Ευρυδίκη Μπουλιμάρη Χημικός

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Ευρυδίκη Μπουλιμάρη Χημικός ΑΥΤΟΜΑΤΗ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΟΥ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΙΟΥ ΤΟΥ ΥΔΡΟΓΟΝΟΥ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΥΒΡΙΔΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ SI/FI. ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: Π.Δ. Τζαναβάρας, Λέκτορας ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

2 Πρόλογος i Πρόλογος Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία μελετήθηκε για πρώτη φορά σε συνθήκες συνεχούς ροής η δυνατότητα προσδιορισμού του Η 2 Ο 2 με βάση την παρεμποδιστική του δράση στην αντίδραση της TCEP με το αντιδραστήριο Ellman s (DTNB). Η εργασία απαρτίζεται από δυο μέρη, το θεωρητικό και το πειραματικό. Στο θεωρητικό μέρος, αναφέρονται αρχικά κάποιοι ορισμοί, ενώ στη συνέχεια καταγράφονται οι βασικές αρχές που διέπουν τις τεχνικές FIA και SIA. Στη συνέχεια γίνεται μία θεωρητική προσέγγιση του υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) όπως επίσης και των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν. Τέλος δίνεται μια βιβλιογραφική επισκόπηση των μεθόδων προσδιορισμού του H 2 O 2 με FIA και SIA. Στο πειραματικό μέρος, επιχειρείται μια προσπάθεια, όσο το δυνατόν λεπτομερέστερης περιγραφής όλων των πειραματικών διαδικασιών που πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο, με σκοπό την ανάπτυξη, βελτιστοποίηση, επικύρωση και εφαρμογή της νέας μεθόδου. Το πειραματικό μέρος της εργασίας έλαβε χώρα στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, του τμήματος Χημείας, της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης από τον Οκτώβριο του 2010 μέχρι τον Φεβρουάριο του Το θέμα της συγκεκριμένης μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας υποδείχθηκε από τον Λέκτορα του Τμήματος Παρασκευά Δ. Τζαναβάρα, η συμβολή του οποίου ήταν καθοριστική σε όλη τη διάρκεια της εργασίας. Τον ευχαριστώ θερμά όχι μόνο για αυτό αλλά και για την αμέριστη συμπαράστασή του, τη συνεχή επιστημονική του καθοδήγηση και την καθημερινή του παρουσία. Ιδιαίτερες ευχαριστίες χρωστώ στον Καθηγητή του Τμήματος Δημήτριο Γ. Θεμελή, ο οποίος ήταν πάντα πρόθυμος να ακούσει τις ανησυχίες και τους προβληματισμούς μου. Οι συμβουλές του ήταν εύστοχες και καθοριστικές για τα πρώτα βήματά μου στον τομέα της Αναλυτικής Χημείας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για την ηθική και υλική συμπαράστασή της, χωρίς την οποία η ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας θα ήταν αδύνατη. Ευρυδίκη Α. Μπουλιμάρη Θεσσαλονίκη, 2011

3 ΠEΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. Πρόλογος ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή 1 1. Αυτοματισμός στο αναλυτικό εργαστήριο 1.1. Ορισμοί Ανάγκη για αυτοματοποίηση Πλεονεκτήματα 3 Βιβλιογραφία 4 2. Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή SIA 2.1. Εισαγωγή Ιστορική εξέλιξη Βασικές αρχές λειτουργίας Οργανολογία ενός αναλυτή SIA Τυπικά στάδια κύκλου ανάλυσης με τη SIA Αναχαίτιση ροής σε συστήματα SIA (stopped flow -SIA) Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα SIA Εφαρμογές της SIA 12 Βιβλιογραφία Υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, Η 2 Ο 2 ) 3.1. Φυσικές και χημικές ιδιότητες του υπεροξειδίου του υδρογόνου Σταθερότητα του υπεροξειδίου του υδρογόνου Εμπορικά διαθέσιμες μορφές του υπεροξειδίου του υδρογόνου Κύριες εφαρμογές του υπεροξειδίου του υδρογόνου To υπεροξείδιο του υδρογόνου στο χίονι To υπεροξείδιο του υδρογόνου στο νερό της βροχής 19 Βιβλιογραφία 21 4.Τρις(2-καρβοξυαίθυλο)φωσφίνη (tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) 22 Βιβλιογραφία ,5-διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (DTNB ή αντιδραστήριο Ellman) 26 Βιβλιογραφία Βιβλιογραφική επισκόπηση 29 Βιβλιογραφία 34

4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 7. Αντιδραστήρια Οργανολογία 7.1. Αντιδραστήρια-Υλικά Οργανολογία Ανάπτυξη αυτόματης μεθόδου για τον προσδιορισμό του Η 2 Ο 2 σε πραγματικά δείγματα με χρήση υβριδικού συστήματος FI/SI 8.1. Αρχή της μεθόδου Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 σε υδατικά διαλύματα Ανάπτυξη μεθόδου Προκαταρκτικά πειράματα Πειράματα αναχαίτισης της ροής Επίδραση του ph Επίδραση των συγκεντρώσεων ποσότητας των TCEP και DTNB Επίδραση του όγκου του εγχυόμενου δείγματος Επίδραση του σπειράματος αντίδρασης Επίδραση θερμοκρασίας Επικύρωση μεθόδου Γραμμικότητα Όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού Επαναληψιμότητα Εκλεκτικότητα και ακρίβεια Ανάλυση πραγματικών δειγμάτων 55 Βιβλιογραφία Συμπεράσματα Περίληψη 59

5 Εισαγωγή Εισαγωγή Η προσπάθεια για βελτιστοποίηση των ήδη υπαρχουσών αναλυτικών μεθόδων από άποψη ευαισθησίας, ακρίβειας, επαναληψιμότητας, μείωσης του χρόνου και του κόστους ανάλυσης και ταυτόχρονα μερικής ή ολικής αντικατάστασης του ανθρώπινου παράγοντα σε αναλύσεις ρουτίνας οδήγησε στην έρευνα για την αυτοματοποίηση των αναλυτικών τεχνικών. Η έρευνα αυτή είχε σαν αποτέλεσμα την εξέλιξη ενός σημαντικού κλάδου της αναλυτικής χημείας. Η τεχνική που κυριάρχησε αρχικά και μονοπώλησε την πρωτοκαθεδρία στην αυτοματοποιημένη ανάλυση ήταν αυτή της αεροδιαχωριζόμενης ροής. Όταν μερικά χρόνια αργότερα εμφανίστηκαν η τεχνική αναλύσεων με εισαγωγή του δείγματος σε συνεχή ροή (FIA) και η διαδοχική έγχυση του δείγματος σε ροή (SIA) οριοθετήθηκε μια νέα εποχή στις αυτοματοποιημένες μεθόδους αναλύσεων. Οι παραπάνω τεχνικές στηρίζονται στη χρησιμοποίηση μη διαχωριζόμενων ρευμάτων αντιδραστηρίων και δείγματος και εισήγαγαν σημαντικές βελτιώσεις, όπως η αυξημένη συχνότητα δειγματοληψίας και αναλύσεων, η άμεση λήψη αποτελεσμάτων, η ευελιξία της ανάλυσης και το μειωμένο κόστος ανάλυσης. Μα πάνω από όλα η ελεγχόμενη διασπορά της ζώνης του δείγματος σε συνδυασμό με τον επαναλήψιμο χρόνο από την εισαγωγή του δείγματος μέχρι την είσοδό του στον ανιχνευτή κατέστησαν δυνατή τη λήψη αξιόπιστων αποτελεσμάτων ακόμα και όταν στο σύστημα της αντίδρασης δεν έχει προλάβει να επιτευχθεί κατάσταση φυσικής και χημικής ισορροπίας. Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία μελετήθηκε για πρώτη φορά σε συνθήκες συνεχούς ροής η δυνατότητα προσδιορισμού του Η 2 Ο 2 με βάση την παρεμποδιστική του δράση στην αντίδραση της TCEP με το αντιδραστήριο Ellman s (DTNB). Το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) είναι μία πολύ σημαντική ένωση καθώς βρίσκει βιομηχανικές, οικιακές και στρατιωτικές εφαρμογές. Η μελέτη συνεπώς αυτής της ένωσης απασχολεί το ενδιαφέρον πολλών ερευνητικών πεδίων, όπως αυτό της ανάλυσης τροφίμων, της περιβαλλοντικής και κλινικής ανάλυσης, του ελέγχου ποιότητας φαρμάκων και της PAT (Process Analytical Technology). 1

6 Κεφάλαιο 1: Αυτοματισμός στο αναλυτικό εργαστήριο Κεφάλαιο 1 Αυτοματισμός στο αναλυτικό εργαστήριο 1.1. Ορισμοί Η έννοια της «αυτοματοποίησης», όπως αυτή έχει οριστεί από την Επιτροπή Αναλυτικής ορολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC) [1], παρερμηνεύεται συχνά από πολλούς αναλυτικούς χημικούς, πιθανότατα γιατί ο ορισμός καθαυτός συμπεριλαμβάνει στη διατύπωσή του ορισμούς άλλων εννοιών, οι διαφορές των οποίων δεν είναι ούτε αυτές πλήρως κατανοητές. Για να δοθεί, επομένως ο ορισμός της «αυτοματοποίησης» κρίνεται σκόπιμο να δοθούν αρχικά οι ορισμοί όλων εκείνων των εννοιών που μπορεί να συγχέονται μεταξύ τους [1,2]. Σύμφωνα, λοιπόν, με την Επιτροπή Αναλυτικής ορολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC), «μηχανισμός» ονομάζεται ο κατάλληλος συνδυασμός των εξαρτημάτων, ένα τουλάχιστον από τα οποία έχει την δυνατότητα να παράγει έργο ή μπορεί να κινείται. Μια «μηχανή» είναι μια διάταξη που αποτελείται από έναν οι περισσότερους μηχανισμούς. Οι μηχανισμοί αυτοί είναι σε θέση να εκτελούν μια ή περισσότερες λειτουργίες. Σύμφωνα πάντα με την IUPAC με τον όρο «μηχανοποίηση» ορίζεται η χρησιμοποίηση μηχανών για την αντικατάσταση, βελτίωση, επέκταση και συμπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας. Τα όργανα χωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Τα «επιστημονικά όργανα», που είναι συσκευές που χρησιμοποιούνται για την παρατήρηση, μέτρηση ή έλεγχο μιας ιδιότητας που αντικαθιστά, επεκτείνει ή συμπληρώνει την ανθρώπινη ικανότητα, και τα «αναλυτικά όργανα», συσκευές που χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση μιας αναλυτικής μεθόδου. Τα όργανα είναι δυνατό να αποτελούνται από έναν ή περισσότερους μηχανισμούς. «Αυτοματοποίηση», συνεπώς, καλείται η συνδυασμένη χρήση μηχανών και οργάνων με σκοπό την αντικατάσταση, τη βελτίωση, την επέκταση και τέλος την συμπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας στην πραγματοποίηση μιας δεδομένης διεργασίας, κατά την οποία ένα τουλάχιστον βασικό στάδιο εκτελείται όχι από ανθρώπινη παρέμβαση αλλά από ένα σύστημα «ανάδρασης» (ανατροφοδότησης, feedback). Το σύστημα ανάδρασης είναι μια μηχανική ή ηλεκτρονική διάταξη που συνδυάζει την λήψη πληροφοριών, από διάφορους αισθητήρες, και την αποστολή εντολών τροποποιώντας τις επιμέρους λειτουργίες των οργάνων με σκοπό την παραγωγή συγκεκριμένου έργου. 2

7 Κεφάλαιο 1: Αυτοματισμός στο αναλυτικό εργαστήριο 1.2. Ανάγκη για αυτοματοποίηση - Πλεονεκτήματα Οι ολοένα αυξανόμενες απαιτήσεις για γρήγορες, αξιόπιστες και οικονομικές αναλύσεις πολλών και ταυτόχρονα διαφορετικής φύσεως δειγμάτων (βιολογικών, βιομηχανικών, γεωργικών, κλινικών, φαρμακευτικών και άλλα) κατέστησαν τις τελευταίες δεκαετίες επιτακτική την ανάγκη ανάπτυξης αυτοματοποιημένων αναλυτικών τεχνικών. Για τον λόγο αυτό δεν είναι λίγες οι ερευνητικές ομάδες, που έχουν στρέψει το ερευνητικό τους ενδιαφέρον προς την κατεύθυνση αυτή [3]. Οι στόχοι, που έπρεπε να επιτευχθούν, ήταν πολλοί, με αρχικό πάντα γνώμονα την αντικατάσταση της χειροκίνητης διαδικασίας. Ο σημαντικότερος ίσως λόγος που οδήγησε στην ανάπτυξη αυτοματοποιημένων τεχνικών ήταν η απελευθέρωση του ανθρώπινου δυναμικού από αναλύσεις ρουτίνας. Αυτό θα επέφερε σημαντικά οφέλη. Θα οδηγούσε όχι μόνο στον μεγαλύτερο δυνατό αριθμό αναλύσεων, αλλά και στην μεγαλύτερη ασφάλεια του προσωπικού, μιας και η έκθεσή του σε επικινδύνους και τοξικούς διαλύτες θα περιοριζόταν, με τον τρόπο αυτό, σημαντικά. Πολύπλοκες μεθοδολογίες μπορούν πλέον να πραγματοποιούνται σε σύντομο χρονικό διάστημα και με λιγότερο κοπιαστικές και επίπονες προκατεργασίες του δείγματος αλλά και πολύ πιο οικονομικά. Ο μεγάλος αριθμός αναλύσεων οδηγεί στην μείωση του κόστους τις κάθε επιμέρους ανάλυσης και το πλεονέκτημα αυτό γίνεται ακόμα σημαντικότερο όταν τα προς ανάλυση δείγματα είναι πολύτιμα ή περιορισμένης ποσότητας. Η ανάγκη για άμεση λήψη αναλυτικών αποτελεσμάτων και η βελτίωση της αναλυτικής διαδικασίας οδήγησαν και αυτές με τη σειρά τους στην αυτοματοποίηση των αναλυτικών διεργασιών. Ο περιορισμός της ανθρώπινης δράσης στις αναλύσεις οδηγεί στην εξάλειψη τυχαίων ή συστηματικών σφαλμάτων, που προέρχονται από τον ανθρώπινο παράγοντα, βελτιώνοντας, έτσι, την ακρίβεια και την επαναληψιμότητα των μετρήσεων. 3

