουχίες των υποκινητών των γονιδίων που μεταγράφονται από την RNΑ Pol II είναι ο εναρκτής Inr (initiator), που περιβάλλει τη θέση έναρξης της μεταγραφής, το στοιχείο αναγνώρισης του TFIIB, BRE, που βρίσκεται ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, καθώς και αρκετά στοιχεία που βρίσκονται καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (DPE, DCE και ΜΤΕ). Οι υποκινητές διαφορετικών γονιδίων περιέχουν ποικίλους συνδυασμούς αυτών των στοιχείων, τα οποία συμμετέχουν από κοινού στην πρόσδεση των γενικών μεταγραφικών παραγόντων. Τουλάχιστον 5 ΓΜΠ απαιτούνται για την έναρξη της μεταγραφής από την RNAP II σε in vitro συστήματα. Το πρώτο βήμα για το σχηματισμό του μεταγραφικού συμπλόκου είναι η πρόσδεση στον υποκινητή ενός ΓΜΠ, του TFIID. Ο TFIID αποτελείται από πολλές υπομονάδες, συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνης πρόσδεσης στο TATA (ΤΒΡ, TATA-Binding Protein) και άλλων 14 πολυπεπτιδίων, που ονομάζονται παράγοντες που συνδέονται με την ΤΒΡ (TAF, TBP-Associated Factors). Η ΤΒΡ προσδένεται στο πλαίσιο TATA, ενώ οι TAF προσδένονται στα στοιχεία Inr, DPE, DPC και ΜΤΕ. Η πρόσδεση του TFIID ακολουθείται από τη στρατολόγηση ενός δεύτερου γενικού TF, του TFIIB, που αλληλεπιδρά με την ΤΒΡ αλλά και με το στοιχείο BRE. Στη συνέχεια, ο TFIIB λειτουργεί ως γέφυρα για την RNAP II, η οποία, αφού προηγουμένως προσδεθεί σε έναν τρίτο ΓΜΠ, τον TFIIF, προσδένεται στο σύμπλοκο TBP-TFIIB. Μετά την πρόσδεση της RNA Pol II στον υποκινητή, η πρόσδεση δύο ακόμα ΓΜΠ, του TFIIE και TFIIH, ολοκληρώνει τον σχηματισμό του προεναρκτήριου συμπλόκου (preinitiation complex; PIC) 48

49 Γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες και έναρξη της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση II ΕΙΚΟΝΑ 7.11: Ο σχηματισμός in vitro του προεναρκτήριου συμπλόκου της RNA πολυμεράσης ΙΙ. TFIID (TBP & TAFs) TFIIB RNAP II + TFIIF TFIIE + TFIIH Οι υποκινητές της RNAPΙΙ περιλαμβάνουν διάφορες ρυθμιστικές αλληλουχίες, όπως το πλαίσιο ΤΑΤΑ νουκλεοτίδια ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, το στοιχείο αναγνώρισης του TFIIB, BRE, 35 νουκλεοτίδια ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, τον εναρκτή Inr, που περιβάλλει τη θέση έναρξης της μεταγραφής, καθώς και διάφορα στοιχεία που βρίσκονται καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, DCE, MTE και DPE. Ο σχηματισμός του προεναρκτήριου συμπλόκου (PIC) της μεταγραφής αρχίζει με την πρόσδεση του ΓΜΠ, TFIID. Μια υπομονάδα του TFIID, η πρωτεΐνη πρόσδεσης στο ΤΑΤΑ, TBP, προσδένεται στο πλαίσιο ΤΑΤΑ. Άλλες υπομονάδες του TFIID, οι παράγοντες που συνδέονται με την TBP (TAF), προσδένονται στον εναρκτή Inr, καθώς και στα στοιχεία που βρίσκονται καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής DCE, MTE και DPE. Κατόπιν, στρατολογείται ο TFIIB (B), που προσδένει στην TBP και στο στοιχείο BRE. Ακολουθεί η πρόσδεση της RNAPII που βρίσκεται ήδη συνδεδεμένη με τον TFIIF (F). Ο σχηματισμός του PIC ολοκληρώνεται με την προσθήκη του TFIIE (E) και του TFIIH (H). CTD (Carboxy-Terminal Domain) καρβοξυτελική επικράτεια της μεγαλύτερης υπομονάδας της RNAP II 49

50 ΕΙΚΟΝΑ 7.12: Μοντέλο του προεναρκτήριου συμπλόκου της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Ένα μοριακό μοντέλο της RNA πολυμεράσης ΙΙ (γκρι), της TBP (πράσινο), του TFIIB (κίτρινο), του TFIIE (μοβ), του TFIIF (μπλε) και του TFIIH (καφέ) στη μορφή του συμπλόκου που συγκροτούν πάνω σε έναν υποκινητή. Στη φωτογραφία, ο προσανατολισμός του προεναρκτήριου συμπλόκου πάνω στο DNA είναι αντίστροφος από αυτόν της Εικ (Bushnell D.A., et al., Science 303: 983). 50

51 Οι 5 γενικοί ΓΜΠ και η RNA Pol II, που στρατολογούνται διαδοχικά πάνω στον υποκινητή, συνιστούν το ελάχιστο απαιτούμενο σύστημα για τη μεταγραφή in vitro. 51

52 O TFIIH αποτελείται από πολλές υπομονάδες και έχει δύο σημαντικούς ρόλους: (α) Δύο υπομονάδες του είναι DNA ελικάσες που ξετυλίγουν το DNA γύρω από την περιοχή έναρξης. Πρόκειται για τις πρωτεΐνες ΧΡΒ (ERCC3) και XPD (ERCC2), που είναι απαραίτητες για την επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (nucleotide-excision repair) (β) Μια άλλη υπομονάδα του ΤFIΙΗ η CDK7 κινάση φωσφορυλιώνει μια αμινοξική αλληλουχία που επαναλαμβάνεται στην καρβοξυτελική επικράτεια (CTD, Carboxy-Terminal Domain) της μεγαλύτερης υπομονάδας της RNAP II. Η CTD της RNAP II περιλαμβάνει, στον άνθρωπο, 52 διαδοχικές επαναλήψεις 7 αμινοξέων με πρότυπη αλληλουχία την Tyr-Ser-Pro-ThrSer-Pro-Ser. Η φωσφορυλίωση από την CDK7 κινάση του ΤFIΙΗ των επαναλήψεων της CTD στη Ser της θέσης 5 της πρότυπης αλληλουχίας οδηγεί στην αποδέσμευση της RNAP II από το προεναρκτήριο σύμπλοκο και προκαλεί την έναρξη της μεταγραφής. 52

53 Η έναρξη όμως της μεταγραφής στο κύτταρο προϋποθέτει την παρουσία επιπλέον παραγόντων. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνεται ένα μεγάλο πρωτεϊνικό σύμπλοκο, που ονομάζεται διαμεσολαβητής (Mediator), που αποτελείται από >20 διαφορετικές υπομονάδες και αλληλεπιδρά τόσο με τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες όσο και με την RNAP lι. Ο διαμεσολαβητής όχι μόνο ενεργοποιεί την έναρξη της μεταγραφής από τους ΓΜΠ, αλλά και διαδραματίζει κύριο ρόλο στη σύνδεση των ΓΜΠ με τους ειδικούς, για κάθε γονίδιο, μεταγραφικούς παράγοντες (ΕΜΠ) που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση. Οι πρωτεΐνες του διαμεσολαβητή αποδεσμεύονται από την RNAPII μετά τη συναρμολόγηση του προεναρκτήριου συμπλόκου και τη φωσφορυλίωση της CTD της RNAPII. Η φωσφορυλιωμένη CTD προσδένεται σε άλλες πρωτεΐνες που χρειάζονται για την επιμήκυνση και την ωρίμανση του mrna. 53

54 ΕΙΚΟΝΑ 7.13: Το σύμπλοκο της RNA πολυμεράσης ΙΙ με τον διαμεσολαβητή και η έναρξη της μεταγραφής. Η RNA Pol ΙΙ αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες του διαμεσολαβητή, καθώς και με τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες στην περιοχή του υποκινητή. Ο διαμεσολαβητής προσδένεται στη μη φωσφορυλιωμένη CTD της RNA Pol ΙΙ. Η φωσφορυλίωση της CTD έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση του διαμεσολαβητή και την έναρξη της μεταγραφής. Η φωσφορυλιωμένη CTD αλληλεπιδρά με παράγοντες επιμήκυνσης και επεξεργασίας του μεταγράφου που υποβοηθούν τη σύνθεση και επεξεργασία του mrna. 54

55 Σχηματισμός του PIC της RNAP ΙΙ Η συναρμολόγηση των γενικών μεταγραφικών παραγόντων είναι απαραίτητη για την έναρξη της μεταγραφής από την RNAP II 55

56 Ρόλος του διαμεσολαβητή στη μεταγραφή: Ο σχηματισμός βρόχου επιτρέπει σε ειδικούς μεταγραφικούς παράγοντες που προσδένονται σε έναν ενισχυτή ή σε έναν αποσιωπητή σε απόσταση από τον υποκινητή να αλληλεπιδρούν με τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες του προεναρκτήριου συμπλόκου και να ρυθμίζουν τα επίπεδα της μεταγραφής. 56

57 Περίληψη (Βίντεο): από το Molecular Biology: Principles of Genome Function Second edition, Oxford Press 57

58 Μεταγραφή από τις RNA πολυμεράσες I και III RNA πολυμεράση I Γονίδια 28S, 18S και 5,8S του ριβοσωμικού RNA (rrna) RNA πολυμεράση III Γονίδια 5S rrna και trna και ορισμένα μικρά RNA 58

59 Ευκαρυωτικό ριβόσωμα και Γονίδια rrna "S" σημαίνει "Svedberg", μια μονάδα σχετικού ρυθμού καθίζησης σε διαβαθμισμένες στήλες CsCl Προκειμένου να ανταποκριθούν στην ανάγκη για μεγάλο αριθμό μορίων rrna, όλα τα κύτταρα περιέχουν πολυάριθμα αντίγραφα των γονιδίων rrna. Το γονιδίωμα του ανθρώπου περιέχει ~200 αντίγραφα των γονιδίωνπου κωδικοποιεί τα 5.8S, 18S και 28S rrna και ~2.000 αντίγραφα του γονιδίου που κωδικοποιεί το 5S rrna. Τα γονίδια των 5.8S, 18S και 28S rrna ομαδοποιούνται σε συστοιχίες διαδοχικών επαναλήψεων σε 5 διαφορετικά ανθρώπινα χρωμοσώματα (Chr 13, 14, 15, 21 και 22), ενώ τα γονίδια του 5S rrna εντοπίζονται σε μία μόνο συστοιχία διαδοχικών επαναλήψεων στο Chr 1. Venkatraman Ramakrishnan, Thomas A Steitz και Ada E Yonath, Nobel Χημείας (2009) για τις μελέτες τους στη δομή και τη λειτουργία του ριβοσώματος 59

