ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΠΡΟΑΓΩΓΕΑ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ p16 ΣΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΩΣ ΕΙΚΤΗ ΠΡΩΙΜΗΣ ΙΑΓΝΩΣΗΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΝΟΡΜΑ ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2006-2007 Αριθµ.1968 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΠΡΟΑΓΩΓΕΑ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ p16 ΣΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΩΣ ΕΙΚΤΗ ΠΡΩΙΜΗΣ ΙΑΓΝΩΣΗΣ ΕΛΙΣΑΒΕΤ Ν. ΓΕΩΡΓΙΟΥ ΙΑΤΡΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ YΠOBΛHΘHKE ΣTHN IATPIKH ΣXOΛH TOY APIΣTOTEΛEIOY ΠANEΠIΣTHMIOY ΘEΣΣAΛONIKHΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2006

H ƒπª Àªµ À À π π ƒ ºπ Àπ À ƒ À, AÓ. ıëá ÙÚÈ ºƒ π ª ƒπ À, ıëá ÙÚÈ ƒª µ µ Ãπ, ıëá ÙÚÈ ª π π ƒ ºπ Àπ À ƒ À, AÓ. ıëá ÙÚÈ ƒ ø, ıëáëù ƒª µ µ Ãπ, ıëá ÙÚÈ ø π ø π, ıëáëù ƒ ª ƒ À, Ó. ıëáëù øƒ π Àƒπ, Ó. ıëáëù ƒ À ƒ À À, Ó. ıëá ÙÚÈ " ÁÎÚÈÛË ÙË È ÎÙÔÚÈÎ È ÙÚÈ applefi ÙËÓ π ÙÚÈÎ ÔÏ ÙÔ ÚÈÛÙÔÙÂÏÂ Ô ÓÂappleÈÛÙËÌ Ô ÂÛÛ ÏÔÓ ÎË, ÂÓ appleô ËÏÒÓÂÈ appleô Ô ÙˆÓ ÁÓˆÌÒÓ ÙÔ Û ÁÁÚ Ê " fiìô 5343/32, ÚıÚ. 202 2 Î È ÓfiÌÔ 1268/82, ÚıÚ. 50 8

ƒπ π π ªπ π π ƒπ Ã ƒ ƒ Ã πø. ª

ÙÔ ÁÔÓÂ ÌÔ ÙÔÓ ÕÁÁÂÏÔ Î È ÙË ª ÚÙÒ

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠPOΛOΓOΣ...13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...17 1. ΒΙΟΛΟΓIΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚIΝΟΥ...19 1.1. Ο κυτταρικός κύκλος...20 1.2. Απόπτωση...24 1.3. Ογκογονίδια...25 1.4. Ογκοκατασταλτικά γονίδια...26 1.5. Αγγειογένεση - µετάσταση...26 2. ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚH ΤΡΟΠΟΠΟIΗΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚHΣ EΚΦΡΑΣΗΣ...29 2.1. Μεθυλίωση του DNA...29 2.1.α. Ο ρόλος της µεθυλίωσης του DNA στη γονιδιακή έκφραση...32 2.1.β. Μεθυλίωση του DNA και καρκίνος...34 2.1.γ. Μεθυλίωση του DNA και καρκινογένεση από ιούς...39 2.1.δ. Μεθυλίωση του DNA και διατροφή...39 2.1.ε. Μεθυλίωση του DNA και κάπνισµα...40 2.1.στ. Πιθανές εφαρµογές της ανίχνευσης της υπερµεθυλίωσης...41 2.2. Τροποποίηση των ιστονών...42 2.3. Απενεργοποίηση γονιδίων µέσω των sirna (Small interfering RNA)...44 3. ΚΑΡΚIΝΟΣ ΤΟΥ ΠΝΕYΜΟΝΑ...45 3.1. Επιδηµιολογία...45 7

3.2. Καρκίνος του πνεύµονα και κάπνισµα...46 3.3. Ιστολογική ταξινόµηση...48 3.4. Μοριακή βιολογία του καρκίνου του πνεύµονα...49 3.4.α. Χρωµοσωµικές βλάβες...49 3.4.β. Γονιδιακές βλάβες...50 3.4.γ. Γενοµική αστάθεια...54 3.4.δ. Καρκινογένεση πεδίου (field cancerization)...55 3.4.ε. Εφαρµογές της χρήσης µοριακών δεικτών στον καρκίνο του πνεύµονα...55 4. ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΟ ΓΟΝΙ ΙΟ p16 ΙΝΚ4a...57 4.1. Οργάνωση του γονιδίου...57 4.2. Η πρωτεΐνη p16 ΙΝΚ4a...58 4.3. Ρόλος της πρωτεΐνης p16 ΙΝΚ4a στον κυτταρικό κύκλο και ρύθµιση των επιπέδων της...58 4.4. Βιολογικός ρόλος του γονιδίου p16 και µηχανισµοί απενεργοποίησης...60 4.5. Υπερµεθυλίωση του προαγωγέα του γονιδίου p16 και καρκίνος του πνεύµονα...61 5. ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΣΤΟ DNA...65 5.1. Μέθοδοι που δεν βασίζονται στην τροποποίηση του DNA...65 5.1.α. Ανάλυση της µεθυλίωσης του DNA µε ένζυµα περιορισµού και επακόλουθο υβριδισµό κατά Southern (Southern Hybridization)...65 5.1.β. Ανάλυση της µεθυλίωσης του DNA µε ένζυµα περιορισµού και επακόλουθη µεγέθυνση µε αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR)...65 5.2. Μέθοδοι που βασίζονται στην τροποποίηση του DNA...66 5.2.α. Ανάλυση της µεθυλίωσης µε τροποποίηση του DNA και επακόλουθη ανάλυση της αλληλουχίας (sequencing)...66 5.2.β. Ανάλυση της µεθυλίωσης µε τη µέθοδο MSP (Methylation- Specific PCR)...66 5.2.γ. Ανάλυση της µεθυλίωσης µε τη µέθοδο Ms-SNuPE (Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension)...67 8

5.2.δ. Ανάλυση της µεθυλίωσης στο DNA µε τη µέθοδο COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis)...67 5.2.ε. Ανάλυση της µεθυλίωσης στο DNA µε PCR αληθούς χρόνου (Real-time PCR, MethyLight)...67 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...69 6. ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ...71 6.1. ειγµατοληψία...71 6.2. Επεξεργασία βρογχικών εκπλυµάτων και πτυέλων...71 6.3. Τεχνικές µοριακής βιολογίας...72 6.3.α. Αποµόνωση νουκλεϊκών οξέων...72 Αποµόνωση γονιδιωµατικού DNA...72 Αποµόνωση RNA...73 6.3.β. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR)...73 6.3.γ. Φωλιασµένη PCR (nested PCR)...75 6.3.δ. Τροποποίηση του DNA...76 6.3.ε. Προβλήµατα κατά την τροποποίηση του DNA- βελτιστοποίηση της µεθόδου...76 6.3.στ. Ανάλυση της µεθυλίωσης του DNA µε τη µέθοδο MSP (Methylation-Specific PCR)...77 6.3.ζ. Σχεδιασµός των εκκινητών για τη µέθοδο MSP...78 6.3.η. Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων PCR...79 7. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...83 7.1 Υλικό...83 7.1.α. Προέλευση δειγµάτων...83 7.1.β. Συλλογή και αποθήκευση ιστικών δειγµάτων...84 7.1.γ. Επεξεργασία και αποθήκευση βρογχικών εκπλυµάτων και πτυέλων...84 7.2. Μέθοδοι...85 7.2.α. Αποµόνωση γονιδιωµατικού DNA από ιστικά δείγµατα...85 9

7.2.β. Αποµόνωση γονιδιωµατικού DNA από δείγµατα βρογχικών εκπλυµάτων και πτυέλων...87 7.2.γ. Αποµόνωση γονιδιωµατικού DNA από δείγµατα περιφερικού αίµατος...87 7.2.δ. Ποσοτικός προσδιορισµός και ποιοτικός έλεγχος του DNA που αποµονώθηκε...88 7.2.ε. Τροποποίηση του DNA...88 7.2.στ. Ανίχνευση µεθυλίωσης στον προαγωγέα του γονιδίου p16 µε τη µέθοδο φωλιασµένης MSP...90 7.2.ζ. Εφαρµογή της PCR σε µη τροποποιηµένα δείγµατα γονιδιωµατικού DNA...93 7.2.η. Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων PCR...94 7.3. Αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν στη µελέτη...95 7.4. Στατιστική ανάλυση...96 8. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...97 8.1. Έλεγχος της µεθόδου µεγέθυνσης του τροποποιηµένου DNA µε την εφαρµογή MSP δύο σταδίων (φωλιασµένη MSP)...97 8.2. Ανίχνευση της µεθυλίωσης στον προαγωγέα του γονιδίου p16 σε δείγµατα ιστού καρκίνου του πνεύµονα και σε αντίστοιχα δείγµατα παρακείµενου µη καρκινικού ιστού πνεύµονα από τους ίδιους ασθενείς...98 8.3. Ανίχνευση της µεθυλίωσης στον προαγωγέα του γονιδίου p16 σε δείγµατα βρογχικών εκπλυµάτων και πτυέλων ασθενών µε καρκίνο του πνεύµονα...104 8.4. Συσχέτιση µεταξύ ανίχνευσης της µεθυλίωσης και κυτταρολογικής εξέτασης στα βρογχικά εκπλύµατα και πτύελα των ασθενών...111 8.5. Ανίχνευση της µεθυλίωσης στον προαγωγέα του γονιδίου p16 σε δείγµατα βρογχικών εκπλυµάτων ασθενών µε χρόνια αποφρακτική πνευµονοπάθεια (ΧΑΠ)...114 8.6. Ανίχνευση της µεθυλίωσης στον προαγωγέα του γονιδίου p16 σε δείγµατα πτυέλων από καπνιστές ελεύθερους καρκίνου...114 8.7. Ανίχνευση της µεθυλίωσης στον προαγωγέα του γονιδίου p16 σε 10