8 Κεφάλαιο 1: Αυτοματισμός στο αναλυτικό εργαστήριο Βιβλιογραφία [1] IUPAC, Compendium of Analytical Nomenclature, The Orange Book, 1 st Edition, Pergamon Press, New York, 1978 [2] Σημειώσεις μαθήματος του Μ.Π.Σ. του τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ., «Προχωρημένη Ενόργανη Χημική Ανάλυση» (Διδάσκων: Επικ. Καθ. Α. Ανθεμίδης) [3] Δ.Γ. Θεμελή, Αυτόματες μέθοδοι χημικής ανάλυσης, Θεσσαλονίκη,

9 Κεφάλαιο 2: Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή-sia Κεφάλαιο 2 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή SIA 2.1. Εισαγωγή Ιστορική εξέλιξη Η τεχνική των Aυτόματων Aναλύσεων με Έγχυση του Δείγματος σε Συνεχή Ροή (Flow injection analysis FIA) ανακαλύφθηκε κάπου στα μέσα του 1974 όταν οι Ruzicka και Hansen δούλευαν πάνω στην ανάπτυξη ενός αισθητήρα αερίων για τον προσδιορισμό ατμών αμμωνίας. Οι ερευνητές είχαν κατασκευάσει ένα κατάλληλο ηλεκτρόδιο, η αρχή λειτουργίας του οποίου βασιζόταν στη μέτρηση της μερικής πιέσεως του αερίου ύστερα από ανάμειξη του δείγματος με κινούμενο ρεύμα NaOH με την βοήθεια μιας περισταλτικής αντλίας. Η ανάμειξη των ρευμάτων γινόταν αμέσως πριν τον ανιχνευτή και οι παραγόμενοι ατμοί NH 3 ανιχνεύονταν στη συνέχεια από το ηλεκτρόδιο. Το πρόβλημα, όμως, ήταν η πολύ αργή απόκριση του αισθητήρα για δείγματα διαφορετικών συγκεντρώσεων. Σε μία στιγμή εκνευρισμού οι ερευνητές, με τη χρήση μιας απλής σύριγγας, εισήγαγαν απευθείας στο ρεύμα NaOH μια ποσότητα δείγματος ορισμένης συγκέντρωσης και προς μεγάλη τους έκπληξη παρατήρησαν την καταγραφή μιας κορυφής, η οποία ήταν επαναλήψιμη και ανάλογη της συγκεντρώσεως του προς ανάλυση συστατικού [1]. Χωρίς ακόμα να έχουν συνειδητοποιήσει την σημαντικότητα της ανακάλυψής τους, δημοσιεύουν στα 1975 την πρώτη τους εργασία [2] και μερικά χρόνια αργότερα δίνουν τον ορισμό της FIA στο πρώτο τους βιβλίο [3]. Σύμφωνα με τους ερευνητές, «Η FIA είναι μια τεχνική που βασίζεται στην έγχυση ενός υγρού δείγματος σε συνεχές, μη διακοπτόμενο, κινούμενο ρεύμα κατάλληλου υγρού. Το εγχυόμενο δείγμα σχηματίζει μια ζώνη, που οδηγείται στον ανιχνευτή, ο οποίος μετρά τη συνεχή μεταβολή μιας φυσικοχημικής παραμέτρου του δείγματος, καθώς αυτό διέρχεται από την κυψελίδα συνεχούς ροής». Με τον ορισμό αυτόν ορίστηκε από την πρώτη στιγμή η πρώτη βασική αρχή της FIA, που δεν είναι άλλη από την έγχυση του δείγματος σε μη διακοπτόμενο ρεύμα ροής. Παρόλα αυτά, στην δεύτερη έκδοση, ο ορισμός της νέας τεχνικής διατυπώνεται ξανά από τους ερευνητές όπως παρακάτω: «FIA ονομάζεται η συλλογή πληροφοριών μέσω της βαθμίδωσης της συγκέντρωσης που δημιουργείται όταν μια αυστηρά καθορισμένη ζώνη δείγματος εγχυθεί και διασπαρθεί σε ένα μη διακοπτόμενο ρεύμα μεταφορέα» [1]. Η δεύτερη αυτή διατύπωση δεν αναιρεί την προηγούμενη αλλά δρα συμπληρωματικά της πρώτης, εισάγοντας και τη δεύτερη αρχή της FIA, που είναι η αυστηρά καθορισμένη και ελεγχόμενη διασπορά της ζώνης του δείγματος. Αυτή η αρχή, συνεπώς δίνει τη δυνατότητα στον χρήστη για λήψη αποτελεσμάτων πριν ακόμα ολοκληρωθεί η αντίδραση και φτάσει σε κατάσταση, τόσο φυσικής όσο και χημικής, ισορροπίας. 5

10 Κεφάλαιο 2: Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή-sia Οι βασικές αρχές της FIA είναι συνεπώς [4]: 1. Ο αυστηρά καθορισμένος όγκος δείγματος, ο οποίος εγχύεται σε ρεύμα κατάλληλου μεταφορέα ή αντιδραστηρίου 2. Η συνεχής και μη διακοπτόμενη ροή των διαλυμάτων 3. Η ελεγχόμενη και επαναλήψιμη διασπορά της ζώνης του δείγματος. 4. Ο επαναλήψιμος χρόνος παραμονής του δείγματος στο σύστημα. Μια δεκαετία περίπου μετά την εισαγωγή της FIA στην πραγματικότητα της χημικής ανάλυσης, η αυξανόμενη απαίτηση κυρίως από τους χώρους της βιομηχανίας και της κλινικής χημείας για μια αυτοματοποιημένη τεχνική, με πιο απλά και ανθεκτικά μηχανικά μέρη, τα οποία να μην έχουν αυξημένες απαιτήσεις για συντήρηση αλλά ταυτόχρονα να δίνουν αξιόπιστες και γρήγορες μετρήσεις, οδήγησε στην γέννηση της «Τεχνικής της Διαδοχικής Έγχυσης του δείγματος σε Ροή» (Sequential Injection analysis, SIA) [5]. Η τεχνική αυτή αποτελεί ουσιαστικά τη δεύτερη γενιά της FIA, και ήρθε να επιλύσει τις δυσχέρειες και τα προβλήματα αυτής. Τα προβλήματα αυτά ήταν : 1. Η κατανάλωση μεγάλων όγκων αντιδραστηρίου, λόγω της συνεχούς λειτουργίας του οργάνου 2. Η συχνά απαιτούμενη βαθμονόμηση του συστήματος 3. Το υψηλό πολλές φορές κόστος συντήρησης των μηχανικών τμημάτων του συστήματος, όπως οι περισταλτικές αντλίες, αλλά και των αναλώσιμων τμημάτων, όπως τα κανάλια ροής που με το πέρασμα του χρόνου φθείρονται. 4. Η ανάγκη χρησιμοποίησης πολλών καναλιών και πολλές φορές περίπλοκων διατάξεων για την ανάμιξη των διαλυμάτων και την αντίδρασή τους Βασικές αρχές λειτουργίας Από την αρχή έγινε κατανοητό ότι η νέα τεχνική ανήκει στην οικογένεια της FIA καθώς διέπεται από τις ίδιες αρχές (έγχυση δείγματος και αντιδραστηρίου, ελεγχόμενη διασπορά και επαναλήψιμος χρόνος από τη στιγμή της έγχυσης του δείγματος μέχρι την έξοδό του.) Η επιτυχία της νέας αυτής τεχνικής βασίζεται στον ακριβή έλεγχο τον δύο κινητικών διεργασιών που συμβαίνουν ταυτόχρονα, καθώς μετακινείται το δείγμα μέσα στο κανάλι. Οι διεργασίες αυτές είναι από τη μία η φυσική διασπορά των ζωνών του δείγματος και τον αντιδραστηρίων και από την άλλη η χημική διεργασία σχηματισμού των προϊόντων, τα οποία οδηγούνται προς τον ανιχνευτή. Το επιπλέον χαρακτηριστικό της SIA που την διακρίνει από την FIA είναι η δυνατότητα αντιστροφής της ροής του δείγματος και του αντιδραστηρίου με τη βοήθεια της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής πολλαπλών θέσεων, έτσι ώστε να μπορούν να πραγματοποιηθούν διάφορες χημικές αντιδράσεις, χωρίς να απαιτείται ο επανασχεδιασμός του πολλαπλού τμήματος ανάμειξης και αντιδράσεων, που απαιτείται στη FIA. 6

11 Κεφάλαιο 2: Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή-sia Η καρδιά επομένως του αναλυτή είναι η βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Οι περιφερειακές θύρες της βαλβίδας είναι συνδεδεμένες με τους περιέκτες των δειγμάτων, των αντιδραστηρίων και το σύστημα ανίχνευσης, ενώ η κεντρική θύρα συνδέεται μέσω ενός σπειράματος παραμονής (holding coil - HC) με κατάλληλη αντλία, με τη βοήθεια της οποίας μπορούμε να επιλέξουμε τη φορά της ροής των διαλυμάτων. Όταν η αντλία λειτουργεί προς τη μια κατεύθυνση αναρροφώνται, μέσω της βαλβίδας, συγκεκριμένοι όγκοι δείγματος και αντιδραστηρίων από τον εκάστοτε περιέκτη και οδηγούνται στοιβάζονται στο σπείραμα παραμονής. Στη συνέχεια θέτουμε την αντλία σε λειτουργία, προς την αντίθετη κατεύθυνση αυτή τη φορά, και οι στοιβαγμένες ζώνες προωθούνται μέσω της ανάλογης θύρας της βαλβίδας προς το σύστημα ανίχνευσης. Η χημική αντίδραση πραγματοποιείται με διέλευση των ζωνών δια μέσω κατάλληλου σπειράματος (reaction coil-rc), στο οποίο λαμβάνει χώρα επικάλυψη των ζωνών και σχηματισμός του επιθυμητού προϊόντος. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η μείωση κατανάλωσης όγκου δείγματος και αντιδραστηρίων και συνεπώς η μείωση του όγκου των παραγόμενων αποβλήτων. Ένα τυπικό διάγραμμα ροής SIA καθώς και η αρχή λειτουργίας της τεχνικής δίνονται σχηματικά στα σχήματα 2.1 και 2.2 αντίστοιχα. Σχήμα 2.1. Τυπικό διάγραμμα ροής αναλυτή SIA. 7

12 Κεφάλαιο 2: Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή-sia Σχήμα 2.2. Αρχή λειτουργίας της SIA [6]. (A) Έγχυση καθορισμένου όγκου δείγματος. (B)Έγχυση καθορισμένου όγκου αντιδραστηρίου - σχηματίζονται ευδιάκριτες ζώνες. (Γ) Έγχυση του διαλύματος του μεταφορέα ή δεύτερου διαλύματος αντιδραστηρίου (Δ) Αναστροφή της ροής - προώθηση προς τον ανιχνευτή. (E) Ανίχνευση καταγραφή κορυφής. Συνοψίζοντας μπορούμε να πούμε ότι η SIA είναι μια τεχνική συνεχούς ροής που πραγματοποιείται με απόλυτα επαναλήψιμο χειρισμό των ζωνών του δείγματος και των αντιδραστηρίων σε συνθήκες μη θερμοδυναμικής ισορροπίας Οργανολογία ενός αναλυτή SIA Τα βασικά τμήματα από τα οποία αποτελείται ένας αναλυτής SIA είναι: 1. Αντλία. Με τη βοήθεια της αντλίας πραγματοποιείται η αναρρόφηση των ζωνών των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων και στη συνέχεια, με αλλαγή της φοράς λειτουργίας της, πραγματοποιείται η προώθησή τους προς τον ανιχνευτή. Η λειτουργία της καθορίζεται από το κατάλληλο λογισμικό. Η λειτουργία της πρέπει να είναι πλήρως επαναλήψιμη και ακριβής. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων οι αντλίες που χρησιμοποιούνται σε συστήματα SIA είναι είτε περισταλτικές είτε τύπου σύριγγας. Μειονέκτημα των περισταλτικών αντλιών είναι ότι δεν είναι εφικτό να δώσουν ροές τελείως απαλλαγμένες από παλμούς, ενώ οι σωλήνες που χρησιμοποιούνται φθείρονται σχετικά εύκολα και δεν επιτρέπουν τη χρήση όλου του φάσματος των διαλυτών. Αντίθετα, οι αντλίες τύπου σύριγγας έχουν το μειονέκτημα της καθορισμένης χωρητικότητας, με αποτέλεσμα να απαιτείται περιοδικό ξαναγέμισμά τους με το διάλυμα του μεταφορέα. 8

