(YΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ) ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ (HIGH PERFORMANCE) LIQUID CHROMATOGRAPHY ΑΘΗΝΑ, ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2014

Transcript

1 (YΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ) ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ (HIGH PERFORMANCE) LIQUID CHROMATOGRAPHY ΑΘΗΝΑ, ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2014

2 ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ Ονομάζεται έτσι επειδή η κινητή φάση είναι υγρή. Η στατική φάση μπορεί να είναι στερεά σωματίδια (χρωματογραφία υγρού- στερεού χρωματογραφία προσρόφησης) ή υγρό που συγκρατείται πάνω σε αδρανή στερεά σωματίδια (χρωματογραφία υγρού-υγρού χρωματογραφία κατανομής). Εφαρμογή υψηλής πίεσης η κινητή φάση διέρχεται μέσα από την στατική φάση υγροχρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Γενικά χρησιμοποιείται για την ανάλυση ΜΗ πτητικών ενώσεων.

3 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ Δεν περιορίζεται από την ανάγκη για πτητικότητα και θερμική σταθερότητα του δείγματος. Η υγροχρωματογραφία εφαρμόζεται για τον διαχωρισμό οποιωνδήποτε ουσιών διαλυτών στην κινητή φάση. Δύο ενεργές φάσεις (στατική και κινητή) που αλληλεπιδρούν Μεγαλύτερο εύρος μεταβολής συνθηκών ώστε να επιτευχθεί ο επιδιωκόμενος διαχωρισμός. Δυνατότητα ανάλυσης σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ευκολία στην ανάκτηση του δείγματος (οι περισσότεροι ανιχνευτές στην υγροχρωματογραφία δεν είναι καταστροφικοί για τις εκλουόμενες ουσίες). Μειονεκτήματα HPLC σε σχέση με GC: Μεγαλύτερος χρόνος ανάλυσης, μικρότερη διαχωριστική ικανότητα.

4 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Δεξαμενή διαλύτη/ διαλυτών. Αντλία ή αντλίες. Σύστημα εισαγωγής δείγματος στην στήλη. Χρωματογραφική στήλη (αναλυτική στήλη + προστήλη). Ανιχνευτής. Καταγραφικό ή Η/Υ. Δεξαμενή Αποβλήτων.

5 ΣΥΣΤΗΜΑ ΠΑΡΟΧΗΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ Απαέρωση διαλυτών (συνεχής διοχέτευση αδρανούς αερίου (He), διήθηση υπό κενό, χρήση ειδικών μεμβρανών). Οι διαλύτες αναμιγνύονται στον θάλαμο ανάμειξης (mixing chamber) πριν την προώθηση τους στην αντλία.

6 ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΑΝΤΛΙΑΣ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ Χημική αδράνεια υλικών που αποτελείται σε σχέση με τους διαλύτες. Μεγάλο εύρος ροών από 0.1 ml/min (μικροστήλες) έως 10 ml/min (για παρασκευαστική υγροχρωματογραφία μικρής κλίμακας). Ακρίβεια στην παροχή. Όχι διακυμάνσεις (όχι παλμοί ροής) ελαχιστοποίηση θορύβου ανιχνευτή. Δυνατότητα λειτουργίας σε υψηλές πιέσεις (έως 6000 psi ή 400 atm). Δυνατότητα επέκτασης σε σύστημα βαθμωτής (gradient) έκλουσης. Λίγες απαιτήσεις σε συντήρηση.

7 ΤΥΠΟΙ ΕΚΛΟΥΣΗΣ Ισοκρατική (isocratic): Σταθερή σύσταση της κινητής φάσης κατά την διάρκεια της έκλουσης. Είναι ο πλέον συνηθισμένος τρόπος έκλουσης. Βαθμωτή (gradient): Η σύσταση της κινητής φάσης μεταβάλλεται κατά την διάρκεια της έκλουσης με την ανάμειξη δυο ή περισσοτέρων διαλυτών σε μεταβαλλόμενες αναλογίες. Χρησιμοποιείται κυρίως όταν τα k των υπό διαχωρισμό συστατικών εμφανίζουν μεγάλο εύρος τιμών (π.χ. αύξηση του ποσοστού MeOH/ CH 3 CN στην κινητή φάση κατά την διάρκεια της έκλουσης στην χρωματογραφία αντιστρόφου φάσεως μείωση του χρόνου έκλουσης (λιπόφιλων) συστατικών που συγκρατούνται ισχυρά στην στήλη μείωση του χρόνου ανάλυσης). Κατάταξη: Συστήματα χαμηλής πίεσης με μια αντλία (ανάμειξη διαλυτών στο τμήμα χαμηλής πίεσης της αντλίας), Συστήματα υψηλής πίεσης με αντλίες όσες και οι διαφορετικοί διαλύτες (ανάμειξη διαλυτών μετά τις αντλίες).

