Εργαστηριακή άσκηση Β1 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΤΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ, ΜΟΡΦΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥΣ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΚΑΤΑ BRADFORD Το κομμάτι που αφορά την παρασκευή πρωτεϊνών του γάλακτος είναι ευγενική προσφορά της κ. Ελενας Κουϊμτζόγλου από το Βιολογικό Τμήμα. ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός αυτού του πειράματος είναι η εξοικείωση με την απομόνωση πρωτεϊνών από μια βιολογική πηγή (γάλα), την μορφοποίησή και παρασκευή υλικού από αυτές, και την ανίχνευσή τους με μία μέθοδο ανίχνευσης πρωτεϊνών (Bradford). Συνιστάται πριν από την προσέλευση στο εργαστήριο, να γίνει επανάληψη του κεφαλαίου 2 (Δομή και λειτουργία πρωτεϊνών) από το βιβλίο «Βιοχημεία» του Stryer. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΓΑΛΑ Το γάλα είναι ένα σύνθετο βιολογικό μίγμα χημικών ουσιών, που αποτελεί την κύρια πηγή τροφής για τα νεαρής ηλικίας θηλαστικά. Το γάλα περιέχει τα περισσότερα είδη βιολογικών μορίων, που είναι απαραίτητα για τη διατήρηση της ζωής, όπως νερό, μια σειρά βιταμινών (κυρίως θειαμίνη, ριβοφλαβίνη, παντοθενικό οξύ και βιταμίνες Α, Β 12, D και Κ), μεταλλικά στοιχεία (ασβέστιο, νάτριο, φωσφόρο, κάλιο και ίχνη άλλων μετάλλων), πρωτεΐνες (που περιλαμβάνουν όλα τα βασικά αμινοξέα), υδατάνθρακες (κυρίως λακτόζη) και λίπη. Παρόλο που τα περισσότερα θηλαστικά σταματούν να πίνουν γάλα όταν αρχίζουν να μεγαλώνουν, οι περισσότεροι άνθρωποι συνεχίζουν να πίνουν γάλα και να καταναλώνουν γαλακτοκομικά προϊόντα, όπως τυρί, βούτυρο, κρέμα κ.α. σε όλη τη διάρκεια της ζωής τους. Πρωτεΐνες : Υπάρχουν τρεις βασικές πρωτεΐνες στο γάλα: η καζεΐνη, η λακταλβουμίνη και η λακτοσφαιρίνη (lactoglobulin). Στο εργαστήριο αυτό θα απομονωθεί η καζεΐνη και το μίγμα λακταλβουμίνης και λακτοσφαιρίνης (είναι δύσκολο να διαχωριστούν οι δύο αυτές πρωτεΐνες, η μία από την άλλη). Η καζεΐνη μπορεί εύκολα να απομονωθεί. Μπορεί να ιζηματοποιηθεί όταν καταστραφεί η κανονική δομή της με οξίνιση. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται αποδιάταξη πρωτεΐνης. Πολλά είδη τυριών παρασκευάζονται από την ιζηματοποίηση της καζεΐνης και την απομάκρυνσή της από το υγρό γάλα. Η καζεΐνη είναι μια φωσφοπρωτεΐνη, που έχει φωσφορικές ομάδες που συνδέονται με τις υδροξυλομάδες πλευρικών αλυσίδων κάποιων αμινοξέων. Η καζεΐνη υπάρχει στο γάλα με τη μορφή άλατος ασβεστίου, το καζεϊνικό ασβέστιο. Στην πραγματικότητα είναι ένα μίγμα τριών παρόμοιων πρωτεϊνών, της α- καζεΐνης, β-καζεΐνης και κ-καζεΐνης, που σχηματίζουν ένα μικύλλιο. 1
