Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Μοριακή Ιατρική. Διπλωματική Εργασία

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ, ΤΟΜΕΑΣ ΜΟΡΦΟΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ-ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: Καθηγητής κ. Βασίλειος Γ. Γοργούλης Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Μοριακή Ιατρική Διπλωματική Εργασία Η παρατεταμένη υπέρ-έκφραση της p21 WAF1/Cip1 σε p53-ανεξάρτητο περιβάλλον, πυροδοτεί τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης δικλωνικών θραύσεων στο DNA, έναντι των μηχανισμών εκτομής λανθασμένων νουκλεοτιδίων Παππάς Γεώργιος ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ : Καθηγητής κ. Βασίλειος Γ. Γοργούλης ΑΘΗΝΑ 2016

2 1 Όρκος του Ιπποκράτη

3 2 Ευχαριστίες Θα ήθελα καταρχάς να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου Καθηγητή κ. Βασίλη Γοργούλη, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε από την πρώτη στιγμή και για την πολύτιμη καθοδήγησή του. Τον ευχαριστώ που μου έδωσε την ευκαιρία να συνεργαστώ, στα πλαίσια της διπλωματικής μου, με μια μεγάλη επιστημονική ομάδα από την οποία πήρα πολλά σημαντικά εφόδια για τη συνέχεια. Η στήριξή του καθίσταται πολύ σημαντική για μένα και τον ευχαριστώ ιδιαίτερα για αυτό. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της τριμελούς επιτροπής, τον Επίκουρο καθηγητή κ. Αθανάσιο Κοτσίνα για τις χρήσιμες συμβουλές του και τη συμπαράστασή του και την Επίκουρη καθηγήτρια κα Σοφία Χαβάκη για την στήριξή της. Θα ήθελα να ευχαριστήσω πολύ, επίσης, όλα τα μέλη της ομάδας, τα οποία με στήριξαν σε αυτό το ταξίδι, και έκαναν τη κάθε μέρα μου ξεχωριστή στο εργαστήριο. Τους ευχαριστώ για τις εμπειρίες που μου έδωσαν την ευκαιρία να συλλέξω και την ανεκτίμητη βοήθειά τους. Ένα μεγάλο ευχαριστώ αξίζει επίσης ένας ξεχωριστός άνθρωπος, ο οποίος έχει ένα μεγάλο μερίδιο ευθύνης για τη μέχρι τώρα πορεία μου στο εργαστήριο. Είχα τη τύχη να συνεργαστώ και να βρίσκομαι υπό την επίβλεψη ενός μεγάλου επιστήμονα-φίλου, Δρ. Γαλανού Παναγιώτη. Με εμπιστεύτηκε από τη πρώτη στιγμή και με επέλεξε να συμμετάσχω στη συνέχεια μιας εκπληκτικής δουλειάς, την οποία ο ίδιος είχε ξεκινήσει. Η καθοδήγηση και η συνεχής στήριξή του αποτέλεσαν σημαντικές παραμέτρους που συνέβαλλαν στην επιτυχή ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας. Πάνω από όλα, θα ήθελα να πω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου, για την ηθική, ψυχολογική και οικονομική υποστήριξη που μου παρείχε όλο αυτό το διάστημα. Η εμπιστοσύνη που μου έδειξαν και συνεχίζουν να μου δείχνουν με βοηθά να συνεχίζω και να ξεπερνώ κάθε εμπόδιο. Σε αυτούς αφιερώνω και την παρούσα διπλωματική.

4 3 Πρόλογος Ο καταστολέας των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών p21 WAF1/Cip1 (p21), αποτελεί ένα σημαντικό ρυθμιστή των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και επαγωγέα της κυτταρικής γήρανσης, εξαρτώμενος από την πρωτεΐνη p53. Προσφάτως αποδείξαμε ότι η πρωτεΐνη p21 μπορεί να αποκτήσει ογκογόνο δράση, απουσία της πρωτεΐνης p53. Αναλύσεις μεγάλης κλίμακας (high-throughput) καθώς και λειτουργικές αναλύσεις p21-επαγώγιμων καρκινικών και σχεδόν φυσιολογικών κυτταρικών σειρών, απέδειξαν ότι μετά από μια αρχική φάση αναστολής της κυτταρικής αύξησης, προέκυψε ένας υποπληθυσμός κυττάρων που εξέφραζαν την πρωτεΐνη p21, τα οποία διέθεταν μεγάλη πολλαπλασιαστική ικανότητα (διαφυγόντα κύτταρα), που χαρακτηρίζονταν από υψηλή γενωμική αστάθεια. Η αυξημένη γενωμική αστάθεια κατέστη αποτέλεσμα αντιγραφικού στρες μέσω της απορρύθμισης των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής, CDT1 και CDC6. Ωστόσο τα διαφυγόντα κύτταρα χαρακτηρίζονταν επίσης από μειωμένες σημειακές υποκαταστάσεις, εν αντιθέσει με τα κύτταρα, στα οποία δεν είχε επαχθεί η έκφραση της πρωτεΐνης p21. Στην παρούσα εργασία αποδεικνύεται ότι η πρωτεΐνη p21 πυροδοτεί τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης δικλωνικών θραύσεων έναντι των μηχανισμών εκτομής λανθασμένων νουκλεοτιδίων, ενισχύοντας ακόμα περισσότερο το φαινόμενο της γενωμικής αστάθειας.

5 4 Περιεχόμενα 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Καρκίνος Βιολογικά χαρακτηριστικά του καρκίνου Ενεργοποίηση εσωτερικών ερεθισμάτων κυτταρικού πολλαπλασιασμού ανεξάρτητα από τα εξωτερικά ερεθίσματα Ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε μηνύματα αναστολής της ανάπτυξης Συνεχής κυτταρικός πολλαπλασιασμός και διαφυγή από το πρόγραμμα γήρανσης Αντιγραφική πίεση και Γονιδιωματική αστάθεια Μιτωτική πίεση Μεταβολική πίεση Διαφυγή από το πρόγραμμα απόπτωσης Διαφυγή από την επιτήρηση του ανοσοποιητικού συστήματος Αγγειογένεση Διήθηση σε παρακείμενους ιστούς και μετάσταση Διττός ρόλος της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 στη καρκινογένεση Βλάβες επί του DNA Αντιγραφική Πίεση (Replication Stress) Κυτταρική απόκριση στις βλάβες επί του DNA Μηχανισμοί επιδιόρθωσης του DNA Επιδιόρθωση αταίριαστων βάσεων (MMR) Επιδιόρθωση εκτομής νουκλεοτιδίου (NER) Επιδιόρθωση εκτομής βάσης (BER) Κλασικός μηχανισμός σύνδεσης μη ομόλογων ελεύθερων άκρων Εναλλακτικός μηχανισμός σύνδεσης μη ομόλογων ελεύθερων άκρων..33

6 Επιδιόρθωση εξαρτώμενη από την ομολογία Σύνθεση εξαρτώμενη από την υβριδοποίηση των αλυσίδων DNA (SDSA: Synthesis Dependent Strand Annealing) Δημιουργία διπλών κόμβων Holiday (dhj mechanism) Υβριδοποίηση εκτεθειμένων μονόκλωνων άκρων (SSA: Single Strand Annealing) Αντιγραφή επαγόμενη από ρήξη (BIR: Break Induced Replication) Ανοχή στις βλάβες επί του DNA Ρόλος του αντιγραφικού ολισθητήρα PCNA στην ανοχή στις βλάβες επί του DNA Σύνθεση πάνω από τη βλάβη (TLS: Translesion Synthesis) Αλλαγή υποστρώματος (TS: Template Switch) Σκοπός παρούσας εργασίας ΥΛΙΚΑ Καλλιέργεια κυττάρων Κυτταρικές σειρές Επιδράσεις Crosslinking κυτταρικών σειρών Μέτρηση επιπέδων ενεργών ριζών οξυγόνου (ROS) Κυτταρομετρία ροής Ανάλυση πρωτεϊνών Απομόνωση πρωτεϊνών από κύτταρα Στύπωμα κατά Western ή Ανοσοαποτύπωση (Western Blot WB ή Immunoblot, IB) Ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου Μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη PVDF.50

7 Επώαση της μεμβράνης με πρωτογενές και δευτερογενές αντίσωμα Εμφάνιση της μεμβράνης με αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ-Alkaline Phosphatase) Εμφάνιση της μεμβράνης με χημειοφωταύγεια Μικρής κλίμακας βιοχημική κλασμάτωση των κυττάρων Αντισώματα Αντισώματα για Ανοσοαποτύπωση (IB) Πλασμιδιακοί φορείς και διαμολύνσεις Διαμόλυνση κυττάρων με πλασμίδια Ανάπτυξη και απομόνωση πλασμιδίων Απομόνωση και καθαρισμός πλασμιδιακού DNA Υπολογισμός συγκέντρωσης και καθαρότητας πλασμιδίων Αντίδραση πέψης πλασμιδιακού DNA Αναλύσεις νουκλεικών οξέων Μέτρηση Ν-alkyl-purine monoadducts επί του γονιδίου N-Ras Μεγάλης κλίμακας αναλύσεις του γονιδιώματος Αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) Oμική ανάλυση σε επίπεδο μικροσυστοιχιών Βιοπληροφορική ανάλυση Προσδιορισμός νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων και mutational signature Μεταγραφομική ανάλυση μη επαγόμενων και επαγόμενων για χρονικό διάστημα 12, 48 και 96 ωρών, κυττάρων Saos2-p21 WAF1/Cip1 Tet-ON ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Οι σημειακές νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις (SNSs) μειώνονται χαρακτηριστικά στα p21 WAF1/Cip1 Escaped κύτταρα Αλλοιώσεις επί των μηχανισμών TLS σε συνδυασμό με μειωμένη δραστηριότητα των επιδιορθωτικών μηχανισμών εκτομής βάσεων και νουκλεοτιδίων (NER, BER), συνεισφέρουν στη παρατηρούμενη μείωση των

8 7 σημειακών νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων, ενισχύοντας φαινόμενα αντιγραφικής πίεσης και επάγοντας ως εκ τούτου εκτεταμένες δίκλωνες ρήξεις Η παρατεταμένη έκφραση του p21 WAF1/Cip1 ενισχύει τους εξαρτώμενους από τη πρωτείνη RAD52 μηχανισμούς επιδιόρθωσης των δίκλωνων ρήξεων BIR και SSA ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 80

9 8 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

10 9 1.1 Καρκίνος Ο καρκίνος αναφέρεται σε κύτταρα με βλάβες στον κυτταρικό τους κύκλο. Πρόκειται για μάζες κυττάρων που διαιρούνται ανεξέλεγκτα δηλαδή χωρίς να ελέγχεται η ακεραιότητα του γενετικού τους υλικού. Η συσσώρευση βλαβών έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία επικίνδυνων για τον οργανισμό συσσωματωμάτων από κύτταρα, τα οποία ονομάζονται όγκος. Η δημιουργία του καρκίνου έχει την αρχή της σε τροποποιήσεις των πληροφοριών που ρυθμίζουν την ομοιόσταση του κυττάρου. Αυτό απορρέει είτε από τη συσσώρευση αλλοιώσεων στην αλληλουχία του DNA (μετάλλαξη) είτε από επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωματίνης (μεθυλίωση του DNA, μετά-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών). Στις περιπτώσεις των μεταλλάξεων, οι τροποποιήσεις του DNA είναι σπάνιες αλλά μόνιμες, ενώ οι αλλαγές της χρωματίνης είναι δυναμικά αναστρέψιμες και οφείλονται σε περιβαλλοντικούς παράγοντες. Η μετάλλαξη «παραμορφώνει» τις γενετικές πληροφορίες, ενώ η επιγενετική αλλαγή αλλοιώνει την έκφραση της πρωτογενούς, αλλά κατά τα άλλα ορθής, γενετικής πληροφορίας. Τόσο οι γενετικές όσο και οι επιγενετικές τροποποιήσεις προκαλούν ανισορροπία στα μεταβολικά δίκτυα του κυττάρου με αποτέλεσμα την διαταραχή της ανάπτυξης και της δια-κυτταρικής επικοινωνίας (Martinez J.D. et al., 2003). Τρεις κατηγορίες γονιδίων εμπλέκονται στην ανάπτυξη καρκίνου, τα ογκογονίδια, τα ογκοκατασταλτικά γονίδια και τα γονίδια ελέγχου του DNA. Τα ογκογονίδια προέρχονται είτε από αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης είτε από αλλοιώσεις στη αλληλουχία των πρωτο-ογκογονιδίων. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασής τους σχετίζονται με αυξητικούς παράγοντες και υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. Η ενεργοποίησή τους γίνεται φυσιολογικά όταν ένα κύτταρο πρέπει να διαιρεθεί όπως κατά την διάρκεια της εμβρυογένεσης ή σε περιπτώσεις τραυματισμών και ανάπλασης ιστών. Οι μεταλλαγμένες μορφές των πρωτοογκογονιδίων οδηγούν σε μη ρυθμιζόμενη κυτταρική διαίρεση. Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια παρεμποδίζουν την κυτταρική διαίρεση όταν αυτή δεν χρειάζεται άλλο ή σε περιπτώσεις βλαβών δίνοντας χρόνο στο κύτταρο να τις επιδιορθώσει. Η δράση τους ολοκληρώνεται όταν πλέον έχει διασφαλιστεί η φυσιολογική λειτουργία του κυττάρου. Μεταλλάξεις στα γονίδια αυτά θέτουν σημαντικές βάσεις για την

11 10 ανάπτυξη του καρκίνου. Τα γονίδια ελέγχου φροντίζουν για την ακεραιότητα του γονιδιώματος ώστε να διασφαλιστεί η ομοιόσταση και η φυσιολογική λειτουργία του κυττάρου και κατ επέκταση του οργανισμού. Τα γονίδια αυτά ανήκουν σε επιμέρους μονοπάτια τα οποία πυροδοτούνται ως απόκριση του κυττάρου σε κάποιο σφάλμα στο DNA και η αναστολή της λειτουργίας τους οδηγεί σε συσσώρευση μεταλλάξεων μέσα στο κύτταρο (Martinez J.D. et al., 2003) Βιολογικά χαρακτηριστικά καρκινικών κυττάρων Σύμφωνα με το άρθρο των Hanahan και Weinberg το 2000 (Hanahan and Weinberg 2000) καθώς και με την ανανεωμένη του μορφή το 2011, τα βιολογικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων που οδηγούνται σε κακοήθειες είναι: α) Ενεργοποίηση εσωτερικών ερεθισμάτων κυτταρικού πολλαπλασιασμού ανεξάρτητα από τα εξωτερικά ερεθίσματα, β) Ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε μηνύματα αναστολής της ανάπτυξης, γ) Συνεχής κυτταρικός πολλαπλασιασμός και διαφυγή από το πρόγραμμα γήρανσης, δ) Αντιγραφική πίεση και Γενωμική αστάθεια, ε) Μιτωτική πίεση, στ) Μεταβολική πίεση, ζ) Διαφυγή από το πρόγραμμα απόπτωσης, η) Διαφυγή από την επιτήρηση του ανοσοποιητικού συστήματος, θ) Αγγειογένεση και ι) Διήθηση σε παρακείμενους ιστούς και μετάσταση (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al., 2011). Παρόλο που όλα τα παραπάνω χαρακτηρίζουν τον καρκίνο, πολλές περιπτώσεις κακοηθειών δεν είναι απαραίτητο να χαρακτηρίζονται από όλα αυτά. Για παράδειγμα, στην περίπτωση των λευκών αιμοσφαιρίων επειδή αυτά ήδη βρίσκονται στην κυκλοφορία του αίματος δεν χρειάζονται διηθητική ικανότητα για να δημιουργήσουν λευχαιμίες. Επίσης, τα διαφορετικά βήματα δεν σημαίνουν αναγκαστικά ότι πρέπει να συμβούν μεταλλάξεις σε διαφορετικά γονίδια. Όταν καταστέλλεται το ογκοκατασταλτικό γονίδιο της πρωτεΐνης p53 προκαλείται γονιδιακή αστάθεια, διαφυγή απόπτωσης και αύξηση της αγγειογένεσης (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al., 2011).

12 11 Εικόνα 1. Βιολογικά Χαρακτηριστικά Καρκινικών κυττάρων (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al., 2011) Ενεργοποίηση εσωτερικών ερεθισμάτων κυτταρικού πολλαπλασιασμού ανεξάρτητα από τα εξωτερικά ερεθίσματα Τα φυσιολογικά κύτταρα χρειάζονται μιτογόνα σήματα (mitogenic growth signals) για να εισέλθουν στα διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου. Αυτά τα σήματα μεταδίδονται μέσα στο κύτταρο μέσω διαμεμβρανικών υποδοχέων στους οποίους προσδένονται αυξητικοί παράγοντες, συστατικά του εξωκυτταρικού στρώματος και μόρια πρόσφυσης ή αλληλεπίδρασης μεταξύ των κυττάρων. Tα καρκινικά κύτταρα δεν χρειάζονται εξωγενή ερεθίσματα, αφού φροντίζουν τα ίδια να παράγουν τα δικά τους. Πολλά από τα ογκογονίδια στον καρκίνο οδηγούν στην αυτονομία του σε μιτογόνα σήματα. Τέτοια ογκογονίδια αφορούν την έκφραση αυξητικών παραγόντων, διαμεμβρανικών υποδοχέων αυξητικών παραγόντων και πρωτεϊνών μεταγωγής σημάτων στο εσωτερικό του κυττάρου. Τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν αυξητικούς παράγοντες, για παράδειγμα ο PDGF (platelet-derived growth

13 12 factor) και ο TGFα (Tumor Growth Factor α), οι οποίοι επάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων από τα οποία προέρχονται. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται δημιουργία αυτοκρινούς ερεθίσματος (autocrin stimulation). Επίσης, η υπερέκφραση υποδοχέων που ανταποκρίνονται στους αυξητικούς παράγοντες επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να ενεργοποιήσουν τον πολλαπλασιασμό τους υπό τη δράση χαμηλής συγκέντρωσης αυξητικών παραγόντων, η οποία για ένα φυσιολογικό κύτταρο δεν θα ήταν αρκετή. Τέλος, τα καρκινικά κύτταρα τροποποιούν την μετάδοση των σημάτων μέσα στο κυτταρόπλασμα με κυριότερο μονοπάτι το SOS-Ras-Raf-MAPK. Στο 25% των περιπτώσεων καρκίνου, οι πρωτεΐνες Ras εμφανίζουν τροποποιήσεις στη στερεοδιαμόρφωση του μορίου τους. Οι αλλαγές αυτές επιτρέπουν στην πρωτεΐνη Ras να μεταδώσει το σήμα χωρίς τους φυσιολογικούς επαγωγείς της (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al., 2011) Ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε μηνύματα αναστολής της ανάπτυξης Σε ένα φυσιολογικό ιστό, παράγονται αντι-αυξητικά μήνυμα με στόχο τη διατήρηση της κυτταρικής ηρεμίας και της κυτταρικής ομοιόστασης. Στα μηνύματα συμπεριλαμβάνονται αναστολείς αυξητικών παραγόντων, οι οποίοι προσδένονται σε υποδοχείς της επιφανείας των κυττάρων και ενεργοποιούν ενδοκυτταρικά σήματα. Τα περισσότερα μηνύματα καταλήγουν στην πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος prb. Όταν υποφωσφορυλιώνεται δεσμεύεται στο μεταγραφικό παράγοντα E2F οπότε αυτός δεν μπορεί να ενεργοποιήσει την κυτταρική διαίρεση μέσω έκφρασης γονιδίων που επιτρέπουν την είσοδο από την G1 στην S φάση. Ο αντι-αυξητικός παράγοντας TGFβ αποτρέπει τη φωσφορυλίωση της prb, ενώ παράλληλα ενεργοποιεί τη σύνθεση της πρωτεΐνης p15 INK4B και της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1. Οι δύο τελευταίες σταματούν το σύμπλοκο κυκλίνη-κυκλινοεξαρτώμενη κινάση, ώστε η prb να μη φωσφορυλιωθεί. Επίσης σε ορισμένες περιπτώσεις καρκίνων το γονίδιο της prb εμφανίζεται μεταλλαγμένο. Παρά την αντι-αυξητική δράση του TGFβ, σε όψιμες φάσεις του καρκίνου η υπερέκφρασή του οδηγεί σε μετάβαση από την επιθηλιακή στη μεσεγχυματική κατάσταση των κυττάρων (EMT Epithelial to Mesenchymal Transition), αυξάνοντας ως εκ τούτου την επιθετικότητα του καρκίνου. Τα κύτταρα του όγκου διαθέτουν επιπλέον στρατηγικές ώστε να διαφύγουν από την διαφοροποίηση, ένας από αυτούς είναι το ογκογονίδιο c-myc. Κατά την

14 13 φυσιολογική ανάπτυξη, η αυξητική δράση της πρωτεΐνης Myc σε συνεργασία με την πρωτεΐνη Max, εκτοπίζεται από την πρωτεΐνη Mad η οποία συνδέεται με την Max επάγοντας μηνύματα διαφοροποίησης. Στα καρκινικά κύτταρα ευνοείται η σύνδεση Myc/Max επάγοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al., 2011) Συνεχής κυτταρικός πολλαπλασιασμός και διαφυγή από το πρόγραμμα γήρανσης Ένας πληθυσμός κυττάρων όταν ολοκληρώσει ένα συγκεκριμένο αριθμό διαιρέσεων, εισέρχεται σε γήρανση. Κύρια μόρια διαμεσολαβητές της γήρανσης αποτελούν οι πρωτεΐνες p16, prb και p53. Τα καρκινικά κύτταρα καθιστούν ανίκανες τις πρωτεΐνες αυτές να προχωρούν στην διαδικασία της διαίρεσης χωρίς να καταστρατηγούνται από αυτές. Η φάση αυτή αποκαλείται κρίση και χαρακτηρίζεται από μαζικούς θανάτους, καρυοτυπική αταξία και συγχωνεύσεις των άκρων των χρωμοσωμάτων, αλλά και από ομάδα κυττάρων που συνεχίζουν την πορεία τους κερδίζοντας την αθανασία. Η κυτταρική γήρανση διακρίνεται σε δύο μεγάλες κατηγορίες, την αντιγραφική γήρανση και τη γήρανση επαγόμενη από πίεση (Stress induced senescence). Η αντιγραφική γήρανση χαρακτηρίζεται από τη μείωση του μήκους των τελομερών σε τέτοιο βαθμό ώστε πλέον τα κύτταρα να εμποδίζονται να εισέλθουν εκ νέου στο κυτταρικό κύκλο. Η διαδικασία αυτής της γήρανσης στηρίζεται στη σταδιακή απώλεια ζευγών βάσεων (50-200) από τα τελομερή σε κάθε αντιγραφικό κύκλο. Η επαγόμενη από πίεση κυτταρική γήρανση, καθίσταται μια πολύ σημαντική απόκριση του κυττάρου σε εξωγενή ή ενδογενή ερεθίσματα που αποσκοπούν στην αλλοίωση της κυτταρικής ομοιόστασης. Στα πλαίσια του καρκίνου και πιο συγκεκριμένα στα προ-καρκινικά στάδια η επαγόμενη από ογκογονίδια κυτταρική γήρανση (που αποτελεί υποκατηγορία της κυτταρικής γήρανσης επαγόμενης από πίεση) αποτελεί ένα σημαντικό φραγμό στην μετέπειτα εξέλιξη του καρκίνου (OIS: Oncogene Induced Senescence). Παρόλα αυτά, υποστηρίζεται ότι η διαδικασία της γήρανσης σε επίπεδο καρκίνου, αποτελεί έναν ατελή προστατευτικό μηχανισμό. Η ατελής δράση του μηχανισμού αυτού προέρχεται από την παρατήρηση της διαδικασίας SASP (Senescence Associated Secretory Phenotype), η οποία

