Κολοκυθάς Ντούκας Αργύρης Α.Μ. 63

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Μελέτη των Αλληλεπιδράσεων και των Ιδιοτήτων Μαγνητικών Νανοκρυσταλλιτών Πυκνής Διάταξης με Διπλά Υδρόφιλα Συμπολυμερή για Βιοϊατρικές Εφαρμογές Κολοκυθάς Ντούκας Αργύρης Α.Μ. 63 Π.Μ.Σ. ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ Δρ. ΜΠΑΚΑΝΔΡΙΤΣΟΣ ΑΡΙΣΤΕΙΔΗΣ (Λέκτορας Τμήματος Επιστήμης των Υλικών) Πάτρα, Οκτώβριος 2014

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΜΑΓΝΗΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΚΡΥΣΤΑΛΛΙΤΩΝ ΠΥΚΝΗΣ ΔΙΑΤΑΞΗΣ ΜΕ ΔΙΠΛΑ ΥΔΡΟΦΙΛΑ ΣΥΜΠΟΛΥΜΕΡΗ ΓΙΑ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Π.Μ.Σ. ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ Κολοκυθάς Ντούκας Αργύρης Α.Μ. 63 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ Δρ. ΜΠΑΚΑΝΔΡΙΤΣΟΣ ΑΡΙΣΤΕΙΔΗΣ (Λέκτορας Τμήματος Επιστήμης των Υλικών) ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Μπουρόπουλος Νικόλαος Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Επιστήμης Υλικών Τοπογλίδης Εμμανουήλ Λέκτορας Τμήματος Επιστήμης Υλικών Μπακανδρίτσος Αριστείδης Λέκτορας Τμήματος Επιστήμης Υλικών

Σε αυτούς που δεν τα παράτησαν και συνεχίζουν

Ευχαριστίες Η ολοκλήρωση της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας θα ήταν εξαιρετικά δύσκολη χωρίς την βοήθεια και την αμέριστη στήριξη που έλαβα από ένα πλήθος ανθρώπων. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών για την οικονομική υποστήριξη του μεγαλύτερου τμήματος των μεταπτυχιακών μου σπουδών, που έκανε την προσπάθεια αυτή απείρως πιο εύκολη. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον Λέκτορα του τμήματος Επιστήμης Υλικών και επιβλέποντα της μεταπτυχιακής εργασίας, Δρ. Αριστείδη Μπακανδρίτσο για την καθοδήγηση του σε όλα τα βήματα εκπόνησης της παρούσας εργασίας καθώς και για την εμπιστοσύνη που μου έχει δείξει σε αυτά τα τέσσερα παραγωγικά χρόνια της συνεργασίας μας. Επίσης, δε θα ήταν δυνατό να μην ευχαριστήσω όλα τα παιδιά με τα οποία περάσαμε (πολύ) χρόνο στο εργαστήριο και ιδίως τους Αντρέα Σεργίδη, Ηλία Ρουσάλη, Θάνο Σκανδάλη και Νίκο Παπαϊοάννου για την ευχάριστη ατμόσφαιρα που υπήρχε στο εργαστήριο καθώς και τον ερευνητή Ιωάννη Σαριγιάννη για τις πολύτιμες συμβουλές και υποδείξεις που μου παρείχε. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Καθηγητή και διευθυντή του Ινστιτούτου Βιολογικής και Ιατρικής Απεικόνισης (IBMI) του Helmholtz Zentrum στο Μόναχο, Βασίλειο Ντζιαχρίστο, για την ευκαρία πρακτικής άσκησης που μου πρόσφερε καθώς και τους ερευνητές Nicolas Beziere, Antonio Nunes και Josefine Reber για την επίβλεψη και βοήθεια τους στην διεξαγωγή πειραμάτων κατά την διάρκεια της πρακτικής μου, όπως επίσης και το πρόγραμμα Erasmus Placements για την υλοποίηση αυτής της πρακτικής. Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ το χρωστάω σε αυτούς τους ανθρώπους που με στηρίζουν συνεχώς όλα αυτά τα χρόνια.

Η παρούσα διπλωματική εργασία μεταπτυχιακής ειδίκευσης χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών στα πλαίσια της πράξης «Πρόγραμμα χορήγησης υποτροφιών ΙΚΥ με διαδικασία εξατομικευμένης αξιολόγησης ακαδημαϊκού έτους 2012 2013» από πόρους του Ε.Π. «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου (ΕΚΤ) και του ΕΣΠΑ (2007-2013)

Πίνακας συντομογραφιών NPs: Nanoparticles, Νανοσωματίδια EPR: Enhanced Permeability and Retention effect, φαινόμενο Ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης MagDDS: Magnetic Drug Delivery Systems, Μαγνητικά συστήματα στοχευμένης χορήγησης φαρμάκων DOX: Doxorubicin, Δοξορουβικίνη MDR: Multiple Drug Resistance, Πολλαπλή αντίσταση φαρμάκου MNPs : Magnetic Nanoparticles, Μαγνητικά νανοσωματίδια MRI: Magnetic Resonance Imaging, Απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού XRD: Χ-Ray Diffraction, Περίθλαση ακτίνων Χ TEM: Transmission Electron Microscopy, Ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης HR-TEM: High-Resolution Transmission Electron Microscopy, Υψηλής ανάλυσης ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης DLS: Dynamic Light Scattering, Δυναμική σκέδαση φωτός ζp: Zeta Potential, ζ-δυναμικό AMF: Alternating Magnetic Field, Εναλλασσόμενο Μαγνητικό Πεδίο SLP: Specific Loss Power, Ειδικός συντελεστής Απωλειών Ενέργειας ILP: Intrinsic Loss Power, Εγγενής Απώλεια Ενέργειας IEP: IsoElectric Point, Iσοηλεκτρικό σημείο LDV: Laser Doppler Velocimetry UV Vis: Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους Ορατού TGA: Thermo Gravimetric Analysis, Θερμοσταθμική ανάλυση VSM: Vibrating Sample Magnetometry, Μαγνητομετρία δονούμενου δείγματος σ: Αγωγιμότητα I

II

Περίληψη Στο πεδίο της βιοϊατρικής νανοτεχνολογίας, και ειδικότερα στον τομέα που συνδέεται με την θεραπεία του καρκίνου, υπάρχει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον σχετικά με την ανάπτυξη πολυλειτουργικών συστημάτων ικανών να συνδυάσουν εφαρμογές διάγνωσης και θεραπείας (theranostics). Στην παρούσα διπλωματική μεταπτυχιακή εργασία έγινε αξιολόγηση υβριδικών μαγνητικών νανοφορέων οξειδίων του σιδήρου, πυκνής διάταξης ως προς την δυνατότητα τους να χρησιμοποιηθούν σε εφαρμογές μεταφοράς βιοδραστικών ουσιών, μαγνητικής υπερθερμίας και απεικόνισης in-vivo μέσω οπτοακουστικών τεχνικών. Επίσης έγινε σύγκριση των μαγνητικών ιδιοτήτων τους σε σχέση με άλλους τύπους μαγνητικών κολλοειδών χαλαρής δόμησης μέσω μαγνητοφόρησης και μετρήσεων υπερθερμίας. Οι μαγνητικοί αυτοί νανοφορείς είχαν αναπτυχθεί και μελετηθεί, μερικώς, στην προπτυχιακή διπλωματική εργασία. Είχε διαπιστωθεί η ικανότητα των νανοφορέων να προσροφούν σημαντική ποσότητα ενός αντικαρκινικού μορίου, κατόπιν όμως το σύστημα έχανε την κολλοειδή του σταθερότητα. Το γεγονός αυτό ήταν αποτρεπτικό για την περαιτέρω μελέτη του ως φαρμοκοφορέα. Προκειμένου να βελτιωθεί η σταθερότητα του συστήματος παρουσία ηλεκτρολυτών (κατιόντων) και του φαρμάκου, αλλά και για να αποκτήσει ικανότητες αντίστασης στην προσρόφηση πρωτεϊνών, επιχειρήθηκε η επικάλυψη με ένα δεύτερο πολυμερικό φλοιό από πολυαιθυλενογλυκόλη μέσω ηλεκτροστατικής σύμπλεξης των νανοφορέων με διπλά υδρόφιλα δισυσταδικά συμπολυμερή PEG-πολυηλεκτρολύτη. Ο πρώτος πολυμερικός φλοιός είναι ένα φυσικός βιογενής πολυηλεκτρολύτης (αλγινικό οξύ). Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των προκυπτόντων συστημάτων μελετήθηκαν μέσω DLS, ηλεκτροκινητικών μετρήσεων και θολερομετρίας προκειμένου να αξιολογηθεί η σταθερότητα τους σε διαλύματα αυξημένης ιοντικής ισχύος, καθώς και μετά την προσρόφηση του αντικαρκινικού μορίου δοξορουβικίνη. Στο τρίτο μέρος της διπλωματικής εργασίας έγινε μελέτη της κυτταροσυμβατότητας των PEG-νανοφορέων, αλλά και in vivo μελέτη της βιοκατανομής τους σε ζωικά καρκινικά μοντέλα, με και χωρίς την εφαρμογή εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, για την αξιολόγηση της ικανότητάς τους να στοχεύουν τον καρκινικό όγκο. III

IV

Abstract In the field of biomedical technology and especially in connection to cancer therapy, there is a special interest for the development of multifunctional nanoplatforms capable to combine simultaneously diagnosis and therapy (theranostics) The present MSc. thesis evaluates the ability and performance of hybrid condensed Colloidal Nanocrystal Clusters as theranostic systems in drug delivery, magnetic hyperthermia and in vivo imaging using Optoacoustic Imaging modalities. Furthermore a comparative study regarding the magnetic properties of the condensed colloidal nanoassemblies with respect to other structures of magnetic colloidal nanoclusters took place by means of hyperthermia and magnetophoresis measurements. These magnetic nanocarriers had been developed and partially studied in the framework of the undergraduate thesis. Their ability ability to adsorb significant quantities of an anticancer agent was evident, but their lack of colloidal stability upon drug loading was prohibiting for further studies as a potential drug nanocarrier. In order to enhance the systems colloidal stability in the presence of electrolytes (cations) as well to minimize its non-specific binding to plasma proteins, the installation of a second polymeric canopy of poly(ethyleneglycol) (PEG) onto the surface of the nanocolloids was successfully attempted through electrostatic self-assembly using double hydrophilic polycationic- PEG block copolymers. The first polymeric shell consists of the natural biogenic polyelectrolyte (alginic acid). The physicochemical properties of the PEGylated nanocarriers were studied through dynamic light scattering, electrokinetic measurements and turbidimetry in order to assess the colloidal stability in high ionic strength media, as well as after the adsorption of the anticancer agent doxorubicin. Cytotoxicity assays were performed in order to assess the biocompatibility of the PEGylated nanocarriers. In vivo experiments in animal cancer models were also performed in order to study the biodistribution of the products with or without the presence of external magnetic fields, and evaluate their tumor targeting ability. V

VI

Πίνακας Περιεχομένων Πίνακας συντομογραφιών... I Περίληψη... III Abstract... V 1 Εισαγωγικό μέρος... 1 1.1 Εισαγωγή... 1 1.2 Theranostics... 3 1.3 Συστήματα Theranostics βασισμένα σε νανοφορείς... 3 1.3.1 Μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου 4 1.4 Εφαρμογές των Theranostics... 5 1.4.1 Ελεγχόμενη χορήγηση μέσω φυσικής και μοριακής στόχευσης 5 1.4.2 Εφαρμογές απεικόνισης 10 1.4.3 Μαγνητική Υπερθερμία 12 1.5 Μηχανισμοί απωλειών ισχύος μαγνητικών υλικών... 13 1.5.1 Μηχανισμοί υπερθερμίας μαγνητικών νανοσωματιδίων μονής μαγνητικής περιοχής 13 1.5.2 Ειδικός συντελεστής απωλειών ενέργειας (Specific Loss Power-SLP) 15 1.5.3 Εγγενής απώλεια ισχύος (Intrinsic Loss Power-ILP) 18 1.6 Οξείδια του σιδήρου... 19 1.6.1 Μαγνητίτης και μαγκεμίτης 19 1.6.2 Μορφολογία 20 1.7 Μαγνητικές ιδιότητες... 20 VII

1.7.1 Γενικά 20 1.7.2 Μαγνητικές περιοχές Weiss 24 1.7.3 Σταθερά ανισοτροπίας και υπερπαραμαγνητισμός 25 1.8 Κολλοειδή... 27 1.8.1 Κολλοειδής Σταθερότητα 27 1.9 Μέθοδοι σύνθεσης μαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου. 34 1.9.1 Υδρολυτικές Τεχνικές 35 1.9.2 Θερμολυτική μέθοδος 36 1.10 Σταθεροποίηση ΜΝΣ μέσω της επιφανειακής τους τροποποίησης... 36 1.10.1 Άμεση επιφανειακή τροποποίηση 37 1.10.2 Έμμεση επιφανειακή τροποποίηση (εγκλωβισμός σε κοίλες δομές) 38 1.10.3 Σταθεροποίηση MNPs με διπλά υδρόφιλα συμπολυμερή μέσω μεθόδων αυτό-οργάνωσης και Layer-by-Layer 39 1.11 Απόκριση σε εξωτερικά μαγνητικά πεδία... 41 1.12 Οργάνωση σε πλειάδες πυκνής και χαλαρής διάταξης... 42 2 Βασικές τεχνικές χαρακτηρισμού Θεωρητικό υπόβαθρο... 45 2.1 Περίθλαση ακτίνων Χ (XRD)... 45 2.2 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (TEM)... 47 2.3 Δυναμική σκέδαση φωτός (DLS)... 48 2.4 Επιφανειακό φορτίο κολλοειδών και ηλεκτροκινητικές μετρήσεις... 50 2.5 Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους - Ορατού (UV Vis)... 54 2.6 Μαγνητομετρία Δονούμενου Δείγματος (VSM)... 55 2.7 Θολερομετρία (Turbidimetry)... 56 VIII

2.8 Οπτοακουστική Τομογραφία Πολλαπλών Φασμάτων (Multi Spectral Optoacoustic Tomography-MSOT)... 58 2.9 Μαγνητοφόρηση... 60 3 Πειραματικό μέρος... 63 3.1 ΟΡΓΑΝΑ... 63 3.2 Αντιδραστήρια... 63 3.3 Σύνθεση μαγνητικών κολλοειδών... 64 3.3.1 Σχόλια επί της σύνθεσης 66 3.4 Διαδικασία ηλεκτροστατικής σύμπλεξης MagAlg με διπλά υδρόφιλα δισυσταδικά συμπολυμερή... 66 3.5 Τεχνικές χαρακτηρισμού μαγνητικών νανοφορέων... 68 4 Ανάλυση και επεξεργασία αποτελεσμάτων... 75 4.1 Φυσικοχημικές ιδιότητες συντιθέμενων νανοφορέων... 75 4.2 Μελέτη υπερθερμίας... 77 4.2.1 Επίδραση της συγκέντρωσης του νανοφορέα 77 4.2.2 Βέλτιστη συγκέντρωση για in vivo εφαρμογή 81 4.2.3 Κολλοειδής σταθερότητα μετά την εφαρμογή υπερθερμίας 82 4.3 Αλληλεπίδραση του αλγινικού οξέος με τους μανγητικούς νανοκρυσταλλίτες 84 4.4 Μελέτη της αλληλεπίδρασης των νανοφορέων MagAlg με δοξορουβικίνη 85 4.4.1 Ικανότητα δέσμευσης δοξορουβικίνης 85 4.4.2 Αποδέσμευση δοξορουβικίνης 87 4.5 Κολλοειδής σταθερότητα νανοφορέων παρουσία NaCl... 88 4.6 Αλληλεπιδράση του MagAlg μέσω ηλεκτροστατικής σύμπλεξης με διπλά υδρόφιλα συμπολυμερή και φυσικοχημικός χαρακτηρισμός... 90 IX

4.6.1 Παράμετροι αλληλεπίδρασης του MagAlg με τα συμπολυμερή 91 4.6.2 Σταθερότητα παρουσία ηλεκτρολυτών 93 4.6.3 Αλληλεπιδράσεις με DOX 95 4.7 In vitro μελέτη κυτταροτοξικότητας... 99 4.8 In vitro και in vivo μελέτη των νανοφορέων με την μέθοδο MSOT... 100 4.8.1 In vitro μελέτη 100 4.8.2 In vivo μελέτη 103 5 Συζήτηση Συμπεράσματα... 107 5.1 Συζήτηση αποτελεσμάτων χαρακτηρισμού των μαγνητικών νανοφορέων MagAlg 107 5.2 Συζήτηση ως προς την σταθεροποίηση των νανοφορέων MagAlg... 110 5.3 Συζήτηση αποτελεσμάτων in vitro και in vivo μελέτης... 111 5.4 Συμπεράσματα... 112 5.5 Μελλοντική εργασία... 113 Βιβλιογραφία... 115 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι...... 127 X

Κεφάλαιο 1 o 1 Εισαγωγικό μέρος 1.1 Εισαγωγή Η επιστήμη της νανοτεχνολογίας έχει εξελιχθεί σημαντικά τις τελευταίες δεκαετίες 1 αφού πλέον ο χειρισμός της ύλης στην νανοκλίμακα μπορεί να γίνει αποτελεσματικά και με ακρίβεια, παρέχοντας έτσι τα κατάλληλα εργαλεία στους επιστήμονες για τον σχεδιασμό καινοτόμων υλικών και νανοσυσκευών. Τέτοια νανοσυστήματα συχνά βασίζονται στα νανοσωματίδια. Ο όρος νανοσωματίδια (NPs) αναφέρεται σε σωματίδια των οποίων τουλάχιστον η μία εκ των διαστάσεων τους είναι μεταξύ 1 και 100 nm. Ο λόγος για τον οποίο υπάρχει έντονο επιστημονικό ενδιαφέρον για τα νανοσωματίδια έγκειται στο γεγονός ότι σε αυτά τα μεγέθη τα υλικά παρουσιάζουν ιδιότητες οι οποίες είναι διαφορετικές από αυτές των αντίστοιχων μακροσκοπικών υλικών. Οι δύο βασικότεροι λόγοι αυτής της διαφοράς είναι αφενός μεν η αύξηση της επιφάνειας τους σε σχέση με τον συνολικό όγκο και αφετέρου η επικράτηση των κβαντικών φαινομένων, με αποτέλεσμα να αλλάζουν σημαντικά οι οπτικές, ηλεκτρικές και μαγνητικές ιδιότητες του υλικού 2. Αυτή η εξέλιξη της νανοτεχνολογίας έχει βρει πολλές εφαρμογές σε ποικίλους επιστημονικούς τομείς από τα ηλεκτρονικά και την οπτική, μέχρι την κατάλυση χημικών αντιδράσεων και φυσικά την βιολογία και την ιατρική, διεισδύοντας όλο και περισσότερο στην καθημερινότητα του ανθρώπου 3. Στο σχήμα 1.1 απεικονίζονται μερικοί μόνο από τους τομείς στους οποίους έχουν βρει εφαρμογή τα νανοσωματίδια. Ειδικότερα η εφαρμογή της νανοτεχνολογίας στις επιστήμες της βιολογίας και της ιατρικής παρουσιάζει ολοένα και αυξανόμενο ερευνητικό ενδιαφέρον την τελευταία δεκαετία. Αυτή η εξέλιξη έχει οδηγήσει στην εισαγωγή δύο νέων όρων, της νανοβιοτεχνολογίας που αναφέρεται στον συνδυασμό της νανοτεχνολογίας και της μοριακής βιολογίας και του συγγενικού όρου βιοϊατρική νανοτεχνολογία που περιγράφει την χρήση της νανοτεχνολογίας στον ιατρικό τομέα. Η ανάπτυξη της βιοϊατρικής νανοτεχνολογίας έχει εστιάσει στην ανίχνευση, απεικόνιση και θεραπεία για ασθένειες όπως για παράδειγμα είναι ο καρκίνος, ο διαβήτης και οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Ο καρκίνος είναι μία από τις πέντε σημαντικότερες ασθένειες που ευθύνεται για τον θάνατο εκατομμυρίων ανθρώπων κατά την διάρκεια του 20 ου αιώνα και παραμένει μία από τις κύριες αιτίες νοσηρότητας ή/και θνησιμότητας με περισσότερα από 10 εκατομμύρια νέα περιστατικά κάθε χρόνο. Πρόκειται για μία κακοήθη ασθένεια που χαρακτηρίζεται από την ανεξέλεγκτη ανάπτυξη και διάδοση (μετάσταση) μη φυσιολογικών κυττάρων η οποία αν δεν ελεγχθεί, τότε μπορεί να προκαλέσει το θάνατο. Προκαλείται από εξωγενείς (κάπνισμα, χημικά, ακτινοβολία, κ.α.) αλλά και από ενδογενείς παράγοντες (κληρονομικές μεταλλάξεις, ορμόνες, παθήσεις του ανοσοποιητικού και μεταλλάξεις που προκαλούνται από τον μεταβολισμό). Αυτοί οι παράγοντες δρώντας συνεργατικά ή ξεχωριστά ο καθένας έχουν σαν αποτέλεσμα την ανάπτυξη της καρκινογένεσης 4. 1

Σχήμα 1.1: Ορισμένες μόνο από τις εφαρμογές των νανοσωματιδίων 3. Οι σύγχρονοι τρόποι αντιμετώπισης του καρκίνου περιλαμβάνουν χειρουργικές επεμβάσεις, ακτινοβολία και χημειοθεραπεία. Ειδικότερα η χημειοθεραπεία, είναι η πιο συχνή μέθοδος αντιμετώπισης των καρκινικών όγκων 5. Οι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες είναι κυτταροτοξικές ενώσεις που χρησιμοποιούνται για την θεραπεία του καρκίνου, και οι οποίοι στοχεύουν τα γρήγορα αναπτυσσόμενα καρκινικά κύτταρα, μπλοκάροντας μερικές κρίσιμες διεργασίες της διαίρεσης του κυττάρου, σταματώντας έτσι την διαδικασία της μίτωσης και επιπλέον οδηγούν στην απόπτωση του κυττάρου. Οι ογκολόγοι που χορηγούν σήμερα συμβατικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα πρέπει να ρυθμίζουν τη δόση του φαρμάκου λαμβάνοντας υπόψιν την σοβαρότητα των ανεπιθύμητων παρενεργειών 6. Όμως με τις συμβατικές μεθόδους χορήγησης τα φάρμακα διασπείρονται μη-ειδικά μέσα στο σώμα, επηρεάζοντας έτσι και καρκινικά αλλά και φυσιολογικά κύτταρα. Με αυτόν τον τρόπο περιορίζεται η δόση του φαρμάκου που φτάνει στον όγκο, επομένως και η αποτελεσματικότητα του. Επίσης η ανεξέλεγκτη δράση των φαρμάκων και στα υγιή κύτταρα προκαλεί τοξικότητα και τελικά χαμηλή ποιότητα ζωής των ασθενών 4 5 7. Έτσι η αντιμετώπιση του καρκίνου με συμβατικά μέσα έχει κυρίως παρηγορητικό χαρακτήρα, με πολύ χαμηλά ποσοστά ίασης της ασθένειας και κύριο σκοπό να επάγει την ανακούφιση στον ασθενή. Η εφαρμογή της νανοτεχνολογίας για την ανάπτυξη μεθόδων και τρόπων με σκοπό την στοχευμένη μεταφορά αντικαρκινικών φαρμάκων και την μείωση των ανεπιθύμητων ενεργειών τους μελετάται εκτενώς την τελευταία δεκαετία 8 9 10 καθώς επίσης σημαντικό ερευνητικό ενδιαφέρον συγκεντρώνει και η ανάπτυξη συστημάτων για την ταυτόχρονη μεταφορά δραστικών ουσιών και απεικόνισης των καρκινικών περιοχών. Αυτή η νέα κατηγορία νανοσυστημάτων ονομάζεται Theranostics 11 12. 2

1.2 Theranostics Ο όρος theranostics εμφανίστηκε για πρώτη φορά στην βιβλιογραφία το 2000 13 και επινοήθηκε για να περιγράψει φάρμακα ή μεθόδους τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ταυτόχρονη διάγνωση και θεραπεία. Ένα απλός ορισμός του όρου theranostics που περιγράφηκε από την S. Warner είναι diagnostics plus therapy 14. Η εφαρμογή της νανοτεχνολογίας στην ιατρική έχει βοηθήσει στην γεφύρωση του χάσματος μεταξύ διάγνωσης και θεραπείας. Παράγοντες βασισμένοι σε νανοσωματίδια για την απεικόνιση 15 16 17 και την θεραπεία 18 19 έχουν διερευνηθεί ξεχωριστά και έχουν εξελιχθεί σε βαθμό όπου είναι πλέον δυνατή η δημιουργία theranostics βασισμένων σε νανοσωματίδια τα οποία είναι ικανά να επιτελέσουν και τις δύο αυτές λειτουργίες (σχήμα 1.2) 20 21. 1.3 Συστήματα Theranostics βασισμένα σε νανοφορείς Οι νανοφορείς είναι υπερμοριακά συστήματα (ειδικά σχεδιασμένα νανοσωματίδια) που συνήθως έχουν μέγεθος από 3-200 nm, και μπορούν ανάλογα με τη σύστασή και τη δομή τους, να έχουν ιδιότητες κατάλληλα σχεδιασμένες για βιοϊατρικές εφαρμογές. Στην βιβλιογραφία υπάρχει μία μεγάλη ποικιλία νανοφορέων οι οποίοι χρησιμοποιούνται σαν νανό-πλατφόρμες για την ανάπτυξη συστημάτων theranostics. Αν και διακρίνονται από ποικίλα χαρακτηριστικά, όσον αφορά στη σύνθεση τους μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο βασικές κατηγορίες. Σχήμα 1.2: Τα συστήματα theranostics μπορούν να συνδυάσουν πλήθος λειτουργιών με σκοπό την ενοποίηση απεικόνισης και θεραπείας με την χρήση ενός μόνο σύνθετου νανοσωματιδίου. 22 3

Οργανικοί νανοφορείς, η σύνθεση των οποίων είναι εξ ολοκλήρου από οργανικά μόρια. Παραδείγματα τέτοιων νανοφορέων είναι τα πολυμερικά νανοσωματίδια 23, τα λιποσώματα, τα μικύλλια, οι νανοσωλήνες άνθρακα και τα δενδριμερή. Υβριδικοί νανοφορείς, οι οποίοι απαρτίζονται από οργανικά και ανόργανα τμήματα. Ο πιο χαρακτηριστικός τύπος υβριδικού νανοφορέα που χρησιμοποιείται στις βιοϊατρικές εφαρμόγες είναι της μορφής πυρήνα-περιβλήματος (core-shell), όπου ο ανόργανος πυρήνας επικαλύπτεται με έναν πολυμερικό φλοιό ώστε να καταστεί βιοσυμβατός και βιοχημικά ενεργός καθώς και για να ενισχυθεί η σταθερότητα του συστήματος. Οι σημαντικότεροι τύποι υβριδικών νανοφορέων είναι τα νανοσωματίδια χρυσού, οι κβαντικές τελείες, τα μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου και άλλων μετάλλων, μαγνητικά λιποσώματα καθώς και νανοσωματίδια πυριτίας (silica). Σχήμα 1.3: Διαφορετικές μορφές και είδη υβριδικών νανοφορέων 1.3.1 Μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου Τα μαγνητικά νανοσωματίδια (MNPs) αποτελούνται κυρίως από οξείδια του σιδήρου και σε μικρότερο βαθμό από μεταλλικό σίδηρο καθώς και άλλα μαγνητικά στοιχεία 24 25. Όταν το μέγεθος των μαγνητικών νανοσωματιδίων μειωθεί κάτω από ένα συγκεκριμένο όριο ( ~20 nm για τα MNPs οξειδίων του σιδήρου) τότε τα νανοσωματίδια γίνονται μονής μαγνητικής περιοχής (single magnetic domain) και η μαγνητική διπολική ροπή του συνόλου των ασύζευκτων ηλεκτρονιών θα έχει μία προτιμητέα διεύθυνση 26. Περαιτέρω μείωση του μεγέθους των νανοσωματιδίων έχει σαν αποτέλεσμα την μείωση του ενεργειακού φράγματος που απαιτείται για την περιστροφή της μαγνητικής ροπής, ώσπου τελικά η θερμική ενέργεια του περιβάλλοντος είναι αρκετή ώστε να προκαλέσει την περιστροφή της μαγνητικής ροπής των νανοσωματιδίων σε τυχαίες διευθύνσεις. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται υπερπαραμαγνητισμός και θα αναλυθεί εκτενέστερα σε επόμενη παράγραφο (παρ. 1.7.3). Απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, τα υπερπαραμγνητικά σωματίδια δεν εμφανίζουν φαινόμενα μαγνήτισης, ιδιότητα κρίσιμη για την κολλοειδή τους σταθερότητα. Με την εφαρμογή όμως εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, οι μαγνητικές διπολικές ροπές των νανοσωματιδίων ευθυγραμμίζονται προς την κατεύθυνση του πεδίου και φθάνουν στην μαγνήτιση κόρου σε σχετικά χαμηλές εντάσεις μαγνητικού πεδίου. Η πλειονότητα των μαγνητικών νανοφορέων που χρησιμοποιούνται σε βιοϊατρικές εφαρμογές αποτελούνται από μαγνητίτη και μαγκεμίτη εξαιτίας της πολύς καλής βιοσυμβατότητας που επιδεικνύουν. Η χρήση υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου (SPIONs) σε εφαρμογές απεικόνισης μαγνητικού συντονισμού (Magnetic Resonance Imaging-MRI) σαν 4

παράγοντες αντίθεσης Τ1 ή Τ2 έχει την δυνατότητα να βελτιώσει σημαντικά την ευαισθησία της συγκεκριμένης μεθόδου 27 28. Ο χρόνος χαλάρωσης Τ2 των μαγνητικών νανοσωματιδίων καθορίζεται από την μαγνητική τους ροπή και τις ιδιότητες του μέσου που έχει χρησιμοποιηθεί σαν επιφανειακός τροποποιητής 29. Γενικά τα μαγνητικά νανοσωματίδια με υψηλή τιμή μαγνήτισης κόρου, διάμετρο νανοκρυσταλλίτη και λεπτό πολυμερικό φλοιό έχουν υψηλότερους χρόνους χαλάρωσης T2. Ειδικότερα τα SPIONs μεγάλου μεγέθους και υψηλής μαγνήτισης μπορούν να εμφανίσουν έως και 2 τάξεις μεγέθους υψηλότερους χρόνους χαλάρωσης T2 συγκρινόμενα με τα πρώτης γενιάς κλινικώς εγκεκριμένα SPIONs, ενώ ενδιαφέρον ακόμα παρουσιάζει η ιδιότητα τους να αυξάνουν επιπλέον τους χρόνους χαλάρωσης Τ2 μέσω του σχηματισμού νανο-πλειάδων (clustering) 30. Έντονο είναι επίσης το ερευνητικό ενδιαφέρον που έχει αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια σχετικά με την χρησιμοποίηση των MNPs σε εφαρμογές μαγνητικής υπερθερμίας και στόχευσης. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια έχουν την δυναμική να παράγουν θερμότητα μέσω της εφαρμογής εναλλασσόμενων μαγνητικών πεδίων ιδιότητα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την in vivo επαγωγή υπερθερμίας 31 32. Η μαγνητική στόχευση έχει χρησιμοποιηθεί σε μεγάλο βαθμό σε ποικίλες in vitro εφαρμογές οι οποίες περιλαμβάνουν εφαρμογές κυτταρικού διαχωρισμού 33, διαμόλυνσης γονιδίων και εφαρμογές εμπλουτισμού δειγμάτων σε τεχνικές ανίχνευσης 34. Μεγαλύτερο όμως ενδιαφέρον παρουσιάζει η in vivo εφαρμογή της μαγνητικής στόχευσης καρκινικών όγκων η οποία μπορεί να αποδειχθεί πολύτιμη στην προσπάθεια μεταφοράς βιοδραστικών μορίων σε επιθυμητές in vivo περιοχές στόχους 35 36. Παράλληλα το ερευνητικό ενδιαφέρον για την ανάπτυξη συστημάτων ελεγχόμενης χορήγησης φαρμάκων βασισμένων σε μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου παραμένει αμείωτο την τελευταία δεκαετία 20 37 38 39. 1.4 Εφαρμογές των Theranostics Οι κυριότερες εφαρμογές των theranostics στην διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου εστιάζονται στους τομείς της απεικόνισης, στοχευμένης χορήγησης και θεραπείας μέσω επαγωγής υπερθερμίας. 1.4.1 Ελεγχόμενη χορήγηση μέσω φυσικής και μοριακής στόχευσης Η ελεγχόμενη χορήγηση φαρμακοδραστικών μορίων επιτυγχάνεται μέσω της επιφανειακής τροποποίησης των νανοφορέων ούτως ώστε να καταστεί δυνατή η στοχευμένη και η εκλεκτική χορήγηση φαρμάκων στον πάσχοντα ιστό. Η στοχευμένη χορήγηση επιδιώκεται μέσω δύο κύριων προσεγγίσεων: της φυσικής (παθητικής) και της μοριακής (ενεργούς) στόχευσης ή και μέσω συνδυασμού αυτών. 1.4.1.1 Φυσική στόχευση Η φυσική στόχευση εκμεταλλεύεται τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα της βιολογίας των καρκινικών όγκων που επιτρέπουν στους νανοφορείς να συσσωρεύονται στην περιοχή του όγκου. Ένα χαρακτηριστικό στο οποίο βασίζεται η φυσική στόχευση είναι το φαινόμενο ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης EPR (Enhanced Permeability and Retention effect) 40. 5

Πιο συγκεκριμένα, οι περισσότεροι συμπαγείς όγκοι, εμφανίζουν ιδιαίτερα παθοφυσιολογικά χαρακτηριστικά που δεν παρατηρούνται στους φυσιολογικούς ιστούς, όπως εκτεταμένη αγγειογένεση προκειμένου να καλυφθούν οι συνεχώς αυξανόμενες ανάγκες του όγκου σε οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά. Αυτή όμως η υπερ-αγγείωση που δημιουργείται έχει δομικές ατέλειες, με διεσταλμένα, ακανόνιστα ή διαπερατά αιμοφόρα αγγεία καθώς και κακή λεμφική παροχεύτευση. Επιπλέον τα ενδοθηλιακά κύτταρα των κυτταρικών τοιχωμάτων συχνά παρουσιάζουν μεγάλα κενά. Έτσι αυτή η ελαττωματική αρχιτεκτονική των αιμοφόρων αγγείων του όγκου, σε συνδυασμό με τον ευρύ αυλό τους, έχει σαν αποτέλεσμα την εκτεταμένη διαρροή συστατικών του πλάσματος του αίματος μέσα στον όγκο. Ενώ ταυτόχρονα η κακή λεμφική παροχέτευση του όγκου, οδηγεί στην κατακράτηση αυτών των συστατικών (μακρομόρια, νανοσωματίδια, λιπιδικά νανοσωματίδια) εντός του όγκου 41 42. Μέσω αυτού του μηχανισμού λοιπόν, οι νανοφορείς μπορούν, όπως τα συστατικά του πλάσματος, να συγκεντρωθούν στον καρκινικό ιστό. Πολύ σημαντικό για την ικανοποιητική συγκέντρωση των νανοφορέων στον στόχο μέσω του EPR είναι η παρατεταμένη κυκλοφορία τους στο αίμα, ώστε σταδιακά να επιτευχθεί αυξημένη στατιστικά ποσότητα των νανοφορέων μέσω της διάχυσης από τα υψηλής διαπερατότητας αιμοφόρα αγγεία του όγκου. Σχήμα 1.4: (a) Απεικόνιση της in vivo κατανομής δεξτράνης (μετά από ενέσιμη χορήγηση της) που δείχνει την διαφορά της διαπερατότητας των αγγείων σε φυσιολογικό και καρκινικό ιστό. (b) Απεικόνιση αγγειακού συστήματος υγιούς (αριστερά) και καρκινικού (δεξιά) ιστού 40 Με βάση αυτό το φαινόμενο έχουν γίνει πολλές προσπάθειες στοχευμένης μεταφοράς και αποδέσμευσης φαρμάκων στην περιοχή του όγκου 43 42. Έτσι είναι δυνατό να επιτευχθούν τοπικές συγκεντρώσεις φαρμάκων έως και 10-50 φορές μεγαλύτερες στην περιοχή του όγκου συγκριτικά 6

με τους φυσιολογικούς ιστούς, σε ένα διάστημα 1-2 ημερών. Νεότερα πολυμερικά σύμπλοκα, μικκύλια ή λιποσωμικά φάρμακα αντικαρκινικών παραγόντων βασίζονται στο φαινόμενο EPR. Όμως μελέτες έχουν δείξει ότι το φαινόμενο EPR δεν είναι εφαρμόσιμο σε χαμηλού μοριακού βάρους φάρμακα εξαιτίας της γρήγορης διάχυσης τους στην κυκλοφορία του αίματος, ακολουθούμενη από νεφρική κάθαρση 42. Αποτελέσματα ερευνών με λιποσώματα διαφορετικών μέσων μεγεθών, δείχνουν ότι το όριο μεγέθους των σωματιδίων που διεισδύουν στους όγκους είναι περίπου 400 nm, ενώ άλλες έρευνες δείχνουν ότι σωματίδια με διαμέτρους μικρότερες των 200 nm είναι πιο αποτελεσματικά 44. Παρόλο όμως που η φυσική στόχευση αποτελεί τη βάση για την κλινική θεραπεία, ταυτόχρονα παρουσιάζει αρκετούς περιορισμούς. Η στόχευση των κυττάρων μέσα σ έναν όγκο δεν είναι πάντα εφικτή εξαιτίας της μη αποτελεσματικής διάχυσης μερικών φαρμάκων και της τυχαίας φύσης αυτής της προσέγγισης. Αυτός ο περιορισμός βέβαια είναι κοινός με τη συμβατική θεραπεία. Επιπλέον η φυσική στόχευση περιορίζεται επειδή δεν παρουσιάζουν όλοι οι όγκοι το φαινόμενο EPR, και επειδή η διαπερατότητα των αιμοφόρων αγγείων δεν είναι η ίδια σε όλη την έκταση του όγκου. 1.4.1.2 Μοριακή στόχευση Η μοριακή στόχευση βασίζεται στη μοριακή τροποποίηση της επιφάνειας των νανοφορέων. Συνήθως μέσω χημικών μεθόδων, επιτυγχάνεται η σύνδεση τους με ποικιλία παραγόντων στόχευσης, οι οποίοι αναγνωρίζονται και συνδέονται από συγκεκριμένους υποδοχείς ή αντιγόνα της επιφάνειας των κυττάρων-στόχων. Αυτοί οι παράγοντες στόχευσης συνήθως είναι πρωτεΐνες (κυρίως αντισώματα και τα κλάσματα τους), κλάσματα νουκλεϊκών οξέων (aptamers), ή άλλοι συνδέτες υποδοχέων (πεπτίδια, βιταμίνες, υδατάνθρακες, κ.α.). Γενικά, όταν χρησιμοποιείται ένας παράγοντας στόχευσης για την πρόσδεση του νανοφορέα σε καρκινικά κύτταρα, είναι αναγκαίο ο συνδέτης να προσδένεται με υψηλή εκλεκτικότητα στα μόρια που εκφράζονται στην επιφάνεια των κυττάρων. Επίσης, για την βελτιστοποίηση της εκλεκτικότητας, κρίνεται σκόπιμο το μόριο στο οποίο θα προσδεθεί ο συνδέτης να είναι υπερεκφρασμένο στην επιφάνεια του κυττάρου στόχου, συγκριτικά με τα φυσιολογικά κύτταρα 44 45. Μόλις οι νανοφορείς αναγνωριστούν και προσδεθούν στην επιφάνεια των κύτταρων στόχων (μέσω αλληλεπιδράσεων συνδέτη υποδοχέα) τότε, ανάλογα με τον συνδέτη τον οποίο φέρουν, είτε θα πραγματοποιηθεί ενδοκυττάρωση του νανοφορέα, είτε θα παραμείνει προσκολλημένος στην επιφάνεια του κυττάρου. Η 1 η περίπτωση κρίνεται αναγκαία όταν χρειάζεται να γίνει η αποδέσμευση του φαρμάκου εντός του κυττάρου. Ενώ αντίθετα, η δεύτερη περίπτωση πλεονεκτεί σε συμπαγείς όγκους, στους οποίους η αποδέσμευση του φαρμάκου στην επιφάνεια μπορεί να σκοτώσει και τα γειτονικά κύτταρα, τα οποία πιθανόν να μην εκφράζουν τον υποδοχέα με τον οποία θα μπορούσε να προσδεθεί ο νανοφορέας. Τα μειονεκτήματα όμως αυτής της θεραπευτικής οδού, είναι i) το ιδιαίτερα υψηλό της κόστος, αφού σχετίζεται με εξατομικευμένη μοριακή ανάλυση του πάσχοντα ιστού του ασθενούς και ii) η πιθανή επαγωγή αποκρίσεων του ανοσοποιητικού από τους παράγοντες στόχευσης. Δηλαδή έχει παρατηρηθεί ότι όταν οι νανοφορείς εκφράζουν στην επιφάνειά τους μόρια κατάλληλα για στόχευση, τότε μειώνεται ο χρόνος κυκλοφορίας τους στο αίμα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα οι νανοφορείς να μην προλαβαίνουν να συγκεντρωθούν και να αποδεσμεύσουν το 7

φάρμακο εκλεκτικά 46 47. Η σημασία αυτού γίνεται ακόμα περισσότερο αντιληπτή λαμβάνοντας υπόψη πως η διαδικασία της μοριακής στόχευσης προϋποθέτει την συγκέντρωση των νανοφορέων μέσω του φαινομένου EPR στους συμπαγείς όγκους. Στο σχήμα 1.5 φαίνεται ο τρόπος δράσης των δύο αυτών φαινομένων (παθητικής και ενεργούς στόχευσης). Σχήμα 1.5: Σχηματική αναπαράσταση του μηχανισμού φυσικής στόχευσης (μέσω του φαινομένου EPR) και της μοριακής μέσω της πρόσδεσης συνδετών στην επιφάνεια των νανοφορέων 44 1.4.1.3 Μαγνητική στόχευση Η προσέγγιση της μαγνητικής στόχευσης προσφέρει μία επιπλέον φυσική οδό στην θεραπεία του καρκίνου, κάνοντας χρήση συστημάτων ελεγχόμενης χορήγησης φαρμάκων βασισμένα σε μαγνητικά νανοσωματίδια. Η βασική αρχή της μαγνητικής στόχευσης, είναι η σύνδεση μίας φαρμακευτικής ένωσης με έναν μαγνητικό νανοφορέα, η ενδοφλέβια χορήγηση του στην κυκλοφορία του αίματος του ασθενούς και εν συνεχεία η ακινητοποίηση της, με την χρήση ενός ισχυρού μαγνητικού πεδίου στην περιοχή στόχο (σχήμα 1.6). Η μέθοδος της μαγνητικής στόχευσης μπορεί να αυξήσει την τοπική συγκέντρωση του φαρμάκου στην επιθυμητή περιοχή κατά αρκετές τάξεις μεγέθους, μειώνοντας έτσι την απαιτούμενη δόση χορήγησης και τις επακόλουθες ανεπιθύμητες ενέργειες από την συστημική κυκλοφορία των χημειοθεραπευτικών παραγόντων στην κυκλοφορία του αίματος. Μελέτες έχουν αναδείξει την αποτελεσματικότητα αυτής της μεθόδου σε in vivo εφαρμογές 48 35. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η εργασία των C. Alexiou et al. 48 όπου μετά από ενδοαρτηριακή χορήγηση SPIONs συζευγμένων με το χημειοθεραπευτικό μόριο MTO και εφαρμογή μαγνητικής στόχευσης παρατήρησαν εξαπλάσια ποσότητα ΜΤΟ στην περιοχή του όγκου. Ο ex vivo χαρακτηρισμός δειγμάτων ιστού που ακολούθησε επιβεβαίωσε την αυξημένη ύπαρξη SPIONs στην περιοχή του όγκου (σχήμα 1.7). 8