8 ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Δείγμα: Αποκλειστικά σε υγρή μορφή. Συνήθης προκατεργασία: Αραίωση, διήθηση. Εισαγωγή δείγματος στο υγροχρωματογραφικό σύστημα: Μέσω περιστρεφόμενης βαλβίδας υψηλής πίεσης και χρήση βρόγχου δείγματος διαφόρων χωρητικοτήτων (5-250 μl). Ο βρόγχος γεμίζεται με το υγρό δείγμα μέσω σύριγγας και απορρίπτεται η ποσότητα του δείγματος που υπερβαίνει την χωρητικότητα του βρόγχου. Δυνατότητα χρήσης αυτόματων δειγματοληπτών.

9 ΠΡΟΣΤΗΛΕΣ (GUARD COLUMNS) Τοποθετούνται πριν την κυρίως (αναλυτική) στήλη με σκοπό την αύξηση του χρόνου ζωής της αναλυτικής στήλης. Κατακρατούν αιωρούμενα σωματίδια, προσμίξεις των διαλυτών και του δείγματος που συνδέονται με μη αντιστρεπτό τρόπο με την αναλυτική στήλη. Η προστήλη αποτελείται με το ίδιο υλικό με την κυρίως στήλη, αλλά με μεγαλύτερο μέγεθος σωματιδίων. Προκαλεί κορεσμό της κινητής φάσης με το υλικό της στατικής φάσης ώστε οι απώλειες της κινητής φάσης να είναι ελάχιστες. Σε περίπτωση κορεσμού μπορεί το υλικό της προστήλης να αντικατασταθεί ή ολόκληρη η προστήλη να αντικατασταθεί με καινούργια (η προστήλη είναι φθηνότερη από την αναλυτική στήλη).

10 ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΣΤΗΛΕΣ I (ANALYTICAL COLUMNS) Συνήθη χαρακτηριστικά: Ευθύγραμμες με μήκος: cm. Εσωτερική διάμετρος (i.d.): 4-10 mm. Μέγεθος σωματιδίων: 5-10 μm. Η πλέον χαρακτηριστική στήλη έχει μήκος 15 ή 25 cm, εσωτερική διάμετρο 4.6 mm και μέγεθος σωματιδίων 5 μm. Οι στήλες αυτών των χαρακτηριστικών έχουν Ν= θεωρητικούς δίσκους/ m. Θερμοστάτες στήλης: Ρύθμιση θερμοκρασίας στήλης έως 100 o C. Δυνατότητα σύνδεσης δυο ή περισσοτέρων στηλών. Τάση για μείωση του μεγέθους της στήλης (π.χ. i.d.= 1-2 mm ή και χαμηλότερα μικροστήλες/ τριχοειδείς στήλες) Σμίκρυνση του υγροχρωματογραφικού συστήματος Ελάχιστη κατανάλωση διαλυτών, ελάχιστος όγκος δείγματος (τάξη nl), σύνδεση με μικροσκοπικούς ανιχνευτές. Προβλήματα: Κακή αναπαραγωγισιμότητα της ροής ειδικά για την βαθμωτή έκλουση, δυσκολία στον χειρισμό/ εισαγωγή πολύ μικρών δειγμάτων.

