Κεφάλαια 8 ο Ένζυμα και κατάλυση

Transcript

1 Κεφάλαια 8 ο Ένζυμα και κατάλυση Τα ένζυμα είναι βιομόρια που μεσολαβούν στους χημικούς μετασχηματισμούς και στη μετατροπή της ενέργειας Κύρια χαρακτηριστικά τους η ισχύς και η εξειδίκευση Πλέον θα τα ταυτίζουμε με πρωτείνες (αν και δεν είναι αποκλειστικά αυτής της υφής, πχ ριβοένζυμα) Οι πρωτείνες δεσμεύουν με μεγάλη εξειδίκευση μια μεγάλη σειρά από μόρια (τα υποστρώματα), τα φέρνουν σε επαφή και τα οδηγούν σε αντίδραση, σταθεροποιώντας τις μεταβατικές καταστάσεις. Μπορεί τελικά να επιταχύνουν τις αντιδράσεις κατά ένα εκατομμύριο φορές ή και περισσότερο

2 Αύξηση της ταχύτητας επιλεγμένων αντιδράσεων από ένζυμα

3 Ακόμη και οι απλούστερες αντιδράσεις απαιτούν τη δράση των ενζύμων ώστε να προσαρμοστούν στις απαιτήσεις των βιολογικών συστημάτων Ανθρακική ανυδράση

4 Πρωτεολυτικά ένζυμα: υδρολύουν τον πεπτιδικό δεσμό in vivo, αλλά υδρολύουν και τον εστερικό in vitro Πεπτίδιο Καρβοξυλική συνιστώσα Αμινική συνιστώσα Εστέρας Οξύ Αλκοόλη

5 Εξειδίκευση της δράσης των πρωτεινασών: Θέση υδρόλυσης Α. Θρυψίνη Β. Θρομβίνη Θέση υδρόλυσης

6 Εξειδίκευση του ενζύμου Η DNA πολυμεράση είναι το ένζυμο που προσθέτει τα νουκλεοτίδια σε μια αυξανόμενη αλυσίδα DNA, με βάση την ακολουθία της αλυσίδας-εκμαγείο Κάνει λάθος περίπου μια φορά σε κάθε ένα εκατομμύριο προσθήκες Η ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΟΦΕΙΛΕΤΑΙ ΣΤΗΝ ΑΚΡΙΒΗ ΔΟΜΙΚΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΕΝΖΥΜΟΥ- ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ

7 ΕΝΖΥΜΙΚΟΙ ΣΥΜΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Η καταλυτική δράση πολλών ενζύμων εξαρτάται πολλές φορές και από μικρά μόρια που ονομάζονται συμπαράγοντες. Αποένζυμο+συμπαράγοντας = ολοένζυμο Οι συμπαράγοντες μπορεί να είναι μικρά οργανικά μόρια (τότε ονομάζονται συνένζυμα) ή μέταλλα Τα συνένζυμα που συχνά παράγονται από βιταμίνες, μπορεί να είναι χαλαρά ή σφιχτά (προσθετικές ομάδες) προσδεδεμένα με το ένζυμο

8

9 Σε πολλές αντιδράσεις πραγματοποιείται μετατροπή ενέργειας από μια μορφή σε μια άλλη. π.χ. Φωτεινή σε χημική (φωτοσύνθεση) Κάποια ένζυμα μετασχηματίζουν παρόμοια μορφές ενέργειας

10 Ονοματολογία ενζύμων - Ταξινόμηση

11 ΕΛΕΥΘΕΡΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Η μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας (ΔG) προσδιορίζει αν μια αντίδραση θα γίνει αυθόρμητα ή όχι. Γιαναγίνειαυθόρμηταπρέπειναείναιαρνητική Αν είναι μηδέν το σύστημα είναι σε ισορροπία και δεν υπάρχει μεταβολή ΗΔG είναι ανάλογη των τελικών και αρχικών ενεργειών, ανεξάρτητα από το μοριακό μηχανισμό και την πορεία της αντίδρασης ΗΔG δε δίνει πληροφορίες για την ταχύτητα με την οποία γίνεται η αντίδραση

12 Τα ένζυμα δε μεταβάλλουν τη θέση της χημικής ισορροπίας Τα ένζυμα επιταχύνουν την αντίδραση προς τις δύο κατευθύνσεις ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΕΠΙΤΑΧΥΝΟΥΝ, ΔΕ ΜΕΤΑΒΑΛΛΟΥΝΤΗΘΕΣΗΤΗΣ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ

13 Σχέση μεταβολής ελεύθερης ενέργειας και σταθεράς ισορροπίας ΔG=ΔG 0 + RTlnK eq Όπου ΔG 0 είναι η μεταβολή της πρότυπης ελέυθερης ενέργειας Από τη σχέση αυτή προκύπτει ότι σε ισορροπία (ΔG=0) Keq = 10 -ΔG 0 /1.36 Το αν θα πραγματοποιηθεί μια αντίδραση αυθόρμητα ή όχι, θα εξαρτηθεί από τις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων

14 Μια αντίδραση χημικής μετατροπής υποστρώματος S σε προιόν P γίνεται μέσω μεταβατικής κατάστασης S, η οποία διαθέτει υψηλότερη ενέργεια από τα S και P Η διαφορά Gs και Gs ονομάζεται ελεύθερη ενέργεια ενεργοποίησης και σε αυτή παρεμβαίνουν τα ένζυμα, διευκολύνοντας το σχηματισμό της

15 Τα ένζυμα φέρνουν το υπόστρωμα σε ευνοϊκό προσανατολισμό και προάγουν το σχηματισμό συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος (ES) Τα υποστρώματα συνδέονται σε μια ειδική περιοχή του ενζύμου, το ενεργό κέντρο Ποια στοιχεία μας λένε ότι υπάρχουν τα σύμπλοκα ES; 1. Η ταχύτητα αυξάνει όταν αυξάνεται η συγκέντρωση του υποστρώματος, με σταθερή την ποσότητα του ενζύμου 2. Κρυσταλλογραφία (δίνει εικόνες ενζύμων με υποστρώματα) 3. Φασματοσκοπία. Τα χαρακτηριστικά μεταβάλλονται όταν σχηματίζονται τα σύμπλοκα, ιδιαίτερα όταν τα ένζυμα έχουν έγχρωμες προσθετικές ομάδες

16 Μέγιστη ταχύτητα Ταχύτητα αντίδρασης Συγκέντρωση υποστρώματος

17 Δομή συμπλόκου υποστρώματος με κρυσταλλογραφία

18 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΕΝΕΡΓΩΝ ΚΕΝΤΡΩΝ Στο ενεργό κέντρο προσδένεται το υπόστρωμα και ο συμπαράγοντας. Περιέχει τα κατάλοιπα που συμμετέχουν στη σύνθεση ή διάσπαση δεσμών (καταλυτικές ομάδες) Είναι μια τρισδιάστατη εσοχή στην οποία συμβάλλουν κατάλοιπα από διαφορετικές περιοχές της αλληλουχίας

19 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΕΝΕΡΓΩΝ ΚΕΝΤΡΩΝ (συνέχεια) Καταλαμβάνει μικρό μέρος του συνολικού όγκου του ενζύμου. Ο υπόλοιπος όγκος δίνει την απαραίτητη δομή ώστε να δράσει το ένζυμο Το ενεργό κέντρο είναι μια σχισμή ή μια εσοχή. Συνήθως η εσοχή δεν περιέχει πολικά κατάλοιπα Τα υποστρώματα προσδένονται με ασθενείς έλξεις στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Πρόκειται για μη ομοιπολικές αλληλεπιδράσεις: ηλεκτροστατικούς δεσμούς, δεσμούς υδρογόνου, υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις και δεσμούς van der Waals. Από αυτές τις δυνάμεις συμπεραίνουμε ότι το υπόστρωμα με το ένζυμο θα πρέπει να έχουν συμπληρωματικά σχήματα. Καλή αρχικά περιγραφή η σχέση κλειδιού κλειδαριάς, αργότερα η επαγόμενη προσαρμογή

20

21 Υπόστρωμα Ενεργό κέντρο ES σύμπλοκο Ένζυμο Μοντέλου κλειδιού-κλειδαριάς: Το ενεργό κέντρο έχει συμπληρωματικό σχήμα προς το υπόστρωμα

22 Μοντέλο επαγόμενης προσαρμογής: Το ένζυμο αλλάζει σχήμα και το ενεργό κέντρο γίνεται συμπληρωματικό προς το υπόστρωμα