60 Γονίδια του ριβοσωμικού rrna και οργάνωση του πυρηνίσκου Ο πυρηνίσκος, που δεν περιβάλλεται από μεμβράνη, συνδέεται με χρωμοσωμικές περιοχές όπου περιέχονται τα γονίδια 5.8S, 18S και 28S rrna. Τα ριβοσώματα των ανώτερων ευκαρυωτών περιέχουν 4 τύπους RNA: 5S (120 bp), 5.8S (160 bp), 18S (1874 bp) και 28S (4718 bp) rrna. Τα γονίδια 5.8S, 18S και 28S rrna, που εντοπίζονται ως συστοιχία, μεταγράφονται ως ενιαία μονάδα μέσα στον πυρηνίσκο από την RNA πολυμεράση I, που παράγει ένα πρόδρομο rrna, το 45S. Το 45S προ-rrna υφίσταται επεξεργασία, παράγοντας το 18S rrna της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας (40S) και τα 5.8S και 28S rrna της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας (60S). Η μεταγραφή του 5S rrna, που επίσης συναντάται στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα 60S, διεξάγεται εκτός του πυρηνίσκου, στον πυρήνα, στους ανώτερους ευκαρυώτες και καταλύεται από την RNA πολυμεράση III. Γενετικός τόπος rdna στον πυρηνίσκο RNA Pol I 18S rrna (40S) και 5.8S & 28S (60S) ΕΙΚΟΝΑ 9.25: Τα γονίδια του ριβοσωμικού RNA. Κάθε γονίδιο rrna αποτελεί μια μονάδα μεταγραφής που περιέχει τα 18S, 5,8S και 28S rrna, καθώς και μεσοδιαστήματα μεταγραφόμενων αλληλουχιών. Τα γονίδια rrna οργανώνονται σε συστοιχίες διαδοχικών επαναλήψεων, οι οποίες χωρίζονται μεταξύ τους από μεσοδιαστήματα μη μεταγραφόμενου DNA. Πολλά από τα ανθρώπινα γονίδια 45S rrna είναι ψευδογονίδια. 60

61 Μεταγραφή από τις RNA πολυμεράσες I και III Η RNA πολυμεράση I είναι υπεύθυνη αποκλειστικά για τη μεταγραφή των 28S, 18S και 5,8S γονιδίων του ριβοσωμικού RNA (rrna), που οργανώνονται σε διαδοχικές επαναλήψεις. Από τη μεταγραφή τους προκύπτει αρχικά ένα μεγάλο πρόδρομο προrrna, το 45S, από το οποίο στη συνέχεια παράγονται τα 28S, 18S και 5,8S rrna. Ο υποκινητής των γονιδίων του rrna εκτείνεται ~150 bp ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής και αναγνωρίζεται από δύο μεταγραφικούς παράγοντες. RNA πολυμεράση I 60S: 5,8S, 28S + 5S rrna 40S: 18S rrna ΕΙΚΟΝΑ 7.14: Τα γονίδια του ριβοσωμικού RNA. Το ριβοσωμικό DNA (rdna) μεταγράφεται σε ένα μεγάλο πρόδρομο μόριο RNA (το 45S prerrna), από το οποίο στη συνέχεια αποκόπτονται τα 28S, 18S και 5,8S rrna. 61

62 Οι μεταγραφικοί παράγοντες, που ονομάζονται ανοδικός παράγοντας πρόσδεσης (UBF, Upstream Binding Factor) και παράγοντας επιλεκτικότητας 1 (SL1, Selectivity factor 1), προσδένονται συνεργιακά στον υποκινητή και κατόπιν στρατολογούν την RNΑ πολυμεράση I, οπότε σχηματίζεται το σύμπλοκο έναρξης της μεταγραφής. Ο SL1 αποτελείται από 4 πρωτεϊνικές υπομονάδες, μία από τις οποίες είναι η ΤΒΡ (πρωτεΐνη πρόσδεσης στο πλαίσιο ΤΑΤΑ), και 3 υπομονάδες TAF (TAF1A, TAF1B, TAF1C). Καθώς ο υποκινητής των γονιδίων του rrnα δεν περιέχει πλαίσιο TATA, η ΤΒΡ δεν προσδένεται σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία του υποκινητή. Η σύνδεση της επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσει με τις υπομονάδες του SL1 (R. Tjian, 1985). Υποκινητής 45 S rrna (Γονίδια 28S, 18S και 5,8S) UBF SL1 RNAP I ΕΙΚΟΝΑ 7.15: Η έναρξη της μεταγραφής του rdna. Δύο μεταγραφικοί παράγοντες, ο UBF και ο SL1, συνδέονται συνεργειακά στον υποκινητή του rdna και στρατολογούν την RNA πολυμεράση Ι, προκειμένου να σχηματιστεί το σύμπλοκο έναρξης. Μια υπομονάδα του SL1 είναι η πρωτεΐνη πρόσδεσης στο ΤΑΤΑ (TBP). 62

63 Γονίδια 5S rrna Σε αντίθεση με τα γονίδια 5.8S, 18S και 28S rrna που εντοπίζονται στον πυρηνίσκο όπου και μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση I, τα γονίδια 5S rrna εντοπίζονται στον πυρήνα ως συστοιχίες διαδοχικών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών, και μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ. ~2.000 αντίγραφα των γονιδίων 5S rrna στο Chr1 Οργάνωση των γονιδίων 5S rrna. Τα γονίδια 5S rrna εντοπίζονται σε πολλαπλά αντίγραφα στο Chr1, καθένα από τα οποία φέρει μια κωδική περιοχή 200 bp από το κωδικόνιο έναρξης της μεταγραφής στο κωδικόνιο λήξης της μεταγραφής που μετά από επεξεργασία το ώριμο 5S rrna που ενσωματώνεται στην μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα 60S, έχει μέγεθος 120 bp. Τα γονίδια 5S rrna διαχωρίζονται μεταξύ τους με αλληλουχίες μεσοδιαστήματος (NTS; non transcribed DNA segments) διαφορετικού μεγέθους. 63

64 Γονίδια 5S rrna, trna και ορισμένα μικρά RNA που συμμετέχουν στο μάτισμα και στη μεταφορά πρωτεϊνών μεταγράφονται από την RNA Pol III. (Μάτισμα του RNA) ΕΙΚΟΝΑ 7.16: Η μεταγραφή από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ. Υπάρχουν 3 τύποι υποκινητών που χρησιμοποιούν την RNA Pol ΙΙΙ. Οι υποκινητές των γονιδίων του 5S rrna και των trna βρίσκονται καθοδικά από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (δηλ. στο εσωτερικό και όχι ανοδικά της μεταγραφόμενης αλληλουχίας). Η μεταγραφή του γονιδίου του 5S rrna αρχίζει με την πρόσδεση του TFIIIA, που ακολουθείται από την πρόσδεση του TFIIIC, του TFIIIB (που φέρει TBP) και της RNA Pol ΙΙΙ. Οι υποκινητές των γονιδίων των trna δε φέρουν τη θέση πρόσδεσης για τον TFIIA. Η μεταγραφή τους αρχίζει με την πρόσδεση του TFIIIC, που ακολουθείται από την πρόσδεση του TFIIIB και της RNA Pol III. Ο υποκινητής του γονιδίου U6 snrna βρίσκεται ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής και φέρει ένα πλαίσιο ΤΑΤΑ, που αναγνωρίζεται από την πρωτεΐνη πρόσδεσης στο ΤΑΤΑ (TBP) που αποτελεί υπομονάδα του TFIIIB. Φέρει επίσης μια θέση πρόσδεσης ενός άλλου μεταγραφικού παράγοντα, του συμπλόκου SNAP. Οι TFIIIB και SNAP προσδένονται συνεργιακά σε αυτόν τον υποκινητή. 64

65 ΡYΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Μια σημαντική διαφορά στη ρύθμιση της μεταγραφής ανάμεσα στους προκαρυώτες και τους ευκαρυώτες προκύπτει από το πακετάρισμα του ευκαρυωτικού DNA στη χρωματίνη, που περιορίζει τη διαθεσιμότητα του ως εκμαγείου (μήτρας) για τη μεταγραφή. Έτσι, η τροποποίηση της δομής της χρωματίνης διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της μεταγραφής στα ευκαρυωτικά κύτταρα. 65

66 cis-δραστικές ρυθμιστικές αλληλουχίες: Υποκινητές και Ενισχυτές Με μεθόδους μεταφοράς γονιδίων ελέγχονται περιοχές κλωνοποιημένων γονιδίων που ενδέχεται να περιέχουν cis-δραστικές αλληλουχίες. Στα πειράματα αυτά δημιουργούνται κατασκευές στις οποίες οι υπό έλεγχο αλληλουχίες συνδέονται με ένα γονίδιο αναφοράς (reporter gene) που κωδικοποιεί κάποιο εύκολα ανιχνεύσιμο προϊόν, όπως η λουσιφεράση της πυγολαμπίδας. Στη λουσιφεράση οφείλεται η βιοφωταύγεια που εμφανίζει το έντομο. Με τέτοιες κατασκευές είναι δυνατόν να διαμολυνθούν τα κύτταρα μιας καλλιέργειας, οπότε η ενδεχόμενη έκφραση του γονιδίου αναφοράς υποδεικνύει την παρουσία ενός βιολογικά ενεργού στοιχείου που επάγει τη μεταγραφή. Περαιτέρω μελέτες με in vitro μεταλλαξιγένεση είναι δυνατόν να επιτρέψουν τον ακριβή προσδιορισμό συγκεκριμένων βάσεων του DNA που είναι κρίσιμες για τη λειτουργία του cis-δραστικού στοιχείου. (Βιοφωταύγεια ονομάζεται το φαινόμενο της εκπομπής φωτός κατά την επιτέλεση μιας βιολογικής αντίδρασης. Η λουσιφεράση καταλύει την οξείδωση της λουσιφερίνης, που συνοδεύεται από την εκπομπή φωτός). ΕΙΚΟΝΑ 7.17: Ταυτοποίηση ευκαρυωτικών ρυθμιστικών αλληλουχιών. Η εν δυνάμει ρυθμιστική αλληλουχία ενός κλωνοποιημένου ευκαρυωτικού γονιδίου τοποθετείται σε ένα πλασμίδιο ανοδικά κάποιου γονιδίου αναφοράς που κωδικοποιεί ένα εύκολα ανιχνεύσιμο προϊόν. Κατόπιν, με το πλασμίδιο διαμολύνεται μια καλλιέργεια ευκαρυωτικών κυττάρων. Αν η υπό έλεγχο αλληλουχία περιλαμβάνει τη θέση αναγνώρισης ενός ενεργοποιητή της μεταγραφής, θα πρέπει στα διαμολυσμένα κύτταρα να ανιχνευτεί το προϊόν του γονιδίου αναφοράς. 66

