ιατριβή για το Μεταπτυχιακό ίπλωμα Ειδίκευσης στη Βιολογική Τεχνολογία

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ ser326cys ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ OGG1 ΣΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΗ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ ΟΞΟΡΟΥΒΙΚΙΝΗΣ (DOXORUBICIN) ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ IN VITRO Παναγίδης Ανδρέας Βιολόγος ιατριβή για το Μεταπτυχιακό ίπλωμα Ειδίκευσης στη Βιολογική Τεχνολογία ΠΑΤΡΑ 2008

2 1

3 2

4 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ημόπουλος Νικόλαος Καθηγητής, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Τμήμα Βιολογίας, Σχολής Θετικών Επιστημών, Πανεπιστημίου Πατρών. ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γεωργίου Χρήστος Καθηγητής, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Τμήμα Βιολογίας, Σχολής Θετικών Επιστημών, Πανεπιστημίου Πατρών. Στεφάνου Γεωργία Καθηγήτρια, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Τμήμα Βιολογίας, Σχολής Θετικών Επιστημών, Πανεπιστημίου Πατρών. ημόπουλος Νικόλαος Καθηγητής, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Τμήμα Βιολογίας, Σχολής Θετικών Επιστημών, Πανεπιστημίου Πατρών. 3

5 4

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα ερευνητική εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Γενετικής, του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Τμήματος Βιολογίας, της Σχολής Θετικών Επιστημών του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών του Τμήματος Βιολογίας με Ειδίκευση στη Βιολογική Τεχνολογία. Με την ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Νικόλαο Δημόπουλο, καθηγητή στο Τμήμα Βιολογίας καθώς επίσης και την κ. Γεωργία Στεφάνου, Καθηγήτρια στο Τμήμα Βιολογίας, για την ευκαιρία που μου έδωσαν να εκπονήσω τη διατριβή μου στο εργαστήριό τους, καθώς επίσης και για τη συνεχή παρακολούθηση και υποστήριξή τους, τόσο κατά το πειραματικό μέρος όσο και κατά τη συγγραφή της Διατριβής. Ιδιαίτερα θέλω να τους ευχαριστήσω για την καλή σχέση που είχαμε και το ευχάριστο κλίμα που επικρατεί στο εργαστήριο. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας κ. Χρήστο Γεωργίου, για τη συμμετοχή του στην Εξεταστική Επιτροπή και τις χρήσιμες παρατηρήσεις του. Ευχαριστίες οφείλω στις φίλες μου και υποψήφιες Διδάκτορες του Εργαστηρίου μας, και ιδιαίτερα στις Δέσποινα Ουρανού και Μαρία Ευθυμίου, για την άψογη συνεργασία μας, το χρόνο που διέθεσαν για την επίλυση των αποριών μου και την υπομονή που επέδειξαν κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της παρούσας Διατριβής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τους φίλους μου, για τις αμέτρητες ώρες που περάσαμε μαζί και τη στήριξη που μου προσέφεραν όλα αυτά τα χρόνια. Τέλος, θα ήταν παράλειψη μου να μην αναφερθώ στην οικογένεια μου και ιδιαίτερα στους γονείς μου, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξαν, για τις θυσίες που έκαναν, για την πολύτιμη ηθική και υλική υποστήριξη και τα εφόδια που μου προσέσφεραν κατά τη διάρκεια των σπουδών μου. Χωρίς αυτούς η εκπόνηση της Διατριβής μου δεν θα ήταν δυνατή, γι αυτό και τους ευχαριστώ θερμά. Πάτρα, Ιούλιος

7 6

8 7

9 8

10 Περιεχόμενα ΕΙΣΑΓΩΓΗ οξορουβικίνη Γενικά Ιστορικά στοιχεία Βιοσύνθεση Κλινικές χρήσεις Παρενέργειες Μηχανισμοί δράσης Παραγωγή ελευθέρων ριζών Αναστολή της τοποϊσομεράσης ΙΙ Απόπτωση Αναστολή πρωτεασώματος Παρεμβολή στο DNA Μηχανισμοί Επιδιόρθωσης DNA Γενικά Άμεση Αναστροφή της Βλάβης Επιδιόρθωση λανθασμένων ζευγών βάσεων Αναγνώριση της βλάβης ιάκριση θυγατρικού DNA κλώνου Εξαγωγή της βλάβης και σύνθεση του DNA Επιδιόρθωση δίκλωνων ρηγμάτων στο DNA Μη ομόλογη ένωση άκρων Ομόλογος ανασυνδυασμός Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίων Επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων Αναγνώριση αφαίρεση βλάβης δημιουργία μονόκλωνου ρήγματος Εισαγωγή νουκλεοτιδίου Επιλογή ανάμεσα στο SN-BER και LP-BER Μετατόπιση της αλυσίδας και σύνθεση DNA μέσω του LP-BER Σφράγισμα του κλώνου Γλυκοζυλάση της 8-οξογουανίνης (OGG1) Γενικά οξογουανίνη (8-oxoguanine, 8-oxoG) Επιδιόρθωση 8-οξογουανίνης Ανθρώπινη γλυκοζυλάση της 8-οξογουανίνης (hogg1) Πολυμορφισμοί στο γονίδιο της ανθρώπινης γλυκοζυλάσης της 8-οξογουανίνης

11 4 Μέθοδος Αναστολής της Κυτταροκίνησης Ανάλυση Μικροπυρήνων Γενικά Μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνισης (Cytokinesis Block MicroNucleus assay, CBMN) Πλεονεκτήματα της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης Μεινονεκτήματα της μεθόδους αναστολής της κυτταροκίνησης In Situ Υβριδοποίηση με Φθοροχρώματα Γενικά Βασική αρχή Ανιχνευτές DNA Επαναλαμβανόμενες Αλληλουχίες Ολόκληρα χρωμοσώματα Μοναδικές αλληλουχίες Συνδυασμός της in situ υβριδοποίησης με φθορωχρώματα με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης Σκοπός της Εργασίας ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Βιολογικό Υλικό Γενικά Κύτταρα αίματος Πλεονεκτήματα χρήσης λεμφοκυττάρων Μεινονεκτήματα χρήσης λεμφοκυττάρων Γονιδιοτύπηση Γενικά Απομόνωση DNA από ολικό αίμα Πηγή αίματος ιαλύματα Πειραματική διαδικασία Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) ιαλύματα PCR ιαλύματα ηλεκτροφόρησης Πειραματική διαδικασία Ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR Προετοιμασία πηκτώματος αγαρόζης Προετοιμασία δειγμάτων για ηλεκτροφόρηση Πέψη Προϊόντων PCR ηλεκτροφόρηση προϊόντων πέψης Προετοιμασία δειγμάτων για πέψη Προετοιμασία πηκτώματος αγαρόζης 3,5% Προετοιμασία δειγμάτων για ηλεκτροφόρηση

12 9 Μέθοδος Αναστολής της Κυτταροκίνησης In Situ Υβριδοποίηση με Φθροροχρώματα Μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης Μικροπυρήνες Γενικά Κριτήρια αναγνώρισης διπύρηνων κυττάρων Κριτήρια αναγνώρισης μικροπυρήνων Καλλιέργειες λεμφοκυττάρων ολικού αίματος Πηγή λεμφοκυττάρων Συνθήκες καλλιέργειας Απομόνωση λεμφοκυττάρων In situ υβριδοποίηση με φθοροχρώματα (FISH) Γενικά Καλλιέργειες λεμφοκυττάρων ολικού αίματος ιαλύματα Μονιμοποίηση προετοιμασία παρασκευασμάτων Υβριδοποίηση Μικροσκοπική παρατήρηση Στατιστική ανάλυση Ανοσοκυτταροχημική Ανίχνευση 8-oxoG Γενικά ιαλύματα Καλλιέργειες λεμφοκυττάρων ολικού αίματος Απομόνωση λεμφοκυττάρων Μονιμοποίηση προετοιμασία παρασκευασμάτων Πειραματική διαδικασία Πρώτη μέρα εύτερη μέρα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Προσδιορισμός του Πολυμορφισμού Ser326Cys του Γονιδίου hogg Γενικά PCR ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR Πέψη με το ένζυμο περιορισμού Fnu4HI ηλεκτροφόρηση προϊόντων πέψης Επίδραση της οξορουβικίνης στον Κυτταρικό Κύκλο Μελέτη Κυτταροτοξικότητας Γενικά Προκαταρκτικά πειράματα επιλογή των προς μελέτη συγκεντρώσεων

13 12.3. Μελέτη της συμμετοχής του πολυμορφισμού Ser326Cys στη μεταβολής των δεικτών πυρηνικής διαίρεσης, πολλαπλασιασμού των κυττάρων και κυτταροτοξικότητας Συμμετοχή του Πολυμορφισμού Ser326Cys στην Κυτταρογενετική ράση της οξορουβικίνης: Προσδιορισμός Συχνότητας Μικροπυρήνων Γενικά Μελέτη του Μηχανισμού Προέλευσης των Μικροπυρήνων: In situ υβριδοποίηση με φθοροχρώματα Γενικά Συμμετοχή της Οξειδωτικής Βλάβης στη ράση της οξορουβικίνης: Ανοσοκυτταροχημική Ανίχνευση 8-οξογουανίνης Γενικά ΣΥΖΗΤΗΣΗ Συζήτηση Συμπεράσματα Περίληψη Summary ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Βιβλιογραφία

