ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Φαρμακοχημεία Φυσικά Προϊόντα: Σχεδιασμός, Σύνθεση και Ανάλυση Βιοδραστικών Ενώσεων Διατριβή Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης Υπολογιστική μελέτη Δομής και Δυναμικής βιομοριακών συμπλόκων της α1 υπομονάδας του νικοτινικού υποδοχέα της Ακετυλοχολίνης (nachr) με άλφα νευροτοξίνες. Δημητρόπουλος Νικόλαος Φαρμακοποιός Πάτρα 2010

2

3 Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή 1. Αναπληρωτής Καθηγητής Γεώργιος Α. Σπυρούλιας (επιβλέπων) Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 2. Καθηγητής Σωκράτης Τζάρτος Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 3. Επίκουρος Καθηγητής Κωνσταντίνος Πουλάς Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών

4

5 Ευχαριστίες Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών από τον Οκτώβριο του 2008 έως το Σεπτέμβριο του 2010, στα πλαίσια της απόκτησης του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης. Θα ήθελα να εκφράσω τις πιο θερμές ευχαριστίες στον επιβλέποντά μου, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Σπυρούλια, για την επιστημονική συμβουλή, τη συνεχή καθοδήγηση και εμπιστοσύνη όλο αυτό το χρονικό διάστημα. Τον ευχαριστώ ιδιαίτερα για την ευκαιρία που μου έδωσε να ασχοληθώ με ενδιαφέροντα επιστημονικά θέματα, καθώς και την προτροπή του να εκπαιδευτώ σε πολλές διαφορετικές τεχνικές στο ερευνητικό πεδίο μου. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, τον Καθηγητή κ. Σωκράτη Τζάρτο και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Πουλά, για τις πολύτιμες συμβολές τους και την πολύ καλή συνεργασία μας σε εκπαιδευτικά και ερευνητικά θέματα. Δε θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω το Δρ. Αθανάσιο Παπακυριακού και τον υποψήφιο Διδάκτορα Γεώργιο Δάλκα για τις γνώσεις και συμβουλές που μου προσέφεραν. Ιδιαίτερη αναφορά πρέπει να γίνει στην υποψήφια Διδάκτορα Ζηνοβία Σπυράντη για τις συμβουλές της στη συγγραφή και παρουσίαση του τελικού κειμένου. Ευχαριστώ θερμά τα μέλη του εργαστηρίου Χρήστο Χασάπη, Αριάδνη Λουτσίδου, Πέτρο Γκαζώνη και Κατερίνα Αργυρίου για την ευχάριστη συνεργασία και το πολύ φιλικό περιβάλλον. Ευχαριστώ επίσης όλους τους φίλους μου για την ηθική συμπαράσταση και το κουράγιο που μου έδωσαν. Τέλος, ευχαριστώ θερμά τους γονείς μου και τους αδερφούς μου για την αμέτρητη στήριξή τους όλα αυτά τα χρόνια.

6

7 Περιεχόμενα Περιεχόμενα Περίληψη Abstract v vii Α. Θεωρητικό Μέρος 1 Α.1. Νικοτινικός Υποδοχέας Ακετυλοχολίνης 3 Α.1.1. Μυϊκού τύπου nachrs 3 Α.1.2. Νευρικού τύπου nachrs 5 Α.2. Δομή του nachr Α.2.1. Πρωτοταγής δομή των nachr υπομονάδων 8 Α.2.2. Δευτεροταγής και Τριτοταγής Δομή του nachr 9 A Δομή της AChBP 11 Α Ατομική δομή της θέσης πρόσδεσης ACh 13 Α Πρόσδεση αγωνιστών στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών της AChBP 15 Α Πρόσδεση ανταγωνιστών στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών της AChBP 17 Α Επαγόμενες δομικές αλλαγές κατά την πρόσδεση υποκαταστατών 19 A Δομή του μυϊκού τύπου nachr 21 Α Άνοιγμα του καναλιού του nachr 25 Α Δομή της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του μυϊκού τύπου nachr 28 Α Δομή προκαρυωτικών LGICs 31 Α.3. Λειτουργία του nachr 34 Α.3.1. Λειτουργία μυϊκού τύπου nachrs 34 Α.3.2. Λειτουργία νευρικού τύπου nachrs 35 Α.3.3. Αλλοστερικές καταστάσεις του nachr 37 i

8 Περιεχόμενα B. Υπολογιστικές Μέθοδοι 39 Β.1. Πρόβλεψη και Προσομοίωση Δομών Πρωτεϊνών 41 Β.1.1. Γενικά 41 Β.1.2. Προσομοίωση μέσω Ομολογίας 43 Β.1.3. Πρόβλεψη δομής με το λογισμικό MODELLER 46 Β.2. Προσομοίωση Σύμπλεξης/Πρόσδεσης Μορίων 48 Β.2.1. Γενικά 48 Β.2.2. Μοριακή Προσομοίωση Πρόσδεσης 48 Β.2.3. Ευρετικοί αλγόριθμοι 49 Β.2.4. Συνάρτηση υπολογισμού της ενέργειας 50 Β.2.5. Στρατηγική της μελέτης ενός συμπλόκου υποδοχέα υποκαταστάτη μέσω Προσομοίωσης Πρόσδεσης 51 Β.2.6. Προσομοίωση Πρόσδεσης με το λογισμικό AutoDock 52 Β.3. Προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής Βιομορίων 57 Β.3.1. Γενικά 57 Β.3.2. Αρχές Στατιστικής Μηχανικής 58 Β.3.3. Κλασσική Μηχανική 59 Β.3.4. Πεδίο δυνάμεων 61 Β.3.5. Προσομοίωση παρουσία διαλύτη 66 Β.3.6. Προετοιμασία και εκτέλεση προσομοιώσεων Μοριακής Δυναμικής 68 Γ. Σκοπός Εργασίας 71 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση 77 Δ.1. Ανάλυση των προσομοιώσεων ΜΔ 79 Δ.1.1. Αποτίμηση ποιότητας του ομολογιακού μοντέλου 79 Δ.1.2. Σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ποντικού με α Btx 82 Δ.1.3. Σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου με α Btx 85 Δ.1.4. Σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου με α Cbtx 89 Δ.1.5. Σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου με α Ctx ImI 92 ii

9 Περιεχόμενα Δ.1.6. Σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου με α Ctx GI 95 Δ.2. Συγκριτική μελέτη των αποτελεσμάτων προσομοίωσης 98 Δ.2.1. Σύγκριση του μοντέλου της α1 ΕΚΠ ποντικού με την κρυσταλλογραφική δομή 98 Δ.2.2. Είσοδος μορίων νερού στην υδρόφιλη κοιλότητα της α1 ΕΚΠ 99 Δ.2.3. Διαφορές μεταξύ των μοντέλων της α1 ΕΚΠ ανθρώπου και της α1 ΕΚΠ ποντικού 100 Δ.2.4. Ο ρόλος της γλυκοζυλίωσης στην πρόσδεση τοξινών στην α1 ΕΚΠ 102 Δ.3. Συμπεράσματα 105 Ε. Πειραματικό Μέρος 109 Ε.1. Δημιουργία αρχικών μοντέλων 111 Ε.1.1. Προσομοίωση μέσω ομολογίας της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου nachr 111 Ε.1.2. Δημιουργία συμπλόκων της α1 υπομονάδας με α νευροτοξίνες και προσθήκη υδατανθρακικής αλυσίδας 112 Ε.1.3. Δημιουργία συμπλόκων της α1 υπομονάδας με α κωνοτοξίνες 114 Ε.2. Μοριακή Δυναμική 116 Ε.2.1. Προετοιμασία των δομικών μοντέλων για προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής 116 Ε.2.2. Προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής 117 ΣΤ. Βιβλιογραφία 121 Ζ. Παράρτημα 133 Ζ.1. Δεδομένα προσομοιώσεων Μοριακής Προσομοίωσης 135 Ζ.2. Συντμήσεις 137 Ζ.3. Δημοσίευση 139 iii

10 iv

11 Περίληψη Περίληψη Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nachrs) ανήκουν στην υπεροικογένεια των ιοντικών καναλιών που ενεργοποιούνται από τη δέσμευση ενός προσδέτη (LGICs) και αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες. Κάθε μονομερής υπομονάδα αποτελείται από μία Ν τελική εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ), από τέσσερεις διαμεμβρανικές α έλικες και από μία κυτταροπλασματική περιοχή. Στην ΕΚΠ βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπερ οικογένειας, καθώς και οι θέσεις πρόσδεσης αγωνιστών και ανταγωνιστών του υποδοχέα. Οι γνώσεις μας γύρω από τη δομή των nachrs προέρχονται κυρίως από κρυσταλλογραφικές δομές ομολόγων πρωτεϊνών δέσμευσης της ACh (AChBP) μαλακίων, από μια δομή του nachr από ιχθείς του γένους Torpedo που προέρχεται από ηλεκτρονική μικροσκοπία, από την κρυσταλλογραφική δομή της α1 ΕΚΠ ποντικού σε σύμπλοκο με α μπουγκαροτοξίνη (α Btx) και από κρυσταλλογραφικές δομές δύο προκαρυωτικών LGICs. Παρά τη μεγάλη πρόοδο που πραγματοποιήθηκε με τα παραπάνω επιτεύγματα, ακόμη δεν έχει επιλυθεί πειραματικά η δομή ανθρώπινου υποδοχέα. Επίσης λίγα είναι γνωστά για την επίδραση της γλυκοζυλίωσης των ΕΚΠ στη λειτουργία του nachr. Χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου α1 ΕΚΠ ποντικού/α Btx δημιουργήθηκαν υπολογιστικά μοντέλα της ανθρώπινης α1 ΕΚΠ προσδεμένης στις τοξίνες α μπουγκαροτοξίνη (α Btx), α κομπρατοξίνη (α Cbtx), α κωνοτοξίνη (α Ctx) ImI και α κωνοτοξίνη GI. Στα σύμπλοκα με α Btx και α Cbtx προστέθηκε η υδατανθρακική αλυσίδα, συνδεδεμένη με το κατάλοιπο Asn141, που συγκρυσταλλώθηκε μαζί με την α1 ΕΚΠ ποντικού. Για να μελετηθεί η δυναμική συμπεριφορά της αλληλεπίδρασης υποδοχέα τοξίνης καθώς και η συνεισφορά των σακχάρων σε αυτήν πραγματοποιήθηκαν προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής σε υδατικό περιβάλλον. Με τη χρήση υπολογιστικών εργαλείων για τη μελέτη των συμπλόκων προσδιορίστηκαν σε ατομικό επίπεδο οι αλληλεπιδράσεις που καθοδηγούν την πρόσδεση τοξινών στην α1 ΕΚΠ. Βρέθηκε ότι η υδατανθρακική αλυσίδα συμμετέχει δυναμικά στη δέσμευση της τοξίνης στον υποδοχέα. Τα σάκχαρα συγκλίνουν προς την προσδεμένη τοξίνη στηριζόμενα στα κατάλοιπα Ser187 και Trp184 της α1 υπομονάδας. Η v

12 Περίληψη τοξίνη επίσης μετακινείται φέρνοντας τη θηλιά Ι σε επαφή με τα σάκχαρα. Αναγνωρίστηκαν σημαντικές αλληλεπιδράσεις των σακχάρων με τα τοξινικά κατάλοιπα Thr6, Ser9, και Th15 της α Btx και Thr6 και Pro7 της α Cbtx. Επίσης επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη μιας υδρόφιλης κοιλότητας στο εσωτερικό του υδρόφοβου πυρήνα της α1 ΕΚΠ, η οποία πιθανόν εμπλέκεται στο άνοιγμα του ιοντικού καναλιού του nachr. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν σημαντικά δεδομένα για την κατανόηση της επίδρασης της υδατανθρακικής αλυσίδας στη λειτουργία του υποδοχέα, η οποία μπορεί να αξιοποιηθεί στην αντιμετώπιση των πολλών παθολογικών καταστάσεων στις οποίες εμπλέκονται οι nachrs. vi

13 Abstract Abstract Nicotinic acetylcholine receptors (nachrs) belong to the superfamily of ligandgated ion channels (LGICs). LGICs form homo or hetero pentamers of related subunits, and each of them consists of a N terminal extracellular ligand binding domain (ECD), four transmembrane α helixes and an intracellular region. The characteristic Cys loop of the superfamily is found in the ECD of each subunit. The ECD also contains binding sites for agonists and competitive antagonists. Our knowledge regarding the nachr structure mainly derives from the X ray crystal structures of the molluscan ACh binding proteins (AChBPs), the electron microscopy structure of the Torpedo nachr, the X ray crystal structure of the mouse nachr α1 ECD bound to α bungarotoxin (α Btx), and the X ray crystal structures of two prokaryotic LGICs. Despite the progress made by these achievements, the determination of any human nachr structure has not yet been accomplished. Furthermore, the effect of glycosylation on nachr function has not yet been explored. Based on the crystal structure of the extracellular domain of the mouse nachr α1 subunit bound to α Btx we have generated in silico models of the human nachr α1 ECD bound to the toxins α bungarotoxin (α Btx), α cobratoxin (α Cbtx), α conotoxin (α Ctx) ImI and α conotoxin GI. In the case of the α1 ECD/α Btx and α Cbtx complexes, a Asn141 linked carbohydrate chain was modeled, its coordinates taken from the crystal structure of the mouse α1 ECD. To gain further insight into the structural role of glycosylation molecular dynamics (MD) simulations were carried out in explicit solvent so as to compare the conformational dynamics of the binding interface between nachr α1 and the two toxins. The use of computational methods allowed the monitoring of the interactions that govern toxin binding. The MD simulations revealed the strengthening of the receptortoxin interaction in the presence of the carbohydrate chain. A shift in the position of the sugars towards the bound toxin was observed. Residues Ser187 and Trp184 of nachr act as critical anchor points for the stabilization of the sugar chain in a close position to the toxin. Toxin Finger I shifts closer to the mannoses, forming important toxin sugar interactions that implicate residues Thr6, Ser9, and Thr15 of α Btx, as well as Thr6 and vii

14 Abstract Pro7 of α Cbtx. Additionally the MD simulations of the human α1 ECD toxin complexes confirmed the possible accommodation of two water molecules into a hydration cavity inside the hydrophobic core of the subunit, which may contribute to the gating mechanism of the receptor. These findings provide additional structural data that are intended to inspire biophysical studies on the functional role of glycosylation in the gating mechanism of nachr and also guide the development of novel therapeutic agents for the treatment of nachr associated diseases. viii

15 Ενότητα Α Θεωρητικό Μέρος

16

17 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.1. Νικοτινικός Υποδοχέας Ακετυλοχολίνης Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nachrs) είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες οι οποίες ανταποκρίνονται στην πρόσδεση της ακετυλοχολίνης, η οποία συντίθεται, αποθηκεύεται και εκκρίνεται από τους χολινεργικούς νευρώνες. Ανήκουν στην υπερ οικογένεια των ιοντικών καναλιών που ενεργοποιούνται από την δέσμευση ενός προσδέτη (LGICs: Ligand gated ion channels). Άλλα μέλη της υπερ οικογένειας αποτελούν οι υποδοχείς της 5 υδροξυτρυπταμίνης (5 ΗΤ 3 ) ή σεροτονίνης, [1] της γλυκίνης (Gly) [2] και του γ αμινοβουτυρικού οξέος τύπου Α και C (GABA A, GABA C ). [3] Τα ιοντικά αυτά κανάλια συγκροτούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες διευθετημένες περιμετρικά ενός κεντρικού πόρου, [4] καθεμία από τις οποίες αποτελείται από μία Ν τελική (μήκους περίπου 210 αμινοξικών καταλοίπων στην περίπτωση των nachrs) εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ), από τέσσερεις διαμεμβρανικές α έλικες (M1 M4) και από μία κυτταροπλασματική περιοχή (ΚΠ) μεταξύ της M3 και M4 έλικας. [5] Στην Ν τελική εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ) κάθε υπομονάδας βρίσκεται η χαρακτηριστική θηλιά 13 αμινοξέων μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων κυστεΐνης (Cys) συνδεδεμένων με δισουλφιδικό δεσμό. Για το λόγο αυτό οι υποδοχείς αυτοί ονομάζονται επίσης υποδοχείς Cys θηλιάς (Cys loop receptors). [6 8] Οι διαφορετικοί υποδοχείς μέλη της υπεροικογένειας εμφανίζουν κοινά δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά και τα γονίδια που κωδικοποιούν τις ομόλογες υπομονάδες θεωρείται ότι προέρχονται εξελικτικά από το ίδιο αρχέγονο γονίδιο. [9,10] Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά, οι nachrs διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες, στους μυϊκού τύπου και στους νευρικού τύπου. Α.1.1. Μυϊκού τύπου nachrs Οι μυϊκού τύπου nachrs απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σκελετικών μυών των σπονδυλωτών, καθώς και στα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων του γένους Torpedo και Electrophorus. Οι μυϊκού τύπου nachrs (Εικόνα Α1.Α) σχηματίζονται από τέσσερεις διαφορετικούς τύπους υπομονάδων (α1, β1, γ ή ε και δ) που οργανώνονται ως ετεροπενταμερή με στοιχειομετρία 3

18 Α. Θεωρητικό Μέρος υπομονάδων (α) 2 βγδ στα ηλεκτρικά όργανα των Torpedo και Electrophorus και (α1) 2 β1γδ ή (α1) 2 β1εδ στα εμβρυϊκά ή ενήλικα άτομα θηλαστικών, αντίστοιχα. [11,12] Η αντικατάσταση της γ από την ε υπομονάδα ξεκινά αμέσως μετά τη γέννηση και ολοκληρώνεται μέσα στις δύο πρώτες εβδομάδες μετά από αυτή. [13,14] Η παρουσία της γ ή της ε υπομονάδας στο πενταμερές μόριο του υποδοχέα επηρεάζει τα μεταβολικά και φαρμακολογικά χαρακτηριστικά του, καθώς και την αγωγιμότητα του ιοντικού καναλιού. Έτσι, ο εμβρυϊκού τύπου μυϊκός nachr παρουσιάζει χαμηλή αγωγιμότητα και μεγαλύτερη διάρκεια επαγόμενου ρεύματος, ενώ ο ενήλικου τύπου nachr αποτελεί κανάλι υψηλής αγωγιμότητας με επαγόμενο ρεύμα μικρότερης διάρκειας. [15 17] ΕΚΠ ΚΠ Εικόνα Α1. [18] (Α) Σχηματική αναπαράσταση της πρωτοταγούς δομής των υπομονάδων α1, β1, γ, δ και ε του μυϊκού τύπου nachr. Σημειώνονται η εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ), οι τέσσερεις διαμεμβρανικές α έλικες (M1 M4), η κυτταροπλασματική περιοχή (ΚΠ), οι δισουλφιδικοί δεσμοί και οι θέσεις γλυκοζυλίωσης. (Β) Διάταξη των υπομονάδων των υποτύπων του μυϊκού τύπου nachr. Οι θέσεις πρόσδεσης υποκαταστατών αναπαρίστανται με λευκά τρίγωνα. Οι μυϊκού τύπου nachrs διαθέτουν δύο θέσεις πρόσδεσης της ACh και άλλων χολινεργικών προσδετών στα εξωκυττάρια τμήματά τους (Εικόνα Α1.Β). Η μία θέση πρόσδεσης σχηματίζεται μεταξύ της μίας α1 και της γ υπομονάδας (ή ε στα ενήλικα 4

19 Α. Θεωρητικό Μέρος άτομα), ενώ η άλλη σχηματίζεται μεταξύ της δεύτερης α1 και της δ υπομονάδας. [19] Η παρουσία διαφορετικών υπομονάδων, οι οποίες συνεργάζονται με την α1 για να σχηματίσουν τη θέση πρόσδεσης των αγωνιστών, προκαλεί διαφορετική συγγένεια για τους αγωνιστές στις δύο ξεχωριστές θέσεις πρόσδεσης. [20] [21] Για παράδειγμα, η θέση πρόσδεσης μεταξύ της α1 και γ (ε) υπομονάδας εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης για τον ανταγωνιστή δ τουμποκουραρίνη από την θέση πρόσδεσης μεταξύ της α1 και δ υπομονάδας. [22,23] Ο μυϊκού τύπου υποδοχέας ενέχεται σε πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, η πλειονότητα των οποίων έχει ως επακόλουθο την εξασθένηση της νευρομυϊκής διαβίβασης και κατά συνέπεια μυϊκή αδυναμία. Το επίκτητο αυτοάνοσο νόσημα βαριά μυασθένεια είναι το πιο κοινό και καλύτερα μελετημένο, το οποίο προκαλείται από αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα. [18,24] Η πλειονότητα των αντιnachr αντισωμάτων κατευθύνονται έναντι της κύρια ανοσογόνου περιοχής (MIR), που βρίσκεται στην α ΕΚΠ. Υπάρχουν επίσης μερικές σπάνιες κληρονομικές ασθένειες, γνωστές ως συγγενή μυασθενικά σύνδρομα, οι οποίες επηρεάζουν την έκκριση της ακετυλοχολίνης, τη λειτουργία της ακετυλοχολινεστεράσης, καθώς επίσης και τη λειτουργία ή τον αριθμό των υποδοχέων μυϊκού τύπου στη νευρομυϊκή σύναψη. Α.1.2. Νευρικού τύπου nachrs Οι νευρικού τύπου nachrs εκφράζονται ευρέως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα σπονδυλωτών και εντόμων, στα περιφερικά γάγγλια, καθώς και σε μη νευρικούς ιστούς, όπως είναι τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Οι νευρικού τύπου υποδοχείς σχηματίζονται από υπομονάδες τύπου α και τύπου β. Μέχρι σήμερα έχουν κλωνοποιηθεί εννέα διαφορετικές υπομονάδες τύπου α (α2 α10) και τρεις υπομονάδες τύπου β (β2 β4) που λαμβάνουν μέρος στο σχηματισμό του νευρικού τύπου υποδοχέα. [25] Οι νευρικού τύπου nachrs απαντούν είτε ως ετεροπενταμερή, συγκροτούμενα συνήθως από δύο υπομονάδες τύπου α (α2 α6) και από τρεις υπομονάδες τύπου β (β2 β4), είτε ως ομοπενταμερή, τα οποία συγκροτούνται από α υπομονάδες (α7 α9) (Εικόνα Α2.Α). Οι νευρικού τύπου υπομονάδες α7 α9 σχηματίζουν επίσης ετεροπενταμερή 5

20 Α. Θεωρητικό Μέρος σύστασης α7/α8 και α9/α10. [26] Στους ετεροπενταμερείς νευρικού τύπου nachrs σχηματίζονται δύο θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών μεταξύ των α και β υπομονάδων, ενώ στους ομοπενταμερείς σχηματίζονται πέντε θέσεις πρόσδεσης μεταξύ των α υπομονάδων τους. Οι φαρμακολογικές ιδιότητες των ετεροπενταμερών και ομοπενταμερών νευρικού τύπου nachrs διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους. Έτσι, οι νευρικού τύπου ετεροπενταμερείς nachrs, εμφανίζουν υψηλή συγγένεια πρόσδεσης αγωνιστών (της τάξεως των nm), ενώ δεν προσδένουν τον ανταγωνιστή α μπουγκαροτοξίνη (α Btx), σε αντίθεση με τους νευρικού τύπου ομοπενταμερείς nachrs (α7 α9), οι οποίοι εμφανίζουν χαμηλότερη μεν συγγένεια πρόσδεσης αγωνιστών (της τάξεως των μm), αλλά υψηλή συγγένεια πρόσδεσης α Btx (της τάξεως των nm). [18] Η έκφραση των υποδοχέων νευρικού τύπου ποικίλει σε διαφορετικά κύτταρα και νευρώνες, τα οποία εντοπίζονται στα διαφορετικά μέρη του νευρικού συστήματος (Εικόνα Α2.Β). Οι κύριοι νευρικού τύπου ετεροπενταμερείς υποδοχείς nachr στον εγκέφαλο των θηλαστικών είναι οι (α4) 2 (β2) 3, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από υψηλή συγγένεια πρόσδεσης για την νικοτίνη, [27,28] ενώ υπάρχουν και δευτερεύοντες υπότυποι με τη συμμετοχή και της α5 υπομονάδας. [29] Επίσης, οι κύριοι νευρικού τύπου ετεροπενταμερείς υποδοχείς nachr στα γάγγλια των θηλαστικών είναι οι (α3) 2 (β4) 3, ενώ έχουν εντοπισθεί και υπότυποι με την επιπλέον συμμετοχή β2, β4 και α5 υπομονάδων. [30,31] Για τους νευρικού τύπου ομοπενταμερείς nachr ο κύριος υπότυπος τόσο στον εγκέφαλο, όσο και στα γάγγλια είναι ο α7. [18,32 35] Οι α7 nachrs έχουν εντοπισθεί και σε μη νευρικά κύτταρα, όπως σε αναπτυσσόμενα μυϊκά, [36] καθώς και σε μακροφάγα κύτταρα. [37] Οι α8 nachrs έχουν εντοπιστεί μόνο στο νευρικό σύστημα όρνιθας ως ομοπενταμερή ή σε συνδυασμούς με α7 υπομονάδες, ενώ οι α9 nachrs εντοπίζονται μόνο στον κοχλία και στα αισθητικά γάγγλια του νευρικού συστήματος του αρουραίου. [38] Χαρακτηριστικό γνώρισμα των α7 α9 ομοπενταμερών nachrs είναι η υψηλή διαπερατότητά τους σε ιόντα Ca 2+. [38 40] Η μεγάλη ποικιλία των υπότυπων των νευρικού τύπου nachrs, με διαφορετικές φυσιολογικές και φαρμακολογικές ιδιότητες, ευθύνεται για τη συμμετοχή τους σε πολλές και διαφορετικές λειτουργίες του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος, όπως είναι ο έλεγχος της έκκρισης νευροδιαβιβαστικών ουσιών, ο έλεγχος των εκούσιων κινήσεων, η ρύθμιση της θερμοκρασίας του σώματος, καθώς και η ρύθμιση πολύπλοκων ανώτερων πνευματικών διεργασιών, όπως η μνήμη, η μάθηση και η συμπεριφορά. [41] Οι 6

21 Α. Θεωρητικό Μέρος νευρικού τύπου nachrs εμπλέκονται επίσης σε μία πληθώρα παθολογικών καταστάσεων και δυσλειτουργιών του νευρικού συστήματος, όπως είναι η νόσος του Alzheimer, η νόσος του Parkinson, η κατάθλιψη, η σχιζοφρένεια και ορισμένοι τύποι επιληψίας, ενώ ενέχονται στον εθισμό στη νικοτίνη. [42] ΕΚΠ ΚΠ Εικόνα Α2. [18] (Α) Σχηματική αναπαράσταση της πρωτοταγούς δομής των υπομονάδων α2 α9 και β2 β4 του μυϊκού τύπου nachr. Σημειώνονται η εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ), οι τέσσερεις διαμεμβρανικές α έλικες (M1 M4), η κυτταροπλασματική περιοχή (ΚΠ), οι δισουλφιδικοί δεσμοί και οι θέσεις γλυκοζυλίωσης. (Β) Διάταξη των υπομονάδων των υποτύπων του νευρικού τύπου nachr. Οι θέσεις πρόσδεσης υποκαταστατών αναπαρίστανται με λευκά τρίγωνα. 7

22 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.2. Δομή του nachr Α.2.1. Πρωτοταγής δομή των nachr υπομονάδων Χάρη στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA προσδιορίστηκαν αρχικά τα cdnas των α, [43] β, [44] γ [45] και δ [44] υπομονάδων του Torpedo californica nachr. Αυτά χρησιμοποιήθηκαν ως ιχνηθέτες για την απομόνωση cdna και γενομικού DNA των nachr υπομονάδων μυϊκού και νευρικού τύπου από διάφορα είδη οργανισμών έτσι ώστε σήμερα να είναι γνωστές οι νουκλεοτιδικές και αμινοξικές ακολουθίες τους. [46 51] Η σύγκριση της πρωτοταγούς δομής των τεσσάρων υπομονάδων (α, β, γ, δ) του Torpedo californica nachr κατέδειξε ένα σημαντικό ποσοστό ομολογίας (35 50%). [46,52] Αντίστοιχη ομολογία βρέθηκε και για τις διαφορετικές υπομονάδες του ανθρώπινου μυϊκού τύπου nachr, ενώ ακόμα υψηλότερα ποσοστά ομολογίας προκύπτουν από την σύγκριση της ίδιας υπομονάδας μεταξύ διαφορετικών ειδών. Για παράδειγμα, η α1 υπομονάδα από Torpedo californica εμφανίζει 80% ομολογία με την ανθρώπινη α1. [53] Υψηλά ποσοστά ομολογίας εμφανίζονται επίσης μεταξύ των υπομονάδων των nachrs νευρικού τύπου του ίδιου είδους αλλά και μεταξύ διαφορετικών ειδών, καθώς και μεταξύ αντίστοιχων υπομονάδων του μυϊκού και νευρικού τύπου. [54] Για παράδειγμα, η ανθρώπινη α7 nachr υπομονάδα παρουσιάζει 93% ομολογία με την α7 όρνιθας και 97% ομολογία με την α7 αρουραίου, ενώ οι διάφορες α και β υπομονάδες αρουραίου εμφανίζουν 40 70% ομολογία μεταξύ τους. [55] Η υψηλή ομολογία μεταξύ των υπομονάδων ενισχύει την άποψη περί ύπαρξης κοινού προγονικού γονιδίου, από το οποίο προήλθαν μέσω εξελικτικών διεργασιών όλα τα γονίδια που τις κωδικοποιούν. Κοινό χαρακτηριστικό όλων των υπομονάδων του nachr αποτελεί η ύπαρξη δύο συντηρημένων καταλοίπων Cys (που αντιστοιχούν στις θέσεις 128 και 142 της μυϊκού τύπου α1 υπομονάδας του Torpedo californica), τα οποία ενώνονται μεταξύ τους με δισουλφιδικό δεσμό σχηματίζοντας μια χαρακτηριστική Cys θηλιά (Cys loop) 13 αμινοξέων. [56] Τα 13 παρεμβαλλόμενα αμινοξέα είναι επίσης συντηρημένα και στο σύνολό τους εμφανίζουν υδρόφοβο χαρακτήρα. Η σχηματιζόμενη Cys θηλιά είναι συντηρημένη σε όλες τις υπομονάδες των υποδοχέων της LGIC υπερ οικογένειας [10] και σε αυτήν οφείλεται και η εναλλακτική ονομασία αυτής της υπερ οικογένειας (Cys loop receptors). Οι α nachr υπομονάδες διαθέτουν ένα επιπλέον ζεύγος γειτονικών 8

23 Α. Θεωρητικό Μέρος καταλοίπων Cys (που αντιστοιχεί στις θέσεις 192 και 193 της α1 υπομονάδας του Torpedo californica), τα οποία συνδέονται επίσης με δισουλφιδικό δεσμό (Εικόνες Α1.Α, Α2.Α). [57] Στο Ν τελικό άκρο κάποιων υπομονάδων υπάρχουν επιπλέον κατάλοιπα κυστεΐνης, για τα οποία δεν είναι γνωστό εάν συμμετέχουν στο σχηματισμό κάποιου ενδομοριακού δισουλφιδικού δεσμού. Συγκεκριμένα, υπάρχει ένα τέτοιο κατάλοιπο κυστεΐνης στις α1, α7, δ, και ε υπομονάδες, και τρία στη γ υπομονάδα. Στην Ν τελική περιοχή όλων των nachr υπομονάδων υπάρχουν διάφορες θέσεις γλυκοζυλίωσης (Εικόνες Α1.Α, Α2.Α). Σε όλες τις nachr υπομονάδες, εκτός από τις α7, α8 και α9, υπάρχει μία συντηρημένη θέση γλυκοζυλίωσης μέσα στην χαρακτηριστική Cysθηλιά, η οποία αντιστοιχεί στην Asn141 της α1 υπομονάδας του μυϊκού τύπου nachr. [58] Επιπλέον έχουν βρεθεί i) μία θέση γλυκοζυλίωσης στις υπομονάδες α3, α6, β2, β3, γ και δ, ii) δύο θέσεις γλυκοζυλίωσης στις υπομονάδες α4, α5, β και ε, και iii) τρεις θέσεις γλυκοζυλίωσης στην α2 υπομονάδα. [59] Η α7 υπομονάδα έχει τρεις θέσεις γλυκοζυλίωσης, ενώ οι α8 και α9 υπομονάδες έχουν δύο θέσεις. [59] Οι αλυσίδες των ολιγοσακχαριτών που προσδένονται σε αυτές τις θέσεις έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε μαννόζη, ενώ κάποιες περιέχουν σιαλικό οξύ. [60 63] Οι διάφορες υπομονάδες του nachr διαθέτουν εξωκυτταρικές, διαμεμβρανικές και κυτταροπλασματικές περιοχές. [64] Κάθε υπομονάδα αποτελείται από: (i) μία Ν τελική υδρόφιλη περιοχή μήκους αμινοξέων, που περιέχει θέσεις δέσμευσης αγωνιστών και ανταγωνιστών, (ii) τέσσερεις διαμεμβρανικές υδρόφοβες περιοχές (Μ1 Μ4), μήκους αμινοξέων, και δύο μικρές υδρόφοβες θηλιές, συνδετικές μεταξύ των ζευγών Μ1 Μ2 και Μ2 Μ3, (iii) μία υδρόφιλη περιοχή ( αμινοξέων) μεταξύ των Μ3 και Μ4 περιοχών στην οποία εντοπίζονται και οι θέσεις φωσφορυλίωσης των nachr υπομονάδων, [65,66] και (iv) ένα υδρόφιλο C τελικό άκρο μήκους 4 28 αμινοξικών καταλοίπων, που βρίσκεται εξωκυτταρικά. [67] Α.2.2. Δευτεροταγής και Τριτοταγής Δομή του nachr Για τον προσδιορισμό της δευτεροταγούς δομής των nachr υπομονάδων χρησιμοποιήθηκαν αρχικά διάφορες μέθοδοι, όπως κυκλικός διχρωϊσμός (CD), υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμού Fourier (FTIR) και συντονισμός Raman. [53,68 72] Οι 9

24 Α. Θεωρητικό Μέρος μελέτες έγιναν κυρίως σε παρασκευάσματα υποδοχέων από Torpedo και οδήγησαν σε αποκλίσεις στα υπολογιζόμενα ποσοστά σύστασης δευτεροταγούς δομής. Οι CD μελέτες έδειξαν σύσταση δευτεροταγούς δομής 24 45% α έλικα και 24 40% β πτυχωτή δομή, οι μελέτες συντονισμού Raman έδειξαν σύσταση 40% α έλικα και 34% β πτυχωτή δομή, ενώ μελέτες FTIR έδειξαν σύσταση 32 33% α έλικα και 36 43% β πτυχωτή δομή. Τα διαμεμβρανικά τμήματα του nachr αρχικά θεωρούνταν ότι είχαν σχεδόν αποκλειστικά δομή α έλικας. [44,65,73] Ηλεκτρονική μικροσκοπία δισδιάστατων κρυστάλλων Torpedo marmorata nachr σε διακριτικότητα 9 Å έδειξε ότι τα διαμεμβρανικά τμήματα εκτός από α έλικες αποτελούνται και από β πτυχώσεις, [74] το οποίο επιβεβαιώθηκε από αποτελέσματα φασματοσκοπικών μελετών. [75] Επίσης, πειράματα ομοιοπολικής τροποποίησης αμινοξέων του διαμεμβρανικού τμήματος [45,73] έδειξαν ότι το ποσοστό α έλικας στη διαμεμβρανική περιοχή είναι μικρότερο του 100%, αλλά και μεγαλύτερο από 25% που προβλέφθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία σε διακριτικότητα 9 Å. [74] Επίσης, CD μελέτες είχαν δείξει ότι τα εξωκυτταρικά Ν τελικά άκρα των nachr υπομονάδων αποτελούνται κυρίως από β πτυχωτές επιφάνειες με την συνεισφορά α ελίκων. [76 81] Όλες οι παραπάνω μελέτες οδήγησαν σε μία υποθετική σύσταση δευτεροταγούς δομής του nachr και σε μία πολύ απλουστευμένη αναπαράσταση της τριτοταγούς και τεταρτοταγούς δομής του, λόγω της περιορισμένης αναλυτικής ικανότητας των μεθόδων αυτών. Οι γνώσεις μας για την κατανόηση της δομής του nachr σε ατομικό επίπεδο αυξήθηκαν δραματικά μόλις τα τελευταία χρόνια χάρη στα εξής επιτεύγματα: Α. Η επίλυση της δομής της ομόλογης των ΕΚΠ του nachr, πρωτεΐνης δέσμευσης της ACh (AChBP) από μαλάκια με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ σε υψηλή διακριτικότητα, [82] καθώς και συμπλόκων της με διάφορους χολινεργικούς προσδέτες (αγωνιστές και ανταγωνιστές). [83 89] Αυτές οι δομές προσέγγισαν για πρώτη φορά σε ατομικό επίπεδο τη διάταξη των θέσεων πρόσδεσης υποκαταστατών των nachrs. Β. Η επίλυση της δομής του Torpedo marmorata nachr με χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε σχετικά υψηλή διακριτικότητα (4 Å), [90] η οποία αποκάλυψε με μεγαλύτερη ακρίβεια την αρχιτεκτονική της διάταξης των nachr υπομονάδων περιμετρικά του ιοντικού καναλιού, καθώς και τη δευτεροταγή δομή των υπομονάδων του μυϊκού τύπου nachr. Γ. Η επίλυση της δομής του συμπλόκου της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του nachr ποντικού με την τοξίνη α μπουγκαροτοξίνη (α Btx) με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ σε 10

25 Α. Θεωρητικό Μέρος διακριτικότητα 1,94 Å, [58] με την οποία αποκαλύφθηκε σε ατομικό επίπεδο η διαμόρφωση σημαντικών περιοχών της α1 ΕΚΠ, όπως ο επίτοπος MIR, η διάταξη του δεσμευμένου στη θέση γλυκοζυλίωσης Asn141 ολιγοσακχαρίτη, καθώς και οι αλληλεπιδράσεις της ΕΚΠ με τον ανταγωνιστή α Btx. Δ. Η επίλυση της δομής δύο πρόδρομων προκαρυωτικών πενταμερών ιοντικών καναλιών της υπερ οικογένειας LGIC με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ σε υψηλή διακριτικότητα (~3 Å), που απομονώθηκαν από τα βακτήρια Erwinia chrysanthemi (ELIC) [91] και από το βακτήριο Gleobacter violaceus (GLIC). [92,93] Παρακάτω περιγράφονται αναλυτικά τα ευρήματα των τεσσάρων αυτών επιτευγμάτων, μέσα από τα οποία αποκαλύφθηκε σε μεγάλο βαθμό η δομή του nachr. A Δομή της AChBP Η τρισδιάστατη δομή της AChBP επιλύθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ σε διακριτικότητα 2,7 Å τo [82] Η AChBP είναι μία πενταμερής υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη που απομονώθηκε για πρώτη φορά από κύτταρα γλοίας του γαστερόποδου μαλακίου Lymnaea stagnalis. [94] Απελευθερώνεται από τα κύτταρα γλοίας που περιβάλλουν τη συναπτική σχισμή μεταξύ προ και μετασυναπτικών κυττάρων, έπειτα από την πρόσδεση της ACh σε nachrs αυτών των κυττάρων. Η ACh που εκκρίνεται από τα προσυναπτικά κύτταρα απομακρύνεται από την συναπτική σχισμή με πρόσδεση στα μόρια AChBP, έτσι ώστε να μειώνεται ή να τερματίζεται η απόκριση των μετασυναπτικών κυττάρων στην ACh. Έτσι, η AChBP ρυθμίζει τη διαβίβαση της νευρικής ώσης στα γαστερόποδα. [95] Το ώριμο μόριο της AChBP έχει μήκος 210 αμινοξέα και παρουσιάζει ικανοποιητική ομολογία με τις Ν τελικές ΕΚΠ των υπομονάδων (μεγαλύτερη με τις α υπομονάδες) των πενταμερών υποδοχέων της LGIC υπερ οικογένειας. Το κάθε μονομερές της AChBP περιέχει όλα σχεδόν τα συντηρημένα κατάλοιπα των ΕΚΠ των υπομονάδων της LGIC υπερ οικογένειας. Η AChBP μπορεί να προσδέσει και άλλους χαρακτηριστικούς αγωνιστές και ανταγωνιστές του nachr εκτός της ACh, όπως νικοτίνη, καρβαμυλοχολίνη, δ τουμποκουραρίνη και α Btx. [94] Επίσης, διαθέτει τη χαρακτηριστική Cys θηλιά της LGIC υπερ οικογένειας, με τη διαφορά όμως ότι είναι κατά ένα κατάλοιπο μικρότερη και πιο υδρόφιλη από τη Cys θηλιά του nachr. Για τους λόγους αυτούς, η 11

26 Α. Θεωρητικό Μέρος AChBP αποτελεί ένα δομικό ομόλογο του ΕΚΠ τμήματος των υπομονάδων του nachr (κυρίως των α), και συνεπώς η επίλυση της δομής της σε υψηλή διακριτικότητα προσέγγισε, σε ατομικό επίπεδο, τη διαμόρφωσή τους στο χώρο. Εικόνα Α3. [82] (Α) Κάτοψη του πενταμερούς μορίου της AChBP. Τα μονομερή είναι χρωματισμένα το καθένα με διαφορετικό χρώμα και αριθμημένα με φορά αντίστροφης των δεικτών του ρολογιού. Η θέσεις πρόσδεσης ACh βρίσκονται στις διεπιφάνειες των μονομερών και συμβολίζονται με αναπαράσταση σφαίρας ράβδου. (Β) Πλάγια όψη του πενταμερούς. Η θέση πρόσδεσης στη διεπιφάνεια Α Β συμβολίζεται με αναπαράσταση σφαίρας ράβδου. Η AChBP συγκροτείται από πέντε ίδια μονομερή που διατάσσονται περιμετρικά γύρω από ένα κεντρικό πόρο, διαμέτρου περίπου 18 Å (Εικόνα Α3). Το μόριο της AChBP έχει διάμετρο 80 Å και ύψος 62 Å. Οι διαστάσεις αυτές είναι σε συμφωνία με τις διαστάσεις του Ν τελικού ΕΚΠ τμήματος του Torpedo marmorata nachr που βρέθηκαν με μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε διακριτικότητα 4,6 Å. [96] Στο πενταμερές μόριο, οι μόνες επαφές των υπομονάδων παρατηρούνται στις διεπιφάνειες που σχηματίζονται μεταξύ δύο γειτονικών μονομερών (Εικόνα Α3). Έτσι, κάθε μονομερές μόριο AChBP διαθέτει δύο τέτοιες διεπιφάνειες, οι οποίες συμβατικά ονομάζονται θετική (plus side) και αρνητική πλευρά (minus side). Ως θετική ονομάζεται η πλευρά του κάθε μονομερούς που βρίσκεται σε επαφή με το γειτονικό του κατά την αντίστροφη φορά από εκείνη των δεικτών του ρολογιού, ενώ ως αρνητική ονομάζεται η αντιδιαμετρική του πλευρά. Το κάθε μονομερές της AChBP έχει διαστάσεις 62x47x34 Å. Η δευτεροταγής του δομή έχει σύσταση 5% α έλικα και 45% β πτυχωτή επιφάνεια. Πιο αναλυτικά, το κάθε μονομερές συγκροτείται από μία Ν τελική α έλικα, από δέκα πτυχωτά φύλλα (β1 β10), 12

27 Α. Θεωρητικό Μέρος καθώς και από δέκα θηλιές (L1 L10), ακανόνιστης δομής (Εικόνα Α4), σε συμφωνία με CD μελέτες που είχαν πραγματοποιηθεί σε ΕΚΠ τμήματα των nachrs. [76 81] Οι β πτυχωτές επιφάνειες του κάθε μονομερούς AChBP είναι αναδιπλωμένες με τέτοιο τρόπο ώστε να σχηματίζεται ένας υδρόφοβος πυρήνας (β sandwich core), ο οποίος χαρακτηρίζεται από σχετική ακαμψία, σε αντίθεση με τις ευλύγιστες θηλιές L1 L10. Η θηλιά L7 που συνδέει τα β6 και β7 πτυχωτά φύλλα αποτελεί την χαρακτηριστική Cys θηλιά της LGIC υπεροικογένειας (μεταξύ των Cys128 και Cys142). Η Cys θηλιά μαζί με τις θηλιές L2 και L9, μεταξύ των β1 β2 και β8 β9 πτυχωτών φύλλων, αντίστοιχα, βρίσκονται προς το κατώτερο τμήμα του κάθε μονομερούς. Στην θηλιά L10, μεταξύ των β9 και β10 πτυχωτών φύλλων υπάρχει το συντηρημένο ζεύγος των καταλοίπων Cys (θέσεις 187 και 188), το οποίο είναι χαρακτηριστικό των ΕΚΠ τμημάτων των α υπομονάδων του nachr. Εικόνα Α4. [82] Πλάγια όψη του μονομερούς της AChBP, όπως φαίνεται από εξωτερικά του πενταμερούς μορίου. Διακρίνονται τα στοιχεία της δευτεροταγούς δομής, το Ν και το C τελικό άκρο, η χαρακτηριστική Cys θηλιά, το συντηρημένο ζεύγος Cys των α nachrs υπομονάδων και ο επίτοπος MIR. Α Ατομική δομή της θέσης πρόσδεσης ACh Η επίλυση της δομής της AChBP αποκάλυψε για πρώτη φορά σε ατομικό επίπεδο τη διαμόρφωση της θέσης πρόσδεσης της ACh και άλλων χολινεργικών προσδετών, στις 13

28 Α. Θεωρητικό Μέρος ομόλογες ΕΚΠ των α υπομονάδων του nachr (Εικόνα Α5). Στο πενταμερές της AChBP σχηματίζονται πέντε διαφορετικές θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών. Ο προσδιορισμός αυτών των θέσεων προέκυψε από την παρατήρηση της ύπαρξης μορίων HEPES (συστατικό του ρυθμιστικού διαλύματος στο οποίο ήταν διαλυμένη η AChBP), σε συγκεκριμένες θέσεις μέσα στις διεπιφάνειες του πενταμερούς (Εικόνα Α5.Β). Στο μόριο του HEPES υπάρχει μία τεταρτοταγής θετικά φορτισμένη αμινομάδα, η οποία προσομοιάζει τους χολινεργικούς προσδέτες του nachr. Με αυτόν τον τρόπο βρέθηκε ότι η θέση πρόσδεσης των διάφορων χολινεργικών προσδετών σχηματίζεται από την συνεισφορά αρωματικών και υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων που βρίσκονται σε θηλιές της θετικής πλευράς του ενός μονομερούς και από β πτυχωτά φύλλα της αρνητικής πλευράς του γειτονικού μονομερούς. Εικόνα Α5. [82] (Α) Απεικόνιση της θέσης πρόσδεσης Ach της AChBP. Οι συμμετέχουσες θηλιές σημειώνονται με διαφορετικό χρώμα: Α κίτρινο, Β σκούρο κίτρινο, C πορτοκαλί, D βιολετί, E γαλάζιο, F μπλε. (Β) Χάρτης ηλεκτρονιακής πυκνότητας της θέσης πρόσδεσης, με προσδεμένο ένα μόριο HEPES (μωβ χρώμα). (Γ) και (Δ) Θέση των θηλιών αυτών στην κυρίως και συμπληρωματική πλευρά της θέσης πρόσδεσης, αντίστοιχα. 14