67 ΓΕΝΙΚΗ ΔΟΜΗ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ ΕΝΟΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ RNAP II 67

68 Τα μεταγραφόμενα γονίδια από την RNA Pol II διαθέτουν ειδικές περιοχές πρόσδεσης γενικών μεταγραφικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων του πλαισίου TATA και του εναρκτή Inr. Άλλες cis-δραστικές αλληλουχίες λειτουργούν ως περιοχές πρόσδεσης ποικίλων ρυθμιστικών παραγόντων που ελέγχουν την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Αυτές οι cis-δραστικές ρυθμιστικές αλληλουχίες βρίσκονται συχνά, αλλά όχι πάντα, ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Για παράδειγμα, δύο ρυθμιστικές αλληλουχίες παρούσες σε πολλά ευκαρυωτικά γονίδια εντοπίστηκαν κατά τη μελέτη του υποκινητή ενός γονιδίου του ιού του απλού έρπητα (HSV, Herpes Simplex Virus) το οποίο κωδικοποιεί την κινάση της θυμιδίνης. Τα δύο αυτά στοιχεία βρίσκονται σε μια περιοχή 100 bp ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Οι πρότυπες αλληλουχίες τους είναι CCAAT (πλαίσιο CAAT) και GGGCGG (πλαίσιο GC). Έχουν ταυτοποιηθεί συγκεκριμένες πρωτεΐνες που προσδένονται με ειδικότητα σε αυτές τις αλληλουχίες και ενεργοποιούν τη μεταγραφή. Πλαίσιο GC Πλαίσιο CAAT Πλαίσιο GC BRE Πλαίσιο TATA Inr DCE MTE DPE ΕΙΚΟΝΑ 7.18: Ένας ευκαρυωτικός υποκινητής. Ο υποκινητής του γονιδίου της κινάσης της θυμιδίνης του HSV φέρει ανοδικά από το πλαίσιο ΤΑΤΑ τρία στοιχεία τα οποία χρειάζονται για τη μεταγραφή του σε φυσιολογικά επίπεδα: ένα πλαίσιο CCAAT και δύο πλαίσια GC των οποίων η πρότυπη αλληλουχία είναι GGGCGG. 68

69 Σε αντίθεση με τη σχετικά απλή οργάνωση των πλαισίων CCAAT και GC του υποκινητή του γονιδίου της κινάσης της θυμιδίνης του HSV, πολλά γονίδια των θηλαστικών ελέγχονται από ρυθμιστικές αλληλουχίες που βρίσκονται αρκετά μακριά (μερικές φορές περισσότερο από 50 kb) από τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Τέτοιες αλληλουχίες, που ονομάζονται ενισχυτές (enhancers), εντοπίστηκαν αρχικά κατά τη μελέτη του υποκινητή του ιού SV40. Για την αποτελεσματική μεταγραφή από αυτόν τον υποκινητή του ιού του SV40, εκτός από ένα πλαίσιο TATA και μια ομάδα 6 πλαισίων GC, χρειάζονται και 2 επαναλήψεις 72 ζευγών βάσεων που βρίσκονται ανοδικά και σε σχετικά μεγάλη απόσταση. Αυτές οι αλληλουχίες ενεργοποιούν τη μεταγραφή τόσο από αυτόν όσο και από άλλους υποκινητές. Διαπιστώθηκε απροσδόκητα ότι η δραστικότητα τους δεν εξαρτάται ούτε από την απόσταση τους από τη θέση έναρξης της μεταγραφής ούτε από τον προσανατολισμό τους σε σχέση με αυτή (Εικ. 7.20). Μπορούν να ενεργοποιήσουν τη μεταγραφή είτε τοποθετηθούν ανοδικά ή καθοδικά σε σχέση με τον υποκινητή και ανεξάρτητα από τον προσανατολισμό τους. ΕΙΚΟΝΑ 7.19: Ο ενισχυτής του SV40. Ο ενισχυτής του ιού SV40 που είναι υπεύθυνος για την έκφραση των πρώιμων γονιδίων φέρει ένα πλαίσιο ΤΑΤΑ και έξι πλαίσια GC τα οποία βρίσκονται ανά δύο σε μία αλληλουχία που επαναλαμβάνεται τρεις φορές. Προκειμένου τα επίπεδα της μεταγραφής να είναι φυσιολογικά, χρειάζεται και η παρουσία ενός ανοδικού ενισχυτή, ο οποίος αποτελείται από δύο επαναλήψεις των 72 ζευγών βάσεων. 69

70 ΕΙΚΟΝΑ 7.20: Η λειτουργία των ενισχυτών. Χωρίς τη δράση ενός ενισχυτή, ένα γονίδιο μεταγράφεται σε χαμηλά επίπεδα (Α). Παρουσία ενός ενισχυτή, Ε για παράδειγμα, των δύο επαναλήψεων 72 ζευγών βάσεων του SV40, η μεταγραφή διεγείρεται. Ο ενισχυτής είναι ενεργός όχι μόνο όταν τοποθετείται ακριβώς ανοδικά σε σχέση με τον υποκινητή (Β), αλλά και όταν τοποθετείται αρκετές κιλοβάσεις είτε ανοδικά είτε καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (Γ και Δ). Επίσης, οι ενισχυτές είναι ενεργοί ανεξάρτητα από τον προσανατολισμό τους σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής (Ε). 70

71 Οι ενισχυτές, όπως και οι υποκινητές, λειτουργούν προσδένοντας μεταγραφικούς παράγοντες (TFs) που στη συνέχεια αλληλεπιδρούν με την RNA Pol II. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της αναδίπλωσης του μορίου του DNA και του σχηματισμού ενός βρόγχου, με αποτέλεσμα ένας TF που βρίσκεται συνδεδεμένος σε κάποιον απομακρυσμένο ενισχυτή να μπορεί να αλληλεπιδράσει στον χώρο με το σύμπλοκο μεταγραφικών παραγόντων - RNA Pol ΙΙ - διαμεσολαβητή, που βρίσκεται στην περιοχή του υποκινητή. ΕΙΚΟΝΑ 7.21: Απομακρυσμένοι ενισχυτές και αναδίπλωση του DNA. Οι μεταγραφικοί παράγοντες που προσδένονται σε απομακρυσμένους ενισχυτές είναι δυνατόν, μέσω της αναδίπλωσης του DNA (του σχηματισμού βρόχου), να αλληλεπιδράσουν με το σύμπλοκο RNA πολυμεράσης ΙΙ/Διαμεσολαβητή που βρίσκεται στρατολογημένο στην περιοχή του υποκινητή. Επομένως, σε επίπεδο μηχανισμού δεν υπάρχει κάποια ουσιαστική διαφορά ανάμεσα στον τρόπο λειτουργίας των μεταγραφικών παραγόντων που προσδένονται σε απομακρυσμένους ενισχυτές και αυτών που προσδένονται σε αλληλουχίες του υποκινητή. 71

72 Οι ενισχυτές μπορούν να λειτουργήσουν από πολύ μεγάλες αποστάσεις, και μπορούν ακόμα να επηρεάσουν γονίδια που βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα. Αυτό το επιγενετικό φαινόμενο ονομάζεται διαλληλική επίδραση (transvection) και έχει μελετηθεί στην Drosophila, όπου ο ενισχυτής ενός γονιδίου μπορεί να εμφανίσει trans-δραστικότητα και να ρυθμίσει την έκφραση του αλληλομόρφου του που εδράζεται σε διαφορετικό (ομόλογο) χρωμόσωμα. Δηλαδή, οι ενισχυτές ενός αλληλόμορφου μπορούν να ενεργοποιήσουν (ή να καταστείλουν) τον υποκινητή του άλλου αλληλόμορφου στο ομόλογο χρωμόσωμα. Οι TFs που προσδένονται σε απομακρυσμένους ενισχυτές μπορούν να λειτουργήσουν με τους ίδιους μηχανισμούς όπως και οι TFs που προσδένονται στους υποκινητές. Συνεπώς, δεν υπάρχει καμία ιδιαίτερη διαφορά μεταξύ του μηχανισμού δράσης των ενισχυτών και αυτού των cis-δραστικών στοιχείων που εδράζονται κοντά στη θέση έναρξης της μεταγραφής. 72

73 Η εξειδικευμένη πρόσδεση TF σε ενισχυτές έχει καθοριστικό ρόλο στον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και διαφοροποίησης των ποικίλων κυτταρικών τύπων στους ανώτερους οργανισμούς, καθώς και κατά την απόκριση των κυττάρων σε ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες. Ένα καλά μελετημένο παράδειγμα αφορά τον ενισχυτή που ελέγχει τη μεταγραφή των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στα λεμφοκύτταρα Β. Με πειράματα μεταφοράς γονιδίων αποδείχθηκε ότι αυτή η cis-δραστική αλληλουχία είναι ενεργή μόνο στα λεμφοκύτταρα Β και όχι σε άλλους τύπους κυττάρων. Αποτελεί κεντρικό στοιχείο του μηχανισμού μέσω του οποίου διασφαλίζεται η ιστοειδική έκφραση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στον κατάλληλα διαφοροποιημένο κυτταρικό τύπο, δηλαδή στα λεμφοκύτταρα Β. ΕΙΚΟΝΑ 7.22: Ο ενισχυτής της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών (IgH). Ο ενισχυτής της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών εκτείνεται σε περίπου 200 ζεύγη βάσεων και φέρει εννέα ρυθμιστικές αλληλουχίες (Ε, με1-5, π, μβ & OCT), οι οποίες από κοινού διασφαλίζουν την ιστοειδική μεταγραφή στα λεμφοκύτταρα Β. 73

