Το δίπλωμα των πρωτεϊνών Ηλίας Ηλιόπουλος Εργαστήριο Γενετικής, Τμήμα Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Εισαγωγή Η πλειονότητα των πρωτεϊνών διπλώνει σε μία μοναδική τρισδιάστατη δομή βιολογικά ενεργή παρ ότι οι πρωτείνες συντίθενται στο ριβόσωμα σαν γραμμικές αλυσίδες αμινοξέων. Έτσι κάθε νεοσυντιθέμενη αλυσίδα πρέπει να βρει το μονοπάτι του διπλώματος που θα την οδηγήσει στην μοναδική ενεργή στερεοδομή. Η κατανόηση αυτής της διεργασίας απασχολεί τους επιστήμονες επί δεκαετίες. Η επίλυση αυτού του προβλήματος θα αποκαλύψει τον συνδετικό κρίκο στην ροή της πληροφορίας μεταξύ της νουκλεοτιδικής ακολουθίας και της τρισδιάστατης δομής της πρωτεΐνης. Επίσης θα έχει σημαντικές επιπτώσεις στην βελτίωση των αλγορίθμων πρόβλεψης δομής και στον λογικό σχεδιασμό ακολουθιών που δεν μπορούν να προβλεφθούν εξελικτικά.
Εισαγωγή (2) Σε αντιδιαστολή, απλοί υπολογισμοί σε μία πρωτεΐνη 100 αμινοξέων θα χρειαστούν δισεκατομμύρια χρόνια για να καταλήξουν στην ενεργή στερεοδομή εάν ερευνηθούν όλες οι δυνατές στερεοδομές. Αυτές οι παρατηρήσεις οδήγησαν στην άποψη ότι θα πρέπει να υπάρχει ένα συγκεκριμένο μονοπάτι για το δίπλωμα μιας πρωτεϊνικής αλυσίδας και είναι αναγκαίο να κατανοήσουμε πως η πρωτεΐνη βρίσκει το σωστό μονοπάτι και αποφεύγει τα άλλα. Επίσης πρέπει να κατανοήσουμε τις ενδιάμεσες καταστάσεις μερικού διπλώματος, εάν μπορούν να εντοπιστούν και μελετηθούν, επειδή αυτές μπορούν να δώσουν σημαντικές απαντήσεις για τα ενδιάμεσα στάδια προς την ενεργή κατάσταση. Έχουν προκύψει διαφορετικές μεθοδολογίες διπλώματος που συνδυάζουν πειραματικές και θεωρητικές προσεγγίσεις.
Μοντέλα μηχανισμού διπλώματος. Το μοντέλο της αύξησης του πυρήνα προτείνει ότι κατάλοιπα διαδοχικά στην ακολουθία φτιάχνουν ένα πυρήνα από όπου η φυσική στερεοδομή αναπτύσσεται διαδοχικά. Αντίθετα το σκελετικό μοντέλο προτείνει ότι τοπικά στοιχεία δευτεροταγούς δομής σχηματίζονται πρώτα και αυτά πλησιάζουν και συνδυάζονται στην φυσική στερεοδομή της πρωτεΐνης πιθανά με ένα μηχανισμό διάχυσης-σύγκρουσης. Στο μοντέλο υδρόφοβης κατάρρευσης η πρωτεΐνη κρύβει τις υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες από τον διαλύτη, φτιάχνοντας μία ενδιάμεση κατάσταση ή εύπλαστη σφαίρα (molten globule) από όπου διαμορφώνεται η φυσική κατάσταση από αυτή την περιορισμένη στερεοδομικά κατάσταση. Τέλος το παλλόμενο μοντέλο προτείνει ότι κάθε πρωτεϊνικό μόριο ακολουθεί διαφορετικό μονοπάτι διπλώματος. Τώρα είναι πλέον φανερό ότι δεν υπάρχει ένας απόλυτα καθορισμένος τρόπος διπλώματος όπως προτείνουν ορισμένα από τα αρχικά μοντέλα.
Φάσεις διπλώματος Ίσως η μεγαλύτερη ανακάλυψη στην κατανόηση του διπλώματος σήμερα είναι ότι δεν υπάρχει ένα μοναδικό μονοπάτι διπλώματος όπως υποστηρίζονταν από τα παλαιά μοντέλα. Μία πολυδιάστατη ενεργειακή επιφάνεια περιγράφει καλλίτερα την διαδικασία διπλώματος.
Ενεργειακό διάγραμμα διπλώματος Σχηματικό διάγραμμα της ενεργειακής επιφάνειας διπλώματος. Αποδομημένα μόρια βρίσκονται στο χείλος του ενεργειακού κώνου και μπορούν να διπλώσουν στην φυσική κατάσταση με πολλούς διαφορετικούς τρόπους μερικούς από τους οποίους περιέχουν ενδιάμεσες καταστάσεις (τοπικά ενεργειακά ελάχιστα) ενώ άλλοι περιέχουν μη αντιστρέψιμες καταστάσεις (καταστάσεις μη σωστού διπλώματος). Για πρωτείνες που διπλώνουν χωρίς ενδιάμεσες καταστάσεις η επιφάνεια του ενεργειακού κώνου θα είναι λεία.