15 14 πραγματοποιείται από τα γηρασμένα κύτταρα και χαρακτηρίζεται από ογκογόνο δράση. Οι δύο μηχανισμοί που προαναφέρθηκαν χρησιμοποιούνται από τα καρκινικά κύτταρα ώστε να ξεπεράσουν τους φραγμούς της γήρανσης ή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και να διατηρήσουν την ικανότητα αντιγραφής τους (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al., 2011/ Gorgoulis et al., 2010) Αντιγραφική πίεση και Γενωμική αστάθεια Βάσει δεδομένων που προκύπτουν από την ανάλυση καρυοτύπου και μεταλλάξεων στα καρκινικά κύτταρα, γίνεται σαφές ότι τα καρκινικά κύτταρα περνούν από το στάδιο της γενωμικής αστάθειας. Αυτή προκύπτει ως αποτέλεσμα σημειακών μεταλλάξεων, ελλείψεων, χρωμοσωμικών ανακατατάξεων και εκτεταμένης ανευπλοειδίας (Hartwell and Kastan 1994). Τα επίπεδα αστάθειας εξαρτώνται από τα επίπεδα βλαβών του DNA, ως αποτέλεσμα ενεργοποίησης του μονοπατιού απόκρισης βλαβών του DNA (DDR pathway DNA damage response), (Gorgoulis, Vassiliou et al. 2005). Η αυξημένη παρουσία βλαβών στα αρχικά στάδια της ανάπτυξης του καρκίνου οφείλεται αρχικά στην μείωση του μήκους των τελομερών απουσία τελομεράσης με αποτέλεσμα τη δημιουργία δικλωνικών θραύσεων στα τελομερή. Συνεπακόλουθο είναι οι συγχωνεύσεις και οι γέφυρες μεταξύ των άκρων των χρωμοσωμάτων με αποτέλεσμα τις μετατοπίσεις και την ενίσχυση γονιδίων. Επίσης, η ενεργοποίηση ογκογονιδίων σε προ-καρκινικές αλλοιώσεις αυξάνει τις δικλωνικές θραύσεις και τη γενωμική αστάθεια (Halazonetis, Gorgoulis et al., 2008/ Galanos et al., 2016) λόγω της αντιγραφικής πίεσης. Τέλος, μεταλλάξεις σε γονίδια των μηχανισμών επιδιόρθωσης ή του μηχανισμού DDR (όπως στο ATM και το TP53) οδηγούν σε αυξημένες βλάβες στο γενετικό υλικό, άστατο κυτταρικό κύκλο και γενωμική αστάθεια (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al., 2011) Μιτωτική πίεση

16 15 Ένα από τα χαρακτηριστικά της μίτωσης των καρκινικών κυττάρων είναι η διαταραγμένη μετακίνηση των χρωμοσωμάτων, γνωστό ως φαινότυπος χρωμοσωμικής αστάθειας (Chromosome Instability-CIN). Τέτοιοι φαινότυποι μπορούν να προκύψουν από βλάβες που συμβαίνουν στις πρωτεΐνες που ελέγχουν το σωστό διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και το σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου. Επίσης, πολύ συχνά οφείλονται σε κεντροσωμιακή αστάθεια δηλαδή αυξημένο αριθμό των κεντροσωμάτων πέρα από τα δύο που επιτρέπεται για τη σωστή ανάπτυξη της ατράκτου. Οι δικλωνικές θραύσεις και η γενωμική αστάθεια λόγω ενεργοποίησης ογκογονιδίων προκαλούν διαταραχές στη μίτωση (Halazonetis, Gorgoulis et al., 2008). Τέλος, μεταλλάξεις σε ογκογονίδια, όπως το RAS, και σε ογκοκατασταλτικά γονίδια, όπως το ΤP53, συμβάλουν στο φαινότυπο CIN (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al., 2011) Μεταβολική πίεση Τα φυσιολογικά κύτταρα εξασφαλίζουν την απαραίτητη ενέργεια μέσω της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Σύμφωνα με το φαινόμενο Warburg, τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα εξασφαλίζουν την ενέργειά τους μέσω μιας διαδικασίας λιγότερο αποδοτικής. Μετά τη γλυκόλυση το πυροσταφυλικό οξύ διασπάται σε γαλακτικό οξύ όπως συμβαίνει φυσιολογικά υπό ανοξικές συνθήκες παρά την παρουσία οξυγόνου. Τα κύτταρα των όγκων καταναλώνουν τεράστιες ποσότητες γλυκόζης μέσω της διαδικασίας της γλυκόλυσης. Αυτός ο τρόπος προσφέρει στα καρκινικά κύτταρα πολλά πλεονεκτήματα όπως η προσαρμοστικότητα τους σε περιβάλλον με χαμηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου και την οξύνιση του μικροπεριβάλλοντος, επάγοντας την διήθηση και διαφεύγοντας την επιτήρηση του ανοσοποιητικού συστήματος (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al.,2011) Διαφυγή από το πρόγραμμα απόπτωσης Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να επεκτείνουν τον πληθυσμό τους εξαρτάται από την κυτταρική διαίρεση αλλά και από την δυνατότητα τους να αποφεύγουν τη διαδικασία της απόπτωσης, παρά την παρουσία βλαβών στο DNA, την ανεπάρκεια σε παράγοντες επιβίωσης, τη διαταραχή λόγω έκφρασης

17 16 ογκογονιδίων και την υποξία. Ο αποπτωτικός μηχανισμός διαθέτει πρωτεΐνες αισθητήρες και τελεστές. Οι αισθητήρες αντιλαμβάνονται τα ενδοκυτταρικά ή τα περιβαλλοντικά ερεθίσματα και αποστέλλουν τα ερεθίσματα στους τελεστές για να αποφασιστεί η επιβίωση ή ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος του κυττάρου. Παρουσία βλαβών στο DNA, η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 επάγει την απόπτωση προκαλώντας την υπερέκφραση του προ-αποπτωτικού μορίου Bax, το οποίο διεγείρει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C από το μιτοχόνδριο. Οι τελεστές της απόπτωσης είναι οι πρωτεάσες κασπάσες. Οι κασπάσες 8 και 9 ενεργοποιούνται από το κυτόχρωμα C και οδηγούν μαζί με άλλες κασπάσες στην καταστροφή αρχικά των οργανιδίων του κυττάρου και εν τέλει του γονιδιώματος του. Ένας από τους τρόπους διαφυγής του αποπτωτικού προγράμματος για το καρκινικό κύτταρο είναι οι μεταλλάξεις που εμφανίζονται στο γονίδιο της πρωτεΐνης p53 (Gorgoulis, Vassiliou et al. 2005/Negrini, Gorgoulis et al. 2010/ Hanahan et al., 2011) Διαφυγή από την επιτήρηση του ανοσοποιητικού συστήματος Όλα τα κύτταρα του σώματος βρίσκονται υπό την συνεχή επιτήρηση του ανοσοποιητικού συστήματος. Η επιτήρηση αυτή είναι υπεύθυνη για την αναγνώριση και των περιορισμό των καρκινικών κυττάρων και των όγκων. Ωστόσο, όγκοι καταφέρνουν να ξεφύγουν από αυτήν την επιτήρηση. Τα καρκινικά κύτταρα διαφεύγουν από το ανοσοποιητικό σύστημα καθιστώντας ανίκανα τα συστατικά του, που έχουν στόχο να τα καταστρέψουν. Για παράδειγμα, τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν τον παράγοντα TGFβ ή άλλους αναστολείς παρεμποδίζοντας τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTL) και τα κύτταρα φυσικούς φονείς (ΝΚ). Επίσης, ένας άλλος μηχανισμός είναι η προσέλκυση κυττάρων φλεγμονής, όπως τα ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα (Tregs) και κατασταλτικά κύτταρα που προέρχονται από το μυελό (MDSCs) τα οποία καταστέλλουν το ανοσοποιητικό. Αυτά καταστέλλουν την δράση των κυτταροτοξικών (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al., 2011).

18 Αγγειογένεση Το οξυγόνο και τα θρεπτικά υλικά είναι απολύτως απαραίτητα για την ανάπτυξη των κυττάρων, ιδιαίτερα στην περίπτωση ανάπτυξης όγκου όπου διαιρούνται με ταχύτατους ρυθμούς άρα η ανάγκη τους σε ενέργεια είναι πολύ μεγάλη. Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της οργανογένεσης είναι η δημιουργία αγγείων ώστε να διασφαλίζεται η τροφοδότηση των κυττάρων. Η αγγειογένεση είναι μια διαδικασία ελεγχόμενη με χαρακτηριστικά παραδείγματα ρύθμισης από τον αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) και τους βασικούς αυξητικούς παράγοντες ινοβλαστών FGF1/2 (Fibroblast Growth Factors). Στον καρκίνο οι παράγοντες αυτοί εμφανίζονται υπερεκφρασμένοι. Παράλληλα, οι παράγοντες που καταστέλλουν την αγγειογένεση εμφανίζονται σε χαμηλά επίπεδα, όπως η thrombospondin-1 και η β-interferon. Η thrombospondin-1 ρυθμίζεται θετικά από την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53. Η απώλεια της τελευταίας, όπως συμβαίνει σε πολλές περιπτώσεις καρκίνου, προκαλεί πτώση των επιπέδων της thrombospondin-1 αυξάνοντας τη δυνατότητα αγγειογένεσης. Επίσης, η ενεργοποίηση του ογκογονιδίου Ras προκαλεί την υπερέκφραση του VEGF (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahanet al., 2011) Διήθηση σε παρακείμενους ιστούς και μετάσταση Η ικανότητα διήθησης και μετάστασης οδηγεί τα καρκινικά κύτταρα να μεταναστεύσουν σε άλλες περιοχές του σώματος, οι οποίες τουλάχιστον στην αρχή θα μπορούν να τους προσφέρουν θρεπτικά υλικά και χώρο για να αναπτυχθούν. Διάφορες πρωτεΐνες είναι υπεύθυνες για την ανάπτυξη αυτής της ικανότητας των καρκινικών κυττάρων. Περιλαμβάνουν μόρια επαφής μεταξύ των κυττάρων (Cell Adhesion Molecules-CAMs) και ιντεγκρίνες, που συνδέουν τα κύτταρα με το εξωκυτταρικό στρώμα. Το πιο σύνηθες αλλοιωμένο μόριο επαφής μεταξύ των κυττάρων είναι η E-cadherin, η οποία εκφράζεται στα επιθηλιακά κύτταρα. Η σύζευξη των γειτονικών κυττάρων μέσω αυτής οδηγεί στην μεταβίβαση αντιαυξητικών σημάτων και άλλων, μέσω ενδο-κυτταροπλασματικής επαφής της με την β-catenin. Στις περισσότερες περιπτώσεις επιθηλιακών καρκίνων η λειτουργία της E- cadherin έχει χαθεί, είτε λόγω μεταλλάξεων αυτής καθώς και των γονιδίων της β-

19 18 catenin, είτε λόγω μεταγραφικής καταστολής και πρωτεόλυσης της εξωκυτταρικής περιοχής της πρωτεΐνης (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al., 2011). Ένας δεύτερος σημαντικός παράγοντας είναι οι εξωκυτταρικές πρωτεάσες. Τα γονίδια των πρωτεασών υπερεκφράζονται και των αναστολέων τους αναστέλλονται. Η πρωτεάσες που διασπούν το στρώμα σχετίζονται με την κυτταρική επιφάνεια, συνδέονται με πρωτεασικούς υποδοχείς και με ιντεγκρίνες. Μέσω αυτών, το καρκινικό κύτταρο μπορεί να διηθήσει το στρώμα, ανάμεσα σε γειτονικά υγιή επιθηλιακά στρώματα κυττάρων και να εισέλθει σε αγγεία ώστε μέσω της αιματικής ροής να καταλήξει σε νέο ενδιαίτημα (Negrini, Gorgoulis et al., 2010/ Hanahan et al., 2011). 1.2 Διττός ρόλος της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 στην καρκινογένεση Η φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων στηρίζεται εξ ολοκλήρου σε ρυθμιστικά δίκτυα, τα οποία ενεργοποιούνται ως απόκριση σε ενδογενή και εξωγενή ερεθίσματα που τείνουν να αλλοιώσουν την ομοιόσταση του κυττάρου. Καθοριστικής σημασίας, όσον αφορά τη σωστή λειτουργία των μοριακών αυτών δικτύων, διαδραματίζει η οργάνωσή τους, τόσο στο χώρο όσο και στο χρόνο. Με βάση τα παραπάνω, υπό τη παρουσία κάποιου τέτοιου ερεθίσματος, ενεργοποιείται το κατάλληλο ρυθμιστικό κύκλωμα στα πλαίσια ενός γενικού συναγερμού που πυροδοτεί το κύτταρο. Έπειτα από την εξουδετέρωσή του, πραγματοποιείται πλήρης επαναφορά των ομοιοστατικών μηχανισμών και της φυσιολογικής λειτουργίας του κυττάρου (Rue P et al., 2013/ Ciccia et al., 2010/ Jackson et al., 2009). Ένα βασικό ρυθμιστικό δίκτυο που φέρει το κύτταρο και ενεργοποιεί ως απόκριση στα διάφορα στρεσογόνα ερεθισμάτα, είναι αυτό που εκκινείται από τον ογκοκατασταλτικό παράγοντα p53. (Cabisi et al., 2007/ Velimezi et al., 2013). Υπό συνθήκες απειλής της φυσιολογικής κυτταρικής λειτουργίας, η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης p53 επάγει την έκφραση του καθοδικού στόχου p21 WAF1/Cip1, για περιορισμένο χρονικό διάστημα, οδηγώντας βραχυπρόθεσμα σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου (στη φάση G1/ G1-S/G2) και ως εκ τούτου παρέχει στο κύτταρο το χρόνο να αποκριθεί κατάλληλα και να απομακρύνει την απειλή. Με την

20 19 ολοκλήρωση της απόκρισης αυτής, η πρωτείνη p53 καθίσταται ανενεργή μέσω πρωτεολυτικής αποικοδόμησης από την Ε3 λιγάση MDM2 και το δίκτυο απενεργοποιείται. Το κύτταρο δύναται να εισέλθει εκ νέου στο κυτταρικό κύκλο. Το παραπάνω μοριακό δίκτυο ενεργοποιείται από μια πληθώρα διαφορετικών στρεσογόνων ερεθισμάτων, ανάμεσά τους και ογκογόνα, αναδεικνύοντας έναν προστατευτικό-ογκοκατασταλτικό ρόλο της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 κάτω από αυτές τις συνθήκες (Jackson et al., 2009/ Abbas et al., 2009). Μια σειρά από πειραματικές διαδικασίες αποσιώπησης του γονιδίου CDKN1A,τόσο in vivo όσο και in vitro, υποστήριξαν το κατασταλτικό του ρόλο στην καρκινογένεση. Τα πρώτα αποτελέσματα για το σημαντικό ογκοκατασταλτικό ρόλο της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1, προήλθαν από knock out ποντίκια, ως προς το γονίδιο που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη αυτή, τα οποία εμφάνισαν αυξημένο αριθμό όγκων. Παρόλα αυτά, το γεγονός ότι υπό την προαναφερθείσα απουσία, η ανάπτυξη των όγκων δεν πραγματοποιούνταν άμεσα, αλλά μετά από ένα εκτεταμένο χρονικό διάστημα, σε σύγκριση με ποντίκια στα οποία είχε πραγματοποιηθεί αποσιώπηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως το ΤP53 ή CDKN2A, υπέδειξε την ανεπάρκεια, εν μέρει, του μορίου p21 WAF1/Cip1 στην υποκίνηση της διαδικασίας της καρκινογένεσης. Η έκφραση του γονιδίου CDKN1A έχει βρεθεί ελαττωμένη σε κάποιους καρκινικούς τύπους, όπως στον καρκίνο του παχέος εντέρου, σε κάποιες περιπτώσεις του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα και του καρκίνου της κεφαλής και του τραχήλου. Παρόλα αυτά, στους περισσότερους καρκινικούς τύπους, η προαναφερθείσα καταστολή του γονιδίου αυτού δεν πραγματοποιείται, οδηγώντας σε συμπεράσματα, που αίρουν την πιθανή ογκοκατασταλτική δραστηριότητά του. Τα αποτελέσματα αυτά βέβαια, ενώ θέτουν ένα μεγάλο ερωτηματικό στην αποκλειστικότητα της ογκοκατασταλτικής δραστηριότητας του μορίου αυτού, δεν μπορούν να απορρίψουν τη συνεργατική του δράση με άλλους κύριους ογκοκατασταλτικούς παράγοντες (π.χ. p53), έναντι της επαγωγής της έκφρασης συγκεκριμένων ογκογονιδίων που τείνουν να οδηγήσουν στη καρκινογένεση. Μια σειρά πειραματικών προσεγγίσεων απέδειξε τη συσχέτιση των χαμηλών επιπέδων της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1, με την επαγωγή και την ενίσχυση της γενωμικής αστάθειας, η οποία αποτελεί σημαντικό χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων (Negrini, Gorgoulis et al., 2010). Πιο συγκεκριμένα, η ταυτόχρονη καταστολή τόσο της έκφρασης του γονιδίου CDKN1A, όσο και του γονιδίου που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη ATM, οδηγεί σε αυξημένη χρωμοσωμική αστάθεια, κάτι που γίνεται αντιληπτό από την αύξηση του αριθμού των ανευπλοειδικών κυττάρων και ως εκ τούτου στην ανάπτυξη του καρκίνου. Το προαναφερθέν φαινόμενο της γενωμικής αστάθειας, προκαλείται σε αυξημένο βαθμό από την ταυτόχρονη απουσία τόσο του λειτουργικού μορίου p53, όσο και του μορίου

21 20 p21 WAF1/Cip1. Ακόμα, αποτελέσματα σχετικά με τη συνεισφορά της καταστολής της έκφρασης του γονιδίου CDKN1A στο φαινόμενο της μικροδορυφορικής αστάθειας, ανεξάρτητα από το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου TP53, σε συνδυασμό με τα προαναφερθέντα, υποδεικνύουν το σημαντικό ρόλο του μορίου p21 WAF1/Cip1 στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας και με τον τρόπο αυτό, στη παρεμπόδιση της καρκινογένεσης (Abbas et al., 2009). Ο ογκοκατασταλτικός ρόλος της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1, που υποστηρίζεται από τις παραπάνω μελέτες, δεν καθίσταται απόλυτος. Η μικρή συχνότητα, με την οποία η ίδια βρίσκεται μεταλλαγμένη στους διάφορους καρκινικούς τύπους (σε αντίθεση με τη περίπτωση των ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών p53 και p16), σε συνδυασμό με την αυξημένη της αφθονία σε πολλούς εξ αυτών (καρκίνος του προστάτη, καρκίνος του τραχήλου της μήτρας, καρκίνος της ουροδόχου κύστεος, καρκίνος του στήθους κ.α.) (Roninson et al., 2002), φαινόμενα τα οποία είναι άμεσα συνδεδεμένα με αυξημένη επιθετικότητα, μεταστατική ικανότητα και κακή πρόγνωση, απετέλεσαν το υπόβαθρο πάνω στο οποίο στηρίχτηκε η υπόθεση του ογκογόνου ρόλου της πρωτεΐνης αυτής (Abbas et al., 2009). Μια σειρά από διαφορετικές μελέτες, είχαν σκοπό να αποδείξουν μηχανιστικά το ρόλο αυτό, συσχετίζοντάς τον είτε με την επαγωγή της έκφρασης αυξητικών και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνώνν είτε με τη καταστολή προαποπτωτικών μορίων και την αύξηση του χρόνου ζωής συγκεκριμένων κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (CDK4/6 και CDK2), πάντα υπό συνθήκες κυτταροπλασματικής αφθονίας της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 (Abbas et al., 2009). Παραπάνω τονίστηκε η καθοριστική σημασία των ρυθμιστικών δικτύων στη φυσιολογία του κυττάρου. Σε πολλούς καρκινικούς τύπους το δίκτυο p53- p21 WAF1/Cip1 αποδιοργανώνεται, εφόσον η πρωτεΐνη p53 εμφανίζεται είτε κατεσταλμένη είτε μεταλλαγμένη. Αντίθετα η πρωτεΐνη p21 WAF1/Cip1 όχι μόνο είναι λειτουργική αλλά σε πολλά καρκινικά κύτταρα εμφανίζεται να συνεντοπίζεται με τον παράγοντα πολλαπλασιασμού Ki67. Το αρχικό αυτό γεγονός οδήγησε στην αποκλειστική αποκρυπτογράφηση του ογκογόνου ρόλου του κυκλινοεξαρτώμενου αυτού καταστολέα, καθώς και στη διαπίστωση ότι η διττή του φύση εξαρτάται από το περιεχόμενο του κυττάρου σε ανοδικούς ρυθμιστές και καθοδικούς στόχους του. Πιο συγκεκριμένα, αποδείχθηκε ότι η παρατεταμένη έκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1, τόσο σε μια καρκινική (Saos2) όσο και σε μια προ-καρκινική [MDAH 041 (ινοβλάστες προερχόμενοι από ασθενείς με σύνδρομο Li Fraumeni)] κυτταρική σειρά, απουσία p53, δύναται να αποκτήσει ογκογόνο ρόλο, συνεισφέροντας στην απορρύθμιση της συσκευής αδειοδότησης της αντιγραφής και στην αλλοίωση της γενωμικής σταθερότητας. Πιο συγκεκριμένα, η προαναφερθείσα απορρύθμιση πραγματοποιήθηκε μέσω της εξαρτώμενης από τη p21 WAF1/Cip1 αύξησης του χρόνου ζωής των παραγόντων αδειοδότησης CDT1 και CDC6, οδηγώντας σταδιακά σε εκτεταμένη αντιγραφική πίεση (μέσω επαναδιπλασιασμού), η οποία αποτελεί βασική πηγή γενωμικής αστάθειας. Το

22 21 παραπάνω φαινόμενο σε συνδυασμό με την επαγόμενη μείωση της σταθερότητας των αντιγραφικών συσκευών, οι οποίες έχουν παύσει την διαδικασία της σύνθεσης DNA και τη δραστηριότητα της ενδονουκλεάσης MUS81-EME1, οδήγησε σε αυξημένο αριθμό ρήξεων της δίκλωνης αλυσίδας. Η αύξηση των βλαβών του DNA και ταυτόχρονα η ενίσχυση της επιρρεπούς σε λάθη, RAD52-εξαρτώμενης επιδιόρθωσης τους, οδήγησε σε εκτεταμένες χρωμοσωμικές ανακατατάξεις και συνακόλουθα σε εκτεταμένη γενωμική αστάθεια (εικόνα 2). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα, μετά την είσοδο των κυττάρων αυτών στη γήρανση και την αναστολή του κυτταρικού κύκλου για ένα μικρό χρονικό διάστημα, τη δημιουργία απογόνων (escaped cells), οι οποίοι είχαν προσπεράσει το παραπάνω ογκοκατασταλτικό φραγμό και εμφάνιζαν μεγάλη επιθετικότητα (Galanos et al., 2016) Εικόνα 2. Προτεινόμενο μοντέλο το οποίο απεικονίζει την ογκογόνο δράση της παρατεταμένης, ανεξάρτητης από την p53 έκφραση της p21 WAF1/Cip1. (Galanos P. et al., 2016) 1.3 Βλάβες στο DNA Με την ανακάλυψη του DNA, πάνω από 50 χρόνια έρευνας έχουν μεσολαβήσει στην κατανόηση των μηχανισμών εκείνων που διέπουν τη διατήρηση της γενετικής πληροφορίας, αποτρέποντας την αλλοίωσή της. Για να διατηρηθεί η γενωμική σταθερότητα, το DNA θα πρέπει να προστατευτεί από βλάβες που δημιουργούνται από εξωγενείς παράγοντες, είτε προκύπτουν αυθόρμητα, ενδογενώς, από διάφορες μεταβολικές διαδικασίες, που το ίδιο συμμετέχει. Οι αυθόρμητες αυτές αλλοιώσεις μπορεί να προκύπτουν από λανθασμένες ενσωματώσεις μη συμπληρωματικών νουκλεοτιδίων κατά τη διαδικασία της αντιγραφής, από υδρολύσεις, όπως απαμινώσεις και αποπουρινώσεις καθώς και από αλκυλιώσεις