29 Α. Θεωρητικό Μέρος Γενικά η θέση πρόσδεσης διακρίνεται στην κυρίως (θετική) και στη συμπληρωματική (αρνητική) πλευρά (Εικόνες Α5.Γ, Α5.Δ). Η κυρίως πλευρά σχηματίζεται από κατάλοιπα της θετικής πλευράς του ενός μονομερούς, τα οποία εμφανίζουν υψηλό βαθμό συντήρησης μεταξύ των μελών της LGIC υπερ οικογένειας. Τα κατάλοιπα αυτά συγκροτούν τις θηλιές Α (Tyr89), B (Trp143, Trp145) και C (Tyr185, Cys187, Cys188, Tyr192). Η συμπληρωματική πλευρά της θέσης πρόσδεσης σχηματίζεται από κατάλοιπα της αρνητικής πλευράς του γειτονικού μονομερούς. Τα κατάλοιπα αυτά είναι λιγότερο συντηρημένα και συγκροτούν τις θηλιές D (Trp53, Gln55), Ε (Arg104, Val106, Leu112, Met114) και F (Tyr164). Για όλα τα παραπάνω κατάλοιπα είχε βρεθεί, με μελέτες μεταλλαξιγενέσης και σήμανσης με φθορισμό, ότι συμμετέχουν και στο σχηματισμό των αντίστοιχων θέσεων πρόσδεσης του nachr. [57,97 100] Το μόριο του HEPES βρέθηκε ότι καταλαμβάνει ίσες επιφάνειες μεταξύ της κύριας και συμπληρωματικής πλευράς της θέσης πρόσδεσης, ενώ η τεταρτοταγής αμινομάδα του αλληλεπιδρά με την Trp143 μέσω αλληλεπιδράσεων π κατιόντος, όπως θα αναμένονταν για nachr αγωνιστές. [101,102] Α Πρόσδεση αγωνιστών στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών της AChBP Η επίλυση της δομής της AChBP σε ατομικό επίπεδο το 2001 [82] ήταν η πρώτη από τις πολλές δομές υψηλής διακριτικότητας που ακολούθησαν, στις οποίες AChBPs από διάφορα είδη μαλακίων συγκρυσταλλώθηκαν με γνωστούς nachr αγωνιστές. Οι δομές αυτές αποκάλυψαν τις ειδικές αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα μεταξύ των αγωνιστών και της θέσης πρόσδεσης του nachr. Συγκεκριμένα, η AChBP του είδους Lymnaea stagnalis (L AChBP) συγκρυσταλλώθηκε με τους αγωνιστές νικοτίνη και καρβαμυλοχολίνη (Εικόνες Α6.Α, Α6.Β), [83] ενώ η AChBP του είδους Aplysia californica (A AChBP) με τους αγωνιστές λομπελίνη και επιβατιδίνη (Εικόνες Α6.Γ, Α6.Δ). [86] Η αρχιτεκτονική της θέσης πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών είναι ιδιαίτερα συντηρημένη μεταξύ των διαφορετικών AChBPs. Η θέση πρόσδεσης αποτελείται από έναν αρωματικό πυρήνα συγκροτημένο από τα κατάλοιπα Tyr93, Trp147, Tyr188 και Tyr195 της κυρίως πλευράς και από την Tyr195 της συμπληρωματικής πλευράς (αρίθμηση κατά A AChBP). Ο αγωνιστής προσδένεται με τη δημιουργία δεσμών 15

30 Α. Θεωρητικό Μέρος Η, αλληλεπιδράσεων π κατιόντος, καθώς και αλληλεπιδράσεων van der Waals. Η εξαιρετικά συντηρημένη Trp143 (αρίθμηση κατά L AChBP) της κυρίως πλευράς της θέσης πρόσδεσης βρίσκεται στο κέντρο των συμπλόκων αυτών και αναπτύσσει ισχυρές αρωματικές αλληλεπιδράσεις π κατιόντος με τους αγωνιστές. Επίσης, το ζεύγος κυστεϊνών Cys187 Cys188 (αρίθμηση κατά L AChBP), που είναι συντηρημένο σε όλες τις AChBPs και στις α υπομονάδες του nachr, αλληλεπιδρά με όλους τους αγωνιστές, αλλά η Cys187 κυρίως με την καρβαμυλοχολίνη, ενώ η Cys188 με την νικοτίνη. Η Tyr185 της L AChBP (Tyr188 στην A AChBP) σχηματίζει αρωματικές αλληλεπιδράσεις με την καρβαμυλοχολίνη και την επιβατιδίνη, αλλά όχι με τη νικοτίνη, ενώ σχηματίζει αλληλεπιδράσεις van der Waals με τη λομπελίνη. Η λομπελίνη και η επιβατιδίνη αναπτύσσουν και επιπλέον επαφές με την Trp147 της A AChBP (143 στη L AChBP). Εικόνα Α6. Σύμπλοκα L AChBP με (Α) νικοτίνη και (Β) καρβαμυλοχολίνη. [83] Σύμπλοκα Α AChBP με (Γ) λομπελίνη και (Δ) επιβατιδίνη. [86] Η πρόσδεση των αγωνιστών ενισχύεται και από την ανάπτυξη δεσμών με διάφορα και λιγότερο συντηρημένα κατάλοιπα της συμπληρωματικής πλευράς της θέσης 16

31 Α. Θεωρητικό Μέρος πρόσδεσης. Έτσι, η λομπελίνη αναπτύσσει δεσμούς Η μέσω μορίων νερού με τις Ile106 και Ile118, ενώ η επιβατιδίνη προσδένεται στην Ile118 μέσω ενός μορίου νερού. Επίσης, η Leu112 και η Met114 της L AChBP (Met116 και Ile118 στην A AChBP) σχηματίζουν υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με τη νικοτίνη και την καρβαμυλοχολίνη. Τέλος, τα κατάλοιπα Leu102 και Met114 της L AChBP συνεισφέρουν σημαντικά στην πρόσδεση της νικοτίνης, αφού αναπτύσσουν με αυτήν ένα δεσμό Η μέσω ενός μορίου νερού. Α Πρόσδεση ανταγωνιστών στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών της AChBP Εκτός από τους παραπάνω αγωνιστές, διάφοροι ανταγωνιστές του nachr συγκρυσταλλώθηκαν με AChBPs, οδηγώντας σε δομές υψηλής διακριτικότητας. Συγκεκριμένα, κρυσταλλώθηκαν τα σύμπλοκα της L AChBP με τον ανταγωνιστή α κομπρατοξίνη (α Cbtx) [87] και της A AChBP με α κωνοτοξίνες (α Ctxs), [84,86,88,89] καθώς και με τον αλκαλοειδή ανταγωνιστή μεθυλ κακονιτίνη (MLA). [86] Οι δομές αυτές αποκάλυψαν τα κατάλοιπα που εμπλέκονται στην πρόσδεση ανταγωνιστών, αλλά και τις σημαντικές δομικές αλλαγές που επάγονται στην AChBP μετά την πρόσδεση αυτών. Η α Cbtx απομονώνεται από φίδια του είδους Naja siamensis και ανήκει στις α νευροτοξίνες. Η δομή της εμφανίζει τη χαρακτηριστική αναδίπλωση στο χώρο των «τριών δακτύλων» (three finger fold), [103] και αποτελείται από έναν υδρόφοβο πυρήνα β πτυχώσεων και τέσσερεις δισουλφιδικούς δεσμούς μεταξύ των διάφορων β πτυχωτών φύλλων. Από τον πυρήνα αυτό του μορίου εξέρχονται τρεις θηλιές «δάχτυλα» (Ι, ΙΙ και ΙΙΙ). Στην α έλικα της θηλιάς ΙΙ βρίσκεται ο πέμπτος χαρακτηριστικός δισουλφιδικός δεσμός των α νευροτοξινών, ο οποίος παίζει πολύ σημαντικό ρόλο για την πρόσδεση σε νευρικού τύπου nachrs. [104] Η κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου L AChBP/α Cbtx (Εικόνα Α7.Α) δείχνει ότι η θηλιά ΙΙ της α Cbtx διεισδύει βαθιά μέσα στη θέση πρόσδεσης της AChBP, όπου συγκρατείται κυρίως μέσω υδρόφοβων και αρωματικών αλληλεπιδράσεων. Tα κατάλοιπα Phe29 και Arg33 που βρίσκονται στην άκρη της θηλιάς ΙΙ της α Cbtx αλληλεπιδρούν με τα συντηρημένα κατάλοιπα Trp53, Tyr185, Tyr192 και Trp143 της κυρίως πλευράς της θέσης πρόσδεσης της L AChBP. Επίσης, παρατηρούνται αλληλεπιδράσεις καταλοίπων της θηλιάς ΙΙ της α Cbtx με τα κατάλοιπα Glu163, Glu55, 17

32 Α. Θεωρητικό Μέρος Leu112, Met114 και Tyr164 της συμπληρωματικής πλευράς της θέσης πρόσδεσης. Η πρόσδεση της α Cbtx στην AChBP επάγει μία σημαντική μετατόπιση των θηλιών C και F κατά 10 Å σε σχέση με τη θέση τους στη δομή της A AChBP ελεύθερης προσδετών. [86] Εικόνα Α7. Σύμπλοκα (Α) L AChBP με α Cbtx, [87] (Β) Α AChBP με α Ctx PnIA (Ala10Leu Asp14Lys), [84] (Γ) Α AChBP με α Ctx ImI, [86] (Δ) Α AChBP με μεθυλ κακονιτίνη (MLA). [86] Οι α κωνοτοξίνες (α Ctxs) απομονώνονται από μαλάκια Conus και ανήκουν στην κατηγορία των μικρών πεπτιδικών τοξινών. Έχουν αμινοξική αλληλουχία μήκους καταλοίπων η οποία χαρακτηρίζεται από την παρουσία κυστεϊνών με το μοτίβο CC C C, που συνδέονται σε δύο δισουλφιδικούς δεσμούς C1 C3 και C2 C4, σχηματίζοντας ένα χαρακτηριστικό πλέγμα δύο θηλιών (two loop framework). [103,105] Η δομή τους περιλαμβάνει μία κεντρική α έλικα. Οι α Ctxs χωρίζονται σε υπο ομάδες ανάλογα με τον αριθμό των αμινοξέων που βρίσκονται μεταξύ των C2 C3 και C3 C4 (3/5, 4/3, 4/4, 4/6, 18

33 Α. Θεωρητικό Μέρος 4/7). [106] Οι α Ctxs εμφανίζουν εξαιρετική επιλεκτικότητα και εξειδίκευση πρόσδεσης σε συγκεκριμένους υπότυπους του nachr. Οι α Ctxs της υπο ομάδας 3/5 (π.χ. α Ctx GI, MI, SI) είναι εκλεκτικοί αναστολείς του μυϊκού τύπου nachr, ενώ αυτές των υπόλοιπων υποομάδων δρουν μόνο σε νευρικού τύπου nachrs, με διαφορετική εξειδίκευση προς τους διάφορους υπότυπους. [105,106] Για παράδειγμα, ο συναγωνιστικός ανταγωνιστής των νευρικού τύπου nachrs α Ctx PnIA, εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης για α3β2 nachrs σε σχέση με τον α7 nachr. [107] H μετάλλαξη όμως Ala10Leu αντιστρέφει την επιλεκτικότητά του προς τον α7 nachr, [108] ενώ η διπλή μετάλλαξη Ala10Leu/Asp14Lys αυξάνει περαιτέρω την επιλεκτικότητά του για τον α7 nachr όρνιθας. [109] Από την άλλη η α Ctx ImI είναι ένας ειδικός αναστολέας του α7 nachr, [107] αλλά βρέθηκε ότι εμφανίζει ακόμη μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης για τον ανθρώπινο α3β2 nachr. [110] Οι κρυσταλλογραφικές δομές των συμπλόκων του διπλού μεταλλάγματος PnIA και της α Ctx ImI με την A AChBP (Εικόνες Α7.Β, Α7.Γ) δείχνουν ότι ο δισουλφιδικός δεσμός Cys2 Cys8 (θηλιά I) και των δύο α Ctxs αλληλεπιδρά με τον εξαιρετικά συντηρημένο δισουλφιδικό δεσμό της θηλιάς C της AChBP. Εντούτοις, οι δύο αυτές α Ctxs δημιουργούν διαφορετικές αλληλεπιδράσεις με τη θέση πρόσδεσης, κάτι που πιθανώς εξηγεί την επιλεκτικότητά τους έναντι κάποιων nachr υποτύπων. Το διπλό μετάλλαγμα PnIA αναπτύσσει κυρίως υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, χρησιμοποιώντας τα κατάλοιπα Pro7, Ala9 και Leu10, ενώ η ImI χρησιμοποιεί το τριπεπτίδιο Asp5 Pro6 Arg7 της θηλιάς I για να σχηματίσει μία γέφυρα άλατος και δεσμούς υδρογόνου. Στα σύμπλοκα AChBP/α Ctxs, οι α κωνοτιξίνες εισχωρούν βαθιά μέσα στη θέση πρόσδεσης της AChBP. Κατά την πρόσδεση αυτών των α Ctxs, η θηλιά C της A AChBP σταθεροποιείται σε μία «ανοικτή» διαμόρφωση, αντίστοιχα με το σύμπλοκο A AChBP/α Cbtx. [87] Αντιθέτως, η θηλιά F δεν μετατοπίζεται καθόλου, πιθανότατα επειδή οι α Ctxs είναι πολύ μικρότερα μόρια από την α Cbtx. Η «ανοικτή» διαμόρφωση της θηλιάς C παρατηρήθηκε επίσης και στο σύμπλοκο Α AChBP/MLA (Εικόνα Α7.Δ). Α Επαγόμενες δομικές αλλαγές κατά την πρόσδεση υποκαταστατών Η σύγκριση των κρυσταλλογραφικών δομών των συμπλόκων AChBPs/αγωνιστές με το σύμπλοκο L AChBP/HEPES και με την απο μορφή (απουσία προσδέτη) της A 19

34 Α. Θεωρητικό Μέρος AChBP, [86] ανέδειξε σημαντικές δομικές ανακατατάξεις στην AChBP κατά την πρόσδεση των αγωνιστών, οι οποίες είναι πολύ πιθανό να προκαλούν τη διάνοιξη του ιοντικού καναλιού στην περίπτωση του nachr. Η πρόσδεση αγωνιστών οδηγεί σε σημαντική μετακίνηση της θηλιάς C της κυρίως πλευράς της θέσης πρόσδεσης, ώστε να κλείνει την είσοδο της υδρόφοβης κοιλότητάς της και να περιβάλλει τα μόρια των αγωνιστών. Απουσία αγωνιστών, η συντηρημένη Tyr185 της θηλιάς C (Tyr190 στην α1 υπομονάδα του μυϊκού τύπου nachr) βρίσκεται σε απόσταση 8 Å από τη συντηρημένη Lys139 (Lys145 στην α1 υπομονάδα) του β7 πτυχωτού φύλλου, η οποία σχηματίζει μία γέφυρα άλατος με το συντηρημένο Asp194 (Asp200 στην α1 υπομονάδα) του β10 πτυχωτού φύλλου. Όμως, στα σύμπλοκα AChBP/αγωνιστές, η θηλιά C έχει μετατοπιστεί και πλέον η Tyr185 βρίσκεται σε απόσταση 2 3 Å με τη Lys139, ενώ εξαφανίζεται η γέφυρα άλατος με το Asp194. Έχει βρεθεί ότι μεταλλάξεις σε οποιαδήποτε από τα τρία αυτά κατάλοιπα παρεμποδίζουν το άνοιγμα του καναλιού. [111] Συμπερασματικά, κατά την πρόσδεση αγωνιστών, η θηλιά C της θέσης πρόσδεσης μετακινείται κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να ευνοεί την ανάπτυξη ενός δεσμού υδρογόνου μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων Tyr και Lys, σταθεροποιώντας τη θηλιά C στην καινούρια της διαμόρφωση. Εικόνα Α8. [86] «Ανοικτή» και «κλειστή» διαμόρφωση της δομής της AChBP. Η θηλιά C σημειώνεται με κόκκινο ή μπλε χρώμα, αντίστοιχα. Όλες οι διαθέσιμες μέχρι στιγμής κρυσταλλογραφικές δομές των AChBPs μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με τη διευθέτηση της θηλιάς C: «ανοικτή» ή «κλειστή» (Εικόνα Α8). Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει τις δομές της απομορφής της A AChBP και όλων των συμπλόκων των AChBPs με ανταγωνιστές (α Cbtx, α 20

35 Α. Θεωρητικό Μέρος Ctx PnIA διπλό μετάλλαγμα, α Ctx ImI και MLA), και αντιπροσωπεύει την κατάσταση ηρεμίας των nachrs. Η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει τις δομές των συμπλόκων της AChBP με αγωνιστές (L AChBP/νικοτίνη, L AChBP/καρβαμυλοχολίνη, A AChBP/λομπελίνη και A AChBP/επιβατιδίνη) ή με μόρια που προσομοιάζουν κατιονικούς αγωνιστές (L AChBP/HEPES, A AChBP/HEPES), και αντιπροσωπεύει την ενεργή κατάσταση των nachrs. Μεταξύ των δομών των δύο αυτών κατηγοριών, η θηλιά C μετατοπίζεται έως και 11 Å, όπως παρατηρείται από την σύγκριση των δύο ακραίων καταστάσεων (σύμπλοκα Α AChBP/α Ctx ImI και Α AChBP/επιβατιδίνη). [112] Εκτός της θηλιάς C, παρατηρούνται επίσης σημαντικές μετακινήσεις των θηλιών β1 β2, β8 β9 και Cys θηλιάς. [88] A Δομή του μυϊκού τύπου nachr Η τρισδιάστατη δομή του μυϊκού τύπου nachr αποκαλύφθηκε το 2005, με μελέτες κρυο ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε απομονωμένες μετασυναπτικές μεμβράνες του ιχθύος Torpedo marmorata. [90] Οι μελέτες αυτές οδήγησαν στην κατασκευή του μοντέλου του μυϊκού τύπου nachr στην κλειστή μορφή του σε διακριτικότητα 4 Å. Το μοντέλο αυτό ήταν πολύ μεγαλύτερης διακριτικότητας από προηγούμενες μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας που είχαν αποδώσει τη δομή του Torpedo nachr τόσο στην ανοικτή (κατά την πρόσδεση ACh), όσο και στην κλειστή του μορφή. [23,74,96, ] Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, ο Torpedo nachr έχει ένα συνολικό μήκος περίπου 160 Å με τις πέντε υπομονάδες του (2α, β, γ, δ) να διατάσσονται περιμετρικά του κεντρικού πόρου του ιοντικού καναλιού διαμέτρου 20 Å. Η διάταξη των υπομονάδων εμφανίζει ένα κυκλικό συμμετρικό σχήμα στην κάτοψη του υποδοχέα από την συναπτική σχισμή, ενώ παρουσιάζει ένα σφηνοειδές σχήμα στην πλάγια όψη του (Εικόνα Α9). Η κάθε υπομονάδα του έχει διαστάσεις 30x40x160 Å και αποτελείται από τρεις διακριτές περιοχές: α) μία Ν τελική εξωκυτταρική περιοχή (ΕΚΠ), β) μία διαμεμβρανική περιοχή και γ) μία κυτταροπλασματική περιοχή (Εικόνα Α10). Η ΕΚΠ κάθε υπομονάδας του nachr συγκροτείται από ένα υδρόφοβο πυρήνα, που σχηματίζεται από την αναδίπλωση δέκα β πτυχωτών φύλλων (β1 β10) μεταξύ τους. Αυτά διακρίνονται σε εξωτερικά (β4, β7 10) και σε εσωτερικά β φύλλα (β1 3, β5 6). Οι δύο αυτές ομάδες β πτυχώσεων της ΕΚΠ ενώνονται μεταξύ τους μέσω της συντηρημένης Cys θηλιάς. Επίσης, στο Ν τελικό άκρο 21

36 Α. Θεωρητικό Μέρος της κάθε υπομονάδας βρίσκεται μία συντηρημένη α έλικα. Το μοντέλο αυτό επιβεβαίωσε ότι η δομή της ΕΚΠ των nachr υπομονάδων είναι σε πολύ μεγάλο βαθμό όμοια με αυτή που είχε προηγουμένως αποκαλυφθεί για την ομόλογη AChBP. Στην ΕΚΠ του nachr σχηματίζονται και διάφορες θηλιές, πολλές εκ των οποίων (θηλιές Α, B, C, καθώς και οι β1 β2 και οι Cys θηλιές) παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του. Εικόνα Α9. [90] Δομή του Topredo nachr. (Α) Κάτοψη από τη συναπτική σχισμή και (Β) πλάγια όψη κάθετα στην κυτταρική μεμβράνη. Οι υπομονάδες σημειώνονται με διαφορετικό χρώμα (α κόκκινο, β πράσινο, γ μπλε, δ γαλάζιο). Σημειώνεται επίσης η θέση της Trp149 (με χρυσαφί χρώμα) και η θέση του επιτόπου MIR στην α υπομονάδα. Ε = εξωκυττάριος χώρος, Ι = ενδοκυττάριος χώρος. Παλαιότερες βιοχημικές μελέτες είχαν δείξει ότι για το σχηματισμό των θέσεων πρόσδεσης αγωνιστών και ανταγωνιστών του nachr συμμετείχαν δύο διαφορετικά τμήματα, η κυρίως και η συμπληρωματική πλευρά της θέσης πρόσδεσης ACh. [99,116,117] Η κυρίως πλευρά της θέσης πρόσδεσης ACh βρίσκεται σε καθεμιά από τις δύο α υπομονάδες, ενώ η συμπληρωματική πλευρά βρίσκεται στις γειτονικές γ και δ υπομονάδες. Επομένως, σε κάθε πενταμερές μόριο nachr σχηματίζονται δύο θέσεις πρόσδεσης ACh. Με την επίλυση της δομής του Torpedo nachr σε 4 Å, αποκαλύφθηκαν και τα δομικά στοιχεία που συμμετέχουν στη συγκρότηση των δύο αυτών θέσεων. Αυτά είναι οι θηλιές A, B και C των ΕΚΠ των δύο α υπομονάδων (κυρίως πλευρά) και μέρη των β5 και β6 πτυχώσεων των ΕΚΠ των γειτονικών γ και δ υπομονάδων (συμπληρωματική 22

37 Α. Θεωρητικό Μέρος πλευρά). Οι δύο θέσεις πρόσδεσης της ACh βρίσκονται σε απόσταση 40 Å από την κυτταρική μεμβράνη και σε αντιδιαμετρικά σημεία. Τα αμινοξικά κατάλοιπα της κύριας πλευράς που συμμετέχουν στο σχηματισμό των θέσεων πρόσδεσης είναι η Tyr190, η Cys192 και η Tyr198 της θηλιάς C, καθώς και η Trp149 της θηλιάς B (Εικόνα Α11). Τα αμινοξέα αυτά είναι ιδιαίτερα συντηρημένα στα μέλη της LGIC υπερ οικογένειας καθώς και στις AChBPs, όπου είχαν επίσης βρεθεί να συμμετέχουν στο σχηματισμό των πέντε θέσεων πρόσδεσης. [82,83] Επίσης, ο επίτοπος MIR, ο οποίος ήταν ήδη γνωστό ότι βρίσκεται στα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων, [ ] εντοπίστηκε στη θηλιά β2 β3 (Εικόνα Α10), εκτεθειμένος στο εξωτερικό περιβάλλον του υποδοχέα, όπως είχε προβλεφθεί από την επίλυση της δομής της ομόλογης AChBP. [82] Εικόνα Α10. [90] Πλάγια όψη μιας υπομονάδας του nachr, όπως φαίνεται από δυο διαφορετικές κατευθύνσεις. Οι α έλικες σημειώνονται με κίτρινο χρώμα, τα εσωτερικά β φύλλα με μπλε και τα εξωτερικά β φύλλα με κόκκινο. Με χρυσαφί χρώμα σημειώνονται οι θέσεις των Trp149 και Val46. 23

38 Α. Θεωρητικό Μέρος Η διαμεμβρανική περιοχή της κάθε υπομονάδας του nachr αποτελείται από τέσσερεις α έλικες (M1 M4), οι οποίες διατάσσονται συμμετρικά και περιμετρικά του κεντρικού πόρου του ιοντικού καναλιού (Εικόνα Α10). Οι πέντε Μ2 α έλικες όλων των υπομονάδων διατάσσονται έτσι ώστε να σχηματίζουν τα εσωτερικά τοιχώματα του καναλιού, ενώ οι υπόλοιπες 15 α έλικες (Μ1, Μ3, Μ4) περιελίσσονται η μία της άλλης σχηματίζοντας τον εξωτερικό δακτύλιο του καναλιού, ο οποίος το θωρακίζει από τα μεμβρανικά λιπίδια. Όταν το κανάλι είναι κλειστό, οι Μ2 έλικες βρίσκονται σε κοντινή απόσταση μεταξύ τους, σχηματίζοντας περίπου στη μέση του ύψους της κυτταρικής μεμβράνης την λεγόμενη θύρα του καναλιού, η οποία αποτελεί εμπόδιο για την ελεύθερη διακίνηση ιόντων διαμέσου αυτής. Η διαμεμβρανική περιοχή περιέχει επίσης και τις μικρές θηλιές Μ1 Μ2 (ενδοκυτταρικές) και M2 M3 (εξωκυτταρικές) (Εικόνα Α10). Η θηλιά Μ2 Μ3 αλληλεπιδρά με τη θηλιά β1 β2 και τη Cys θηλιά της ΕΚΠ. Με αυτόν τον τρόπο παίζει σημαντικό ρόλο στη μετάδοση των δομικών αλλαγών που επάγονται στην ΕΚΠ από την πρόσδεση αγωνιστών, στη διαμεμβρανική περιοχή του υποδοχέα. Εικόνα Α11. [90] Δομή της θέσης πρόσδεσης ACh του κλειστού καναλιού του nachr. Κάτοψη όπως φαίνεται από τη συναπτική σχισμή. Απεικονίζονται οι θηλιές B και C της α υπομονάδας (κόκκινο) και οι β5 και β6 πτυχώσεις της γ υπομονάδας (μπλε). 24

39 Α. Θεωρητικό Μέρος Τέλος, η κυτταροπλασματική περιοχή κάθε υπομονάδας του nachr αποτελείται από τη θηλιά M3 M4, η οποία περιέχει μία α έλικα (MA) ακριβώς πριν από την ένωση με την Μ4 περιοχή (Εικόνα Α10). Το τμήμα της θηλιάς M3 M4 που βρίσκεται αμέσως μετά την Μ3 περιοχή δεν αποκαλύφθηκε από αυτήν τη μελέτη ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, αλλά εικάζεται ότι δεν έχει κάποια γνωστού τύπου διαμόρφωση. [121,122] Κάθε nachr υπομονάδα συνεισφέρει από μία ΜΑ έλικα, και όλες μαζί σχηματίζουν το ενδοκυτταρικό τοίχωμα του καναλιού. Οι πέντε αυτές έλικες διατάσσονται σε σχήμα ανεστραμμένου πενταγωνικού κώνου, στις πέντε πλευρές του οποίου υπάρχουν οπές διαμέτρου 8 Å (συγκρίσιμες με τη διάμετρο ενός ενυδατωμένου ιόντος Na + ή K + ). Οι οπές αυτές ονομάζονται «παράθυρα επιλεκτικότητας» και μέσω αυτών πραγματοποιείται η επιλεκτική είσοδος ιόντων στο κυτταρόπλασμα. Επίσης, καθώς τα «παράθυρα» αυτά περιβάλλονται από αρνητικά φορτισμένα αμινοξέα, αποτελούν επιλεκτικά φίλτρα αποκλεισμού μορίων τόσο λόγω μεγέθους, όσο και λόγω φορτίου. Αξίζει να σημειωθεί ότι εκτός από το ενδοκυτταρικό εσωτερικό τοίχωμα του καναλιού, και αυτό της εξωκυττάριας περιοχής περιβάλλεται από αρνητικά φορτισμένα φορτία, επιτρέποντας έτσι την κίνηση κατιόντων του σωστού μεγέθους κατά μήκος του (π.χ. Na +, K + και Ca 2+ ). Α Άνοιγμα του καναλιού του nachr Η τρισδιάστατη δομή του Torpedo nachr σε διακριτικότητα 4 Å επιβεβαίωσε τη διαφορετική διευθέτηση στο χώρο που έχουν οι β πτυχώσεις των α υπομονάδων σε σχέση με τις μη α υπομονάδες (β, γ, δ), η οποία είχε παρατηρηθεί από προηγούμενη μελέτη. [123] Η υπέρθεση του πεπτιδικού σκελετού μεταξύ των α και των άλλων υπομονάδων αποκάλυψε την κατά 10 μετατόπιση, αντίθετα από τους δείκτες του ρολογιού, των εσωτερικών β πτυχώσεων των α υπομονάδων σε σχέση με τις άλλες υπομονάδες στην κάτοψη του nachr, όπως φαίνεται από τη συναπτική σχισμή. Επίσης, τα εξωτερικά β πτυχωτά φύλλα των α υπομονάδων εμφανίζονται να εξέχουν περισσότερο προς τη πλευρά του κεντρικού πόρου σε σχέση με αυτά των μη α υπομονάδων. Η ειδική αυτή διαμόρφωση των α υπομονάδων αναφέρεται ως «παραμορφωμένη», αφού οι α υπομονάδες μεταπίπτουν στη διαμόρφωση των μη α υπομονάδων, κατά την πρόσδεση αγωνιστή. Όταν το κανάλι είναι κλειστό, η τεταμένη 25

40 Α. Θεωρητικό Μέρος διαμόρφωση των α υπομονάδων σταθεροποιείται από διάφορους δεσμούς που αναπτύσσονται μεταξύ των α υπομονάδων και των γειτονικών τους. Εικόνα Α12. [90] (Α) Απλουστευμένη απεικόνιση της κυρίως πλευράς της θέσης πρόσδεσης ACh της α υπομονάδας στο κλειστό κανάλι του nachr. (Β) Απλουστευμένη απεικόνιση της ίδιας περιοχής της L AChBP προσδεμένη με καρβαμυλοχολίνη. Τα κόκκινα τόξα αναπαριστούν τις κινήσεις των δομικών στοιχείων σε σχέση με το (Α). (Γ) Υπέρθεση των (Α) και (Β) και επέκταση της απεικόνισης ώστε να εμφανιστεί η θηλιά β1 β2. Συγκρίνοντας τη διαμόρφωση των ΕΚΠ τμημάτων των α υπομονάδων του κλειστού καναλιού του nachr με τη διαμόρφωση του μονομερούς της AChBP κατά την πρόσδεση αγωνιστών, [83,86] αποκαλύφθηκαν οι δομικές ανακατατάξεις που πιθανώς συμβαίνουν κατά την πρόσδεση της ACh, οι οποίες επιτρέπουν στις τεταμένες α υπομονάδες να χαλαρώσουν. Στην κλειστή μορφή του καναλιού [90] η θηλιά C των α υπομονάδων προβάλλει μακριά από το «κυρίως σώμα» τουςς, σε αντίθεση με τη θηλιά C του κάθε μονομερούς AChBP παρουσία αγωνιστή που βρίσκεται σε στενή επαφή με τις θηλιές Α και Β της θέσης πρόσδεσης (Εικόνα Α12). Η απόσταση των α ατόμων άνθρακα μεταξύ της Cys192 της θηλιάς C και της Trp149 της θηλιάς B είναι κατά 6 Å μικρότερη στην περίπτωση της α υπομονάδας του κλειστού καναλιού του nachr σε σχέση με την αντίστοιχη απόσταση στο σύμπλοκο AChBP/αγωνιστής. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι 26

41 Α. Θεωρητικό Μέρος οι θηλιές αυτές θα πρέπει να αναδιοργανωθούν έτσι ώστε να επιτρέψουν τη πρόσδεση της ACh. Έτσι, προκειμένου τα κατάλοιπα των θηλιών Β και C να στοιχηθούν σωστά απέναντι στο μόριο της ACh και να το περιβάλλουν, θα πρέπει η θηλιά Β να περιστραφεί κατά τη φορά των δεικτών του ρολογιού, ενώ η θηλιά C κατά την αντίθετη κατεύθυνση (Εικόνα Α12). Η θηλιά Β παίζει και ένα επιπλέον ρόλο σε αυτές τις τοπικές διευθετήσεις, αφού ενώνει τα εξωτερικά με τα εσωτερικά β πτυχωτά φύλλα της ΕΚΠ, μεταδίδοντας έτσι τις δομικές αλλαγές των εξωτερικών δομικών στοιχείων στον υδρόφοβο πυρήνα. Υπάρχουν διάφορα δομικά στοιχεία της ΕΚΠ του nachr που θα μπορούσαν να μεταδώσουν τις δομικές ανακατατάξεις της περιοχής αυτής, που προκαλούνται από παρουσία αγωνιστή, στο διαμεμβρανικό τμήμα του υποδοχέα, οδηγώντας στο άνοιγμα του καναλιού (Εικόνα Α10). Το φύλλο β10 είναι ενωμένο με την αρχή της Μ1 διαμεμβρανικής περιοχής, ενώ οι θηλιές Cys και β1 β2 των ΕΚΠ των α υπομονάδων βρίσκονται κατά 2 3 Å πλησιέστερα προς τις Μ2 Μ3 θηλιές της διαμεμβρανικής περιοχής σε σχέση με τις μη α υπομονάδες. Η αλληλεπίδραση με την Μ2 Μ3 θηλιά της α υπομονάδας πραγματοποιείται ως εξής: Η συντηρημένη σε όλες τις υπομονάδες, αλληλουχία Phe Pro Phe της θηλιάς C, αλληλεπιδρά με τα κατάλοιπα Ile274, Tyr277 και Phe280 της M2 M3 θηλιάς (αρίθμηση α υπομονάδας), ενώ δύο συντηρημένα κατάλοιπα της θηλιάς β1 β2 (Val46 και Gln47) αλληλεπιδρούν με την M2 M3. Οι πλευρικές αλυσίδες των καταλοίπων αυτών σχηματίζουν ένα τόξο που πλαισιώνει το σκελετό της Μ2 Μ3 θηλιάς στις α υπομονάδες, το οποίο δεν παρατηρείται για τις μη α υπομονάδες. Επομένως, το άνοιγμα του καναλιού μετά την πρόσδεση ACh ή άλλων αγωνιστών μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο πιθανούς τρόπους: α) ως συνέπεια των δομικών αλλαγών που συμβαίνουν στα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων, οι θηλιές β1 β2 και Cys υποχωρούν προς τη μη τεταμένη διαμόρφωση που έχουν στις μη α υπομονάδες, παύοντας να αλληλεπιδρούν με την Μ2 Μ3 θηλιά. Έτσι, η τελευταία μένει ελεύθερη να κινηθεί, επιτρέποντας με αυτόν τον τρόπο την επαναδιευθέτηση της Μ2 α έλικας ώστε να ανοίξει το κανάλι, ή β) η υποχώρηση των θηλιών β1 β2 και Cys των α υπομονάδων μακριά από την κυτταρική μεμβράνη, λόγω της χαλάρωσης των β πτυχώσεών τους, παρασύρει επίσης την Μ2 Μ3 θηλιά μέσω των διατηρούμενων σε αυτή την περίπτωση αλληλεπιδράσεών τους, και αυτή με τη σειρά της παρασύρει την Μ2 έλικα μακριά από τον άξονα του καναλιού, ανοίγοντας έτσι την πύλη του καναλιού. 27

42 Α. Θεωρητικό Μέρος Α Δομή της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του μυϊκού τύπου nachr Η πρόσφατη (μόλις το 2007) επίλυση της δομής της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του μυϊκού τύπου nachr ποντικού (α1 ΕΚΠ) με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ σε διακριτικότητα 1,94 Å, [58] αποτέλεσε το τρίτο σημαντικό επίτευγμα στη μελέτη της δομής των nachrs. Στη μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε η συγκρυστάλλωση ενός διαλυτού τριπλού μεταλλάγματος της α1 ΕΚΠ (Val8Glu, Trp149Arg, Val155Ala) με τον ανταγωνιστή α Btx (Εικόνα Α13). Η δομή αποκάλυψε σε ατομικό επίπεδο τα αμινοξικά κατάλοιπα της κυρίως πλευράς της θέσης πρόσδεσης ACh, τις αλληλεπιδράσεις με τον ανταγωνιστή α Btx, τον σημαντικό ρόλο της γλυκοζυλίωσης της α1 για την πρόσδεση της α Btx, καθώς και την ύπαρξη μίας υδρόφιλης κοιλότητας μέσα στον υδρόφοβο πυρήνα της ΕΚΠ περιοχής της α1 υπομονάδας, με πιθανό σημαντικό ρόλο στο μηχανισμό ανοίγματος του nachr. Επίσης, αποκαλύφθηκε σε ατομικό επίπεδο η διαμόρφωση του επίτοπου MIR. Εικόνα Α13. [58] (Α) Μπροστινή όψη και (Β) κάτοψη της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του μυϊκού τύπου nachr. Η ΕΚΠ σημειώνεται με πράσινο χρώμα, η α Btx με πορτοκαλί και η υδατανθρακική αλυσίδα με μωβ. Η α1 ΕΚΠ αποτελείται από έναν υδρόφοβο πυρήνα, ο οποίος συγκροτείται από δέκα β πτυχωτά φύλλα και από μία Ν τελική α έλικα. Η δομή αυτή είναι σε συμφωνία με τις κρυσταλλογραφικές δομές των ομόλογων AChBPs και με την ηλεκτρονική μικροσκοπία του Torpedo nachr, που είχαν προηγουμένως αποκαλυφθεί. Τα πτυχωτά φύλλα διακρίνονται σε εξωτερικά (β4, β7, β9 10) και εσωτερικά (β1 3, β5 6, β8), τα οποία ενώνονται μέσω της χαρακτηριστικής Cys θηλιάς, που σχηματίζεται από το δισουλφιδικό δεσμό μεταξύ της Cys128 (β6 πτυχωτό φύλλο) και της Cys142 (β7 πτυχωτό φύλλο). Οι θηλιές Α, Β και C μεταξύ των εξωτερικών β φύλλων συμμετέχουν στην 28

43 Α. Θεωρητικό Μέρος πρόσδεση της α Btx, σχηματίζοντας την κυρίως πλευρά της θέσης πρόσδεσης υποκαταστατών, όπως είχε δειχθεί και στην περίπτωση του συμπλόκου AChBP/α Cbtx. Η α Btx είναι ένα πολυπεπτίδιο 74 αμινοξέων μοριακού βάρους 8 KDa, που απομονώνεται από το δηλητήριο του φιδιού Bungarus multisinctus. Ανήκει στις α νευροτοξίνες και εμφανίζει πολύ υψηλή χημική συγγένεια για το μυϊκού τύπου nachr. Ομοίως με την α Cbtx, η δομή της α Btx εμφανίζει τη χαρακτηριστική αναδίπλωση στο χώρο των «τριών δακτύλων», με τις τρεις θηλιές «δάχτυλα» (Ι, ΙΙ και ΙΙΙ) που εξέρχονται από έναν υδρόφοβο πυρήνα β πτυχώσεων. [103] Η κρυσταλλογραφική δομή δείχνει ότι η πρόσδεση της α Btx στην α1 υπομονάδα επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπιδράσεων των θηλιών Ι και ΙΙ της α Btx με τις θηλιές Α, Β και C της α1 ΕΚΠ (Εικόνα Α14.Α). Η θηλιά ΙΙ της α Btx εισέρχεται βαθιά μέσα στην κοιλότητα που ορίζεται από τις θηλιές Α, Β και C της α1 υπομονάδας, όπως είχε δειχτεί και στο σύμπλοκο AChBP/α Cbtx. Αντιθέτως η θηλιά ΙΙΙ της α Btx δε συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις με την πρωτεΐνη. Η θηλιά Ι της α Btx συνδέεται με την α1 ΕΚΠ κυρίως διαμέσου της υδατανθρακικής αλυσίδας της α1 ΕΚΠ, η οποία εκτείνεται από το κατάλοιπο Asn141 της Cys θηλιάς προς το ανώτερο τμήμα του μορίου της α1 ΕΚΠ (Εικόνα Α14.Β). Το κατάλοιπο Asn141 είναι συντηρημένο σε όλες τις nachr υπομονάδες, εκτός από τις νευρικού τύπου α7 9. Η υδατανθρακική αλυσίδα αποτελείται από δύο Ν ακετυλ γλυκοζαμίνες (NAG2 3) και από οκτώ μαννόζες (ΜΑΝ4 11). Στον μηχανισμό πρόσδεσης της α Btx, σημαντικό ρόλο παίζει η συντηρημένη Trp187 της θηλιάς C (αντίστοιχη της Trp184 της AChBP, η οποία αλληλεπιδρά άμεσα με την α Cbtx), καθώς σταθεροποιεί μία συγκεκριμένη διαμόρφωση των μαννοζών MAN5 έως ΜΑΝ8, ώστε αυτές να αλληλεπιδρούν με διάφορα αμινοξικά κατάλοιπα της θηλιάς Ι της α Btx (Εικόνα Α14.Γ). Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της τοξίνης και των σακχάρων είναι τόσο σημαντικές, ώστε η απογλυκοζυλίωση της α1 ΕΚΠ να οδηγεί σε αδυναμία πρόσδεσης α Btx, κάτι το οποίο είχε διαπιστωθεί και σε προηγούμενες μελέτες. [124] Ένα άλλο πολύ σημαντικό εύρημα που προκύπτει από τη δομή αυτή είναι η ύπαρξη μίας υδρόφιλης κοιλότητας μέσα στον υδρόφοβο πυρήνα του μορίου. Στην κοιλότητα αυτή, η οποία οριοθετείται από τα υδρόφιλα κατάλοιπα Thr52 (β2 πτυχωτό φύλλο) και Ser126 (β6' πτυχωτό φύλλο) εντοπίσθηκε ένα διευθετημένο μόριο νερού, προσδεμένο σε αυτά τα κατάλοιπα. Αυτό το σύστημα καταλοίπων νερού συνδέεται μέσω ενός άλλου σταθερού μορίου νερού στο κατάλοιπο Asn94 της θηλιάς Α (Εικόνα Α14.Δ). Με αυτόν τον τρόπο είναι δυνατή η έμμεση αλληλεπίδραση των εσωτερικών β 29

44 Α. Θεωρητικό Μέρος πτυχώσεων με τη θηλιά Α της κυρίως πλευράς πρόσδεσης. Τα κατάλοιπα αυτά είναι εξαιρετικά συντηρημένα στα ΕΚΠ τμήματα και των άλλων nachr υπομονάδων, ενώ τα αντίστοιχα κατάλοιπα της ομόλογης AChBP, η οποία δε συμμετέχει σε σχηματισμό ιοντικού καναλιού, είναι υδρόφοβα. Με μία σειρά μεταλλαξιγεννέσεων και ηλεκτροφυσιολογικών μελετών αποδείχθηκε ο σπουδαίος ρόλος των καταλοίπων αυτών για τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού, αφού η αντικατάστασή τους από τα αντίστοιχά τους στην AChBP οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη απόκριση του καναλιού του nachr μετά την πρόσδεση ACh. [58] Έτσι, είναι πολύ πιθανό η σχηματιζόμενη υδρόφιλη κοιλότητα να είναι ένας σημαντικός διαμεσολαβητής της μετάδοσης των δομικών αλλαγών που συμβαίνουν στις θέσεις πρόσδεσης μετά την πρόσδεση αγωνιστών (μετακινήσεις των θηλιών Α, Β και C, ώστε να «αγκαλιάζουν» τον αγωνιστή) προς τα εσωτερικά β πτυχωτά φύλλα της α1 ΕΚΠ, τα οποία στη συνέχεια προκαλούν το άνοιγμα του καναλιού μέσω αλληλεπιδράσεών τους με διαμεμβρανικά τμήματα του υποδοχέα. Εικόνα Α14. [58] Λεπτομερείς απεικονίσεις τμημάτων της δομής της α1 ΕΚΠ. Η ΕΚΠ σημειώνεται με πράσινο χρώμα, η α Btx με πορτοκαλί και η υδατανθρακική αλυσίδα με μωβ. (Α) Θέση πρόσδεσης ACh και σημαντικότερες αλληλεπιδράσεις. (Β) Αλληλεπιδράσεις μεταξύ α Btx και σακχάρων. (Γ) Διαμόρφωση της υδατανθρακικής αλυσίδας και αλληλεπιδράσεις με την ΕΚΠ. (Δ) Υδρόφιλη κοιλότητα, όπως φαίνεται από την κορυφή του μορίου. 30

45 Α. Θεωρητικό Μέρος Η επίλυση της δομής της α1 ΕΚΠ έδωσε επίσης σημαντικές πληροφορίες για τη διαμόρφωση του επίτοπου MIR σε ατομικό επίπεδο. Ο MIR αποτελείται από τα αμινοξικά κατάλοιπα και η διαμόρφωσή του σταθεροποιείται από μια 3 10 έλικα, καθώς και από αλληλεπιδράσεις με τα γειτονικά στοιχεία, την Ν τελική α έλικα και τη θηλιά β5 β6. Οι πληροφορίες αυτές μπορεί να διευκολύνουν την ανάπτυξη ειδικών θεραπευτικών προσεγγίσεων για την αντιμετώπιση της βαριάς μυασθένειας. Α Δομή προκαρυωτικών LGICs Πρόσφατα έγινε γνωστή η ύπαρξη νουκλεοτιδικών αλληλουχιών σε βακτηριακά γονιδιώματα, οι οποίες κωδικοποιούν 15 πιθανούς ομόλογους υποδοχείς της LGIC υπεροικογένειας των ευκαρυωτικών. [125] Μία τέτοια νουκλεοτιδική αλληλουχία από το γονιδίωμα του κυανοβακτηριδίου Gloeobacter violaceous (Glvi) κλωνοποιήθηκε και η αντίστοιχη Glvi πρωτεΐνη εκφράστηκε σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών. [126] Αποδείχθηκε ότι η Glvi πρωτεΐνη σχηματίζει πενταμερή και λειτουργεί ως ένα κατιονικό κανάλι, το οποίο ενεργοποιείται από την πρόσδεση πρωτονίων σε αυτό. Έτσι, δεδομένης της σχετικά υψηλής ομολογίας της κυρίως με την α7 υπομονάδα του nachr (20% αμινοξική ταύτιση), θεωρείται ως ένας πρόγονος της υπερ οικογένειας των ευκαρυωτικών LGICs. To τρισδιάστατο μοντέλο που κατασκευάσθηκε για τη δομή της Glvi πρωτεΐνης [126] βασιζόμενο σε ένα μοντέλο του α7 nachr, [127] φανέρωσε μερικά δομικά χαρακτηριστικά εξαιρετικού ενδιαφέροντος. Η κάθε υπομονάδα της πενταμερούς πρωτεΐνης αποτελείται από μία εξωκυτταρική περιοχή (ΕΚΠ) και τέσσερεις διαμεμβρανικές περιοχές (Μ1 Μ4), όπως και οι ευκαρυωτικοί LGICs. Επίσης, η ΕΚΠ αποτελείται από ένα υδρόφοβο πυρήνα β πτυχώσεων, ενώ οι Μ1 Μ4 περιοχές διατάσσονται σε α έλικες, αντίστοιχα με τους ευκαρυωτικούς LGICs. Όμως, στην ΕΚΠ της Glvi φαίνεται να απουσιάζει η Ν τελική α έλικα, καθώς επίσης και η κυτταροπλασματική θηλιά μεταξύ των Μ3 Μ4 διαμεμβρανικών περιοχών, στοιχεία που υπάρχουν στους ευκαρυωτικούς LGICs. Επίσης, απουσιάζει η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπερ οικογένειας των ευκαρυωτικών LGICs, λόγω της έλλειψης των δύο συντηρημένων κυστεϊνών που την σχηματίζουν. Με βάση τα παραπάνω η Glvi πρωτεΐνη φαίνεται να αποτελεί μία προγονική μορφή των ευκαρυωτικών LGICs και χαρακτηρίζεται από μία «ελάχιστη δομή», η οποία κατά την 31

46 Α. Θεωρητικό Μέρος εξέλιξη υπέστη κατάλληλες διαφοροποιήσεις, ώστε να οδηγήσει στην πιο περίπλοκη δόμηση των ευκαρυωτικών LGICs, όπως την γνωρίζουμε μέχρι σήμερα. Εικόνα Α15. [91] (Α) Πλάγια όψη και (Β) κάτοψη της δομής της ELIC. Ε = εξωκυττάριος χώρος, Ι = ενδοκυττάριος χώρος. Ακόμα πιο πρόσφατα πραγματοποιήθηκε η κρυστάλλωση και επίλυση της δομής ενός προκαρυωτικού LGIC (ELIC) από το βακτήριο Erwinia crysanthemi, με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ και σε διακριτικότητα 3,3 Å. [91] Η δομή της ELIC (Εικόνα Α15), που αντιπροσωπεύει την μη αγώγιμη (κλειστή) μορφή του καναλιού, επιβεβαίωσε το προτεινόμενο μοντέλο για τη δομή των προκαρυωτικών LGICs. Η πρωτεΐνη αυτή είναι ένα πενταμερές κατιονικό κανάλι που θεωρείται ότι αποτελεί τον πρόγονο των nachrs. Η δομή της αποκάλυψε τη μεγάλη ομοιότητα του εξωκυττάριου τμήματός της με τη δομή της AChBP και με τα ΕΚΠ τμήματα των υπομονάδων του Torpedo nachr, με εξαίρεση την έλλειψη της Ν τελικής α έλικας και της Cys θηλιάς. [91] Επιπλέον, η διαμεμβρανική περιοχή αυτής της πρωτεΐνης βρέθηκε ότι είναι παρόμοια με την αντίστοιχη των υπομονάδων του Torpedo nachr, καθώς αποτελείται από τέσσερεις α έλικες (α1 α4). Οι α2 έλικες των διαμεμβρανικών περιοχών και των πέντε μονομερών της ELIC πρωτεΐνης σχηματίζουν ένα εσωτερικό κύκλο που ορίζει την περίμετρο του καναλιού, ο οποίος περιβάλλεται και προστατεύεται από το λιπόφιλο περιβάλλον από ένα εξωτερικό κύκλο 32

