ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8. Σύνθεση πρωτεϊνών, επεξεργασία και ρύθμιση της λειτουργίας τους. Δημήτρης Λιακόπουλος

Transcript

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Σύνθεση πρωτεϊνών, επεξεργασία και ρύθμιση της λειτουργίας τους Δημήτρης Λιακόπουλος

2 Μετάφραση (translation) Στάδια σχηματισμού μίας πρωτεϊνης: 1. Μετάφραση 2. Αναδίπλωση προς κατάλληλη στερεοδιαμόρφωση 3. Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (posttranslational modifications) Μετάφραση: Mεταβίβαση γενετικής πληροφορίας από mrna σε πρωτεΐνη Τόπος: Κυτταρόπλασμα αλλά και στο εσωτερικό μιτοχονδρίων (matrix)

3 Αναστολείς της μετάφρασης με αντιβιοτική δράση 1. Αμινογλυκοσίδες: Kanamycin B Gentamicin Tobramycin Amikacin Apramycin Fortimicin 2. Τετρακυκλίνες 3. Μακρολίδια, λινκοζαμίδες, στρεπτογραμίνες (macrolides, lincosamides, streptogramins) 4. Πλευρομουτιλίνες (Pleuromutilins) 5. Ορθοσομυκίνες (Orthosomycines) 6. Φενικόλες (Phenicoles: Chloramphenicol ) Thomas Steitz Venkatraman Ramakrishnan Ada Yonath Nobel 2009

4 Τα χαρακτηριστικά της μετάφρασης του mrna 1. Όλα τα mrna μεταφράζονται με κατεύθυνση: 5 προς 3 1. Οι πρωτεΐνες συντίθενται από το αμινοτελικό προς καρβοξυτελικό άκρο 2. Κάθε αμινοξύ καθορίζεται από μία τριάδα βάσεων mrna ή κωδικόνιο σύμφωνα με το ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΚΩΔΙΚΑ 1. Ο βασικός μηχανισμός της μετάφρασης είναι κοινός σε όλα τα κύτταρα, προ- & ευκαρυωτικά

5 Μηχανισμός της μετάφρασης του mrna trna αμινοξέα ριβόσωμα mrna

6 Μεταφορικά RNA (trna) 1. Τα trna δρούν ως προσαρμογείς ανάμεσα στις τριπλέτες mrna & στα αμινοξέα 2. Έχουν όλα παρόμοια δομή 3. Σε κάθε trna γίνεται πρόσδεση μόνο ενός αμινοξέος 4. Έχουν μήκος nt, δευτεροταγή δομή «τριφυλλιού» και αναδιπλώνονται σε σχήμα L, αναγκαίο για σωστή πρόσδεση στο ριβόσωμα 5. Περιέχουν τροποποιημένες βάσεις: mg (μεθυλογουανοσίνη), mc (μεθυλοκυτιδίνη), DHU (διυδροουριδίνη), T (ριβοθυμιδίνη), Y ( τροποποιημένη πουρίνη, συνήθως αδενοσίνη) και ψ (ψευδοουριδίνη). Μεταγράφονται από την RNApol III.

7 Μεταφορικά RNA (trna) 1. Η λειτουργία του trna ως Προσαρμογέα βασίζεται σε 2 διακριτές περιοχές: 2. Στη συντηρημένη ακολουθία CCA στο 3 άκρο. Το αμινοξύ προσδένεται ομοιοπολικά στη ριβόζη της τελικής αδενοσίνης Α, της CCA 1. Βρόγχος του αντικωδικονίου που αλληλεπιδρά με το συμπληρωματικό κωδικόνιο του mrna.

8 Ο γενετικός κώδικας Εκφυλισμός του γενετικού κώδικα: 1 αμινοξύ καθορίζεται από περισσότερα κωδικόνια 64 κωδικόνια: 61 για τα 20 αμινοξέα και 3 κωδικόνια λήξης της μετάφρασης, UAA, UAG, UGA