δείγµατα ιστών και βρογχικών εκπλυµάτων από ασθενείς µε άλλα νεοπλάσµατα (πλην ΜΜΚΠ)...120 9. ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...121 10. ΠΕΡΙΛΗΨΗ...127 11. SUMMARY...129 ΓΕΝΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...131 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...131 11

ΠPOΛOΓOΣ Ο καρκίνος του πνεύµονα είναι η συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις ανεπτυγµένες χώρες και είναι υπεύθυνος για περισσότερους θανάτους από όσους προκαλούν ο καρκίνος του µαστού, του προστάτη και του παχέος εντέρου µαζί. Αυτό οφείλεται σε µεγάλο βαθµό στη δυσχέρεια ανίχνευσης της νόσου σε πρώιµα στάδια. Παρά την ανάπτυξη νέων διαγνωστικών τεχνικών, οι περισσότερες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται αργά και η ολική 5ετής επιβίωση είναι πολύ µικρή. Η ανάπτυξη βιολογικών δεικτών που θα επέτρεπαν τη διάγνωση της νόσου σε πρώιµα στάδια, θα συνεισφέρει σηµαντικά στη βελτίωση της επιβίωσης, επιτρέποντας την αφαίρεση του νεοπλάσµατος πριν από τη δηµιουργία µεταστάσεων. Η µελέτη των επιγενετικών φαινοµένων, ιδιαίτερα της µεθυλίωσης της κυτοσίνης στο DNA, δηµιούργησε ένα καινούριο πεδίο αναζήτησης µοριακών µεταβολών στην καρκινογένεση. Η ανίχνευση σε υψηλή συχνότητα των επιγενετικών µεταβολών σε µεγάλο αριθµό νεοπλασµάτων επέτρεψε την κατανόηση της σηµασίας των µεταβολών αυτών στην ανάπτυξη του καρκίνου και στην ανάπτυξη νέων στοχευµένων θεραπειών. Παράλληλα, η ανακάλυψη ότι οι µεταβολές αυτές ανιχνεύονται σε σηµαντικό ποσοστό σε βιολογικά δείγµατα πριν από την κλινική εµφάνιση του καρκίνου, δηµιούργησε πολλές ελπίδες για τη χρησιµοποίησή τους ως δεικτών πρώιµης διάγνωσης. Ο µεγάλος αριθµός µελετών της µεθυλίωσης του DNA δεν θα µπορούσε να πραγ- µατοποιηθεί αν δεν συνοδευόταν από την ανάπτυξη νέων µεθόδων, καθώς αυτό το είδος της πληροφορίας "σβήνεται" µε την κλασσική µέθοδο PCR και οι παλιότερες µέθοδοι ήταν τεχνικά δύσκολες. Η µέθοδος Methylation Specific PCR είναι µια µέθοδος υψηλής ευαισθησίας, καθώς ανιχνεύει ένα µεθυλιωµένο αλλήλιο σε περισσότερα από 50000 µη µεθυλιωµένα. Αυτό την καθιστά ιδιαίτερα χρήσιµη για την ανίχνευση της συγκεκριµένης µοριακής µεταβολής σε δείγµατα µε περιορισµένο αριθ- µό κυττάρων, όπως τα πτύελα, που αποτελούν ένα βιολογικό δείγµα που λαµβάνεται µε µη παρεµβατική µέθοδο. 13

Όταν ξεκινούσε η παρούσα µελέτη, ελάχιστα δεδοµένα ήταν υπήρχαν για µεθυλίωση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p16 στον καρκίνο του πνεύµονα, τη συσχέτισή της µε το κάπνισµα και άλλους επιδηµιολογικούς παράγοντες καθώς και την πιθανή πρώιµη εµφάνισή του σε βιολογικό υλικό από άτοµα υψηλού κινδύνου, πριν την κλινική εµφάνιση του καρκίνου. Σκοπός της µελέτης είναι ο προσδιορισµός της συχνότητας της µεθυλίωσης του γονιδίου p16 στον Ελληνικό πληθυσµό µε την εφαρµογή µιας µεθόδου υψηλής ευαισθησίας και πώς αυτή µεταβάλλεται σε δείγµατα καρκίνου πνεύµονα, µη καρκινικού παρακείµενου ιστού και σε δείγµατα πτυέλων και βρογχικών εκπλυµάτων από ασθενείς και τέλος η διερεύνηση της ύπαρξης µεθυλίωσης σε υγιή άτοµα καπνιστές και η πιθανή συσχέτισή της µε την ανάπτυξη καρκίνου. Θα ήθελα να εκφράσω τις ολόψυχες ευχαριστίες µου στην Καθηγήτρια κ. Νόρµα Βαβάτση, µέλος της τριµελούς επιτροπής και νυν ιευθύντριας του Εργαστηρίου Βιολογικής Χηµείας. Υπήρξε δασκάλα µου στη µοριακή βιολογία από τα φοιτητικά µου χρόνια. Την ευχαριστώ για την αµέριστη συµπαράστασή της και τις πολύτιµες συµβουλές και παρατηρήσεις της στην εκπόνηση της διατριβής. Ευχαριστώ θερµά την καθηγήτρια κ. Αφροδίτη ηµητριάδου, µέλος της τριµελούς επιτροπής και ιευθύντρια του Εργαστηρίου Βιολογικής Χηµείας κατά την έναρξη της εκπόνησης της διατριβής, για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε στην ανάθεση της διατριβής, για την παροχή των υποδοµών στο Εργαστήριο και για τις συµβουλές της. Ευχαριστίες, επίσης οφείλω και στα υπόλοιπα µέλη της επταµελούς επιτροπής, τον Καθηγητή κ. Αλέξανδρο Κώτση, τον Καθηγητή κ. Αντώνιο Αντωνιάδη, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Αλέξανδρο Λαµπρόπουλο, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Κυριαζή και την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Ελένη Καστρουνή για την ενθάρρυνση και τις συµβουλές τους στα τελικά στάδια αυτής της διατριβής. Θέλω επίσης να ευχαριστήσω τον Λέκτορα κ. Γεώργιο Τζηµαγιώργη, µέλος του Εργαστηρίου Βιολογικής Χηµείας. Με την τεράστια εµπειρία του υπήρξε πολύτιµος σύµβουλος και συµπαραστάτης σε όλους τους τοµείς εκπόνησης της διατριβής. Η συνεργασία µαζί του αποτελεί πηγή συνεχούς µάθησης στις µεθόδους της µοριακής βιολογίας. Η διατριβή αυτή δεν θα µπορούσε να πραγµατοποιηθεί χωρίς την αµέριστη συνεργασία του Κυτταρολογικού Εργαστηρίου του "Θεαγενείου" Αντικαρκινικού Νοσοκοµείου, για την παροχή κυτταρολογικών δειγµάτων των ασθενών και των ατόµων υψηλού κινδύνου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τη ιευθύντρια κ. Χαρίκλεια εστούνη και την Επιµελήτρια κ. Ροζαλία Βαλερή για το προσωπικό τους ενδιαφέρον και βοήθεια, καθώς και το τεχνικό προσωπικό του εργαστηρίου. 14

Ευχαριστίες επίσης οφείλω στο ιευθυντή της Θωρακοχειρουργικής Κλινικής του "Θεαγενείου" Αντικαρκινικού Νοσοκοµείου κ. Χρήστο Τσιλίκα, στο ιευθυντή της Πνευµονολογικής Κλινικής κ. Γεώργιο Σαρίκο και στον Επιµελητή της Πνευµονολογικής Κλινικής κ. Ιακώβ Άντζελ για τη συνεργασία και την παροχή των δειγµάτων και δεδοµένων από ασθενείς τους. Ευχαριστώ επίσης το συνάδελφο κ. ηµήτριο Κρικέλη, επίσης υποψήφιο διδάκτορα του Εργαστηρίου Βιολογικής Χηµείας για τη βοήθεια και συµπαράστασή του. Τελευταία, αλλά πιο σηµαντική, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Σοφία Κουίδου, Επιβλέπουσα της διατριβής, χωρίς τη συνεχή συ- µπαράσταση της οποίας δεν θα είχε ξεκινήσει και ολοκληρωθεί η διατριβή αυτή. Οι λέξεις δεν µπορούν να αποδώσουν το µέγεθος της ευγνωµοσύνης µου. Αναγνώρισε τη σηµασία της µεθυλίωσης του DNA σε µια εποχή που ελάχιστα δεδοµένα υπήρχαν πάνω σε αυτό θέµα. Υπήρξε ακούραστη στην υποστήριξη, στην παροχή συµβουλών και στην επίλυση προβληµάτων, σε άµεση και στενή συνεργασία µαζί µου. Με εισήγαγε από τα φοιτητικά µου χρόνια στον κόσµο της µοριακής βιολογίας. Το προσωπικό της ενδιαφέρον για µένα και για την εκπόνηση της διατριβής είναι συγκινητικό. Η εκπόνηση της παρούσας διατριβής ολοκληρώθηκε µε την οικονοµική επιχορήγηση του Υπουργείου Παιδείας και Θρησκευµάτων και του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταµείου, στα πλαίσια του προγράµµατος ΕΠΕΑΕΚ "Ηράκλειτος", αρ. έργου 21779. 15