Σχήμα 1.6: Η βασική ιδέα της μαγνητικής στόχευσης 49 Σχήμα 1.7: (a) Ακτινογραφία ακτίνων Χ καρκινικού ιστού τύπου VX-2 μετά από μαγνητική στόχευση, είναι ορατή η ύπαρξη νανοσωματιδίων στο αγγειακό σύστημα, (b) εγκάρσια τομή δείγματος επισημασμένου με χρωστική Prussian blue, τα νανοσωματίδια είναι ορατά σαν μπλε σκούρες περιοχές στο αγγειακό σύστημα του όγκου 48. Αυτή η προσέγγιση μπορεί να συνδυαστεί και με απεικόνιση του ιστού μέσω μαγνητικού συντονισμού, και επομένως να αναδείξει ένα πλεονέκτημα της χρήσης συστημάτων theranostics βασισμένων σε μαγνητικά νανοσωματίδια 50. 9

1.4.2 Εφαρμογές απεικόνισης Η έγκαιρη διάγνωση της νόσου στα αρχικά στάδια μπορεί να συντελέσει στην θετική έκβαση ανεξαρτήτως του τύπου της θεραπείας που θα ακολουθηθεί. Οι κυριότερες μέθοδοι απεικόνισης ανατομικών περιοχών που χρησιμοποιούνται σε αυτόν τον τομέα είναι η Τομογραφία Εκπομπής Ποζιτρονίων (Positron Emission Tomography-PET), η Αξονική Τομογραφία Ακτίνων Χ (X-Ray Computed Tomography), η Σπινθιρογραφική απεικόνιση (Single Photon Emission Computed Tomography-SPECT), η Μαγνητική Τομογραφία Πυρηνικού Συντονισμού (Magnetic Resonance Imaging) και η απεικόνιση με χρήση φθοριζόντων ενώσεων, ενώ τα τελευταία χρόνια έχουν αρχίσει να αναπτύσσονται και μέθοδοι Οπτο-ακουστικής Απεικόνισης (Photoacoustic ή Optoacoustic Imaging Tomography-PAT). Από τις προαναφερθέντες τεχνικές ιδιαίτερου ενδιαφέροντος χρίζουν οι MRI και PAT λόγω της μηιονίζουσας φύσης τους προσφέροντας έτσι ένα πλεονέκτημα όσον αφορά την ασφάλεια του ασθενούς ενώ ταυτόχρονα είναι σε θέση να παράγουν ανατομικές εικόνες υψηλής ανάλυσης. 1.4.2.1 Μαγνητική τομογραφία πυρηνικού συντονισμού (Magnetic Resonance Imaging, MRI) H μαγνητική τομογραφία πυρηνικού συντονισμού βασίζεται στην ανίχνευση των διεργασιών χαλάρωσης των πυρηνικών σπιν ατόμων υδρογόνου που υπάρχουν στους μαλακούς ιστούς του σώματος (κυρίως από το νερό και το λίπος) μετά την εφαρμογή μαγνητικού πεδίου παράγοντας στην συνέχεια μία εικόνα αντίθεσης φωτεινών και σκοτεινών περιοχών. Τα υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια μπορούν να μειώσουν τον χρόνο αυτών των διεργασιών χαλάρωσης αυξάνοντας την ευαισθησία της μεθόδου. Παράλληλα μέσω της κατάλληλης τροποποίησης των νανοφορέων με φθορίζοντα μόρια μπορεί να γίνει συνδυασμός διαφορετικών μεθόδων απεικόνισης, ενώ η αύξηση της τοπικής τους συγκέντρωσης στην επιθυμητή περιοχή μπορεί να αξιοποιηθεί για επαγωγή μαγνητικής υπερθερμίας (σχήμα 1.8 51 ). Σχήμα 1.8: Διαφορετικές προσεγγίσεις στην ανάπτυξη συστημάτων theranostics 51 10

1.4.2.2 Οπτοακουστική απεικόνιση Η μέθοδος της οπτοακουστικής απεικόνισης είναι μία μη-επεμβατική μέθοδος που συνδυάζει τα οφέλη της οπτικής και μέσω υπερήχων μεθόδων απεικόνισης. Μπορεί να προσφέρει μεγαλύτερο βάθος διείσδυσης (50-70 mm) συγκριτικά με μεθόδους οπτικής απεικόνισης με μεγάλο πλεονέκτημα τον σχηματισμό εικόνων υψηλής ανάλυσης (~50 μm) σε πραγματικό χρόνο. Οι παράγοντες αντίθεσης που χρησιμοποιούνται σε μεθόδους οπτοακουστικής απεικόνιση μετατρέπουν την προσπίπτουσα ακτινοβολία σε θερμότητα, αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την θερμική διαστολή τους και την επακόλουθη εκπομπή υπερήχων οι οποίοι μπορούν να ανιχνευθούν μέσω αισθητήρων. Για in vivo εφαρμογές χρησιμοποιούνται παράγοντες αντίθεσης οι οποίοι επιδεικνύουν ισχυρή απορρόφηση στην NIR περιοχή του φάσματος. Σε αυτά τα μήκη κύματος η ενδογενής απορρόφηση του ιστού εμφανίζει ελάχιστο επομένως ο παράγοντας αντίθεσης είναι ευκολότερο να ανιχνευθεί 52. Σαν οπτοακουστικοί παράγοντες χρησιμοποιούνται κυρίως νανοσωματίδια χρυσού εξαιτίας της υψηλής απορρόφησης που παρουσιάζουν καθώς και μόρια NIR χρωστικών συζευγμένα με νανοδομές. Ίδια χαρακτηριστικά απαιτούνται και για τους παράγοντες που χρησιμοποιούνται σε φωτοθερμικές μεθόδους κάνοντας έτσι δυνατό την συνδυασμό απεικόνισης και παραγωγής υπερθερμίας μέσω ακτινοβόλησης. Ταυτόχρονα, μέσω της σύνδεσης SPIONs με NIR χρωστικές μπορούν να παραχθούν παράγοντες αντίθεσης που συνδυάζουν τα οφέλη του MRI και της οπτοακουστικής απεικόνισης 53 54. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα υλοποίησης αυτής της ιδέας είναι η εργασία των Yanglong et al. όπου μετά από επικάλυψη νανοσωματιδίων καρβιδίου του σιδήρου με ένα λεπτό στρώμα άνθρακα και την μετέπειτα πρόσδεση πολύ(αιθυλενογλυκόλης) και στοχευτικών παραγόντων συνδύασαν τα οφέλη των υπερπαραμαγνητικών ιδιοτήτων του πυρήνα για MRI απεικόνιση και την ισχυρή απορρόφηση στο NIR του κελύφους άνθρακα για εφαρμογές φωτοθερμίας και οπτοακουστικής απεικόνισης (σχήμα 1.9). Σχήμα 1.9: Σχηματική απεικόνιση σχεδιασμού συστήματος για την ταυτόχρονη απεικόνιση και θεραπεία 54 11

1.4.3 Μαγνητική Υπερθερμία Η εφαρμογή εναλλασσόμενων μαγνητικών πεδίων μπορεί να οδηγήσει στην αύξηση της θερμοκρασίας των μαγνητικών νανοσωματιδίων λόγω φαινομένων υστέρησης και χαλάρωσης των μαγνητικών διπολικών ροπών. Η εγγενής αυτή ιδιότητα των μαγνητικών νανοσωματιδίων μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε εφαρμογές μαγνητικής υπερθερμίας για την αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση του καρκίνου. Η τοπική αύξηση της θερμοκρασίας (~45 ο C) μπορεί να κάνει τα καρκινικά κύτταρα πιο ευαίσθητα στην δράση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων 55 ή να προκαλέσει ακόμα και την απόπτωση τους. Επιπλέον, μελέτες αναφέρουν ότι οι υποξικές περιοχές των καρκινικών όγκων παρουσιάζουν μεγαλύτερη αντίσταση στην ακτινοβολία όμως είναι πολύ πιο ευαίσθητες στην αύξηση της θερμοκρασίας 56. Επομένως ο συνδυασμός των παραδοσιακών μεθόδων με την εφαρμογή υπερθερμίας μπορεί να έχει σαν αποτέλεσμα την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας των φαρμακομορίων. Σε ένα πρόσφατο παράδειγμα οι Hayashi et al. 57 χρησιμοποιώντας μαγνητικά νανοσωματίδια συζευγμένα με τον χημειοθεραπευτικό παράγοντα δοξορουβικίνη μέσω ενός θερμο-αποκρινόμενου πολυμερούς πέτυχαν σχεδόν πλήρη υποχώρηση του καρκινικού όγκου σε ποντίκια μέσω του συνδυασμού υπερθερμίας και εκλεκτικής αποδέσμευσης του φαρμάκου λόγω της αυξημένης θερμοκρασίας που αναπτύχθηκε. Στις φωτογραφίες του σχήματος 1.10 αποτυπώνεται η σταδιακή υποχώρηση του όγκου μετά την εφαρμογή υπερθερμίας. Σχήμα 1.10: (a) Φωτογραφία και θερμική εικόνα κατά την εφαρμογή υπερθερμίας. (b) Μέση θερμοκρασία που αναπτύσσεται στην περιοχή του όγκου κατά την διάρκεια AMF μετά την χορήγηση (κόκκινοι κύκλοι, μπλε τρίγωνα) και χωρίς την χορήγηση (γκρι ρόμβοι) μαγνητικών νανοσωματιδίων 57 Η χρήση των SPIONs σαν παράγοντες υπερθερμίας μπορεί να έχει ποικίλα οφέλη έχοντας την ικανότητα να συνδυάσει και απεικονιστικές τεχνικές (πχ MRI) συμβάλλοντας έτσι στην παρακολούθηση της ασθένειας και τον κατάλληλο προγραμματισμό συνέχισης της θεραπείας. 12

1.5 Μηχανισμοί απωλειών ισχύος μαγνητικών υλικών Η εφαρμογή εναλλασσόμενων μαγνητικών πεδίων υψηλών συχνοτήτων μπορεί να επάγει την θέρμανση υλικών με μονήρη ηλεκτρόνια μέσα από τέσσερεις ανεξάρτητους μηχανισμούς: Ρεύματα Eddy, απώλειες υστέρησης καθώς και μέσω των μηχανισμών χαλάρωσης Neel και Brown. Στα μακροσκοπικά υλικά η παραγωγή των ρευμάτων Eddy επάγεται από την ταχεία εναλλαγή της μαγνητικής ροής και εξαρτάται κυρίως από την ηλεκτρική αντίσταση του υλικού (electrical resistivity) ενώ και η μετατόπιση των τοιχωμάτων bloch των μαγνητικών περιοχών (απώλειες λόγω φαινομένων υστέρησης) μπορεί να επάγει την μετατροπή της ενέργειας του μαγνητικού πεδίου σε θερμότητα. Η σημασία όμως των ρευμάτων Eddy περιορίζεται σε υλικά μακροσκοπικών διαστάσεων και επομένως έχει μηδαμινή συνεισφορά στην υπερθερμία με την χρήση μαγνητικών νανοσωματιδίων. Οι απώλειες λόγω φαινομένων υστέρησης παραμένουν σημαντικές για νανοσωματίδια μονής μαγνητικής περιοχής (single domain). Όμως καθώς το συνεκτικό πεδίο και η παραμένουσα μαγνήτιση εξαρτώνται από τον όγκο του μαγνητικού νανοσωματιδίου υπάρχει ένα κρίσιμο μέγεθος (το υπερπαραμαγνητικό όριο) κάτω από το οποίο συμβαίνει μία απότομη εξαφάνιση των φαινομένων υστέρησης. Κάτω από αυτό το όριο τα φαινόμενα χαλάρωσης Neel και Brown είναι οι κυρίαρχοι μηχανισμοί για την επαγωγή θερμότητας 58. Στο σχήμα 1.11 περιγράφονται οι βασικοί μηχανισμοί απωλειών λόγω φαινομένων υστέρησης και χαλάρωσης που αναφέρθηκαν παραπάνω. 1.5.1 Μηχανισμοί υπερθερμίας μαγνητικών νανοσωματιδίων μονής μαγνητικής περιοχής Η επαγωγή θερμότητας σε νανοσωματίδια με μέγεθος μικρότερο αυτού του κρίσιμου ορίου επιτυγχάνεται μέσω της περιστροφή της μαγνητικής ροπής του κάθε σωματιδίου ενάντια σε ένα ενεργειακό φράγμα. Στον μηχανισμό χαλάρωσης Neel η εφαρμογή του μαγνητικού πεδίου είναι ικανή να προκαλέσει περιστροφή της μαγνητικής ροπής (χωρίς την φυσική περιστροφή του σωματιδίου) και η επαναφορά της στη θέση ισορροπίας μπορεί να απελευθερώσει θερμική ενέργεια σαν αποτέλεσμα της αναδιευθέτησης των ατομικών διπόλων της μαγνητικής ροπής εντός του κρυστάλλου. Ο χρόνος χαλάρωσης (ή χρόνος εφησυχασμού) του μηχανισμού Neel περιγράφηκε αρχικά από τον Neel 59 και στη συνέχεια από τον Brown 60 και περιγράφεται μέσω της εξίσωσης 1.1 τ Ν = τ ο 2 kt π ekv kt (εξίσωση 1.1) KV Όπου K είναι η σταθερά ανισοτροπίας, V ο όγκος του σωματιδίου, kτ η θερμική ενέργεια και το τ 0 ~ 10-6 sec. 13

Σχήμα 1.11: Μηχανισμοί που εμπλέκονται στις διεργασίες απωλειών ενέργειας των μαγνητικών νανοσωματιδίων υπό την εφαρμογή εναλλασσόμενων μαγνητικών πεδίων 61 Στην περίπτωση όμως που η μαγνητική ανισοτροπία του σωματιδίου είναι αρκετά ισχυρή τότε η εφαρμογή του εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου μπορεί να προκαλέσει την φυσική περιστροφή του σωματιδίου με την μαγνητική ροπή να παραμένει σταθερή ως προς τον κρυσταλλικό άξονα του σωματιδίου. Αυτός ο μηχανισμός ονομάζεται χαλάρωση Brown και η παραγωγή θερμότητας είναι αποτέλεσμα των τριβών που αναπτύσσονται κατά την περιστροφή του σωματιδίου με το περιβάλλον υγρό λόγω της ιξώδους αντίστασης. Ο χρόνος χαλάρωσης Brown εξαρτάται κατά κύριο λόγο από το ιξώδες η του διαλύματος και από τον υδροδυναμικό όγκο VH του σωματιδίου και περιγράφεται από την εξίσωση 1.2 τ Β = 3ηV H kt (εξίσωση 1.2) Στην πραγματικότητα είναι δυνατή η ταυτόχρονη εμφάνιση και των δύο μηχανισμών με τον χρόνο χαλάρωσης του συστήματος να περιγράφεται από την εξίσωση 1.3 1 = 1 + 1 (εξίσωση 1.3) τ τ Β τ Ν Από την εξίσωση 1.3 γίνεται εμφανές ότι ο γρηγορότερος μηχανισμός χαλάρωσης είναι και ο κυρίαρχος του συστήματος. Έτσι ο μηχανισμός χαλάρωσης Brown ευνοείται για σωματίδια με μεγάλο όγκο σε υγρά που εμφανίζουν μικρό ιξώδες, ενώ ο μηχανισμός Neel για μικρότερα σωματίδια σε πιο ιξώδη διαλύματα. Το σχήμα 1.12 αποτυπώνει την συνεισφορά των μηχανισμών 14

Neel και Brown στον συνολικό χρόνο χαλάρωσης ενός σφαιρικού νανοσωματιδίου μαγνητίτη σε νερό θερμοκρασίας δωματίου 62. Σχήμα 1.12: Χρόνοι χαλάρωσης Neel (τ Ν ) και Brown (τ Β ) για μαγνητικά νανοσωματίδια μονής μαγνητικής περιοχής, με διακεκομμένη γραμμή συμβολίζει τον συνολικό χρόνο χαλάρωσης που δίνεται από την εξίσωση 1.3 62 1.5.2 Ειδικός συντελεστής απωλειών ενέργειας (Specific Loss Power-SLP) Ο R. E. Rosenweig με την θεωρητική μελέτη που δημοσίευσε το 2002 63 επιχείρησε να αναπτύξει αναλυτικές σχέσεις και ένα θεωρητικό μοντέλο που να συνδέει την διάχυση των απωλειών ισχύος ενός μαγνητικού νανοσωματιδίου που προκύπτουν σαν αποτέλεσμα της εφαρμογής εναλλασσόμενων μαγνητικών πεδίων. Σε αυτό το μοντέλο, ως ειδικός ρυθμός απορρόφησης (Specific Absorption Rate-SAR) ή ειδικός συντελεστής απώλειας ισχύος (Specific Loss Power-SLP) ορίζεται η ενέργεια που διαχέεται από ένα μαγνητικό νανοσωματίδιο ανά μονάδα μάζας και δίνεται από την εξίσωση 1.4. P = 1 2 ωμ 0χ 0 Η 2 ωτ 1+ω 2 τ2 (εξίσωση 1.4) όπου ω (ω=2πf) και Η η γωνιακή συχνότητα και το μέγεθος του εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου αντίστοιχα, μο η μαγνητική διαπερατότητα του κενού και τ ο συνολικός χρόνος χαλάρωσης. Το υλικό θεωρείται ότι αποτελεί ένα σύνολο νανοσωματιδίων με μαγνητική ροπή m, όπου το κάθε ένα από αυτά, απουσία πεδίου, προσανατολίζεται τυχαία στο χώρο. Ως χ0 ορίζεται η μαγνητική επιδεκτικότητα του συνόλου αυτού. Η εξίσωση 1.4 μπορεί να μετασχηματιστεί στην μορφή της εξίσωσης 1.5, η οποία και χρησιμοποιείται για τον υπολογισμού του πειραματικού SLP στην πλειοψηφία των βιβλιογραφικών αναφορών 64. SLP = Cv Vs dt dt ( 1 m ox ) (εξίσωση 1.5) 15

Ο SLP υπολογίζεται σε W/g και στην παραπάνω σχέση mox είναι η μαγνητική μάζα του υλικού η οποία είναι διεσπαρμένη σε μέσο ειδικής θερμοχωρητικότητας Cv, Vs ο όγκος του δείγματος και dt/dt ο ρυθμός αύξησης της θερμοκρασίας. Ο κλασματικός όρος της εξίσωσης 1.4 οδηγεί σε ένα καθολικό μέγιστο SAR για ωt=1, και συνεπώς η εξίσωση αυτή ορίζει την «κρίσιμη συχνότητα» του συστήματος. Για τιμές αρκετά μικρότερες της κρίσιμης συχνότητας (ωt<<1), η εξίσωση 1.4 μετατρέπεται σε Pωt<<1= ½(ω 2 τμ0χ0η 2 ) και οι απώλειες αυξάνονται εκθετικά από το τετράγωνο τόσο της συχνότητας, όσο και του μεγέθους του εφαρμοζόμενου πεδίου. Για συχνότητες αρκετά υψηλότερες της κρίσιμης (ωt>>1), η εξίσωση 1.4 μετατρέπεται σε Pωt>>1=μ0χ0Η 2 /2τ και κατά συνέπεια το SAR γίνεται ανεξάρτητο της συχνότητας. Οι τυπικές τιμές συχνοτήτων των μαγνητικών πεδίων που χρησιμοποιούνται σε πειραματικές μελέτες έχουν συνήθως εύρος από 100-300 KHz και ευνοούν χρόνους χαλάρωσης της τάξης των 10-6 sec, επομένως ο μηχανισμός χαλάρωσης Neel τείνει να είναι ο κυρίαρχος για single-domain νανοσωματίδια. Το μοντέλο Rosenweig προβλέπει την εξάρτηση του SLP από ένα πλήθος παραμέτρων όπως το μέγεθος των νανοσωματιδίων, η συχνότητα του μαγνητικού πεδίου, το μέγεθος του μαγνητικού πεδίου καθώς και η σταθερά ανισοτροπίας των νανοσωματίδιων. Στο σχήμα 1.13 αναπαρίσταται η εξάρτηση του SLP από την συχνότητα του μαγνητικού πεδίου και την διάμετρο του νανοσωματιδίου όπως προβλέπεται από το μοντέλο Rosenweig. Σχήμα 1.13: Ο συντελεστής SLP σαν συνάρτηση του μαγνητικού πεδίου και της διαμέτρου νανοσωματιδίου μονής μαγνητικής περιοχής στο μοντέλο Rosenweig. Η διακεκομμένη γραμμή αναπαριστά την συνθήκη ωτ = 1 όπου ο SLP μεγιστοποιείται 62 Γενικά όπως προκύπτει από την εξίσωση 1.4 ο SLP είναι ευθέως ανάλογος με το τετράγωνο της έντασης του μαγνητικού πεδίου και όντως υπάρχουν αρκετές πειραματικές μελέτες που επιβεβαιώνουν αυτή την συμπεριφορά 65 66. Η συνεισφορά της συχνότητας του μαγνητικού πεδίου είναι περισσότερο πολύπλοκη από ότι της έντασης, γενικά όμως για συχνότητες που χρησιμοποιούνται σε θεραπευτικές εφαρμογές (100-300 KHz) οι διακυμάνσεις που προκύπτουν από την συχνότητα είναι μικρές. Η διάμετρος των νανοσωματιδίων παίζει επίσης πολύ σημαντικό ρόλο αφού το μέγεθος καθορίζει σε μεγάλο βαθμό ποιος μηχανισμός χαλάρωσης θα είναι ο κυρίαρχος, με τον μηχανισμό χαλάρωσης Neel να ευνοείται για μεγέθη από 7-15 nm, 16

με τον μηχανισμό χαλάρωσης Brown να ευνοείται για μεγαλύτερα μεγέθη. Η σταθερά ανισοτροπίας των νανοσωματιδίων επίσης έχει σημαντική επίδραση στην θερμική συμπεριφορά των νανοσωματιδίων. Σε νανοσωματίδια με σφαιρική συμμετρία δεν θα υπήρχε κάποιος προτιμητέος προσανατολισμός της μαγνητικής ροπής. Στα πραγματικά νανοσωματίδια όμως πάντα υπάρχει μία ανισοτροπία (είτε κρυσταλλική, είτε σχήματος) η οποία οδηγεί σε κατάσταση ελάχιστης ενέργειας κατά μήκος ενός συγκεκριμένου κρυσταλλικού άξονα. Η ενέργεια μαγνητικής ανισοτροπίας (KV) αναφέρεται στο ενεργειακό φράγμα που απαιτείται να ξεπεραστεί προκειμένου να περιστραφεί (εκτραπεί) η μαγνητική ροπή του μαγνητικού νανοσωματιδίου γύρω από τον αυτόν τον προτιμητέο άξονα συμμετρίας. Αυτό το ενεργειακό φράγμα ευθύνεται και για την περιστροφή Brown αφού όταν είναι αρκετά υψηλό τότε κατά την εφαρμογή εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου είναι πιθανό ολόκληρο το νανοσωματίδιο περιστραφεί ενάντια στις ιξώδεις αντιστάσεις του μέσου όπου βρίσκεται. Ο ρόλος της ανισοτροπίας όμως έχει ισχυρότερη επίδραση στον μηχανισμό χαλάρωσης Neel αφού επηρέαζει εκθετικά το τ Ν, όπως προκύπτει από την εξίσωση 1.1 Στο σχήμα 1.14 αποτυπώνεται η εξάρτηση του SLP και των χρόνων χαλάρωσης Neel και Brown σαν συνάρτηση της διαμέτρου και της σταθεράς ανισοτροπίας νανοσωματιδίων μαγνητίτη. Αξίζει να σημειωθεί η επίδραση που έχει η μεταβολή της σταθεράς ανισοτροπίας (πχ από τα 10 KJ/m 3 στα 25 KJ/m 3 ) στο SLP για δεδομένο μέγεθος νανοκρυσταλλίτη. Σχήμα 1.14: Η επίδραση της σταθεράς ανισοτροπίας K στον χρόνο χαλάρωσης (κάτω διάγραμμα) και τον SLP σαν συνάρτηση του μεγέθους. Η σκιασμένη περιοχή του κατώτερου γραφήματος αντιπροσωπεύει τους χρόνους χαλάρωσης για τους οποίους ισχύει η συνθήκη ωτ = 1 για φάσμα συχνοτήτων 100 300 khz 62 Ένα ακόμη σημείο στο οποίο πρέπει να δοθεί έμφαση είναι η εξάρτηση του SLP από τον χρόνο χαλάρωσης μόνο μέσω του κλασματικού όρου της εξίσωσης 1.4 και η μεγιστοποίηση αυτού του όρου όταν ικανοποιείται η συνθήκη ωτ = 1. Στο γράφημα του σχήματος 1.15 απεικονίζεται η εξάρτηση του SLP από την μεταβολή του όρου ωτ. Για τιμές ωτ μικρότερες της μονάδας ο χρόνος χαλάρωσης είναι αρκετά γρήγορος επιτρέποντας έτσι την χαλάρωση της 17

μαγνητικής ροπής λόγω της θερμικής ενέργειας μέσα στο χρονικό διάστημα που απαιτείται για μία ταλάντωση του μαγνητικού πεδίου. Για τιμές ωτ μεγαλύτερες της μονάδας ο χρόνος που απαιτείται για την χαλάρωση της μαγνητικής ροπής είναι μεγαλύτερος από την ταχύτητα ταλάντωσης του μαγνητικού πεδίου με αποτέλεσμα την υποβάθμιση των φαινομένων χαλάρωσης Neel. Άρα για τιμές ωτ >>1, ο κύριος μηχανισμός χαλάρωσης γίνεται ο μηχανισμός Brown. Η μεγιστοποίηση του SLP πραγματοποιείται όταν ωτ=1, όταν δηλαδή ο χρόνος χαλάρωσης της μαγνητικής ροπής ταυτίζεται με την περίοδο της ταλάντωσης του μαγνητικού πεδίου. Σχήμα 1.15: Διάγραμμα μεταβολής του (κανονικοποιημένου) SLP σαν συνάρτηση του γινομένου της συχνότητας και του χρόνου χαλάρωσης ωτ ενός μαγνητικού νανοσωματιδίου σύμφωνα με το μοντέλο Rosenweig. Ο SLP μεγιστοποιείται για ωτ = 1 62 1.5.3 Εγγενής απώλεια ισχύος (Intrinsic Loss Power-ILP) Αν και η παράμετρος του SLP χρησιμοποιείται ευρέως στην βιβλιογραφία για να αξιολογήσει την αποτελεσματικότητα των μαγνητικών νανοσωματιδίων σαν παράγοντες υπερθερμίας, εντούτοις η εξάρτηση του από εξωγενείς παράγοντες, όπως το μέγεθος και η συχνότητα του εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου κάνει την σύγκριση μεταξύ πειραμάτων που έχουν διεξαχθεί σε διαφορετικές πειραματικές συνθήκες εξαιρετικά δύσκολη υπόθεση. Αυτός ο σημαντικός περιορισμός οδήγησε στην εισαγωγή μιας νέας παραμέτρου, η οποία ονομάζεται εγγενής απώλεια ισχύος (Intrinsic Loss Power-ILP) 67 και ορίζεται μέσω της παρακάτω σχέσης (εξίσωση 1.6): ILP = SLP H 2 f (εξίσωση 1.6) Η παράμετρος ILP ουσιαστικά είναι μία κανονικοποιήση του δείκτη SLP και φυσικά δεν είναι πλήρως ενδογενής ιδιότητα του υλικού όμως παραμένει μία καλή προσέγγιση για την αξιολόγηση της ικανότητας μαγνητικών υλικών να επάγουν υπερθερμία για εντάσεις μαγνητικών πεδίων και συχνότητες εφαρμογής μέσα στα θεραπευτικά όρια. Στο διάγραμμα του σχήματος 1.16 απεικονίζεται η εξάρτηση του SLP και του ILP για μαγνητικά νανοσωματίδια 13 nm από την ένταση του μαγνητικού πεδίου (η συχνότητα παρέμενε σταθερή) 68. Παρατηρώντας την μεταβολή του SLP από την αύξηση της έντασης γίνεται εμφανής η σημασία της προσέγγισης του ILP, καθώς παρατηρείται ότι για αρκετά μεγάλο εύρος εντάσεων μαγνητικού πεδίου το ILP μένει σταθερό, σε αντίθεση με το SAR(SLP). 18

Σχήμα 1.16: Η μεταβολή των δεικτών SLP και ILP από την ένταση του μαγνητικού πεδίου 68 1.6 Οξείδια του σιδήρου Ο μαγνητίτης (Fe3O4), είναι ένα από τα τρία σημαντικότερα οξείδια του σιδήρου μαζί με τον αιματίτη (Fe2O3) και τον βουστίτη (FeO). 1.6.1 Μαγνητίτης και μαγκεμίτης Ο μαγνητίτης ανήκει σε μια σημαντική κατηγορία μεταλλικών οξειδίων, που ονομάζονται φερρίτες, και εμφανίζει τις εντονότερες μαγνητικές ιδιότητες από οποιοδήποτε άλλο οξείδιο του σιδήρου. Αποτελεί ένα από τα κυριότερα μεταλλεύματα του σιδήρου. Το σημαντικότερο δομικό χαρακτηριστικό του μαγνητίτη, είναι ότι διαθέτει ιόντα σιδήρου σε δισθενή και τρισθενή οξειδωτική βαθμίδα, με αποτέλεσμα να μπορεί να λειτουργήσει και ως οξειδωτικό και ως αναγωγικό μέσο. Το ορυκτό αυτό είναι μέλος της ομάδας των σπινελίων ΑΒ2Ο4 ( Α= δισθενές άτομο και Β= τρισθενές άτομο) και περιέχει περίπου 72,4% κ.β. σίδηρο (Fe) και 27,6% οξυγόνο (O2). Ο μαγνητίτης κρυσταλλώνεται σε ολοεδρία κατά το κυβικό σύστημα (σχήμα 1.17), έχει χρώμα σκούρο καφέ έως μαύρο και μεταλλική λάμψη. Βρίσκεται σε κοκκώδη και φλοιώδη συσσωματώματα υπό μορφή κόκκων με το όνομα «μαγνητίτης άμμος» 69. 19

Σχήμα 1.17: Δομή του μαγνητίτη (α) Πολυεδρικό μοντέλο με εναλλασσόμενα οκταεδρικά και τετραεδρικά επίπεδα. (β) Μοντέλο σφαιρών με σκιαγραφημένη την μοναδιαία κυψελίδα. (γ) Μοντέλο σφαιρών όπου απεικονίζονται τρείς οκτάεδρικες και δύο τετράεδρικές θέσεις 69 Ο μαγκεμίτης (γ-fe2o3) είναι μέλος της οικογένειας των οξειδίων. Έχει παρόμοια δομή με αυτή του μαγνητίτη, αλλά μόνο τα 5/6 των συνολικών τετραεδρικών και οκταεδρικών θέσεων καταλαμβάνονται από άτομα σιδήρου. Αποτελείται περίπου από 69,9% σίδηρο και 30,1% οξυγόνο 69. Σε θερμοκρασία δωματίου, ο μαγνητίτης οξειδώνεται σε μαγκεμίτη με αργό ρυθμό, οδηγώντας σε ασθενέστερο μαγνητισμό. Ο μηχανισμός οξείδωσης είναι αρκετά περίπλοκος. H βασική διαφορά του με τον μαγνητίτη, είναι ότι όλα τα κατιόντα σιδήρου του μαγκεμίτη βρίσκονται στην τρισθενή κατάσταση (Fe +3 ) 70. 1.6.2 Μορφολογία Ο φυσικός αλλά και ο συνθετικός μαγνητίτης εμφανίζεται πιο συχνά με την μορφή οκταεδρικών κρυστάλλων που ορίζονται από το κρυσταλλογραφικό επίπεδό (111) (σχήμα 1.18α). Επίσης εμφανίζεται και με τη μορφή ρομβο-δωδεκαεδρικών κρυστάλλων (σχήμα 1.18β). Στο επίπεδο (111) συχνά προκύπτουν διδυμίες. Η διδυμία που απεικονίζεται στο σχήμα 1.18δ ονομάζεται διδυμία σπινελίων και είναι χαρακτηριστική για την οικογένεια αυτών των υλικών. Αυτού του τύπου η διδυμία παράγει έναν κρύσταλλο ο οποίος αποτελείται από δύο ίδια οκτάεδρα τα οποία αναπτύχθηκαν παράλληλα έχοντας μία κοινή επιφάνεια, την επιφάνεια διδυμίας. Σχήμα 1.18: Κρυσταλλικές δομές του μαγνητίτη. (α, γ) οκταεδρική, (β) ρομβοδωδεκαεδρική, (δ) διδυμία σπινελίων 69 1.7 Μαγνητικές ιδιότητες 1.7.1 Γενικά Ο μαγνητισμός είναι ένα φαινόμενο κατά το οποίο υλικά και κινούμενα φορτισμένα σωματίδια ασκούν ελκτικές και απωστικές δυνάμεις καθώς και ροπές σε άλλα υλικά ή φορτισμένα σωματίδια. Ένα άτομο χαρακτηρίζεται ως μαγνητικό, όταν έχει μη μηδενική μαγνητική ροπή. Μερικά γνωστά υλικά που διαθέτουν εύκολα ανιχνεύσιμες μαγνητικές ιδιότητες (ονομάζονται μαγνήτες) είναι το νικέλιο, ο σίδηρος, το κοβάλτιο, το γαδολίνιο και τα κράματά τους. Όλα τα υλικά όμως επηρεάζονται σε μεγαλύτερο ή μικρότερο βαθμό από την παρουσία 20

ενός μαγνητικού πεδίου. Η ύπαρξη μαγνητικών φαινομένων αποδίδεται στην τροχιακή κίνηση και στο σπιν των ηλεκτρονίων 71. Όταν μαγνητικό πεδίο, Η, εφαρμόζεται σε υλικό, η απόκριση του υλικού ονομάζεται μαγνητική επαγωγή, Β. Η σχέση μεταξύ Η και Β είναι ιδιότητα του ίδιου του υλικού. Σε μερικά υλικά (όπως και στο κενό) το Β είναι γραμμικά ανάλογο του Η, αλλά εν γένει η σχέση τους είναι αρκετά πιο πολύπλοκη. Η σχέση (εξίσωση 1.7) που συνδέει αυτές τις δύο ποσότητες σε μονάδες SI είναι : B = μ 0 (H + M) (εξίσωση 1.7) Όπου μ 0 είναι η μαγνητική διαπερατότητα του κενού και Μ είναι η μαγνήτιση του μέσου. Το πεδίο ενός υλικού παρουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου ονομάζεται μαγνήτιση Μ και ορίζεται ως η μαγνητική ροπή (m) ανά μονάδα όγκου V (εξίσωση 1.8). Μ = m V (εξίσωση 1.8) H Μ είναι ιδιότητα του υλικού και εξαρτάται τόσο από τις επιμέρους μαγνητικές ροπές των ιόντων, ατόμων ή μορίων, όσο και από τον τρόπο που οι ροπές αυτές αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Όλα τα υλικά είναι μαγνητικά ως ένα βαθμό. Η απόκρισή τους εξαρτάται από την ατομική τους δομή, την θερμοκρασία και το πεδίο. Παρουσία μαγνητικού πεδίου οι μαγνητικές ροπές των ατόμων τείνουν να διευθετηθούν παράλληλα με αυτό, όμως η τάση αυτή αντισταθμίζεται από τις θερμικές τους κινήσεις. Ο βαθμός απόκρισης ενός υλικού σε ένα εφαρμοζόμενο πεδίο ποσοτικοποιείται μέσα από τη μαγνητική επιδεκτικότητα χ και καθορίζεται από την εξίσωση 1.9 (νόμος Curie-Weiss). χ = Μ Η (εξίσωση 1.9) Οι μετασχηματισμοί των εξισώσεων και οι μονάδες των ποσοτήτων δίνονται στους πίνακες που ακολουθούν (πίνακες 1.1,1.2) Πίνακας 1.1: Μετασχηματισμοί εξισώσεων 71 Cgs SI Μαγνητικό πεδίο H = p 1 p (oersted) H = r2 4πμ 0 r 2 (ampere m ) Μαγνητική επαγωγή B = H + 4πM (gauss) B = μ 0 (Η + Μ)(tesla) Μαγνήτιση M = m v (emu cm 3 ) Επιδεκτικότητα χ = Μ H ( emu cm 3 oersted ) χ = M H (Αδιάστατο) 21

Πίνακας 1.2: Μετασχηματισμοί μονάδων 71 H 1 oersted = 79.58 ampere/m B 1 gauss = 10 4 tesla M 1 emu/cm 3 = 12.57 10 4 weber/m 2 Όταν ένα μαγνητικό υλικό τοποθετηθεί εντός μαγνητικού πεδίου μπορεί να παρατηρηθεί αύξηση ή μείωση της πυκνότητας των δυναμικών γραμμών που το διαπερνούν. Εν γένει η πυκνότητα της ροής εντός ενός υλικού είναι διαφορετική από ότι έξω από αυτό. Τα μαγνητικά υλικά μπορούν να ενταχθούν σε κατηγορίες ανάλογα με την διαφορά ανάμεσα στην εξωτερική και εσωτερική μαγνητική ροή (σχήμα 1.19). Αν η πυκνότητα μέσα στο υλικό είναι μικρότερη απ ότι έξω από το υλικό τότε αυτό το υλικό ονομάζεται διαμαγνητικό. Τα υλικά αυτά έχουν την τάση να αποκλείουν το μαγνητικό πεδίο από το εσωτερικό τους. Αν η πυκνότητα στο εσωτερικό είναι μεγαλύτερη από ότι στο εξωτερικό, τότε το υλικό είναι είτε παραμαγνητικό είτε σιδηρομαγνητικό. Το πρόθεμα αναφέρεται στην φύση των αλληλεπιδράσεων της σύζευξης μεταξύ των ηλεκτρονίων μέσα στο υλικό. Σχήμα 1.19: Διαφοροποιήσεις στην πυκνότητα των δυναμικών γραμμών εντός του σωματιδίου ανάλογα με το είδος του υλικού 72 Υπάρχουν έξι διαφορετικά είδη μαγνητισμού, ο διαμαγνητισμός, ο παραμαγνητισμός, ο σιδηρομαγνητισμός, ο σιδηριμαγνητισμός, ο αντισιδιρομαγνητισμός και ο υπερπαραμαγνητισμός. Ο διαμαγνητισμός είναι μια πολύ ασθενής μορφή μαγνητισμού, η οποία δεν είναι μόνιμη και διαρκεί μόνο όσο εφαρμόζεται ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο. Στα διαμαγνητικά υλικά, χωρίς την παρουσία κάποιου εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, σε κάθε άτομο, οι ροπές λόγω των ηλεκτρονιακών σπιν είναι αντίρροπες μεταξύ τους καθώς και οι μαγνητικές ροπές λόγω της 22

τροχιακής κίνησης των ηλεκτρονίων, με αποτέλεσμα, μακροσκοπικά, η ολική μαγνητική ροπή να είναι μηδενική. Παρουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου κάθε άτομο έχει μια μαγνητική ροπή και σε μακροσκοπική κλίμακα υπάρχει μια ολική μαγνητική ροπή η οποία δίνει μια μαγνήτιση Μ. Για τα διαμαγνητικά υλικά η μαγνήτιση είναι πολύ μικρή, αντιτίθεται στο εφαρμοζόμενο εξωτερικό πεδίο, και δίνει αρνητικές επιδεκτικότητες x = -10-5 και πολύ μικρές σχετικές διαπερατότητες, λίγο μικρότερες από τη μονάδα. Παράδειγμα διαμαγνητικών υλικών είναι ο χαλκός, ο άργυρος, ο χρυσός, το βισμούθιο. Στα παραμαγνητικά υλικά οι μαγνητικές ροπές που σχετίζονται με τα ηλεκτρόνια και τα σπιν τους μέσα σ ένα άτομο δεν αλληλοαναιρούνται απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Συνεπώς, κάθε άτομο έχει μια μικρή μαγνητική ροπή η διεύθυνση της οποίας όμως είναι τυχαία, γι αυτό και η ολική μαγνητική ροπή μιας μεγάλης περιοχής δείγματος, όπως και η ολική μαγνήτιση Μ, είναι μηδενικές απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Όταν εφαρμοστεί εξωτερικό πεδίο τότε τα μαγνητικά δίπολα προσανατολίζονται ελαφρώς κατά τη διεύθυνση του μαγνητικού πεδίου και δίνουν μία μη μηδενική μαγνήτιση Μ παράλληλη προς αυτό. Στα παραμαγνητικά υλικά οι μαγνητικές επιδεκτικότητες έχουν μικρές θετικές τιμές χ = 10-3 10-5 και οι σχετικές διαπερατότητες είναι λίγο μεγαλύτερες από τη μονάδα. Παράδειγμα παραμαγνητικών υλικών είναι το αλουμίνιο, το μαγγάνιο και ο λευκόχρυσος. Στα σιδηρομαγνητικά υλικά, τα άτομα, απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, έχουν πολύ ισχυρές μαγνητικές ροπές που οφείλονται στα ασύζευκτα ηλεκτρονιακά σπιν. Αυτές οι μαγνητικές ροπές συσχετίζονται και δημιουργούν περιοχές, διαφόρων μεγεθών και σχημάτων, από ομόρροπα σπιν. Οι διαστάσεις των περιοχών εξαρτώνται από την προηγούμενη μαγνητική κατάσταση του υλικού και την ιστορία του και ποικίλουν από 1 μm μέχρι και μερικά χιλιοστά. Σε μακροσκοπική κλίμακα όμως η ολική μαγνήτιση Μ απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου είναι μηδέν διότι οι περιοχές είναι τυχαία προσανατολισμένες και οι μαγνητικές ροπές των διαφόρων ατόμων αλληλοαναιρούνται. Όταν εφαρμοστεί εξωτερικό μαγνητικό πεδίο η συνολική μαγνήτιση είναι μεγάλη δίνοντας πολύ μεγάλες επιδεκτικότητες x = 50 10 4. Στη συνέχεια, όταν το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο απομακρυνθεί, οι μαγνητικές ροπές των διαφόρων ατόμων διατηρούν τον προηγούμενο προσανατολισμό τους και παραμένει μια ολική μόνιμη μαγνήτιση Μ. Βλέπουμε λοιπόν ότι η μαγνήτιση ενός σιδηρομαγνητικού υλικού είναι διαφορετική σε μακροσκοπική κλίμακα μετά την απομάκρυνση ενός εξωτερικού πεδίου, δηλαδή η μαγνητική του κατάσταση εξαρτάται από την προηγούμενή του ιστορία. Έτσι η εξάρτηση της μαγνήτισης Μ από το εφαρμοζόμενο μαγνητικό πεδίο δεν είναι γραμμική αλλά σχηματίζει ένα βρόγχο υστέρησης. Επιπλέον οι τιμές της επιδεκτικότητας και της διαπερατότητας δεν είναι σταθερές αλλά μεταβάλλονται. Παράδειγμα σιδηρομαγνητικών υλικών είναι ο σίδηρος, το κοβάλτιο και το νικέλιο. Υλικά τα οποία έχουν άτομα με ισχυρές μαγνητικές ροπές αλλά τα γειτονικά σπινς είναι ίσα και αντίθετα, δίνοντας μηδενική μαγνήτιση απουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, ονομάζονται αντισιδηρομαγνητικά. Η εφαρμογή εξωτερικού πεδίου έχει μικρή επίδραση σ αυτά τα υλικά και οι σχετικές διαπερατότητες είναι λίγο μεγαλύτερες από τη μονάδα. Αν οι γειτονικές αντίρροπες μαγνητικές ροπές ενός υλικού είναι μεγάλες και άνισες, απουσία εξωτερικού πεδίου, τότε το υλικό ονομάζεται σιδηριμαγνήτης. Οι μόνιμες μαγνητικές ροπές στα σιδηριμαγνητικά υλικά προέρχονται από τις ατομικές μαγνητικές ροπές εξαιτίας της ροπής λόγω σπιν του ηλεκτρονίου (μη εξουδετερωμένες στροφορμές του σπιν του ηλεκτρονίου ως συνέπεια της ηλεκτρονιακής δομής). Υπάρχει επίσης και η συνεισφορά της τροχιακής 23