23 ΕΝΖΥΜΑ ΚΙΝΗΤΙΚΗ Τα ένζυμα δε μεταβάλλουν τη θέση της χημικής ισορροπίας αλλά επιταχύνουν την αντίδραση προς τις δύο κατευθύνσεις Τα ένζυμα κάνουν τις αντιδράσεις συμβατές με τις ανάγκες του οργανισμού Σημαντικός ο ρόλος του ενεργού κέντρου, που αλληλεπιδρά δομικά με το υπόστρωμα

24 Η ταχύτητα της αντίδρασης (προιόντα που σχηματίζονται στη μονάδα του χρόνου) αυξάνεται με την αύξηση του υποστρώματος, αρχικά γραμμικά και μετά σταθεροποιείται. Κ Μ = Vmax/2 K M = σταθερά Μichaelis (συγκέντρωση όπου έχουμε τη μισή ταχύτητα) Ταχύτητα αντίδρασης Συγκέντρωση υποστρώματος

25 Το σχηματιζόμενο προϊόν ως συνάρτηση του χρόνου για διάφορες αρχικές συγκεντρώσεις. Το Vo είναι η κλίση της καμπύλης. Ισορροπία Προιόν Χρόνος

26 Χρόνος Ισορροπία Συγκέντρωση

27

28 E + S K 1 K 2 ES E + P K -1 Αναζητούμε μια σχέση που να συνδέει: Ταχύτητα, συγκεντρώσεις υποστρώματος και ενζύμου Δεχόμαστε ότι στη σταθερή κατάσταση το ενδιάμεσο προϊόν δε μεταβάλλεται (ΔES=0) Τότε k 1 [E][S]=(k -1 +k 2 )[ES] ή [E][S]/[ES] = (k -1 +k 2 )/k 1 (k -1 +k 2 )/k 1 = K M (σταθερά Michaelis, με μονάδες συγκέντρωσης)

29 Η K M είναι σημαντικό χαρακτηριστικό μιας ενζυμικής αντίδρασης V o = V max [S]/[S]+K M (εξίσωση Michaelis Menten) Όταν η [S] είναι πολύ μεγάλη, Vo = V max

30

31 ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΩΝ K M καιv max Η K M ποικίλει, από 10-1 έως 10-7 Είναι συγκεκριμένη για δεδομένο υπόστρωμα και εξαρτάται από περιβαλλοντικές συνθήκες (ph, θερμοκρασία κλπ) Είναι η συγκέντρωση του υποστρώματος όπου τα μισά ενεργά κέντρα έχουν καταληφθεί

32 Οι πιο πολλές αντιδράσεις έχουν συνήθως δύο υποστρώματα και δύο προϊόντα Διαιρούνται σε δύο κατηγορίες: διαδοχικής αντικατάστασης και διπλής αντικατάστασης Στη διαδοχική αντικατάσταση όλα τα υποστρώματα συνδέονται στο ένζυμο πριν πάμε σε προϊόν (δημιουργείται τριμερές σύμπλοκο). Ησύνδεσηαυτήμπορείνα γίνεται διατεταγμένα ή τυχαία

33 Παράδειγμα διατεταγμένης διαδοχικής αντικατάστασης Γαλακτική αφυδρογονάση Πυροσταφυλικό Γαλακτικό Ένζυμο Πυροσταφυλικό Πυροσταφυλικό Γαλακτικό Ένζυμο

34 Παράδειγμα τυχαίας διαδοχικής αντικατάστασης Κινάση της κρεατίνης Κρεατίνη Φωσφοκρεατίνη Τριμερή σύμπλοκα

35 Αντιδράσεις διπλής αντικατάστασης ή πινγκ-πονγκ: Η Ασπαραγινική αμινοτρανσφεράση κλασικό παράδειγμα

36 Σε πολλές περιπτώσεις δεν ακολουθείται το μοντέλο Michaelis-Menten. Παράδειγμα τα αλλοστερικά ένζυμα, που έχουν πολλές υπομονάδες και πολλαπλά ενεργά κέντρα. Αυτά περιγράφονται από σιγμοειδείς καμπύλες

37 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ Η ενζυμική αναστολή (μέσω ειδικών μορίων ή ιόντων) αποτελεί μηχανισμό ελέγχου. Μας βοηθά να κατανοήσουμε μηχανισμούς ενζυμικής δράσης. Η αναστολή μπορεί να είναι αντιστρεπτή ή μη αντιστρεπτή. Ο μη αντιστρεπτός αναστολέας συνδέεται ομοιοπολικά ή μη με το ένζυμο αλλά πάντως πολύ ισχυρά. Έτσι η διαχωρίζεται πολύ δύσκολα από το ένζυμο. Π.χ. Η πενικιλλίνη δρα στο ένζυμο τρανσπεπτιδάση και εμποδίζει τη σύνθεση του τοιχώματος.