13 Κεφάλαιο 2: Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή-sia 2. Βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Έχουν συνήθως 6-10 θέσεις. Βασικό χαρακτηριστικό που πρέπει να διακρίνει μια βαλβίδα είναι οι μικροί νεκροί όγκοι ώστε να αποφεύγεται επιπλέον διασπορά των ζωνών όταν δεν είναι επιθυμητή. Η λειτουργία της βαλβίδας καθορίζεται και αυτή ηλεκτρονικά από το εγκατεστημένο λογισμικό στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. 3. Σπείραμα παραμονής (holding coil). Το σπείραμα αυτό τοποθετείται μεταξύ της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής. Σε αυτό οδηγούνται και στοιβάζονται διαδοχικά και με τη σειρά που επιθυμεί ο χρήστης οι ζώνες των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων πριν την προώθηση τους στον ανιχνευτή. Η χωρητικότητα του σπειράματος αυτού θα πρέπει να είναι ικανή, ώστε να αποτρέπεται η είσοδος των ζωνών δείγματος και αντιδραστηρίου στο διάλυμα του μεταφορέα και να αποφεύγεται η επιμόλυνσή του. 4. Σπείραμα αντίδρασης (reaction coil). Το σπείραμα αυτό τοποθετείται μεταξύ της βαλβίδας επιλογής και του ανιχνευτή. Εκεί λαμβάνει χώρα η αντίδραση μεταξύ του δείγματος και του αντιδραστηρίου οπότε και σχηματίζεται το επιθυμητό προϊόν το οποίο οδηγείται στη συνέχεια στον ανιχνευτή. 5. Σύστημα ανίχνευσης. Πρακτικά χρησιμοποιούνται όλα τα διαθέσιμα συστήματα ανίχνευσης τα οποία μπορούν να λειτουργήσουν σε συνθήκες συνεχούς ροής. 6. Λογισμικό ελέγχου. Η απαραίτητη χρήση κατάλληλου λογισμικού ελέγχου αποτελεί βασική διαφορά μεταξύ των τεχνικών FIA και SIA. Με το λογισμικό αυτό ελέγχονται πλήρως όλες οι απαραίτητες λειτουργίες του αναλυτή (εισαγωγή δειγμάτων και αντιδραστηρίων, σειρά ανάμιξης, παροχές όγκου κ.α.) Τυπικά στάδια κύκλου ανάλυσης με τη SIA Ένας κύκλος ανάλυσης με την τεχνική της SIA περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: 1. Προώθηση του διαλύματος του μεταφορέα προς τον ανιχνευτή (πλήρωση του σπειράματος συγκράτησης, του σπειράματος αντίδρασης και της κυψελίδας του ανιχνευτή) μέχρι λήψη σταθερής γραμμής βάσης. 2. Αναρρόφηση καθορισμένου όγκου δείγματος στο σπείραμα παραμονής. 3. Αναρρόφηση καθορισμένων όγκων διαλυμάτων αντιδραστηρίων στο σπείραμα παραμονής. 4. Προώθηση του μίγματος της αντίδρασης προς τον ανιχνευτή (ενδέχεται να εφαρμοστεί αναχαίτιση της ροής, πριν ή εντός του ανιχνευτή κατά περίπτωση). 5. Καταγραφή των σημάτων 6. Προώθηση του προϊόντος της αντίδρασης στα απόβλητα. 9

14 Κεφάλαιο 2: Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή-sia 2.5. Αναχαίτιση ροής σε συστήματα SIA (stopped flow -SIA) Με την τεχνική της αναχαίτισης της ροής παρέχεται στο χημικό σύστημα περισσότερος χρόνος προκειμένου να εξελιχθεί η αντίδραση, χωρίς την επίδραση της αξονικής διασποράς στις ζώνες του δείγματος και των αντιδραστηρίων. Στόχοι της εφαρμογής της τεχνικής της αναχαίτισης της ροής είναι: 1. Η αύξηση της ευαισθησίας ενός προσδιορισμού σε περιπτώσεις αργών αντιδράσεων. 2. Η αύξηση της εκλεκτικότητας άρση παρεμποδίσεων υποστρώματος. 3. Η κινητική θεωρητική μελέτη των αντιδράσεων. 4. Η ανάπτυξη μεθόδων ταυτόχρονων προσδιορισμών με κινητική διαφοροποίηση. Στα σχήματα 2.3 και 2.4 δίνονται αντίστοιχα η αρχή της τεχνικής και τα τυπικά λαμβανόμενα καταγραφήματα. Σχήμα 2.3. Προφίλ ζώνης του δείγματος με εφαρμογή αναχαίτισης της ροής [7]. 10

15 Κεφάλαιο 2: Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή-sia Σχήμα 2.4. Τυπικό γράφημα εφαρμογής αναχαίτισης της ροής σε ένα σύστημα SIA / FIA [8]. Στην περίπτωση α) ευνοείται ο σχηματισμός του προϊόντος της αντίδρασης με το χρόνο αναχαίτισης. Στην περίπτωση β) η αντίδραση είναι ανεξάρτητη του χρόνου αναχαίτισης και τέλος στην περίπτωση γ) το προϊόν της αντίδρασης αρχίζει να αποικοδομείται κατά τον χρονικό διάστημα αναχαίτισης της ροής. Η αναχαίτιση της ροής μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε πριν είτε μέσα στην κυψελίδα του ανιχνευτή. Αναχαίτιση της ροής μέσα στον ανιχνευτή δίνει τη δυνατότητα στον αναλυτή να παρακολουθήσει την πορεία εξέλιξης της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο παρέχοντας τη δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων που αφορούν στο μηχανισμό της αντίδρασης. Με αναχαίτιση της ροής πριν τον ανιχνευτή απλά παρατείνεται ο χρόνος αντίδρασης. Η προσέγγιση αυτή επιλέγεται σε περιπτώσεις επίδρασης της ακτινοβολίας των οπτικών ανιχνευτών στην αντίδραση Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα SIA Τα βασικά πλεονεκτήματα της SIA σε σχέση με την FIA είναι: 1. Είναι οργανολογικά απλούστερη από τη FIA, αφού ανεξαρτήτως από τον αριθμό των διαλυμάτων, χρησιμοποιείται μια και μόνο βαλβίδα πολλαπλής επιλογής, μια μονοκαναλική αντλία και μόνο ένα κανάλι ροής. Όλες δηλαδή οι απαραίτητες διεργασίες για τον προσδιορισμό γίνονται σε μονοκαναλικό σύστημα. 11

16 Κεφάλαιο 2: Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή-sia 2. Η κατανάλωση των αντιδραστηρίων και των δειγμάτων καθώς και οι όγκοι των παραγόμενων αποβλήτων είναι σημαντικά μικρότεροι αφού τα αντιδραστήρια εισάγονται μέσω της βαλβίδας σε αυστηρά καθορισμένους όγκους και δεν ρέουν συνεχώς. 3. Οι βασικές γεωμετρικές παράμετροι ενός συστήματος SIA, δηλαδή οι όγκοι και οι ταχύτητες ροής, μπορούν εύκολα να μεταβάλλονται με τη βοήθεια κατάλληλου λογισμικού. Tα κυριότερα μειονεκτήματα της τεχνικής SIA, ως προς την πρόδρομή της, FIA, αφορούν το κόστος της οργανολογίας και της απόκτησης του απαραίτητου λογισμικού. Επίσης, είναι σχετικά δύσκολη η εφαρμογή πολύπλοκων χημικών συστημάτων που απαιτούν πολλαπλά στάδια αντιδράσεων, καθώς και τεχνικές προκατεργασίας όπως η εκχύλιση υγρού Εφαρμογές της SIA Τα τελευταία χρόνια οι αυξημένες απαιτήσεις για αυτοματισμό των αναλυτικών διατάξεων οδήγησαν στην εκτεταμένη χρήση της τεχνικής SIA. Οι κυριότερες εφαρμογές της, όπως προκύπτει βιβλιογραφικά από πρόσφατα άρθρα επισκόπησης είναι οι παρακάτω: 1. Ανάλυση Τροφίμων [9]. 2. Περιβαλλοντική ανάλυση [10] 3. Κλινική ανάλυση [11] 4. Έλεγχος Ποιότητας φαρμάκων [12-14] 5. PAT(Process Analytical Technology) [15]. 12

17 Κεφάλαιο 2: Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή-sia Βιβλιογραφία [1] Ε.Η. Hansen, Comprehensive Anal. Chem. 54 (2008) 3 [2] J.Ruzicka, E.H. Hansen, Anal. Chim. Acta 78 (1975) 145 [3] J.Ruzicka, E.H. Hansen, Flow injection analysis, 1 st edition, Wiley, New York, 1981 [4] Δ.Γ. Θεμελή, Αυτόματες μέθοδοι χημικής ανάλυσης, Θεσσαλονίκη 1998 [5] J.Ruzicka, G.D. Marschall, Anal. Chim. Acta 237 (1990) 329 [6] J.Ruzicka, Comprehensive Anal. Chem. 54 (2008) 23 [7] Φ.Σ. Κίκα, «Αναλυτικές εφαρμογές του χρωμοτροπικού οξέως σε αυτοματοποιημένα συστήματα συνεχούς ροής με τις τεχνικές FIA και SIA». Διδακτορική Διατριβή, Θεσσαλονίκη, 2006 [8] Π.Δ Τζαναβάρα, «Ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού ορισμένων ανιόντων με την τεχνική της έγχυσης του δείγματος σε συνεχή ροή», Διδακτορική Διατριβή, Θεσσαλονίκη, 2003 [9] R. Perez-Olmos, J.C. Soto, N. Zarate, A.N. Araujo, J.L.F.C. Lima, M.L.M.F.S. Saraiva, Food Chem. 90 (2005) [10] M. Miro, E.H. Hansen, TRAC-Trends Anal. Chem. 25 (2006) [11] A. Economou, P.D. Tzanavaras, D.G. Themelis, Cur. Pharm. Anal. 3 (2007) 1-13 [12] K. Mervartova, M. Polase, J.M. Calatayud, J. Pharm. Biomed. Anal. 45 (2007) [13] A.M. Pimenta, M.C.B.S.M. Montenegro, A.N. Araujo, J.M. Calatayud, J. Pharm. Biomed. Anal. 40 (2006) [14] P. Solich, M. Polasek, J. Klimundova, J. Ruzicka, TRAC-Trends Anal. Chem. 22 (2003) [15] N.W. Barnett, C.E. Lenehan, S.W. Lewis, TRAC-Trends Anal. Chem. 18 (1999)

18 Κεφάλαιο 3: Υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, Η 2 Ο 2 ) Κεφάλαιο 3 Υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, Η 2 Ο 2 ) 3.1. Φυσικές και χημικές ιδιότητες του υπεροξειδίου του υδρογόνου Το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) είναι υγρό περισσότερο παχύρρευστο από το νερό (σχήμα 3.1). Σε αραιά διαλύματα εμφανίζεται άχρωμο. Έχει σχετική μοριακή μάζα 32,015 και ειδικό βάρος 1,44 g/cm 3. Παράγεται στην φύση από τους οργανισμούς ως παραπροϊόν του μεταβολισμού τους. Σχεδόν όλα τα ζωντανά όντα διαθέτουν ειδικά ένζυμα, τις υπεροξειδάσες, τα οποία το αποικοδομούν [1]. Σχήμα 3.1. Υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το Η 2 Ο 2 είναι ένα ισχυρότατο οξειδωτικό αντιδραστήριο, ισχυρότερο από το χλώριο (Cl 2 ), το διοξείδιο του χλωρίου (ClO 2 ) και τα υπερμαγγανικά ανιόντα (MnO 4 - ). Ως οξειδωτική ουσία θεωρείται ως η πλέον φιλική στο περιβάλλον, αφού η οξειδωτική δράση του δεν δημιουργεί τοξικά παραπροϊόντα σε αντίθεση με άλλα ισχυρά οξειδωτικά μέσα (χλώριο, νιτρικό οξύ, όζον) και η περίσσειά του καταστρέφεται πλήρως είτε με θέρμανση είτε καταλυτικά. Ωστόσο, είναι χαρακτηριστικό το ότι δρα και ως ήπιο αναγωγικό μέσον, τόσο σε όξινα, όσο και σε αλκαλικά διαλύματα (με έκλυση πάντοτε Ο 2 ). Ο ογκομετρικός προσδιορισμός του Η 2 Ο 2 βασίζεται στην αντίδρασή του (ως αναγωγικού) με πρότυπα διαλύματα υπερμαγγανικού καλίου ή δημητρίου(iv) σε όξινα διαλύματα, αλλά και ως οξειδωτικού (προσθήκη περίσσειας ιωδιούχων, οξείδωση μέρους τους από το Η 2 Ο 2 προς ιώδιο, ογκομέτρηση του ιωδίου με πρότυπο διάλυμα θειοθειικών). Σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις το Η 2 Ο 2 προσδιορίζεται με μια μεγάλη ποικιλία φωτομετρικών, φθορισμομετρικών και ηλεκτροχημικών μεθόδων. 14

19 Κεφάλαιο 3: Υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, Η 2 Ο 2 ) 3.2. Σταθερότητα του υπεροξειδίου του υδρογόνου Με την επίδραση του φωτός διασπάται ο υπεροξειδικός -Ο-Ο- δεσμός και παράγονται οι εξαιρετικά οξειδωτικές ρίζες υδροξυλίου (HO ). Το Η 2 Ο 2 διασπάται αυτόματα σε νερό και οξυγόνο σε υψηλές θερμοκρασίες, για τον λόγο αυτόν η απομόνωση πρακτικά καθαρού Η 2 Ο 2 από τα υδατικά του διαλύματα πραγματοποιείται με απόσταξη υπό κενό για να αποφευχθούν υψηλές θερμοκρασίες. Πολλά μέταλλα (π.χ. ο Ag) και μεταλλικά οξείδια καταλύουν τη διάσπαση του Η 2 Ο 2. Ιδιαίτερα έντονη είναι η καταλυτική δράση του MnO 2 η επίδραση του οποίου πάνω στο Η 2 Ο 2 αποτελεί "παραδοσιακό" πείραμα επίδειξης καταλυόμενης χημικής αντίδρασης και αποτελεί σχετικά ακίνδυνη μέθοδο παρασκευής οξυγόνου στα σχολικά εργαστήρια. Το Η 2 Ο 2 διασπάται από το ένζυμο καταλάση, το οποίο αποτρέπει τη συσσώρευση του στους ζωικούς ιστούς, αφού το Η 2 Ο 2 αποτελεί προϊόν πλήθους βιοχημικών αντιδράσεων. 'Εχει υπολογισθεί ότι ένα μόριο καταλάσης διασπά μόρια Η 2 Ο 2 κάθε δευτερόλεπτο. Ο χαρακτηριστικός αφρισμός που προκαλείται σε μια πληγή κατά τον καθαρισμό της με οξυζενέ και οφείλεται ακριβώς στη δράση της καταλάσης, η οποία προέρχεται από τα κατεστραμμένα κύτταρα. Ορισμένες ύαλοι καταλύουν τη διάσπαση του Η 2 Ο 2 και έτσι πυκνά διαλύματά του διατίθενται σε πλαστικές φιάλες από πολυαιθυλένιο. Ακόμη και απλά σωματίδια σκόνης μπορούν να προκαλέσουν καταλυτική διάσπαση του Η 2 Ο 2. Στα πώματα των πλαστικών φιαλών υπάρχει συνήθως μια μικρή οπή για να αποφευχθεί η ανάπτυξη πίεσης από το παραγόμενο οξυγόνο κατά τη βραδεία διάσπαση του Η 2 Ο 2 [2] Εμπορικά διαθέσιμες μορφές του υπεροξειδίου του υδρογόνου Το Η 2 Ο 2 βρίσκει πάρα πολλές εφαρμογές στην καθημερινότητα οι οποίες είναι: Το Η 2 Ο 2 είναι ένας πολύ καλός τρόπος, ιδιαίτερα αποτελεσματικός και ίσως ο ισχυρότερος τρόπος καθαρισμού και απολύμανσης των φακών επαφής. Μειονεκτεί στον χρόνο που χρειάζεται για να ολοκληρώσει τον κύκλο αποστείρωσης και εξουδετέρωσης (6 ώρες αναγκαστική παραμονή στο διάλυμα). Επίσης αρκετές φορές η εξουδετέρωση του υπεροξειδίου (μετατροπή του σε οξυγόνο και νερό) δεν είναι επαρκής και ενοχλεί με τσούξιμο τα περισσότερο ευαίσθητα μάτια. Έχει όμως άριστα αποτελέσματα βακτηριδιακής και μυκητιακής καταπολέμησης, με ευρύ αντιμικροβιακό φάσμα [3]. 15