14 13

15 14

16 1. οξορουβικίνη 1.1. Γενικά Χημειοθεραπεία είναι η προσπάθεια θεραπείας του καρκίνου με φάρμακα (αντικαρκινικά φάρμακα), τα οποία έχουν την ιδιότητα να καταστρέφουν τα καρκινικά κύτταρα. Η χημειοθεραπεία αναφέρεται συνήθως σε κυτταροτοξικά φάρμακα, τα οποία επηρεάζουν τα κύτταρα που διαιρούνται με γρήγορους ρυθμούς ανεξαρτήτως αν αυτά είναι τα καρκινικά ή τα κανονικά κύτταρα. Οι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες επεμβαίνουν στην κυτταρική διαίρεση με διάφορους τρόπους. Για παράδειγμα μπορεί να επεμβαίνουν στο διπλασιασμό του γενετικού υλικού ή στον αποχωρισμό των χρωμοσωμάτων κατά τη μίτωση. Οι περισσότερες μορφές χημειοθεραπείας, στοχεύουν σε όλους τους διαιρούμενους πληθυσμούς, και δεν είναι εξειδικευμένοι για τα καρκινικά κύτταρα. Παρόλα αυτά, υπάρχει κάποια μορφή εξειδίκευσης, λόγω του ότι πολλά καρκινικά κύτταρα, έχουν χάσει την ικανότητα επιδιόρθωσης του γενετικού υλικού, ιδιότητα την οποία διατηρούν τα κανονικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, παρόλο που η χημειοθεραπεία έχει τη δυνατότητα να βλάψει και τους υγιείς ιστούς, ιδιαίτερα αν αυτοί διαιρούνται με έντονο ρυθμό, αυτοί οι ιστοί συνήθως επιδιορθώνονται με το πέρας της χημειοθεραπείας. Η Δοξορουβικίνη (Doxorubicin, CAS No: ) ανήκει στην κατηγορία των αντιβιοτικών ανθρακυκλίνης και είναι ένας αντινεοπλασματικός παράγοντας που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου (εικόνα 1.1.1). Συγκεκριμένα, χρησιμοποιείται ευρέως στη θεραπεία ορισμένων μορφών λευχαιμίας, του λεμφώματος Hodgkin, καθώς επίσης και στη θεραπεία καρκίνων της ουροδόχου κύστεως, του στήθους, του στομάχου, των πνευμόνων, των ωοθηκών, του θυρεοειδούς και άλλων. 15

17 Εικόνα 1.1.1: Η χημική δομή της Δοξορουβικίνης (τροποποίηση από Arcamone et al., 1969). Η δοξορουβικίνη αποτελείται από δύο κυρίως μέρη: Μια αδιάλυτη στο νερό τετρακυκλική αγλυκόνη (δακτύλιοι Α-Δ) και ένα υδατοδιαλυτό, σάκχαρο daunosamine (Keizer et al., 1990). Η συστηματική της ονοματολογία είναι (8S,10S)-10-(4-amino-5- hydroxy-6-methyl-tetrahydro-2h-pyran-2-yloxy)-6,8,11-trihydroxy-8- (2-hydroxyacetyl)-1-methoxy-7,8,9,10-tetrahydrotetracene-5,12-dione hydrochloride, ενώ συναντάται και με τα εξής συνώνυμα: Doxorubicin HCl, Adriamycin, Adriblastin, 14-Hydroxydaunomycin, 14- Hydroxydaunorubicine, DOXO, Adriamycin semiquinone, ADM, ADR κλπ. Η Δοξορουβικίνη είναι μια κόκκινη κρυσταλλική σκόνη, που αποσυντίθεται στους 205 ο C. Έχει μοριακό τύπο, C 27 H 29 O 11 N. HCl και μοριακό βάρος g/mol. Είναι διαλυτή στο νερό και σε υδατικά διαλύματα αλκοόλης, λιγότερο διαλυτή σε άνυδρη μεθανόλη και τελείως αδιάλυτη σε μη πολικούς οργανικούς διαλύτες. Τα διαλύματα της Δοξορουβικίνης έχουν πορτοκαλοκίτρινο χρώμα σε όξινο ph, πορτοκαλοκόκκινο χρώμα σε ουδέτερο ph και μπλε ιώδες σε ph με τιμές μεγαλύτερες του 9 (Arcamone et al., 1969). 16

18 Η δοξορουβικίνη, αποτελείται από μια αγλυκόνη που περιλαμβάνει ένα τετρακυκλικό δακτύλιο (εικόνα 1.1.1: δακτύλιοι Α-Δ) με παρακείμενες ομάδες κινόνης και υδροκινόνης (δακτύλιοι Γ και Β αντίστοιχα). Επίσης περιλαμβάνει μια μεθόξυ ομάδα στον άνθρακα 4, και μια μικρή πλευρική αλυσίδα στον άνθρακα 9 με ένα καρβονύλιο στον άνθρακα 13. Επίσης ένα σάκχαρο daunosamine σύνδέεται με γλυκοσιδικό δεσμό στον άνθρακα 7 του δακτυλίου Α (Takemura and Fujiwara, 2007) Ιστορικά στοιχεία Το 1950 μια ιταλική ερευνητική εταιρία ξεκίνησε μια οργανωμένη προσπάθεια για να ανακαλύψει αντικαρκινικά φάρμακα από μικροοργανισμούς του εδάφους. Από ένα δείγμα εδάφους που πάρθηκε από την περιοχή που περιβάλλει το Castel del Monte (Κάστρο του βουνού), ένα κάστρο του 13 ου αιώνα στην Ιταλία, απομονώθηκε ένα νέο στέλεχος το Streptomyces peucetius, το οποίο παρήγαγε μια κόκκινη χρωστική. Από αυτό το βακτήριο απομονώθηκε ένα αντιβιοτικό, το οποίο βρέθηκε να έχει θετική επίδραση ενάντια σε όγκους ποντικιών. Αυτή η χημική ένωση ανακαλύφθηκε σχεδόν ταυτόχρονα και από μια ομάδα Γάλλων ερευνητών και έτσι οι δύο ερευνητικές ομάδες αποφάσισαν να ονομάσουν την ένωση αυτή Daunorubicin από τις λέξεις Daunii, (μια φυλή της προ-ρωμαϊκής εποχής, η οποία είχε καταλάβει την περιοχή στην Ιταλία όπου ανακαλύφθηκε η ένωση) και από τη γαλλική λέξη rubis, που σημαίνει ρουμπίνι και περιγράφει το χρώμα της εν λόγω ένωσης ( 17

19 Εικόνα 1.3.1: Το βιοσυνθετικό μονοπάτι της Δοξορουβικίνης. Η μετατροπή του (12) στο (13) μέσω της πρωτεΐνης DoxA συμβαίνει 170 φορές λιγότερο αποδοτικά σε σχέση με τη μετατροπή του (10) σε (12) μέσω της ίδιας πρωτεΐνης. Αυτό υποδεικνύει ότι η κύρια λειτουργία της DoxA είναι η παραγωγή daunorubicin, ενώ η παραγωγή δοξορουβικίνης είναι μάλλον δευτερεύουσα ιδιότητα (τροποποίηση από Hutchinson and Colombo, 1999). Οι κλινικές δοκιμές άρχισαν τη δεκαετία του 1960, με αξιοσημείωτη επιτυχία στη θεραπεία της λευχαιμίας ιδιαίτερα σε περιπτώσεις τις οποίες, άλλου είδους φαρμακευτική αγωγή απέτυχε να θεραπεύσει. Παρόλα αυτά, ορισμένοι ασθενείς ανέπτυξαν οξεία καρδιακή ανεπάρκεια, η οποία σε ορισμένες περιπτώσεις ήταν μοιραία (Tan et. al., 1967). Παράλληλα, η σύγκριση της Daunorubicin με άλλα αντιβιοτικά ανθρακυκλίνης με παρόμοια δομή αλλά όχι τόσο καλά φαρμακολογικά αποτελέσματα (πχ rhodomycin) οδήγησε στο συμπέρασμα ότι μικρές αλλαγές στη δομή της ένωσης μπορούσαν να επιφέρουν και αλλαγές στη βιολογική της δράση. Γι αυτό το λόγο οι ερευνητές άρχισαν να ψάχνουν για παράγωγα της Daunorubicin με καλύτερες αντινεοπλασματικές ιδιότητες και ηπιότερες παρενέργειες. Για να το πετύχουν αυτό άρχισαν 18