74 Επομένως, ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των ενισχυτών είναι ότι συχνά περιέχουν πολλαπλά cis-δραστικά στοιχεία τα οποία προσδένουν διαφορετικές το καθένα πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τη μεταγραφή. Αυτές οι πρωτεΐνες λειτουργούν από κοινού για να ρυθμίσουν τη γονιδιακή έκφραση. Οι περιοχές πρόσδεσης των μεταγραφικών παραγόντων στους υποκινητές και στους ενισχυτές προσδιορίζονται με δύο μεθόδους: (A) Ιχνηλάτηση του DNA που χρησιμοποιήθηκε και για τον χαρακτηρισμό της περιοχής πρόσδεσης της RNA πολυμεράσης στους προκαρυωτικούς υποκινητές. (Β) Δοκιμασία μεταβολής της ηλεκτροφορητικής Electrophoretic-Mobility Shift Assay). κινητικότητας (EMSΑ, Στην περίπτωση της EMSA, το υπό έλεγχο τμήμα DNA σημαίνεται στο ένα άκρο του με κάποιο ραδιοϊσότοπο, επωάζεται με την υπό έλεγχο πρωτεΐνη και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση σε μη αποδιατακτικό πήκτωμα ακρυλαμιδίου. Αν η πρωτεΐνη προσδεθεί στο σημασμένο DNA, μέρος αυτού δεσμεύεται σε ένα σύμπλοκο με μειωμένη, λόγω του μεγαλύτερου μεγέθους του, ηλεκτροφορητική κινητικότητα σε σχέση με το «γυμνό» DNA. Η ανίχνευση κατά την EMSA ενός τέτοιου συμπλόκου που κινείται βραδύτερα στην ηλεκτροφόρηση υποδεικνύει πως η πρωτεΐνη έχει προσδεθεί στο DNA. Με τη συνδυασμένη χρήση της ιχνηλάτησης του DNA και της EMSA χαρακτηρίστηκαν τα ρυθμιστικά στοιχεία των ενισχυτών και των υποκινητών ως εξειδικευμένες θέσεις πρόσδεσης συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων. 74

75 ΕΙΚΟΝΑ 7.23: Δοκιμασία μεταβολής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. Μια ποσότητα του υπό έλεγχο τμήματος DNA ραδιοσημαίνεται και στη συνέχεια χωρίζεται στα δύο. Το ένα από τα δύο δείγματα επωάζεται με την υπό έλεγχο πρωτεΐνη. Κατόπιν, τα δύο δείγματα ηλεκτροφορούνται σε ένα πήκτωμα ακρυλαμιδίου που δεν είναι αποδιατακτικό και έτσι κατά την ηλεκτροφόρηση δε διασπώνται τα σύμπλοκα DNA-πρωτεΐνης. Η πρόσδεση της πρωτεΐνης στο DNA γίνεται αντιληπτή από την παρουσία στο δείγμα που επωάστηκε με πρωτεΐνη μιας ζώνης η οποία κινείται βραδύτερα στο πήκτωμα σε σχέση με το «γυμνό» DNA. Η βραδύτερα κινούμενη ζώνη είναι το σύμπλοκο DNA-πρωτεΐνης. Τυπικά χρησιμοποιείται μεγάλη περίσσεια του ραδιοσημασμένου τμήματος DNA, με αποτέλεσμα, ακόμα και στο δείγμα όπου προστέθηκε η πρωτεΐνη, ένα μέρος του DNA να μη σχηματίζει σύμπλοκο με αυτή και να παραμένει «γυμνό». 75

76 Οι περιοχές πρόσδεσης των περισσότερων TFs αποτελούνται από βραχείες αλληλουχίες DNA μέσου μήκους 6-10 bp, που στις περισσότερες περιπτώσεις είναι εκφυλισμένες. Αυτό σημαίνει ότι σε μία ή περισσότερες θέσεις τους είναι δυνατόν να υπάρχουν περισσότερα από ένα εναλλακτικά νουκλεοτίδια, χωρίς αυτό να επηρεάζει σημαντικά την πρόσδεση του TF. Είναι σύνηθες να συγκρίνονται όλες οι γνωστές περιοχές πρόσδεσης ενός TF και τα αποτελέσματα να αναπαρίστανται σε ένα ιστόγραμμα, που υποδεικνύει τη συχνότητα με την οποία εμφανίζεται καθεμία από τις 4 βάσεις στις διάφορες θέσεις της αλληλουχίας αναγνώρισης. Καθώς όμως οι αλληλουχίες αναγνώρισης των περισσότερων TFs είναι βραχείες και εκφυλισμένες, συναντώνται πάρα πολλές φορές στο γονιδίωμα. Ασφαλώς, μόνο ένα υποσύνολο των αλληλουχιών αυτών λειτουργούν πραγματικά ως cis-ρυθμιστικά στοιχεία στα οποία προσδένεται ο συγκεκριμένος μεταγραφικός παράγοντας in vivo. Ο εντοπισμός των αυθεντικών λειτουργικών ρυθμιστικών αλληλουχιών στο γονιδιωματικό DNA παραμένει μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις της βιοπληροφορικής και της βιολογίας συστημάτων. ΕΙΚΟΝΑ 7.24: Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα περιοχών πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων. Παρουσιάζονται οι περιοχές πρόσδεσης 3 μεταγραφικών παραγόντων των θηλαστικών (AP1, Myc και SRF) στη μορφή ιστογραμμάτων. Υποδεικνύεται η συχνότητα με την οποία εμφανίζεται καθεμία από τις 4 βάσεις στις διάφορες θέσεις της αλληλουχίας αναγνώρισης. 76

77 Ο πειραματικός προσδιορισμός των αυθεντικών περιοχών πρόσδεσης TFs στο κύτταρο είναι δυνατόν να πραγματοποιηθεί με τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (ChIP, Chromatin lmmunoprecipitation). ΕΙΚΟΝΑ 7.25: Ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης. Αρχικά, τα κύτταρα υφίστανται επεξεργασία με φορμαλδεΰδη, που προκαλεί την ομοιοπολική διασύνδεση των πρωτεϊνών με τις αλληλουχίες του DNA στις οποίες βρίσκονται συνδεδεμένες in vivo. Κατόπιν, απομονώνεται η χρωματίνη και εκτίθεται σε υπερήχους, προκειμένου να τεμαχιστεί σε μικρά τμήματα μέσου μεγέθους 500 bp. Τα τμήματα αυτά της χρωματίνης επωάζονται με ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει έναν συγκεκριμένο TF (ή άλλη πρωτεΐνη). Όσα από αυτά προσδένονται στο αντίσωμα απομονώνονται με ανοσοκατακρήμνιση. Στη συνέχεια, οι ομοιοπολικές διασυνδέσεις που προκάλεσε η φορμαλδεΰδη διασπώνται και το απομονωμένο DNA που περιέχει τις θέσεις πρόσδεσης του υπό έλεγχο μεταγραφικού παράγοντα in vivo καθαρίζεται και αναλύεται με PCR. Με τον τρόπο αυτό μπορεί να διαπιστωθεί αν μια συγκεκριμένη γονιδιωματική περιοχή αποτελεί θέση πρόσδεσης του υπό εξέταση μεταγραφικού παράγοντα. 77

78 Η πρωτεΐνη εξειδίκευσης 1 (Sp1, Specificity protein 1), διεγείρει τη μεταγραφή μέσω της πρόσδεσης του ειδικά στην αλληλουχία GGGCGG του πλαισίου GC του υποκινητή του SV40. ΕΙΚΟΝΑ 7.26: Καθαρισμός του μεταγραφικού παράγοντα Sp1 με χρωματογραφία συγγένειας με το DNA. Ένα δίκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο που περιείχε επαναλήψεις της αλληλουχίας του πλαισίου GC προσδέθηκε σε σφαιρίδια αγαρόζης, που στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή μιας χρωματογραφικής στήλης. Κατόπιν, από τη στήλη διήλθε ένα μείγμα κυτταρικών πρωτεϊνών που περιείχε και τον Sp1. Δεδομένου ότι ο Sp1 προσδένεται με ειδικότητα στο πλαίσιο GC, συγκρατήθηκε εκλεκτικά από τη στήλη, ενώ οι υπόλοιπες πρωτεΐνες διήλθαν από αυτή. Τέλος, περνώντας από τη στήλη ένα διάλυμα με υψηλή συγκέντρωση αλάτων, (0,5 Μ KCl) αποσπάστηκε και συλλέχθηκε σε καθαρή μορφή ο Sp1. 78

79 ΠΕΙΡΑΜΑ-ΣΤΑΘΜΟΣ Η απομόνωση ενός μεταγραφικού παράγοντα Πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τη μεταγραφή: Ο Sp1 αναγνωρίζει ειδικά την αλληλουχία GGGCGG του πλαισίου GC και προσδένεται ισχυρά σε αυτή. Ο Sp1 και γενικότερα οι μεταγραφικοί παράγοντες αντιπροσωπεύουν μόλις το ~0,001% της συνολικής πρωτεΐνης του κυττάρου. Καθαρισμός του Sp1. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου των πρωτεϊνών που περιέχονταν στο αρχικό πυρηνικό εκχύλισμα (διαδρομή 1) και των πρωτεϊνών που ανακτήθηκαν ύστερα από έναν ή δύο γύρους καθαρισμού με τη μέθοδο της χρωματογραφίας συγγένειας με το DNA (διαδρομές 2 και 3 αντίστοιχα). Ιδιαίτερα, μετά από μόλις 2 γύρους καθαρισμού με χρωματογραφία συγγένειας με το DNA, το ~90% της πρωτεΐνης που ανακτήθηκε αποτελούνταν από 2 μόνο πολυπεπτίδια. Τα πολυπεπτίδια αυτά, με πειράματα πρόσδεσης στην αλληλουχία του πλαισίου GC και με πειράματα ελέγχου της ενεργότητας τους σε συστήματα μεταγραφής in vitro, ταυτοποιήθηκαν ως ο Sp1. Ο Sp1 αποτέλεσε λοιπόν τον πρώτο μεταγραφικό παράγοντα που απομονώθηκε επιτυχώς με τη μέθοδο της χρωματογραφίας συγγένειας με το DNA. Αριστερά από το πήκτωμα υποδεικνύονται τα μεγέθη των ζωνών του μάρτυρα μοριακού βάρους που χρησιμοποιήθηκε. Τα βέλη στα δεξιά του πηκτώματος υποδεικνύουν τη θέση των δύο πολυπεπτιδίων από τα οποία συνίσταται ο Sp1. 79