20 Κεφάλαιο 3: Υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, Η 2 Ο 2 ) Υδατικό διάλυμα 3% w/w Η 2 Ο 2 διατίθεται ελεύθερα από τα φαρμακεία ως ήπιο αντισηπτικό (οξυζενέ) για καθαρισμούς τραυμάτων και ως λευκαντικό οικιακής χρήσης. Ως πυκνότερο διάλυμα (τυπικά 15% w/w) διατίθεται σε επαγγελματίες κομμωτές σε διάφορα εμπορικά καλλυντικά σκευάσματα ως "ξεβαφτικό μαλλιών". Σημειώνεται ότι διαλύματα Η 2 Ο 2 με περιεκτικότητα ίση ή μεγαλύτερη από 8% χαρακτηρίζονται ως προς τη διακίνησή τους ως "οξειδωτικά" και πρέπει να φέρουν τη χαρακτηριστική σήμανση. Το Η 2 Ο 2 διατίθεται από οίκους χημικών αντιδραστηρίων σε χημικά εργαστήρια ως υδατικό διάλυμα 30-35% w/w, το οποίο είναι γνωστό ως Perhydrol. Στο Perhydrol συχνά προστίθενται μικρές συγκεντρώσεις σταθεροποιητικών ουσιών, όπως 0,02% ακετανιλίδιο (Aldrich) ή 0,006% νιτρικό αμμώνιο (Merck). Στη συγκέντρωση αυτή το Η 2 Ο 2 είναι ιδιαίτερα καυστικό για το δέρμα στο οποίο προκαλεί λεύκανση ("λευκό έγκαυμα") και χαρακτηριστικό πόνο. Αυτό οφείλεται στην είσοδο Η 2 Ο 2 στα τριχοειδή αιμοφόρα αγγεία, όπου διασπάται εκλύοντας οξυγόνο το οποίο προκαλεί εμβολή (απόφραξη) σε αυτά, καταστρέφοντας τοπικά τον ιστό. Το ίδιο αποτέλεσμα μπορεί να έχει και παρατεταμένη επαφή του δέρματος με αραιότερα διαλύματά του. Ως πυκνότερο διάλυμα (50-70% w/w) το Η 2 Ο 2 διατίθεται μόνο σε εξουσιοδοτημένους χρήστες, όπως π.χ. σε χημικές βιομηχανίες, βιομηχανίες χάρτου και ξυλείας, όπως και σε μονάδες επεξεργασίας λημμάτων. Εξειδικευμένοι οίκοι διαθέτουν Η 2 Ο 2 σε ακόμη μεγαλύτερες συγκεντρώσεις (85-98% w/w), το οποίο είναι γνωστό ως hight test peroxide (HTP) και χρησιμοποιείται κυρίως ως προωθητικό πτητικών συσκευών (jetpacks) και πυραύλων. Τέλος σχηματίζει μικτές ενώσεις με διάφορα άλατα, γνωστότερα από τα οποία είναι το υπερβορικό νάτριο (NaBO 2.H 2 O 2.3H 2 O) και το υπερανθρακικό νάτριο (2Na 2 CO 3.3H 2 O 2 ). Τα άλατα αυτά (υπεροξυάλατα) παράγονται βιομηχανικά σε μεγάλες ποσότητες και αποτελούν ένα είδος "στερεής" μορφής του Η 2 Ο 2. Είναι ασφαλή στη χρήση και χρησιμοποιούνται ως δραστικά συστατικά πολλών απορρυπαντικών και λευκαντικών προϊόντων οικιακής χρήσης. Είναι πιο ήπια ως προς τη δραστικότητα και λιγότερο καταστρεπτικά για τα υφάσματα από τα υποχλωριώδη (χλωρίνες). Τα άλατα αυτά χρησιμοποιούνται επίσης σε διάφορα ήπια αντισηπτικά φαρμακευτικά σκευάσματα. 16

21 Κεφάλαιο 3: Υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, Η 2 Ο 2 ) 3.4. Κύριες εφαρμογές του υπεροξειδίου του υδρογόνου 1. Βιομηχανικές εφαρμογές: Η ετήσια παραγωγή του Η 2 Ο 2 υπολογίζεται σε 2 εκατομμύρια τόνους. 'Eχει πολλές βιομηχανικές εφαρμογές αλλά περισσότερο από το 50% της παραγωγής του φαίνεται ότι χρησιμοποιείται αποκλειστικά για τη λεύκανση του χαρτιού. Ως πρώτη ύλη στη βιομηχανία χρησιμοποιείται: Στην παραγωγή υπερανθρακικού και υπερβορικού νατρίου για απορρυπαντικά. Σε αποχρωματισμούς προϊόντων, όπως υφασμάτων, ξυλείας κ.α. Στην παρασκευή άλλων χημικών ενώσεων όπως διβενζοϋλοϋπεροξειδίου, υπεροξέων, εποξειδικών ενώσεων και προπυλενοξειδίου που με τη σειρά τους χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση πλήθους χημικών προϊόντων. 2. Οικιακές εφαρμογές: Ως διάλυμα 8-15% χρησιμοποιείται για τον αποχρωματισμό μαλλιών (bleach human hair). Το H 2 O 2 αντιδρά με τη μελανίνη, τη φυσική χρωστική των μαλλιών, καταστρέφει τους διπλούς δεσμούς προκαλώντας αποχρωματισμό της τρίχας και αφήνοντάς την με το ξανθό χρώμα της κερατίνης (peroxide blonde). Ως υδατικό διάλυμα 3% (οξυζενέ) χρησιμοποιείται ως ήπιο αντισηπτικό για καθαρισμό πληγών. Η δράση του είναι διπλή, αφενός μεν καταστρέφει οξειδωτικά τους μικροοργανισμούς, αφετέρου με τον αφρισμό που δημιουργεί η διάσπασή του, απομακρύνει μηχανικά μολυσματικούς παράγοντες και καθαρίζει την πληγή. Χρησιμοποιείται ως έχει ή ως υπερβορικό νάτριο ως ήπιο αντισηπτικό σε διαλύματα έκπλυσης της στοματικής κοιλότητας, σε διαλύματα καθαρισμού φακών επαφής και τεχνητών οδοντοστοιχιών. Υπό τη μορφή καρβαμιδικού υπεροξειδίου (μικτή ένωση με ουρία, H 2 NCONH 2.H 2 O 2 )χρησιμοποιείται σε λευκαντικά σκευάσματα (π.χ. σε μορφή ζελέ) δοντιών, σε σταγόνες καθαρισμού των αυτιών. 3. Άλλες χρήσεις του: Μεγάλες ποσότητες Η 2 Ο 2 χρησιμοποιούνται σε μονάδες επεξεργασίας αποβλήτων για την απομάκρυνση οσμών θειολών και άλλων θειούχων ενώσεων και ως απολυμαντικό. Για τον έλεγχο της ανάπτυξης μυκήτων σε ψάρια και αυγά ψαριών (FDA). Στην κηπουρική μερικοί προσθέτουν Η 2 Ο 2 στο νερό ποτίσματος, γιατί η απελευθέρωση οξυγόνου φαίνεται ότι ενισχύει τις ρίζες των φυτών. 4. Στρατιωτικές εφαρμογές: Ως πυκνότερο μίγμα με το νερό (>90%) έχει χρησιμοποιηθεί ως προωστική ουσία πυραύλων: α) ως έχει, αφού με καταλύτη (συνήθως με πλέγμα αργύρου ή επαργυρωμένο ορείχαλκο), διασπάται προς οξυγόνο και υπέρθερμους ατμούς ύδατος (1 mol Η 2 Ο 2 κατά τη διάσπασή του σε Η 2 Ο και Ο 2 εκλύει θερμότητα 98 kj), β) ως οξειδωτικό σε συνδυασμό με κάποια καύσιμη ουσία (παραφίνες, υδραζίνη). 17

22 Κεφάλαιο 3: Υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, Η 2 Ο 2 ) Στα υποβρύχια το Η 2 Ο 2 (περιεκτικότητας 90% και πλέον) έχει χρησιμοποιηθεί ως πηγή θερμότητας και οξυγόνου, αλλά και ως προωστική ουσία τορπιλών [2] Το υπεροξείδιο του υδρογόνου στο χιόνι Το Η 2 Ο 2 σχηματίζεται στην ατμόσφαιρα, είτε στην αέρια φάση είτε στα σύννεφα, με βάση την παρακάτω εξίσωση : HΟ 2 + HΟ2 H2 Ο 2 + Ο 2, σύμφωνα με την παραπάνω εξίσωση τα σύννεφα καθαρίζουν τον αέρα από το HΟ 2 και το H 2 Ο 2. Υπάρχουν δύο διαφορετικοί μηχανισμοί για την απομάκρυνση του H 2 Ο 2 : (α) Μέσα στα σύννεφα, με θερμοκρασίες μικρότερες από -10 C, οι σταγόνες του νερού που συχνά υπερψύχονται συνυπάρχουν μαζί με κρύσταλλα πάγου. Τα κρύσταλλα πάγου που έχουν μια χαμηλότερη πίεση ατμού από τα σταγονίδια νερού είναι σε θέση να αυξηθούν από τη διάχυση υδρατμών εις βάρος των σταγονιδίων. (β) Ο άλλος μηχανισμός της αύξησης των κρυστάλλων πάγου είναι η σύγκρουση των κρυστάλλων πάγου με τα σταγονίδια που ακολουθούνται από απότομη ψύξη. Για πολύ χαμηλές θερμοκρασίες πολικών περιοχών, σύμφωνα με τον πρώτο μηχανισμό, βρέθηκε ότι τουλάχιστον το κύριο ποσοστό H 2 Ο 2 στον πάγο μάλλον διανέμεται ομοιόμορφα στο δικτυωτό του πλέγμα. Με βάση το δεύτερο μηχανισμό, τα διαλυμένα μόρια του H 2 Ο 2 θα διατηρηθούν στις αρχικές θέσεις τους μετά την ψύξη. Μετά από πειράματα βρέθηκε ότι η σειρά έκλουσης κατά την τήξη ενός ομογενοποιημένου κομματιoύ πάγου είναι η εξής : αλκαλιμέταλλα και πρωτόνια > ανιόντα > NH4 + > H 2 Ο 2. Όταν η θερμοκρασία στο κομμάτι χιονιού είναι κάτω από 0 C, οι συγκεντρώσεις των σημαντικότερων ιόντων δεν αλλάζουν. Εντούτοις, παρατηρήθηκε μια αξιοσημείωτη μείωση της συγκέντρωσης του H 2 Ο 2, ένα φαινόμενο που εξηγείται από τη φωτόλυση. Αν και η έκλουση του H 2 Ο 2 είναι πιό αργή από αυτή των άλλων ιόντων, παρατηρήθηκε ένας ισχυρός εμπλουτισμός από H 2 Ο 2 στην αρχή της τήξης του πάγου. Αποκλείεται απώλεια του κατά τη διάρκεια της ανακρυστάλωσης. Η διαφορά στη σειρά έκλουσης εξηγείται από τις διαφορές της διαλυτότητας στον πάγο, την άνιση διανομή στην αρχή της τήξης και το χρωματογραφικό διαχωρισμό κατά τη διάρκεια της τήξης του πάγου. 18