47 Α. Θεωρητικό Μέρος που σχηματίζεται από τις έλικες α1 και α3. Σε σχέση με τους ευκαρυωτικούς LGICs, είναι συντηρημένη η ύπαρξη υδρόφοβου περιβάλλοντος στο κέντρο της μεμβράνης καθώς και η ύπαρξη αρνητικά φορτισμένων αμινοξικών καταλοίπων στην περιφέρεια του καναλιού, τα οποία προσδίδουν ιοντική επιλεκτικότητα. Όμως, η διάμετρος του ιοντικού πόρου της ELIC είναι μικρότερη από αυτή του nachr. Είναι αξιοσημείωτο ότι στα προκαρυωτικά LGICs δεν υπάρχει η α3 α4 θηλιά, [91,126] η οποία εμφανίσθηκε κατά τη διαδικασία της εξέλιξης στα ευκαρυωτικά LGICs ώστε να εξυπηρετήσει συγκεκριμένες διεργασίες, όπως για παράδειγμα στην περίπτωση του nachr, τη μεγαλύτερη επιλεκτικότητα στα διαπερατά ιόντα καθώς και τη σύνδεσή του με την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη Rapsyn, με την οποία επιτυγχάνεται η συνάθροιση του υποδοχέα σε διάφορα σημεία της κυτταρικής μεμβράνης. [128,129] Μετά την επίλυση της δομής της ELIC, πραγματοποιήθηκε κρυστάλλωση και ενός άλλου προκαρυωτικού LGIC, της πρωτεΐνης GLIC από το βακτήριο Gleobacter violaceus, με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ σε διακριτικότητα 3.1 Å [92] και 2.9 Å. [93] Σε αντίθεση με την ELIC, οι δομές αυτές της GLIC αντιπροσωπεύουν την ανοικτή μορφή του ιοντικού καναλιού του προκαρυωτικού υποδοχέα. Η γενικότερη δομή της GLIC φέρει τα ίδια δομικά στοιχεία με αυτήν της AChBP και του Torpedo nachr, καθώς και της ELIC. Μια σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο προκαρυωτικών LGICs εντοπίζεται στη γεωμετρία του πόρου: στη GLIC είναι στενός εξωκυτταρικά και πλατύς ενδοκυτταρικά, ενώ στην ELIC είναι στενός εξωκυτταρικά και πλατύς ενδοκυτταρικά. Η διαφορά αυτή οφείλεται σε διαφορετική διαμόρφωση των α2 και α3 διαμεμβρανικών ελίκων. Η διαμόρφωση αυτή του πόρου της GLIC πιστεύεται ότι αντιπροσωπεύει την ανοικτή μορφή του καναλιού. [92] Η υπέρθεση των δύο δομών αποκαλύπτει ότι οι υπομονάδες της GLIC έχουν υποστεί μια στρέψη σε σχέση με αυτές της ELIC. Η στρέψη αυτή ακολουθεί τη φορά των δεικτών του ρολογιού (όπως φαίνεται από την εξωκυτταρική πλευρά) για την ΕΚΠ, και την αντίθετη φορά για τη διαμεμβρανική περιοχή. Επιπρόσθετα, παρατηρούνται και άλλες τοπικές κινήσεις και παραμορφώσεις, τόσο στην ΕΚΠ όσο και στη διαμεμβρανική περιοχή. [93] Οι διαφορές αυτές σχετίζονται με το μηχανισμό ανοίγματος του καναλιού στους προκαρυωτικούς LGICs. 33

48 Α. Θεωρητικό Μέρος Α.3. Λειτουργία του nachr Α.3.1. Λειτουργία μυϊκού τύπου nachrs Η νευρομυϊκή σύναψη των σκελετικών μυών (γνωστή και ως τελική κινητική πλάκα) αποτελείται από την απόληξη του κινητικού νευρώνα, από εξειδικεύσεις της μεμβράνης του μετασυναπτικού κυττάρου και από κύτταρα Schwann. [130] Η απόληξη του κινητικού νευρώνα υποδιαιρείται σε διακλαδώσεις με πάχος 2 μm που βρίσκονται σε μια επιμήκη κοιλότητα κατά μήκος της επιφάνειας της μυϊκής ίνας. Η μεμβράνη του μυϊκού κυττάρου που καλύπτει την παραπάνω κοιλότητα σχηματίζει πολλαπλές αναδιπλώσεις, τις μετασυναπτικές πτυχές. Απέναντι από αυτές η προσυναπτική μεμβράνη εμφανίζει περιοχές με μικρή πάχυνση, τις ενεργές ζώνες, πάνω από τις οποίες συσσωρεύονται τα συναπτικά κυστίδια (Εικόνα Α16). Η απόληξη του κινητικού νευρώνα περιέχει πλήθος μιτοχονδρίων που εξασφαλίζουν την απαιτούμενη ενέργεια για τη σύνθεση του νευροδιαβιβαστή ACh. Η ACh συντίθεται αρχικά στο κυτταρόπλασμα της απόληξης και έπειτα προσροφάται στο εσωτερικό των συναπτικών κυστιδίων. Κάθε συναπτικό κυστίδιο περιέχει περίπου 10 4 μόρια νευροδιαβιβαστή. [131] Η άφιξη δυναμικού ενεργείας στην απόληξη του προσυναπτικού νευρώνα ενεργοποιεί τα τοπικά κανάλια ασβεστίου, με αποτέλεσμα ιόντα Ca 2+ εισέρχονται στη νευρική ίνα. Αυτό οδηγεί στην εξωκύττωση των κυστιδίων που περιέχουν ACh. [132] H ACh δεσμεύεται στους μυϊκού τύπου nachrs στις μετασυναπτικές πτυχές, προκαλώντας το άνοιγμα του καναλιού του υποδοχέα, οπότε και ακολουθεί η παθητική μεταφορά ιόντων με κινητήρια δύναμη την επικρατούσα ηλεκτροχημική κλίση, η οποία ευνοεί την εισροή ιόντων Na + και την εκροή ιόντων Κ +. Κάθε ιοντικό κανάλι του μυϊκού τύπου nachr παραμένει ανοικτό για περίπου 1 ms επιτρέποντας τη διέλευση 5x10 4 κατιόντων. Η είσοδος ιόντων Na +, που εξουδετερώνεται σε κάποιο βαθμό από τη μικρή έξοδο ιόντων Κ +, οδηγεί στη γένεση συναπτικού ρεύματος στην τελική κινητική πλάκα. Το συναπτικό ρεύμα εκπολώνει τοπικά τη μετασυναπτική μεμβράνη και δημιουργεί μετασυναπτικό δυναμικό, το δυναμικό τελικής κινητικής πλάκας. Η τοπική εκπόλωση, προκαλεί την ενεργοποίηση των τασεο εξαρτώμενων καναλιών Na +, οπότε συμβαίνει περαιτέρω εισροή ιόντων Na + και πιο εκτεταμένη εκπόλωση σύμφωνα με μια ανατροφοδοτούμενη διαδικασία. Όταν το 34

49 Α. Θεωρητικό Μέρος μετασυναπτικό δυναμικό ξεπεράσει το λεγόμενο "κατώφλι" δυναμικού, δημιουργείται το δυναμικό ενέργειας (+40 mv) και πυροδοτείται η ώση που θα οδηγήσει στη μυϊκή συστολή με την έκκριση Ca 2+ από το σαρκοπλασματικό δίκτυο της μυϊκής ίνας. Η ACh αμέσως μετά την ενεργοποίηση των υποδοχέων της μετασυναπτικής μεμβράνης, υδρολύεται από το ένζυμο ακετυλοχολινεστεράση (AChE) σε οξικό οξύ και χολίνη. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η άμεση επαναπόλωση της μεμβράνης του μετασυναπτικού κυττάρου. Η χολίνη επαναπροσλαμβάνεται από τις προσυναπτική μεμβράνη και ανακυκλώνεται με σύνδεση με μόρια ακετυλο συνενζύμου Α, σχηματίζοντας νέα μόρια ACh. Εικόνα Α16. Δομή της νευρομυϊκής σύναψης. Μηχανισμός αγωγής: 1) Μετάδοση δυναμικού ενέργειας κατά μήκους του κινητικού νευρώνα. 2) Άνοιγμα τασεο εξαρτώμενων καναλιών Ca 2+ και εισροή ιόντων Ca 2+ στο κύτταρο. 3) Εξωκύττωση των συναπτικών κυστιδίων που περιέχουν ACh. 4) Πρόσδεση ACh στους μυϊκού τύπου nachrs της μετασυναπτικής μεβράνης. 5) Άνοιγμα των καναλιών των nachrs και είσοδος ιόντων Na + στο κύτταρο. 6) Άνοιγμα τασεο εξαρτώμενων καναλιών Na + και δημιουργία δυναμικού ενέργειας. 7) Αποικοδόμηση της ACh από την ακετυλοχολινεστεράση. Α.3.2. Λειτουργία νευρικού τύπου nachrs Οι νευρικού τύπου nachrs συναντώνται σε πολλές περιοχές του εγκεφάλου, όπου κατανέμονται σε προ, περι, και μετα συναπτικές θέσεις [133,134] και ο ρόλος τους 35

50 Α. Θεωρητικό Μέρος είναι η διαβίβαση των νευρικών ώσεων μεταξύ των νευρώνων (Εικόνα Α17). Οι προ και περι συναπτικοί υποδοχείς ρυθμίζουν την έκλυση σειράς σημαντικών νευροδιαβιβαστών, όπως η ACh, η ντοπαμίνη, η νορεπινεφρίνη, το γλουταμινικό οξύ, η 5 υδροξυ τρυπταμίνη (5 HT 3 ) και το γ αμινοβουτυρικό οξύ σε διάφορες θέσεις στο κεντρικό νευρικό σύστημα (Κ.Ν.Σ.). Η προσυναπτική μεμβράνη μιας σύναψης διαχωρίζεται από τη μετασυναπτική μεμβράνη με μία σχισμή (περίπου 50 nm), η οποία ονομάζεται συναπτική σχισμή. Αξίζει να σημειωθεί ότι η συναπτική απελευθέρωση συγκεκριμένου νευροδιαβιβαστή, σε διαφορετικές περιοχές του Κ.Ν.Σ., είναι δυνατόν να διαμεσολαβείται από διαφορετικό νευρικού τύπου nachr. [135,136] Οι μετασυναπτικοί νευρικού τύπου nachrs εμπλέκονται στην ταχεία διεγερτική νευροδιαβίβαση στο Κ.Ν.Σ., αλλά θεωρούνται μειωμένης σημαντικότητας συγκριτικά με τους προσυναπτικούς και περισυναπτικούς υποδοχείς. Έχει πιστοποιηθεί η παρουσία μετασυναπτικών α7, α4β2 και α3β4 νευρικού τύπου υποδοχέων σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου. [135,137] Εικόνα Α17. Σχηματική αναπαράσταση νευρικής σύναψης. Η έκφραση μεγάλης ποικιλίας νευρικού τύπου nachrs κατά τα πρώιμα στάδια της εμβρυογένεσης, καθώς και η ύπαρξη ενός πρωτογενούς μηχανισμού που επιτρέπει τόσο τη σύνθεση ACh όσο και την απόκριση σε αυτή, μαρτυρούν ένα σημαντικό ρόλο της χολινεργικής σηματοδότησης κατά τα πρώιμα στάδια ανάπτυξης του νευρικού συστήματος. [ ] 36

51 Α. Θεωρητικό Μέρος Οι νευρικού τύπου nachrs θεωρείται ότι εμπλέκονται και στις διάφορες γνωστικές διεργασίες, όπως αυτές της μάθησης και μνήμης. Πέρα από τον αδιαμφισβήτητο ρόλο των νευρικού τύπου nachrs στο νευρικό σύστημα, έχει πιστοποιηθεί η έκφρασή τους και σε κύτταρα μη νευρικών ιστών, όπως είναι τα λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, λιποκύτταρα, κερατινοκύτταρα, ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου και των πνευμόνων. [142,143] Πειραματικά δεδομένα αποκαλύπτουν την σημαντική συνεισφορά των νευρικού τύπου nachrs των μακροφάγων κυττάρων σε διαδικασίες καταστολής της φλεγμονώδους αντίδρασης [144] καθώς και την συμμετοχή τους στην αύξηση των ενδοθηλιακών αυτών κυττάρων και στις διεργασίες της αγγειογένεσης, συμπεριλαμβανομένης και της αγγειογένεσης σε καρκινικούς όγκους. [145,146] Α.3.3. Αλλοστερικές καταστάσεις του nachr Η λειτουργία του nachr στη νευρομυϊκή σύναψη περιλαμβάνει μια συνεχή διαδικασία δέσμευσης αποδέσμευσης της ACh με επακόλουθο το άνοιγμα και κλείσιμο του πόρου του καναλιού και τη μεταβολή του δυναμικού της μετασυναπτικής μεμβράνης. Ο nachr, ανταποκρινόμενος στο προσυναπτικό ερέθισμα μεταπίπτει σε διαφορετικές λειτουργικές καταστάσεις. Αυτές αντιστοιχούν σε διαφορετικές δομικές καταστάσεις που χαρακτηρίζονται από μικρές και αμφίδρομες δομικές τροποποιήσεις, καθώς το μόριο του nachr είναι μία αλλοστερική πρωτεΐνη. [6,133] Υπάρχουν τρεις βασικές αλλοστερικές καταστάσεις του nachr, οι οποίες μπορούν να παρατηρηθούν υπό την επίδραση διαφόρων υποκαταστατών (Εικόνα Α18). I. Κατάσταση ηρεμίας. Το κανάλι είναι κλειστό, αλλά μπορεί να ενεργοποιηθεί με τη δέσμευση δύο μορίων ACh. ΙΙ. Ενεργή κατάσταση. Το κανάλι είναι ανοιχτό. Ο nachr είναι προσδεμένος με δύο μόρια ACh. Η μετάβαση στην ενεργή κατάσταση από την κατάσταση ηρεμίας είναι μία εξαιρετικά γρήγορη διαδικασία ( μs). ΙΙΙ. Απευαισθητοποιημένη κατάσταση. Το κανάλι είναι κλειστό. Αν και στο nachr είναι προσδεδεμένα δύο μόρια ACh, αυτός δεν μπορεί να ενεργοποιηθεί. Η μετάβαση από την ενεργή στην απευαισθητοποιημένη κατάσταση είναι κατά τρεις τάξεις μεγέθους 37

52 Α. Θεωρητικό Μέρος βραδύτερη διαδικασία. Η κατάσταση αυτή παρατηρείται μετά από παρατεταμένη έκθεση του nachr σε υψηλές συγκεντρώσεις υποκαταστάτη. Ο φυσιολογικός της ρόλος δεν έχει αποσαφηνιστεί, δεδομένου ότι στη σύναψη η AChE υδρολύει την ACh ταχύτατα, με αποτέλεσμα ο nachr να μην εκτίθεται παρατεταμένα σε αρκετά υψηλές συγκεντρώσεις ACh. Εικόνα Α18. [147] Σχηματική απεικόνιση των αλλοστερικών καταστάσεων του nachr. Κάποια χαρακτηριστικά του τρόπου λειτουργίας του nachr, όπως η συνεργική διαδικασία που λαμβάνει χώρα μεταξύ της πρόσδεσης του αγωνιστή και του ανοίγματος του πόρου του καναλιού, έρχονται σε συμφωνία με το κλασσικό αλλοστερικό πρότυπο των Monod Wyman Changeux. [148] Ωστόσο, άλλα χαρακτηριστικά και κυρίως η μηισοδυναμία μεταξύ των δύο θέσεων πρόσδεσης της ACh δεν είναι σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, το οποίο απαιτεί απόλυτη συμμετρία στις θέσεις πρόσδεσης του υποκαταστάτη. [149] 38

53 Ενότητα Β Υπολογιστικές Μέθοδοι

54

55 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι Β.1. Πρόβλεψη και Προσομοίωση Δομών Πρωτεϊνών Β.1.1. Γενικά Από την στιγμή που επιλύθηκε η πρώτη δομή μιας πρωτεΐνης, οι ερευνητές, χημικοί/βιοχημικοί και βιολόγοι οι οποίοι χρησιμοποιούσαν υπολογιστικές προσεγγίσεις επιχείρησαν να αναπτύξουν προσεγγίσεις ή πρωτόκολλα, με στόχο την πρόβλεψη και την προσομοίωση μιας τρισδιάστατης δομής με μοναδικό στοιχείο και αφετηρία την ακολουθία αμινοξέων της πρωτεΐνης. Αξίζει να αναφερθεί ότι η πλειοψηφία των πρώτων λογισμικών Βιοπληροφορικής επιχειρούσαν να μελετήσουν και να επιλύσουν το λεγόμενο «πρόβλημα της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών». Μετά από 40 χρόνια εξέλιξης στο πεδίο αυτό, η πρόβλεψη και η προσομοίωση δομών πρωτεϊνών, συνεχίζει να αποτελεί ένα από τα πιο ενεργά ερευνητικά πεδία στη Δομική Βιοπληροφορική, στη Βιομοριακή Προσομοίωση, στη Δομική Βιοχημεία/Βιολογία και στο σχεδιασμό ενώσεων με βιολογικό και φαρμακευτικό ενδιαφέρον. Η ερευνητική δραστηριότητα στο συγκεκριμένο πεδίο, εκτός από το μεγάλο αριθμό επιστημονικών δημοσιεύσεων που αποδίδει ανά έτος, κατάφερε να επιτύχει την αποτελεσματική εφαρμογή νέων υπολογιστικών προσεγγίσεων για την προσομοίωση δομών πρωτεϊνών. Οι προσεγγίσεις αυτές μπορούν να τοποθετηθούν σε τρεις άξονες: α) προσομοίωση μέσω ομολογίας συγκριτική προσομοίωση, β) προσομοίωση μέσω threading, και γ) προσομοίωση ab initio, ή de novo προσομοίωση. [150] Και οι τρεις μέθοδοι είναι ουσιαστικά προσεγγιστικές προβλέψεις, με την έννοια ότι οι δομές οι οποίες προκύπτουν είναι δομικά μοντέλα και όχι δομές οι οποίες βασίζονται σε καθαρά πειραματικά δεδομένα, όπως αυτά προκύπτουν από την Κρυσταλλογραφία Ακτίνων Χ και από την Φασματοσκοπία NMR. Αντίθετα, κάθε μία από τις τρεις αυτές προσεγγίσεις επιχειρεί να αξιοποιήσει την υπάρχουσα γνώση και να εξάγει συμπεράσματα από τα υφιστάμενα πειραματικά δεδομένα σχετικά με τη δομή μιας πρωτεΐνης, στην προσπάθεια προσομοίωσης νέων πρωτεϊνικών δομών. Στην Εικόνα Β1 παρουσιάζεται μια σχηματική απεικόνιση της ποιότητας και ακρίβειας των δομικών μοντέλων ανάλογα με την μέθοδο μοριακής προσομοίωσης. Τα παραδείγματα της προσομοίωσης μέσω ομολογίας βασίζονται σε περίπου 60% (Α), 40% (Β) και 30% (C) ταύτιση αμινοξικής ακολουθίας. Τα παραδείγματα της ab initio (de novo) 41

56 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι προσομοίωσης παρουσιάζονται στο (D) και (Ε). Οι δομές που προβλέφθηκαν είναι με κόκκινο και οι πραγματικές δομές με μπλε. Εικόνα Β1. [150] Συσχέτιση της μεθόδου προσομοίωσης πρωτεϊνικών δομών, με την ακρίβεια των μοντέλων που προκύπτουν και της εφαρμογές για κάθε δομικό μοντέλο που προκύπτει. Η ακρίβεια των δομών μειώνεται από το (Α) στο (Ε) αλλά όπως γίνεται αντιληπτό η συνολική δομή των μοντέλων παραμένει σχετικά κοντά με την πραγματική δομή. Στη δεξιά στήλη του σχήματος συσχετίζεται η ακρίβεια ενός μοντέλου με την εφαρμογή που μπορεί να έχει ένα τέτοιο μοντέλο στην κατανόηση βιολογικών φαινομένων ή στην δομική μελέτη άλλων μορίων. 42

57 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι Β.1.2. Προσομοίωση μέσω Ομολογίας Ανάμεσα στις τρεις διαθέσιμες προσεγγίσεις, η πιο αποτελεσματική και ακριβής είναι η προσομοίωση μέσω ομολογίας (homology modeling). Η προσομοίωση μέσω ομολογίας αποδίδει σχετικά υψηλής ακρίβειας τρισδιάστατα δομικά μοντέλα πρωτεϊνών, βασισμένα σε ομοιότητες στην αμινοξική ακολουθία με κάποια άλλη διαθέσιμη τρισδιάστατη δομή στη βάση δεδομένων Protein Data Bank (PDB). Στις δομές οι οποίες προκύπτουν από την προσομοίωση μέσω ομολογίας, η ποιότητα των μοντέλων εξαρτάται σημαντικά από το βαθμό της ομοιότητας ανάμεσα στην ακολουθία της αγνώστου δομής πρωτεΐνης και της ακολουθίας της πρωτεΐνης με την οποία επιχειρείται σύγκριση της ομολογίας τους. Οι πρωτεΐνες οι οποίες εμφανίζουν το μεγαλύτερο βαθμό ταύτισης ή ομολογίας είναι και αυτές για τις οποίες επιτυγχάνεται η προσομοίωσή τους με μεγαλύτερη ακρίβεια και αξιοπιστία. Ως γενικός κανόνας, η επιτυχία στην προσομοίωση μπορεί να οριστεί ως η μέση συμφωνία των συντεταγμένων μεταξύ της πρωτεΐνης της οποίας η δομή προσομοιάζεται (πρωτεΐνη στόχος) και της δομής της πρωτεΐνης που χρησιμοποιείται ως εκμαγείο (η γνωστή και πειραματικά υπολογισμένη δομή, δηλαδή το γνωστό δομικό πλαίσιο το οποίο μέσω της ομολογίας θα κατευθύνει την αναδίπλωση της πρωτεΐνης με άγνωστη δομή), και είναι η σύγκλιση κατά 0,3 Å για κάθε 10% αύξηση της ταύτισης/ομολογίας ανάμεσα στις δύο ακολουθίες. Η προσομοίωση μέσω ομολογίας δεν μπορεί να εφαρμοστεί με αποτελεσματικότητα και αξιοπιστία για την προσομοίωση και την πρόβλεψη δομών πρωτεϊνών οι οποίες εμφανίζουν ποσοστό ταύτισης αμινοξικής ακολουθίας μικρότερο του 25 30% με την πρωτεΐνη αναφοράς. Παρ' όλα αυτά σε συγκεκριμένες σπάνιες περιπτώσεις η προσομοίωση μέσω ομολογίας μπορεί να χρησιμοποιηθεί ακόμα και με ποσοστό ταύτισης μικρότερο του 25%. Στην περίπτωση αυτή συνυπολογίζονται και άλλα δομικά χαρακτηριστικά, όπως η τοπολογία, η ύπαρξη συμπαραγόντων όπως προσθετικές ομάδες (π.χ. αίμη), μεταλλικά ιόντα με παρόμοια αμινοξέα και θέσεις πρόσδεσης, πεπτιδικά τμήματα σύνδεσης μεταξύ τομέων της πρωτεΐνης κ.λ.π. Η προσομοίωση μέσω ομολογίας είναι μια πολυδιάστατη διαδικασία, η οποία χρησιμοποιεί την αντιστοίχιση των ακολουθιών, τη δομική ταυτοποίηση, την αναζήτηση σε βάσεις δεδομένων, τη διερεύνηση της καταλληλότερης διαμόρφωσης του πεπτιδικού σκελετού και των πλευρικών αλυσίδων ώστε να επιτευχθεί η ικανοποιητικότερη ταύτιση 43

58 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι της ακολουθίας της πρωτεΐνης με την άγνωστη δομή πάνω στο δομικό πλαίσιο της γνωστής δομής καθώς επίσης και τη διευθέτηση των τμημάτων τα οποία δεν ταυτίζονται ανάμεσα στις δύο ακολουθίες (τα οποία συνήθως αποτελούν τις λεγόμενες θηλιές), την ελαχιστοποίηση της ενέργειας του δομικού μοντέλου που προκύπτει από την διαδικασία και την αποτίμηση της δομής που προκύπτει για να καταλήξει τελικά στη δημιουργία ενός αξιόπιστου δομικού μοντέλου. Πιο συγκεκριμένα η προσομοίωση μέσω ομολογίας μπορεί να αναλυθεί σε πέντε βασικά στάδια: [150] 1) Αντιστοίχιση της αμινοξικής ακολουθίας της πρωτεΐνης με την άγνωστη δομή στην ακολουθία της πρωτεΐνης με τη γνωστή δομή, και επιλογή μιας διαθέσιμης δομής αυτής της πρωτεΐνης από την PDB. 2) Χρήση της αντιστοίχισης των ακολουθιών για την επιλογή και την αντικατάσταση τμημάτων του σκελετού (συνήθως θηλιές, οι δομές των οποίων είναι συγκεντρωμένες και διαθέσιμες σε ειδικές βιβλιοθήκες ακολουθιών γνωστές για το σχηματισμό θηλιών), τα οποία χρειάζεται να υποστούν διαμορφωτικές τροποποιήσεις κατά την προσομοίωση. Κάτι τέτοιο είναι απαραίτητο όταν μεταξύ των υπό σύγκριση ακολουθιών υπάρχουν τμήματα τα οποία εμφανίζονται επιπλέον ή απουσιάζουν σε κάποια από τις δύο ακολουθίες. 3) Αντικατάσταση των πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων που διαφέρουν ανάμεσα στις δύο ακολουθίες, είτε λόγω της εισαγωγής είτε λόγω της έλλειψης πεπτιδικού τμήματος αμινοξέων στην ακολουθία των αμινοξέων της πρωτεΐνης στόχου και επιτυχή προσομοίωση/μοντελοποίηση της διαμόρφωσης πεπτιδικών τμημάτων τα οποία σχηματίζουν θηλιές (loops). 4) Βελτιστοποίηση του μοντέλου που προκύπτει από την προσομοίωση, με χρήση πρωτοκόλλων Μοριακής Μηχανικής/Δυναμικής για την ελαχιστοποίηση της ενέργειας του συστήματος (μήκη/γωνίες δεσμών, στερεοχημικές αλληλεπιδράσεις, δεσμοί Η, κ.λ.π.). 5) Έλεγχος της ποιότητας, σε επίπεδο ανάλυσης και ορθότητας, των μοριακών δομών με χρήση λογισμικού μοριακής απεικόνισης και αποτίμησης μοριακών δομών (π.χ. PROCHECK). Το πλέον καθοριστικό στάδιο στη διαδικασία προσομοίωσης μέσω ομολογίας είναι το πρώτο βήμα, δηλαδή η αντιστοίχιση των δύο ακολουθιών. Εσφαλμένη 44

59 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι αντιστοίχιση ανάμεσα στις δύο ακολουθίες των πρωτεϊνών θα δημιουργήσει ένα ντόμινο λαθών ανάμεσα στα διάφορα στάδια της διαδικασίας προσομοίωσης, οδηγώντας τελικά σε ένα παραπλανητικό τρισδιάστατο δομικό μοντέλο της πρωτεΐνης. Τα πιθανά σφάλματα στα δομικά μοντέλα τα οποία προκύπτουν από την διαδικασία της συγκριτικής προσομοίωσης μπορούν να εστιαστούν στα εξής σημεία: [150] Α. Σφάλματα στη διάταξη/πακετάρισμα των πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων (παρατηρούνται μεγαλύτερες διαφορές ανάμεσα στις πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων της πρωτεΐνης στόχου και της πρωτεΐνης αναφοράς σε σχέση με τον πεπτιδικό σκελετό, τα άτομα του οποίου παραμένουν ίδια). Β. Σφάλματα και αποκλίσεις από την πρωτεΐνη αναφοράς ακόμα και σε σωστά αντιστοιχισμένες περιοχές της ακολουθίας ως επακόλουθο της διαφοράς στην συγκεκριμένη περιοχή ανάμεσα στην πρωτεΐνη αναφοράς και την πρωτεΐνη στόχο (αυτό μπορεί να οφείλεται είτε στο μέσο, διάλυμα ή στερεά κατάσταση και στον τρόπο υπολογισμού της δομής, είτε στα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων όταν αυτά διαφέρουν ανάμεσα σε πρωτεΐνη στόχο και αναφοράς). Γ. Σφάλματα στην περιοχή όπου δεν υπάρχει διαθέσιμη δομή αναφοράς (εκμαγείο), και οφείλεται σε απουσία πεπτιδικών τμημάτων στη δομή αναφοράς. Δ. Σφάλματα λόγω μη ακριβούς ή παραπλανητικής αντιστοίχισης των ακολουθιών της πρωτεΐνης στόχου και της πρωτεΐνης αναφοράς. Ε. Σφάλματα τα οποία οφείλονται σε λάθος επιλογή της πρωτεΐνης αναφοράς, ένα πρόβλημα το οποίο είναι συχνό όταν συγκρίνονται μακρινές μεταξύ τους πρωτεΐνες (<25% ταύτιση αμινοξικών ακολουθιών). Αρχικά η διαδικασία της προσομοίωσης μέσω ομολογίας αποτελούσε μια πολύπλοκη διαδικασία, προσιτή μόνο σε όσους διέθεταν σημαντικές γνώσεις στη χρήση του λειτουργικού UNIX και γενικά υπολογιστικών προγραμμάτων. Ένας άλλος περιοριστικός παράγοντας ήταν η μικρή διαθεσιμότητα εξειδικευμένων προγραμμάτων μοριακής απεικόνισης και Η/Υ υψηλής υπολογιστικής ισχύος. Σήμερα, η εξέλιξη στην τεχνολογία των υπολογιστών και του λογισμικού περιόρισε σημαντικά τη χρονική διάρκεια των επί μέρους σταδίων. Έτσι η προσομοίωση μέσω ομολογίας μπορεί τώρα να εκτελείται καθημερινά και να εφαρμόζεται με ευχέρεια ακόμα και από μη εξειδικευμένους με υπολογιστικά συστήματα ερευνητές. Επιπλέον εκτός των εμπορικά 45

60 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι διαθέσιμων λογισμικών υπάρχουν αρκετά αξιόπιστα λογισμικά ευρέως διαδεδομένα και ελεύθερης χρήσης, όπως το λογισμικό MODELLER. [151] Το λογισμικό αυτό είναι διαθέσιμο τόσο για λειτουργικά συστήματα UNIX και LINUX όσο και για την πλατφόρμα των Windows. Πρόσφατα η διαδικασία της μοριακής προσομοίωσης έχει γίνει διαθέσιμη μέσω διακομιστών στο διαδίκτυο. Πλέον υπάρχει ένας σημαντικός αριθμός διακομιστών, όπως ο SWISS MODEL [152] όπου μπορεί να πραγματοποιηθεί αυτόματα, με μικρή συμμετοχή του χειριστή, η διαδικασία της προσομοίωσης μέσω ομολογίας από οποιονδήποτε ερευνητή. Β.1.3. Πρόβλεψη δομής με το λογισμικό MODELLER Το MODELLER είναι ένα από τα πιο ευρέως διαδεδομένα λογισμικά για την πρόβλεψη/προσομοίωση δομής μέσω ομολογίας. [153] Στην πιο απλή του μορφή, τα εισαγόμενα δεδομένα είναι η αντιστοίχιση της αμινοξικής ακολουθίας της πρωτεΐνηςστόχου με μία ή περισσότερες πρωτεΐνες αναφοράς, οι ατομικές συντεταγμένες (από την PDB) της δομής των πρωτεϊνών αναφοράς και ένα μικρό αρχείο εντολών (script). Από αυτά το MODELLER υπολογίζει αυτόματα ένα δομικό μοντέλο της πρωτεΐνης στόχου μέσα σε λίγα λεπτά σε έναν κοινό Η/Υ, χωρίς να χρειάζεται να παρέμβει ο χρήστης. Το MODELLER κατασκευάζει δομικά μοντέλα μέσω της ικανοποίησης κάποιων διαμορφωτικών περιορισμών (spatial restraints). Οι περιορισμοί αυτοί περιλαμβάνουν: α) περιορισμούς εξ ομολογίας, που προέρχονται από την αντιστοίχιση ακολουθίας με τις πρωτεΐνες αναφοράς και εφαρμόζονται σε ατομικές αποστάσεις και δίεδρες γωνίες της ακολουθίας στόχου, β) στερεοχημικούς περιορισμούς όπως προτιμώμενα μήκη και γωνίες δεσμών, που προέρχονται από το πεδίο δυνάμεων (force field) μοριακής μηχανικής του CHARMM 22 (βλ. Β.3.4.), γ) στατιστικές προτιμήσεις για δίεδρες γωνίες μη δεσμικές ατομικές αποστάσεις, προερχόμενες από μία βάση γνωστών πρωτεϊνικών δομών, και δ) προαιρετικά, μη αυτόματους περιορισμούς βασισμένους σε πληροφορίες από φασματοσκοπία NMR, πειράματα αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών με χημικές ενώσεις διασταυρούμενης διασύνδεσης (cross linking), φθορισμομετρία, ηλεκτρονική μικροσκοπία, κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση κ.ά. Οι παραπάνω περιορισμοί εκφράζονται ως πιθανολογικές συναρτήσεις και συνδυάζονται σε μια συνάρτηση 46

61 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι (objective function). Η συνάρτηση αυτή βελτιστοποιείται με τρόπο ώστε να παραβιάζεται όσο το δυνατόν μικρότερος αριθμός περιορισμών. Η διαδικασία της βελτιστοποίησης ακολουθεί τη μέθοδο της μεταβλητής συνάρτησης (variable target function), δηλαδή γίνεται σε κύκλους, με την αρχική συνάρτηση να λαμβάνει υπ όψιν μόνο τους τοπικούς περιορισμούς (που αφορούν τα κοντινά αμινοξέα) και στη συνέχεια αυτή να ενσωματώνει όλο και πιο μακρινούς, μέχρι το σύνολό τους να συμπεριληφθεί στην τελική συνάρτηση. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται κατά τη βελτιστοποίηση είναι η μέθοδος συζευγμένου ανύσματος (conjugate gradients method) και η προσομοίωση ανόπτησης (simulated annealing). Η όλη διαδικασία είναι παρόμοιο με τον υπολογισμό τριτοταγούς διαμόρφωσης στη φασματοσκοπία NMR. Εκτός από τη δημιουργία δομικών μοντέλων με τη μέθοδο των διαμορφωτικών περιορισμών, το MODELLER μπορεί επίσης να πραγματοποιήσει de novo προσομοίωση της δομής των θηλιών (loops). [154] Οι θηλιές στη δομή μιας πρωτεΐνης μπορεί να διαφοροποιούνται σε μεγάλο βαθμό, ακόμη και μεταξύ πρωτεϊνών με υψηλή ομολογία. Συχνά όμως παίζουν σημαντικό ρόλο στη λειτουργία της πρωτεΐνης, συμμετέχοντας στο σχηματισμό των θέσεων δέσμευσης υποκαταστατών ή στο ενεργό κέντρο. Η προσομοίωση της δομής των θηλιών πραγματοποιείται με μια διαδικασία διαμορφωτικής έρευνας και βελτιστοποίησης. Οι χρησιμοποιούμενοι αλγόριθμοι είναι η μέθοδος συζευγμένου ανύσματος και η προσομοίωση ανόπτησης. Το MODELLER προσφέρει και τη δυνατότητα εκτέλεσης διαφόρων βοηθητικών εργασιών, όπως αντιστοίχιση ακολουθιών ή δομών για δύο ή περισσότερες πρωτεΐνες, δημιουργία φυλογενετικών δέντρων κ.ά. Το πρόγραμμα στη μορφή για τοπική εγκατάσταση σε Η/Υ δεν περιλαμβάνει γραφικό περιβάλλον, αλλά λειτουργεί με αρχεία γραπτών εντολών (scripts). 47

62 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι Β.2. Προσομοίωση Σύμπλεξης/Πρόσδεσης Μορίων Β.2.1. Γενικά Η επικρατούσα άποψη στην ανάπτυξη νέων φαρμακευτικών ενώσεων είναι η αναζήτηση ενός μικρού μορίου (προσδέτης ligand), το οποίο εμφανίζει ικανότητα πρόσδεσης πάνω σε ένα βιομόριο στόχο, που μπορεί να είναι πρωτεΐνη, ένζυμο, υποδοχέας, DNA, RNA κ.λ.π. Η τρισδιάστατη δομή του βιομορίου στόχου μπορεί είτε να είναι πειραματικά προσδιορισμένη, είτε να προσομοιωθεί με υπολογιστικές μεθόδους. Ο προσδέτης καλείται να λειτουργήσει ως ρυθμιστής της δράσης του μορίου στόχου και να μπορεί να δράσει είτε σαν αγωνιστής (agonist), είτε σαν ανταγωνιστής (antagonist). Για να επιδείξει τη βιολογική ή φαρμακευτική του δράση ένα μόριο, πρέπει να επιτυγχάνεται η πρόσδεσή του (docking) στην κατάλληλη περιοχή (π.χ. καταλυτικό κέντρο για ένα ένζυμο) του μεγαλύτερου βιομορίου στόχου. Για να γίνει η σύνδεση αυτή, πρέπει το μακρομόριο και ο υποκατάστατης να παρουσιάζουν συμπληρωματικότητα τόσο στις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, όσο και στην στερεοχημική τους δομή. Η συμπληρωματικότητα αυτή συνήθως ρυθμίζει την ισχύ της αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο μορίων και καταλήγει στην συγγένεια πρόσδεσης ενός μικρού μορίου έναντι στο μόριο στόχο. Για τον σκοπό αυτό έχουν αναπτυχθεί ειδικά λογισμικά προσομοίωσης πρόσδεσης (docking simulation) με χρήση των οποίων καθίσταται δυνατή η πρόβλεψη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ του υποκαταστάτη και του μακρομορίου. Β.2.2. Μοριακή Προσομοίωση Πρόσδεσης Η μοριακή προσομοίωση πρόσδεσης (molecular docking) ορίζεται ως η πρόβλεψη της διαμόρφωσης/προσανατολισμού δύο ή περισσοτέρων μορίων, τα οποία σχηματίζουν ένα σταθερό σύμπλοκο. O στόχος αυτού του βήματος είναι η μελέτη της διαμόρφωσης του συμπλέγματος υποδοχέα υποκαταστάτη στο χώρο. Σε κάθε διαδικασία πρόσδεσης υπάρχουν δύο αντικρουόμενες απαιτήσεις τις οποίες πρέπει να ικανοποιήσουμε: την επιθυμία για πειραματικώς ορθή πρόβλεψη και την επιθυμία για απλοποίηση των υπολογιστικών απαιτήσεων. Η ιδεατή διαδικασία θα 48

63 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι υπολόγιζε την ολική ελάχιστη ενέργεια αλληλεπίδρασης ανάμεσα στον υποκατάστατη και την πρωτεΐνη στόχο, λαμβάνοντας υπόψη όλους τους βαθμούς ελευθερίας του συστήματος. Σε αυτήν την περίπτωση το μέγεθος του χώρου εύρεσης (search space) είναι τεράστιο και με την υπάρχουσα τεχνολογία είναι αδύνατο να ερευνηθεί σε πεπερασμένο χρονικό διάστημα. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται κάποιες στρατηγικές προκειμένου να ερευνηθούν οι πιθανές διαμορφώσεις με τη μέγιστη αποτελεσματικότητα. Β.2.3. Ευρετικοί αλγόριθμοι Κάθε πρόγραμμα προσομοίωσης πρόσδεσης χρησιμοποιεί έναν ή περισσότερους εξειδικευμένους ευρετικούς αλγορίθμους (search algorithm), που προσπαθούν να προβλέψουν τις πιθανές διαμορφώσεις του συμπλόκου στόχου υποκαταστάτη. Οι αλγόριθμοι πρόσδεσης διακρίνονται σε τρεις ευρείες κατηγορίες: [155] Α. Αλγορίθμους ταιριάσματος ή συμπληρωματικότητας διαμόρφωσης (matching ή shape complementarity algorithms), που προσπαθούν να ταιριάξουν τον υποκαταστάτη στο καταλυτικό κέντρο (κέντρο πρόσδεσης binding pocket) του υποδοχέα, εξετάζοντας γεωμετρικά, χημικά και ενεργειακά την πρόσδεσή του εκεί. Β. Προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (molecular dynamics MDs), όπου διάφορες διαμορφώσεις του υποκαταστάτη προσδένονται στο μόριο στόχο και η τελική διαμόρφωση του συμπλέγματος βελτιστοποιείται με τεχνικές προσομοίωσης ανόπτησης (simulated annealing SA) και ελαχιστοποίησης ενέργειας. Γ. Γενετικούς αλγόριθμους (genetic algorithms GA), που θεωρούν κάθε πιθανή διαμόρφωση ως ένα «γονίδιο» με συγκεκριμένη ενέργεια. Στη συνέχεια προσομοιάζουν την «εξέλιξη του γονιδιώματος» με τυχαίες διασταυρώσεις μεταξύ γονιδίων και τυχαίες μεταλλάξεις στους «απογόνους». Στην πρώτη κατηγορία ο υποκαταστάτης και ο υποδοχέας θεωρούνται άκαμπτοι, και οι βαθμοί ελευθερίας του υποκαταστάτη ως προς τον υποδοχέα έχουν να κάνουν μόνο με τη θέση και τον προσανατολισμό του. Το μεγάλο πλεονέκτημα αυτής της προσέγγισης είναι το χαμηλό υπολογιστικό κόστος, αλλά τα αποτελέσματα είναι χαμηλής ακρίβειας, αφού στην πραγματικότητα η ευελιξία των μορίων στο χώρο επηρεάζει τη 49

64 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι διαμόρφωση πρόσδεσης. Όμως οι μέθοδοι αυτές είναι πολύ αποτελεσματικές για το διεξοδικό έλεγχο (screening) μορίων από βάσεις δεδομένων. Το πιο διαδεδομένο λογισμικό αυτής της κατηγορίας είναι το DOCK. [156] Από την άλλη, οι άλλες δύο προσεγγίσεις λαμβάνουν επιπλέον υπόψη το βαθμό ελευθερίας του υποκαταστάτη που σχετίζεται με την εσωτερική διαμόρφωσή του, δηλαδή ο υποκαταστάτης διαθέτει ευκαμψία. Σε αυτήν την περίπτωση το υπολογιστικό κόστος είναι μεγάλο, καθώς μεγαλώνει ο αριθμός των βαθμών ελευθερίας του προβλήματος και κατά συνέπεια και το μέγεθος του χώρου εύρεσης. Συχνά, για την απλοποίηση των υπολογισμών και τη μείωση της υπολογιστικής πολυπλοκότητας, θεωρείται ότι ο υποδοχέας δεν έχει ευκινησία. Η προσέγγιση αυτή μειώνει κατά πολύ τον απαιτούμενο υπολογιστικό χρόνο, αλλά πολύ συχνά μικρές αλλαγές στη διαμόρφωση του υποδοχέα επιφέρουν σημαντική μεταβολή στη χημική συγγένειά του με τον υποκατάστατη. Τα προγράμματα προσομοίωσης πρόσδεσης τελευταίας γενιάς παρέχουν πλέον τη δυνατότητα διαμορφωτικής ελευθερίας στις πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων του μορίου στόχου. Σε αυτή την κατηγορία υπάγεται το λογισμικό AutoDock, [157] το οποίο θα περιγραφεί αναλυτικά παρακάτω. Β.2.4. Συνάρτηση υπολογισμού της ενέργειας Οι προσομοιώσεις πρόσδεσης παράγουν μεγάλο αριθμό πιθανών διαμορφώσεων για το σύμπλεγμα στόχο. Για να προσδιοριστεί η πιθανότητα που έχει κάθε υπολογιζόμενη διαμόρφωση να παριστάνει μία πραγματική αλληλεπίδραση μεταξύ υποκαταστάτη και υποδοχέα χρησιμοποιείται μια συνάρτηση υπολογισμού της ενέργειας (energy/scoring function). Αυτή αποτελεί ένα προσεγγιστικό μαθηματικό μοντέλο που υπολογίζει την ισχύ (συγγένεια) της σύνδεσης των δύο μορίων. Ιδανικά η ελάχιστη τιμή αυτής της συνάρτησης θα πρέπει να αντιστοιχεί στο βέλτιστο τρόπο πρόσδεσης του ενός μορίου στο άλλο. Υπάρχουν ποικίλες συναρτήσεις υπολογισμού της ενέργειας που χρησιμοποιούνται από τα λογισμικά προσομοίωσης πρόσδεσης. Οι συναρτήσεις αυτές μπορούν να χωριστούν σε τρεις γενικές κατηγορίες: [158] Α. Πεδίου δυνάμεων (force field). Η συγγένεια προσδιορίζεται από το συνδυασμό των ενεργειών διαμοριακής αλληλεπίδρασης μεταξύ των μορίων (van der 50

65 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι Waals, ηλεκτροστατικές κ.ά), των ενδομοριακών ενεργειών του κάθε μορίου, και των ενεργειών διαλυτοποίησής τους στο διαλύτη. Β. Εμπειρικές (empirical). Βασίζονται στην απαρίθμηση των ξεχωριστών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των προσδεμένων μορίων. Αυτό υπολογίζετε είτε από τον αριθμό των ατόμων των δύο μορίων που βρίσκονται σε επαφή, είτε από την αλλαγή στην επιφάνεια που είναι προσβάσιμη στο διαλύτη (accessible surface area ASA) μετά τον σχηματισμό του συμπλόκου. Οι αλληλεπιδράσεις ανάλογα με το είδος τους κατατάσσονται σε ευνοϊκές (π.χ. μεταξύ υδρόφοβων ατόμων) και δυσμενείς (π.χ. μεταξύ υδρόφοβου και πολικού ατόμου). Γ. Βασισμένες σε υπάρχουσα γνώση (knowledge based). Βασίζονται σε στατιστικές παρατηρήσεις πάνω σε διαμοριακές αλληλεπιδράσεις σε βάσεις δεδομένων τρισδιάστατων δομών (όπως η PDB). Θεωρούν ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ συγκεκριμένων ατόμων ή χημικών ομάδων επιδρούν ευνοϊκά στη συγγένεια δέσμευσης. Β.2.5. Στρατηγική της μελέτης ενός συμπλόκου υποδοχέα υποκαταστάτη μέσω Προσομοίωσης Πρόσδεσης Σε κάθε διαδικασία πρόσδεσης υπάρχουν τρία βασικά βήματα που απαιτούνται πριν από την έναρξη των υπολογισμών: 1) Προετοιμασία του συστήματος, δηλαδή του μακρομορίου όπου θέλουμε να πραγματοποιήσουμε την πρόσδεση, καθώς και του υποκαταστάτη (οργανικό μόριο, πεπτίδιο, κ.ά.). Εάν οι συντεταγμένες του μακρομορίου είναι γνωστές, τότε είναι δυνατό να αποκτηθούν από τη βάση δεδομένων PDB. Εφόσον όμως η διαμόρφωση του υποδοχέα είναι άγνωστη, πρέπει να προηγηθεί το στάδιο της πρόβλεψης μέσω ομολογίας της διαμόρφωσης της πρωτεΐνης και της δημιουργίας της τρισδιάστατης δομής της ( Β.1.). Όσον αφορά τον υποκαταστάτη, οι ατομικές του συντεταγμένες μπορούν είτε να εξαχθούν από κάποια βάση δεδομένων, είτε να δημιουργηθούν με κάποιο ειδικό πρόγραμμα. Στη συνέχεια, τα δύο μόρια επεξεργάζονται περαιτέρω εισάγοντας ορισμένες παραμέτρους που χρειάζονται τα λογισμικά πρόσδεσης για τους υπολογισμούς, όπως για παράδειγμα το φορτίο των ατόμων, οι δίεδρες γωνίες, κ.ά. 51