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

1. ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Ο καρκίνος είναι το τελικό αποτέλεσµα µιας σειράς µεταβολών που οδηγούν σε απώλεια των µηχανισµών που ελέγχουν τη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασµό και τη χωροταξική εντόπιση των κυττάρων. Οι µεταβολές που συµβαίνουν και χαρακτηρίζουν τα καρκινικά κύτταρα µπορούν να συνοψισθούν στα εξής (1): α) Αυτοδυναµία σε αυξητικά σήµατα, β) Αντίσταση σε σήµατα ανασταλτικά της αύξησης, γ) ιαφυγή από µηχανισµούς απόπτωσης, δ) Απεριόριστη δυνατότητα πολλαπλασιασµού, ε) Ικανότητα για αγγειογένεση, στ) Ικανότητα για διείσδυση και µετάσταση. Η καρκινογένεση είναι µια πολυσταδιακή διαδικασία που ξεκινά από την έκθεση σε µεταλλαξιογόνους παράγοντες (χηµικά καρκινογόνα, ακτινοβολία, ογκογόνοι ιοί) και δηµιουργεί κύτταρα µε πλεονέκτηµα πολλαπλασιασµού και επιβίωσης. Τα κύτταρα αυτά µε την επίδραση άλλων παραγόντων αύξησης και γενετικών επιγενετικών µεταβολών (ενεργοποίηση ογκογονιδίων, απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων) οδηγούνται στην πρόοδο προς κακόηθες νεόπλασµα (2,3). Μία µόνο µετάλλαξη δεν µπορεί να δηµιουργήσει καρκινικά κύτταρα καθώς κάθε δυνητικά καρκινικό κύτταρο υποβάλλεται συνεχώς σε έλεγχο ώστε να οδηγείται είτε σε επιδιόρθωση της βλάβης, είτε σε απόπτωση. Τουλάχιστον 6-7 διαδοχικές µεταλλάξεις χρειάζονται κατά µέσο όρο για να µετατρέψουν ένα φυσιολογικό κύτταρο σε διηθητικό νεόπλασµα (4). Ωστόσο στατιστικά υπολογίζεται ότι µε συνήθη ποσοστά µεταλλάξεων δεν συµβαίνουν περισσότερες από 2-3 µεταλλάξεις ανά κύτταρο κατά τη διάρκεια της ζωής ενός ατόµου. Αυτό οδήγησε στην υπόθεση ότι το καθοριστικό χαρακτηριστικό ενός καρκινικού κυττάρου είναι η γενετική αστάθεια (5). Τα γονίδια που επηρεάζονται κατά την καρκινογένεση ελέγχουν τον κυτταρι- 19

κό πολλαπλασιασµό (κυτταρικό κύκλο) και τον κυτταρικό θάνατο (απόπτωση). ύο οµάδες αυτών των γονιδίων µπορούν να διακριθούν: τα ογκογονίδια και τα ογκοκατασταλτικά γονίδια. 1.1. Ο κυτταρικός κύκλος Τα σωµατικά κύτταρα των ευκαρυωτικών οργανισµών χαρακτηρίζονται από ακριβείς µηχανισµούς ρύθµισης των λειτουργιών αύξησης και διαίρεσής τους, οι οποίοι οργανώνονται σε µια σειρά γεγονότων που ονοµάζεται κυτταρικός κύκλος. Ο κυτταρικός κύκλος δεν είναι παρά ένα σύνθετο κύκλωµα που αποτελείται από θετικούς και αρνητικούς ρυθµιστές, ο ρόλος των οποίων είναι ο ακριβής διπλασιασµός του γενετικού υλικού και η ισότιµη διαίρεσή του σε δύο κύτταρα απογόνους (6). Απώλεια αυτών των µηχανισµών ρύθµισης συνεπάγεται διαταραγµένη διεκπεραίωση ολόκληρου του κυτταρικού κύκλου, και εποµένως ανώ- µαλο κυτταρικό πολλαπλασιασµό. Ο κυτταρικός κύκλος διαιρείται σε τέσσερις φάσεις: α) τη φάση S (synthesis) όπου γίνεται διπλασιασµός του γενετικού υλικού, β) τη φάση Μ (mitosis) στην οποία λαµβάνει χώρα η κυτταρική διαίρεση, γ) τη φάση G1 που προηγείται της φάσης S και τέλος δ) τη φάση G2 που προηγείται της µίτωσης. Η φάση ηρεµίας G0 είναι µια φάση άλλοτε άλλης διάρκειας κατά την οποία τα κύτταρα δεν διαιρούνται και βρίσκονται σε στασιµότητα (Εικόνα 1). Εικόνα 1. Ο κυτταρικός κύκλος και οι κυκλίνες και κυκλινοεξαρτώµενες κινάσες (CDKs) που ενεργοποιούνται σε κάθε φάση του 20

Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου εξαρτάται από δύο σηµεία ελέγχου όπου λαµβάνεται η απόφαση για την εξέλιξη του κύκλου: α) το σηµείο R (restriction) (7) στη φάση G1 όπου λαµβάνεται απόφαση για είσοδο στη φάση S και αντιγραφή του γενετικού υλικού και β) στο τέλος της G2 φάσης όπου λαµβάνεται η απόφαση για είσοδο στη φάση S και µιτωτική διαίρεση του κυττάρου. Φαίνεται πως για τα περισσότερα διπλοϊδικά κύτταρα το σηµείο R είναι το σηµαντικότερο στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου ενώ το σηµείο G2/M είναι µικρότερης σηµασίας: τα κύτταρα που θα περάσουν τη φάση G1 και θα µπουν στη φάση S, θα ακολουθήσουν τη φάση G2 και τελικά θα διαιρεθούν. Ένα σύνολο πρωτεϊνών που ονοµάζονται κυκλινο-εξαρτώµενες κινάσες (cyclin-dependent kinases, cdks) έχουν αναγνωριστεί ως υπεύθυνες για τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Σχεδόν όλες χρειάζονται τη σύνδεση µε πρωτεϊνικές υποοµάδες που ονοµάζονται κυκλίνες για να ενεργοποιηθούν. ηλαδή µια ενεργή κυκλινο-εξαρτώµενη κινάση είναι ένα ετεροδιµερές ένζυµο που αποτελείται από µια ρυθµιστική υποοµάδα (κυκλίνη) και µια καταλυτική υποοµάδα (κινάση) (8). Κάθε κυκλίνη µαζί µε τις αντίστοιχες κινάσες δραστηριοποιούνται σε συγκεκριµένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου (9) (Εικόνα 1). Η κυκλίνη D αρχίζει να εκφράζεται νωρίς στη φάση G1 όταν κύτταρα σε ηρεµία λαµβάνουν σήµατα για επανείσοδο στον κυτταρικό κύκλο και παραµένει σε υψηλά επίπεδα όσο παρα- µένουν τα µιτογόνα ερεθίσµατα. Έχει µικρή ηµιπερίοδο ζωής και τα επίπεδά της πέφτουν γρήγορα όταν αποµακρύνονται τα σήµατα για διαίρεση. Αναστολή της κυκλίνης D σταµατάει τα κύτταρα στη φάση G1, κάτι που δείχνει ότι είναι απαραίτητη για τον κυτταρικό κύκλο (10). Αντίθετα, υπερέκφρασή της βραχύνει τη διάρκεια της G1 φάσης. Η δραστηριότητα της κυκλίνης Ε είναι επίσης απαραίτητη στη φάση G1 για την είσοδο στη φάση S (11). Η ενεργοποίηση των κυκλινών D και E πιθανότατα αντιστοιχεί στο σηµείο ελέγχου R του κυτταρικού κύκλου. Οι επόµενες φάσεις του κύκλου ελέγχονται από τις κυκλίνες Α και Β. Το σύµπλεγµα κυκλίνης Η-cdk7 αποτελεί την cdk-ενεργοποιούσα κινάση (cdkactivating kinase, CAK) (12). Εκτός από τη σύνδεση µε τις αντίστοιχες κυκλίνες, η ρύθµιση της δραστηριότητας των κυκλινο-εξαρτώµενων κινασών γίνεται µε φωσφορυλίωση και αποφωσφορυλίωση (Εικόνα 2). Η φωσφορυλίωση γίνεται από την CAK σε µια θρεονίνη στη θέση 161 και συµβάλλει, µαζί µε τη σύνδεση της κυκλίνης, στην ενεργοποίηση της κινάσης (13). Αντίθετα, η φωσφορυλίωση της τυροσίνης στη θέση 15 οδηγεί σε απενεργοποίηση της κινάσης. 21

Εικόνα 2. Ενεργοποίηση των κυκλινο-εξαρτώµενων κινασών (cdks) µέσω φωσφορυλίωσης Ένας άλλος σηµαντικός µηχανισµός µε τον οποίο ρυθµίζεται η δραστηριότητα των cdks είναι µέσω των αναστολέων των cdks, µε τους οποίους ελέγχεται η απάντηση σε διάφορα ερεθίσµατα. Στα κύτταρα των θηλαστικών αυτοί διακρίνονται σε δυο κατηγορίες (Εικόνα 3): την οικογένεια των αναστολέων Cip/Kip (όπου ανήκουν οι πρωτεΐνες p21, p27, p57) που είναι γενικοί αναστολείς των cdks (14) και στην οµάδα των πρωτεϊνών INK4 (όπου ανήκουν οι πρωτεΐνες p15, p16, p18, p19) που είναι ειδικοί αναστολείς των cdks4/6 και του συµπλέγµατός τους µε την κυκλίνη D (15,16). Εικόνα 3. Γενικοί (Cip/Kip) και ειδικοί (INK4) αναστολείς των κυκλινο-εξαρτώµενων κινασών (cdks) 22