Η σημασία της τοπολογίας του μορίου. Πολλά μοντέλα έχουν αναπτυχθεί πρόσφατα που κάνουν επιτυχή πρόβλεψη των ρυθμών διπλώματος και του μηχανισμού διπλώματος πρωτεϊνών. Η επιτυχία τους αποδεικνύει ότι οι αλληλεπιδράσεις εκτός της φυσικής κατάστασης είναι σχετικά μη σημαντικές στον καθορισμό του διπλώματος, τουλάχιστον για μικρές πρωτείνες που διπλώνουν σε μεταπτώσεις δύο φάσεων. Ο στόχος είναι να βελτιωθεί η ακρίβεια αυτών των μοντέλων ώστε η διεργασία διπλώματος να περιγραφεί καλλίτερα και περισσότερο πολύπλοκες πρωτείνες να προβλεφθούν. Στο μέλλον πιθανόν να υπάρχουν μοντέλα που θα προβλέπουν πρωτεϊνικές δομές από την αρχή.
Φάσεις διπλώματος Οι μικρές πρωτείνες διπλώνουν σε δύο φάσεις. (α) που ενσωματώνουν την συνδημιουργία όλων των αλληλεπιδράσεων της φυσικής κατάστασης. (β) Την κατάρρευση σε μία εύπλαστη σφαίρα και κατόπιν την αναδιάταξη των διπλωμένων περιοχών. (γ) Την δημιουργία της πρώτης διπλωμένης ενότητας και κατόπιν της υπόλοιπης δομής.
Στερεοδιάταξη και ενεργειακό μονοπάτι Στο δίπλωμα δύο φάσεων σταθερές ενδιάμεσες καταστάσεις δεν είναι προαπαιτούμενες για το δίπλωμα αλλά καταστάσεις υψηλής ενέργειας δεν μπορούν να αποκλειστούν. Ο ρόλος των ενδιάμεσων καταστάσεων στο δίπλωμα των πρωτεϊνών είναι ένα σημείο αντίρρησης. Σε μερικές περιπτώσεις εμφανίζονται σαν σημαντικές ενδιάμεσες καταστάσεις για την δημιουργία του διπλώματος ενώ σε άλλες περιπτώσεις προκύπτουν από μη εξειδικευμένες συσπειρώσεις της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Στην τελευταία περίπτωση παρ ότι δεν μας υποδεικνύουν την διαφορά μεταξύ της αποδομημένης ή δομημένης κατάστασης είναι σημαντικές για την διαμόρφωση της ενεργειακής επιφάνειας διπλώματος και πιθανόν να είναι καταστάσεις υποστρωμάτων μοριακών ακολούθων ή προαγωγοί αποδόμησης. Επίσης εξηγεί γιατί προσομοιώσεις πλέγματος μπορούν να προσφέρουν μια κατανόηση του διπλώματος παρά την απλούστευση τους και την παρατήρηση ότι η δομή του συνόλου των καταστάσεων μετάπτωσης συντηρείται σε πρωτείνες μιας δομικής οικογένειας παρ ότι μπορούν να έχουν μη ομόλογες ακολουθίες.
Η σημασία της τοπολογίας του μορίου. Πρόσφατα μεγάλο ενδιαφέρον δόθηκε στην παρατήρηση ότι οι ρυθμοί διπλώματος και οι μηχανισμοί μικρών πρωτεϊνών δεν καθορίζονται από τις λεπτομέρειες της αμινοξικής ακολουθίας αλλά από γενικότερα χαρακτηριστικά της πολυπεπτιδικής αλυσίδας την τοπολογία της. Αυτό προκύπτει από την παρατήρηση ότι ο ρυθμός διπλώματος συσχετίζεται άμεσα με μία παράμετρο τον βαθμό επαφής που αντικατοπτρίζει την απόσταση στην γραμμική ακολουθία αμινοξέων που βρίσκονται σε επαφή στην φυσική κατάσταση. Αυτή η συσχέτιση είναι βασική και σημαίνει ότι απλά μοντέλα βασισμένα στη δομή της φυσικής κατάστασης μπορούν να περιγράψουν την διεργασία διπλώματος.