66 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι 2) Χαρακτηρισμός του σημείου πρόσδεσης. Η περιοχή που θα οριστεί μπορεί να περιλαμβάνει μόνο την περιοχή της πρωτεΐνης όπου πραγματοποιείται η πρόσδεση, ή και ολόκληρη την πρωτεΐνη σε περίπτωση που αυτή δεν είναι γνωστή. 3) Ορισμός των παραμέτρων πρόσδεσης. Σε αυτό το βήμα θα πρέπει να καθοριστούν όλοι οι παράγοντες που θα λάβει υπόψη το λογισμικό προκειμένου να αρχίσει η προσομοίωση πρόσδεσης, όπως για παράδειγμα οι χάρτες πλέγματος, τα αρχεία παραμέτρων των μορίων, ποιον αλγόριθμο πρόσδεσης θα χρησιμοποιήσει, καθώς και πόσες διαμορφώσεις θα εξάγει. Στο τέλος της προσομοίωσης πρόσδεσης πραγματοποιείται αξιολόγηση και οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων, χαρακτηρισμός της επιφάνειας αλληλεπίδρασης των συμπλόκων και ερμηνεία του τρόπου με τον οποίο τα διαμορφωμερή επιλέγουν το σημείο πρόσδεσής τους στον υποδοχέα. Αυτό γίνεται κυρίως μελετώντας την ενέργεια αλληλεπίδρασης του κάθε διαμορφωμερούς και τις αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα μεταξύ υποδοχέα και υποκαταστάτη (δεσμοί υδρογόνου, ηλεκτροστατικές και υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις, αλληλεπιδράσεις van der Waals). Ειδικότερα, η ανάλυση των αποτελεσμάτων μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας κάθε φορά διάφορα κριτήρια, τα οποία θα πρέπει να λαμβάνονται όλα υπόψη στην επιλογή της τελικής διαμόρφωσης πρόσδεσης. Τα κριτήρια αυτά είναι: Η ενέργεια αλληλεπίδρασης της κάθε διαμόρφωσης. Η μέση απόκλιση (root mean square deviation RMSD) της δομής του κάθε διαμορφωμερούς σε σχέση με μια δομή αναφοράς. Η απόσταση ατόμων του υποκαταστάτη από αμινοξέα του ενεργού κέντρου του υποδοχέα, ή κάποια κατάλοιπα του υποδοχέα που παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρόσδεση του υποκαταστάτη (βιολογικό κριτήριο). Ο αριθμός των διαμορφωμερών που κατατάσσονται σε ομοειδή σύνολα (clusters) με βάση την ομοιότητα της διαμόρφωσής τους. Β.2.6. Προσομοίωση Πρόσδεσης με το λογισμικό AutoDock Ένα από τα ευρέως χρησιμοποιούμενα λογισμικά προσομοίωσης πρόσδεσης είναι το AutoDock, το οποίο παρέχει μια αυτοματοποιημένη διαδικασία με την οποία 52

67 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι προβλέπονται οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υποκαταστατών και των μακρομοριακών στόχων. Στην έκδοση 3.0 το AutoDock χρησιμοποιεί διάφορους αλγόριθμους για την εύρεση των πιθανών διαμορφώσεων: προσομοίωση ανόπτησης Monte Carlo, γενετικό αλγόριθμο (για ολική εύρεση), μέθοδο τοπικής εύρεσης (local search LS), και υβριδική μέθοδο που συνδυάζει τις δύο τελευταίες και ονομάζεται Λαμαρκιανός γενετικός αλγόριθμος (Lamarckian genetic algorithm LGA). Η μέθοδος της προσομοίωσης ανόπτησης Monte Carlo [159] αποτελεί μια καλή προσέγγιση της πρόσδεσης ενός εύκαμπτου υποκατάστατη με το ενεργό κέντρο μιας στατικής πρωτεΐνης. Αρχικά υπολογίζεται ένα πλέγμα συγγένειας για κάθε τύπο ατόμου του υποκαταστάτη, καθώς επίσης και ένα πλέγμα ηλεκτροστατικών δυναμικών, χρησιμοποιώντας σαν «φορτίο ελέγχου» το +1e (1,60219x10 19 C). Η ενέργεια κάθε διαμόρφωσης του υποκαταστάτη υπολογίζεται με τρι γραμμική παρεμβολή των οχτώ σημείων του πλέγματος που περιβάλλουν κάθε άτομο. Οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις υπολογίζονται ομοίως, με παρεμβολή των ηλεκτροστατικών δυναμικών και πολλαπλασιασμό με το φορτίο του ατόμου. Ο χρόνος που απαιτείται για τον υπολογισμό της ενέργειας εξαρτάται μόνο από τον αριθμό ατόμων του υποκατάστατη και είναι ανεξάρτητος από τον αριθμό ατόμων της πρωτεΐνης. Κατά τη διαδικασία της εύρεσης, η πρωτεΐνη θεωρείται στατική και ο υποκατάστατης εκτελεί μια τυχαία κίνηση γύρω από αυτήν. Σε κάθε βήμα της προσομοίωσης πραγματοποιείται μια μικρή τυχαία μετατόπιση των βαθμών ελευθερίας του υποκαταστάτη, η οποία οδηγεί σε μια νέα διαμόρφωση. Η ενέργεια της νέας διαμόρφωσης συγκρίνεται με αυτήν του προηγούμενου βήματος. Αν είναι μικρότερη, τότε γίνεται αμέσως αποδεκτή, ενώ αν είναι μεγαλύτερη η πιθανότητα αποδοχής ή απόρριψης της διαμόρφωσης εξαρτάται από μια καθορισμένη θερμοκρασία Τ. Σε αρκετά υψηλές θερμοκρασίες σχεδόν όλα τα βήματα γίνονται αποδεκτά, ενώ σε χαμηλότερες θερμοκρασίες, λιγότερες δομές είναι αποδεκτές. Η προσομοίωση λαμβάνει χώρα σε μια σειρά από κύκλους οι οποίοι εξελίσσονται σε μια συγκεκριμένη θερμοκρασία. Κάθε κύκλος αποτελείται από ανεξάρτητα βήματα, τα οποία απορρίπτονται ή γίνονται αποδεκτά ανάλογα με την θερμοκρασία. Μετά από έναν αριθμό αποδοχών ή απορρίψεων, ο επόμενος κύκλος ξεκινά με μειωμένη θερμοκρασία. Στο τέλος της διαδικασίας το σύστημα καταλήγει σε μια διαμόρφωση με ελάχιστη ενέργεια. 53

68 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι Εικόνα Β2. [157] Αναπαράσταση των μεθόδων αναζήτησης του AutoDock. Στο δεξιό τμήμα του διαγράμματος αναπαρίσταται ο γενετικός αλγόριθμος (Δαρβινιανή εξέλιξη). Η μετάλλαξη του γονέα οδηγεί στον απόγονο, ο οποίος έχοντας μικρότερη τιμή στη συνάρτηση ενέργειας f(x), επιβιώνει. Στο αριστερό τμήμα αναπαρίσταται ο Λαμαρκιανός γενετικός αλγόριθμος, που εμπεριέχει την τοπική εύρεση. Ο φαινότυπος του γονέα μεταβάλλεται μέχρι να φτάσει σε μια ελάχιστη τιμή της συνάρτησης, οπότε μετατρέπεται σε γονότυπο ο οποίος διατηρείται στην επόμενη γενεά. Οι γενετικοί αλγόριθμοι [160] είναι μέθοδοι εύρεσης που μιμούνται τη φυσική διαδικασία της εξέλιξης. Στη μέθοδο αυτή, η σχετική διάταξη πρωτεΐνης υποκαταστάτη ορίζεται ως μια σειρά τιμών, κάθε μία εκ των οποίων είναι μία μεταβλητή κατάστασης που περιγράφει τη θέση, τον προσανατολισμό και τη διαμόρφωση του υποκαταστάτη σε σχέση με την πρωτεΐνη. Αυτές οι μεταβλητές κατάστασης ονομάζονται «γονίδια», με την κατάσταση του υποκαταστάτη να αποτελεί το «γονότυπο» και τις ατομικές συντεταγμένες του να αποτελούν το «φαινότυπο». Τα γονίδια υπόκεινται σε τυχαία «διασταύρωση», ώστε οι απόγονοι να κληρονομούν γονίδια από έναν ή τον άλλο γονέα. Κάποιοι απόγονοι υπόκεινται επίσης σε τυχαία «μετάλλαξη», όπου ένα γονίδιο αλλάζει με τυχαίο τρόπο. Η επιλογή των απογόνων κάθε «γενεάς» εξαρτάται από την ικανότητα «επιβίωσής» τους, η οποία καθορίζεται από τη συνάρτηση υπολογισμού της ενέργειας. Η νέα υβριδική τεχνική εύρεσης του AutoDock 3.0 συνδυάζει ένα γενετικό αλγόριθμο για ολική εύρεση και μία μέθοδο τοπικής εύρεσης. Η μέθοδος τοπικής 54

69 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι εύρεσης βασίζεται στον αλγόριθμο βελτιστοποίησης των Solis και Wets, [161] ο οποίος έχει το προτέρημα ότι δεν απαιτεί πληροφορίες της διαβάθμισης (gradient) της τοπικής ενέργειας. Η μέθοδος αυτή είναι προσαρμοστική, δηλαδή ρυθμίζει το μέγεθος του κάθε βήματος με βάση τις ενέργειες των αμέσως προηγούμενων. Η υβριδική αυτή μέθοδος ονομάζεται Lamarckian genetic algorithm (LGA), ως αναφορά στον Lamarck, ο οποίος θεωρούσε ότι τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά που αποκτούνται κατά τη διάρκεια της ζωής ενός ατόμου μπορούν να κληρονομηθούν στους απογόνους του. Η αρχή της μεθόδου είναι η εξής: από τον αρχικό πληθυσμό γονιδίων δημιουργούνται απόγονοι με διασταυρώσεις και τυχαίες μεταλλάξεις. Οι παραγόμενοι γονότυποι μετατρέπονται σε φαινότυπους και υπολογίζεται η ενέργειά τους. Με βάση αυτήν επιλέγονται όσοι απόγονοι θα περάσουν στην επόμενη γενιά, και η διαδικασία επαναλαμβάνεται. Αυτά αποτελούν χαρακτηριστικά του γενετικού αλγορίθμου. Επιπλέον, σε κάθε γενιά ένα ποσοστό του πληθυσμού υπόκεινται σε τοπική εύρεση σε επίπεδο φαινότυπου, για βελτιστοποίηση των αποτελεσμάτων. Αν η τοπική εύρεση είναι θετική, ο φαινότυπος μεταβάλει το γονότυπο, ο οποίος περνάει στην επόμενη γενιά, σύμφωνα με την Λαμαρκιανή εξέλιξη (Εικόνα Β2). Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με τον LGA του AutoDock δείχνουν την ξεκάθαρη υπεροχή του έναντι της προσομοίωσης ανόπτησης αλλά και του κλασσικού GA στην ακριβή αναπαραγωγή της κρυσταλλογραφικής δομής συμπλόκων πρωτεϊνών με μικρά μόρια. Το AutoDock 3.0 διαθέτει επίσης και μια νέα εμπειρική συνάρτηση υπολογισμού της ελεύθερης ενέργειας πρόσδεσης (Empirical Binding Free Energy Function): [157] Η συνάρτηση αυτή αποτελείται από πέντε θερμοδυναμικούς όρους, που αφορούν την ενέργεια van der Waals, την ενέργεια δεσμών υδρογόνου, την ενέργεια ηλεκτροστατικών 55

70 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι αλληλεπιδράσεων, την ενέργεια περιστροφής των δεσμών του υποκαταστάτη, και την ενέργεια διαλυτοποίησης. Οι παραπάνω όροι αντισταθμίζονται από μια σταθερά ο καθένας, η οποία υπολογίστηκε εμπειρικά με βάση τριάντα σύμπλοκα πρωτεΐνηςυποκαταστάτη με γνωστή τιμή σταθεράς δέσμευσης, υπολογισμένη πειραματικά. Ένα άλλο χαρακτηριστικό του AutoDock είναι ότι χρησιμοποιεί προυπολογισμένους χάρτες πλέγματος, που δημιουργούνται από το υπο πρόγραμμα AutoGrid. Ο χάρτης πλέγματος (Εικόνα Β3) καθορίζει την περιοχή του μορίου στόχου όπου θα διερευνηθεί η πιθανή πρόσδεση του υποκατάστατη. Ο χάρτης αυτός αποτελείται από ένα δικτυωτό πλέγμα τριών διαστάσεων με σημεία τοποθετημένα ανά τακτά διαστήματα, τα οποία περιβάλουν (ολικώς ή μερικώς) περιοχές του μακρομορίου που παρουσιάζουν βιολογικό ενδιαφέρον. Κάθε σημείο μέσα στο χάρτη πλέγματος φέρει το δυναμικό ενεργείας ενός ατόμου αναφοράς ή μιας λειτουργικής ομάδας. Η ενέργεια του ατόμου αναφοράς σε κάθε σημείο του πλέγματος καθορίζεται από μια σειρά παραμέτρων καθορισμένες για κάθε τύπο ατόμου και είναι το άθροισμα από όλα τα άτομα του μακρομορίου. Για κάθε είδος ατόμου που υπάρχει στον υποκατάστατη πρέπει να υπολογιστεί ένας χάρτης. Επίσης, απαιτείται και ένας χάρτης ηλεκτροστατικού δυναμικού. Η ύπαρξη των προ υπολογισμένων χαρτών αποτελεί συγκριτικό πλεονέκτημα του λογισμικού και συνεισφέρει στην ταχύτητα των υπολογισμών. Εικόνα Β3. [150] Σχηματική απεικόνιση του χάρτη πλέγματος, όπως ορίζεται από την διαδικασία προσομοίωσης πρόσδεσης μέσω του λογισμικού AutoDock. 56

71 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι Β.3. Προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής Βιομορίων Β.3.1. Γενικά Η Μοριακή Δυναμική ή ΜΔ (Molecular Dynamics MDs) είναι μια μορφή υπολογιστικής προσομοίωσης στην οποία άτομα και μόρια αλληλεπιδρούν για ένα χρονικό διάστημα με την εφαρμογή των νόμων της φυσικής, αποδίδοντας έτσι την κίνηση των σωματιδίων. Έχει εφαρμοστεί στη μελέτη μεγάλου εύρους συστημάτων, από πολύ μικρά όσο μια χημική αντίδραση διατομικών μορίων, έως και πολύ μεγάλα όσο ένας γαλαξίας. [162] Η μέθοδος της ΜΔ αναπτύχθηκε αρχικά από τους Alder και Wainwright τη δεκαετία του 1950 για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων σκληρών σφαιρών. [163,164] Από τις μελέτες τους προέκυψαν σημαντικές πληροφορίες για την συμπεριφορά των απλών υγρών. Το επόμενο μεγάλο βήμα έγινε το 1964, όταν ο Rahman Α. διεξήγαγε την πρώτη προσομοίωση χρησιμοποιώντας εξισώσεις που εκφράζουν με αρκετά ρεαλιστικό τρόπο τις διαμοριακές δυνάμεις στο υγρό Αργό (Ar). [165] Η πρώτη προσομοίωση ΜΔ ενός ρεαλιστικού συστήματος πραγματοποιήθηκε από τους Rahman και Stillinger με την προσομοίωση νερού σε υγρή κατάσταση το [166] Το 1977 έγιναν για πρώτη φορά προσομοιώσεις πρωτεϊνών με την προσομοίωση του αναστολέα της παγκρεατικής θρυψίνης βοοειδών (Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor, BPTI). [167] Σήμερα γίνονται καθημερινώς πολυάριθμες προσομοιώσεις ΜΔ πρωτεϊνών και πρωτεϊνικών συμπλόκων, της διπλής έλικας του DNA, συμπλεγμάτων πρωτεϊνών DNA, και λιπιδικών συστημάτων, που απευθύνονται σε μια ποικιλία προβλημάτων, όπως η δέσμευση υποκαταστατών σε έναν υποδοχέα, η αναδίπλωση των πρωτεϊνών στο χώρο, η διείσδυση μορίων νερού διάμεσου μεμβρανικών πρωτεϊνών κ.ά. Υπάρχουν τρεις τύποι εφαρμογών της μοριακής δυναμικής στη μελέτη των βιολογικών μακρομορίων: [168] Α) Η χρήση της απλώς ως μέσο δειγματοληψίας του χώρου των πιθανών διαμορφώσεων. Αυτό βρίσκει εφαρμογή στον προσδιορισμό και στη βελτιστοποίηση δομών βάσει δεδομένων κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ ή φασματοσκοπίας NMR. B) Η χρήση τους για τον προσδιορισμό δομικών και κινητικών ιδιοτήτων (π.χ. εύρος των ατομικών διακυμάνσεων), καθώς και θερμοδυναμικών μεγεθών σε κατάσταση ισορροπίας. Σε αυτήν την περίπτωση είναι απαραίτητο να ελέγχεται επαρκής αριθμός 57

72 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι διαμορφώσεων και να χρησιμοποιούνται οι κατάλληλοι συντελεστές βαρύτητας Boltzmann σε κάθε βήμα της προσομοίωσης. Γ) Η χρήση τους για τη μελέτη της πραγματικής δυναμικής του συστήματος. Εκτός από τις παραπάνω προϋποθέσεις πρέπει να αντιπροσωπεύεται σωστά η εξέλιξη του συστήματος με το πέρασμα του χρόνου. Στις πρώτες δύο κατηγορίες μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν στοχαστικές μέθοδοι Monte Carlo, σε αντίθεση με την τρίτη κατηγορία, όπου μόνο η αιτιοκρατική Μοριακή Δυναμική μπορεί να δώσει την απαιτούμενη πληροφορία. Β.3.2. Αρχές Στατιστικής Μηχανικής Η βασική ιδέα πίσω από τη Μοριακή Δυναμική είναι ότι η μελέτη των δυναμικών παραμέτρων των στοιχειωδών σωματιδίων από τα οποία αποτελείται ένα σύστημα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον καθορισμό των μακροσκοπικών φυσικών μεγεθών του συστήματος, όπως πίεση, θερμοκρασία κ.λ.π. Η μετατροπή των μικροσκοπικών παραμέτρων σε μακροσκοπικά φυσικά μεγέθη απαιτεί μεθόδους στατιστικής μηχανικής. Υπό αυτήν τη λογική, κάθε σύστημα καθορίζεται από δύο σημαντικές έννοιες: 1) τη θερμοδυναμική κατάσταση, που αποτελείται από τα μακροσκοπικά μεγέθη πίεση, θερμοκρασία, αριθμός σωματιδίων, ενέργεια κ.ά. 2) τη μικροσκοπική κατάσταση, που χαρακτηρίζεται από την ατομική θέση και την ορμή των σωματιδίων. Μια στατιστική κατανομή (ensemble) είναι το σύνολο όλων των πιθανών μικροσκοπικών καταστάσεων του συστήματος που εμφανίζουν την ίδια θερμοδυναμική κατάσταση. Η ΜΔ μεταβάλει τις μικροσκοπικές παραμέτρους σε συνάρτηση με το χρόνο, ακολουθώντας μία σταθερή κατανομή. Οι σημαντικότερες κατανομές είναι: Α) Μικρο κανονική (microcanonical NVE). Ο αριθμός σωματιδίων (Ν), ο όγκος (V) και η ενέργεια (Ε) είναι σταθερά. Περιγράφει ένα απομονωμένο σύστημα. Β) Κανονική (canonical NVT). Ο αριθμός σωματιδίων (Ν), ο όγκος (V) και η θερμοκρασία (Τ) είναι σταθερά. Το σύστημα είναι συνδεδεμένο με ένα «θερμοστάτη» για τη διατήρηση της θερμοκρασίας. Γ) Ισόθερμη Ισοβαρής (isothermal isobaric NPT). Ο αριθμός σωματιδίων (Ν), η πίεση (P) και η θερμοκρασία (Τ) είναι σταθερά. Εκτός από «θερμοστάτη», το σύστημα 58

73 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι συνδέεται και με «βαροστάτη». Είναι η κατανομή που προσομοιάζει καλύτερα τις κανονικές πειραματικές συνθήκες. Σύμφωνα με την στατιστική μηχανική, για να προσδιοριστούν τα μακροσκοπικά μεγέθη μιας κατανομής πρέπει να υπολογιστούν όλες οι πιθανές μικροσκοπικές καταστάσεις της κατανομής. Επειδή αυτό είναι πρακτικά αδύνατο, στη Μοριακή Δυναμική θεωρείται ότι εφόσον η χρονική διάρκεια της προσομοίωσης είναι μεγάλη, τα μακροσκοπικά μεγέθη του συστήματος μπορούν να υπολογιστούν από το χρονικό μέσο όρο τους κατά τη διάρκεια της προσομοίωσης. Με άλλα λόγια, θεωρείται ότι κατά τη διάρκεια της προσομοίωσης το σύστημα διέρχεται από όλες τις πιθανές μικροσκοπικές καταστάσεις. Β.3.3. Κλασσική Μηχανική Για τη μελέτη της δυναμικής συμπεριφοράς βιολογικών μακρομορίων, ένα απλό μοντέλο μοριακής μηχανικής είναι επαρκές, σε αντίθεση με άλλα συστήματα όπως χημικές αντιδράσεις κατά τις οποίες διασπώνται και δημιουργούνται χημικοί δεσμοί, όπου είναι απαραίτητη η χρήση στην κβαντομηχανικών υπολογισμών. Η Μοριακή Δυναμική ανάλυση βασίζεται στην επίλυση του δεύτερου νόμου του Νεύτωνα με σκοπό την παρακολούθηση της κίνησης κάθε ατόμου σε ένα σύστημα. [169,170] Στην περίπτωση μεταφορικής κίνησης ενός συμμετρικά σφαιρικού μορίου, ο νόμος παίρνει την απλή μορφή F = m*a, όπου F είναι η συνισταμένη των δυνάμεων που ασκούνται στο μόριο, m είναι η μάζα του μορίου και a είναι η επιτάχυνσή του. Αυτή η εξίσωση μπορεί να γραφτεί ως εξής: 2 2 d r dv d r F = m = m 2 2 dt dr dt όπου r είναι η μετατόπιση του μορίου, t είναι ο χρόνος και V είναι η δυναμική ενέργεια του συστήματος εκφρασμένη ως κλίση της συνάρτησης της δύναμης F. Με ολοκλήρωση της παραπάνω εξίσωσης προκύπτει η χρονική εξέλιξη της θέσης των ατόμων, που ονομάζεται τροχιά (trajectory). Αυτή περιγράφει τη μετατόπιση, την ταχύτητα και την επιτάχυνση κάθε ατόμου του συστήματος στη συνάρτηση του χρόνου. Η γνώση της τροχιάς επιτρέπει τον υπολογισμό μακροσκοπικών φυσικών ιδιοτήτων. Η 59

74 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι μέθοδος αυτή είναι αιτιοκρατική (deterministic): Αν είναι γνωστές η μετατόπιση και η ταχύτητα όλων των ατόμων σε μια χρονική στιγμή, η κατάσταση του συστήματος μπορεί να προβλεφθεί για οποιαδήποτε άλλη στιγμή. Εντούτοις, η ολοκλήρωση των εξισώσεων της κίνησης είναι αδύνατο να γίνει με τις γνωστές μεθόδους ολοκλήρωσης, και πρέπει να γίνει αριθμητικά. Από τους διάφορους αλγορίθμους που έχουν αναπτυχτεί για αυτό το σκοπό, ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος είναι ο αλγόριθμος του Verlet και οι παραλλαγές του. [171] Η σταθερότητα που παρουσιάζει αυτός ο αλγόριθμος τον καθιστά κατάλληλο για χρονικά μεγάλες προσομοιώσεις. Άλλα πλεονεκτήματά του είναι η απλότητα υλοποίησής του και οι μειωμένες απαιτήσεις του σε αποθηκευτικό χώρο. Στον αλγόριθμο Verlet η ολοκλήρωση γίνεται σε βήματα χρόνου δt. Το μέγεθος του βήματος πρέπει να είναι αρκετά μικρό για να είναι η προσομοίωση ακριβής (συνήθως είναι 1 fs = s). Από την άλλη όσο πιο μικρό είναι το βήμα, τόσο αυξάνεται ο υπολογιστικός χρόνος. Μια συνήθης πρακτική στη ΜΔ είναι η θεώρηση ότι οι ενδομοριακοί δεσμοί (ή ένα υποσύνολό τους, όπως οι δεσμοί υδρογόνου) δεν ταλαντεύονται αλλά έχουν σταθερό μήκος. Αυτό γίνεται με την εφαρμογή περιορισμών στο μήκος του δεσμού και στη γωνία των δεσμών. Σε κάθε βήμα αρχικά λαμβάνεται μια μετατόπιση των ατόμων χωρίς περιορισμούς και στη συνέχεια προστίθεται σε αυτή ένα διάνυσμα μετατόπισης ώστε να ικανοποιούνται οι συνθήκες των περιορισμών. Για το σκοπό αυτό έχουν αναπτυχθεί διάφοροι αλγόριθμοι, όπως ο SHAKE. [172] Η εφαρμογή τέτοιων αλγορίθμων επιτρέπει την αύξηση του χρονικού διαστήματος δt και μειώνει δραματικά τον απαιτούμενο υπολογιστικό χρόνο. Οι αρχικές ταχύτητες των ατόμων αποδίδονται με τυχαίο τρόπο με βάση την κατανομή Maxwell Boltzmann ανάλογα με την επιθυμητή θερμοκρασία. Η κατανομή αυτή δίνει την πιθανότητα ενός ατόμου να έχει μια συγκεκριμένη ταχύτητα και κατεύθυνση σε μια δεδομένη τιμή της θερμοκρασίας. Η θερμοκρασία του συστήματος μετράται από τη μέση κινητική ενέργεια των ατόμων. Για να επιτευχθεί η προσομοίωση του συστήματος σε μια σταθερή επιθυμητή τιμή θερμοκρασίας οι ταχύτητες των ατόμων επαναπροσδιορίζονται σε κάθε βήμα μέσω του αλγόριθμου του Berendsen. [173] Ο αλγόριθμος χαρακτηρίζεται από μια σταθερά χρόνου χαλάρωσης της σύζευξης συστήματος θερμοκρασίας που κυμαίνεται μεταξύ 0,1 και 5,0 ps. Όσο μικρότερη είναι η τιμή της, τόσο πιο εφικτή είναι η προσέγγιση της επιθυμητής θερμοκρασίας, το οποίο όμως δεν επιτρέπει τον υπολογισμό ιδιαίτερα «φυσικών» διαμορφώσεων. Αντίθετα, 60

75 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι χρησιμοποιώντας μεγαλύτερες τιμές της σταθεράς οι διακυμάνσεις της θερμοκρασίας αυξάνονται αναλόγως αλλά λαμβάνονται πιο ακριβή δεδομένα ως προς τη δυναμική του συστήματος. Β.3.4. Πεδίο δυνάμεων Στους υπολογισμούς μοριακής μηχανικής η δυναμική ενέργεια του συστήματος περιγράφεται από μια απλή συνάρτηση και ένα σύνολο παραμέτρων, τα οποία μαζί καλούνται πεδίο δυνάμεων (force field). Τα πεδία δυνάμεων έχουν κατασκευαστεί βασιζόμενα σε ένα συνδυασμό πειραματικής δουλειάς και υψηλού επιπέδου υπολογισμών κβαντικής μηχανικής. Η ορθότητα των πληροφοριών που παράγουν ελέγχεται μέσω σύγκρισης με πειραματικά δεδομένα, όπως κρυσταλλογραφικές δομές ακτίνων Χ, δομές φασματοσκοπίας NMR, θερμοδυναμικά δεδομένα κ.ά. Τα πιο διαδεδομένα πεδία δυνάμεων είναι τα AMBER, [174] CHARMM, [175] GROMOS [176] και OPLS. [177] Παρακάτω θα περιγραφεί το πεδίο δυνάμεων AMBER, το οποίο αναπτύχθηκε από τις ομάδες των Kollmann και Case. Σε ένα πεδίο δυνάμεων η ενέργεια Ε είναι συνάρτηση των καρτεσιανών συντεταγμένων που καθορίζουν τις θέσεις όλων των ατόμων του συστήματος. Η ενέργεια υπολογίζεται από το άθροισμα των δεσμικών ενεργειών, που περιγράφουν τα μήκη δεσμών (r), τις γωνίες των δεσμών (θ) και τις δίεδρες γωνίες (φ), και των μηδεσμικών ενεργειών, που περιγράφουν ηλεκτροστατικές και van der Waals αλληλεπιδράσεις (Εικόνα Β4). Στην περίπτωση του AMBER η ενέργεια δίνεται από την γενική εξίσωση: [174] E + ολική = διέδρων r δεσμών V n 2 K ( r r ) 0 + K θ γωνιών [ 1 + συν ( nφ φ0 )] + 2 ( θ θ ) A < ij Bij qiq j j Rij Ri R ε j ij Οι τρεις πρώτοι όροι της εξίσωσης αντιπροσωπεύουν τις δεσμικές αλληλεπιδράσεις ενώ ο τελευταίος όρος της αντιπροσωπεύει τη συνεισφορά των μη δεσμικών αλληλεπιδράσεων και υπολογίζεται για κάθε διαμοριακό ζεύγος ατόμων και για κάθε απομακρυσμένο ενδομοριακό ζεύγος ατόμων (πέραν των 3 4 δεσμών). Στη συνέχεια i

76 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι αναλύεται ξεχωριστά κάθε όρος της εξίσωσης και παρουσιάζεται η μεθοδολογία παραμετροποίησης του. Εικόνα Β4. Σχηματική αναπαράσταση των παραμέτρων που λαμβάνονται υπ όψιν στη συνάρτηση δυναμικής ενέργειας ενός πεδίου δυνάμεων. Το εικονιζόμενο μόριο είναι ένα διπεπτίδιο αλανίνης. Στην εξίσωση οι δεσμοί και οι γωνίες τους έχουν μια απλή αρμονική αναπαράσταση (Εικόνα Β5). Οι αρμονικοί όροι της ενέργειας δεσμών και γωνιών αντανακλούν την ενεργειακή τάση του μορίου που προκαλείται από τη μετατόπιση από τα ιδανικά μήκη δεσμών (r - r o ) και τις γωνίες ισορροπίας (θ - θ ο ). Τα ιδανικά μήκη δεσμών και οι γωνίες ισορροπίας εξάγονται ως επί το πλείστον από κρυσταλλογραφικά δεδομένα υψηλής διακριτικότητας, αλλά και από δεδομένα φασματοσκοπίας μικροκυμάτων. Οι σταθερές δύναμης (force constants) Κ r, και Κ θ καθορίζουν την ευελιξία των δεσμευμένων ατόμων, σε αντιστοιχία με τη σταθερά ελατηρίου. Οι τιμές τους προσαρμόζονται σε δονητικά δεδομένα είτε φασματοσκοπίας υπερύθρου, είτε ab initio υπολογισμών, έτσι ώστε να αποδίδουν τις δονητικές καταστάσεις (normal modes) απλών, αλλά χαρακτηριστικών μορίων. Για την περιγραφή των δίεδρων γωνιών χρησιμοποιείται μια συνημιτονοειδής συνάρτηση (Εικόνα Β5). Ο περιοδικός όρος της ενέργειας δίεδρων γωνιών έχει συνημιτονοειδή εξάρτηση από τη γωνία των δύο επιπέδων φ που σχηματίζουν τέσσερα 62

77 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι διαδοχικά συνδεδεμένα άτομα I J K L. Το ενεργειακό φράγμα για την περιστροφή γύρω από τον κεντρικό δεσμό J K δίνεται από την τιμή V n, ενώ η αρχική φάση φ ο είναι 0 ο ή 180 ο ανάλογα με το αν παρουσιάζεται ενεργειακό μέγιστο ή ελάχιστο αντίστοιχα, για φ = 0 ο. Η περιοδικότητα n εκφράζει τον αριθμό των ενεργειακών μεγίστων ή ελαχίστων που παρουσιάζονται ανά ένα κύκλο ( 180 < φ 180 ο ). Η ενέργεια των δίεδρων γωνιών μπορεί να αποτελείται από παραπάνω από έναν όρο Fourier (δηλαδή πάνω από μία τιμή του V n ) για πιο ακριβή αναπαράσταση των πιθανών διαμορφώσεων. Επίσης με την ίδια συνάρτηση ορίζεται και ο όρος των μη επιτρεπτών δίεδρων γωνιών (improper torsions) που αναφέρεται σε μία τετράδα διακλαδισμένων ατόμων (I )(L )K J. Στον όρο αυτό η αρχική φάση είναι πάντα φ ο = 180 ο και χρησιμοποιείται κυρίως ώστε να επιβάλει την επιπεδότητα των τεσσάρων ατόμων (π.χ. σε αμιδικούς δεσμούς και αρωματικούς δακτυλίους). Βελτιστοποίηση του όρου των δίεδρων γωνιών επιτυγχάνεται προσομοιώνοντας τις ενεργειακές διαφορές διαμόρφωσης και τις δονητικές συχνότητες μερικών χαρακτηριστικών μοντέλων μορίων. Στην περίπτωση που δεν είναι διαθέσιμα πειραματικά δεδομένα, επιστρατεύονται υψηλού επιπέδου υπολογισμοί κβαντικής μηχανικής. Για το πεδίο AMBER επιλέχθηκε ένας μικρός αριθμός μοντέλων για την προσαρμογή γενικευμένων παραμέτρων της ενέργειας δίεδρων γωνιών (υδρογονάνθρακες, αλκοόλες, κετόνες, αιθέρες, αμίνες, φωσφίνες, σάκχαρα και βάσεις νουκλεοτιδίων), με το πλεονέκτημα της απεξαρτητοποίησης των παραμέτρων από συγκεκριμένα σύνολα μορίων που είχαν χρησιμοποιηθεί σε άλλα πεδία. ϵ Εικόνα Β5. [178] Αναπαράσταση των όρων της δυναμικής ενέργειας ενός τυπικού πεδίου όπως είναι το AMBER. Αριστερά οι αρμονικοί όροι της ενέργειας δεσμών και γωνιών για δύο τιμές της σταθεράς Κ, στο κέντρο ο όρος δίεδρης γωνίας με περιοδικότητα n=2 και αρχική φάση φ ο =180 ο και δεξιά το δυναμικό Lennard Jones (6 12) με τις παραμέτρους R* και ϵ. Οι μη δεσμικές αλληλεπιδράσεις αποτελούνται από τον ενεργειακό όρο van der Waals και το ηλεκτροστατικό δυναμικό Coulomb (Εικόνα Β5). Οι μη δεσμικοί όροι της 63

78 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι ενέργειας van der Waals προκύπτουν από τη συνάρτηση Lennard Jones (6 12), όπου οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν τους αρνητικούς εκθέτες της απόστασης R ij μεταξύ δύο ατόμων. Ο θετικός όρος (1/R 12 ij ) της ενέργειας van der Waals αναπαριστά τις απωστικές δυνάμεις λόγω στερικής παρεμπόδισης που εμφανίζονται καθώς δύο άτομα πλησιάζουν κοντά, ενώ ο αρνητικός ελκτικός όρος (-1/R 6 ij ) αντιπροσωπεύει τις δυνάμεις διασποράς London. Οι συντελεστές A και B συνδέονται με το ενεργειακό ελάχιστο του δυναμικού ϵ στην απόσταση ισορροπίας R* δύο όμοιων ατόμων ενώ για κάθε ζεύγος ατόμων οι κανόνες συνδυασμού των R* και ϵ βασίζονται στον αριθμητικό και γεωμετρικό τους μέσο αντίστοιχα. Η παραμετροποίηση του όρου van der Waals είναι από τις δυσκολότερες διαδικασίες και συνήθως γίνεται εμπειρικά, προσαρμόζοντας τις τιμές των R* και ϵ έτσι ώστε να λαμβάνονται οι ενέργειες πλέγματος και οι δομές βάση κρυσταλλογραφικών δεδομένων. Οι περισσότερες τιμές των παραμέτρων αυτών στο πεδίο AMBER δανείστηκαν από το πεδίο OPLS που αναπτύχθηκε με σκοπό την κατάλληλη απόδοση των μοριακών ιδιοτήτων σε υγρή φάση. [179] Με αυτό το σκοπό, η βελτιστοποίηση πραγματοποιήθηκε με προσομοιώσεις Monte Carlo σε περισσότερους από 30 οργανικούς διαλύτες, έτσι ώστε να επιτευχθεί η αναπαραγωγή της πυκνότητας και των πειραματικών τιμών ενθαλπίας εξάτμισης. [180] Ο ηλεκτροστατικός όρος Coulomb εξαρτάται από τα μονοπολικά φορτία των ατόμων και το συντελεστή ε της διηλεκτρικής σταθεράς που χρησιμοποιείται. Στις προσομοιώσεις σε κενό χρησιμοποιείται διηλεκτρική σταθερά ανάλογη της απόστασης (ε = R ij ), ενώ παρουσία διαλύτη διατηρείται σταθερή (ε = 1). Η μεταβλητή διηλεκτρική σταθερά προσομοιώνει τη δραστική εξασθένιση των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων που επιφέρει η παρουσία ενός πολικού διαλύτη. Προφανώς, η ηλεκτροστατική ενέργεια ενός συστήματος υπολογίζεται με μεγαλύτερη ακρίβεια παρουσία των μορίων του διαλύτη, γεγονός το οποίο αυξάνει δραματικά το μέγεθος του συστήματος και τον υπολογιστικό χρόνο. Σε πολλά πεδία δυνάμεων η απόδοση των ατομικών φορτίων γίνεται εμπειρικά, έτσι ώστε να αναπαράγονται διάφορες πειραματικές ιδιότητες με μοριακά μοντέλα. Σε αυτή την προσέγγιση το ολικό φορτίο χαρακτηριστικών ομάδων είναι μηδέν, με σκοπό τα ατομικά τους φορτία να μπορούν να μεταφερθούν σε οποιοδήποτε μόριο. Στο πεδίο AMBER τα ατομικά φορτία των φυσικών αμινοξέων και νουκλεοτιδίων εξήχθησαν με προσαρμογή τους στο ηλεκτροστατικό δυναμικό (ESP) που 64

79 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι υπολογίζεται σε κβαντομηχανικό επίπεδο. Στις πιο πρόσφατες εκδόσεις του πεδίου AMBER χρησιμοποιήθηκε μια μεγάλη βάση συναρτήσεων, η οποία έχει βρεθεί ότι υπερεκτιμά τη διπολική ροπή σε ποσοστό 10 20%, [181] γεγονός που το καθιστά συμβατό με τα περισσότερα μοντέλα νερού (SPC/E, TIP3P, TIP4P). [182] Με αυτό τον τρόπο, προσδίδεται στα μόρια μέσω των ατομικών τους φορτίων μια εν δυνάμει πολικότητα, η οποία είναι επιθυμητή για προσομοιώσεις στην υγρή φάση. Επιπροσθέτως, αναπτύχθηκε μια μέθοδος προσαρμογής των ατομικών φορτίων στο ηλεκτροστατικό δυναμικό υπό περιορισμούς (Restrained ESP). Σε αυτήν επιβάλλονται επιπλέον περιορισμοί με υπερβολικές συναρτήσεις στα μη υδρογονικά άτομα, με σκοπό να μειωθεί το φορτίο τους εφόσον δεν επηρεάζεται η συνολική προσαρμογή. [183] Με αυτό τον τρόπο, αποδείχτηκε ότι είναι δυνατή η απόδοση των ενεργειακών μεταβολών διαμόρφωσης σε μια πληθώρα μικρών μορίων, όπως επίσης ότι αντιπροσωπεύονται με μεγάλη ακρίβεια οι ιδιότητες των οργανικών διαλυτών. Τέλος, πρέπει να σημειωθεί ότι στο πεδίο AMBER οι μη δεσμικοί ενεργειακοί όροι δεν υπολογίζονται για τα ζεύγη γειτονικών ατόμων μέχρι 3 δεσμούς, ενώ η ενέργεια των ζευγών 1 4 ελαττώνεται επί 0,50 για τις van der Waals και επί 0,83 για τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις. Στην συνάρτηση της δυναμικής ενέργειας ο πιο υπολογιστικά απαιτητικός όρος είναι οι μη δεσμικές αλληλεπιδράσεις. Θεωρητικά θα έπρεπε να υπολογιστούν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ κάθε πιθανού ζεύγους ατόμων μέσα στο σύστημα. Στην περίπτωση αυτή ο αριθμός των υπολογισμών αυξάνεται ανάλογα με το τετράγωνο του αριθμού των ατόμων (Ν 2 ). Για να μειωθεί το υπολογιστικό κόστος, μία προσέγγιση είναι η χρήση μιας οριακής απόστασης (cutoff) μεταξύ των ατόμων, πέρα από την οποία δε λαμβάνονται υπ όψιν οι αλληλεπιδράσεις. Το μειονέκτημα είναι ότι σε ορισμένες βιολογικές διαδικασίες οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεγάλου εύρους (longrange) έχουν αποδειχτεί πολύ σημαντικές. [184,185] Για τον λόγο αυτό έχουν αναπτυχτεί διάφορες μέθοδοι για την εισαγωγή των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεγάλου εύρους στις προσομοιώσεις ΜΔ. Μία από αυτές είναι η particle mesh Ewald (PME). [186,187] Σε αυτήν οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις διακρίνονται σε μικρού και μεγάλου εύρους. Οι μικρού εύρους υπολογίζονται κανονικά ενώ οι μεγάλου εύρους (απόσταση μεγαλύτερη ενός ορίου) μετατρέπονται σε συναρτήσεις συχνότητας μέσω μετασχηματισμού Fourier. Η εφαρμογή ταχέως μετασχηματισμού Fourier (fast Fourier transform) μειώνει σημαντικά τον υπολογιστικό χρόνο. Η μέθοδος PME απαιτεί την 65

80 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι ύπαρξη απείρως περιοδικού συστήματος, δηλαδή το σύστημα αναφοράς να περιβάλλεται από άπειρα είδωλα πανομοιότυπα με αυτό. Η τεχνική αυτή θα περιγραφεί παρακάτω. Β.3.5. Προσομοίωση παρουσία διαλύτη Στα βιολογικά συστήματα ο διαλύτης, που συνήθως είναι νερό, έχει πολύ μεγάλη επίδραση στη δομή και δυναμική ενός βιολογικού μακρομορίου. Επομένως είναι σημαντική η αναπαραγωγή των ιδιοτήτων του στις προσομοιώσεις ΜΔ. Έχουν αναπτυχθεί πολλά διαφορετικά μοντέλα που μας επιτρέπουν να αναπαράγουμε αρκετές από τις φυσικές ιδιότητες του νερού όπως πυκνότητα, διηλεκτρική σταθερά, συμπίεση, συντελεστής διάχυσης, θερμοκρασία κ.ά. Τα μοντέλα αυτά έχουν χρησιμοποιηθεί και για τη μελέτη πιο περίπλοκων διαδικασιών, όπως η υδροφοβική ενυδάτωση ή η επιρροή του νερού στη διαμόρφωση των βιομορίων στο διάλυμα. Υπάρχουν δύο γενικές προσεγγίσεις: η «υπονοούμενη» (implicit) και η «ρητή» (explicit) αναπαράσταση των ιδιοτήτων του νερού. Κατά την πρώτη προσέγγιση το νερό δεν αναπαρίσταται με τη μορφή μορίων αλλά ως ένα συνεχές μέσο το οποίο έχει ορισμένες ιδιότητες. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της ενέργειας των αλληλεπιδράσεων διαλύτηδιαλυμένων ουσιών. Τα μοντέλα που ακολουθούν αυτήν την προσέγγιση είτε βασίζονται στο εμβαδόν προσβάσιμης επιφάνειας (accessible surface area ASA) είτε είναι μοντέλα συνεχούς ηλεκτροστατικού δυναμικού. Ένα παράδειγμα του τελευταίου τύπου είναι το γενικευμένο μοντέλο Born (generalized Born GB), [188] το οποίο βασίζεται στη δραστική ακτίνα Born (effective Born radius), που είναι η απόσταση ενός ατόμου από την επιφάνεια του μορίου. Τα μοντέλα αυτής της προσέγγισης έχουν το πλεονέκτημα των μειωμένων υπολογιστικών απαιτήσεων, αλλά δεν μπορούν να αναπαραστήσουν κάποια φαινόμενα όπως το ιξώδες του νερού και την υδροφοβικότητα του μακρομορίου και παρουσιάζουν προβλήματα στην περίπτωση των ιονισμένων ομάδων των αμινοξέων. Κατά τη δεύτερη προσέγγιση το νερό αναπαρίσταται με την εισαγωγή διακριτών μορίων που εισάγονται στο σύστημα προσομοίωσης. Με άλλα λόγια το μακρομόριο τοποθετείται σε ένα δοχείο συγκεκριμένου γεωμετρικού σχήματος που περιέχει μεγάλο 66

81 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι αριθμό μορίων νερού. Τα μόρια νερού υπόκεινται στην συνάρτηση δυναμικής ενέργειας του πεδίου δυνάμεων όπως και τα υπόλοιπα άτομα. Τα μοντέλα που έχουν αναπτυχθεί διαφέρουν ως προς τον αριθμό των ατόμων που χρησιμοποιούν για την αναπαράσταση ενός μορίου νερού, την ευκαμψία ή μη των μορίων και την δυνατότητα πόλωσης των μορίων. Παραδείγματα τέτοιων μοντέλων είναι τα SPC/E, TIP3P, TIP4P και TIP5P. [182] Η προσέγγιση αυτή προσεγγίζει σε μεγάλο βαθμό το φυσιολογικό υδατικό περιβάλλον, γεγονός απαραίτητο για τη μελέτη κάποιων διαδικασιών. Επίσης δίνει τη δυνατότητα της οπτικής απεικόνισης των δεσμών υδρογόνου που δημιουργούνται μεταξύ μακρομορίου νερού. Το μειονέκτημα είναι το αυξημένο υπολογιστικό κόστος λόγω της προσθήκης δεκαπλάσιων επιπρόσθετων ατόμων στο σύστημα προσομοίωσης. Εικόνα Β6. [189] Δημιουργία πλέγματος με οριακές συνθήκες. (Α) Το μόριο ανακλάται και επιστρέφει στο δοχείο αναφοράς (reflective boundary conditions). (Β) Το μόριο κινείται περιοδικά και επιστρέφει στο δοχείο αναφοράς από κάποιο άλλο σημείο (periodic boundary conditions). Ένα πρόβλημα που δημιουργείται κατά τη χρήση διακριτών μορίων νερού στην προσομοίωση είναι η κίνηση ενός μορίου κοντά στις επιφάνειες του νοητού δοχείου που περιέχει το σύστημα. Μία μέθοδος είναι να θεωρηθεί απλώς ότι το μόριο ανακλάται προς την αντίθετη κατεύθυνση κατά την πρόσκρουσή του με την επιφάνεια (Εικόνα Β6.Α). Ωστόσο επειδή οι διαστάσεις του δοχείου προσομοίωσης είναι πεπερασμένες η προσέγγιση αυτή είναι προβληματική, καθώς τα μόρια που βρίσκονται κοντά στις πλευρές του κουτιού συμπεριφέρονται διαφορετικά από τα μόρια του κυρίως όγκου. Η 67

82 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι λύση στο πρόβλημα αυτό είναι εφαρμογή περιοδικών οριακών συνθηκών (periodic boundary conditions PBC), δηλαδή το δοχείο αναφοράς να περιστοιχίζεται από όμοια δοχεία είδωλα με πανομοιότυπο περιεχόμενο που επαναλαμβάνονται άπειρες φορές προς όλες τις διευθύνσεις. [190] Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τα μόρια που βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια να αλληλεπιδρούν με τα γειτονικά μόρια που ανήκουν στα διπλανά δοχεία. Επίσης, όταν το μόριο κατά την κίνηση του μετατοπίζεται εκτός δοχείου, τότε το «είδωλό» του εισέρχεται από την αντίθετη πλευρά του δοχείου αναφοράς (Εικόνα Β6.Β). Έτσι, σε όλη τη διάρκεια της προσομοίωσης ο συνολικός αριθμός των μορίων παραμένει σταθερός. Αλληλεπίδραση λαμβάνει χώρα τόσο μεταξύ των μορίων του δοχείου όσο και μεταξύ των μορίων κάθε γειτονικού εικονικού δοχείου. Η ένταση κάθε αλληλεπίδρασης θεωρείται ότι φθίνει αυξανομένης της διαμοριακής απόστασης και μηδενίζεται σε απόσταση τέτοια ώστε ένα μόριο στο δοχείο αναφοράς να μην αλληλεπιδρά με τα είδωλά του. Το υπό μελέτη σύστημα δεν είναι ανάγκη να είναι κυβικό, αλλά μπορεί να έχει οποιοδήποτε γεωμετρικό σχήμα (π.χ. οκταεδρικό). [190] Β.3.6. Προετοιμασία και εκτέλεση προσομοιώσεων Μοριακής Δυναμικής Τα βασικά βήματα που πρέπει να ακολουθηθούν για την πραγματοποίηση μιας προσομοίωσης ΜΔ είναι τα εξής: 1) Επιλογή αρχικής διαμόρφωσης. Το αρχικό βήμα είναι ο καθορισμός του σημείου εκκίνησης της προσομοίωσης, δηλαδή την αρχική διαμόρφωση του συστήματος. Στην περίπτωση των βιολογικών μακρομορίων η αρχική δομή είναι μια τρισδιάστατη δομή που έχει επιλυθεί με ακτινογραφία ακτίνων Χ ή φασματοσκοπία NMR και έχει κατατεθεί στην βάση δεδομένων PDB, ή μπορεί να είναι ένα θεωρητικό μοντέλο υπολογισμένο με συγκριτική προσομοίωση. Η αρχική δομή επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την πορεία της προσομοίωσης. Για το λόγο αυτό η επιλογή πρέπει να γίνει προσεκτικά και η επιλεγμένη δομή να έχει παρόμοια χαρακτηριστικά με την κατάσταση του βιομορίου που θέλουμε να προσομοιώσουμε. Επίσης πριν ξεκινήσει η προσομοίωση συνιστάται να πραγματοποιηθεί ελαχιστοποίηση ενέργειας της επιλεγμένης αρχικής δομής, για την απομάκρυνση αλληλεπιδράσεων που τυχόν υπάρχουν στην παγιωμένη δομή του βιομορίου, οι οποίες μπορούν να προκαλέσουν διαστρέβλωση της δομής. 68