μαγνητικής ροπής που είναι μικρή σε σχέση με την ροπή του σπιν. Όταν το υλικό αυτό βρίσκεται μέσα σε πεδίο τότε παρουσιάζει μεγάλες τιμές διαπερατότητας, όχι όμως τόσο μεγάλες όσο των σιδηρομαγνητών. Οι φερρίτες αποτελούν μια ομάδα σιδηριμαγνητών με χαμηλές αγωγιμότητες. 1.7.2 Μαγνητικές περιοχές Weiss Ο σιδηρομαγνητισμός σε έναν κρύσταλλο προκύπτει από την αλληλεπίδραση των μαγνητικών ροπών λόγω του σπιν και της τροχιακής κίνησης των ηλεκτρονίων γύρω από τον πυρήνα των ατόμων. Μακροσκοπικά όμως η εικόνα του κρυστάλλου είναι επίσης πολύπλοκη. Θεωρούμε ότι ο κρύσταλλος χωρίζεται σε μαγνητικές περιοχές, τις οποίες ονομάζουμε περιοχές Weiss. Μέσα σε κάθε περιοχή όλα τα σπιν είναι παράλληλα διευθετημένα δίνοντας ένα μόνο συνολικό σπιν, τα σπιν όμως της κάθε περιοχής είναι τυχαία διευθετημένα το ένα σε σχέση με το άλλο. Τα όρια ανάμεσα στις μαγνητικές περιοχές ονομάζονται τοιχώματα Bloch. Εκεί η διεύθυνση των μαγνητικών ροπών αλλάζει συνεχώς και σταδιακά. Στο παρακάτω σχήμα (σχήμα 1.20) φαίνεται η εναλλαγή της κατεύθυνσης των σπιν μεταξύ δύο περιοχών Weiss και ενός τοιχώματος Bloch. Σχήμα 1.20: Τοίχωμα Bloch ανάμεσα σε δυο μαγνητικές περιοχές Weiss 73 Τα σπιν τείνουν να διευθετηθούν παράλληλα λόγω των αλληλεπιδράσεων ανταλλαγής (επικάλυψη των τροχιακών) αλλά οι αλληλεπιδράσεις μαγνητικού διπόλου τείνουν να τα διευθετήσουν αντιπαράλληλα. Άρα οι αλληλεπιδράσεις ανταλλαγής διευθετούν τα σπιν εντός μιας περιοχής παράλληλα, ενώ οι αλληλεπιδράσεις μαγνητικού διπόλου τείνουν να διευθετήσουν τα σπιν των διαφορετικών περιοχών σε διαφορετικές κατευθύνσεις. Όταν εφαρμοστεί εξωτερικό μαγνητικό πεδίο το υλικό μαγνητίζεται, οι περιοχές τείνουν να γίνουν παράλληλες προς αυτό, κάτι που οφείλεται σε δύο μηχανισμούς. Σύμφωνα με τον πρώτο η αύξηση οφείλεται στην αύξηση του όγκου των περιοχών εκείνων που η μαγνητική τους ροπή σχηματίζει μικρότερη γωνία με τη διεύθυνση του εξωτερικού πεδίου, κάτι που αποδίδεται στη μετατόπιση των τοιχωμάτων Bloch. Σύμφωνα με τον δεύτερο, η αύξηση οφείλεται στη στροφή των ροπών των περιοχών Weiss 73. Στο παρακάτω σχήμα (σχήμα 1.21) φαίνεται η συμπεριφορά των μαγνητικών περιοχών στις εξής περιπτώσεις: α) Απουσία πεδίου, μακροσκοπικά καμία μαγνήτιση, τα σπιν αλληλοεξουδετερώνονται β) Μαγνήτιση λόγω αύξησης του όγκου μιας περιοχής γ) Μαγνήτιση λόγω αλλαγής της διεύθυνσης των σπιν. 24

Σχήμα 1.21: Επίδραση του μαγνητικού πεδίου στις περιοχές Weiss. α) καμία μαγνήτιση απουσία πεδίου β) μαγνήτιση λόγω αύξησης του όγκου μιας περιοχής, γ) μαγνήτιση λόγω αλλαγής της διεύθυνσης των σπιν 73 1.7.3 Σταθερά ανισοτροπίας και υπερπαραμαγνητισμός Όταν μια ιδιότητα από ένα υλικό είναι συνάρτηση της κατεύθυνσης αυτή η ιδιότητα λέγεται ότι εμφανίζει ανισοτροπία. Η προτίμηση για την μαγνήτιση να είναι σε μια ειδική, καθορισμένη κατεύθυνση είναι ένα δείγμα μαγνητικής ανισοτροπίας. Οι υπερπαραμαγνητικές ιδιότητες των νανοσωματιδίων καθορίζονται από την μαγνητοκρυσταλλική ανισοτροπία, η οποία είναι ενδογενής ιδιότητα του υλικού, την ανισοτροπία σχήματος και την επιφανειακή ανισοτροπία. Σε κάθε κρυσταλλικό μαγνητικό υλικό υπάρχουν ορισμένοι άξονες οι οποίοι είναι εύκολο να προσανατολιστούν με το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο (εύκολοι άξονες μαγνήτισης) και κάποιοι άλλοι οι οποίοι παρουσιάζουν αντίσταση στο να προσανατολισθούν (δύσκολοι άξονες μαγνήτισης). Για να μαγνητιστεί ένας κρύσταλλος σε ένα δύσκολο άξονα απαιτείται περισσότερο έργο απ ότι σε έναν εύκολο. Η επιπλέον απαιτούμενη ενέργεια που χρειάζεται για να αποκλίνει η μαγνητική ροπή σε ένα κρύσταλλο από την εύκολη στη δύσκολη κατεύθυνση ονομάζεται ενέργεια ανισοτροπίας. Οι άξονες αυτοί είναι κρυσταλλογραφικοί και προκύπτουν από την αλληλεπίδραση των μαγνητικών ροπών σπιν-τροχιάς. Συγκεκριμένα η ανισοτροπία προκαλείται από μία ζεύξη των τροχιών των ηλεκτρονίων σε ένα πλέγμα. Σε έναν άξονα εύκολης μαγνήτισης, η ζεύξη είναι τέτοια που αυτές οι τροχιές είναι σε σημείο κατώτατης ενεργειακής κατάστασης. Σύμφωνα με την θεωρία των Stoner-Wohlfarth η μαγνητοκρυσταλλική ανισοτροπία για ένα νανοσωματίδιο μιας και μόνο περιοχής Weiss δίνεται από την εξίσωση 1.10. Ε Α = ΚVsin 2 θ (εξίσωση 1.10) Όπου Κ η σταθερά ανισοτροπίας, V ο όγκος του σωματιδίου και θ η γωνία ανάμεσα στο μαγνητικό πεδίο και τους άξονες του κρυστάλλου. H ενέργεια ανισοτροπίας παριστά ένα ενεργειακό φράγμα το οποίο εμποδίζει τα σπιν να αλλάξουν προσανατολισμό. Όταν η ενέργεια αυτή γίνει συγκρίσιμη με την θερμική ενέργεια τότε το υλικό γίνεται υπερπαραμαγνητικό και ο μαγνητικός του άξονας περιστρέφεται τυχαία. Όσο μειώνεται το μέγεθος του σωματιδίου τόσο μειώνεται και η θερμοκρασία μετάβασης από τον σιδιρομαγνητισμό στον υπερπαραμαγνητισμό. Η ονομασία αυτή έχει δοθεί επειδή τα σωματίδια δείχνουν συμπεριφορά παρόμοια με αυτή των παραμαγνητικών υλικών, αλλά με πολύ μεγαλύτερες μαγνητικές ροπές (σχήμα 1.22). Υπερπαραμαγνητισμός προκύπτει όταν τα νανοσωματίδια έχουν διαμέτρους ακόμα μικρότερες από την διάμετρο στην οποία γίνονται μονού μαγνητικού τομέα. Τότε το κάθε νανοσωματίδιο γίνεται μια περιοχή Weiss. Δηλαδή πρόκειται για νανοκρυσταλλίτες μεγέθους περίπου από 1-20 nm. Ειδικά για την περίπτωση των οξειδίων του σιδήρου το μέγεθος αυτό παίρνει τιμές <25 nm. 25

Σχήμα 1.22: Απεικόνιση των μαγνητικών ροπών δυο υλικών με διαφορετικές ενέργειες ανισοτροπίας (E A) Λόγω μεγέθους. α) Όταν η ενέργεια ανισοτροπίας είναι μεγαλύτερη από την ενέργεια περιβάλλοντος οι μαγνητικές ροπές των σωματιδίων παραμένουν σταθερές. β) Στην περίπτωση όπου η ενέργεια ανισοτροπίας είναι μικρότερη ή ίση με την θερμοκρασία περιβάλλοντος παρατηρείται το φαινόμενο του υπερπαραμαγνητισμού. Οι μαγνητικές ροπές τώρα μεταβάλλονται αυθόρμητα 73 Ο μαγνητισμός μικροσκοπικής κλίμακας επηρεάζεται σημαντικά από τα επιφανειακά άτομα. Όσο μικρότερο είναι ένα σωματίδιο τόσο περισσότερα άτομα υπάρχουν στην επιφάνειά του σε σχέση με το εσωτερικό του, ο λόγος δηλαδή V shell Vcore αυξάνεται. Άρα κάτω από μια κρίσιμη διάσταση ένα μεγάλο ποσοστό των ατόμων του κρυστάλλου βρίσκονται στην επιφάνεια, οπότε τα επιφανειακά φαινόμενα γίνονται ιδιαίτερα έντονα. Χαρακτηριστικά, σε νανοσωματίδια με μέση διάμετρο ~3 nm αντιστοιχούν ~ 1400 άτομα ανά νανοσωματίδιο, εκ των οποίων το 40% βρίσκεται στην επιφάνεια. Για να μελετηθούν λοιπόν οι μαγνητικές ιδιότητες των νανοσωματιδίων θα πρέπει να ληφθεί υπόψη και η μαγνητοκρυσταλλική ανισοτροπία της επιφάνειας Κs, η οποία προκύπτει από την χαμηλή συμμετρία σύνταξης κατά την σύζευξη σπιντροχιακών. Έτσι, τελικά, η φαινομενική σταθερά ανισοτροπίας (effective anisotropy, Keff) σχετίζεται με την ανισοτροπία της κύριας μάζας (Κb) του υλικού και την διάμετρο (d) του νανοσωματιδίου με την εξίσωση 1.11. Κ eff = K b + (6/d)K s (εξίσωση 1.11) Επίσης, εκτός της μαγνητοκρυσταλλικής ανισοτροπίας, άμεση συσχέτιση υπάρχει και μεταξύ του μεγέθους των μαγνητικών νανοσωματιδίων και της μαγνήτισης τους. Όσο ο λόγος V shell Vcore αυξάνεται οι δομικές ατέλειες (άρα και μαγνητικές ατέλειες) που υπάρχουν στον φλοιό τείνουν να έχουν βαρύνουσα σημασία στην τελική μαγνήτιση, λόγω δημιουργίας ενός εξωτερικού περιβλήματος χαμηλής τάξης προσανατολισμού των μαγνητικών ροπών. Όσο μικρότερο είναι το σωματίδιο τόσο μεγαλύτερο είναι το εξωτερικό περίβλημα σε σχέση με τον πυρήνα και κατά συνέπεια τα μαγνητικά νανοσωματίδια τείνουν να γίνουν παραμαγνητικά (χαμηλής μαγνητικής ροπής) 73. 26

1.8 Κολλοειδή Οι περισσότεροι νανοφορείς είναι κολλοειδή συστήματα. Τα κολλοειδή είναι μία διασπορά σωματιδίων μίας ουσίας (διεσπαρμένη φάση) στη μάζα μίας άλλης ουσίας ή διαλύματος (μέσο διασποράς ή συνεχής φάση). Ένα τυπικό παράδειγμα κολλοειδούς είναι η ομίχλη, η οποία συνίσταται από πολύ μικρά σταγονίδια νερού (διεσπαρμένη φάση) μέσα σε αέρα (μέσο διασποράς). Τα κολλοειδή χαρακτηρίζονται σύμφωνα με την κατάσταση της διεσπαρμένης φάσης και του μέσου διασποράς σε στερεά, υγρά και αέρια. Ένα κολλοειδές διαφέρει από ένα πραγματικό διάλυμα, στο ότι τα διεσπαρμένα σωματίδια είναι μεγαλύτερα από κανονικά μόρια, εντούτοις όμως είναι πολύ μικρά για να τα παρατηρήσει κάποιος στο μικροσκόπιο. Μπορεί να οριστεί ως ένα σύστημα δύο ή περισσότερων συστατικών όπου υπάρχει διαχωρισμός φάσεων (διεσπαρμένη ουσία και διαλύτης), όπου όμως οι διαστάσεις της διεσπαρμε νης ουσίας είναι τόσο μικρές ώστε τα σωματίδια αυτά να υπόκεινται σε κίνηση Brown. Το μέγεθος των σωματιδίων μπορεί να κυμαίνεται περίπου από 1 1000 nm. Το μέγεθος των κολλοειδών σωματιδίων εμπίπτει σε τέτοια κλίμακα μεγέθους, ώστε να υπόκεινται σε κίνηση Brown (βλ. επόμενη παράγραφο). Ένα κολλοειδές διάλυμα μακροσκοπικά εμφανίζεται να είναι ομογενές επειδή τα διεσπαρμένα σωματίδια είναι πολύ μικρά, όμως είναι αρκετά μεγάλα για να προκαλέσουν σκέδαση του φωτός. Το φαινόμενο αυτό είναι γνωστό ως φαινόμενο Tyndall 74. Τα κολλοειδή, στα οποία το μέσο διασποράς είναι νερό, μπορούν να διακριθούν σε δύο κατηγορίες: τα υδρόφιλα και τα υδρόφοβα κολλοειδή. Υδρόφιλο κολλοειδές, είναι ένα κολλοειδές στο οποίο υπάρχει μία ισχυρή έλξη μεταξύ διεσπαρμένης φάσης και μέσου διασποράς (νερού). Αυτού του τύπου τα κολλοειδή εμφανίζουν σταθερότητα διότι έλκουν τα μόρια του νερού μέσα στο διάλυμα (ενυδατώνονται). Τυπικά παραδείγματα υδρόφιλων κολλοειδών είναι τα τασιενεργά μόρια (π.χ. τα σαπούνια), οι πολυσακχαρίτες (π.χ. το άμυλο) και οι πρωτεΐνες (π.χ. ο ορός του αίματος, το γάλα). Υδρόφοβο κολλοειδές, είναι ένα κολλοειδές στο οποίο υπάρχει έλλειψη έλξεων μεταξύ διεσπαρμένης φάσης και μέσου διασποράς (νερού). Τα υδρόφοβα κολλοειδή δεν έχουν συγγένεια με το νερό και η σταθερότητα τους, δηλαδή η παραμονή τους εν αιωρήσει, εξαρτάται από το περιβάλλων μοριακό, οργανικό ή ιοντικό στρώμα. Έτσι, αν δοθεί επαρκής χρόνος, η διεσπαρμένη φάση συσσωματώνεται σε μεγαλύτερα σωματίδια. 1.8.1 Κολλοειδής Σταθερότητα Αρκετοί παράγοντες συμβάλλουν στην σταθερότητα των κολλοειδών συστημάτων, οι κυριότεροι εκ των οποίων είναι: 1.8.1.1 Κίνηση Brown Τα διεσπαρμένα σωματίδια ενός κολλοειδούς βρίσκονται σε συνεχή κίνηση προς τις τρεις διευθύνσεις του χώρου και σε περιστροφή λόγω των συγκρούσεών τους με τα μόρια του διαλύτη, του μικρού τους μεγέθους και μάζας. Η κίνηση αυτή είναι άτακτη και χαρακτηρίζεται ως κίνηση Brown. Ο Einstein μελέτησε πρώτος την κίνηση κολλοειδών σωματιδίων χρησιμοποιώντας 27

θεωρία πιθανοτήτων. Κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η μέση τιμή του τετραγώνου της μετατόπισης του σωματιδίου που πραγματοποιεί κίνηση Brown είναι συνάρτηση του χρόνου t, της θερμοκρασίας T, της ακτίνας του σωματιδίου r και του ιξώδους του μέσου n, βάση της εξίσωσης 1.12 75 : dx 2 = 2t RT N 1 6πnr (εξίσωση 1.12) Όπου, R η σταθερά των αερίων (8,31 J/mol K), Ν ο αριθμός Avogadro (6,0221367 10 23 /mol) και π η μαθηματική σταθερά (3,14159). Η κίνηση Brown των σωματιδίων έχει ως συνέπεια την διάχυσή τους προς περιοχές του μέσου με μικρότερη συγκέντρωση σωματιδίων. Η ποσότητα α (σε mol) των σωματιδίων που διαχέονται στη μονάδα του χρόνου ανά μονάδα επιφανείας (mol s -1 m -2 ) δίνεται από το νόμο του Fick (εξίσωση 1.13): α = D dc dx (εξίσωση 1.13) όπου, D ο συντελεστής διάχυσης των σωματιδίων στο μέσο και dc/dx η βαθμίδα της συγκέντρωσης των σωματιδίων στη διεύθυνση x. Συνδυάζοντας τις δύο παραπάνω σχέσεις ο Einstein υπολόγισε τη σταθερά διάχυσης D των κολλοειδών σωματιδίων συναρτήσει της θερμοκρασίας Τ του κολλοειδούς, της ακτίνας του σωματιδίου r και του ιξώδους του μέσου n (εξίσωση 1.14): D = dx2 = KT 2t 6πηr (εξίσωση 1.14) όπου, Κ η σταθερά του Boltzmann (1.380 6505 10-23 J K -1 ), D ο συντελεστής διάχυσης, r η υδροδυναμική ακτίνα, T η απόλυτη θερμοκρασία, η το ιξώδες. Η εξίσωση αυτή χρησιμοποιείται ευρέως για την εκτίμηση των διαστάσεων κολλοειδών σωματιδίων με την τεχνική της δυναμικής σκέδασης ακτινοβολίας, όπως αναφέρεται σε επόμενο κεφάλαιο. 1.8.1.2 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ των σωματιδίων Τα κολλοειδή σωματίδια τα οποία βρίσκονται μέσα σε ένα μέσο διασποράς πάντα επιδεικνύουν κίνηση Brown και επομένως οι συγκρούσεις μεταξύ τους είναι συχνές. Επομένως η σταθερότητα των κολλοειδών καθορίζεται από τις αλληλεπιδράσεις των σωματιδίων κατά τη διάρκεια αυτών των συγκρούσεων. Δύο είναι οι βασικοί τύποι αυτών των αλληλεπιδράσεων, οι απωστικές και οι ελκτικές. Όταν υπερισχύουν οι ελκτικές τότε τα σωματίδια θα συσσωματωθούν και τελικά το κολλοειδές θα καθιζάνει. Όταν οι απωστικές δυνάμεις υπερισχύουν όμως, τότε το σύστημα θα βρίσκεται σε μία σταθερή κατάσταση και θα διατηρήσει τον κολλοειδή του χαρακτήρα. 28

1.8.1.3 Δυνάμεις Van der Waals Οι ελκτικές δυνάμεις είναι κυρίως δυνάμεις Van der Waals και είναι αποτέλεσμα αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ηλεκτρονιακών νεφών των ατόμων ή των μορίων, γι αυτό και επηρεάζουν οποιαδήποτε δύο σώματα ύλης. Υπάρχουν ακόμα και αν τα άτομα ή τα μόρια είναι ηλεκτρικά ουδέτερα. Από τις δύνάμεις Van der Waals αυτές που έχουν μεγαλύτερη σημασία για τα κολλοειδή συστήματα είναι οι δυνάμεις London οι οποίες είναι ελκτικές δυνάμεις μεγαλύτερης εμβέλειας και ανάμεσα στα άτομα/μόρια είναι της μορφής 76 (σχήμα 1.23): V A (r) σταθερά r 6 (εξίσωση 1.15) Σχήμα 1.23: Απόσταση r μεταξύ δύο σωματιδίων. Αυτές οι ελκτικές δυνάμεις όμως έχουν προσθετικό χαρακτήρα, οπότε επηρεάζουν και τα μακροσκοπικά σώματα, μόνο που σε αυτή την περίπτωση εκτός από την μεταξύ τους απόσταση, υπάρχει και εξάρτηση από την γεωμετρία των σωμάτων, με τη μορφή του δυναμικού τώρα να είναι της μορφής (εξ. 1.16, σχήμα 1.24): V A (r) ar r6 (εξίσωση 1.16) Σχήμα 1.24: Μορφή δυναμικού για σφαιρικά σωματίδια ακτίνας R για την περίπτωση σωματιδίων σφαιρικού σχήματος, όπου R είναι η ακτίνα των σωματιδίων, r η μεταξύ τους απόσταση και a η σταθερά του Hamaker. Έτσι η μορφή του δυναμικού των ελκτικών δυνάμεων είναι η παρακάτω (σχήμα 1.25). Σχήμα 1.25: Δυναμικό αλληλεπιδράσεων Van der Waals Το μεγάλο ελάχιστο στο δυναμικό για αποστάσεις κοντά στο r = 2R (εάν πάρουμε την θεώρηση του μοντέλου σκληρών σφαιρών) είναι πολλές φορές μεγαλύτερο από την θερμική 29

ενέργεια kτ και προκαλεί μη αναστρέψιμη συσσωμάτωση σε αιωρήματα μη προστατευμένων κολλοειδών. Οπότε για να υπερνικήσουν αυτό το φαινόμενο και να αποφύγουν την συσσωμάτωση τα σωματίδια χρειάζονται κάποιου είδους σταθεροποίηση. Οι δύο πιο κοινές περιπτώσεις είναι η σταθεροποίηση μέσω ηλεκτροστατικών απώσεων και στερικών αλληλεπιδράσεων. 1.8.1.4 Σταθεροποίηση μέσω φορτίου - Ηλεκτρική Διπλοστοιβάδα Οι περισσότερες ουσίες αποκτούν ένα επιφανειακό ηλεκτρικό φορτίο όταν έρχονται σε επαφή με ένα πολικό (πχ υδατικό) μέσο. Έτσι, όταν σωματίδια διασπείρονται σε ένα υδατικό σύστημα εμφανίζουν ένα επιφανειακό φορτίο εξαιτίας ιονισμού των επιφανειακών χημικών ομάδων τους ή προσρόφησης φορτισμένων μορίων ή ιόντων. Η ανάπτυξη τέτοιων φορτίων έχει σαν αποτέλεσμα τη μεταβολή της συγκέντρωσης των ιόντων του διαλύματος κοντά στην επιφάνεια των σωματιδίων δημιουργώντας ένα στρώμα γύρω από αυτά, με διαφορετική κατανομή ιόντων από αυτή του κυρίου όγκου του διαλύματος, το οποίο αποτελείται από δύο μέρη (σχήμα 1.26). Το εσωτερικό μέρος ονομάζεται στρώμα Stern (Stern layer) και αποτελείται από ιόντα τα οποία είναι ισχυρά συνδεδεμένα με τα σωματίδια, λόγω των αντίθετων φορτίων τους. Το εξωτερικό μέρος δημιουργείται από διάχυση ασθενέστερα συνδεδεμένων ιόντων του μίγματος. Στο διάχυτο στρώμα υπάρχει ένα νοητό όριο μέσα στο οποίο ιόντα και μόρια διαλύτη αλληλεπιδρούν αρκετά ισχυρά με τη φορτισμένη επιφάνεια του σωματιδίου ώστε σχηματίζουν μια σταθερή οντότητα με το σωματίδιο. Το όριο αυτό ονομάζεται επίπεδο ολίσθησης. Όταν ένα σωματίδιο κινείται, τα ιόντα μέσα σε αυτό το όριο κινούνται μαζί του. Το ηλεκτρικό δυναμικό το οποίο υπάρχει στο εξωτερικό μέρος αυτού του ορίου (επίπεδο ολίσθησης) ονομάζεται δυναμικό ζ (ζ potential) 77 και αποτελεί ένδειξη του επιφανειακού φορτίου του σωματιδίων. Για αυτό απαντάται και με τον όρο φαινόμενο επιφανειακό φορτίο. Το μέγεθος του δυναμικού ζ δίνει μια ένδειξη της δυναμικής σταθερότητας του κολλοειδούς συστήματος. Σχήμα 1.26: Σχηματική απεικόνιση της διασποράς των ιόντων του διαλύματος γύρω από ένα φορτισμένο σωματίδιο 30

Οι ηλεκτροστατικές απωστικές δυνάμεις είναι αποτέλεσμα της αλληλοδιείσδυσης των στρωμάτων διάχυσης των ηλεκτρικών διπλοστοιβάδων του κάθε φορτισμένου σωματιδίου. Αν όλα τα σωματίδια στο μίγμα είχαν πολύ μεγάλη (πολύ θετική) ή πολύ μικρή (πολύ αρνητική) τιμή δυναμικού ζ θα είχαν την τάση να απομακρυνθούν το ένα από το άλλο και έτσι δεν θα δημιουργείτο το κολλοειδές. Ωστόσο, αν τα σωματίδια έχουν τιμή δυναμικού ζ κοντά στο μηδέν, τότε δεν υπάρχει καμία δύναμη να τα αποτρέψει από το να έρθουν κοντά και να συσσωματωθούν. Για το λόγο αυτό σωματίδια με δυναμικό ζ πιο θετικό από +30mV ή πιο αρνητικό από -30mV θεωρούνται σταθερά (σχήμα 1.27). Σχήμα 1.27: Σχηματική αναπαράσταση της επικάλυψης των κυματοσυναρτήσεων, της ηλεκτρικής διπλοστοιβάδας των σωματιδίων καθώς και της μορφής του απωστικού δυναμικού. 1.8.1.5 Στερική Σταθεροποίηση Η στερική σταθεροποίηση επιτυγχάνεται μέσω της επικάλυψης των σωματιδίων με μία πολυμερική κορώνα. Όταν δύο επικαλυμμένες με πολυμερές επιφάνειες προσεγγίσουν η μία την άλλη θα δεχθούν μία δύναμη καθώς τα εξωτερικά τους τμήματα αρχίσουν να διαπλέκονται. Αυτή η αλληλεπίδραση συνήθως οδηγεί σε απωστικές δυνάμεις επειδή η συμπίεση των πολυμερικών αλυσίδων των δύο επιφανειών δεν ευνοείται εντροπικά (σχήμα 1.28) 78. Οι δυνάμεις που εμπλέκονται σε αυτές τις αλληλεπιδράσεις εξαρτώνται από την ποσοτική κάλυψη των επιφανειών με πολυμερές και από το αν το πολυμερές είναι ελεύθερο μέσα στο διάλυμα ή χημειοροφημένο στην επιφάνεια των σωματιδίων, καθώς και από την ποιότητα του διαλύτη που έχει χρησιμοποιηθεί (αφού αυτή η παράμετρος θα επηρεάσει την έκταση ή την συστολή των πολυμερικών αλυσίδων). 31

Σχήμα 1.28: Σχηματική αναπαράσταση ενός στερικά σταθεροποιημένου σωματιδίου, των στερικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των σωματιδίων καθώς και του συνολικού δυναμικού τους 1.8.1.6 DLVO Δυναμικό (Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek) Η σταθερότητα του κολλοειδούς εξαρτάται από την ισορροπία μεταξύ ελκτικών και απωστικών αλληλεπιδράσεων. Ένα κολλοειδές αιώρημα παραμένει σταθερό όταν οι απωστικές ηλεκτροστατικές δυνάμεις (VR) υπερισχύουν των ελκτικών (VA) και επομένως τα σωματίδια δεν μπορούν να έλθουν σε επαφή μεταξύ τους και να συσσωματωθούν. Η θεώρηση DLVO έχει να κάνει με το συνολικό δυναμικό (σχήμα 1.29) των αλληλεπιδράσεων που είναι το άθροισμα των απωστικών (Coulomb) και ελκτικών (Van der Waals) αλληλεπιδράσεων 79. Η έλξη των δυνάμεων Van der Waals θα είναι κυρίαρχη στις μικρές και στις μεγάλες διασωματιδιακές αποστάσεις. Στις ενδιάμεσες αποστάσεις θα επικρατεί η ηλεκτροστατική άπωση των διπλοστοιβάδων. Σε αυτή την περίπτωση δημιουργείται ένα ενεργειακό φράγμα όπου, όταν τα σωματίδια πλησιάσουν αρκετά, και εάν η κινητική τους ενέργεια, μετά από κάποια σύγκρουση, είναι μικρότερη από αυτό τότε δεν είναι σε θέση να το περάσουν και το σύστημα δε συσσωματώνεται. Γι αυτό τα κολλοειδή αυτά χαρακτηρίζονται ως κινητικώς σταθερά. Σχήμα 1.29: Συνολικό δυναμικά ηλεκτρικά φορτισμένων σωματιδίων συναρτήσει της μεταξύ τους απόστασης. 32

Σχήμα 1.30: Το δυναμικό DLVO Στην κάμπυλη του DLVO δυναμικού (σχήμα 1.30) υπάρχει και ένα δεύτερο ελάχιστο στο οποίο μπορεί να υπάρξει μία σχετικά αδύναμη συσσωμάτωση των κολλοειδών σωματιδίων η οποία όμως είναι αντιστρέψιμη, σε αντίθεση με την συγκόλληση των σωματιδίων στο πρώτο ελάχιστο η οποία είναι μη αναστρέψιμη (σχήμα 1.31). Σχήμα 1.31: Αναπαράσταση μίας διασωματιδιακής σύγκρουσης και τα σενάρια που οδηγούν σε σταθερότητα ή μη Τα κολλοειδή που έχουν σταθεροποιηθεί μέσω επιφανειακού φορτίου και ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων είναι πολύ ευαίσθητα στην παρουσία ηλεκτρολυτών, αφού μία αύξηση στην συγκέντρωση ηλεκτρολυτών εντός του διαλύματος έχει σαν αποτέλεσμα την συμπίεση της ηλεκτρικής διπλοστοιβάδας και έτσι το ενεργειακό φράγμα προς την μη αναστρέψιμη συσσωμάτωση των σωματιδίων μειώνεται ή και εξαφανίζεται (σχήμα 1.32). Αυτή η απουσία του φράγματος έχει σαν αποτέλεσμα, ότι η συνολική αλληλεπίδραση θα είναι καθαρά ελκτική και έτσι η σταθερότητα του κολλοειδούς θα καταρρεύσει. 33

Σχήμα 1.32: Η προσθήκη ηλεκτρολυτών έχει σαν αποτέλεσμα την συμπίεση της ηλεκτρικής διπλοστοιβάδας και την μείωση του ενεργειακού φράγματος. 1.9 Μέθοδοι σύνθεσης μαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου Τις τελευταίες δεκαετίες έχει αναπτυχθεί ένα πλήθος μεθόδων για την παρασκευή νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου. Οι μέθοδοι αυτές μπορούν να είναι φυσικές, όπως η μηχανική λειοτρίβιση, οι συνηθέστερες όμως είναι οι χημικές συνθετικές μέθοδοι, που περιλαμβάνουν αντιδράσεις υδρόλυσης και θερμόλυσης πρόδρομων ενώσεων 80 81. Αλλά και αρκετές παραλλαγές αυτών των μεθόδων, όπως υδρόλυση με χρήση υπερήχων 82, μικροκυμάτων, sol-gel, μικρογαλακτώματος, συγκαταβύθισης. Επίσης απατώνται η μέθοδος αέριας φάσης 83, και η μέθοδος στερεάς φάσης 84 85. Ιδανικά οι συνθετικές μέθοδοι θα πρέπει να είναι σε θέση να παράγουν νανοσωματίδια με όσο το δυνατόν μεγαλύτερο έλεγχο της μικροδομής και των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών. Μερικά κρίσιμα χαρακτηριστικά των προϊόντων που προκύπτουν από αυτές τις μεθόδους είναι 86 : i) To μέγεθος των νανοκρυστάλλων. ii) H κατανομή του μεγέθους των νανοκρυστάλλων να είναι όσο το δυνατόν στενότερη. iii) Η υψηλή κρυσταλλικότητα και η επιθυμητή κρυσταλλική δομή. Αυτό επιτρέπει την καλύτερη ρύθμιση των τελικών ιδιοτήτων των προϊόντων. Χρήσιμη είναι επίσης και η ικανότητα παραγωγής μεγάλων ποσοτήτων χημικώς σταθερών προϊόντων. Σήμερα, οι μέθοδοι της υγρής χημικής σύνθεσης είναι οι πιο ανεπτυγμένες στην παραγωγή κολλοειδών νανοσωματιδίων, καθώς δίνουν το πλεονέκτημα της ελεγχόμενης κρυστάλλωσης των μοριακών πρόδρομων μεταλλικών ενώσεων παρουσία οργανικών επιφανειακών τροποποιητών, οι οποίοι είναι απαραίτητοι για τον περιορισμό των διαστάσεων στην νανοκλίμακα, την εξασφάλιση της κολλοειδούς σταθερότητας των νανοκρυσταλλιτών και την παρουσία χημικών ομάδων. Η κατηγορία της υγρής χημικής σύνθεσης μπορεί να χωριστεί σε δύο υποκατηγορίες. Στις υδρολυτικές και στις θερμολυτικές μεθόδους. Οι υδρολυτικές οδοί, βασίζονται κυρίως στην υδρόλυση δισθενών και τρισθενών ιόντων σιδήρου, ενώ οι θερμολυτικές τεχνικές στηρίζονται στην θερμόλυση σιδηρο-οργανικών ενώσεων 80. 34

1.9.1 Υδρολυτικές Τεχνικές Ανάμεσα στις υδρολυτικές συνθετικές τεχνικές, η καταβύθιση από υδατικά διαλύματα είναι η πιο σημαντική και ευρέως χρησιμοποιούμενη καθώς είναι απλή. Χρησιμοποιούνται μη τοξικές ενώσεις σε όλη την πορεία της σύνθεσης, γι' αυτό δεν είναι τυχαίο ότι όλα τα MNPs που έχουν εγκριθεί για κλινικές και προκλινικές εφαρμογές προέρχονται από αυτή. Στη συνέχεια παρουσιάζονται οι δύο γνωστές μέθοδοι αυτής της συνθετικής προσέγγισης 80. 1.9.1.1 Υδρολυτική αλκαλική συγκαταβύθιση με δύο πρόδρομες ενώσεις σιδήρου Με αυτή την μέθοδο, υδατικά διαλύματα σιδηρούχων (Fe +2 ) και σιδηρικών (Fe +3 ) ιόντων σιδήρου, παρουσία περισσείας υδροξυλίων (αλκαλικό περιβάλλον), οδηγούν ταχύτατα στην παρασκευή σωματιδίων μαγνητίτη 87, σύμφωνα με την αντίδραση 1.0 Fe 2 + 2Fe 3 + 8 OH Fe 3 O 4 + 4H 2 O (αντίδραση 1.0) Σχήμα 1.33: Μέση διάμετρος των μαγνητικών νανοσωματιδίων όπως διαμορφώνεται σε διαφορετικό ph και σε μεταβαλλόμενη ιοντική ισχύ (NaNO3) 85 Το μέγεθος μειώνεται όσο το ph και η ιονική ισχύς στο διάλυμα αυξάνονται, δεδομένου ότι και οι δύο παράμετροι καθορίζουν την χημική σύσταση της επιφάνειας των αναπτυσσόμενων νανοσωματιδίων και συνεπώς, το ηλεκτροστατικό φορτίο της επιφάνειας των σωματιδίων (σχήμα 1.33) 85 88. Όπως φαίνεται στο ίδιο σχήμα, έχουν αναφερθεί μεγέθη των 12 nm με αυτήν την τεχνική, αλλά πρέπει να σημειωθεί πως αυτά τα αποτελέσματα αναφέρονται σε σύνθεση χωρίς την παρουσία επιφανειακών τροποποιητών. 1.9.1.2 Υδρολυτική αλκαλική καταβύθιση με μία πρόδρομη ένωση του σιδηρού Μία ακόμη μέθοδος υδρολυτικής αλκαλικής καταβύθισης είναι αυτή που βασίζεται στη χρήση μίας μόνο πρόδρομης ένωσης του σιδήρου (συγκεκριμένα άλατος του δισθενούς σιδήρου), σε αντίθεση με την προηγούμενη μέθοδο η οποία απαιτεί δύο πρόδρομες ενώσεις. 35

Στην καταβύθιση από Fe +2 η ανάπτυξη του πλέγματος του μαγνητικού οξειδίου του σιδήρου λαμβάνει χώρα μέσω της αρχικής παραγωγής Fe(OH)2 και αντιδράσεων αφυδάτωσης, συμπύκνωσης και οξείδωσης (1.1, 1.2) : Fe +2 + 2OH + xh 2 O Fe II (OH) 2 (H 2 O) x (1.1) 2Fe II (OH) 2 (H 2 O) x + O 2 αφυδάτωση, συμπύκνωση Fe III 2 O 3 + (x + 1)H 2 O + 2OH (1.2) Σε αντίθεση με την περίπτωση της συγκαταβύθισης, αυτή η πορεία διαρκεί για αρκετά λεπτά της ώρας (~30 min). Η μέθοδος αυτή είναι γνωστή εδώ και πολλές δεκαετίες. Σημαντικό πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ότι τα παραγόμενα MNPs έχουν μεγαλύτερο μέγεθος σε σχέση με αυτά από συγκαταβύθιση 89 90. Το μέγεθος έχει σημαντική επίδραση στις μαγνητικές ιδιότητες και επομένως στις ζητούμενες εφαρμογές. Μια ακόμη μέθοδος που χρησιμοποιείται για την παρασκευή νανοσωματιδίων είναι αυτή του μικρογαλακτώματος 91 και ανήκει στις υδρολυτικές τεχνικές μαγνητικών κολλοειδών. Η μέθοδος αυτή είναι μια καλή επιλογή όσο αναφορά γενικά τον έλεγχο μεγέθους καθώς επιτρέπει τις χημικές αντιδράσεις για την παρασκευή νανοσωματιδίων να λαμβάνουν χώρα εγκλωβισμένες στο εσωτερικό των κοιλοτήτων της διεσπαρμένης φάσης, δηλαδή στο εσωτερικό του γαλακτωματοποιητή, έτσι ώστε να εμποδίζεται ο σχηματισμός συσσωματωμάτων και να υπάρχει μικρή διασπορά μεγέθους των νανοσωματιδίων. Κύριο χαρακτηριστικό ενός γαλακτώματος είναι η σταθερότητά του. Μειονεκτήματα της μεθόδου αποτελούν οι διαδικασίες καθαρισμού που απαιτούνται για την απομάκρυνση των επιφανειοδραστικών και η μικρή ποσότητα νανοσωματιδίων που παράγονται, η οποία περιορίζεται από την φύση της μεθόδου. 1.9.2 Θερμολυτική μέθοδος Σε αντίθεση με την υδρολυτική μέθοδο παρασκευής MNPs, η θερμολυτική μέθοδος βασίζεται στη θερμική αποδόμηση οργανομεταλλικών ενώσεων του σιδήρου σε οργανικούς διαλύτες υψηλού σημείου ζέσεως (250 300 ο C ). Τα νανοσωματίδια που λαμβάνονται είναι συνήθως μεγέθους 4 nm έως 20 nm. Η διάσπαση οργανομεταλλικών συμπλόκων σιδήρου παρουσία επιφανειοδραστικών μορίων, χρησιμοποιώντας οργανικούς διαλύτες με υψηλές θερμοκρασίες βρασμού, έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή MNPs με πολύ καλό έλεγχο μεγέθους και πολύ μικρή διασπορά 80 85. Η ανάπτυξη του πλέγματος του οξειδίου, πιστεύεται ότι λαμβάνει χώρα μέσω δημιουργίας και ανασυνδυασμού ριζών 92. Τα δομικά χαρακτηριστικά των προϊόντων εξαρτώνται από παράγοντες όπως η θερμοκρασία σύνθεσης και ο ρυθμός αύξησής της, η συγκέντρωση των αντιδραστηρίων, η φύση του διαλύτη και των προδρόμων μεταλλικών ενώσεων, ακόμη και της ταχύτητας με την οποία προστίθενται τα αντιδραστήρια. 1.10 Σταθεροποίηση ΜΝΣ μέσω της επιφανειακής τους τροποποίησης Ένα σημαντικό στάδιο για την παρασκευή και χρήση των μαγνητικών νανοσωματιδίων ως λειτουργικών κολλοειδών είναι η χημική τροποποίηση της επιφάνειας τους. Η κατάλληλη επιφανειακή τροποποίηση έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της βιοσυμβατότητας, την ενίσχυση της κολλοειδούς σταθερότητας των MNPs στο νερό, σε ουδέτερο ph και σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις ιόντων, την ικανότητα προσκόλλησης σε συγκεκριμένες ουσίες-στόχους ή την 36