20 να προκαλούν μεταλλάξεις σε άτομα του στελέχους Streptomyces peucetius, από το οποίο προερχόταν η αρχική ένωση. Έτσι κατάφεραν να απομονώσουν και να χαρακτηρίσουν την Αδριαμυκίνη (Adriamycin), ένα νέο, κόκκινου χρώματος αντιβιοτικό, από το στέλεχος Streptomyces peucetius var. caesius. Η αδριαμυκίνη μετονομάστηκε αργότερα σε Δοξορουβικίνη (Doxorubicin). Η Δοξορουβικίνη έδειξε να είναι πιο ενεργή από τη Daunorubicin όσον αφορά στη θεραπεία όγκων σε ποντίκια και ιδιαίτερα στους στερεούς όγκους. Επίσης έδειξε να έχει καλύτερο δείκτη απόδοσης φαρμάκου (therapeutic index) (Arcamone et al., 1969) Βιοσύνθεση Η Δοξορουβικίνη είναι ένα φυσικό προϊόν, το οποίο προέρχεται από την daunorubicin μετά από υδροξυλίωσή της στον άνθρακα 14. Η δοξορουβικίνη απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1969 από το στέλεχος Streptomyces peucetius υποείδος caesius, ATCC Το στέλεχος αυτό προέρχεται από το Streptomyces peucetius μετά από επίδραση με N-nitroso-N-methyl urethane (Arcamone et al., 1969). Το βιοσυνθετικό μονοπάτι της Δοξορουβικίνης (εικόνα 1.3.1) έχει ως εξής: Το πρώτο στάδιο στο μονοπάτι αυτό τελειώνει με τη βιοσύνθεση της ε-rhodomycinone (6). Ο ανθρακικός σκελετός του μορίου αυτού φτιάχνεται από την πολυκετιδική συνθετάση τύπου ΙΙ (type II polyketide synthase, PKS), η οποία κωδικοποιείται από τα γονίδια dpsabcdgefy. Στη συνέχεια η ε-rhodomycinone γλυκοσυλιώνεται από την TDPdaunosamine οπότε και προκύπτει η rhodomycin-d (7). Η τελευταία μετατρέπεται σε 13-deoxycarminomycin (9) από την DnrP εστεράση μέσω ενός ενδιάμεσου προϊόντος (8). Η ένωση αυτή (9), μεθυλιώνεται για να προκύψει η 13-deoxy-daunorubicin (10). Η 13-deoxy-daunorubicin οξειδώνεται στον άνθρακα 13 μέσω μιας αντίδρασης που ολοκληρώνεται σε δύο στάδια και καταλύεται από το προϊόν του γονιδίου doxa, το οποίο είναι ένα ένζυμο που ανήκει στην οικογένεια κυτοχρώματος P450. Από την αντίδραση αυτή προκύπτει το πρόδρομο μόριο της δοξορουβικίνης, 19

21 η daunorubicin (12). Η δοξορουβικίνη (13) προκύπτει μετά από οξείδωση της daunorubicin στον άνθρακα 14, αντίδραση που επίσης καταλύεται από το προϊόν του γονιδίου doxa (Hutchinson, 1997 και Hutchinson and Colombo, 1999). Εικόνα 1.3.2: Η ποσότητα της Δοξορουβικίνης που παράγεται υπό φυσιολογικές συνθήκες είναι ελάχιστη. Τα κύρια προϊόντα που προκύπτουν από τα περισσότερα στελέχη που παράγουν daunorubicin είναι γλυκοσίδια που μοιάζουν στη baumycin (τροποποίηση από Hutchinson and Colombo, 1999). Αξίζει να σημειωθεί ότι η τελευταία αντίδραση στο παραπάνω μονοπάτι είναι μάλλον μια τυχαία ιδιότητα της πρωτεΐνης DoxA, αφού έχει βρεθεί ότι η υδροξυλίωση στον άνθρακα 14 της daunorubicin είναι κατά 170 φορές λιγότερο αποδοτική από την οξείδωση στον άνθρακα 13 της 13-deoxy-daunorubicin (Hutchinson and Colombo, 1999 και Walczak et al., 1999). Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες η ποσότητα της Δοξορουβικίνης που παράγεται από αυτό το μονοπάτι είναι ελάχιστη σε σχέση με τα άλλα προϊόντα που επίσης παράγονται (εικόνα 1.3.2). Αυτό συμβαίνει διότι η daunorubicin είναι υπόστρωμα και για τα προϊόντα των γονιδίων dnru (το οποίο καταλύει την μετατροπή της daunorubicin σε (13S)-13-dihydrodaunorubicin) και των γονιδίων dnrh και dnrx (τα 20

22 οποία συμμετέχουν στη μετατροπή της daunorubicin σε άλλα baumycin-like γλυκοσίδια). Σε γενετικά τροποποιημένα στελέχη, στα οποία έχουν απενεργοποιηθεί τα παραπάνω γονίδια, έχει παρατηρηθεί μια αξιόλογη αύξηση στην παραγωγή της δοξορουβικίνης (Lomovskaya et al., 1999). Σημαντική επίσης αύξηση στην παραγωγή της Δοξορουβικίνης παρατηρήθηκε και σε στελέχη που υπερέκφραζαν την πρωτεΐνη DoxA (Lomovskaya et al., 1999, και Walczak et al., 1999). Η πρωτεΐνη DoxA είναι το προϊόν του γονιδίου doxa, το οποίο απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε το 1996 από την ερευνητική ομάδα του Strohl (Dickens and Strohl, 1996). Η πρωτεΐνη DoxA καταλύει τρεις αντιδράσεις οξείδωσης κατά τη βιοσύνθεση της δοξορουβικίνης (εικόνα 1.3.1): i Στην οξείδωση της 13-deoxydaunorubicin σε 13- dihydrodaunorubicin, ii Στην οξείδωση της 13-dihydrodaunorubicin σε daunorubicin και iii Στην οξείδωση της daunorubicin σε δοξορουβικίνη (Walczak et al., 1999). Η ανακάλυψη του γονιδίου αυτού ήταν ένα σημαντικό βήμα στην μελέτη της δοξορουβικίνης, γιατί εκτός από τη σπουδαιότητά του στη βιοσύνθεση της εν λόγω ένωσης, κατέστει ξεκάθαρο ότι όλα τα στελέχη που είχαν τη δυνατότητα να παράγουν daunorubicin, είχαν επίσης και όλα τα απαραίτητα γονίδια για την παραγωγή της δοξορουβικίνης. Μέχρι το 1999, η παραγωγή της δοξορουβικίνης (η οποία έφτανε τα 225Kg το χρόνο) γινόταν με ημισυνθετικό τρόπο από το πρόδρομο μόριό της, την daunorubicin, υπερέκφραση της οποίας παρατηρείται σε πολλά διαθέσιμα στελέχη. Η ανακάλυψη όμως των γονιδίων τα οποία είτε συμμετέχουν στην μετατροπή της daunorubicin σε δοξορουβικίνη (doxa), είτε συμμετέχουν στην μετατροπή της σε άλλα παραπροϊόντα (dnrx, dnrh, dnru), έστρεψε την έρευνα στη γενετική τροποποίηση των στελεχών αυτών, έτσι ώστε να προκύψουν στελέχη τα οποία να υπερεκφράζουν την δοξορουβικίνη. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα τη στροφή της βιομηχανίας στην παραγωγή δοξορουβικίνης με φυσικό τρόπο, μέσω 21

23 της καλλιέργειας τέτοιων στελεχών σε βιοαντιδραστήρες, γεγονός το οποίο μείωσε σημαντικά το κόστος παραγωγής της δοξορουβικίνης (Lomovskaya et al., 1999). Εικόνα : Ελεύθερες ρίζες και αλκυλιωτικοί παράγοντες που προκύπτουν κατά το μεταβολισμό της δοξορουβικίνης. Η δοξορουβικίνη μπορεί να αναχθεί από κυτταρικές φλαβοπρωτεΐνες (FH 2 ) και να μετατραπεί στην ελέυθερη ρίζα της ημικινόνης. Παρουσία οξυγόνου η ρίζα αυτή οξειδώνεται πίσω στην αρχική της μορφή με ταυτόχρονη παραγωγή ριζών υπεροξειδίου. Απουσία οξυγόνου, η ρίζα αυτή είναι ασταθής. Έτσι χάνει το τμήμα σακχάρου δίνοντας μια C 7 -ελεύθερη ρίζα. Η τελευταία έχει τη δυνατότητα να προσδεθεί ομοιοπολικά με διάφορα κυτταρικά μακρομόρια, ή να αναχθεί και πάλι δίνοντας ένα σχετικά σταθερό προϊόν, τη C 7 - δεοξυαγλυκόνη. Ένα ταυτομερές της ένωσης αυτής είναι το C 7 -quinone methide, το οποίο είναι ένας αλκυλιωτικός παράγοντας (τροποποίηση από Keizer et al., 1990) Κλινικές χρήσεις Η DXR χρησιμοποιείται ευρέως στη θεραπεία ορισμένων μορφών λευχαιμίας, του λεμφώματος Hodgkin, καθώς επίσης και στη θεραπεία καρκίνων της ουροδόχου κύστεως, του στήθους, του στομάχου, των πνευμόνων, των ωοθηκών, του θυρεοειδούς και άλλων. Οι πιο συνηθισμένες θεραπευτικές αγωγές που περιλαμβάνουν την DXR και χρησιμοποιούνται σήμερα είναι οι CA (Cyclophosphamide, Adriamycin), TAC (Taxotere, CA), ABVD (Adriamycine, Bleomycin, Vinblastine, Dacarbazine), CHOP (Cyclophosphamide, Adriamycin, Vincristine, 22