83 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι 2) Εισαγωγή διαλύτη. Σε αυτό το βήμα διακριτά μόρια νερού εισάγονται στο σύστημα προσομοίωσης. Αν στην κρυσταλλογραφική δομή υπάρχουν μόρια νερού, συνήθως απομακρύνονται πριν από αυτό το βήμα. Το βιομόριο «βυθίζεται» σε ένα δοχείο γεωμετρικού σχήματος που περιέχει μεγάλο αριθμό μορίων νερού. Στη συνέχεια πρέπει να γίνει μια ελαχιστοποίηση ενέργειας θέτοντας περιορισμούς στα άτομα του βιομορίου ώστε να παραμείνουν σταθερά. Αυτό επιτρέπει στα μόρια νερού να βελτιστοποιήσουν τη θέση τους σε σχέση με το διαλυμένο βιομόριο. 3) Θέρμανση του συστήματος. Αποδίδονται οι αρχικές ταχύτητες στα άτομα με βάση την κατανομή Maxwell Boltzmann για μια χαμηλή θερμοκρασία και ξεκινάει η προσομοίωση. Η θερμοκρασία αυξάνεται σταδιακά ανά κύκλους στους οποίους αποδίδονται νέες αρχικές ταχύτητες στα άτομα. Αυτό γίνεται μέχρι να επιτευχθεί η επιθυμητή θερμοκρασία. 4) Εξισορρόπηση του συστήματος. Η προσομοίωση συνεχίζεται και παρακολουθούνται οι ιδιότητες του συστήματος, όπως θερμοκρασία, πίεση, ενέργεια. Αυτό γίνεται μέχρι οι τιμές τους να σταθεροποιηθούν ως προς το χρόνο. Αν η θερμοκρασία μεταβληθεί σημαντικά, οι ταχύτητες μπορούν να ρυθμιστούν ανάλογα ώστε αυτή να επιστρέψει στην επιθυμητή τιμή. 5) Παραγωγική φάση. Στη φάση αυτή πραγματοποιούνται οι κυρίως προσομοιώσεις του συστήματος για τον επιθυμητό χρόνο. Τα θερμοδυναμικά μεγέθη υπολογίζονται ώστε να υπακούουν σε κάποια κατανομή. Συνήθως επιλέγεται η ισόθερμη ισοβαρής κατανομή καθώς προσομοιάζει καλύτερα τις πειραματικές συνθήκες. Μετά το τέλος της προσομοίωσης πραγματοποιείται ανάλυση των αποτελεσμάτων. Κατά τη διάρκεια της προσομοίωσης οι ατομικές θέσεις και ταχύτητες καταγράφονται και μπορούν στο τέλος να παρουσιαστούν γραφικά ως συνάρτηση του χρόνου. Διάφορα μεγέθη μπορούν να υπολογιστούν όπως: Μέση ενέργεια του συστήματος. Μεταβολή της μέσης απόκλισης της θέσης των ατόμων από την αρχική τους θέση (root mean square deviation RMSD) ως προς το χρόνο. Διακύμανση της θέσης των ατόμων από τη μέση τιμή τους (root mean square fluctuation RMSF) ανά αμινοξύ. Κρυσταλλογραφικοί παράγοντες Β (B factors), που προκύπτουν από τις τιμές RMSF και αποτελούν μέτρο της ευκινησίας του μορίου. 69

84 Β. Υπολογιστικές Μέθοδοι Ακτίνα περιστροφής (radius of gyration R g ) που είναι η μεταβολή της μέσης απόστασης των ατόμων από το κέντρο βάρους του μορίου. Μεταβολές στο εμβαδόν προσβάσιμης επιφάνειας (accessible surface area ASA), που είναι το εμβαδόν της επιφάνειας του μορίου που είναι προσιτό στο διαλύτη. Οι τροχιές της ΜΔ μπορούν επίσης να αναπαρασταθούν με διάφορα προγράμματα οπτικοποίησης, τα οποία απεικονίζουν τη μεταβολή των θέσεων των ατόμων σε συνάρτηση με το χρόνο προσομοίωσης. Τα άτομα μπορούν να απεικονιστούν με διάφορους τρόπους αναπαράστασης (απλής γραμμής, σφαίρας ράβδου, κορδέλας, επιφάνειας κ.ά.), ο καθένας από τους οποίους είναι κατάλληλος για τη μελέτη διαφορετικών χαρακτηριστικών (π.χ. κίνηση των στοιχείων δευτεροταγούς δομής, αλληλεπιδράσεις μεταξύ ατόμων, εμβαδόν επιφάνειας και όγκος ελεύθερων κοιλοτήτων κ.ά.). Το γεγονός αυτό τα καθιστά κατάλληλα και για τη δημιουργία εικόνων των μακρομορίων. Τα προγράμματα αυτά επιτρέπουν επίσης τη μέτρηση του μήκους των δεσμών και του μεγέθους των γωνιών, καθώς και τη μεταβολή τους στο χρόνο. 70

85 Ενότητα Γ Σκοπός Εργασίας

86

87 Γ. Σκοπός Εργασίας Γ. Σκοπός Εργασίας Η γνώσεις μας πάνω στην τριτοταγή δομή του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης έχουν αυξηθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια. Αυτό έγινε εφικτό χάρη στην κρυστάλλωση διαφόρων δομών της ομόλογης πρωτεΐνης δέσμευσης της ACh (AChBP) από μαλάκια σε σύμπλοκα με αγωνιστές και ανταγωνιστές του nachr, [82 89] στην επίλυση της δομής του Torpedo marmorata nachr με μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας [90] και στην κρυστάλλωση του συμπλόκου της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του nachr ποντικού με την τοξίνη α μπουγκαροτοξίνη (α Btx). [58] Ειδικά η τελευταία δομή έδωσε πολύ σημαντικές πληροφορίες για τα αμινοξικά κατάλοιπα που συμμετέχουν στην πρόσδεση της α Btx, τη διαμόρφωση του επιτόπου MIR, καθώς και την ύπαρξη μιας υδρόφιλης κοιλότητας μέσα στον υδρόφοβο πυρήνα της ΕΚΠ, με πιθανό σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του υποδοχέα ως ιοντικού καναλιού. Μια άλλη σπουδαία αποκάλυψη που προήλθε από τη δομή αυτή είναι η συμμετοχή μιας υδατανθρακικής αλυσίδας, συνδεδεμένης με το συντηρημένο κατάλοιπο Asn141 της Cys θηλιάς, στην πρόσδεση της τοξίνης. Η τρισδιάστατη δομή δείχνει με μεγάλη λεπτομέρεια τη διαμόρφωση της αλυσίδας των σακχάρων και τις αλληλεπιδράσεις τους με τα κατάλοιπα της α Btx. [58] Παρά τα μεγάλα άλματα που πραγματοποιήθηκαν για την κατανόηση της δομής και λειτουργίας του nachr, υπάρχουν πολλά σημεία που απαιτούν επιπλέον διερεύνηση. Καμία από τις παραπάνω δομές δεν προέρχεται από ανθρώπινο nachr: οι δομές των AChBP (που είναι ομόλογα της ΕΚΠ) προέρχονται από μαλάκια, η ηλεκτρονικής μικροσκοπίας δομή του nachr από το ηλεκτρικό όργανο ιχθύων του γένους Torpedo και η υψηλής διακριτικότητας δομή της α1 ΕΚΠ προέρχεται από ποντίκι. Παρόλο που αυτές οι δομές εμφανίζουν ομολογία με τον ανθρώπινο nachr, υπάρχει φαρμακολογικό ενδιαφέρον για τη γνώση σε ατομικό επίπεδο του ιδίου του ανθρώπινου υποδοχέα. Πράγματι, οι nachrs εμπλέκονται σε αρκετές παθολογικές καταστάσεις στον άνθρωπο, όπως το αυτοάνοσο νόσημα βαριά μυασθένεια, η νόσος του Alzheimer, η νόσος του Parkinson, η κατάθλιψη, η σχιζοφρένεια, η επιληψία και η εξάρτηση από τη νικοτίνη. [18,42] Επίσης σχετίζονται με ανώτερες διανοητικές λειτουργίες του εγκεφάλου όπως οι διαδικασίες της μνήμης, της μάθησης και της συμπεριφοράς. [41] Η λεπτομερής απεικόνιση του ανθρώπινου υποδοχέα είναι απαραίτητη για τον ορθολογικό σχεδιασμό 73

88 Γ. Σκοπός Εργασίας φαρμάκων κατευθυνόμενων από τη δομή του βιομορίου στόχου. Όμως η επίλυση της δομής του ανθρώπινου nachr με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ απαιτεί την κρυστάλλωση του μορίου του υποδοχέα, γεγονός δύσκολο λόγω της μεγάλης υδροφοβικότητας που αυτό παρουσιάζει. Μια διαφορετική προσέγγιση είναι η χρήση υπολογιστικών εργαλείων για την πρόβλεψη ενός δομικού μοντέλου του υποδοχέα, βασισμένο στα υπάρχοντα πειραματικά δεδομένα. Η προσέγγιση αυτή επιτρέπει τη μελέτη της δομής σε υψηλή διακριτικότητα και επιπλέον δίνει τη δυνατότητα προσομοίωσης της δυναμικής συμπεριφοράς του μορίου μέσα σε διάλυμα. Ο ρόλος της γλυκοζυλίωσης στη δομή και λειτουργία του nachr είναι κάτι που επίσης χρήζει περαιτέρω μελέτης. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου α1 ΕΚΠ έδειξε τη σημασία της ολιγοσακχαρικής αλυσίδας της α1 υπομονάδας στην πρόσδεση των τοξινών. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνεται και από βιοχημικές μελέτες, οι οποίες επιπλέον δείχνουν τη συμμετοχή της ολιγοσακχαρικής αλυσίδας στη λειτουργία του υποδοχέα. [58,124] Η ανακάλυψη αυτή ανοίγει μια νέα κατεύθυνση στη μελέτη του nachr, καθώς η γλυκοζυλίωση δε λαμβανόταν υπ όψιν στις μέχρι τώρα μελέτες. Επίσης δεν υπάρχει στη βιβλιογραφία υπολογιστική μελέτη προσομοίωσης που να υπολογίζει την επίδραση των σακχάρων. Με βάση τα παραπάνω, ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι: (Α) Η δημιουργία ενός τρισδιάστατου δομικού μοντέλου της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου nachr με προσομοίωση μέσω ομολογίας, η οποία θα βασιστεί στην υψηλής διακριτικότητας και υψηλής ομολογίας δομή της α1 ΕΚΠ ποντικού. [58] Το μοντέλο που θα υπολογιστεί θα περιέχει την υδατανθρακική αλυσίδα που συγκρυσταλλώθηκε μαζί με την α1 ΕΚΠ ποντικού συνδεδεμένη με το κατάλοιπο Asn141. (B) Η δημιουργία συμπλόκων του παραπάνω μοντέλου με διάφορες τοξίνεςανταγωνιστές του nachr. Για το σκοπό αυτό επιλέχτηκαν οι α νευροτοξίνες α μπουγκαροτοξίνη (α Btx) [191] και α κομπρατοξίνη (α Cbtx) [192] και οι α κωνοτοξίνες (α Ctx) ImI [107] και GI. [193] Τα σύμπλοκα δημιουργήθηκαν είτε με υπέρθεση δομών είτε με προσομοίωση πρόσδεσης. (Γ) Η προσομοίωση της συμπεριφοράς σε διάλυμα των συμπλόκων της ανθρώπινης α1 ΕΚΠ με τις παραπάνω τοξίνες με τη βοήθεια της Μοριακής Δυναμικής. Για να μελετηθεί ο ρόλος της υδατανθρακικής αλυσίδας οι προσομοιώσεις εκτελέστηκαν 74

89 Γ. Σκοπός Εργασίας και σε γλυκοζυλιωμένα και σε μη γλυκοζυλιωμένα μοντέλα του κάθε συμπλόκου, και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν. Όλες οι προσομοιώσεις έγιναν σε τεχνητό περιβάλλον υδατικού διαλύματος, ώστε να προσομοιάζονται όσο το δυνατόν καλύτερα οι in vivo συνθήκες. Με τις προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής θα γίνει δυνατή η παρατήρηση των διαμορφωτικών μεταβολών των συμπλόκων α1 ΕΚΠ/τοξίνης μέσα στο διάλυμα καθώς και η αναγνώριση σημαντικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ υποδοχέα τοξίνης και σακχάρων τοξίνης. 75

90 Γ. Σκοπός Εργασίας 76

91 Ενότητα Δ Αποτελέσματα Συζήτηση

92

93 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Δ.1. Ανάλυση των προσομοιώσεων ΜΔ Δ.1.1. Αποτίμηση ποιότητας του ομολογιακού μοντέλου Το μοντέλο της α1 ΕΚΠ του ανθρώπινου nachr δημιουργήθηκε με προσομοίωση μέσω ομολογίας με βάση την κρυσταλλογραφική δομή της nachr α1 ΕΚΠ ποντικού (PDB ID: 2QC1). [58] Η δομή του μοντέλου φαίνεται στην Εικόνα Δ1. Το επιλεγμένο μοντέλο αξιολογήθηκε ως προς την ορθότητά του με χρήση του διακομιστή Structural Analysis and Verification Server (SAVES). [194] Ο διακομιστής αυτός προσφέρει τη δυνατότητα ελέγχου της δομής μιας πρωτεΐνης με πέντε διαφορετικά λογισμικά αποτίμησης (PROCHECK, WHAT_CHECK, ERRAT, VERIFY_3D, PROVE). Τα αποτελέσματα του ελέγχου με τα λογισμικά PROCHECK [195] και PROVE [196] δίνονται στις Εικόνες Δ2 και Δ3. Εικόνα Δ1. Απεικόνιση του μοντέλου της α1 ΕΚΠ του ανθρώπινου nachr και της υδατανθρακικής αλυσίδας του. Η α1 ΕΚΠ απεικονίζεται ως κορδέλες χρωματισμένες ανάλογα με τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής. Η αλυσίδα σακχάρων απεικονίζεται με αναπαράσταση ράβδων. Τα άτομα άνθρακα είναι ασημί, τα άτομα οξυγόνου είναι κόκκινα και τα άτομα αζώτου είναι μπλε. Η εικόνα αυτή και όσες ακολουθούν δημιουργήθηκαν με το λογισμικό VMD [197] 79

94 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Εικόνα Δ2. Αποτελέσματα της ανάλυσης PROCHECK για το μοντέλο της ανθρώπινης α1 ΕΚΠ. Το λογισμικό PROCHECK ελέγχει τη στερεοχημεία του πεπτιδικού σκελετού και των πλευρικών αλυσίδων σε επίπεδο δίεδρων γωνιών και απεικονίζει τα αποτελέσματα μέσω του διαγράμματος Ramachandran. [198] Η ανάλυση της δομής του μοντέλου έδειξε ότι το 94,1% των αμινοξέων βρίσκεται στις προτιμώμενες περιοχές του διαγράμματος και το 5,9% στις αποδεκτές, ενώ κανένα αμινοξύ δεν βρίσκεται στις επιτρεπτές και στις μη 80

95 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση επιτρεπτές περιοχές (Εικόνα Δ2). Το λογισμικό PROVE ελέγχει το όγκο των ατόμων του μακρομορίου και την απόκλιση της τιμής του (Z score) από τις μέσες τιμές που υπολογίζονται από κατατεθειμένες δομές υψηλής διακριτικότητας. Το μοντέλο της α1 ΕΚΠ βρέθηκε ότι βρίσκεται εντός των αποδεκτών ορίων απόκλισης με βάση την ευκρίνειά του (Εικόνα Δ3). Εικόνα Δ3. Αποτελέσματα της ανάλυσης PROVE για το μοντέλο της ανθρώπινης α1 ΕΚΠ. 81

96 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Δ.1.2. Σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ποντικού με α Btx Για να μελετηθεί η επίδραση της υδατανθρακικής αλυσίδας της α1 ΕΚΠ ποντικού στην πρόσδεση της τοξίνης α Btx, πραγματοποιήθηκαν δύο ανεξάρτητες προσομοιώσεις των 20 ns για τη μη γλυκοζυλιωμένη και για τη γλυκοζυλιωμένη μορφή της υπομονάδας. Στο μη γλυκοζυλιωμένο μοντέλο (Εικόνα Δ4), η κεντρική θηλιά («δάχτυλο» ΙΙ) της τοξίνης α Btx έχει εισχωρήσει βαθιά μέσα στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών της α1 ΕΚΠ, μεταξύ των θηλιών Α, B, και C της τελευταίας. Η θηλιά Ι και η C τελική θηλιά της τοξίνης είναι επίσης τοποθετημένες κοντά στην θηλιά C της α1 ΕΚΠ. Αντιθέτως, η θηλιά ΙΙΙ της τοξίνης βρίσκεται μακριά από τη δομή της α1 υπομονάδας και δεν αλληλεπιδρά καθόλου με αυτήν. Εικόνα Δ4. Σύγκριση της μη γλυκοζυλιωμένης και της γλυκοζυλιωμένης α1 ΕΚΠ ποντικού σε σύμπλοκο με την α Btx, ύστερα από χρόνο προσομοίωσης 20 ns. Η α1 ΕΚΠ απεικονίζεται με μπλε και γαλάζιο για το μηγλυκοζυλιωμένο και το γλυκοζυλιωμένο μοντέλο, αντίστοιχα. Τα αντίστοιχα μόρια τοξίνης απεικονίζονται με κόκκινο και πορτοκαλί. Η αλυσίδα σακχάρων απεικονίζεται με αναπαράσταση ράβδου. Τα άτομα άνθρακα είναι ασημί, τα άτομα οξυγόνου είναι κόκκινα και τα άτομα αζώτου είναι μπλε. 82

97 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Πίνακας Δ1. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ καταλοίπων της α Btx και της α1 ΕΚΠ ποντικού. Τα κατάλοιπα που συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις van der Waals παρουσιάζονται με απλή γραμματοσειρά, αυτά που δημιουργούν δεσμούς υδρογόνου με έντονη γραμματοσειρά και αυτά που συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις π κατιόντος με πλάγια γραμματοσειρά. α Btx α1 ΕΚΠ ποντικού α1 ΕΚΠ ποντικού με υδατανθρακική αλυσίδα Θηλιά I Thr6 Phe189 Pro10 Thr195 Thr195 Ile11 Phe189, Pro194 Phe189, Pro194 Θηλιά II Asp30 Tyr190 Val31 Tyr93 Tyr93 Phe32 Val91, Tyr93, Tyr190 Tyr93, Tyr190 Arg36 Arg149, Tyr190, Cys192, Tyr198 Tyr190, Cys192, Tyr198 Lys38 Ser191 Ser191 Val39 Val188, Tyr190 Val188, Tyr190 Val40 Phe189 Phe189 C τελική Θηλιά His68 Tyr190, Pro194 Tyr190, Pro194 Pro69 Pro194 Lys70 Pro194 Η δέσμευση της α Btx σταθεροποιείται από ένα εκτεταμένο δίκτυο αλληλεπιδράσεων μεταξύ των καταλοίπων υποδοχέα τοξίνης (Πίνακας Δ1). Πιο συγκεκριμένα, το κατάλοιπο Arg36 της θηλιάς ΙΙ σχηματίζει δεσμό Η με τα κατάλοιπα Arg149 (θηλιά Β), Tyr190 και Cys192 (θηλιά C), και συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις π κατιόντος με την Phe32 της τοξίνης και τις Tyr190 και Tyr198 της α1 ΕΚΠ (Εικόνα Δ5). Αυτές οι αλληλεπιδράσεις διατηρούνται σε όλη τη διάρκεια της προσομοίωσης. Η ομάδα γουανιδίνης της Arg36 τοποθετείται παρόμοια με το τεταρτοταγές άτομο αζώτου των nachr αγωνιστών προσδεμένων με το μόριο της AChBP, όπως φαίνεται από τις κρυσταλλογραφικές δομές τους. [83,86] Ο μηχανισμός με τον οποίο οι α νευροτοξίνες προκαλούν συναγωνιστική αναστολή του nachr βασίζεται στην εισαγωγή ενός θετικά φορτισμένου καταλοίπου στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών. [199] Άλλες σημαντικές αλληλεπιδράσεις δεσμών υδρογόνου παρατηρούνται μεταξύ των ζευγών αμινοξέων τοξίνης υποδοχέα, Lys38 Ser191 και Val40 Phe189. Οι αλληλεπιδράσεις που παρατηρούνται μεταξύ των θηλιών Ι, ΙΙ και C τελική θηλιά της τοξίνης και της α1 υπομονάδας συνοψίζονται στον Πίνακα Δ1. Πολλές από αυτές έχουν παρατηρηθεί και στην κρυσταλλογραφική δομή της α1 ΕΚΠ ποντικού. [58] 83

98 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Εικόνα Δ5. Λεπτομερής απεικόνιση της θέσης πρόσδεσης στο σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ποντικού/α Btx. Η α1 ΕΚΠ και η τοξίνη απεικονίζονται με μπλε και κόκκινες κορδέλες αντίστοιχα. Επιλεγμένα κατάλοιπα απεικονίζονται με τη μορφή ράβδων, όπου τα άτομα άνθρακα είναι μωβ και πορτοκαλί αντίστοιχα για την α1 ΕΚΠ και την τοξίνη, ενώ τα άτομα οξυγόνου είναι κόκκινα και τα άτομα αζώτου είναι μπλε. Στο γλυκοζυλιωμένο μοντέλο της α1 ΕΚΠ παρατηρούνται μικρές διαφορές όσον αφορά τις αλληλεπιδράσεις που εντοπίζονται στη θηλιά ΙΙ και στην C τελική θηλιά (Πίνακας Δ1). Τα αμινοξέα Phe32 και Arg36 της θηλιάς ΙΙ της τοξίνης σχηματίζουν ένα δίκτυο αλληλεπιδράσεων π κατιόντος με τις Tyr190 και Tyr198 της nachr υπομονάδας. Επιπλέον η Arg36 σχηματίζει δεσμούς Η με τις Tyr190 και Cys192, ενώ το Asp30 της τοξίνης σχηματίζει και αυτό δεσμό Η με την Tyr190. Επιπρόσθετες αλληλεπιδράσεις εμφανίζονται στο τμήμα της α1 ΕΚΠ που έρχεται σε επαφή με την θηλιά Ι της τοξίνης: η Ile11 δημιουργεί δεσμό Η με την Pro194. Το γλυκοζυλιωμένο μοντέλο διαθέτει επιπλέον μια αλυσίδα σακχάρων δεσμευμένη στο κατάλοιπο Asn141 της Cys θηλιάς. Τα σάκχαρα εκτείνονται από το σημείο γλυκοζυλίωσης που βρίσκεται στο κάτω μέρος του μορίου, κοντά στην επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης στον ακέραιο nachr, μέχρι την κορυφή της θηλιάς C, 84

99 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση εφαπτόμενα της θέσης πρόσδεσης υποκαταστατών. Σημαντικός αριθμός αλληλεπιδράσεων δημιουργείται τόσο μεταξύ σακχάρων ΕΚΠ, όσο και μεταξύ σακχάρων τοξίνης (Πίνακας Δ2). Η Trp187 βρίσκεται στην πίσω επιφάνεια της θηλιάς C και δημιουργεί δεσμό Η με τη μαννόζη ΜΑΝ5 καθώς και van der Waals επαφές με την ΜΑΝ6. Τα σάκχαρα ΜΑΝ5, ΜΑΝ6 και ΜΑΝ8 σχηματίζουν δεσμούς Η με τα κατάλοιπα Thr6 και Ser9 της θηλιάς Ι. Επίσης, το σάκχαρο ΜΑΝ8 εκτείνεται ως τη βάση της θηλιάς ΙΙ της τοξίνης και σχηματίζει υδατο διαμεσολαβούμενες επαφές με τα Val40 και Glu41. Η αλληλεπίδραση σακχάρων πρωτεΐνης είχε περιγραφεί και στην κρυσταλλογραφική δομή. [58] Πίνακας Δ2. Αλληλεπιδράσεις σακχάρων πρωτεΐνης στο σύμπλοκο της α1 ΕΚΠ ποντικού/α Btx. Τα κατάλοιπα που συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις van der Waals παρουσιάζονται με απλή γραμματοσειρά, αυτά που δημιουργούν δεσμούς υδρογόνου με έντονη γραμματοσειρά και αυτά που συμμετέχουν σε επαφές διαμέσου μορίων νερού βρίσκονται εντός παρενθέσεων. Σάκχαρο α1 ΕΚΠ ποντικού α Btx NAG2 His204 NAG3 (Trp184), His186, His204 MAN4 Trp184 MAN5 His186, Trp187 Thr6 MAN6 Trp187, Pro197 Ser9 MAN8 His186, Phe189 Thr6, (Val40), (Glu41) Δ.1.3. Σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου με α Btx Τα μοντέλα της ανθρώπινης α1 ΕΚΠ σε σύμπλοκο με την α Btx υποβλήθηκαν επίσης σε προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής για 20 ns στις ίδιες συνθήκες με τα σύμπλοκα της α1 ΕΚΠ ποντικού (Εικόνα Δ6). Η ανάλυση των ΜΔ έδειξε ότι στη μηγλυκοζυλιωμένη μορφή, τα σύμπλοκα α1 ποντικού και α1 ανθρώπου είναι παρόμοια. Η δέσμευση γίνεται κυρίως μέσω της θηλιάς ΙΙ της α Btx, η οποία εισέρχεται στην κοιλότητα περιστοιχιζόμενη από τις θηλιές A, B και C της ΕΚΠ. Στη δέσμευση συνεισφέρουν επίσης η θηλιά Ι και η C τελική θηλιά του ανταγωνιστή, ενώ η θηλιά ΙΙΙ είναι απομακρυσμένη από τον υποδοχέα. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές παρουσιάζονται στον Πίνακα Δ3. Η α1 ΕΚΠ ποντικού της κρυσταλλογραφικής δομής περιέχει τρεις μεταλλάξεις σε σχέση με τη φυσική ακολουθία (Val8Glu, Trp149Arg, Val155Ala). [58] Οι μεταλλάξεις αυτές 85

100 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση διατηρήθηκαν στο τρισδιάστατο μοντέλο της α1 ΕΚΠ ποντικού που χρησιμοποιήθηκε για τη ΜΔ. Η ανθρώπινη α1 υπομονάδα όμως δημιουργήθηκε με βάση τη φυσική ακολουθία της, με αποτέλεσμα να μην περιέχει αυτές τις μεταλλάξεις. Η Trp149 είναι συντηρημένη σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των nachr α υπομονάδων και των διαφόρων μορίων της AChBP. Έχει δειχτεί ότι παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη δέσμευση αγωνιστών και ανταγωνιστών στον υποδοχέα. [82,83,86,90,97,102] Η ανάλυση των τροχιών ΜΔ έδειξε ότι το κατάλοιπο αυτό συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις π κατιόντος και van der Waals με τα αμινοξέα της τοξίνης Val31, Phe32 και Arg36, επιβεβαιώνοντας τις προηγούμενες μελέτες. Εικόνα Δ6. Σύγκριση της μη γλυκοζυλιωμένης και της γλυκοζυλιωμένης α1 ΕΚΠ ανθρώπου σε σύμπλοκο με την α Btx, ύστερα από χρόνο προσομοίωσης 20 ns. Η α1 ΕΚΠ απεικονίζεται με μπλε και γαλάζιο για το μηγλυκοζυλιωμένο και το γλυκοζυλιωμένο μοντέλο, αντίστοιχα. Τα αντίστοιχα μόρια τοξίνης απεικονίζονται με κόκκινο και πορτοκαλί. Η αλυσίδα σακχάρων απεικονίζεται με αναπαράσταση ράβδου. Τα άτομα άνθρακα είναι ασημί, τα άτομα οξυγόνου είναι κόκκινα και τα άτομα αζώτου είναι μπλε. Το γλυκοζυλιωμένο μοντέλο της ανθρώπινης α1 υπομονάδας εμφανίζει τον γνωστό τρόπο δέσμευσης της τοξίνης, όσον αφορά τη διάταξη του μορίου της στη θέση 86

101 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση πρόσδεσης του nachr. Οι ατομικές αλληλεπιδράσεις είναι αυξημένες σε σχέση με το μηγλυκοζυλιωμένο μοντέλο, ιδιαίτερα στην περιοχή της θηλιάς Ι της α Btx, όπου διάφορα κατάλοιπα της τοξίνης αλληλεπιδρούν με την Pro194 (Πίνακας Δ3). Με την Pro194 αλληλεπιδρούν και τα κατάλοιπα της C τελικής θηλιάς. Τα παραπάνω είναι αποτέλεσμα της μεταβολής της θέσης της τοξίνης κατά τη διάρκεια της προσομοίωσης, που ευθυγραμμίζει το β πτυχωτό φύλλο της θηλιάς Ι με την αλυσίδα των σακχάρων. Λόγω της μεταβολής αυτής έχουν αυξηθεί και οι αλληλεπιδράσεις τοξίνης σακχάρων σε σχέση με την α1 ΕΚΠ ποντικού (Πίνακας Δ4). Πίνακας Δ3. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ καταλοίπων της α Btx και της α1 ΕΚΠ ανθρώπου. Τα κατάλοιπα που συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις van der Waals παρουσιάζονται με απλή γραμματοσειρά, αυτά που δημιουργούν δεσμούς υδρογόνου με έντονη γραμματοσειρά, αυτά που συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις π κατιόντος με πλάγια γραμματοσειρά και αυτά που συμμετέχουν σε επαφές διαμέσου μορίων νερού βρίσκονται εντός παρενθέσεων. α Btx α1 ΕΚΠ ανθρώπου α1 ΕΚΠ ανθρώπου με υδατανθρακική αλυσίδα Θηλιά I Th6 Thr189, (Pro194) Thr8 (Pro194) Ile11 Thr189, Pro194, Pro194 Θηλιά II Asp30 (Tyr190) Val31 Tyr93, Trp149 Tyr93, Trp149 Phe32 Tyr93, Trp149, Tyr190 Tyr93, Trp149, Tyr190 Arg36 Tyr93, Thr148, Trp149, Tyr190, Tyr93, Trp149, Tyr190, Cys192, Cys192, Tyr198, (Leu199) Tyr198 Lys38 Ser191 Ser191 Val39 Val188, Tyr190 Val188, Tyr190 Val40 Thr189 Thr189 C τελική Θηλιά His68 Tyr190, Pro194 Pro194 Pro69 Pro194 Lys70 Cys192 Τα κατάλοιπα του β9 πτυχωτού φύλλου συμμετέχουν όλα σε δεσμούς υδρογόνου με την τοξίνη. Ιδιαίτερα σημαντική είναι η συμβολή της Ser187 με τρεις δεσμούς Η με τις μαννόζες ΜΑΝ5, ΜΑΝ6 και ΜΑΝ8. Καθώς οι μαννόζες αυτές έρχονται σε επαφή και με αμινοξέα της α Btx, η υδατανθρακική αλυσίδα παίζει το ρόλο της γέφυρας μεταξύ υποδοχέα και τοξίνης (Εικόνα Δ7). Οι δεσμοί τοξίνης σακχάρων εντοπίζονται και στη θηλιά Ι και στο β πτυχωτό φύλλο που βρίσκεται πριν από αυτήν. Το 87

102 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση σάκχαρο ΜΑΝ8 σχηματίζει δεσμό με τη Val40 στη βάση της θηλιάς ΙΙ της τοξίνης, γεγονός που είχε παρατηρηθεί και στην προσομοίωση της α1 ΕΚΠ ποντικού. Πίνακας Δ4. Αλληλεπιδράσεις σακχάρων πρωτεΐνης στο σύμπλοκο της α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Btx. Τα κατάλοιπα που συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις van der Waals παρουσιάζονται με απλή γραμματοσειρά και αυτά που δημιουργούν δεσμούς υδρογόνου με έντονη γραμματοσειρά. Σάκχαρο α1 ΕΚΠ ανθρώπου α Btx NAG2 His204 NAG3 Trp184, His186 MAN5 Ser187 MAN6 Ser187 Thr6, Ser9 MAN7 Ser9 MAN8 Ser187, Val188, Thr189 Thr6, Val40 MAN11 Ala7, Val14, Thr15 Εικόνα Δ7. Αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης σακχάρων στο σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Btx ύστερα από χρόνο προσομοίωσης 20 ns. Η α1 ΕΚΠ και η τοξίνη απεικονίζονται με μορφή κορδέλας γαλάζιου και κόκκινου χρώματος αντίστοιχα. Τα σάκχαρα και κάποια σημαντικά πρωτεϊνικά κατάλοιπα απεικονίζονται ως ράβδοι, με τα άτομα άνθρακα να είναι ασημί και μωβ αντίστοιχα. Και στις δύο περιπτώσεις τα άτομα οξυγόνου είναι κόκκινα ενώ τα άτομα αζώτου είναι μπλε. 88

103 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Δ.1.4. Σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου με α Cbtx Για την ΕΚΠ της ανθρώπινης α1 υπομονάδας δημιουργήθηκαν επιπλέον μοντέλα στα οποία είναι προσδεμένη μια άλλη α νευροτοξίνη, η α Cbtx. Η ανάλυση των ΜΔ διάρκειας 20 ns του παραπάνω συμπλόκου έδωσε πληροφορίες για τον τρόπο πρόσδεσης της τοξίνης (Εικόνα Δ8). Στη μη γλυκοζυλιωμένη μορφή, τρεις θηλιές της α Cbtx (θηλίες Ι ΙΙ και C τελική θηλιά) περιβάλλουν τη θηλιά C του υποδοχέα. Η θηλιά ΙΙ της α Cbtx τοποθετείται μέσα στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών. Τα κατάλοιπα Arg33 και Phe29 (που αντιστοιχούν στα Arg36 και Phe32 στην αμινοξική ακολουθία της α Btx) δημιουργούν αλληλεπιδράσεις π κατιόντος με τις Tyr93, Trp149, Tyr190 και Tyr198. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές είναι σε συμφωνία με την κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου L AChBP/α Cbtx. [87] Εικόνα Δ8. Σύγκριση της μη γλυκοζυλιωμένης και της γλυκοζυλιωμένης α1 ΕΚΠ ανθρώπου σε σύμπλοκο με την α Cbtx, ύστερα από χρόνο προσομοίωσης 20 ns. Η α1 ΕΚΠ απεικονίζεται με μπλε και γαλάζιο για το μηγλυκοζυλιωμένο και το γλυκοζυλιωμένο μοντέλο, αντίστοιχα. Τα αντίστοιχα μόρια τοξίνης απεικονίζονται με κόκκινο και πορτοκαλί. Η αλυσίδα σακχάρων απεικονίζεται με αναπαράσταση ράβδου. Τα άτομα άνθρακα είναι ασημί, τα άτομα οξυγόνου είναι κόκκινα και τα άτομα αζώτου είναι μπλε. 89

104 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Πίνακας Δ5. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ καταλοίπων της α Cbtx και της α1 ΕΚΠ ανθρώπου. Τα κατάλοιπα που συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις van der Waals παρουσιάζονται με απλή γραμματοσειρά, αυτά που δημιουργούν δεσμούς υδρογόνου με έντονη γραμματοσειρά, αυτά που συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις π κατιόντος με πλάγια γραμματοσειρά, αυτά που σχηματίζουν γέφυρες άλατος είναι υπογραμμισμένα και αυτά που συμμετέχουν σε επαφές διαμέσου μορίων νερού βρίσκονται εντός παρενθέσεων. α Cbtx α1 ΕΚΠ ανθρώπου α1 ΕΚΠ ανθρώπου με υδατανθρακική αλυσίδα Θηλιά I Pro7 (Pro194), Pro197, Thr189 Pro197 Ile9 Pro194 Pro197 Θηλιά II Asp27 (Tyr190) Ala28 Val91, (Tyr93), (Asp99), Phe100, Trp149 Phe29 Val91, Tyr93, Trp149, Tyr190 Tyr93, Trp149, Tyr190 Ile32 Trp149 Trp149 Arg33 Thr148, (Trp149), Tyr190, Cys192, Tyr93, Trp149, Tyr190, Cys192, Tyr198, (Leu199) Tyr198 Lys35 Ser191 Ser191 Arg36 Tyr93, Tyr198, Asp200 Val37 Thr189 Thr189 C τελική Θηλιά Phe65 Pro194 Pro194 Thr67 Ser191 Σε γενικές γραμμές ο τρόπος πρόσδεσης της α Cbtx είναι όμοιος με αυτόν της α Btx. Τα ζεύγη δεσμών Η Lys35 Ser191 και Val37 Thr189 είναι αντίστοιχα των Lys38 Ser191 και Val40 Thr189 που παρατηρούνται στην α Btx. Οι παρατηρούμενες αλληλεπιδράσεις του συμπλόκου συνοψίζονται στον Πίνακα Δ5. Εκτός των αλληλεπιδράσεων π κατιόντος, η Arg33 συμμετέχει σε πολλούς δεσμούς Η με τα αμινοξέα Thr148, Thr149, Tyr190, Cys192 και Leu199, με κάποιους από αυτούς να είναι διαμεσολαβούμενοι από μόρια νερού. Το γειτονικό κατάλοιπο Arg36 βρίσκεται της θηλιάς C και σχηματίζει δεσμό Η με την Tyr93 καθώς και μια γέφυρα άλατος με το Asp200, κάτι που δεν είχε παρατηρηθεί στην περίπτωση της α Btx. Στο γλυκοζυλιωμένο μοντέλο η θέση της προσδεμένης α Cbtx διαφέρει αρκετά από το μη γλυκοζυλιωμένο. Αυτό οφείλεται σε μια μετατόπιση της τοξίνης κατά τη διάρκεια της προσομοίωσης, η οποία την απομακρύνει από τη θηλιά Α της α1 υπομονάδας και την τοποθετεί πάνω από τη θέση της ολιγοσακχαρικής αλυσίδας. Ταυτόχρονα η αλυσίδα σακχάρων αλλάζει διαμόρφωση και έρχεται πιο κοντά στη θηλιά Ι της α Cbtx. Η μεταβολή αυτή είναι παρόμοια με αυτή που είχε παρατηρηθεί στο 90

105 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Btx. Ως αποτέλεσμα ενισχύονται οι αλληλεπιδράσεις της τοξίνης με τη θηλιά C της ΕΚΠ, ενώ μειώνονται σημαντικά οι αλληλεπιδράσεις της τοξίνης με τις θηλιές Α και Β, που αφορούν τα πρωτεϊνικά κατάλοιπα Val91, Tyr93, Asp99 Phe100 και Thr148 (Πίνακας Δ5). Η μετατόπιση της τοξίνης ενισχύει επίσης τις αλληλεπιδράσεις της με τα σάκχαρα (Πίνακας Δ6). Πίνακας Δ6. Αλληλεπιδράσεις σακχάρων πρωτεΐνης στο σύμπλοκο της α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Cbtx. Τα κατάλοιπα που συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις van der Waals παρουσιάζονται με απλή γραμματοσειρά, αυτά που δημιουργούν δεσμούς υδρογόνου με έντονη γραμματοσειρά και αυτά που συμμετέχουν σε επαφές διαμέσου μορίων νερού βρίσκονται εντός παρενθέσεων. Σάκχαρο α1 ΕΚΠ ανθρώπου α Cbtx NAG2 Ile131, His204, Val206 NAG3 Trp184, (Lys185), His204 MAN4 Trp184 MAN5 Trp184, His186, Ser187 Pro7 MAN6 Trp184 Pro7 MAN7 Trp184, Lys185 MAN8 His186, Val188, (Thr189) Thr6, Pro7, (Val37), Asp38 MAN11 Ile5, Thr6, Pro7 Το σύμπλοκο αυτό παρουσιάζει πολλές αλληλεπιδράσεις μεταξύ υποδοχέα και υδατανθρακικής αλυσίδας (Πίνακας Δ6). Σε πολλές από αυτές συμμετέχει το κατάλοιπο Trp184, που βρίσκεται στο β9 πτυχωτό φύλλο. Συνολικά αυτό έρχεται σε επαφή με πέντε σάκχαρα μέσω van der Waals αλληλεπιδράσεων, τα NAG3, MAN4, MAN5, MAN6 και ΜΑΝ7 (Εικόνα Δ9). Με τον τρόπο αυτό σταθεροποιεί τη διαμόρφωση της υδατανθρακικής αλυσίδας. Αμινοξέα που συμμετέχουν σε δεσμούς υδρογόνου με τα σάκχαρα είναι τα Lys185, His186, Ser187, Thr189 και His204. Μάλιστα η Ser187 σχηματίζει δύο δεσμούς Η με τη ΜΑΝ5. Όσον αφορά τις αλληλεπιδράσεις τοξίνηςσακχάρων, το κατάλοιπο Pro187 παίζει σημαντικό ρόλο, καθώς έρχεται σε επαφή με τέσσερεις μαννόζες, τις ΜΑΝ5, ΜΑΝ6, ΜΑΝ8 και ΜΑΝ11. Η μαννόζη ΜΑΝ8 αλληλεπιδρά και με άλλα τοξινικά κατάλοιπα και συγκεκριμένα με Thr6, Val37 και Asp38, με τα οποία σχηματίζει δεσμούς Η. Η ΜΑΝ11 σχηματίζει επίσης πολλαπλούς δεσμούς, με τη διαφορά ότι παρατηρούνται για μικρότερο χρονικό διάστημα στην προσομοίωση. Καθώς τα σάκχαρα ΜΑΝ5 και ΜΑΝ8 αλληλεπιδρούν τόσο με την α1 υπομονάδα όσο και με το μόριο της τοξίνης, αποτελούν σημαντικά σημεία στήριξης για τη διαμόρφωση της ολιγοσακχαρικής αλυσίδας. 91

106 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Εικόνα Δ9. Αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης σακχάρων στο σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Cbtx ύστερα από χρόνο προσομοίωσης 20 ns. Η α1 ΕΚΠ και η τοξίνη απεικονίζονται με μορφή κορδέλας γαλάζιου και κόκκινου χρώματος αντίστοιχα. Τα σάκχαρα και το πρωτεϊνικό κατάλοιπο Trp184 απεικονίζονται ως ράβδοι, με τα άτομα άνθρακα να είναι ασημί και μωβ αντίστοιχα. Και στις δύο περιπτώσεις τα άτομα οξυγόνου είναι κόκκινα ενώ τα άτομα αζώτου είναι μπλε. Δ.1.5. Σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου με α Ctx ImI Η α κωνοτοξίνη ImI είναι ένας εξειδικευμένος υψηλής συγγένειας αναστολέας των α7 και α3β2 νευρικού τύπου nachr, ενώ δεν αναστέλλει τους μυϊκού τύπου υποδοχείς. [107,110] Η τοξίνη αυτή έχει κρυσταλλωθεί σε σύμπλοκο με την A AChBP. [88] Παρόλο που η α1 υπομονάδα ανήκει στις υπομονάδες που συγκροτούν το μυϊκού τύπου nachr, επιχειρήσαμε να δημιουργήσουμε το μοντέλο της α1 ΕΚΠ ανθρώπου προσδεμένο με την α Ctx ImI. Αυτό έγινε με σκοπό την σύγκριση του τρόπου δέσμευσης της τοξίνης με αυτόν που φανερώνει η υπάρχουσα κρυσταλλογραφική δομή (Α AChBP/α Ctx ImI), [88] και πιθανώς την ανακάλυψη των χαρακτηριστικών που καθορίζουν την 92

107 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση εξειδίκευση της τοξίνης για νευρικού τύπου υποδοχείς. Για τον καθορισμό της θέσης δέσμευσης της τοξίνης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της προσομοίωσης πρόσδεσης, από την οποία επιλέχτηκε η ενεργειακά χαμηλότερη διαμόρφωση. Λόγω του μικρού μεγέθους της τοξίνης αυτής, δε δημιουργήθηκε γλυκοζυλιωμένο μοντέλο, καθώς η θέση της αλυσίδας των σακχάρων βρίσκεται σε σημαντική απόσταση από το δεσμευμένο μόριο της α Ctx ImI και επομένως δεν επηρεάζει την πρόσδεσή της. Εικόνα Δ10. Σύγκριση της θέσης δέσμευσης της τοξίνης α Ctx ImI μεταξύ του μοντέλου της α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Ctx ImI ύστερα από χρόνο 15 ns (κόκκινο) και της κρυσταλλογραφικής δομής του συμπλόκου A AChBP/α Ctx ImI (πορτοκαλί). Η α1 ΕΚΠ απεικονίζεται μόνο για το μοντέλο της α1 ΕΚΠ ανθρώπου για χάρη απλότητας (μπλε κορδέλες). Η ανάλυση των τροχιών της προσομοίωσης ΜΔ διάρκειας 15 ns έδειξε ότι η α Ctx ImI προσδένεται στη θηλιά C της α1 ΕΚΠ (Εικόνα Δ10). Η κεντρική θηλιά της τοξίνης είναι προσανατολισμένη προς το εσωτερικό της κοιλότητας πρόσδεσης υποκαταστατών. Το μόριο της α Ctx ImI είναι τοποθετημένο κατακόρυφα με τα C και Ν τελικά άκρα να βρίσκονται στο πάνω και το κάτω μέρος του. Ο τρόπος δέσμευσης είναι παρόμοιος με αυτόν που παρατηρείται στην κρυσταλλογραφική δομή της A AChBP, [88] αλλά η θέση είναι διαφορετική: στο μοντέλο η τοξίνη δεν εισχωρεί σε μεγάλο βαθμό στην κοιλότητα 93

108 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση πρόσδεσης. Η απόσταση μεταξύ των δύο δομών φτάνει μέχρι και 6 Å στην περίπτωση του ατόμου Cα του καταλοίπου Arg7 (Εικόνα Δ10). Πίνακας Δ7. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ καταλοίπων της α Ctx ImI και της α1 ΕΚΠ ανθρώπου. Τα κατάλοιπα που συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις van der Waals παρουσιάζονται με απλή γραμματοσειρά, αυτά που δημιουργούν δεσμούς υδρογόνου με έντονη γραμματοσειρά, αυτά που σχηματίζουν γέφυρες άλατος είναι υπογραμμισμένα και αυτά που συμμετέχουν σε επαφές διαμέσου μορίων νερού βρίσκονται εντός παρενθέσεων. α Ctx ImI Cys2 Cys8 Asp5 Arg7 Arg11 α1 ΕΚΠ ανθρώπου Cys192 Cys193 Tyr190 Tyr198, (Leu199), (Asp200) Asp195, Thr196 Παρατηρούνται αρκετές αλληλεπιδράσεις της τοξίνης με τη θηλιά C (Πίνακας Δ7). Συγκεκριμένα, το κατάλοιπο Arg11 της τοξίνης σχηματίζει γέφυρα άλατος με το κατάλοιπο Asp195 και δεσμό Η με το κατάλοιπο Thr196. Το τελευταίο αυτό κατάλοιπο αντιστοιχεί στο Glu191 της Α AChBP, με το οποίο η Arg11 σχηματίζει μια σταθερή γέφυρα άλατος. Επίσης, ο δισουλφιδικός δεσμός Cys2 Cys8 αλληλεπιδρά με τον εξαιρετικά συντηρημένο δισουλφιδικό δεσμό της θηλιάς C, μεταξύ των Cys192 Cys193. Η αλληλεπίδραση αυτή έχει περιγραφεί στην κρυσταλλογραφική δομή Α AChBP/α Ctx ImI, [88] καθώς και στην κρυσταλλογραφική δομή Α AChBP/α Ctx PnIA. [84] Η άλλη αργινίνη της α Ctx ImI, η Arg7, εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις με τη θηλιά C της α1 υπομονάδας, με τα κατάλοιπα Tyr198, Leu199 και Asp200. Τα κατάλοιπα αυτά σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου διαμέσου μορίων νερού. Αντιθέτως, στην κρυσταλλογραφική δομή τα αντίστοιχα κατάλοιπα Tyr193 και Ile194 δημιουργούν άμεσους δεσμούς Η με την Arg7. Η διαφορά αυτή αντανακλά τη μεγαλύτερη απόσταση από τη θηλιά C που έχει η τοξίνη στο μοντέλο σε σχέση με την κρυσταλλογραφική δομή. Η Arg7 δημιουργεί επίσης μια ενδομοριακή γέφυρα άλατος με το Asp5. Στην κρυσταλλογραφική δομή η Arg7 αλληλεπιδρά επιπλέον με άλλα πέντε κατάλοιπα στις θηλιές Α και Β της Α AChBP. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνονται και τα Tyr91 και Trp145 (Tyr93 και Trp149 αντίστοιχα στην ανθρώπινη α1 υπομονάδα), που έχει 94