80 Μεταγραφικοί Ενεργοποιητές και Καταστολείς 80

81 Οι μεταγραφικοί ενεργοποιητές (transcriptional activators), όπως ο Sp1, προσδένονται σε ρυθμιστικές αλληλουχίες του DNA και ενεργοποιούν τη μεταγραφή. Τυπικά οι παράγοντες αυτοί αποτελούνται από 2 ανεξάρτητες επικράτειες: (α) Επικράτεια πρόσδεσης στο DNA - αναγνωρίζει συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA (β) Επικράτεια ενεργοποίησης - ενεργοποιεί τη μεταγραφή μέσω της αλληλεπίδρασης της με άλλες πρωτεΐνες της μεταγραφικής μηχανής, όπως αυτές του Διαμεσολαβητή. Η βασική λειτουργία της επικράτειας πρόσδεσης στο DNA είναι να προσδένει τον TF σε συγκεκριμένες θέσεις-στόχους του γονιδιώματος. Μετά την πρόσδεση του στις κατάλληλες ρυθμιστικές αλληλουχίες-στόχους, η επικράτεια ενεργοποίησης, η οποία λειτουργεί ανεξάρτητα, διεγείρει τη μεταγραφή μέσω της αλληλεπίδρασης της με άλλες πρωτεΐνες. ΕΙΚΟΝΑ 7.27: Η δομή των μεταγραφικών ενεργοποιητών. Οι ενεργοποιητές της μεταγραφής αποτελούνται από δύο ανεξάρτητες επικράτειες. Η επικράτεια πρόσδεσης στο DNA αναγνωρίζει μια ειδική αλληλουχία του DNA και προσδένεται σε αυτή. Η επικράτεια ενεργοποίησης αλληλεπιδρά με τον Διαμεσολαβητή ή με άλλα στοιχεία της μεταγραφικής μηχανής, προκειμένου να διεγείρει τη μεταγραφή. 81

82 Οι TFs με LZ και με HLH έχουν σημαντικό ρόλο στην ιστοειδική ρύθμιση της έκφρασης πολλών γονιδίων, καθώς και στην επαγόμενη γονιδιακή έκφραση κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες. ΕΙΚΟΝΑ 7.28: Παραδείγματα επικρατειών πρόσδεσης στο DNA. 82

83 ΕΙΚΟΝΑ 7.28: Παραδείγματα επικρατειών πρόσδεσης στο DNA. (Α) Η επικράτεια δάκτυλος ψευδαργύρου (zinc finger domain) αποτελείται από βρόχους στους οποίους συντονισμένα μια α-έλικα και ένα β-φύλλο που περιέχουν επαναλήψεις καταλοίπων κυστεΐνης και ιστιδίνης προσδένουν ένα ιόν ψευδαργύρου. Τα κατάλοιπα αυτά δεσμεύουν Zn2+ και αναδιπλώνονται σε χαρακτηριστικές επιμήκεις δομές (δάκτυλα) που προσδένονται στο DNA. Μολονότι αυτός ο τύπος επικράτειας εντοπίστηκε αρχικά στον TFIIIA, μεταγραφικό παράγοντα της RNA Pol III, είναι πολύ κοινή και μεταξύ των TF που ρυθμίζουν υποκινητές μέσω της RNA Pol II (π.χ. Sp1, υποδοχείς στεροειδών ορμονών). (Β) Η επικράτεια έλικα-στροφή-έλικα (helix-turn-helix) περιλαμβάνει 3 (ή σε ορισμένες περιπτώσεις 4) ελικοειδείς περιοχές. Η έλικα 3 είναι αυτή που πραγματοποιεί τις περισσότερες επαφές με το DNA, ενώ οι έλικες 1 και 2 διευθετούνται πάνω από την έλικα 3 κατά τέτοιο τρόπο ώστε να σταθεροποιούν την αλληλεπίδραση. Το μοτίβο έλικα-στροφήέλικα απαντάται σε πολλές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων αυτών που φέρουν ομοιοεπικράτεια (homeodomain), οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης. (Γ) Η επικράτεια φερμουάρ λευκίνης (leucine zipper) σχηματίζεται από 2 ανεξάρτητες πολυπεπτιδικές αλυσίδες που συγκροτούν ένα διμερές. Το φερμουάρ λευκίνης φέρει 4 ή 5 κατάλοιπα λευκίνης (leu) ελικοειδώς διατεταγμένα σε απόσταση 7 αμινοξέων το ένα από το άλλο. Ο διμερισμός επιτυγχάνεται χάρη στις αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται ανάμεσα στις υδρόφοβες πλευρικές ομάδες καταλοίπων leu που εκτίθενται στη μία πλευρά μιας ελικοειδούς περιοχής που ονομάζεται φερμουάρ λευκίνης. Αμέσως μετά το φερμουάρ λευκίνης συναντάται μια έλικα πλούσια σε βασικά αμινοξέα (lys & Arg), που πραγματοποιεί τις επαφές με το DNA. (Δ) Η επικράτεια έλικα-βρόχος-έλικα (helix-loop-helix) είναι παρόμοια με την επικράτεια φερμουάρ λευκίνης, από την άποψη ότι η πρόσδεση στο DNA πραγματοποιείται από ένα διμερές. Ωστόσο, οι περιοχές που αλληλεπιδρούν για τον σχηματισμό του διμερούς αποτελούνται η καθεμία από 2 ελικοειδείς περιοχές οι οποίες διαχωρίζονται από έναν βρόχο.83

84 Οι TFs που φέρουν ομοιοεπικράτεια (homeodomain) παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Τα αντίστοιχα γονίδια εντοπίστηκαν αρχικά σε στελέχη της Drosophila που έφεραν μεταλλάξεις που επηρέαζαν την ανάπτυξη της. Ορισμένες από τις πρώτες μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν στην Drosophila και ονομάστηκαν ομοιωτικές μεταλλάξεις είχαν ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη μυγών στις οποίες ένα τμήμα του σώματος τους είχε μετασχηματιστεί σε ένα άλλο. Για παράδειγμα, μια ομοιωτική μετάλλαξη που ονομάζεται Antennapedia προκαλεί την ανάπτυξη ποδιών αντί για κεραίες στο κεφάλι της μύγας. ΕΙΚΟΝΑ 7.29: Η μεταλλαγή Antennapedia. Μύγες οι οποίες φέρουν τη μεταλλαγή Antennapedia εμφανίζουν στο κεφάλι τους πόδια αντί για κεραίες. (Α) Κεφάλι μιας φυσιολογικής μύγας. (Β) Κεφάλι του μεταλλάγματος Antennapedia. 84

85 Οι επικράτειες ενεργοποίησης των TFs δεν είναι τόσο καλά χαρακτηρισμένες όσο οι επικράτειες πρόσδεσης στο DNA. Ορισμένες είναι πλούσιες σε αρνητικά φορτισμένα αμινοξέα (Asp και Glu) και ονομάζονται όξινες επικράτειες ενεργοποίησης. Άλλες είναι πλούσιες σε κατάλοιπα Pro ή Gln. Οι επικράτειες ενεργοποίησης των ευκαρυωτικών TFs ενεργοποιούν τη μεταγραφή μέσω δύο διακριτών μηχανισμών: (α) Αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες του διαμεσολαβητή και με γενικούς TFs, όπως TFIIB και TFIID, διευκολύνοντας το σχηματισμό του μεταγραφικού συμπλόκου στον υποκινητή κατά τρόπο ανάλογο με αυτόν των μεταγραφικών ενεργοποιητών στα βακτήρια. (β) Οι ευκαρυωτικοί TFs αλληλεπιδρούν με διάφορους συνενεργοποιητές (coactivators), που ενεργοποιούν τη μεταγραφή τροποποιώντας τη δομή της χρωματίνης ΕΙΚΟΝΑ 7.30: Η λειτουργία των μεταγραφικών ενεργοποιητών. Οι μεταγραφικοί ενεργοποιητές των ευκαρυωτικών οργανισμών διεγείρουν τη μεταγραφή με δύο μηχανισμούς: 1) αλληλεπιδρούν με τον Διαμεσολαβητή και τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες προκειμένου να διευκολύνουν τη συγκρότηση του μεταγραφικού συμπλόκου και 2) αλληλεπιδρούν με συνενεργοποιητές οι οποίοι διευκολύνουν τη μεταγραφή τροποποιώντας τη δομή της χρωματίνης. 85

86 Ευκαρυωτικοί καταστολείς Η γονιδιακή έκφραση στα ευκαρυωτικά κύτταρα ρυθμίζεται όχι μόνο μέσω μεταγραφικών ενεργοποιητών αλλά και μέσω μεταγραφικών καταστολέων. ΕΙΚΟΝΑ 7.31: Η λειτουργία των μεταγραφικών καταστολέων. (Α) Μερικοί καταστολείς εμποδίζουν την πρόσδεση ενεργοποιητών σε ρυθμιστικές αλληλουχίες. (Β) Άλλοι καταστολείς φέρουν μια επικράτεια η οποία καταστέλλει ενεργά τη μεταγραφή μέσω της αλληλεπίδρασής της με πρωτεΐνες του Διαμεσολαβητή ή με γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες ή με συγκαταστολείς (corepressors) που τροποποιούν τη δομή της χρωματίνης.86