δυνατότητα να αποφεύγουν άλλες και να μεταφέρουν φαρμακοδραστικές ενώσεις. Η παρουσία κατάλληλων τερματικών χημικών ομάδων στην επιφάνεια των MNPs επιτρέπει την παραπέρα ανάπτυξη και τροποποίηση των υβριδικών κολλοειδών, ανάλογα με την επιθυμητή κάθε φορά εφαρμογή. Για παράδειγμα μπορεί να συνδεθεί πολυμερές το οποίο να εξασφαλίζει μεγάλο χρόνο παραμονής στο αίμα (απαραίτητη ιδιότητα για τη φυσική στόχευση, βλ. παρ. 1.4.1.1). Ταυτόχρονα, εκτός από τον εξωτερικό πολυμερικό φλοιό, μπορεί να υπάρχει και δεύτερος κατάλληλα επιλεγμένος εσωτερικός φλοιός ο οποίος να εξασφαλίζει την πρόσδεση φαρμάκων. Στην ιδανική περίπτωση δηλαδή ένα υβριδικό κολλοειδές σωματίδιο, για να δράσει επιτυχώς ως νανοφορέας, πρέπει να έχει τέτοια αρχιτεκτονική που να προσδίδει στο σύστημα πολλές ιδιότητες και λειτουργίες που να δρουν ταυτοχρόνως. Αυτό συνήθως επιτυγχάνεται με την ανάπτυξη τουλάχιστον δύο εξωτερικών οργανικών φλοιών, στο κέντρο των οποίων βρίσκεται το ανόργανο νανοσωματίδιο. Η τροποποίηση των ανόργανων νανοσωματιδίων μπορεί να γίνει άμεσα ή έμμεσα. Η άμεση τροποποίηση περιλαμβάνει την φυσική η χημική σύνδεση μορίων και πολυμερών, στην επιφάνεια των μαγνητικών νανοσωματιδίων 20 93 94. Έμμεση τροποποίηση είναι η ενκαψυλίωση των νανοσωματιδίων μέσα σε κατάλληλες διατάξεις όπως π.χ. τα λιποσώματα και μικκύλια γενικότερα 95. Η επιφανειακή τροποποίηση πραγματοποιείται με διάφορους τρόπους. Είτε μετά το τέλος της σύνθεσης των νανοσωματιδίων, είτε με επιτόπια σύνθεση των μαγνητικών σωματιδίων παρουσία κατάλληλων μονομερών 96 ή πολυμερών 97. Στην συνέχεια παρατίθενται χαρακτηριστικά παραδείγματα τροποποιητών ανάλογα την κατηγορία στην οποία αυτοί ανήκουν. 1.10.1 Άμεση επιφανειακή τροποποίηση Χαρακτηριστικά παραδείγματα αυτής της κατηγορίας επιφανειακών τροποποιητών είναι βιοπολυμερή της οικογένειας των δεξτρανών. Συνθετικά πολυμερή όπως η πολυβινυλική αλκοόλη (PVA) και το πολυακριλικό οξύ (PAA) έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή βιοσυμβατών μαγνητικών νανοσωματιδίων 98. Επίσης χρησιμοποιούνται συνθετικά πολυμερή όπως η πολυ(αιθυλενο-γλυκόλη) (PEG) 97. Η πολύ(αιθυλενο-γλυκόλη), ή αλλιώς PEG, είναι από τα πιο χρησιμοποιημένα πολυμέρη για αυτό το σκοπό επειδή είναι μη τοξική και δεν επάγει ανοσοαποκρίσεις όσο άλλα πολυμερή. Επίσης έχει βιο-απωθητικές ιδιότητες, δηλαδή ελαχιστοποιεί την αλληλεπίδραση με βιολογικά (μακρο)μόρια. Οι ιδιότητες αυτές είναι σημαντικές γιατί έτσι αυξάνεται ο χρόνος παραμονής στο αίμα. Είναι υδρόφιλο μη-ιοντικό πολυμερές πετυχαίνοντας έτσι να προσδώσει στα κολλοειδή θερμοδυναμική σταθερότητα. Η σύνδεση των επιφανειακών τροποποιητών επιτυγχάνεται μέσω παρουσίας χημικών ομάδων (π.χ. φωσφορικές ή καρβοξυλικές) οι οποίες συναρμόζονται στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου. Σε άλλες περιπτώσεις η πρόσδεση γίνεται μέσω χημικών ομάδων οι οποίες αναπτύσσουν δεσμούς υδρογόνου με τις επιφάνειες των μαγνητικών νανοσωματιδίων όπως απεικονίζεται στο παρακάτω σχήμα 1.34 99. 37

Σχήμα 1.34: Χημικές αντιδράσεις προς την παρασκευή νανοσωματιδίων μαγνητίτη επικαλυμμένων με πολυ(αιθυλενο-γλυκόλη). α) δομή μορίου mpeg, β) ένωση mpeg με TsT, γ) αντίδραση β με ντοπαμίνη, δ) νανοσωματίδιο μαγνητίτη επικαλυμμένο με mpeg 99 1.10.2 Έμμεση επιφανειακή τροποποίηση (εγκλωβισμός σε κοίλες δομές) Ο εγκλωβισμός των μαγνητικών νανοσωματιδίων σε λιποσώματα, μικκύλια και τεχνητά καψίδια πολυηλεκτρολυτών φαίνεται μια ελπιδοφόρα προσέγγιση που μπορεί να λειτουργήσει ως εφαλτήριο για την χρήση των μαγνητικών νανοσφαιριδίων σε βιοϊατρικές εφαρμογές. Ένα παράδειγμα αυτής της προσέγγισης είναι η εργασία των Jinming Gao et al. 100, οι οποίοι εγκλώβισαν επιτυχώς υδρόφοβα υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου (διαμέτρου 8 nm) σε πολυμερικά μικκύλια, μαζί με το αντικαρκινικό φάρμακο doxorubicin, όπως φαίνεται στο σχήμα 1.35. Σχήμα 1.35: Απεικόνιση έμμεσης επιφανειακής τροποποίησης μαγνητικών νανοσωματιδίων μέσω εγκλωβισμού τους σε πολυμερικό μικκύλιο 100 Σε αυτή την μελέτη η εξάτμιση υδρόφοβου διαλύτη που περιέχει συσταδικά συμπολυμερή πολυλακτικό οξέος με πολύ(αιθυλενο-γλυκόλη) προωθεί την δημιουργία μικκυλίων, διαμέτρου περίπου 50 nm, με υδρόφοβο εσωτερικό, στο οποίο εγκλωβίζονται τα υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια (σχήμα 1.36) και η DOX, ενώ το υδρόφιλο κέλυφος με την επικάλυψη PEG τις επιθυμητές ιδιότητες οι οποίες αναφέρθηκαν προηγουμένως. 38

Σχήμα 1.36: Απεικόνιση TEM των πολυμερικών μικκυλίων, όπου διακρίνονται τα υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια εγκλωβισμένα στο εσωτερικό τους. Στο κάτω μέρος της εικόνας απεικονίζονται τα ίδια μικκύλια με την μέθοδο cryo-tem 100 1.10.3 Σταθεροποίηση MNPs με διπλά υδρόφιλα συμπολυμερή μέσω μεθόδων αυτόοργάνωσης και Layer-by-Layer Μία ακόμη προσέγγιση για τον σχηματισμό σταθερών νανοδομών που έχει τύχει έντονου ενδιαφέροντος τα τελευταία χρόνια είναι η αυτό-οργάνωση ανάμεσα σε φορτισμένες (υπερ)μοριακές δομές αντίθετου φορτίου μέσω εναπόθεσης κατά στρώσεις (Layer-by-Layer- LbL) ή ηλεκτροστατικής σύμπλεξης 101. Η LbL εναπόθεση αντίθετα φορτισμένων πολύηλεκτρολυτών είναι ένα αξιοσημείωτο παράδειγμα σχηματισμού υπερμοριακών δομών σε διεπιφάνειες. Χρησιμοποιώντας αυτή την μέθοδο για την σύμπλεξη διεπιφανειών είναι δυνατή η ανάπτυξη πολυστρωματικών δομών αποτελούμενων από μακρομόρια διαφορετικού φορτίου ή/και ανόργανων νανοϋλικών 102 (πχ, σωματίδια, πρωτεΐνες) με ποικίλες εφαρμογές όπως λεπτά υμένια ή υλικά επικάλυψης 103 με αντι-ανακλαστικές 104 και αυτό-καθαριστικές ιδιότητες. Η ηλεκτροστατική σύμπλεξη υποδηλώνει την διαδικασία στην οποία η συναρμογή των (υπερ)μοριακών δομών πηγάζει από την σύζευξη των ηλεκτρικών φορτίων που βρίσκονται για παράδειγμα στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων ή κατά μήκος των συμπολυμερών. Η χρησιμότητα των διπλά υδρόφιλων δισυσταδικών συμπολυμερών * έγκειται στην διαλυτότητα που παρουσιάζουν σε υδατικά μέσα όμως εν αντιθέσει με τα αμφίφιλα συμπολυμερή αυτόοργανώνονται μόνο παρουσία δομών (μορίων, σωματιδίων, κλπ) αντίθετου φορτίου. Αυτού του είδους τα συμπολυμερή προσέλκυσαν το ενδιαφέρον στα μέσα της δεκαετίας του 1990 από την ερευνητική ομάδα του Kataoka που ήταν ο πρώτος που πρότεινε τον σχηματισμό πολύ-ιοντικών μικυλλίων μέσω σύμπλεξης αντίθετα φορτισμένων πολυπεπτιδικών συστάδων με τμήματα πολύ(αιθυλενογλυκόλης) 105 106. Αυτές οι πρώτες προσπάθειες ανέδειξαν ότι οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε συμπολυμερή και αντίθετου φορτίου δομές μπορούν να παράγουν * Ο όρος διπλά υδρόφιλα συμπολυμερή σε αυτή την εργασία αναφέρεται σε συμπολύμερη αποτελούμενα από μία φορτισμένη και μία ουδέτερη συστάδα. 39

νέου τύπου κολλοειδή συστήματα. Τέτοιου τύπου κολλοειδή συστήματα σχηματίζονται αυθόρμητα μέσω απευθείας ανάμιξης και σχηματίζουν μικροδομές πυρήνα-κελύφους. Όσον αφορά τον μηχανισμό της σύμπλεξης, έχει γίνει πλέον αποδεκτό ότι οι κινητήριες δυνάμεις είναι ενθαλπικής και εντροπικής φύσης 107 108. Η παράμετρος της ενθαλπίας στην ελεύθερη ενέργεια της σύμπλεξης συνδέεται με την σύζευξη των αντίθετων φορτίων. Η ενθαλπία της δέσμευσης αυτής εξαρτάται κυρίως από τις χημικές οντότητες που συμμετέχουν στην διαδικασία της σύμπλεξης 109. Η συνεισφορά της εντροπίας στην ελεύθερη ενέργεια πηγάζει από την αποδέσμευση ιόντων αντίθετου φορτίου τα οποία αρχικά ήταν πυκνώς κατανεμειμένα στην επιφάνεια των κολλοειδών σωματιδίων ή στις συστάδες των πολυμερών, καθώς επίσης και από την εκφύλιση των μεταφορικών και περιστροφικών βαθμών ελευθερίας των μακρομορίων στην νέα κατάσταση ισορροπίας τους 110. Η ισορροπία ανάμεσα στην εντροπική και ενθαλπική συνεισφορά έχει σαν συνέπεια ποικίλες συμπεριφορές κατά την διάρκεια της σύμπλεξης. Σημαντικό ρόλο σε αυτή την συμπεριφορά μπορεί να διαδραματίσει ακόμα και το πρωτόκολλο που ακολουθείται για την σύμπλεξη, με την σειρά και τον τρόπο ανάμιξης των αντιδραστηρίων να αποδεικνύεται μείζονος σημασίας 101 111 112. Με την μέθοδο της ηλεκτροστατικής σύμπλεξης έχει επιτευχθεί η συγκρότηση νανοσωματιδίων 113 114 115 οξειδίου του σιδήρου σε πλειάδες (clusters) ποικίλων διαστάσεων και διαμορφώσεων διατηρώντας την κολλοειδή τους σταθερότητα (σχήμα 1.37). Σχήμα 1.37: Μικρογράφημα TEM νανοκρυστάλλων οξειδίου του σιδήρου (a) πριν και (b) μετά την διαδικασία της ηλεκτροστατικής σύμπλεξης 115 Σε ένα ακόμη παράδειγμα οι P. Liu et al. παρασκεύασαν κοίλες πολύ-λειτουργικές βιοσυμβατές δομές με την μέθοδο LbL μέσω της ηλεκτροστατικής σύμπλεξης ανάμεσα σε έναν κατιοντικό πολυηλεκτρολύτη χιτοζάνης και μία υβριδική ανιοντική δομή αποτελούμενη από νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου τροποποιημένα με κιτρικό οξύ τα οποία στη συνέχεια τροποποιήθηκαν περαιτέρω με πολύ(αιθυλενογλυκόλη) συζευγμένη με φολικό οξύ σαν παράγοντα στόχευσης 116. 40

Σχήμα 1.38: Σχηματική απεικόνιση της σύνθεσης μέσω της μεθόδου LbL κοίλων πολυλειτουργικών νανοσφαιρών 116 1.11 Απόκριση σε εξωτερικά μαγνητικά πεδία Σημαντικό ρόλο στις εφαρμογές των νανοκολλοειδών παίζει η μαγνητική τους ροπή. Τα νανοκολλοειδή που παρασκευάζονται, έχουν συνήθως μεγέθη της τάξης των 6-20 nm. Σε αυτά τα μεγέθη, ένα σημαντικό μέρος των ατόμων βρίσκεται στην επιφάνεια των σωματιδίων. Τα spin όμως αυτών των ατόμων τείνουν να δυσκολεύονται να ευθυγραμμιστούν με το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο, παρουσιάζοντας έτσι μία ελαφριά απόκλιση, σε αντίθεση με τα spin των εσωτερικών ατόμων. Έτσι, στην επιφάνεια του νανοσωματιδίου δημιουργείται ένα στρώμα μηευθυγραμμισμένων spin, που έχει σαν αποτέλεσμα την μείωση της συνολικής μαγνήτισης του νανοσωματιδίου (σχήμα 1.39). Σχήμα 1.39: Σχηματική απεικόνιση της διαταραγμένης επιφάνειας των spin στην νανοκλίμακα και της εξάρτησης της μαγνήτισης κορεσμού από το μέγεθος των νανοσωματιδίων 117 Αυτό, δυσχεραίνει τον έλεγχο της κίνησης τους στον οργανισμό με την χρήση μαγνητικών πεδίων. Επομένως, περιορίζει και την χρήση τους σε εφαρμογές στοχευμένης θεραπείας. Ένας τρόπος για να αυξηθεί η μαγνητική ροπή των σωματιδίων, είναι να αυξηθεί αρκετά το μέγεθος τους. Κάτι τέτοιο όμως, θα σήμαινε την μετάβαση των MNPs από την υπερπαραμαγνητική στη σιδηρομαγνητική συμπεριφορά (κρίσιμη διάμετρος ~25nm για Fe3O4), με αποτέλεσμα τα νανοσωματίδια να μην διασπείρονται πλέον αποτελεσματικά. Μία στρατηγική για την αντιμετώπιση αυτού του εμποδίου, είναι η σύνθεση κολλοειδών πλειάδων (colloidal clusters) μαγνητικών νανοκρυσταλλιτών. Με αυτόν τον τρόπο, 41

εξασφαλίζεται το πλεονέκτημα της αύξησης της μαγνητικής ροπής ανά κολλοειδές σωματίδιο (δηλαδή του όγκου μαγνητικού υλικού ανά κολλοειδές σωματίδιο), με ταυτόχρονη διατήρηση των υπερπαραμαγνητικών χαρακτηριστικών. Η σημασία της αύξησης του όγκου μαγνητικού υλικού ανά κολλοειδές σωματίδιο, γίνεται καλύτερα αντιληπτή, αν ληφθεί υπόψη πως η απόκριση ενός μαγνητικού σωματιδίου σε βαθμίδα μαγνητικού πεδίου περιγράφεται από την παρακάτω εξίσωση 118. (εξίσωση 1.17) όπου F η μαγνητική δύναμη που ασκείται στο μαγνητικό υλικό, Vt ο συνολικός όγκος του μαγνητικού υλικού που υπάρχει σε κάθε σωματίδιο, B η μαγνητική επαγωγή και Ms η μαγνήτιση κόρου. Οπότε, η παράμετρος που υπαγορεύει το πως αποκρίνεται το σωματίδιο είναι το ποσό του μαγνητικού υλικού που συμμετέχει σε κάθε πλειάδα (σχήμα 1.40). Οπότε, η παράμετρος που υπαγορεύει το πως αποκρίνονται το σωματίδιο είναι το ποσό του μαγνητικού υλικού που συμμετέχει σε κάθε πλειάδα. Ο όρος Vt δηλαδή της εξίσωσης 1.17. Σχήμα 1.40: Σχηματική αναπαράσταση της κίνησης πλειάδων χαλαρής και πυκνής διάταξης σε βαθμίδες μαγνητικών πεδίων 119 1.12 Οργάνωση σε πλειάδες πυκνής και χαλαρής διάταξης Στην βιβλιογραφία υπάρχουν περιορισμένες αναφορές για την σύνθεση κολλοειδών πλειάδων 15 120 121 122 123 124 125. Από τη μελέτη της βιβλιογραφίας, φαίνεται πως οι κολλοειδείς πλειάδες χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: (α) πλειάδες πυκνής διάταξης 120 121 122 και (β) πλειάδες χαλαρής διάταξης 15 123 124 125. Οι δομές αυτές θα μπορούσαν να περιγραφούν προσεγγιστικά στο σχήμα 1.41. Η βασική διαφορά μεταξύ των δύο ειδών έγκειται στο ότι κατά την πυκνή διάταξη οι νανοκρυσταλλίτες αλληλεπιδρούν απευθείας μεταξύ τους, ενώ κατά την χαλαρή διάταξη οι νανοκρυσταλλίτες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους μέσω πολυμερικών αλυσίδων που λειτουργούν ως γέφυρα. Και στις δύο περιπτώσεις η αυτοσυνάθροιση των νανοκρυσταλλιτών προς σχηματισμό των πλειάδων γίνεται αυθόρμητα κατά τη χημική σύνθεση. Οι πλειάδες πυκνής διάταξης μέχρι τώρα έχουν αναπτυχθεί με υδρολυτικές μεθόδους σε υψηλή πίεση (~30 atm) και υψηλή θερμοκρασία (~200 o C) ή μόνο σε υψηλή θερμοκρασία. Οι πλειάδες χαλαρής διάταξης 42

παρασκευάζονται με την τεχνική της συγκαταβύθισης που αναπτύχθηκε προηγουμένως σε συνθήκες περιβάλλοντος. Μεταξύ αυτών των δύο, πλεονεκτούν τα συστήματα πυκνής διάταξης διότι καθίσταται δυνατό κολλοειδή να περιέχουν μεγαλύτερη μάζα υπερπαραμαγνητικών νανοκρυσταλλιτών χωρίς αύξηση της υδροδυναμικής διαμέτρου.. (α) (β) Σχήμα 1.41: Υβριδικό κολλοειδές τύπου πλειάδας (α) πυκνής δομής και (β) χαλαρής δομής. Για παράδειγμα οι Yadong Yin et al 120 συνέθεσαν κολλοειδείς νανο-πλειάδες πυκνής διάταξης χρησιμοποιώντας μέθοδο υδρόλυσης υψηλής θερμοκρασίας. Το πολύ(ακρυλικού οξύ), PAA, χρησιμοποιήθηκε σαν επιφανειακός τροποποιητής, παρουσία μίας πρόδρομης ένωσης σιδήρου (τρισθενούς χλωριούχου σιδήρου) και σαν διαλύτης χρησιμοποιήθηκε η διεθυλενογλυκόλη (ένας πολικός διαλύτης υψηλού σημείου ζέσεως 245 ο C). Τελικά οι νανοκρυσταλλίτες Fe3O4 συναθροίζονται αυθόρμητα δημιουργώντας πλειάδες νανοκρυσταλλιτών πυκνής διάταξης (σχήμα 1.42a). Σε μία ακόμα προσέγγιση, οι F. Berret et al 15 προχώρησαν στον σχηματισμό νανο-πλειάδων χαλαρής διάταξης μέσω της μεθόδου selfassembly (σχήμα 1.42b). Σχήμα 1.42: (α) Τυπική εικόνα ΤΕΜ από πλειάδες νανοκρυσταλλιτών πυκνής δομής (κλίμακα 200 nm) 120 και (β) Τυπική εικόνα ΤΕΜ από πλειάδες νανοκρυσταλλιτών χαλαρής δομής 15 43

44

Κεφάλαιο 2 o 2 Βασικές τεχνικές χαρακτηρισμού Θεωρητικό υπόβαθρο 2.1 Περίθλαση ακτίνων Χ (XRD) Η τεχνική περίθλασης ακτίνων Χ (X-Ray diffraction, XRD) είναι μία μη καταστρεπτική, αναλυτική τεχνική, μέσω της οποίας μπορούμε να αντλήσουμε ποιοτικές πληροφορίες ως προς την κρυσταλλογραφική δομή, το μέγεθος των κρυσταλλιτών, την χημική σύσταση και τις φυσικές ιδιότητες ενός στερεού δείγματος, σε μορφή σκόνης ή ακόμη και λεπτού φιλμ. Η αρχή λειτουργίας της βασίζεται στην παρατήρηση της έντασης μίας σκεδαζόμενης ακτίνας Χ, η οποία χτυπά στο δείγμα, σαν συνάρτηση της γωνίας της προσπίπτουσας και ανακλώμενης ακτινοβολίας, της πόλωσης, του μήκους κύματος ή της ενέργειας 126. Μιλώντας για κρυσταλλικά υλικά όπως ο μαγνητίτης και ο μαγκεμίτης γίνεται αντιληπτό ότι πρόκειται για σειρές ατόμων τακτικά τοποθετημένες μέσα στον κρύσταλλο. Από ένα θερμαινόμενο σύρμα παράγονται ηλεκτρόνια τα οποία επιταχύνονται λόγω μεγάλης διαφοράς δυναμικού (~ 40 kv) και προσκρούουν σε μια άνοδο από χαλκό. Η άνοδος, σαν αποτέλεσμα της κρούσης, χάνει ηλεκτρόνια από την εσωτερική Κ στοιβάδα. Οι οπές που δημιουργούνται καταλαμβάνονται από ηλεκτρόνια της εξωτερικής στοιβάδας μεταβαίνοντας από υψηλότερη σε χαμηλότερη ενεργειακή στάθμη. Η μετάπτωση των ηλεκτρονίων σε χαμηλότερη ενεργειακή στάθμη λόγω αυτής της μετάβασης αποδίδεται ως ακτίνες Χ. Η ακτινοβολία Χ προσκρούει πάνω στο δείγμα, τα άτομα στα επίπεδα Miller hkl του κρυστάλλου την περιθλούν και στη συνέχεια προσπίπτει σε έναν ανιχνευτή. Η αλληλεπίδραση μεταξύ του ηλεκτρικού διανύσματος της ακτινοβολίας Χ και των ηλεκτρονίων της ύλης, μέσα από την οποία διέρχεται, προκαλεί σκέδαση. Όταν μία δέσμη ακτίνων Χ σκεδάζεται στο οργανωμένο περιβάλλον του κρυστάλλου (διάταξη κρυσταλλογραφικών επιπέδων που περιέχουν τα περιοδικά διατεταγμένα άτομα, τα προαναφερθέντα επίπεδα Miller), συμβαίνει συμβολή (ενισχυτική ή καταστρεπτική) των σκεδαζόμενων ακτίνων, επειδή οι αποστάσεις μεταξύ των κέντρων σκέδασης είναι του ίδιου μεγέθους με το μήκος κύματος της ακτινοβολίας. Αποτέλεσμα αυτού του τύπου σκέδασης είναι η περίθλαση της ακτινοβολίας, η δημιουργία δηλαδή σφαιρικών κυμάτων χαρακτηριστικών της ατομικής διάταξης του κρυστάλλου και συνεπώς του προς εξέταση υλικού. Όταν μία δέσμη ακτίνων Χ προσκρούει στην επιφάνεια του κρυστάλλου με κάποια γωνία θ, ένα τμήμα της σκεδάζεται από το επιφανειακό στρώμα των ατόμων. Το μη σκεδαζόμενο τμήμα της δέσμης εισέρχεται στο δεύτερο στρώμα ατόμων όπου και πάλι ένα τμήμα σκεδάζεται, το υπόλοιπο εισέρχεται στο τρίτο στρώμα κ.ο.κ. (σχήμα 2.1). Το αθροιστικό αποτέλεσμα της σκέδασης αυτής από τα τακτικά χωροθετημένα κέντρα του κρυστάλλου είναι η περίθλαση της δέσμης. 45

Σχήμα 2.1: Σχηματική απεικόνιση περίθλασης ακτίνων Χ από τα επίπεδα Miller 126 Αναλυτικότερα, η στενή δέσμη της ακτινοβολίας προσπίπτει στην επιφάνεια του κρυστάλλου με γωνία θ. Η σκέδαση είναι το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης της ακτινοβολίας με τα άτομα στα σημεία Ε, Ζ, Η. Εάν ισχύει ότι ΑΖ + ΖΓ = nλ, όπου n είναι ένας ακέραιος αριθμός (1, 2, 3...) και αντιστοιχεί στα κρυσταλλογραφικά επίπεδα, η σκεδαζόμενη ακτινοβολία θα βρίσκεται σε φάση στα σημεία ΕΓΔ και ο κρύσταλλος θα φαίνεται ότι ανακλά την ακτινοβολία Χ. Ισχύει όμως η σχέση ΑΖ + ΖΓ = 2 d sin θ, όπου d είναι η απόσταση μεταξύ των επιπέδων του κρυστάλλου. Έτσι, η συνθήκη για ενισχυτική συμβολή της δέσμης για την γωνία θ δίνεται από την εξίσωση 2.1: 2d sin θ = nλ (εξίσωση 2.1) Η παραπάνω εξίσωση είναι γνωστή ως εξίσωση του Bragg 126. Οι ακτίνες Χ εμφανίζονται σαν να ανακλούνται από τον κρύσταλλο, μόνο όταν η γωνία πρόσπτωσης ικανοποιεί την εξίσωση 2.1, sin θ = nλ. σε κάθε άλλη γωνία η συμβολή είναι καταστρεπτική, ακυρώνοντας τα σφαιρικά κύματα το ένα το άλλο. Προϋποθέσεις για την περίθλαση ακτίνων Χ είναι: (1) οι αποστάσεις μεταξύ των στρωμάτων των ατόμων πρέπει να είναι περίπου ίδιες με το μήκος κύματος ακτινοβολίας και (2) τα κέντρα σκέδασης πρέπει να κατανέμονται στο χώρο με υψηλή κανονικότητα. Η αξία των τεχνικών περίθλασης ακτίνων Χ βασίζονται στο ότι το φάσμα περίθλασής τους είναι μοναδικό για κάθε κρυσταλλική ουσία. 2d 46

2.2 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (TEM) Η ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης είναι μια σημαντική τεχνική χαρακτηρισμού μιας και μπορεί να φτάσει σε διακριτική ικανότητα περίπου τα 0,15 0,35 nm ή Angstrom εκμεταλλευόμενη την κυματική φύση των ηλεκτρονίων. Κατά την τεχνική αυτή μια δέσμη ηλεκτρονίων διέρχεται από το δείγμα. Η προβολή της δέσμης αντιστοιχεί στο είδωλο του δείγματος. Η πηγή ηλεκτρονίων αποτελείται από νήμα βολφραμίου το οποίο καθώς διατρέχεται από ρεύμα εκπέμπει ηλεκτρόνια (θερμιονική εκπομπή). Μεταξύ του νήματος, που αποτελεί την κάθοδο, και της ανόδου, εφαρμόζεται διαφορά δυναμικού (της τάξης των 60-200 kv) η οποία επιταχύνει τα ηλεκτρόνια. Η πορεία και η κλίση των τροχιών των ηλεκτρονίων, ρυθμίζεται από τους ηλεκτρομαγνητικούς φακούς στους οποίους αλλάζοντας την ένταση του ρεύματος που τους διαπερνάει, μεταβάλλεται η ένταση του μαγνητικού πεδίου και επομένως η δέσμη των ηλεκτρονίων μπορεί να εστιαστεί στο δείγμα. Σχήμα 2.2: Σχηματική παράσταση ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διέλευσης. Το δείγμα πρέπει να είναι πολύ λεπτό έτσι ώστε τα ηλεκτρόνια να διέρχονται από μέσα του, με συνέπεια να λαμβάνει χώρα ελαστική ή και καθόλου σκέδαση των ηλεκτρονίων (σε αντίθεση με τα ηλεκτρονικά μικροσκόπια σάρωσης όπου τα ηλεκτρόνια σταματούν μέσα στο δείγμα). Το σύστημα που αποτελείται από την πηγή ηλεκτρονίων, φακούς, δείγμα, οθόνη και σύστημα φωτογράφησης, πρέπει να βρίσκεται σε υψηλό κενό της τάξης των 10-4 Torr τουλάχιστον για να αποφεύγονται οι σκεδάσεις ηλεκτρονίων από μόρια του αέρα (σχήμα 2.2). Η εικόνα που 47

λαμβάνεται σχηματίζεται πάνω σε οθόνη επικαλυμμένη με φθορίζουσα ουσία. Η οθόνη αυτή διεγείρεται από τα ηλεκτρόνια που πέφτουν επάνω της, αφού πρώτα έχουν διαπεράσει το δείγμα. Στα σημεία εκείνα που το δείγμα δεν είναι διαπερατό από τα ηλεκτρόνια, δημιουργούνται σκοτεινές περιοχές, ενώ αντίθετα τα διαπερατά σημεία δίνουν φωτεινές περιοχές 127. Επίσης υπάρχει η δυνατότητα λήψης εικόνας μέσω ηλεκτρονικού υπολογιστή σε ψηφιακή μορφή, χάρη στην διάταξη με μικροκάμερες που υπάρχει πάνω στο σύστημα. Όπως στην περίθλαση ακτίνων Χ έτσι και στην ηλεκτρονική μικροσκοπία τα ηλεκτρόνια περιθλώνται από τα κρυσταλλογραφικά επίπεδα του κρυστάλλου έτσι ώστε να ισχύει ο νόμος του Bragg. Ο τρόπος με τον οποίο λειτουργεί το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης θέτει πολλούς περιορισμούς ως προς τη φύση των δειγμάτων που μπορούν να μελετηθούν. Κάποιες από τις ιδιότητες που θα πρέπει να έχει ένα δείγμα ώστε να μπορεί να παρατηρηθεί με ΤΕΜ είναι οι ακόλουθες: να μην είναι πτητικό, να αντέχει σε υψηλό κενό, να είναι σταθερό στο βομβαρδισμό ηλεκτρονίων και να είναι αρκετά λεπτό για να μπορούν να το διαπερνούν τα ηλεκτρόνια. 2.3 Δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) Μια από τις πιο δημοφιλείς τεχνικές σήμερα για την μέτρηση του μεγέθους κολλοειδών νανοσωματιδίων είναι η δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS), καθώς δύναται να μετρήσει το μέγεθος σωματιδίων σε διασπορά, ταχύτατα και απαιτώντας ελάχιστη προετοιμασία δείγματος. Η DLS ανιχνεύει τη συχνότητα του τρεμοπαίγματος του μοτίβου που καταγράφεται στον ανιχνευτή από τη σκέδαση του φωτός στα σωματίδια (σχήμα 2.3a) 128. Η ενισχυτική και καταστρεπτική συμβολή του φωτός από τη σκέδαση (σχήμα 2.3b) είναι υπεύθυνη για την εμφάνιση σκοτεινών και φωτεινών περιοχών σε αυτό το μοτίβο. Η συχνότητα αυτή είναι ανάλογη της θερμικής κίνησης Brown των σωματιδίων, η οποία με τη σειρά της εξαρτάται από το μέγεθος των σωματιδίων (όσο μικρότερα τα σωματίδια τόσο γρηγορότερη είναι η κίνηση Brown) και από το ιξώδες του διαλύτη. Το ιξώδες ενός υγρού συσχετίζεται άμεσα με την θερμοκρασία του, άρα για μετρηθεί η κινητικότητα των σωματιδίων μέσα σε ένα διάλυμα είναι απαραίτητο οι μετρήσεις να διεξάγονται κάτω από μια γνωστή και σταθερή θερμοκρασία. Η ανάλυση της χρονικής εξάρτησης της διακύμανσης/συσχέτισης του μοτίβου τρεμοπαίγματος μπορεί επομένως να αποδώσει το συντελεστή διάχυσης των σωματιδίων μέσω του οποίου, χρησιμοποιώντας την εξίσωση Stokes-Einstein (εξισώση 1.14, D = kt 6πηr ), και γνωρίζοντας το ιξώδες του μέσου, μπορεί να υπολογιστεί η υδροδυναμική διάμετρος των σωματιδίων. Η διάμετρος που μετριέται μέσω της τεχνικής DLS ονομάζεται υδροδυναμική διάμετρος και είναι η διάμετρος μιας ιδεατής σφαίρας που έχει τον ίδιο συντελεστή διάχυσης με το σωματίδιο. 48

Σχήμα 2.3: α) Σχηματική αναπαράσταση ενός μοτίβου τρεμοπαίγματος, β) Το παρατηρηθέν σήμα εξαρτάται από την συμβολή των φάσεων του σκεδαζόμενου φωτός που προσπίπτει στον ανιχνευτή. β 1) δύο ακτίνες συμβάλουν και ακυρώνονται μεταξύ τους με συνέπεια να ανιχνεύεται μειωμένη ένταση (σκοτεινή περιοχή). β 2), δύο ακτίνες συμβάλουν ενισχυτικά με συνέπεια να ανιχνεύεται αυξημένη ένταση (φωτεινή περιοχή) 128 Σχήμα 2.4: Κατανομές αριθμού (number), όγκου (volume) και έντασης (intensity) κολλοειδούς διασποράς ίσου πληθυσμού σωματιδίων διαμέτρου 5 και 50 nm 129 Μέσω της τεχνικής DLS μπορεί να γίνει επιλογή μεταξύ τριών διαφορετικών κατανομών υδροδυναμικής διαμέτρου, με βάση την ένταση, τον όγκο ή τον αριθμό. Ένας απλός τρόπος περιγραφής των διαφορών μεταξύ όγκου, έντασης και αριθμού είναι να θεωρήσουμε δύο πληθυσμούς σφαιρικών σωματιδίων διαμέτρου 5 και 50 nm, οι οποίοι αντιπροσωπεύονται σε ίδιους αριθμούς (σχήμα 2.4) Εάν γίνει απεικόνιση της κατανομής του αριθμού της κολλοειδής διασποράς, το προκύπτον διάγραμμα θα αποτελείται από 2 κορυφές (τοποθετημένες στα 5 και 50nm) σε αναλογία 1:1. Όταν η κατανομή αριθμού μετατραπεί σε κατανομή όγκου, τότε η αναλογία των δύο κορυφών θα αλλάξει σε 1:1000, καθώς ο όγκος είναι ανάλογος της τρίτης δύναμης της ακτίνας (r 3 ). Εάν στη συνέχεια, η κατανομή αυτή μετατραπεί σε κατανομή έντασης, ο λόγος της έντασης των δύο κορυφών θα είναι 1:1.000.000, αφού η ένταση, σύμφωνα με την προσέγγιση Rayleigh, είναι ανάλογη της έκτης δύναμης της ακτίνας (r 6 ). Ένα τυπικό σύστημα δυναμικής σκέδασης φωτός αποτελείται από έξι κύρια τμήματα (σχήμα 2.5). Την πηγή φωτός (laser), η ακτίνα της οποίας θα περάσει μέσα από την κυψελίδα με το δείγμα, την κυψελίδα με το δείγμα και τον ανιχνευτή για να μετρηθεί η σκεδαζόμενη 49

ακτινοβολία. Επίσης μία ψηφιακή πλατφόρμα επεξεργάζεται το σήμα της έντασης της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας και το μοτίβο τρεμοπαίγματος. Τέλος η πληροφορία αυτή περνά σε ένα ηλεκτρονικό υπολογιστή όπου με το κατάλληλο λογισμικό, αναλύονται τα δεδομένα και δίνονται πληροφορίες για το μέγεθος των σωματιδίων. Σχήμα 2.5: Σχηματική απεικόνιση ενός συστήματος δυναμικής σκέδασης φωτός 128 2.4 Επιφανειακό φορτίο κολλοειδών και ηλεκτροκινητικές μετρήσεις Όταν σωματίδια διασπείρονται σε ένα υδατικό σύστημα συχνά εμφανίζουν επιφανειακό φορτίο εξαιτίας ιονισμού των επιφανειακών χημικών ομάδων τους ή προσρόφησης φορτισμένων μορίων ή ιόντων. Η ανάπτυξη τέτοιων φορτίων έχει σαν αποτέλεσμα τη μεταβολή της συγκέντρωσης των ιόντων του διαλύματος κοντά στην επιφάνεια των σωματιδίων δημιουργώντας ένα στρώμα γύρω από αυτά, με διαφορετική κατανομή ιόντων από αυτή του κυρίου όγκου του διαλύματος, το οποίο αποτελείται από δύο μέρη (σχήμα 2.6). Το εσωτερικό μέρος ονομάζεται στρώμα Stern (Stern layer) και αποτελείται από ιόντα τα οποία είναι ισχυρά συνδεδεμένα με τα σωματίδια, λόγω των αντίθετων φορτίων τους. Το εξωτερικό μέρος δημιουργείται από διάχυση ασθενέστερα συνδεδεμένων ιόντων του μίγματος. Στο διάχυτο στρώμα υπάρχει ένα νοητό όριο μέσα στο οποίο ιόντα και μόρια διαλύτη αλληλεπιδρούν αρκετά ισχυρά με τη φορτισμένη επιφάνεια του σωματιδίου ώστε σχηματίζουν μια σταθερή οντότητα με το σωματίδιο. Το όριο αυτό ονομάζεται επίπεδο ολίσθησης. Όταν ένα σωματίδιο κινείται, τα ιόντα μέσα σε αυτό το όριο κινούνται μαζί του. Το ηλεκτρικό δυναμικό το οποίο υπάρχει στο εξωτερικό μέρος αυτού του ορίου (επίπεδο ολίσθησης) ονομάζεται δυναμικό ζ (ζ potential) 77 και αποτελεί ένδειξη του επιφανειακού φορτίου του σωματιδίων. Για αυτό απαντάται και με τον όρο φαινόμενο επιφανειακό φορτίο. Το μέγεθος του δυναμικού ζ δίνει μια ένδειξη της δυναμικής σταθερότητας του κολλοειδούς συστήματος. Αν όλα τα σωματίδια στο μίγμα είχαν πολύ μεγάλη (πολύ θετική) ή πολύ μικρή (πολύ αρνητική) τιμή δυναμικού ζ θα είχαν την τάση να απομακρυνθούν το ένα από το άλλο και έτσι δεν θα δημιουργείτο το κολλοειδές. Ωστόσο, αν τα σωματίδια έχουν τιμή δυναμικού ζ κοντά στο μηδέν, τότε δεν υπάρχει καμία δύναμη να τα αποτρέψει από το να έρθουν κοντά και να συσσωματωθούν. Για το λόγο αυτό σωματίδια με δυναμικό ζ πιο θετικό από +30mV ή πιο αρνητικό από -30mV θεωρούνται σταθερά. 50

Σχήμα 2.6: Σχηματική απεικόνιση της διασποράς των ιόντων του διαλύματος γύρω από ένα φορτισμένο σωματίδιο 130 Το ζ-δυναμικό των σωματιδίων είναι μοναδικό για κάθε διάλυμα στο οποίο είναι διεσπαρμένα και επηρεάζεται από διάφορες παραμέτρους όπως το ph του διαλύματος, την ιοντική ισχύ του και την παρουσία σταθεροποιητικών ουσιών (π.χ. γαλακτωματοποιητές), οι οποίες πρέπει να ληφθούν υπόψη για την διασφάλιση μιας μακροχρόνιας σταθερότητας στο τελικό προϊόν. Όταν δεν δίνεται η τιμή του δυναμικού ζ μαζί με την τιμή του ph είναι ουσιαστικά ένας αριθμός χωρίς νόημα, κυρίως όταν πρόκειται για φορτισμένα-ιοντικά κολλοειδή όπως τα οξείδια του σιδήρου. Ας θεωρήσουμε ένα σωματίδιο, μέσα σε διάλυμα, στο οποίο τα επιφανειακά άτομα απολήγουν σε υδροξυλομάδες (-ΟΗ) όπως τα οξείδια του σιδήρου. Αν προστεθεί βάση στο διάλυμα, το σωματίδιο θα αποκτήσει ακόμα πιο αρνητικό φορτίο όπως φαίνεται στην παρακάτω αντιστρεπτή χημική αντίδραση (αντίδραση 2.1). +OH Fe OH Fe O + H 2 O (2.1) Εν συνεχεία, αν προστεθεί οξύ, η πορεία της αντίδρασης αντιστρέφεται, μέχρι ενός σημείου όπου το αρνητικό φορτίο εξουδετερώνεται. Με περεταίρω προσθήκη οξέος οι τερματικές υδροξυλομάδες προσλαμβάνουν (επίσης αντιστρεπτά) υδρογονοκατιόντα και τελικά το κολλοειδές αποκτά θετική τιμή του δυναμικού ζ, όπως φαίνεται στην παρακάτω αντίδραση (αντίδραση 2.2). Fe OH H+ Fe OH 2 + Κατά συνέπεια, ένα διάγραμμα δυναμικού ζ ως προς το ph θα είναι θετικό σε χαμηλά ph και μικρότερο ή αρνητικό σε υψηλότερα. To σημείο όπου η καμπύλη περνά από μηδενικό δυναμικό ζ ονομάζεται ισοηλεκτρικό σημείο (IsoElectric Point, I.E.P.) και είναι πολύ σημαντικό για μια πρώτη εκτίμηση της σταθερότητας του κολλοειδούς σε φυσιολογικά ph. Είναι συνήθως το σημείο στο οποίο το κολλοειδές σύστημα είναι λιγότερο σταθερό. Ακολουθεί ένα χαρακτηριστικό διάγραμμα δυναμικού ζ ως προς το ph (σχήμα 2.7). (2.2) 51

Σχήμα 2.7: Διάγραμμα δυναμικού ζ προς ph για ιοντικά κολλοειδή που προσροφούν αντιστρεπτά υδρογονοκαντιόντα στην επιφάνειά τους 130 Ο προσδιορισμός του ζ δυναμικού γίνεται ως εξής: τα φορτισμένα σωματίδια σε διάλυμα τίθενται σε κίνηση από την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου ανάμεσα σε δύο ηλεκτρόδια. Εναλλάσσοντας το φορτίο μεταξύ των ηλεκτροδίων, τα σωματίδια κινούνται μπρος-πίσω με ταχύτητα ανάλογη του επιφανειακού τους φορτίου, του εφαρμοζόμενου δυναμικού, της διηλεκτρικής σταθεράς του μέσου και του ιξώδους. Η ταχύτητα ενός σωματιδίου μέσα σε ηλεκτρικό πεδίο αναφέρεται συνήθως ως η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του. Γνωρίζοντας αυτά, υπολογίζεται η τιμή του δυναμικού ζ των σωματιδίων κάνοντας χρήση της εξίσωσης Henry (εξίσωση 2.2). U E = 2εzf(Κ a) 3η (2.2) Όπου, z το δυναμικό ζ, U E η ηλεκτροφορητική κινητικότητα, ε η διηλεκτρική σταθερά, η το ιξώδες, f(k a ) ο συντελεστής Henry (δύο τιμές χρησιμοποιούνται γενικά ως προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό του συντελεστή Henry, 1.5 ή 1.0 ) Οι ηλεκτροφορητικοί προσδιορισμοί του δυναμικού ζ γίνονται συνήθως σε υδατικά μέσα και με μέση συγκέντρωση ηλεκτρολυτών. Σε αυτήν την περίπτωση η τιμή του f(ka) είναι 1,5 και ονομάζεται προσέγγιση Smoluchowski. Για μικρά σωματίδια σε μέσα χαμηλής διηλεκτρικής σταθεράς η τιμή του f(ka) γίνεται 1,0 και ονομάζεται προσέγγιση Huckel. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται γενικά σε μη υδατικά κολλοειδή. Οι μετρήσεις γίνονται σε μία τριχοειδή κυψελίδα με ένα ηλεκτρόδιο στις δύο εισόδους της. Η κυψελίδα γεμίζεται με το προς μέτρηση δείγμα και εφαρμόζεται δυναμικό στα ηλεκτρόδιά της (σχήμα 2.8). Τα σωματίδια κινούνται προς το ηλεκτρόδιο με το αντίθετο φορτίο. Η ταχύτητά τους μετριέται με βάση το φαινόμενο Doppler (Laser Doppler Velocimetry, LDV) 130 και εκφράζεται ως κινητικότητα. Η τεχνική LDV χρησιμοποιείται στην μηχανική για την μελέτη της ροής ρευστών σε μια πληθώρα καταστάσεων 131. Είναι μη-παρεισφρητική και μπορεί να δώσει αποτελέσματα ανεξάρτητα των περιβαλλοντικών συνθηκών. Με κατάλληλες τροποποιήσεις μπορεί να μετρήσει ταχύτητες σε ιδιαίτερα δύσκολες περιοχές (μηχανές τζετ, πιστόνια μηχανών) και έχει μεγάλο εύρος μετρήσεων, από θερμικές κινήσεις μέχρι και υπερηχητικές ταχύτητες. 52