109 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση αποδειχτεί ότι είναι κρίσιμα για τη δέσμευση υποκαταστατών του nachr. Οι διαφορές αυτές στις εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις και η απομακρυσμένη θέση της α Ctx ImI από την κοιλότητα πρόσδεσης οδηγούν στο συμπέρασμα ότι αυτή η α κωνοτοξίνη δε δεσμεύεται στην α1 υπομονάδα του ανθρώπινου μυϊκού τύπου nachr, όπως άλλωστε δείχνουν και τα βιολογικά δεδομένα. Δ.1.6. Σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου με α Ctx GI Η α κωνοτοξίνη GI είναι εκλεκτικός ανταγωνιστής του μυϊκού τύπου nachr, ενώ δεν παρουσιάζει συγγένεια προς τους νευρικού τύπου υποδοχείς. [200] Υπό αυτήν την άποψη είναι το αντίθετο της α Ctx ImI που περιγράφτηκε προηγουμένως. Για αυτήν την α κωνοτοξίνη δεν υπάρχει κατατεθειμένη δομή στην οποία να είναι προσδεμένη σε κάποιο μόριο AChBP ή σε nachr. Όπως και στην α Ctx ImI, η θέση δέσμευσης της α Ctx GI στο μοντέλο της α1 ΕΚΠ ανθρώπου προσδιορίστηκε με προσομοίωση πρόσδεσης. Και σε αυτήν την περίπτωση δεν προστέθηκε υδατανθρακική αλυσίδα στο τελικό σύμπλοκο, καθώς το μικρό μέγεθος της τοξίνης αποκλείει την πιθανότητα αλληλεπίδρασης με τα σάκχαρα, βάσει της θέσης στην οποία προσδένεται. Εικόνα Δ11. Μεταβολή της θέσης της τοξίνης α Ctx GI κατά τη διάρκεια της προσομοίωσης ΜΔ. (Α) Αρχική θέση (κόκκινο). (Β) Τελική θέση ύστερα από χρόνο 10 ns (πορτοκαλί). Και στις δύο περιπτώσεις η α1 ΕΚΠ απεικονίζεται με μπλε κορδέλες. Η προσομοίωση πρόσδεσης έδειξε ότι η α Ctx GI δεσμεύεται στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών του nachr, μεταξύ των θηλιών Β και C. Τα C και Ν τελικά άκρα είναι 95

110 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση προσανατολισμένα στο πάνω μέρος του μορίου και εκτός της κοιλότητας πρόσδεσης (Εικόνα Δ11). Κατά τα πρώτα στάδια της προσομοίωσης ΜΔ η τοξίνη παρουσιάζει μεγάλη κινητικότητα. Ύστερα από χρόνο 2 ns, η άκρη της θηλιάς C μετατοπίζεται προς τα έξω, με αποτέλεσμα να μεγαλώνει το άνοιγμα της θέσης πρόσδεσης. Το προσδεμένο μόριο της τοξίνης ακολουθεί την κίνηση αυτή και σταδιακά εισάγει πρώτα το C και ύστερα το Ν τελικό άκρο στην κοιλότητα μεταξύ των θηλιών Β και C. Το μόριο της τοξίνης πραγματοποιεί μια περιστροφή αντίθετα προς τη φορά των δεικτών του ρολογιού ως προς τον κατακόρυφο άξονα (Εικόνα Δ11). Η νέα αυτή τοποθέτηση της α Ctx GI διατηρείται μέχρι το τέλος των 10 ns της προσομοίωσης. Στη νέα αυτή θέση τα Ν και C τελικά άκρα έρχονται σε επαφή με τις θηλιές της α1 υπομονάδας, ενώ η έλικα προσανατολίζεται προς το διάλυμα και δεν συμμετέχει στην πρόσδεση. Οι αλληλεπιδράσεις τοξίνης υποδοχέα συνοψίζονται στον Πίνακα Δ8. Το Ν τελικό κατάλοιπο Glu1 σχηματίζει δεσμούς Η με τα κατάλοιπα Cys192, Ser191 και Thr196, στα δύο τελευταία διαμέσου μορίων νερού. Κοντά στο C τελικό άκρο, το κατάλοιπο Ser12 σχηματίζει δεσμό Η με την Cys192. Αρκετές αλληλεπιδράσεις σχηματίζει το κατάλοιπο Arg9. Αυτές περιλαμβάνουν μια γέφυρα άλατος με το Asp200 και δεσμούς υδρογόνου με τα Trp149 (θηλιά B) και Tyr198 (θηλιά C). Το διπλανό κατάλοιπο His10 δημιουργεί επαφές van der Waals με τα υδρόφοβα αμινοξέα Val188, Tyr190, Tyr198 και με το δισουλφιδικό δεσμό Cys192 Cys193. Αξίζει να σημειωθεί επίσης ότι στα C και Ν τελικά άκρα δημιουργούνται δύο δεσμοί Η μεταξύ Cys2 και Ser12. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η α Ctx GI δεν έχει συγκρυσταλλωθεί με κάποιον υποδοχέα, είτε nachr είτε AChBP. Επομένως ο τρόπος δέσμευσής της δεν είναι γνωστός. Είναι γνωστό ότι η τοξίνη αυτή (όπως και άλλες 3/5 κωνοτοξίνες) εμφανίζει διαφορετική συγγένεια δέσμευσης για τις δύο θέσεις πρόσδεσης ACh του πενταμερούς nachr μυϊκού τύπου. [201,202] Αναλυτικότερα, η α Ctx GI δεσμεύεται φορές πιο ισχυρά στην θέση πρόσδεσης α/δ του nachr από ότι στην α/γ. Διάφορες μελέτες δομής δράσης (μεταλλαξιγένεση, πειράματα δέσμευσης κ.ά) έχουν φανερώσει τα κατάλοιπα της α Ctx GI που σχετίζονται με την πρόσδεση στην α ή στη δ nachr υπομονάδα. Σύμφωνα με αυτές, η πλευρά της τοξίνης που σχηματίζεται από τη σειρά καταλοίπων Cys2, Asn4, Pro5, Ala6 και Cys7 είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση στην α υπομονάδα. [203,204] Αντιθέτως, τα κατάλοιπα Arg9 και His10 είναι αυτά που προσδίδουν εκλεκτικότητα για την δ ή γ υπομονάδα. [205,206] Σύμφωνα με τα δεδομένα αυτά η α Ctx GI κατά την 96

111 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση πρόσδεση θα προσανατολίζεται με τέτοιο τρόπο ώστε η πλευρά των καταλοίπων 2 7 να έρχεται σε επαφή με την α υπομονάδα ενώ τα κατάλοιπα 9 και 10 να αλληλεπιδρούν με τη δ υπομονάδα. Πίνακας Δ8. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ καταλοίπων της α Ctx GI και της α1 ΕΚΠ ανθρώπου. Τα κατάλοιπα που συμμετέχουν σε αλληλεπιδράσεις van der Waals παρουσιάζονται με απλή γραμματοσειρά, αυτά που δημιουργούν δεσμούς υδρογόνου με έντονη γραμματοσειρά, αυτά που σχηματίζουν γέφυρες άλατος είναι υπογραμμισμένα και αυτά που συμμετέχουν σε επαφές διαμέσου μορίων νερού βρίσκονται εντός παρενθέσεων. α Ctx GI Glu1 Arg9 His10 Ser12 α1 ΕΚΠ ανθρώπου (Ser191), Cys192, (Thr196) Cys192 Cys193, Val188, Tyr190, Tyr198, Trp149, Tyr198, Asp200 Cys192 Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τη δομή που προσομοιάστηκε στην παρούσα μελέτη. Τα αμινοξέα Arg9 και His10 είναι αυτά που κυρίως συμμετέχουν στην πρόσδεση στην α υπομονάδα, ενώ η πλευρά 2 7 κατευθύνεται προς το διαλύτη, εκεί που θα βρισκόταν η δ ή γ υπομονάδα στον πενταμερή nachr. Η «λανθασμένη» αυτή πρόβλεψη οφείλεται επακριβώς στην έλλειψη της γειτονικής υπομονάδας στο μοντέλο που δημιουργήθηκε, η παρουσία της οποίας θα καθοδηγούσε την πρόσδεση της τοξίνης με τον σωστό προσανατολισμό. Το γεγονός αυτό καταδεικνύει την ανάγκη συνεξέτασης των υπολογιστικών μοντέλων με τα υπάρχοντα βιολογικά δεδομένα. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι στην περίπτωση των α νευροτοξινών α Btx και α Cbtx έγινε σωστή πρόβλεψη του τρόπου πρόσδεσης, παρά την απουσία της γειτονικής υπομονάδας. 97

112 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Δ.2. Συγκριτική μελέτη των αποτελεσμάτων προσομοίωσης Δ.2.1. Σύγκριση του μοντέλου της α1 ΕΚΠ ποντικού με την κρυσταλλογραφική δομή Η κρυσταλλογραφική δομή της ΕΚΠ της nachr α1 υπομονάδας ποντικού προσδεμένη με την τοξίνη α Btx παρέχει μια υψηλής διακριτικότητας εικόνα της α1 υπομονάδας και των αλληλεπιδράσεών της με την ολιγοσακχαρική αλυσίδα και την τοξίνη. [58] Τα μοντέλα της α1 ΕΚΠ ποντικού που δημιουργήθηκαν είναι σε μεγάλο βαθμό όμοια με την κρυσταλλογραφική δομή όσον αφορά τη διαμόρφωση της α1 υπομονάδας. Οι όποιες διαφορές συνίστανται σε μικρές αποκλίσεις στη διαμόρφωση των θηλιών, οι οποίες είναι αναμενόμενες, λαμβάνοντας υπ όψιν ότι οι θηλιές είναι τα τμήματα δευτεροταγούς δομής με τη μεγαλύτερη ευκαμψία. Η παρουσία ή μη των σακχάρων δεν επηρέασε τη δομή της α1 ΕΚΠ. Αντιθέτως, τα σάκχαρα χαρακτήρισαν σε μεγάλο βαθμό την πρόσδεση της τοξίνης α Btx. Στο μη γλυκοζυλιωμένο μοντέλο η τοξίνη συμπεριφέρεται διαφορετικά κατά της διάρκεια της ΜΔ σε σχέση με το γλυκοζυλιωμένο. Κατά συνέπεια η τελική θέση της δεσμευμένης τοξίνης διαφέρει από την κρυσταλλογραφική δομή. Η θηλιά ΙΙ της α Btx είναι σωστά τοποθετημένη εντός της κοιλότητας πρόσδεσης και περιτριγυρίζεται από τις θηλιές Α, Β και C του υποδοχέα. Εντούτοις το υπόλοιπο μόριο της τοξίνης έχει μετατοπιστεί προς τα πάνω (Εικόνα Δ4). Η μετατόπιση αυτή παρατηρείται ήδη από το δεύτερο ns της προσομοίωσης και οδηγεί στην πιο κοντινή επαφή της θηλιάς Ι και της C τελικής θηλιάς με τη θηλιά C της ΕΚΠ. Στο γλυκοζυλιωμένο μοντέλο το μόριο της α Btx παρουσιάζει μικρή κινητικότητα κατά της διάρκεια της προσομοίωσης. Η θηλιά Ι παραμένει σταθερή μεταξύ της θηλιάς C και της ολιγοσακχαρικής αλυσίδας. Οι μαννόζες αλληλεπιδρούν με την τοξίνη και την σταθεροποιούν. Συνολικά η δέσμευση είναι παρόμοια με αυτήν που παρατηρείται στην κρυσταλλογραφική δομή. Επομένως η μεταβολή στο μη γλυκοζυλιωμένο μοντέλο μπορεί να αποδοθεί στην απουσία των Asn141 συνδεδεμένων σακχάρων, ο ρόλος των οποίων είναι καθοριστικός. 98

113 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Δ.2.2. Είσοδος μορίων νερού στην υδρόφιλη κοιλότητα της α1 ΕΚΠ Η κρυσταλλογραφική δομή της α1 ΕΚΠ ποντικού φανέρωσε την ύπαρξη μιας υδρόφιλης κοιλότητας μέσα στον υδρόφοβο πυρήνα β πτυχωτών φύλλων της α1 υπομονάδας. [58] Στο εσωτερικό της βρέθηκαν δύο καλώς διευθετημένα μόρια νερού. Το ένα από αυτά ήταν προσδεμένο στα κατάλοιπα Thr52 (β2 πτυχωτό φύλλο) και Ser126 (β6' πτυχωτό φύλλο), ενώ το άλλο στα Ser126 και Asn94 (θηλιά Α). Το δημιουργούμενο δίκτυο αλληλεπιδράσεων επιτρέπει την έμμεση σύνδεση των εσωτερικών β πτυχώσεων με τη θηλιά Α στην εξωτερική επιφάνεια του μορίου. Τα παραπάνω υδρόφιλα κατάλοιπα είναι εξαιρετικά συντηρημένα στις ΕΚΠ των nachr υπομονάδων, όχι όμως στα διάφορα μόρια AChBP. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με πειραματικές μελέτες αποδεικνύει τον πιθανό σημαντικό ρόλο αυτής της υδρόφιλης κοιλότητας στο άνοιγμα του καναλιού του nachr. [58] Εικόνα Δ12. (Α) Η υδρόφιλη κοιλότητα εντός του πυρήνα β πτυχώσεων στο σύμπλοκο α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Btx. Οι β πτυχώσεις απεικονίζονται ως γαλάζιες κορδέλες, τα κατάλοιπα ως ράβδοι και τα μόρια νερού ως μοντέλα van der Waals, με τα άτομα άνθρακα να είναι ασημί, τα άτομα οξυγόνου κόκκινα, τα άτομα αζώτου μπλε και τα άτομα υδρογόνου λευκά. (Β) και (Γ) Μεταβολή του μήκους των δεσμών Η που σχηματίζουν τα μόρια νερού ως προς το χρόνο προσομοίωσης. 99

114 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Οι προσομοιώσεις ΜΔ που πραγματοποιήθηκαν επιβεβαίωσαν την ικανότητα αυτής της κοιλότητας να φιλοξενεί μόρια νερού. Τα κρυσταλλογραφικά μόρια νερού είχαν απομακρυνθεί από όλες τις αρχικές δομές των μοντέλων, συμπεριλαμβανομένων και των δύο μορίων εντός της υδρόφιλης κοιλότητας. Με αυτόν τον τρόπο ήταν δυνατή η παρατήρηση της εισόδου των μορίων νερού από το εξωτερικό περιβάλλον του διαλύτη εντός αυτής της κοιλότητας. Τα μόρια νερού σχηματίζουν σταθερούς δεσμούς Η με τα κατάλοιπα Thr52, Ser126 και Asn94, όπως έδειξε η κρυσταλλογραφική δομή (Εικόνα Δ12). Οι δεσμοί αυτοί παρατηρήθηκαν στις προσομοιώσεις όλων των μοντέλων και ήταν μεγάλης διάρκειας. Δ.2.3. Διαφορές μεταξύ των μοντέλων της α1 ΕΚΠ ανθρώπου και της α1 ΕΚΠ ποντικού Καθώς και το μοντέλο της ανθρώπινης α1 ΕΚΠ βασίστηκε στην κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου α1 ΕΚΠ ποντικού/α Btx, υπάρχει μεγάλη ομοιότητα μεταξύ των δύο. Υπέρθεση των δύο μοντέλων μετά από ΜΔ διάρκειας 20 ns φανερώνει ταύτιση σχεδόν των υδρόφοβων πυρήνων από β πτυχωτά φύλλα και μικρές διαφορές στη διαμόρφωση των θηλιών. Η τοξίνη α Btx έχει παρόμοιο τρόπο δέσμευσης και στις δύο περιπτώσεις, αν και παρατηρείται μια μικρή διαφορά στην τελική της θέση. Η δέσμευση επιτελείται κυρίως μέσω της θηλιάς ΙΙ, η οποία εισχωρεί βαθιά μέσα στη θέση δέσμευσης υποκαταστατών του nachr, όπου σταθεροποιείται μέσω πολλών αλληλεπιδράσεων με κατάλοιπα των θηλιών Α, Β και C (Εικόνα Δ5). Η θηλιά Ι και η C τελική θηλιά της τοξίνης συνεισφέρουν επίσης στη δέσμευση καθώς έρχονται σε επαφή με τη θηλιά C του υποδοχέα. Η θηλιά Ι επιπλέον αλληλεπιδρά με τα σάκχαρα της υδατανθρακικής αλυσίδας. Μια σημαντική διαφορά εντοπίζεται στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών του nachr. Όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως, η μεταλλαγμένη Arg149 (θηλιά Β) στην κρυσταλλογραφική δομή της α1 υπομονάδας ποντικού [58] έχει αντικατασταθεί από τη φυσική Trp149 στην ανθρώπινη υπομονάδα. Η αλλαγή αυτή έχει επίδραση στη δέσμευση της τοξίνης. Κατά τη διάρκεια των προσομοιώσεων η Trp149 συμμετέχει στο σχηματισμό του αρωματικού πυρήνα της θέσης πρόσδεσης, μαζί με τα κατάλοιπα Tyr93, 100

115 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Tyr190 και Tyr198 των θηλιών Α και C. Αυτό το δίκτυο αρωματικών καταλοίπων περιστοιχίζει τη θετικά φορτισμένη αργινίνη των α νευροτοξινών (Arg36 στην περίπτωση της α Btx, Arg33 στην α Cbtx) και την δεσμεύει μέσω αλληλεπιδράσεων π κατιόντος (Εικόνα Δ5). Το κατάλοιπο της Trp σε αυτήν τη θέση είναι εξαιρετικά συντηρημένο στις nachr α υπομονάδες και στις διάφορες AChBP και έχει αποδειχτεί ότι είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τη δέσμευση αγωνιστών και ανταγωνιστών. [82,83,86,90,97,102] Από την άλλη η μεταλλαγμένη Arg149 στο μοντέλο του ποντικού δημιουργεί μόνο ένα δεσμό υδρογόνου με την τοξίνη, μέσω του καρβονυλίου του πεπτιδικού σκελετού της. Η πλευρική της αλυσίδα απομακρύνεται από την κοιλότητα πρόσδεσης και δε συνεισφέρει καθόλου στη δέσμευση της τοξίνης. Ένα άλλο κατάλοιπο που μεταλλάχτηκε για την κρυσταλλοποίηση της α1 ΕΚΠ ποντικού είναι η Phe189 της θηλιάς C, που μετατράπηκε σε Thr189. Σε αυτήν την περίπτωση η διαφορά δεν ήταν σημαντική. Τόσο στο μοντέλου ποντικού όσο και στο ανθρώπινο, το κατάλοιπο αυτό σχηματίζει δεσμό Η με μια βαλίνη της θηλιάς ΙΙ της τοξίνης (Val40 και Val37 στις α Btx και α Cbtx αντίστοιχα). Η διαμόρφωση της ολιγοσακχαρικής αλυσίδας διαφέρει στις προσομοιώσεις των δύο μοντέλων. Στην προσομοίωση της α1 υπομονάδας ποντικού διατηρεί την αρχική διαμόρφωσή της σε μεγάλο βαθμό, με πολύ μικρές μεταβολές στη θέση των σακχάρων. Ο άξονας της αλυσίδας που αποτελείται από τις μαννόζες ΜΑΝ9, ΜΑΝ10 και ΜΑΝ11 παραμένει απομακρυσμένος από τη δεσμευμένη τοξίνη και δεν αλληλεπιδρά με αυτήν. Αντιθέτως στην προσομοίωση της ανθρώπινης υπομονάδας η αλυσίδα σακχάρων μετά από χρόνο μόλις 1 ns απομακρύνεται από τα β πτυχωτά φύλλα του υποδοχέα και πλησιάζει το μόριο της τοξίνης (Εικόνα Δ13). Συγκεκριμένα ο άξονας της αλυσίδας στρέφεται με τέτοιο τρόπο ώστε να φέρνει τη ΜΑΝ11 σε στενή επαφή με τη θηλιά Ι της τοξίνης, οδηγώντας στη δημιουργία δύο δεσμών Η με το κατάλοιπο Thr15. Σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της υδατανθρακικής αλυσίδας παίζει το κατάλοιπο Ser187 της ανθρώπινης υπομονάδας, το οποίο εντοπίζεται στο κάτω μέρος της θηλιάς C. Από τη θέση αυτή δημιουργεί δύο δεσμούς Η με το σάκχαρο ΜΑΝ5 και άλλον ένα δεσμό με το σάκχαρο ΜΑΝ8, αλληλεπιδρώντας ταυτόχρονα και με κατάλοιπα της τοξίνης. Οι επαφές αυτές στηρίζουν την ολιγοσακχαρική αλυσίδα και την σταθεροποιούν σε μια διαμόρφωση που βρίσκεται κοντά στην τοξίνη. Στην α1 ΕΚΠ ποντικού η σερίνη στη θέση 187 αντικαθίσταται από μια τρυπτοφάνη. Σε αυτήν την περίπτωση οι ισχυρές αλληλεπιδράσεις με τα σάκχαρα χάνονται και παραμένει μόνο 101

116 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση ένας δεσμός Η και κάποιες επαφές van der Waals, παρά το γεγονός ότι στην κρυσταλλογραφική δομή της α1 ποντικού, η Trp187 θεωρήθηκε σημαντική για την σταθεροποίηση των σακχάρων. [58] Τα αποτελέσματα της ΜΔ όμως δείχνουν ότι η αντικατάσταση Trp187Ser μεταξύ των υποδοχέων ποντικού και ανθρώπου οδηγεί σε αύξηση στον αριθμό και στην κατανομή των αλληλεπιδράσεων τοξίνης σακχάρων. Η διαφορά στη θέση της υδατανθρακικής αλυσίδας στα δύο μοντέλα μπορεί να αποδοθεί σε αυτήν την αλλαγή αμινοξέων. Εικόνα Δ13. Στιγμιότυπα από την προσομοίωση της α1 ΕΚΠ ανθρώπου σε σύμπλοκο με α Btx που δείχνουν τη διαμόρφωση της αλυσίδας σακχάρων στην αρχή (Α) και στο τέλος (Β) της ΜΔ. Η α1 ΕΚΠ και η τοξίνη απεικονίζονται με κορδέλες γαλάζιες και κόκκινες, αντίστοιχα. Τα σάκχαρα και επιλεγμένα τοξινικά κατάλοιπα απεικονίζονται με τη μορφή ράβδων όπου τα άτομα άνθρακα είναι ασημί και μωβ, αντίστοιχα. Και στις δύο περιπτώσεις τα άτομα οξυγόνου είναι κόκκινα ενώ τα άτομα αζώτου μπλε. Δ.2.4. Ο ρόλος της γλυκοζυλίωσης στην πρόσδεση τοξινών στην α1 ΕΚΠ Ένα σημαντικό επίτευγμα της κρυσταλλογραφικής δομής της α1 ΕΚΠ ποντικού [58] είναι η συγκρυστάλλωση μαζί με την α1 υπομονάδα και της ολιγοσακχαρικής αλυσίδας προσδεμένης στο κατάλοιπο Asn141. Με αυτόν τον τρόπο φανερώθηκε η διαμόρφωση της αλυσίδας αυτής καθώς και ο μεγάλης σημασίας ρόλος της στην πρόσδεση της τοξίνης α Btx, ο οποίος είχε διαπιστωθεί και από προηγούμενες μελέτες. [124] Οι αλληλεπιδράσεις υποδοχέα σακχάρων και τοξίνης σακχάρων αποκαλύφτηκαν σε ατομικό επίπεδο. Επίσης, πειράματα απογλυκοζυλίωσης έδειξαν ότι τα σάκχαρα πιθανώς εμπλέκονται στη διασύνδεση της πρόσδεσης τοξινών στην ΕΚΠ με το άνοιγμα του καναλιού του nachr. [58] 102

117 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Για να διερευνηθεί περαιτέρω ο δομικός ρόλος των σακχάρων στην πρόσδεση τοξινών, δημιουργήθηκαν γλυκοζυλιωμένα και μη μοντέλα της α1 ΕΚΠ με δύο προσδεμένες τοξίνες, την α Btx και την α Cbtx. Η προσομοίωση ΜΔ επέτρεψε τη μελέτη της δυναμικής της πρόσδεσης των τοξινών παρουσία και απουσία των σακχάρων. Η ανάλυση των τροχιών της ΜΔ έδειξε ότι τα γλυκοζυλιωμένα και μη γλυκοζυλιωμένα μοντέλα είναι σε μεγάλο βαθμό όμοια όσον αφορά τις α1 υπομονάδες, με μικρές διαφοροποιήσεις στη διαμόρφωση των θηλιών Α, Β, C και Cys θηλιά. Η παρουσία ή μη των σακχάρων δε φαίνεται να επηρεάζει τη δομή της ΕΚΠ αυτή καθεαυτή σε σημαντικό βαθμό. Το σημείο στο οποίο διαφέρουν οι γλυκοζυλιωμένες και μη δομές είναι ο τρόπος πρόσδεσης της τοξίνης (Εικόνες Δ6 και Δ8). Κατά τη διάρκεια των προσομοιώσεων η προσδεμένη τοξίνη μετακινείται σε θέση πλησιέστερη στα σάκχαρα. Αυτό παρατηρείται και για τα δύο μόρια α νευροτοξίνης. Παράλληλα η προσκείμενη θηλιά C του υποδοχέα αλλάζει τη διαμόρφωσή της και ακολουθεί την κίνηση αυτή της τοξίνης, «παγιδεύοντας» τη θηλιά Ι της τελευταίας μεταξύ της α1 υπομονάδας και των σακχάρων. Χαρακτηριστική είναι επίσης η αλλαγή της διαμόρφωσης των σακχάρων κατά τη διάρκεια της ΜΔ, η οποία τα φέρνει πιο κοντά στη θηλιά Ι της τοξίνης (Εικόνα Δ13). Τα κατάλοιπα Ser187 και Trp184 της α1 ΕΚΠ έρχονται σε επαφή με πολλά σάκχαρα ταυτόχρονα. Για το λόγο αυτό είναι κρίσιμα για την σταθεροποίηση της διαμόρφωσης της αλυσίδας των σακχάρων σε θέση κατάλληλη για αλληλεπίδραση με την προσδεμένη τοξίνη. Πιο συγκεκριμένα, στην περίπτωση της α Btx η τοξίνη μετατοπίζεται προς τα κάτω, φέρνοντας τη θηλιά Ι σε επαφή με την υδατανθρακική αλυσίδα. Η κίνηση αυτή ευνοεί τη δημιουργία αλληλεπιδράσεων μεταξύ των καταλοίπων και των σακχάρων. Οι σημαντικότερες από αυτές αφορούν τα αμινοξέα Thr6, Ser9 και Thr15. Οι δύο δεσμοί Η που σχηματίζει το τελευταίο με την τελική μαννόζη της αλυσίδας, τη ΜΑΝ11, αποδεικνύουν πόσο πολύ τα σάκχαρα έχουν πλησιάσει την τοξίνη. Στην περίπτωση της α Cbtx, ολόκληρο το μόριο της τοξίνης μετατοπίζεται προς την πλευρά των σακχάρων. Η θηλιά ΙΙ εισχωρεί λιγότερο στην κοιλότητα πρόσδεσης σε σχέση με τα υπόλοιπα μοντέλα. Η θηλιά Ι συγκλίνει προς τα σάκχαρα και παρασέρνει μαζί της και τη θηλιά C της α1 ΕΚΠ. Τα σημαντικότερα τοξινικά κατάλοιπα για τη δέσμευση στις μαννόζες είναι τα Thr6 και Pro7. Σε αυτήν την περίπτωση δεν υπάρχει κάποιο κατάλοιπο της τοξίνης που να δημιουργεί μακράς διάρκειας δεσμούς με τη ΜΑΝ

118 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Η υδατανθρακική αλυσίδα δρα πραγματικά ως μεσολαβητής της πρόσδεσης της τοξίνης στην ΕΚΠ της α1 υπομονάδας. Τα κατάλοιπα της τοξινικής θηλιάς Ι που αναφέρθηκαν παραπάνω (Thr6, Ser9 και Thr15 για την α Btx, Thr6 και Pro7 για την α Cbtx) καθώς και αρκετά άλλα, αλληλεπιδρούν ελάχιστα ή καθόλου με την nachr α1 υπομονάδα. Μέσω όμως της αλληλεπίδρασής τους με την ολιγοσακχαρική αλυσίδα συνεισφέρουν σε μεγάλο βαθμό στην πρόσδεση της τοξίνης με υψηλή συγγένεια στον υποδοχέα. Το καλύτερο παράδειγμα για αυτό αποτελούν οι μαννόζες ΜΑΝ5, ΜΑΝ6 και ΜΑΝ8 που βρίσκονται στη διακλάδωση της αλυσίδας, απέναντι από τα πτυχωτά φύλλα β7 και β10 και κάτω από τη θηλιά C της α1 ΕΚΠ (Εικόνα Δ1). Λόγω της θέσης τους και της ειδικής διαμόρφωσης που λαμβάνει η υδατανθρακική αλυσίδα σχηματίζουν δεσμούς τόσο με τον υποδοχέα όσο και με το μόριο της προσδεμένης τοξίνης. Οι δεσμοί αυτοί σταθεροποιούν μεν την αλυσίδα στη θέση της, εφαπτόμενη της α1 υπομονάδας, συγκρατούν δε την τοξίνη στη θέση πρόσδεσης. Οι προσομοιώσεις ΜΔ έδειξαν ότι οι αλληλεπιδράσεις αυτές δεν υπάρχουν εξ αρχής αλλά δημιουργούνται και είναι δυναμικής φύσεως. Το συνολικό τους αποτέλεσμα όμως είναι η σταθερή πρόσδεση της α νευροτοξίνης στην ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του nachr. 104

119 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση Δ.3. Συμπεράσματα Η παρούσα εργασία παρέχει νέες πληροφορίες για την πρόσδεση διαφόρων τοξινών στον ανθρώπινο nachr και για το ρόλο της γλυκοζυλίωσης σε αυτήν. Χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου α1 ΕΚΠ ποντικού/α Btx, υπολογίστηκε το μοντέλο της ανθρώπινης α1 ΕΚΠ με προσομοίωση μέσω ομολογίας και δημιουργήθηκαν τα σύμπλοκα της τελευταίας με τις τοξίνες α Btx, α Cbtx, α Ctx ImI και α Ctx GI. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής για κάθε σύμπλοκο σε δύο μορφές, τη γλυκοζυλιωμένη και τη μηγλυκοζυλιωμένη, για χρόνους 20 ns για τις α νευροτοξίνες, 15 ns για την α Ctx ImI και 10 ns για την α Ctx GI. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν μεταξύ τους και οδήγησαν στα παρακάτω συμπεράσματα. Από τη μελέτη της δομής των παραπάνω συμπλόκων επιβεβαιώνεται η συμμετοχή των σακχάρων στην πρόσδεση των α νευροτοξινών που είχε αποκαλυφτεί από την κρυσταλλογραφική δομή. Η δέσμευση γενικά επιτελείται μέσω της θηλιάς ΙΙ της τοξίνης, η οποία εισέρχεται στην κοιλότητα πρόσδεσης (θηλιές Α, Β και C του υποδοχέα), καθώς και μέσω της θηλιάς Ι, η οποία εκτείνεται πίσω από τη θηλιά C της α1 ΕΚΠ και εφάπτεται της υδατανθρακικής αλυσίδας. Αντιθέτως στην περίπτωση των α κωνοτοξινών τα σάκχαρα δεν έρχονται σε επαφή με την τοξίνη λόγω του μικρού μεγέθους της, το οποίο επιτρέπει αλληλεπιδράσεις μόνο στο εσωτερικό της κοιλότητας πρόσδεσης του nachr. Για το λόγο αυτό η υδατανθρακική αλυσίδα δεν συμπεριλήφθη στην προσομοίωση των συμπλόκων α1 ΕΚΠ/α κωνοτοξινών. Στις προσομοιώσεις παρατηρήθηκε ότι η διαμόρφωση της ολιγοσακχαρικής αλυσίδας αλλάζει από την αρχική κρυσταλλογραφική θέση της και πλησιάζει την προσδεμένη τοξίνη. Ο άξονας της αλυσίδας αλλάζει διαμόρφωση φέρνοντας την τελευταία μαννόζη ΜΑΝ11 σε επαφή με τη θηλιά Ι της τοξίνης, όπου σταθεροποιείται με δεσμούς υδρογόνου. Τα κατάλοιπα Ser187 και Trp184 της α1 ΕΚΠ αποτελούν σημεία στήριξης για αυτήν τη μεταλλαγμένη διαμόρφωση των σακχάρων, καθώς αλληλεπιδρούν ταυτόχρονα με πολλά από αυτά. Στα μοντέλα που περιείχαν υδατανθρακική αλυσίδα, η θέση της προσδεμένης τοξίνης μεταβλήθηκε κατά τη διάρκεια των προσομοιώσεων. Ως αποτέλεσμα της 105

120 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση μεταβολής αυτής η θηλιά Ι έρχεται πιο κοντά στα σάκχαρα της α1 ΕΚΠ και αυξάνονται οι αλληλεπιδράσεις τοξίνης σακχάρων, οι οποίες ενισχύουν τη δέσμευση της α νευροτοξίνης στον υποδοχέα. Τα τοξινικά κατάλοιπα που αναγνωρίστηκαν ως κρίσιμα για το ρόλο αυτό είναι τα Thr6, Ser9, και Th15 της α Btx και Thr6 και Pro7 της α Cbtx. Αυτά συμμετέχουν σε πολλαπλούς δεσμούς υδρογόνου με τα σάκχαρα και κάποια από αυτά αλληλεπιδρούν επίσης με κατάλοιπα της α1 υπομονάδας. Από πλευράς σακχάρων, τα πιο σημαντικά είναι το ΜΑΝ5, ΜΑΝ6 και ΜΑΝ8, που δημιουργούν επαφές τόσο με την α1 υπομονάδα, όσο και με το μόριο της τοξίνης. Σημαντική είναι και η συμβολή της μαννόζης ΜΑΝ11, που δημιουργεί δεσμούς (άλλοτε μικρής και άλλοτε μεγαλύτερης διάρκειας) με το β φύλλο της τοξίνης, στη βάση της θηλιάς Ι. Τα παραπάνω δείχνουν ότι η υδατανθρακική αλυσίδα είναι ο μεσολαβητής της πρόσδεσης της τοξίνης στον nachr υποδοχέα. Οι προσομοιώσεις επιβεβαίωσαν επίσης την ύπαρξη της υδρόφιλης κοιλότητας που ανακαλύφτηκε στην κρυσταλλογραφική δομή της α1 ΕΚΠ ποντικού. Αυτή βρίσκεται στο εσωτερικό του υδρόφοβου πυρήνα β πτυχώσεων της υπομονάδας. Παρατηρήθηκε η είσοδος μορίων νερού στο εσωτερικό της κοιλότητας, τα οποία σταθεροποιήθηκαν με δεσμούς υδρογόνου από τα συντηρημένα υδρόφιλα κατάλοιπα Thr52, Asn94 και Ser126. Έχει προταθεί ότι τα συγκεκριμένα μόρια νερού εμπλέκονται στο μηχανισμό ανοίγματος του ιοντικού καναλιού του nachr. Τα παραπάνω ευρήματα συνεισφέρουν στην περαιτέρω κατανόηση του τρόπου δέσμευσης ανταγωνιστών στον ανθρώπινο nachr. Η γνώση αυτή μπορεί να αξιοποιηθεί για το σχεδιασμό φαρμακευτικών αναστολέων με μεγάλη συγγένεια για την αντιμετώπιση των πολλών παθολογικών καταστάσεων στις οποίες εμπλέκεται ο υποδοχέας αυτός. Επίσης η εργασία αυτή δείχνει ότι οι υπολογιστικές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη δομική μελέτη βιομορίων για τις οποίες δεν υπάρχει πειραματικά υπολογισμένη δομή. Η δυνατότητα προσομοίωσης της δυναμικής συμπεριφοράς των βιομορίων και των αλληλεπιδράσεών τους με άλλα βιομόρια είναι εφικτή μέσω της Μοριακής Δυναμικής. Οι μελλοντικές προοπτικές στη μελέτη αυτή είναι η διερεύνηση της πρόσδεσης τοξινών στην ακέραια πενταμερής ΕΚΠ του υποδοχέα, ώστε να μελετηθεί η επίδραση της συμπληρωματικής πλευράς πρόσδεσης. Στην περίπτωση αυτή θα ήταν ενδιαφέρον επίσης να μελετηθεί η επίδραση της γλυκοζυλίωσης όχι μόνο της α1 υπομονάδας αλλά 106

121 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση και των υπόλοιπων που συμμετέχουν στη συγκρότηση του μυϊκού τύπου nachr. Τα πρώτα βήματα που έχουν πραγματοποιηθεί προς αυτήν την κατεύθυνση είναι η δημιουργία υπολογιστικών μοντέλων για τις ΕΚΠ των υπομονάδων β1, δ και ε του ανθρώπινου nachr και η συγκρότησή τους σε πενταμερές. 107

122 Δ. Αποτελέσματα Συζήτηση 108

123 Ενότητα Ε Πειραματικό Μέρος

124

125 Ε. Πειραματικό Μέρος Ε.1. Δημιουργία αρχικών μοντέλων Ε.1.1. Προσομοίωση μέσω ομολογίας της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου nachr Η τρισδιάστατη δομή του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (nachr) δεν έχει επιλυθεί με κάποια πειραματική μέθοδο και επομένως δεν είναι διαθέσιμη στη βάση δεδομένων Protein Data Bank ( [207]. Για το λόγο αυτό μια δομική μελέτη πάνω στον ανθρώπινο nachr πρέπει να βασιστεί σε ένα υπολογιστικό μοντέλο. Το μοντέλο αυτό μπορεί να δημιουργηθεί με προσομοίωση μέσω ομολογίας, καθώς διάφορες τρισδιάστατες δομές του nachr [58,90] ή της ομόλογης AChBP [82 89] είναι διαθέσιμες σε υψηλή διακριτικότητα. Για το μοντέλου της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου nachr επιλέχτηκε ως εκμαγείο η δομή της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του nachr ποντικού συμπλεγμένη με την τοξίνη α μπουγκαροτοξίνη (α Btx), που έχει επιλυθεί με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ σε διακριτικότητα 1,94 Å. [58] Η επιλογή της δομής αυτής έγινε με κριτήριο την υψηλή ομολογία μεταξύ της α1 ΕΚΠ ανθρώπου και ποντικού (95%) και την υψηλή διακριτικότητα (1,94 Å) της τρισδιάστατης δομής αυτής. Εικόνα Ε1. Αντιστοίχιση αλληλουχίας των ΕΚΠ (α.α ) των nachr α1 υπομονάδων ανθρώπου και ποντικού. Από την βάση δεδομένων Swiss Prot ( [208] ανακτήθηκαν οι αμινοξικές αλληλουχίες της nachr α1 υπομονάδας ποντικού (n. P04756) και ανθρώπου (n. P02708). Από αυτές επιλέχτηκαν τα τμήματα που αντιστοιχούν στην 111

126 Ε. Πειραματικό Μέρος εξωκυττάρια περιοχή (210 αμινοξέα) και πραγματοποιήθηκε αντιστοίχιση της αλληλουχίας τους με χρήση του αλγορίθμου ClustalW2. [209] Όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως, η ύπαρξη υψηλής ομολογίας είναι απαραίτητη για τη δημιουργία ενός ορθού μοντέλου με συγκριτική προσομοίωση ( Β.1.2.). Η αντιστοίχιση έδειξε ποσοστό ταυτότητας ίσο με 95% (Εικόνα Ε1). Με βάση αυτήν την αντιστοίχιση δημιουργήθηκε το δομικό μοντέλο της α1 ΕΚΠ του ανθρώπινου nachr, χρησιμοποιώντας τη δομή της nachr α1 ΕΚΠ ποντικού (PDB ID: 2QC1) [58] ως εκμαγείο. Πρέπει να σημειωθεί ότι η δομή 2QC1 δεν είναι η φυσική ακολουθία της α1 ΕΚΠ ποντικού αλλά ένα τριπλό μετάλλαγμα (Val8Glu, Trp149Arg, Val155Ala), που ονομάζεται α211. Το μετάλλαγμα αυτό παρουσιάζει μεγάλη διαλυτότητα και για το λόγο αυτό έγινε δυνατή η κρυστάλλωσή του. Για τη δημιουργία του μοντέλου χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα MODELLER v7.2. [151] Από τα είκοσι μοντέλα που παράχθηκαν από το πρόγραμμα επιλέχτηκε αυτό με τη χαμηλότερη τιμή της συνάρτησης ενέργειας (target function). Το επιλεγμένο μοντέλο αξιολογήθηκε ως προς την ορθότητά του με τα λογισμικά PROCHECK [195] και PROVE [196] μέσω του διακομιστή Structural Analysis and Verification Server (SAVES). [194] Ο έλεγχος έδειξε το επιθυμητό αποτελέσμα όσον αφορά την υψηλή ποιότητα και ορθότητα του υπολογισμένου μοντέλου ( Δ.1.1). Ε.1.2. Δημιουργία συμπλόκων της α1 υπομονάδας με α νευροτοξίνες και προσθήκη υδατανθρακικής αλυσίδας Το μοντέλο της α1 ΕΚΠ του ανθρώπινου nachr και η δομή εκμαγείο, το σύμπλοκο της α1 ΕΚΠ από nachr ποντικού με την α Btx (PDB ID: 2QC1), συγκρίθηκαν με υπέρθεση δομών. Η απόκλιση των δύο δομών μεταξύ τους (RMSD) ήταν ίση με 0,37 Å. Από την κρυσταλλογραφική δομή 2QC1 αποκτήθηκαν οι ατομικές συντεταγμένες της α Btx και χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία ενός μοντέλου της ανθρώπινης α1 ΕΚΠ με προσδεμένη την τοξίνη αυτή. Με τον ίδιο τρόπο αποκτήθηκαν οι ατομικές συντεταγμένες και της συνδεδεμένης με το κατάλοιπο Asn141 υδατανθρακικής αλυσίδας της 2QC1, και χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία ενός μοντέλου της γλυκοζυλιωμένης ανθρώπινης α1 ΕΚΠ, προσδεμένη με την τοξίνη α Btx. Η σύσταση και ο τρόπος σύνδεσης της υδατανθρακικής αλυσίδας δίνονται στην Εικόνα Ε2. 112

127 Ε. Πειραματικό Μέρος Εικόνα Ε2. Σχηματική αναπαράσταση της υδατανθρακικής αλυσίδας της κρυσταλλογραφικής δομής της nachr α1 ΕΚΠ ποντικού. Από την κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου της L AChBP με την α κομπρατοξίνη (α Cbtx) (PDB ID: 1YI5) [87] ανακτήθηκαν οι ατομικές συντεταγμένες της τοξίνης α Cbtx (αλυσίδα F στο PDB αρχείο συντεταγμένων). Για να καθοριστεί η θέση δέσμευσης της α Cbtx στο μοντέλο της ανθρώπινης α1 ΕΚΠ, πραγματοποιήθηκε υπέρθεση της α Cbtx με την α Btx, όπως αυτή βρίσκεται στο σύμπλοκο με την nachr α1 ΕΚΠ ποντικού. Η υπέρθεση έγινε με τη ρουτίνα MultiSeq του προγράμματος απεικόνισης VMD [197] και απεικονίζεται στην Εικόνα Ε3. Ομοίως με παραπάνω, δημιουργήθηκαν δύο μοντέλα της α1 ΕΚΠ του ανθρώπινου nachr σε σύμπλοκο με την α Cbtx, το ένα με την υδατανθρακική αλυσίδα και το άλλο χωρίς αυτήν. Τέλος, για λόγους ομοιομορφίας δημιουργήθηκε ένα μοντέλο της nachr α1 ΕΚΠ ποντικού σε σύμπλοκο με την α Btx χωρίς την υδατανθρακική αλυσίδα. Αυτό έγινε με αφαίρεση των ατομικών συντεταγμένων των σακχάρων από τη δομή 2QC1. 113

128 Ε. Πειραματικό Μέρος Εικόνα Ε3. (Α) Υπέρθεση της α Cbtx (μπλε) και της α Btx (κόκκινο), όπως βρίσκονται στις κρυσταλλογραφικές δομές 1YI5 και 2QC1, αντίστοιχα. Σημειώνονται τα Ν και C τελικά άκρα. (Β) Γραφική παράσταση του RMSD κάθε αμινοξέος της α Btx ως προς την α Cbtx. Ε.1.3. Δημιουργία συμπλόκων της α1 υπομονάδας με α κωνοτοξίνες Από την κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου της A AChBP με την α κωνοτοξίνη ImI (α Ctx ImI) (PDB ID: 2C9T) [88] ανακτήθηκαν οι ατομικές συντεταγμένες της τοξίνης α Ctx ImI (αλυσίδα F στο PDB αρχείο συντεταγμένων). Για τις ατομικές συντεταγμένες της α κωνοτοξίνης α Ctx GI επιλέχτηκε η οικογένεια NMR δομών με PDB ID: 1XGA. [193] Για να καθοριστούν οι θέσεις δέσμευσης των δύο αυτών τοξινών στο μοντέλο της ανθρώπινης α1 ΕΚΠ χρησιμοποιήθηκε η διαδικασία της προσομοίωσης πρόσδεσης. Η προσομοίωση πρόσδεσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην περίπτωση των α κωνοτοξινών λόγω του μικρού τους μεγέθους (13 αμινοξέα για την α Ctx ImI και

129 Ε. Πειραματικό Μέρος αμινοξέα για την α Ctx GI), σε αντίθεση με τα μεγάλα μόρια των α νευροτοξινών. Για τους υπολογισμούς προσομοίωσης πρόσδεσης χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό AutoDock 3.05 [157] και για την ανάλυση των αποτελεσμάτων το πρόγραμμα AutoDockTools. [210] Υπολογίστηκαν οι χάρτες πλέγματος με 81 x 81 x 81 σημεία πλέγματος (grid points) απόστασης 0,375 Å, χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα AutoGrid 3.0. Τα πλέγματα τοποθετήθηκαν στο σημείο πρόσδεσης υποκαταστατών της α1 υπομονάδας, που περιβάλλεται από τις θηλιές Α, Β και C. Όλοι οι δεσμοί των τοξινών θεωρήθηκαν άκαμπτοι (rigid docking). Για τους υπολογισμούς χρησιμοποιήθηκαν ο Λαμαρκιανός Γενετικός Αλγόριθμος (Lamarckian Genetic Algorithm LGA) με τις παραμέτρους που φαίνονται στον Πίνακα Ε1. Πίνακας Ε1. Οι παράμετροι που χρησιμοποιήθηκαν για τους υπολογισμούς προσομοίωσης πρόσδεσης των α κωνοτοξινών. Παράμετροι AutoDock Τιμές Κύκλοι 100 Βήμα μετατόπισης (translation step size) Βήμα προσανατολισμού/στρέψης (Orientation/torsion step size) 0,2 Å Πληθυσμός (Individual population size) 150 Μέγιστος αριθμός αποτίμησης ενέργειας (maximum number of energy evaluations) Μέγιστος αριθμός γενεών (maximum number of generations) Ρυθμός ελιτισμού (elitism value) 1,0 50,0 deg 2, Ρυθμός μετάλλαξης (mutation rate) 0,02 Ρυθμός διασταύρωσης (crossover rate) 0,80 Όριο ομαδοποίησης (cluster tolerance) 1,5 Å Από τις τελικές διαμορφώσεις επιλέχτηκε η καλύτερη από ενεργειακής άποψης για κάθε τοξίνη. Η διαμόρφωση αυτή χρησιμοποιήθηκε στις μετέπειτα προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής. Πρέπει να σημειωθεί ότι στα μοντέλα των δύο α κωνοτοξινών δεν προστέθηκε η υδατανθρακική αλυσίδα που είναι συνδεδεμένη με το κατάλοιπο Asn141 της α1 ΕΚΠ. Αυτό έγινε διότι η θέση των σακχάρων απέχει πολύ από τη θέση δέσμευσης των τοξινών αυτών, λόγω του μικρού μεγέθους τους. 115