Το δίπλωμα στο κύτταρο Γιατί όμως το δίπλωμα in vivo είναι τόσο δύσκολο;. Κατ αρχήν βιοσύνθεση και δίπλωμα είναι στενά συνδεδεμένα και η νεοπαραγόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα μπορεί να διπλώνει πριν να ολοκληρωθεί η βιοσύνθεση. Ο ρυθμός διπλώματος μιας τυπικής πρωτείνης ( t1/2= 1 sec ) είναι πολύ μεγαλύτερος από τον ρυθμό βιοσύνθεσης (4-20 αμινοξέα/sec). Μόλις αρκετά αμινοξέα εξέχουν από το ριβόσωμα αυτά θα διπλώσουν στο χαμηλότερο διαθέσιμο ενεργειακό ελάχιστο για αυτό το μήκος της αλυσίδας. Για κοντές ακολουθίες αυτό να σημαίνει στοιχεία δευτεροταγούς δομής αλλά για μακρύτερες η απουσία της ολοκληρωμένης ακολουθίας θα οδηγούσε σε μη κανονικές στερεοδομές. Σε μερικές περιπτώσεις ολόκληρη η δομική ενότητα διπλώνει ταυτόχρονα με την βιοσύνθεση της. Στην περίπτωση μιας πρωτείνης όμως με πολλές δομικές ενότητες η απουσία μιας γειτονικής δομικής ενότητας θα μπορούσε να προβάλει στον διαλύτη μία υδρόφοβη επιφάνεια ειδικότερα στο πολύ πυκνό περιβάλλον του πολυσώματος.
Το δίπλωμα στο κύτταρο (2)
Το δίπλωμα στο κύτταρο (3) Η μεταγραφή και η μετάφραση βασίζονται σε ενεργειακά εξαρτώμενους μηχανισμούς για την αποφυγή λαθών. Η χρήση των μοριακών ακολούθων ως μηχανισμοί διόρθωσης έχουν αναγνωριστεί πολύ πρόσφατα. Εκτός από μικρά πολυπεπτίδια οι περισσότερες πρωτείνες διπλώνουν δια μέσου συμπαγών σφαιρικών καταστάσεων γνωστές ως εύπλαστες σφαίρες (molten globules) που μπορεί να περιέχουν φυσιολογικά στοιχεία δευτεροταγούς δομής αλλά δεν έχουν την στερεοδομή που χαρακτηρίζει την φυσιολογική κατάσταση. Αυτά τα μη-φυσιολογικά πολυπεπτίδια εκθέτουν τα υδρόφοβα αμινοξικά κατάλοιπα (συνήθως στο εσωτερικό στη φυσιολογική κατάσταση) και έχουν την τάση να δημιουργούν συσσωματώματα. Αυτή η κατάσταση θα είναι πιο έντονη in vivo με τις υψηλές συγκεντρώσεις αδόμητων πολυπεπτιδίων που προκύπτουν από την μετάφραση στα ριβοσώματα και την υψηλή περιεκτικότητα μακρομορίων στο κυτόπλασμα που αυξάνει τις σταθερές σύνδεσης αδόμητων πολυπεπτιδίων σε σχέση με αυτές στο διάλυμα in vitro.
Το δίπλωμα στο κύτταρο (4) Η δυσκολία διπλώματος μέσα στο κύτταρο δεν συνδέεται μόνον με την βιοσυνθετική διεργασία. Σε συγκεντρώσεις της τάξης μεγέθους [~300 (g πρωτείνης) l-1] στο κυτταρόπλασμα η θερμοδυναμική σταθερότητα μερικώς διπλωμένων καταστάσεων αυξάνεται 10-100 φορές με αποτέλεσμα την αύξηση της πιθανότητας δημιουργίας συσσωματωμάτων κατά την διάρκεια του διπλώματος.
Οι Μοριακοί Aκόλουθοι Οι σωτήρες του σωστού διπλώματος στο κύτταρο είναι οι μοριακοί ακόλουθοι (chaperones η Heat Shock Proteins). Αυτές οι πρωτείνες βοηθούν την διαδικασία διπλώματος in vivo παίρνοντας μέρος στην βιοσυνθετική διαδικασία και δεσμεύοντας μόρια σε καταστάσεις ανώμαλου διπλώματος στο κυτταρόπλασμα μετά την μετάφραση και δίνοντας σε αυτές νέες ευκαιρίες διπλώματος. Είναι επίσης σημαντικές στην προστασία από την δημιουργία συσσωματωμάτων σε καταστάσεις ακραίων συνθηκών θερμότητας ή ψύχους και συμμετέχουν σε πολλές κυτταρικές διεργασίες όπως μετάδοση σήματος, δημιουργία στόχων και αποδόμηση πρωτεϊνών.