9 Mηχανισμός πρόσδεσης αμινοξέων στα trna Συνθετάσες των αμινοακυλο-trna. Κάθε μία αναγνωρίζει ΜΟΝΟ ένα αμινοξύ & ένα ή περισσότερα trna και τα συνδέει μεταξύ τους 1. Το αμινοξύ ενεργοποιείται μέσω υδρόλυσης ATP 2. Σχηματίζεται ενδιάμεσο αμινοάκυλο-αμρ 3. Tο AMP αφαιρείται & το ενεργοποιημένο αμινοξύ προσδένεται στο 3 άκρο CCA του trna 4. Η υψηλή πιστότητα αναγνώρισης του σωστού αμινοξέος γίνεται με μηχανισμό διορθωτικού ελέγχου: το λανθασμένα ενεργοποιημένο αμινοξύ υδρολύεται, χωρίς να προσδένεται στο trna

10 Στοίχιση του αμινοξέος με τη μήτρα mrna Ζευγάρωμα συμπληρωματικών βάσεων, κωδικονίου mrna / αντικωδικονίου του trna 1. Το ζευγάρωμα στη τρίτη θέση του κωδικονίου είναι λιγότερο αυστηρό απ οτι το τυπικό ζευγάρωμα A-U & G-C. Έτσι παρατηρούνται ασυνήθιστα ζευγαρώματα, π.χ. μία γουανοσίνη ζευγαρώνει με ουριδίνη 2. Τα ασυνήθιστα ζευγαρώματα εξηγούν πως τα αμινοξέα καθορίζονται από >1 κωδικόνια 1. Το φαινόμενο του μη-τυπικού ζευγαρώματος αντικωδικονίουs στην 3η βάση του κωδικονίου ονομάζεται ταλάντευση, και είναι η βάση του παρατηρούμενου πλεονασμού/εκφυλισμού του γενετικού

11 Φαινόμενα ταλάντευσης από τη πλευρά του αντικωδικονίου 1. Η ινοσίνη συμμετέχει στο φαινόμενο της Ταλάντευσης (*Ινοσίνη, νουκλεοσίδιο με πρόσδεση υποξανθίνης σε ριβόζη) με την παρουσία ινοσίνης στο αντικωδικόνιο 1. Η παρουσία ινοσίνης στο αντικωδικόνιο οφείλεται στη τροποποίηση γουανοσίνης 1. Η ινοσίνη μπορεί να ζευγαρώσει με U ή C ή 1. Συνολικά η παρουσία της επιτρέπει σε 1 μόριο trna να αναγνωρίζει 3 διαφορετικά κωδικόνια mrna

12 Ριβοσώματα 1. Είναι μοριακές μηχανές που επιτελούν την πρωτεϊνοσύνθεση στα Προκαρυωτικά & Ευκαρυωτικά κύτταρα 2. Τα κύτταρα έχουν μεγάλο αριθμό ριβοσωμάτων: π.χ. E. coli: ριβοσώματα ή 25% του ξηρού των βάρους, πολλαπλασιαζόμενα Ευκαρυωτικά κύτταρα: ~10Χ10 6 ριβοσώματα 1. Μετά από λύση κυττάρων διαχωρίζονται με υπερφυγοκέντρηση και το συντελεστή καθίζησης S (συντελεστής καθίζησης Svedberg: ταχύτητα καθίζησης / επιτάχυνση δηλαδή η αύξηση της ταχύτητας που επιτυγχάνεται για κάθε μονάδα αύξησης της επιτάχυνσης ενός σωματιδίου. 1S=10-13 s) 2. Ο συντελεστής καθίζησης είναι 70S για τα Βακτηριακά και 80S για τα Ευκαρυωτικά ριβοσώματα 1. Aποτελούνται από 2 υπομονάδες και κάθε μία περιέχει χαρακτηριστικές πρωτεϊνες & rrna

13 Δομή Ριβοσωμάτων 1. Αν και τα Βακτηριακά και Ευκαρυωτικά ριβοσώματα έχουν διαφορές, η δομή τους είναι παρόμοια 2. Tα ριβοσώματα αυτο-συναρμολογούνται in vitro ανάμιξη rrna & πρωτεϊνών (M. Nomura,1968) Δομή με ανάλυση ακτίνων Χ: 50S μεγάλη υπομονάδα: 223S, 5S r RNA & 34 πρωτεϊνες 30S μικρή υπομονάδα: 16S rrna & 21 πρωτεϊνες 60S μεγάλη υπομονάδα: 28S, 5,8S, 5S rrna & 45 πρωτεϊνες 40S μικρή υπομονάδα: 18S rrna & 30 πρωτεϊνες

14 40S Δομή ανθρώπινων Ριβοσωμάτων 60S H. Khatter, A. G. Myasnikov, S. K. Natchiar, B. P. Klaholz, Structure of the human 80S ribosome. Nature. 520, (2015).