23 22 αζωτούχων βάσεων, που οδηγούν σε μεταπτώσεις και μεταστροφές. Η παραγωγή, επίσης, ενεργών ριζών οξυγόνου (ROS), προκαλεί επιπλέον οξείδωση συγκεκριμένων αζωτούχων βάσεων (8oxo-G) και ρήξεις της δίκλωνης έλικας του DNA. Οι ενδογενείς αυτές πηγές αλλοιώσεων εκτιμάται ότι θέτουν κάθε κύτταρο αντιμέτωπο με 10 5 σφάλματα στο γενετικό του υλικό καθημερινώς, εκ των οποίων η πλειοψηφία καθίσταται αποτέλεσμα πολλαπλών οξειδώσεων (Ηoeijmakers et al., 2009/ Cicia et al., 2010/ Ghosal et al., 2013). Περιβαλλοντικοί εξωγενείς παράγοντες μπορεί να προέρχονται είτε από φυσικές είτε από χημικές πηγές. Χαρακτηριστικά παραδείγματα φυσικών γενοτοξικών παραγόντων είναι η ιονίζουσα ακτινοβολία (IR), καθώς και η υπεριώδης ακτινοβολία (UVA/ UVB), η οποία και εκτιμάται σε περιπτώσεις υπερβολικής έκθεσης στον ήλιο, να συνεισφέρει σε περίπου 10 5 αλλοιώσεις (διμερή θυμιδίνης και 6-4 φωτοπροϊόντα) καθημερινώς σε καθένα από τα εκτιθέμενα κύτταρα (Hoeijmakers et al., 2009). Η έκθεση στην ιονίζουσα ακτινοβολία δύναται να οδηγήσει σε εκτεταμένες ρήξεις, μονόκλωνες ή δίκλωνες, στο DNA. Επιπλέον, χημικής φύσεως παράγοντες, οι οποίοι χρησιμοποιούνται κατά κύριο λόγο στη θεραπεία γενετικών διαταραχών όπως ο καρκίνος, μπορούν να προκαλέσουν μια μεγάλη ποικιλία αλλοιώσεων στο DNA. Οι χημικοί αυτοί παράγοντες περιέχουν αλκυλιωτικές χημικές ουσίες, όπως MMS (Methyl methanesulfonate), Melphalan, crosslinking παράγοντες, όπως Cisplantin, Psoralen, MMC και Nitrogen Mustard, οι οποίοι εισάγουν ομοιοπολικούς δεσμούς μεταξύ αζωτούχων βάσεων, που είτε ανήκουν στην ίδια έλικα DNA (intrastrand crosslinks) είτε σε διαφορετικές (interstrand crosslinks). Άλλοι χημικοί παράγοντες όπως αναστολείς τοποϊσομερασών Ι και ΙΙ (Εtoposide, Captothesin) επάγουν τη δημιουργία μονόκλωνων και δίκλωνων ρήξεων. Σημαντική επιπλέον συνεισφορά σε μια μεγάλη ποικιλία σφαλμάτων που επιβαρύνει κατά κύριο λόγο τα κύτταρα του πνεύμονα, έχει ο καπνός του τσιγάρου (Επαγωγή χημικών αλλοιώσεων στη βάση G, BP-G) (Cicia et al., 2010/ Ghosal et al., 2013) Αντιγραφική Πίεση (Replication Stress) Το κύτταρο έχει φυσιολογικά την ικανότητα να προστατεύει τη γενωμική του σταθερότητα και να αποκρίνεται αποδοτικά σε κάθε είδους βλάβη, μέσω ενός πολύ καλά οργανωμένου δικτύου μοριακών μηχανισμών, το οποίο περιγράφεται

24 23 παρακάτω. Παρόλα αυτά, κάποιες αλλοιώσεις δεν απομακρύνονται από το DNA, περνώντας στο στάδιο της αντιγραφής. Η αντιγραφική διαδικασία αποτελεί μια πολύ ευαίσθητη και κρίσιμη διαδικασία του κυττάρου. Οι αλλοιώσεις αυτές αναγνωρίζονται από τις αντιγραφικές πολυμεράσες δ και ε και πραγματοποιείται μια πρόσκαιρη παύση (μερικών ωρών) της διαδικασίας της αντιγραφής, η οποία αν παραμείνει για μεγάλο χρονικό διάστημα οδηγεί σε αποσυναρμολόγηση της αντιγραφικής συσκευής, ένα φαινόμενο που αναφέρεται συνολικά ως αντιγραφική πίεση. Αρχικά, όταν η αντιγραφική διχάλα έρθει σε επαφή με βλάβες στην έλικα του DNA, πρωτεΐνες που συμμετάσχουν στην επιδιορθωτική διαδικασία εξαρτώμενη από ομολογίες (HDR: Homology Directed Repair), η οποία περιγράφεται στη συνέχεια, προστατεύουν την αντιγραφική συσκευή από την αποσυναρμολόγηση, καθώς και τα προκύπτοντα μονόκλωνα τμήματα DNA από την εκτομή. Ταυτόχρονα, είναι υπεύθυνες για την επανέναρξη της αντιγραφικής διαδικασίας ή την επαναδημιουργία της αντιγραφικής συσκευής όταν έχει διαμεσολαβήσει αποσυναρμολόγησή της. Η θωράκιση αυτή διαμεσολαβείται από μια χαρακτηριστική δομική αλλαγή υποκινούμενη από την οπισθοδρόμηση της αντιγραφικής συσκευής και τον ανασυνδυασμό ομόλογων αλληλουχιών της αντιγραφικής διχάλας, που είναι γνωστή ως Chikenfoot. Μετά από την απομάκρυνση της εκάστοτε βλάβης, η αντιγραφική συσκευή είναι σε θέση να συνεχίσει την σύνθεση του DNA. Η παραμονή αυτής της δομής για εκτεταμένα χρονικά διαστήματα οδηγεί σε αποσύνθεση της συσκευής αυτής και στη δημιουργία δίκλωνων ρήξεων από ενδονουκλεάσες που αναγνωρίζουν συγκεκριμένα δομικά μοτίβα (π.χ. MUS81-EME1). Στη συγκεκριμένη περίπτωση η δημιουργία των ρήξεων αυτών επιφέρει τη δημιουργία ενός δίκλωνου άκρου, το οποίο επιδιορθώνεται μέσω ενός μηχανισμού επιρρεπή σε λάθη, γνωστού ως αντιγραφή επαγόμενη από ρήξη (BIR: Break Induced Replication) (Lliorente et al., 2008/ Costantino et al., 2014). Χαρακτηριστική είναι και η περίπτωση κατά την οποία η αντιγραφική συσκευή μπορεί να παρακάμψει την εκάστοτε βλάβη που προκάλεσε την αναστολή της, είτε μέσω της επιστράτευσης χαμηλής πιστότητας DNA πολυμερασών είτε μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού με την αδελφή χρωματίδα που έχει αντιγραφεί. Τα παραπάνω μονοπάτια ανήκουν στο μηχανισμό ανεκτικότητας σε βλάβες στο γενετικό υλικό, που φέρει το ευκαρυωτικό κύτταρο. Στα πλαίσια του μηχανισμού αυτού, που περιγράφεται εκτεταμένα παρακάτω, η βλάβη επιδιορθώνεται σε δεύτερο χρόνο, μετά

25 24 την ολοκλήρωση του διπλασιασμού του DNA (Yeeles et al., 2013/ Petermann et al., 2010/ Haber et al., 2014/ Ghosal et al., 2013/ Foiani et al., 2010/ Halazonetis et al., 2015) Κυτταρική απόκριση στις βλάβες του DNA Τα ευκαρυωτικά κύτταρα, προκειμένου να ανταπεξέλθουν στις καθημερινές απειλές που δέχονται από ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες, που αποσκοπούν στην αλλοίωση της γενωμικής τους σταθερότητας, έχουν αναπτύξει ένα σύνολο ομοιοστατικών μηχανισμών, οι οποίοι χαρακτηρίζονται ως απόκριση στις βλάβες στο DNA (DDR: DNA Damage Response). Η απόκριση αυτή αποτελεί ένα μονοπάτι μεταγωγής σήματος που εντοπίζει βλάβες στο DNA και φαινόμενα αντιγραφικής πίεσης και ενεργοποιεί κατάλληλες καθοδικές πρωτεΐνες στόχους, με μοναδικό σκοπό την εξάλειψη του πιθανού κίνδυνου τόσο για το κύτταρο, όσο και για τον οργανισμό. Οι πρωτεΐνες ATM, ATR, DNAPKcs και τα μέλη της οικογενείας PARP (PARP1 και PARP2), αποτελούν κύριους διαμεσολαβητές του παραπάνω καταρράκτη μοριακών γεγονότων (Jackson et al., 2009/ Cicia et al., 2010). Τα παραπάνω μόρια είναι υπεύθυνα για τη μεταγωγή του σήματος σε ολόκληρο το κύτταρο, κάτι το οποίο πραγματοποιείται με μεγάλη ταχύτητα μέσω διακυτταρικών αλληλεπιδράσεων και μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, συνεισφέροντας ταυτόχρονα και στην ανίχνευση των διάφορων αλλοιώσεων (PARP1/2, ATM). Οι τελικοί αποδέκτες της μεταγωγής αυτής ρυθμίζουν κυτταρικές μεταβολικές διαδικασίες, με κυριότερες την επιδιόρθωση της εκάστοτε βλάβης και την ενεργοποίηση συγκεκριμένων σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που οδηγεί σε αναστολή της προόδου του (εικόνα 3). Με τον τρόπο αυτό, δίνεται ο χρόνος στο κύτταρο να επιδιορθώσει τις όποιες αλλοιώσεις, είτε πριν εισέλθει στην S φάση του κυτταρικού κύκλου (G1 phase arrest), είτε πριν εισέλθει στη φάση της μίτωσης (intras phase/g2-m phase arrest). Αν η απομάκρυνση της βλάβης αυτής δε μπορέσει να πραγματοποιηθεί, ενεργοποιούνται συγκεκριμένες πρωτεΐνες τελεστές που ρυθμίζουν μη αναστρέψιμες διαδικασίες του κυττάρου όπως η κυτταρική γήρανση (π.χ. p16) και η απόπτωση (π.χ. ΒAX, PUMA) (Cicia et al., 2010/ Ghosal et al., 2013/ Jackson et al., 2009/ Kastan et al., 2004). Τα πρωτεϊνικά μόρια που συμμετέχουν σε κάθε στάδιο της κυτταρικής απόκρισης στις βλάβες στο DNA, διαφέρουν ανάλογα με το τύπο της βλάβης που έχει

26 25 εντοπιστεί. Όπως αναφέρθηκε στην προηγούμενη υποενότητα οι βλάβες στο γενετικό υλικό ποικίλουν από απλές αλλοιώσεις αζωτούχων βάσεων, έως δομικές ανωμαλίες στη δίκλωνη έλικα και δικλωνικές θραύσεις. Τα κύτταρα τα οποία δε διαθέτουν τους παραπάνω ομοιοστατικούς μηχανισμούς, καθίστανται ανίκανα να διατηρήσουν τη γονιδιακή τους σταθερότητα, αυξάνοντας την πιθανότητα δημιουργίας γενετικών διαταραχών με κυριότερη αυτή του καρκίνου (Jakson & Bartek, 2009/ Kastan et al., 2004). Εικόνα 3. Ο καταρράκτης των μοριακών γεγονότων που πυροδοτούνται στα πλαίσια της απόκρισης του κυττάρου στην ποικιλία των σφαλμάτων στο DNA (Ghosal et al., 2013). 1.4 Μηχανισμοί επιδιόρθωσης του DNA Το κύτταρο φέρει μια ποικιλία από διαφορετικούς μηχανισμούς επιδιόρθωσης, ειδικούς για κάθε τύπο βλάβης που προκύπτει στο DNA. Πιο συγκεκριμένα, οι μη συμπληρωματικές βάσεις στη δίκλωνη έλικα του DNA απομακρύνονται μέσω του μηχανισμού επιδιόρθωσης αταίριαστων συνδυασμών (MMR: Missmatch Repair), ενώ χημικές μεταβολές των αζωτούχων βάσεων απομακρύνονται μέσω του μηχανισμού επιδιόρθωσης-εκτομής βάσεων (BER: Base Excision Repair). Πιο περίπλοκες αλλοιώσεις (π.χ. διμερή θυμίνης) καθώς και εκτεταμένες παραμορφώσεις στη δίκλωνη έλικα επιδιορθώνονται μέσω του

27 26 μηχανισμού επιδιόρθωσης-εκτομής νουκλεοτιδίων (NER: Nucleotide Excision Repair). Σημαντικό επιδιορθωτικό ρόλο διαδραματίζουν και πρωτεΐνες που συμμετέχουν στο σύνδρομο της αναιμίας Fanconi. Οι μονόκλωνες ρήξεις επιδιορθώνονται από το μηχανισμό επιδιόρθωσης των μονόκλωνων ρήξεων (SSBR: Single Strand Break Repair), ο οποίος παράλληλα καθίσταται συμπληρωματικός του μηχανισμού επιδιόρθωσης-εκτομής βάσεων. Οι πιο κρίσιμες κυτταρικές βλάβες, οι δίκλωνες ρήξεις στα ευκαρυωτικά κύτταρα, επιδιορθώνονται μέσω συγκεκριμένων επιδιορθωτικών μηχανισμών που διακρίνονται ανάλογα με το περιεχόμενό τους, σε τρεις κατηγορίες: τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης εξαρτώμενης από την ομολογία (HDR: Homology Directed Repair), το κλασικό μηχανισμό μη ομόλογης σύνδεσης ελεύθερων άκρων (cnhej: classical Non Homologous End Joining) και τον εναλλακτικό μηχανισμό μη ομόλογης σύνδεσης ελεύθερων άκρων (a-ej: alternative End Joining), ο οποίος διαμεσολαβείται κατά κύριο λόγο από μικρο-ομολογίες (MMEJ: Microhomology Mediated End Joining) (Chapman et al., 2012/ Ciccia et al., 2010/ McVey et al., 2008). Όσον αφορά την επιδιόρθωση των δίκλωνων ρήξεων, φυσιολογικά στο κύτταρο υπάρχει μια δυναμική ισορροπία που διέπει τους διαφορετικούς επιδιορθωτικούς μηχανισμούς, πάντα εξυπηρετώντας το συμφέρον του, στα πλαίσια της σωστής λειτουργίας και της επιβίωσης. Η επιστράτευση καθενός από τους παραπάνω μηχανισμούς επιδιόρθωσης, εξαρτάται από το ποσοστό της 5-3 εκτομής των δίκλωνων άκρων που προκύπτουν, τη διαθεσιμότητα των πρωτεϊνών που συμμετέχουν σε καθέναν από τους μηχανισμούς αυτούς, κάτι το οποίο σχετίζεται με το στάδιο του κυτταρικού κύκλου, καθώς και από μια σειρά μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων ιστονών και μη ιστονών, που ρυθμίζουν την κινητική τους (Chapman et al., 2012/ Ciccia et al., 2010) Επιδιόρθωση αταίριαστων βάσεων (MMR) Ο μηχανισμός της επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων αποτελεί έναν πολύ συντηρημένο μηχανισμό ανάμεσα στα διαφορετικά είδη, που συμβάλλει στη διατήρηση της γονιδιακής σταθερότητας μέσω της επιδιόρθωσης ζευγών βάσεων, τα οποία δεν υπακούν στον κανόνα της συμπληρωματικότητας. Η πιο κοινή πηγή των σφαλμάτων αυτών αποτελεί η διαδικασία της αντιγραφής του DNA. Η απομάκρυνση

28 27 των εσφαλμένα τοποθετημένων νουκλεοτιδίων κατά την επιδιορθωτική αυτή διαδικασία πραγματοποιείται από τη νεοσυντιθέμενη αλληλουχία, κατά τη διάρκεια της αντιγραφής. Ο διαχωρισμός της μητρικής από τη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα υποδεικνύεται από την παρουσία εγκοπών, είτε 3 στην περίπτωση που η νεοσυντιθέμενη αλυσίδα αντιγράφεται συνεχώς, είτε 5 στην περίπτωση της ασυνεχούς αντιγραφόμενης αλυσίδας (λόγω παρουσίας τμημάτων Okazaki) (Fukui et al., 2010/ Modrich et al., 2006/ Li et al., 2008). Η παρουσία των μη συμπληρωματικών νουκλεοτιδίων στο DNA ανιχνεύεται από δύο ετεροδιμερή σύμπλοκα στα ευκαρυωτικά κύτταρα, τα MutSα και MutSβ. Το σύμπλοκο MutSα αποτελείται από τις πρωτεΐνες MSH2 και MSH6 και ειδικεύεται στην αναγνώριση λανθασμένων ζευγαρωμένων βάσεων, είτε αλλοιώσεων στην έλικα του DNA που προκύπτουν από ενσωματώσεις ή απαλοιφές 1-2 νουκλεοτιδίων. Το σύμπλοκο MutSβ αποτελείται από τις πρωτεΐνες MSH2 και MSH3 και ειδικεύεται στην αναγνώριση αλλοιώσεων που προκύπτουν από ενσωματώσεις ή απαλοιφές 2-10 νουκλεοτιδίων. Σημαντικό ρόλο στο βήμα της προαναφερθείσας αναγνώρισης και ακολούθως στην πυροδότηση του επιδιορθωτικού μηχανισμού διαδραματίζει ο αντιγραφικός ολισθητήρας PCNA, ο οποίος αλληλεπιδρά με τα παραπάνω σύμπλοκα διαδραματίζοντας ταυτόχρονα ρόλο στην υπόδειξη της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Εν συνεχεία, επιστρατεύεται στο σημείο της βλάβης το σύμπλοκο MutLα, το οποίο αποτελείται από τις πρωτείνες MLH1 και PMS2, κατά τρόπο εξαρτώμενο τόσο από τα σύμπλοκα MutSα/ MutSβ, όσο και από τον PCNA και το φορτωτή του ολισθητήρα RFC. Το ετεροδιμερές MutLα, έπειτα από την αλληλεπίδρασή του με τους προαναφερθέντες παράγοντες, αποκτά δραστικότητα ενδονουκλεάσης, εισάγοντας μία εγκοπή στην αλυσίδα που περιέχει τη βλάβη. Το ετεροδιμερές MutSα/ MutSβ, εκτός από το σημαντικό ρόλο που επιτελεί ως αισθητήρας λανθασμένα ζευγαρωμένων τμημάτων DNA, αλληλεπιδρά επιπλέον με την εξωνουκλεάση EXO1. Η 5-3 εξωνουκλεάση αυτή συνεισφέρει στην εκτομή του τμήματος, το οποίο οριοθετείται από τις δύο εγκοπές. Η επιδιόρθωση ολοκληρώνεται ακολούθως με τη δράση της πολυμεράσης δ, η οποία επιτελεί τη σύνθεση του τμήματος που αφαιρέθηκε, σε συνδυασμό με τη λιγάση Ι, η οποία καλύπτει την εναπομείνασα εγκοπή (εικόνα 4Α) (Fukui et al., 2010/ Modrich et al., 2006/ Li et al., 2008).

29 28 Εικόνα 4. Δύο από τους τρεις κύριους μηχανισμούς εκτομής του κυττάρου, η επιδιόρθωση αταίριαστων βάσεων και η επιδιόρθωση εκτομής νουκλεοτιδίων. a) Μετά από την αναγνώριση του αταίριαστου ζεύγους από το σύμπλοκο MutSa, το σύμπλοκο MutLa επάγει τη δημιουργία εγκοπών στη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα. Η εξωνουκλεάση EXO1 συνεισφέρει στην απομάκρυνση του μονόκλωνου κομματιού που περιέχει τη βλάβη. b) Μετά την αναγνώριση της μεταβολής της δίκλωνης έλικας του DNA, είτε από το σύμπλοκο XPC-RAD23B- CETN2 στην περίπτωση του GG-NER, είτε από το ένζυμο RNA πολυμεράση στην περίπτωση του TC-NER, πραγματοποιείται η πιστοποίηση του σφάλματος από τις XPB (ERCC3), XPD (ERCC2) υπομονάδες του TFIIH. H απομάκρυνση του τμήματος που περιέχει τη βλάβη πραγματοποιείται από τις ενδουνουκλέασες XPF και XPG. (Fukui Kenji, 2010/ Marteijn et al., 2014)

30 Επιδιόρθωση εκτομής νουκλεοτιδίων (NER) Ο επιδιορθωτικός μηχανισμός της εκτομής νουκλεοτιδίων, καλύπτει ένα μεγαλύτερο φάσμα δομικών αλλοιώσεων της δίκλωνης έλικας του DNA. Ο μηχανισμός αυτός διακρίνεται σε δύο χαρακτηριστικά μονοπάτια, που διαφέρουν μόνο στον τρόπο με τον οποίο πραγματοποιείται η αναγνώριση της βλάβης. Το πρώτο ανιχνεύει βλάβες σε ολόκληρο το γονιδίωμα των κυττάρων (GG-NER: Global Genome NER) ενώ το δεύτερο δύναται να ανιχνεύει βλάβες μόνο στη μη κωδική αλυσίδα των γονιδίων που μεταγράφονται, κατά μήκος του DNA (TC-NER: Transcription Coupled NER) (Marteijn et al., 2014). Όσον αφορά το μηχανισμό GG-NER, η αναγνώριση οποιασδήποτε δομικής αλλοίωσης πραγματοποιείται από ένα σύμπλοκο τριών πρωτεϊνών, των οποίων η αλληλεπίδραση κρίνεται απαραίτητη. Πιο συγκεκριμένα, το σύμπλοκο XPC- RAD23B-CETN2, αναγνωρίζει και προσδένεται (μέσω του XPC) στην περιορισμένη μονόκλωνη DNA αλληλουχία που δημιουργείται από τις δομικές αυτές μεταβολές της δίκλωνης έλικας. Υπάρχουν, παρόλα αυτά, και αλλοιώσεις οι οποίες δε δημιουργούν τόσο εκτεταμένα μονόκλωνα κομμάτια DNA, εμποδίζοντας τη δέσμευση του συμπλέγματος αυτού, με χαρακτηριστικό παράδειγμα τα διμερή πυριμιδινών, που προκύπτουν ως αποτέλεσμα της έκθεσης των κυττάρων στην υπεριώδη ακτινοβολία. Στην περίπτωση αυτή, η δέσμευση του XPC μορίου διαμεσολαβείται από μια αρχική αναγνώριση του σφάλματος αυτού από το ετεροδιμερές UVDDB (αποτελούμενο από τις υπομονάδες DDB1 και DDB2). Στην περίπτωση του μηχανισμού TC-NER, το προαναφερθέν βήμα διαμεσολαβείται από το ένζυμο RNA πολυμεράση και πιο συγκεκριμένα από την παύση της διαδικασίας της μεταγραφής, που η ίδια πραγματοποιεί. Η παύση αυτή είναι αποτέλεσμα κάποιας εκτεταμένης δομικής αλλοίωσης στο γονίδιο το οποίο μεταγράφεται. Στην περίπτωση αυτή, επιστρατεύονται από το ένζυμο αυτό οι πρωτεΐνες CSA και CSB, που με τη σειρά τους διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στη συναρμολόγηση της TC-NER συσκευής και στην πυροδότηση του μηχανισμού αυτού. Η ολοκλήρωση του βήματος της αναγνώρισης, στα δύο παραπάνω μονοπάτια, δε σηματοδοτεί απαραίτητα την έναρξη της επιδιορθωτικής διαδικασίας. Η σηματοδότηση αυτή πραγματοποιείται μετά από την πιστοποίηση της βλάβης, η οποία διαμεσολαβείται από τις δύο υπομονάδες του γενικού μεταγραφικού παράγοντα TFIIH, XPB και XPD. Τα μόρια αυτά διαθέτουν δραστικότητα ελικάσης και ως εκ τούτου, εφόσον πιστοποιήσουν την ύπαρξη βλάβης,