24 Prednisone) και η FAC (5-Fluorouracil, Adriamycin, Cyclophosphamide). Το φάρμακο χορηγείται με ένεση και μπορεί να πωλείται κάτω από τις εμπορικές ονομασίες Adriamycin PFS, Adriamycin RDF, Rubex ή Doxil. Το Doxil είναι μια μορφή του φαρμάκου, η οποία περικλείεται σε λιποσώματα και πλεονεκτεί ως προς τις άλλες στο ότι μειώνεται η καρδιοτοξικότητα. Το Doxil χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών ή για τη θεραπεια του Σαρκώματος του Kaposi Παρενέργειες Η χρήση της DXR έχει πολλές οξείες παρενέργειες στις οποίες περιλαμβάνονται η ναυτία, οι εμετοί, η λευκοπενία, καθώς επίσης και πλήρης αλωπεκία (πτώση μαλλιών). Η δοξορουβικίνη παρουσιάζει επίσης τόσο οξέα όσο και χρόνια συμπτώματα στο καρδιαγγειακό σύστημα. Στα οξέα συμπτώματα, περιλαμβάνονται οι αρρυθμίες, υπόταση και διάφορες αλλαγές στο ηλεκτροκαρδιογράφημα. Τα συμπτώματα αυτά εμφανίζονται κατά μέσο όρο στο 11% των ασθενών και συνήθως κατά τη διάρκεια ή λίγο μετά το πέρας της χημειοθεραπείας. Γενικά τα συμπτώματα αυτά είναι αναστρέψιμα και μπορούν να ελεγχθούν. Αντίθετα τα χρόνια συμπτώματα της δοξορουβικίνης περιλαμβάνουν παθολογικές αλλαγές στο μυοκάρδιο, οι οποίες είναι δοσοεξαρτώμενες, μη-αντιστρεπτές, δεν μπορούν να προβλεφθούν και συνήθως οδηγούν συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια με τελικό αποτέλεσμα το θάνατο. Η συχνότητα με την οποία εμφανίζονται είναι 1,7% και από τα περιστατικά αυτά, ένα ποσοστό μεγαλύτερο του 50% τελικά καταλήγει. Η ανάπτυξη της καρδιομυοπάθειας εξαρτάται ξεκάθαρα από την ολική δόση που χορηγείται στον ασθενή. Σε μια ανάλυση που πραγματοποιήθηκε σε 399 ασθενείς, το 4% των ασθενών που έλαβαν συνολική δόση δοξορουβικίνης mg/m 2, παρουσίασε καρδιομυοπάθεια και συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια. Το ποσοστό 23

25 αυτό αυξήθηκε στο 18% σ αυτούς που η δόση ήταν μεταξύ mg/m 2 και στο 36% όταν η δόση ξεπερνούσε τα 661mg/m 2. Η καρδιομυοπάθεια εμφανίστηκε κατά μέσο όρο 34 ημέρες μετά την τελευταία χορήγηση του φαρμάκου. Επιπλέον η πρόγνωση ήταν ανεπαρκής για τους ασθενείς οι οποίοι παρουσίασαν τα συμπτώματα μέσα σε διάστημα 4 εβδομάδων από την τελευταία χορήγηση του φαρμάκου. Οι περισσότεροι από αυτούς πέθαναν σε διάστημα δύο εβδομάδων από την έναρξη της ασθένειας. Από τα άτομα τα οποία επέζησαν για μεγάλο χρονικό διάστημα μετά τη χημειοθεραπεία, πολλοί εμφάνισαν καρδιακή ανεπάρκεια σε διάστημα 6 με 10 χρόνων από το τέλος της θεραπείας (Takemura and Fujiwara, 2007). Η καρδιομυοπάθεια που εμφανίζεται λόγω της δοξορουβικίνης δεν είναι δυνατόν να θεραπευτεί με τις συνήθεις θεραπευτικές αγωγές που εφαρμόζονται σε ασθενείς με καρδιομυοπάθεια. Έτσι οι πρακτικές που εφαρμόζονται για την πρόληψη της καρδιομυοπάθειας περιλαμβάνουν τη μείωση της συνολικής δόσης του φαρμάκου στα 550mg/m 2, γεγονός που περιορίζει και την αποτελεσματικότητα της ένωσης έναντι των καρκινικών κυττάρων. Άλλες πρακτικές που εφαρμόζονται είναι η αντικατάσταση της χορήγησης του φαρμάκου από μια ενδοβλέβια χορήγηση των λεπτών, με μια πιο αργή έγχυση των 6 ωρών. Η πρακτική αυτή έχει μειώσει την καρδιοτοξικότητα αλλά δεν είναι γνωστή ακόμα η επίδραση που έχει στα καρκινικά κύτταρα. Τέλος, πολλά υποσχόμενη φαίνεται να είναι η χορήγηση του φαρμάκου παράλληλα με τη χορήγηση αντιοξειδωτικών ή αιμοποιητικών κυτταροκινών, χωρίς όμως να υπάρχουν ακόμα ενδείξεις για την αποτελεσματικότητα αυτών των στρατηγικών (Takemura and Fujiwara, 2007) Μηχανισμοί δράσης Παραγωγή ελευθέρων ριζών Η δοξορουβικίνη έχει την ικανότητα να προκαλεί το σχηματισμό μεγάλου αριθμού ελευθέρων ριζών με δύο τρόπους: 24

26 Σύμφωνα με τον πρώτο τρόπο, οι δακτύλιοι Β και Γ (εικόνα 1.1.1), παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, όσον αφορά στην ικανότητα της δοξορουβικίνης να παράγει ελεύθερες ρίζες. Ο δακτύλιος Γ είναι μια ομάδα κινόνης, η οποία μετατρέπεται σε ελεύθερη ρίζα ημικινόνης μετά από αναγωγή ενός ηλεκτρονίου. Ο δακτύλιος Β είναι μια υδροκινόνη, η οποία επίσης μπορεί να αναχθεί σε ρίζα ημικινόνης. Κάτω από ανοξικές συνθήκες αυτές οι ρίζες είναι σχετικά σταθερές, αλλά παρουσία οξυγόνου, δίνουν το ασύζευκτο ηλεκτρόνιό τους στο τελευταίο, με αποτέλεσμα την παραγωγή ελεύθερης ρίζας οξυγόνου. Στο σχηματισμό των ανηγμένων ριζών ημικινόνης συμμετέχουν οι κατάλληλες φλαβοπρωτεΐνες οι οποίες δέχονται ηλεκτρόνια από το NADH ή το NADPH και τα δίνουν στη δοξορουβικίνη. Η αναγωγή του οξυγόνου σε ρίζα υπεροξειδίου έχει ως αποτέλεσμα τον επανασχηματισμό του μορίου της δοξορουβικίνης. Ο οξειδοαναγωγικός αυτός κύκλος μπορεί να επαναληφθεί, με αποτέλεσμα την παραγωγή ενός μεγάλου αριθμού ριζών υπεροξειδίου από ένα και μόνο μόριο δοξορουβικίνης (εικόνα ). Οι Goodman και Hochstein είχαν παρατηρήσει το 1977 ότι η αναγωγάση του κυτοχρώματος P-450 παρουσία δοξορουβικίνης προκαλούσε κατανάλωση οξυγόνου που εξαρτιόταν από το NADPH. Αργότερα έγινε γνωστό ότι εκτός από την αναγωγάση του κυτοχρώματος Ρ-450, αναγωγή της δοξορουβικίνης μπορούσε να προκαλέσει και η NADH αφυδρογονάση και η οξειδάση της ξανθίνης. Ως αποτέλεσμα, ο οξειδοαναγωγικός κύκλος της δοξορουβικίνης (και συνεπώς η παραγωγή ελευθέρων ριζών) μπορεί να πραγματοποιηθεί στο κυτταρόπλασμα, στα μιτοχόνδρια, στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στον πυρήνα. Το τελευταίο ίσως και να εξηγεί ένα τρόπο πρόκλησης βλαβών στο γενετικό υλικό: Η δοξορουβικίνη προσδένεται επιλεκτικά στο DNA όπου και ενεργοποιείται μεταβολικά προκαλώντας βλάβες με τη μεσολάβηση των ελευθέρων ριζών που παράγονται. Στην παρουσία οξυγόνου σχηματίζεται ένας μεγάλος αριθμός ελευθέρων ριζών ενώ αντίθετα σε υποξικές συνθήκες συσσωρεύεται η ρίζα ημικινόνης. Έτσι για την τοξικότητα της δοξορουβικίνης στο DNA έχουν περιγραφεί τρεις διαφορετικοί μηχανισμοί: 25