Καζεΐνη Μ.Β. Φωσφορικές ομάδες/μόριο α 27300 ~ 9 β 24100 ~ 4-5 κ 8000 ~ 1,5 Η α-καζεΐνη και η β-καζεΐνη είναι αδιάλυτες στο νερό και διαλυτοποιούνται με το μικύλλιο που τις περιβάλλει. Η κ-καζεΐνη, που έχει ένα υδρόφιλο τμήμα, είναι υπεύθυνη για τη διαλυτοποίηση των άλλων δύο πρωτεΐνών, προωθώντας το σχηματισμό και τη σταθεροποίηση των μικυλλίων. Το καζεΐνικό ασβέστιο έχει ισοηλεκτρικό σημείο 4,6. Αυτό σημαίνει ότι είναι αδιάλυτο σε διαλύματα με ph 4,6. Το ph του γάλακτος είναι 6,6, οπότε η καζεΐνη έχει αρνητικό φορτίο στο ph αυτό και διαλυτοποιείται σαν αλάτι. Έτσι, αν προστεθεί οξύ στο γάλα, τα αρνητικά φορτία της εξωτερικής επιφάνειας των μικυλλίων της καζεΐνης εξουδετερώνονται με την πρωτονίωση των φωσφορικών ομάδων. Τα μικύλλια αποσταθεροποιούνται ή συσσωματώνονται και η καζεΐνη (με ουδέτερο φορτίο) καθιζάνει, διότι δεν είναι πλέον πολικό μόριο και τα ιόντα ασβεστίου μένουν στο διάλυμα: Ca 2+ Casinate + 2HCl Casein + CaCl 2 Όταν το γάλα ξινίζει, παράγεται γαλακτικό οξύ μέσω βακτηριακής δράσης και η ελάττωση του ph προκαλεί την αντίδραση πήξης του γάλακτος. Η λακταλβουμίνη μπορεί, επίσης, να απομονωθεί εύκολα. Οι αλβουμίνες είναι σφαιρικές πρωτεΐνες διαλυτές στο νερό και σε αραιά διαλύματα άλατος. Αποδιατάσσονται και πήζουν με τη θερμοκρασία. Όταν η καζεΐνη απομακρυνθεί από το γάλα και το διάλυμα γίνει όξινο, η λακταλβουμίνη μπορεί να απομονωθεί, καθώς καθιζάνει με την αύξηση της θερμοκρασίας. Το Μ.Β. μιας τυπικής αλβουμίνης είναι περίπου 41000. H λακτοσφαιρίνη βρίσκεται σε μικρότερο ποσοστό στο γάλα από την αλβουμίνη. Αποδιατάσσεται και καθιζάνει στις ίδιες συνθήκες με την λακταλβουμίνη. Στη λακτοσφαιρίνη οφείλονται οι ανοσολογικές ιδιότητες του γάλακτος, προστατεύοντας τα νεαρά θηλαστικά μέχρι την ανάπτυξη του ανοσοποιητικού τους συστήματος. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Σκεύη Όργανα -Μαγνητικός αναδευτήρας -Ποτήρια ζέσεως των 80ml -Θερμόμετρο ή θερμοστάτης -Ζυγός ακριβείας -Σπάτουλα -Διηθητικό χαρτί -Γυάλινη πιπέτα Pasteur 2
2. Αντιδραστήρια -Αποβουτυρωμένο γάλα -Οξικό οξύ (CH 3 COOH) 10% -Ανθρακικό Ασβέστιο (CaCO 3) Απομόνωση πρωτεϊνών του γάλακτος Απομόνωση καζεΐνης 1. Βάλτε περίπου 4g σκόνης αποβουτυρωμένου γάλακτος και 42ml Η 2 Ο σε ποτήρι βρασμού και σημειώστε τη μάζα. Θερμάνετε το γάλα στους 40 C. 2. Όταν το γάλα φτάσει στην επιθυμητή θερμοκρασία, αρχίστε να προσθέτετε διάλυμα οξικού οξέος 10%, ανά 5 σταγόνες. Μετά από κάθε 5 σταγόνες, ανακατεύετε το διάλυμα με μια ράβδο. Θα δείτε ένα λευκό στερεό