Οι κυκλινο-εξαρτώµενες κινάσες ρυθµίζουν τον κυτταρικό κύκλο µέσω φωσφορυλίωσης ενός συνόλου πρωτεϊνών που αποτελούν τα υποστρώµατά τους. Ένα από τα υποστρώµατα που παίζει σηµαντικό ρόλο στον κυτταρικό κύκλο είναι η πρωτεΐνη του γονιδίου του ρετινοβλαστώµατος (prb) (17). Σε κύτταρα σε κατάσταση ηρεµίας η πρωτεΐνη Rb συνδέεται µε το µεταγραφικό παράγοντα E2F, κάτι που τον καθιστά ανενεργό. Ο παράγοντας E2F ελέγχει τη µεταγραφή γονιδίων που είναι σηµαντικά για τον κυτταρικό κύκλο: ρυθµιστές του κυτταρικού κύκλου (όπως οι κυκλίνες Ε και Α), ένζυµα που συµµετέχουν στη βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων (όπως η αναγωγάση του διυδροφολικού, η θυµιδυλική συνθετάση) και στοιχεία του συστήµατος αντιγραφής του DNA (18). Καθώς το κύτταρο περνάει το σηµείο ελέγχου R προς τη φάση S, η πρωτεΐνη Rb φωσφορυλιώνεται σταδιακά σε πολλαπλές θέσεις και αυτό οδηγεί σε αποδέσµευση του E2F και ενεργοποίησή του, η οποία είναι απαραίτητη για τη µετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S (19) (Εικόνα 4). Η φωσφορυλίωση της prb γίνεται από τις κυκλινο-εξαρτώµενες κινάσες. Το σύµπλεγµα κυκλίνη D- cdk4 συνδέεται σταθερά µε την πρωτεΐνη Rb και αποσυνδέεται µόλις γίνει η φωσφορυλίωσή της (20). Πιθανότατα τα συµπλέγµατα κυκλίνη D- cdk4 και κυκλίνη Ε- cdk2 συνεργάζονται για τη φωσφορυλίωση της prb και αυτός είναι ο µηχανισµός µε τον οποίο τα αυτές οι κυκλίνες προάγουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου προς τη φάση S. Εικόνα 4. Έλεγχος του κυτταρικού κύκλου µέσω του µονοπατιού Rb και της πρωτεΐνης p53 Σηµεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoints). Τα φυσιολογικά κύτταρα εισέρχονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό υπό την επίδραση εξωκυττάριων σηµάτων, µε τη µεσολάβηση και υπό τον έλεγχο των πρωτεϊνών του κυττα- 23

ρικού κύκλου (Εικόνα 4) (21). Αντίθετα τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται και υπό συνθήκες που τα φυσιολογικά κύτταρα δεν θα µπορούσαν. Τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα φέρουν µεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου. Τουλάχιστον ένα από τα στοιχεία του ρυθµιστικού µονοπατιού του Rb (p16, κυκλίνη D, cdk4, E2F, Rb) παρουσιάζει κάποια µετάλλαξη ή επιγενετική αλλοίωση σε σχεδόν 100% των νεοπλασµάτων του ανθρώπου. Εικόνα 5. Καταστάσεις στις οποίες ενεργοποιούνται µηχανισµοί διακοπής του κυτταρικού κύκλου Τα φυσιολογικά κύτταρα χρησιµοποιούν τα σηµεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου ως µηχανισµούς ασφαλείας για να αποφεύγουν τη συσσώρευση γενετικών λαθών κατά το διπλασιασµό τους (Εικόνα 5) (22). Πολλά ογκοκατασταλτικά γονίδια είναι µέρος αυτών των µονοπατιών ελέγχου και αδρανοποίησή τους συµβάλλει στην κλωνική εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων επιτρέποντας τη συσσώρευση γενετικών λαθών που υπό κανονικές συνθήκες θα προκαλούσαν διακοπή του κυτταρικού κύκλου (και επιδιόρθωση) ή κυτταρικό θάνατο. Ίσως το καλύτερο παράδειγµα είναι το γονίδιο p53, το πιο συχνά µεταλλαγµένο γονίδιο σε νεοπλάσµατα, που ρυθµίζει το σηµείο ελέγχου στη φάση G1 ώστε να εµποδίζει το διπλασιασµό του DNA που φέρει κάποια βλάβη. 1.2. Απόπτωση Ο όρος απόπτωση ή προγραµµατισµένος κυτταρικός θάνατος αναφέρεται στην προαγωγή του κυτταρικού θανάτου µέσω ενός ρυθµισµένου µοριακού µονοπατιού που διαθέτει το κύτταρο. Η απόπτωση είναι εξαιρετικά σηµαντική για την ανάπτυξη και την οµοιόσταση των πολυκυττάριων οργανισµών (23). 24

Η οικογένεια πρωτεϊνών bcl-2 κατέχει σηµαντικό ρόλο στον έλεγχο της απόπτωσης (24). Η διαπίστωση ότι αυτές οι πρωτεΐνες έχουν ως λειτουργία την αναστολή της απόπτωσης, οδήγησε στο να οριστεί µια καινούρια οµάδα ογκογονιδίων: τα αντι-αποπτωτικά γονίδια (25). Παράλληλα, πολλοί υποδοχείς της επιφάνειας του κυττάρου (όπως ο υποδοχέας του παράγοντα νέκρωσης όγκων, tumor necrosis factor receptor, TNFR) µπορούν να µεταβάλλουν την ευαισθησία του κυττάρου σε σήµατα απόπτωσης (26). Κεντρικό ρόλο στον έλεγχο της απόπτωσης έχει η πρωτεΐνη p53 (TP53), που ενεργοποιείται σε περίπτωση µη επιδιορθώσιµης βλάβης του DNA (27). Η δράση της TP53 στην απόπτωση επιτυγχάνεται µέσω αύξησης της έκφρασης του γονιδίου bax (που προάγει την απόπτωση) µε ταυτόχρονη ελάττωση της bcl-2 (28). Η συσχέτιση της απόπτωσης µε την καρκινογένεση στηρίζεται στο µοντέλο των πολλαπλών γενετικών βλαβών που είναι απαραίτητες για τη δηµιουργία του καρκινικού φαινότυπου. Πολλές καρκινογόνες µεταλλάξεις διεγείρουν το µηχανισµό της απόπτωσης ώστε το κύτταρο που τις φέρει να καταστρέφεται (29). Η ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και η αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων µπορεί να µην επαρκούν για να προκαλέσουν πολλαπλασιασµό των καρκινικών κυττάρων χωρίς την ταυτόχρονη απώλεια της ικανότητας αυτών των κυττάρων για απόπτωση (30). Από την άλλη µεριά, µεταλλάξεις στα γονίδια που ελέγχουν την απόπτωση είναι ίσως από µόνες τους ανεπαρκείς για να προκαλέσουν καρκινογένεση, παρέχουν ωστόσο στο κύτταρο µεγαλύτερη διάρκεια ζωής και επιτρέπουν τη συσσώρευση επιπλέον µεταλλάξεων σε γονίδια που ελέγχουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό (31). 1.3. Ογκογονίδια Τα ογκογονίδια είναι µεταλλαγµένες µορφές φυσιολογικών γονιδίων του κυττάρου που ονοµάζονται πρωτο-ογκογονίδια (32) ή γονίδια ογκογόνων ιών µε ικανότητα µεταµόρφωσης του κυττάρου ξενιστή (33). Πρόκειται για γονίδια που συµµετέχουν σε καταρράκτες που ρυθµίζουν την πρόοδο στον κυτταρικό κύκλο, την κυτταρική διαίρεση και διαφοροποίηση (34). Κωδικοποιούν πρωτεΐνες που µπορεί να είναι αυξητικοί παράγοντες, υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, κινάσες τυροσίνης που συνδέονται µε την κυτταρική µεµβράνη, πρωτεΐνες µε δράση GTP-ασης, κυτταροπλασµατικές κινάσες σερίνης-θρεονίνης και πυρηνικοί αυξητικοί παράγοντες (35,36). 25

Η ενεργοποίηση µόνο του ενός από τα δύο αλλήλια ενός πρωτο-ογκογονιδίου και η µετατροπή του σε ογκογονίδιο είναι αρκετή για να επηρεάσει το φαινότυπο του κυττάρου. Η ενεργοποίηση αυτή µπορεί να γίνει µε κάποιο από τους παρακάτω µηχανισµούς (37): α) Σηµειακές µεταλλάξεις που οδηγούν σε αλλαγή της δοµής των αντίστοιχων πρωτεϊνικών προϊόντων, τα οποία έχουν διαφορετική δραστικότητα και ιδιότητες. β) Υπερέκφραση του γονιδίου λόγω χρωµοσωµικής µετατόπισης που φέρνει το πρωτο-ογκογονίδιο δίπλα στον ενισχυτή ενός άλλου γονιδίου ή στον προαγωγέα ενός συχνά εκφραζόµενου γονιδίου στο συγκεκριµένο κύτταρο, µε αποτέλεσµα την απώλεια του µεταγραφικού ελέγχου του γονιδίου. γ) Γονιδιακή ενίσχυση, δηλαδή ενσωµάτωση πολλαπλών αντιγράφων του γονιδίου και κατά συνέπεια αυξηµένη έκφραση. 1.4. Ογκοκατασταλτικά γονίδια Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες που ρυθµίζουν την κυτταρική αύξηση και πολλαπλασιασµό και η απώλεια της λειτουργίας τους µπορεί να οδηγήσει στην αλλαγή του φαινότυπου του κυττάρου. Κάποια από αυτά εµποδίζουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, άλλα οδηγούν τα κύτταρα σε απόπτωση και άλλα διατηρούν σταθερό το γονιδίωµα εξασφαλίζοντας την πιστή αντιγραφή και επιδιόρθωση του DNA (38-43). Σύµφωνα µε την υπόθεση του Knudson (44), η διαταραχή της λειτουργίας ενός µόνο ογκογονιδίου ή ενός µόνο ογκοκατασταλτικού γονιδίου δεν αρκεί για την καρκινογένεση. Ένα "γεγονός" που ενεργοποιεί κάποιο ογκογονίδιο δεν µπορεί να οδηγήσει σε καρκίνο, εφόσον φυσιολογικά ογκοκατασταλτικά γονίδια αντισταθµίζουν τη βλάβη και µόνο ένα επιπλέον "γεγονός" που να αδρανοποιεί κάποιο ογκοκατασταλτικό γονίδιο οδηγεί σε µη ελεγχόµενο πολλαπλασιασµό. Αντίστροφα, βλάβη σε κάποιο ογκοκατασταλτικό γονίδιο δεν οδηγεί σε καρκίνο παρά µόνο όταν συνδυάζεται µε αυξητικά σήµατα από ένα ενεργοποιηµένο ογκογονίδιο. 1.5. Αγγειογένεση - µετάσταση Τα νεοπλασµατικά κύτταρα προάγουν την αγγειογένεση µέσω της έκκρισης αυξητικών παραγόντων. Τέτοιοι παράγοντες, όπως ο Ενδοθηλιακός Αυξητικός 26