27 i Σε ένα σύστημα το οποίο περιλάμβανε τη δοξορουβικίνη, NADPH, αναγωγάση του κυτοχρώματος Ρ-450 και DNA, παρατηρήθηκε θραύση στο DNA. Σε ένα άλλο σύστημα το οποίο περιλάμβανε δεοξυριβόζη, ελεύθερες ρίζες ημικινόνης που προερχόταν από τη δοξορουβικίνη και ιόντα σιδήρου παρατηρήθηκε αποσύνθεση της δεοξυριβόζης. Ο μηχανισμός αυτός εξαρτάται από το οξυγόνο και κατ αυτόν παράγονται ελεύθερες ρίζες υδροξυλίου σύμφωνα με την αντίδραση Haber-Weiss: H 2 * + O H H 2O2 O2 2 + O 2 O + * 2 + Fe η οποία στο σύνολό της δίνει: O O Fe OH O OH * Fe OH OH 2+ + Fe O * * H ii Απουσία οξυγόνου, η ρίζα ημικινόνης μετατρέπεται στη C 7 - δεοξυαγλυκόνη, η οποία δεν είναι ενεργή. Το ταυτομερές της όμως, η C 7 - quinone methide είναι ένας αλκυλιωτικός παράγοντας. Επίσης, ένα ενδιάμεσο προϊόν στην παραγωγή της C 7 -δεοξυαγλυκόνης, η C 7 - ελεύθερη ρίζα είναι μια ένωση η οποία μπορεί να προσδεθεί ομοιοπολικά στο DNA (εικόνα ). iii Ένας τρίτος μηχανισμός συμβαίνει όταν υπάρχει μικρή μερική πίεση οξυγόνου. Σε αυτή την περίπτωση η ρίζα ημικινόνης αντιδρά με το H 2 O 2 προκαλώντας την αποσύνθεση της δεοξυριβόζης σε μια αντίδραση που καταλύεται από μικρές συγκεντρώσεις ιόντων σιδήρου. Εκτός όμως από τις βλάβες στο γενετικό υλικό, οι ρίζες υπεροξειδίου που προκύπτουν κατά το μεταβολισμό της δοξορουβικίνης μέσω του οξειδοαναγωγικού κύκλου μπορεί να προκαλέσουν και υπεροξείδωση των λιπιδίων στην κυτταροπλασματική μεμβράνη. Επιπλέον έχει δειχθεί ότι η υπεροξείδωση λιπιδίων που συμβαίνει λόγω της δοξορουβικίνης μπορεί να ανασταλεί από την υπεροξειδική 26

28 δισμουτάση, την καταλάση, τη γλουταθειόνη και από αναστολείς ελευθέρων ριζών υδροξυλίου, κάτι που φανερώνει τη συμμετοχή της συγκεκριμένης ρίζας και στην υπεροξείδωση λιπιδίων (Keizer et al., 1990). Εικόνα : Παραγωγή ελευθέρων ριζών από το σύμπλοκο Dox-Fe. Στην παρουσία αναγωγικού συστήματος, το σύμπλοκο Dox-Fe 2+ αντιδρά με το μοριακό οξυγόνο ή το υπεροξείδιο του υδρογόνου δίνοντας ρίζες υπεροξειδίου και υδροξυλίου αντίστοιχα ενώ το ίδιο οξειδώνεται στο σύμπλοκο Dox-Fe 3+. Το σύμπλοκο αυτό μπορεί να αναχθεί στην αρχική του μορφή είτε ενζυμικά από την αναγωγάση του κυτοχρώματος Ρ-450 (Fp), είτε μη ενζυμικά από τη γλουταθειόνη. Όταν δεν υπάρχει διαθέσιμο κάποιο αναγωγικό σύστημα, το σύμπλοκο Dox-Fe 3+ ανάγει το σίδηρο σε Fe 2+ με ταυτόχρονη οξείδωση του δακτυλίου υδροκινόνης, οδηγώντας στο σχηματισμό μιας οξειδωμένης ρίζας ημικινόνης. Εναλλακτικά η αναγωγή του σιδήρου μπορεί να επιτευχθεί και με οξείδωση της πλευρικής αλυσίδας στον άνθρακα 9 (τροποποίηση από Keizer et al., 1990). Σύμφωνα με το δεύτερο τρόπο, η δοξορουβικίνη έχει την ιδιότητα να δημιουργεί σύμπλοκα με ιόντα σιδήρου (Dox-Fe 3+ ). Το σύμπλοκο αυτό μπορεί να επάγει την παραγωγή ελευθέρων ριζών μέσω δύο μηχανισμών (εικόνα ): i Ο πρώτος μηχανισμός συμβαίνει παρουσία κάποιου αναγωγικού συστήματος. Σ αυτή την περίπτωση το σύμπλοκο Dox-Fe 3+ ανάγεται σε Dox-Fe 2+. Το τελευταίο αντιδρά με το οξυγόνο δίνοντας ρίζες 27

29 υπεροξειδίου ( * O 2 ), οι οποίες αν αντιδράσουν με την υπεροξειδική δισμουτάση δίνουν υπεροξείδιο του υδρογόνου ( O H 2 2 ), το οποίο μπορεί επίσης να αντιδράσει με το σύμπλοκο Dox-Fe 2+ και να δώσει ρίζες υδροξυλίου. ii Όταν απουσιάζει το αναγωγικό σύστημα, τότε το σύμπλοκο Dox-Fe 3+ μπορεί να προκαλέσει αναγωγή στο Fe 3+ μέσω μιας ενδομοριακής οξειδοαναγωγικής αντίδρασης με ταυτόχρονη οξείδωση είτε της πλευρικής αλυσίδας στον άνθρακα 9, είτε του δακτυλίου υδροκινόνης (δακτύλιος Β). Το σύμπλοκο που δημιουργείται μπορεί να οξειδωθεί όπως και πριν δίνοντας ρίζες υπεροξειδίου και υδροξυλίου. Τα σύμπλοκα Dox-Fe προσδένονται ισχυρά στο DNA και επιπλέον διατηρούν την ιδιότητά τους να παράγουν ελεύθερες ρίζες. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή ελευθέρων ριζών πολύ κοντά στο DNA. Οι ελεύθερες ρίζες δρουν πάνω στο γενετικό υλικό προκαλώντας ρήγματα στις αλυσίδες του DNA (Keizer et al., 1990). Αξίζει να σημειωθεί ότι ο οξειδοαναγωγικός κύκλος και η παραγωγή ελευθέρων ριζών μπορεί να συνδέεται άμεσα και με την επαγωγή της απόπτωσης (μηχανισμός που θα αναλυθεί παρακάτω), αφού οι ελεύθερες ρίζες του υπεροξειδίου και το υπεροξείδιο του υδρογόνου ενεργοποιούν το γονίδιο Bax (μέσω της ενεργοποίησης του γονιδίου p53), το οποίο στη συνέχεια οδηγεί σε απόπτωση. Οι ίδιες ενώσεις μπορεί να αυξάνουν άμεσα και τη διαπερατότητα της μεμβράνης των μιτοχονδρίων κάτι που ενισχύει τη θεωρία ότι η δοξορουβικίνη μπορεί να επάγει κατευθείαν την έξοδο του κυτοχρώματος C από τα μιτοχόνδρια και ως εκ τούτου να επάγει την απόπτωση ανεξάρτητα από το επίπεδο βλάβης στο γενετικό υλικό, τα επίπεδα του p53 ή τα μονοπάτια ενεργοποίησης της απόπτωσης. Επίσης η παρατήρηση ότι η λιποδιαλυτή C 7 -δεοξυαγλυκόνη συσσωρεύεται στη μεμβράνη των μιτοχονδρίων με αποτέλεσμα να ενισχύεται η απόκλιση των ηλεκτρονίων από το κανονικό μονοπάτι της αναπνευστικής αλυσίδας προς την παραγωγή ελευθέρων ριζών με συνέπεια την ενίσχυση της δυσλειτουργίας των μιτοχονδρίων, ενισχύει ακόμα περισσότερο την παραπάνω θεωρία (Minotti et al., 2004). 28