31 30 επεκτείνουν το αρχικό μονόκλωνο κομμάτι DNA. Με την ολοκλήρωση του δεύτερου βήματος πυροδοτείται ο μηχανισμός της εκτομής νουκλεοτιδίων. Πιο συγκεκριμένα, στο σημείο της βλάβης προσελκύονται οι ενδονουκλεάσες, που στοχεύουν συγκεκριμένα δομικά μοτίβα, τα XPG και XPF, οι οποίες ευθύνονται για την πρόκληση εγκοπών εκατέρωθεν της βλάβης και την εκτομή ενός τμήματος DNA μήκους νουκλεοτιδίων (το οποίο περιέχει τη βλάβη). Στο βήμα της σύνθεσης, το οποίο έπεται της εκτομής, σημαντικό ρόλο έχει αποδειχθεί να διαδραματίζουν οι αντιγραφικές πολυμεράσες δ και ε καθώς και η TLS πολυμεράση κ, ενώ η επούλωση της εναπομείνασας εκτομής πραγματοποιείται είτε από τη λιγάση Ι είτε από το σύμπλοκο XRCC1/ λιγάση 3 (εικόνα 4Β) (Marteijn et al., 2014) Επιδιόρθωση εκτομής βάσεων (BER) Οι αλλοιώσεις (μεθυλιώσεις, οξειδώσεις) των αζωτούχων βάσεων του DNA, αποτελούν τη συχνότερη ενδογενή πηγή βλαβών ενός κυττάρου, ενώ ο αριθμός τους ανέρχεται σε χιλιάδες ανά κύτταρο, ανά ημέρα. Ο μηχανισμός της εκτομής βάσεων δίνει τη δυνατότητα στο κύτταρο να απομακρύνει τέτοιες αλλοιώσεις, που μπορεί να αποβούν απειλητικές όσον αφορά τη σταθερότητα του γονιδιώματός του (Kim Y.J. et al., 2012). Εικόνα 5. Οι DNA γλυκοζυλάσες αποτελούν τα κύρια μόρια αισθητήρες στον επιδιορθωτικό μηχανισμό εκτομής βάσεων. Στην παρούσα εικόνα απεικονίζονται οι ήδη αναγνωρισμένες DNA γλυκοζυλάσες, καθώς και οι χημικές αλλοιώσεις στις βάσεις, που οι ίδιες αναγνωρίζουν. (Kim Y.J. et al., 2012)

32 31 Ο επιδιορθωτικός αυτός μηχανισμός διακρίνεται σε τέσσερα επιμέρους στάδια. Όσον αφορά το πρώτο στάδιο, καθοριστικό ρόλο διαδραματίζουν ένζυμα γνωστά ως γλυκοζυλάσες, τα οποία ευθύνονται όχι μόνο για την αναγνώριση της βάσης που φέρει τη χαρακτηριστική αλλοίωση αλλά και για την απομάκρυνσή της. Πιο συγκεκριμένα τα ένζυμα αυτά καταλύουν τη διάσπαση του Ν-γλυκοζυτικού δεσμού μεταξύ της αζωτούχας βάσης και του 2 ατόμου άνθρακα της δεοξυριβόζης, αφήνοντας τελικά μια αβασική ανθρακική αλυσίδα. Υπάρχουν φυσιολογικά πολλά τέτοια ένζυμα στο κύτταρο, ειδικά για κάθε τύπο αλλοίωσης που το ίδιο φέρει στις βάσεις του (εικόνα 5). Με την ολοκλήρωση της διαδικασίας αυτής, πυροδοτείται η δράση της AP ενδονουκλεάσης, η οποία δημιουργεί μια χαρακτηριστική εγκοπή ακριβώς στο 5 άκρο του αβασικού νουκλεοτιδίου. Η διαδικασία αυτή επάγει τη δημιουργία μιας ασύμβατης φωσφορικής ομάδας, που δε μπορεί να συμμετέχει στη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού (5 deoxyribose phosphate, drp). Η κυριότερη ΑΡ ενδονουκλεάση στα θηλαστικά είναι η APE1. Το τρίτο στάδιο της επιδιορθωτικής αυτής διαδικασίας πραγματοποιείται από την πολυμεράση β, η οποία έχει όχι μόνο δράση πολυμεράσης αλλά και δράση drp λυάσης, απομακρύνοντας την ασύμβατη φωσφορική ομάδα. Οι DNA πολυμεράσες λ και ι διαθέτουν παρόμοιες λειτουργίες και καθίστανται ως back up ένζυμα της λειτουργίας της πρώτης. Η έκταση του πολυμερισμού μετά την αντικατάσταση του αβασικού νουκλεοτιδίου, που πραγματοποιείται από τα παραπάνω μόρια, διακρίνει το μηχανισμό επιδιόρθωσης εκτομής βάσεων σε δύο κατηγορίες, σε μεγάλης έκτασης και μικρής (LP-BER: Long Patch BER, SP-BER: Short Patch BER). Στην πρώτη κατηγορία, η διαδικασία του πολυμερισμού περιορίζεται αποκλειστικά στην αντικατάσταση του αβασικού νουκλεοτιδίου, ενώ στη δεύτερη ο πολυμερισμός συνεχίζεται και αφορά ένα μικρό κομμάτι DNA (2-12 νουκλεοτίδια). Η σύνθεση του μικρού κομματιού DNA οδηγεί σε ταυτόχρονη εκτομή του αντίστοιχου μονόκλωνου συμπληρωματικού κομματιού του δικλώνου μορίου. Ακολουθεί η απομάκρυνση του εκτεθειμένου αυτού τμήματος, από συγκεκριμένες ενδονουκλεάσες, τις FEN1, οι οποίες αναγνωρίζουν αυτό το δομικό μοτίβο. Το τελικό στάδιο της σύνδεσης πραγματοποιείται από τη DNA λιγάση ΙΙΙα (εικόνα 6) (Kim Y.J. et al., 2012).

33 32 Εικόνα 6. Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης εκτομής βάσεων αποτελεί έναν από τους βασικότερους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς του κυττάρου. Διακρίνεται σε μεγάλης έκτασης (LP-BER) και μικρής έκτασης (SP-BER), κάτι το οποίο καθορίζεται από το στάδιο της σύνθεσης του DNA. (Kim Y.J. et al., 2012) Κλασικός μηχανισμός σύνδεσης μη ομόλογων ελεύθερων άκρων Ο κλασικός μηχανισμός σύνδεσης μη ομόλογων ελεύθερων άκρων αποτελεί τον κύριο μηχανισμό επιδιόρθωσης των δίκλωνων ρήξεων στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Δύναται να ενεργοποιηθεί έπειτα από το κατάλληλο ερέθισμα, καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και ιδιαίτερα κατά τη φάση G1, κατά την οποία ο ανταγωνισμός του με τους υπόλοιπους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς είναι αμελητέος. Σύμφωνα με το μηχανισμό αυτό, οι δίκλωνες ρήξεις που δημιουργούνται στο DNA αναγνωρίζονται ταχύτατα (μέσα στα πρώτα δευτερόλεπτα από τη δημιουργία της ρήξης) από τις πρωτεΐνες KU70 και KU80. Τα μόρια αυτά, αποκτούν μεγάλη συγγένεια για τα δίκλωνα εκτεθειμένα άκρα, την οποία παρόλα αυτά χάνουν αν προηγηθεί η προαναφερθείσα διαδικασία της 5-3 εκτομής (Symington et al.,

34 ). Καθένα από τα μόρια αυτά προσδένεται σε ένα εκ των δύο εκτεθειμένων δίκλωνων άκρων και μέσω της αλληλεπίδρασης τους και της δημιουργίας ετεροδιμερούς, γνωστού ως KU70-KU80, τα φέρουν σε γειτνίαση. Στη συνέχεια, επιστρατεύουν στην περιοχή της ρήξης την κινάση DNAPKcs, η οποία αυτοφωσφωρυλιώνοντας τα κατάλληλα αμινοξικά κατάλοιπα (PQR cluster), σταθεροποιεί τα δίκλωνα άκρα, εμποδίζοντας την εκτομή τους. Η πρωτείνη κλειδί η οποία θα πραγματοποιήσει το τελικό βήμα της επιδιορθωτικής αυτής διαδικασίας, είναι η λιγάση 4 και το υπόστρωμά της XRCC4. Η πρόσδεσή της στο σημείο της ρήξης οφείλεται εξ ολοκλήρου σε διαπρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις του υποστρώματος XRCC4 με την κινάση DNAPKcs. Τα δύο δίκλωνα άκρα πλέον συνδέοντα μεταξύ τους άμεσα (εικόνα 7Α) (Ciccia et al., 2010). H επιδιορθωτική διαδικασία της άμεσης αυτής σύνδεσης, είναι επιρρεπής σε λάθη και πιο συγκεκριμένα μετά την ολοκλήρωσή της το κομμάτι εκατέρωθεν της ρήξης χαρακτηρίζεται από μικρές απαλοιφές ή προσθήκες. Υπάρχουν, παρόλα αυτά, και περιπτώσεις κατά τις οποίες πραγματοποιείται πλήρης επαναφορά της αρχικής αλληλουχίας πριν τη ρήξη. Επίσης, υπάρχει και η περίπτωση κατά την οποία ο κλασικός μηχανισμός μη ομόλογης σύνδεσης ελεύθερων άκρων μπορεί να επιφέρει και πιο περίπλοκες χρωμοσωμικές ανακατατάξεις όπως μη αμοιβαίες μετατοπίσεις. Η τελευταία περίπτωση είναι χαρακτηριστική υπό συνθήκες δημιουργίας πολλαπλών δίκλωνων ρήξεων στο γονιδίωμα του κυττάρου που μπορούν να οδηγήσουν, έπειτα από την κατάλληλη γειτνίαση στο χώρο του πυρήνα, σε σύνδεση δύο δίκλωνων άκρων προερχόμενων από διαφορετικά χρωμοσώματα (Ciccia et al., 2010) Εναλλακτικός μηχανισμός σύνδεσης μη ομόλογων ελεύθερων άκρων Ο εναλλακτικός επιδιορθωτικός μηχανισμός σύνδεσης μη ομόλογων ελεύθερων άκρων, όπως και ο αντίστοιχος κλασικός, δεν περιορίζεται σε κάποια συγκεκριμένη φάση του κυτταρικού κύκλου αλλά είναι διαθέσιμος καθ όλη τη διάρκειά του. Παρόλα αυτά, για την πραγματοποίησή του δεν απαιτεί κάποια από τις πρωτεΐνες που επιστρατεύονται στο κλασικό μηχανισμό μη ομόλογης σύνδεσης ελεύθερων άκρων. Επίσης, η διαδικασία της μη εκτεταμένης 5-3 εκτομής (5-25 νουκλεοτίδια) αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για να ενεργοποιηθεί ο εναλλακτικός αυτός μηχανισμός ο οποίος στηρίζεται κατά κύριο λόγο, όπως αναφέρθηκε

35 34 παραπάνω, σε μικρο-ομολογίες που βρίσκονται στις αλληλουχίες των δύο δίκλωνων άκρων. Πιο συγκεκριμένα, αφού προηγηθεί κάποια αρχική εκτομή των δύο άκρων, πραγματοποιείται σε δεύτερο χρόνο υβριδοποίησή τους σε περιοχές με χαρακτηριστικές μικρο-ομολογίες. Οι αλληλουχίες που μένουν εκτεθειμένες μετά από τη διαδικασία της υβριδοποίησης, πέπτονται από χαρακτηριστικές ενδονουκλεάσες, υποκινούμενες από καθορισμένα δομικά μοτίβα (FLAP ενδονουκλεάσες). Το τελικό βήμα της σύνθεσης του DNA στα μονόκλωνα κομμάτια πραγματοποιείται από την πολυμεράση θ, που εμφανίζει μικρή ικανότητα επεξεργασίας και μειωμένη πιστότητα (McVey et al., 2008/ Jakson et al., 2009). O επιδιορθωτικός αυτός μηχανισμός είναι επιρρεπής σε λάθη και θεωρείται ότι ευθύνεται για μια πληθώρα περίπλοκων χρωμοσωμικών ανακατατάξεων όπως απαλοιφές, προσθήκες, μετατοπίσεις και αναστροφές Επιδιόρθωση εξαρτώμενη από την ομολογία Οι δίκλωνες ρήξεις επιδιορθώνονται από τέσσερα διαφορετικά μονοπάτια που ανήκουν στο μηχανισμό της επιδιόρθωσης εξαρτώμενης από την ομολογία. Τα τρία εξ αυτών καθίστανται επιρρεπή στα λάθη κατά τη διάρκεια της επιδιόρθωσης. Ο μηχανισμός αυτός γίνεται διαθέσιμος για το κύτταρο, σε συγκεκριμένα στάδια του κυτταρικού κύκλου και πιο συγκεκριμένα κατά την S και G2 φάση, κατά τις οποίες έχει επιτευχθεί ο διπλασιασμός του γενετικού υλικού και στη διαδικασία του ομόλογου ανασυνδυασμού, δύναται να αποτραπούν τα οποιαδήποτε λάθη. Ο περιορισμός αυτός σχετίζεται άμεσα με τη διαθεσιμότητα των πρωτεϊνικών μορίων που συμμετέχουν στα στάδια του μηχανισμού αυτού. Όλα τα επιμέρους μονοπάτια που ανήκουν στον εξαρτώμενο από ομολογίες επιδιορθωτικό μηχανισμό, βασίζονται στη διαδικασία της 5-3 εκτομής των δίκλωνων άκρων για την εύρεση των ομόλογων αλληλουχιών και ακολούθως τη διαδικασία του ανασυνδυασμού (Haber et al., 2014/ Llorente et al., 2008). Η αναγνώριση των δίκλωνων ρήξεων στη περίπτωση της S και τη G2 φάσης του κυτταρικού κύκλου, διαμεσολαβείται είτε από το μόριο ATM είτε από το σύμπλοκο MRN. Τελικά, και τα δύο επιστρατεύονται στο σημείο των ρήξεων. Η διαδικασία της εκτομής ρυθμίζεται από την ATM, μέσω της πρωτεΐνης CtIP, η οποία αλληλεπιδρά ταυτόχρονα με το BRCA1 μόριο (το οποίο ευθύνεται και για την ενίσχυση της

36 35 ικανότητας πρόσδεσης της CtIP) και το σύμπλοκο MRN. Πιο συγκεκριμένα, το MRN σύμπλοκο πραγματοποιεί το αρχικό βήμα της εκτομής, μέσω της MRE11 ενδονουκλεάσης και η CtIP πρωτεΐνη δρα συμπληρωματικά ενισχύοντας την εκτομή αυτή. Στη συνέχεια, η παραπάνω διαδικασία ενισχύεται ακόμα πιο πολύ από την εξαρτώμενη από την ATM επιστράτευση επιπλέον νουκλεασών όπως η EXO1 και το σύμπλοκο BLM/DNA2. Τα 3 μονόκλωνα τμήματα που προκύπτουν από τη διαδικασία αυτή καλύπτονται από το ετεροτριμερές σύμπλοκο RPA (RPA1-RPA2- RPA3), το οποίο στη συνέχεια είτε προσελκύει το μόριο RAD52, είτε αντικαθίσταται από την πρωτεΐνη RAD51, που είναι υπεύθυνη στα ευκαρυωτικά κύτταρα για τη διαδικασία του ανασυνδυασμού. Τα επακόλουθα βήματα της επιδιόρθωσης διαφέρουν και εξαρτώνται από το μονοπάτι που έχει επιλεχθεί (Haber et al., 2014/ Llorente et al., 2008). Εικόνα 7. Μονοπάτια επιδιόρθωσης δίκλωνων ρήξεων. Η επιδιόρθωση των δίκλωνων ρήξεων πραγματοποιείται μέσω δύο κύριων μηχανισμών, της σύνδεσης μη ομόλογων άκρων (NHEJ) και της επιδιόρθωσης εξαρτώμενης από ομολογίες (HDR). dhj: διπλός κόμβος Holiday, CO: προϊόντα επιχιασμού, NCO: προϊόντα μη επιχιασμού. (Haber et al., 2009)

37 Σύνθεση εξαρτώμενη από την υβριδοποίηση των αλυσίδων DNA (SDSA: Synthesis Dependent Strand Annealing) Το μονοπάτι αυτό εκκινείται έπειτα από τη δημιουργία εκτεθειμένων μονόκλωνων τμημάτων DNA, καλυπτόμενων από την πρωτεΐνη RAD51. Εν συνεχεία, η μία εκ των δύο, καλυπτόμενη από τη RAD51, αφού εντοπίσει την ομόλογη αλληλουχία, εισβάλλει στη δίκλωνη αλυσίδα και υβριδοποιείται με βάση το κανόνα της συμπληρωματικότητας με αυτή, εκτοπίζοντας τη μη ομόλογή, σχηματίζοντας ένα χαρακτηριστικό βρόγχο (D-loop: Displacement loop). Έπειτα, πραγματοποιείται μια νέα έναρξη της σύνθεσης DNA, με την πολυμεράση δ να καθίσταται η κύρια πολυμεράση που συμμετέχει ενεργά στη διαδικασία αυτή, με μοναδικό υπόστρωμα την ομόλογη αλληλουχία που έχει εντοπιστεί. Πιο συγκεκριμένα, μετά από το βήμα της εισβολής σχηματίζεται ένας κινούμενος βρόγχος που υποκινεί τη διαδικασία της σύνθεσης του DNA. Με την ολοκλήρωση της αντιγραφής ενός μικρού τμήματος της εισβαλλόμενης αλυσίδας, η ίδια εκτοπίζεται από το σημείο της εισβολής και υβριδοποιείται με το εναπομένον μονόκλωνο τμήμα του δεύτερου κομματιού DNA που έχει προκύψει από τη διαδικασία της δίκλωνης θραύσης και της επακόλουθης εκτομής. Μετά από ένα επιπλέον βήμα σύνθεσης, με υπόστρωμα αυτή τη φορά το μονόκλωνο τμήμα του ενός άκρου, ολοκληρώνεται η διαδικασία της επιδιόρθωσης. Το επιδιορθωμένο τελικά μόριο αποτελεί προϊόν μη επιχιασμού, θέτοντας το μονοπάτι αυτό (SDSA) ως έναν επιδιορθωτικό μηχανισμό εξαρτώμενο από ομολογίες, υψηλής πιστότητας (εικόνα 7D) (Haber et al., 2014/ Llorente et al., 2008) Δημιουργία διπλών κόμβων Holiday (dhj mechanism) Το αρχικό βήμα του μονοπατιού αυτού καθίσταται η 5-3 εκτομή των δίκλωνων άκρων. Τα μονόκλωνα άκρα που προκύπτουν καλύπτονται από την πρωτεΐνη RAD51 και εν συνεχεία, αφού εντοπιστεί η ομόλογη αλληλουχία, πραγματοποιείται εισβολή στη δίκλωνη αλυσίδα και υβριδοποίηση με βάση το κανόνα της συμπληρωματικότητας. Ακολουθεί η δημιουργία του παραπάνω αναφερόμενου βρόγχου (D-loop), που σηματοδοτεί την έναρξη της σύνθεσης του DNA. Το βήμα της σύνθεσης, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, διαμεσολαβείται από μια συνεχή μετακίνηση του βρόγχου (προς τη φορά της αντιγραφής). Ο ήδη υπάρχων κόμβος Holiday συμπληρώνεται από έναν ακόμη, ο οποίος προκύπτει από την

38 37 υβριδοποίηση της εκτοπισμένης από το βρόγχο, μη ομόλογης αλληλουχίας με το εναπομένον μονόκλωνο άκρο, που έχει προκύψει από τη θραύση και από το βήμα της εκτομής. Εναλλακτικά, υπάρχει περίπτωση πρόκλησης διπλής εισβολής που θα συμμετέχει καθένα από τα δύο μονόκλωνα άκρα. Με την ολοκλήρωση της αντιγραφής ενός περιορισμένου τμήματος DNA, ακολουθεί η διάσπαση των κόμβων Holiday. Από τον τρόπο που θα πραγματοποιηθεί αυτή καθορίζονται και τα τελικά προϊόντα, τα οποία μπορούν να είναι είτε προϊόντα επιχιασμού είτε προϊόντα μη επιχιασμού. Το μονοπάτι αυτό είναι επιρρεπές σε λάθη και οδηγεί σε εκτεταμένη απώλεια της ετεροζυγωτίας (εικόνα 7C) (LOH: Loss Of Heterozygosity). (Haber et al., 2014/ Llorente et al., 2008) Υβριδοποίηση εκτεθειμένων μονόκλωνων άκρων (SSA: Single Strand Annealing) Αυτό τo μονοπάτι επιδιόρθωσης εξαρτάται από εκτεταμένη 5-3 εκτομή των δίκλωνων άκρων που προκύπτουν από τη ρήξη. Είναι, επίσης, ανεξάρτητο από την πρωτεΐνη RAD51, η οποία διαμεσολαβεί τη διαδικασία της εισβολής στην ομόλογη αλληλουχία για να πραγματοποιηθεί ο ομόλογος ανασυνδυασμός. Τα ελεύθερα μονόκλωνα άκρα που προκύπτουν από την προαναφερθείσα εκτομή επικαλύπτονται από το ετεροτριμερές σύμπλοκο RPA. Το ίδιο, όμως, στην περίπτωση αυτή δεν υποκαθίσταται από την πρωτεΐνη RAD51, αλλά αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη RAD52. Στα θηλαστικά η πρωτείνη αυτή διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο μόνο στο μονοπάτι της υβριδοποίησης εκτεθειμένων μονόκλωνων άκρων, συνεισφέροντας στη διαδικασία της υβριδοποίησής τους μέσω μικρο-ομολογιών (εικόνα 7B). Η άμεση υβριδοποίηση καθιστά το μονοπάτι αυτό ιδιαίτερα επιρρεπές σε λάθη, χαρακτηριζόμενα κυρίως από εκτεταμένες απαλοιφές και χρωμοσωμικές μετατοπίσεις (Haber et al., 2014) Αντιγραφή επαγόμενη από ρήξη (BIR: Break Induced Replication) Αυτό το μονοπάτι επιδιόρθωσης πυροδοτείται κατά κύριο λόγο στην περίπτωση που από μια δίκλωνη ρήξη προκύπτει ένα δίκλωνο κομμάτι DNA, όπως στην περίπτωση αντιγραφικού στρες που αναφέρθηκε παραπάνω. Στην περίπτωση των δύο δίκλωνων

39 38 άκρων έπειτα από μια δίκλωνική θραύση, η πυροδότηση του μηχανισμού αυτού αποφεύγεται από το κύτταρο, λόγω των πολύπλοκων χρωμοσωμικών ανακατατάξεων (μετατοπίσεις, απαλοιφές, διπλασιασμοί κ.α.), που εμφανίζονται μετά από την ολοκλήρωσή του. Χαρακτηριστική είναι και η συνεισφορά του μονοπατιού αυτού στη διατήρηση του μήκους των τελομερών υπό συνθήκες υπολειτουργίας της τελομεράσης, ένας μηχανισμός που αναφέρεται ως εναλλακτική επιμήκυνση τελομερών (ALT: Alternative Lengthening of Telomeres). Κατά τη διαδικασία του BIR, η πρωτεΐνη RAD51 δεν είναι απαραίτητη, κάτι το οποίο δε συμβαίνει και για την πρωτεΐνη RAD52. Το μόριο RAD52 καθίσταται απαραίτητο για το μονοπάτι αυτό, κάτι το οποίο έχει αποδειχθεί κατά κύριο λόγο στη ζύμη, με αρκετά δεδομένα να πιστοποιούν τη συνεισφορά του και στα θηλαστικά (Halazonetis, unpublished data). Μετά από μια αρχική εκτομή που πραγματοποιείται στο μοναδικό δίκλωνο άκρο, ακολουθεί η εισβολή και υβριδοποίηση του μονόκλωνου με την ομόλογη προς αυτό αλληλουχία, η οποία είτε εντοπίζεται στην αδελφή χρωματίδα είτε στο ομόλογο χρωμόσωμα είτε εκτοπικά σε κάποια άλλη χρωμοσωμική περιοχή. Στη συνέχεια, ακολουθεί η διαδικασία της σύνθεσης του DNA. Για τη διαδικασία αυτή, σε αντίθεση με τα προηγούμενα μονοπάτια, είναι απαραίτητη η πλειοψηφία των αντιγραφικών παραγόντων που συμμετέχουν στη διαδικασία της σύνθεσης του DNA κατά τη S φάση του κυτταρικού κύκλου. Μετά από την αντιγραφή ενός τμήματος DNA ακολουθεί ο εκτοπισμός της μονόκλωνης αλυσίδας. Στην περίπτωση που δεν εντοπιστεί κάποιο δεύτερο δίκλωνο άκρο με το οποίο η ίδια να μπορεί να συνδεθεί, ακολουθεί ένας νέος κύκλος εισβολής (εικόνα 7E). Πολλές φορές η διαδικασία της σύνθεσης ολοκληρώνεται στο τέλος του ομόλογου χρωμοσώματος, το οποίο χρησιμοποιείται σαν υπόστρωμα. Όπως γίνεται αντιληπτό, οι χρωμοσωμικές ανακατατάξεις όπως απαλοιφές, μετατοπίσεις, εκτεταμένες απώλειες ετεροζυγωτίας, αναστροφές κ.α., ενισχύονται ιδιαίτερα μετά την πυροδότηση του αναφερθέντος μονοπατιού (Haber et al., 2014/ Constantino et al., 2014/ Lliorente et al., 2008/ Malkova et al., 2013).