23 Κεφάλαιο 3: Υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, Η 2 Ο 2 ) Επισημάνθηκε ότι οι διαφορές στη συγκέντρωση του H 2 Ο 2 στο χίονι προκαλούνται από τη κίνηση του χιονιού, η οποία οδηγεί σε αλλαγές στην επιφάνεια της δομής, και κατά συνέπεια, σε αλλαγές της πυκνότητας του χιονιού και της γωνίας της έκθεσης στην ηλιακή ακτινοβολία. Οι συνέπειες είναι διάφορες στη φωτολυτική αποσύνθεση και εξάτμιση, και επίσης στον περιστασιακό σχηματισμός του υγρού νερού [4] Το υπεροξείδιο του υδρογόνου στο νερό της βροχής Στα υψηλά επίπεδα της ατμόσφαιρας, ασταθή μόρια οξυγόνου που ονομάζονται όζον, με χημικό τύπο Ο 3, και δημιουργούνται από το φως του ήλιου και τις κοσμικές ακτίνες αλληλεπιδρούν με μόρια οξυγόνου. Καθώς είναι βαρύτερα από το οξυγόνο (Ο 2 ), αυτά τα μόρια πέφτουν αργά στη γη, έρχονται σε επαφή με τους υδρατμούς του νερού και γίνονται μέρος της βροχής. Αυτές οι ελεύθερες ρίζες ενώνονται χημικά με τους υδρατμούς του νερού και παράγεται υπεροξείδιο υδρογόνου. Αυτό πέφτει στη συνέχεια στο έδαφος διαλυμένο και αραιωμένο στο νερό βροχής. Ο σχηματισμός του γίνεται ως εξής : O 3 + H 2 O H 2 O 2 + Ο 2 Η παρουσία μορίων Η 2 Ο 2 είναι ένας από τους λόγους για τους οποίους το νερό της βροχής είναι καλύτερο για τα φυτά από το συνηθισμένο νερό βρύσης. Με αυτό το νερό τα φυτά λαμβάνουν περισσότερο οξυγόνο στις ρίζες και τα φύλλα τους. Το υπεροξείδιο υδρογόνου οξειδώνει πολλά είδη παθογόνων μικροοργανισμών και απομακρύνει τους ατμοσφαιρικούς ρύπους από τον αέρα στο έδαφος. Έτσι βοηθά στον καθαρισμό του αέρα, καθώς η βροχή πέφτει και αυτός είναι ο λόγος που ο αέρας μυρίζει τόσο καθαρός μετά από μια καταιγίδα [5]. Αυτήν την περίοδο υπάρχει λιγότερο υπεροξείδιο στο νερό βροχής από ότι στο παρελθόν, δεδομένου ότι η οξειδωτική ατμοσφαιρική ρύπανση τώρα «καταναλώνει» ένα μεγάλο μέρος του υπεροξειδίου [6]. Μετά από πειράματα παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση του Η 2 Ο 2 αυξάνεται στην επιφάνεια του θαλασσινού νερού μετά από συνεχόμενες μέρες βροχής [5]. Η συγκέντρωση του Η 2 Ο 2 στο νερό της βροχής ποικίλει με την ώρα της μέρας, με μικρότερες συγκετρώσεις νωρίς το πρωί και μεγαλύτερες αργά το απόγευμα [7]. Τα επίπεδα του Η 2 Ο 2 μειώνονται γενικά με την ώρα κατά τη διάρκεια μιας καταιγίδας. Οι μετρούμενες τιμές του Η 2 Ο 2 είναι μικρότερες από αυτές που προβλέπονται όταν βρίσκεται μέσα στα σύννεφα [8]. Η διαδοχική δειγματοληψία δείχνει τη γρήγορη παραγωγή του Η 2 Ο 2 και την ενσωμάτωση του στη βροχή κατά τη διάρκεια των θερινών πρωινών βροχών. 19

24 Κεφάλαιο 3: Υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, Η 2 Ο 2 ) Σύμφωνα με πειράματα, η ετήσια απόθεσή του από τη βροχή είναι περίπου 12 mmole m -2 yr -1. Οι υψηλότερες συγκεντρώσεις Η 2 Ο 2 και τα μεγαλύτερα ποσά βροχοπτώσεων είναι περίπου επτά φορές μεγαλύτερα κατά τη διάρκεια των θερινών μηνών από τους χειμερινούς [9]. 20

25 Κεφάλαιο 3: Υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide, Η 2 Ο 2 ) Βιβλιογραφία [1] Υπεροξείδιο υδρογόνου-βικιπαίδεια, URL: november 2010 [2] Η χημική ένωση του μήνα: Υπεροξείδιο υδρογόνου, URL: november 2010 [3] Καθαρισμός των φακών επαφής, URL: November 2010 [4] R. Herrmann, J. Kranz, Nord. Hydrol. 26 (1995) [5] J.D. Willeyl, H.W. Paer, M. Go, Mar. Ecol. Prog. Ser. 178 (1999) [6] Food Grade Hydrogen Peroxide Ingestion for Health in the Human Body Truth or Dare, URL: February 2011 [7] J. Yuan, A.M. Shiller, Atm. Envir. 34 (2000) [8] G.L. Kok, Atm. Envir. 14 (1980) [9] M. Santos, J. Pedrotti and A. Fornaro, Evaluation of hydrogen peroxide in rainwater in downtown São Paulo in Highway and Urban Environment (G.M. Morrison & S. Rauch, Eds) 12 (2007)

26 Κεφάλαιο 4: Τρις (2-καρβοξυαίθυλο) φωσφίνη (tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) Κεφάλαιο 4 Τρις (2-καρβοξυαίθυλο) φωσφίνη (tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) Η ικανότητα και η αποτελεσματικότητα των τριαλκυλοφωσφινών στην αναγωγή των πρωτεϊνικών και μη δισουλφιδικών δεσμών είναι γνωστή εδώ και πολλά χρόνια. Οι φωσφίνες είναι πολύ σταθερές σε υδατικό περιβάλλον, ανάγουν εκλεκτικά τους δισουλφιδικούς δεσμούς και δεν αντιδρούν με άλλες χαρακτηριστικές ομάδες που υπάρχουν στις πρωτεΐνες. Ωστόσο, η δυσάρεστη οσμή τους και η μικρή διαλυτότητα στο νερό είναι δύο παράγοντες που παρεμποδίζουν την ευρεία εφαρμογή τους. Τα μειονεκτήματα αυτά εξαλείφθηκαν με τη χρήση της TCEP, η οποία αναφέρθηκε για πρώτη φορά ως αντιδραστήριο αναγωγής δεσμών S-S το 1969 από τον Levison [1]. Τα κύρια πλεονεκτήματα της TCEP μπορούν να συνοψιστούν στα παρακάτω: α) διαλύεται εύκολα και είναι πολύ σταθερή σε υδατικό περιβάλλον β) είναι άοσμη γ) είναι μη-πτητική και σε αντίθεση με άλλα αναγωγικά αντιδραστήρια είναι ανθεκτική στην οξείδωση από τον αέρα δ) είναι δραστική σε ευρεία περιοχή ph ( ph = 5 10) ε) ο τυπικός χρόνος που απαιτείται για την αναγωγή είναι μικρότερος από 5 min στ) είναι δραστική σε θερμοκρασία δωματίου ζ) ανάγει εκλεκτικά ακόμα και τα πιο σταθερά δισουλφίδια Η τυπική αντίδραση αναγωγής θειολών από την TCEP φαίνεται στο Σχήμα 4.1. Σχήμα 4.1. Αναγωγή του δισουλφιδικού δεσμού με TCEP. Παρά όμως τις σημαντικές αυτές ιδιότητες που παρουσιάζει η TCEP, δεν είχε ευρεία εφαρμογή μέχρι πρόσφατα [2]. Το 1991 οι Burns et al. ανέφεραν ότι η TCEP μπορεί να συντεθεί εύκολα και σε μεγάλες ποσότητες με την όξινη υδρόλυση του εμπορικά διαθέσιμου αντιδραστηρίου τρις(2-κυανοαιθυλο)φωσφίνη. Οι ερευνητές αυτοί ανάφεραν επίσης ότι με την TCEP επιτυγχάνεται εύκολα η πλήρης αναγωγή πολύ σταθερών δισουλφιδίων (π.χ. οξειδωμένη διθειοθρεϊτόλη (DTT)) σε ph = 5,0 [2]. Το Δεκέμβριο του 1992 η εταιρία Pierce Chemical Co. ξεκίνησε τη διαφήμιση του αντιδραστηρίου 22

27 Κεφάλαιο 4: Τρις (2-καρβοξυαίθυλο) φωσφίνη (tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) αυτού ως ένα καινούργιο, άοσμο, δραστικό αναγωγικό αντιδραστήριο περισσότερο δραστικό από την DTT ή τη μερκαπτοαιθανόλη [3]. Εκτός από την αποτελεσματικότητα του αντιδραστηρίου στην αναγωγή δισουλφιδικών δεσμών, η TCEP πλεονεκτεί στο γεγονός ότι δεν περιέχει στο μόριό της θειολική ομάδα. Η DTT και άλλα αναγωγικά αντιδραστήρια που περιέχουν θειολική ομάδα, πρέπει να απομακρύνονται μετά την αναγωγή, καθώς η περίσσεια τους συνήθως παρεμποδίζει τον προσδιορισμό. Ακινητοποιημένη TCEP Τα πλεονεκτήματα της TCEP που αναφέρθηκαν παραπάνω την καθιστούν ως ένα από τα αποτελεσματικότερα αναγωγικά αντιδραστήρια σε υδατικά διαλύματα. Ωστόσο μερικά πρωτόκολλα απαιτούν τον διαχωρισμό του αναγωγικού αντιδραστηρίου από το δείγμα, μετά την αναγωγή. Για να αποφευχθούν οι δύσκολες και επίπονες διαδικασίες διήθησης πηκτής (gel filtration) ως εναλλακτική λύση προτείνεται η ακινητοποιημένη TCEP [4]. Το πλεονέκτημα αυτό είναι εξαιρετικά σημαντικό σε περιπτώσεις αναγωγής πεπτιδίων τα οποία είναι ευαίσθητα στην διαδικασία της διήθησης πηκτής [5]. Γενικά η ακινητοποίηση αναγωγικών αντιδραστηρίων δισουλφιδικών δεσμών γίνεται πάνω σε αδιάλυτα σφαιρίδια αγαρόζης ή σεφαρόζης [6], τα οποία έχουν τροποποιηθεί κατάλληλα με ενώσεις που περιέχουν σουλφυδριλική ομάδα. Η παρουσία των ομάδων αυτών καθιστά το υπόστρωμα ως ένα ισχυρό αναγωγικό μέσο. Με μια απλή ανάμιξη ενός δείγματος, το οποίο αποτελείται από πεπτίδια ή πρωτεΐνες, με το ακινητοποιημένο αναγωγικό, προκύπτει η αποτελεσματική θραύση των δισουλφιδικών δεσμών και δημιουργούνται ελεύθερες θειόλες. Η αναγωγή αυτή γίνεται χωρίς εξωτερικές επιμολύνσεις που πιθανόν να έχει το αναγωγικό, όπως συμβαίνει στην περίπτωση του διαλυμένου αναγωγικού μέσου [7]. Τα ακινητοποιημένα αναγωγικά αντιδραστήρια μπορεί κανείς να τα παρασκευάσει στο εργαστήριο, όπως έχει περιγράψει ο Hermanson [7] ή να τα προμηθευτεί από το εμπόριο. Τα ακινητοποιημένα αναγωγικά αντιδραστήρια υπάρχει δυνατότητα να τοποθετούνται σε στήλες (Immobilized Reductant Columns) μέσα από τις οποίες διέρχεται το δείγμα. Οι στήλες αυτές βοηθούν στη γρήγορη και εύκολη αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών σε πρωτεϊνικά και πεπτιδικά δείγματα. Ο χρόνος που απαιτείται για την αναγωγή των πεπτιδικών δεσμών είναι μόλις λίγα λεπτά, όσος δηλαδή απαιτείται ώστε το δείγμα να περάσει μέσα από τη στήλη. Ο τρόπος αυτός της αναγωγής πλεονεκτεί, γιατί αποφεύγονται τα χρονοβόρα στάδια διαχωρισμού του αναγωγικού από το δείγμα. Τα κύρια πλεονεκτήματα των ακινητοποιημένων αναγωγικών μέσων μπορούν να συνοψιστούν στα εξής: 23

28 Κεφάλαιο 4: Τρις (2-καρβοξυαίθυλο) φωσφίνη (tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) α) τα ακινητοποιημένα αναγωγικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αναγωγή όλων των ειδών των βιολογικών δισουλφιδίων χωρίς την παραγωγή παραπροϊόντων β) όταν χρησιμοποιούνται τα ακινητοποιημένα αναγωγικά δεν υπάρχουν διαλυμένες ουσίες που αλληλεπιδρούν με τις ελεύθερες θειόλες που παράγονται γ) τα μικρά μόρια τα οποία περιέχουν δισουλφιδικούς δεσμούς (π.χ. πεπτίδια που περιέχουν κυστίνη) μπορούν να αναχθούν και να απομονωθούν πολύ εύκολα με την απομάκρυνση του ακινητοποιημένου αναγωγικού μέσου. Στην περίπτωση των διαλυμένων αναγωγικών η απομάκρυνση του αναγωγικού είναι πολύ δύσκολη δ) τα ακινητοποιημένα αναγωγικά αντιδραστήρια μπορούν εύκολα να αναγεννηθούν και να ξαναχρησιμοποιηθούν πολλές φορές. [7]. Τα κύρια πλεονεκτήματα της ακινητοποιημένης TCEP είναι [4, 5]: α) αναγωγή σε ποσοστό πάνω από 85% β) είναι άοσμη, οπότε η αναγωγή μπορεί να γίνεται εύκολα στον πάγκο του εργαστηρίου γ) είναι σταθερή στον αέρα και συνεπώς δεν χρειάζονται ειδικές προφυλάξεις κατά τον χειρισμό και την φύλαξή της δ) είναι εύκολη στο χειρισμό (με την ακινητοποιημένη TCEP γίνεται χρήση όσης ποσότητας απαιτείται για κάθε περίπτωση) ε) η αναγωγή μπορεί να διεξαχθεί σε ένα μεγάλο εύρος ph ( ) και θερμοκρασιών (5 C - 95 C) στ) παρέχεται η δυνατότητα κατασκευής αναγωγικών στηλών (Immobilized Reductant Columns) ζ) είναι εμπορικά διαθέσιμη 24

29 Κεφάλαιο 4: Τρις (2-καρβοξυαίθυλο) φωσφίνη (tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP) Βιβλιογραφία [1] M.E. Levison, A.S. Joseph, D.M. Kirschenbaum, Experientia 25 (1969) 126 [2] J.A. Burns, J.C. Butler, J. Moran, G.M. Whitesides, J. Org. Chem. 56 (1991) 2648 [3] J.C. Han, G.Y. Han, Anal. Biochem. 220 (1994) 5 [4] Pierce Biotechnology Inc, Immobilized TCEP disulfide reducing gel, (2003) URL: [5] Thermo Scientific, Immobilized reductant columns, (2007) URL: [6] J. Han, C. Clark, G. Han, T.C. Chu, P. Han, Anal. Biochem. 268 (1999) 404 [7] G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2 nd Ed., 2008, Elsevier 25

