igenetics Mια Μεντελική προσέγγιση

Transcript

1 igenetics Mια Μεντελική προσέγγιση

2 Κεφάλαιο 20 (+ κεφ. 16, Hartwell) Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Πυρίνας ανθρώπινου μεσοφασικού κυττάρου στον οποίο παρατηρούμε, με ανοσοφθορισμό, τη διάστικτη κατανομή της απακετυλάσης των ιστονών (HDAC). 2

3 Ομοιότητες και διαφορές στη γονιδιακή ρύθμιση μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών κυττάρων Ομοιότητες: 1.Αλληλουχίες υποκινητών 2.Ρυθμιστικές αλληλουχίες (καθορίζουν την απόκριση του γονιδίου σε μόρια-τελεστές) 3.Ρυθμιστικές πρωτείνες (ενεργοποιητές και καταστολείς με συγκεκριμένες επικράτειες πρόσδεσης) Διαφορές: 1.Δομή χρωματίνης 2.Διαδικασία ωρίμανσης μεταγράφων (5 καλύπτρα, 3 ουρά polya μάτισμα) 3.Εναλλακτικό μάτισμα 4.Μεταφορά του mrna στο κυτταρόπλασμα (υπόκειται σε ρύθμιση) 5.Οπερόνια (μόνο στο c. elegans στα ευκαρυωτικά) 3

4 ΕΙΚΟΝΑ 20.1 Ένα οπερόνιο του C. elegans και η δημιουργία μονογονιδιακών mrna από το αρχικό ενιαίο πολυγονιδιακό mrna με trans-μάτισμα και κοπή/πολυαδενυλίωση. -Ενιαίο pre-mrna -To pre-mrna κόβεται με διαδικασία ματίσματος στο 5 άκρο. -Το Spliced-Leader RNA (100 bp, ριβονουκελοπρωτεινικό σωμάτιο). -Το SL-RNA συρράπτεται σε κάθε 5 άκρο). - και θεωρείται το πρώτο εξόνιο. 15% των γονδίων στο σκουλήκι φέρουν SL-RNA (2.600 γονίδια). Κάθε οπερόνο = ~2,6 γονίδια Αλλά δεν σχετίζονται με το ίδιο βιοχημικό μονοπάτι 4

5 ΕΙΚΟΝΑ 20.2 Επίπεδα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Πολλά διαφορετικά κύτταρα, ένας ιστός, ένα όργανο, ένας οργανισμός 5

6 Cis-δρώντα στοιχεία και trans-δρώντα γονιδιακά προιόντα Cis-δρώντα στοιχεία: Trans-δρώντα γονιδιακά προιόντα: 6

7 Αναδιαμόρφωση χρωματίνης: καταστολή γονιδιακής έκφρασης -Οι ιστόνες καταστέλλουν τη γονιδιακή έκφραση. -Οικονομία στη καταστολή γονιδίων μέσω ιστονών αντί ανεξάρτητων καταστολέων -Τα περισσότερα γονίδια βρίσκονται εκεί που το χρωμόσωμα είναι λιγότερο σπειρωμένο. -DNaseI: Υπερευαίσθητες θέσεις/περιοχές (συνήθως ανοδικά της έναρξης μεταγραφής). -Πείραμα (για τη δράση των ιστονών): 1.DNA + πρωτείνες υποκινητών + ιστόνες (ανταγωνίζονται) 2.DNA + πρωτείνες υποκινητών + μετά ιστόνες (δεν ανταγωνίζονται) 3.DNA + πρωτείνες υποκινητών + ενισχυτών + ιστόνες (ανταγωνίζονται) 7

8 Αναδιαμόρφωση χρωματίνης: ενεργοποίηση γονιδιακής έκφρασης Αναδιαμόρφωση χρωματίνης: τροποποίηση της δομής τη χρωματίνης στη περιοχή του υποκινητή. -Δύο κατηγορίες πρωτεινικών συμπλόκων αναδιαμορφώνουν τη χρωματίνη: 1.Ενζυμα που ακετυλιώνουν ή απακετυλιώνουν τις πυρηνικές ιστόνες. (Histone Acetyl Transferases: HATs). Η προσθήκη ακετυλομάδων εξουδετερώνει το θετικό φορτίο των λυσινών. Η συγγένεια με το DNA χάνεται προοδευτικά. 8