Σχήμα 2.8: Χαρακτηριστική απεικόνιση τριχοειδούς κυψελίδας 130 Η LDV χρησιμοποιεί τη κυματική φύση του φωτός λέιζερ. Δύο ακτίνες οι οποίες συνήθως έχουν προέλθει από τον διαχωρισμό μιας ακτίνας λέιζερ (ώστε να είναι συμφασικές) συμβάλουν μέσα στο προς μέτρηση υγρό (μέσα στην κυψελίδα). Η συμβολή δύο ακτίνων λέιζερ του ίδιου μήκους κύματος παράγει περιοχές καταστρεπτικής και ενισχυτικής συμβολής. Οι περιοχές αυτές ονομάζονται κροσσοί συμβολής και δημιουργούν ένα δισδιάστατο στρώμα υψηλής και χαμηλής έντασης φωτός. Καθώς τα σωματίδια περνούν μέσα από τους κροσσούς κινούμενα υπό την επίδραση της ηλεκτροφόρησης, σκεδάζουν το φως (μόνο από τις περιοχές της ενισχυτικής συμβολής) σε έναν φωτοανιχνευτή. Η συχνότητα του σκεδαζόμενου φωτός μεταβάλλεται λόγω του φαινόμενου Doppler που λαμβάνει χώρα και συχνά αναφέρεται ως συχνότητα Doppler της ροής. Αυτή η συχνότητα Doppler είναι ανάλογη της ταχύτητας σωματιδίων. Δεδομένου ότι το διάστημα μεταξύ των κροσσών (d) είναι γνωστό, η ταχύτητα μπορεί να υπολογιστεί ως (εξίσωση 2.3): u = f d (2.3) Όπου f είναι η συχνότητα του σήματος που λαμβάνεται από τον ανιχνευτή. Ένα χαρακτηριστικό σύστημα LDV παρουσιάζεται στο σχήμα 2.9. Αποτελείται από την πηγή λέιζερ, το κελί Βragg, τον θάλαμο με την κυψελίδα, έναν ανιχνευτή της οπισθοσκεδαζόμενης ακτινοβολίας και έναν επεξεργαστή σήματος. Σχήμα 2.9: Απεικόνιση πειραματικής διάταξης LDV. 53

Λόγω της ειδικά διαμορφωμένης διάταξης ακόμα και πολύ μικρής κινητικότητας σωματίδια δίνουν εξίσου καλό σήμα, έτσι η μέτρηση είναι τόσο ακριβής όσο και για τα σωματίδια με μεγάλη κινητικότητα. Αυτή η τεχνική διασφαλίζει ακριβή αποτελέσματα μέσα σε δευτερόλεπτα, με δυνατότητα παρατήρησης ακόμα και χιλιάδων σωματιδίων. 2.5 Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους - Ορατού (UV Vis) Η φασματοφωτομετρία απορροφήσεως αποτελεί μια από τις πιο χρήσιμες τεχνικές στη χημική ανάλυση. Πολλές χημικές ουσίες απορροφούν ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία, ιδιαίτερα στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος και με χρήση του κατάλληλου οργάνου και τεχνικής είναι δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός τους σε ένα μίγμα. Το τμήμα του μορίου που είναι υπεύθυνο για την απορρόφηση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας, ονομάζεται χρωμοφόρο και η εμφάνιση των χαρακτηριστικών ταινιών απορροφήσεως των διαφόρων χρωμοφόρων ομάδων σε ένα φάσμα απορροφήσεως είναι ενδεικτική για την ύπαρξη των ομάδων αυτών στο μόριο. Η φασματοφωτομετρία υπεριώδους ορατού (200-800nm) χρησιμοποιείται ευρέως για τον ποσοτικό προσδιορισμό ουσιών Όταν μονοχρωματική ακτινοβολία διέρχεται από ένα διάλυμα το οποίο περιέχει μια ουσία που απορροφά, η ισχύς της ακτινοβολίας ελαττώνεται προοδευτικά κατά μήκος της διαδρομής, λόγω απορροφήσεώς της από την ουσία. Η ελάττωση της ισχύος εξαρτάται από την συγκέντρωση της ουσίας και από την απόσταση που διένυσε η δέσμη μέσα στο διάλυμα. Οι σχέσεις αυτές εκφράζονται με το νόμο των Lambert-Beer, που συνήθως αναφέρεται ως νόμος του Beer και διατυπώνεται με τη μορφή (εξίσωση 2.4): A= log(p0/p) = -logt = αbcg/lt = εbcmol/lt (2.4) Όπου, Α η απορρόφηση, Ρ0 η ισχύς της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, Ρ η ισχύς της ακτινοβολίας μετά τη διέλευσή της από το διάλυμα, Τ η διαπερατότητα, α μια σταθερά αναλογίας που ονομάζεται απορροφητικότητα, b το μήκος της διαδρομής που διανύθηκε από την ακτινοβολία μέσα στο διάλυμα, ε μια σταθερά αναλογίας που ονομάζεται μοριακή απορροφητικότητα και c η συγκέντρωση της ουσίας που απορροφά στο διάλυμα. Ο νόμος του Beer προϋποθέτει ότι: α) Ο μόνος μηχανισμός αλληλεπίδρασης ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας και διαλυμένης ουσίας είναι η απορρόφηση. β) Η προσπίπτουσα ακτινοβολία είναι μονοχρωματική. γ) η απορρόφηση γίνεται σε ένα όγκο διαλύματος ομοιόμορφης διατομής. δ) ότι τα σωματίδια που απορροφούν δρουν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο και άσχετα από τον αριθμό και το είδος τους. Οι βασικές δομικές μονάδες ενός φασματοφωτομέτρου είναι: 1) μια πηγή ακτινοβολίας σταθερής ισχύος, 2) ένας μονοχρωμάτορας για την απομόνωση της επιθυμητής ακτινοβολίας, 3) μια κυψελίδα για την τοποθέτηση του δείγματος, 4) ένας ανιχνευτής ακτινοβολίας που μετατρέπει το οπτικό σήμα σε ηλεκτρικό και 5) ένα σύστημα μετρήσεως που περιλαμβάνει ενισχυτή του σήματος και όργανο αναγνώσεως. 54

Στην υπεριώδη περιοχή (160-340nm) χρησιμοποιείται η λυχνία εκκενώσεως δευτερίου, ενώ στην ορατή (340-800nm) λυχνία πυρακτώσεως βολφραμίου, στην οποία σπείραμα από σύρμα βολφραμίου, ευρισκόμενο σε γυάλινο περίβλημα, πυρακτώνεται με ηλεκτρικό ρεύμα και φωτοβολεί. Για να αποφευχθεί απόθεση του βολφραμίου στα τοιχώματα της λυχνίας και επομένως ελάττωση της διαπερατότητας του περιβλήματος και του χρόνου ζωής της λυχνίας, προστίθεται μικρή ποσότητα ιωδίου σε χαμηλή πίεση, οπότε το σχηματιζόμενο σπείρωμα και τα άτομα του W επανατοποτίθενται σε αυτό. Η ακτινοβολία που εκπέμπεται από την πηγή κατευθύνεται μέσω κατόπτρων στο μονοχρωμάτορα, όπου ένα φράγμα περιθλάσεως μπλοκάρει τα μήκη κύματος που δεν είναι επιθυμητά, επιτρέποντας τη διέλευση μόνο της προεπιλεγμένης μονοχρωματικής ακτινοβολίας. Στη συνέχεια η δέσμη διχάζεται σε δύο τμήματα, ένα για το διάλυμα του δείγματος και ένα για το τυφλό ή διάλυμα αναφοράς. Καθεμία από τις δέσμες διέρχεται από μια κυψελίδα (που περιέχει το δείγμα και το τυφλό αντίστοιχα) όπου λαμβάνει χώρα απορρόφηση. Οι κυψελίδες είναι κατασκευασμένες από χαλαζία για μετρήσεις στην περιοχή του υπεριώδους ή από γυαλί είτε πλαστικό για μετρήσεις στο ορατό, έχουν συγκεκριμένο πάχος, συνήθως 1cm και θα πρέπει να δείχνουν την ίδια απορρόφηση όταν περιέχουν το ίδιο διάλυμα. Μετά τη διέλευσή τους από τις κυψελίδες, οι δέσμες κατευθύνονται προς τους αντίστοιχους ανιχνευτές για την μετατροπή του οπτικού σήματος σε ηλεκτρικό και την ενίσχυσή του. Ως ανιχνευτές χρησιμοποιούνται φωτοδίοδοι πυριτίου. Αυτοί αποτελούνται από ένα επίπεδο ηλεκτρόδιο Cu ή Fe, στο οποίο έχει αποτεθεί στρώμα ημιαγωγού, Si. Στην επιφάνεια του ημιαγωγού υπάρχει διαφανές μεταλλικό στρώμα Ag που δρα ως δεύτερο ηλεκτρόδιο (συλλέκτης). Όταν προσπίπτει ακτινοβολία στην επιφάνεια του ημιαγωγού, προκαλεί ροή ηλεκτρονίων από τον αγωγό προς το μεταλλικό στρώμα, το οποίο συνδέεται με εξωτερικό αγωγό και το κύκλωμα διαρρέεται από ασθενές ρεύμα 126. 2.6 Μαγνητομετρία Δονούμενου Δείγματος (VSM) H μαγνητομετρία δονούμενου δείγματος βασίζεται στο νόμο του Faraday. Ο νόμος αυτός ορίζει ότι το μέτρο της ηλεκτρεγερτικής δύναμης που επάγεται σε ένα κύκλωμα ισούται με το ρυθμό μεταβολής της μαγνητικής ροής που διαπερνά το κύκλωμα σε σχέση με το χρόνο. Στο VSM, ένα δείγμα το οποίο έχει μαγνητιστεί από ένα ομογενές μαγνητικό πεδίο ταλαντώνεται με ημιτονοειδή μορφή με ένα συγκεκριμένο πλάτος σύμφωνα με τα σταθερά πηνία ανίχνευσης. Το VSM το οποίο απεικονίζεται στο σχήμα 2.10 αποτελείται από έναν ηλεκτρομαγνήτη ο οποίος παράγει το μαγνητικό πεδίο (DC), έναν μηχανισμό δόνησης ο οποίος προκαλεί ταλάντωση του δείγματος στο μαγνητικό πεδίο, και στα πηνία ανίχνευσης, τα οποία παράγουν τάση εξαιτίας της αλλαγής της ροής η οποία πηγάζει από την ταλάντωση του δείγματος. Οι μετρήσεις οι οποίες λαμβάνονται δείχνουν τη μαγνητική ροπή ως συνάρτηση του πεδίου H. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των μαγνητικών ιδιοτήτων λεπτών υμενίων ή κρυσταλλικών συστημάτων όπως μαγνητικά οξείδια. Αυτό γίνεται εφαρμόζοντας μαγνητικό πεδίο ορισμένης έντασης σε συγκεκριμένη θερμοκρασία. Το VSM μετράει τη διαφορά της μαγνητικής επαγωγής ανάμεσα σε μία περιοχή που περιέχει και που δεν περιέχει το δείγμα. Μ αυτόν τον τρόπο παρέχει άμεση μέτρηση της μαγνήτισης Μ. Το δείγμα υποβάλλεται σε κίνηση κάθετη προς το εφαρμοζόμενο πεδίο μέσω ενός κινητήρα με στροφαλοφόρο άξονα. 55

Εναλλακτικά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα ηχείο, η δόνηση του οποίου να μεταβιβάζεται μηχανικά στο δείγμα. Κατά τη δόνηση του δοκιμίου μεταβάλλεται η μαγνητική επαγωγή και επάγεται ΗΕΔ στο πηνίο ανίχνευσης. Το πηνίο ανίχνευσης παραμένει στη θέση του και δεν ταλαντώνεται όπως το δοκίμιο. Από τις μετρήσεις αυτής της τάσης εξάγονται οι μαγνητικές ιδιότητες του δείγματος. Αξίζει να σημειωθεί ότι επάγεται και μια δεύτερη ΗΕΔ σε ένα παρόμοιο στατικό πηνίο αναφοράς, από ένα δοκίμιο αναφοράς που μπορεί να είναι ένας μικρός μόνιμος μαγνήτης ή ένας ηλεκτρομαγνήτης. Το δοκίμιο αναφοράς δονείται συγχρόνως με το δείγμα. Για τον λόγο αυτό η φάση και το πλάτος των δύο τάσεων είναι άμεσα συνδεόμενες μεταξύ τους. Το σήμα λήψης στο VSM είναι εναλλασσόμενο συγκεκριμένης συχνότητας και μετριέται μέσω ενισχυτή. Το VSM μπορεί να μετρήσει μαγνητικές ροπές τόσο μικρές όσο και 5x104 Am 2. Η ακρίβειά του είναι καλύτερη από 2% 132. Σχήμα 2.10: Σχηματική απεικόνιση VSM 132. 2.7 Θολερομετρία (Turbidimetry) Η Θολερομετρία (Turbidimetry) υπολογίζει της απώλειας έντασης του μεταδιδόμενου φωτός, που οφείλεται στην αλληλεπίδραση σωματίδια που αιωρούνται σε αυτό. Όσον το κολλοειδές παραμένει σταθερό η απορρόφηση επίσης παραμένει σταθερή. Εάν τα κολλοειδή σωματίδια αρχίσουν να συσσωματώνονται τότε είτε παρατηρείτε αύξηση της απορρόφησης λόγω αύξησης της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας από τα μεγαλύτερου μεγέθους συσσωματώματα, είτε μείωση της απορρόφησης εάν τα συσσωματώματα είναι πολύ μεγάλα και λαμβάνει χώρα καταβύθιση των σωματιδίων. Το φως διέρχεται μέσα από ένα φίλτρο δημιουργώντας μια φωτεινή ακτινοβολία γνωστού μήκους κύματος η οποία διαπερνά την κυψελίδα του δείγματος. Ένα φωτοηλεκτρικό κύτταρο συλλέγει το φως που περνά μέσα στην κυψελίδα. 133 (σχήμα 2.11). 56

Σχήμα 2.11. Χρωματόμετρο Vernier Colorimeter 134 Ο αισθητήρας του φωτόμετρου (σχήμα 2.12) περιέχει μια πηγή φωτός LED, η οποία εκπέμπει φώς που περνά μέσα από την κυψελίδα που βρίσκεται το δείγμα του διαλύματος. Ορισμένο εισερχόμενο φώς απορροφάται από το διάλυμα. Ως αποτέλεσμα, φως χαμηλότερης έντασης χτυπά μια φωτοδίοδο. Παρακάτω φαίνεται σχηματικά (σχήμα 2.12) η διάταξη: Σχήμα 2.12. Αισθητήρας χρωματομέτρου 134 Η λειτουργία του φωτόμετρου βασίζεται στο νόμο του Beer. Η ποσότητα του φωτός που περνά μέσα από ένα διάλυμα που είναι γνωστή ως διαπερατότητα Τ, με Ι ένταση. (εξίσωση 2.5) Η αντίστροφη λογαριθμικά ποσότητα της διαπερατότητας είναι η απορρόφηση: (εξίσωση 2.6) Το αντίστροφο της διαπερατότητας του δείγματος μεταβάλλεται λογαριθμικά σύμφωνα με την παρακάτω σχέση, όπου ε η μοριακή απορροφητικότητα, b η οπτική διαδρομή και C η μοριακή συγκέντρωση: Από τις παραπάνω σχέσεις βγαίνει: (εξίσωση 2.7) (εξίσωση 2.8) 57

Αυτός ο τύπος σημαίνει ότι το φως που απορροφάται από ένα διάλυμα εξαρτάται από την απορροφητική ικανότητα της διαλυμένης ουσίας, την απόσταση που διανύεται από το φως διαμέσου του διαλύματος, και την συγκέντρωση του διαλύματος. 2.8 Οπτοακουστική Τομογραφία Πολλαπλών Φασμάτων (Multi Spectral Optoacoustic Tomography-MSOT) Η οπτοακουστική απεικόνιση βασίζεται στην παραγωγή ακουστικών κυμάτων μετά από απορρόφηση φωτεινών παλμών υπερβραχείας διάρκειας. Το οπτοακουστικό (ή φωτοακουστικό) φαινόμενο είναι γνωστό για περισσότερο από έναν αιώνα ( 135 ), αλλά η χρήση του σε βιοϊατρικές εφαρμογές, όπως οι απεικονιστικές τεχνικές, έχει αποτελέσει αντικείμενο ενδιαφέροντος κατά τις τελευταίες δεκαετίες και, ακόμα εντονότερα, κατά τα τελευταία έτη. Η οπτοακουστική τομογραφία πολλαπλών φασμάτων (MSOT) βασίζεται στην φασματική ταυτοποίηση χρωμοφόρων μορίων και σωματιδίων που βρίσκονται διεσπαρμένα στον ιστό, έναντι της μη ειδική απορρόφησης του ιστού. Η αρχή λειτουργίας του MSOT περιγράφεται στο σχήμα 2.13. Σχήμα 2.13: Αρχή λειτουργίας του MSOT. (a) Το προς μελέτη δείγμα φωτοβολείται με παλμικό φως πολλαπλών μηκών κυμάτων, ισοκατανεμημένων στο χρόνο. (b) Η ταχεία απορρόφησης από τα στοιχεία του ιστού, έχει σαν αποτέλεσμα την δημιουργία ακουστικών κυμάτων μέσω του θερμοακουστικού φαινομένου, οι οποίες εν συνεχεία ανιχνεύονται από τους ακουστικούς ανιχνευτές. (c) Παλμοί διαφορετικών μηκών κύματος (οι οποίοι απεικονίζονται με πράσινη γραμμή στο σχήμα) επιλέγονται ώστε να στοχεύσουν την μετάβαση απορρόφησης του χρωμοφόρου ή του φθορίζοντος μορίου (με κόκκινη γραμμή απεικονίζεται το φάσμα απορρόφησης της φθορίζουσας πρωτεΐνης DsRed2). Ο ιστός ακτινοβολείται με φωτεινούς παλμούς εύρους διάρκειας 1-100ns, διαφορετικού μήκους κύματος ισοκατανεμημένων στο χρόνο. Τα μήκη κύματος επιλέγονται με τέτοιο τρόπο ώστε να αντιπροσωπεύουν ένα φασματικό χαρακτηριστικό του φωτοαπορροφητικού παράγοντα ενδιαφέροντος, όπως φαίνεται για παράδειγμα στο σχήμα 2.13c για την φθορίζουσα πρωτεΐνη DsRed2. Σε απόκριση της ταχείας απορρόφησης των φωτεινών παλμών από τους φωτοαπορροφητικούς παράγοντες, οι δεύτεροι υφίστανται μία θερμοελαστική διαστολή, που έχει σαν επακόλουθο την εκπομπή μηχανικών κυμάτων υπερηχητικών συχνοτήτων. Τα κύματα αυτά 58

είναι δυνατόν να ανιχνευθούν από ακουστικούς ανιχνευτές που τοποθετούνται κοντά στον φωτοβολούμενο ιστό. Με χρήση κατάλληλων μαθηματικών μεθόδων και αλγορίθμων, τα σήματα που συλλέγονται από τους ανιχνευτές μπορούν να αναλυθούν και να ανασυντεθούν με τελικό αποτέλεσμα την δημιουργία ανατομικών εικόνων. Η ένταση των παραγόμενων υπερηχητικών κυμάτων εξαρτάται από τις ιδιότητες της οπτικής απορρόφησης των φωτοαπορροφητικών παραγόντων. Η χωρική ανάλυση της μεθόδου, καθορίζεται από το όριο περίθλασης των υπερηχητικών κυμάτων και τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά του υπερηχητικού ανιχνευτή. Και ενώ η παραγωγή των ανατομικών εικόνων είναι δυνατή για κάθε μήκος κύματος, η ακτινοβόληση με πολλαπλά μήκη κύματος και η φασματική επεξεργασία απαιτούνται για την ταυτοποίηση της φασματικής ταυτότητας του κάθε οπτικού παράγοντα ενδιαφέροντος, παρουσία των ενδογενών χρωμοφόρων μορίων του ιστού. Η απλούστερη μορφή φασματικής επεξεργασίας είναι η αφαίρεση μεταξύ εικόνων που ελήφθησαν σε δύο παρακείμενα μήκη κύματος, υποθέτοντας ότι ο ιστός θα παρουσιάζει παρόμοια απορρόφηση στα δύο αυτά μήκη κύματος, και, ως αποτέλεσμα αυτού, η αφαίρεση θα απαλείψει την μη ειδική απορρόφηση και θα αναδείξει την κατανομή του παράγοντα ενδιαφέροντος. Η υπόθεση αυτή, έχει επιβεβαιωθεί σε ομοιώματα ιστού ομογενούς οπτικής απορρόφησης (phantoms) αλλά η εφαρμογή της in vivo μπορεί να είναι προβληματική, αφού οι ιστοί είναι γενικώς ετερογενείς δομές και η απορρόφηση τους εμφανίζει συνήθως διακριτά φασματικά προφίλ. Η κύριοι παράγοντες που συμβάλλουν στην ενδογενή απορρόφηση του ιστού είναι η οξυγονωμένη και μη αιμογλοβίνη και το νερό λόγω της μεγάλης συγκέντρωσης τους στους ιστούς. Η απορρόφηση αυτών των παραγόντων εμφανίζει ελάχιστο στο εγγύς υπέρυθρο όπως φαίνεται στο σχήμα 2.14 Ως εκ τούτου, οι παράγοντες που παρουσιάζουν απορρόφηση στο NIR διαφέρουν χαρακτηριστικά από την μη ειδική απορρόφηση του ιστού και μπορούν να εκμεταλλευτούν αυτό το στενό παράθυρο της φασματικής περιοχής αποτελώντας τους καταλληλότερους παράγοντες για MSOT απεικόνιση in vivo. Πιο συγκεκριμένα, τα μόρια ή τα νανοσωματίδια με απότομες αλλαγές στην απορρόφηση είναι ιδανικά για απεικόνιση MSOT, αφού μπορούν εν συνεχεία να αναλυθούν μέσω σάρωσης εντός στενών φασματικών ζωνών. Εφαρμόζοντας σάρωση σε διαφορετικές φασματικές ζώνες, καθίσταται δυνατή η ανάλυση πολλαπλών χρωμοφόρων μορίων ή νανοσωματιδίων κατά τη διάρκεια της ίδιας απεικονιστικής συνεδρίας. 59

Σχήμα 2.14: Το φάσμα απορρόφησης των κυριότερων ενδογενών παραγόντων απορρόφησης ιστών στην NIR περιοχή 2.9 Μαγνητοφόρηση Η κατευθυνόμενη κίνηση των μαγνητικών σωματιδίων λόγω της δράσης ενός μαγνητικού πεδίου καλείται μαγνητοφόρηση και έχει βρει τις πρώτες της εφαρμογές σε διάφορους τομείς κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του '70 και του '80. Ένας απλός μαγνήτης στην περιοχή δοκιμαστικού σωλήνα που περιέχει παραμαγνητικά σωματίδια, παράγει βαθμίδα μαγνητικού πεδίου της τάξης του 1T/m, το οποίο αρκεί για να παρατηρηθεί εύκολα η κίνηση της διασποράς των σωματιδίων. Φυσικά, αυτή η απλή διαδικασία μαγνητοφόρησης μπορεί να βελτιωθεί κατά πολύ. Η γενική ιδέα είναι βασισμένη στην παρατήρηση ότι οι ταχύτητες των μαγνητικών σωματιδίων είναι ανάλογες προς τη βαθμίδα μαγνητικού πεδίου. Η κίνηση των σωματιδίων κατά τη διάρκεια της μαγνητοφόρησης έχει μια σύνθετη, συλλογική συμπεριφορά, όπως επιβεβαιώνεται από άμεσες παρατηρήσεις με την βοήθεια μικροσκοπίου στην εργασία. 136 Η ταχύτητα ενός σωματιδίου v c, σε ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο είναι συνάρτηση της κινητικότητας m του σωματιδίου και της τοπικής ισχύος της δύναμης S m : v c = m S m (εξίσωση 2.7) Η τοπική ισχύς της δύναμης ορίζεται ως: S m = B2 2μ 0 (εξίσωση 2.8) Όπου B είναι η ένταση του μαγνητικού πεδίου και μ 0 η μαγνητική επιδεκτικότητα στο κενό 137. Η μαγνητοφόρηση είναι μια αντιστρέψιμη διαδικασία, καθώς όταν γίνει άρση του μαγνητικού πεδίου, η αρχική διασπορά ανακτάται με απλή ανακίνησή του δείγματος. Ο διαχωρισμός, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις απαιτήσεις του πειράματος και του περιβάλλοντος (υγρό, 60

εναιωρήματα, αίμα) στο οποίο λαμβάνει χώρα 138. Η πρόοδος της διαδικασίας διαχωρισμού μπορεί να παρακολουθείται ποσοτικά με μέτρηση της έντασης του φωτός που απορροφάται από το δείγμα. Όπως είναι γνωστό η μαγνήτιση ανά μονάδα όγκου ή μάζας ( Ms = Mnet ) εξαρτάται από την διάμετρο των νανοκρυσταλλιτών (και βέβαια από το υλικό) 90. Οπότε, δείγματα μαγνητικών κολλοειδών τα οποία αποτελούνται από νανοκρυσταλλίτες με παρόμοια διάμετρο και ανεξάρτητα από την εσωτερική τους οργάνωση (αν αποτελούνται δηλαδή από έναν ή περισσότερους πυρήνες) αναμένεται να έχουν και παρόμοια Ms (σχήμα 2.15a). Όταν όμως εξετάζονται μαγνητικά κολλοειδή εντός βαθμίδων μαγνητικών πεδίων, η κίνηση τους περιγράφεται από την εξίσωση 2.9: F = (V t M s )B (εξίσωση 2.9) Όπου, F η μαγνητική δύναμη που ασκείται στο μαγνητικό υλικό, Vt ο συνολικός όγκος του μαγνητικού υλικού που υπάρχει σε κάθε σωματίδιο (κολλοειδές), B η μαγνητική επαγωγή και Ms η μαγνήτιση κόρου. Από τα παραπάνω συνάγεται ότι η απόκριση των μαγνητικών κολλοειδών κατά την αλληλεπίδρασή τους με βαθμίδες μαγνητικών πεδίων, εξαρτάται και από τον όγκο του μαγνητικού υλικού Vt που συμμετέχει σε κάθε κολλοειδές (σχήμα 2.15b). Σχήμα 2.15: (a) Μαγνητικοί νανοκρυσταλλίτες ανεξάρτητοι μεταξύ τους και οργανωμένοι σε πλειάδα. (b) Δύναμη που δέχονται οι νανοκρυσταλλίτες σε βαθμίδα μαγνητικού πεδίου αναλόγως της οργάνωσής τους. 61

62

Κεφάλαιο 3 o 3 Πειραματικό μέρος 3.1 ΟΡΓΑΝΑ Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας (Mettler AE 166, Deltarange) Μηχανικός αναδευτήρας θερμοελεγχόμενη πλάκα (Wisestir) Μαγνητάκια Φυγόκεντρος (Κendro Laboratory Products, Biofuge pico-heraeus - 16000g max (13000 rpm)) Φυγόκεντρος (Kendro Laboratory Products, Megafuge 1.0R- Heraeus - 2000 g max (4000 rpm)) Φυγόκεντρος Micro 220 (30.000 g max (18000 rpm)) της εταιρίας Hettich Zentrifugen Λουτρό Υπερήχων (Branson, Bransonic ultrasonic 2510) ph-μετρο (WTW, ph 522) Μηχανικός αναδευτήρας vortex (A-100 Micrel) Tεχνική της θερμοσταθμικής ανάλυσης (TGA) (Q500 της TA Instrument) Zeta-sizer δυναμικός σκεδασμός φωτός (Malvern Nano-Zs, Malvern Instrument, UK) Φασματοφωτόμετρο, Spectrophotometer UV-Vis (Hitachi Digilab U-2800) Φθορισμόμετρο (Shimadzu, RF-5301 PC) Περίθλαση ακτίνων Χ (XRD) (Bruker D8 Advance) Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διερχόμενης δέσμης TEM (JEM-2100) Υδατόλουτρο ρυθμιζόμενης θερμοκρασίας (FS18) Μετρήσεις υπερθερμίας στο όργανο Magnetherm (Nanotherics, UK) Καταγραφέας δεδομένων Data Logger BK Precision Οπτοακουστικές μετρήσεις στο σύστημα MSOT invision 256-TF της εταιρίας ithera Medical. 3.2 Αντιδραστήρια Επτά-ένυδρος θειϊκός σίδηρος (FeSO4 x7h2o) (Chem Lab NV) Έξα-ένυδρος τριχλωριούχος σίδηρος (FeCl3 x6h2o) (Sigma-Aldrich) Υδροχλωρικό οξύ (HCl) 37% ( Carlo Erba ) Χλωριούχο νάτριο (NaCl) από την Merck Chemicals Αλγινικό Νάτριο χαμηλού ιξώδους από καφέ φύκι, (Sigma-Aldrich) Δισκία υδροξειδίου νατρίου (ΝaOH) από την Merck Chemicals Υδατικό διάλυμα αμμωνίας NH4OH (30%) από την Carlo Ebra Doxorubicin, από την EBEWE Pharma G.m.b.H. Δισυσταδικό συμπολυμερές μεθόξυ-πολύ(αιθυλενογλυκόλης)-b-πολύ(τριφθόρο-ακέτυλο L- λυσίνη) (Alabama Polymers) 63

Ισότονο Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, PBS: Σε 1L περιέχονται: NaH2PO4 (δισόξινο φωσφορικό νάτριο) 1,44gr; KH2PO4 (δισόξινο φωσφορικό κάλιο) 0,24gr; NaCl (χλωριούχο νάτριο) 8gr; KCl (χλωριούχο κάλλιο) 0,2gr. MTT (3-(4,5 Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma Aldrich) Πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM (Sigma Aldrich) για την κυτταρική σειρά MDA-MB-231. 3.3 Σύνθεση μαγνητικών κολλοειδών Υδρολυτική αλκαλική καταβύθιση μίας πρόδρομης ένωσης σιδήρου Η μέθοδος που ακολουθήθηκε για την σύνθεση του μαγνητικού κολλοειδούς ήταν η υδρολυτική αλκαλική καταβύθιση μιας πρόδρομης ένωσης σιδήρου 89 για τον σχηματισμό των μαγνητικών νανοκρυσταλλιτών, παρουσία του πολυμερούς αλγινικού νατρίου σαν επιφανειακού τροποποιητή. Πιο συγκεκριμένα, η πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: Σε 10 ml νερού διαλύονται 720 mg άλατος ένυδρου δισθενούς σιδήρου (FeSO4x7H2O) προσθέτοντας 30 μl πυκνό υδροχλώριο (HCl, 37%), παράλληλα σε σφαιρική φιάλη με 30 ml νερό διαλύονται, υπό μαγνητική ανάδευση, 150 mg αλγινικού νατρίου (Alginate) και στη συνέχεια προστίθεται μία ποσότητα υδροξειδίου του αμμωνίου (1-4 ml NH3). Στη συνέχεια τα δύο διαλύματα αναμιγνύονται υπό θέρμανση και μαγνητική ανάδευση με αρχική θερμοκρασία τους 30 ο C. Στα πρώτα 15-20 λεπτά της αντίδρασης η θερμοκρασία αυξανόταν σταδιακά μέχρι τους 50 ο C όπου και παρέμενε σταθερή καθ όλη την διάρκεια της αντίδρασης. Μετά από 80 λεπτά η αντίδραση λάμβανε τέλος. Η σφαιρική φιάλη απομακρυνόταν από την εστία και το προϊόν αφηνόταν να έρθει σε θερμοκρασία δωματίου. Σε αυτό το σημείο παρατηρήθηκε η μαγνητική απόκριση των ρευστών με μόνιμους μαγνήτες χειρός Nd-Fe-B. Στη συνέχεια το κολλοειδές, καθαρίζεται μέσω φυγοκεντρήσεων με σκοπό τον διαχωρισμό των τροποποιημένων νανοκρυσταλλιτών από τα παραπροϊόντα της αντίδρασης (πολυμερές που δεν αντέδρασε και ελεύθερα ιόντα) τα οποία μένουν στο υπερκείμενο. Αρχικά το προϊόν μοιράστηκε σε 20 φιαλίδια των 2ml και φυγοκεντρήθηκε για 30 λεπτά στις 13000 rpm (Heraeus, Biofuge pico, RCF= 11000 g ή 13000 rpm). Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης η υπερκείμενη φάση απορρίπτεται και το ίζημα συλλέγεται από τα φιαλίδια και επεναδιασπείρεται στην μισή ποσότητα νερού (20 ml H2O). Σε αυτή τη φάση της σύνθεσης μετρήθηκε η αγωγιμότητα του υπερκειμένου η οποία ήταν περίπου ~ 15 ms/cm. Στη συνέχεια ακολούθησε μαγνητική ανάδευση για 20 λεπτά και λουτρό υπερήχων για 15 λεπτά με σκοπό να μειωθούν τα συσσωματώματα που δημιουργήθηκαν από την φυγοκέντρηση (αγωγιμότητα ~ 2 ms/cm). Η διαδικασία της έκπλυσης επαναλαμβάνεται με μία δεύτερη φυγοκέντρηση στις 13000 rpm (~11000g) για 20 λεπτά με σκοπό την καλύτερη απομάκρυνση των παραπροϊόντων. Μετά το τέλος της δεύτερης φυγοκέντρησης ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία με επαναδιασπορά του ιζήματος σε νερό (20 ml Η2Ο), μαγνητική ανάδευση για 20 λεπτά και λουτρό υπερήχων για 15 λεπτά. Σε αυτό το σημείο μετά από την διαδικασία των εκπλύσεων η αγωγιμότητα του κολλοειδούς είχε μειωθεί σε ~ 0,4 ms/cm. Μία επιπλέον ήπια φυγοκέντρηση του κολλοειδούς ακολουθούσε για 30 λεπτά στις 4000 rpm (Kendro Laboratory Products, Megafuge 1.0R- Heraeus 64

4000 rpm ή 2100 g) με σκοπό την απομάκρυνση των μεγαλύτερων συσσωματωμάτων από το κολλοειδές, τα οποία καταβυθίζονταν στα φιαλίδια μετά το τέλος της φυγοκέντρησης. Στη συνέχεια, απομονώθηκε το μεγαλύτερο μέρος της υπερκείμενης φάσης από τα φιαλίδια και το κολλοειδές αποθηκευόταν στο ψυγείο (στους 7 ο C) για περαιτέρω χρήση (αγωγιμότητα ~ 0,4 ms/cm). Στο σχήμα 3.1 φαίνεται σχηματικά η παρασκευή του μαγνητικού κολλοειδούς. Σχήμα 3.1: Σχηματική απεικόνιση της συνθετικής πορείας των νανοκολλοειδών. Με την ίδια ακριβώς μέθοδο έγινε η σύνθεση και του υβριδικού κολλοειδούς MagP(MAAg-EGMA) (το οποίο για το υπόλοιπο κείμενο θα αναφέρεται με την κωδική ονομασία MagP) με βάση τη βιβλιογραφία 139. Η παρασκευή αυτού του υλικού έγινε για λόγους σύγκρισης με τα υπόλοιπα προϊόντα της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής. Κωδική ονομασία Πίνακας 3.1: Περιγραφή προϊόντων και συντομογραφιών τους Χαρακτηριστικά MagAlg MagP Πρόδρομη ένωση σιδήρου FeSO 4 x7h 2O Επιφανειακός τροποποιητής Αλγινικό νάτριο Η σύνθεση οδηγεί σε υβριδικά κολλοειδή τύπου πλειάδων πυκνής δομής. Επανάληψη σύνθεσης από βιβλιογραφία 139 (κατ' αντιστοιχία με την παρούσα σύνθεση, η οποία οδηγεί σε υβριδικά κολλοειδή τύπου πλειάδων χαλαρής δομής, με κρυσταλλίτες μεγέθους ~13 nm. 65

3.3.1 Σχόλια επί της σύνθεσης Κατά την διάρκεια της σύνθεσης, ο σχηματισμός μαγκεμίτη ή/και μαγνητίτη πραγματοποιείται μετά από τον αρχικό σχηματισμό πράσινων υδροξειδίων του σιδήρου (και όξο-υδροξειδίων) μέσω αντιδράσεων υδρόλυσης, αφυδάτωσης και συμπύκνωσης. Μία απλοποιημένη πορεία της διαδικασίας θα μπορούσε να περιγραφεί ως ακολούθως: Fe +2 + 2OH - + xh 2 O Fe II (OH) 2 (H 2 O) x αφυδάτωση, συμπύκνωση 2Fe II (OH) 2 (H 2 O) x + O 2 Fe 2 III O 3 + (2x+1)H 2 O + 2OH - Κατά την διάρκεια της ανάπτυξης των νανοκρυσταλλιτών οι καρβοξυλομάδες του αλγινικού νατρίου αλληλεπιδρούν με τα ιόντα σιδήρου της επιφάνειας των μαγνητικών νανοκρυσταλλιτών. Αυτού του τύπου η αλληλεπίδραση έχει μελετηθεί και επιβεβαιωθεί σε προηγούμενες μελέτες 90. Το αλγινικό νάτριο προέρχεται από το αλγινικό οξύ (alginic acid), το οποίο είναι ένας γραμμικός ανιοντικός πολυσακχαρίτης. Είναι ένα τυχαίο συμπολυμερές του L- γλουρονικού οξέος (L-glouronic acid, G) και του D μανουρονικού οξέος (D-mannuronic acid, M) (σχήμα 3.2). Η διαμόρφωσή του περιλαμβάνει επαναλαμβανόμενα τμήματα με ομάδες M ή G και τυχαία τμήματα όπως MG, MMG, MGM, MGG και GMG. Τα άλατα αυτού του πολυσακχαρίτη ονομάζονται αλγινικά άλατα ή alginates. Σχήμα 3.2: Μοριακή δομή αλγινικού οξέος 3.4 Διαδικασία ηλεκτροστατικής σύμπλεξης MagAlg με διπλά υδρόφιλα δισυσταδικά συμπολυμερή Στο δεύτερο στάδιο της διπλωματικής εργασίας επιχειρήθηκε η σταθεροποίηση των νανοφορέων MagAlg μέσω της ηλεκτροστατικής σύμπλεξης των ανιοντικών καρβοξυλομάδων του αλγινικού (με το οποίο είχε γίνει η επιφανειακή τροποποίηση των μαγνητικών νανοσωματιδίων) με διπλά υδρόφιλα πολύ-κατιοντικά συμπολυμερή πολύ(αιθυλενογλυκόλης). Η πορεία της σύνθεσης του MagAlg και της ηλεκτροστατικής του σύμπλεξης αναπαρίσταται στο σχήμα 3.3. 66

Σχήμα 3.3: Σχηματική αναπαράσταση της συνθετικής πορείας του (1) MagAlg και (2) της ηλεκτροστατικής σύμπλεξης του MagAlg με πολύ-κατιοντικά PEG συμπολυμερή. Τα συμπολυμερή που χρησιμοποιήθηκαν για αυτό το σκοπό ήταν: Ένα διπλά υδρόφιλο συμπολυμερές αποτελούμενο από PEG σαν την ουδέτερη υδατοδιαλυτή συστάδα και μία δεύτερη συστάδα κατιοντικού πολύ-ηλεκτρολύτη βασισμένη σε παράγωγα πολύ(υδρόξυ-στυρενίου) τα οποία παρασκευάσθηκαν από συνεργάτες σύμφωνα με προηγούμενη εργασία 140. Το δεύτερο ήταν ένα εμπορικά διαθέσιμο δισυσταδικό συμπολυμερές πολύ(λυσίνης)-peg) με την κωδική ονομασία mpeg-b-plkf [methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(llysine trifluoroacetate)] Η μοριακή δομή των πολυμερών φαίνεται στο σχήμα 3.4. Σχήμα 3.4: Μοριακή δομή του (a) QNPHOS-PEG και του (b) PLL-b-PEG Πίνακας 3.2: Μοριακά χαρακτηριστικά των PEG κατιοντικών συμπολυμερών PEG-πολυμερές Mw x 10 3 % wt PEG Q-N-PHOS-PEG 62.7 14 PLL-b-PEG 7.4 67.5 Μετά από αρκετές δοκιμές και μελέτη ποικίλων παραμέτρων καθορίστηκε το τελικό πρωτόκολλο για την επιτυχή ηλεκτροστατική σύμπλεξη ως εξής: 67

Απορρόφηση στα 510nm Αρχικά γίνεται προ-ρύθμιση του υδατικού διαλύματος των συμπολυμερών (~2% w/v) σε ph 7.4 Στη συνέχεια πραγματοποιείται απλή ανάμιξη μέσω της (όσο το δυνατό πιο ακαριαίας) προσθήκης του πολυμερικού διαλύματος στο διάλυμα MagAlg. Η σειρά προσθήκης παίζει καθοριστικό ρόλο στην επιτυχή σύμπλεξη. Ακολουθεί ελαφριά ανακίνηση των δειγμάτων και στη συνέχεια αφήνονται σε ηρεμία για 24 ώρες. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας σύμπλεξης ακολουθεί μία πλύση μέσω φυγοκέντρησης και επαναδιασποράς σε απιονισμένο νερό με τη χρήση vortex προκειμένου να απομακρυνθεί η περίσσεια πολυμερούς. Η επιτυχής σύμπλεξη αξιολογήθηκε μέσω της σταθερότητας των κολλοειδών σε διαλύματα αυξημένης ιονικής ισχύς. 3.5 Τεχνικές χαρακτηρισμού μαγνητικών νανοφορέων Προσδιορισμός ιόντων σιδήρου μέσω φασματοφωτομετρίας: Η περιεκτικότητα σε Fe +2 του μαγνητικού κολλοειδούς προσδιορίστηκε φασματοφωτομετρικά μέσω της σύμπλεξής τους με την 1,10 φαινανθρολίνη (το φασματοφωτόμετρο που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Hitachi Digilab U-2800). 100 μl από το κολλοειδές αναμίχθηκαν με 200 μl πυκνού υδροχλωρίου (HCl 37%) με σκοπό να διαλυθούν πλήρως τα μαγνητικά νανοσωματίδια σε ιόντα σιδήρου. Ύστερα από 20 λεπτά, το δείγμα έγινε κίτρινο και αραιώθηκε σε νερό, με την χρήση ογκομετρικής φιάλης. Σε 1 ml αυτού του διαλύματος προστέθηκαν 100 μl υδροχλωρικής υδροξυλαμίνης (NH2OH HCl) (100 g / L), για αναγωγή του σιδήρου, και στη συνέχεια 1 ml 1,10- φαινανθρολίνης (1g / L) και 1 ml CH3COONa (1.2 M) προστέθηκαν στο διάλυμα, το οποίο αραιώθηκε με νερό σε τελικό όγκο 10 ml, και μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα στα 510 nm. Η αντίδραση που γίνεται είναι η εξής: 4Fe 3+ + 2NH2OH 4Fe 2+ + N2O + 4H + + H2O (αντίδραση 3.1) Η συγκέντρωση σιδήρου υπολογίστηκε μέσω πρότυπης καμπύλης (σχήμα 3.5) που είχε κατασκευαστεί προηγουμένως από άνυδρο FeCl2. Με βάση το Fe+2, η συγκέντρωση των διαλυμάτων αναφέρεται ως wt % σε Fe2O3. 0.8 Πρότυπη καμπύλη συγέντρωσης σιδήρου με τη μέθοδο φαινανθρολίνης 0.6 0.4 0.2 0 y = 0.1949x + 0.0009 R² = 0.9999 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 ppm σιδήρου Σχήμα 3.5: Πρότυπη καμπύλη για τον προσδιορισμό συγκέντρωσης σιδήρου μέσω φαιναφθρολίνης και οξικού οξέος 68

Δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS): Η υδροδυναμική διάμετρος των σωματιδίων μετρήθηκε σε σύστημα της εταιρίας Malvern (Nano Zeta Sizer) εφοδιασμένο με λέιζερ He-Ne 4mW μήκους κύματος λ=633 nm. Χρησιμοποιεί μία φωτοδίοδο ως ανιχνευτή και η σκεδαζόμενη ακτινοβολία μετριέται σε γωνία 173 ο. Οι μετρήσεις DLS πραγματοποιήθηκαν σε αραιωμένα διαλύματα των νανοφορέων (~0,015% w/v σε Fe2O3). Όπου ήταν αναγκαίο είχε πραγματοποιηθεί προ-ρύθμιση του ph και της συγκέντρωσης [NaCl] στις επιθυμητές τιμές. Τα δείγματα μετρήθηκαν μετά από 24 h, ώστε να έρθουν σε ισορροπία. Οι αναφερόμενες υδροδυναμικές διάμετροι είναι ο μέσος όρος τριών μετρήσεων (n=3), κάθε μία από τις οποίες είναι το αποτέλεσμα 12 διαγραμμάτων αυτοσυσχέτισης και προσαρμογών. ζ-δυναμικό και ηλεκτροκινητικές μετρήσεις (ζ-potential, ζp): Οι ηλεκτροκινητικές μετρήσεις για τον προσδιορισμό της κινητικότητας και των τιμών ζp των κολλοειδών, πραγματοποιήθηκαν με το ίδιο όργανο με χρήση της LDV (Laser Doppler velocimetry) και με την προσέγγιση κατά Smoluchowski. Οι αναφερόμενες τιμές ζp είναι το άθροισμα 50 μετρήσεων. Περίθλαση ακτίνων Χ: Η ανάλυση μέσω περίθλασης ακτίνων-χ πραγματοποιήθηκε σε ένα περιθλασίμετρο Bruker D8 Advance με φίλτρο νικελίου (Ni) και ακτινοβολία CuKa (1,54 Å), στο Τμήμα Γεωλογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Ως δειγματοφορέας χρησιμοποιήθηκε πλακίδιο Si. Μία επαρκής ποσότητα δείγματος ~ 1ml τοποθετήθηκε στην επιφάνεια του δειγματοφορέα και παρέμεινε σε ηρεμία ~24 ώρες ώστε να εξατμιστεί το νερό και να σχηματιστεί ένα λεπτό υμένιο στην επιφάνεια του μονοκρυστάλλου Si του δειγματοφορέα. Μετά από αυτή την προετοιμασία το δείγμα τοποθετήθηκε εντός του περιθλασιμέτρου για ανάλυση. Θερμοσταθμική Ανάλυση (Thermo Gravimetric Analysis, TGA): Οι μετρήσεις θερμοσταθμικής ανάλυσης (TGA) πραγματοποιήθηκαν με την χρήση του οργάνου Q500 της TA Instruments. H θερμοκρασία αυξανόταν με ταχύτητα 10 ο C/min από τους 20 ο C μέχρι τους 110 ο C όπου και παρέμενε σταθερή για 30 λεπτά για την απομάκρυνση της υγρασίας. Στη συνέχεια αυξανόταν πάλι με ταχύτητα 10 ο C/min μέχρι τους 700 ο C όπου και παρέμενε σταθερή για 5 λεπτά. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν υπό ροή αζώτου (Ν2 flow). Πρώτα μελετήθηκε το αλγινικό νάτριο με σκοπό να προσδιοριστεί η υπολειμματική του μάζα. Έχοντας αυτό ως δεδομένο, προσδιορίστηκε τελικώς το ποσοστό του πολυμερούς που είχε συνδεθεί με την επιφάνεια των νανοφορέων. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (Transmission electron microscopy, ΤΕΜ): Τα μικρογραφήματα ΤΕΜ ελήφθησαν με την χρήση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διέλευσης της εταιρίας JEOL, μοντέλο JEM-2100, χρησιμοποιώντας δυναμικό επιτάχυνσης 200 kv. Τα δείγματα για ΤΕΜ, προετοιμάστηκαν ρίχνοντας μία σταγόνα αραιωμένου κολλοειδούς (0,01% w/v σε Fe2O3) των νανοφορέων σε δειγματοφορείς χαλκού καλυμμένων με υμένιο άνθρακα (formvar). Θολερομετρία: Για τις μετρήσεις θολερομετρίας χρησιμοποιήθηκε το χρωματόμετρο COL-BTA της εταιρίας Vernier Colorimeter. Για τις μετρήσεις σε διαλύματα υψηλής ιονικής ισχύς προετοιμάστηκαν δείγματα τελικού όγκου 2 ml συγκέντρωσης 0.01% w/v Fe2O3 και [NaCl] 69

0.3M. Αμέσως μετά την προσθήκη NaCl ξεκινούσε η καταγραφή της οπτικής απορρόφησης του διαλύματος στα 470 nm, η καταγραφή διαρκούσε 3000 sec. Για την μελέτη σταθερότητας σε διαλύματα DOX η καταγραφή της απορρόφησης έγινε στα 430 nm λόγω της ισχυρής απορρόφησης που παρουσιάζει η DOX στην περιοχή των 480 nm. Μαγνητοφόρηση: Οι μετρήσεις μαγνητοφόρησης πραγματοποιήθηκαν με την χρήση του φασματοφωτομέτρου Hitachi Digilab U-2800 και με την εφαρμογή ενός μαγνήτη χειρός Nd-Fe- B (διαστάσεις: διάμετρος = 20 mm, πάχος = 10 mm) δίπλα στην κυψελίδα που περιείχε το προς μέτρηση δείγμα. Τα κολλοειδή μετρήθηκαν σε συγκέντρωση (0,0125 % w/v) σε Fe2O3. Το μήκος κύματος ρυθμίστηκε στα 450 nm και η απορρόφηση καταγράφηκε για ~2h, παίρνοντας μετρήσεις κάθε 100 sec. Η μείωση στην απορρόφηση που εμφανίζεται κατά την διάρκεια της μέτρησης συνδέεται με την μείωση της συγκέντρωσης του μαγνητικού υλικού εντός της κυψελίδας λόγω της παρουσίας του μαγνήτη. Όσο πιο απότομη είναι η εν λόγω μείωση (η κλίση της καμπύλης δηλαδή), τόσο μεγαλύτερη είναι η ταχύτητα των σωματιδίων που έλκονται από το μαγνητικό πεδίο. Ποσοτικά, όσο μεγαλύτερη είναι η απόλυτη τιμή της κλίσης, τόσο μεγαλύτερη είναι η απόκριση υπό την επίδραση του μαγνητικού πεδίου. Καλύτερη ακρίβεια επιτυγχάνεται υπολογίζοντας τον δείκτη Μ.Α.Ι. (Magnetophoresis Absorbance Index) από τη σχέση: M. A. I = ABS i ABS f ABS i (εξίσωση 3.0) όπου ABSi η απορρόφηση μετά από 2000 sec και ABSf η απορρόφηση μετά από 6000 sec. Η επεξεργασία αυτή γίνεται ώστε να μπορούν να συγκριθούν τα αποτελέσματα με ασφάλεια καθώς διαφορές στον συντελεστή απορρόφησης κάθε δείγματος επηρεάζουν την κλίση της καμπύλης. Μαγνητική Υπερθερμία: Οι μετρήσεις μαγνητικής υπερθερμίας πραγματοποιήθηκαν σε δείγματα όγκου 1ml και διαφόρων συγκεντρώσεων Fe2O3 με τη χρήση του οργάνου Magnetherm της εταιρίας Νanotherics. Τα δείγματα μεταφέρονταν γυάλινα φιαλίδια των 2ml και μετά την θερμοστάτηση τους στην επιθυμητή θερμοκρασία με λουτρό νερού, τοποθετούνταν σε ειδικά διαμορφωμένα δοχεία τα οποία είχαν μονωθεί θερμικά με αφρό πολυουρεθάνης προκειμένου να ελαχιστοποιηθούν οι απώλειες θερμότητας προς το περιβάλλον. Το όργανο είχε ρυθμιστεί ως εξής: Ένταση μαγνητικού πεδίου: Β=25mT συχνότητα: f =109,9 khz ένταση ρεύματος: I= 13,6 A τάση: V=28,8 V χωρητικότητα πυκνωτή: C=200μF. Κατά την διάρκεια της μέτρησης γινόταν συνεχής καταγραφή της θερμοκρασίας μέσω θερμοζεύγους τύπου Κ συνδεδεμένο με καταγραφέα δεδομένων (data logger) της εταιρίας BK Precision. Η επεξεργασία των δεδομένων γινόταν με την χρήση του προγράμματος Origin 8.0. Αρχικά γινόταν η γραφική σχεδίαση της καμπύλης T(t) (σχήμα 3.6a), στη συνέχεια ακολουθούσε η κατάλληλη προσαρμογή της καμπύλης (σχήμα 3.6b). Ύστερα από δοκιμές διαπιστώθηκε ότι η εκθετική προσαρμογή που περιέγραφε καλύτερα την συμπεριφορά της καμπύλης T(t) ήταν η συνάρτηση Εκθετικής συσχέτισης (Exponential Association) 141. Ακολουθούσε η παραγώγιση της 70

καμπύλης προσαρμογής (σχήμα 3.6c) η οποία αντιστοιχούσε στον ρυθμό αύξησης της θερμοκρασίας (δηλ της κλίσης) και με βάσει την τιμή της κλίσης της καμπύλης στα αρχικά στάδια της μέτρησης γινόταν ο υπολογισμός των τιμών SLP και ILP μέσω των εξισώσεων 3.1 και 3.2. SLP = Cv Vs dt dt ( 1 m ox ) (εξίσωση 3.1) όπου mox είναι η μαγνητική μάζα του υλικού η οποία είναι διεσπαρμένη σε μέσο ειδικής θερμοχωρητικότητας Cv, Vs ο όγκος του δείγματος και dt/dt ο ρυθμός αύξησης της θερμοκρασίας. Ο SLP καλείται και ως ειδικός συντελεστής απώλειας ενέργειας και περιγράφεται ως η ενέργεια της θέρμανσης ενός μαγνητικού υλικού ανά γραμμάριο. Ο ILP ορίζεται ως ο εγγενής συντελεστής απώλειας ενέργειας και δίνεται από την παρακάτω σχέση: ILP = SLP fh2 (εξίσωση 3.2) όπου f είναι η συχνότητα και H η ένταση εφαρμοζόμενου του μαγνητικού πεδίου. Σχήμα 3.6: Καμπύλες υπερθερμίας T(t) (a) πριν και (b) μετά την προσαρμογή δεδομένων. (c) Καμπύλη παραγώγισης για τον υπολογισμό του ρυθμού αύξησης θερμοκρασίας. Προσδιορισμός δέσμευσης και αποδέσμευσης φαρμάκου: Συγκεκριμένη και σταθερή ποσότητα νανοφορέα (υβριδικού κολλοειδούς), τοποθετήθηκε σε κυψελίδες με αυξανόμενη συγκέντρωση 71

Dox. Τα δείγματα παρέμειναν για 24 ώρες στους 37 o C και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν μαγνήτες χειρός στα τοιχώματα των κυψελίδων για το δεύτερο 24ώρο. Μετά από τον μαγνητικό διαχωρισμό των νανοφορέων συλλέχθηκε το υπερκείμενο και προσδιορίστηκε μέσω φασματοφωτομετρίας απορρόφησης και φθορισμού (σχημα 3.7), η ποσότητα του φαρμάκου που δεν είχε δεσμευτεί από τους νανοφορείς. Οι υπολογισμοί έγιναν με βάση πρότυπες καμπύλες που είχαν κατασκευαστεί πριν από την έναρξη κάθε πειράματος. Από το δεδομένο αυτό και γνωρίζοντας την αρχική ποσότητα του φαρμάκου που είχε προστεθεί υπολογίζεται η ποσότητα που τελικά προσροφήθηκε. Η τελική % wt δέσμευση του φαρμάκου από τους νανοφορείς υπολογίστηκε μέσω της παρακάτω σχέσης (εξίσωση. 3.3). Δέσμευση φαρμάκου % wt = μg (DOX) που δεσμεύθηκαν μg (νανοφορέα) (εξίσωση 3.3) Αντίστοιχα ο υπολογισμός της αποδοτικότητας δέσμευσης της DOX (entrapment efficient) έγινε μέσω της εξίσωσης (εξίσωση. 3.4). Απόδοση Δέσμευσης % = μg (DOX) που χορηγήθηκαν μg (DOX) που δεσμεύθηκαν (εξίσωση 3.4) Σχήμα 3.7: Πρότυπες καμπύλες για τον προσδιορισμό συγκέντρωσης του μη δεσμευμένου φαρμάκου. Η διαδικασία του προσδιορισμού αποδέσμευσης της DOX από τους νανοφορείς πραγματοποιήθηκε αμέσως μετά το πέρας της φόρτωσης. Μόλις έγινε ο μαγνητικός διαχωρισμός και απομακρύνθηκε το υπερκείμενο με την περίσσεια DOX οι νανοφορείς επαναδιασπάρθηκαν σε μικρή ποσότητα απιονισμένου H2O (~50 μl) και συλλέχθηκαν προκειμένου να μεταφερθούν εντός μεμβρανών διάλυσης που περιείχαν το εκάστοτε διάλυμα αποδέσμευσης (PBS, αλβουμίνη, κτλ). Στη συνέχεια οι μεμβράνες τοποθετούνταν εντός δοχείων με επαρκές διάλυμα αποδέσμευσης και ακολουθούσε δειγματοληψία σε διαφορά χρονικά σημεία για τον ποσοτικό προσδιορισμό της αποδέσμευσης DOX μέσω φθορισμομετρίας βάσει πρότυπης καμπύλης. Μετά από κάθε δειγματοληψία το εξωτερικό διάλυμα αποδέσμευσης ανανεωνόταν ώστε καθ όλη την διάρκεια συλλογής δεδομένων να υπάρχει βαθμίδα συγκέντρωσης του φαρμάκου εντός και εκτός της μεμβράνης αποδέσμευσης. Στη συνέχεια το αθροιστικό ποσοστό αποδέσμευσης υπολογιζόταν από την παρακάτω σχέση, όπου ι οι χρονικές στιγμές δειγματοληψίας. (Αποδέσμευση φαρμάκου % wt) ti = (εξίσωση 3.5) t i=1 (μg (DOX) που απόδεσμεύθηκαν) i μg (DOX) που είχαν δεσμευθεί 72

Κυτταρική καλλιέργεια MDA-MB-231: Η καλλιέργεια της κυτταρικής σειράς MDA-MB-231 (κυτταρική σειρά μεταστατικού καρκίνου του μαστού) έγινε σε φλάσκες με πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM (Sigma Aldrich) που περιέχει 10% FBS και πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη σε ατμόσφαιρα 5% CO2 στους 37 ο C. Μελέτη κυτταρό-τοξικότητας μέσω MTT: Μετά την ολοκλήρωση της καλλιέργειας τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε πλάκες 96 πηγαδίων όπου και παραμένουν για 24 ώρες με σκοπό την προσκόλληση τους στα τοιχώματα. Την επόμενη μέρα αφαιρείται το θρεπτικό μέσο και τα κύτταρα επωάζονται για τέσσερεις ώρες με 100 μl διαλύματος νανοφορέων αυξανόμενης συγκέντρωσης (n=3). Επίσης σε δύο ξεχωριστές σειρές πηγαδιών γίνεται προσθήκη διαλύματος 10% DMSO σαν αρνητικό control και θρεπτικό μέσο DMEM σαν θετικό control. Μετά από 4ωρη επώαση των κυττάρων με τα νανοσωματίδια, ακολουθεί μία πλύση των κυττάρων με 100 μl PBS που ακολουθείται από προσθήκη θρεπτικού μέσου DMEM. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάζονται για 5 μέρες στους 37C χωρίς αλλαγή του θρεπτικού μέσου. Έπειτα ακολουθεί υπολογισμός της βιωσιμότητάς τους μέσω της χρωματομετρικής μεθόδου MTT. Σε κάθε κυψελίδα τοποθετούνται 50μl διαλύματος ΜΤΤ (5mg/ml), το οποίο μετατρέπεται σε κρυστάλλους φορμαζάνης από μιτοχονδριακά ένζυμα, μόνο όταν το κύτταρο βρίσκεται σε φυσιολογική κατάσταση και ακολουθεί επώαση για 2 ώρες για τον σχηματισμό των κρυστάλλων. Στη συνέχεια το θρεπτικό μέσο αναρροφάται με αντλία κενού και σε κάθε κυψελίδα προστίθενται 200μl DMSO για την διάλυση των κρυστάλλων φορμαζάνης. Η μετατροπή του ΜΤΤ σε κρυστάλλους φορμαζάνης είναι ένδειξη της φυσιολογικής κατάστασης των κυττάρων. Για τη διάλυση των κρυστάλλων μετά την προσθήκη του DMSO, γίνεται επώαση στους 37οC και ανάδευση. Ακολουθεί φωτομέτρηση στα 595 nm χρησιμοποιώντας microplate reader (Infinite 200 PRO, Tecan). Από τις οπτικές απορροφήσεις υπολογίζεται το επί τις εκατό ποσοστό βιωσιμότητας. Οπτοακουστική απεικόνιση μαγνητικών νανοφορέων μέσω MSOT Πειράματα Phantom: Κυλινδρικά phantom διαμέτρου 2 cm παρασκευάστηκαν από γέλες περιεκτικότητας 1.3% w/w σε αγαρόζη και 6% v/v γαλακτώματος intralipid. Λεπτά πλαστικά σωληνάρια που περιείχαν το δείγμα τοποθετήθηκαν στην μέση των phantom μάζι με ένα πλαστικό σωληνάριο που περιείχε μαύρη μελάνη οπτικής πυκνότητας 0.2 ως δείγμα αναφοράς της έντασης των μετρήσεων. Η απεικόνιση πραγματοποιήθηκε στο εγκάρσιο επίπεδο σε σταθερή θέση περίπου στην μέση των phantom. Για την λήψη δεδομένων τα δείγματα ακτινοβολήθηκαν με nanosecond παλμούς laser από τα 680 έως τα 900 nm σε βήματα των 5 nm. Το τελικό αποτέλεσμα είναι ο μέσος όρος 20 ακτινοβολήσεων ανά μήκος κύματος in vivo πειράματα: Όλες οι διαδικασίες αναφορικά με τον χειρισμό των πειραματόζωων έγιναν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του Ινστιτούτου Βιολογικής και Ιατρικής Απεικόνισης (IBMI) Μονάχου και τους νόμους που θέτει η κυβέρνηση της άνω Βαυαρίας. Τα καρκινικά μοντέλα ζώων που χρησιμοποιήθηκαν βασίστηκαν στην ανάπτυξη αλλομοσχευμάτων καρκινικού όγκου τύπου 4Τ1 142 (επιθετικός τύπος καρκίνου του μαστού) σε 8 εβδομάδων θηλυκά ποντίκια τύπου Athymic Nude-Foxn1. Η απεικόνιση των ζώων έγινε όταν η ανάπτυξη των καρκινικών όγκων έφτασε περίπου τα 8 mm σε διάμετρο. Πριν την απεικόνιση πραγματοποιήθηκε ενδοφλέβια χορήγηση των 73

νανοφορέων (σχήμα 3.8) (συγκέντρωσης 4% w/v Fe2O3 σε ~100 μl PBS) και κατόπιν απεικόνιση του όγκου κατά τις χρονικές στιγμές των 5 λεπτών, μίας ώρας και τεσσάρων ωρών μετά το πέρας της χορήγησης. Για τα πειράματα μαγνητικής στόχευσης τοποθετήθηκε ισχυρός μαγνήτης χειρός Nd-Fe-B εφαπτομενικά στον όγκο κατά την διάρκεια της χορήγησης και στις αναμονές των μετρήσεων (εικόνες 3.8). Σχήμα 3.8: Ποντίκι τύπου Athymic Nude FOXN1, στην δεξιά πλευρά της λεκάνης διακρίνεται ο όγκος ~8 mm τύπου 4T1 που έχει αναπτυχθεί καθώς και ο καθετήρας που έχει τοποθετηθεί στην πλάγια ουραία φλέβα για την χορήγηση των μαγνητικών νανοσωματιδίων Σχήμα 3.9: Τοποθέτηση του μαγνήτη ακριβώς δίπλα από τον όγκο μετά την χορήγηση των μαγνητικών νανοσωματιδίων 74

Κεφάλαιο 4 o 4 Ανάλυση και επεξεργασία αποτελεσμάτων 4.1 Φυσικοχημικές ιδιότητες συντιθέμενων νανοφορέων Ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των συστημάτων MagP 139 και MagAlg 119 έχει πραγματοποιηθεί σε μεγάλο βαθμό σε προγενέστερες εργασίες, για λόγους όμως πληρότητας κρίνεται σκόπιμο να γίνει μία σύντομη αναφορά και σύγκριση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων του κάθε συστήματος. Η σύνθεση και των δύο συστημάτων γίνεται μέσω της υδρολυτικής αλκαλικής καταβύθισης μίας πρόδρομης ένωσης σιδήρου σε ήπιες συνθήκες (ατμοσφαιρική πίεση, θερμοκρασία σύνθεσης ~ 50 ο C) παρουσία διαφορετικών επιφανειακών τροποποιητών. Τα δύο συστήματα παρουσιάζουν παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες (μέγεθος μαγνητικού νανοκρυσταλλίτη, μέγιστη μαγνήτιση μάζας, υδροδυναμική διάμετρο, κτλ. βλ. σχήμα 4.1 και πίνακα 4.1) με την σημαντική τους διαφορά να εστιάζεται στην εσωτερική τους οργάνωση όπως αυτή αποκαλύπτεται από τα μικρογραφήματα TEM του σχήματος 4.1d,e και f. Σχήμα 4.1: (a) Διαγράμματα XRD νανοφορέων MagAlg και MagP, στο διάγραμμα έχει προστεθεί και το φάσμα XRD ενός δείγματος MagAlg 6nm από συγκαταβύθιση για λόγους σύγκρισης. Bρόγχοι υστέρησης των μαγνητικών νανοφορέων σε (b) θερμοκρασία δωματίου και (c) 5Κ. Μικρογραφήματα TEM των (d) MagP και (e) MagAlg. (f) Μικρογράφημα HRTEM όπου φαίνεται η ανάπτυξη κρυστάλλων ίδιου κρυσταλλικού προσανατολισμού. 75

Εκεί γίνεται εμφανές ότι η παρουσία του αλγινικού κατά την διάρκεια της σύνθεσης των μαγνητικών νανοσωματιδίων έχει οδηγήσει στον σχηματισμό πλειάδων πυκνής διάταξης. Σε αυτή την διαμόρφωση ο κάθε νανοκρυσταλλίτης βρίσκεται πολύ κοντά με τον γειτονικό του οδηγώντας στον σχηματισμό μίας πλειάδας νανοκρυστάλλων οι οποίοι περιβάλλονται από πολυμερές. Μάλιστα αρκετοί από τους νανοκρυστάλλους κάθε πλειάδας έχουν αναπτυχθεί γύρω από το ίδιο κρυσταλλογραφικό επίπεδο. Αντίθετα στη διαμόρφωση πλειάδων χαλαρής διάταξης (όπως στην περίπτωση του MagP) οι νανοκρυσταλλίτες είναι περισσότερο διάσπαρτοι εντός των πλειάδων συνδεόμενοι μεταξύ τους μέσω πολυμερικών αλυσίδων. Ο σχηματισμός πλειάδων πυκνής διάταξης έχει ποικίλα οφέλη στις μαγνητικές ιδιότητες του κολλοειδούς. Από μελέτες μαγνητοφόρησης έχει γίνει φανερό ότι σε νανοφορείς πυκνής διάταξης μπορεί να εξασκηθεί μεγαλύτερη δύναμη από ότι σε αντίστοιχους χαλαρής δόμησης (έχοντας και οι δύο την ίδια υδροδυναμική διάμετρο) όταν βρεθούν σε βαθμίδες μαγνητικού πεδίου (σχήμα 4.2). Αυτό δίνει πλεονέκτημα σε νανοφορείς αυτού του τύπου για εφαρμογές μαγνητικής στόχευσης και in vivo καθοδήγησης μέσω μαγνητικών πεδίων. Στον πίνακα 4.1 συνοψίζονται οι σημαντικότερες φυσικοχημικές ιδιότητες των νανοφορέων. Σχήμα 4.2: Καμπύλες μαγνητοφόρησης των δειγμάτων MagAlg (πυκνής διάταξης) και MagP (χαλαρής διάταξης). Για λόγους σύγκρισης παρατίθεται και ένα δείγμα MagAlg με διάμετρο νανοκρυσταλλίτη 6 nm. Πίνακας 4.1 Φυσικοχημικές ιδιότητες MagAlg και MagP Μέσο μέγεθος Νανοκρυσταλλίτη <DXRD > (nm) Μαγνήτιση Κόρου ((Am 2 )/kg) Υδροδυναμική διάμετρος (nm) Δείκτης Μαγνητοφόρησης MagAlg 12,7 ± 1 83,5 83 ± 2 0,265 MagP 13,0 ± 1 85,6 85 ± 2 0,164 Με την συγκεκριμένη μέθοδο κρατώντας ορισμένες παραμέτρους σταθερές όπως την συγκέντρωση σε οξείδια του σιδήρου, το μέγεθος των MNPs και την υδροδυναμική διάμετρο, μπορούν να εξαχθούν συμπεράσματα για την επίδραση του τρόπoυ οργάνωσης των MNPs σε κάθε κολλοειδές σωματίδιο στον τρόπο απόκρισης των μαγνητικών νανοφορέων σε βαθμίδες μαγνητικών πεδίων. 76

4.2 Μελέτη υπερθερμίας Η ικανότητα παραγωγής θερμότητας των μαγνητικών κολλοειδών μέσω της εφαρμογής εναλλασσόμενων μαγνητικών πεδίων (AMF) εξετάστηκε με την μέθοδο της υπερθερμίας. Ο υπολογισμός του ειδικού συντελεστή απωλειών ενέργειας SLP (Specific Loss Power) και της εγγενούς απώλειας ισχύος ILP (Intrinsic Loss Power) έγινε με βάση την κλίση της καμπύλης προσαρμογής (curve fitting) των πειραματικών δεδομένων των γραφημάτων της θερμοκρασίας (T) συναρτήσει του χρόνου (t) και με την χρήση των εξισώσεων 3.1 και 3.2 του τρίτου κεφαλαίου. 4.2.1 Επίδραση της συγκέντρωσης του νανοφορέα Αρχικά προετοιμάστηκαν και εξετάστηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις των μαγνητικών κολλοειδών. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων παρουσιάζονται στα διαγράμματα των σχημάτων 4.3 και 4.4 καθώς και στον πίνακα 4.2. Temperature (Celcious) 60 55 50 45 40 35 30 25 20 (a) 10 mg/ml 7 mg/ml 5 mg/ml 2 mg/ml 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time (sec) MagAlg Temperature (Celcious) 40 35 30 25 20 MagP (b) 5 mg/ml 2 mg/ml 0 100 200 300 400 500 600 Time (Sec) DT (Celcious) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 10 mg/ml 7 mg/ml 5 mg/ml 2 mg/ml (c) MagAlg DT (Celcious) 20 15 10 5 0 5 mg/ml 2 mg/ml MagP (d) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Time (sec) 0 100 200 300 400 500 Time (sec) Σχήμα 4.3: Γράφημα αύξησης της θερμοκρασίας συναρτήσει του χρόνου μαζί με την προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων για τα δείγματα a) MagAlg και b) MagP. Στα διαγράμματα c) και d) απεικονίζεται η διαφορά της θερμοκρασίας ΔΤ των MagAlg και MagP αντίστοιχα για καλύτερη σύγκριση των δεδομένων. 77

SLP (W/g) 120 100 80 60 40 20 0 (a) MagAlg MagP 2 5 7 10 Concentration (mg/ml) ILP (nhm 2 /kg) 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 (b) MagAlg MagP 2 5 7 10 Concentration (mg/ml) Σχήμα 4.4: Παρουσίαση των αποτελεσμάτων της a) ειδικής και b) εγγενούς απώλειας ισχύος των μαγνητικών κολλοειδών, όπως υπολογίστηκε από την κλίση των καμπυλών της θερμοκρασίας συναρτήσει του χρόνου. Πίνακας 4.2: Συγκεντρωτικά αποτελέσματα Υπερθερμίας Υπερθερμία Δείγμα Συγκέντρωση SLP(W/g) ILP (nhm 2 /kg) (mg/ml) MagAlg_a 2 54 1,24 MagAlb_b 5 52 1,19 MagAlg_c 7 43,3 0,98 MagAlg_d 10 49,1 1,12 MagP_a 2 126,2 2,89 MagP_b 5 79,4 1,82 Από τα διαγράμματα του σχήματος 4.3 συμπεραίνουμε ότι η αύξηση του ρυθμού της θερμοκρασίας των μαγνητικών κολλοειδών είναι συνάρτηση της συγκέντρωσης, όπως και ήταν αναμενόμενο. Ύστερα όμως από την μετάφραση των δεδομένων σε δείκτες SLP και ILP (βλ. πίνακα 4.2) γίνεται εμφανές ότι (i) υπάρχει μία συστηματική διαφορά του ILP για ίδιες συγκεντρώσεις νανοφορέων MagP και MagAlg με το πρώτο να καταγράφει σχεδόν διπλάσιες τιμές ILP (σχήμα 4.5) και (ii) όσο αυξάνεται η συγκέντρωση των νανοφορέων η απόδοση του MagAlg καταγράφει μικρές μόνο διακυμάνσεις χωρίς να υπάρχει μία σαφής μεταβολή του ILP ενώ αντίθετα στην περίπτωση του MagP παρατηρείται μία κατακόρυφη πτώση του ILP καθώς μεταβαίνουμε από συγκέντρωση 2 σε 5 mg/ml. 78

DT (Celcious) 25 20 15 10 5 0 MagP MagAlg (a) 5 mg/ml 0 150 300 450 600 750 Time (sec) ILP (nhm2/kg), SLP (W/g x10) 12 10 8 6 4 2 0 (b) SLP MagAlg SLP MagP ILP MagAlg ILP MagP 2 5 Concentration (mg/ml) Σχήμα 4.5: α) Σύγκριση της διαφοράς θερμοκρασίας ΔΤ για τα δύο κολλοειδή ίδιας συγκέντρωσης και β) σύγκριση των τιμών SLP και ILP των δύο συστημάτων. Από τον φυσικοχημικό χαρακτηρισμό των νανοφορέων (παράγραφος 4.1) προκύπτει ότι οι φυσικοχημικές ιδιότητες των δύο συστημάτων που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την συμπεριφορά τους (<DXRD > ~ 13 nm, Ms ~80 Am 2 /kg) κατά την εφαρμογή AMF είναι παρόμοιες. Επομένως αυτή η διαφοροποίηση μένει να αναζητηθεί στον τρόπο οργάνωσης των νανοκρυστάλλων των MagP και MagAlg σε πλειάδες χαλαρής και πυκνής διάταξης αντιστοίχως. Το μοντέλο Rosensweig (όπως έχει περιγραφεί στην ενότητα 1.5) όσο ισχυρό και αν αποδεικνύεται στην πρόβλεψη της επίδρασης αρκετών παραμέτρων που επηρεάζουν το SLP (διάμετρος νανοσωματιδίων, ένταση μαγνητικού πεδίου κτλ), περιορίζεται από την υπόθεση των μεμονωμένων μη-αλληλεπιδρώντων σωματιδίων. Στην πραγματικότητα όμως οι υψηλές συγκεντρώσεις των μαγνητικών κολλοειδών που απαιτούνται για την αποτελεσματική εφαρμογή της υπερθερμίας μπορούν να έχουν σαν αποτέλεσμα την συλλογική συμπεριφορά (collective behavior) 143 των νανοσωματιδίων εξαιτίας της ανάπτυξης διπολικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις πηγάζουν από την μείωση των ενδο-σωματιδιακών αποστάσεων με την αύξηση της συγκέντρωσης και επηρεάζουν άμεσα (μειώνουν όπως συζητείται παρακάτω) τον χρόνο χαλάρωσης Neel που είναι και ο κυρίαρχος μηχανισμός παραγωγής θερμότητας σε αυτή την περιοχή μεγεθών των νανοσωματιδίων (10-17 nm) 143. Οι απόψεις όμως που έχουν προταθεί όσον αφορά την επίδραση που έχουν οι αλληλεπιδράσεις των μαγνητικών ροπών σε αυτή την παράμετρο είναι αντικρουόμενες. Ένα από τα πρώτα θεωρητικά μοντέλα προτάθηκε από τους Dormann et al. 144 και προέβλεπε την αύξηση της ενέργειας ανισοτροπίας K σαν αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων των σωματιδίων σε αυξανόμενης συγκέντρωσης διαλύματα, που θα επέφερε αύξηση του χρόνου χαλάρωσης Neel. Σε μία άλλη εργασία οι Morap et al. 145 πρότειναν ένα εναλλακτικό μοντέλο που προέβλεπε την μείωση του χρόνου χαλάρωσης Neel. Φαίνεται όμως τελικά να επικρατεί η άποψη της μείωσης του χρόνου χαλάρωσης της μαγνητικής ροπής με αύξηση των αλληλεπιδράσεων 146. Όπως έχει αναφερθεί στην παράγραφο 1.5.2 η εξάρτηση του SLP από τον χρόνο χαλάρωσης είναι σύνθετη και εξαρτάται από την τιμή του γινομένου της γωνιακής συχνότητας ω = 2πf του εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου και του χρόνου χαλάρωσης τ που είναι συνήθως της τάξης των 10-6 sec. Για συστήματα λοιπόν όπου η χαλάρωση Neel είναι κυρίαρχος 79

μηχανισμός, η μείωση του χρόνου χαλάρωσης έχει σαν αποτέλεσμα την μείωση του SLP (σχήμα 1.15) Παρά την ασυμφωνία αυτών των αρχικών μοντέλων, τα τελευταία χρόνια έχουν δημοσιευθεί αρκετές θεωρητικές εργασίες που καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι οι αυξανόμενες 146 147 148 αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μαγνητικών ροπών επηρεάζουν αρνητικά τον δείκτη SLP 149 ανεξαρτήτως των όποιων μεταβολών στο χρόνο χαλάρωσης Neel. Πειραματικές μελέτες επίσης δείχνουν ότι όντως υπάρχει εξάρτηση μεταξύ της συγκέντρωσης (επομένως και των αλληλεπιδράσεων των σωματιδίων) και του SLP με την πλειοψηφία των εργασιών να αναφέρουν μείωση του SLP για αυξανόμενες συγκεντρώσεις,150,151,152 που με αυτόν τον τρόπο ενισχύουν την πρόβλεψη της μείωσης του χρόνου χαλάρωσης Neel και άρα εξασθένισης του μηχανισμού με τον οποίο παράγεται θερμότητα. Επομένως, και με βάση την βιβλιογραφία υπάρχει μία σαφής συσχέτιση της συγκέντρωσης, και κατά συνέπεια των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μαγνητικών νανοσωματιδίων και του SLP. Προχωρώντας στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων του πίνακα 4.2, θα μπορούσε να ειπωθεί ότι η διαμόρφωση πλειάδων πυκνής διάταξης που χαρακτηρίζει το MagAlg ανεξαρτήτως συγκέντρωσης, προάγει την μαγνητική αλληλεπίδραση μεταξύ των νανοκρυσταλλιτών, ανεξαρτήτως της συγκέντρωσης στην οποία διεξάγεται το πείραμα. Άρα, εξ αρχής, λόγω αυτών των αλληλεπιδράσεων, ο χρόνος χαλάρωσης Neel είναι μειωμένος, γεγονός το οποίο εξηγεί τη συστηματικά μικρότερη τιμή SLP του MagAlg σε σχέση με το MagP σε μετρήσεις με ίδια συγκέντρωση μαγνητικών νανοσωματιδίων. Ένας ακόμη λόγος που πιθανώς θα μπορούσε να εξηγήσει την διαφορά των τιμών SLP για δείγματα ίδιας συγκέντρωσης είναι η μεγαλύτερη διεπιφάνεια νανοκρυσταλλίτη-διαλύτη στο MagP, η οποία πιθανώς συμβάλλει στην πιο αποτελεσματική διάχυση της παραγόμενης θερμότητας από τον μαγνητικό νανοκρυσταλλίτη προς το περιβάλλον (διαλύτη). Η δεύτερη παρατήρηση προς συζήτηση αφορά στο γεγονός ότι στην περίπτωση του MagP, που συνίσταται από νανο-πλειάδες χαλαρής διάταξης, η συγκέντρωση παίζει καθοριστικό ρόλο στην τιμή του SLP, σε αντίθεση με το MagAlg, το SLP του οποίου μεταβάλλεται ελάχιστα με τη συγκέντρωση. Όπως ειπώθηκε στο εισαγωγικό μέρος, οι μηχανισμοί χαλάρωσης που συνεισφέρουν στην παραγωγή θερμότητας είναι η χαλάρωση Neel και η Brown, αλλά για μεγέθη νανοκρυσταλλιτών της τάξης των 10-15 nm και για συχνότητες εναλλασσόμενου πεδίου 100-300 khz η χαλάρωση Neel είναι σημαντικά ταχύτερη από τη χαλάρωση Brown 143, και κυριαρχεί. Στην περίπτωση του MagAlg οι εγγενείς, λόγω δομής, διπολικές ενδοσωματιδιακές μαγνητικές αλληλεπιδράσεις υπάρχουν ανεξαρτήτως συγκέντρωσης. Άρα η μικρή επίπτωση της συγκέντρωσης στο SLP θα μπορούσε να εξηγηθεί με αυτόν τον τρόπο. Αντίθετα στην περίπτωση του MagP οι ενδοσωματιδιακές αλληλεπιδράσεις δεν προϋπάρχουν, έτσι η εμφάνισή τους με αύξηση της συγκέντρωσης μπορεί να εξηγήσει τη δραματική μείωση του SLP καθώς η συγκέντρωση αυξάνεται από 2 σε 5 mg/ml. Παραμένει όμως ανοιχτό το θέμα των διασωματιδιακών αλληλεπιδράσεων, κατά πόσο επηρεάζουν τη χαλάρωση Neel, και εάν την επηρεάζουν γιατί αυτό δεν γίνεται εμφανές στην περίπτωση του MagAlg. Είναι πολύ πιθανό πως στην περίπτωση του MagAlg κυριαρχεί ο μηχανισμός παραγωγής θερμότητας μέσω χαλάρωσης Με τον όρο ενδοσωματιδιακές εννοούνται οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των νανοκρυσταλλιτών σε κάθε κολλοειδές σωματίδιο. Ενώ διασωματιδιακές είναι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των διαφορετικών κολλοειδών/πλειάδων. 80

Brown. Άρα η χαλάρωση Neel και οι όποιες διπολικές αλληλεπιδράσεις που την επηρεάζουν, δεν επιδρούν στην SLP. Η άποψη αυτή ενισχύεται από θεωρητικές μελέτες 143, όπου χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι: Brownian relaxation is significant in larger particles and Neel relaxation is most significant in smaller particles. Στο σχήμα 5 της ίδιας εργασίας (σχήμα 1.14 του κεφαλαίου 1) και από την αντίστοιχη συζήτηση εκεί, φαίνεται πως όσο μεγαλύτερη η μαγνητική ανισοτροπία ενός συστήματος τόσο νωρίτερα, (καθώς η διάμετρος των νανοκρυσταλλιτών αυξάνει) αρχίζει η χαλάρωση Brown να έχει καθοριστικό ρόλο. Στην περίπτωση του MagAlg, η μαγνητική ανισοτροπία είναι ίδια (και μάλιστα λίγο μικρότερη) σε σχέση με το MagP, ενώ η διάμετρος των σωματιδίων-πλειάδων είναι 45 nm αντί των 13 nm της περίπτωσης του MagP. Είναι λοιπόν εξαιρετικά πιθανό πως οι διασωματιδιακές μαγνητικές αλληλεπιδράσεις και η επίδραση τους στη χαλάρωση Neel και άρα στην παραγωγή θερμότητας στις μετρήσεις με το MagAlg, δε χρειάζεται να ληφθούν υπόψιν, εφόσον η χαλάρωση των μαγνητικών ροπών κυριαρχείται από τον μηχανισμό Brown. Άρα εξηγείται η πολύ μικρή μεταβολή του SLP με αύξηση της συγκέντρωσης στην περίπτωση MagAlg. 4.2.2 Βέλτιστη συγκέντρωση για in vivo εφαρμογή Από ιατρικής πλευράς, η μέθοδος της συμβατικής υπερθερμίας για in vivo εφαρμογές στηρίζεται στην τοπική αύξηση και διατήρηση της θερμοκρασίας στους 43-45 ο C για αρκετά λεπτά της ώρας προκειμένου να επάγει μέσω κυτταρικών και μεταβολικών μηχανισμών την αύξηση της ευαισθησίας σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ή/και την απόπτωση των (καρκινικών) κυττάρων του ιστού-στόχου. Για να ικανοποιηθεί αυτή η απαίτηση πρέπει η τοπική συγκέντρωση του μέσου υπερθερμίας να ρυθμιστεί (σε συνδυασμό πάντα με την εφαρμογή συχνοτήτων και εντάσεων μαγνητικού πεδίου ακίνδυνων για τον ασθενή) έτσι ώστε να επιτυγχάνει και να διατηρεί αυτή τη θερμοκρασία στόχο, κρατώντας ταυτόχρονα την συγκέντρωση του νανοφορέα στο ελάχιστο δυνατό ώστε να μην προκαλεί προβλήματα τοξικότητας στον ασθενή. Επίσης, υπάρχουν αναφορές που συνιστούν ότι ο SLP μειώνεται με την αύξηση της θερμοκρασίας 153 154, επομένως κρίνεται σκόπιμο να γίνεται μία μελέτη με σκοπό τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης σε μαγνητικό υλικό η οποία απαιτείται για την αύξηση και διατήρηση της επιθυμητής θερμοκρασίας στη ζητούμενη περιοχή. Για τον λόγο αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα αφού είχε θερμοστατηθεί το δείγμα στους 37 ο C και κατόπιν η μέτρηση πραγματοποιήθηκε σε μονωμένο περιβάλλον. Από το διάγραμμα του σχήματος 4.6 γίνεται εμφανές ότι το δείγμα MagAlg_a με τη χαμηλότερη συγκέντρωση, δεν μπορεί να θερμάνει το περιβάλλον νερό, και σταδιακά η θερμοκρασία μειώνεται. ** Αντιθέτως τα δείγματα MagAlg_b και _c ανταποκρίνονται πολύ καλύτερα λόγω υψηλότερης συγκέντρωσης σε μαγνητικό υλικό. Από το διάγραμμα βλέπουμε ότι στα 5 πρώτα λεπτά εφαρμογής AMF το MagAlg_b έχει φτάσει στους ~42 ο C ενώ στα 10 λεπτά έχει αρχίσει να σταθεροποιείται στους 43 ο C και μέχρι το τέλος της μέτρησης (συνολικά 20 λεπτά) Το μέγεθος της μαγνητικής ανισοτροπίας φαίνεται από τον βρόγχο υστέρησης στους 5Κ στο σχήμα 4.1, από το συνεκτικό πεδίο, το οποίο είναι λίγο μικρότερο για την περίπτωση του MagAlg. ** Το σύστημα είναι μονωμένο, ωστόσο η μόνωση δεν είναι τέλεια και παρατηρούνται απώλειες θερμότητας. 81