Η λειτουργία των μοριακών ακολούθων Οι μοριακοί ακόλουθοι εμποδίζουν την δημιουργία πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων δεσμευμένες σε έκθετα υδρόφοβα αμινοξέα μή φυσιολογικά ή τελείως μη διπλωμένων πολυπεπτιδίων. Με αυτό τον τρόπο τα πολυπεπτίδια μπορούν να συντηρηθούν σε μία κατάσταση ετοιμότητας για δίπλωμα. Αποτελεσματικό δίπλωμα τότε επιτυγχάνεται με κύκλους ελεγχόμενης πρόσδεσης και αποχωρισμού του πολυπεπτιδίου από μία άλλη μοριακή ακόλουθο. Έτσι οι μοριακοί ακόλουθοι προσφέρουν ένα ασφαλές περιβάλλον όπου η γραμμική ακολουθία αμινοξέων θα πάρει την φυσική στερεοδομή της χωρίς όμως να προσφέρουν στερικές αλληλεπιδράσεις που θα επηρεάσουν ή κατευθύνουν το δίπλωμα. Επίσης οι μοριακοί ακόλουθοι εμποδίζουν την δημιουργία συσσωματωμάτων σε περιπτώσεις αποδιάταξης πρωτεϊνών εξ αιτίας της έκθεσης των κυττάρων σε ακραίες συνθήκες, όπως υψηλή ή χαμηλή θερμοκρασία. Έχει επίσης προταθεί ότι ορισμένες μοριακοί ακόλουθοι επαναδιατάσουν λάθος διπλωμένα πολυπεπτίδια επαναφέροντας τα στο μονοπάτι που οδηγεί στην φυσιολογική στερεοδομή.
Σχηματικό διάγραμμα απ αρχής διπλώματος στο κυτταρόπλασμα ευκαρυωτικών και προκαρυωτικών κυττάρων. (a) Δίπλωμα που δεν εξαρτάται από τις hsp70 ή hsp60. (b) Δίπλωμα που υποβοηθείται από την hsp70 ή ενεργοποιείται από κάποιον άλλο παράγοντα (TF). (c) Δίπλωμα που υποβοηθείται και από την hsp70 ή TF και από την hsp60. Το διάγραμμα δίνει τα κοινά στοιχεία μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών κυττάρων για το δίπλωμα με την βοήθεια μοριακών ακολούθων παρότι σε αυτά υπάρχουν και διαφορές.
Μοριακοί ακόλουθοι Hsp70 και Hsp60 Μέχρι σήμερα έχει γίνει μια διεξοδική ανάλυση των δομικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών για τα δύο συστήματα μοριακών ακολούθων. Η hsp70 έχει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δράσεων μία εκ των οποίων είναι να προσδένεται σε κοντές υδρόφοβες ακολουθίες (περίπου επτά αμινοξέα) όπως αναδύονται από το ριβόσωμα, ενώ αγνοεί τα διπλωμένα πολυπεπτίδια. Έτσι αυτές οι πρωτείνες εμποδίζουν την συσσωμάτωση νεοσυντιθεμένων αλυσίδων κατά την διάρκεια της πρωτεϊνικής βιοσύνθεσης. Η δέσμευση και η απελευθέρωση των ξεδιπλωμένων πεπτιδίων είναι εξαρτημένη από ATP και ρυθμίζεται από διάφορες μοριακές ακολούθους συντρόφους, όπως τα μέλη της οικογένειας Hsp40 (DnaJ).
Μοριακοί ακόλουθοι Hsp60 Αντίθετα οι Ηsp60 συμμετέχουν αργότερα στο δίπλωμα, όταν η βιοσύνθεση έχει ολοκληρωθεί. Αυτές οι μοριακοί ακόλουθοι αποτελούνται από δύο υπομονάδες σχήματος δακτυλίου σχηματίζοντας μία κεντρική κοιλότητα, τον κλωβό του διπλώματος. Στην περίπτωση της Escherichia coli μοριακής ακολούθου GroEL η κεντρική κοιλότητα καλύπτεται με την πρόσδεση μιας δεύτερης μοριακής ακολούθου που λέγεται GroES
Μοριακοί ακόλουθοι Hsp60 (2) Οι μοριακοί ακόλουθοι προσφέρουν μία κεντρική κοιλότητα όπου μία πολυπεπτιδική αλυσίδα διπλώνει αποφεύγοντας την συσσωμάτωση με άλλες ξεδιπλωμένες πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Αυτός ο μηχανισμός έχει προσδιοριστεί για την GroEL, την μοριακή ακόλουθο της E. coli, και το συνένζυμο GroES. Το ξεδιπλωμένο πολυπεπτίδιο δεσμεύεται σε συμπαγή μορφή σε υδρόφοβες επιφάνειες στο εσωτερικό κυλινδρικό τοίχωμα της GroEL. Η GroES, ένας επταμερής δακτύλιος μεγέθους ~10 kda, προσδένεται με ΑΤΡ στην GroEL κλείνοντας το άνοιγμα του κυλίνδρου και δημιουργώντας ένα υδρόφιλο κλωβό όπου το ξεδιπλωμένο πολυπεπτίδιο απελευθερώνεται. Η δέσμευση του ΑΤΡ στον άλλο δακτύλιο της GroEL προκαλεί την απελευθέρωση της GroES ανοίγοντας τον κλωβό. Το διπλωμένο πολυπεπτίδιο διαφεύγει στο διάλυμα ενώ πολυπεπτίδια που δεν έχουν πλήρως διπλώσει μπορούν να επαναπροσδεθούν για άλλη μια προσπάθεια διπλώματος. Ανώμαλα διπλωμένα πολυπεπτίδια μπορούν επίσης να προσδεθούν με αποτέλεσμα την αναδίπλωση τους.