40 Ανοχή στις βλάβες του DNA Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το κύτταρο καλείται να αντιμετωπίσει μια πληθώρα από βλάβες που τείνουν να αλλοιώσουν τη γενωμική του σταθερότητα. Κάποια από τα σφάλματα αυτά δεν επιδιορθώνονται εγκαίρως από τους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς του κυττάρου και παραμένουν στο DNA, καθώς το ίδιο εισέρχεται στην S φάση του κυτταρικού κύκλου. Η απόκριση του κυττάρου στα εναπομένοντα σφάλματα, θα πρέπει να είναι άμεση και αποτελεσματική ιδιαίτερα σε ένα τόσο ευαίσθητο κυτταρικό στάδιο, στο οποίο θα πρέπει να αντιγράψει με μεγάλη πιστότητα το γενετικό του υλικό. Εκτός από την προαναφερθείσα απόκρισή του σε βλάβες στο DNA (DDR), το ίδιο πυροδοτεί και ένα επιπλέον μονοπάτι μεταγωγής σήματος, γνωστό ως ανοχή στις βλάβες του DNA (DDT: DNA Damage Tolerance). Η πυροδότηση του μονοπατιού αυτού, συνεισφέρει στην ολοκλήρωση της διαδικασίας της αντιγραφής, παρακάμπτοντας τη βλάβη του γενετικού υλικού, που μπορεί να οδηγήσει σε αντιγραφική πίεση. Η εναπομείνασα βλάβη επιδιορθώνεται σε δεύτερο χρόνο από τους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς του κυττάρου, ενώ έχει ολοκληρωθεί με επιτυχία η διαδικασία της αντιγραφής και έχει αποφευχθεί η γενωμική αστάθεια. Η ανοχή στις βλάβες του DNA διαμεσολαβείται από δύο κύρια μονοπάτια, το πρώτο εκ των οποίων στηρίζεται σε φαινόμενα ομόλογου ανασυνδυασμού, γνωστό ως εναλλαγή του υποστρώματος (TS: Template Switch) και το δεύτερο σχετίζεται με συγκεκριμένες χαμηλής πιστότητας πολυμεράσες, γνωστό ως σύνθεση πάνω από τη βλάβη (TLS: Translesion Synthesis). Οι δύο τύποι αποκρίσεων (DDR/ DDT), αλληλοεξαρτώνται και επικοινωνούν μεταξύ τους, ενώ ταυτόχρονα διαθέτουν και πολλά κοινά μόρια διαμεσολαβητές (Ghosal et al., 2013/ Goodman et al., 2013) Ρόλος του αντιγραφικού ολισθητήρα PCNA στην ανοχή στις βλάβες επί του DNA Στη ρύθμιση του μονοπατιού της ανοχής στη βλάβη του DNA, κύριο ρόλο διαδραματίζουν μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του αντιγραφικού ολισθητήρα PCNA. Μετά από κάποια βλάβη στο DNA, το PCNA ομοτριμερές μόριο, μόνο- ή

41 40 πόλυ-ουβικιτινιλιώνεται στο αμινοξικό κατάλοιπο Λυσίνης που φέρει στη θέση 164 (K164) (εικόνα 8). Οι τροποποιήσεις αυτές, όχι μόνο είναι απαραίτητες για την πυροδότηση της απόκρισης αυτής, αλλά και για το καθορισμό του επιμέρους μονοπατιού που θα ακολουθηθεί, προκειμένου η ίδια να ολοκληρωθεί. Στον άνθρωπο, κύρια μετα-μεταφραστική τροποποίηση του PCNA αποτελεί η μόνοουβικιτινιλίωση, η οποία πραγματοποιείται από τη Ε3 λιγάση ουβικιτίνης RAD18. Η διαδικασία της πολύ-ουβικιτινιλίωσης πραγματοποιείται από δύο διαφορετικές πρωτεΐνες, τη HLTF και τη SHPRH, οι οποίες είναι υπεύθυνες για τη μεταφορά μιας αλυσίδας μορίων ουβικιτίνης, συνδεδεμένες μεταξύ τους με πεπτιδικούς δεσμούς μεταξύ των καταλοίπων λυσίνης που φέρουν στη θέση 63 (Κ63) (εικόνα 8). Πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν την εμπλοκή της προαναφερθείσας Ε3 λιγάσης RAD18 στη δέσμευση της αλυσίδας αυτής στο PCNA. Το μόνο-ουβικιτινιλιωμένο PCNA αποτελεί ένα μοριακό φάρο για τη προσέλκυση των TLS πολυμερασών, όντας υπεύθυνο για την υποκατάσταση των αντιγραφικών πολυμερασών με αυτές (εικόνα 8). Αντίθετα, το πολύ-ουβικιτινιλιωμένο PCNA υποκινεί την παράκαμψη της βλάβης μέσω της αλλαγής υποστρώματος (TS) (εικόνα 8). Το μονοπάτι της παράκαμψης της βλάβης μέσω αλλαγής υποστρώματος, δεν καθίσταται επιρρεπές σε λάθη, κάτι το οποίο δε συμβαίνει πάντα στο μονοπάτι της σύνθεσης πάνω από τη βλάβη. Η επιστράτευση καθενός από τα δύο σχετίζεται με τις ανάγκες του κυττάρου, καθώς επίσης και με το είδος και την έκταση των βλαβών (Ghosal et al., 2013/ Goodman et al., 2013/ Galanos et al. 2016).

42 41 Εικόνα 8. Μηχανισμός ανοχής στις βλάβες του DNA. Η βλάβη του DNΑ (κίτρινο πλαίσιο) μπλοκάρει την ολοκλήρωση της διαδικασίας της αντιγραφής του DNA. Η παράκαμψη, στη συνέχεια, της βλάβης πραγματοποιείται είτε από τις TLS πολυμεράσες μειωμένης πιστότητας είτε μέσω αλλαγής υποστρώματος με τη χρήση της αδελφής χρωματίδας. Και στις δύο περιπτώσεις καθοριστικό ρόλο διαδραματίζουν συγκεκριμένες μετάμεταφραστικές τροποποιήσεις στον ολισθητήρα της αντιγραφής, PCNA. (Ghosal et al., 2013) Σύνθεση πάνω από τη βλάβη (TLS: Translesion Synthesis) Η μόνο-ουβιλιτινιλίωση του PCNA, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για την πυροδότηση του μονοπατιού της σύνθεσης πάνω από τη βλάβη. Πιο συγκεκριμένα, οι TLS πολυμεράσες, που συνεισφέρουν στην αρχική προσθήκη ενός νουκλεοτιδίου απέναντι από τη βλάβη (Y-family), διαθέτουν κατάλληλες επικράτειες που αναγνωρίζουν την τροποποίηση αυτή (UBZ επικράτειες), οι οποίες σε συνδυασμό με τις επικράτειες PIP, ενισχύουν τη συγγένειά τους προς το παραπάνω αντιγραφικό ολισθητήρα. Οι παραπάνω DNA πολυμεράσες

43 42 διαθέτουν μειωμένη ικανότητα επεξεργασίας και χαρακτηρίζονται από ελαττωμένη πιστότητα, σε αντίθεση με τις αντιγραφικές πολυμεράσες (πολυμεράση δ/ πολυμεράση ε). Στα ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν αναγνωριστεί 15 πρωτεϊνικά μόρια που διαθέτουν την ικανότητα να αντιγράφουν παρακάμπτοντας τις οποιεσδήποτε βλάβες. Οι κύριες TLS πολυμεράσες κατανέμονται σε τρεις χαρακτηριστικές οικογένειες: την Υ οικογένεια που περιέχει τα μόρια polη, polι, polκ, REV1, τη Β οικογένεια που περιλαμβάνει τη polζ και την Α οικογένεια πρωτεϊνών, στην οποία ανήκουν η polθ και η polν. Καθένα από τα μόρια αυτά επιστρατεύεται και παρακάμπτει διαφορετικούς τύπους βλαβών, ενώ επηρεάζεται από τη διαθεσιμότητα των υπολοίπων (Ghosal et al., 2013/ Livneh et al., 2010). Το μονοπάτι της σύνθεσης πάνω από τη βλάβη αποτελείται από επιμέρους στάδια για την ολοκλήρωσή του. Οι βασικοί διαμεσολαβητές του μονοπατιού αυτού, διακρίνονται σε TLS πολυμεράσες, οι οποίες ειδικεύονται στην προσθήκη ενός νουκλεοτιδίου απέναντι από την εκάστοτε βλάβη (insterters) και σε TLS πολυμεράσες, που ειδικεύονται στον πολυμερισμό καθοδικά αυτής της αρχικής προσθήκης (extenders) (εικόνα 9). Υπάρχουν, βέβαια, και οι περιπτώσεις κατά τις οποίες κάποιο από τα παραπάνω μόρια μπορεί να πραγματοποιήσει τόσο την αρχική προσθήκη, όσο και το μετέπειτα πολυμερισμό. Επομένως, σε κάθε πυροδότηση του μονοπατιού πραγματοποιούνται τουλάχιστον δύο εναλλαγές μεταξύ πολυμερασών. Αρχικά, για την παράκαμψη της βλάβης, υπό συγκεκριμένες τροποποιήσεις του αντιγραφικού ολισθητήρα, οι αντιγραφικές πολυμεράσες, υποκαθίστανται από τις TLS πολυμεράσες και ως εκ τούτου πραγματοποιείται προσθήκη ενός νουκλεοτιδίου απέναντι από την υπάρχουσα βλάβη. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται μια δεύτερη εναλλαγή, αυτή τη φορά μεταξύ TLS πολυμερασών, με σκοπό έναν περιορισμένο πολυμερισμό της αρχικής προσθήκης, κατάσταση που αποφεύγεται στην περίπτωση που το αρχικό μόριο μπορεί να συμμετέχει και στα δύο βήματα (της προσθήκης και του πολυμερισμού). Η τελευταία εναλλαγή μεταξύ πολυμερασών επαναφέρει την αντιγραφική πολυμεράση στη διχάλα της αντιγραφής, επιτρέποντας τη συνέχιση της σύνθεσης του DNA, με μεγάλη πιστότητα και την ολοκλήρωση του διπλασιασμού του (εικόνα 8) (Ghosal et al., 2013/ Livneh et al., 2010). Το μονοπάτι της σύνθεσης πάνω από τη βλάβη ενδέχεται να είναι επιρρεπές ή όχι σε λάθη, ενώ στην πλειοψηφία των περιπτώσεων καρκίνου εμφανίζεται αποσυντονισμένο και ως εκ τούτου αποτελεί βασική πηγή εκτεταμένων σημειακών

44 43 μεταλλάξεων. Η πιστότητα του μονοπατιού αυτού, εξαρτάται εξ ολοκλήρου από τη βλάβη και από την επιστράτευση της κατάλληλης TLS πολυμεράσης, η οποία θα μπορέσει να την παρακάμψει, τοποθετώντας απέναντί της το κατάλληλο νουκλεοτίδιο (συμπληρωματικό του λανθασμένου) (εικόνα 9). Βασικό ρόλο στη ρύθμιση αυτή, έχει αποδειχθεί ότι διαδραματίζουν κύριοι διαμεσολαβητές που συμμετάσχουν στην απόκριση στις βλάβες του DNA (DDR), όπως το μόριο p53 και ο καθοδικός του στόχος p21 WAF1/Cip1 (Avkin et al., 2006). Φυσιολογικά στα ευκαρυωτικά κύτταρα, ο TLS μηχανισμός δεν αποτελεί μια back up απόκριση στις βλάβες στο DNA, αλλά μια ζωτικής σημασίας απόκριση. Αυτό υποδεικνύεται από τη διατήρησή του στην πορεία της εξέλιξης, κάτι το οποίο αντικατοπτρίζει όχι μόνο την ορθή και καίρια συμμετοχή του για τη διατήρηση της ομοιόστασης του κυττάρου, αλλά και τη συμμετοχή του στην αντιμετώπιση κρίσιμων και συχνά εμφανιζόμενων αλλοιώσεων (Ghosal et al., 2013/ Livneh et al., 2010). Εικόνα 9. Το μοντέλο των δύο πολυμερασών, σχετικά με τη σύνθεση του DNA πάνω από διαφορετικές βλάβες στο μόριο αυτό. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν τις κύριες αντιδράσεις που πραγματοποιούνται σε κάθε βλάβη. (Livneh et al., 2010)

45 Αλλαγή υποστρώματος (TS: Template Switch) Οι περισσότερες ενδείξεις σχετικά με το μονοπάτι αυτό προέρχονται από μελέτες στη ζύμη. Η παράκαμψη της βλάβης μέσω αλλαγής υποστρώματος, διαμεσολαβείται από μόρια, τα οποία συμμετέχουν στο μηχανισμό επιδιόρθωσης HDR. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιείται μια παροδική αντικατάσταση του υποστρώματος DNA που φέρει τη βλάβη με την αντίστοιχη συμπληρωματική, ως προς το νεοσυντηθέμενο μόριο, αλυσίδα DNA της αδελφής χρωματίδας. Δύο μοντέλα έχουν μέχρι στιγμής προταθεί για την περιγραφή του μονοπατιού αυτού. Σύμφωνα με το πρώτο μοντέλο, μετά την παύση της αντιγραφής από την αντιγραφική πολυμεράση, πραγματοποιείται οπισθοδρόμηση της αντιγραφικής διχάλας και δημιουργία της χαρακτηριστικής δομής Chickenfoot, με αποτέλεσμα την άμεση επαφή με τη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα της αδελφής χρωματίδας. Όσον αφορά το δεύτερο μοντέλο, η δημιουργία της προαναφερθείσας δομής αποφεύγεται και πραγματοποιείται εισβολή της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας του μητρικού κλώνου που φέρει τη βλάβη, στην αδερφή χρωματίδα (εικόνα 8). Το αυτό μονοπάτι της κυτταρικής ανοχής, χαρακτηρίζεται από υψηλή πιστότητα, εφόσον εξαρτάται αποκλειστικά από την αλλαγή των υποστρωμάτων μεταξύ των αδελφών χρωματίδων, για την ολοκλήρωση της αντιγραφικής διαδικασίας ( εικόνα 8) (Ghosal et al., 2013/ Chang et al., 2009). 1.6 Σκοπός της παρούσας εργασίας Από τα παραπάνω, κατέστη σαφές ότι το κύτταρο θα πρέπει να είναι σε θέση να πυροδοτήσει ένα πολύπλοκο δίκτυο μοριακών αλληλεπιδράσεων και μονοπατιών μεταγωγής σήματος προκειμένου να προστατεύσει τη γενωμική του σταθερότητα. Η οργάνωση των αποκρίσεών του, τόσο στο χώρο όσο και στο χρόνο, αποτελεί κύριο παράγοντα της επιτυχούς ολοκλήρωσης τους. Η ερευνητική προσέγγιση των Galanos P. et al., 2016 της ογκογόνου δράσης της p21 WAF1/Cip1, αποτέλεσε την απόδειξη ότι η αλλοίωση των ρυθμιστικών δικτύων που φέρει ένα κύτταρο και τα οποία είναι υπεύθυνα για τη διατήρηση της ομοιόστασής του, έχουν τη δυνατότητα να επιφέρουν τα αντίθετα αποτελέσματα. Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, η προσέγγιση αυτή

46 45 υπέδειξε την επαγωγή φαινομένων αντιγραφικής πίεσης και εκτεταμένων δίκλωνων ρήξεων εξαρτώμενων από την υπερ-έκφραση της p21 WAF1/Cip1, υπό συνθήκες απουσίας της p53. Η υπερ-έκφραση αυτή συνεισφέροντας στα παραπάνω φαινόμενα μέσω επαγωγής αυξημένης σταθεροποίησης των παραγόντων αδειοδότησης αντιγραφής, ενισχύει τη γονιδιωματική αστάθεια των κυττάρων. Η παρούσα εργασία στοχεύει στην περαιτέρω αποκωδικοποίηση των μηχανισμών με τους οποίους η πρωτεΐνη p21 WAF1/Cip1 πραγματοποιεί την ογκογόνο της δράση, τόσο σε επίπεδο επαγωγής φαινομένων αντιγραφικής πίεσης και εκτεταμένων δικλωνικών θραύσεων όσο και σε επίπεδο πυροδότησης επιδιορθωτικών μηχανισμών που αποσκοπούν την απομάκρυνσή τους.

47 46 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΥΛΙΚΑ/ ΜΕΘΟΔΟΙ

48 Καλλιέργεια κυττάρων Κυτταρικές σειρές Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά Saos2, η οποία αποτελείται από κύτταρα οστεοσαρκώματος, στα οποία δεν εκφράζεται ο ογκοκατασταλτικός παράγοντας p53 και MDAH-041, όπου με τη σειρά της αποτελείται από ινοβλάστες ατόμων με σύνδρομο Li-Fraumeni, χαρακτηριζόμενη παράλληλα από το ίδιο πρότυπο έκφρασης του προαναφερθέντος παράγοντα, καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό υλικό DMEM (BIOSERA, Invitrogen, AntiSel Αθήνα, Ελλάδα) συμπληρωμένο με 10% ορό FBS (GIBCO, AntiSel Invitrogen, AntiSel, Αθήνα, Ελλάδα), ή 10% FBS TET free (Clontech) και αντιβιοτικά πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη 1% (GIBCO, Invitrogen, AntiSel, Αθήνα, Ελλάδα) Επιδράσεις Στα επαγόμενα κυτταρικά συστήματα Tet-ON p21 WAF1/Cip1 MDAH-041 και Tet-ON p21 WAF1/Cip1 Saos2, πραγματοποιήθηκε επαγωγή της έκφρασης του παράγοντα p21 μέσω προσθήκης Doxocyclin (Dox), σε συγκέντρωση 1μg/mL, για χρονικά διαστήματα 3 ημερών, 15 ημερών καθώς και 4 ημερών, 20 ημερών αντίστοιχα. Στις κυτταρικές καλλιέργειες πραγματοποιήθηκε επίσης επίδραση με το χημειοθεραπευτικό παράγοντα Melphalan [(4-(bis{2-chloroethyl} amino)-lphenylalanine]. Η δράση του σχετίζεται με την αλκυλίωση του DNA και τη δημιουργία Ν-alkyl-purine βλαβών και σε μικρότερο ποσοστό με τη δημιουργία crosslinks μεταξύ διαφορετικών δίκλωνων μορίων. Οι βλάβες αυτές επιδιορθώνονται αποκλειστικά από το NER μηχανισμό επιδιόρθωσης Crosslinking κυτταρικών σειρών Η πραγματοποίηση του crosslinking των κυττάρων έγινε παρουσία 1% παραφορμαλδεύδης. Πιο συγκεκριμένα, τα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την καλλιέργεια και προστέθηκε σε αυτά κατάλληλος όγκος από την 37%

49 48 παραφορμαλδεύδη (με στόχο τελική συγκέντρωση 1%). Τα κύτταρα επωάστηκαν με το αυτόν τον crosslinker για 1 ώρα υπό ανάδευση. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η αναστολή της αντίδρασης της παραφορμαλδεύδης με 0,125Μ διάλυμα γλυκίνης για 15 λεπτά. Ακολούθησαν 3 πλυσίματα με PBS και scraping-συλλογή των κυττάρων από τις plates Μέτρηση επιπέδων ενεργών ριζών οξυγόνου (ROS) Η ενδοκυτταρική συγκέντρωση των ενεργών ριζών οξυγόνου, πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο DCFH-DA. Πιο συγκεκριμένα, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 96-well plates, σε συγκέντρωση κύτταρα/ πηγάδι και όταν έφτασαν στο επίπεδο να καλύπτουν το 80% της επιφάνειας των πηγαδιών, πραγματοποιήθηκε η χορήγηση του αντιβιοτικού doxocyclin (1 μg/ml) στο θρεπτικό υλικό DMEM που καλλιεργούνταν. Στα χρονικά διαστήματα των 6, 24, 48 και 72 ωρών πραγματοποιήθηκε προσθήκη του αντιδραστηρίου DCFH-DA (10 μm). Μετά από χρονικό διάστημα 60 λεπτών μετρήθηκε η εκπομπή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας στο μήκος κύματος 530nm, έπειτα από διέγερση στα 480nm με τη χρήση FLUOStar OPTIMA microplate reader (BMG Labtech GmbH, Ortenberg, Germany), αξιοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης δεδομένων MARS. Η συγκέντρωση των ενεργών ριζών οξυγόνου υπολογίστηκε στη συνέχεια με βάση τον εκπεμπόμενο φθορισμό (Mavrogonatou et al., 2010) Κυτταρομετρία ροής Οι κλώνοι των κυττάρων Saos2-p21 οι οποίοι έφεραν τα πλασμίδια παρακολούθησης των επιδιορθωτικών μηχανισμών SSA, SDSA και BIR, μετά από παροδική διαμόλυνση με το πλασμίδιο pha-isceid44a και επώαση 48 ωρών, υποβλήθηκαν σε κυτταρομετρία ροής. Η παρατήρηση του φθορισμού, προερχόμενου από τη διέγερση του GFP, έγινε με τη χρήση FL1 αισθητήρα.