αυξάνεται μόλις κατά 1 βαθμό Κελσίου. Αντίστοιχα στην περίπτωση του MagAlg_c παρατηρούμε ότι ο ρυθμός αύξησης της θερμοκρασίας είναι πολύ μεγαλύτερος με τις αντίστοιχες τιμές να είναι 45 ο C για το πρώτο πεντάλεπτο, 48 ο C για τα δέκα λεπτά ενώ μέχρι το τέλος της μέτρησης το δείγμα είχε φτάσει τους 51 ο C χωρίς να έχει φτάσει ακόμα σε πλατώ. Στον πίνακα 4.3 παρουσιάζονται ομαδοποιημένα τα αποτελέσματα των μετρήσεων. Temperature (Celcious) 54 52 50 48 46 44 42 40 38 36 7 mg/ml 5 mg/ml 2 mg/ml MagAlg 0 200 400 600 800 1000 1200 Time (Sec) Σχήμα 4.6: Καμπύλες υπερθερμίας MagAlg διαφορετικών συγκεντρώσεων με θερμοκρασία εκκίνησης τους 37 o C. Επομένως από τα παραπάνω προκύπτει ότι η βέλτιστη συγκέντρωση που θα πρέπει να επιτευχθεί στον ιστό για πιθανή in vivo εφαρμογή συμβατικής υπερθερμίας θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 5 mg/ml. Ενώ για εφαρμογές θερμικής νέκρωσης (thermal ablation) του ιστού μέσω υπερθερμίας κρίνεται καταλληλότερη συγκέντρωση των 7 mg/ml για τον συγκεκριμένου νανοφορέα. Πίνακας 4.3: Τιμές θερμοκρασίας των δειγμάτων που μελετήθηκαν στα χρονικά σημεία των 5, 10 και 20 λεπτών Δείγμα Συγκέντρωση Θερμοκρασία (C) (mg/ml) 5 min 10 min 20 min MagAlg_a 2 35 - - MagAlb_b 5 42 43 44 MagAlg_c 7 45 48 51 4.2.3 Κολλοειδής σταθερότητα μετά την εφαρμογή υπερθερμίας Η κολλοειδής σταθερότητα των νανοφορέων εξετάστηκε μέσω μετρήσεων δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) μετά από διαδοχικές εφαρμογές υπερθερμίας. Συνολικά πραγματοποιήθηκαν τρεις διαδοχικοί κύκλοι υπερθερμίας διάρκειας ~30 λεπτών όπου το δείγμα μετά από κάθε εφαρμογή αφέθηκε να επανέλθει σε θερμοκρασία 82

δωματίου και κατόπιν επαναλήφθηκε η διαδικασία. Το δείγμα MagAlg που επιλέχθηκε ήταν συγκέντρωσης 7 mg/ml ώστε να αναπτύξει θερμοκρασία μεγαλύτερη των 50 ο C για αρκετά λεπτά της ώρας. Από το διάγραμμα του σχήματος 4.7a προκύπτει ότι η συμπεριφορά του MagAlg ήταν πανομοιότυπη, παρουσιάζοντας μέγιστη απόκλιση θερμοκρασίας ±1 βαθμό Κελσίου προς το τέλος των μετρήσεων. Αυτό επιβεβαιώνεται και από τις τιμές SLP και ILP της κάθε μέτρησης οι οποίες παρουσιάζουν ελάχιστη απόκλιση και παρουσιάζονται στον πίνακα 4.4. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων της υδροδυναμικής διαμέτρου των νανοφορέων συνοψίζονται στο διάγραμμα 4.7b και τον πίνακα 4.5 και επιβεβαιώνουν περαιτέρω ότι δεν υπήρξε κάποια αλλαγή στα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του συστήματος με την μέση υδροδυναμική διάμετρο να παραμένει ουσιαστικά αναλλοίωτη. Temperature (Celcious) 60 55 50 45 40 35 30 25 20 MagAlg 7 mg/ml (a) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time (Sec) Mean (Intensity %) 24 20 16 12 8 4 0 MagAlg 7 mg/ml 10 100 1000 D h (nm) by intensity by volume by number by intensity by volume by number Before AMF (b) After AMF Σχήμα 4.7: (a) Καμπύλες υπερθερμίας MagAlg διαφορετικών συγκεντρώσεων με θερμοκρασία εκκίνησης τους 37 o C, (b) Μετρήσεις DLS του δείγματος MagAlg πριν και μετά την εφαρμογή των τριών κύκλων υπερθερμίας. Πίνακας 4.4: Δείκτες SLP και ILP μετά την εφαρμογή διαδοχικών κύκλων υπερθερμίας Αριθμός μετρήσεων SLP(W/g) ILP (nhm 2 /kg) 1 43,0 0,99 2 41,7 0,96 3 45,3 1,04 Μέσος όρος 43,3 ± 1,82 1,00 ± 0,04 Πίνακας 4.5: Παρουσίαση μετρήσεων Dh εκφρασμένης σε διαφορετικές κατανομές μεγεθών καθώς και o δείκτης πολυδιασποράς PDI των δειγμάτων πριν και μετά την εφαρμογή υπερθερμίας. MagAlg_c Dh average (nm) Dh by Intensity (nm) Dh by Volume (nm) Dh by Number (nm) Πριν 107 ± 1 130 ± 1 93± 1 57± 1 0.169 Μετά 99 ± 2 117 ± 2 87± 2 61± 3 0.151 PDI 83

4.3 Αλληλεπίδραση του αλγινικού οξέος με τους μανγητικούς νανοκρυσταλλίτες Ένας σημαντικός παράγοντας που πρέπει να ληφθεί υπόψη για πιθανή in vivo εφαρμογή των νανοφορέων είναι η μελέτη της σταθερότητας του πολυμερικού φλοιού σε συνθήκες υψηλής αραίωσης, η οποία μπορεί να προκαλέσει την εκρόφηση του από την επιφάνεια των νανοσωματιδίων. Αυτό είναι ένα σενάριο στο οποίο θα υποβληθούν οι νανοφορείς κατά την παραμονή τους σε βιολογικό περιβάλλον. Επομένως η αντίσταση του πολυμερικού φλοιού στην αραίωση, και κατ επέκταση η κολλοειδής σταθερότητα του συστήματος, σχετίζεται άμεσα με την ισχύ της αλληλεπίδρασης της πολυμερικής κορώνας με τα επιφανειακά ιόντα Fe των μαγνητικών νανοσωματιδίων. Για τον σκοπό αυτό οι Tόth et al. 155 πραγματοποίησαν μετρήσεις του ελεύθερου πολυμερούς μετά από δύο φορές αραίωση, ώστε να επιβεβαιώσουν ότι δεν υπήρξε εκρόφηση πολυμερούς από την επιφάνεια των νανοσωματιδίων. Στην παρούσα εργασία και προκειμένου να εξεταστεί αυτή η παράμετρος στην περίπτωση του MagAlg, πραγματοποιήθηκε μια σειρά διαδοχικών πλύσεων (μέσω φυγοκέντρησης) και προσδιορισμού της απώλειας μάζας μέσω θερμοσταθμικής ανάλυσης (TGA). Μετά από κάθε πλύση γινόταν επαναδιασπορά του ιζήματος (~ 100 μl) σε 2 ml απιονισμένου νερού. Επομένως με κάθε διαδικασία πλύσης και επαναδιασποράς απομακρύνονται τα τυχόν εκροφημένα μακρομόρια και το κολλοειδές επαναδιασπείρεται σε νέα ποσότητα διαλύτη. Έτσι, η αρχική χημική ισορροπία μεταξύ προσροφημένων και ελεύθερων μακρομορίων διαταράσσεται, αναγκάζοντας το σύστημα να απελευθερώσει και άλλα μακρομόρια προς αποκατάσταση της χημικής ισορροπίας. Κάθε έκπλυση λοιπόν αντιστοιχεί σε 20 φορές αραίωση της συγκέντρωσης των προϊόντων (δηλαδή των ελεύθερων μακρομορίων). Η απώλεια μάζας του MagAlg μετά από το στάδιο της κλασμάτωσης (όπως περιγράφηκε στο πειραματικό μέρος παρ. 3.8) προσδιορίστηκε μέσω TGA στο ~11% (σχήμα 4.8 καμπύλη (i) στο ένθετο). Στη συνέχεια μία ποσότητα αυτού του κλάσματος φυγοκεντρήθηκε στα 30000 g και μετά την επαναδιασπορά του σε νερό η απώλεια μάζας ήταν 9,65%. Μετά την δεύτερη και τρίτη διαδικασία πλύσης η απώλεια μάζας ήταν 9,45 και 9,35% αντίστοιχα (καμπύλες (ii), (iii), και (iv) αντίστοιχα του διαγράμματος 4.8). Residual Mass (%) 100 (iv) 90.6 (iii) 90.5 98 96 94 92 90 88 Residual Mass (%) 90.4 90.3 88.8 88.6 660 670 680 690 Temperature ( o C) + 200 300 400 500 600 700 Temperature ( o C) Σχήμα 4.8: (a) Καμπύλες TGA της απώλειας μάζας του MagAlg (i) μετά από την κλασμάτωση και (ii), (iii) και (iv) μετά από μία, δύο και τρείς συνεχόμενες πλύσεις μέσω φυγοκέντρησης και επαναδιασποράς. Στο ένθετο παρουσιάζεται σε μεγέθυνση η απώλεια μάζας στα τελικά στάδια των μετρήσεων TGA. (ii) (i) 84

Αυτές οι αλλαγές στην απώλεια μάζας του νανοφορέα μετά τις τρεις τελευταίες πλύσεις θεωρούνται αμελητέες και εντός της μέγιστης αναλυτικής ικανότητας του οργάνου μέτρησης. Δηλαδή, μετά από αραίωση 20Χ τρεις φορές (δηλαδή συνολικά 8000 φορές αραίωση) η ποσότητα του πολυμερούς η οποία παραμένει προσροφημένη στα νανοσωματίδια είναι σταθερή. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώνει την πολύ ισχυρή αλληλεπίδραση που αναπτύσσει το αλγινικό οξύ με την επιφάνεια των μαγνητικών νανοσωματιδίων. Η αλληλεπίδραση αυτή δεν μπορεί να αποδοθεί απλά στους δεσμούς ένταξης που αναπτύσσονται μεταξύ των καρβοξυλομάδων του πολυμερούς και τον επιφανειακών ιόντων Fe, αλλά στον μεγάλο αριθμό τέτοιων δεσμών που αναπτύσσονται μεταξύ ενός μακρομορίου και ενός σωματιδίου, οι οποίοι αθροιστικά οδηγούν τελικά σε πολύ ισχυρές αλληλεπιδράσεις. 4.4 Μελέτη της αλληλεπίδρασης των νανοφορέων MagAlg με δοξορουβικίνη Η καταλληλότητα του MagAlg για χρήση σε εφαρμογές μεταφοράς βιοδραστικών μορίων αξιολογήθηκε μέσω της μελέτης των αλληλεπιδράσεων του MagAlg με το μόριο της Δοξορουβικίνης (DOX). Η δοξορουβικίνη είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αντικαρκινικό φάρμακο, το οποίο δρα σταθεροποιώντας το σύμπλοκο της τοποϊσομεράσης II, σταματώντας έτσι την αντιγραφή του DNA των κυττάρων. 4.4.1 Ικανότητα δέσμευσης δοξορουβικίνης Όπως έχει αναφερθεί (παράγραφος 3.3.1), το αλγινικό νάτριο είναι ένας φυσικός πολυσακχαρίτης πλούσιος σε καρβοξυλομάδες, επομένως παρουσία της DOX υπάρχει αυξημένη πιθανότητα να αναπτυχθούν ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις ανιοντικές καρβοξυλομάδες του αλγινικού και τις θετικά φορτισμένες αμινομάδες του φαρμάκου. Αρχικά, έγινε εκτίμηση της ικανότητας δέσμευσης της δοξορουβικίνης στο MagAlg. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων απεικονίζονται στο γράφημα του σχήματος 4.9. Το MagAlg επέδειξε εξαιρετικά υψηλή ικανότητα δέσμευσης του φαρμάκου που κυμάνθηκε περίπου στο 26% wt για αναλογία μάζας (feed) DOX/νανοφορέα 0,5 με 0,6. Η απόδοση δέσμευσης (entrapment efficiency) της DOX επίσης κυμάνθηκε σε αρκετά υψηλά επίπεδα φτάνοντας το 65 με 75% στα αντίστοιχα feed και σημειώνοντας μείωση στο 40% για μεγαλύτερες αναλογίες μάζας DOX/νανοφορέα. Οι συγκεκριμένες τιμές φόρτωσης φαρμάκου (~26% w/v) είναι από τις πλέον υψηλές που υπάρχουν βιβλιογραφικά σε παρόμοια συστήματα. Πιο συγκεκριμένα οι Guo et al. 93 156, επίσης με την προσέγγιση της άμεσης επιφανειακής τροποποίησης μαγνητικών νανοσωματιδίων (χρησιμοποιώντας όμως διαφορετικούς επιφανειακούς τροποποιητές και μεθόδους σύνθεσης), ανέπτυξαν μαγνητικούς νανοφορείς με ικανότητα δέσμευσης Dox ~20% wt. Τα νανοσωματίδια όμως είχαν αρκετά χαμηλότερες τιμές μαγνήτισης κόρου Ms (~28 Am 2 /kg). Οι Lee et al. 94, έδειξαν ότι η απευθείας επιφανειακή τροποποίηση των μαγνητικών νανοσωματιδίων με το πολυμερές (poly(3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate-r-peg methyl ether methacrylate-r-nacryloxysuccinimide), μπορεί να οδηγήσει σε σημαντική αύξηση των μαγνητικών ιδιοτήτων. Όμως αυτό το σύστημα επέδειξε πολύ χαμηλή ικανότητα δέσμευσης του φαρμάκου Dox (2% wt). 85

% Entrapment Efficiency -potential (mv) % Loading ( g Dox/ g MagAlg) 30 25 20 15 10 5 0 Feed ( mol DOX / µmol Carboxylate) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 % Loading % Entrapement Efficiency 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Feed ( g Dox/ g MagAlg) 80 70 60 50 40 30 20 10 Σχήμα 4.9: Διάγραμμα δέσμευσης δοξορουβικίνης από τους νανοφορείς και απόδοση δέσμευσης Κατά την διάρκεια των πειραμάτων φόρτωσης φαρμάκου στους νανοφορείς πραγματοποιήθηκε καταγραφή της Dh και του ζp, όπως φαίνεται στο σχήμα 4.10. Εξετάζοντας προσεκτικά την συμπεριφορά της υδροδυναμικής διαμέτρου των νανοφορέων παρατηρούμε ότι για χαμηλές τιμές feed (~0,08) το σύστημα διατηρεί την σταθερότητα του, ενώ από feed ~0,1 παρατηρείται μια μικρή αύξηση της Dh στα ~150 nm. Οι ιοντικές αλληλεπιδράσεις του συστήματος με τα μόρια της DOX γίνονται εμφανείς από την συμπεριφορά του ζp, η οποία παρουσιάζει σημαντική αύξηση από τα -40 στα -20mV για feed 0,1. Περαιτέρω προσθήκη DOX οδηγεί σε ακόμα πιο ουδέτερες τιμές ζp με τελικό αποτέλεσμα την κατάρρευση της σταθερότητας του συστήματος για feed μεγαλύτερα του ~0,2. Αυτή η αποσταθεροποίηση του συστήματος μπορεί να αποδοθεί στην ισχυρή αλληλεπίδραση της αμίνης της DOX με τα καρβοξύλια του αλγινικού και έχει σαν άμεση συνέπεια την μείωση του ωφέλιμου ποσοστού φόρτωσης DOX στο ~8% w/w. D h (nm) 2000 1500 1000 500 400 300 200 100 Feed ( mol DOX / µmol Carboxylate) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 aggregation 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Feed ( g Dox/ g MagAlg) Σχήμα 4.10: Μεταβολή της υδροδυναμικής διαμέτρου και του ζ-δυναμικού σε αυξανόμενες ποσότητες DOX D h p -50-40 -30-20 -10 0 10 20 30 86

4.4.2 Αποδέσμευση δοξορουβικίνης Πειράματα αποδέσμευσης φαρμάκου από τους νανοφορείς πραγματοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών/άλατος (Phosphate Buffer Saline) φυσιολογικού ph. Όπως φαίνεται από το διάγραμμα του σχήματος 4.11 το MagAlg παρουσιάζει πολύ χαμηλή αποδέσμευση που συνοδεύεται και από πολύ χαμηλό ρυθμό αποδέσμευσης του φαρμάκου. Τέτοιου είδους συμπεριφορά είναι ζωτικής σημασίας για in vivo εφαρμογές αφού η αργή αποδέσμευση του φαρμάκου μπορεί να προσφέρει στους νανοφορείς ικανό χρονικό διάστημα ώστε να προσεγγίσουν την επιθυμητή περιοχή-στόχο προτού απελευθερώσουν το φορτίο τους. Cumulative Release (%) 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Time (hours) ph 7.4 PBS Σχήμα 4.11: Καμπύλη αποδέσμευσης DOX από τους νανοφορείς σε διάλυμα PBS Cumulative Release (%) 70 60 50 40 30 20 10 (b) 28 o C and AC field, 0.01 % wt concentration 28 o C 45 o C 0 5 10 15 20 25 Time (hours) Σχήμα 4.12: (a) Κινητική της αποδέσμευσης φαρμάκου με και χωρίς την εφαρμογή AMF. (b) Καμπύλες αποδέσμευσης δοξορουβικίνης σε ποικίλες συνθήκες. Η επίδραση της εφαρμογής εναλλασσόμενων μαγνητικών πεδίων (AMF) στο ρυθμό αποδέσμευσης της Dox από τους νανοφορείς ελέγχθηκε μέσω πειραμάτων υπερθερμίας. Μετά από τρείς ώρες απλής αποδέσμευσης σε δείγμα νανοφορέων MagAlg φορτωμένων με DOX (συγκέντρωσης 7 mg/ml Fe2O3) έγινε εφαρμογή AMF για μία περίοδο 30 λεπτών. Σε αυτό το χρονικό διάστημα η θερμοκρασία του δείγματος ξεπέρασε τους 50 ο C για αρκετά λεπτά της ώρας. 87

Όπως απεικονίζεται στο διάγραμμα του σχήματος 4.12a η κινητική της απελευθέρωσης του φαρμάκου άλλαξε ριζικά φτάνοντας το 90% μέσα στην επόμενη ώρα. Προκειμένου να ερμηνευθεί αυτό το αποτέλεσμα και να διερευνηθεί καλύτερα ο μηχανισμός της απελευθέρωσης του φαρμάκου πραγματοποιήθηκε μία σειρά πειραμάτων αποδέσμευσης σε τρείς διαφορετικές συνθήκες: Στους 28 o C χωρίς την εφαρμογή AMF Στους 28 o C με εφαρμογή AMF Και στους 45 o C χωρίς την εφαρμογή AMF Σε αυτή τη σειρά πειραμάτων η συγκέντρωση του νανοφορέα ήταν μόλις 0,1 mg/ml σε οξείδια του σιδήρου. Σε αυτήν τη χαμηλή συγκέντρωση δεν υπάρχει αύξηση της θερμοκρασίας μακροσκοπικά κατά την εφαρμογή AMF. Αυτό το γεγονός, όπως φαίνεται και από το διάγραμμα του σχήματος 4.12b, είχε άμεσο αντίκτυπο στην αποδέσμευση του φαρμάκου διατηρώντας την σε χαμηλά επίπεδα. Σε αντίθεση όμως με τα πειράματα των 28 ο C, κατά την διάρκεια των πειραμάτων στους 45 ο C παρατηρείται μία σημαντική αύξηση του ποσοστού αποδέσμευσης του φαρμάκου ακόμα και χωρίς την εφαρμογή AMF. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα προκύπτει το συμπέρασμα ότι η αποδέσμευση του φαρμάκου επιτυγχάνεται μόνο σε περιπτώσεις όπου υπάρχει αύξηση της θερμοκρασίας. Δηλαδή είτε σε υψηλή συγκέντρωση νανοφορέα και εφαρμογή AMF είτε σε υψηλές θερμοκρασίες (πχ. σε συνθήκες φλεγμονής) ακόμα και χωρίς την εφαρμογή AMF. 4.5 Κολλοειδής σταθερότητα νανοφορέων παρουσία NaCl Η κολλοειδής σταθερότητα των νανοφορέων MagAlg εκτιμήθηκε μέσω της παρακολούθησης των μεταβολών της υδροδυναμικής διαμέτρου και του ζp μέσω δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) και ηλεκτροκινητικών μετρήσεων αντίστοιχα, σε διαλύματα NaCl μεταβαλλόμενης συγκέντρωσης και ιοντικής ισχύος. Η συγκέντρωση του NaCl που βρίσκεται φυσιολογικά στα αίμα είναι 0,135M επομένως αυτή η παράμετρος κρίνεται ιδιαιτέρως σημαντική για πιθανή in vivo εφαρμογή των νανοφορέων. Επίσης τέτοιου είδους μελέτες παρέχουν αρκετές πληροφορίες για τις δυνάμεις που σταθεροποιούν τα κολλοειδή και τη δομή του πολυμερικού φλοιού των μαγνητικών νανοσωματιδίων 157. Στην περίπτωση του MagAlg, παρατηρείται μία ευαίσθητη συμπεριφορά στην παρουσία ηλεκτρολυτών (σχήμα 4.13a), με την πρώτη σημαντική αύξηση στην D h των νανοφορέων να συμβαίνει σε συγκεντρώσεις 0,04 Μ (D h= 160nm), η οποία συνοδεύεται και από την εμφάνιση ελαφριάς θολερότητας στο κολλοειδές. Προχωρώντας σε ακόμα μεγαλύτερες συγκεντρώσεις NaCl (0,1 M), καταγράφεται απότομη αύξηση της D h στα ~ 750 nm η οποία οδηγεί σε καταβύθιση του κολλοειδούς. Οι μελέτες αυτές έχουν ιδιαίτερη σημασία για τον προσδιορισμό του είδους των απωστικών δυνάμεων που σταθεροποιούν το κολλοειδές. Εδώ παρατηρείται πως ο μηχανισμός που επικρατεί είναι ηλεκτροστατικών απώσεων, εφόσον το σύστημα είναι ευαίσθητο στην παρουσία ηλεκτρολυτών. Η συμπεριφορά αυτή υποδεικνύει πως είναι απαραίτητη η περαιτέρω τροποποίηση του νανοφορέα με δεύτερη εξωτερική πολυμερική κορώνα, η οποία να προσδίδει εντροπική σταθεροποίηση. 88

D h (nm) 10 4 10 3 (a) MagAlg p (mv) 10 MagAlg 0-10 -20-30 (b) 10 2 0.01 NaCl (M) 0.1 0.5-40 0.01 0.1 1 [NaCl] (M) Σχήμα 4.13: Η εξάρτηση της (a) υδροδυναμικής διαμέτρου (D h) και (b) του ζp των νανοφορέων MagAlg σε υδατικό διάλυμα διαφορετικών συγκεντρώσεων NaCl. Αυτές οι μεταβολές στην υδροδυναμική διάμετρο των κολλοειδών καταγράφηκαν και μακροσκοπικά στις παρακάτω φωτογραφίες (σχήμα 4.14), όπου είναι εμφανείς οι μεταβολές στη σταθερότητα του κολλοειδούς καθώς προχωράμε σε υψηλότερες συγκεντρώσεις NaCl. Ηλεκτροκινητικές μετρήσεις έδειξαν ότι η τιμή του ζp δεν επηρεάστηκε ιδιαίτερα και παρέμεινε σταθερή για συγκεντρώσεις μέχρι και 0,04 M NaCl, έχοντας τιμή ζp = ~29 mv. Αυξάνοντας όμως την συγκέντρωση του NaCl στο διάλυμα τα κατιόντα Na + εξουδετερώνουν όλο και περισσότερο το φορτίο των ιονισμένων καρβοξυλομάδων του αλγινικού νατρίου, οδηγώντας το ζp των νανοφορέων σε όλο και μικρότερες τιμές. Στο σχήμα 4.13b φαίνεται η μεταβολή του ζp στις διαφορετικές συγκεντρώσεις του NaCl. Σχήμα 4.14: Σε συγκέντρωση NaCl 0,04 Μ αρχίζουν να γίνονται και μακροσκοπικά εμφανή τα φαινόμενα συσσωμάτωσης των νανοφορέων, ενώ στα 0,06 M φαίνεται καθαρά η δημιουργία ιζήματος. 89

4.6 Αλληλεπιδράση του MagAlg μέσω ηλεκτροστατικής σύμπλεξης με διπλά υδρόφιλα συμπολυμερή και φυσικοχημικός χαρακτηρισμός Η περαιτέρω τροποποίηση της επιφάνειας των μαγνητικών νανοφορέων επιχειρήθηκε μέσω της σύνδεσης ενός δεύτερου πολυμερικού φλοιού πλούσιου σε ομάδες πολύ(αιθυλενογλυκόλης) (PEG). Το PEG πέρα από την επιπλέον σταθερότητα που θα μπορούσε να προσδώσει στο σύστημα στην παρουσία ιόντων, έχει την ιδιότητα να ελαχιστοποιεί τις αλληλεπιδράσεις του υβριδικού συστήματος με τις πρωτεΐνες του αίματος, αυξάνοντας έτσι τον χρόνο ημίσιας ζωής του στην κυκλοφορία του αίματος. Η οδός που επιλέχθηκε προκειμένου να επιτευχθεί αυτή η σύζευξη ήταν μέσω της αυτόοργάνωσης (Layer by Layer Self-assembly 101 158 159 ) διπλά υδρόφιλων δισυσταδικών συμπολυμερών πολύ(αιθυλενο-γλυκόλης) μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων γύρω από την αρνητικά φορτισμένη επιφάνεια του MagAlg (λόγω των καρβοξυλομάδων του αλγινικού οξέος), όπως φαίνεται στο σχήμα 4.15. Στην προσπάθεια αυτή χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά πολυμερή. Ένα διπλά υδρόφιλο συμπολυμερές αποτελούμενο από PEG σαν την ουδέτερη υδατοδιαλυτή συστάδα και μία δεύτερη συστάδα κατιοντικού πολύ-ηλεκτρολύτη βασισμένο σε παράγωγα πολύ(υδρόξυ-στυρενίου) τα οποία παρασκευάσθηκαν από συνεργάτες σύμφωνα με προηγούμενη εργασία. 140. Το δεύτερο ήταν ένα εμπορικά διαθέσιμο δισυσταδικό συμπολυμερές πολύ(λυσίνης)-peg. Η λεπτομερής πορεία της σύμπλεξης που ακολουθήθηκε οριστικοποιήθηκε μετά από μελέτη ποικίλων παραμέτρων και περιγράφεται στο πειραματικό μέρος. Σχήμα 4.15: Σχηματική αναπαράσταση της συνθετικής πορείας του (1) MagAlg και (2) της ηλεκτροστατικής σύμπλεξης του MagAlg με πολύ-κατιοντικά PEG συμπολυμερή. Τα προϊόντα που παρήχθησαν μετά την σύμπλεξη του MagAlg με το QNPHOS-PEG και PLL-b-PEG θα αναφέρονται στη συνέχεια του κειμένου με τις ονομασίες MagPEG_a και MagPEG_b αντίστοιχα. 90

4.6.1 Παράμετροι αλληλεπίδρασης του MagAlg με τα συμπολυμερή Οι παράμετροι που διερευνήθηκαν για την επιτυχή σύμπλεξη του MagAlg με τα PEG κατιοντικά συμπολυμερή ήταν: Η σειρά της ανάμιξης των δύο διαλυμάτων (του πολυμερούς και του MagAlg). H ταχύτητα ανάμιξης κατά την προσθήκη. Η ρύθμιση του ph στο 7,4 πριν την διαδικασία της σύμπλεξης για το πολυμερικό διάλυμα και μετά την σύμπλεξη για το τελικό διάλυμα. Ύστερα από αρκετές σειρές δοκιμών έγινε εμφανές ότι η ταχύτητα της ανάμιξης κατά την προσθήκη των διαλυμάτων δεν επηρέασε το τελικό αποτέλεσμα, ενώ (a) η ρύθμιση του διαλύματος των πολυμερών σε ph 7.4 πριν την διαδικασία της ανάμιξης και (b) η σειρά της ανάμιξης των διαλυμάτων αποδείχθηκαν οι καθοριστικές παράμετροι για την επιτυχή σύμπλεξη των νανοφορέων. Στους πίνακες 4.7 και 4.8 συνοψίζεται η επίδραση αυτών των παραμέτρων στην σταθερότητα των νανοφορέων. Η αξιολόγηση της επιτυχούς σύμπλεξης των νανοφορέων με τα συμπολυμερή έγινε μέσω DLS και ηλεκτροκινητικών μετρήσεων (σχήμα 4.16). Στην περίπτωση της σύμπλεξης με το QN- PHOS (4.16a) και καθώς αυξάνει η μοριακή αναλογία των θετικά/αρνητικά φορτισμένων χημικών ομάδων παρατηρείται μία σταδιακή αύξηση του ζp η οποία αντανακλά τη μείωση των ελεύθερων ανιοντικών ομάδων της επιφάνειας του MagAlg. Σε μοριακή αναλογία ~0.3 το σύστημα εμφανίζει ισοηλεκτρικό σημείο καθώς το ζp αποκτά τιμή 0. Σε αυτές τις συνθήκες, ως γνωστόν, επέρχεται αποσταθεροποίηση του συστήματος. Πίνακας 4.7: Αποτελέσματα σταθερότητας του MagPEG_a συναρτήσει των παραμέτρων που μελετήθηκαν Σειρά Προσθήκης Ρύθμιση ph (7.4) D h (nm) Νανοσωματίδια στο πολυμερές Πολυμερές στα νανοσωματίδια Διαλύματος πολυμερούς πριν την προσθήκη Διαλύματος μετά την προσθήκη Μετά την σύμπλεξη Μετά την προσθήκη [NaCl] 0,3Μ 400 Χ 148 180 190 Χ 300 600 Ορισμένοι παράγοντες όπως η ταχύτητα ανάμιξης και ο χρόνος που αφήνονταν τα δείγματα για να έρθουν σε ισορροπία (24 ώρες μετά την ανάμιξη) επιλέχθηκαν εξαρχής και δεν μελετήθηκαν περαιτέρω. Οι θετικά φορτισμένες ομάδες προέρχονται από αμινομάδες του QN-PHOS και οι αρνητικά φορτισμένες είναι οι καρβοξυλομάδες του MagAlg. 91

Πίνακας 4.8:Αποτελέσματα σταθερότητας του MagPEG_b συναρτήσει των παραμέτρων που μελετήθηκαν Σειρά Προσθήκης Ρύθμιση ph (7.4) D h (nm) Νανοσωματίδια στο πολυμερές Πολυμερές στα νανοσωματίδια Πολυμερικού διαλύματος πριν την προσθήκη Διαλύματος μετά την προσθήκη Μετά την σύμπλεξη Μετά την προσθήκη [NaCl] 0,3Μ 160 Χ 128 140 200 Χ 170 300 Οι ηλεκτροστατικές δυνάμεις που ήταν υπαίτιες για την κολλοειδή σταθερότητα μειώνονται διαρκώς από την εξουδετέρωση του φορτίου των καρβοξυλομάδων από τα κατιοντικά μονομερή. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την μακροσκοπικώς παρατηρήσιμη συσσωμάτωση και την επακόλουθη κατακρήμνιση του συστήματος. Προχωρώντας όμως σε τιμές μεγαλύτερες από αυτή της κρίσιμης αναλογίας το σύστημα αποκτά θετικές τιμές ζp και η κολλοειδής σταθερότητα του συστήματος αποκαθίσταται. Το ίδιο μοτίβο φαίνεται να επαναλαμβάνεται και στην περίπτωση του PLL-PEG με την υδροδυναμική διάμετρο να παρουσιάζει μία απότομη αύξηση σε αναλογία ~0,2 κατιονικών/ανιονικών μερών και στη συνέχεια, προχωρώντας σε μεγαλύτερες τιμές, να επανέρχεται η σταθερότητα του συστήματος.το γεγονός ότι και στις δύο περιπτώσεις το ισοηλεκτρικό σημείο επέρχεται σε πολύ μικρότερη μοριακή αναλογία από την 1:1, δείχνει ότι τα πολυμερή (οι κατιοντικές τους συστάδες) αλληλεπιδρούν μόνο με μέρος των καρβοξυλομάδων του αλγινικού και συγκεκριμένα (υποθέτουμε) με αυτές οι οποίες βρίσκονται στον εξωτερικό φλοιό του αλγινικού. Η υπόθεση αυτή βασίζεται στις στερεοχημικές αλληλεπιδράσεις που θα αναπτύσσονται καθώς τα συμπολυμερή πλησιάζουν την πολυμερική κορώνα του MagAlg και πρώτα θα αλληλεπιδρούν (η κατιοντική συστάδα) με τις επιφανειακές καρβοξυλομάδες και θα ακινητοποιούνται σε αυτό το σημείο. Απ την άλλη μεριά, η PEG αναμένεται να δημιουργεί την εξωτερική πλέον κορώνα σταθεροποιώντας το σύστημα, όπως ήταν και ο απώτερος στόχος της μελέτης αυτής. Αυτό επιβεβαιώθηκε και στη συνέχεια από τις μελέτες σταθερότητας που περιγράφονται στην παράγραφο 4.6.2. Από την σύγκριση της υδροδυναμικής διαμέτρου των νανοφορέων πριν και μετά την διαδικασία της σύμπλεξης προκύπτει ότι και στις δύο περιπτώσεις καταγράφεται μία αύξηση της τάξης των 40-50 nm (σχήμα 4.16c) η οποία πιθανώς θα μπορούσε να αποδοθεί στο επιπλέον μήκος των PEG συμπολυμερών που έχουν πλέον δημιουργήσει έναν δεύτερο πολυμερικό φλοιό γύρω από την επιφάνεια των νανοσωματιδίων. Τέλος έγινε εκτίμηση της σταθερότητας των PEG συζευγμένων νανοφορεών στην πάροδο του χρόνου και όπως αποτυπώνεται και από το διάγραμμα του σχήματος 4.16d η υδροδυναμική διάμετρος δεν μεταβλήθηκε ακόμα και μετά την πάροδο αρκετών ημερών (μετά την πάροδο των συγκεκριμένων ημερών δε συνεχίστηκε η μελέτη). Δυστυχώς λόγω δυσλειτουργίας της συσκευής Nano ZetaSizer την περίοδο των πειραμάτων δεν κατέστει δυνατή η καταγραφή των τιμών του ζ-δυναμικού για τις συγκεκριμένες μετρήσεις. 92

Zeta-p (mv) D h (nm) Feed ( mol Cationic / µmol Carboxylate) 5000 2500 1000 750 500 250 100 75 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 2 4 6 8 (a) IP MagPEG_a D h Zeta ph 7,4 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 2 4 6 8 10 Feed (µg QNPHOS / µg Alg) 20 10 0-10 -20 D h (nm) 320 280 240 200 160 120 Feed (µmol Poly(Lysine) / µmol Alg) 0.05 0.1 0.5 1 5 (b) MagPEG_b D h 80 0.1 1 10 Feed (µg Poly(Lysine) / µg Alg) 300 D h (nm) 250 200 150 (d) MagPEG_a 100 1 2 3 4 5 6 15 16 Days Σχήμα 4.16: Εξάρτηση της D h και του ζ p από το feed (a) του QNPHOS-PEG και (b) του PLL-PEG. (c) Μεταβολή της D h του MagAlg πριν και μετά την διαδικασία σύμπλεξης και (d) σταθερότητα των PEG κολλοειδών σε διάστημα 15 ημερών. 4.6.2 Σταθερότητα παρουσία ηλεκτρολυτών Η επιτυχής τροποποίηση της επιφάνειας των νανοσωματιδίων εξετάστηκε περαιτέρω μελετώντας την απόκριση της υδροδυναμικής διαμέτρου σε διαλύματα αυξημένης ιοντικής ισχύος. Όπως προκύπτει από τα διαγράμματα 4.17 a και b η σταθεροποίηση της υδροδυναμικής διαμέτρου (μετά την εμφάνιση του ισοηλεκτρικού σημείου) δεν εγγυάται την σταθερότητα των νανοφορέων στην παρουσία NaCl. Για να επέλθει αυτή η σταθερότητα απαιτείται περίσσεια των κατιοντικών έναντι των ανιοντικών περιοχών η οποία πρέπει να φτάσει σε μοριακή αναλογία περίπου 4 προς 1. Σε αυτή την μοριακή αναλογία το σύστημα εμφανίζει εξαιρετική σταθερότητα ακόμα και σε συγκεντρώσεις 0.3Μ NaCl, με την μέση Dh να παρουσιάζει μία πολύ μικρή αύξηση τις πρώτες ώρες της προσθήκης και στη συνέχεια να μεταβάλλεται ελάχιστα ακόμα και μετά από 72 ώρες όπως φανερώνουν οι μετρήσεις DLS των διαγραμμάτων 4.17 c και d. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων DLS παρουσιάζονται αναλυτικά και στον πίνακα 4.9. 93

D h (nm) Feed ( mol Cationic / µmol Carboxylate) 0.8 1 2 4 6 8 400 350 300 250 200 150 100 (a) No Salt NaCl 0,3M 24H NaCl 0,3M 2H MagPEG_a 0.8 1 2 4 6 8 10 Feed (µg QNPHOS / µg Alg) D h (nm) Feed ( mol Cationic / µmol Carboxylate) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 400 No Salt 280 NaCl 0.15 M (b) NaCl 0.3 M NaCl 0.15 M Day3 240 NaCl 0.3 M Day 3 200 160 120 MagPEG_b 0 5 10 15 20 Feed (µg Poly(Lysine) / µg Alg) Intensity (%) 20 16 12 8 4 0 MagPEG_a (144 nm) 2H 0,3M [NaCl] (170 nm) 24H 0,3M [NaCl] (175 nm) ph 7,4 10 100 1000 D h (nm) (c) Σχήμα 4.17: Μεταβολή της D h παρουσία [NaCl] 0.3Μ για το (a) MagPEG_a και (b) MagPEG_b σε διάφορα feeds. (b),(c) Διαγράμματα DLS των MagPEG_a και MagPEG_b αντίστοιχα για διάφορα χρονικά σημεία μετά την προσθήκη NaCl. Intensity (%) 20 16 12 8 4 0 MagPEG_b (148 nm) 24H 0.3M [NaCl] 72H 0.3M [NaCl] (180 nm) ph 7,4 10 100 1000 D h (nm) (d) Πίνακας 4.9: Σύγκριση των επιμέρους κατανομών μεγεθών της D h πριν και μετά την προσθήκη NaCl στους PEGylated νανοφορείς. Z-average (nm) by Intensity (nm) by Volume (nm) by Number (nm) MagPEG_a MagPEG_b Χωρίς NaCl 139 ± 3 144 134 86 2 Hours [NaCl] 0,3M 173 ± 3 170 168 118 24 Hours [NaCl] 0,3M 178 ± 2 175 190 90 Χωρίς NaCl 128 ± 1 148 122 77 24 Hours [NaCl] 0,3M 140 ± 2 164 148 96 72 Hours [NaCl] 0,3M 144 ± 2 180 152 72 Μέσω μετρήσεων θολερομετρίας (turbidimetry) έγινε συμπληρωματική μελέτη για την σταθερότητα των κολλοειδών σε υδατικά διαλύματα [NaCl] 0,3M. Με την συγκεκριμένη τεχνική μπορούν να εξαχθούν σε μικρό χρονικό διάστημα πολύτιμες πληροφορίες για την σταθερότητα του συστήματος στην πάροδο του χρόνου. Η συνεχής ανάδευση του κολλοειδούς κατά την διάρκεια της μέτρησης δίνει την δυνατότητα στο σύστημα να έρθει σε κατάσταση ισορροπίας σε πολύ μικρότερο χρονικό διάστημα από ότι κανονικά θα χρειαζόταν. 94

Absorbance (a.u.) (iii) MagAlg 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Time (sec) Σχήμα 4.18: Καμπύλες μετρήσεων θολερομετρίας (i) MagPEG_b } self assembly (ii) MagPEG_a (iv) MagAlg PEG Mw2000 (v) Control, neat MagAlg, no salt Στο διάγραμμα του σχήματος 4.18 παρουσιάζονται συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα των μετρήσεων θολερομετρίας. To MagAlg παρουσία [NaCl] 0,3Μ παρουσιάζει μία απότομη πτώση από την αρχή κιόλας της μέτρησης (καμπύλη iii), ένδειξη της άμεσης συσσωμάτωσης του MagAlg στην παρουσία ιόντων. Αντίθετα μετά την επιφανειακή τροποποίηση του με τα PEG κατιοντικά συμπολυμερή το κολλοειδές παρουσιάζει μία εντελώς διαφορετική εικόνα (καμπύλες (i) και (ii)) επιδυκνείοντας μία σχεδόν γραμμική συμπεριφορά ως προς τον χρόνο ειδικά για την περίπτωση (i) που αντιστοιχεί στην σύμπλεξη με το PLL-PEG. Στην περίπτωση αυτή το σύστημα παρουσιάζει σχεδόν μηδενική κλίση και είναι πανομοιότυπη με την καμπύλη (v) η οποία αντιστοιχεί στην συμπεριφορά του MagAlg χωρίς την παρουσία NaCl, δείγμα της εξαιρετικής σταθερότητας που πλέον έχει αποκτήσει το τροποποιημένο MagAlg. Τέλος η καμπύλη (iv) αντιστοιχεί σε δείγμα MagAlg στο οποίο έχει απλά προστεθεί PEG σε ίδια αναλογία μάζας με τα MagPEG_a και MagPEG_b. Η μηδενική σταθερότητα που επιδεικνύει στην παρουσία NaCl είναι άλλη μία απόδειξη και συνηγορεί περαιτέρω στο συμπέρασμα ότι η αποκτηθείσα κολλοειδής σταθερότητα του τροποποιημένου MagAlg δεν προκύπτει απλά από την παρουσία της PEG στο διάλυμα αλλά οφείλεται στην επιτυχή τροποποίηση/σύνδεση της επιφάνειας των νανοφορέων MagAlg με τα PEG κατιοντικά συμπολυμερή. 4.6.3 Αλληλεπιδράσεις με DOX Όπως και στην περίπτωση του MagAlg, έγινε εκτίμηση των αλληλεπιδράσεων των τροποποιημένων νανοφορέων με το αντικαρκινικό φάρμακο DOX. Αρχικά ελέγχθηκε μέσω μετρήσεων θολερομετρίας αν η τροποποίηση του MagAlg βελτίωσε την κολλοειδή σταθερότητα του συστήματος παρουσία της DOX. Για λόγους σύγκρισης το μη τροποποιημένο MagAlg υποβλήθηκε στην ίδια δοκιμασία. Όπως γίνεται φανερό από το διάγραμμα του σχήματος 4.19a το σύστημα πλέον παρουσιάζει πλήρη σταθερότητα σε υδατικό διάλυμα DOX. Η διαφορά όπως φαίνεται και στην φωτογραφία 4.19b ήταν αξιοσημείωτη. Αξίζει μάλιστα να σημειωθεί ότι η αναλογία DOX/νανοφορέα που διεξήχθει το 95