σχηματισμό. Αυτή είναι η καζεΐνη. Τραβήξτε την καζεΐνη προς τα τοιχώματα του ποτηριού πάνω από το διάλυμα, πιέζοντας την πρωτεΐνη ώστε να φύγει το υγρό. Μεταφέρετε την πρωτεϊνη σε αλουμινόχαρτο. Αν βλέπετε ότι υπάρχει υγρό πάνω στο αλουμινόχαρτο, μαζέψτε το με μια πιπέτα Pasteur και βάλτε το ξανά στο ποτήρι βρασμού. ph. 3. Προσθέστε 0,2g CaCO 3 στο ποτήρι με το γάλα, ώστε να εξουδετερωθεί το όξινο 4. Μεταφέρετε την πρωτεΐνη σε μια γάζα (ή σουρωτήρι) και στραγγίξετε πάνω από το ποτήρι για να φύγει όσο το δυνατόν περισσότερο υγρό. 5. Επαναφέρετε την πρωτεΐνη σε αλουμινόχαρτο και ζυγίστε την. Καταγράψτε τη μάζα καζεΐνης στο Φύλλο Αναφοράς. 6. Στεγνώνετε καλά την μάζα της καζεΐνης πιέζοντάς την ανάμεσα σε φύλλα απορροφητικού χαρτιού. Κατόπιν ρίχνετε 2-3 σταγόνες χρώματος ζαχαροπλαστικής και μαλάζετε την μάζα με τα χέρια σας μέχρι να ομογενοποιηθεί και να γίνει σαν ζύμη. Την πατάτε με την παλάμη σας και της δίνετε σχήμα με φόρμες για κουλουράκια (κουπ-πατ). Κατόπιν την αφήνετε να στεγνώσει στον αέρα. Σε περίπου 48 ώρες θα έχει σκληρύνει. Το κομμάτι αυτό του πειράματος έχει σκοπό να σας δείξει ότι η καζεΐνη μπορεί να μορφοποιηθεί, που είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των υλικών. Κανονικά για να μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν υλικό (γαλάλιθος, galalith or milk stone) χρειάζεται και εμβάπτιση σε διάλυμα φορμαλδεΰδης 5 % (βλ. casein: the Plastics Historical Society, http://plastiquarian.com/?page_id=14228). Απομόνωση λακταλβουμίνηςκαι λακτοσφαιρίνης 1. Θερμάνετε το μίγμα του ποτηριού από την πρηγούμενη διαδιακασία, στους 75 C για 5 λεπτά. Η λακταλβουμίνη (και όση λακτοσφαιρίνη υπάρχει) θα πέσουν σαν ίζημα. 2. Χρησιμοποιώντας διηθητικό χαρτί, διαχωρείστε το στερεό ίζημα από το ζεστό διάλυμα. 3. Μεταφέρετε την πρωτεΐνη σε αλουμινόχαρτο, ζυγίστε και καταγράψτε τη μάζα στο Φύλλο Αναφοράς. 3
ΦΥΛΛΟ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΓΑΛΑ Α. Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών 1. Ακριβής μάζα αποβουτυρωμένου γάλακτος:... 2. Μάζα απομονωμένης καζεΐνης... 3. Μάζα λακταλβουμίνης... 4. Συνολική μάζα Πρωτεϊνών (καζεΐνης και λακταλβουμίνης)... 5. Ποσοστό ολικών πρωτεϊνών στο δείγμα... [(μάζα ολικών πρωτεϊνών) / (μάζα γάλακτος +μάζα νερού) ] x 100 6. Ποσοστό καζεΐνης στο δείγμα... 