50 Ανάλυση πρωτεϊνών Απομόνωση πρωτεϊνών από κύτταρα Για την απομόνωση πρωτεϊνών από κύτταρα, τα κύτταρα θρυψινοποιούνται, συλλέγονται, φυγοκεντρούνται και στη συνέχεια λύονται με την προσθήκη διαλύματος λύσης (RIPA) παρουσία αναστολέων πρωτεασών (Protease inhibitor cocktail, Thermo Scientific, Bioanalytica) και φωσφατασών (Phosphatase inhibitor cocktail, Thermo Scientific, Bioanalytica). Η ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης στο διάλυμα λύσης έγινε με τη μέθοδο Bradford (BioRad) Στύπωμα κατά Western ή Ανοσοαποτύπωση (Western Blot WB ή Immunoblot, IB ) Πρωτεΐνη ποσότητας μg ηλεκτροφορήθηκε σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνη PVDF (Millipore, LabSupplies, Αθήνα, Ελλάδα). Η κάλυψη των μη ειδικών θέσεων έγινε με επώαση σε διάλυμα TBS-Tween 0,1%-γάλα 5%. Στη συνέχεια έγινε ολονύκτια επώαση της μεμβράνης με πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ο C. Η επώαση με δευτερογενές anti-mouse ή anti-rabbit αντίσωμα έγινε για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η εμφάνιση πραγματοποιήθηκε, είτε με χημειοφωταύγεια με διάλυμα ECL (Pierce, Thermo Scientific, Bioanalytica, Αθήνα, Ελλάδα) είτε με αλκαλική φωσφατάση με διάλυμα BCIP/NBT (Invitrogen, AntiSel, Αθήνα, Ελλάδα) Ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου Αρχικά, το πήκτωμα πολυακρυλαμίδης παρασκευάζεται με πρώτη στρώση το πήκτωμα διαχωρισμού (Separating gel). Για πρωτεΐνες με μοριακό βάρος πάνω από 40kD η συγκέντρωση του πηκτώματος διαχωρισμού είναι 10% (2,85ml dh2o, 2,5ml 2,25M Tris-Cl, ph8,8, 4,5ml acrylamide/bis 37:1, 100μl 10% SDS, 100μl 10% APS, 10μl TEMED), ενώ για πρωτεΐνες μικρότερου μοριακού βάρους είναι 15% (0m53l dh2o, 2,5ml 2,25M Tris-Cl, ph8,8, 6,76ml acrylamide/bis 37:1, 100μl 10% SDS, 100μl 10% APS, 10μl TEMED). Πάνω από το πήκτωμα διαχωρισμού προστίθεται

51 50 μικρότερη ποσότητα πηκτώματος φόρτωσης (Stacking gel) με συγκέντρωση 4,8% (5,6ml dh2o, 1,25ml 0,5M Tris-Cl, ph6,8, 2ml acrylamide/bis 37:1, 100μl 10% SDS, 100μl 10% APS, 10μl TEMED). Το πήκτωμα τοποθετείται σε συσκευή ηλεκτροφόρησης με ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης 1x (Running buffer 10x: 900ml dh2o, 24gr Trizma Base, 115,2gr Glycine, 8gr SDS). Παράλληλα γίνεται η προετοιμασία των δειγμάτων. Σε 30μg πρωτεΐνης (μέγιστος όγκος 15μl) προστίθεται ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης 1x (SDS protein oading buffer 2x: 20% Glycerol, 4% SDS, 120mM Tris-Cl ph6,8, 0,003% Bromophenol blue, 10% β- μερκαπτοαιθανόλης). Το παραπάνω μίγμα θερμαίνεται επί 10 λεπτά στους 95 o C, ώστε να αποδιαταχθούν οι πρωτεΐνες. Στη συνέχεια, γίνεται φόρτωση των δειγμάτων στο πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται στα 125V και 200mA για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα (1-3 ώρες). Μεταξύ των δειγμάτων ηλεκτροφορείται δείκτης (Novex sharp pre-stained protein standard, LC5800, ThermoFisher scientific) που περιέχει μίγμα πρωτεϊνών με γνωστό μοριακό βάρος και αποτελεί σημείο αναφοράς για την εκτίμηση του μοριακού βάρους των πρωτεϊνών που εξετάζονται Μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη PVDF Μετά την ηλεκτροφόρηση οι πρωτεΐνες μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF με την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η μεταφορά πραγματοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1x (Transfer Buffer 20x: 500ml dh2o, 15,5gr Trizma Base, 72gr Glycine) και 20% μεθανόλης. Η μεταφορά γίνεται στα 100V και 200mA από 60 λεπτά για πρωτεΐνες χαμηλού μοριακού βάρους (έως 30 kd) έως 90 λεπτά για πρωτεΐνες υψηλού μοριακού βάρους (έως 70 kd). Στη συνέχεια, η μεμβράνη επωάζεται με διάλυμα κάλυψης μη ειδικών θέσεων 5% ημιαποβουτυρωμένο γάλα ή Αλβουμίνη ορού μόσχου (Bovine Serum Albumine) σε περίπτωση χρήσης φωσφοαντισωμάτων διαλυμένα σε ΤΒS-Τ 0,1% (20mM TrisCl ph7.6, 0.135M NaCl, 0.1% Tween-20 0,1%) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου Επώαση της μεμβράνης με πρωτογενές και δευτερογενές αντίσωμα Η μεμβράνη επωάζεται με το πρωτογενές αντίσωμα (διαλυμένο σε 0,5% γάλα και ΤΒS-T 0,1%) ολονύκτια στους 4 ο C. Ακολουθούν τρεις πλύσεις της μεμβράνης διάρκειας 5 λεπτών η κάθε μία σε διάλυμα ΤΒS-T 0,1%. Στη συνέχεια, γίνεται η

52 51 επώαση της μεμβράνης με το δευτερογενές αντίσωμα σε συγκεκριμένη αραίωση ανάλογα με το δευτερογενές και τη συγκέντρωσή του για περίπου 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθούν τρεις πλύσεις των 5 λεπτών με διάλυμα TBS-T 0,1% Εμφάνιση της μεμβράνης με αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ-Alkaline Phosphatase) Το δευτερογενές αντίσωμα που χρησιμοποιείται πρέπει να είναι συνδεδεμένο με ΑΡ (Αλκαλική φωσφωατάση) (AP conjugated). Η μεμβράνη επωάζεται με το αντίσωμα σε αραίωση 1/1000 για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη καλύπτεται με 14ml διαλύματος εμφάνισης (14ml AP buffer, 200μl διάλυμα ΝΒΤ, 100μl BCIP). Κατά τη διάρκεια της εμφάνισης αποφεύγεται η έκθεση της μεμβράνης σε δυνατό φως γιατί το ένζυμο απενεργοποιείται. Μόλις εμφανιστεί η πρωτεΐνη, η μεμβράνη εμβαπτίζεται σε νερό για να σταματήσει η αντίδραση Εμφάνιση της μεμβράνης με χημειοφωταύγεια Το δευτερογενές αντίσωμα που χρησιμοποιείται πρέπει να είναι συνδεδεμένο με HRP (HRP conjugated - Horse Radish Peroxidase). Η μεμβράνη επωάζεται με αντίσωμα σε αραίωση 1/1000 για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα διαλύματα της χημειοφωταύγειας αναμιγνύονται 5 λεπτά πριν την επώαση της μεμβράνης. Η μεμβράνη καλύπτεται με το διάλυμα της χημειοφωταύγειας (chemiluminescent detection substrate της εταιρίας Pierce) και επωάζεται για 5 λεπτά στο σκοτάδι. Η μεμβράνη καλύπτεται με σελοφάν και τοποθετείται σε κασέτα εμφάνισης. Στη συνέχεια σε σκοτεινό θάλαμο, πάνω στη μεμβράνη τοποθετείται κομμάτι φιλμ αυτοραδιογραφίας (Kodak X-omat). Ο χρόνος έκθεσης καθορίζεται εμπειρικά. Τα φιλμ αναλύθηκαν με σαρωτή και εκτιμήθηκαν με το πρόγραμμα Image- Pro, Έκδοση 3.0 των Windows (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA).

53 Μικρής κλίμακας βιοχημική κλασμάτωση των κυττάρων Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και στη συνέχεια αναδιαλύθηκαν σε 200μL ρυθμιστικού διαλύματος A (10 mm HEPES KOH [ph 7.9], 1.5 mm MgCl2, 10 mm KCl, 0.5 mm DTT) και επωάστηκαν για 8 λεπτά στον πάγο. Εν συνεχεία, φυγοκεντρήθηκαν στις 4400 rpm για 5 λεπτά στους 4 ο C. To υπερκείμενο συλλέχθηκε ως το κυτταροπλασματικό κλάσμα S1. Το ίζημα των πυρήνων (P1 κλάσμα) αναδιαλύθηκε εκ νέου σε ρυθμιστικό διάλυμα Α, και φυγοκεντρήθηκε σε 4400 rpm. Οι πυρήνες, στη συνέχεια, αναδιαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Β (EDTA 3Mm, ph 8.0, EGTA 0,25Mm, ph 8.0, DTT 1Mm) και επωάστηκαν για χρονικό διάστημα 30 λεπτών στους 4 ο C. Ταυτόχρονα όσον αφορά το κλάσμα S1, πραγματοποιήθηκε φυγοκέντρηση για 20 λεπτά σε full-speed (13400 rpm) στους 4 ο C. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης απομονώθηκε το υπερκείμενο S2 κλάσμα το οποίο περιέχει τις κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες και απορρίφθηκε το ίζημα. Με την ολοκλήρωση της 30λεπτης επώασης των πυρήνων με το ρυθμιστικό διάλυμα Β πραγματοποιήθηκε φυγοκέντρηση στις 5000 rpm. Το υπερκείμενο που περιέχει τις πυρηνικές πρωτεΐνες συλλέχθηκε και το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 1x LB. Το ίζημα περιέχει τη χρωματίνη με τις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν μαζί της. Τα διαφορετικά κλάσματα φυλάχθηκαν στη συνέχεια στους -80 ο C Αντισώματα Αντισώματα για Ανοσοαποτύπωση (IB) Πρωτογενή αντισώματα RAD52 (provided by Jiri Lucas, 2 nd Bleed, sheep anti-rad52, 1:200), PCNA (Cell Signaling, 2586s, mouse monoclonal anti-pcna, 1:1000), Ubiquitil PCNA (K164) (Cell Signaling, 13439s, rabbit monoclonal anti ubi-pcna, 1:1000), polη (Santa Cruz, sc5592, rabit polyclonal anti polη, 1:200), p21 (Santa Cruz, sc6246, mouse monoclonal anti-p21, 1:400), b actin (Cell signaling, 4067s, rabbit monoclonal anti-b-actin, 1:1000), Lamin B1 (Abcam, ab16048, rabbit polyclonal anti-laminb1, 1:500)

54 53 Δευτερογενή αντισώματα Goat anti-mouse IgG-HRP conjugated (#HAF007 R&D Systems, AntiSel, Αθήνα, Ελλάδα ), goat anti-rabbit-hrp conjugated (# HAF008 R&D Systems, AntiSel, Αθήνα, Ελλάδα), goat anti-mouse IgG-AP conjugated (#G21060, Invitrogen, AntiSel, Αθήνα, Ελλάδα), goat anti-rabbit IgG-AP conjugated (#G21079,Invitrogen, AntiSel, Αθήνα, Ελλάδα) Πλασμιδιακοί φορείς και διαμολύνσεις Διαμόλυνση κυττάρων με πλασμίδια H δημιουργία των κυτταρικών σειρών Saos2 p21 Tet-ON πραγματοποιήθηκε με τη διαμόλυνση των κυττάρων αυτών με τα πλασμίδια pdr-gfp (SDSA) (addgene #26475), pbir-gfp (BIR) (addgene #49807) και psa-gfp (SSA) (addgene #41594), τα οποία ήταν παροχή του Dr. Halazonetis T. Η διαμόλυνση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Effectene transfection reagent (Qiagen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια επιλογή κλώνων. Mετά την επιτυχημένη επιλογή των καταλληλότερων κλώνων ακολούθησε παροδική διαμόλυνση με το πλασμίδιο pha-isceid44a (addgene #59424) που έφερε το γονίδιο κωδικοποίησης του ενζύμου Isce1 (ΗΑ-Isce1), το οποίο ήταν παροχή της Dr. Soutoglou. Μετά από διάστημα 48 ωρών από τη διαμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη για FACS Ανάπτυξη και απομόνωση πλασμιδίων Για την ανάπτυξη όλων των πλασμιδιακών φορέων χρησιμοποιήθηκαν βακτήρια Ε.coli στελέχους DH5a σε θρεπτικό υλικό Luria Bertani (LB) με επιλογή με χρήση αμπικιλλίνης 100μg/ml. Για το μετασχηματισμό των βακτηρίων χρησιμοποιήθηκαν χημειοδεκτικά βακτήρια στα οποία εισήχθη μικρή ποσότητα του κατάλληλου πλασμιδίου. Ακολούθησε επώαση στον πάγο για 20 λεπτά, θερμικό σοκ για 2 λεπτά στους 42 ο C, επώαση στον πάγο για 3 λεπτά, επώαση σε LB στους 37 ο C για 45 λεπτά και επίστρωση σε τρυβλία αγαρ/lb παρουσία αμπικιλλίνης 100μg/ml για ανάπτυξη αποικιών ολονύκτια στους 37 ο C. Από τις αποικίες που αναπτύχθηκαν έγινε επιλογή και μεταφορά σε υγρή καλλιέργεια με 5ml LB παρουσία αμπικιλλίνης 100μg/ml ολονύκτια στους 37 ο C υπό ανάδευση. Την επόμενη μέρα κρατήθηκε στοκ

55 54 γλυκερόλης 30% σε LB στους -80 ο C και έγινε απομόνωση πλασμιδιακού DNA από την υπόλοιπη καλλιέργεια Απομόνωση και καθαρισμός πλασμιδιακού DNA Η απομόνωση του πλασμιδιακού DNA έγινε με το kit ΜΝ Nucleospin plasmid (Macherey-Nagel). Ολονύχτια βακτηριακή καλλιέργεια των 5ml κατακρημνίστηκε στις 3000 rpm για 5 λεπτά και το ίζημα κυττάρων αναδιαλύθηκε σε 250μl διαλύματος Α1. Προστέθηκαν 250μl διαλύματος λύσης Α2 και ακολούθησε ήπια ανακίνηση 4 με 5 φορές ώστε το διάλυμα να ομογενοποιηθεί. Μετά από ακριβώς 5 λεπτά προστέθηκαν 350μl διαλύματος εξουδετέρωσης Α3, έγινε ήπια ανακίνηση 4 με 5 φορές και φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στις rpm. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε κολόνα απομόνωσης (Nucleospin plasmid columns) και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στις rpm. Η κολόνα ξεπλύθηκε αρχικά με 500μl διάλυμα WB και στη συνέχεια με 600μl διάλυμα A4 και φυγοκεντρήθηκε για 1 λεπτό στις rpm. Η φυγοκέντρηση επαναλήφθηκε ώστε να απομακρυνθούν τα υπολείμματα της αιθανόλης από το διάλυμα A4. Η κολόνα τοποθετήθηκε σε καινούριο σωληνάκι φυγοκέντρησης και σε αυτό προστέθηκαν 50μl ΕΒ (10Mm Τris- Cl, ph 8,5). Η κολόνα επωάστηκε για 1 λεπτό και φυγοκεντρήθηκε για επίσης 1 λεπτό στις rpm Υπολογισμός συγκέντρωσης και καθαρότητας πλασμιδίων Η ποσότητα του πλασμιδίου υπολογίστηκε με φωτομέτρηση και με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Τα πηκτώματα παρασκευάστηκαν με διάλυση κατάλληλης ποσότητας αγαρόζης σε 1x ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ (40mM Tris-acetate, 1mM EDTA) και θέρμανση. Προστέθηκε 0.5μg/ml βρωμιούχο αιθίδιο και τοποθετήθηκε σε κατάλληλο δοχείο για να πήξει. Στα δείγματα DNA προστέθηκε LB (Loading buffer: 0,04% Bromophenol Blue, 5% glycerol) και φορτώθηκαν στο πήκτωμα. Για την ηλεκτροφόρηση εφαρμόστηκε τάση 50-80V. Το DNA ελέγχθηκε σε πλάκα υπεριώδους ακτινοβολίας.

56 55 Υπολογισμός Συγκέντρωσης του DNA Ο υπολογισμός της ποσότητας του DNA υπολογίζεται με φωτομέτρηση βάσει της απορρόφησης στα 260nm. H μέτρηση του πλασμιδιακού DNA πραγματοποιήθηκε μέσω nanodrop. Aφού μετρηθεί η απορρόφηση, η συγέντρωση του DNΑ υπολογίζεται βάσει του τύπου [DNA] = OD260 x 1/αραίωση x 50(μg/ml), όπου OD260 είναι η οπτική πυκνότητα στα 260nm.O υπολογισμός της καθαρότητας του κάθε δείγματος έγινε με βάση το λόγο OD260/OD280. Όταν αυτός βρίσκεται μεταξύ των τιμών 1.8-2, υποδεικνύει δείγμα υψηλής καθαρότητας. Στη συνέχεια τα δείγματα αποθηκεύονται στους -20 ο C Αντίδραση πέψης πλασμιδιακού DNA Η διαδικασία της πέψης των πλασμιδιακών DNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συγκεκριμένων ενζύμων περιορισμού. Τα ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διαδικασία αυτή αναγράφονται στον παρακάτω πίνακα. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας της πέψης πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Πλασμίδια Ένζυμα περιορισμού επαγωγής διπλών θράυσεων pha-isceid44a EcorI-HF pdr-gfp EcorI-HF phprt-sa-gfp SalI-HF pbir-gfp EcorI-HF 2.5. Αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων Μέτρηση Ν-alkyl-purine monoadducts στο γονίδιο N-Ras Η επιδιόρθωση των βλαβών στις βάσεις G του DNA, που προκλήθηκαν μετά την καλλιέργεια των κυττάρων με το χημειοθεραπευτικό παράγοντα melphalan, υπολογίστηκε μέσω στυπώματος κατά Southern, με ραδιενεργά σεσημασμένους ανιχνευτές. Πιο συγκεκριμένα, μετά την επώαση των κυττάρων με τον παραπάνω παράγοντα για 0 ώρες, 14 ώρες και 48 ώρες, πραγματοποιήθηκε απομόνωση του γονιδιώματός τους και πλήρης πέψη με το ένζυμο περιορισμού EcoRI. Στη συνέχεια,

57 56 τα δείγματα επωάστηκαν στους 70 ο C για χρονικό διάστημα 30 λεπτών, όπου πραγματοποιήθηκε η αποπουρίνωση των Ν-alkylated νουκλεοτιδίων. Τα απουρινικά νουκλεοτίδια στη συνέχεια υπέστησαν μονόκλωνες ρήξεις μετά την προσθήκη NaOH και την επώασή τους για 30 λεπτά στους 37 ο C. Ακολούθησε η ηλεκτροφόρησή τους πήκτωμα αγαρόζης και η μεταφορά κατά Southern (Souliotis V. et al., 2006) Μεγάλης κλίμακας αναλύσεις του γονιδιώματος Αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) Γενωμικό DNA απομονωμένο από τις επαγώγιμες κυτταρικές σειρές Saos2 p21 WAF1/Cip1 Tet-ON και Li-Fraumeni (MDAH041) p21 WAF1/Cip1 Tet-ON, στις οποίες είτε είχε επαχθεί είτε όχι η έκφραση του γονιδίου CDKN1A, υποβλήθηκε σε αλληλούχιση. Η προετοιμασία της γονιδιακής βιβλιοθήκης, καθώς επίσης και η διαδικασία της αλληλούχισης, πραγματοποιήθηκαν στο EMBL Genecore facility, υπακούοντας στα πρότυπα της πλατφόρμας illumine (Galanos et al., 2016). Η αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος πραγματοποιήθηκε τόσο στα OFF, όσο και στα ON κύτταρα επιτυγχάνοντας 30x κάλυψη ολόκληρου του γονιδιώματος. Paired-end 2x100 bp πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Illumina Hiseq Ο ποιοτικός έλεγχος των αλληλουχημένων τμημάτων (reads), πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού fastqc και η ταυτοποίηση του ανθρώπινου γονιδιώματος (GRCh37/hg19 version), πραγματοποιήθηκε με τον αλγόριθμο bowtie 2, με τη χρήση του κωδικού (-D 5 -R 1 -N 1 -L 22 -i S0,2,.50 trim3 25 -I 0 -X 500). Το Samtools χρησιμοποιήθηκε με στόχο τη μετατροπή των sam αρχείων σε bam, καθώς και για την κατανομή των τελευταίων. Το λογισμικό Breakdancer χρησιμοποιήθηκε με στόχο την ανίχνευση SV (ενδο- και διαχρωμοσωμικές μετατοπίσεις, απαλοιφές, προσθήκες και αναστροφές). Λαμβάνοντας υπ όψη την απόσταση μεταξύ των δύο paired ends κατά τη διαδικασία

58 57 της αλληλούχισης, έγιναν αντιληπτά τα SVs με μήκος μικρότερο των 500bp. (απαλοιφές, προσθήκες και αναστροφές) (Galanos et al., 2016). Η χρήση του breakdancer λογισμικού με προκαθορισμένες παραμέτρους, οδήγησε στην αναγνώριση νέων ενδοχρωμοσωμικών μετατοπίσεων στα ON (escaped) κύτταρα εναντίον των OFF κυττάρων (Saos2 p21 WAF1/Cip1 Tet-ON και Li- Fraumeni (MDAH041) p21 WAF1/Cip1 Tet-ON), τα οποία βρίσκονταν στην καλλιέργεια και αναπτύσσονταν για το ίδιο χρονικό διάστημα. Θέτοντας ως στόχο την αναγνώριση των περιοχών που εμφάνιζαν μικροομολογία σε επίπεδο ενδοχρωμοσωμικών μετατοπίσεων των δύο προαναφερθέντων κυτταρικών συστημάτων, χρησιμοποιήθηκαν τα εξαχθέντα αποτελέσματα του λογισμικού breakdancer και ταυτόχρονα επιμηκύνθηκαν κατά 30bp και από τις δύο πλευρές του σημείου που αρχικά είχε πραγματοποιηθεί η ρήξη. Χρησιμοποιήθηκε επίσης το λογισμικό Clustal W, με στόχο την ταυτοποίηση των περιοχών ανάμεσα στις 103 αναγνωρισθέντες ρήξεις. Αναγνωρίστηκαν με τον τρόπο αυτό περιοχές οι οποίες εμφάνιζαν μικροομολογία που εκτεινόταν σε μέγεθος 1-9bp εκατέρωθεν των ρήξεων αυτών (Galanos et al., 2016) Oμική ανάλυση σε επίπεδο μικροσυστοιχιών Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα Saos2-p21 WAF1/Cip1 Tet ON, μη επαχθέντα και επαχθέντα για χρονικό διάστημα 12h, 48h, 96h, ως προς την έκφραση του γονιδίου CDKN1A, με χρήση του RNeasy Total RNA kit (Qiagen), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάλυση των μικροσυστοιχιών πραγματοποιήθηκε από τη μονάδα μικροσυστοιχιών του CBM Core Facility Italy ( με τη χρήση Illumina s Whole-Genome Expression Beadchip. Η πλατφόρμα αυτή στοχεύει περισσότερους από ανιχνευτές προερχόμενους από το NCBI (National Center for Biotechnology Information Reference Sequence) RefSeq 38 και από άλλες πηγές. Η ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές (Bioanalyzer 2100, Agilent) και η συγκέντρωσή του υπολογίστηκε με τη χρήση Nanodrop Συγκεκριμένες ποσότητες των RNA δειγμάτων που απομονώθηκαν αρχικά (250ng), ενισχύθηκαν με τη χρήση Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion) για να παραχθεί μια ποσότητα (pool) σημασμένων RNA με βιοτίνες, που αντιστοιχούν στα πολύ-