30 Εικόνα α: Μηχανισμός λειτουργίας της τοποϊσομεράσης Ι (τροποποίηση από Alberts et al., 2002). Εικόνα β: Μηχανισμός λειτουργίας της τοποϊσομεράσης ΙΙ (τροποποίηση από Alberts et al., 2002) Αναστολή της τοποϊσομεράσης ΙΙ Ένα βασικό πρόβλημα στην αντιγραφή του DNA είναι η ύπαρξη των υπερελίκων. Η κίνηση της διχάλας αντιγραφής δημιουργεί υπερέλικες στη μη αντιγραφόμενη περιοχή του DNA μπροστά από τη διχάλα. Υπολογίζεται ότι για κάθε 10 ζευγάρια βάσεων που πολυμερίζονται στη διχάλα αντιγραφής, θα πρέπει το γονικό δίκλωνο μόριο να κάνει μια περιστροφή γύρω από τον άξονά του για να μην υπερελικωθεί. Στο επίπεδο του χρωμοσώματος αυτό σημαίνει ότι το χρωμόσωμα θα πρέπει να περιστρέφεται αστραπιαία δεδομένου ότι η αντιγραφή είναι μια πολύ γρήγορη διαδικασία. Κάτι τέτοιο όμως δεν 29

31 συμβαίνει διότι δεν το επιτρέπει η όλη τοπολογία των χρωμοσωμάτων και επιπροσθέτως απαιτούνται μεγάλα ποσά ενέργειας (Μαρμάρας B. και Λαμπροπούλου Μ. 2000). Οι τοποϊσομεράσες, είναι μια κατηγορία πρωτεϊνών, οι οποίες τροποποιούν την τοπολογία του DNA χωρίς να μεταβάλουν τη δομή και την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων (Minotti et al., 2004). Η τοποϊσομεράση Ι (εικόνα α) χαρακτηρίζεται από την ικανότητά της να προκαλεί ρήγματα στον ένα κλώνο του DNA ανακουφίζοντας το μόριο από τις τάσεις που δημιουργούνται εξαιτίας της υπερελίκωσης. Στη συνέχεια λειτουργεί ως λιγάση και επαναδημιουργεί το φωσφοδιεστερικό δεσμό. Συγκεκριμένα, μόλις κόψει τον ένα κλώνο, ενώνεται ομοιοπολικά με το ένα τμήμα του μορίου μέσω μιας φωσφορικής τυροσίνης, η οποία προκύπτει από μια τυροσίνη του ενζύμου και από τη φωσφορική ρίζα του νουκλεοτιδίου που ελευθερώνεται με το κόψιμο. Ακολούθως το άλλο τμήμα του κομμένου κλώνου περιελίσσεται μέχρι το μόριο να ανακουφιστεί από την υπερελίκωση και μετά δημιουργείται πάλι ο φωσφοδιεστερικός δεσμός. Η τοποϊσομεράση ΙΙ (εικόνα β) χαρακτηρίζεται από την ικανότητα να προκαλεί ρήγματα και στους δύο κλώνους ενός μορίου DNA, να περνά τμήμα ενός άλλου μορίου DNA μέσα από το πρώτο και στη συνέχεια να επανενώνει τα δύο άκρα του πρώτου μορίου (Μαρμάρας B. και Λαμπροπούλου Μ. 2000). Η δοξορουβικίνη (και γενικά οι ανθρακυκλίνες) δρουν στο μόριο της τοποϊσομεράσης ΙΙ και σταθεροποιούν μια ενδιάμεση κατάσταση, κατά την οποία οι δύο κλώνοι του DNA είναι κομμένοι και ομοιοπολικά συνδεδεμένοι με περιοχές τυροσίνης στο μόριο της τοποϊσομεράσης ΙΙ, εμποδίζοντας με αυτό τον τρόπο την επανένωση των δύο κλώνων. Η δομή της δοξορουβικίνης, έχει σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό και τη σταθερότητα του τριμερούς συμπλόκου δοξορουβικίνη DNA τοποϊσομεράση ΙΙ. Το επίπεδο σύστημα δακτυλίων είναι σημαντικό για την παρεμβολή στο DNA, καθώς οι δακτύλιοι Β και Γ συμπλέκονται με τα γειτονικά ζεύγη βάσεων και ο δακτύλιος Δ διέρχεται του σημείου παρεμβολής. Οι περιοχές του μορίου που δεν συμμετέχουν στην παρεμβολή (ο δακτύλιος Α και το σάκχαρο), φαίνεται να παίζουν 30

32 σημαντικό ρόλο στη σταθεροποίηση του συμπλόκου. Συγκεκριμένα, το σάκχαρο daunosamine εντοπίζεται στη μικρή αύλακα του DNA και είναι ένας καθοριστικός παράγοντας για την ενεργότητα των ανθρακυκλινών ως αναστολείς της τοποϊσομεράσης ΙΙ. Αυτό φάνηκε από πειράματα στα οποία παρατηρήθηκε αύξηση της αναστολής μετά από απομάκρυνση της αμινομάδας στον άνθρακα 3 του σακχάρου. Επιπλέον έχει αναφερθεί ότι η δοξορουβικίνη αναστέλει και την τοποϊσομεράση Ι. Παρόλα αυτά έχει βρεθεί ότι ο θάνατος των κυττάρων είναι σχετικά ανεξάρτητος από τη συγκέντρωση της τοποϊσομεράσης Ι στο κύτταρο, κάτι που υποδηλώνει ότι η αναστολή της τοποϊσόμερασης Ι από τη δοξορουβικίνη είναι ένας δευτερεύοντας μηχανισμός δράσης της ένωσης. Τη βλάβη που προκαλείται στο DNA ως αποτέλεσμα της αναστολής της τοποϊσομεράσης ΙΙ, ακολουθεί διακοπή της αύξησης στη φάση G 1 και G 2 του κυτταρικού κύκλου και τέλος ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος. Αξίζει να σημειωθεί ότι κάποια καρκινικά κύτταρα μπορεί να γίνουν ανθεκτικά στη δράση της δοξορουβικίνης λόγω μεταβολής στη λειτουργία του γονιδίου ή της πρωτεΐνης της τοποϊσομεράσης ΙΙ (Minotti et al., 2004) Απόπτωση Η απόπτωση είναι μια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου η οποία ρυθμίζεται από φυσιολογικούς και γενετικούς παράγοντες και έχει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, τη μορφογένεση, το ρυθμό αντικατάστασης των κυττάρων, την ορμονοεξαρτώμενη ατροφία οργάνων και στη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος. Κατά την διάρκεια αυτής της διαδικασίας, η χρωματίνη στον πυρήνα συμπυκνώνεται και προσκολλάται στην πυρηνική μεμβράνη. Το κύτταρο και το κυτταρόπλασμα συρρικνώνονται και στη συνέχεια τεμαχίζονται. Επίσης τεμαχίζεται και ο πυρήνας, αλλά τα υπόλοιπα κυτταρικά οργανίδια παραμένουν άθικτα μέχρι το τελευταίο στάδιο της απόπτωσης. Τα τεμάχια που κυττάρου, τα οποία καλούνται και αποπτωτικά σωμάτια, περικλείονται από την κυτταρική μεμβράνη, έτσι ώστε τα περιεχόμενα 31

33 του κυττάρου να μην διαχυθούν στο περιβάλλον του κυττάρου. Τα αποπτωτικά σωμάτια απομακρύνονται με κυτταροφαγία. Ένα χαρακτηριστικό της απόπτωσης είναι ότι δεν προκαλεί φλεγμονή στους γύρω ιστούς. Κάτι τέτοιο συμβαίνει κατά τη διάρκεια της νέκρωσης, μιας άλλης μορφής κυτταρικού θανάτου, κατά την οποία διαρρηγνύεται η κυτταρική μεμβράνη και τα κυτταρικά οργανίδια απελευθερώνονται στο περιβάλλον προκαλώντας φλεγμονή. Τα τελικά μόρια τελεστές της απόπτωσης που είναι κοινοί σε όλα τα κύτταρα είναι οι κασπάσες και οι DNAάσες. Οι πρώτες προκαλούν πρωτεόλυση και οι τελευταίες θρυμματισμό του DNA (Takemura and Fujiwara, 2007). Πολλά αντικαρκινικά φάρμακα δρουν προκαλώντας απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα. Αυτό συμβαίνει μέσω δύο κυρίως οδών (εικόνα ): Οδός ανεξάρτητη από τους υποδοχείς θανάτου (DR-independent pathway intrinsic pathway) Το κρίσιμο σημείο για την επαγωγή της απόπτωσης είναι η δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων, η οποία ρυθμίζεται από την οικογένεια πρωτεϊνών Bcl-2. Η οικογένεια αυτή αποτελείται από τρεις υποοικογένειες, την υποοικογένεια ΒΗ-3 και τις υποοικογένειες των προαποπτωτικών και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών. Η έναρξη ή όχι της απόπτωσης καθορίζεται από το λόγο της συγκέντρωσης των προαποπτωτικών και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών. Τα αντικαρκινικά φάρμακα που δρουν μέσω αυτού του μονοπατιού, ενεργοποιούν τα γονίδια που εκφράζουν τις προ-αποπτωτικές πρωτεΐνες (Bax, Bak και Bad). Ενεργοποίηση του γονιδίου bax, έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της πρωτεΐνης Bax, μόρια της οποίας σχηματίζουν ομοδιμερή σύμπλοκα, τα οποία μεταφέρονται στα μιτοχόνδρια. Εκεί δρουν στο δίαυλο ιόντων VDAC (Voltage-Dependent Anion Channel), ο οποίος βρίσκεται στην εξωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C στο κυτταρόπλασμα. Το κυτόχρωμα C σχηματίζει σύμπλοκο με τις πρωτεΐνες Apaf-1 και προκασπάση 9. Το 32