87 ΕΙΚΟΝΑ 7.31: Η λειτουργία των μεταγραφικών καταστολέων. (Α) Μερικοί καταστολείς εμποδίζουν την πρόσδεση ενεργοποιητών σε ρυθμιστικές αλληλουχίες. Η πρόσδεση κάποιου καταστολέα κοντά στη θέση έναρξης της μεταγραφής ενός γονιδίου ενδέχεται να καταστέλλει την αλληλεπίδραση της RNΑ πολυμεράσης ή ορισμένων γενικών TFs με τον υποκινητή, κατά τρόπο ανάλογο με αυτόν της δράσης των μεταγραφικών καταστολέων στα βακτήρια. Άλλοι καταστολείς ανταγωνίζονται την πρόσδεση ενεργοποιητών σε συγκεκριμένες αλληλουχίες του DNΑ. Μερικοί από τους καταστολείς αυτής της κατηγορίας φέρουν την ίδια επικράτεια πρόσδεσης στο DNA με τον ενεργοποιητή τον οποίο ανταγωνίζονται, αλλά δεν έχουν επικράτεια ενεργοποίησης. Κατά συνέπεια, η πρόσδεση τους σε έναν υποκινητή ή σε έναν ενισχυτή παρεμποδίζει την πρόσδεση του ενεργοποιητή και ως εκ τούτου καταστέλλει τη μεταγραφή. (Β) Άλλοι καταστολείς φέρουν μια επικράτεια η οποία καταστέλλει ενεργά τη μεταγραφή μέσω της αλληλεπίδρασής της με πρωτεΐνες του διαμεσολαβητή ή με γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες ή με συγκαταστολείς που τροποποιούν τη δομή της χρωματίνης. Ορισμένοι καταστολείς, που ονομάζονται ενεργοί καταστολείς, δε δρουν παρεμποδίζοντας την πρόσδεση στο DNΑ κάποιων ενεργοποιητών της μεταγραφής. Οι ενεργοί καταστολείς φέρουν εξειδικευμένες λειτουργικές επικράτειες που καταστέλλουν τη μεταγραφή μέσω αλληλεπίδρασης με άλλες πρωτεΐνες. Ένα παράδειγμα αφορά ένα γονίδιο που ενέχεται στη ρύθμιση της εμβρυϊκής ανάπτυξης της Drosophila και ονομάζεται Kruppel. Η πρωτεΐνη Kruppel φέρει μια διακριτή επικράτεια με κατασταλτική δράση και έναν δάκτυλο ψευδαργύρου, μέσω του οποίου προσδένεται σε συγκεκριμένες θέσεις-στόχους του DNA. Η κατασταλτική επικράτεια της πρωτεΐνης Kruppel είναι πλούσια σε κατάλοιπα Ala, ενώ άλλες κατασταλτικές πρωτεΐνες είναι πλούσιες σε κατάλοιπα Pro ή σε όξινα κατάλοιπα. Οι στόχοι της δράσης των καταστολέων επίσης ποικίλλουν. Ορισμένοι αλληλεπιδρούν με συγκεκριμένους μεταγραφικούς ενεργοποιητές, άλλοι με τις πρωτεΐνες του Διαμεσολαβητή ή με γενικούς TFs και άλλοι με συγκαταστολείς (compressors ή corepressors) οι που τροποποιούν τη δομή της χρωματίνης. 87

88 Ρύθμιση της επιμήκυνσης του μετάγραφου 88

89 Ρύθμιση της επιμήκυνσης Η μεταγραφή πολλών γονιδίων ρυθμίζεται στο επίπεδο του σχηματισμού του προεναρκτήριου συμπλόκου και της έναρξης της μεταγραφής. Αλλά είναι δυνατόν να ρυθμιστεί και στο επίπεδο της επιμήκυνσης από κατάλληλα εξωκυτταρικά σήματα. CDK7 NELF - Negative Elongation Factor DSIF DRB Sensitivity Inducing Factor P-TEFb -Positive Transcription Elongation Factor ΕΙΚΟΝΑ 7.32: Ρύθμιση της επιμήκυνσης του μεταγράφου. Η μεταγραφή αρχίζει με τη φωσφορυλίωση της Ser5 των διαδοχικών επαναλήψεων CTD της RNA Pol ΙΙ από την κινάση CDK7 του TFIIH. Με τη φωσφορυλιωμένη CTD συνδέονται παράγοντες που ενέχονται στα αρχικά στάδια της επεξεργασίας του mrna. Επιπλέον, 2 αρνητικοί ρυθμιστές, NELF και DSIF, συνδέονται με την RNAPII και προκαλούν την παύση της μεταγραφής ~50 νουκλεοτίδια μετά τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Κατόπιν, η φωσφορυλίωση από τον P-TEFb των NELF, DSIF και Ser2 των επαναλήψεων της CTD έχει ως αποτέλεσμα τη συνέχιση της μεταγραφής και την επιμήκυνση του μεταγράφου. Ο φωσφορυλιωμένος NELF αποσυνδέεται από το σύμπλοκο και νέοι παράγοντες που χρειάζονται για την επιμήκυνση και την επεξεργασία του RNA συνδέονται στην RNA Pol II. 89

90 Επεξεργασία και μάτισμα του mrna στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Στα βακτήρια, τα ριβοσώματα έχουν άμεση πρόσβαση στα υπό σύνθεση μόρια mrna, με αποτέλεσμα η μετάφραση τους να αρχίζει ενώ ακόμα εξελίσσεται η διαδικασία της μεταγραφής τους. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, το mrna συντίθεται στον πυρήνα και θα πρέπει πρώτα να μεταφερθεί στο κυτταρόπλασμα πριν χρησιμοποιηθεί ως εκμαγείο για τη διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης. Επιπλέον, το αρχικό προϊόν της μεταγραφής στα ευκαρυωτικά κύτταρα, το πρόδρομο mrna ή προ-mrna (pre-mrna, precursor mrna), υφίσταται εκτεταμένες τροποποιήσεις πριν εξαχθεί από τον πυρήνα. Η επεξεργασία του προ-mrnα περιλαμβάνει την τροποποίηση και των δύο άκρων του, 5 & 3, και την απομάκρυνση των ιντρονίων από το εσωτερικό του Οι διαδικασίες αυτές είναι στενά συνδεδεμένες με τη διαδικασία της μεταγραφής. Επομένως, η σύνθεση και επεξεργασία του mrna στους ευκαρυώτες αποτελούν 2 στενά συνδεδεμένα στάδια της γονιδιακής έκφρασης Η καρβοξυτελική επικράτεια (CTD) της RNA Pol II συντονίζει τις 2 παραπάνω διαδικασίες, λειτουργώντας ως θέση πρόσδεσης ενζυμικών συμπλοκών επεξεργασίας του mrna. Καθώς οι RNA Pol I & III δε διαθέτουν μια ανάλογη CTD, τα μετάγραφα τους δεν αποτελούν στόχους των ίδιων ενζυμικών συμπλοκών. 90

91 Ένζυμα προσθήκης της καλύπτρας 7-μεθυλογουανοσίνης (m7g) RNA τριφωσφατάση (RNA triphosphatase) RNA γουανυλομεταφοράση (RNA guanylyltransferase) Γουανυλο-7-μεθυλομεταφοράση (RNA guanine 7-methyltransferase) ΕΙΚΟΝΑ 7.45: Η επεξεργασία του ευκαρυωτικού αγγελιαφόρου RNA. Η επεξεργασία του mrna περιλαμβάνει την τροποποίηση του 5 άκρου του μέσω της προσθήκης μιας καλύπτρας 7μεθυλογουανοσίνης (m7g). Αυτή η 5 καλύπτρα m7g σχηματίζεται με την προσθήκη στο 5 άκρο του mrna ενός GTP σε αντίστροφο προσανατολισμό, σχηματίζοντας ένα δεσμό 5-5. Το πρόσθετο G μεθυλιώνεται στη θέση Ν-7 και μεθυλομάδες προστίθενται επίσης στις ριβόζες του ενός ή των δύο πρώτων νουκλεοτιδίων του RNA. Η τροποποίηση του 3 άκρου συνίσταται στην προσθήκη μιας ουράς πολυ(α). 91

92 Τα ένζυμα υπεύθυνα για την προσθήκη της καλύπτρας 7-μεθυλογουανοσίνης (m7g) προσελκύονται από τη φωσφορυλιωμένη CTD λίγο μετά την έναρξη της μεταγραφής. Η καλύπτρα m7g προστίθεται στο 5 άκρο του μετάγραφου μετά τον πολυμερισμό των πρώτων ριβονουκλεοτιδίων από την RNAP II. Η διαδικασία αρχίζει με την προσθήκη ενός μορίου GTP στο 5' άκρο του mrna. To GTP προσδένεται με αντίθετο προσανατολισμό σε σχέση με αυτόν του ακραίου νουκλεοτιδίου του μεταγράφου, σχηματίζωντας ένα δεσμό 5-5. Το πρόσθετο G μεθυλιώνεται στη θέση Ν-7. Στη συνέχεια, προστίθενται μεθυλομάδες (-CH3) στη γουανίνη του επιπρόσθετου νουκλεοτιδίου, καθώς και στη ριβόζη του ενός ή των 2 ακραίων νουκλεοτιδίων της αναπτυσσόμενης αλυσίδας RNA. Η καλύπτρα m7g σταθεροποιεί το μόριο του RNA και το προστατεύει από τη δράση 5 -εξωριβονουκλεασών Εμπλέκεται στο μάτισμα του RNA Διευκολύνει τη μεταφορά του mrna από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα Η m7g συμβάλλει στην αλληλεπίδραση του mrna με το ριβόσωμα κατά τις διαδικασίες έναρξης της μετάφρασης, διότι η μεθυλομάδα (-CH3) σηματοδοτεί την έναρξη της μετάφρασης και διευκολύνει τη μετάφραση 92

93 Το 3' άκρο των ευκαρυωτικών mrna καθορίζεται όχι από τη θέση τερματισμού της μεταγραφής, αλλά από μια θέση πέψης του πρωτογενούς μεταγράφου στην οποία μετά από την κοπή προστίθεται μια ουρά πολυ(α) μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται πολυαδενυλίωση σήματα πολυαδενυλίωσης εξανουκλεοτίδιο nt Η πολυαδενυλίωση σταθεροποιεί το mrna ΕΙΚΟΝΑ 7.46: Σχηματισμός του 3 άκρου των ευκαρυωτικών mrna. Τα σήματα πολυαδενυλίωσης στα θηλαστικά αποτελούνται από το εξανουκλεοτίδιο AAUAAA, και μια πλούσια σε G και U αλληλουχία που βρίσκεται καθοδικά από αυτό. Επιπλέον, σε ορισμένα mrna υπάρχει και μια αλληλουχία πλούσια σε U ανοδικά του στοιχείου AAUAAA. Οι παραπάνω αλληλουχίες που σηματοδοτούν την πολυαδενυλίωση αναγνωρίζονται από ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών στο οποίο περιλαμβάνεται μία ενδονουκλεάση και μία πολυ(α) πολυμεράση. Κατά την πολυαδενυλίωση, η ενδονουκλεάση κόβει το pre-mrna νουκλεοτίδια καθοδικά του στοιχείου AAUAAA, συνήθως μετά από ένα δινουκλεοτίδιο CA. Κατόπιν, η πολυ(a) πολυμεράση προσθέτει στο 3 άκρο του RNA μια ουρά πολυ(a), η οποία αποτελείται από ~200 νουκλεοτίδια αδενίνης. 93