πείραμα ήταν σχεδόν διπλάσια (0,4) της κρίσιμης αναλογίας του σκέτου MagAlg (~0.25) στην οποία είχε καταγραφεί η αποσταθεροποίηση του συστήματος. Absorbance (au) 1.05 0.90 0.75 0.60 0.45 (a) MagPEG_b MagAlg DOX feed 0.4 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Time (sec) Σχήμα 4.19: (a) Σύγκριση της σταθερότητας του MagAlg πριν και μετά την τροποποίηση του μέσω θολερομετρίας. (b) Εικόνες των δειγμάτων MagPEG_a και MagAlg σε διάλυμα DOX μετά το τέλος της μέτρησης. 4.6.3.1 Μελέτη δέσμευσης δοξορουβικίνης Όπως φάνηκε από τα πειράματα φόρτωσης του φαρμάκου DOX που ακολούθησαν η PEGυλίωση των νανοφορέων είχε επίπτωση στην ποσότητα φαρμάκου που μπορούν να δεσμεύσουν. Στον πίνακα 4.10 αναφέρονται συγκριτικά τα ποσοστά δέσμευσης και απόδοσης δέσμευσης της DOX πριν και μετά την τροποποίηση των νανοφορέων. Συγκεκριμένα για λόγο μάζας φαρμάκου/νανοφορέα 0,4 η ικανότητα δέσμευσης της DOX μειώνεται από το ~21% για το MagAlg στο ~ 8% για το MagPEG_a και μόλις στο ~ 3,5% για το MagPEG_b, με την απόδοση δέσμευσης να έχει επίσης μειωθεί από ~70% σε ~19,3 και ~8% αντίστοιχα. Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο 4.4.1 ο κύριος μηχανισμός δέσμευσης των μορίων δοξορουβικίνης από τους νανοφορείς είναι μέσω των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται ανάμεσα στις καρβοξυλομάδες του αλγινικού και τις θετικά φορτισμένες αμινομάδες της DOX. Επομένως, αυτή η (μεγάλη) μείωση του ποσοστού φόρτωσης μπορεί να χαρακτηριστεί και ως αναμενόμενη αφού πλέον ποσοστό των καρβοξυλομάδων (και ειδικά των επιφανειακών) είναι κατειλημμένες από τις κατιοντικές ομάδες των PEG συμπολυμερών μειώνοντας με αυτό τον τρόπο το ποσοστό των μορίων DOX που μπορούν να δεσμευτούν από τους νανοφορείς. Πίνακας 4.10: Σύγκριση ποσοστών δέσμευσης DOX από τους νανοφορείς πριν και μετά την τροποποίηση για λόγο μαζών φαρμάκου/νανοφορέων 0,4. Δείγμα % wt Δέσμευση DOX % Απόδοση δέσμευσης MagAlg 21,2 73 MagPEG_a 7,7 19,3 MagPEG_b 3,2 7,93 Η υδροδυναμική διάμετρος των νανοφορέων εξετάστηκε μέσω μετρήσεων DLS προκειμένου να επιβεβαιωθεί η σταθερότητα τους μετά από την διαδικασία της φόρτωσης δοξορουβικίνης. Όπως φαίνεται από τα διαγράμματα του σχήματος 4.20 η Dh των νανοφορέων 96

έχει μεταβληθεί ελάχιστα αποδεικνύοντας έτσι την σταθερότητα του συστήματος. Μάλιστα εξετάζοντας πιο προσεκτικά τα αποτελέσματα του DLS (πίνακας 4.11) παρατηρούμε ότι η δέσμευση της DOX από τους νανοφορείς όχι μόνο δεν έχει προκαλέσει την αύξηση της υδροδυναμικής διαμέτρου τους αλλά και στις δύο περιπτώσεις έχει επάγει μία μικρή μείωση του μεγέθους της τάξης των περίπου ~ 6 nm. Αυτό πιθανώς θα μπορούσε να αποδοθεί στην δέσμευση των μορίων DOX από τις ελεύθερες εσωτερικές καρβοξυλομάδες του αλγινικού πολυμερικού φλοιού. Η εξουδετέρωση του φορτίου των καρβοξυλομάδων επάγει την μείωση των ηλεκτροστατικών απώσεων μεταξύ των μονομερών του αλγινικού. Αυτό έχει σαν συνέπεια μία μικρή συστολή των μονομερών του αλγινικού η οποία και επιφέρει μια μικρή μείωση στην υδροδυναμική διάμετρο των νανοφορέων. Μόνο που σε αυτή την περίπτωση δεν διακυβεύεται η κολλοειδής σταθερότητα αφού οι αλυσίδες PEG που πλέον υπάρχουν στην επιφάνεια των νανοφορέων δεν τους επιτρέπουν να πλησιάσουν μεταξύ τους σε σημείο που να επέλθει η συσσωμάτωση. Intensity (%) 24 20 16 12 8 4 0 (a) by intensity by number by volume by intensity by number by volume 100 1000 D h (nm) Before DOX After DOX MagPEG_a Σχήμα 4.20: Διαγράμματα DLS των MagPEG_a και MagPEG_b αντίστοιχα πριν και μετά την δέσμευση DOX Intensity (%) 24 20 16 12 8 4 0 (b) by intensity by number Before DOX by volume by intensity by number After DOX by volume MagPEG_b 10 100 1000 D h (nm) Πίνακας 4.11: Σύγκριση των επιμέρους κατανομών μεγεθών της D h από τα πειράματα δέσμευσης DOX Z-average (nm) by Intensity (nm) by Volume (nm) by Number (nm) MagPEG_a MagPEG_b Χωρίς DOX 145 ±2 169 156 100 DOX 138 ± 2 158 135 83 Χωρίς DOX 131 ± 1 156 132 81 DOX 127 ± 1 150 124 77 4.6.3.2 Μελέτη αποδέσμευσης Δοξορουβικίνης Από το διάγραμμα του σχήματος 4.21 προκύπτει ότι η κινητική της αποδέσμευσης σε PBS παρουσιάζει παρόμοια μορφή με αυτή που είχε επιδείξει το μη-τροποποιημένο MagAlg στα αντίστοιχα πειράματα της παραγράφου 4.4.2. Μία διαφορά που εντοπίζεται ανάμεσα σε αυτά τα δύο πειράματα είναι ότι το MagPEG_a παρουσιάζει μικρότερο ρυθμό αποδέσμευσης στα αρχικά στάδια του πειράματος (και συνολικά πιο σταθερό ρυθμό κατά την διάρκεια της αποδέσμευσης). 97

Αυτό του παρέχει την δυνατότητα να κρατάει εγκλωβισμένο το φορτίο του για ακόμα μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, χωρίς όμως αυτό να συνεπάγεται μικρότερη αποδέσμευση φαρμάκου, αφού όπως διαπιστώνεται στην ολοκλήρωση του 24ώρου οι καμπύλες αποδέσμευσης των MagAlg και MagPEG_a συμπίπτουν. Αυτή η μείωση του ρυθμού αποδέσμευσης στην αρχή, πιθανόν να οφείλεται στην προστασία που πλέον παρέχει ο εξωτερικός PEG φλοιός στα ηλεκτροστατικώς δεσμευμένα μόρια της DOX, η πλειοψηφία των οποίων έχει βρει καταφύγιο εντός του αρχικού αλγινικού φλοιού. Αυτό έχει σαν συνέπεια την πιο αργή διάχυση της DOX. Cumulative Release (%) 50 40 30 20 10 (a) MagPEG_a MagPEG_b MagAlg 10 20 30 40 50 60 70 80 t (hours) PBS ph 7.4 Σχήμα 4.21: Καμπύλες αποδέσμευσης των νανοφορέων σε διάλυμα (a) νερό-pbs και (b) αλβουμίνη-pbs. Προκειμένου να εξαχθούν επιπλέον πληροφορίες για την φύση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ DOX και νανοφορέων αλλά και για την καλύτερη πορσομοίωση των φυσιολογικών συνθηκών στο αίμα (το οποίο περιέχει~ 4% κ.β. αλβουμίνη), πραγματοποιήθηκαν πειράματα αποδέσμευσης σε διάλυμα αλβουμίνης-pbs σε ph 7,4. Αυτή η αλλαγή έχει επιφέρει μία σημαντική αύξηση στο ποσοστό της αποδέσμευσης της DOX από τους νανοφορείς, σημειώνοντας στις πέντε πρώτες ώρες ~ 21% αποδέσμευση και για τους δύο νανοφορείς ενώ στο 24ώρο έχει φτάσει στο ~31% για το MagPEG_a και στο 38% για το MagPEG_b. Η αυξημένη αποδέσμευση παρουσία της αλβουμίνης μπορεί ίσως να αποδοθεί στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις που μπορούν να αναπτύχθούν μεταξύ του φαρμάκου και της πρωτείνης. Η αλβουμίνη με ισοηλεκτρικό σημείο ~4,7, έχει αρκετά μεγάλο ποσοστό καρβοξυλομάδων, επομένως λειτουργεί ανταγωνιστικά με το αλγινικό για τη δέσμεση της DOX, και δημιουργεί φιλικότερο περιβάλλον για την διαλυτοποίηση της DOX σε αυτό, από ότι στην περίπτωση του συστήματος νερό-pbs. Οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στην DOX και την αλβουμίνη μπορεί επίσης να έχουν παρόμοια δράση και θα πρέπει να αναφερθούν. Οπωσδήποτε διαδραματίζουν μικρότερο ρόλο όπως επιβεβαιώθηκε από δύο πειράματα ελέγχου, κατά τα οποία στην μία περίπτωση το σύστημα MagAlg-DOX εμβαπτίστηκε σε υδατικό διάλυμα ph=4 και την άλλη σε διάλυμα ακετόνης. Παρατηρήθηκε ότι η αποδεσμευση του φαρμάκου ήταν κατά πολύ εντονότερη στην πρώτη περίπτωση. Δηλαδή μειώνοντας το ph, επάγεται πρωτονίωση των καρβοξυλομάδων του αλγινικού, μείωση των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων και αποδέσμευση της DOX. Στην περίπτωση της ακετόνης (ενός λιγότερου πολικού διαλύτη) δεν παρατηρήθηκε σημαντική αποδέσμευση. Αυτό συνεπάγεται πως οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις έχουν μικρότερο ρόλο στη δέσμευση της DOX στο MagAlg.. Cumulative Release (%) 50 40 30 20 10 MagPEG_a MagPEG_b (b) Albumin-PBS ph 7.4 5 10 15 20 25 30 t (hours) 98

4.7 In vitro μελέτη κυτταροτοξικότητας Η κυτταρό-τοξικότητα των νανοφορέων εκτιμήθηκε μέσω της δοκιμασίας MTT. Για αυτή τη σειρά πειραμάτων επιλέχθηκαν o νανοφορέας MagPEG_b και ο νανοφορέας MagAlg για λόγους σύγκρισης πριν και μετά την διαδικασία τροποποίησης. Ο MagPEG_b επιλέχθηκε έναντι του MagPEG_a λόγω της πιο σταθερής συμπεριφοράς που παρουσίασε σε διαλύματα αυξημένης ιοντικής ισχύος καθώς σκοπός αυτής της κυτταροτοξικής μελέτης είναι η μετέπειτα in vivo χορήγηση των νανοφορέων για εφαρμογές απεικόνισης. Η κυτταρική σειρά που επιλέχθηκε ήταν η MDA-MB-231, η οποία είναι μία ανθρώπινη κυτταρική σειρά μεταστατικού καρκίνου του μαστού. Αφού έγινε η καλλιέργεια των κυττάρων όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο του πειραματικού μέρους, πραγματοποιήθηκε προσθήκη των νανοφορέων στο διάλυμα των κυττάρων και ακολούθησε επώαση διάρκειας τεσσάρων ωρών. Το εύρος των συγκεντρώσεων νανοφορέα που χρησιμοποιήθηκε ήταν 0,05 έως 4 mg/ml για τον νανοφορέα MagAlg και 0,05 έως 1 mg/ml για τον MagPEG_b. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων παρατίθενται στα διαγράμματα του σχήματος 4.22. Όπως προκύπτει από την ανάγνωση των αποτελεσμάτων στην περίπτωση του MagAlg η βιωσιμότητα των κυττάρων υπήρξε εξαιρετικά υψηλή παραμένοντας μεγαλύτερη του 80% ακόμα και για την υψηλότερη συγκέντρωση που εξετάστηκε (4 mg/ml ή 50 mm σε ιόντα Fe). Τα αποτελέσματα των μετρήσεων των τροποποιημένων με PEG κατιοντικά συμπολυμερή νανοφορέων υπήρξαν εξίσου ικανοποιητικά, εμφανίζοντας ελαφρώς μόνο μειωμένα ποσοστά βιωσιμότητας των κυττάρων συγκριτικά με τους μη-τροποποιημένους νανοφορείς. Πιο συγκεκριμένα, από τη σύγκριση της βιωσιμότητας των κυττάρων παρουσία των δύο νανοφορέων (σχήμα 4.23 και πίνακας 4.12) φαίνεται ότι ο MagPEG_b νανοφορέας επάγει μία μικρή τοξικότητα στα κύτταρα ακόμα και σε χαμηλές συγκεντρώσεις, η οποία κυμαίνεται περίπου στο ~10% συγκριτικά με το MagAlg. Cell Viability (%) 100 80 60 40 20 0 (a) Control 0.05 0.1 0.2 0.5 1 2 Concentration (mg/ml) MagAlg 4 DMSO Control 0.05 Σχήμα 4.22: Ιστογράμματα βιωσιμότητας κυττάρων μετά από 4ώρη επώαση με τους νανοφορείς Προχωρώντας σε υψηλότερες συγκεντρώσεις αυτό το αρχικό ποσοστό σχεδόν διατηρείται και αυξάνεται ελαφρά μόνο στην υψηλότερη συγκέντρωση του MagAlgPEG_b φτάνοντας περίπου στο ~14%. Φυσικά το ποσοστό βιωσιμότητας εξακολουθεί να παραμένει υψηλό (~73%). Αυτή η μικρή αύξηση της τοξικότητας είναι αναμενόμενη αφού όπως αναφέρεται βιβλιογραφικά 160, 161, 162 τα πολύ-κατιονικά πολυμερή επάγουν αυτή την συμπεριφορά. 80 60 40 20 Cell Viability (%)100 0 (b) 0.1 0.2 0.5 1 Concentration (mg/ml) MagPEG_b DMSO 99

Cell Viability (%) 100 80 60 40 20 MagAlg MagPEG_b 0 0.05 1 Concentration (mg/ml) Σχήμα 4.23: Συγκριτικό ιστόγραμμα βιωσιμότητας των κυττάρων για τους δύο νανοφορείς Πίνακας 4.12: Βιωσιμότητα κυττάρων (%) μετά από 4 ώρες επώασης μαζί με τους νανοφορείς Συγκέντρωση Νανοφορέα (mg/ml) MagAlg MagPEG_b 0,05 98,0 ± 3,5 90,0 ± 9,0 0,1 98,9 ± 3,5 89,6 ± 10,5 0,2 93,3 ± 7,2 83,6 ± 8,7 0,5 89,0 ± 5,5 79,4 ± 5,2 1 86,1 ± 3,4 72,7 ± 1,8 4.8 In vitro και in vivo μελέτη των νανοφορέων με την μέθοδο MSOT Η in vitro μελέτη των νανοφορέων με την χρήση phantom gel αγαρόζης έγινε με σκοπό να εξακριβωθεί αν οι νανοφορείς MagPEG_b μπορούν να ανιχνευθούν (μέσω του οπτοακουστικού φαινομένου) με την μέθοδο της MultiSpectral Optoacoustic Tomogrpahy (MSOT). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε in vivo χορήγηση τους σε ποντίκια στα οποία είχε πραγματοποιηθεί ανάπτυξη καρκινικών όγκων μέσω αλλομοσχευμάτων. 4.8.1 In vitro μελέτη Αρχικά εξετάστηκε το φάσμα απορρόφησης των νανοφορέων MagPEG_a ώστε να εξακριβωθεί η συμπεριφορά τους στην περιοχή του εγγύς υπέρυθρου (~700-900 nm). Το MagPEG_b μην έχοντας τροποποιηθεί περαιτέρω με κάποια NIR-χρωμοφόρο μόριο επέδειξε μία ομοιόμορφη απορρόφηση στο εγγύς υπέρυθρο (όπως και ήταν αναμενόμενο), παρουσιάζοντας γραμμική αύξηση της οπτικής πυκνότητας (Optical Density) συναρτήσει της συγκέντρωσης (σχήμα 4.24b). Προκειμένου να διαπιστωθεί αν οι νανοφορείς είναι ικανοί να εκπέμψουν αντίστοιχο οπτοακουστικό σήμα ανάλογο της συγκέντρωσης τους και να ανιχνευθούν μέσω της μεθόδου MSOT πραγματοποιήθηκαν in vitro πειράματα με τη χρήση phantoms. Όπως φαίνεται από το διάγραμμα 4.24c οι νανοφορείς κατά την ακτινοβόληση τους παρουσιάζουν και σε αυτή 100

την περίπτωση μία γραμμική αύξηση του παραγόμενου σήματος συναρτήσει της συγκέντρωσης. Η τεχνική MSOT (παράγραφος 2.7) βασίζεται στην φασματική διαφοροποίηση του οπτοακουστικού σήματος που παράγεται από το σύνολο των φωτο-απορροφητικών παραγόντων του εξεταζόμενου δείγματος. Επομένως καταλληλότεροι κρίνονται οι παράγοντες που παρουσιάζουν ένα χαρακτηριστικό φάσμα απορρόφησης στην περιοχή του NIR *** προκειμένου να είναι αποτελεσματική η διαφοροποίηση τους από την μη-ειδική απορρόφηση του ιστού. Στα συγκεκριμένα in vitro πειράματα η παραγωγή οποτοακουστικού σήματος μπορεί να προέλθει από την απορρόφηση των νανοφορέων, της μαύρης μελάνης που χρησιμοποιείται σαν δείκτης αναφοράς και του phantom γέλης. Από την επεξεργασία των δεδομένων με τη χρήση του προγράμματος ViewMSOT προκύπτει ότι ο διαχωρισμός του σήματος των νανοφορέων από το σήμα που παράγει η μαύρη μελάνη και το υπόβαθρο είναι εφικτός παρά την ομοιόμορφη απορρόφηση των νανοφορέων. (σχήμα 4.25). Absorbance (au) 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 (a) 0.0 400 500 600 700 800 900 Wavelength (nm) INK 0.1 mg/ml 0.15 mg/ml 0.2 mg/ml 0.5 mg/ml 1 mg/ml MagPEG_b Optical Density (au) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 (b) MagPEG_b R 2 =0.9997 0.1 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Concentration (mg/ml) Optoacoustic signal (MSOT) (au) 25000 20000 15000 10000 5000 (c) MagPEG_b R 2 =0.9954 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Optical Density @ 780 nm (au) Σχήμα 4.24: (a) Φάσματα απορρόφησης του MagPEG_b για διάφορες συγκεντρώσεις. (b) Γραμμική εξάρτηση της οπτικής πυκνότητας από τη συγκέντρωση. (c) Ένταση οπτοακουστικού σήματος MSOT σαν συνάρτηση της OD. (d) Κανονικοποιημένες καμπύλες του οπτοακουστικού σήματος και της απορρόφησης για το MagPEG_b. Normalized Signal 1.2 1.0 0.8 0.6 (d) Spectrometer MSOT Phantom MagPEG_b 0.4 650 700 750 800 850 900 Wavelength (nm) *** Στην φασματική περιοχή του εγγύς υπερύθρου η απορρόφηση των ενδογενών φωτο-απορροφητικών παραγόντων του ιστού (αιμοσφαιρίνη, μελανίνη, λιπίδια, κτλ) ελαχιστοποείται. Σε in vitro μελέτες MSOT με τη χρήση phantoms, χρησιμοποιείται μαύρη μελάνη οπτικής πυκνότητας ~ 0,4% σαν σήμα αναφοράς στην μετέπειτα επεξεργασία των αποτελεσμάτων 101

Σχήμα 4.25: (a) Κυλινδρικό phantom γέλης αγαρόζης-γαλακτώματος λιπιδίων που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα MSOT, διακρίνονται τα λεπτά πλαστικά σωληνάρια όπου ήταν τοποθετημένα τα δείγματα του νανοφορέα και της μαύρης μελάνης σαν σήμα αναφοράς. (b) Παραχθείσα εικόνα μετά την επεξεργασία των δεδομένων όπου έχει πραγματοποιηθεί διαχωρισμός του σήματος των νανοφορέων (πράσινο χρώμα) και της μελάνης (κόκκινο χρώμα). (c) Πάνελ εικόνων MagPEG_b αυξανόμενων συγκεντρώσεων. Η ομοιόμορφη σκέδαση του φωτός από το phantom αγαρόζης-γαλακτώματος λιπιδίων δίνει μία ιδανική προσέγγιση της απορρόφησης από ανθρώπινους ιστούς. Η in vivo μελέτη όμως μπορεί να είναι προβληματική εξαιτίας της ετερογένειας που γενικώς εμφανίζουν οι ιστοί και της παρουσίας ποικίλων φωτο-απορροφητικών παραγόντων. Για να διαπιστωθεί αν σε αυτές τις συνθήκες είναι δυνατή η ανίχνευση των νανοφορέων πραγματοποιήθηκε ex vivo μελέτη των νανοφορέων σε ιστό προερχόμενο από στήθος κοτόπουλου. Και σε αυτή την περίπτωση ο διαχωρισμός του σήματος των νανοφορέων ήταν επιτυχής. Στο σχήμα 4.26 παρατίθεται τρισδιάστατη επεξεργασμένη εικόνα του πειράματος όπου διακρίνονται τα σημεία χορήγησης των νανοφορέων (μέσω ένεσης) με κόκκινο χρώμα και η κατανομή των νανοφορέων εντός του ιστού (με μπλε χρώμα). Σχήμα 4.26: Τρισδιάστατη εικόνα MSOT στην οποία φαίνεται η κατανομή των νανοφορέων εντός του ιστού (μπλέ χρώμα). Τα σημεία ένεσης είχαν σημανθεί με μελάνη και παρoυσιάζονται με κόκκινο χρώμα στην επιφάνεια του ιστού 102

4.8.2 In vivo μελέτη Για την in vivo μελέτη των νανοφορέων MagPEG_b χρησιμοποιήθηκαν θηλυκά ποντίκια 8 εβδομάδων τύπου Athymic Nude FOXN1 στα οποία είχαν αναπτυχθεί αλλομοσχεύματα του καρκινικού μοντέλου 4Τ1 (τύπος καρκίνου του μαστού) 142. Αρχικά εξετάστηκε η ικανότητα των νανοφορέων για φυσική στόχευση του καρκινικού όγκου. Το χαρακτηριστικό του καρκινικού μοντέλου 4Τ1 είναι η υψηλή διαπερατότητα που εμφανίζει το αγγειακό του σύστημα. Επομένως εφόσον οι νανοφορείς παραμείνουν αρκετό χρονικό διάστημα στην κυκλοφορία του αίματος μπορούν μέσω του φαινομένου EPR (Enhanced Permeation and Retention) να μεταναστεύσουν στην περιοχή του όγκου και να συσσωρευτούν εκεί. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε ενδοφλέβια χορήγηση των νανοφορέων και κατόπιν απεικόνιση του όγκου κατά τις χρονικές στιγμές των 5 λεπτών, μίας ώρας και τεσσάρων ωρών μετά το πέρας της χορήγησης. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων (σχήμα 4.27) δείχνουν εμφανή σταδιακή συσσώρευση του MagPEG_b στην περιοχή του όγκου. Αναλύοντας περαιτέρω τις εικόνες MSOT γίνεται φανερό ότι ήδη από την 1 η ώρα της χορήγησης έχει συγκεντρωθεί ικανή ποσότητα νανοφορέων στην περιοχή του όγκου ώστε να είναι εφικτή η ανίχνευση τους, ενώ παράλληλα η κυκλοφορία τους στην ροή του αίματος συνεχίζεται κανονικά. Μετά το πέρας των τεσσάρων ωρών η συσσώρευση των νανοφορέων στον καρκινικό ιστό παραμένει σε υψηλά επίπεδα ενώ το μεγαλύτερο μέρος τους φαίνεται να έχει απομακρυνθεί από την ροή του αίματος. Επομένως το MagPEG_b έδειξε ότι μπορεί να επάγει την φυσική στόχευση του 4Τ1 μέσω του φαινομένου EPR στο διάστημα των τεσσάρων ωρών που διήρκεσε το πείραμα. Σχήμα 4.27: (a) Εικόνα MSOT πριν την χορήγηση των νανοφορέων όπου φαίνεται το φυσικό background που δίνει ο ιστός. Εικόνες MSOT από (b) 5 λεπτά (c) μία ώρα και (d) τέσσερεις ώρες μετά την χορήγηση των νανοφορέων. 103

Σχολιάζοντας περαιτέρω τα αποτελέσματα του MSOT αξίζει να σημειωθεί ότι προηγούμενες μελέτες βιοκατανομής που είχαν πραγματοποιηθεί για το μη-pegυλιωμένο MagAlg 119 είχαν δείξει ότι μετά από μία ώρα, περίπου το 95% της χορηγηθείσας δόσης είχε απομακρυνθεί από την κυκλοφορία του αίματος. Συγκρίνοντας αυτό το αποτέλεσμα με την μελέτη MSOT αναδεικνύεται περαιτέρω η επιτυχής τροποποίηση των νανοφορέων με τα PEG συμπολυμερή, δίνοντας πλέον την δυνατότητα στους νανοφορείς να ελαχιστοποιήσουν τις αλληλεπιδράσεις τους με τις πρωτεΐνες του αίματος παρατείνοντας την κυκλοφορία τους στην ροή του αίματος για πολλαπλάσιο χρονικό διάστημα. Έτσι ακόμα και τέσσερεις ώρες μετά την χορήγηση τους είναι δυνατή η ανίχνευση τους στην κυκλοφορία του αίματος χωρίς ωστόσο να μπορεί να ποσοτικοποιηθεί το ποσοστό αυτό αφού ένα μειονέκτημα της τεχνικής MSOT έγκειται στο ότι μπορεί να γίνει δισδιάστατη απεικόνιση μίας μόνο τομής κάθε φορά (σχήμα 4.28). Αυτό συνεπάγεται ότι με την συγκεκριμένη τεχνική μπορούν να συλλεχθούν ποιοτικές και όχι ποσοτικές πληροφορίες της in vivo κατανομής των νανοφορέων. Σχήμα 4.28: (a) Σχηματική αναπαράσταση και (b) φωτογραφία της πειραματικής διάταξης και των επιμέρους στοιχείων που χρησιμοποιήθηκαν για τα in vivo πειράματα. (c) Αναπαράσταση του επιπέδου (πράσινο πλαίσιο) των ανατομικών εικόνων που παράγονται μέσω της τεχνικής MSOT 163 Ένα ακόμη ενδιαφέρον στοιχείο προκύπτει από την χαρτογράφηση των νανοφορέων στην περιοχή του όγκου. Στις εικόνες του σχήματος 4.29a και c παρουσιάζονται με μπλε χρώμα οι περιοχές του όγκου που εμφανίζουν μεγάλη συγκέντρωση μη-οξυγονωμένης αιμοσφαρίνης, φαινόμενο που αποτελεί χαρακτηριστικό της υποξίας. Συγκρίνοντας την κατανομή των νανοφορέων στην μία και στις τέσσερεις ώρες (σχήμα 4.29b και d αντίστοιχα) προκύπτει ότι μετά την εισχώρηση τους στο μικρο-περιβάλλον του όγκου υπάρχει μία σαφής συσσώρευση στην υποξική περιοχή του όγκου. Βιβλιογραφικά υπάρχει πλήθος αναφορών 164 165 166 167 που συσχετίζουν την υποξία με την έναρξη της μεταστατικής διαδικασίας. Οι υποξικές περιοχές γενικά εμφανίζουν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στους παραδοσιακούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες κάνοντας έτσι πιο πιθανή την επανεμφάνιση των καρκινικών όγκων, ενώ συχνά συνδέεται και με την πρόοδο της νόσου και χρησιμοποιείται σαν δείκτης της απόκρισης στην θεραπευτική αγωγή. Για την αντιμετώπιση της υποξίας υπάρχει έντονο ενδιαφέρον γύρω από την ανάπτυξη καινοτόμων φαρμάκων που έχουν σαν σκοπό είτε την ενίσχυση της ροής του αίματος στην περιοχή του όγκου που εμφανίζει υποξία 168, είτε την στόχευση όγκων με κυτταροτοξίνες που ενεργοποιούνται σε περιβάλλον υποξίας 169. Η μελέτη της βιοκατανομής πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο SPECT από την ερευνητική ομάδα του Γ. Λούντου στο τμήμα Τεχνολογίας Ιατρικών Οργάνων του ΤΕΙ Αθηνών 104

Επομένως αυτή η φυσική ιδιότητα που (πιθανώς) φέρεται να έχει το MagAlg κρίνεται ιδιαιτέρως θετική δίνοντας την δυνατότητα στο σύστημα να αυξήσει την αποτελεσματικότητα του (σε πιθανή εφαρμογή υπερθερμίας και απελευθέρωσης DOX). Σχήμα 4.29: Εικόνες MSOT όπου φαίνονται με μπλέ χρώμα οι υποξικές περιοχές του όγκου στην μέτρηση της (a) μίας και των (c) τεσσάρων ωρών. Στις εικόνες (b) και (d) έχει γίνει σύνθεση του σήματος της μη οξυγονωμένης αιμοσφαιρίνης και των νανοφορέων στα αντίστοιχα χρονικά σημεία. Στη συνέχεια εξετάστηκε η επίδραση της παρουσίας βαθμίδων μαγνητικού πεδίου στο προφίλ της συσσώρευσης των μαγνητικών νανοσωματιδίων στην περιοχή του όγκου μέσω της τοποθέτησης ενός ισχυρού μαγνήτη χειρός εφαπτομενικά στον όγκο. Όπως και στο προηγούμενο πείραμα έγινε απεικόνιση του όγκου πριν από την χορήγηση, στα 5 λεπτά και στην μία ώρα μετά την χορήγηση των νανοσωματιδίων. Όπως προκύπτει από τις εικόνες του σχήματος 4.30 η επίδραση του μαγνήτη ήταν καταλυτική έλκοντας την πλειοψηφία των μαγνητικών σωματιδίων που εισχώρησαν στην περιοχή του όγκου προς το μέρος του, όπως γίνεται εμφανές στην εικόνα 4.30b. Το χρονικό σημείο των τεσσάρων ωρών δεν μελετήθηκε λόγω απώλειας του ζώου. 105

Σχήμα 4.30: Εικόνες MSOT στα (a) 5 λεπτά (b) μία ώρα μετά την χορήγηση των νανοφορέων. Η υψηλή ένταση του σήματος των νανοφορέων στην εικόνα (b) είναι αποτέλεσμα της έλξης των νανοφορέων από την παρουσία του μαγνήτη στο συγκεκριμένο σημείο. Αν και όπως έχει αναφερθεί μέσω MSOT δεν μπορεί να γίνει ποσοτικός προσδιορισμός των νανοφορέων στην περιοχή του όγκου, εντούτοις υπάρχουν αναφορές όπου η εφαρμογή μαγνητικής στόχευσης έχει οδηγήσει στην αύξηση της συγκέντρωσης των νανοφορέων. Σε μία πρόσφατη μελέτη αναφέρεται από τους N. Schleich et al. 50 αύξηση της ανίχνευσης των μαγνητικών νανοσωματιδίων που χρησιμοποιήθηκαν μέσω MRI έως και 18 φορές περισσότερο συγκριτικά με την φυσική στόχευση χρησιμοποιώντας μόνιμους μαγνήτες χειρός έντασης 1,1 Τ και MPNs με Ms ~ 15 Am 2 /kg και Dh ~240 nm, ενώ σε μία άλλη εργασία οι C. Alexiou et al. 170 ανέφεραν αύξηση της συγκέντρωσης των SPIONs (Dh ~ 100 nm) που χορήγησαν στην περιοχή του όγκου έως και 50% με την εφαρμογή μαγνητικής στόχευσης χρησιμοποιώντας έναν ισχυρό ηλεκτρομαγνήτη υψηλής έντασης μαγνητικού πεδίου χωρίς όμως να αναφέρουν την μαγνήτιση κορεσμού των νανοσωματιδίων. Επομένως εκτιμάται ότι και στην περίπτωση του MagAlg το οποίο διαθέτει υψηλή μαγνήτιση κόρου το αποτέλεσμα της μαγνητικής στόχευσης θα είναι ανάλογο. 106

Κεφάλαιο 5 o 5 Συζήτηση Συμπεράσματα 5.1 Συζήτηση αποτελεσμάτων χαρακτηρισμού των μαγνητικών νανοφορέων MagAlg Στο πρώτο μέρος της παρούσας διπλωματικής εργασίας πραγματοποιήθηκε μελέτη και αξιολόγηση της ικανότητας πλειάδων μαγνητικών νανοκρυσταλλιτών πυκνής διάταξης (και σύγκριση με άλλες δομές) ως προς την ικανότητας τους να λειτουργήσουν σαν παράγοντες υπερθερμίας και φορείς μεταφοράς και αποδέσμευσης βιοδραστικών μορίων. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε σύνθεση υβριδικών μαγνητικών νανοφορέων σε κολλοειδή μορφή, με την μέθοδο της υδρολυτικής αλκαλικής καταβύθισης από μία πρόδρομη ένωση σιδήρου. Σαν επιφανειακοί τροποποιητές επιλέχθηκαν: i. Το αλγινικό νάτριο, παρουσία του οποίου προωθείται η ανάπτυξη νανοπλειάδων πυκνής διάταξης. Σε αυτή την διαμόρφωση ο κάθε νανοκρυσταλλίτης βρίσκεται πολύ κοντά με τον γειτονικό του οδηγώντας στον σχηματισμό μίας πλειάδας νανοκρυστάλλων οι οποίοι περιβάλλονται από πολυμερές. ii. Το συμπολυμερές πολύ(μεθακρυλικού οξέος)-πολύ(αιθυλενό-γλυκόλης) p(maa-g- EGMA) που έχει σαν αποτέλεσμα την δημιουργία πλειάδων χαλαρής δομής όπου οι νανοκρυσταλλίτες συνδέονται εντός της πλειάδας μέσω πολυμερικών αλυσίδων και το οποίο παρασκευάστηκε για λόγους σύγκρισης. Τα προϊόντα που παρήχθησαν από αυτές τις συνθέσεις θα αναφέρονται με την κωδική ονομασία MagAlg και MagP αντίστοιχα. Ο δείκτης που χρησιμοποιείται κατά κόρον για την σύγκριση (νάνο)συστημάτων υπερθερμίας είναι ο ειδικός συντελεστής απωλειών ισχύος SLP ή ειδικός συντελεστής απορρόφησης SAR. Η εξάρτηση αυτού του μεγέθους από την ένταση και την συχνότητα του εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου κάνει την σύγκριση αποτελεσμάτων μεταξύ διαφορετικών πειραματικών συστημάτων εξαιρετικά δύσκολη. Αυτό οδήγησε στην εισαγωγή του συντελεστή εγγενούς απώλειας ισχύος ILP ο οποίος είναι ουσιαστικά μία κανονικοποίηση του δείκτη SLP (ILP = SLP/f*H 2 ) και βασίζεται στην παραδοχή ότι για εντάσεις μαγνητικών πεδίων και συχνότητες εφαρμογής τους εντός των επιτρεπόμενων ορίων για in vivo εφαρμογές ο SLP εξαρτάται γραμμικά από την συχνότητα και εκθετικά από την ένταση του εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου. Ο υπολογισμός όμως του πειραματικού SLP βασίζεται στην κλίση της καμπύλης T(t) στα αρχικά στάδια (των πρώτων δευτερολέπτων) της μέτρησης και εφόσον δεν υπάρχει ακόμα κάποιο αναγνωρισμένο πρωτόκολλο για την επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων, είναι σύνηθες το φαινόμενο του αυθαίρετου υπολογισμού αυτής της παραμέτρου. Αποτέλεσμα αυτού είναι η αναφορά κάποιων τιμών SLP (και κατ επέκταση ILP) στην βιβλιογραφία που πιθανώς να αποκλίνουν από την πραγματικότητα. Για παράδειγμα οι Yogo et al. 171 (σχήμα 5.1) ανέφεραν το 2010 για νανοσωματίδια μαγνητίτη διαμέτρου ~ 8 nm τιμή SAR ~156 W/g μετά από μέτρηση δείγματος συγκέντρωσης 10 mg/ml σε ένταση μαγνητικού πεδίου 107

7,96 ka/m και συχνότητας 230 khz. Αυτή η τιμή αντιστοιχεί σε ILP 10,7 nhm 2 /kg η οποία είναι εξαιρετικά υψηλή συγκρινόμενη με τους δείκτες ILP εμπορικών σκευασμάτων που παρουσιάζονται στον πίνακα 5.1 67, και η πλειονότητα των οποίων κυμαίνεται μεταξύ 0,3 και 3 nhm 2 /kg. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5.1 αυτή η τιμή προκύπτει από τον τρόπο υπολογισμού της κλίσης της καμπύλης των πειραματικών δεδομένων. Στη συγκεκριμένη περίπτωση είναι ξεκάθαρο πως η καμπύλη αύξησης της θερμοκρασίας δεν ακολουθεί τον ίδιο μοτίβο (την ίδια συνάρτηση) τα πρώτα δευτερόλεπτα, καθώς μετά η συνάρτηση αλλάζει. Δηλαδή η καμπύλη αύξησης είναι υπέρθεση δύο ρυθμών αύξησης. Αυτό δε μπορεί να αποδοθεί στο ίδιο το υλικό (εφόσον δεν πρόκειται για ταυτόχρονη μελέτη δύο πολύ διαφορετικών πλυθησμών νανκρυσταλλιτών), παρά μόνο σε κάποιον εξωτερικό παράγοντα. Σε άλλη μελέτη αναφέρεται ότι ο υπολογισμός γίνεται με βάση την κλίση στα 30 πρώτα δεύτερα της μέτρησης 172, ενώ σε κάποιες εργασίες όπου αναφέρονται υψηλές τιμές ILP (9,4 nhm 2 /kg) για νανοκρυστάλλους διαμέτρου 9,5 nm δεν παρατίθενται τα πειραματικά δεδομένα 173. Στην παρούσα μελέτη η επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων έγινε μέσω προσαρμογής της πειραματικής καμπύλης ώστε να ανταποκρίνεται στον τρόπο αύξησης της θερμοκρασίας καθ όλη την διάρκεια της μέτρησης. Μόνο μετά την προσαρμογή αυτή και με υπολογισμό της πρώτης παραγώγου για τα πρώτα δευτερόλεπτα υπολογίστηκαν οι κλίσεις. Πέρα από τον τρόπο επεξεργασίας των δεδομένων όμως, το συνεχώς αυξανόμενο ενδιαφέρον της ερευνητικής κοινότητας στον τομέα της μαγνητικής υπερθερμίας τα τελευταία χρόνια έχει αναδείξει νέα εμπόδια στην προσπάθεια σύγκρισης των πειραματικών αποτελεσμάτων. Η αύξηση των δημοσιεύσεων (θεωρητικών 147 148 174 149 και πειραματικών 146 175 152 ) όπου αναφέρουν εξάρτηση του SLP από την συγκέντρωση αλλά και την θερμοκρασία 154 153 διεξαγωγής του πειράματος κάνει ακόμα και την χρήση του ILP μη ικανοποιητική και δύσχρηστη για την σύγκριση των πειραματικών δεδομένων και αναδεικνύει το κενό και την ανάγκη που υπάρχει για τον ορισμό μίας πρότυπης διαδικασίας του τρόπου μέτρησης της αποτελεσματικότητας των μαγνητικών νανοφορέων για εφαρμογές υπερθερμίας. Σχήμα 5.1: Καμπύλη T(t) των πειραματικών δεδομένων και τρόπος υπολογισμού της κλίσης της καμπύλης, όπως δημοσιεύονται στην εργασία 171 Συγκρίνοντας την συμπεριφορά των δύο συστημάτων που μελετήθηκαν στα πλαίσια της διπλωματικής αναδεικνύεται ακόμη μία παράμετρος που επηρεάζει την απόδοση των μαγνητικών κολλοειδών υπό την επίδραση AMF και την ικανότητα τους να παράγουν θερμότητα. Αυτή η 108

παράμετρος έγκειται στην εσωτερική οργάνωση των συστημάτων αφού τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το MagP χάρη στον σχηματισμό πλειάδων χαλαρής δόμησης και την μεγαλύτερη ενδο-σωματιδιακή απόσταση των μαγνητικών νανοκρυσταλλιτών που το χαρακτηρίζει μπορεί να επάγει την αύξηση της θερμοκρασίας του περιβάλλοντός του με ταχύτερο ρυθμό συγκριτικά με το MagAlg για ίδιας συγκέντρωσης δείγματα. Πίνακας 5.1: Δείκτες ILP εμπορικά διαθέσιμων μαγνητικών ρευστών 67 Αυτή η διαφορά (πιθανόν) οφείλεται στην ύπαρξη ισχυρών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μαγνητικών ροπών των νανοκρυστάλλων MagAlg ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις εξαιτίας της διαμόρφωσης νανο-πλειάδων πυκνής δόμησης. Επακόλουθο αυτής της διαμόρφωσης είναι η υποβάθμιση της παραγωγής θερμότητας μέσω του μηχανισμού χαλάρωσης Neel. Μία ακόμη πιθανή εξήγηση θα μπορούσε να είναι η μεγαλύτερη επιφάνεια επαφής των νανοκρυστάλλων MagP με τον περιβάλλοντα διαλύτη, επιτρέποντας την αποτελεσματικότερη διάχυση της παραγόμενης θερμότητας προς το εξωτερικό περιβάλλον τους. Όσον αφορά στην απόδοση του MagAlg σαν παράγοντας υπερθερμίας επέδειξε μία συμπεριφορά ανεξάρτητη της συγκέντρωσης καταγράφοντας μικρές μόνο διακυμάνσεις του ILP για τις διάφορες συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν. Η μέση τιμή ILP που κατέγραψε ήταν ~1,13 nhm 2 /kg, τιμή υψηλότερη από αρκετά εμπορικώς διαθέσιμα σκευάσματα. Επίσης πραγματοποιήθηκε μελέτη με σκοπό τον προσδιορισμό της βέλτιστης συγκέντρωσης για πιθανή in vivo εφαρμογή η οποία και βρέθηκε να είναι ~ 5 mg/ml για μέγιστη θερμοκρασία ~ 44 ο C στα 20 λεπτά εφαρμογής ενώ για εφαρμογές θερμικής νέκρωσης πιο κατάλληλη κρίνεται η συγκέντρωση των ~7 mg/ml (μέγιστη θερμοκρασία > 51 ο C στα 20 λεπτά εφαρμογής). Μία ακόμη παράμετρος που μελετήθηκε (και η οποία βιβλιογραφικά δεν αναφέρεται) είναι η σταθερότητα της απόδοσης και των φυσικοχημικών 109