Το σύμπλοκο GroEL-GroES (a) Η μορφή του συμπλόκου GroEL GroES είναι η φυσιολογική κατάσταση. (b) Με την δέσμευση της αποδιαταγμένης πολυπεπτιδικής αλυσίδας στην GroEL το ADP και η GroES αποχωρίζονται. (c) Δεσμεύεται ΑΤΡ κάνοντας την αλληλεπίδραση GroEL και πρωτείνης ασθενέστερη και προκαλεί την δέσμευση πάλι της GroES. (d) Η υδρόλυση της ΑΤΡ προκαλεί την απελευθέρωση της πρωτείνης από την GroEL και το φυσιολογικό δίπλωμα της. (e) Η Δημιουργία της ADP κατάστασης αυξάνει την συγγένεια της GroEL για την GroES. Έτσι η πρωτείνη αν έχει διπλώσει αποχωρίζεται (Ν) ή επαναπροσδένεται για άλλο ένα κύκλο.
Ποσοστά αλληλεπιδρασης με HSP Τουλάχιστον το 50% των πρωτεϊνών αλληλεπιδρούν με μία ή περισσότερες hsp70 μοριακές ακολούθους κατά την διάρκεια της βιοσύνθεσης ένώ το 10% των νεοσυντιθεμένων πρωτεϊνών στην E. Coli και 15% των πρωτεϊνών σε ευκαρωτικά κύτταρα αλληλεπιδρούν με hsp60 μοριακές ακολούθους για το δίπλωμα. Έτσι μοριακοί ακόλουθοι είναι αναγκαίες για ένα περιορισμένο υποσύνολο πρωτεϊνών. Είναι αξιόλογο ότι συχνά αυτές οι πρωτείνες περιέχουν ενότητες με τοπολογία α/β. Μεγάλες πρωτείνες με σύνθετη τοπολογία αναμένεται να διπλώνουν αργά και να σχηματίζουν ενδιάμεσες καταστάσεις. Είναι επίσης αξιόλογο ότι η GroEL μπορεί να δεσμεύει πολλούς τύπους ενδιάμεσων καταστάσεων, από την τελείως αποδιπλωμένη αλυσίδα μέχρι αρχικές ή τελικές καταστάσεις διπλώματος ακόμη και σχεδόν φυσικές καταστάσεις. Αυτό αποδεικνύει ότι η GroEL δεσμεύει το πολυπεπτίδιο χωρίς εξειδικευμένη αλληλεπίδραση αναγνωρίζοντας εκτιθέμενες υδρόφοβες επιφάνειες τυπικές σε μη φυσιολογικές καταστάσεις.
Οι μοριακοί ακόλουθοι συνεργάζονται Οι Hsp70 και Hsp60 μοριακοί ακόλουθοι δρουν διαδοχικά στα μιτοχόνδρια όπου οι ξεδιπλωμένες πρωτείνες εισάγονται από το κυτόπλασμα. Πειράματα ανασύστασης ιn vitro με ομόλογες των μιτοχονδριακών μοριακές ακολούθους της E. coli όπως DnaK (Hsp70), DnaJ, GrpE, GroEL and GroES, ανέδειξαν την σημαντικότητα της συνεργασίας αυτής στο δίπλωμα των πρωτείνών. Το σύστημα Hsp70 διατηρεί την ικανότητα διπλώματος του πολυπεπτιδίου στο κυτοπλασματικό περιβάλλον ενώ η μοριακή ακόλουθος Hsp60 μεσολαβεί στο δίπλωμα. Εκτός από το δίπλωμα που προκύπτει μετά την μετάφραστική διαδικασία το σύστημα των μοριακών ακολούθων δρα και στην αναδίπλωση πρωτεϊνών που έχουν αποδομηθεί εξ αιτίας ακραίων συνθηκών (στρές).
Το μέγεθος των πρωτεϊνών που διπλώνουν Τα πολυπεπτίδια υποστρώματα της GroEL ποικίλλουν σε μέγεθος από 10 and 55 kda. Ο χρόνος που απαιτείται για ένα κύκλο διπλώματος από την GroEL (~15 s), είναι ίσος με τον χρόνο σύνθεσης μιας μέσης πρωτείνης της E. Coli. Ένα μεγάλο ποσοστό από τις πρωτείνες που δημιουργούνται είναι μικρότερο από 25 kda και διπλώνουν τάχιστα. Αντίθετα οι μεγαλύτερες, μεταξύ 25 και 55 kda παραμένουν συμπλοκοποιημένες με τη GroEL για περισσότερο (100-150s κατά μέσο όρο) που αντιστοιχεί σε πολλαπλούς κύκλους αναδίπλωσης από την μοριακή ακόλουθο. Το άνω όριο μεγέθους των υποστρωμάτων της GroEL (~55 kda η ~500 αμινοξικά κατάλοιπα) είναι σύμφωνο με την χωρητικότητα της κοιλότητας του συστήματος GroEL GroES.