59 58 αδενυλιωμένα RNA (mrna). Το δείγμα των crnas αυτών στη συνέχεια υποβλήθηκε σε αλληλούχιση με τη χρήση συστοιχιών whole-genome HumanHT-12 v4.0 arrays (Illumina) και υβριδοποιήθηκε με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε συστοιχία στο beadchip στοχεύει σε πάνω από μετάγραφα, καθώς σε κάθε σφαιρίδιο (3 micron bead), είναι ομοιοπολικά προσδεδεμένοι ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές (50 βάσεων). Κάθε ανιχνευτής σχετίζεται με ένα συγκεκριμένο γονίδιο και κάθε τύπος σφαιριδίου αντιπροσωπεύεται κατά μέσο όρο 30 φορές σε κάθε συστοιχία. Τα BeadChips αυτά στη συνέχεια σαρώνονται με τη χρήση Illumina's Beadarray system scanner (Illumina). Η ένταση του σήματος που λαμβάνεται τελικά από τη διαδικασία της υβριδοποίησης απομονώθηκε, ενώ η ένταση του μη ειδικού σήματος αφαιρέθηκε, με τη χρήση του λογισμικού Illumina Inc. BeadStudio software v Τα παραγόμενα αποτελέσματα ελέγχθηκαν από το σύστημα Illumina internal quality control (Galanos et al., 2016) Βιοπληροφορική ανάλυση Προσδιορισμός νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων και mutational signature Για την αναγνώριση των νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων τα δεδομένα από την αλληλούχιση των γονιδιωμάτων των δύο επαγόμενων κυτταρικών σειρών (τόσο σε κύτταρα στα οποία δεν είχε επαχθεί η έκφραση του p21, όσο και σε escaped κύτταρα), επεξεργάστηκαν με τα βιοπληροφορικά εργαλεία Samtools, BCFtools και custom scripts. Για την αναγνώριση της μοριακής υπογραφής των escaped κυττάρων σε καθένα από τα παραπάνω συστήματα, χρησιμοποιήθηκε περαιτέρω το βιοπληροφορικό εργαλείο Bedtools Μεταγραφωμική ανάλυση μη επαγόμενων και επαγόμενων για χρονικό διάστημα 12, 48 και 96 ωρών, κυττάρων Saos2-p21 WAF1/Cip1 Tet-ON. Οι αναλογίες των γονιδίων (time-point/time-0) were log(2) transformed and centered. Το 95% διάστημα εμπιστοσύνης από το μέσο όρο των λόγων log2, υπολογίστηκε για κάθε ένα από τα παραπάνω χρονικά διαστήματα για να

60 59 αποφασιστεί η ουδός πάνω και κάτω από την οποία, τα αποτελέσματα θα θεωρούνται στατιστικώς σημαντικά, τόσο σε επίπεδο αυξημένης όσο και μειωμένης γονιδιακής έκφρασης αντίστοιχα. Οι λόγοι αυτοί αναλύθηκαν επίσης μέσω ANOVA, με σκοπό την ανίχνευση στατιστικά σημαντικών αλλαγών ανάμεσα στα τρία διαφορετικά χρονικά διαστήματα, λαμβάνοντας υπόψιν την επαναληψιμότητα του κάθε δείγματος, εφόσον για κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν 3 αντίγραφα. Τα γονίδια των οποίων ο λόγος βρισκόταν πάνω ή κάτω από την προαναφερθείσα ουδό και το υπολογισμένο από το ANOVA p-value ήταν μικρότερο από 0,05 θεωρήθηκαν ρυθμιζόμενα. Όλοι οι υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν μέσω της χρήσης του προγράμματος R. Ο αλγόριθμος Gene-Set Enrichment Analysis, με False-Discovery-Rate (FDR) correction, εφαρμόστηκε στο Gene-Ontology Biological-Process sets, μέσω του Ariadne Genomics Pathway Studio v 9.0, με σκοπό την ανίχνευση των λειτουργικών αυτών ομάδων (γονιδίων), που δεν επηρεάζονται με τυχαίο τρόπο από την προαναφερθείσα επαγωγή (Galanos et al., 2016).

61 60 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

62 Οι σημειακές νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις (SNSs) μειώνονται χαρακτηριστικά στα p21 WAF1/Cip1 «escaped» κύτταρα. Η επαγωγή της έκφρασης της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 πραγματοποιήθηκε σε Tet-ON κυτταρικά συστήματα, Saos2 p21-tet-on και MDAH 041 p21-tet-on, έπειτα από προσθήκη του αντιβιοτικού doxocyclin (dox). Η επαγόμενη κυτταρική σειρά Tet-ON p21 WAF1/Cip1 Saos2 (Saos2- p21) αναπαριστά το καρκινικό στάδιο ενώ η επαγόμενη κυτταρική σειρά Tet-ON p21 WAF1/Cip1 MDAH-041 (Li- Fraumeni (LiFr)- p21) το προ-καρκινικό στάδιο. Η Saos2 καρκινική κυτταρική σειρά αποτελείται από κύτταρα οστεοσαρκώματος που δε διαθέτουν την πρωτεΐνη p53. Οι ινοβλάστες της LiFr κυτταρικής σειράς προέρχονται από ασθενείς με σύνδρομο Li- Fraumeni, δε διαθέτουν την πρωτεΐνη p53 και θεωρούνται «σχεδόν-φυσιολογικά» κύτταρα καθώς αν αποκατασταθεί η λειτουργία της πρωτεΐνης p53 συμπεριφέρονται ως κανονικά, υποδεικνύοντας ότι όλα τα καταβολικά μονοπάτια της πρωτεΐνης αυτής είναι λειτουργικά (Agarwal ML et al. 1995/ GalanosP. et al. 2016). Η ανάλυση του γονιδιώματος των «escaped» κυττάρων προερχόμενα και από τις δύο κυτταρικές σειρές (LiFr-p21, Saos2-p21), αποκάλυψε ένα μειωμένο φορτίο σε σημειακές νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις, σε σύγκριση με τα κύτταρα στα οποία δεν είχε πραγματοποιηθεί επαγωγή της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 («OFF» κύτταραεικόνα 1). Το αποτέλεσμα αυτό παρατηρήθηκε και στις δύο επαγόμενες κυτταρικές σειρές, LiFr- p21 και Saos2-p21, σε τρία ανεξάρτητα χρονικά, βιολογικά πειράματα. Δεδομένου ότι η παρατεταμένη έκφραση της p21 WAF1/Cip1 οδηγεί σε γενωμική αστάθεια ο μειωμένος αριθμός των υποκαταστάσεων αυτών στα «escaped» κύτταρα, κατέστη μη αναμενόμενος. Βέβαια, αν και οι υποκαταστάσεις αυτές αποτελούν αλλοιώσεις στο γονιδίωμα των παραπάνω κυττάρων, η δημιουργία τους καθίσταται μια πιθανή διέξοδος για το κύτταρο, καταστέλλοντας την εκτεταμένη δημιουργία δίκλωνων ρήξεων, λόγω παραμονής στο γενετικό υλικό βλαβών που μπορούν να προκαλέσουν σε μεγάλη κλίμακα φαινόμενα αντιγραφικής πίεσης. Η διέξοδος αυτή διαμεσολαβείται από το μηχανισμό TLS, καθιστώντας τον μια πολύ σημαντική πηγή νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων. Επομένως, τα μειωμένα επίπεδα των υποκαταστάσεων αυτών στα «escaped» κύτταρα θα μπορούσαν να είναι αποτέλεσμα αλλοιώσεων στο προαναφερθέν μονοπάτι ανοχής στις βλάβες του DNA.

63 62 Εικόνα 1. Μείωση του αριθμό των συνολικών σημειακών νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων. Τα ραβδογράμματα απεικονίζουν τη μείωση αυτή, η οποία είναι κοινή και στις δύο επαγόμενες κυτταρικές σειρές, όσον αφορά τα escaped κύτταρα που προκύπτουν από την κάθε μια. 3.2 Καταστολή του TLS μονοπατιού σε συνδυασμό με μειωμένη δραστηριότητα των επιδιορθωτικών μηχανισμών εκτομής βάσεων και νουκλεοτιδίων (NER, BER), συνεισφέρουν στη μείωση των SNSs, ενισχύοντας φαινόμενα αντιγραφικής πίεσης και εκτεταμένων δικλωνικών θραύσεων στο DNA. Έπειτα από την επαγωγή της έκφρασης της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 για χρονικό διάστημα 96h για τα Saos2-p21 και 72h για τα LiFr-p21, πραγματοποιήθηκε ολική απομόνωση πρωτεϊνών, ανάλυση με ανοσοστύπωμα κατά Western (Western Blot analysis) και εξέταση των επιπέδων μόνο-ουβικιτινιλίωσης του PCNA. Η μόνοουβικιτινιλίωση αυτή, πραγματοποιείται όπως αναφέρθηκε και στην εισαγωγή στο αμινοξικό κατάλοιπο λυσίνης στη θέση 164 του προαναφερθέντος ολισθητήρα. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης, υπέδειξαν μια σαφή μείωση της μεταμεταφραστικής τροποποίησης του PCNA παρουσία αυξημένων επιπέδων p21 WAF1/Cip1, τόσο στα Saos2-p21, όσο και στα LiFr-p21. Τα αποτελέσματα

64 63 καταδεικνύουν την καθοδηγούμενη από την πρωτεΐνη p21 WAF1/Cip1 αλλοίωση της μετα-μεταφραστικής τροποποίησης του προαναφερθέντος αντιγραφικού ολισθητήρα (εικόνα 2). Η μετα-μεταφραστική τροποποίηση του PCNA αποτελεί έναν κρίσιμο παράγοντα για την πυροδότηση της διαδικασίας TLS. Πιο συγκεκριμένα, μετά την πραγματοποίησή της γίνεται η πρώτη εναλλαγή μεταξύ αντιγραφικών πολυμερασών και TLS πολυμερασών της Υ πρωτεϊνικής οικογένειας, με κύρια πολυμεράση την πολυμεράση η (polymerase eta- polη), όπως αναφέρθηκε και στην εισαγωγή. Αποτελέσματα προερχόμενα από μικρής κλίμακας βιοχημική κλασμάτωση υπέδειξαν τη μείωση της επιστράτευσης και πρόσδεσης της πολυμεράσης η στη χρωματίνη, υπό συνθήκες υπερέκφρασης της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 (εικόνα 2). Από τα παραπάνω αποτελέσματα εξάγεται το συμπέρασμα, ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1, απουσία της πρωτεΐνης p53, καταστέλλει το βασικότερο μονοπάτι ανοχής του κυττάρου στις βλάβες του γενετικού του υλικού, κάτι το οποίο εξηγεί εν μέρει τις μειωμένες σημειακές υποκαταστάσεις-μεταλλάξεις που εμφανίζονται στα «escaped» κύτταρα. Όπως χαρακτηριστικά αναφέρθηκε και στην εισαγωγή, ο μηχανισμός TLS αποτελεί μια πηγή εκτεταμένων σημειακών μεταλλάξεων στα καρκινικά κύτταρα, στα οποία εμφανίζεται ιδιαίτερα αυξημένος. Εικόνα 2.Αλλοιώσεις του TLS μηχανισμού, έπειτα από την έκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1. Α)Πτώση των επιπέδων της μόνο-ουβικιτινιλίωσης του PCNA στα δύο επαγόμενα κυτταρικά συστήματα, μετά την επαγωγή της πρωτεΐνης p21. B) Μείωση των επιπέδων φόρτωσης της πολυμεράσης η στη χρωματίνη μετά από έκφραση της πρωτεΐνης p21.

65 64 Με τον τρόπο αυτό, βλάβες του γενετικού υλικού δε μπορούν να παρακαμφθούν, λόγω μειωμένης δραστηριότητας του επιρρεπή σε λάθη αλλά κατά τα άλλα προστατευτικού για το κύτταρο μηχανισμού TLS. Το γεγονός της συσσώρευσης και της παραμονής σφαλμάτων στο DNA επιβαρύνεται ακόμα περισσότερο από τη μειωμένη δραστηριότητα των επιδιορθωτικών μηχανισμών εκτομής/απομάκρυνσης νουκλεοτιδίων, που φέρουν διάφορες χημικές αλλοιώσεις. Δεδομένου ότι τα επαγόμενα κυτταρικά συστήματα, Saos2-p21 και LiFr-p21 δεν εκτίθενται σε εξωγενείς γενοτοξικούς παράγοντες (υπεριώδης ακτινοβολία, ακτίνες Χ κ.ο.κ.) μια κύρια ενδογενή πηγή τέτοιων αλλοιώσεων αποτελούν τα ανεβασμένα επίπεδα παραγωγής ενεργών ριζών οξυγόνου (ROS). Μια χαρακτηριστική αλλοίωση που προκύπτει από τα ανεβασμένα επίπεδα ROS καθίσταται η οξείδωση αζωτούχων βάσεων και πιο συγκεκριμένα της γουανίνης, που οδηγεί στη παραγωγή 8oxo-G. Η ποσοτικοποίηση των ROS πραγματοποιήθηκε τόσο στα Saos2-p21 όσο και στα LiFr-p21 επαγώγιμα κυτταρικά συστήματα. Η μέτρηση πραγματοποιήθηκε έπειτα από επαγωγή της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 για χρονικά διαστήματα 6 ωρών, 24 ωρών, 48 ωρών και 72 ωρών. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης αυτής υπέδειξαν μια σταδιακή και ταυτόχρονα σημαντική αύξηση των επιπέδων ROS, μετά την έκφραση της παραπάνω πρωτεΐνης και στις δύο κυτταρικές σειρές, με τη συγκέντρωσή τους να είναι ιδιαίτερα υψηλή κατά το χρονικό διάστημα των 72ωρών (εικόνα 3).

66 65 Εικόνα 3.Επίπεδα ενεργών ριζών οξυγόνου τόσο στα Saos-p21 (S-/S+) όσο και στα LiFr-p21 (LF-/LF+). Τα σύμβολα + και υποδηλώνουν την παρουσία και την απουσία dox (1μg/mL), αντίστοιχα για τα παραπάνω χρονικά διαστήματα. Επιπρόσθετα, ομικές αναλύσεις σε επίπεδο μεταγράφων, οι οποίες διεξήχθησαν στην επαγόμενη κυτταρική σειρά Saos2-p21 στα χρονικά διαστήματα 0 και 96 ωρών, υπέδειξαν μειωμένα επίπεδα έκφρασης καθοριστικών παραγόντων που λαμβάνουν μέρος στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης εκτομής νουκλεοτιδίων και βάσεων (ΝER και ΒER αντιστοίχως). Πιο συγκεκριμένα, όσον αφορά το μηχανισμό εκτομής βάσεων, ο οποίος ειδικεύεται κατά κύριο λόγο στην απομάκρυνση χημικών αλλοιώσεων των αζωτούχων βάσεων με χαρακτηριστικότερη αυτή της οξείδωσης της γουανίνης, τα επίπεδα των μεταγράφων κύριων γλυκοζυλασών, όπως της OGG1 (αναγνώριση 8-oxoG) και της TDG (αναγνώριση γλυκοζυλιομένης θυμίνης), βρέθηκαν ιδιαίτερα μειωμένα. Σημαντικά επίσης μόρια «κλειδιά» του μονοπατιού επιδιόρθωσης εκτομής νουκλεοτιδίων εμφάνισαν μειωμένα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης (εικόνα 4).

67 66 Εικόνα 4. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης γονιδίων, τα οποία κωδικοποιούν παράγοντες κλειδιά, όσον αφορά τους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς εκτομής αζωτούχων βάσεων (BER) και νουκλεοτιδίων (NER). Η δραστηριότητα του επιδιορθωτικού μηχανισμού εκτομής νουκλεοτιδίων, εξετάσθηκε περαιτέρω μέσω της ικανότητας των κυττάρων, τόσο των Saos2-p21 όσο και των LiFr-p21, να απομακρύνουν αποτελεσματικά βλάβες του DNA, οι οποίες προκαλούνται από το χημειοθεραπευτικό παράγοντα melphalan. Πιο συγκεκριμένα, μετά από έκθεση των κυττάρων στον παράγοντα αυτό και επακόλουθη καλλιέργειά τους, για χρονικά διαστήματα 0, 24 και 48 ωρών, αποσαφηνίστηκε η ικανότητα επιδιόρθωσης των βλαβών στο γονίδιο Ν-Ras. Mε τον τρόπο αυτό εξετάσθηκε τόσο η αποτελεσματικότητα του GG-NER όσο και η αποτελεσματικότητα του TC-NER μηχανισμού επιδιόρθωσης. Η βιοχημική αυτή ανάλυση πραγματοποιήθηκε στις δύο παραπάνω κυτταρικές σειρές σε τρεις επιμέρους καταστάσεις. Όσον αφορά τα Saos2- p21 κύτταρα πραγματοποιήθηκε τόσο στα κύτταρα στα οποία δεν είχε επαχθεί η έκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 όσο και σε αυτά που η έκφραση της πρωτεΐνης αυτής είχε επαχθεί για χρονικό διάστημα 96 ωρών καθώς και στα «escaped» κύτταρα. Αντίστοιχα, όσον αφορά τα LiFr-p21, η βιοχημική αυτή ανάλυση πραγματοποιήθηκε τόσο στα κύτταρα στα οποία δεν είχε επαχθεί η έκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 όσο και σε αυτά που η έκφραση της πρωτεΐνης αυτής είχε επαχθεί για χρονικό διάστημα 72 ωρών καθώς και στα «escaped» κύτταρα. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν το κατασταλτικό ρόλο της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1, όσον αφορά την επιδιορθωτική δραστηριότητα του μηχανισμού εκτομής νουκλεοτιδίων. Η αποτελεσματικότητα του μηχανισμού αυτού και ως επακόλουθο η ικανότητα απομάκρυνσης της πλειοψηφίας των δημιουργούμενων από τη melphalan αλλοιώσεων του DNA, επανήλθε στα «escaped» κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα η αποτελεσματικότητα της απομάκρυνσης των αλλοιώσεων αυτών κατέστη αντίστοιχη της αποτελεσματικότητας των κυττάρων τα οποία δε χαρακτηρίζονταν από τη παρουσία της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 (εικόνα 5).

68 67 Εικόνα 5. Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης εκτομήςνουκλεοτιδίων επηρεάζεται από την έκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1. Η διαγραμματική απεικόνιση (Α), (C), αναπαριστά την επάρκεια του μηχανισμού επιδιόρθωσης αυτού στις δύο επαγόμενες κυτταρικές σειρές σε τρεις επιμέρους καταστάσεις OFF, ON 96h (72h για τα LiFr-p21) για χρονικά διαστήματα 0h, 24h και 48h μετά από πεντάλεπτη επώαση με το χημειοθεραπευτικό παράγοντα melphalan. (B),(D) Η ανάλυση με το παράγοντα melphalan πραγματοποιήθηκε στα χρονικά διαστήματα που αναφέρθηκαν παραπάνω. Η περίπτωση 0/0 περιλαμβάνει τα κύτταρα στα οποία δεν υπήρχε επίδραση με τον παράγοντα αυτό. Απεικονίζονται παραπάνω τα αποτελέσματα της αυτοραδιογραφίας, τα οποία προέρχονται έπειτα από στύπωμα κατά Southern. Οι ραδιενεργά σεσημασμένοι ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν στόχευαν τμήμα του γονιδίου N-RAS. Ως δείκτης ισοφόρτωσης (IS: InternalStandard) χρησιμοποιήθηκε μια αλληλουχία 100bp του ίδιου γονιδίου.

69 68 Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα, η αύξηση των επιπέδων ROS σε συνδυασμό με αλλοιώσεις της λειτουργικότητας των μηχανισμών εκτομής νουκλεοτιδίων (NER) και αζωτούχων βάσεων (BER), αυξάνει το φορτίο των βλαβών που προκαλούνται από εκτεταμένη οξείδωση του DNA οι οποίες δεν απομακρύνονται αποτελεσματικά και εγκαίρως. Τα παραπάνω σε συνδυασμό με την επαγόμενη από την πρωτεΐνη p21 WAF1/Cip1 αναποτελεσματικότητα του μηχανισμού TLS, ενισχύει το φαινόμενο της αντιγραφικής πίεσης, οδηγώντας σε εκτεταμένες δίκλωνες ρήξεις (Galanos et al., 2016). 3.3 Η παρατεταμένη έκφραση του p21 ενισχύει τους εξαρτώμενους από την πρωτεΐνη RAD52 μηχανισμούς επιδιόρθωσης των δίκλωνων ρήξεων BIR και SSA. Οι εξελίξεις σε επίπεδο αλληλούχισης του γενετικού υλικού έχουν επιφέρει επανάσταση στο κομμάτι της αποκρυπτογράφησης των σωματικών μεταλλάξεων που φέρουν τα καρκινικά κύτταρα, οποιουδήποτε καρκινικού τύπου. Η ολοκλήρωση της αποκρυπτογράφισης αυτής ορίζεται ως μεταλλαξογόνος υπογραφή, «Mutational Signature». Οι μοριακές αυτές υπογραφές αποτελούν το αποτύπωμα πάνω στο DNA των κυττάρων, όχι μόνο του συνόλου των ενδογενών ή εξωγενών παραγόντων με τους οποίους έχουν έρθει σε επαφή, αλλά και των διαθέσιμων επιδιορθωτικών μηχανισμών οι οποίοι έχουν πυροδοτηθεί ως απόκριση στις βλάβες αυτές. Πρόσφατα αποσαφηνίστηκαν 21 υπογραφές (Alexandrov et al., 2014), οι οποίες καθορίζονται από το σύνολο των νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων, το είδος, καθώς και από τα εκατέρωθεν, 5 και 3 νουκλεοτίδια. Η διαδικασία της αποκρυπτογράφησης αυτής πραγματοποιήθηκε επίσης στις δύο επαγόμενες κυτταρικές σειρές Saos2-p21 και LiFr-p21, τόσο σε κύτταρα στα οποία δεν είχε πραγματοποιηθεί η επαγωγή της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 όσο και στα escaped κύτταρα κάθε σειράς. Τα αποτελέσματα της βιοπληροφορικής ανάλυσης τόσο στην καρκινική όσο και στην προκαρκινική σειρά ανέδειξαν μεταλλαξογόνες υπογραφές, σχεδόν πανομοιότυπες, υποδεικνύοντας το ρόλο καθοδηγητή της προαναφερθείσας πρωτεΐνης σχετικά με αυτές. Συγκρίνοντας τις υπογραφές αυτές με τις προαναφερθείσες 21 βρέθηκαν αρκετές επικαλύψεις ως προς τις υποκαταστάσεις

70 69 που αυτές ακολουθούσαν. Άλλωστε, μια και μόνο υπογραφή δε μπορεί να χαρακτηρίσει ένα καρκινικό τύπο. Πιο συγκεκριμένα, οι υπογραφές σχετικά με τις δύο επαγόμενες κυτταρικές σειρές Saos2-p21 και LiFr-p21, υπέδειξαν την παρουσία της έκτης υπογραφής (Signature 6) στα escaped κύτταρα. Η υπογραφή 6 χαρακτηρίζεται από τη μετάπτωση C>T, με τις υποκαταστάσεις αυτές να εμφανίζονται σε τρινουκλεοτίδια NpCpC και να σχετίζονται άμεσα με την απενεργοποίηση του μηχανισμού επιδιόρθωσης αταίριαστων νουκλεοτιδίων (MMR) (Alexandrov et al. 2014), για τον οποίο δεν είχαμε δεδομένα από την προαναφερθείσα μεταγραφομική ανάλυση (εικόνα 6). Μια πιθανή εξήγηση αυτού δύναται να αποτελεί είτε το γεγονός ότι η υπογραφή 6 αποτελεί κομμάτι ενός πιο πολύπλοκου αποτυπώματος χαρακτηριζόμενο από πολλαπλές αλλοιώσεις σε μη επιρρεπή σε λάθη επιδιορθωτικών μηχανισμών, είτε το γεγονός ότι υπάρχει μια αρνητική ρύθμιση του επιδιορθωτικού αυτού μηχανισμού, του οποίου τα μόρια κλειδιά δρουν μέσω αλληλεπιδράσεων με τον αντιγραφικό ολισθητήρα PCNA. Οι παραπάνω υπογραφές εμφάνισαν επίσης πολλά κοινά χαρακτηριστικά με την υπογραφή 15 (μεταπτώσεις C>T στα τρινουκλεοτίδια GpCpN), της οποίας η πηγή προέλευσης είναι άγνωστη (εικόνα 6). Η ομική ανάλυση του μεταγραφώματος, η οποία αναφέρθηκε παραπάνω σε επίπεδο Saos2-p21 κυττάρων, υπέδειξε μειωμένα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης του γονιδίου BRCA1 στις 96h, ενώ ταυτόχρονα και στις δύο κυτταρικές σειρές δεδομένα προερχόμενα από την αλληλούχιση εκατέρωθεν των δημιουργούμενων δίκλωνων ρήξεων (breakpointsequencing), υπέδειξαν εκτεταμένες μικρο-ομολογίες. Παράλληλα ανιχνεύθηκαν σημειακές μεταλλάξεις στα γονίδια που ευθύνονται για την κωδικοποίηση των πρωτεϊνών BRCA1 και BRCA2. Τα δεδομένα αυτά υποδηλώνουν την παρουσία της υπογραφής 3, που σχετίζεται με την απενεργοποίηση των προαναφερθέντων πρωτεϊνών και ακολούθως του μηχανισμού επιδιόρθωσης μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού που στηρίζεται σε αυτές, χαρακτηριζόμενη από μικροομολογίες ως και 50bp εκατέρωθεν των σημείων ρήξεων. Παρόλα αυτά οι υπογραφές των δύο επαγόμενων κυτταρικών σειρών Saos2-p21 και LiFr-p21 δε διαθέτουν πολλά κοινά χαρακτηριστικά με την υπογραφή 3.