Παράγοντας (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) και ο Βασικός Αυξητικός Παράγοντας των Ινοβλαστών (basic Fibroblast Growth Factor, bfgf), προάγουν τη δηµιουργία τριχοειδών στον όγκο, ώστε να εξασφαλιστεί η παροχή οξυγόνου και θρεπτικών στοιχείων (45). Η αγγειογένεση χρειάζεται για την αύξηση του µεγέθους του όγκου και παράλληλα είναι απαραίτητη για την εξάπλωση του νεοπλάσµατος και τη δηµιουργία µεταστάσεων. Τα καρκινικά κύτταρα εισέρχονται στα αγγεία και µέσω της κυκλοφορίας φτάνουν σε αποµακρυσµένες θέσεις. O VEGF είναι ένας σηµαντικός παράγοντας για την αγγειογένεση. Η σύνδεση µε τον υποδοχέα του (VEGF receptor-2, VEGFR-2) ενεργοποιεί ένα καταρράκτη που οδηγεί στην παραγωγή παραγόντων οι οποίοι διεγείρουν τη διαπερατότητα των αγγείων, την επιβίωση / πολλαπλασιασµό, τη µετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων και τελικά τη διαφοροποίηση προς ώριµα αιµοφόρα αγγεία (46). Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων για µετάσταση και επιβίωση σε θέσεις αποµακρυσµένες από την πρωτοπαθή εστία αποτελεί µια πολύπλοκη διαδικασία στην οποία βασικό ρόλο κατέχει η σχέση των καρκινικών κυττάρων µε το εξωκυττάριο στρώµα και τα µόρια που το αποτελούν. Η αποδόµηση των πρωτεϊνών του εξωκυτταρίου στρώµατος επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να διεισδύουν στους ιστούς και να δίνουν µεταστάσεις. Οι µεταλλοπρωτεϊνάσες του στρώ- µατος (Matrix metalloproteinases, MMPs) και η συµµετοχή τους στη διάσπαση του εξωκυτταρίου στρώµατος, έχουν κεντρικό ρόλο στην ικανότητα των κυττάρων για διείσδυση και µετάσταση. Επίσης έχει αποσαφηνιστεί ο ρόλος τους στην αγγειογένεση και στη δηµιουργία των µεταστατικών εστιών στις δευτεροπαθείς θέσεις του νεοπλάσµατος (47). 27

28

2. ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ Είναι γνωστό ότι οι µεταλλάξεις, είτε είναι κληρονοµούµενες µέσω των γεννητικών κυττάρων, είτε (συχνότερα) προκύπτουν κατά τη διάρκεια της ζωής στα σωµατικά κύτταρα, µπορούν να οδηγήσουν σε καρκίνο. Όπως προαναφέρθηκε, αυτές οι µεταλλάξεις µπορούν να µεταβάλουν τη λειτουργία γονιδίων, όπως π.χ. να ενισχύσουν τη λειτουργία ογκογονιδίων ή να προκαλέσουν απώλεια της λειτουργίας ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Για πολλές δεκαετίες υπήρχε το ερώτηµα εάν η έναρξη και η εξέλιξη του καρκίνου οφειλόταν µόνο στις µεταλλάξεις ή και σε "επιγενετικές" µεταβολές που δεν σχετίζονται µε αλλαγές στην πρωτοταγή αλληλουχία των βάσεων στο DNA. Ο όρος "επιγενετική" αναφέρεται σε µια κληρονοµούµενη (στα σωµατικά κύτταρα) µεταβολή της γονιδιακής έκφρασης που δεν οφείλεται σε αλλαγή της αλληλουχίας των βάσεων του DNA (48). ύο βασικοί µηχανισµοί που προκαλούν επιγενετικές µεταβολές είναι η µεθυλίωση του DNA και οι µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών (49). ιαταραχή στην ισορροπία των επιγενετικών µηχανισµών µπορεί να έχει σηµαντική επίδραση στη δοµή της χρωµατίνης και στη µεταγραφική δραστηριότητα. Οι επιγενετικές µεταβολές µπορούν να γεφυρώσουν µε τον καλύτερο τρόπο την έκθεση σε περιβαλλοντικούς παράγοντες και το γενετικό υπόστρωµα στη διαδικασία της καρκινογένεσης (50). 2.1. Μεθυλίωση του DNA Σε ένα ανθρώπινο κύτταρο η µεγάλη πλειοψηφία των γονιδίων είναι απενεργοποιηµένα, καθώς τα περισσότερα γονίδια είναι απαραίτητα σε ορισµένα µόνο κύτταρα και εκφράζονται µόνο στα κύτταρα αυτά. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα χρησιµοποιούν αρκετούς µηχανισµούς για την απενεργοποίηση των γονιδίων τους. Για τα θηλαστικά η µεθυλίωση του DNA αποτελεί ένα από τα σηµεία από τα οποία ξεκινάνε οι µεταβολές της χρωµατίνης που είναι υπεύθυνες για την απε- 29

νεργοποίηση και τη διατήρηση τη "σιωπηρής" κατάστασης των γονιδίων και αποτελεί µια απαραίτητη διαδικασία (51). Μόνο τέσσερις βάσεις (αδενίνη, γουανίνη, κυτοσίνη, θυµίνη) συµµετέχουν στην πρωτοταγή δοµή του DNA. Ωστόσο µετά το διπλασιασµό του DNA που προηγείται µιας κυτταρικής διαίρεσης, συµβαίνει µια τροποποίηση που παράγει την "πέµπτη βάση" (52). Πιθανότατα είναι µέρος ενός συστήµατος που επηρεάζει τη δοµή της χρωµατίνης και τον έλεγχο της µεταγραφής. Εικόνα 6. οµή της 5 - µεθυλοκυτοσίνης (συγκριτικά µε τη δοµή της κυτοσίνης) Η µεθυλίωση του DNA στα θηλαστικά περιορίζεται αποκλειστικά στην 5 θέση της κυτοσίνης (Εικόνα 6) και γίνεται in vivo από τα ένζυµα DNA µεθυλοτρανσφεράσες (Dnmts) (53). ότης µεθυλο-οµάδων είναι η S-αδενοσινοµεθειονίνη (SAM) (Εικόνα 7 και 8). Εικόνα 7. οµή της S- αδενοσινοµεθειονίνης (SAM) Από τις µεθυλοτρανσφεράσες, η Dnmt1 είναι υπεύθυνη για τη διατήρηση της µεθυλίωσης στα διαιρούµενα κύτταρα και παρουσιάζει την ακόλουθη ειδικότητα: α) µεθυλιώνει µόνο κυτοσίνες (C) που ενώνονται µε φωσφοδιεστερικό δεσµό στην 5 θέση της δεοξυριβόζης µε µια γουανίνη (G), δηλαδή αποτελούν µέρος 30

Εικόνα 8. Αντίδραση µεθυλίωσης της κυτοσίνης από τις µεθυλοτρανφεράσες. ότης µεθυλο-οµάδων είναι η S- αδενοσινοµεθειονίνη (SAM) του δινουκλεοτιδίου CpG και β) παρουσιάζει προτίµηση για CpG δινουκλεοτίδια στα οποία µια από τις δύο κυτοσίνες είναι ήδη µεθυλιωµένη (54). Είναι γνωστό ότι η συχνότητα των CpG δινουκλεοτιδίων είναι πολύ µικρότερη (4-5 φορές) από την αναµενόµενη µε βάση τη συχνότητα των C και G βάσεων στο DNA. Από τα υπάρχοντα CpG δινουκλεοτίδια περίπου 60-90% είναι µεθυλιωµένα και αυτή η υψηλή συχνότητα παρέχει µια πιθανή αιτιολόγηση της ελαττωµένης συχνότητας CpG: οι κυτοσίνες του DNA υπόκεινται σε αυτόµατη υδρολυτική απαµίνωση προς ουρακίλη, µια βάση που αναγνωρίζεται από τους µηχανισµούς επιδιόρθωσης του DNA, αποµακρύνεται και αντικαθίσταται. Αντίθετα, όταν η 5 -µεθυλοκυτοσίνη υφίσταται την ίδια απαµίνωση, η βάση που προκύπτει δεν είναι ουρακίλη αλλά θυµίνη (Τ), µια βάση που είναι µέρος της φυσιολογικής δοµής του DNA και ξεφεύγει από τους επιδιορθωτικούς µηχανισµούς (Εικόνα 9) (55). Έτσι η χαµηλή συχνότητα CpG δινουκλεοτιδίων πιθανώς αντανακλά τη σταδιακή τους απώλεια µέσω αυτής της διαδικασίας C > T χηµικής µετάπτωσης (transition), που αποτελεί το συχνότερο πολυµορφισµό στον ανθρώπινο πληθυσµό και από τις συχνότερες µεταλλάξεις στον καρκίνο (56,57). Από τα CpG δινουκλεοτίδια που έχουν διατηρηθεί τα περισσότερα είναι διασκορπισµένα στο γονιδίωµα, κάποια όµως βρίσκονται σε πολύ υψηλή συγκέντρωση σε περιοχές που ονοµάζονται CpG νησίδες (CpG islands). Πρόκειται για περιοχές του γονιδιώµατος µήκους 500-2000 ζευγών βάσεων (bp) και αντι- 31