7. Ποσοστό λακταλβουμίνης στο δείγμα... ΜΕΘΟΔΟΣ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΚΑΤΑ BRADFORD ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Έχουν αναπτυχθεί πολλές μέθοδοι μέτρησης των πρωτεϊνών, όπως για παράδειγμα ο φαρματομετρικός προσδιορισμός πρωτεΐνης με μέτρηση απορρόφησης στα 280nm, η μέθοδος της διουρίας (Biuret) ή και η μέθοδος Lowry. Eμείς θα εστιάσουμε τη προσοχή μας σε μια που έχει καταστεί πολύ δημοφιλής εξ αιτίας της απλότητάς της. Η μέθοδος ονομάζεται Μέθοδος Bradford, από τον επιστήμονα που την επινόησε και βασίζεται στην ιδιότητα της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 να αλλάζει χρώμα όταν αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες σε όξινο περιβάλλον. Η ελεύθερη χρωστική έχει χρώμα καστανό και απορροφά στα 465nm, ενώ το σύμπλοκο πρωτεΐνη χρωστική είναι γαλάζιο και απορροφά στα 595nm. Στην δεδομένη άσκηση θα χρησιμοποιηθεί η πρωτεΐνη αλβουμίνη. Η αλβουμίνη μπορεί να αντιδράσει με την χρωστική ουσία κυανούν του Coomassie (Coomassie Brilliant Blue). Η χρωστική αυτή περιέχει σουλφοομάδα που στην ανιοντική μορφή δεσμεύει τα αμινοξέα αργινίνη, θρυπτοφάνη, τυροσίνη, ιστιδίνη και φαινυλαλανίνη. Κυρίως όμως δεσμεύει αργινίνη οκτώ φορές περισσότερο από τα άλλα αμινοξέα. Έτσι, μια πρωτεΐνη που είναι πλούσια σε αργινίνη θα δεσμευθεί από την χρωστική στην ανιοντική μορφή. Σε αυτή την μορφή η χρωστική έχει χρώμα μπλε και απορροφά στα 595 nm. Όταν η χρωστική βρίσκεται σε ελεύθερη μορφή έχει καφεκόκκινο χρώμα και απορροφά στα 470 nm. Ουσιαστικά όλες οι υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες αντιδρούν με τη χρωστική κυανούν του Coomassie και σχηματίζουν ένα γαλάζιο σύμπλοκο. Απλά, η αντίδραση εξαρτάται και από τη περιεκτικότητα της κάθε πρωτεΐνης σε αργινίνη και άλλα αμινοξέα που αντιδρούν με τη χρωστική, καθώς και από την υδροφοβικότητά της. Οπότε, σε μείγμα πολλών πρωτεϊνών, η 4
πρότυπη πρωτεΐνη πρέπει να έχει ιδιότητες αντίδρασης με την χρωστική παρόμοιες με αυτές του συνόλου των άγνωστων πρωτεϊνών στο μείγμα. H μέθοδος αυτή έχει τα εξής πλεονεκτήματα: Είναι απλή γιατί η μέτρηση γίνεται ύστερα από ανάμειξη του διαλύματος της πρωτεΐνης με ένα μόνο διάλυμα χρωστικής. Είναι πολύ γρήγορη Είναι πολύ ευαίσθητη γιατί επιτρέπει τον προσδιορισμό μέχρι και 5 μg πρωτεΐνης και Οι παράγοντες που την παρεμποδίζουν είναι πολύ λιγότεροι. Τα δείγματα πρέπει να ανακινούνται και ύστερα από μερικά λεπτά μετριέται η απορρόφηση στα 595 nm. Τα δείγματα δεν πρέπει να μείνουν περισσότερο από 1 ώρα. Από την πρότυπη καμπύλη υπολογίζονται τα mg πρωτεΐνης του κάθε διαλύματος Η Μέθοδος στη δεδομένη περίπτωση είναι αξιόπιστη για πρωτεϊνικά δείγματα των οποίων η συγκέντρωση κυμαίνεται από 0.1 1.4mg/ml 5
