ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ

Transcript

1 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Διάμετρος 3, 5, 1 μm Λογισμικό επεξεργασίας Δυνατότητα βαθμιδωτής έκλουσης Στενές σωληνώσεις 4 psi 1 ml/min Καθορισμένου όγκου 1-2 μl Στατική Φάση Προσδιοριζόμενη Ουσία Κινητή Φάση Ανοξείδωτο χάλυβα Ποικιλία υλικών πλήρωσης Μήκος 1 έως 3 cm Εσωτερική διάμετρος 4 έως 1 mm Διάμετρος σωματιδίων πλήρωσης 1 έως 1 μm 3

2 Αλληλεπίδραση προσδιοριζόμενων ουσιών με τις επιφάνειες των υλικών πλήρωσης 4 Χημικά τροποποιημένες στατικές φάσεις Κανονικής φάσης Αντίστροφης φάσης 5

3 Χημικά τροποποιημένες στατικές φάσεις

4 Χημικά τροποποιημένες στατικές φάσεις Προηγμένη εκτίμηση στατικών φάσεων αντίστροφης φάσης ΟΧΙ Χημικά τροποποιημένες στατικές φάσεις

5 Είδη χρωματογραφίας Βάση πολικότητας κινητής στατικής φάσης φάσης Στατική Φάση Είδος χρωματογραφίας Κινητή Φάση Πολική Κανονικής φάσης Μη πολική Εξάνιο, διχλωρομεθάνιο, ισοπροπανόλη, μεθανόλη Μη πολική Αντίστροφης φάσης Πολική Νερό, ακετονιτρίλιο μεθανόλη, THF Εκλουστική ισχύ διαλυτών κινητής φάσης Ουσίες που προσδιορίζονται με HPLC αντιστρόφου φάσης % ιονισμός, άρα δεν παρατηρούνται μεταβολές στους χρόνους κατακράτησης με την μεταβολή του ph Ιονίζονται σε αλκαλικό περιβάλλον, Ka σε A ποσοστό ανάλογο της τιμής pka A καιh K a εκλούονται σε μικρότερους χρόνους HA AH H Ιονίζονται σε όξινο περιβάλλον, σε ποσοστό ανάλογο της τιμής pka και εκλούονται σε μικρότερους χρόνους Ανάλογα με το περιβάλλον (όξινο ή αλκαλικό) και με τις pka τιμές ιονίζονται είτε οι όξινες είτε οι βασικές ομάδες αντίστοιχα CH 3 OCOCH 3 COOH NH 2 HO NH 2 NO 2 toluene acetylsalicylic acid o-nitroaniline OH D,L-octopamine

6 Εξίσωση Henderson -Hasselbach ph-pka Οξύ: %ιοντισμός 1 x1 ph-pka (1) 1 1 Τα οξέα ιονίζονται σε βασικό περιβάλλον σε τιμές ph pka (ph=pka 5%ionization) Όσο μικρότερη η τιμή ρκα ενός οξέος τόσο ισχυρότερο είναι Βάση: %ιοντισμός pka-ph pka-ph x1 (2) Οι βάσεις ιονίζονται σε όξινο περιβάλλον σε τιμές ph pka (ph=pka 5%ionization) Όσο μεγαλύτερη έναι η τιμή ρκα μίας βάσεως τόσο ισχυρότερη είναι Εξίσωση Henderson -Hasselbach ph-pka 1 Οξύ: %ιοντισμός x1 ph-pka (1) 1 1 Βάση: %ιοντισμός pka-ph pka-ph x1 (2) ΟΞΕΑ ΒΑΣΕΙΣ ph=pk a (5% ionization) ph=pk a (5% ionization) PΗ>pK a +1 (9% ionization) PΗ<pK a -1 (9% ionization) PΗ>pK a +3 (99.9% ionization) PΗ<pK a -3 (99.9% ionization)

7 Retention times of neutral molecules nm4nm (1. ) min ph 2.3 anisole/7.171 OCH 3 C4 Στήλη nm4nm (1. ) ph min anisole/ /2.11 anisole min 25 / min Phenyl Στήλη 254nm4nm (1. ) ph 2.3 ph nm4nm (1. ) NO 2 nitrobenzene nitrobenzene/ min min 1 5 /2.6 nitrobenzene/ min min Λιποφιλικότητα/Υδροφιλικότητα προσδιοριζόμενων ουσιών Στατική Φάση Προσδιοριζόμενη Ουσία Λιποφιλικότητα Κινητή Φάση Ουδέτερα Μόρια Ιονισμένα Μόρια P app ή Συντελεστής μερισμού Φαινομενικός συντελεστής μερισμού Οξέα : Βάσεις : 14