34 σύμπλοκο αυτό αποτελεί το αποπτώσωμα, και ενεργοποιεί την κασπάση 9. Εικόνα : Τα δύο μονοπάτια που οδηγούν στην απόπτωση μετά από επίδραση με αντικαρκινικές ενώσεις. Κατά το μονοπάτι που εξαρτάται από υποδοχείς, επάγεται η έκφραση του γονιδίου Fas το οποίο ενεργοποιεί την κασπάση 8, η οποία ενεργοποιεί την κασπάση 3 που οδηγεί στην απόπτωση. Εναλλακτικά η κασπάση 8 μπορεί να διασπάσει την πρωτεΐνη Bid, η οποία θα σχηματίσει διμερή με την Bak (tbid-bak) με αποτέλεσμα την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C από τα μιτοχόνδρια και ένα καταρράκτη αντιδράσεων που τελικά οδηγεί σε απόπτωση. Κατά το μονοπάτι που δεν εξαρτάται από υποδοχείς, επάγεται η έκφραση του γονιδίου p53, το οποίο ενεργοποιεί το γονίδιο bax. Αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης Bax έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ομοδιμερών τα οποία δρουν στους διαύλους VDAC για να απελευθερωθεί το κυτόχρωμα C από τα μιτοχόνδρια. Μελέτες έχουν δείξει ότι η δοξορουβικίνη μπορεί να επάγει την απόπτωση είτε μέσω ενεργοποίησης του p53, του Fas ή ακόμα και μέσω αναστολής της Bcl-X L, πρωτεΐνη η οποία εμποδίζει την έξοδο του κυτοχρώματος C από τα μιτοχόνδρια (τροποποίηση από Kim et al., 2002) Οδός εξαρτωμένη από τους υποδοχείς θανάτου (DR-dependent pathway extrinsic pathway) Το μονοπάτι αυτό οδηγεί στην απόπτωση μέσω των Fas, DR4 και DR5. Ο μηχανισμός μέσω του οποίου ο Fas οδηγεί στην απόπτωση χωρίζεται σε δύο υπομονοπάτια. Κατά το πρώτο (Τύπου Ι, ή μονοπάτι 33

35 ανεξάρτητο από τα μιτοχόνδρια), διάφορα αντικαρκινικά φάρμακα επάγουν το σχηματισμό του Fas, κάτι που οδηγεί στο σχηματισμό του συμπλόκου DISC (Death-Inducing Signaling Complex). Το σύμπλοκο αυτό ενεργοποιεί την κασπάση 8 και αυτή με τη σειρά της ενεργοποιεί την κασπάση 3 με τελικό αποτέλεσμα την απόπτωση. Κατά το δεύτερο μονοπάτι (Τύπου ΙΙ, ή μονοπάτι εξαρτώμενο από τα μιτοχόνδρια), η επαγωγή του Fas οδηγεί σε ενεργοποίηση της κασπάσης 8, η οποία διασπά την πρωτεΐνη Bid με τελικό αποτέλεσμα την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C από τα μιτοχόνδρια και την ενεργοποίηση της απόπτωσης (Kim et al., 2002). Έχει βρεθεί ότι η δοξορουβικίνη επάγει την απόπτωση σε ενδοθηλιακά κύτταρα και καρδιομυοκύτταρα (Takemura and Fujiwara, 2007), καθώς επίσης και σε θυμοκύτταρα ποντικού και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές (Gewritz, 1999). Η δοξορουβικίνη, όπως και πολλοί άλλοι γονιδιοτοξικοί παράγοντες ενεργοποιούν την πρόσδεση της πρωτεΐνης p53 στο DNA (Minotti et al., 2004). Η πρωτεΐνη p53 πιθανώς να ενεργοποιεί το γονίδιο Bax (το οποίο φέρει μια περιοχή πρόσδεσης για την p53), το οποίο όπως έχει προαναφερθεί (εσωτερικό μονοπάτι ενεργοποίησης απόπτωσης), μετατοπίζεται στα μιτοχόνδρια (Takemura and Fujiwara, 2007). Επίσης αναστέλλει την έκφραση του γονιδίου Bcl- X L (μέλος της υποοικογένειας των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2), το προϊόν του οποίου εμποδίζει το κυτόχρωμα C να εξέλθει των μιτοχονδρίων. Μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι η δοξορουβικίνη συμμετέχει και στην ενεργοποίηση της απόπτωσης μέσω του δεύτερου μονοπατιού, αυτού δηλαδή που εξαρτάται από τους υποδοχείς θανάτου (ή εξωτερικό μονοπάτι ενεργοποίησης της απόπτωσης). Αυτό συμβαίνει μέσω της Fas πρωτεΐνης. Ένας επιπλέον σημαντικός παράγοντας αφορά στο ρόλο του p53 στη ρύθμιση της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα στα οποία έγινε επίδραση με δοξορουβικίνη. Συγκεκριμένα η ενεργοποίηση του p53 από την δοξορουβικίνη συμβάλλει στην ενεργοποίηση του γονιδίου WAF1/CIP1 p21, προϊόν του οποίου είναι ένας ισχυρός αναστολέας των cdks (Cyclin-dependent kinases) που συμμετέχουν στον έλεγχο του 34

36 κυτταρικού κύκλου και συγκεκριμένα στη μετάβαση από την φάση G 1 στην S. Έχει προταθεί ότι αυτός ο μηχανισμός, ενώ συμβάλλει στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G 1, ουσιαστικά προστατεύει τα κύτταρα από τη δράση της δοξορουβικίνης αφού τους δίνει τη δυνατότητα επιδιόρθωσης των βλαβών πριν αρχίσει ο διπλασιασμός του γενετικού υλικού. Το γεγονός αυτό ίσως να εξηγεί και την παρατήρηση ότι η ανθεκτικότητα που αναπτύσσουν ορισμένοι τύποι καρκινικών κυττάρων στη δοξορουβικίνη συνδέεται με υψηλές συγκεντρώσεις της πρωτεΐνης WAF1/CIP1 (Minotti et al., 2004). Εικόνα : Ο ρόλος του πρωτεασώματος στην μεταφορά της δοξορουβικίνης στον πυρήνα. Η δοξορουβικίνη αφού εισέλθει στο κύτταρο με απλή διάχυση, προσδένεται στο πρωτεάσωμα αναστέλλοντας παράλληλα τη λειτουργία του. Το πρωτεάσωμα μεταφέρει την δοξορουβικίνη στον πυρήνα, όπου έχει υψηλότερη χημική συγγένεια με το DNA στο οποίο και παρεμβάλλεται αναστέλλοντας τη σύνθεση του. Παράλληλα, η αναστολή του πρωτεασώματος οδηγεί τα κύτταρα σε απόπτωση (τροποποίηση από Kiyomiya et al., 2001) Αναστολή Πρωτεασώματος Το πρωτεάσωμα είναι ένα σύμπλοκο από κυτταροπλασματικές και πυρηνικές πρωτεάσες, οι οποίες συμμετέχουν σε μηχανισμούς 35

37 αποικοδόμησης πρωτεϊνών που δεν αποικοδομούνται στα λυσοσώματα. Το 26S πρωτεάσωμα (που αποτελείται από έναν 20S πυρήνα και δύο 19S καλύμματα), έχει σημαντικό ρόλο στο ρυθμό ανακύκλωσης των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών πρωτεϊνών, καθώς επίσης και στην αποικοδόμηση ρυθμιστικών πρωτεϊνών που ελέγχουν την ανάπτυξη των κυττάρων και το μεταβολισμό τους (Minotti et al., 2004). Τα πρωτεασώματα εντοπίζονται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα και τελευταία έχει δειχθεί ιδιαίτερο ενδιαφέρον στο ρόλο που έχουν στη μεταφορά της δοξορουβικίνης στον πυρήνα. Αυτό συμβαίνει ως εξής (εικόνα ): Αρχικά η δοξορουβικίνη εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα με παθητική διάχυση. Εκεί έχει υψηλή χημική συγγένεια με την υπομονάδα 20S του πρωτεασώματος με την οποία και συνδέεται, σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο. Το σύμπλοκο που σχηματίζεται μετατοπίζεται στον πυρήνα μέσω των πυρηνικών πόρων και με μια διαδικασία που απαιτεί ενέργεια από το ATP. Στον πυρήνα η δοξορουβικίνη έχει υψηλότερη χημική συγγένεια με το DNA σε σχέση με το πρωτεάσωμα. Έτσι αποσυνδέεται από το πρωτεάσωμα και παρεμβάλλεται στο DNA προκαλώντας αναστολή της σύνθεσής του. Επιπλέον, όταν η δοξορουβικίνη είναι συνδεδεμένη στο πρωτεάσωμα, αυτό παρουσιάζει μικρή ικανότητα πρωτεϊνόλυσης. Αυτή η αναστολή του πρωτεασώματος, έχει ως αποτέλεσμα τη μη αποικοδόμηση ρυθμιστικών αλλά και μεταλλαγμένων πρωτεϊνών και ως εκ τούτου επαγωγή της απόπτωσης (Kiyomiya at al., 2001). Σε μετασχηματισμένα κύτταρα και διαιρούμενους ιστούς, παρατηρείται μια συσσώρευση του πρωτεασώματος στον πυρήνα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ελάττωση της συγκέντρωσής του στο κυτταρόπλασμα και συνεπώς μειωμένη μεταφορά της δοξορουβικίνης στον πυρήνα. Το γεγονός αυτό ίσως να εξηγεί και το λόγο που παρατηρείται μείωση της κυτταροτοξικότητας της δοξορουβικίνης σε 36