130 Ε. Πειραματικό Μέρος Ε.2. Μοριακή Δυναμική Ε.2.1. Προετοιμασία των δομικών μοντέλων για προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής Από τις αρχικές δομές όλων των μοντέλων απομακρύνθηκαν όλα τα κρυσταλλογραφικά μόρια νερού. Τα άτομα υδρογόνου καθώς και τυχόν βαρέα άτομα που έλειπαν από της κρυσταλλογραφικές δομές προστέθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα xleap του λογισμικού πακέτου AMBER 9. [211] Όλα τα βασικά αμινοξικά κατάλοιπα τέθηκαν ως πρωτονιομένα ενώ όλα τα όξινα κατάλοιπα ως αποπρωτονιομένα. Οι ιστιδίνες εξετάστηκαν μία προς μία μελετώντας τη δυνατότητα σχηματισμού δεσμού υδρογόνου με τα γειτονικά τους κατάλοιπα και λαμβάνοντας υπ όψη τις τιμές του pka που υπολόγισε για την καθεμία το πρόγραμμα H++ μέσω του ιστοσελίδας του. [212] Συγκεκριμένα, τα κατάλοιπα His79, His115, και His134 της α1 ΕΚΠ, το κατάλοιπο His4 της α Btx και το κατάλοιπο His18 της α Cbtx ορίστηκαν πρωτονιομένα στο άτομο Ν δ1, ενώ τα κατάλοιπα His3, His25, His186 και His204 της α1 ΕΚΠ και το κατάλοιπο His68 της α Btx ορίστηκαν πρωτονιομένα στο άτομο Ν ε2. Στα πρωτεϊνικά άτομα εφαρμόστηκε το βελτιωμένο πεδίο δυνάμεων για πρωτεϊνικό σκελετό του AMBER, το ff99sb, [174,213] ενώ στα άτομα της υδατανθρακικής αλυσίδας εφαρμόστηκε το πεδίο δυνάμεων GLYCAM06. [214] Το σύστημα υποβλήθηκε σε ελαχιστοποίηση ενέργειας με σκοπό την εκτόνωση και χαλάρωση των μοντέλων από την «τεταμένη» δομή που παγιώθηκε κατά την κρυστάλλωση. Η ελαχιστοποίηση ενέργειας έγινε με το πρόγραμμα SANDER του λογισμικού πακέτου AMBER 9 [211] και πραγματοποιήθηκε σε τρία στάδια. Στο πρώτο στάδιο πραγματοποιήθηκαν 1000 βήματα για τη χαλάρωση μόνο των ατόμων υδρογόνου, χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο απότομης κλίσης (steepest descent algorithm). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν 1000 βήματα με τη μέθοδο συζευγμένου ανύσματος (conjugate gradient) θέτοντας αρμονικούς περιορισμούς θέσεως σε όλα τα Α άτομα άνθρακα (Cα) με μια σταθερά ισχύος 50 kcal mol 1 Å 2. Τέλος πραγματοποιήθηκαν 3000 βήματα μη περιορισμένης ελαχιστοποίησης. Το γενικευμένο μοντέλο ενυδάτωσης Born (GB HCT ) [188] εφαρμόστηκε κατά τη διάρκεια της ελαχιστοποίησης, με αποκοπή των μη δεσμικών αλληλεπιδράσεων 116

131 Ε. Πειραματικό Μέρος όταν αυτές αναπτύσσονται μεταξύ ατόμων που βρίσκονται σε απόσταση μεγαλύτερη από 16 Å. Ε.2.2. Προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής Οι προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής διαμοιράστηκαν και πραγματοποιήθηκαν παράλληλα μεταξύ ενός ισχυρού υπολογιστικού συστήματος τύπου Apple Mac Pro (Quad Core), δύο σταθμών εργασίας ΗP xw8200 Linux (Intel Xeon Dual Core, CPU 3.2 GHz) και τριών σταθμών εργασίας ΗP xw4100 Linux (P4, CPU 3.2 GHz). Οι προσομοιώσεις πραγματοποιήθηκαν με το πρόγραμμα PMEMD του λογισμικού πακέτου AMBER 9. [211] Τα μοντέλα των συμπλόκων υποδοχέα τοξίνης τοποθετήθηκαν σε ένα ισομετρικό οκτάεδρο δοχείο με μόρια νερού, που αναπαρίστανται με το μοντέλο TIP3Ρ. [182] Η παρουσία του νερού συμβάλει ώστε να δημιουργηθεί ένα κατά προσέγγιση φυσιολογικό υδατικό περιβάλλον, που να προσομοιάζει όσο το δυνατόν καλύτερα τις in vivo συνθήκες. Προστέθηκαν επίσης αντισταθμιστικά ιόντα για να εξουδετερωθεί το φορτίο του κάθε συμπλόκου, καθώς τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιήθηκαν στις προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής απαιτούν την ύπαρξη ουδέτερου συστήματος. Η συμπεριφορά των μορίων κοντά στα όρια του κουτιού αναπαραστάθηκε με την εφαρμογή περιοδικών οριακών συνθηκών (periodic boundary conditions PBC), [190] και χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος particle mesh Ewald (PME) για τον υπολογισμό των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων μεγάλου εύρους, με όριο μεγέθους 8 Å για τις αλληλεπιδράσεις μικρού εύρους (van der Waals). [186,215] Η ρουτίνα SHAKE χρησιμοποιήθηκε για τον περιορισμό όλων των δεσμών που περιελάμβαναν άτομα υδρογόνου. [216] Ο έλεγχος της θερμοκρασίας και της πίεσης του συστήματος έγινε με έναν αλγόριθμο του Berendsen, με σταθερά σύζευξης ίση με 1 ps και για τα δύο μεγέθη. [173] Για την εξισορρόπηση της θερμοκρασίας και της πίεσης του συστήματος και για την βελτιστοποίηση της θέσης των μορίων του διαλύτη πραγματοποιήθηκαν τα εξής προκαταρτικά στάδια προσομοίωσης: 1) Ελαχιστοποίηση ενέργειας για 1000 βήματα με τη μέθοδο απότομης κλίσης (steepest descent) θέτοντας αρμονικούς περιορισμούς θέσεως σε όλα τα πρωτεϊνικά άτομα με σταθερά ισχύος 50 kcal mol 1 Å

132 Ε. Πειραματικό Μέρος 2) Προσομοίωση σε κανονική κατανομή (NVT) σε θερμοκρασία 300Κ για 30 ps, διατηρώντας τους περιορισμούς στα πρωτεϊνικά άτομα. 3) Δεύτερη ελαχιστοποίηση ενέργειας για 1000 βήματα θέτοντας αρμονικούς περιορισμούς θέσεως μόνο στα πρωτεϊνικά Α άτομα άνθρακα (Cα) αυτή τη φορά, με σταθερά ισχύος 10 kcal mol 1 Å 2. 4) Έξι στάδια προσομοίωσης σε κανονική κατανομή (NVT) διάρκειας 5 ps το καθένα, στα οποία η θερμοκρασία αυξήθηκε σταδιακά στα 300Κ, με αρμονικούς περιορισμούς θέσεως σε όλα τα πρωτεϊνικά άτομα με σταθερά ισχύος 10 kcal mol 1 Å 2. 5) Προσομοίωση σε κανονική κατανομή (NVT) σε θερμοκρασία 300Κ για 20 ps, κατά τη διάρκεια της οποίας απομακρύνθηκαν σταδιακά όλοι οι περιορισμοί. 6) Προσομοίωση σε ισόθερμη ισοβαρή κατανομή (NPT) για 150 ps, ώστε η πυκνότητα του συστήματος να αυξηθεί σε 1,0 g cm 3. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν οι παραγωγικές προσομοιώσεις, υπό κανονικές συνθήκες (θερμοκρασία 300Κ, πίεση 1 atm) σε ισόθερμη ισοβαρή κατανομή (NPT). Οι προσομοιώσεις έγιναν σε στάδια χρονικής διάρκειας 5 ns, στο τέλος των οποίων ελεγχόταν η κατάσταση του κάθε συστήματος. Για τα σύμπλοκα της α1 ΕΚΠ με α Btx και α Cbtx ο συνολικός χρόνος προσομοίωσης ήταν 20 ns (Πίνακας Ε2). Για το σύμπλοκο με α Ctx ImI και για το σύμπλοκο με α Ctx GI, προσομοιώσεις διάρκειας 15 και 10 ns αντίστοιχα κρίθηκαν αρκετές για τη μελέτη τους, καθώς η α Ctx ImI δεν παρουσιάζει συγγένεια για την α1 υπομονάδα, ενώ η προβλεπόμενη πρόσδεση της α Ctx GI δεν συμφωνεί με τα υπάρχοντα βιολογικά δεδομένα. Η κίνηση του κέντρου μάζας του συστήματος εκμηδενιζόταν κάθε 1000 βήματα, ενώ οι τροχιές (trajectories) διαμορφώθηκαν καταγράφοντας τις ατομικές συντεταγμένες ολόκληρου του συστήματος κάθε 500 βήματα. Για να αποτιμηθεί η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων, όλες οι προσομοιώσεις πραγματοποιήθηκαν για δεύτερη φορά από το τέταρτο στάδιο εξισορρόπησης (βλ. παραπάνω), ξεκινώντας από διαφορετική αρχική κατανομή ταχυτήτων. Στην περίπτωση της κρυσταλλογραφικής δομής της α1 ΕΚΠ ποντικού προσδεμένη με α Btx η δεύτερη προσομοίωση πραγματοποιήθηκε παρουσία των αρχικών μορίων νερού που υπήρχαν στην κατατεθειμένη δομή (PDB ID: 2QC1). Τα αποτελέσματα των δεύτερων προσομοιώσεων επιβεβαίωσαν την επαναληψιμότητα των παρατηρήσεων. 118

133 Ε. Πειραματικό Μέρος Η επεξεργασία των δεδομένων των προσομοιώσεων μοριακής δυναμικής έγινε από το πρόγραμμα ptraj του λογισμικού πακέτου AMBER 9, [211] και η ανάλυσή τους έγινε με τη ρουτίνα VMD [197] Προκειμένου να αναγνωριστούν σημαντικές μοριακές αλληλεπιδράσεις στα σύμπλοκα πραγματοποιήθηκε ανάλυση των τροχιών των προσομοιώσεων εξάγοντας τα γεωμετρικά τους χαρακτηριστικά (αποστάσεις και γωνίες) ως συνάρτηση του χρόνου προσομοίωσης. Τα διαγράμματα της μεταβολής της μέσης απόκλισης της θέσης των ατόμων από την αρχική τους θέση (RMSD) ως προς το χρόνο και των διακυμάνσεων της θέσης των ατόμων από τη μέση τιμή τους (RMSF) ανά αμινοξύ δίνονται στο Παράρτημα (Εικόνες Ζ1 και Ζ2). Πίνακας Ε2. Σύνοψη των προσομοιώσεων μοριακής δυναμικής που πραγματοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Υποδοχέας Φορτίο Τοξίνη Φορτίο Υδατανθρακική αλυσίδα Χρόνος (ns) α1 ΕΚΠ ποντικού 7 α Btx +3 Όχι 2 20 α1 ΕΚΠ ποντικού 7 α Btx +3 Ναι 2 20 α1 ΕΚΠ ανθρώπου 7 α Btx +3 Όχι 2 20 α1 ΕΚΠ ανθρώπου 7 α Btx +3 Ναι 2 20 α1 ΕΚΠ ανθρώπου 7 α Cbtx +2 Όχι 2 20 α1 ΕΚΠ ανθρώπου 7 α Cbtx +2 Ναι 2 20 α1 ΕΚΠ ανθρώπου 7 α Ctx ImI +1 Όχι 2 x 15 α1 ΕΚΠ ανθρώπου 7 α Ctx GI 0 Όχι 2 x 10 Στην μελέτη των δεσμών υδρογόνου χρησιμοποιήθηκε ένα ανώτατο επιτρεπτό όριο 3.4 Å για τις αποστάσεις και 120 μοίρες για τις γωνίες. Οι υδροφοβικές επαφές που καταγράφτηκαν αφορούν άτομα άνθρακα που απέχουν μεταξύ τους λιγότερο από 4.0 Å. Μελετήθηκαν μόνο οι αλληλεπιδράσεις που διατηρούνται για περισσότερο από το μισό 119

134 Ε. Πειραματικό Μέρος χρόνο προσομοίωσης ΜΔ, ενώ για τις επαφές διαμέσου μορίων νερού μελετήθηκαν μόνο αυτές που παρατηρήθηκαν τουλάχιστον στο 25% των τροχιών. 120

135 Ενότητα ΣΤ Βιβλιογραφία

136

137 ΣΤ. Βιβλιογραφία ΣΤ. Βιβλιογραφία 1. Maricq, A. V.; Peterson, A. S.; Brake, A. J.; Myers, R. M.; Julius, D.; Primary structure and functional expression of the 5HT3 receptor, a serotonin gated ion channel. Science 1991, 254 (5030), Grenningloh, G.; Gundelfinger, E.; Schmitt, B.; Betz, H.; Darlison, M. G.; Barnard, E. A.; Schofield, P. R.; Seeburg, P. H.; Glycine vs GABA receptors. Nature 1987, 330 (6143), Schofield, P. R.; Darlison, M. G.; Fujita, N.; Burt, D. R.; Stephenson, F. A.; Rodriguez, H.; Rhee, L. M.; Ramachandran, J.; Reale, V.; Glencorse, T. A.; et al.; Sequence and functional expression of the GABA A receptor shows a ligand gated receptor super family. Nature 1987, 328 (6127), Le Novere, N.; Grutter, T.; Changeux, J. P.; Models of the extracellular domain of the nicotinic receptors and of agonist and Ca2+ binding sites. Proc Natl Acad Sci U S A 2002, 99 (5), Le Novere, N.; Changeux, J. P.; The Ligand Gated Ion Channel Database. Nucleic Acids Res 1999, 27 (1), Karlin, A.; Akabas, M. H.; Toward a structural basis for the function of nicotinic acetylcholine receptors and their cousins. Neuron 1995, 15 (6), Changeux, J. P.; Edelstein, S. J.; Allosteric mechanisms of signal transduction. Science 2005, 308 (5727), Arias, H. R.; Bhumireddy, P.; Bouzat, C.; Molecular mechanisms and binding site locations for noncompetitive antagonists of nicotinic acetylcholine receptors. Int J Biochem Cell Biol 2006, 38 (8), Betz, H.; Ligand gated ion channels in the brain: the amino acid receptor superfamily. Neuron 1990, 5 (4), Ortells, M. O.; Lunt, G. G.; Evolutionary history of the ligand gated ion channel superfamily of receptors. Trends Neurosci 1995, 18 (3), Wess, J.; Molecular biology of muscarinic acetylcholine receptors. Crit Rev Neurobiol 1996, 10 (1), Ishii, M.; Kurachi, Y.; Muscarinic acetylcholine receptors. Curr Pharm Des 2006, 12 (28), Martinou, J. C.; Falls, D. L.; Fischbach, G. D.; Merlie, J. P.; Acetylcholine receptor inducing activity stimulates expression of the epsilon subunit gene of the muscle acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1991, 88 (17), Missias, A. C.; Chu, G. C.; Klocke, B. J.; Sanes, J. R.; Merlie, J. P.; Maturation of the acetylcholine receptor in skeletal muscle: regulation of the AChR gamma to epsilon switch. Dev Biol 1996, 179 (1), Bouzat, C.; Bren, N.; Sine, S. M.; Structural basis of the different gating kinetics of fetal and adult acetylcholine receptors. Neuron 1994, 13 (6), Mishina, M.; Takai, T.; Imoto, K.; Noda, M.; Takahashi, T.; Numa, S.; Methfessel, C.; Sakmann, B.; Molecular distinction between fetal and adult forms of muscle acetylcholine receptor. Nature 1986, 321 (6068), Schuetze, S. M.; Vicini, S.; Apparent acetylcholine receptor channel conversion at individual rat soleus end plates in vitro. J Physiol 1986, 375, Lindstrom, J. M.; Acetylcholine receptors and myasthenia. Muscle Nerve 2000, 23 (4), Sine, S. M.; Claudio, T.; Gamma and delta subunits regulate the affinity and the cooperativity of ligand binding to the acetylcholine receptor. J Biol Chem 1991, 266 (29), Blount, P.; Merlie, J. P.; Molecular basis of the two nonequivalent ligand binding sites of the muscle nicotinic acetylcholine receptor. Neuron 1989, 3 (3), Ackermann, E. J.; Taylor, P.; Nonidentity of the alpha neurotoxin binding sites on the nicotinic acetylcholine receptor revealed by modification in alpha neurotoxin and receptor structures. Biochemistry 1997, 36 (42), Sine, S. M.; Kreienkamp, H. J.; Bren, N.; Maeda, R.; Taylor, P.; Molecular dissection of subunit interfaces in the acetylcholine receptor: identification of determinants of alpha conotoxin M1 selectivity. Neuron 1995, 15 (1), Miyazawa, A.; Fujiyoshi, Y.; Stowell, M.; Unwin, N.; Nicotinic acetylcholine receptor at 4.6 A resolution: transverse tunnels in the channel wall. J Mol Biol 1999, 288 (4), Conti Fine, B. M.; Milani, M.; Kaminski, H. J.; Myasthenia gravis: past, present, and future. J Clin Invest 2006, 116 (11),

138 ΣΤ. Βιβλιογραφία 25. McGehee, D. S.; Role, L. W.; Physiological diversity of nicotinic acetylcholine receptors expressed by vertebrate neurons. Annu Rev Physiol 1995, 57, Plazas, P. V.; Katz, E.; Gomez Casati, M. E.; Bouzat, C.; Elgoyhen, A. B.; Stoichiometry of the alpha9alpha10 nicotinic cholinergic receptor. J Neurosci 2005, 25 (47), Picciotto, M. R.; Zoli, M.; Rimondini, R.; Lena, C.; Marubio, L. M.; Pich, E. M.; Fuxe, K.; Changeux, J. P.; Acetylcholine receptors containing the beta2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature 1998, 391 (6663), Marubio, L. M.; del Mar Arroyo Jimenez, M.; Cordero Erausquin, M.; Lena, C.; Le Novere, N.; de Kerchove d'exaerde, A.; Huchet, M.; Damaj, M. I.; Changeux, J. P.; Reduced antinociception in mice lacking neuronal nicotinic receptor subunits. Nature 1999, 398 (6730), Lindstrom, J.; Nicotinic acetylcholine receptors in health and disease. Mol Neurobiol 1997, 15 (2), Conroy, W. G.; Berg, D. K.; Neurons can maintain multiple classes of nicotinic acetylcholine receptors distinguished by different subunit compositions. J Biol Chem 1995, 270 (9), Sine, S. M.; Bren, N.; Quiram, P. A.; Molecular dissection of subunit interfaces in the nicotinic acetylcholine receptor. J Physiol Paris 1998, 92 (2), Frazier, C. J.; Buhler, A. V.; Weiner, J. L.; Dunwiddie, T. V.; Synaptic potentials mediated via alphabungarotoxin sensitive nicotinic acetylcholine receptors in rat hippocampal interneurons. J Neurosci 1998, 18 (20), Breese, C. R.; Adams, C.; Logel, J.; Drebing, C.; Rollins, Y.; Barnhart, M.; Sullivan, B.; Demasters, B. K.; Freedman, R.; Leonard, S.; Comparison of the regional expression of nicotinic acetylcholine receptor alpha7 mrna and [125I] alpha bungarotoxin binding in human postmortem brain. J Comp Neurol 1997, 387 (3), Chen, D.; Patrick, J. W.; The alpha bungarotoxin binding nicotinic acetylcholine receptor from rat brain contains only the alpha7 subunit. J Biol Chem 1997, 272 (38), Kawai, H.; Zago, W.; Berg, D. K.; Nicotinic alpha 7 receptor clusters on hippocampal GABAergic neurons: regulation by synaptic activity and neurotrophins. J Neurosci 2002, 22 (18), Romano, S. J.; Pugh, P. C.; McIntosh, J. M.; Berg, D. K.; Neuronal type acetylcholine receptors and regulation of alpha 7 gene expression in vertebrate skeletal muscle. J Neurobiol 1997, 32 (1), Wang, H.; Yu, M.; Ochani, M.; Amella, C. A.; Tanovic, M.; Susarla, S.; Li, J. H.; Yang, H.; Ulloa, L.; Al Abed, Y.; Czura, C. J.; Tracey, K. J.; Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature 2003, 421 (6921), Elgoyhen, A. B.; Johnson, D. S.; Boulter, J.; Vetter, D. E.; Heinemann, S.; Alpha 9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell 1994, 79 (4), Seguela, P.; Wadiche, J.; Dineley Miller, K.; Dani, J.; Patrick, J.; Molecular cloning, functional properties, and distribution of rat brain alpha 7: a nicotinic cation channel highly permeable to calcium. J. Neurosci. 1993, 13 (2), Gerzanich, V.; Anand, R.; Lindstrom, J.; Homomers of alpha 8 and alpha 7 subunits of nicotinic receptors exhibit similar channel but contrasting binding site properties. Mol Pharmacol 1994, 45 (2), Gotti, C.; Fornasari, D.; Clementi, F.; Human neuronal nicotinic receptors. Prog Neurobiol 1997, 53 (2), Gotti, C.; Zoli, M.; Clementi, F.; Brain nicotinic acetylcholine receptors: native subtypes and their relevance. Trends Pharmacol Sci 2006, 27 (9), Noda, M.; Takahashi, H.; Tanabe, T.; Toyosato, M.; Furutani, Y.; Hirose, T.; Asai, M.; Inayama, S.; Miyata, T.; Numa, S.; Primary structure of alpha subunit precursor of Torpedo californica acetylcholine receptor deduced from cdna sequence. Nature 1982, 299 (5886), Noda, M.; Takahashi, H.; Tanabe, T.; Toyosato, M.; Kikyotani, S.; Hirose, T.; Asai, M.; Takashima, H.; Inayama, S.; Miyata, T.; Numa, S.; Primary structures of beta and delta subunit precursors of Torpedo californica acetylcholine receptor deduced from cdna sequences. Nature 1983, 301 (5897), Claudio, T.; Ballivet, M.; Patrick, J.; Heinemann, S.; Nucleotide and deduced amino acid sequences of Torpedo californica acetylcholine receptor gamma subunit. Proc Natl Acad Sci U S A 1983, 80 (4),

139 ΣΤ. Βιβλιογραφία 46. Noda, M.; Takahashi, H.; Tanabe, T.; Toyosato, M.; Kikyotani, S.; Furutani, Y.; Hirose, T.; Takashima, H.; Inayama, S.; Miyata, T.; Numa, S.; Structural homology of Torpedo californica acetylcholine receptor subunits. Nature 1983, 302 (5908), Nef, P.; Mauron, A.; Stalder, R.; Alliod, C.; Ballivet, M.; Structure linkage, and sequence of the two genes encoding the delta and gamma subunits of the nicotinic acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1984, 81 (24), Nef, P.; Oneyser, C.; Alliod, C.; Couturier, S.; Ballivet, M.; Genes expressed in the brain define three distinct neuronal nicotinic acetylcholine receptors. EMBO J 1988, 7 (3), LaPolla, R. J.; Mayne, K. M.; Davidson, N.; Isolation and characterization of a cdna clone for the complete protein coding region of the delta subunit of the mouse acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1984, 81 (24), Boulter, J.; Evans, K.; Goldman, D.; Martin, G.; Treco, D.; Heinemann, S.; Patrick, J.; Isolation of a cdna clone coding for a possible neural nicotinic acetylcholine receptor alpha subunit. Nature 1986, 319 (6052), Claudio, T.; Paulson, H. L.; Green, W. N.; Ross, A. F.; Hartman, D. S.; Hayden, D.; Fibroblasts transfected with Torpedo acetylcholine receptor beta, gamma, and delta subunit cdnas express functional receptors when infected with a retroviral alpha recombinant. J Cell Biol 1989, 108 (6), Raftery, M. A.; Hunkapiller, M. W.; Strader, C. D.; Hood, L. E.; Acetylcholine receptor: complex of homologous subunits. Science 1980, 208 (4451), Hucho, F.; Tsetlin, V. I.; Machold, J.; The emerging three dimensional structure of a receptor. The nicotinic acetylcholine receptor. Eur J Biochem 1996, 239 (3), Sargent, P. B.; The diversity of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Annu Rev Neurosci 1993, 16, Boulter, J.; O'Shea Greenfield, A.; Duvoisin, R. M.; Connolly, J. G.; Wada, E.; Jensen, A.; Gardner, P. D.; Ballivet, M.; Deneris, E. S.; McKinnon, D.; et al.; Alpha 3, alpha 5, and beta 4: three members of the rat neuronal nicotinic acetylcholine receptor related gene family form a gene cluster. J Biol Chem 1990, 265 (8), Stroud, R. M.; McCarthy, M. P.; Shuster, M.; Nicotinic acetylcholine receptor superfamily of ligandgated ion channels. Biochemistry 1990, 29 (50), Kao, P. N.; Karlin, A.; Acetylcholine receptor binding site contains a disulfide cross link between adjacent half cystinyl residues. J Biol Chem 1986, 261 (18), Dellisanti, C. D.; Yao, Y.; Stroud, J. C.; Wang, Z. Z.; Chen, L.; Crystal structure of the extracellular domain of nachr alpha1 bound to alpha bungarotoxin at 1.94 Å resolution. Nat Neurosci 2007, 10 (8), Mattson, C.; Heilbronn, E.; The nicotinic acetylcholine receptor; a glycoprotein. J Neurochem 1975, 25 (6), Nomoto, H.; Takahashi, N.; Nagaki, Y.; Endo, S.; Arata, Y.; Hayashi, K.; Carbohydrate structures of acetylcholine receptor from Torpedo californica and distribution of oligosaccharides among the subunits. Eur J Biochem 1986, 157 (2), Poulter, L.; Earnest, J. P.; Stroud, R. M.; Burlingame, A. L.; Structure, oligosaccharide structures, and posttranslationally modified sites of the nicotinic acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1989, 86 (17), Shoji, H.; Takahashi, N.; Nomoto, H.; Ishikawa, M.; Shimada, I.; Arata, Y.; Hayashi, K.; Detailed structural analysis of asparagine linked oligosaccharides of the nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica. Eur J Biochem 1992, 207 (2), Strecker, A.; Franke, P.; Weise, C.; Hucho, F.; All potential glycosylation sites of the nicotinic acetylcholine receptor delta subunit from Torpedo californica are utilized. Eur J Biochem 1994, 220 (3), Strader, C. B.; Revel, J. P.; Raftery, M. A.; Demonstration of the transmembrane nature of the acetylcholine receptor by labeling with anti receptor antibodies. J Cell Biol 1979, 83 (2 Pt 1), Finer Moore, J.; Stroud, R. M.; Amphipathic analysis and possible formation of the ion channel in an acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1984, 81 (1), Yee, G. H.; Huganir, R. L.; Determination of the sites of camp dependent phosphorylation on the nicotinic acetylcholine receptor. J Biol Chem 1987, 262 (34),

140 ΣΤ. Βιβλιογραφία 67. DiPaola, M.; Czajkowski, C.; Karlin, A.; The sidedness of the COOH terminus of the acetylcholine receptor delta subunit. J Biol Chem 1989, 264 (26), Moore, W. M.; Holladay, L. A.; Puett, D.; Brady, R. N.; On the conformation of the acetylcholine receptor protein from Torpedo nobiliana. FEBS Lett 1974, 45 (1), Mielke, D. L.; Wallace, B. A.; Secondary structural analyses of the nicotinic acetylcholine receptor as a test of molecular models. J Biol Chem 1988, 263 (7), Wu, C. S.; Sun, X. H.; Yang, J. T.; Conformation of acetylcholine receptor in the presence of agonists and antagonists. J Protein Chem 1990, 9 (1), Fong, T. M.; McNamee, M. G.; Stabilization of acetylcholine receptor secondary structure by cholesterol and negatively charged phospholipids in membranes. Biochemistry 1987, 26 (13), Naumann, D.; Schultz, C.; Gorne Tschelnokow, U.; Hucho, F.; Secondary structure and temperature behavior of the acetylcholine receptor by Fourier transform infrared spectroscopy. Biochemistry 1993, 32 (12), Devillers Thiery, A.; Giraudat, J.; Bentaboulet, M.; Changeux, J. P.; Complete mrna coding sequence of the acetylcholine binding alpha subunit of Torpedo marmorata acetylcholine receptor: a model for the transmembrane organization of the polypeptide chain. Proc Natl Acad Sci U S A 1983, 80 (7), Unwin, N.; Nicotinic acetylcholine receptor at 9 A resolution. J Mol Biol 1993, 229 (4), Gorne Tschelnokow, U.; Strecker, A.; Kaduk, C.; Naumann, D.; Hucho, F.; The transmembrane domains of the nicotinic acetylcholine receptor contain alpha helical and beta structures. EMBO J 1994, 13 (2), West, A. P., Jr.; Bjorkman, P. J.; Dougherty, D. A.; Lester, H. A.; Expression and circular dichroism studies of the extracellular domain of the alpha subunit of the nicotinic acetylcholine receptor. J Biol Chem 1997, 272 (41), Schrattenholz, A.; Pfeiffer, S.; Pejovic, V.; Rudolph, R.; Godovac Zimmermann, J.; Maelicke, A.; Expression and renaturation of the N terminal extracellular domain of torpedo nicotinic acetylcholine receptor alpha subunit. J Biol Chem 1998, 273 (49), Alexeev, T.; Krivoshein, A.; Shevalier, A.; Kudelina, I.; Telyakova, O.; Vincent, A.; Utkin, Y.; Hucho, F.; Tsetlin, V.; Physicochemical and immunological studies of the N terminal domain of the Torpedo acetylcholine receptor alpha subunit expressed in Escherichia coli. Eur J Biochem 1999, 259 (1 2), Grant, M. A.; Gentile, L. N.; Shi, Q. L.; Pellegrini, M.; Hawrot, E.; Expression and spectroscopic analysis of soluble nicotinic acetylcholine receptor fragments derived from the extracellular domain of the alpha subunit. Biochemistry 1999, 38 (33), Yao, Y.; Wang, J.; Viroonchatapan, N.; Samson, A.; Chill, J.; Rothe, E.; Anglister, J.; Wang, Z. Z.; Yeast expression and NMR analysis of the extracellular domain of muscle nicotinic acetylcholine receptor alpha subunit. J Biol Chem 2002, 277 (15), Tsetlin, V. I.; Dergousova, N. I.; Azeeva, E. A.; Kryukova, E. V.; Kudelina, I. A.; Shibanova, E. D.; Kasheverov, I. E.; Methfessel, C.; Refolding of the Escherichia coli expressed extracellular domain of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor. Eur J Biochem 2002, 269 (11), Brejc, K.; van Dijk, W. J.; Klaassen, R. V.; Schuurmans, M.; van Der Oost, J.; Smit, A. B.; Sixma, T. K.; Crystal structure of an ACh binding protein reveals the ligand binding domain of nicotinic receptors. Nature 2001, 411 (6835), Celie, P. H.; van Rossum Fikkert, S. E.; van Dijk, W. J.; Brejc, K.; Smit, A. B.; Sixma, T. K.; Nicotine and carbamylcholine binding to nicotinic acetylcholine receptors as studied in AChBP crystal structures. Neuron 2004, 41 (6), Celie, P. H.; Kasheverov, I. E.; Mordvintsev, D. Y.; Hogg, R. C.; van Nierop, P.; van Elk, R.; van Rossum Fikkert, S. E.; Zhmak, M. N.; Bertrand, D.; Tsetlin, V.; Sixma, T. K.; Smit, A. B.; Crystal structure of nicotinic acetylcholine receptor homolog AChBP in complex with an alpha conotoxin PnIA variant. Nat Struct Mol Biol 2005, 12 (7), Celie, P. H.; Klaassen, R. V.; van Rossum Fikkert, S. E.; van Elk, R.; van Nierop, P.; Smit, A. B.; Sixma, T. K.; Crystal structure of acetylcholine binding protein from Bulinus truncatus reveals the conserved structural scaffold and sites of variation in nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem 2005, 280 (28),

141 ΣΤ. Βιβλιογραφία 86. Hansen, S. B.; Sulzenbacher, G.; Huxford, T.; Marchot, P.; Taylor, P.; Bourne, Y.; Structures of Aplysia AChBP complexes with nicotinic agonists and antagonists reveal distinctive binding interfaces and conformations. EMBO J 2005, 24 (20), Bourne, Y.; Talley, T. T.; Hansen, S. B.; Taylor, P.; Marchot, P.; Crystal structure of a Cbtx AChBP complex reveals essential interactions between snake alpha neurotoxins and nicotinic receptors. EMBO J 2005, 24 (8), Ulens, C.; Hogg, R. C.; Celie, P. H.; Bertrand, D.; Tsetlin, V.; Smit, A. B.; Sixma, T. K.; Structural determinants of selective alpha conotoxin binding to a nicotinic acetylcholine receptor homolog AChBP. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103 (10), Dutertre, S.; Ulens, C.; Buttner, R.; Fish, A.; van Elk, R.; Kendel, Y.; Hopping, G.; Alewood, P. F.; Schroeder, C.; Nicke, A.; Smit, A. B.; Sixma, T. K.; Lewis, R. J.; AChBP targeted alpha conotoxin correlates distinct binding orientations with nachr subtype selectivity. EMBO J 2007, 26 (16), Unwin, N.; Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4 Å resolution. J Mol Biol 2005, 346 (4), Hilf, R. J.; Dutzler, R.; X ray structure of a prokaryotic pentameric ligand gated ion channel. Nature 2008, 452 (7185), Hilf, R. J.; Dutzler, R.; Structure of a potentially open state of a proton activated pentameric ligandgated ion channel. Nature 2009, 457 (7225), Bocquet, N.; Nury, H.; Baaden, M.; Le Poupon, C.; Changeux, J. P.; Delarue, M.; Corringer, P. J.; X ray structure of a pentameric ligand gated ion channel in an apparently open conformation. Nature 2009, 457 (7225), Smit, A. B.; Syed, N. I.; Schaap, D.; van Minnen, J.; Klumperman, J.; Kits, K. S.; Lodder, H.; van der Schors, R. C.; van Elk, R.; Sorgedrager, B.; Brejc, K.; Sixma, T. K.; Geraerts, W. P.; A glia derived acetylcholine binding protein that modulates synaptic transmission. Nature 2001, 411 (6835), Sixma, T. K.; Smit, A. B.; Acetylcholine binding protein (AChBP): a secreted glial protein that provides a high resolution model for the extracellular domain of pentameric ligand gated ion channels. Annu Rev Biophys Biomol Struct 2003, 32, Miyazawa, A.; Fujiyoshi, Y.; Unwin, N.; Structure and gating mechanism of the acetylcholine receptor pore. Nature 2003, 423 (6943), Dennis, M.; Giraudat, J.; Kotzyba Hibert, F.; Goeldner, M.; Hirth, C.; Chang, J. Y.; Lazure, C.; Chretien, M.; Changeux, J. P.; Amino acids of the Torpedo marmorata acetylcholine receptor alpha subunit labeled by a photoaffinity ligand for the acetylcholine binding site. Biochemistry 1988, 27 (7), Galzi, J. L.; Revah, F.; Black, D.; Goeldner, M.; Hirth, C.; Changeux, J. P.; Identification of a novel amino acid alpha tyrosine 93 within the cholinergic ligands binding sites of the acetylcholine receptor by photoaffinity labeling. Additional evidence for a three loop model of the cholinergic ligands binding sites. J Biol Chem 1990, 265 (18), Galzi, J. L.; Revah, F.; Bouet, F.; Menez, A.; Goeldner, M.; Hirth, C.; Changeux, J. P.; Allosteric transitions of the acetylcholine receptor probed at the amino acid level with a photolabile cholinergic ligand. Proc Natl Acad Sci U S A 1991, 88 (11), Fu, D. X.; Sine, S. M.; Competitive antagonists bridge the alpha gamma subunit interface of the acetylcholine receptor through quaternary ammonium aromatic interactions. J Biol Chem 1994, 269 (42), Dougherty, D. A.; Cation pi interactions in chemistry and biology: a new view of benzene, Phe, Tyr, and Trp. Science 1996, 271 (5246), Zhong, W.; Gallivan, J. P.; Zhang, Y.; Li, L.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A.; From ab initio quantum mechanics to molecular neurobiology: a cation pi binding site in the nicotinic receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95 (21), Tsetlin, V. I.; Hucho, F.; Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental aspects and medical applications. FEBS Lett 2004, 557 (1 3), Servent, D.; Antil Delbeke, S.; Gaillard, C.; Corringer, P. J.; Changeux, J. P.; Menez, A.; Molecular characterization of the specificity of interactions of various neurotoxins on two distinct nicotinic acetylcholine receptors. Eur J Pharmacol 2000, 393 (1 3), Azam, L.; McIntosh, J. M.; Alpha conotoxins as pharmacological probes of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin 2009, 30 (6),

142 ΣΤ. Βιβλιογραφία 106. Tsetlin, V.; Utkin, Y.; Kasheverov, I.; Polypeptide and peptide toxins, magnifying lenses for binding sites in nicotinic acetylcholine receptors. Biochem Pharmacol 2009, 78 (7), McIntosh, J. M.; Yoshikami, D.; Mahe, E.; Nielsen, D. B.; Rivier, J. E.; Gray, W. R.; Olivera, B. M.; A nicotinic acetylcholine receptor ligand of unique specificity, alpha conotoxin ImI. J Biol Chem 1994, 269 (24), Luo, S.; Nguyen, T. A.; Cartier, G. E.; Olivera, B. M.; Yoshikami, D.; McIntosh, J. M.; Single residue alteration in alpha conotoxin PnIA switches its nachr subtype selectivity. Biochemistry 1999, 38 (44), Hogg, R. C.; Hopping, G.; Alewood, P. F.; Adams, D. J.; Bertrand, D.; Alpha conotoxins PnIA and [A10L]PnIA stabilize different states of the alpha7 L247T nicotinic acetylcholine receptor. J Biol Chem 2003, 278 (29), Ellison, M.; Gao, F.; Wang, H. L.; Sine, S. M.; McIntosh, J. M.; Olivera, B. M.; Alpha conotoxins ImI and ImII target distinct regions of the human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor and distinguish human nicotinic receptor subtypes. Biochemistry 2004, 43 (51), Mukhtasimova, N.; Free, C.; Sine, S. M.; Initial coupling of binding to gating mediated by conserved residues in the muscle nicotinic receptor. J Gen Physiol 2005, 126 (1), Dutertre, S.; Lewis, R. J.; Toxin insights into nicotinic acetylcholine receptors. Biochem Pharmacol 2006, 72 (6), Brisson, A.; Unwin, P. N.; Tubular crystals of acetylcholine receptor. J Cell Biol 1984, 99 (4 Pt 1), Toyoshima, C.; Unwin, N.; Three dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction. J Cell Biol 1990, 111 (6 Pt 1), Unwin, N.; Acetylcholine receptor channel imaged in the open state. Nature 1995, 373 (6509), Corringer, P. J.; Le Novere, N.; Changeux, J. P.; Nicotinic receptors at the amino acid level. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2000, 40, Arias, H. R.; Localization of agonist and competitive antagonist binding sites on nicotinic acetylcholine receptors. Neurochem Int 2000, 36 (7), Barkas, T.; Mauron, A.; Roth, B.; Alliod, C.; Tzartos, S. J.; Ballivet, M.; Mapping the main immunogenic region and toxin binding site of the nicotinic acetylcholine receptor. Science 1987, 235 (4784), Tzartos, S. J.; Cung, M. T.; Demange, P.; Loutrari, H.; Mamalaki, A.; Marraud, M.; Papadouli, I.; Sakarellos, C.; Tsikaris, V.; The main immunogenic region (MIR) of the nicotinic acetylcholine receptor and the anti MIR antibodies. Mol Neurobiol 1991, 5 (1), Tzartos, S. J.; Barkas, T.; Cung, M. T.; Mamalaki, A.; Marraud, M.; Orlewski, P.; Papanastasiou, D.; Sakarellos, C.; Sakarellos Daitsiotis, M.; Tsantili, P.; Tsikaris, V.; Anatomy of the antigenic structure of a large membrane autoantigen, the muscle type nicotinic acetylcholine receptor. Immunol Rev 1998, 163, Kottwitz, D.; Kukhtina, V.; Dergousova, N.; Alexeev, T.; Utkin, Y.; Tsetlin, V.; Hucho, F.; Intracellular domains of the delta subunits of Torpedo and rat acetylcholine receptors expression, purification, and characterization. Protein Expr Purif 2004, 38 (2), Kukhtina, V.; Kottwitz, D.; Strauss, H.; Heise, B.; Chebotareva, N.; Tsetlin, V.; Hucho, F.; Intracellular domain of nicotinic acetylcholine receptor: the importance of being unfolded. J Neurochem 2006, 97 Suppl 1, Unwin, N.; Structure of the acetylcholine gated channel. Novartis Found Symp 2002, 245, 5 15; discussion 15 21, Psaridi Linardaki, L.; Mamalaki, A.; Remoundos, M.; Tzartos, S. J.; Expression of soluble ligand and antibody binding extracellular domain of human muscle acetylcholine receptor alpha subunit in yeast Pichia pastoris. Role of glycosylation in alpha bungarotoxin binding. J Biol Chem 2002, 277 (30), Tasneem, A.; Iyer, L. M.; Jakobsson, E.; Aravind, L.; Identification of the prokaryotic ligand gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys loop ion channels. Genome Biol 2005, 6 (1), R Bocquet, N.; Prado de Carvalho, L.; Cartaud, J.; Neyton, J.; Le Poupon, C.; Taly, A.; Grutter, T.; Changeux, J. P.; Corringer, P. J.; A prokaryotic proton gated ion channel from the nicotinic acetylcholine receptor family. Nature 2007, 445 (7123),

143 ΣΤ. Βιβλιογραφία 127. Taly, A.; Delarue, M.; Grutter, T.; Nilges, M.; Le Novere, N.; Corringer, P. J.; Changeux, J. P.; Normal mode analysis suggests a quaternary twist model for the nicotinic receptor gating mechanism. Biophys J 2005, 88 (6), Feng, G.; Steinbach, J. H.; Sanes, J. R.; Rapsyn clusters neuronal acetylcholine receptors but is inessential for formation of an interneuronal cholinergic synapse. J Neurosci 1998, 18 (11), Bruneau, E.; Akaaboune, M.; The dynamics of the rapsyn scaffolding protein at individual acetylcholine receptor clusters. J Biol Chem 2007, 282 (13), Peper, K.; Dreyer, F.; Sandri, C.; Akert, K.; Moor, H.; Structure and ultrastructure of the frog motor endplate. A freeze etching study. Cell Tissue Res 1974, 149 (4), Kuffler, S. W.; Yoshikami, D.; The number of transmitter molecules in a quantum: an estimate from iontophoretic application of acetylcholine at the neuromuscular synapse. J Physiol 1975, 251 (2), Heuser, J. E.; Salpeter, S. R.; Organization of acetylcholine receptors in quick frozen, deep etched, and rotary replicated Torpedo postsynaptic membrane. J Cell Biol 1979, 82 (1), Lena, C.; Changeux, J. P.; Allosteric modulations of the nicotinic acetylcholine receptor. Trends Neurosci 1993, 16 (5), Wonnacott, S.; Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends Neurosci 1997, 20 (2), Sher, E.; Chen, Y.; Sharples, T. J.; Broad, L. M.; Benedetti, G.; Zwart, R.; McPhie, G. I.; Pearson, K. H.; Baldwinson, T.; De Filippi, G.; Physiological roles of neuronal nicotinic receptor subtypes: new insights on the nicotinic modulation of neurotransmitter release, synaptic transmission and plasticity. Curr Top Med Chem 2004, 4 (3), Jensen, A. A.; Frolund, B.; Liljefors, T.; Krogsgaard Larsen, P.; Neuronal nicotinic acetylcholine receptors: structural revelations, target identifications, and therapeutic inspirations. J Med Chem 2005, 48 (15), Levy, R. B.; Aoki, C.; Alpha7 nicotinic acetylcholine receptors occur at postsynaptic densities of AMPA receptor positive and negative excitatory synapses in rat sensory cortex. J Neurosci 2002, 22 (12), Arenella, L. S.; Oliva, J. M.; Jacob, M. H.; Reduced levels of acetylcholine receptor expression in chick ciliary ganglion neurons developing in the absence of innervation. J Neurosci 1993, 13 (10), Corriveau, R. A.; Berg, D. K.; Coexpression of multiple acetylcholine receptor genes in neurons: quantification of transcripts during development. J Neurosci 1993, 13 (6), Devay, P.; Qu, X.; Role, L.; Regulation of nachr subunit gene expression relative to the development of pre and postsynaptic projections of embryonic chick sympathetic neurons. Dev Biol 1994, 162 (1), Howard, M. J.; Gershon, M. D.; Margiotta, J. F.; Expression of nicotinic acetylcholine receptors and subunit mrna transcripts in cultures of neural crest cells. Dev Biol 1995, 170 (2), Sharma, G.; Vijayaraghavan, S.; Nicotinic receptor signaling in nonexcitable cells. J Neurobiol 2002, 53 (4), Gahring, L. C.; Rogers, S. W.; Neuronal nicotinic acetylcholine receptor expression and function on nonneuronal cells. AAPS J 2005, 7 (4), E Borovikova, L. V.; Ivanova, S.; Zhang, M.; Yang, H.; Botchkina, G. I.; Watkins, L. R.; Wang, H.; Abumrad, N.; Eaton, J. W.; Tracey, K. J.; Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature 2000, 405 (6785), Heeschen, C.; Jang, J. J.; Weis, M.; Pathak, A.; Kaji, S.; Hu, R. S.; Tsao, P. S.; Johnson, F. L.; Cooke, J. P.; Nicotine stimulates angiogenesis and promotes tumor growth and atherosclerosis. Nat Med 2001, 7 (7), Heeschen, C.; Weis, M.; Aicher, A.; Dimmeler, S.; Cooke, J. P.; A novel angiogenic pathway mediated by non neuronal nicotinic acetylcholine receptors. J Clin Invest 2002, 110 (4), Changeux, J. P.; Allosteric proteins: from regulatory enzymes to receptors personal recollections. Bioessays 1993, 15 (9), Monod, J.; Wyman, J.; Changeux, J. P.; On the Nature of Allosteric Transitions: A Plausible Model. J Mol Biol 1965, 12, Changeux, J. P.; Edelstein, S. J.; On allosteric mechanisms and acetylcholine receptors. Trends Biochem Sci 1994, 19 (10), Σπυρούλιας, Γ.; Μοριακή Προσομοίωση. 2008, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. 129

144 ΣΤ. Βιβλιογραφία 151. Eswar, N.; Webb, B.; Marti Renom, M. A.; Madhusudhan, M. S.; Eramian, D.; Shen, M. Y.; Pieper, U.; Sali, A.; Comparative protein structure modeling using Modeller. Curr Protoc Bioinformatics 2006, Chapter 5, Unit Arnold, K.; Bordoli, L.; Kopp, J.; Schwede, T.; The SWISS MODEL workspace: a web based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics 2006, 22 (2), Sali, A.; Blundell, T. L.; Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J Mol Biol 1993, 234 (3), Fiser, A.; Do, R. K.; Sali, A.; Modeling of loops in protein structures. Protein Sci 2000, 9 (9), Halperin, I.; Ma, B.; Wolfson, H.; Nussinov, R.; Principles of docking: An overview of search algorithms and a guide to scoring functions. Proteins 2002, 47 (4), Kuntz, I. D.; Blaney, J. M.; Oatley, S. J.; Langridge, R.; Ferrin, T. E.; A geometric approach to macromolecule ligand interactions. J Mol Biol 1982, 161 (2), Morris, G. M.; Goodsell, D. S.; Halliday, R. S.; Huey, R.; Hart, W. E.; Belew, R. K.; Olson, A. J.; Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function. Journal of Computational Chemistry 1998, 19 (14), Jain, A. N.; Scoring functions for protein ligand docking. Curr Protein Pept Sci 2006, 7 (5), Kirkpatrick, S.; Gelatt, C. D., Jr.; Vecchi, M. P.; Optimization by simulated annealing. Science 1983, 220 (4598), Holland, J. H.; Adaptation in Natural and Artificial Systems. 1975, University of Michigan Solis, F. J.; Wets, R. J. B.; Minimization by Random Search Techniques. Mathematics of Operations Research 1981, 6 (1), Karplus, M.; Petsko, G. A.; Molecular dynamics simulations in biology. Nature 1990, 347 (6294), Alder, B. J.; Wainwright, T. E.; Phase transition of a hard sphere system. Journal of Chemical Physics 1957, 27 (5), Alder, B. J.; Wainwright, T. E.; Studies in Molecular Dynamics I: General method. Journal of Chemical Physics 1959, 31 (2), Rahman, Α.; Correlations in the motion of atoms in liquid Argon. Physical Reviews 1964, 136 (2Α), Stillinger, F. H.; Rahman, A.; Improved Simulation of liquid water by molecular dynamics. Journal of Chemical Physics 1974, 60 (4), McCammon, J. A.; Gelin, B. R.; Karplus, M.; Dynamics of folded proteins. Nature 1977, 267 (5612), Karplus, M.; McCammon, J. A.; Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nat Struct Biol 2002, 9 (9), Rapaport, D. C.; The art of molecular dynamics simulations. 1995, Cambridge University Press Hansen, J. P.; MacDonald, I. A.; Theory of simple liquids. 1990, Academic Press Verlet, L.; Computer "Experiments" on Classical Fluids. I. Thermodynamical Properties of Lennard Jones Molecules. Physical Review 1967, 159 (1), Ryckaert, J. P.; Ciccotti, G.; Berendsen, H. J. C.; Numerical Integration of Cartesian Equations of Motion of a System with Constraints Molecular Dynamics of N Alkanes. Journal of Computational Physics 1977, 23 (3), Berendsen, H. J. C.; Postma, J. P. M.; Vangunsteren, W. F.; Dinola, A.; Haak, J. R.; Molecular Dynamics with Coupling to an External Bath. Journal of Chemical Physics 1984, 81 (8), Cornell, W. D.; Cieplak, P.; Bayly, C. I.; Gould, I. R.; Merz, K. M.; Ferguson, D. M.; Spellmeyer, D. C.; Fox, T.; Caldwell, J. W.; Kollman, P. A.; A 2nd Generation Force Field for the Simulation of Proteins, Nucleic Acids, and Organic Molecules. Journal of the American Chemical Society 1995, 117 (19), MacKerell, A. D.; Bashford, D.; Bellott, M.; Dunbrack, R. L.; Evanseck, J. D.; Field, M. J.; Fischer, S.; Gao, J.; Guo, H.; Ha, S.; Joseph McCarthy, D.; Kuchnir, L.; Kuczera, K.; Lau, F. T. K.; Mattos, C.; Michnick, S.; Ngo, T.; Nguyen, D. T.; Prodhom, B.; Reiher, W. E.; Roux, B.; Schlenkrich, M.; Smith, J. C.; Stote, R.; Straub, J.; Watanabe, M.; Wiorkiewicz Kuczera, J.; Yin, D.; Karplus, M.; All atom empirical potential for molecular modeling and dynamics studies of proteins. Journal of Physical Chemistry B 1998, 102 (18),