71 70 Εικόνα 6. Α) Ηeatmap που απεικονίζει τις νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις στα escaped κύτταρα. Στον κάθετο άξονα τοποθετούνται τα νουκλεοτιδικά κατάλοιπα που βρίσκονται στο 5 άκρο της υποκατάστασης, ενώ στον οριζόντιο άξονα τα νουκλεοτιδικά κατάλοιπα που βρίσκονται στο 3 άκρο της υποκατάστασης. Β) Heatmap που απεικονίζει τη συχνότητα των νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων, προσθήκες και απαλοιφές στα σημεία των ρήξεων (+/- 5 kb γύρω από τη ρήξη), σε καθένα από τα επαγόμενα κυτταρικά συστήματα (Saos2-p21, LiFr-p21). C) Η μεταλλαξογόνος υπογραφή (mutational signature) των p21 WAF1/Cip1 escaped κυττάρων, που αποτελεί ένα υβρίδιο των υπογραφών 15 και 6 σύμφωνα με τους Alexandrov et al. D) Αντιπροσωπευτικές ρήξεις στα χρωμοσώματα των Saos2 και LiFr escaped κύτταρα. Απεικονίζεται η κατανομή των διάφορων αλλοιώσεων όπως των υποκαταστάσεων (συγκεντρωμένων σε ομάδες), των προσθέσεων και των απαλοιφών. Τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης και οι αλλοιώσεις των BRCA1 και BRCA2, σε συνδυασμό με τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης στα escaped κύτταρα της πρωτεΐνης RAD51 (Galanos P. et al. 2016), ανοίγουν το δρόμο για ένα RAD52 εξαρτώμενο μηχανισμό επιδιόρθωσης των δημιουργούμενων ρήξεων. Το γεγονός αυτό ενισχύθηκε από την παρουσία ανεβασμένων επιπέδων της πρωτεΐνης RAD52. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικών πρωτεϊνών από τις δύο παραπάνω κυτταρικές σειρές, Saos2-p21 και LiFr-p21, πριν την έκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 καθώς και μετά από επαγωγή της έκφρασής της για 96 ώρες, όσον αφορά τα Saos2-p21 και

72 71 για 72ώρες όσον αφορά τα LiFr-p21. Εν συνεχεία, ακολούθησε ανάλυση του ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος με στύπωμα κατά Western. Τα αποτελέσματα αυτά υπέδειξαν την αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης RAD52 αποκλειστικά υποκινούμενη από την επαγωγή της έκφρασης του παραπάνω μορίου (εικόνα 7). Εικόνα 7. Αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης RAD52 στα δύο επαγόμενα κυτταρικά συστήματα, μετά από την επαγωγή της πρωτεΐνης p21. Η υπόθεση της RAD52 διαμεσολαβούμενης επιδιόρθωσης των ρήξεων, η οποία εξήχθη από τα παραπάνω αποτελέσματα, ενισχύθηκε ακόμα περισσότερο από την ανάλυση της κατανομής των νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων στα χρωμοσώματα των escaped κυττάρων κάθε μίας από τις επαγόμενες κυτταρικές σειρές. Αν και ο αριθμός των υποκαταστάσεων αυτών στα escaped κύτταρα ήταν μειωμένος, σε σχέση με τα αντίστοιχα κύτταρα, στα οποία δεν είχε επαχθεί η έκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1, οι ίδιες βρέθηκαν να είναι κατανεμημένες σε ομάδες κοντά στα σημεία των ρήξεων (εικόνα 7D). Το πρότυπο της κατανομής αυτό χαρακτηρίζεται ως καταιγίδα ( kataegis ) και για τη δημιουργία του απαιτούνται εκτεταμένα μονόκλωνα άκρα που θα δράσουν ως υπόστρωμα για επαναλαμβανόμενες απαμινώσεις των βάσεων C. Η διαδικασία των απαμινώσεων αυτών πραγματοποιείται από τα ένζυμα που ανήκουν στην οικογένεια πρωτεϊνών APOBEC που προκαλούν μια σειρά μεταπτώσεων C>T και μεταστροφών C>G. Η δημιουργία εκτεταμένων μονόκλωνων τμημάτων DNA είναι αποτέλεσμα του επαγόμενου από ρήξη μηχανισμού (BIR), που όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή αποτελεί έναν μηχανισμό επιδιόρθωσης που επιστρατεύεται σε περιπτώσεις εκτεταμένης αντιγραφικής πίεσης. Ο μηχανισμός αυτός είναι εξαρτώμενος από την πρωτεΐνη RAD52, κάτι το οποίο έχει αποδειχθεί κατά κύριο λόγο στη ζύμη. Παρόλα

73 72 αυτά, το γεγονός ότι δεν υπάρχουν σε όλα τα σημεία των ρήξεων οι χαρακτηριστικές ομαδοποιήσεις των προαναφερθέντων υποκαταστάσεων υποδήλωσε τη συμμετοχή ενός επιπρόσθετου εξαρτώμενου από την πρωτεΐνη RAD52 επιδιορθωτικού μηχανισμού. Με την παρουσία στα σημεία των ρήξεων μικροομολογιών, προσθέσεων και απαλοιφών θεωρήθηκε πιθανή η συμμετοχή του μηχανισμού επιδιόρθωσης υβριδοποίησης μονόκλωνων αλυσίδων (SSA). Για την εξέταση της παραπάνω υπόθεσης σχετικά με την εξαρτώμενη από την πρωτεΐνη p21 μεταβολή των ισορροπιών που διέπουν τα μονοπάτια επιδιόρθωσης του HDR μηχανισμού, πραγματοποιήθηκε η in vivo παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας κάθε μονοπατιού, με τη χρήση συγκεκριμένων πλασμιδίων παρακολούθησης επιδιορθωτικών μηχανισμών. Η ανάλυση αυτή αρχικά πραγματοποιήθηκε στη Saos2-p21 κυτταρική σειρά. Τα πλασμίδια επιδιόρθωσης ήταν χορηγία του Dr. Halazonetis T., ενώ έχουν τοποθετηθεί επιπλέον στην Addgene. Τρία χαρακτηριστικά πλασμίδια επιδιόρθωσης κλωνοποιήθηκαν, με σκοπό το μετέπειτα καθαρισμό τους και την ενσωμάτωσή τους στο γονιδίωμα των κυττάρων Saos-p21. Κάθε πλασμίδιο χρησιμοποιήθηκε για την αποσαφήνιση της επάρκειας πυροδότησης των μηχανισμών επιδιόρθωσης όπως της υβριδοποίησης μονόκλωνων άκρων (SA-GFP), της αντιγραφής υποκινούμενης από ρήξη (BIR-GFP) και της σύνθεσης εξαρτώμενης από την υβριδοποίηση των αλυσίδων DNA (DR-GFP). Δεκτικά βακτήρια DH5α μετασχηματίστηκαν με τα παραπάνω πλασμίδια και επιλέχθηκαν αποικίες, από τις οποίες πραγματοποιήθηκε απομόνωση του πλασμιδιακού DNA με χρήση minipreps. Οι πλασμιδιακοί φορείς στη συνέχεια επωάστηκαν με συγκεκριμένα ένζυμα περιορισμού και τα τελικά προϊόντα της πέψης ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. Παρόμοια διαδικασία κλωνοποίησης και πιστοποίησης μέσω προτύπου πέψης από συγκεκριμένα ένζυμα περιορισμού πραγματοποιήθηκε και σε πλασμίδιο, το οποίο έφερε το σπάνιο ένζυμο περιορισμού HA-Isce1 (χορηγία της Dr. Soutoglou E.). Με στόχο να αποσαφηνιστούν οι αλλαγές στις ισορροπίες που διέπουν τους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς, που στοχεύουν στην επιδιόρθωση των δίκλωνων ρήξεων έπειτα από την έκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1, αναπτύχθηκαν τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές Saos2-p21, εκ των οποίων η κάθε μια έφερε ένα χαρακτηριστικό πλασμίδιο αναφοράς. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των κυττάρων αυτών με καθένα από τα πλασμίδια pbir-gfp, phprt-

74 73 SA-GFP και pdr-gfp, και επιλογή κλώνων, οι οποίοι είχαν ενσωματώσει τα πλασμίδια αυτά. Οι πλασμιδιακοί αυτοί φορείς, όπως χαρακτηριστικά απεικονίζεται και στην εικόνα 7, περιέχουν την αλληλουχία της πρωτεΐνης GFP που διακόπτεται από μια (μοναδική) θέση αναγνώρισης από το ένζυμο περιορισμού Isce1. Πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια παροδική διαμόλυνση των κυττάρων με το ένζυμο αυτό και τα ίδια παρέμειναν στην καλλιέργεια για χρονικό διάστημα 48 ωρών. Το χρονικό διάστημα αυτό έχει θεωρηθεί αρκετό για την επακόλουθη επιδιόρθωση της δίκλωνης θραύσης που θα πραγματοποιηθεί από το ένζυμο περιορισμού Isce1. Αν η επιδιόρθωση πραγματοποιηθεί επιτυχώς στη στοχευμένη ρήξη του γονιδιώματος των Saos-p21 (στα σημεία του γονιδιώματος που φέρουν το εκάστοτε πλασμίδιο, άρα και την αλληλουχία που αναγνωρίζει το προαναφερθέν ένζυμο περιορισμού), η αλληλουχία του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη GFP αποκαθίσταται και το αναμενόμενο πρωτεϊνικό μόριο κωδικοποιείται. Με τον τρόπο αυτό καθίσταται δυνατή, in vivo, η αποσαφήνιση της επάρκειας της πυροδότησης των μηχανισμών επιδιόρθωσης της υβριδοποίησης μονόκλωνων άκρων (SA-GFP), της αντιγραφής υποκινούμενης από ρήξη (BIR-GFP) και της σύνθεσης εξαρτώμενης από την υβριδοποίηση των αλυσίδων DNA (DR-GFP). Η αποσαφήνιση αυτή πραγματοποιείται μέσω ποσοτικοποίησης του σήματος που λαμβάνεται από την κωδικοποιούσα πρωτεΐνη GFP, μέσω κυτταρομετρίας ροής. Πιο συγκεκριμένα, η επιλογή των δημιουργούμενων κλώνων πραγματοποιήθηκε σε δύο επιμέρους βήματα. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η αρνητική επιλογή, κατά την οποία επιλέχθηκαν οι κλώνοι οι οποίοι ήταν αρνητικοί ως προς GFP, στην περίπτωση που δεν είχε προηγηθεί το βήμα της διαμόλυνσης τους με το πλασμίδιο που φέρει την αλληλουχία του ενζύμου περιορισμού Isce1 (HA-Isce1). Στη συνέχεια τα κύτταρα αυτά, πέρασαν στο στάδιο της δεύτερης- θετικής επιλογής, κατά το οποίο επιλέχθηκαν οι κλώνοι, που ήταν θετικοί ως προς το GFP σήμα, έπειτα από διαμόλυνση τους με το HA-Isce1 πλασμίδιο και επακόλουθη 48h επώαση τους. Οι κλώνοι που επιλέχθηκαν για να χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια της λειτουργικής αυτής ανάλυσης, ήταν ο κλώνος 11 από τα Saos2-p21 που έφεραν το πλασμίδιο pdr-gfp, ο κλώνος 12 από αυτά που έφεραν ενσωματωμένο το πλασμίδιο pbir-gfp, και ο κλώνος 2 από αυτά που έφεραν το πλασμίδιο phprt-sa-gfp ενσωματωμένο στο γονιδίωμά τους.

75 74 Τα τελικά αποτελέσματα της λειτουργικής αυτής μελέτης, υπέδειξαν σημαντικές αλλαγές στη συμμετοχή των παραπάνω επιδιορθωτικών μηχανισμών που ανήκουν στο μονοπάτι της επιδιόρθωσης εξαρτώμενης από την ομολογία (HDR) (εικόνα 7). Πιο συγκεκριμένα έπειτα από την επαγωγή της έκφρασης της p21 WAF1/Cip1, το σήμα προερχόμενο από τη πρωτείνη GFP, στα Saos2-p21, που έφεραν το πλασμίδιο DR-GFPυπέστη μια σημαντική ελάττωση, ενώ αντίθετα παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του αντίστοιχου σήματος στα Saos2-p21, που έφεραν τα πλασμίδια BIR-GFP και SA-GFP. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαίωσαν τις αρχικές παρατηρήσεις σχετικά με την ενισχυμένη πυροδότηση RAD52 εξαρτώμενων μηχανισμών επιδιόρθωσης, καθοδηγούμενο από την έκφραση της p21 WAF1/Cip1. Εικόνα 7. Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί εξαρτώμενοι από την ομολογία (HDR). Τα ραβδογράμματα απεικονίζουν τις μεταβολές στην πυροδότηση των επιμέρους επιδιορθωτικών μονοπατιών SDSA, SSA και BIR. Οι μεταβολές αυτές αντικατοπτρίζουν αλλαγές στο σήμα της κωδικοποιούσας πρωτεΐνης GFP και άρα στην αποτελεσματικότητα του εκάστοτε μηχανισμού επιδιόρθωσης.

76 75 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ

77 76 4. Συζήτηση Τα δεδομένα της συγκεκριμένης μελέτης αποκωδικοποιούν μηχανιστικά την ογκογόνο δράση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1, υπό συνθήκες απουσίας του ογκοκατασταλτικού παράγοντα p53 (Galanos P et al. 2016). Η γονιδιωματική αστάθεια αποτελεί ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων, απαραίτητο τόσο για τη δημιουργία τους όσο και για την εμφάνιση όλων των υπόλοιπων χαρακτηριστικών. Τα κύτταρα τα οποία δεν μπορούν να διατηρήσουν τη σταθερότητα του γονιδιώματός τους μέσω μιας συνεχούς διαδικασίας Δαρβίνειας επιλογής, είτε απορρίπτονται από τον οργανισμό είτε αναπτύσσουν συγκεκριμένα χαρακτηριστικά που τους δίνουν ένα παραπάνω προβάδισμα έναντι των υπολοίπων, με αποτέλεσμα τη δημιουργία γενετικών διαταραχών όπως ο καρκίνος. Σύμφωνα με τα ήδη υπάρχοντα δεδομένα η παρατεταμένη έκφραση της πρωτεΐνης p21 σε καρκινικά κύτταρα, υπό συνθήκες απουσίας του ογκοκατασταλτικού παράγοντα p53, δύναται να οδηγήσει, μέσω μιας συνεχούς διαδικασίας κυτταρικής επιλογής, στην δημιουργία πιο επιθετικών και ανθεκτικών σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες απογόνων ( escaped cells). Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης p21 συνοδευόμενη από την απενεργοποίηση της πρωτεΐνης p53, ενισχύει τη γονιδιωματική αστάθεια, μέσω της σταθεροποίησης των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής, Cdt1 και Cdc6. Η αύξηση των επιπέδων των αδειοδοτικών αυτών παραγόντων, πραγματοποιείται μέσω κορεσμού του συμπλόκλου CRL4-Cdt2 Ε3 λιγάσης, που επάγει τη πρωτεοσωμική τους αποικοδόμηση. Ως εκ τούτου τα κύτταρα χαρακτηρίζονται από υψηλά επίπεδα επανααντιγραφής, που αποτελεί μια μορφή αντιγραφικής πίεσης (replication stress). Τα φαινόμενα της αντιγραφικής πίεσης και της επαγόμενης από τη p21 αρνητικής ρύθμισης παραγόντων που συμμετάσχουν στη σταθεροποίηση των σταματημένων αντιγραφικών συσκευών (RAD51, BRCA1/2, BLM κ.α.), σε συνδυασμό με την εκτεταμένη δραστηριότητα της ενδονουκλεάσης MUS81-EME1, επιφέρουν αυξημένα επίπεδα δίκλωνων ρήξεων, οι οποίες εντοπίζονται στα πρώιμα στάδια της S φάσης του κυτταρικού κύκλου. Ταυτόχρονα η ανίχνευση μικρο-ομολογιών εκατέρωθεν των ρήξεων και παράλληλα η πτώση στα επίπεδα έκφρασης σημαντικών διαμεσολαβητών

78 77 της επιδιορθωτικής διαδικασίας του ομόλογου ανασυνδυασμού (RAD51, BRCA1, BRCA2 κ.α.), συνοδευόμενη από αύξηση των μεταλλάξεων στα γονίδια αυτά, ανέδειξε τη πιθανή μεσολάβηση της επιδιόρθωσης των ρήξεων αυτών από έναν επιρρεπή σε λάθη RAD52-εξαρτώμενο μηχανισμό. Η παρούσα μελέτη όχι μόνο ενίσχυσε τα ήδη υπάρχοντα αποτελέσματα περί ογκογόνου δράσης της πρωτεΐνη p21, αλλά και απέδειξε την παραπάνω υπόθεση περί RAD52-εξαρτώμενης επιδιόρθωσης των δημιουργούμενων δίκλωνων ρήξεων. Εκτός από την απορρύθμιση της συσκευής αδειοδότησης της αντιγραφής, υποδείχθηκε μια p21-εξαρτώμενη μείωση της δραστηριότητας των μηχανισμών επιδιόρθωσης εκτομής, χημικά αλλοιωμένων νουκλεοτιδίων και ως εκ τούτου μια ελάττωση της αποτελεσματικής απομάκρυνσής τους από το DNA του κυττάρου. Παράλληλα αποδείχθηκε η καταστολή του TLS μονοπατιού ανοχής στις βλάβες του DNA, η οποία προέρχεται από τις ισχυρές αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης p21 με τον αντιγραφικό ολισθητήρα PCNA, εμποδίζοντας τη πραγματοποίηση συγκεκριμένων μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων του, καθώς και αλληλεπιδράσεις του με τις TLS πολυμεράσες. Τα δύο αυτά αποτελέσματα αποδεικνύουν ένα συνεχώς αυξανόμενο φορτίο των κυττάρων σε βλάβες του γενετικού υλικού, προερχόμενες από ενδογενείς πηγές (ROS), ενώ ταυτόχρονα αποδεικνύουν τη μειωμένη ικανότητά τους να τις παρακάμψουν, ενισχύοντας ακόμα περισσότερο φαινόμενα αντιγραφικής πίεσης και συνακόλουθης δημιουργίας εκτεταμένων δίκλωνων ρήξεων. Οι εκτεταμένες δίκλωνες ρήξεις, επάγουν την άμεση απόκριση του κυττάρου (DDR). Ένα από τα μονοπάτια της απόκρισης αυτής διαμεσολαβείται από την πυροδότηση συγκεκριμένων επιδιορθωτικών μονοπατιών, που αποσκοπούν στην απομάκρυνση των κρίσιμων αυτών βλαβών. Δεδομένα προερχόμενα από την αλληλούχιση των γονιδιωμάτων των escaped κυττάρων των δύο επαγόμενων κυτταρικών σειρών, υπέδειξαν αρχικά τη συμμετοχή τόσο ενός μονοπατιού επιδιόρθωσης δικλωνικών ρήξεων στηριζόμενου στις μικρο-ομολογίες, όσο και στο μηχανισμό BIR. Τα αποτελέσματα αυτά σε συνδυασμό με τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης RAD52 και αντίστοιχα τα μειωμένα επίπεδα μεταγραφής των πρωτεϊνών RAD51, BRCA1 και BRCA2, υπέδειξαν το πρωταρχικό ρόλο της πρωτεΐνης RAD52 στην επιδιόρθωση των δικλωνικών θραύσεων. Οι in vivo λειτουργικές αναλύσεις, οι οποίες ακολούθησαν με τη χρήση πλασμιδίων παρακολούθησης επιδιορθωτικών μηχανισμών, αποτέλεσαν απόδειξη της αρχικής υπόθεσης. Πιο συγκεκριμένα η

79 78 πτώση των επιπέδων της επιδιόρθωσης των επαγόμενων δίκλωνων ρήξεων μέσω SDSA, συνοδευόμενη από την ταυτόχρονη αύξηση των επιπέδων επιδιόρθωσής τους μέσω BIR και SSA, πιστοποίησε ότι τα κύτταρα έπειτα από την υπερέκφραση της πρωτεΐνης p21 απουσία της p53, ακολουθούν ένα Rad52-εξαρτώμενο, επιρρεπές σε λάθη, επιδιορθωτικό μονοπάτι, για την απομάκρυνση των εκτεταμένων βλαβών του DNA. Ταυτόχρονα υποδεικνύεται το μόριο Rad52, ως ένας θεραπευτικός στόχος σε καρκινικούς τύπους με αλλοιώσεις στο μηχανισμό του ομόλογου ανασυνδυασμού, εξηγώντας παράλληλα τα υψηλά του επίπεδα σε πολλούς καρκινικούς τύπους. Εικόνα 8. Το προτεινόμενο μοντέλο που προκύπτει από τα παραπάνω αποτελέσματα, σχετικά με την ογκογόνο δράση της p21 WAF1/Cip1, υπό συνθήκες απουσίας λειτουργικής p53.