9 Αναδιαμόρφωση χρωματίνης: ενεργοποίηση γονιδιακής έκφρασης Αναδιαμόρφωση χρωματίνης: τροποποίηση της δομής τη χρωματίνης στη περιοχή του υποκινητή. -Δύο κατηγορίες πρωτεινικών συμπλόκων αναδιαμορφώνουν τη χρωματίνη: 2. ATP εξαρτώμενα σύμπλοκα αναδιαμόρφωσης νουκλεοσωμάτων. SWI + SNF: αποτελούν υπομονάδες του ίδιου συμπλόκου. Χρησιμοποιούν ATP για να επηρεάζουν την έκφραση πολλών γονιδίων μέσω της αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης. 9

10 Εκτός από τη διαμόρφωση χρωματίνης: Ενεργοποίηση της μεταγραφής από ενεργοποιητές και συνεργοποιητές Τρεις κατηγορίες πρωτεινών που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση της μεταγραφής: 1.Γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες: αναγκαίοι και επαρκείς για τα βασικά επίπεδα της μεταγραφής. 2.Ενεργοποιητές: δύο επικράτειες (α. πρόσδεσης στο DNA και β. επικράτεια ενεργοποίησης ώστε να συνδέονται μεταξύ τους). Συχνά είναι ομοδιμερή. 3.Συνεργοποιητές: μεγάλα σύμπλοκα που δεν προσδένονται απευθείας στο DNA αλλά αλληλεπιδρούν με ενεργοποιητές και γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες. 10

11 ΕΙΚΟΝΑ 20.3 Ρύθμιση της αρχιτεκτονικής δομής της χρωματίνης από (α) ακετυλάσες ιστονών και (β) σύμπλοκα αναδιαμόρφωσης νουκλεοσωμάτων. Και στις δύο περιπτώσεις, το αποτέλεσμα είναι η πρόσβαση του μεταγραφικού μηχανισμού στον υποκινητή. 11

12 ΕΙΚΟΝΑ 20.4 Ενεργοποίηση της μεταγραφής από γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες, ενεργοποιητές και ένα συνενεργοποιητή (στην περίπτω ση αυτή ονομάζεται Mediator). TBP, TATA Binding Protein = πρωτεΐνη πρόσδεσης στο TATA. CTD, C-Terminal Domain (tail) of RNA polymerase II = καρβοξυτελική επικράτεια (ουρά) της RNA πολυμεράσης II. 12

13 Ενεργοποίηση της μεταγραφής

14 TFIID TAF: TATA associated factors

15 ΕΙΚΟΝΑ 20.5 Παραδείγματα δομικών μοτίβων των επικρατειών πρόσδεσης στο DNA που εντοπίζονται σε πρωτεΐνες όπως οι μεταγραφικοί παράγοντες. α) β) γ) Μοτίβο «έλικαστροφή-έλικα» Μοτίβο «δάκτυλος ψευδαργύρου» Μοτίβο «φερμουάρ λευκινών»» 15

16 ΕΙΚΟΝΑ 20.6 Συνδυαστική γονιδιακή ρύθμιση. Θεωρητικό παράδειγμα συνδυαστικής ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης κατά το οποίο (α) η μεταγραφή του γονιδίου A ρυθμίζεται από τους ενεργοποιητές 1, 2, 3 και 4 και (β) η μεταγραφή του γονιδίου B ρυθμίζεται από τους ενεργοποιητές 2, 4 και 6. 16

17 Οι καταστολείς ανταγωνίζονται τη δράση των ενεργοποιητών igenetics 17

18 ΕΙΚΟΝΑ 20.7 Η ρύθμιση του καταβολισμού της γαλακτόζης στους μύκητες. (α) Η οργάνωση των δομικών γονιδίων του μύκητα GAL1, GAL7 και GAL10 στο χρωμόσωμα II. (β) Καταστολή της μεταγραφής των γονιδίων απουσία γαλακτόζης. (γ) Ενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων παρουσία γαλακτόζης. Η UAS δεν είναι ενισχυτής γιατί δρα μόνο όταν βρίσκεται άνωθεν του γονιδίου που ρυθμίζει 18

19 ΕΙΚΟΝΑ 20.7 Η ρύθμιση του καταβολισμού της γαλακτόζης στους μύκητες. (α) Η οργάνωση των δομικών γονιδίων του μύκητα GAL1, GAL7 και GAL10 στο χρωμόσωμα II. (β) Καταστολή της μεταγραφής των γονιδίων απουσία γαλακτόζης. (γ) Ενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων παρουσία γαλακτόζης. 19

20 Μηχανισμοί δράσης των πολυπεπτιδικών ορμονών και των στεροειδών ορμονών.