11 ΥΛΙΚΑ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗΣ ΣΤΗΛΩΝ Υλικά στήριξης: Ευθύγραμμοι σωλήνες συνήθως από ανοξείδωτο χάλυβα. Χρησιμοποιούνται επίσης γυαλί, τηγμένη πυριτία και τιτάνιο. Τα υλικά πλήρωσης της στήλης κατατάσσονται σε μικροπορώδη και υμενοειδή σφαιροειδή σωματίδια. Μικροπορώδη σωματίδια (διάμετρος έως 10 μm): Αποτελούνται από SiO 2, αλούμινα, πολυμερή στυρενίου- διβινυλοβενζολίου ή ιοντο-ανταλλακτικές ρητίνες. Επικαλύπτονται με οργανικό στρώμα φυσικά ή χημικά συνδεδεμένο. Μακροπορώδη σωματίδια (διάμετρος 60 μm): Από πυριτία, αλούμινα ή άλλα εμπορικά υλικά. Δεν περιέχουν υγρό φορέα. Υμενοειδή σφαιροειδή σωματίδια (διάμετρος μm): Σφαιρικά μη πορώδη σωματίδια από πολυμερές ή γυαλί. Αποτίθεται λεπτό πορώδες στρώμα και υγρή στατική φάση. Χρησιμοποιούνται για προστήλες.

12 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΜΗΚΟΥΣ ΣΤΗΛΗΣ ΣΤΟΝ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟ

13 ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ (DETECTORS) Η υγροχρωματογραφία- σε αντίθεση με την αεριοχρωματογραφία δεν χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη ανιχνευτών με ευρεία εφαρμογή και αξιοπιστία όπως είναι οι φλογοφωτομετρικοί ανιχνευτές (FPD) και οι ανιχνευτές θερμικής αγωγιμότητας που χρησιμοποιούνται στην GC Η ανάπτυξη βελτιωμένων ανιχνευτών για την HPLC αποτελεί κλειδί για την τεχνολογική της εξέλιξη. Τύποι ανιχνευτών στην HPLC: 1) Ανιχνευτές που αποκρίνονται σε μια ιδιότητα της κινητής φάσης (π.χ. δείκτης διάθλασης, διηλεκτρική σταθερά). 2) Ανιχνευτές που αποκρίνονται σε κατάλληλες ιδιότητες των υπό διαχωρισμό συστατικών (π.χ. απορρόφηση στο UV, φθορισμός, ρεύμα διάχυσης).

14 ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ: ΙΔΑΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Μεγάλη ευαισθησία, χαμηλό όριο ανίχνευσης και χαμηλός θόρυβος. Γραμμική απόκριση για μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων. Σταθερότητα λειτουργίας. Μικρός χρόνος απόκρισης, ανεξάρτητος από την ταχύτητα ροής της κινητής φάσης. Ανεξάρτητος από τυχόν θερμοκρασιακές μεταβολές και μεταβολές στην ταχύτητα ροής της κινητής φάσης. Μηδενικός νεκρός όγκος δεν συμμετέχει στην διεύρυνση των ζωνών των συστατικών. Μηδενικό σήμα για την κινητή φάση. Ομοιόμορφη απόκριση για όλες τις ενώσεις που διαχωρίζονται (γενικός ανιχνευτής) ή εκλεκτικότητα ως προς συγκεκριμένες ενώσεις (ειδικός ανιχνευτής).

15 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΔΙΑΘΕΣΙΜΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΤΩΝ HPLC Είδος ανιχνευτή LOD Γραμμική περιοχή (τάξεις) Απορρόφησης 10 pg 3-4 Φθορισμού 10 fg 5 Ηλεκτροχημικός 100 pg 4-5 Διαθλασίμετρο 1 ng 3 Αγωγιμομετρικός 100 pg 1 ng 5 MS < 1 pg 5 FTIR 1 μg 3 Σκέδασης φωτός 1 μg 5

16 ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ (UV- Vis) Αποτελούν τους πλέον δημοφιλείς ανιχνευτές LC (καλύπτουν ~80% των εφαρμογών). Πραγματοποιείται μέτρηση της απορρόφησης στο UV ή στο Vis. Η ευαισθησία τους εξαρτάται από την μοριακή απορροφητικότητα των διαφόρων συστατικών. Όρια ανίχνευσης: Από μg/l έως mg/l. Οι διαλύτες δεν πρέπει να απορροφούν στο μήκος κύματος που επιλέγεται για μέτρηση της απορρόφησης. Δεν επηρεάζονται από διακυμάνσεις ροής και θερμοκρασίας. Ανταποκρίνονται με επιτυχία σε περιπτώσεις βαθμωτής έκλουσης.