30 Κεφάλαιο 5: 5,5-διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (DTNB ή αντιδραστήριο Ellman) Κεφάλαιο 5 5,5-διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (DTNB ή αντιδραστήριο Ellman) Ως αντιπροσωπευτικό υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο Ellman (DTNB). Η χημική του δομή φαίνεται στο Σχήμα 5.1. Το DTNB προτάθηκε για πρώτη φορά το 1959 από τον Ellman ως αντιδραστήριο για τον ποσοτικό προσδιορισμό ελεύθερων θειολικών ομάδων [1]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.1, το DTNB είναι το ίδιο ένα δισουλφίδιο. Η πιο χαρακτηριστική του ιδιότητα είναι ότι η υδρόλυση του δεσμού S-S οδηγεί στο σχηματισμό του έγχρωμου προϊόντος 5-θειο-(2-νιτροβενζοϊκού) οξέος (ΤΝΒ) (λ max = 412 nm). Η χρήση του DTNB για τον προσδιορισμό θειολών βασίζεται στην αντίδραση του Σχήματος 5.2. Όπως φαίνεται στην αντιπροσωπευτική αντίδραση του σχήματος, το DTNB αντιδρά με μια ελεύθερη σουλφυδρυλική ομάδα και παράγεται ένα μικτό δισουλφίδιο και το TNB. Το τελευταίο μπορεί να ανιχνευτεί φασματοφωτομετρικά στα 412 nm. Βιβλιογραφικά έχει αποδειχθεί ότι το DTNB είναι ένα πολύ χρήσιμο αντιδραστήριο για την ανάλυση των θειολών. Κύρια πλεονεκτήματά του είναι: α) έχει υψηλή εκλεκτικότητα ως προς τις θειόλες, β) αντιδρά γρήγορα, γ) οι συνθήκες αντίδρασης είναι ήπιες και δ) η ευαισθησία είναι ικανοποιητική για τις περισσότερες εφαρμογές. Σχήμα 5.1. Χημική δομή του αντιδραστηρίου Ellman. 26

31 Κεφάλαιο 5: 5,5-διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (DTNB ή αντιδραστήριο Ellman) Σχήμα 5.2. Αντίδραση του DTNB με ελεύθερες θειολικές ομάδες. Στην βιβλιογραφία έχει αναφερθεί ότι η TCEP έχει τη δυνατότητα να διασπά το δεσμό S-S που υπάρχει στο DTNB ταχύτατα και ποσοτικά [2]. Αντιπροσωπευτικά, η αντίδραση αναγωγής του DTNB από ακινητοποιημένη TCEP δίνεται στο Σχήμα 5.3. Σχήμα 5.3. Αναγωγή του αντιδραστηρίου Ellman από ακινητοποιημένο TCEP. 27

32 Κεφάλαιο 5: 5,5-διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ) (DTNB ή αντιδραστήριο Ellman) Βιβλιογραφία [1] G.L. Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82 (1959) 70 [2] J.C. Han, G.Y. Han, Anal. Biochem. 220 (1994) 5 28

33 Kεφάλαιο 6: Βιβλιογραφική επισκόπηση Κεφάλαιο 6 Βιβλιογραφική επισκόπηση Οι αυτόματες μέθοδοι FIA και SIA που έχουν αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία για τον προσδιορισμό του Η 2 Ο 2 παρατίθενται στον Πίνακα 6.1. Στον Πίνακα 6.1 δίνεται η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε, περιληπτικά η αρχή της μεθόδου, το σύστημα ανίχνευσης, το γραμμικό εύρος προσδιορισμού, το όριο ανίχνευσης, ο ρυθμός ανάλυσης των δειγμάτων και τα δείγματα στα οποία εφαρμόστηκαν. Αξίζει να παρατηρηθεί, ότι σύμφωνα με την παρακάτω βιβλιογραφία, υπάρχει μόνο μια μέθοδος SIA για τον προσδιορισμό του Η 2 Ο 2 [1]. Η εν-λόγω μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση του προσδιοριζόμενου συστατικού με το αντιδραστήριο ABTS (2,2 -Azinobis(3-Ethylbenzothiazoline 6-sulfonic acid)) παρουσία του ενζύμου HRP (horseradish peroxidase). Η παραγόμενη οξειδωμένη μορφή του ABTS μετριέται φασματοφωτομετρικά σε μήκος κύματος 410 nm. Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό του Η 2 Ο 2 σε δείγματα υγρών φακών επαφής. Όσον αφορά στις υπόλοιπες μεθόδους FIA που αναφέρονται στον Πίνακα 6.1., χρησιμοποιείται αρκετά μεγάλη γκάμα ενόργανων τεχνικών ανίχνευσης, με κυριότερες τη χημειοφωταύγεια και τις ηλεκτροαναλυτικές (βολταμμετρία και αμπερομετρία). Οι εφαρμογές σε πραγματικά δείγματα ποικίλουν και περιλαμβάνουν περιβαλλοντικά (νερό βροχής, χιόνι, πόσιμο και θαλασσινό νερό κ.λ.π.), βιολογικά (ορός αίματος, δείγματα ανθρώπινης αναπνοής), τρόφιμα (γαλακτοκομικά προϊόντα) και φαρμακευτικά σκευάσματα/καλλυντικά. 29

34 Kεφάλαιο 6: Βιβλιογραφική επισκόπηση Πίνακας 6.1. Βιβλιογραφική επισκόπηση μεθόδων προσδιορισμού H 2 O 2 με FIA και SIA. 30

35 Kεφάλαιο 6: Βιβλιογραφική επισκόπηση Πίνακας 6.1. (συνέχεια). Βιβλιογραφική επισκόπηση μεθόδων προσδιορισμού H 2 O 2 με FIA και SIA. 31

36 Kεφάλαιο 6: Βιβλιογραφική επισκόπηση Πίνακας 6.1. (συνέχεια). Βιβλιογραφική επισκόπηση μεθόδων προσδιορισμού H 2 O 2 με FIA και SIA. 32

37 Kεφάλαιο 6: Βιβλιογραφική επισκόπηση Συντομογραφίες Πίνακα 6.1. (με σειρά εμφάνισης στον Πίνακα): ABTS: 2,2 -Azino-bis(3-Ethylbenzothiazoline 6-sulfonic acid) ΗRP: horseradish peroxidase PSA: phenol-4-sulfonic acid 4-AAP: 4-aminoantipyrine R 4 OHCF: ruthenium oxide hexacyanoferrate DPC: K5[Cu (HIO6)2] ΗPAA: para-hydroxyphenyl acetic acid POD: ακινητοποιημένη υπεροξειδάση με glutaraldehyde και 3- (trimethoxysilyl)propyldietylenetriamine DAP: 4-amino-5-(p-aminophenyl)-1-methyl-2-phenyl-pyrazol-3-one ALPS: N-ethyl-N-sulphopropylaniline sodium salt AA: 4-aminoantipyrine DMA: N,N-dimethylaniline POD-Fc-CP: peroxidase/ferrocene-embedded carbon paste electrode SDS: Sodium dodecyl sulphate TBPO: N,N-Tetrakis(2-benzimidazolylmethyl)-1,3-diaminopropane-2-ol HPPA: 3-(p-hydroxyphenyl)-propionic acid OP: octylphenyl polyglycol ether ODI: 1,l'-oxalyldiimidazole PHPA: p-hydroxyphenylacetic acid TCPO: bis(2,4,6-trichlorophenyl)oxalate Cy.7.Cl: tricarbochlorocyanine dye 33

38 Kεφάλαιο 6: Βιβλιογραφική επισκόπηση Βιβλιογραφία [1] S.S.M.P. Vidigal, I.V. Tóth, A.O.S.S. Rangel, Microchem. J. 91 (2009) [2] Z.H. Li, D.H. Li, K. Oshita, S. Motomizu, Talanta 82 (2010) [3] J.P.N. Ribeiro, M.A. Segundo, S. Reis, J.L.F.C. Lima, Talanta 79 (2009) [4] R.C. Peña, J.C.M. Gamboa, T.R.L.C. Paixão, M. Bertotti, Microchim Acta 166 (2009) [5] R.A. de Abreu Franchini, M.A. Costa Matos, R. Colombara, R.C. Matos, Talanta 75 (2008) [6] Y. Hu, Z. Zhang, C. Yang, Anal. Chim. Acta 601 (2007) [7] G.M. Greenway, T. Leelasattarathkul, S. Liawruangrath, R.A. Wheatley, N. Youngvisesc, Analyst 131 (2006) [8] S. Campuzano, M. Pedrero, J.M. Pingarron, Talanta 66 (2005) [9] S. Svensson, A.C. Olin, M. Larstad, G. Ljungkvist, K. Toren, Journal of Chromatography B 809 (2004) [10] N. Kiba, T Tokizawa, S Kato, M Tachibana, K Tani, H Koizumi, M Edo, E Yonezawa, Anal. Science 19 (2003) [11] A.Ch. Pappas, C.D. Stalikas, Y.Ch. Fiamegos, M.I. Karayannis, Anal. Chim. Acta 455 (2002) [12] R.C. Matos, J.J. Pedrotti, L. Angnes, Anal. Chim. Acta 441 (2001) [13] N Maeuchihara, S Nakano, T Kawashima, Anal. Science 17 (2001) [14] R. Escobar, S. GarcõÂa-DomõÂnguez, A. GuirauÂm, O. Montes, F. GalvaÂn, F.F. de la Rosa, Luminescence 15 (2000) [15] K. Yamamoto, T. Ohgaru, M. Torimura, H. Kinoshita, K. Kano, T. Ikeda, Anal. Chim. Acta 406 (2000) [16] T. Imato, H. Ohura, S. Yamasaki, Y. Asano, Talanta 52 (2000) [17] O. Nozaki, H. Kawamoto, Luminescence 15 (2000) [18] S.H. Fan, B.T. Hart, I.D. McKelvie, Lab. Robot. Autom. 12 (2000) [19] J.M. Zen, H.H. Chung, A.S. Kumar, Analyst 125 (2000) [20] D. Harms, R. Than, B. Krebs, U. Karst, Fresenius J Anal. Chem. 364 (1999) [21] T. Taniai, A Sakuragawa, T Okutani, Anal. Science 15 (1999) [22] Z. Xingwang, Y. Mei, Z. Zhang, Anal. Let. 32 (1999) [23] I. da Cruz Vieira, O. Fatibello-Filho, Analyst 123 (1998) [24] J.M. Lin, H. Arakawa, M. Yamada, Anal. Chim. Acta 371 (1998) [25] Y.Z. Li, A. Townshend, Anal. Chim. Acta 359 (1998) [26] M. Feng, Z. Li, J Lu, H Jiang, Mikrochim. Acta 126 (1997) [27] K. Schachla, H. Alemub, K. Kalcher, J. Jeözkovac, I. Osvancarac, K Vytörasc, Analyst, 122 (1997) [28] K. Schachla, H. Alemub, K Kalchera, J. Jezkovac, I. Svancarac, K. Vytrasc, Anal. Let. 30 (1997) [29] H. Ohura, T. Imato, S. Yamasaki, N. Ishibashif, Talanta 43 (1996) [30] M. Stlgbrand, E.Ponth, K. Irgum, Anal. Chem. 66 (1994)

39 Kεφάλαιο 6: Βιβλιογραφική επισκόπηση [31] D. Price, P.J. Worsfold, R.F.C. Mantoura, Anal. Chim. Acta 298 (1994) [32] A.M. Almuaibed, A. Townshend, Anal. Chim. Acta 295 (1994) [33] J.A Cox, K. Lewinski, Talanta 40 (1993) [34] M.J. Whitaker, Talanta 40 (1993) [35] J.F. Cerdan, M Peris-Tortajada, R. Puchades, A Maquieira, Fresenius J Anal. Chem. 344 (1992) [36] S.A. Eremina, S.B. Vlasenkoa, A.P. Osipova, I.D. Ereminab, A.M. Egerova, Anal. Let. 22 (1989) [37] I.G.R. Gutz, D. Klockow, Fresenius J Anal. Chem. 335 (1989) [38] K.S. Johnson, C.M. Sakamoto-Arnold, S.W. Willason, C.L. Beehler, Anal, Chim. Acta, 201 (1987) [39] H. Hwang, P.K. Dasgupta, Anal. Chim. Acta 170 (1985) [40] P.V Zoonen, D.A. Kamminga, C. Gooijer, N.H. Velthorst, R.W. Frei, Anal. Chim. Acta 167 (1985) [41] Bo Olsson, Mikrochim Acta II (1985) [42] B.C. Madsen, M.S. Kromis, Anal. Chem. 56 (1984) [43] Bo Olsson, Anal. Chim. Acta, 136 (1982) [44] N. Yamashiro, S. Uchida, Y. Satoh, Y. Morishima, H. Yokoyama, T. Satoh, J Sugama, R. Yamada, Journal of Nuc. Science and Technology 41 (2004) [45] O. Nozaki, H. Kawamoto, Luminescence 18 (2003) [46] B. Tang, L. Zhang, K. Xu, Talanta 68 (2006) [47] D. Harms, H. Luftmann, F.K. Müller, B. Krebs, U. Karst, Analyst 127 (2002)