15 Ριβοσωμικό RNA 60 S: 28S, 5,8S, 5S rrna 40S: 18S rrna 1. Τα rrna, όπως τα trna, αποκτούν δομή με ζευγάρωμα συμπληρωματικών βάσεων 2. Kαταλύουν την πρωτεϊνοσύνθεση Αρχικά, θεωρήθηκαν ότι είχαν δομικό ρόλο, σκελετό συναρμολόγησης ριβοσωματικών πρωτεϊνών. Όμως η απουσία πολλών (90%) ριβοσωματικών πρωτεϊνών μειώνει μόνο την ενεργότητα των ριβοσωμάτων, ενώ η επεξεργασία με RNάση καταστέλει πλήρως την πρωτεϊνοσύνθεση 16S RNA

16 Καταλυτικός ρόλος του rrna στην πρωτεϊνοσύνθεση 1. Οι ριβοσωμικές πρωτεϊνες απουσιάζουν από τη θέση αντίδρασης της πεπτιδυλο-τρανφεράσης 2. Στο μηχανισμό πρωτεϊνοσύνθεσης, η μεγάλη ριβοσωματική μονάδα δρά ως ριβοένζυμο (καταλυτικό RNA), και η βασική αντίδραση του πεπτιδικού δεσμού καταλύεται από το rrna Η βακτηριακή ριβοσωμική υπομονάδα 50S: τα 3 μόρια trna (άσπρο, κόκκινο, κίτρινο) είναι συνδεδεμένα στις ριβοσωμικές πρωτεϊνικές θέσεις A, P & E. Γαλάζιο = rrna 3. Ο ρόλος των ριβοσωματικών πρωτεϊνών είναι κυρίως δομικός Καταλυτικός Ρόλος RNA α. Το RNA είναι το πρώτο μόριο με ικανότητα αυτο-αντιγραφής β. Είναι καταλύτης της πρωτεϊνοσύνθεσης, γ. Το trna προσδένει αμινοξέα δ. Ίσως, οι πρώτες συνθετάσες αμινοακυλο-trna να ήταν RNA και όχι πρωτεϊνες

17 Η οργάνωση των μορίων mrna Μηχανισμοί μετάφρασης Προκαρυωτικών & Ευκαρυωτικών 1. Το 5 & 3 άκρο τους έχει μη-μεταφραζόμενες περιοχές: UTR, UnTranslated Regions) 2. Τα Προκαρυωτικά mrna συχνά κωδικοποιούν πολλαπλά πολυπεπτίδια: ανεξάρτητα μεταξύ των κκαι η μετάφρασή τους ξεκινά από διαφορετικά σημεία. Τα mrna αυτά ονομάζονται ΠΟΛΥΚΙΣΤΡΟΝΙΚΑ 3. Τα Ευκαρυωτικά mrna είναι ΜΟΝΟΚΙΣΤΡΟΝΙΚΑ: δηλ. κωδικοποιούν 1 πολυπεπτίδιο, φέρουν μία καλύπτρα 7- μεθυλογουανοσίνης (m7g) & μία polya ουρά

18 Η έναρξη της μετάφρασης 1. Στα Προκαρυωτικά & Ευκαρυωτικά η πρωτεϊνοσύνθεση αρχίζει πάντοτε με μεθειονίνη (AUG) -Σε σπάνιες περιπτώσεις: αν χρησιμοποιηθεί εναλλακτικό κωδικόνιο, π.χ. GUG (της βαλίνης) τότε το κωδικόνιο αυτό, θα καθοδηγήσει και πάλι την τοποθέτηση μεθειονίνης στο 5 άκρο και όχι βαλίνης -Στα Προκαρυωτικά, η πρωτεϊνοσύνθεση ξεκινά με το τροποποιημένο κατάλοιπο μεθειονίνης, την Ν- φορμυλο-μεθειονίνη 2. Στα Βακτήρια, τα σήματα έναρξης χαρακτηρίζονται από την αλληλουχία Shine-Dalgarno, που ζευγαρώνει με μία συμπληρωματική αλληλουχία κοντά στο 3 άκρο του 16S rrna. Μέσω ζευγαρώματος της Shine-Dalgarno η πρωτεϊνοσύνθεση αρχίζει στο 5 άκρο αλλά και σε εσωτερικές θέσεις του πολυκιστρονικού mrna 3. Στα Ευκαρυωτικά, τα ριβοσώματα προσδένονται στην m7g καλύπτρα στο 5 -άκρο & κινούνται καθοδικά μέχρι το κωδικόνιο έναρξης AUG