21 ΕΙΚΟΝΑ 20.9 Δομές μερικών στεροειδών ορμονών των θηλαστικών. (α) Η υδροκορτιζόνη συμμετέχει στη ρύθμιση του μεταβολισμού υδατανθράκων και πρωτεϊνών. (β) Η αλδοστερόνη ρυθμίζει την ισορροπία αλάτων και νερού. (γ) Η τεστοστερόνη παίζει σημαντικό ρόλο στη δημιουργία και στη διατήρηση των αρσενικών φυλετικών χαρακτηριστικών. (δ) Η προγεστερόνη, μαζί με τα οιστρογόνα, προετοιμάζει και διατηρεί την εσωτερική επένδυση της μήτρας για την εμφύτευση ενός εμβρύου. 21

22 22

23 ΕΙΚΟΝΑ Μοντέλο για τη δράση της γλυκοκορτικοειδούς ορμόνης σε κύτταρα θηλαστικών. Hsp90: μεγαλομοριακό σύμπλοκο που καλείται συνοδός (chaperone). HBD: horm. binding domain BD: binding domain AD: activation domain 23

24 ΕΙΚΟΝΑ Χημικοί τύποι πέντε φυτοορμονών. Αιθυλένιο: ωρίμανση καρπών, Γιββερελλίνες: ενεργοποίηση της μεταγραφής 24

25 ΕΙΚΟΝΑ Επίδραση των γιββερελλινών στη βλάστηση σπερμάτων κριθαριού. 25

26 ΕΙΚΟΝΑ Αποσιώπηση γονιδίων σε ένα τελομερές του μύκητα. Αποσιώπηση γονιδίων: ένα γονίδιο καθίσταται μεταγραφικά ανενεργό λόγω της θέσης του στο γονιδίωμα (ετεροχρωματίνη) και όχι λόγω κάποιου καταστολέα. RAP1: Repressor Activator Protein gene: προσδένεται σε τελομερικές επαναλήψεις και ενεργοποιεί τη καταστολή στρατολογώντας τις Sir2p, 3p και 4p. SIR: Silent Information Regulation Gene: Sir2p: απακετυλάση Η εξάπλωση της αποσιώπησης περιορίζεται από κάποιο σημείο επειδή την αναχαιτίζει μια άλλη τροποποίηση ιστονών (μεθυλίωση των Η3 από τις Histone Methyltransferases)

27 ΕΙΚΟΝΑ Μετατροπή της κυτοσίνης του DNA σε 5-μεθυλοκυτοσίνη με τη δράση του ενζύμου DNA μεθυλάση. 27

28 ΕΙΚΟΝΑ Επίδραση της 5-μεθυλοκυτοσίνης στην πέψη του DNA με HpaII και MspI. 28

29 Το γονιδιακό εντύπωμα Κύρια σημεία: 1.Η έκφραση ορισμένων αυτοσωμικών γονιδίων καθορίζεται από το αν αυτά κληρονομούνται από το πατέρα ή τη μητέρα. 2. Η αλληλουχία του DNA παραμένει αμετάβλητη. Καλείται «Επιγενετική κληρονομικότητα». 3. Οι επιγενετικές τροποιποίησηεις σβήνουν κάθε φορά στους πρώιμους γαμέτες και επαναπρογραμματίζονται (γονιδιακό εντύπωμα). 4. Η τροποποίηση αφορά στη διαφορική μεθυλίωση μεταξύ του μητρικού και πατρικού χρωμοσώματος σε συγκεκριμένες θέσεις.