17 ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΑΝΙΧΝΕΥΤΩΝ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ (UV-Vis) Απλά φωτόμετρα (σταθερού μήκους κύματος): Λυχνία Hg. Φίλτρα: 254 (συνήθως), 334, 365 nm. Χαμηλό κόστος, μεγάλη ευαισθησία, μικρή μετατόπιση της γραμμής βάσης. Φασματοφωτόμετρα UV-Vis (μεταβαλλόμενου μήκους κύματος): Φασματοφωτόμετρα σάρωσης με οπτικό φράγμα. Μπορούν να επιλεγούν διαφορετικά μήκη κύματος για κάθε κορυφή. Λυχνία: Δευτερίου και βολφραμίου. Οι πλέον δημοφιλείς ανιχνευτές. Ανιχνευτές συστοιχίας φωτοδιόδων (photodiode array, PDA): 1024 φωτοδίοδοι τοποθετημένες μετά το φράγμα ταυτόχρονη μέτρηση της απορρόφησης σε όλα τα μήκη κύματος του φράγματος. Τρισδιάστατη απεικόνιση ταυτοποίηση κορυφών, έλεγχος συνεκλουόμενων συστατικών. Μειονέκτημα: Υψηλό κόστος.

18 ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ Φασματοφωτομετρικός ανιχνευτής υπεριώδους- ορατού.

19 ΑΝΙΧΕΥΤΗΣ ΣΥΣΤΟΙΧΙΑΣ ΦΩΤΟΔΙΟΔΩΝ (PHOTODIODE ARRAY) Τρισδιάστατο φάσμα: Χρόνος ανάσχεσης, μήκος κύματος, απορρόφηση.

20 ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ Λυχνία: Hg, Xe με φίλτρα ή μονοχρωμάτορα. Υψηλή ευαισθησία και εκλεκτικότητα. Όρια ανίχνευσης: Επίπεδα από μg/l έως ng/l. Εφαρμογές: Αρωματικοί υδρογονάνθρακες, βιολογικά προϊόντα. Δυνατότητα μετατροπής μιας ουσίας σε φθορίζουσα μέσω χημικής αντίδρασης ΜΕΤΑ τον διαχωρισμό της από την στήλη (post-column derivatization). Στην τελευταία περίπτωση απαιτείται αντιδραστήρα στον οποίο αναμιγνύεται η έξοδος της υγροχρωματογραφικής στήλης (διαχωριζόμενα συστατικά) με κατάλληλο αντιδραστήριο με χρήση πρόσθετης αντλίας.

21 ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ ΔΕΙΚΤΗ ΔΙΑΘΛΑΣΗΣ (ΔΙΑΘΛΑΣΙΜΕΤΡΟ) Γενικός ανιχνευτής (ιδιότητας διαλύματος), ανταποκρίνεται σε κάθε δείγμα. Μέτρηση διαφοράς δείκτη διάθλασης καθαρού διαλύτη κινητής φάσης και εκλούσματος. Όρια ανίχνευσης: Σχετικά υψηλά (mg/l). Επηρεάζεται από την θερμοκρασία. Δυσκολία σύζευξης με συστήματα βαθμωτής έκλουσης.

22 ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ Κυρίως αμπερομετρικοί ανιχνευτές: Μετρούν το ρεύμα κατά την οξείδωση ή την αναγωγή διαφόρων ουσιών. Ευαίσθητοι και εκλεκτικοί ανιχνευτές. ΑΛΛΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ ICP-MS: Ο πλέον κατάλληλος ανιχνευτής για αναλύσεις ειδοταυτοποίησης (ποσοτικός προσδιορισμός διαφόρων ειδών στοιχείων μετά τον διαχωρισμό τους από την χρωματογραφική στήλη). AAS. FTIR. ICP-OES.

23 ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΚΑΤΑΝΟΜΗΣ Υπόστρωμα: Ευρύτατη χρήση πυριτίας (σίλικα). Μεγαλομόριο με ελεύθερες ομάδες Si-OH στην επιφάνεια της πολικός χαρακτήρας. Προσοχή: Αδυναμία να χρησιμοποιηθεί σε αλκαλικές τιμές ph.