145 ΣΤ. Βιβλιογραφία 176. Schuler, L. D.; Daura, X.; Van Gunsteren, W. F.; An improved GROMOS96 force field for aliphatic hydrocarbons in the condensed phase. Journal of Computational Chemistry 2001, 22 (11), Jorgensen, W. L.; Tiradorives, J.; The Opls Potential Functions for Proteins Energy Minimizations for Crystals of Cyclic Peptides and Crambin. Journal of the American Chemical Society 1988, 110 (6), Παπακυριακού, Α. Μελέτη της δομής και αλληλεπίδρασης συμπλόκων ενώσεων του αντικαρκινικού φαρμάκου μπλεομυκίνη στο DNA με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού και προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής. Διδακτορική Διατριβή. 2003, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Jorgensen, W. L.; Pranata, J.; Importance of Secondary Interactions in Triply Hydrogen Bonded Complexes Guanine Cytosine Vs Uracil 2,6 Diaminopyridine. Journal of the American Chemical Society 1990, 112 (5), Jorgensen, W. L.; Maxwell, D. S.; TiradoRives, J.; Development and testing of the OPLS all atom force field on conformational energetics and properties of organic liquids. Journal of the American Chemical Society 1996, 118 (45), Kuyper, L. F.; Hunter, R. N.; Ashton, D.; Merz, K. M.; Kollman, P. A.; Free Energy Calculations on the Relative Solvation Free Energies of Benzene, Anisole, and 1,2,3 Trimethoxybenzene Theoretical and Experimental Analysis of Aromatic Methoxy Solvation. Journal of Physical Chemistry 1991, 95 (17), Jorgensen, W. L.; Chandrasekhar, J.; Madura, J. D.; Impey, R. W.; Klein, M. L.; Comparison of Simple Potential Functions for Simulating Liquid Water. Journal of Chemical Physics 1983, 79 (2), Bayly, C. I.; Cieplak, P.; Cornell, W. D.; Kollman, P. A.; A Well Behaved Electrostatic Potential Based Method Using Charge Restraints for Deriving Atomic Charges the Resp Model. Journal of Physical Chemistry 1993, 97 (40), Thomas, P. G.; Russell, A. J.; Fersht, A. R.; Tailoring the Ph Dependence of Enzyme Catalysis Using Protein Engineering. Nature 1985, 318 (6044), Pantoliano, M. W.; Whitlow, M.; Wood, J. F.; Rollence, M. L.; Finzel, B. C.; Gilliland, G. L.; Poulos, T. L.; Bryan, P. N.; The Engineering of Binding Affinity at Metal Ion Binding Sites for the Stabilization of Proteins Subtilisin as a Test Case. Biochemistry 1988, 27 (22), Darden, T.; York, D.; Pedersen, L.; Particle Mesh Ewald an N.Log(N) Method for Ewald Sums in Large Systems. Journal of Chemical Physics 1993, 98 (12), York, D. M.; Darden, T. A.; Pedersen, L. G.; The Effect of Long Range Electrostatic Interactions in Simulations of Macromolecular Crystals a Comparison of the Ewald and Truncated List Methods. Journal of Chemical Physics 1993, 99 (10), Tsui, V.; Case, D. A.; Theory and applications of the generalized Born solvation model in macromolecular Simulations. Biopolymers 2000, 56 (4), Δάλκας, Γ. Α. Διαμορφωτική μελέτη μέσω Φασματοσκοπίας NMR του καταλυτικού τομέα του Θανατηφόρου Παράγοντα του Άνθρακα και μελέτη των συμπλόκων του με πεπτιδικά υποστρώματα μέσω Βιομοριακής Προσομοίωσης. Διδακτορική Διατριβή. 2010, Πανεπιστήμιο Πατρών Allen, M. P.; Tildesley, D. J.; Computer Simulation of Liquids. 1987, Oxford Love, R. A.; Stroud, R. M.; The crystal structure of alpha bungarotoxin at 2.5 A resolution: relation to solution structure and binding to acetylcholine receptor. Protein Eng 1986, 1 (1), Betzel, C.; Lange, G.; Pal, G. P.; Wilson, K. S.; Maelicke, A.; Saenger, W.; The refined crystal structure of alpha cobratoxin from Naja naja siamensis at 2.4 A resolution. J Biol Chem 1991, 266 (32), Gehrmann, J.; Alewood, P. F.; Craik, D. J.; Structure determination of the three disulfide bond isomers of alpha conotoxin GI: a model for the role of disulfide bonds in structural stability. J Mol Biol 1998, 278 (2), Structural Analysis and Verification Server Laskowski, R. A.; Macarthur, M. W.; Moss, D. S.; Thornton, J. M.; Procheck a Program to Check the Stereochemical Quality of Protein Structures. Journal of Applied Crystallography 1993, 26, Pontius, J.; Richelle, J.; Wodak, S. J.; Deviations from standard atomic volumes as a quality measure for protein crystal structures. J Mol Biol 1996, 264 (1), Humphrey, W.; Dalke, A.; Schulten, K.; VMD: visual molecular dynamics. J Mol Graph 1996, 14 (1), 33 38,

146 ΣΤ. Βιβλιογραφία 198. Ramachandran, G. N.; Ramakrishnan, C.; Sasisekharan, V.; Stereochemistry of polypeptide chain configurations. J Mol Biol 1963, 7, Nirthanan, S.; Gwee, M. C.; Three finger alpha neurotoxins and the nicotinic acetylcholine receptor, forty years on. J Pharmacol Sci 2004, 94 (1), Luetje, C. W.; Wada, K.; Rogers, S.; Abramson, S. N.; Tsuji, K.; Heinemann, S.; Patrick, J.; Neurotoxins distinguish between different neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit combinations. J Neurochem 1990, 55 (2), Groebe, D. R.; Dumm, J. M.; Levitan, E. S.; Abramson, S. N.; alpha Conotoxins selectively inhibit one of the two acetylcholine binding sites of nicotinic receptors. Mol Pharmacol 1995, 48 (1), Hann, R. M.; Pagan, O. R.; Eterovic, V. A.; The alpha conotoxins GI and MI distinguish between the nicotinic acetylcholine receptor agonist sites while SI does not. Biochemistry 1994, 33 (47), Hashimoto, K.; Uchida, S.; Yoshida, H.; Nishiuchi, Y.; Sakakibara, S.; Yukari, K.; Structure activity relations of conotoxins at the neuromuscular junction. Eur J Pharmacol 1985, 118 (3), Almquist, R. G.; Kadambi, S. R.; Yasuda, D. M.; Weitl, F. L.; Polgar, W. E.; Toll, L. R.; Paralytic activity of (des Glu1)conotoxin GI analogs in the mouse diaphragm. Int J Pept Protein Res 1989, 34 (6), Groebe, D. R.; Gray, W. R.; Abramson, S. N.; Determinants involved in the affinity of alphaconotoxins GI and SI for the muscle subtype of nicotinic acetylcholine receptors. Biochemistry 1997, 36 (21), Hann, R. M.; Pagan, O. R.; Gregory, L. M.; Jacome, T.; Eterovic, V. A.; The 9 arginine residue of alpha conotoxin GI is responsible for its selective high affinity for the alphagamma agonist site on the electric organ acetylcholine receptor. Biochemistry 1997, 36 (29), Berman, H. M.; Westbrook, J.; Feng, Z.; Gilliland, G.; Bhat, T. N.; Weissig, H.; Shindyalov, I. N.; Bourne, P. E.; The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res 2000, 28 (1), Bairoch, A.; Boeckmann, B.; Ferro, S.; Gasteiger, E.; Swiss Prot: juggling between evolution and stability. Brief Bioinform 2004, 5 (1), Thompson, J. D.; Higgins, D. G.; Gibson, T. J.; CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 1994, 22 (22), Sanner, M. F.; Python: a programming language for software integration and development. J. Mol. Graph. Model. 1999, 17 (1), Case, D. A.; Cheatham, T. E.; Darden, T.; Gohlke, H.; Luo, R.; Merz, K. M.; Onufriev, A.; Simmerling, C.; Wang, B.; Woods, R. J.; The Amber biomolecular simulation programs. Journal of Computational Chemistry 2005, 26 (16), Gordon, J. C.; Myers, J. B.; Folta, T.; Shoja, V.; Heath, L. S.; Onufriev, A.; H++: a server for estimating pk(a)s and adding missing hydrogens to macromolecules. Nucleic Acids Research 2005, 33, W368 W Hornak, V.; Abel, R.; Okur, A.; Strockbine, B.; Roitberg, A.; Simmerling, C.; Comparison of multiple amber force fields and development of improved protein backbone parameters. Proteins Structure Function and Bioinformatics 2006, 65 (3), Kirschner, K. N.; Yongye, A. B.; Tschampel, S. M.; Gonzalez Outeirino, J.; Daniels, C. R.; Foley, B. L.; Woods, R. J.; GLYCAM06: A generalizable Biomolecular force field. Carbohydrates. Journal of Computational Chemistry 2008, 29 (4), Cheatham, T. E.; Miller, J. L.; Fox, T.; Darden, T. A.; Kollman, P. A.; Molecular Dynamics Simulations on Solvated Biomolecular Systems the Particle Mesh Ewald Method Leads to Stable Trajectories of DNA, Rna, and Proteins. Journal of the American Chemical Society 1995, 117 (14), Miyamoto, S.; Kollman, P. A.; Settle an Analytical Version of the Shake and Rattle Algorithm for Rigid Water Models. Journal of Computational Chemistry 1992, 13 (8),

147 Ενότητα Ζ Παράρτημα

148

149 Ζ. Παράρτημα Ζ.1. Δεδομένα προσομοιώσεων Μοριακής Δυναμικής Εικόνα Ζ1. Μεταβολή του RMSD για τα άτομα Ca ως προς το χρόνο προσομοίωσης. Τα αριστερά διαγράμματα αφορούν τα άτομα της α1 ΕΚΠ ενώ τα δεξιά τα άτομα της τοξίνης για τα εξής σύμπλοκα: (Α) α1 ΕΚΠ ποντικού/α Btx, (B) γλυκοζυλιωμένη α1 ΕΚΠ ποντικού/α Btx, (Γ) α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Btx, (Δ) γλυκοζυλιωμένη α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Btx, (Ε) α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Cbtx, (ΣΤ) γλυκοζυλιωμένη α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Cbtx. Οι δύο γραμμές (κόκκινη και μαύρη) αντιπροσωπεύουν δύο ανεξάρτητες προσομοιώσεις. 135

150 Ζ. Παράρτημα Εικόνα Ζ2. Μεταβολή του RMSF ανά αμινοξύ. Τα αριστερά διαγράμματα αφορούν τα άτομα της α1 ΕΚΠ ενώ τα δεξιά τα άτομα της τοξίνης για τα εξής σύμπλοκα: (Α) α1 ΕΚΠ ποντικού/α Btx, (B) γλυκοζυλιωμένη α1 ΕΚΠ ποντικού/α Btx, (Γ) α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Btx, (Δ) γλυκοζυλιωμένη α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Btx, (Ε) α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Cbtx, (ΣΤ) γλυκοζυλιωμένη α1 ΕΚΠ ανθρώπου/α Cbtx. Οι δύο γραμμές (κόκκινη και μαύρη) αντιπροσωπεύουν δύο ανεξάρτητες προσομοιώσεις. 136

151 Ζ. Παράρτημα Ζ.2. Συντμήσεις Αμινοξέα Ala Α Αλανίνη Leu L Λευκίνη Arg R Αργινίνη Lys K Λυσίνη Asn N Ασπαραγίνη Met M Μεθειονίνη Asp D Ασπαραγινικό οξύ Phe F Φαινυλαλανίνη Cys C Κυστεΐνη Pro P Προλίνη Gln Q Γλουταμίνη Ser S Σερίνη Glu E Γλουταμινικό οξύ Thr T Θρεονίνη Gly G Γλυκίνη Trp W Τρυπτοφάνη His H Ιστιδίνη Tyr Y Τυροσίνη Ile I Ισολευκίνη Val V Βαλίνη ACh: ακετυλοχολίνη nachr: νικοτικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης LGICs: ιοντικά κανάλια που ενεργοποιούνται από την δέσμευση κάποιου προσδέτη ΕΚΠ: εξωκυττάρια περιοχή ΚΠ: κυτταροπλασματική περιοχή MIR: κύρια ανοσογόνος περιοχή AChBP: πρωτεΐνης δέσμευσης της ακετυλοχολίνης A AChBP: AChBP από Aplysia californica L AChBP: AChBP από Lymnaea stagnalis α Btx: α μπουγκαροτοξίνη α Cbtx: α κομπρατοξίνη α Ctx: α κωνοτοξίνη HEPES: 4 (2 υδροξυαιθυλ) 1 πιπεραζινο αιθυλ σουλφονικό οξύ MLA: μεθυλ κακονιτίνη ELIC: προκαρυωτικό LGIC από Erwinia chrysanthemi GLIC: προκαρυωτικό LGIC από Gleobacter violaceus NAG: Ν ακετυλ γλυκοζαμίνη ΜΑΝ: μαννόζη 137

152 Ζ. Παράρτημα CD: κυκλικός διχρωϊσμός FTIR: υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμού Fourier NMR: πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός PDB: βάση δεδομένων Protein Data Bank ΜΔ ή MD: Μοριακή Δυναμική SA: προσομοίωση ανόπτησης simulated annealing GA: γενετικός αλγόριθμος LGA: Λαμαρκιανός γενετικός αλγόριθμος ASA: εμβαδόν προσβάσιμης επιφάνειας RMSD: μέση απόκλιση της θέσης ενός ατόμου από ένα άτομο αναφοράς (root mean square deviation) RMSF: διακύμανση της θέσης ενός ατόμου από τη μέση τιμή (root mean square fluctuation) PME: μέθοδος particle mesh Ewald PBC: περιοδικές οριακές συνθήκες 138

153 Ζ. Παράρτημα Ζ.3. Δημοσίευση Από τα αποτελέσματα της παρούσης εργασίας συγγράφηκε η παρακάτω επιστημονική δημοσίευση (paper), η οποία επισυνάπτεται αυτούσια στις επόμενες σελίδες. Nikolaos Dimitropoulos, Athanasios Papakyriakou, Georgios A. Dalkas, Christos T. Chasapis, Konstantinos Poulas and Georgios A. Spyroulias. A computational investigation on the role of glycosylation in the binding of alpha1 nicotinic acetylcholine receptor with two alpha neurotoxins. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics (2010). DOI: /prot Abstract: Based on the crystal structure of the extracellular domain (ECD) of the mouse nicotinic acetylcholine receptor (nachr) alpha1 subunit bound to alpha bungarotoxin (α Btx) we have generated in silico models of the human nachr α1 bound to α Btx and alpha cobratoxin (α Cbtx), both in the presence and in the absence of the N linked carbohydrate chain. To gain further insight into the structural role of glycosylation molecular dynamics (MD) simulations were carried out in explicit solvent so as to compare the conformational dynamics of the binding interface between nachr α1 and the two toxins. An interesting observation during the course of the MD simulations is the strengthening of the receptor toxin interaction in the presence of the carbohydrate chain, mediated through a shift in the position of the sugars towards the bound toxin. Critical protein sugar interactions implicate residues Ser187 and Trp184 of nachr and Thr6, Ser9, and Thr15 of α Btx, as well as Thr6 and Pro7 of α Cbtx. Analysis of the predicted residuespecific intermolecular interactions is intended to inspire biophysical studies on the functional role of glycosylation in the gating mechanism. 139

154 proteins STRUCTURE O FUNCTION O BIOINFORMATICS A computational investigation on the role of glycosylation in the binding of alpha1 nicotinic acetylcholine receptor with two alpha-neurotoxins Nikolaos Dimitropoulos, Athanasios Papakyriakou, Georgios A. Dalkas, Christos T. Chasapis, Konstantinos Poulas, and Georgios A. Spyroulias* Department of Pharmacy, University of Patras, GR-26504, Patras, Greece ABSTRACT Based on the crystal structure of the extracellular domain (ECD) of the mouse nicotinic acetylcholine receptor (nachr) alpha1 subunit bound to a- bungarotoxin (a-btx) we have generated in silico models of the human nachr a1 bound to a-btx and a-cobratoxin (a- Cbtx), both in the presence and in the absence of the N-linked carbohydrate chain. To gain further insight into the structural role of glycosylation molecular dynamics (MD) simulations were carried out in explicit solvent so as to compare the conformational dynamics of the binding interface between nachr a1 and the two toxins. An interesting observation during the course of the MD simulations is the strengthening of the receptor-toxin interaction in the presence of the carbohydrate chain, mediated through a shift in the position of the sugars towards the bound toxin. Critical protein sugar interactions implicate residues Ser187 and Trp184 of nachr and Thr6, Ser9, and Thr15 of a-btx, as well as Thr6 and Pro7 of a-cbtx. Analysis of the predicted residue-specific intermolecular interactions is intended to inspire biophysical studies on the functional role of glycosylation in the gating mechanism. Proteins 2010; 00: VC 2010 Wiley-Liss, Inc. Key words: nicotinic acetylcholine receptor; ligand-gated ion channels; glycosylation; a-neurotoxins; homology modeling; molecular dynamics simulations. INTRODUCTION Nicotinic acetylcholine receptors (nachrs) are transmembrane glycoproteins which belong to the superfamily of the Cys-loop ligand-gated ion channels (LGICs), which also includes the GABA, glycine, and 5-HT3 receptors. 1 3 LGICs form homo- or hetero-pentamers of related subunits, and each of them consists of a large extracellular ligand-binding domain, a transmembrane region, and an intracellular region. 2 The most characteristic feature of this superfamily is a conserved sequence of 13 residues flanked by linked cysteines in the N-terminal domain of each subunit. 3 The extracellular domains (ECDs), which are 210 residues long, contain binding sites for agonists and competitive antagonists. Binding of an agonist induces rapid opening of the transmembrane ion channel, leading to a change in membrane potential. 4,5 nachrs are divided in two groups: the muscle type and the neuronal type. 2 The muscle type is found in vertebrate skeletal muscle and in fish electric organs, while the neuronal type is found in the central and peripheral nervous system, and also in nonneuronal tissues. The muscle nachr consists of five homologous subunits forming a channel with stoichiometry (a1) 2 bgd in embryos or (a1) 2 bed in adults. Apart from its important physiological role, muscle type nachr is the target in several inherited and acquired diseases. 6 8 The a1 subunit of nachr has been broadly studied due to its unique characteristics. The ECD of the a1 chain contains both the binding sites for cholinergic ligands 2,9 and the major immunogenic region (MIR), the part of the subunit which is targeted by autoantibodies in the autoimmune disease myasthenia gravis. 10,11 The presence of a certain subunit can affect the localization, biophysical, functional, and pharmacological properties of nachrs and the regulation of the expression of the nachr subtype at the developmental or adult stage, whereas the lack of a subunit may lead to the compensatory upregulation of other subtypes. 12 In the last years, the knowledge regarding the nachr structure has been dramatically increased by the determination of (a) the electron microscopy structure of the Torpedo nachr, 13 (b) the X-ray crystal structures of the ligand-free or ligand-bound molluscan ACh-binding Additional Supporting Information may be found in the online version of this article. Grant sponsor: EU FP7 Neurocypres project; Grant number: *Correspondence to: G. A. Spyroulias, Department of Pharmacy, University of Patras, Panepistimioupoli, Rion, GR-26504, Greece. G.A.Spyroulias@upatras.gr Received 23 April 2010; Revised 6 August 2010; Accepted 19 August 2010 Published online 16 September 2010 in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). DOI: /prot VC 2010 WILEY-LISS, INC. PROTEINS 1

155 N. Dimitropoulos et al. Figure 1 Crystal structure of the mouse nachr a1-ecd bound to a-bungarotoxin (a-btx). The receptor and the toxin are represented with cyan and red ribbons, respectively, while the carbohydrate chain is shown as a stick model with carbon atoms in silver, oxygen in red, and nitrogen in blue. [Color figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.] proteins (AChBPs), (c) the X-ray crystal structure of the mouse nachr a1-ecd bound to a-bungarotoxin (a-btx), 22 and (d) the X-ray crystal structures of two prokaryotic LGICs; one from the bacterium Erwinia chrysanthemi (ELIC) 23 and another one from the bacterium Gleobacter violaceus (GLIC). 24,25 The crystal structure of the mouse nachr a1-ecd (a211) bound to a-btx at 1.94 Å resolution revealed atomic details for several key functional elements of nachr, such as the MIR, the signature Cys-loop and the carbohydrate chain linked to Asn The structure of a211 (see Fig. 1) is organized around a hydrophobic core of 10 b-strands, joined through the Cys-loop, and contains one N-terminal a-helix. The sheet made of strands b1, b2, b3, b5, b6, and b8 is called the inner b-sheet, whereas the sheet made of strands b4, b7, b9, and b10 is called the outer b-sheet. The structure also contains several loops that are important for nachr function. Loops b4-b5 (A), b7-b8 (B), and b9-b10 (C) form the ligand-binding site of the nachr a1 subunit, 13,14,26 whereas Loops b1-b2, b6-b7 (Cys-loop), and b8-b9 (F) interact with the transmembrane domain and are involved in coupling of ligandbinding to channel opening. 27 The bound a-btx on the outer sheet of the b-barrel (see Fig. 1) is a long-chain 74- a.a a-neurotoxin isolated from the Bungarus multicinctus venom. Its spatial structure comprises a central b-sheet from which protrude three finger-like loops (I III) confined by four disulfide bonds, while a fifth SS-bond is found at the tip of the central loop (II). 28 The ECDs of nachr subunits contain various glycosylation sites. A highly conserved glycosylation site (found in all muscle and neuronal type subunits except a7, a8, and a9) is located in the Cys-loop residue Asn This is the only glycosylation site of the a1 subunit. Several other conserved glycosylation sites are found in the other nachr subunits. Most of the oligosaccharide chains in nachr subunits are of the high-mannose type. 29 Several studies show that glycosylation is important for the surface expression and correct assembly of the receptor. 30,31 In the crystal structure of the mouse nachr a1-ecd, 22 the Asn141-linked oligosaccharide chain stretches from the Cys-loop to the ligand-binding loops, and extensively interacts with the bound toxin. Functional studies, 22,32 suggest that the carbohydrate chain may be implicated in coupling ligand binding to channel gating. A more profound understanding of the general role of glycosylation in channel function requires further studies. Several studies on nachr that employ computational methods have been published in recent years In these studies, homology modeling and molecular dynamics (MD) are used as a means to explore ligand receptor interactions at the atomic level, as well as to understand the molecular mechanisms involved in channel activation and inhibition. Templates used in the modeling of nachrs are either the structure of the Torpedo nachr, 13 or the various high-resolution X-ray structures of AChBPs Although these studies have provided great insight into the receptor toxin interactions, the effect of the oligosaccharide moiety on toxin binding and receptor dynamics has not yet been explored. In the present study homology modeling and MD simulations were employed with the aim to gain structural information on the role of glycosylation of the human nachr a1-ecd in the binding with two neurotoxins, a- bungarotoxin (a-btx), and a-cobratoxin (a-cbtx). A detailed comparison between the glycosylated and the non-glycosylated models of both the mouse and the human nachr a1 complexes with the two toxins revealed key intermolecular interactions at an atomic level. The explicit solvent representation allowed us to monitor water-mediated interactions, as well as the presence of ordered solvent molecules inside a hydrophobic pocket of a1, which have been proposed to have a functional role in the gating mechanism. 22 COMPUTATIONAL METHODS Homology modeling Protein sequences of the mouse and the human nachr a1 ECD were acquired from the SWISS/PROT database. 39 It should be noted that the term mouse a1 is used to refer to the ECD construct that was used for crystallization with mutations at Val8Glu, Trp149Arg, and Val155Ala. 22 Sequence alignment was performed using ClustalW2, 40 which revealed a 95% identity as shown in Figure S1 (Supporting Information). The crys- 2 PROTEINS

156 MDs on Glycosylated Human nachr a1 ECD tal structure of the ECD of the mouse nachr a1 subunit (PDB ID: 2QC1) 22 was used as a template for the human nachr a1 ECD homology model. Twenty models were generated using MODELLER v7.2, 41 and the model with the lowest target function was selected as the initial structure of human nachr a1 ECD. Validation of the model was performed using the Structural Analysis and Verification Server 42 and selected results are presented in the Supporting Information (Fig. S2). Preparation of the models The human nachr a1 homology model and the template structure of the mouse a211-a-btx complex (PDB ID: 2QC1) were superimposed with a backbone RMSD of 0.37 Å (a.a ). Subsequently, the crystallographic coordinates of a-btx and of the carbohydrate chain from 2QC1 were used for the two models of the human nachr, one with bound a-btx in the presence of the N- linked sugars, and the other with bound a-btx lacking the oligosaccharide moiety. The coordinates of a-cbtx were retrieved from the X-ray structure of the AChBP bound toxin (chain F from PDB ID 1YI5) 16 and was superimposed on the a-btx molecule within the mouse a211 complex using the MultiSeq module of VMD as shown in Figure S3 (Supporting Information). Following the same procedure as described above, two models of the human nachr-a-cbtx complex were prepared (with and without the carbohydrate chain). For reference purposes, a model of the mouse a211-a-btx complex lacking the oligosaccharide was prepared by removing the sugar atoms from 2QC1. All crystallographic water molecules were discarded from the initial models. Missing heavy and hydrogen atoms were added using the XLEaP module of AMBER All basic residues were protonated and all acidic residues were deprotonated. Histidine protonation states were manually set by examining their potential for hydrogen bonding with surrounding residues, and by taking into account the pka values calculated using the H11 web server. 45 Specifically, His79, His115, and His134 of a1 ECD, His4 of a-btx and His18 of a-cbtx were set to be protonated at N d1, while His3, His25, His186, and His204 of a1 ECD, and His68 of a-btx were set to be protonated at N e2. The improved protein backbone AMBER force field, denoted as ff99sb, was employed for all protein atoms, 46,47 while the carbohydrate chain was represented using the GLYCAM06 force field. 48 To relax the models from crystal-packing contacts and optimize the position of the new atoms a set of minimization steps was carried out using the SANDER module of AMBER In particular, 1000 steps were performed in order to allow relaxation of the hydrogen atoms only, using the steepest descent algorithm. Then, 1000 steps of conjugate gradient minimization were carried out by restraining all Ca atoms using positional harmonic restraints of 50 kcal mol 21 Å 22 force constant. A third round of unrestrained minimization was carried out for 3000 steps. The generalized Born implicit solvation model (GB HCT ) 49 was employed throughout the energy minimizations with a 16-Å cutoff for the nonbonded interactions. Molecular dynamics and analysis AMBER 9 was used for all the MD calculations carried out on Intel Xeon workstations. Numerical integration was performed with a 2-fs time step and all bonds involving hydrogen atoms were constrained with SHAKE. 50 Periodic boundary conditions were imposed using the particle mesh Ewald method 51 with 8 Å limit for the direct space sum. Temperature and pressure controls were imposed using a Berendsen-type algorithm, 52 both with 1 ps coupling constants. All receptor-toxin models were immersed in isometric truncated octahedron TIP3P-water boxes, 53 and the appropriate number of counter ions was added to neutralize the total charge. The following procedure was used so as to optimize the position of the solvent molecules and equilibrate the temperature and pressure of the systems: (a) energy minimization for 1000 steps using the steepest descent method with harmonic restraints of 50 kcal mol 21 Å 22 force constant on all solute atoms; (b) restrained constant volume dynamics (NVT ensemble) at 300 K for 30 ps; (c) a second energy minimization for 1000 steps with 10 kcal mol 21 Å 22 restraints on all protein Ca atoms; (d) temperature was then gradually increased to 300 K within six rounds of 5-ps constant volume dynamics (NVT), while solute atoms were restrained with 10 kcal mol 21 Å 22 ; (e) restraints were then gradually released within 20 ps in the NVT ensemble at 300 K; (f) the density of the systems was increased to 1.0 g cm 23 during 150 ps of constant pressure dynamics (NPT ensemble). Subsequently, production runs were carried out under physiological conditions (300 K, 1 atm) in the NPT ensemble for a total time of 20 ns (overviewed in Table SI in Supporting Information). The translational centre-ofmass motion was removed every 1000 steps and trajectories were updated every 500 steps. To assess the validity of our observations all runs were repeated with different initial velocity assignment starting from equilibration Step d (vide supra). In particular, for the simulation of the crystal structure of mouse a211-a-btx complex validation was performed by a second 20-ns MD run in which all the crystallographic water molecules (PDB ID: 2QC1) were preserved. Processing of the MD trajectories was performed using the PTRAJ module of AMBER 9, while VMD was used for their examination. MD trajectories were analyzed to identify important intermolecular interactions by extracting their geometric features (distances and angles) as a function of simulation time. Hydrogen bonding PROTEINS 3

157 N. Dimitropoulos et al. Figure 2 Comparison of the non-glycosylated and the glycosylated model of the mouse a1 ECD-a-Btx complex after 20 ns of MD simulations. The a1 ECD is shown in blue and cyan for the non-glycosylated and the glycosylated model, respectively, while the corresponding a-btx molecules are shown in red and orange. The carbohydrate chain is shown with carbon atoms in silver sticks, oxygen atoms in red, and nitrogen atoms in blue. interactions were monitored using a 3.4 Å distance cutoff and 1208 as the angle cutoff. Hydrophobic interactions were included for a pair of carbon atoms separated by a distance less than 4.0 Å. Only interactions present for more than half of the simulation time were considered. Water-mediated hydrogen bonds were considered if observed in at least 25% of the trajectory frames. Figures were prepared using VMD and plots using Grace. RESULTS AND DISCUSSION Mouse a1 ECD-a-Btx complex With the aim to examine the effect of the oligosaccharide moiety on the mouse a1 ECD bound to a-btx, two independent 20-ns MD simulations were performed for the non-glycosylated and the glycosylated models of the complex. The models were based on the single a1 subunit out of the pentameric receptor, which represents the principal component of the binding side. 2 The use of the a1 mouse nachr crystal structure (PDB ID: 2QC1) as a template was preferred because of its high resolution (1.94 Å) and its high homology with the human a1 subunit (Fig. S1 in Supporting Information). On the other hand, a pentameric model of human nachr would be based either on the low-resolution Torpedo AChR electron microscopy studies 13 or on the various high-resolution crystal structures of AChBPs, which exhibit low homology for human nachr Superposition of the human nachr a1 homology model with the pentameric Torpedo AChR structure showed that the carbohydrate chain does not interact with the neighboring non-alpha subunits, and no major clashes occur between the toxin and the complementary component of the binding site. Therefore, the results generated by the MD simulations are not significantly affected by the absence of the neighboring subunits. The transmembrane domain of the a1 subunit was also not modeled, since the structure of Torpedo nachr 13 has shown that the transmembrane domain interacts with the b1-b2 loop and the Cys loop of the extracellular domain, and does not actively take part in toxin binding. In the non-glycosylated model (see Fig. 2), the a-btx central loop (Finger II) is positioned deep inside the binding pocket, between Loops A, B, and C of mouse a1, while the a-btx Finger I and C-terminal loop are also in close proximity with Loop C. Finger III of a-btx does not interact with the a1 ECD. The binding of a-btx to a1 is stabilized by extensive interactions between individual residues (Table I). In particular, the Finger II Arg36 is hydrogen bonded to Arg149 in Loop B and Tyr190 and Cys192 in Loop C, and participates in p-cation interactions with Phe32 of a-btx and Tyr190 and Tyr198 (both in Loop C) for the entire course of the MDs. The guanidinium moiety of Arg36 closely resembles the position of the quaternary ammonium group of a bound agonist molecule in AChBP crystal structures. 15,19 The introduction of a positively-charged residue in the ligand-binding pocket is critical for the competitive antagonism of neurotoxins. 54 Several other Table I Residue Specific Interactions of a-btx with the Non-glycosylated and the Glycosylated ECD of Mouse nachr a1 Subunit a-btx Finger I Thr6 Mouse a1 ECD Mouse a1 ECD with carbohydrate chain Phe189 Pro10 Thr195 Thr195 Ile11 Phe189, Pro194 Phe189, Pro194 Finger II Asp30 Tyr190 Val31 Tyr93 Tyr93 Phe32 Val91, Tyr93, Tyr190 Tyr93, Tyr190 Arg36 Arg149, Tyr190, Cys192, Tyr198 Tyr190, Cys192, Tyr198 Lys38 Ser191 Ser191 Val39 Val188, Tyr190 Val188, Tyr190 Val40 Phe189 Phe189 C-ter loop His68 Tyr190, Pro194 Tyr190, Pro194 Pro69 Lys70 Pro194 Pro194 Residues involved in van der Waals interactions are in plain font, those forming hydrogen bonds are in bold, and those involved in p-cation interactions in italic. 4 PROTEINS

158 MDs on Glycosylated Human nachr a1 ECD Table II Protein Sugar Interactions Observed in the Simulation of the Mouse nachr a1 ECD Bound to a-btx Carbohydrate Mouse a1 ECD a-btx NAG2 His204 NAG3 (Trp184), His186, His204 MAN4 Trp184 MAN5 His186, Trp187 Thr6 MAN6 Trp187, Pro197 Ser9 MAN8 His186, Phe189 Thr6, (Val40), (Glu41) Residues involved in van der Waals interactions are in plain font, those forming hydrogen bonds are in bold and those forming water-mediated hydrogen bonds are in brackets. contacts are observed between Finger II and Loop C (Table I). These interactions are also observed in the crystal structure of the mouse a1 bound to a-btx. 22 The N-glycosylated mouse a1-a-btx model exhibits analogous interactions with the non-glycosylated model (Table I). Finger II of a-btx inserts into the binding site, while Finger II and the C-terminal loop are wrapped around Loop C of the a1 ECD. Arg36 is involved in p- cation interactions with Phe32 of a-btx and Tyr190, Tyr198 of Loop C and also forms hydrogen bonds with Tyr190 and Cys192. Additionally, Asp30 in Finger II forms a hydrogen bond with the side chain OH of Tyr190. The carbohydrate chain linked to Asn141 interacts both with the a1 ECD and the toxin molecule, consistent with the crystal structure, 22 providing a network Table III Comparison of the Toxin Receptor Interactions Between the Non-glycosylated and the Glycosylated Models of Human nachr a1 ECD Bound to a-btx a-btx Human a1 ECD Human a1 ECD with carbohydrate chain Finger I Th6 Thr189, (Pro194) Thr8 (Pro194) Ile11 Thr189, Pro194, Pro194 Finger II Asp30 (Tyr190) Val31 Tyr93, Trp149 Tyr93, Trp149 Phe32 Tyr93, Trp149, Tyr190 Tyr93, Trp149, Tyr190 Arg36 Tyr93, Thr148, Trp149, Tyr190, Cys192, Tyr93, Trp149, Tyr190, Cys192, Tyr198 Tyr198, (Leu199) Lys38 Ser191 Ser191 Val39 Val188, Tyr190 Val188, Tyr190 Val40 Thr189 Thr189 C-ter loop His68 Tyr190, Pro194 Pro194 Pro69 Pro194 Lys70 Cys192 Residues involved in van der Waals interactions are in plain font, those forming hydrogen bonds are in bold, those forming water-mediated hydrogen bonds are in brackets and those involved in p-cation interactions in italic. of sugar nachr/toxin interactions monitored during the entire MD course (Table II). In the backside of Loop C, Trp187 is found to be hydrogen bonded to MAN5 via its backbone, as well as making van der Waals contacts with MAN6. The mannoses MAN5, MAN6, and MAN8 interact with toxin Finger I through several hydrogen bonds with Thr6 and Ser9. Furthermore, MAN8 reaches out to the base of Finger II, forming water-mediated hydrogen bonds with Val40 and Glu41. Human a1 ECD-a-Btx complex Figure 3 Superposition of the non-glycosylated and the glycosylated model of the human a1 ECD-a-Btx complex, after 20 ns of MD simulations. The a1 ECD is shown in blue and cyan for the non-glycosylated and the glycosylated model, respectively, while the corresponding a-btx molecules are shown in red and orange. The carbohydrate chain is shown with carbon atoms in silver sticks, oxygen atoms in red, and nitrogen atoms in blue. [Color figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.] MD simulations were carried out for the models of human a1 bound to a-btx for 20 ns under the same conditions as for the models of mouse a1 (see Fig. 3). In the non-glycosylated model, the predicted a1-toxin interactions are very similar to the mouse a1-toxin model. Finger II contacts Loops A, B, and C, while Finger I and the C-terminal loop of a-btx interact with Loop C. Finger III is distant from the nachr subunit and does not interact with it. A significant difference from the mouse model is the substitution of Arg149 (mutated in a211 to increase solubility and achieve crystallization) with Trp149 in human nachr a1. Trp149 is highly conserved amongst nachr alpha subunits and AChBP, as it was shown to play a critical role in agonist and antagonist binding. 14,55 In our model Trp149 confirms its significant role as it is involved in p-cation and van der Waals interactions with the toxin residues Arg36, Val31, and Phe32. Several other Loop C residues are involved in the binding of a-btx (Table III). PROTEINS 5

159 N. Dimitropoulos et al. Table IV Protein Sugar Interactions Observed in the Simulation of Human a1 ECD Bound to a-btx Carbohydrate Human a1 ECD a-btx NAG2 His204 NAG3 Trp184, His186 MAN5 Ser187 MAN6 Ser187 Thr6, Ser9 MAN7 Ser9 MAN8 Ser187, Val188, Thr189 Thr6, Val40 MAN11 Ala7, Val14, Thr15 Residues involved in van der Waals interactions are in plain font and those forming hydrogen bonds are in bold. In the glycosylated model, the binding of a-btx displays the usual structural features. Most residue-specific contacts are the same to the non-glycosylated model (Table III). A striking difference is the increased contacts between toxin Finger I and the nachr subunit. These contacts are the result of a shift in the toxin position, which aligns the b-strand of Finger I with the sugars (see Fig. 3). Additionally, the toxin molecule interacts heavily with the sugar chain (Table IV). The mannoses mainly interact with residues in strand b9 and in particular with Ser187, which engages in hydrogen bonds with mannoses MAN5, MAN6, and MAN8. At the same time Figure 5 Comparison of the non-glycosylated and the glycosylated models of human a1 ECD-a-Cbtx complex, after 20 ns of MD simulations. The a1 ECD is shown in blue and cyan for the non-glycosylated and the glycosylated model, respectively, while the corresponding a-cbtx molecules are shown in red and orange. The carbohydrate chain is shown with carbon atoms in silver sticks, oxygen atoms in red, and nitrogen atoms in blue. [Color figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.] MAN6 and MAN8 make contacts with toxin residues. Therefore the carbohydrate chain acts as a bridge between a1 and a-btx (see Fig. 4). Additional interactions between the sugars and a-btx are located both in the loop (Thr6, Ala7, Ser9) and the b-strand (Val14, Thr15) of the toxin s Finger I. In analogy to the models of mouse a1, MAN8 exhibited water-mediated contacts with Finger II, and especially with Val40 a direct hydrogen bond can be observed. Human a1 ECD-a-Cbtx complex Figure 4 Close-up view of the human a1 ECD-a-Btx model (after 20 ns of simulation) showing the sugar moieties that mediate the interaction between Ser187 of a1 and Thr6 and Ser9 of a-btx. The a1 ECD and a-btx are shown in cyan and red ribbons, respectively. The carbohydrate chain is shown with carbon atoms in silver sticks, while the displayed a1 and toxin residues are shown with carbon atoms in light blue sticks. In both cases oxygen atoms are shown in red and nitrogen atoms are in dark blue. [Color figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.] Alpha-cobratoxin (a-cbtx) is a long-chain a-neurotoxin (71 amino acid residues) from the venom of Naja siamensis. Like a-btx, its spatial structure is the characteristic three-finger fold. 56 Models of a-cbtx bound to the human a1 ECD were built and subjected to 20 ns of MDs (see Fig. 5). In the non-glycosylated model, the binding of a-cbtx is largely similar to that of a-btx. Loop C of a1 is tightly surrounded by Fingers I II and C-terminal loop of a-cbtx. Finger II inserts into the binding site of a1, with Arg33 (corresponding to Arg36 in a-btx) and Phe29 (Phe32 in a-btx) forming a strong p-cation interaction system with Tyr93, Trp149, Tyr190, and Tyr198, as observed in the crystal structure of a-cbtx bound to AChBP. 16 Arg33 additionally displays numerous hydrogen bonds with Thr148, Thr149 (water-mediated), Tyr190, Cys192, and Leu199 (water- 6 PROTEINS

160 MDs on Glycosylated Human nachr a1 ECD Table V Comparison of the Toxin Receptor Interactions Between the Non-glycosylated and the Glycosylated Models of Human nachr a1 ECD Bound to a-cbtx a-cbtx Human a1 ECD Human a1 ECD with carbohydrate chain Finger I Pro7 (Pro194), Pro197, Thr189 Pro197 Ile9 Pro194 Pro197 Finger II Asp27 (Tyr190) Ala28 Val91, (Tyr93), (Asp99), Phe100, Trp149 Phe29 Val91, Tyr93, Trp149, Tyr190 Tyr93, Trp149, Tyr190 Ile32 Trp149 Trp149 Arg33 Thr148, (Trp149), Tyr190, Cys192, Tyr198, (Leu199) Tyr93, Trp149, Tyr190, Cys192, Tyr198 Lys35 Ser191 Ser191 Arg36 Tyr93, Tyr198, Asp200 Val37 Thr189 Thr189 C-ter loop Phe65 Pro194 Pro194 Thr67 Ser191 Residues involved in van der Waals interactions are in plain font, those forming hydrogen bonds are in bold, those forming water-mediated hydrogen bonds are in brackets, those forming salt bridges are underlined and those involved in p-cation interactions in italic. mediated). The nearby Arg36 is placed at the bottom of Loop C, forming a hydrogen bond with Tyr93 and a salt bridge with Asp200. Several other residues of a-cbtx are involved in hydrogen bonds and van der Waals interactions with a1 residues (Table V). The glycosylated model displays a small variation in the position of the bound toxin compared to the nonglycosylated model (see Fig. 5). During the simulation, the toxin molecule moves away from Loop A and places over the sugar chain (Table IV). At the same time, the carbohydrate chain moves away from its initial position and shifts closer to the toxin Finger I in a similar way as the human a1 a-btx model. As a result, the toxin-loop C and toxin sugar interactions are enhanced, while several contacts with Loops A and B are lost (Table V). The Table VI Protein Sugar Interactions Observed in the Simulation of Human a1 ECD Bound to a-cbtx Carbohydrate Human a1 ECD a-cbtx NAG2 Ile131, His204, Val206 NAG3 Trp184, (Lys185), His204 MAN4 Trp184 MAN5 Trp184, His186, Ser187 Pro7 MAN6 Trp184 Pro7 MAN7 Trp184, Lys185 MAN8 His186, Val188, (Thr189) Thr6, Pro7, (Val37), Asp38 MAN11 Ile5, Thr6, Pro7 Residues involved in van der Waals interactions are in plain font, those forming hydrogen bonds are in bold and those forming water-mediated hydrogen bonds are in brackets. Figure 6 Close-up view of the protein sugar interactions within the human a1 ECD-a-Cbtx complex. The a1 ECD and a-cbtx are shown in cyan and red ribbons, respectively. The carbohydrate chain is shown with carbon atoms in silver sticks, while residue Trp184 from a1 is shown with carbon atoms in light blue sticks. In both cases oxygen atoms are shown in red and nitrogen atoms are in dark blue. [Color figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.] a1 ECD sugar interactions are summarized in Table VI. The carbohydrate chain seems wrapped around Trp184, which makes van der Waals interactions with NAG3, MAN4, MAN5, MAN6, and MAN7, and therefore stabilizes their conformation (see Fig. 6). Additionally, MAN5 forms two hydrogen bonds with the NH and CO groups of Ser187. Finger I of a-cbtx makes several interactions with the sugars. MAN8 forms hydrogen bonds with residues Thr6, Val37, and Asp38. The mannoses MAN5, MAN6, and MAN8 exhibit van der Waals contacts with Pro7. MAN11 also comes close enough to form contacts with the toxin, albeit short-lived in comparison to the other mannoses. The sugars MAN5 and MAN8 are critical anchor points for the conformation of the carbohydrate chain, as they are involved in numerous interactions with both the a1 ECD and the toxin molecule. Comparison of the mouse model with the crystal structure The crystal structure of the mouse a1-ecd bound to a-btx provides a high-resolution view of nachr a1 with the N-linked oligosaccharide chain and the bound toxin. Modeling of the non-glycosylated mouse a1 subunit revealed minor differences in comparison with the glycosylated structure, which mainly comprise small variations in the conformation of the loops. On the contrary, the binding mode of a-btx is dependent on the presence of PROTEINS 7

161 N. Dimitropoulos et al. Figure 7 Snapshots of the human nachr a1 ECD in complex with a-btx taken at the beginning (A) and at the end (B) of the MD simulations. The a1 ECD and a-btx are shown in cyan and red ribbons, respectively. The carbohydrate chain is shown with carbon atoms in silver sticks, while the toxin residues are shown with carbon atoms in light blue sticks. In both cases oxygen atoms are shown in red and nitrogen atoms are in dark blue. [Color figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.] the sugars. After 20 ns of MDs, the nonsugar model displays a disparity in the position of the bound toxin compared to the crystal structure. While the toxin Finger II is correctly placed inside the binding pocket, surrounded by Loops A, B, and C of the a1 ECD, the rest of the molecule is bent upward. This distorted position is the result of a movement of the toxin molecule during the course of the simulation. After the second nanosecond of simulation the toxin swings upward, so that Finger I and the C-terminal move closer to the upper part of Loop C (a1). Conversely, in the glycosylated model a-btx is much less mobile and remains relatively close to the sugars. Finger I is sandwiched between Loop C and the sugar chain. The mannoses interact with the toxin and stabilize its position. Therefore the change in the first model can be attributed to the lack of interaction with the Asn141-linked carbohydrate chain. The crystal structure of the mouse a1 bound to a-btx revealed a hydration pocket inside the b-sandwich core of nachr. This site harbors a well-ordered water molecule bonded to two buried hydrophilic residues, Thr52 and Ser126. The hydration cavity is also connected to the surface residue Asn94 on Loop A through a second ordered water molecule. Experimental data suggest that this hydrophilic interior of nachr is important for channel function. 22 Our MD study can confirm the ability of this site to accommodate solvent molecules, since all the initial models lacked the crystallographic waters (see Computational Methods). In this way we were able to observe the entrance of water molecules into the cavity during the course of the MD simulations. The most stable and long-lived water molecule mediated the interaction between Thr52 and Ser126 (designated as W1 in Fig. S4 of the Supporting Information). The second water molecule that entered the cavity mediated hydrogen bonding interactions between Asn94 and Ser126 (W2 in Fig. S4, Supporting Information). Both bridging interactions were observed in all the MD simulations, albeit at different time frames. Differences between mouse and human models Since the modeling of human nachr a1 ECD bound to a-btx was based on the mouse a1 crystal structure, the two complexes exhibit a strong similarity. The b- sandwich cores of both human and mouse a1 superimpose very well, while the loops show slightly different trajectories. The binding of a-btx is similar despite its position is slightly changed in the human model. An important difference is found in the core of the binding site: the mouse mutant a211 (which was used for crystallization) has an arginine residue in position 149, while the human a1 has a tryptophan in its place. Various studies indicate Trp149 as a critical residue for agonist and antagonist binding. 14,55 In the human a1 models Trp149 is involved in p-cation interactions with Arg36 of a-btx, contributing in the toxin binding. On the other hand, the Phe189Thr substitution in Loop C has a small impact in the predicted receptor toxin interactions. The N-linked sugar chain behaves differently in the two models of a1. In the mouse model it is slightly per- 8 PROTEINS