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Σκοπός : Προσδιορισμός την άγνωστης συγκέντρωσης της αλβουμίνης βόειου ορού (BSA, Bovine Serum Albumin) φασματοφωτομετρικά με την δοκιμή Bradford. 2. Αρxή της μεθόδου : Αντίδραση πρότυπων διαλυμάτων της πρωτεΐνης με το αντιδραστήριο Bradford. Μετριέται η απορροφητικότητα του συμπλόκου των διάφορων παρασκευασμάτων στα 595 nm. Από την απορροφητικότητα των γνωστών διαλυμάτων κατασκευάζεται η πρότυπη καμπύλη. Από την πρότυπη καμπύλη προσδιορίζεται η συγκέντρωση των άγνωστων διαλυμάτων. Οι φοιτητές θα ετοιμάσουν τα πρότυπα διαλύματα BSA στα οποία θα προστεθεί το αντιδραστήριο Bradford, θα μετρήσουν την απορροφητικότητα στα 595 nm, θα κατασκευάσουν την πρότυπη καμπύλη (ή καμπύλη αναφοράς) και θα προσδιορίσουν τη συγκέντρωση των άγνωστων δειγμάτων. 3. Σκεύη Όργανα - Φασματοφωτόμετρο - Κυψελίδες πλαστικές - eppendorf των 2ml - πιπέτες των 20-200μλ και 200-1000μλ 4. Αντιδραστήρια - Αλβουμίνη (BSA) - Αντιδραστήριο Bradford (Εύρος ανίχνευσης συγκέντρωσης της πρωτεΐνης από το αντιδραστήριο Bradford (0.1 1.4mg/ml) 5. Πορεία εργασίας α) Παρασκευή διαλύματος BSA 2 mg/ml, να παρασκευαστούν 10 ml. (δίνεται έτοιμο) β) Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων BSA 0.25, 0.5, 1, 1.4 mg/ml σε τελικό όγκο 1ml με διαδοχικές αραιώσεις από διάλυμα αρχικής συγκέντρωσης 2 mg/ml. γ) Παρασκευή τυφλού διαλύματος (1 ml απιονισμένου νερού) δ) Προσθέτουμε 967,7 μλ του αντιδραστηρίου Bradford σε κάθε μια πλαστική κυψελίδα. ε) Ανάμειξη σε κάθε μια από τις κυψελίδες με 32,2 μλ από το αντίστοιχο διάλυμα γνωστής συγκέντρωσης BSA χρήση parafilm για καλύτερη ανάδευση. στ) Τα αφήνουμε σε ηρεμία για 10 λεπτά ζ) Μετράμε την απορρόφηση του τυφλού διαλύματος στα 595 nm, την καταγράφουμε και μηδενίζουμε η) Μετράμε την απορρόφηση των γνωστών διαλυμάτων στα 595 nm θ) Μετράμε την απορρόφηση των αγνώστων διαλυμάτων στα 595 nm ι) Κατασκευή πίνακα και καμπύλης αναφοράς (απορροφητικότητα συναρτήσει της συγκέντρωσης) 6
κ) Υπολογισμός της άγνωστης συγκέντρωσης σε mg/ml και κατασκευή νέου διαγράμματος όπου εμπεριέχονται οι νέες συγκεντρώσεις. λ) Παρατήρηση και καταγραφή των χρωμάτων στις κυψελίδες μετά από την παραμονή των 10 λεπτών. 6. Βιβλιογραφία: Thermo Scientific, http://www.qcbio.com/pierce/23236.htm Γεωργάτσος Ι., Κυριακίδης Δ., Γιουψάνης Τ., Χολή-Παπαδοπούλου Θ., Γιαννακούρος Θ., Νικολακάκη Ε., Πανταζάκη Α., Κοτίνης Κ., Καράγιωργας Α., Ασβεστά Α., Εργαστηριακές ασκήσεις Βιοχημείας, εκδόσεις Ζήτη, Θεσσαλονίκη. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976, 72:248-254. The Plastics Historical Society, http://plastiquarian.com/?page_id=14228 7