Η πρόσβαση στις μοριακές ακολούθους Πως όμως οι πρωτείνες που απαιτούν το σύστημα GroEL για το δίπλωμα τους φτάνουν στην θέση της μοριακής ακολούθου δεδομένης της μικρής συγκέντρωσης της GroEL στο κυτόπλασμα και την υψηλή συγκέντρωση ανταγωνιστικών πολυπεπτιδίων; Οι μη φυσιολογικές καταστάσεις πολυπεπτιδίων εκθέτουν περισσότερα υδρόφοβα αμινοξικά κατάλοιπα στο διαλύτη και έτσι έχουν μεγαλύτερη συγγένεια για την GroEL. Επιπλέον οι Hsp70 δρουν ως μεσολαβητές επιτρέποντας την μετα-μεταφραστική μεταφορά στην GroEL.
Συνμεταφραστικό δίπλωμα Σε πρωτείνες με πολλές δομικές ενότητες αυτές συνήθως συνδέονται με εύκαμπτες ολιγοπεπτιδικές συνδέσεις. Τέτοιες πρωτείνες μπορούν να διπλώνουν συνμεταφραστικά όπως οι δομικές τους ενότητες αναδύονται από το ριβόσωμα. Από τη μηχανιστική άποψη το δίπλωμα ενός σύνθετου πολυπεπτιδίου ανάγεται στο δίπλωμα των ανεξαρτήτων υπομονάδων ή δομικών ενοτήτων που μπορούν και να διπλώσουν χωρίς βοήθεια. Έτσι το συνμεταφραστικό δίπλωμα να εξηγεί το γιατί η πλειονότητα των ευκαρυωτικών κυτοπλασματικών πρωτεϊνών να μπορεί να διπλώνει χωρίς την παρουσία μοριακών ακολούθων.
Συνμεταφραστικό δίπλωμα (2) Είναι δυνατόν η σύνδεση και η αποδέσμευση ΑΤΡ και Hsp70 που ρυθμίζεται από τις ομόλογες των Hsp40 να είναι αρκετή μεσολάβηση για το συνμεταφραστικό δίπλωμα πολλών πρωτεϊνών με πολλές ενότητες, με την προστασία που προσφέρουν σε μερικά διπλωμένες δομικές ενότητες. Επειδή το συνμεταφραστικό δίπλωμα σημαίνει την δημιουργία στερεοδομής πολύ κοντά ή ακριβώς στην φυσιολογική, απαιτείται η πλήρης σύνθεση του πολυπεπτιδίου ή επιπλέον αρκετού αριθμού καταλοίπων μετά το καρβοξυλοτελικό άκρο μιάς δομικής ενότητας για την αποφυγή τοπολογικών παρεμποδίσεων από το ριβόσωμα. Έτσι για πρωτείνες με μία δομική ενότητα το δίπλωμα είναι μετα-μεταφραστική διαδικασία γιατί η πλήρης σύνθεση του πολυπεπτιδίου είναι απαραίτητη για το δίπλωμα.
Συνμεταφραστικό δίπλωμα (3) Το δίπλωμα των πρωτεϊνών στο ευκαρυωτικό κυτόπλασμα. Αναπαριστώνται τα μονοπάτια διπλώματος με και χωρίς την παρέμβαση των συστημάτων των μοριακών ακολούθων. (a) Συνμεταφραστικά και ανεξάρτητα από το σύστημα των μοριακών ακολούθων. (b) Μεταμεταφραστικά με την παρέμβαση των μοριακών ακολούθων σε ανεξάρτητες δομικές ενότητες. Η TRiC (CCT) μπορεί να δρα και συνμεταφραστικά σε πολυπεπτίδια που έχουν ένα μήκος αλυσίδας 150 αμινοξέων.
Συνμεταφραστικό δίπλωμα (4) Η κατάσταση θα είναι διαφορετική για πρωτείνες πολλών δομικών ενοτήτων που όμως συντίθενται από διακριτές πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Εδώ μια συνεχής πολυπεπτιδική αλυσίδα συνθέτει ένα τμήμα της δομικής ενότητας αφήνει κάποιο κομμάτι χωρίς δομή συνεχίζει να συνθέσει μια άλλη δομική ενότητα και μετά επιστρέφει στο να ολοκληρώσει το προηγούμενο δίπλωμα. Μία τέτοια πρωτείνη δεν θα ήταν δυνατόν να ολοκληρώσει το δίπλωμα της συνμεταφραστικά ή τουλάχιστον χωρίς να έχει ολοκληρωθεί το μεγαλύτερο μέρος της σύνθεσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Θα μπορούσε εν τούτοις να καταρρέει σε μη φυσιολογικές δομικές ενότητες. Τέτοιες δομικές ενότητες προβάλουν υδρόφοβες επιφάνειες που αναγνωρίζονται απο την TRiC. Αντίστοιχα αυτό μπορεί να συμβεί και σε πρωτείνες που έχουν διαδοχικές ενότητες που όμως αλληλοσταθεροποιούνται με υδρόφοβες επιφάνειες διεπαφής όπως η ακτίνη.