40 Κεφάλαιο 7: Αντιδραστήρια Οργανολογία Κεφάλαιο 7 Αντιδραστήρια Οργανολογία 7.1. Αντιδραστήρια-Υλικά Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στο πειραματικό μέρος της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας ήταν αναλυτικού βαθμού καθαρότητας και προμηθεύτηκαν από τον οίκο Merck, εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό. Ως διαλύτης αραίωσης χρησιμοποιήθηκε δις-απιονισμένο νερό. Τo πρότυπο διάλυμα του Η 2 Ο 2 είχε συγκέντρωση ποσότητας c = 1000 μmol L -1 και παρασκευάζονταν καθημερινά με κατάλληλη αραίωση του πυκνού αντιδραστηρίου σε δις-απιονισμένο νερό. To πυκνό διάλυμα του Η 2 Ο 2 είχε συγκέντρωση ποσότητας c = 10,4 mol L -1 η οποία επιβεβαιώθηκε με τιτλομέτρησή του με πρότυπο διάλυμα KMnO 4. Το αντιδραστήριο Ellman s (5,5-διθειο-δις-(2-νιτρο βενζοϊκό οξύ), DTNB) προμηθεύτηκε από τον οίκο Sigma. Τα πυκνά διαλύματά του είχαν συγκέντρωση ποσότητας c = 1, mol L -1 και παρασκευάζονταν με διάλυση ακριβώς ζυγισμένης ποσότητας του αντιδραστηρίου σε ρυθμιστικό διάλυμα TRIS (0,075 mol L -1, ph = 8,0). Τα διαλύματα εργασίας του DTNB συγκέντρωσης ποσότητας c = 0, mol L -1, παρασκευάζονταν από το πυκνό με κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισμένο νερό. Το πυκνό διάλυμα του αντιδραστηρίου ήταν σταθερό για τουλάχιστον δύο μήνες εφόσον φυλασσόταν στους 4 ο C προστατευμένο από το φως. Τα διαλύματα εργασίας παρασκευάζονταν σε καθημερινή βάση. Η TCEP (τρις(2-καρβοξυαίθυλ)φωσφίνη) προμηθεύτηκε από τον οίκο Sigma. Τo πυκνό διάλυμα είχε συγκέντρωση ποσότητας 1, mol L -1 και παρασκευαζόταν με διάλυση κατάλληλης ποσότητας του αντιδραστηρίου σε δις-απιονισμένο νερό. Τα διαλύματα εργασίας της TCEP, συγκέντρωσης ποσότητας c = 0, mol L -1, παρασκευάζονταν από το πυκνό με κατάλληλη αραίωση σε ρυθμιστικό διάλυμα TRIS (0,075 mol L -1, ph = 9,0). Το πυκνό διάλυμα του αντιδραστηρίου φυλασσόταν στους 4 ο C προστατευμένο από το φως και ήταν σταθερό για τουλάχιστον δύο μήνες. Τα διαλύματα εργασίας παρασκευάζονταν σε καθημερινή βάση. Το ρυθμιστικό διάλυμα τρις-(υδροξυμέθυλο)-αμινομεθανίου (TRIS) συγκέντρωσης ποσότητας c = 0,075 mol L -1 παρασκευαζόταν με αραίωση πυκνού διαλύματος TRIS (c = 1,0 mol L -1 ) και ρύθμιση του ph στην επιθυμητή τιμή με διάλυμα HCl συγκέντρωσης ποσότητας c = 1,0 mol L

41 Κεφάλαιο 7: Αντιδραστήρια Οργανολογία 7.2. Οργανολογία Ο υβριδικός αυτόματος αναλυτής SIA/FIA που χρησιμοποιήθηκε αποτελούνταν από τα επιμέρους οργανολογικά τμήματα: 1. Αυτόματη βαλβίδα επιλογής 10 θέσεων (Valco, Ελβετία). 2. Περισταλτική αντλία (Gilson Miniplus3, Γαλλία). 3. Φασματοφωτομετρικό ανιχνευτή του οίκου Shimadzu (Ιαπωνία), μοντέλο SPD-10A VP. 4. Αντλία milligat (Global FIA, Η.Π.Α.) Το σύστημα ροής αποτελούνταν από σωλήνες Teflon, εσωτερικής διαμέτρου 0.5 mm, εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό. Το σπείραμα συγκράτησης (HC) είχε μήκος 300 cm και εσωτερική διάμετρο 0,7 mm. Η εν-ροή θερμοστάτηση των διαλυμάτων επιτυγχάνονταν με τη χρήση του θερμοστάτη FIAStar 5101 (Tecator, Σουηδία). Η λειτουργία του αναλυτή ελέγχονταν μέσω ηλεκτρονικού υπολογιστή με κάρτα εισόδου / εξόδου (6025 Ε, National Instrument, Austin, TX). Ο έλεγχος του συστήματος γινόταν με τη χρήση ενός λογισμικού LabVIEW (National Instrument, Austin, TX). Το πρόγραμμα αναπτύχθηκε στο εργαστήριο αναλυτικής Χημείας, του τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ. Τα λαμβανόμενα σήματα από το σύστημα ανίχνευσης καταγράφονταν και αποτιμούνταν με τη βοήθεια του λογισμικού Clarity Station for Windows (DataApex, Τσεχία). Ο επιπλέον συνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός περιλάμβανε κατά τη διάρκεια της εργασίας: - αναλυτικό ζυγό του οίκου Sartorius, μοντέλο πεχάμετρο του οίκου Orion, μοντέλο EA940 - λουτρό υπερήχων του οίκου Elma Transonic, μοντέλο 460/H. 37

42 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Κεφάλαιο 8 Ανάπτυξη αυτόματης μεθόδου για τον προσδιορισμό του Η 2 Ο 2 πραγματικά δείγματα με χρήση υβριδικού συστήματος FI/SI σε 8.1. Αρχή της μεθόδου Η προτεινόμενη μέθοδος βασίζεται στην παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2 στην αναγωγή του DTNB (αντιδραστήριο Ellman, 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid), Σχήμα 8.1) από την TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine). Ο κύκλος ανάλυσης περιλαμβάνει τα παρακάτω βασικά στάδια, τα οποία πραγματοποιούνται σε συνθήκες συνεχούς ροής: α) Το προσδιοριζόμενο συστατικό (οξειδωτικό αντιδραστήριο) αντιδρά με την TCEP (αναγωγικό αντιδραστήριο) σε σύστημα SI και συνθήκες αναχαίτισης της ροής και την οξειδώνει, με αποτέλεσμα την ελάττωση της συγκέντρωσής της [1]. β) Η περίσσεια της TCEP αντιδρά στη συνέχεια εν-ροή με το DTNB σε σύστημα FI και ανάγει το δεσμό S-S του αντιδραστηρίου (Σχήμα 8.2 [2]). γ) Η ανηγμένη μορφή του DTNB ανιχνεύεται φασματοφωτομετρικά (Σχήμα 8.3) Σχήμα 8.1. Χημική δομή του αντιδραστηρίου Ellman s (DTNB). Σχήμα 8.2. Σχηματική αντίδραση αναγωγής θειολών από την TCEP. 38

43 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Σχήμα 8.3. Φάσμα UV-vis του DTNB (I) και του προϊόντος αναγωγής του από την TCEP (II) Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 σε υδατικά διαλύματα Το βελτιστοποιημένο διάγραμμα ροής SI/FI για τον προσδιορισμό του Η 2 Ο 2 δίνεται στο Σχήμα 8.4. Ένας τυπικός κύκλος ανάλυσης περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: α) Αναρρόφηση δείγματος (V = μl) και της TCEP (V = 25 μl, c = 250 μmol L -1 ) στο σπείραμα συγκράτησης (HC). β) Προώθηση του μίγματος της πρώτης αντίδρασης στο πρώτο σπείραμα αντίδρασης (RC 1 ) και αναχαίτιση της ροής για 120 s σε θερμοκρασία 40 ο C. γ) Επαναπροώθηση του μίγματος Η 2 Ο 2 /ΤCEP (Q V = 0,6 ml min -1 ) και συγχώνευση με το ρεύμα του DTNB (Q V = 0,2 ml min -1, c = 200 μmol L -1 ). δ) Ανίχνευση του προϊόντος εν-ροή αναγωγής του DTNB από την περίσσεια της TCEP φασματοφωτομετρικά σε μήκος κύματος 412 nm. Όλα τα δείγματα και πρότυπα διαλύματα αναλύονταν με τρεις διαδοχικές εγχύσεις, ενώ η ποσοτική αποτίμηση γίνονταν με βάση το ύψος των λαμβανόμενων κορυφών Ανάπτυξη μεθόδου Προκαταρκτικά πειράματα 39

44 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Σχήμα 8.4. Yβριδικό διάγραμμα ροής SI/FI για τον προσδιορισμό του Η 2 Ο 2 : C = μεταφορέας (Η 2 Ο), ΡΡ = περισταλτική αντλία, HC = σπείραμα συγκράτησης, MPV = βαλβίδα πολλών θέσεων, R = 250 μmol L -1 TCEP / Ρ.Δ. (0,075 mol L -1 TRIS, ph = 9,0), S = δείγμα, W = απόβλητα, TS = θερμοστάτης, RC 1 = σπείραμα αντίδρασης (100 cm / 0,5 mm i.d.), RC 2 = σπείραμα αντίδρασης (30 cm / 0,5 mm i.d.), MGP = αντλία τύπου Milligat, DTNB = 200 μmol L -1, D = ανιχνευτής (412 nm). Η πρώτη σειρά των προκαταρκτικών πειραμάτων αφορούσε στην αντίδραση μεταξύ TCEP και DTNB σε συνθήκες συνεχούς ροής σε σύστημα SI. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.5, επιλέχθηκε μια προσέγγιση τριών ζωνών. Οι τιμές των αρχικών συνθηκών ήταν: V TCEP = V ΡΔ = V DTNB = 50 μl, Q V = 0,6 ml min -1, RC = 100 cm (0.5 mm i.d.), λ max = 412 nm. Μελετήθηκαν δύο επίπεδα συγκέντρωσης ποσότητας DTNB (100 και 200 μmol L -1 ) σε δύο τιμές ph = 7,0 και 8,0 (0,075 mol L -1 TRIS). Οι συγκεντρώσεις ποσότητας της TCEP κυμάνθηκαν μεταξύ 0 και 100 μmol L -1. Τα πειράματα έδειξαν ότι μεγαλύτερη ευαισθησία και καλύτερη γραμμικότητα επιτεύχθηκαν με το συνδυασμό c(dtnb) = 200 μmol L -1 / ph = 8,0. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.6, το ανώτατο όριο της γραμμικής περιοχής ήταν με τις παραπάνω συνθήκες τα 75 μmol L -1 TCEP. Σε μια δεύτερη σειρά πειραμάτων μελετήθηκε η δυνατότητα παρεμποδιστικής δράσης του Η 2 Ο 2 στην αντίδραση μεταξύ TCEP DTNB. Οι τιμές των γεωμετρικών παραμέτρων ήταν αυτές που αναφέρονται στην προηγούμενη παράγραφο. 40

45 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Σχήμα 8.5. Ακολουθία SI για τα προκαταρκτικά πειράματα: S1-S4 = στάδια ανάλυσης, P = περισταλτική αντλία, HC = σπείραμα συγκράτησης (300 cm / 0,7 mm i.d.), V.P. = θέση βαλβίδας, R = TCEP, B = ρυθμιστικό διάλυμα TRIS (0,075 mol L -1 ), S = DTNB, RC = σπείραμα αντίδρασης (100 cm / 0,5 mm i.d.), D = φασματοφωτομετρικός ανιχνευτής. Σχήμα 8.6. Έλεγχος γραμμικότητας αντίδρασης της TCEP με το DTNB σε σύστημα SI. Η συγκέντρωση ποσότητας του DTNB ήταν 200 μmol L -1, το ph = 8,0, ενώ επιλέχθηκε το ανώτατο όριο γραμμικότητας των 75 μmol L -1 TCEP (Σχήμα 8.6). Το αναγωγικό αντιδραστήριο αναμιγνύονταν off-line με το Η 2 Ο 2 (0 100 μmol L -1 ) και αφήνονταν να αντιδράσει για 10 min πριν την έγχυση στο σύστημα SI του Σχήματος

46 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.7, επιτεύχθηκε ικανοποιητική παρεμποδιστική δράση και γραμμικότητα σε εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας Η 2 Ο 2 ως 70 μmol L -1. Συγκρίνοντας τις κλίσεις των καμπύλων των Σχημάτων 8.6 και 8.7, είναι ιδιαίτερα σημαντικό το γεγονός ότι η αντίδραση του Η 2 Ο 2 με την TCEP είναι πρακτικά στοιχειομετρική. Η τρίτη σειρά προκαταρκτικών πειραμάτων αφορούσε στη μελέτη της αντίδρασης μεταξύ TCEP και Η 2 Ο 2 σε συνθήκες συνεχούς ροής. Για να διατηρηθεί η προσέγγιση των τριών ζωνών του Σχήματος 8.5, το ρυθμιστικό διάλυμα (0,075 mol L -1 TRIS, ph = 8,0) και το αναγωγικό αντιδραστήριο (75 μmol L -1 TCEP) παρασκευάστηκαν στην ίδια φιάλη. Πειράματα σταθερότητας απουσία Η 2 Ο 2 έδειξαν ότι το αναγωγικό αντιδραστήριο ήταν σταθερό παρουσία του ρυθμιστικού διαλύματος. Σε αντίθεση όμως με τα αποτελέσματα της προηγούμενης παραγράφου, η παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2 ήταν σημαντικά χαμηλότερη. Αυτό αποδίδεται στο ότι δεν δίνεται ικανοποιητικός χρόνος στην αντίδραση μεταξύ της TCEP και του Η 2 Ο 2. Για να αυξηθεί ο χρόνος αντίδρασης δοκιμάστηκε να γίνει αναχαίτιση της ροής των ζωνών της TCEP και του Η 2 Ο 2 μέσα στο σπείραμα συγκράτησης. Αναλυτικά, αναρροφούνταν οι ζώνες της TCEP και του προσδιοριζόμενου συστατικού και αφήνονταν να αντιδράσουν στο σπείραμα συγκράτησης για αυξανόμενα χρονικά διαστήματα ( s) πριν την έγχυση της ζώνης του DTNB. Η παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2 βελτιώθηκε αλλά σε όχι θεαματικό βαθμό σε σχέση με τα off-line πειράματα της προηγούμενης παραγράφου. Το γεγονός αυτό αποδόθηκε σε μη ικανοποιητική ανάμιξη των ζωνών της TCEP και του Η 2 Ο 2 στο σπείραμα συγκράτησης. Σχήμα 8.7. Έλεγχος γραμμικότητας της off-line αντίδρασης μεταξύ TCEP και Η 2 Ο 2. Το πρόβλημα αυτό επιλύθηκε με τη χρήση του υβριδικού διαγράμματος ροής SI/FI του Σχήματος 8.4. Η ζώνη του δείγματος χωρίστηκε σε δύο τμήματα (V = 50 (25 +25) μl) 42