94 ΜΑΤΙΣΜΑ P ΕΙΚΟΝΑ 7.47: In vitro μάτισμα. Ένα γονίδιο που περιέχει ένα ιντρόνιο κλωνοποιείται καθοδικά κάποιου υποκινητή (P) ο οποίος αναγνωρίζεται από την RNA πολυμεράση ενός βακτηριοφάγου. Το πλασμίδιο πέπτεται με κάποιο ένζυμο περιορισμού το οποίο κόβει στο 3 άκρο του γονιδίου, ώστε να προκύψει ένα γραμμικό μόριο DNA. Κατόπιν, αυτό το DNA μεταγράφεται in vitro από την πολυμεράση του βακτηριοφάγου, ώστε να προκύψει το προ-mrna. Στη συνέχεια, με την προσθήκη πυρηνικών εκχυλισμάτων από κύτταρα θηλαστικών είναι δυνατή η μελέτη της διαδικασίας του ματίσματος in vitro. 94

95 Μάτισμα του προ-mrna U1 snrna U2 snrna Η 5 ΘΜ προσβάλεται από το OH της 2 θέσης ενός νουκλεοτιδίου αδενίνης, A, στο σημείο διακλάδωσης που βρίσκεται κοντά στο 3 άκρο του ιντρονίου Εμπλοκή U1 & U2 snrnas ΕΙΚΟΝΑ 7.48: Το μάτισμα του προ-mrna. Η διαδικασία του ματίσματος διεξάγεται σε δύο στάδια: Κατά το πρώτο στάδιο, η 5 θέση ματίσματος (ΘΜ) προσβάλλεται από το υδροξύλιο της 2 θέσης ενός νουκλεοτιδίου αδενίνης (στο σημείο διακλάδωσης) που βρίσκεται κοντά στο 3 άκρο του ιντρονίου. Με τον τρόπο αυτό, το 5 άκρο του ιντρονίου συνδέεται με το νουκλεοτίδιο της αδενίνης του σημείου διακλάδωσης και έτσι προκύπτει ένα ενδιάμεσο μόριο που έχει τη μορφή λάσου. Κατά το δεύτερο στάδιο κόβεται η 3 θέση ματίσματος και ταυτόχρονα τα δύο εξόνια συνδέονται μεταξύ τους, ενώ το ιντρόνιο απομακρύνεται ως ένα μόριο με μορφή λάσου το οποίο αργότερα αποικοδομείται μέσα στον πυρήνα του κυττάρου. 95

96 Το μάτισμα διεξάγεται σε μεγάλα σύμπλοκα που ονομάζονται σωμάτια ματίσματος (spliceosomes) και αποτελούνται από πρωτεΐνες και RNA. U1 snrna προσδένεται στη ΘΜ μέσω δεσμών-η Το σωμάτιο ματίσματος περιέχει 5 τύπους μικρών πυρηνικών RNA, snrna: τα U1, U2, U4, U5 και U6. Αυτά τα snrna, σχηματίζουν σύμπλοκα με 6-10 πρωτεΐνες με αποτέλεσμα τον σχηματισμό ριβονουκλεο-πρωτεϊνικών σωματίων μικρών πυρηνικών RNA (snrnp), που έχουν κεντρικό ρόλο στη διαδικασία του ματίσματος. Ενώ τα U1, U2 & U5 βρίσκονται σε ξεχωριστά σωμάτια snrnp, τα U4 & U6 αλληλεπιδρούν μεταξύ τους σε ένα κοινό snrnp. ΕΙΚΟΝΑ 7.49: Συγκρότηση του σωματίου ματίσματος Το πρώτο βήμα κατά τον σχηματισμό του σωματίου ματίσματος έγκειται στην πρόσδεση του U1 snrnp στην 5 θέση ματίσματος (ΘΜ) του προ-mrna. Ακολουθεί η πρόσδεση του U2 snrnp στο σημείο διακλάδωσης. Κατόπιν, ένα προσχηματισμένο σύμπλοκο που αποτελείται από τα U4/U6 & U5 snrnp ενσωματώνεται στο σωμάτιο ματίσματος μέσω δεσμών υδρογόνου που αναπτύσσονται ανάμεσα στο U5 snrna και τις αλληλουχίες που βρίσκονται ανοδικά της 5 θέσης ματίσματος. Κατόπιν, τα U1 και U4 αποσυνδέονται από το σύμπλοκο, ενώ το U6 αντικαθιστά το U1 στην 5 θέση ματίσματος και αναπτύσσει αλληλεπιδράσεις με το U2. Έτσι έρχονται κοντά η 5 θέση ματίσματος και το σημείο διακλάδωσης, προκειμένου να σχηματιστεί η δομή σε σχήμα λάσου. Το U5 προσδένεται στην 3 θέση ματίσματος και διευθετεί τα δύο εξόνια κατά τέτοιο τρόπο ώστε να συνδεθούν μεταξύ τους και παράλληλα να απομακρυνθεί το ιντρόνιο. 96

97 Πρόσδεση του U1 snrna στην 5 θέση ματίσματος ΕΙΚΟΝΑ 7.50: Η πρόσδεση του U1 snrna στην 5 θέση ματίσματος. Το 5 άκρο του U1 snrna προσδένεται στη συντηρημένη αλληλουχία της 5 θέσης ματίσματος (ΘΜ) μέσω δεσμών υδρογόνου ανάμεσα στις συμπληρωματικές τους βάσεις. 97

98 Πως στρατολογούνται τα U1 snrna και U2 snrna στην 5 θέση ματίσματος και στο σημείο διακλάδωσης, αντίστοιχα ΕΙΚΟΝΑ 7.52: Ο ρόλος των παραγόντων ματίσματος στη συγκρότηση του σωματίου ματίσματος. Οι παράγοντες SR προσδένονται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες των εξονίων και στρατολογούν το U1 snrnp στην 5 θέση ματίσματος (ΘΜ) και έναν άλλο παράγοντα ματίσματος, τον U2AF, στην 3 θέση ματίσματος. Κατόπιν, ο U2AF στρατολογεί το U2 snrnp στο σημείο διακλάδωσης. 98

99 ΕΙΚΟΝΑ 7.51: Αυτο-μάτισμα. Τα αυτο-ματιζόμενα ιντρόνια της ομάδας Ι και της ομάδας ΙΙ απομακρύνονται με διαφορετικούς μηχανισμούς. Στην περίπτωση των ιντρονίων της ομάδας Ι, η διαδικασία αρχίζει με μία κοπή στην 5 θέση ματίσματος, η οποία πραγματοποιείται με τη βοήθεια ενός νουκλεοτιδίου γουανοσίνης που λειτουργεί ως συμπαράγοντας. Έτσι προστίθεται ένα G στο 5 άκρο του ιντρονίου και προκύπτει ένα γραμμικό ενδιάμεσο. Ο μηχανισμός απομάκρυνσης των ιντρονίων της ομάδας ΙΙ μοιάζει πολύ με αυτόν του ματίσματος των προ-mrna. Η κοπή στην 5 θέση ματίσματος προκαλείται από ένα νουκλεοτίδιο αδενίνης του ιντρονίου, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός ενδιάμεσου μορίου με μορφή λάσου. Και στις δύο περιπτώσεις, η διαδικασία ολοκληρώνεται με την κοπή στην 3' θέση ματίσματος, η οποία πραγματοποιείται ταυτόχρονα με την απομάκρυνση του ιντρονίου και τη σύνδεση των δύο εξονίων μεταξύ τους. 99

100 ΕΙΚΟΝΑ 7.53: Εναλλακτικό μάτισμα και φυλοκαθορισμός στην Drosophila. Το εναλλακτικό μάτισμα του mrna του γονιδίου transformer (tra) ρυθμίζεται από την πρωτεΐνη SXL, η οποία εκφράζεται μόνο στις θηλυκές μύγες. Στα αρσενικά άτομα, το πρώτο εξόνιο του mrna του tra συνδέεται σε μια τέτοια 3 θέση ματίσματος, ώστε το δεύτερο εξόνιο να περιέχει ένα κωδικόνιο τερματισμού της μετάφρασης (UAG). Συνεπώς δεν παράγεται η πρωτεΐνη του γονιδίου tra. Στα θηλυκά άτομα, η πρωτεΐνη SXL εμποδίζει την πρόσδεση του παράγοντα U2AF σε αυτή την 3 θέση ματίσματος, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η χρησιμοποίησή της. Έτσι χρησιμοποιείται μια εναλλακτική θέση ματίσματος η οποία βρίσκεται καθοδικότερα του κωδικονίου τερματισμού. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα το mrna του 10 γονιδίου tra στα θηλυκά άτομα να μεταφράζεται σε μια λειτουργική πρωτεΐνη. 0

101 ΕΙΚΟΝΑ 7.54: Εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου Dscam. Το γονίδιο Dscam περιέχει τέσσερις ομάδες εναλλακτικών εξονίων. Οι ομάδες των εξονίων 4, 6, 9 και 17 περιλαμβάνουν 12, 48, 33 και 2 εναλλακτικές εκδοχές αντίστοιχα. Οποιοδήποτε από αυτά τα εναλλακτικά εξόνια κάθε ομάδας μπορεί να συνδεθεί με οποιοδήποτε από τα εναλλακτικά εξόνια κάποιας άλλης ομάδας. Επομένως, μέσω του εναλλακτικού ματίσματος είναι δυνατόν να προκύψουν = εναλλακτικά μετάγραφα. 10 1