Ανώμαλο δίπλωμα Ασθένειες Πολλές δεκαετίες πίσω οι επιστήμονες παρατήρησαν ότι οι πρωτεΐνες σε διάλυμα έχουν την τάση να δημιουργούν αδιάλυτα συσσωματώματα. Τα τελευταία όμως χρόνια οι ερευνητές μελετώντας το δίπλωμα των πρωτεϊνών παρατήρησαν ότι τα συσσωματώματα αυτά είναι πανομοιότυπα με τα αμυλοειδή κατάλοιπα, παθολογικά χαρακτηριστικά μερικών δεκάδων σοβαρών ασθενειών με περισσότερο γνωστή την ασθένεια του Altzheimer και πιο πρόσφατα την BSE ή ασθένεια των τρελών αγελάδων. Και στις δύο περιπτώσεις ή μερικά διπλωμένη πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με άλλες και συγκροτεί μη διαλυτά ινίδια Στο εργαστήριο αυτά είναι απλά μια ενόχληση αλλά σε ζωντανούς ιστούς η συγκέντρωση τους μπορεί να αποδειχθεί θανατηφόρα. Τα συσσωματώματα αυτά είναι η απαρχή της κατανόησης και πρόληψης αυτών των ασθενειών. Ινίδια β-αμυλοειδούς από ασθενή με Altzheimer
Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι το χυμοτρυψινογόνο ( ο πρόδρομος του ενζύμου χυμοτρυψίνη). Αυτό όταν αποδομηθεί τεχνητά συχνά σχηματίζει συσσωματώματα. Μελέτες αποδεικνύουν ότι ενώ αρχίζει να διπλώνει κανονικά οι μερικά διπλωμένες ενδιάμεσες καταστάσεις κολλούν μεταξύ τους και σταματούν το δίπλωμα. Με ελάττωση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης (δηλαδή μειώνοντας της πιθανότητα οι πρωτεΐνες να έρθουν σε επαφή) το ποσοστό φυσιολογικά αναδιπλωμένης πρωτεΐνης αυξάνει. Έτσι αποκαλύπτεται ότι η εξειδίκευση των συσσωματωμάτων εξαρτάται από αλληλεπιδράσεις μεταξύ ορισμένων αμινοξέων στα πρωτεϊνικά μόρια.
Σχηματική αναπαράσταση των δυνατών μηχανισμών δημιουργίας αμυλοειδών ινιδίων. Μετά την σύνθεση στο ριβόσωμα, η πρωτεΐνη διπλώνει στο ενδοπλασματικού δίκτυο (ER) με την βοήθεια μοριακών ακολούθων που εμποδίζουν την δημιουργία συσσωματωμάτων από μερικά αναδιπλωμένες πρωτείνες. Η σωστά διπλωμένη πρωτείνη εκρίνεται από το κύτταρο και λειτουργεί κανονικά στο εξωκυττάριο περιβάλλον. Κάτω από ορισμένες συνθήκες η πρωτεΐνη αποδιατάσσεται, τουλάχιστον μερικά, και μπορεί να δημιουργήσει συσσωματώματα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την δημιουργία ινιδίων ή άλλων συσσωματωμάτων (πλάκες, σφαιρίδια) στους ιστούς. Είναι πιθανόν η συγκέντρωση αυτών να προκαλεί τις παθολογικές καταστάσεις. Ν,Ι,U, αναφέρονται στην φυσιολογική, ενδιάμεση και αποδιπλωμένη κατάσταση της πρωτεΐνης. QC αναφέρεται στο μηχανισμό ελέγχου ποιότητας που γίνεται σε πρωτεΐνες που δεν έχουν διπλώσει φυσιολογικά στο ενδοπλασματικό δίκτυο.
Συχνά η παρουσία μοριακών ακολούθων βοηθά την αναδίπλωση όπως αναφέρθηκε στο προηγούμενο κεφάλαιο. Τι συμβαίνει όμως όταν οι μοριακοί ακόλουθοι δεν μπορούν να βοηθήσουν στο δίπλωμα των πρωτεϊνών στο κύτταρο είτε κάτω από ακραίες συνθήκες ή σε περιπτώσεις μεταλλαγμένων πρωτεϊνών με αστάθεια ή ανώμαλο δίπλωμα; Τέτοιες καταστάσεις οδηγούν σε θανατηφόρες ανωμαλίες ή ασθένειες. Για παράδειγμα μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη p53 είναι υπεύθυνες για το 50% των καρκίνων. Οι περισσότερες από αυτές τις μεταλλάξεις δημιουργούν αστάθεια στην πρωτεΐνη. Ένα δεύτερο παράδειγμα είναι η μετάλλαξη DF508 σε μία σημαντική πρωτεΐνη κανάλι ιόντων χλωρίου που προκαλεί την κυστική ίνωση εξ αιτίας του ανώμαλου διπλώματος του καναλιού. Ένα τρίτο είναι οι αμυλοειδείς ασθένειες, μια οικογένεια 20 γνωστών ανθρώπινων ανωμαλιών όπως η Alzheimer και η Creutzfeldt-Jakob (prions). Σε αυτές τις περιπτώσεις μη σωστό δίπλωμα ή ανώμαλη επεξεργασία φυσιολογικά διαλυτών πρωτεϊνών οδηγεί στην δημιουργία συσσωματωμάτων και αδιάλυτων πλακών.