47 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 «εγκλωβίζοντας» τη ζώνη του αναγωγικού αντιδραστηρίου (V = 25 μl). Μετά την έγχυσή τους στο σπείραμα συγκράτησης, οι ζώνες προωθούνται (Q V = 0,6 ml min -1 ) και αναμιγνύονται στο πρώτο σπείραμα αντίδρασης (RC 1, 100 cm/0,5 mm i.d.). To DTNB (200 μmol L -1 ) ρέει συνεχώς (Q V = 0,2 ml min -1 ) και αντιδρά με την περίσσεια του αναγωγικού αντιδραστηρίου σε δεύτερο σπείραμα αντίδρασης (RC 2, 60 cm/0,5 mm i.d.). Με το νέο διάγραμμα ροής και τις συνθήκες που αναφέρονται παραπάνω επαναλήφθηκε η μελέτη της γραμμικότητας για την TCEP. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.8, το μέγιστο όριο γραμμικής περιοχής ήταν 250 μmol L -1 TCEP Πειράματα αναχαίτισης της ροής H πιο σημαντική παράμετρος για τη βελτίωση της ευαισθησίας του προσδιορισμού είναι η αποτελεσματικότητα της αντίδρασης μεταξύ του Η 2 Ο 2 και της TCEP. Για να αυξηθεί ο χρόνος της αντίδρασης αυτής, επιλέχθηκε η τεχνική της αναχαίτισης της ροής (stopped-flow). Δοκιμάστηκαν και συγκρίθηκαν δύο εναλλακτικές προσεγγίσεις: α) η αναχαίτιση να πραγματοποιείται στο σπείραμα συγκράτησης (HC) αμέσως μετά την έγχυση των ζωνών του δείγματος και του αναγωγικού αντιδραστηρίου (TCEP). β) η αναχαίτιση να πραγματοποιείται σε κατάλληλο σπείραμα αντίδρασης (RC 1 : 100 cm / 0,5 mm i.d. ) μετά από προώθηση των παραπάνω ζωνών για συγκεκριμένο χρόνο. Σχήμα 8.8. Έλεγχος γραμμικότητας αντίδρασης της TCEP με το DTNB σε υβριδικό σύστημα SI/FI. 43

48 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Και στις δύο περιπτώσεις, οι χρόνοι αναχαίτισης της ροής ήταν 20, 60, 120 και 180 s. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε συγκέντρωση ποσότητας Η 2 Ο 2 ίση με 100 μmol L -1 και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Τα πειραματικά αποτελέσματα τόσο ως προς απόλυτες διαφορές (ΔΑ), όσο και ως προς την ποσοστιαία παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2 δίνονται στα Σχήματα 8.9 και 8.10 αντίστοιχα. Όπως αποδεικνύεται από τις τιμές των σχημάτων, η αναχαίτιση της ροής βελτιώνει την ευαισθησία της μεθόδου και στις δύο περιπτώσεις. Σχήμα 8.9. Επίδραση του χρόνου αναχαίτισης της ροής στην ευαισθησία (ΔΑ) της προτεινόμενης μεθόδου: RC 1 = αναχαίτιση της ροής στο πρώτο σπείραμα αντίδρασης, HC = αναχαίτιση της ροής στο σπείραμα συγκράτησης. Σχήμα Επίδραση του χρόνου αναχαίτισης της ροής στην ποσοστιαία παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2 : RC 1 = αναχαίτιση της ροής στο πρώτο σπείραμα αντίδρασης, HC = αναχαίτιση της ροής στο σπείραμα συγκράτησης. Χαρακτηριστικά μπορεί να αναφερθεί αύξηση του ΔΑ της τάξης του 51 % για αύξηση του χρόνου αναχαίτισης της ροής στο σπείραμα αντίδρασης από s και περίπου 44

49 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 83 % σε σχέση με μετρήσεις χωρίς αναχαίτιση της ροής. Για το διάστημα s η αντίστοιχη αύξηση ήταν της τάξης του 16 %. Συγκρίνοντας τα δύο πρωτόκολλα αναχαίτισης της ροής, από το Σχήμα 8.9 είναι σαφές ότι η αναχαίτιση της ροής στο σπείραμα αντίδρασης υπερέχει όσον αφορά στο ΔΑ σε σχέση με την αντίστοιχη διαδικασία στο σπείραμα συγκράτησης (για ίδιους χρόνους). Για τη συνέχεια των πειραμάτων επιλέχθηκε η αναχαίτιση της ροής να πραγματοποιείται στο σπείραμα αντίδρασης (RC 1 ) και για χρόνο 120 s κάνοντας συμβιβασμό μεταξύ της ευαισθησίας και του ρυθμού ανάλυσης των δειγμάτων Επίδραση του ph Το ph είναι μια σημαντική παράμετρος της προτεινόμενης μεθόδου, καθώς επηρεάζει εν-δυνάμει και τις δύο βασικές αντιδράσεις, δηλαδή μεταξύ TCEP-Η 2 Ο 2 και μεταξύ TCEP-DTNB. Η μελέτη της επίδρασης του ph πραγματοποιήθηκε σε εύρος 7,0 10,0 ρυθμίζοντας κατάλληλα το ph της ζώνης του αναγωγικού αντιδραστηρίου (TCEP). Η συγκέντρωση ποσότητας του Η 2 Ο 2 ήταν 100 μmol L -1 (V = 100 ( μl). Τα μεγέθη που παρακολουθήθηκαν πειραματικά ήταν τόσο η τιμή του τυφλού δείγματος η οποία αντικατοπτρίζει την επίδραση του ph στην αντίδραση TCEP-DTNB όσο και η παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2 (τόσο σε απόλυτες τιμές ΔΑ, όσο και ποσοστιαία). Τα λαμβανόμενα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στα Σχήματα 8.11 και Όπως φαίνεται από το Σχήμα 8.11, η αντίδραση TCEP-DTNB πραγματοποιείται ικανοποιητικά σε εύρος τιμών ph 8,0 9,0, γεγονός που έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες μας [2]. Η μέγιστη απόλυτη παρεμποδιστική δράση (ΔΑ) του Η 2 Ο 2 παρατηρήθηκε σε ph = 9,0, ενώ όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.12 η ποσοστιαία παρεμποδιστική δράση του προσδιοριζόμενου συστατικού ήταν πρακτικά σταθερή για τιμές ph > 9, Επίδραση των συγκεντρώσεων ποσότητας των TCEP και DTNB Η μελέτη της επίδρασης των συγκεντρώσεων ποσότητας της TCEP και του DTNB στην προτεινόμενη μέθοδο πραγματοποιήθηκε σε τέσσερα επίπεδα συγκεντρώσεων για το κάθε αντιδραστήριο: 100, 150, 200 και 250 μmol L -1 για την TCEP και 100, 200, 300 και 400 μmol L -1 για το DTNB. Εξετάστηκαν πειραματικά όλοι οι πιθανοί συνδυασμοί (4 4 = 16 πειράματα) για συγκέντρωση ποσότητας Η 2 Ο 2 ίση με 50 μmol L -1. Ο χρόνος αναχαίτισης της ροής ήταν 120 s, ο όγκος του δείγματος 100 μl και η τιμή του ph = 9,0. 45

50 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Σχήμα Επίδραση του ph στην ευαισθησία (ΔΑ) της προτεινόμενης μεθόδου. Σχήμα Επίδραση του ph στην ποσοστιαία παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2. Τα πειραματικά αποτελέσματα των 16 συνδυασμών δίνονται στο Σχήμα Λαμβάνοντας υπόψη την ευαισθησία της μεθόδου και την κατανάλωση των αντιδραστηρίων κυριότερα του DTNB που ρέει συνεχώς ως βέλτιστος συνδυασμός επιλέχθηκε αυτός των 250 μmol L -1 TCEP / 200 μmol L -1 DTNB. Επίσης, όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.13, επιλέγοντας ως βέλτιστη συγκέντρωση ποσότητας DTNB τα 200 μmol L -1, επιτυγχάνεται ικανοποιητική γραμμικότητα σε όλο το εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας TCEP. 46

51 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Σχήμα Επίδραση των συγκεντρώσεων ποσότητας της TCEP και του DTNB στην ευαισθησία (ΔΑ) της προτεινόμενης μεθόδου Επίδραση του όγκου του εγχυόμενου δείγματος Ο όγκος του εγχυόμενου δείγματος είναι μια πολύ σημαντική παράμετρος κατά την ανάπτυξη νέων μεθόδων FI και SI, καθώς επηρεάζει σημαντικά την ευαισθησία ενός προσδιορισμού. Η επίδραση του όγκου του Η 2 Ο 2 στην προτεινόμενη μέθοδο μελετήθηκε σε εύρος μl. Όπως έχει αναφερθεί και σε προηγούμενες παραγράφους και φαίνεται και στο Σχήμα 8.14, ο συνολικός όγκος του δείγματος χωρίζεται σε δύο ζώνες ώστε να επιτευχθεί καλύτερη ανάμιξη με τη ζώνη του αναγωγικού αντιδραστηρίου (TCEP). Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στα Σχήματα 8.15 και 8.16, όπου στους άξονες του όγκου οι τιμές σε παρένθεση υποδηλώνουν το χωρισμό του δείγματος σε δύο τμήματα. Από το Σχήμα 8.15 παρατηρείται μια γραμμική αύξηση της ευαισθησίας του προσδιορισμού (ΔΑ) σε εύρος μεταβολής του όγκου μl. Η ευαισθησία παραμένει αμετάβλητη διατηρώντας την τιμή των 150 μl και μεταβάλλοντας τον όγκο των δύο υπο-ζωνών του δείγματος (75+75 και ). Τελικά επιλέχθηκε η δεύτερη διαμόρφωση της ζώνης του δείγματος (V = 150 μl, ), καθώς οι τιμές του λευκού δείγματος ήταν μεγαλύτερες (περίπου κατά 7 %) και κατά συνέπεια αναμένεται μεγαλύτερο εύρος προσδιορισμού. 47

52 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Σχήμα Σχηματική παράσταση της ακολουθίας ανάμιξης της TCEP με τις ζώνες του δείγματος: P = περισταλτική αντλία, HC = σπείραμα συγκράτησης (300 cm / 0,7 mm i.d.), MPV = βαλβίδα πολλών θέσεων, R = TCEP, S = δείγμα, D = ανιχνευτής. Σχήμα Επίδραση του συνολικού όγκου του εγχυόμενου δείγματος στην ευαισθησία (ΔΑ) της προτεινόμενης μεθόδου Επίδραση του μήκους του σπειράματος αντίδρασης Η επίδραση του μήκους του δεύτερου σπειράματος αντίδρασης (RC 2 ) μελετήθηκε σε εύρος cm (0,5 mm i.d.). Ο χρόνος αναχαίτισης της ροής πρώτο σπείραμα αντίδρασης (RC 1 ) ήταν 120 s και η συγκέντρωση ποσότητας του Η 2 Ο 2 ίση με 50 μmol L -1. To σπείραμα αυτό καθορίζει το χρόνο αντίδρασης μεταξύ της υπολειπόμενης TCEP και του υποστρώματος (DTNB). Όπως προκύπτει από τις πειραματικές τιμές των Σχημάτων 8.17 και 8.18, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στο μελετούμενο 48

53 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Σχήμα Επίδραση του συνολικού όγκου του εγχυόμενου δείγματος στην παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2. Σχήμα Επίδραση του μήκους του δεύτερου σπειράματος αντίδρασης (RC 2 ) στην ευαισθησία (ΔΑ) της προτεινόμενης μεθόδου. εύρος, τόσο όσον αφορά στις τιμές του τυφλού δείγματος, όσο και στην παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2, γεγονός το οποίο οφείλεται στη γρήγορη κινητική της δεύτερης αντίδρασης μεταξύ TCEP και DTNB [2]. Η τιμή των 30 cm επιλέχθηκε για τη συνέχεια των πειραμάτων. Στο σημείο αυτό διευκρινίζεται ότι δε μελετήθηκε η επίδραση του μήκους του πρώτου σπειράματος αντίδρασης (RC 1 ), το οποίο σχετίζεται με την αντίδραση TCEP H 2 O 2. 49

54 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Σχήμα Επίδραση του μήκους του δεύτερου σπειράματος αντίδρασης (RC 2 ) στην παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2. Ο χρόνος της αντίδρασης αυτής καθορίζεται από την αναχαίτιση της ροής και κατά συνέπεια το μήκος του σπειράματος αντίδρασης δεν είναι κρίσιμος παράγοντας Επίδραση θερμοκρασίας Η επίδραση της θερμοκρασίας στον προσδιορισμό μελετήθηκε σε εύρος θερμοκρασιών o C, θερμοστατώντας το πρώτο σπείραμα αντίδρασης (RC 1 ) με χρήση κατάλληλου θερμοστάτη (FIAStar 5101, Tecator, Σουηδία). Ο χρόνος αναχαίτισης της ροής ήταν 120 s και η συγκέντρωση ποσότητας του Η 2 Ο 2 ίση με 50 μmol L -1. Όπως φαίνεται στα πειραματικά αποτελέσματα του Σχήματος 8.19, μεταβολή της θερμοκρασίας στο μελετούμενο εύρος δεν είχε σημαντική επίδραση στις τιμές του τυφλού προσδιορισμού. Χαρακτηριστικά μπορεί να αναφερθεί ότι η μεταβολή του τυφλού σήματος μεταξύ 25 και 40 ο C ήταν της τάξης του + 3,5 %. Αντίθετα, πιο σημαντική ήταν η επίδραση της θερμοκρασίας στην παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2, η οποία αυξήθηκε κατά περίπου 20 % στο εύρος ο C. Η επίδραση της θερμοκρασίας στην ποσοστιαία παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο 2 δίνεται στο ραβδόγραμμα του Σχήματος Ως βέλτιστη επιλέχθηκε η θερμοκρασία των 40 ο C, καθώς σε μεγαλύτερες τιμές δεν υπήρχαν αξιόλογες μεταβολές και οφέλη στην ευαισθησία της προτεινόμενης μεθόδου. 50

55 Κεφάλαιο 8: Προσδιορισμός Η 2 Ο 2 Σχήμα Επίδραση της θερμοκρασίας του πρώτου σπειράματος αντίδρασης (RC 1 ) στην ευαισθησία (ΔΑ) της προτεινόμενης μεθόδου. Σχήμα Επίδραση της θερμοκρασίας του πρώτου σπειράματος αντίδρασης (RC 1 ) στην παρεμποδιστική δράση του Η 2 Ο Επικύρωση μεθόδου Η προτεινόμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό του Η 2 Ο 2 επικυρώθηκε ως προς: α) τη γραμμικότητα β) τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού γ) την επαναληψιμότητα δ) την ακρίβεια - εκλεκτικότητα 51