Βιοχημεία - Αρχές Βιοτεχνολογίας Εργαστηριακές ασκήσεις

Transcript

1 Βιοχημεία - Αρχές Βιοτεχνολογίας Εργαστηριακές ασκήσεις Γεώργιος Παπαδόπουλος, Καθηγητής Τμ. Τεχνολόγων Γεωπόνων Τ.Ε. Άρτα, 2015

2 Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς. Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο ΤΕΙ Ηπείρου» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

3 Εργαστήριο 5o : ΟΞΙΝΗ ΦΩΣΦΑΤΑΣΗ Βασιλική Καραγιάννη, Αγγελική Ζαρλαχά, Γεώργιος Κ. Παπαδόπουλος Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Χαρακτηριστικά του ενζύμου : Βρίσκεται στα φυτά (κυρίως στους σπόρους των φυτών) και η δραστικότητα του αυξάνεται κατά την περίοδο της βλάστησης. Βρίσκεται επίσης δε διάφορους ιστούς στα ζώα (π.χ. όξινη φωσφατάση στα οστά, στον προστάτη και αλλού) Χρησιμεύει κυρίως στην απελευθέρωση των φωσφορικών ριζών από τις οργανικές ενώσεις. Όπως είναι γνωστό, η πολύ μικρή συγκέντρωση διαλυτού φωσφόρου στο έδαφος αναγκάζει τα φυτά να αναπτύξουν αποτελεσματικούς μηχανισμούς για να απορροφηθεί ο φώσφορος ακόμη και από πολύ μικρές συγκεντρώσεις. Οπότε, η παρουσία του ενζύμου σε φυτικούς ιστούς οι οποίοι διαρκώς αυξάνονται, είναι έντονη. Δεν είναι μεταλλοένζυμο Δρα σε όξινο pη Καταλύει την ίδια αντίδραση με την αλκαλική φωσφατάση, αλλά σε όξινο ph, οπότε υπάρχει θέμα παρακολούθησης της εξέλιξης της αντίδρασης. Συνεπώς, χρησιμοποιώντας την ίδια συντομογραφία όπως και στη προηγούμενη άσκηση έχουμε, Όξινη φωσφατάση π-νο 2 -Φ-Ο-Ρ i + H 2 O π-νο 2 -Φ-ΟΗ + Ρ i ph 5,0 Σε αντίθεση με την προηγούμενη φορά που παρακολουθούσαμε την εμφάνιση κίτρινου χρώματος και κατανοούσαμε τον σχηματισμό προϊόντος (ιόν π-νιτροφαινόλης σε αλκαλικό pη), τώρα η αντίδραση προχωρά σε όξινο ph και το προϊόν που παράγεται (π-νιτροφαινόλη) είναι άχρωμο, οπότε δεν έχουμε τρόπο να διαπιστώσουμε, άμεσα και μη επεμβατικά, την πρόοδο της αντίδρασης. Ο μόνος τρόπος για να διαπιστωθεί αυτό είναι η επαγωγή της διάστασης της π-νιτροφαινόλης, δηλ. η απότομη αύξηση του ph του διαλύματος όπου λαμβάνει χώραν η αντίδραση με προσθήκη πυκνού διαλύματος NaOH. Θυμίζουμε ότι το ιόν της π-νιτροφαινόλης (π-νο 2 -Φ-Ο ) έχει κίτρινο χρώμα και απορροφά έντονα στα 405 nm (ε 405 = 18.8 x 10 3 M -1 cm -1 ). Το τίμημα όμως αυτής της παρέμβασης είναι ότι το ένζυμό μας θα απενεργοποιηθεί, γιατί δεν μπορεί να λειτουργήσει σε ακραίες αλκαλικές συνθήκες. Το όνομά του άλλωστε, παραπέμπει σε λειτουργία σε όξινο ph. Συνεπώς, σε αυτή την άσκηση θα μπορέσουμε να διαπιστώσουμε την παρουσία της συγκεκριμένης ενζυμικής δραστικότητας, δηλ. της όξινης φωσφατάσης, μόνον όταν αποφασίσουμε να σταματήσουμε την αντίδραση, μετά από ένα εύλογο χρονικό διάστημα (π.χ. 10 λεπτά). Χρειάζεται λοιπόν προσοχή σε όλα τα βήματα, διότι η όποια παράλειψη και το όποιο λάθος θα διαπιστωθεί μόνο όταν τελειώσει η αντίδραση. Τότε, ενδεχόμενα να αποφασίσει ο διδάσκων ότι πρέπει να επαναλάβετε το πείραμα, λόγω λανθασμένης προηγούμενης διαδικασίας!

4 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σκοπός της άσκησης : Μελέτη των ιδιοτήτων του ενζύμου της όξινης φωσφατάσης Σκεύη - Αντιδραστήρια 1. Ενζυμο (διάλυμα), ή φυτικός ιστός (προτιμητέος, επειδή το καθαρό ένζυμο από το εμπόριο είναι ακριβό) 2. Υπόστρωμα (π-νιτρο-φωσφορικός εστέρας) σε ταμπλέτες 3. Ρυθμιστικά διαλύματα αιθυλενοδιαμίνης-κιτρικού οξέος σε pη 5,0. (αν υπάρχει χρόνος ας παρασκευαστούν και μικροί όγκοι (5-10 ml για όλα τα τμήματα), από ρυθμιστικά διαλύματα ph 3,2, 4,2, 6,2 και 7,2). 4. Διάλυμα 5Ν NaOH 5. Διάλυμα 1 Μ, ΕDTA. 6. Γουδί, γουδοχέρι, ψαλλίδι ή χειρουργική λεπίδα-νυστέρι 7. Φασματοφωτόμετρο 8. Υδατόλουτρο, θερμαντικό 9. Δοχείο ζέσεως, δοκιμαστικοί σωλήνες, πλαστικά σωληνάκια τύπου Eppendorf, όγκου 2 ml, κυψελίδες φασματοφωτομέτρου (πλαστικές) Πορεία εργασίας Απομόνωση ενζύμου από φυτικό ιστό: ένα φυτό (π.χ. λάπατο, Rumex acetosa). Με προσοχή ξεριζώνεται ένα ολόκληρο φυτό λάπατο σε υγιή κατάσταση. Ξεχωρίζει ο διδάσκων ρίζα, βλαστό και φύλλα. Κάθε ομάδα παίρνει ένα από αυτά τα τρία τμήματα, το ζυγίσει στον ζυγό με ακρίβεια 0,01 g, κόβει τον ιστό σε πολύ μικρά τεμάχια με ψαλίδι και λεπίδα, τοποθετεί τον τεμαχισμένο ιστό σε γουδί, και προσθέτει ρυθμιστικό διάλυμα ανάλογα με τη μάζα του τεμαχισμένου ιστού (αναλογία 4-5 ml/ g ιστού). Με διαρκή τριβή του γουδοχεριού, ο ιστός σταδιακά εναιωρείται στο ρυθμιστικό διάλυμα. Με πολλή προσοχή το διαλυτό μέρος του ιστού τοποθετείται σε δοκιμαστικό σωλήνα και αυτός σε ένα στατώ σε όρθια θέση για 20 (εναλλακτικά φυγοκεντρείται το εκχύλισμα και κατακρατείται το υπερκείμενο). Παρασκευή ρυθμιστικού διαλύματος με υπόστρωμα: Η κάθε ομάδα βάζει σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα 1 ταμπλέτα υποστρώματος και 5 ml από το αντίστοιχο ρυθμιστικό διάλυμα. H διάλυση και ομογενοποίηση του διαλύματος επιτυγχάνεται με τη χρήση συσκευής Vortex. Δοκιμασία παρακολούθησης της ενζυμικής δραστικότητας: Σε διάφορους δοκιμαστικούς σωλήνες τοποθετούμε από 1 ml διαλύματος υποστρώματος και δύο ή τρεις διαφορετικούς όγκους (π.χ. 2 μl, 10 μl και 40 μl) από την κάθε πηγή φυτικού ιστού (σύνολο 6 ή 9 σωλήνες). Έχουμε αντίστοιχα τυφλά δείγματα με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος χωρίς υπόστρωμα, συν την μεγαλύτερη ποσότητα από κάθε πηγή φυτικού ιστού. Αφήνουμε όλα τα δείγματα για 10 σε θερμοκρασία δωματίου. Στα 10 προσθέτουμε 1 ml διαλύματος 5Ν NaOH (Προσοή Πολύ Καυστικό Διάλυμα!!) σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα, αναδεύουμε το περιεχόμενο με προσοχή, και όταν διαπιστώσουμε ότι έχει ομοιογενές χρώμα το μεταφέρουμε σε πλαστική κυψελίδα για μέτρηση της απορροφητικότητας στο 405 nm, στο φασματοφωτόμετρο ορατού-υπεριώδους.

5 Αν υπάρχουν περισσότερες ομάδες, μπορεί μια από αυτές να παρακολουθήσει την εξέλιξη έχοντας σε 5 δοκιμαστικούς σωλήνες την ίδια ποσότητα ενζύμου και σταματώντας την αντίδραση στα 2, 4, 6, 8 και 10. Δοκιμασία της θερμοανθεκτικότητας του ενζύμου: σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες (ή σωληνάκια Eppendorf) τοποθετούνται ποσότητες (π.χ. 40 μl) φυτικού εκχυλίσματος από τον βλαστό (έχει συνήθως τη μεγαλύτερη δραστικότητα όξινης φωσφατάσης). Οι σωλήνες ή τα σωληνάκια τοποθετούνται ένας στο υδατόλουτρο των 55 o C και ο άλλος σε δοχείο ζέσεως με νερό που κοχλάζει (αν χρησιμοποιηθούν σωληνάκια τότε είναι καλύτερα να μπουν σε αφρώδες πλαστικό υλικό ώστε να επιπλέουν). Αφήνουμε όλα τα δείγματα για 10 στην αντίστοιχη θερμοκρασία. Στα 10 αφαιρούμε προσεκτικά (με γάντια τους σωλήνες με λαβίδα τα Eppendorf) και τα αφήνουμε να επανέλθουν σε θερμοκρασία δωματίου (συνήθως σε ). Προσθέτουμε σε κάθε σωλήνα 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος και αφήνουμε για επώαση άλλα 10. Στη συνέχεια προσθέτουμε 1 ml διαλύματος 5Ν NaOH (Προσοχή Πολύ Καυστικό Διάλυμα!!) σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα, αναδεύουμε το περιεχόμενο με προσοχή, και όταν διαπιστώσουμε ότι έχει ομοιογενές χρώμα το μεταφέρουμε σε πλαστική κυψελίδα για μέτρηση της απορροφητικότητας στο 405 nm, στο φασματοφωτόμετρο ορατού-υπεριώδους. Δοκιμασία απαίτησης του ενζύμου για δισθενή-τρισθενή μεταλλικά κατιόντα: Σε 3 δοκιμαστικούς σωλήνες ή σωληνάκια Eppendorf, προσθέτουμε ικανή ποσότητα ενζύμου από βλαστό (π.χ. από 40 μl) και 1 μl, 5 μl και 15 μl από το διάλυμα 1 Μ ΕDTA, με απαλή ανάδευση ώστε να επέλθει μείξη. Αφήνουμε τα δείγματα να επωαστούν για 20, αρκετό χρόνο ώστε το EDTA να μπορέσει να αφαιρέσει τυχόν δισθενή ή τρισθενή κατιόντα που είναι δεσμευμένα στο ένζυμο. Μετά 20 προσθέτουμε σε κάθε σωλήνα 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος και αφήνουμε για επώαση άλλα 10. Στη συνέχεια προσθέτουμε 1 ml διαλύματος 5Ν NaOH (Προσοχή Πολύ Καυστικό Διάλυμα!!) σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα, αναδεύουμε το περιεχόμενο με προσοχή, και όταν διαπιστώσουμε ότι έχει ομοιογενές χρώμα το μεταφέρουμε σε πλαστική κυψελίδα για μέτρηση της απορροφητικότητας στο 405 nm, στο φασματοφωτόμετρο ορατού-υπεριώδους. Αναφορά αποτελεσμάτων Να κατασκευάσετε πίνακες με τα αποτελέσματά σας στην ενζυμική δοκιμασία, α. ως συνάρτηση της ποσότητας του προστιθέμενου ενζύμου από τρεις διαφορετικές πηγές του φυτικού ιστού, β. ως συνάρτηση της θερμοκρασία, και γ. ως συνάρτηση της συγκέντρωσης EDTA (δηλ. παρουσία δισθενών/τρισθενών μεταλλικών κατιόντων). Προαιρετική άσκηση, αν υπάρχει χρόνος: Εξάρτηση από το ph Σε 5 διαφορετικούς δοκιμαστικούς σωλήνες να έχετε ρυθμιστικά διαλύματα αιθυλενοδιαμίνηςκιτρικού-υποστρώματος 5 διαφορετικών τιμών ph (3,2, 4,2, 5,2, 6,2 και 7,2) στον κάθε σωλήνα προσθέτετε ίδια ποσότητα ενζύμου (π.χ. από το εκχύλισμα βλαστού του φυτού). Έχετε άλλους 5 δοκιμαστικούς σωλήνες με ρυθμιστικό διάλυμα αιθυλενοδιαμίνης-κιτρικού, χωρίς υπόστρωμα, αντίστοιχων τιμών ph, ως μάρτυρες, στους οποίους επίσης προσθέτετε την ίδια ποσότητα φυτικού εκχυλίσματος. Αφήνουμε την αντίδραση να εξελιχθεί για 10 λεπτά. Στη συνέχεια προσθέτουμε 1 ml διαλύματος 5Ν NaOH (Προσοχή Πολύ Καυστικό Διάλυμα!!) σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα, αναδεύουμε το περιεχόμενο με προσοχή, και όταν διαπιστώσουμε ότι έχει ομοιογενές χρώμα το

6 μεταφέρουμε σε πλαστική κυψελίδα για μέτρηση της απορροφητικότητας στο 405 nm, στο φασματοφωτόμετρο ορατού-υπεριώδους. Για τη συγκεκριμένη αναφορά αποτελεσμάτων, να κατασκευαστεί πίνακας Α 405 προς ph και η αντίστοιχη γραφική παράσταση Α 405 προς ph. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Πως μπορείτε να βρείτε το βέλτιστο pη που δρα ένα ένζυμο ; 2. Γιατί σε κάθε δοκιμασία ενζύμου όξινης φωσφατάσης έχουμε και τον αντίστοιχο δοκιμαστικό σωλήνα με μάρτυρα; Τι παρατηρήσατε να συμβαίνει σε τέτοιους σωλήνες; 3. Αν σας έλεγε κάποιος ότι ο ίδιος ιστός περιέχει και όξινη και αλκαλική φωσφατάση, θα μπορούσατε να μετρήσετε τις αντίστοιχες δραστικότητες με τη μεθοδολογία που αναπτύχθηκε στις Ασκήσεις 4 και 5; Τι θα μπορούσε να επηρεάσει την απάντησή σας; ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ 1. John Clark, Robert Switzer. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ. Παν/κές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο, 1992, 2 η εκτύπωση, ΙΓ Γεωργάτσου, Δ. Κυριακίδης, Τ. Γιουψάνης, κ.ά. Εργαστηριακές Ασκήσεις Βιοχημείας. Εκδόσεις Ζήτη. Θεσσαλονίκη, Kandeel M., Yosef T., Al-Julaifi M., AL-Rizki A., and Kitade Y. Chelating efficiency and mechanisms of interaction of some toxic and biologically important cations with EDTA by isothermal titration calorimetry. Life Science Journal 2013;10(4) 4. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczo, Lubert Stryer, ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, 5 η έκδοση, Α τόμος, Παν/κές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο, Βλέπε και διαδικτυακό τόπο του βιβλίου Προσεχώς κυκλοφορεί η 7 η έκδοση. 5. Διαμαντίδη Γρ., ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, 3 η έκδοση, University Studio Press, Θεσσαλονίκη, 2007/ Campbell NA, Reece JB. Βιολογία, τόμος Ι. 8 η έκδοση, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο, 2010.