38 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ Στη μη αντιστρεπτή αναστολή η αξιοποιούμε την ομοιοπολική πρόσδεση για να κατανοήσουμε στοιχεία της λειτουργίας των ενζύμων. Διαιρούμε τους μη αντιστρεπτούς αναστολείς σε τρεις κατηγορίες: α. Με εξειδίκευση ομάδας, β. Ανάλογα υποστρωμάτων και γ. Αναστολείς αυτοκτονίας

39 Αναστολείς με εξειδίκευση ομάδας: Αντιδρούν με πλευρικές ομάδες των αμινοξέων του ενζύμου. Στη χυμοθρυψίνη αλλάζει μόνο μια από τις 28 Ser= ΕΝΕΡΓΗ (άρα στο ενεργό κέντρο). Επίσης ενεργή σερίνη στην ακετυλοχολινεστεράση Ακετυλοχολινεστεράση Απενεργοποιημένο ένζυμο

40 Α. Αναστολείς με εξειδίκευση ομάδας: Αντιδρούν με πλευρικές ομάδες των αμινοξέων του ενζύμου. Το ιωδοακεταμίδιο αντιδρά με ενεργές κυστείνες Ένζυμο Ιωδοακεταμίδιο Απενεργοποιημένο ένζυμο

41 Β. Ιχνηθέτες συγγένειας: Μόρια δομικά παρόμοια με το υπόστρωμα., που τροποποιούν ομοιοπολικά τα κατάλοιπα του ενεργού κέντρου. Είναι εξειδικευμένα για το ενεργό κέντρο Φυσικό υπόστρωμα χυμοθρυψίνης

42

43 Γ. Αναστολείς αυτοκτονίας ή μηχανισμού: Μόρια τροποποιημένου υποστρώματος, που προσδένονται στο ένζυμο και υφίστανται επεξεργασία όπως το υπόστρωμα. Κάποιο ενδιάμεσο που παράγεται απενεργοποιεί το ένζυμο Προσθετική ομάδα φλαβίνης, για την οξειδάση των μονοαμινών

44

45

46

47 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ Η αντιστρεπτή ενζυμική αναστολή χαρακτηρίζεται από ταχύ διαχωρισμό του συμπλόκου ένζυμο-αναστολέας. Η αντιστρεπτή αναστολή μπορεί να είναι συναγωνιστική ή μη συναγωνιστική. Στη συναγωνιστική αναστολή το ένζυμο συνδέει αναστολέα ή υπόστρωμα (ΟΧΙ ΚΑΙ ΤΑ ΔΥΟ). Ο αναστολέας συνδέεται στο ενεργό κέντρο αφού μοιάζει με το υπόστρωμα. Ο αναστολέας ελαττώνει την ταχύτητα ελαττώνοντας την αναλογία των μορίων ενζύμου που είναι συνδεδεμένα με το υπόστρωμα Η αναστολή ξεπερνιέται με την αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος

48 Υπόστρωμα Συναγωνιστικός Αναστολέας Υπόστρωμα Μη Συναγωνιστικός Αναστολέας

49 Παράδειγμα συναγωνιστικής αναστολής: Η μεθοτρεξάτη προσδένεται στην αναγωγάση του διυδροφυλλικού, καθώς παρουσιάζει ομοιότητα με το διυδροφυλλικό Μεθοτρεξάτη Διυδροφυλλικό

50 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ Στη μη συναγωνιστική αναστολή (αντιστρεπτή αναστολή) το ένζυμο μπορεί να συνδέει αναστολέα και υπόστρωμα, σε διαφορετικές περιοχές. Ο αναστολέας ελαττώνει την αποτελεσματικότητα του ενζύμου. Η αναστολή ΔΕΝ ξεπερνιέται με την αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος

51 Υπόστρωμα Συναγωνιστικός Αναστολέας Υπόστρωμα Μη Συναγωνιστικός Αναστολέας