102 Στοιχειοθεσία του RNA (RNA Editing) Η στοιχειοθεσία του RNA είναι μια μοριακή διαδικασία με την οποία μερικά κύτταρα πραγματοποιούν χαρακτηριστικές μεταβολές στη νουκλεοτιδική αλληλουχία ενός μορίου RNA το οποίο έχει παραχθεί με τη δράση της RNA πολυμεράσης. Συνήθως, η στοιχειοθεσία του RNA αναφέρεται σε προσθήκη, απάλειψη ή αντικατάσταση βάσεων στο μόριο του RNA, και έχει ανιχνευθεί σε μόρια trna, rrna, mrna ή mirna ευκαρυωτικών, αλλά και σε προκαρυωτικά κύτταρα και ιούς. Η στοιχειοθεσία του RNA διεξάγεται τόσον στον πυρήνα όσον και στο κυτταρόπλασμα, καθώς επίσης και στα μιτοχόνδρια και τους χλωροπλάστες. Στα σπονδυλωτά, η στοιχειοθεσία του RNA είναι σπάνια και αναφέρεται σε ένα μικρό αριθμό μεταβολών στη νουκλεοτιδική αλληλουχία των μορίων RNA (σ άλλους οργανισμούς είναι εκτεταμένη). Η στοιχειοθεσία του mrna, επειδή είναι σχετικά σπάνια, δεν συμπεριλαμβάνεται μαζί με τις άλλες διαδικασίες της επεξεργασίας του mrna, όπως η προσθήκη της 5 καλύπτρας 7-μεθυλογουανοσίνης (m7g), η προσθήκη της πολύ (Α) ουράς στο 3 άκρο ή το μάτισμα. Η στοιχειοθεσία του mrna περιλαμβάνει αντικατάσταση της κυτιδίνης (C) σε ουρακίλη (U), και αδενίνη (Α) σε ινοσίνη (Ι) λόγω απαμίνωσης, και σε μικρότερο βαθμό ένθεση βάσης. Επομένως η στοιχειοθεσία του mrna μεταβάλλει την αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης, η οποία διαφέρει απ αυτήν που 10 προβλέφτηκε με βάση την αλληλουχία του γονιδίου. 2

103 ApoB Κωδικόνιο γλουταμίνης (CAA) σε κωδικόνιο λήξης (UAA) στο νουκλεοτίδιο kb mrna Ν C ~7.5 kb mrna αμινοξέα, ΜB 512 kda Θέση πρόσδεσης LDLR αμινοξέα, ΜB 250 kda ΙΣΟΜΟΡΦΕΣ Η σημειακή μετάλλαξη Arg3500Gln του γονιδίου ApoB στη θέση δέσμευσης με τον LDLR οδηγεί στην κληρονομική νόσο γνωστή ως οικογενής υποβήταλιποπρωτεϊναιμία ΕΙΚΟΝΑ 7.55: Στοιχειοθεσία του mrna της απολιποπρωτεΐνης Β (apob). Το mrna του γονιδίου της apoβ στο ανθρώπινο ήπαρ δεν υφίσταται στοιχειοθεσία και από τη μετάφραση του προκύπτει μια πρωτεΐνη μεγέθους αμινοξέων, η οποία ονομάζεται Apo-B100. Ωστόσο, το mrna αυτό υφίσταται στοιχειοθεσία στο έντερο, με αποτέλεσμα τη μετατροπή μιας συγκεκριμένης βάσης του από C σε U, που έχει ως συνέπεια ένα κωδικόνιο γλουταμίνης (CAA) να μετατρέπεται σε κωδικόνιο τερματισμού της μετάφρασης (UAA). Ο πρόωρος τερματισμός της μετάφρασης του mrna της απολιποπρωτεΐνης Β στο έντερο οδηγεί στη σύνθεση μιας 10 μικρότερης πρωτεΐνης, η οποία ονομάζεται Apo-B48 και έχει μέγεθος αμινοξέα. 3

104 Η απολιποπρωτεΐνη Β (apob) ανιχνεύεται στο πλάσμα σε 2 ισομορφές: apob-100 (512 kda) και apob-48 (250 kda) (~48% apob-100). Και οι 2 ισομορφές κωδικοποιούνται από το γονίδιο ApoB μεγέθους 16 kb που εντοπίζεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 2, και κωδικοποιεί ένα πυρηνικό pre-mrna. Το pre-mrna υφίσταται επεξεργασία και στοιχειοθεσία και παράγει 2 διαφορετικά mrna: Ένα apob-100 mrna μεγέθους 14.1 kb το οποίο κωδικοποιεί την apob-100 με αμινοξέα και ΜΒ 512 kda η οποία συνθέτεται στο ήπαρ, και ένα apob-48 μεγέθους ~7.5 kb το οποίο κωδικοποιεί την apob-48 με αμινοξέα και ΜΒ 250 kda η οποία συνθέτεται στο έντερο. Η σύνθεση του apo-β48 mrna οφείλεται σε στοιχειοθεσία κατά την οποία στο νουκλεοτίδιο μια συγκεκριμένη βάση του C να μετατρέπεται σε U. Αυτή η αντικατάσταση μετατρέπει ένα κωδικόνιο γλουταμίνης (CAA) σε κωδικόνιο τερματισμού της μετάφρασης (UAA). Ο πρόωρος τερματισμός της μετάφρασης του mrna της apoβ στο έντερο οδηγεί στη σύνθεση μιας μικρότερης πρωτεΐνης, της apo-b48 (~48% apob-100). Σαν αποτέλεσμα της στοιχειοθεσίας, η apob-48 φέρει την ίδια Ν-τελική επικράτεια αλλά δεν φέρει τη C-τελική επικράτεια που εντοπίζεται στην apob100, η οποία περιέχει τη θέση δέσμευσης του υποδοχέα LDLR, μεταλλάξεις του οποίου οδηγούν στην κληρονομική νόσο γνωστή ως οικογενής υπερχοληστερολαιμίας (υψηλά επίπεδα χοληστερόλης στο πλάσμα και οι ασθενείς υποφέρουν από καρδιακές προσβολές από νεαρή ηλικία). Η apoβ που παράγεται στο ήπαρ είναι η κύρια απολιποπρωτεΐνη των λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων όπως χυλομικρών, λιποπρωτεϊνών πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDL), ενδιάμεσης πυκνότητας (ΙDL) και χαμηλής πυκνότητας (LDL) που είναι υπεύθυνα για τη μεταφορά λιπιδίων συμπεριλαμβανομένης και της χοληστερόλης σε όλο το σώμα, τα κύτταρα και τους ιστούς διαμέσου του αίματος. To 90-95% των σωματιδίων που περιέχουν apob είναι LDL. Αντίθετα, η apob48 που παράγεται στο λεπτό έντερο αποτελεί συστατικό των χυλομικρών που μεταφέρουν λιπίδια από το έντερο διαμέσου της κυκλοφορίας στο ήπαρ. Υψηλά επίπεδα apob που συσχετίζονται με τα υψηλά επίπεδα σωματιδίων LDL αποτελούν την κύρια αιτία αθηρωματικών πλακών ή αθηρωμάτων στα αγγεία (αθηροσκλήρωση ή αθηροσκλήρυνση). Μεταλλάξεις στο γονίδιο της ApoB (ApoB100) προκαλούν μια κληρονομική νόσο γνωστή ως οικογενής υποβήταλιποπρωτεϊναιμία. Αυτή η αυτοσωμική γενετική νόσος χαρακτηρίζεται από την ανικανότητα των ασθενών να απορροφήσουν και να μεταφέρουν χοληστερόλη διαμέσου του αίματος, με αποτέλεσμα να συσσωρεύεται στο αίμα και η νόσος να έχει όμοια συμπτώματα με την οικογενή υπερχοληστερολαιμία. Επίσης υπάρχει αυξημένη συσσώρευση λίπους στα κόπρανα (στεατόρροια). Έχει χαρακτηριστεί μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο της apob (APOB) με την οποία η Arg3500 αντικαθίσταται με γλουταμίνη 10 (Arg3500Gln) και εντοπίζεται στη θέση πρόσδεσης με τον LDLR. 4

105 Αποικοδόμηση του mrna Τα επίπεδα των mrna στα ευκαρυωτικά κύτταρα εξαρτώνται από: τους ρυθμούς σύνθεσης και επεξεργασίας τους, της μεταφοράς τους από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, και της αποικοδόμησης τους στο κυτταρόπλασμα. Η αποικοδόμηση των mrna είναι καθοριστικός παράγοντας της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης, και μπορεί να επηρεασθεί από αναπτυξιακά, περιβαλλοντικά και μεταβολικά σήματα. Η αποικοδόμηση των περισσοτέρων mrna αρχίζει με την αποδενυλίωση τους (αφαίρεση της πολύ-α ουράς) στο 3 άκρο που καταλύεται από τα ένζυμα πολυαδενυλίωσης CCR4-NOT ή PARN. Στη συνέχεια το mrna αποικοδομείται με 2 μηχανισμούς: (α) Αφαίρεση καλύπτρας και αποικοδόμηση με κατεύθυνση 5 προς 3 : Σ αυτήν την περίπτωση το πρωτεϊνικό σύμπλοκο Lsm1-7 δεσμεύεται στο 3 άκρο του mrna, και το σύμπλοκο DCP1/2 δεσμεύεται στο 5 άκρο και αφαιρεί την 5 καλύπτρα 7-μεθυλογουανοσίνης (5 -me7g). Στη συνέχεια η 5,3 εξωριβονουκλεάση XRN1 αποικοδομεί το mrna με κατεύθυνση 5 προς 3. (β) Αποικοδόμηση με κατεύθυνση 3 προς 5 από το εξόσωμα (exosome), που ακολουθείται από την υδρόλυση της 5 -me7g από το ένζυμο DcpS 10 5

106 Ένζυμα αποδενυλίωσης CCR4 NOT ή PARN Αφαίρεση καλύπτρας και αποικοδόμηση με κατεύθυνση 5 προς 3 Αφαίρεση πολύ-α ουράς Αποικοδόμηση με κατεύθυνση 3 προς 5 Δέσμευση πρωτεϊνικού συμπλόκου Lsm1-7 στο 3 άκρο σύμπλοκο DCP1/2 στο 5 άκρο XRN1 5,3 -εξωριβονουκλεάση XRN1 ΕΙΚΟΝΑ 7.56: Αποικοδόμηση του mrna. Η αποικοδόμηση του mrna συνήθως ξεκινά με τη μείωση του μήκους της ουράς πολυ(α). Η διαδικασία της αποαδενυλίωσης ακολουθείται είτε από την αποικοδόμηση του μορίου του mrna με κατεύθυνση 3 προς 5 είτε από την απομάκρυνση της καλύπτρας στο 5 άκρο και την αποικοδόμηση του μορίου με κατεύθυνση 10 5 προς 3. 6

107 ΠΕΙΡΑΜΑ-ΣΤΑΘΜΟΣ Η ανακάλυψη των snrnp Ανοσοκατακρήμνιση των snrna με αντιορό από ασθενείς με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο. Διαδρομή 1, αντι-sm. Διαδρομή 2, ορός υγιούς ατόμου (ως μάρτυρας). Διαδρομή 3, ορός που αναγνωρίζει κυρίως το RNP. Διαδρομή 4, αντι-rnp. Σημειώστε πως όλοι οι οροί (συμπεριλαμβανομένου του μάρτυρα) αναγνωρίζουν ένα άγνωστο RNA που υποδεικνύεται ως Χ. 107