Εικόνα 9. Αυτόµατη απαµίνωση 5-µεθυλοκυτοσίνης σε θυµίνη στοιχούν στις περιοχές των προαγωγέων (περιοχές του DNA στις οποίες συνδέεται η RNA πολυµεράση και που ελέγχουν την έκφραση των αντίστοιχων γονιδίων) των περισσοτέρων από τα µισά γονιδίων (η πλειοψηφία των CpG νησίδων σχετίζεται µε γονίδια αφορούν στη διατήρηση της κυτταρικής οργάνωσης, house-keeping genes). Στις περιοχές αυτές η συχνότητα CpG είναι παρόµοια µε την αναµενόµενη µε βάση τη συχνότητα των C+G βάσεων και ο λόγος CpG/GpC είναι περίπου 60%. Αυτό σηµαίνει ότι στις περιοχές αυτές τα CpG δεν υπέστησαν την απώλεια που συνέβη στο υπόλοιπο γονιδίωµα, κάτι που οφείλεται στο γεγονός ότι τα CpG δινουκλεοτίδια στις περιοχές αυτές δεν είναι µεθυλιωµένα, σε αντίθεση µε εκείνα που βρίσκονται διασκορπισµένα στο γονιδίωµα (58). 2.1.α. Ο ρόλος της µεθυλίωσης του DNA στη γονιδιακή έκφραση Η µεθυλίωση διατηρεί το µεγάλο τµήµα του µη κωδικοποιού DNA σε αδρανή (µεταφραστικά) κατάσταση. Αυτή η διαδικασία προλαµβάνει τη µετάφραση ενός µεγάλου τµήµατος του γονιδιώµατος που αποτελείται από επαναλαµβανόµενα τµήµατα, ιικές αλληλουχίες και τρανσποζόνια (αλληλουχίες DNA που µετακινούνται από την κανονική τους θέση σε µια άλλη περιοχή στο γονιδίωµα). Η µεταγραφή αυτών των τµηµάτων θα µπορούσε να είναι βλαπτική για τα κύτταρα (59). Η µεθυλίωση αποτελεί ένα φυσιολογικό µηχανισµό για την αδρανοποίηση του Χ χρωµοσώµατος στα θήλεα άτοµα (60) και την έκφραση ορισµένων γονιδίων στα οποία αυτή εξαρτάται από τον γονέα από τον οποίο προέρχονται (imprinted genes) (61). Η µεθυλίωση επηρεάζει την έλικα του DNA αλλάζοντας τη διαµόρφωσή της (Εικόνα 10). Ο µηχανισµός µε τον οποίο η µεθυλίωση του DNA µπορεί να καταστείλει τη µεταγραφή βασίζεται σε πρωτεΐνες που συνδέονται µε το µεθυλιωµένο DNA (62). Η πρώτη που χαρακτηρίστηκε, η MeCP1 (Methyl Cytosine binding 32

Εικόνα 10. Η παρουσία 5 - µεθυλοκυτοσίνης αλλάζει τη δια- µόρφωση στην έλικα του DNA Protein), χρειάζεται µια σειρά από τουλάχιστον 12 συµµετρικά (και στις δύο αλυσίδες) µεθυλιωµένες CpG θέσεις για να συνδεθεί στο DNA. Η ικανότητά της να καταστέλλει τη µεταγραφή εξαρτάται από το βαθµό της µεθυλίωσης και την ισχύ του προαγωγέα: ένας ασθενής προαγωγέας µπορεί να ανασταλεί ακόµα και από χαµηλό επίπεδο µεθυλίωσης ενώ ένας ισχυρός προαγωγέας αναστέλλεται µόνο σε µεγάλο βαθµό µεθυλίωσης που οδηγεί σε ισχυρή σύνδεση µε την MeCP1 (63). Μια άλλη πρωτεΐνη, η MeCP2, µπορεί να συνδέεται µε ένα µόνο συµµετρικά µεθυλιωµένο CpG δινουκλεοτίδιο και καταστέλλει ισχυρά τη µεταγραφή, ακόµα και όταν συνδέεται σε απόσταση έως και 2 kb από την περιοχή του προαγωγέα (64). Η σύνδεση των MeCPs στο µεθυλιωµένο DNA οδηγεί στη δηµιουργία συµπλέγµατος αποτελούµενου από πολλές πρωτεΐνες, ανάµεσα στις οποίες και οι δεακετυλάσες των ιστονών (HDAC, Histone Deacetylases) που αποτελούν µέρος του µηχανισµού τροποποίησης της χρωµατίνης. Η αποακετυλίωση των ιστονών είναι µια από τις µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις που οδηγούν στο σχηµατισµό ετεροχρωµατίνης και στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης (Eικόνα 11) (65). Εικόνα 11. Αποακετυλίωση των ιστονών στο µεθυλιωµένο DNA οδηγεί σε καταστολή της µεταγραφής 33

2.1.β. Μεθυλίωση του DNA και καρκίνος ύο ειδών διαταραχές της µεθυλίωσης έχουν αναγνωριστεί στα καρκινικά κύτταρα: αρχικά πιστευόταν ότι οι µεταβολές της µεθυλίωσης στον καρκίνο αφορούσαν µόνο γενικευµένη αποµεθυλίωση του γονιδιώµατος που θα µπορούσε να οδηγήσει σε µαζική υπερέκφραση ογκογονιδίων (των οποίων φυσιολογικά οι προαγωγείς είναι υπερµεθυλιωµένοι) (66). Ωστόσο βρέθηκε ότι η αποµεθυλίωση αυτή αφορά µόνο CpG δινουκλεοτίδια που είναι διασκορπισµένα στο γονιδίωµα και όχι αυτά που βρίσκονται σε CpG νησίδες (67). ύο πιθανές συνέπειες της αποµεθυλίωσης του γονιδιώµατος είναι α) η απώλεια του ελέγχου της µεταγραφής σε φυσιολογικά σιωπηρές περιοχές, που θα µπορούσε να οδηγήσει σε έκφραση ιικών και άλλων φυσιολογικά απενεργοποιηµένων γονιδίων και β) η περικεντροµεριδιακή αστάθεια, καθώς οι περιοχές του κεντροµεριδίου χρειάζονται αυξηµένα επίπεδα µεθυλίωσης για τη σωστή λειτουργία (68). Η δεύτερη µεταβολή της µεθυλίωσης του DNA που παρατηρείται στον καρκίνο είναι η υπερµεθυλίωση των CpG νησίδων σε περιοχές προαγωγέων γονιδίων, σχετίζεται µε καταστολή της µεταγραφής και αποτελεί, µαζί µε τις µεταλλάξεις, ένα µηχανισµό για την αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων (69). Στο τροποποιηµένο µοντέλο του Knudson (70), διαταραχή της λειτουργίας ενός ογκοκατασταλτικού γονιδίου απαιτεί την απώλεια της λειτουργίας και των δύο αλληλίων του γονιδίου. Εικόνα 12. Το µοντέλο του Κnudson για την αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (σε σποραδικό και οικογενή καρκίνο), µε τη µεθυλίωση να αποτελεί ένα από τα δύο συµβάντα 34

Η απώλεια της λειτουργίας του ενός αλληλίου µπορεί να οφείλεται σε κληρονοµούµενες ή σωµατικές µεταλλάξεις στην κωδικοποιούσα περιοχή του γονιδίου. Το δεύτερο συµβάν (hit) συνήθως οφείλεται σε απώλεια της περιοχής του χρω- µοσώµατος που περιέχει το άλλο αλλήλιο (απώλεια της ετεροζυγωτίας). Η υπερ- µεθυλίωση του προαγωγέα ενός γονιδίου µπορεί να έχει το ίδιο αποτέλεσµα µε µια µετάλλαξη στην κωδικοποιούσα περιοχή του (πρώτο συµβάν) (52) (Eικόνα 12). Ενώ οι σηµειακές µεταλλάξεις σπάνια µπορούν να αποτελέσουν αιτία για απώλεια της λειτουργίας και των δύο αλληλίων, η υπερµεθυλίωση των προαγωγέων και των δύο αντιγράφων ενός γονιδίου δεν είναι σπάνια σε σποραδικό καρκίνο. Ο πιθανός µηχανισµός µε τον οποίο γίνεται η υπερµεθυλίωση των προαγωγέων στον καρκίνο είναι: Στο µεταµορφωµένο κύτταρο κάποιες CpG νησίδες ογκοκατασταλτικών γονιδίων θα εµφανίσουν υπερµεθυλίωση (69,71). Αυτό πιθανότατα είναι µια σταδιακή διαδικασία, σε αντίθεση µε την εµφάνιση µιας µετάλλαξης σε ένα γονίδιο. Μάλλον χρειάζονται αλλεπάλληλα "κύµατα" διαταραγ- µένης µεθυλίωσης για να προκύψει τόσο έντονη υπερµεθυλίωση αρκετή για να προκαλέσει µεταγραφική απενεργοποίηση του αντίστοιχου γονιδίου. ύο πιθανές θεωρίες υπάρχουν για αυτή τη de novo µεθυλίωση (Eικόνα 13). Πρώτον, η µεθυλίωση στον καρκίνο εξαπλώνεται από κέντρα στα οποία υπάρχει φυσιολογικά (π.χ. από Alu περιοχές) προς τις CpG νησίδες (72). εύτερον, υπάρχει Εικόνα 13. Πώς δηµιουργείται η υπερµεθυλίωση στον καρκίνο: εξάπλωση από κέντρα µεθυλίωσης, εµφύτευση µεθυλίωσης, πλεονέκτηµα επιβίωσης 35