24 ΧΗΜΙΚΑ ΣΥΝΔΕΔΕΜΕΝΗ ΠΥΡΙΤΙΑ Αρχικό υπόστρωμα: Σιλανοποίηση Κάλυψη ελεύθερων σιλανίων:

25 ΠΟΛΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΗ ΠΟΛΙΚΕΣ ΦΑΣΕΙΣ Πολικές: R: -(CH 2 ) 3 NH 2, -(CH 2 ) 3 N(CH 3 ) 2, -(CH 2 ) 3 CN, διόλες. Μη Πολικές: R: -(CH 2 ) 7 CH 3 (Ομάδα C8), -(CH 2 ) 17 CH 3 (Ομάδα C18). ΚΑΝΟΝΙΚΗΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΟΥ ΦΑΣΕΩΣ Κανονικής Φάσης: Στατική Φάση: ΠΟΛΙΚΗ (συνδεδεμένα νιτρίλια ή αμίνες). Κινητή φάση: ΜΗ ΠΟΛΙΚΗ (π.χ. n-εξάνιο, τετραχλωράνθακας, αιθέρας). Το πολικότερο συστατικό του δείγματος εκλούεται τελευταίο. Αύξηση πολικότητας κινητής φάσης Μείωση χρόνου συγκράτησης. Αντιστρόφου φάσεως: Στατική φάση: ΜΗ ΠΟΛΙΚΗ (συνδεδεμένα οκτύλια ή δεκαοκτύλια). Κινητή Φάση: ΠΟΛΙΚΗ (Νερό, μεθανόλη, ακετονιτρίλιο, οξικό οξύ, κ.λ.π.). Το πολικότερο συστατικό του δείγματος εκλούεται πρώτο. Μείωση πολικότητας κινητής φάσης (π.χ. προσθήκη MeOH, CH 3 CN) Μείωση χρόνου συγκράτησης.

26 Ποια η σειρά πολικότητας των Α, Β και C;

27 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΖΕΥΓΟΥΣ ΙΟΝΤΩΝ (ION PAIR) Δυνατότητα προσδιορισμού ιοντικών ενώσεων με υγροχρωματογραφία αντιστρόφου φάσεως. Η πολική κινητή φάση περιέχει ΚΑΙ μια ιοντική ουσίααντισταθμιστικό ιόν αντιθέτου φορτίου με τον αναλύτη Σχηματισμός ουδέτερου ζεύγους ιόντων που κατακρατείται από την μη πολική στήλη. Αμίνες: Κυρίως σουλφονικά ιόντα, π.χ. C 12 H 25 SO 3-. Οργανικά Οξέα: Προσθήκη αλάτων τεταρτοταγούς αμμωνίου, π.χ. (C 8 H 17 ) 4 N +.

28 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ (HPLC + ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ) Φάρμακα: Προσδιορισμός φαρμακευτικών ενώσεων και προϊόντων διάσπασης τους σε σκευάσματα. Βιοχημεία: Προσδιορισμός μορίων βιολογικού ενδιαφέροντος (π.χ. αμινοξέα, πρωτεϊνες, νουκλεϊνικά οξέα). Τρόφιμα: Προσδιορισμός συντηρητικών, τεχνητών γλυκαντικών, αντιοξειδωτικών, διαφόρων προσθέτων, αφλατοξινών. Περιβάλλον: Προσδιορισμός οργανικών ρυπαντών (π.χ. διοξίνες, χλωριωμένοι υδρογονάνθρακες, υπολείμματα φυτοφαρμάκων, υπολείμματα φαρμακευτικών ενώσεων). Τοξικολογία- Κλινική Ανάλυση: Προσδιορισμός επιπέδων φαρμάκων και ναρκωτικών σε βιολογικά υγρά, antidoping control.

29 Βενζολίου και Προπυλοβενζολίου. Cl - και SO ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Να προταθεί ένας τύπος υγροχρωματογραφίας που είναι κατάλληλος για τον διαχωρισμό των παρακάτω: Πρωτεΐνες υψηλού μοριακού βάρους. Μελετάται ο διαχωρισμός σαλικυλικού οξέος (pk a = 3.0), ακετυλοσαλικυλικού οξέος (pk a = 3.5) και παρακεταμόλης (pk a = 10.0) με χρωματογραφία αντιστρόφου φάσεως (C18) και κινητή φάση ρυθμιστικό διάλυμα ph 6.0 με 10% MeOH. Ποια θα είναι η επίπτωση στους χρόνους έκλουσης των 3 ενώσεων εάν: α) Προστεθεί στην κινητή φάση (C 8 H 17 ) 4 NBr. β) Μεταβληθεί το ph της κινητής φάσης σε 3.5 γ) Αυξηθεί η περιεκτικότητα της MeOH στην κινητή φάση σε 20%.