38 κύτταρα με αυξημένες πυρηνικές συγκεντρώσεις του πρωτεασώματος (Minotti et al., 2004) Παρεμβολή στο DNA Η δοξορουβικίνη αφού περάσει στον πυρήνα του κυττάρου προσδένεται με υψηλή χημική συγγένεια στο DNA. Αυτό συμβαίνει μέσω παρεμβολής της, μεταξύ των βάσεων του τελευταίου. Η δοξορουβικίνη παρεμβάλλεται μεταξύ της κυτοσίνης και της αμινομάδας των αλληλουχιών 5 -CGN-3 (εικόνα α). Για την παρεμβολή είναι απαραίτητη η εξωκυκλική N 2 αμίνη της γουανίνης και η αμίνη που βρίσκεται στον άνθρακα 3 του σακχάρου daunosamine. Η δοξορουβικίνη συνδέεται στον άνθρακα με ένα ομοιοπολικό δεσμό (δεσμός N-C-N, με κόκκινο χρώμα στην εικόνα α) μεταξύ της 3 αμινομάδας της daunosamine και της Ν 2 αμίνης της γουανίνης. Εικόνα α: Η δομή που προκύπτει μετά από παρεμβολή της δοξορουβικίνης στο DNA. Με μπλε χρώμα η δοξορουβικίνη, με κόκκινο ο δεσμός N-C-N και με πράσινο οι συμπληρωματικές αλυσίδες του DNA (Cutts et al., 2005). Εικόνα β: Φωτογραφία μετά από περίθλαση ακτίνων X, της παρεμβολής της Daunorubicin με το DNA. Η ομοιότητα των δύο ενώσεων μας βοηθά να καταλάβουμε που εντοπίζεται η κάθε περιοχή της δοξορουβικίνης (Cutts et al., 2005). Η περιοχή daunosamine προεξέχει στη μικρή αύλακα του DNA, ενώ ο κεντρικός άνθρακας του N-C-N δεσμού προέρχεται από τη φορμαλδεϋδη, η οποία αντιδρά με τη αμινομάδα της δοξορουβικίνης 37

39 σχηματίζοντας μια ενεργή βάση Schiff. Το σύμπλοκο DNA δοξορουβικίνη σταθεροποιείται περαιτέρω με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ της δοξορουβικίνης και του δεύτερου κλώνου του DNA (Cutts et al., 2005). Η φορμαλδεΰδη που συμμετέχει στην παρεμβολή της δοξορουβικίνης στο DNA μπορεί να παράγεται από την ίδια την δοξορουβικίνη. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι αντιδράσεις παραγωγής ελευθέρων ριζών στις οποίες διαμεσολαβούν ιόντα σιδήρου, έχουν ως αποτέλεσμα και την παραγωγή φορμαλδεΰδης από διάφορες κυτταρικές πηγές άνθρακα όπως είναι τα λιπίδια (Minotti et al., 2004). Παρά την ευρεία κλινική χρήση της δοξορουβικίνης και παρά το μεγάλο αριθμό μελετών και την πρόοδο που σημειώθηκε όσον αφορά στη διαλεύκανση των μηχανισμών δράσης της, υπάρχουν ακόμα πολλά ερωτήματα που πρέπει να απαντηθούν. Για το λόγο αυτό η χορήγησή της περιορίζεται σε συγκεντρώσεις των mg/m 2. Η Χορήγηση του φαρμάκου σε μεγαλύτερες δόσεις, ενώ θα είχε μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα κατά των καρκινικών κυττάρων, έχει ως αποτέλεσμα το θάνατο του ασθενούς λόγω τοξικότητας στα καρδιακά κύτταρα που προκαλεί συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια. Έτσι τα τελευταία 20 χρόνια παρατηρείται μια προσπάθεια εύρεσης ενός αναλόγου της δοξορουβικίνης (και της daunorubicin) που να πλεονεκτεί έναντι αυτής. Η προσπάθεια αυτή είχε ως αποτέλεσμα 2000 ανάλογα της δοξορουβικίνης και της daunorubicin, από τα οποία όμως ελάχιστα είναι αυτά που πλεονεκτούν έναντι των δύο ενώσεων σε λίγα σημεία τα οποία δεν θα δικαιολογούσαν αντικατάσταση των δύο αυτών ενώσεων. Το πιο ενθαρρυντικό ίσως στοιχείο που προέκυψε από τη μελέτη των μηχανισμών δράσης της δοξορουβικίνης αλλά και άλλων ανθρακυκλινών είναι η παρατήρηση ότι οι μηχανισμοί οι οποίοι ευθύνονται για την πρόκληση κυτταροτοξικότητας στην καρδιά, διαφέρουν από αυτούς που ευθύνονται για την κυτταροτοξικότητα στους καρκινικούς όγκους (Minotti et al., 2004). Αυτό αυξάνει τις ελπίδες ότι μπορεί να βρεθούν αποτελεσματικότερες στρατηγικές χρήσης της δοξορουβικίνης, οι οποίες να μειώνουν την κυτταροτοξικότητα στην 38

40 καρδιά χωρίς να μειώνεται η αποτελεσματικότητα κατά των καρκινικών κυττάρων. Επίσης συνεχίζονται και οι προσπάθειες ανακάλυψης ενός καλύτερου αναλόγου της δοξορουβικίνης που θα είχε τις παραπάνω ιδιότητες. 39

41 40

42 2. Μηχανισμοί Επιδιόρθωσης DNA 2.1. Γενικά Η ακεραιότητα του γενετικού υλικού βρίσκεται συνεχώς υπό την απειλή παραγόντων, οι οποίοι μπορούν να το καταστρέψουν. Ο αριθμός των βλαβών που συμβαίνουν καθημερινά στο DNA σε κάθε κύτταρο υπολογίζεται από μέχρι (Lodish et al., 2003). Οι βλάβες αυτές μπορεί να προέρχονται είτε από ενδογενείς είτε από εξωγενείς πηγές. Από τις ενδογενείς πηγές, ίσως η πιο διαδεδομένη είναι η θερμότητα του σώματος. Λόγω της θερμοδυναμικής αστάθειας του DNA, μπορούν να συμβούν διάφορες μεταβολές σ αυτό, ακόμα και στην κανονική θερμοκρασία του σώματος. Για παράδειγμα ο Ν-γλυκοσιδικός δεσμός μεταξύ μιας πουρίνης ή πυριμιδίνης και της δεοξυριβόζης είναι σχετικά ασταθής και μπορεί εύκολα να σπάσει στους 37 ο C. Με αυτό τον τρόπο προκύπτουν απουρινικές ή απυριμιδινικές θέσεις (AP sites). Άλλες μορφές μεταβολών στο DNA που προκαλούνται από αυξημένη θερμότητα είναι οι απαμινώσεις της κυτοσίνης σε ουρακίλη και σε μικρότερο βαθμό της αδενίνης και γουανίνης σε υποξανθίνη και ξανθίνη αντίστοιχα. Μια δεύτερη ενδογενής πηγή βλαβών είναι η παραγωγή ελευθέρων ριζών κατά τη διάρκεια των διαφόρων μεταβολικών διαδικασιών του κυττάρου. Οι κυριότερες ελεύθερες ρίζες που παράγονται κατά τη διαδικασία αυτή είναι οι ελεύθερες μορφές οξυγόνου και οι ρίζες υδροξυλίου. Οι εξωγενείς πηγές βλαβών στο γενετικό υλικό εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από τον τρόπο ζωής, τον χώρο εργασίας και τον τόπο διαμονής των ατόμων. Σ αυτές περιλαμβάνονται μια ποικιλία φυσικών μεταλλαξιγόνων και καρκινογόνων παραγόντων, όπως είναι οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες, η αφλατοξίνη Β 1 και οι νιτροζαμίνες που περιέχονται στις τροφές, το βενζο[α]πυρένιο και άλλοι καρκινογόνοι παράγοντες που υπάρχουν στον καπνό του τσιγάρου καθώς επίσης και η υπεριώδης και ιονίζουσα ακτινοβολία (Mullaart et al., 1990). 41