µια αρχικά περιορισµένη µεθυλίωση και µερικά µεµονωµένα CpG δινουκλεοτίδια µεθυλιώνονται. Αυτό προσελκύει και περαιτέρω καινούρια µεθυλίωση. Αυτή η διαδικασία έχει µια θετική συνεργική δράση µέχρι να επιτευχθεί η υπερµεθυλίωση (67). Ένα ακόµη ερώτηµα που παραµένει αναπάντητο είναι γιατί σε ένα καρκινικό κύτταρο κάποιες CpG νησίδες εµφανίζουν υπερµεθυλίωση και άλλες παραµένουν µη µεθυλιωµένες. Πιθανώς µια απάντηση είναι ότι κάποιες CpG νησίδες εµφανίζουν υπερµεθυλίωση γιατί προσφέρουν ένα πλεονέκτηµα για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασµό του συγκεκριµένου κυττάρου (67). Η µεταγραφική απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων λόγω της υπερµεθυλίωσης των προαγωγέων τους είναι συχνό φαινόµενο στον καρκίνο, πιθανώς συχνότερο των µεταλλάξεων. Ο συνεχώς αυξανόµενος κατάλογος γονιδίων που εµφανίζουν υπερµεθυλίωση των προαγωγέων τους περιλαµβάνει γονίδια που συµµετέχουν στον κυτταρικό κύκλο (p16 INK4a, p15 INK4b, Rb, p14 ARF ), στην επιδιόρθωση του DNA (BRCA1, hmlh1, MGMT), στο µεταβολισµό των καρκινογόνων (GSTP1), στην κυτταρική συγκόλληση (CDH1, CDH13), στην απόπτωση (DAPK, TMS1) (Πίνακας 1). Φαίνεται µάλιστα ότι υπάρχει ένα προφίλ υπερµεθυλίωσης CpG νησίδων ανάλογα µε το είδος του όγκου. Επιπλέον κάποια νεοπλάσµατα παρουσιάζουν πολύ περισσότερη µεθυλίωση (οισοφάγου στοµάχου, εντέρου) σε σχέση µε άλλα που εµφανίζουν σηµαντικά µικρότερη µεθυλίωση (ωοθηκών). Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι τα νεοπλάσµατα µε το µεγαλύτερο βαθµό µεθυλίωσης είναι αυτά µε τη µεγαλύτερη έκθεση σε καρκινογόνες ουσίες (73). Η υπερµεθυλίωση δεν είναι µια µεµονωµένη διαδικασία ανεξάρτητη των µεταλλάξεων. Ένα παράδειγµα για το πώς η µεθυλίωση επηρεάζει το γονιδίωµα του καρκινικού κυττάρου αποτελεί το γονίδιο Ο 6 -µεθυλογουανίνο-dna-µεθυλοτρανσφεράση (MGMT) που επιδιορθώνει το DNA. Η Ο 6 -µεθυλογουανίνη προκύπτει από την προσθήκη µιας µεθυλοµάδας στη γουανίνη (G) µε συνέπεια να αναγνωρίζεται από τις DNA πολυµεράσες ως αδενίνη (Α) και έτσι µπορεί να δηµιουργήσει G > A µεταλλάξεις. Η απενεργοποίηση του γονιδίου MGMT µέσω της µεθυλίωσης του προαγωγέα του µπορεί να οδηγήσει σε συσσώρευση G > A µεταλλάξεων σε σηµαντικά γονίδια (74). Επιπλέον, όπως προαναφέρθηκε, η αυτόµατη απαµίνωση της µεθυλιωµένης κυτοσίνης οδηγεί στη C > T χηµική µετάπτωση, που είναι από τις συχνότερες µεταλλάξεις (όπως για παράδειγµα στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53) (56,57). 36

Πίνακας 1. Ορισµένα από τα γονίδια που εµφανίζουν υπερµεθυλίωση του προαγωγέα τους στον καρκίνο Γονίδιο Λειτουργία Τύπος νεοπλάσµατος Συνέπεια της µεθυλίωσης Βιβλιογραφία p16 αναστολέας κυκλινοεξαρτώµενης πολλοί τύποι είσοδος στον κυτταρικό κύκλο (75) κινάσης p14 αναστολέας του MDM2 π. εντέρου, στοµάχου, αποδόµηση της πρωτεΐνης p53 (76,77) νεφρού p15 αναστολέας κυκλινοεξαρτώµενης λευχαιµία είσοδος στον κυτταρικό κύκλο (78,79) κινάσης hmlh1 επιδιόρθωση κακόζευξης π. εντέρου, ενδοµητρίου, µεταλλάξεις πλαισίου ανάγνωσης (80,81) (mismatch repair) του DNA στοµάχου MGMT επιδιόρθωση της Ο6-µεθυλογουανίνης πολλοί τύποι µεταλλάξεις, χηµειοευαισθησία (82-84) στο DNA GSTP1 σύνδεση µε γλουταθειόνη προστάτη, µαστού, νεφρού συσσώρευση µεταβολιτών (;) (85,86) BRCA1 επιδιόρθωση DNA, µεταγραφή µαστού, ωοθηκών θραύσεις στη διπλή έλικα (;) (87,88) p73 oµόλογο του p53 λεµφώµατα άγνωστη (89,90) LKB1/STK11 κινάση σερίνης/ θρεονίνης π. εντέρου, µαστού, πνεύµονα άγνωστη (91) ER υποδοχέας οιστρογόνων µαστού απουσία ευαισθησίας στις ορµόνες (92) PR υποδοχέας προγεστερόνης µαστού απουσία ευαισθησίας στις ορµόνες (93) AR υποδοχέας ανδρογόνων προστάτη απουσία ευαισθησίας στις ορµόνες (94,95) 37

RARβ2 υποδοχέας ρετινοϊκού οξέος π. εντέρου, πνεύµονα, απουσία ευαισθησίας σε βιταµίνες (96,97) κεφαλής-τραχήλου RASSF1 οµόλογο του ras πολλοί τύποι άγνωστη (98,99) VHL συστατικό της λιγάσης της νεφρού, αιµαγγειοβλάστωµα απώλεια της απάντησης στην υποξία (100,101) ουµπικουιτίνης Rb αναστολέας του κυτταρικού κύκλου ρετινοβλάστωµα είσοδος στον κυτταρικό κύκλο (102,103) THBS-1 θροµβοσπονδίνη, στοµάχου νεοαγγειογένεση (104,105) αντιαγγειογενετικός παράγοντας CDH1 Ε-κατχερίνη, κυτταρική µαστού, στοµάχου, λευχαιµία διασπορά της νόσου (106,107) προσκόλληση APC αναστολέας της β-κατενίνης πεπτικού, αναπνευστικού ενεργοποίηση µονοπατιού β-κατενίνης (108,109) COX-2 κυκλοξυγενάση-2 π. εντέρου, στοµάχου αντίσταση σε αντιφλεγµονώδη (;) (110,111) SOCS-1 αναστολέας του µονοπατιού JAK-STAT ήπατος ενεργοποίηση JAK2 (112,113) RIZ1 µεθυλοτρανσφεράση ιστόνης µαστού, ήπατος υπερέκφραση γονιδίων (;) (114,115) CDH13 Η-κατχερίνη, κυτταρική προσκόλληση µαστού, πνεύµονα διασπορά της νόσου (;) (116,117) DAPK προαποπτωτική δράση π. εντέρου, πνεύµονα, αντίσταση στην απόπτωση (118,119) λεµφώµατα TMS1 προαποπτωτική δράση µαστού αντίσταση στην απόπτωση (120,121) TPEF/HPP1 διαµεµβρανική πρωτεΐνη εντέρου, ουροδόχου κύστεως άγνωστη (122) 38

2.1.γ. Μεθυλίωση του DNA και καρκινογένεση από ιούς Λοίµωξη από DNA ιούς και ρετροϊούς που µπορούν να προκαλέσουν εισαγωγή ιικού DNA στο γονιδίωµα του ξενιστή, συχνά ενεργοποιεί ως µηχανισµό άµυνας τη µεθυλίωση του ιικού γενετικού υλικού. Η µεθυλίωση του ιικού DNA έχει σκοπό την καταστολή της έκφρασης των γονιδίων του ιού και καταλύεται από τις µεθυλοτρανσφεράσες του κυττάρου ξενιστή. Η περαιτέρω συγκέντρωση πρωτεϊνών που συνδέονται στο µεθυλιωµένο DNA και δεακετυλάσης των ιστονών οδηγούν σε πυκνή δοµή χρωµατίνης και απενεργοποίηση των γονιδίων του ιού (123). Ωστόσο οι ιοί έχουν συχνά την ικανότητα να ξεπερνούν αυτό το µηχανισµό και να χρησιµοποιούν τη µεθυλίωση προς όφελός τους (124). Για παράδειγµα, µεθυλίωση συγκεκριµένων προαγωγέων γονιδίων του ιού Epstein-Barr (EBV) ση- µατοδοτεί τη λανθάνουσα φάση της λοίµωξης που είναι απαραίτητη για τη χρόνια λοίµωξη και την ογκογόνο δράση του ιού (125). Από την άλλη, η έκφραση της πρωτεΐνης LMP1 του ιού συσχετίζεται µε υπερµεθυλίωση σηµαντικών γονιδίων όπως της Ε-κατχερίνης (126). Παροµοίως και σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωµα από τον ιό της ηπατίτιδας Β (HBV) ανιχνεύεται υπερµεθυλίωση των γονιδίων p16 INK4a (127,128) και GSTP1 (129). Πιθανώς αυτή η ανώµαλη µεθυλίωση να οφείλεται στην ενεργοποίηση της µεθυλοτρανσφεράσης µετά την εισαγωγή του ιικού γονιδιώµατος. Ένας ακόµα ιός που πιθανότατα χρησιµοποιεί τη µεθυλίωση προς όφελός του είναι ο ιός των ανθρωπίνων θηλωµάτων (HPV). Αν και έχει βρεθεί σε αρχικά στάδια λοίµωξης στον τράχηλο της µήτρας υπερµεθυλίωση των ογκογονιδίων του ιού, φαίνεται πως η καρκινική µεταµόρφωση σχετίζεται µε αποµεθυλίωση των γονιδίων αυτών και αδρανοποίηση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p16 του ξενιστή µέσω υπερµεθυλίωσης του προαγωγέα του (130,131). Ανάλογο φαινόµενο έχει ανιχνευθεί και στον καρκίνο του πνεύµονα (132). 2.1.δ. Μεθυλίωση του DNA και διατροφή Ελαττωµένη πρόσληψη µε την τροφή ή χαµηλά επίπεδα πλάσµατος/ ιστών πολλών θρεπτικών στοιχείων έχουν συσχετισθεί µε µεγαλύτερο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου, καθώς πολλά ιχνοστοιχεία και βιταµίνες είναι απαραίτητα σε µονοπάτια µεταβολισµού του DNA. Όσον αφορά τη µεθυλίωση του DNA, έχουν αναγνωριστεί αρκετά θρεπτικά στοιχεία που την επηρεάζουν. Ανεπάρκεια ψευδαργύρου µπορεί να µειώσει τη 39