Σε μερικές περιπτώσεις συμμετέχει η φυσιολογική πρωτεΐνη ενώ σε άλλες πρωτεΐνες με σημειακές μεταλλάξεις. Και στις δύο περιπτώσεις το πρώτο κρίσιμο βήμα προς την ασθένεια πιστεύεται ότι προκαλείται από την μερική αποδιάταξη της φυσιολογικής πρωτεΐνης.
Επίσης έχουν εντοπιστεί μεταλλάξεις που επηρεάζουν το δίπλωμα ανάλογα με την θερμοκρασία. Στην περίπτωση μιας πρωτεΐνης από το περίβλημα ιού η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη (με μία μόνο αμινοξική υποκατάσταση) σε χαμηλή θερμοκρασία διπλώνει κανονικά ενώ σε υψηλή η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ξεδιπλώνει αντίθετα με την φυσιολογική. Σε άλλη περίπτωση η τεχνητή αντικατάσταση ενός αμινοξέος στην βοδινή αυξητική ορμόνη σταματά την δημιουργία συσσωματωμάτων χωρίς να επηρεάζει το δίπλωμα της.
Στην περίπτωση της σπογγώδους εγκεφαλοπάθειας η prion πολυμερισμένη πρωτεΐνη έχει κυρίως β-πτυχωτές επιφάνειες που μπορουν να επάγουν στην στερεοδομή και στην φυσιολογική πρωτείνη. Στην περίπτωση της Alzheimer η στερεοδιατακτική αλλαγή της αμινοτελικής περιοχής από α-έλικα σε β-πτυχωτή επιφάνεια είναι η δημιουργία των αμυλοειδών. Η δομή των πρωτεϊνών prions. Α,Β. Η δομή της rprp(90-231) από ινδικό χοιρίδιο. Και Γ η δομή της μεταλλαγμένης ανθρώπινης πρωτείνης PrPSc.
Σε μερικές περιπτώσεις δημιουργίας συσσωματωμάτων εμπλέκεται η κανονική πρωτεΐνη ενώ σε άλλες σημειακές μεταλλάξεις είναι η αιτία. Μέχρι σήμερα ελάχιστη είναι η πρόοδος στη θεραπεία τέτοιων ασθενειών. Η μεθοδολογία που αναφέρθηκε για την μελέτη του διπλώματος των πρωτεϊνών και η μεγαλύτερη κατανόηση των μηχανισμών πρωτεϊνικού διπλώματος στο μοριακό επίπεδο εφαρμόζονται ήδη και στην μελέτη αυτών των ασθενειών.
Ένα παράδειγμα είναι ο σχεδιασμός αναλόγων υποστρώματος της πρωτεΐνης τρανσθυρετίνης που δεσμεύονται από αυτή και σταθεροποιούν το τετραμερές της ανθρώπινης πρωτεΐνης αναστέλλοντας την αμυλοείδωση αυτής της πρωτείνης. Επίσης η αναγνώριση πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην ανάπτυξη της ασθένειας Alzheimer και του μηχανισμού δημιουργίας συσσωματωμάτων των δημιουργούμενων πεπτιδίων A βοηθά στην κατασκευή μικρών φαρμακευτικών ουσιών αναστολέων κατά αυτής της σημαντικής ανθρώπινης ασθένειας.
Εκτός από τις μοριακές ακολούθους υπάρχουν τουλάχιστον άλλα δύο ένζυμα που καταλύουν το δίπλωμα των πρωτεϊνών στο κύτταρο. Η ΡΡΙ καταλύει τον cis/trans ισομερισμό της προλίνης και η PDI την δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών. Επειδή το δίπλωμα των πρωτεϊνών είναι τόσο πολύπλοκο οι πιθανότητες ατελειών στο δίπλωμα είναι σημαντικές. Πιθανή θερμοδυναμική αστάθεια της φυσικής πρωτεΐνης ή των ενδιαμέσων καταστάσεων του διπλώματος, τροποποίηση στη κινητική του διπλώματος, δημιουργία μη αντιστρεπτών τοξικών στερεοδιατάξεων μπορούν να αφαιρέσουν από την πρωτεΐνη την λειτουργικότητα της οδηγόντας σε παθολογικές καταστάσεις. Δεν είναι μόνον η λανθασμένη στερεοδιάταξη που προκαλεί τις ανωμαλίες. Και η υπερβολικά σταθερή στερεοδιάταξη, όπως στην περίπτωση των prions, μπορεί να είναι τοξική για τα κύτταρα.