8 P naph >P benz Phenyl Column ph nm4nm (1. ) benzene min benzene/ nm, 4nm (1.) naphthalene min naphthalene/ min 1 2 min 254nm, 4nm (1.) CH min toluene/ nm4nm (1. ) CH 3 CH min p xylene/ toluene 5 /1.972 xylene min min P xyl >P toluen 15 Χρόνοι κατακράτησης με βάση τη δομή C4 Στήλη ph nm, 4nm (1.) 1 5 Cl chlorobenzene min chlorobenzene/ nm, 4nm (1.) Cl Cl dichlorobenzne min 1,2 dichlorobenzene/ min min 3 21nm, 4nm (1.) 2 1 Cl Cl Cl 1,2,4-trichlorobenzene min 1,2,4 trichlorobenzene/ min 16

9 254nm, 4nm (1.) 254nm4nm (1. ) 254nm4nm (1. ) H O OH OH N COCH 3 CONH 2 nicotinamide Acidic compounds with % ionization Substance pka % ionization tr phenyl 4%MeOH tr C4 4%MeOH ph 2.3 ph 6.2 (HCl) (NH 3 ) (HCl) (NH 3 ) phenol ethanophenone benzaldehyde naphthol naphthol prednisolone acetate prednisolone testosterone >3 > progesterone methyl testosterone estrone nicotinamide isoniazid paracetamol phenacetine metronidazole salicin thiocolchicoside digitoxin >4 > cortisol thanophenone % Phenyl Στήλη 1 5 OH ph 2.3 ph min phenol/ min 1 5 phenol/3.945 phenol / min min 254nm4nm (1. ) 5 25 /2.93 /4.648 ph 2.3 prednisolone/ min C4 Στήλη 3 CH 3 CH HO 2 OH min min 2 1 O CH 3 H H H prednisolone ph 6.2 O HO prednisolone/ min

10 Έκλουση ουδέτερων ενώσεων σε C18 Χρόνοι κατακράτησης των ουσιών που ιονίζονται σε ποσοστό 51% έως 1% Ποσοστά Ιονισμού των Όξινων ομάδων Ονομασία pka % Ιονισμός tr phenyl 4%MeOH tr C4 4%MeOH ph 2.3 ph 6.2 (HCl) (NH 3 ) (HCl) (NH 3 ) benzoic acid naproxene nicotinic acid aspirin ethamsylate ethamsylate ethamsylate ibuprofen halazone sulfisoxazole sulfabenzamide glibenclamide > glibenclamide diclofenac ketoprofen flurbiprofen flufenamic acid mefenamic acid niflumic acid nalidixic acid indomethacin cromolyn

11 254nm4nm (1. ) 254nm4nm (1. ) nm, 4nm (1.) OCOCH 3 acetylsalicylic acid COOH /1.758 /1.969 ph 2.3 Έκλουση όξινων ενώσεων 5.19 min Phenyl Στήλη acetylsalicilic acid/ min ph 6.2 acetylsalicilic acid/ min min nm, 4nm (1.) F flurbiprofen C4 Στήλη ph 2.3 ph min COOH CH 3 flurbiprofen/ min min /1.94 flurbiprofen/ min ΟΞΕΑ ΒΑΣΕΙΣ ph=pk a (5% ionization) ph=pk a (5% ionization) PΗ>pK a +1 (9% ionization) PΗ<pK a -1 (9% ionization) PΗ>pK a +3 (99.9% ionization) PΗ<pK a -3 (99.9% ionization) Βάσεις ph=8.4 ph=7.4

12 Επίδραση διαλύτη κινητής φάσης Εκλουστικη ισχύ Τετραυδροφουράνιο 23% Ακετονιτρίλιο 33% Μεθανόλη 4% Η 2 Ο πολικότητα CH 3 CN-H 2 (3:7) CH 3 CN-MeOH-H 2 (15:15:7) CH 3 CN-THF-H 2 (15:15:7) Λιποφιλικότητα/Υδροφιλικότητα προσδιοριζόμενων ουσιών Ουδέτερα Μόρια Ιονισμένα Μόρια P app ή Συντελεστής μερισμού k ' t R t t Συντελεστής συγκράτησης ή παράγοντας χωρητικότητας Κ o o Φαινομενικός συντελεστής μερισμού t t ' Rapp o kapp to Φαινομενικός παράγοντας χωρητικότητας Οξέα : K app K Βάσεις : K app K 23

13 Καμπύλες συσχέτισης ph %ACN: 8% Buffer tr % buffer %buffer ph6.3/acn Vs tr Επίδραση θερμοκρασίας ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 tr ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ: ΑΡΧΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΟΥΣ, ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ- ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ, ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΟΥΣ ΝΑΙ ΠΡΟΗΓΜΕΝΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΣΤΑΤΙΚΩΝ ΦΑΣΕΩΝ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ ΟΧΙ Απόδοση ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων ΟΧΙ Προηγμένη εκτίμηση των στατικών φάσεων αντίστροφης φάσης ΟΧΙ