30 ΕΙΚΟΝΑ Μοντέλο εντυπώματος των γονιδίων Igf2 και H19. 30

31 Μετα-μεταγραφική ρύθμιση 1. Εναλλακτική πολυαδενυλίωση: Διάφορα γονίδια μπορούν να έχουν διαφορετικές θέσεις πολυαδενυλίωσης με αποτέλεσμα τη παραγωγή διαφορετικών pre-mrna μορίων. 2. Εναλλακτικό μάτισμα: Το εναλλακτικό μάτισμα οδηγεί σε διαφορετικά λειτουργικά μόρια mrna αν και είναι μόρια που κωδικοποιούνται από το ίδιο γονίδιο. Τα προιόντα των 1 και 2 παράγουν διαφορετικές ισομορφές που ενδεχομένως να έχουν να έχουν και διαφορετικές λειτουργίες. 31

32 ΕΙΚΟΝΑ Η εναλλακτική πολυαδενυλίωση και το εναλλακτικό μάτισμα συντελούν στη σύνθεση ιστοειδικών προϊόντων από το ανθρώπινο γονίδιο της καλσιτονίνης CALC. Στο θυρεοειδή αδένα παράγεται η καλσιτονίνη, ενώ σε ορισμένους νευρώνες συντίθεται το πεπτίδιο CGRP (Calcitonin-Gene-Related Peptide, πεπτίδιο που σχετίζεται με το γονίδιο της καλσιτονίνης). Θέσεις πολυαδενυλίωσης 32

33 εναλλακτικό μάτισμα

34 Μετα-μεταγραφική ρύθμιση 3. Σταθερότητα του RNA: ρυθμός αποικοδόμησης 34

35 Μετα-μεταγραφική ρύθμιση 4. Μεταφορά των mrna από το πυρήνα στο κυτταρόπλασμα Εξειδικευμένες πρωτείνες προσδένονται μόνο στα ώριμα mrna και αλληλεπιδρούν με με πρωτεινικές υπομονάδες των πυρηνικών πόρων.

36 1. Ρύθμιση της μετάφρασης των mrna στο κυτταρόπλασμα Κύρια σημεία: Ρύθμιση της μετάφρασης και μετα-μεταφραστική ρύθμιση 1.Δεν μεταφράζονται όλα τα μόρια mrna 2.Η ουρά polya ενισχύει την έναρξη της μετάφρασης 3.Ανενεργά mrna (15-90 κατάλοιπα Α) 4.Ενεργά mrna ( κατάλοιπα Α) 5.Η μείωση των Α επιτελείται από ένα ένζυμο (deadenylation enzyme). 6.Το ένζυμο αναγνωρίζει μια ρυθμιστική αλληλουχία στην στην 3 UTR. (ARE: Adenylate/uridilate (AU)-rich Element) 7.To elf4 σύμπλοκο προσδένεται στην 5 καλύπτρα. 8.Η πρωτείνη PABP (3 polyadenine tail-binding protein) προσδένεται στο 3 poly A. 9. To elf4 σύμπλοκο + PABP ανιχνεύουν το κωδικόνιο έναρξης. 36

37 Ρύθμιση της μετάφρασης και μετα-μεταφραστική ρύθμιση 2. Ρύθμιση της αποικοδόμησης των πρωτεινών The N end rule: το αμινοξύ στο αμινοτελικό άκρο χρησιμοποιείται για τη σύνδεση των ουμπικιτινών στη πρωτείνη και σχετίζεται με το χρόνο ημίσιας ζωής της 37

38 Παρεμβολή RNA (RNAi): ένας μηχανισμός αποσιώπησης της γονιδιακής έκφρασης Κύρια σημεία: 1.Ένα μικρού μήκους δίκλωνο RNA (dsrna) παρεμποδίζει την έκφραση ενός γονιδίου στόχου το οποίο έχει συμπληρωματική αλληλουχία με αυτό το dsrna. 2.Εξυπηρετεί φυσιολογικές λειτουργίες: ρύθμιση της ανάπτυξης ή προστασία ενάντια σε ιούς. 3.Ο στόχος είναι το ώριμο mrna. Δηλαδή το dsrna αντιστοιχεί σε εξόνια. 4. Λειτουργεί με ένα κοινό βασικό μηχανισμό. 38

39 ΕΙΚΟΝΑ Παρεμβολή RNA (RNAi) με βραχέα παρεμβαλλόμενα RNA (sirna). Δίκλωνα sirnas RISC* = ενεργό RNAinducing complex 3. μονόκλωνα sirnas

40 Ανάπτυξη θεραπειών που βασίζονται στη παρεμβολή RNA Σύνδεση ενός μορίου χοληστερόλης στο 3 άκρο του δίκλωνου sirna για να μην αποικοδομηθεί. Η χοληστερόλη ενσωματώνεται στο κυτταρική μεμβράνη και διευκολύνει την είσοδο του sirna Στο κυτταρόπλασμα το Dicer κόβει το sirna και Το προωθεί στο RΙSC