χρησιµοποίηση µεθυλο-οµάδων από την S- αδενοσινοµεθειονίνη (SAM) µε αποτέλεσµα µειωµένη µεθυλίωση (133). Ανεπάρκεια της βιταµίνης C σχετίζεται µε υπερµεθυλίωση του DNA σε κύτταρα καρκίνου πνεύµονα (134). Ωστόσο, η πρόσληψη φολικού και µεθυλο-οµάδων αποτελεί το καλύτερο παράδειγµα για την αλληλεπίδραση διατροφής και µεθυλίωσης του DNA επειδή αυτά τα στοιχεία συµµετέχουν άµεσα στους µηχανισµούς µεθυλίωσης του DNA. To µεθυλ-τετραϋδροφολικό είναι απαραίτητο για την αναγέννηση µεθειονίνης από την οµοκυστεΐνη. Η µεθειονίνη χρειάζεται για τη σύνθεση S- αδενοσινοµεθειονίνης (SAM) που αποτελεί και το δότη µεθυλο-οµάδων για τη µεθυλίωση του DNA. Εποµένως ανεπάρκεια µεθυλ-τετραϋδροφολικού, που είναι η µόνη κυκλοφορούσα µορφή φολικού στον οργανισµό, οδηγεί σε µειωµένη σύνθεση SAM και µειωµένη προσφορά µεθυλο-οµάδων. Για το λόγο αυτό, η ανεπάρκεια του φολικού µπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή της µεθυλίωσης του DNA (135). Η αναγωγάση του µεθυλένο-τετραϋδροφολικού είναι ένα ένζυµο που καταλύει τη µη αντιστρεπτή µετατροπή του σε µεθυλ-τετραϋδροφολικό. Ο πολυµορφισµός C677T (ανευρίσκεται σε αρκετά υψηλό ποσοστό σε οµοζυγοτία, 20%) του γονιδίου του ενζύµου οδηγεί σε αντικατάσταση µιας αλανίνης από βαλίνη και µειωµένη ενεργότητα του ενζύµου (136,137), δηλαδή µειωµένη σύνθεση µεθυλτετραϋδροφολικού. Σε καταστάσεις φυσιολογικών επιπέδων φολικού στον οργανισµό, η παρουσία της οµόζυγης µετάλλαξης σχετίζεται µε ελαττωµένη µεθυλίωση του DNA και ελάττωση του κινδύνου για εµφάνιση καρκίνου (138). Η προστατευτική επίδραση αυτού του πολυµορφισµού αίρεται σε καταστάσεις µειω- µένων επιπέδων φολικού στον οργανισµό που σχετίζονται µε αυξηµένο κίνδυνο εµφάνισης καρκίνου (139,140), λόγω γενικευµένης υποµεθυλίωσης του γονιδιώ- µατος (141). 2.1.ε. Μεθυλίωση του DNA και κάπνισµα Υπερµεθυλίωση του DNA έχει συσχετισθεί µε το κάπνισµα σε ένα αριθµό νεοπλασµάτων, σε προκαρκινωµατώδεις καταστάσεις και φυσιολογικούς ιστούς (142-148). Η παρουσία µεθυλίωσης σε νεοπλάσµατα που σχετίζονται µε το κάπνισµα (όπως της στοµατικής κοιλότητας και του πνεύµονα) έχει επιβεβαιωθεί και µε µελέτες υβριδισµού µε τη χρήση αντισώµατος έναντι της 5 - µεθυλοκυτοσίνης (149,150). Η αιτιολογική συσχέτιση µεθυλίωσης και καπνίσµατος αποδείχθηκε σε πρό- 40

σφατη µελέτη στην οποία προκλήθηκε γενικευµένη µεθυλίωση µε την ενδοδερµική χορήγηση καρκινογόνων του καπνού σε πειραµατόζωα (151). 2.1.στ. Πιθανές εφαρµογές της ανίχνευσης της υπερµεθυλίωσης Ο έλεγχος της επαγωγής ή της απάλειψης της µεθυλίωσης των CpG νησίδων θα µπορούσε να είναι ένα χρήσιµο εργαλείο για τη µεταφορά και την εφαρµογή της γνώσης από το εργαστήριο στην κλινική πράξη. Ένα εµφανές πλεονέκτηµα σε σχέση µε τους γενετικούς δείκτες είναι ότι οι µεταλλάξεις µπορούν να εµφανιστούν σε πολλαπλές θέσεις και µπορεί να είναι διαφόρων τύπων. Αντίθετα, η υπερµεθυλίωση εµφανίζεται στην ίδια περιοχή για κάθε γονίδιο και για κάθε µορφή καρκίνου. Αν και είναι πεδίο αντικρουόµενων απόψεων, πιθανολογείται η ύπαρξη φαινότυπου µεθυλίωσης (methylator phenotype), δηλαδή µεθυλίωση συγκεκριµένων οµάδων γονιδίων για ορισµένα νεοπλάσµατα, σε αναλογία µε τα προφίλ έκφρασης (expression profiles) (152,153). Επιπλέον η ανίχνευση της υπερµεθυλίωσης είναι ένα "θετικό" σήµα σε ένα πλήθος φυσιολογικών κυττάρων (67). Τα πιθανά κλινικά οφέλη από τη χρήση δεικτών που βασίζονται στην υπερ- µεθυλίωση είναι τα ακόλουθα: α) Ανίχνευση καρκινικών κυττάρων χρησιµοποιώντας την υπερµεθυλίωση των CpG νησίδων ως δείκτη για τα καρκινικά κύτταρα Για το σκοπό αυτό θα πρέπει να χρησιµοποιούνται ως δείκτες µεθυλίωσης CpG νησίδες που εµφανίζονται υπερµεθυλιωµένες σε καρκίνο αλλά δεν είναι ποτέ µεθυλιωµένες σε φυσιολογικά κύτταρα. Υπερµεθυλίωση των CpG νησίδων χρησιµοποιήθηκε για την ανίχνευση καρκινικών κυττάρων σε βρογχοκυψελιδικό έκπλυµα (154), λεµφαδένες (155), πτύελα (156), ούρα (157), έκπλυµα των πόρων του µαστού (158), περιτοναϊκό υγρό (87), σίελο (159) και τελικά στον ορό (160-163) ασθενών που πάσχουν από ένα ευρύ φάσµα νεοπλασµάτων. β) Χρήση της υπερµεθυλίωσης των CpG νησίδων ως δείκτη για τη συµπεριφορά των κακοήθων νεοπλασµάτων Υπάρχουν δύο κατευθύνσεις προς τις οποίες θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί η υπερµεθυλίωση των γονιδίων: για τη διαµόρφωση προγνωστικών δεικτών, δηλαδή παραγόντων που δίνουν πληροφορίες για την επιθετικότητα ενός νεοπλάσµατος, την ικανότητα για µετάσταση ή την αγγειογενετική του δραστηριότητα (164-167) και ως δείκτες για την πρόβλεψη της απάντησης σε χηµειοθεραπευτικά φάρµακα (84,168-170). γ) Η υπερµεθυλίωση των CpG γονιδίων ως στόχος για θεραπεία 41

Εικόνα 14. οµή της 5 -αζα- 2 -δεοξυκυτιδίνης σε σύγκριση µε τη δοµή της 5 - µεθυλοκυτοσίνης Αποµεθυλιωτικοί παράγοντες όπως η 5 -αζακυτιδίνη και η 5 -αζα-2 -δεοξυκυτιδίνη (Eικόνα 14) αναστέλλουν τις DNA µεθυλοτρανσφεράσες, προκαλούν αποµεθυλίωση και µπορούν να επανενεργοποιήσουν ογκοκατασταλτικά γονίδια (171,172). Έχουν ήδη χρησιµοποιηθεί µε θεραπευτικά οφέλη σε αιµατολογικές κακοήθειες (µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα), χωρίς µεγάλη τοξικότητα (173-175), ενώ βρίσκονται σε εξέλιξη κλινικές µελέτες για τη χρήση αυτών των παραγόντων και σε άλλα κακοήθη νεοπλάσµατα. 2.2. Τροποποίηση των ιστονών Το νουκλεόσωµα ως δοµική µονάδα της χρωµατίνης δεν χρησιµεύει µόνο για το "πακετάρισµα" του DNA. Πιστεύεται πλέον πως είναι φορέας επιγενετικών πληροφοριών, δρα δηλαδή ρυθµιστικά στην έκφραση των γονιδίων. Η θέση στην οποία βρίσκονται αυτές οι πληροφορίες είναι οι ουρές των ιστονών, δηλαδή περιοχές µήκους έως 25 αµινοξέων στο αµινοτελικό άκρο του πυρήνα των ιστονών. Οι ουρές των ιστονών υποβάλλονται σε µια ποικιλία µετα-µεταφραστικών τροποποιήσεων. Οι τροποποιήσεις αυτές περιλαµβάνουν: α) Ακετυλίωση Η ακετυλίωση των ιστονών είναι απαραίτητη µετα-µεταφραστική τροποποίηση και γίνεται σε συγκεκριµένες λυσίνες στο αµινοτελικό άκρο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας της ουράς των ιστονών. Η µεταφορά της ακετυλοµάδας από το ακετυλο-coα προς τις ιστόνες καταλύεται από ένζυµα που ονοµάζονται ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών (Histone Acetyl-Transferases, HAT). Η προσθήκη ακετυλοµάδων µεταβάλει το φορτίο των ιστονών, ρυθµίζοντας τη συνάφειά τους µε το DNA. Σε κάθε ιστόνη οι λυσίνες που ακετυλιώνονται είναι συγκεκριµένες 42