14 Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Ανάλυση ζεύγους ιόντων (ανταλλαγή κατιόντων) αδρεναλίνη ph όξινο Οκτανοσουλφονικό νάτριο Na + Na + Na+ Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Ανάλυση ζεύγους ιόντων (ανταλλαγή ανιόντων) Ασκορβικό οξύ ph=βασικό κετριμίδιο

15 Χρωματογραφία υδρόφιλης αλληλοεπίδρασης (ZIC- HILIC Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (υαλουρονικό οξύ) UV 215nm MB>1 6 Daltons Στατική φάση: Συμβατή με το νερό Κινητή φάση: Υδατικό διάλυμα

16 Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Ανάλυση μη-ιοντικών επιφανειοδραστικών με ELSD αλκυλομάδα CH 3 (CH 2 ) m (OCH 2 CH 2 ) n OH πολυαιθυλενογλυκόλη Ουσία:Cetomacrocol (m=15-17, n=2-24) Ανιχνευτής : IR, ELSD Στατική φάση: αμινοπροπυλ στήλη Κινητή φάση: εξανιο/χλωροφόρμιο/meoh (Βαθμιδωτή έκλουση) Ανάλυση πρωτεϊνών Στατική: φάσηc18 Κιν. Φάση : Τριφθ. Οξύ/Ακετονιτρίλιο Βαθμιδωτή έκλουση Ανίχν. UV (215nm) Ινσουλίνη Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Αντιδράσεις παραγωγοποίησης Ουσία:νεομυκίνη Αντιδραστήριο:φθοροδινιτροβενζόλιο Ανιχνευτής : UV Στατική φάση: SiO 2 Κινητή φάση: ΕtOH/χλωροφόρμιο

17 Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Ιοντική Χρωματογραφία Ουσία: κατιόντα Ανιχνευτής : αγωγιμότητας Στατική φάση: κατιονανταλλακτική ρητίνη Κινητή φάση:μεθανοσουλφονικό οξύ Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Ιοντική Χρωματογραφία Ουσία: ανιόντα Ανιχνευτής : αγωγιμότητας Στατική φάση: ανιονανταλλακτική ρητίνη Κινητή φάση:ναοη Αναλύσεις με εξειδικευμένες τεχνικές HPLC Μηχανισμός Α:Σχηματισμός ζεύγους ιόντων (με θειικό διμεθυλοκυκλοεξύλιο) Μηχανισμός Β: Ιονανταλλαγή Ουσία: κατεχολαμίνες σε ούρα Ανιχνευτής : ηλεκτροχημικός Στατική φάση A : C 18 στήλη B: κατιονανταλλακτική ρητίνη

18 ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΕΝΑΝΤΙΟΜΕΡΩΝ ΜΕ ΧΕΙΡΟΜΟΡΦΗ HPLC ΟΧΙ Εφαρμογές HPLC σε ποσοτικές αναλύσεις φαρμάκων Αναλύσεις βασισμένες σε βαθμονόμηση με εξωτερικό πρότυπο (εύρος± 2%, r>.99) Ανάλυση με βαθμονόμηση ενός σημείου Ανάλυση με βαθμονόμηση ενός σημείου και εσωτερικό πρότυπο Ανάλυση με εκχύλιση Υπολογισμός συγκέντρωσης ατροπίνης σε άγνωστο δείγμα παρουσία εσωτερικής προτύπου Ποσότητα ατροπίνης δείγμα= Παράγων απόκρισης για άγνωστο δείγμα Παράγων απόκρισης για πρότυπο χ Ποσότητα ατροπίνης στο πρότυπο Παράγων απόκρισης=εμβαδόν ατροπίνης/εμβ. εσωτερικής προτύπου Εκχύλιση Σε δισκίο (στερεού-υγρού) N NH SO 2 NH 2 sulfapyridine pk a = 5 Συνήθως η ουσία ιονίζεται στο κατάλληλο ph (όξινο) και παραλαμβάνεται με υδατικό διαλύτη Σε υδρόφιλο σιρόπι (στερεού-υγρού) Συνήθως η ουσία διατηρείται σε μη ιονιζμένη μορφή ph (αλκαλικό) και παραλαμβάνεται με οργανικό μη πολικό διαλύτη διαλύτη που δεν αναμιγνύεται με το σιρόπι Σε αλοιφή (στερεού-υγρού) Συνήθως η ουσία ιονίζεται στο κατάλληλο ph (όξινο) και παραλαμβάνεται με πολικό οργανικό ή υδατικό διαλύτη

19 Χρωματογραφία Υπευψηλής Απόδοσης (UPLC) Χρωματογραφία Υπευψηλής Απόδοσης (UPLC)