19 Η διαδικασία της μετάφρασης IF= Initiator Factor EF= Elongation Factor RF= Release Factor eif= Initiator Factor eef= Elongation Factor erf= Release Factor (e: eucaryotic)

20 Ἐναρξη της μετάφρασης στα βακτηριακά mrna 1. Στην μικρή ριβοσωμική υπομονάδα 30S, προσδένονται οι παράγοντες έναρξης IF1 & IF3 2. Στο σύμπλοκο προστίθενται: το mrna & το εναρκτήριο Ν-φορμυλομεθειονυλοtRNA, που αλληλεπιδρά με τον παράγοντα έναρξης IF2, συνδεδεμένο με GTP 3. Με τη πρόσδεση του εναρκτήριου trna στο κωδικόνιο έναρξης AUG, οι IF1 & IF3 ελευθερώνονται Σε σπάνιες περιπτώσεις: αν χρησιμοποιηθεί εναλλακτικό κωδικόνιο, π.χ. GUG (της βαλίνης) τότε το κωδικόνιο αυτό, θα καθοδηγήσει και πάλι την τοποθέτηση μεθειονίνης στο 5 άκρο και όχι βαλίνης 4. Στο σύμπλοκο προστίθεται η μεγάλη υπομονάδα 50S που διεγείρει την υδρόλυση GTP προς GDP & απελευθερώνεται το σύμπλοκο IF2/GDP. Το σχηματισμένο εναρκτήριο σύμπλοκο 70S με το mrna & εναρκτήριο trna συνδεδεμένα στο ριβόσωμα, είναι έτοιμο για την Επιμήκυνση

21 Ἐναρξη της μετάφρασης στα ευκαρυωτικά mrna 11 ευκαρυωτικούς παράγοντες έναρξης (eif, eukaryotic Inition Factors) 1.Οι eif1, eif1a, eif3, eif5 προσδένονται στη μικρή 40S υπομονάδα 2α. Ο eif2 σε σύμπλοκο με GTP προσδένεται στο μεθειονυλο-trna 2β. To μεθειονυλο-trna προσδένεται στη μικρή υπομονάδα 40S για σχηματισμό του προεναρκτήριου συμπλόκου 3α. To mrna αναγνωρίζεται από ομάδα παραγόντων eif4 και μεταφέρεται στη 40S μικρή υπομονάδα 3β. Ο eif4g αλληλεπιδρά με τη πρωτεϊνη πρόσδεσης PABP (PolyA Binding Protein) στην ουρά πολυ-α στο 3 άκρο του mrna 3γ. Η καλύπτρα αναγνωρίζεται από τον eif4e, που είναι σε σύμπλοκο με eifa/eifg

22 Ἐναρξη της μετάφρασης στα ευκαρυωτικά mrna 4. Η μικρή 40S υπομονάδα σε σύμπλοκο με eif4e & eif4g και τους eif4α & eif4β κινείται καθοδικά στο mrna, μέχρι το κωδικόνιο έναρξης AUG (με ενέργεια από υδρόλυση ΑΤΡ) 5α. Ο eif5 προκαλεί: υδρόλυση του GTP, απελευθέρωση του eif2/gdp & άλλων παραγόντων έναρξης 5β. Ο eif5b προκαλεί τη πρόσδεση της υπομονάδας 60S στο ριβόσωμα & σχηματίζεται το εναρκτήριο σύμπλοκο 80S των ευκαρυωτικών κυττάρων 6. Το εναρκτήριο σύμπλοκο είναι έτοιμο για πρωτεϊνοσύνθεση

23 Τα βήματα επιμήκυνσης της μετάφρασης mrna 1) Ο μηχανισμός της επιμήκυνσης στα Προκαρυωτικά & Ευκαρυωτικά είναι παρόμοιος 2) 1. Οι θέσεις πρόσδεσης των trna στο ριβόσωμα είναι 3: E (εξόδου, Exit), P (πεπτιδυλο-, Peptidyl), Α (αμινοακυλο-, Aminoacyl). Το 1o εναρκτήριο μεθειονυλο-trna προσδένεται στη θέση P (η Α είναι άδεια). 2α. 2o αμινοακυλο-trna μέσω eef1α, μεταφέρεται/προσδένεται στη θέση Α με δεσμούς: αντικωδικονίου trna και του 2ου κωδικονίου του mrna. Tο 2o αμινοακυλο-trna μεταφέρεται στη θέση Α με παράγοντα Επιμήκυνσης (EF, Elongation Factor) σε σύμπλοκο με GTP, τον EF-Tu στους Προκαρυώτες & τον eef1a στους Ευκαρυώτες. 2β. Η εισαγωγή του 2o αμινοακυλο-trna στη θέση Α αλλάζει τη ριβοσωμικήστερεοδιαμόρφωση, επάγει υδρόλυση GTP & απελευθερώνει τον eef1a

24 Τα βήματα επιμήκυνσης της μετάφρασης mrna 3. Μετά την απόσπαση του eef1a από το ριβόσωμα γίνεται: ο πεπτιδικός δεσμός, μεταξύ αμινοξέων του εναρκτήριου μεθειονυλο-trna τηςθέσης Ρ & του 2ου αμινοακετυλο-trna της θέσης Α (με καταλύτη rrna) (η μεθειονίνη μεταφέρεται στο 2ο αμινοακυλο-trna στη θέση Α) 3) 4) 4. Το ριβόσωμα μετατοπίζεται κατά ένα (1) κωδικόνιο mrna από παράγοντα επιμήκυνσης: α. EF-G, για Προκαρυώτες & β. eef2 για Ευκαρυώτες. Η μετατόπιση του trna που γίνεται από τη Α στη θέση P αφήνοντας κενή τη θέση Α για πρόσδεση του επόμενου αμινοξέος, προϋποθέτει υδρόλυση GTP 5. Στη θέση Α εισέρχεται νέο αμινοακυλο-trna, επάγοντας τη απελευθέρωση του αφόρτιστου trna από τη θέση Ε. Στη συνέχεια το ριβόσωμα καταλύει τον επόμενο πεπτιδικό δεσμόστην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα 5)

25 Τα βήματα τερματισμού της μετάφρασης mrna 1. Η επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας συνεχίζεται μέχρι να εισέλθει στη ριβοσωματική θέση Α ένα κωδικόνιο τερματισμού: UAA, UAG ή UGA του mrna 2. Τα κωδικόνια τερματισμού ανγνωρίζονται από τους παράγοντες απελευθέρωσης (RF, Release Factors) -Οι προκαρυώτες διαθέτουν 2 παράγοντες τερματισμού: τον παράγοντα RF1 για τα κωδικόνια τερματισμού UAA & UAG και τον παράγοντα RF2 για τα κωδικόνια UAA & UGA -Οι ευκαρυώτες έχουν μόνο τον παράγοντα απελευθέρωσης erf1 που αναγνωρίζει και τα 3 κωδικόνια τερματισμού UAA, UAG και UGA 3. Οι Προκαρυώτες και Ευκαρυώτες έχουν και τους παράγοντες απελευθέρωσης RF3 και erf3, αντίστοιχα, που δεν αναγνωρίζουν κωδικόνια τερματισμού αλλά αλληλεπιδρούν με τους RF1, RF2 ή erf1 για λήξη της πρωτεϊνοσύνθεσης 4. Οι παράγοντες τερματισμού προσδένονται στο κωδικόνιο τερματισμού στη θέση Α, υδρολύουν το δεσμό trna/πολυπεπτιδικής αλυσίδας στη θέση Ρ που απελευθερώνει το πολυπεπτίδιο από το ριβόσωμα. Ετσι απελευθερώνεται το trna & οι ριβοσωμικές υπομονάδες αποσυνδέονται

26 Τα μόρια mrna μεταφράζονται ταυτόχρονα από πολλά ριβοσώματα ριβοσώματα στην E.coli

27 Οι GTPασες ως μοριακοί διακόπτες GAP GEF RAS and RHO GTPases in G1-phase cell-cycle regulation Mathew L. Coleman, Christopher J. Marshall & Michael F. Olson Nature Reviews Molecular Cell Biology 5, GAP: GTPase Αctivating Protein Eνεργοποιητές υδρόλυσης νουκλεοτιδίων γουανίνης GEF Guanine-Nucleotide Exchange Factor, Παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης