Μοριακή Bιολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 9 & 10

Transcript

1 Μοριακή Bιολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 9 & 10 ΩΡΙΜΑΝΣΗ ΤΟΥ RNA, ΙΝΤΡΟΝΙΑ/ΕΞΟΝΙΑ & ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ Χρήστος Παναγιωτίδης, Ph.D. Καθηγητής Κυτταρικής/Μοριακής Βιολογίας Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Τομέας Φαρμακογνωσίας/Φαρμακολογίας Τμήμα Φαρμακευτικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Θεσσαλονίκη

2 Tο βασικό δόγμα της μοριακής βιολογίας σε ευκαρυωτικά και προκαρυωτικά κύτταρα Eυκαρυώτες Προκαρυώτες κυτταρόπλασμα ιντρόνια πυρήνας εξόνια METAΓPAΦH πρωτείνη METAΦPAΣH πρωτογενές RNA μετάγραφο METAΓPAΦH 5 ΚΑΛΥΠΤΡΑ ΠΡΟΣΘΗΚΗΗ ΚΑΛΥΠΤΡΑΣ & ΠΟΛΎ-Α ΟΥΡΑΣ ΣYPPAΦH RNA ΕΞΟΔΟΣ METAΦPAΣH πρωτείνη

3 Πριν μεταφρασθούν, τα ευκαρυωτικά RNAs τροποποιούνται πολλαπλώς Προκαρυώτες Γονίδιο Eυκαρυώτες Γονίδιο Μεταγραφή Εξόνιο ιντρόνιο Μεταγραφή Πρωτεΐνη Μετάφραση πολυαδενυλίωση Μάτισμα Μεταφορά Μετάφραση Πρωτεΐνη

4 «Ωρίμανση» των ευκαρυωτικών RNAs Προκαρυωτικό mrna κωδική αλληλουχία μη-κωδική αλληλουχία πρωτεΐνη α πρωτεΐνη β πρωτεΐνη γ Ευκαρυωτικό mrna κωδική αλληλουχία μη-κωδική αλληλουχία πρωτεΐνη

5 Επίπεδα «ωρίμανσης» των mrnas 7-μεθυλογουανοσίνη DNA θέση πολυαδενυλίωσης μεταγραφή προmrna m 7 G m 7 G προσθήκη καλύπτρας στο 5 άκρο 3 πολυαδενυλίωση μάτισμα 5 άκρο του mrna mrna m 7 G

6 Η προσθήκη της καλύπτρας Α. Η χημική δομή της 5 καλύπτρας Β. σχηματισμός της 5 καλύπτρας

7 Η συρραφή (μάτισμα) των mrnas

8 Αλληλουχίες RNA καθορίζουν τα σημεία συρραφής

9 Ο μηχανισμός της συρραφής των mrna

10 Εναλλακτική συρραφή

11 Ωρίμανση των 3 -άκρων των mrnas Ανοδικές περιοχές Μεταγραφή καθοδικές περιοχές Ανοδικές περιοχές Ενδονουκλεολυτική θραύση καθοδικές περιοχές Ανοδικές περιοχές Πολυ-Α πολυμεράση Ανοδικές περιοχές

12 Αλληλουχίες RNA καθορίζουν την ωρίμανση των 3 -άκρων τωνmrnas

13 Η «ωρίμανση» των trnas

14 Η «ωρίμανση» των rrnas

15 Η αποικοδόμηση των mrna

16 Η ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΡΥΜΙΖΕΤΑΙ ΚΑΙ ΑΠΟ ΜΙΚΡΑ, ΜΗ ΚΩΔΙΚΑ RNAs

17 Τα μικρο-rnas (mirnas) ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση Τα μικροrnas (mirnas) είναι μικρά μη-κωδικά RNA που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση κυρίως στο επίπεδο τηςμετάφρασης. αγγελιοφόρο RNA 5 καλύπτρα Αναστολή μετάφρασης RISC = RNA-induced Silencing Complex (RNA-επαγόμενο σύμπλοκο αποσιώπισης)

18 Τα πρώτα mirna ανακαλύφθηκαν στο C. elegans Οι μεταλλάξεις lin-14(lf) προκαλούν ανώμαλα γρήγορη ανάπτυξη Οι μεταλλάξεις lin-14(gf) και lin-4 προκαλούν καθυστέρηση στην ανάπτυξη Φυσιολογικό: embryo L1 L2 L3 L4 adult Πρόωρη ανάπτυξη: embryo L2 L3 L4 adult Καθυστέρηση: embryo L1 L1 L2 L3..

19 Το LIN-14 ρυθμίζεται από το lin-4 μεταλλάξεις στις κωδικές αλληλουχίες του lin > απώλεια λειτουργικότητας μεταλλάξεις στο 3 UTR του lin > αύξηση λειτουργικότητας Πως σχετίζονται τα παραπάνω με το lin-4; Το lin-4 δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνη, μόνο RNA Τα ποσά του lin-4 RNA αυξάνονται κατά την ανάπτυξη της λάρβας Το RNA του LIN-14 είναι συνέχεια παρόν, αλλά τα επίπεδα της πρωτεΐνης ελαττώνονται κατά την ανάπτυξη της λάρβας Η παρουσία του lin-4 είναι απαραίτητη για να ελαττωθούν τα επίπεδα της LIN-14 πρωτεΐνης Το lin-4 RNA μπορεί να υβριδισθεί με το 14 3 UTR του lin-14

20 Έλεγχος του μοντέλου δράσης των mirna με χρήση υβριδικών γονιδίων αναφοράς lacz::lin-14 3 UTR lacz lin-14 3 UTR Η έκφραση της γαλακτοσιδάσης (LacZ) ελαττώνεται κατά την ανάπτυξη της λάρβας. Το γονίδιο lin-4 είναι απαραίτητο για να λάβει χώρα η παραπάνω ελάττωση της LacZ. Ελάττωση των επιπέδων του Dicer ή των συστατικών του συμπλόκου Risc επίσης προκαλεί τον lin-4 φαινότυπο, δηλαδή η παρουσία τους είναι απαραίτητη για την ελάττωση των επιπέδων της LacZ.

21 Αρχικό μοντέλο της δημιουργίας και του τρόπου δράσης των mirna

22 Πως σχηματίζονται mirnas? (intergenic/intragenic) Τα mirnas δημιουργούνται μετά από ωρίμανση πρόδρομων μορίων

23 Βιογένεση των mirna Annu. Rev. Cell Dev. Biol :

24 Σχηματισμός και λειτουργίες των ρυθμιστικών παρεμβαλομένων RNAs

25 Τα mirnas αναστέλουν τη μετάφραση προκαλώντας απομάκρυνση των ριβοσωμάτων από το mrna Petersen et al. (2006) Molecular Cell 21:

26 Γονιδιακή οργάνωση των mirna Τα ιντρονικά mirnas συχνά συντίθενται από την μη-κωδική αλυσίδα του DNA (αντινοηματική κατεύθυνση) και από τον δικό τους υποκινητή Τα εξονικά mirnas απαντώνται συνήθως σε εξόνια που δεν περιέχουν πληροφορίες κωδικοποίησης πρωτεΐνης (ή σε εξόνια που δημιουργούνται με εναλλακτική συρραφή)

27 Πόσα mirnas υπάρχουν στον άνθρωπο; Συνολικός αριθμός mirna γονιδίων σε 115 είδη 10,882 Συνολικός αριθμός γνωστών mirna γονιδίων 1,580 Ταυτοποιηθέντα ανθρώπινα mirna γονίδια 851 Αριθμός mirna στόχων στον άνθρωπο 34,788 Τα mirnas μπορεί να έχουν πολλαπλούς στόχους Το κάθε mrna-στόχος μπορεί να έχει πολλαπλές θέσεις πρόσδεσης για mirna

28 Χιλιάδες mirnas επηρεάζουν πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες Μεταβολισμός Κυτταρικός κύκλος Απόπτωση Διαφοροποίηση Γήρανση Αναπτυξιακός συγχρονισμός Καρκίνος

29 Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας