Αποµόνωση DNA από φυτικούς οργανισµούς! Εργαστήριο Φυσικών Επιστημών 8 ου ΓΕΛ Πάτρας, Δεκέμβριος 2016 Καρβουντζή Ηλιάνα & Κούκη Μαριάνθη

Αποµόνωση DNA από φυτικούς οργανισµούς! Εργαστήριο Φυσικών Επιστημών 8 ου ΓΕΛ Πάτρας, Δεκέμβριος 2016 Καρβουντζή Ηλιάνα & Κούκη Μαριάνθη

Αποµόνωση DNA από φυτικούς οργανισµούς! Εργαστηριακή άσκηση για τους μαθητές της θετικής κατεύθυνσης (Γ Λυκείου) Παράγοντες που αποθαρρύνουν τον εκπαιδευτικό που θα θελήσει να υλοποιήσει το εργαστήριο: 1.Πολυπληθής και ανομοιογενής ως προς το γνωστικό υπόβαθρο μαθητική ομάδα. 2.Το εργαστηριακό πρωτόκολλο έχει αρκετά στάδια και απαιτείται καλός συντονισμός της ομάδας. 3. Συχνά λόγω του νωπού φυτικού ιστού χρειάζονται τροποποιήσεις στη διαδικασία, για να διασφαλιστεί το αποτέλεσμα της συλλογής του τελικού υλικού. 4. Το τελικό υλικό δεν ταυτοποιείται ποιοτικά ως νουκλεικα οξέα.

Αποµόνωση DNA από φυτικούς οργανισµούς! Προτείνουμε: 1.Πολυπληθής και ανομοιογενής ως προς το γνωστικό υπόβαθρο μαθητική ομάδα. Το ιδανικό είναι οι μαθητές να μοιραστούν σε τέσσερις ομάδες των 5-7 ατόμων και να υπάρχει ταυτόχρονη παρουσία 2 εκπαιδευτικών. Κάθε ομάδα να δοκιμάσει διαφορετικό φυτικό ιστό για να υπάρχει μεγαλύτερο ενδιαφέρον. Προτείνουμε την μπανάνα, τη φράουλα (ακόμα και κατεψυγμένη), το ακτινίδιο και το λωτό. Ομογενοποιούνται εύκολα και δίνουν τελικό προϊον.

Αποµόνωση DNA από φυτικούς οργανισµούς! Προτείνουμε: 2. Το εργαστηριακό πρωτόκολλο έχει αρκετά στάδια και απαιτείται καλός συντονισμός της ομάδας. Ο συντονισμός της ομάδας μπορεί να γίνει με τη χρήση φύλλου εργασίας και παρουσίασης power point ταυτόχρονα. Οι μαθητές μέσω της εικόνας αντιλαμβάνονται καλύτερα τη διαδικασία, ενώ μέσα από το φύλλο εργασίας κάνουν τη συσχέτιση με το θεωρητικό υπόβαθρο της άσκησης.

Αποµόνωση DNA από φυτικούς οργανισµούς! Προτείνουμε: 3. Συχνά λόγω του νωπού φυτικού ιστού χρειάζονται τροποποιήσεις στη διαδικασία για να διασφαλιστεί το αποτέλεσμα της συλλογής του τελικού υλικού. Με δεδομένη την παρασκευή του εκχυλιστικού μέσου που προτείνουμε, θα παρουσιάσουμε 2 τροποποιήσεις (επιπλέον άλας και επιπλέον αλκοόλη) για να εξασφαλίσουμε τη συλλογή του τελικού προϊόντος

Αποµόνωση DNA από φυτικούς οργανισµούς! Προτείνουμε: 4. Το τελικό υλικό δεν ταυτοποιείται ποιοτικά ως νουκλεικά οξέα. Προτείνουμε την ποιοτική ταυτοποίηση των νουκλεϊκών οξέων με τη μέθοδο του διαλύματος διφαινυλαμίνης.

Γνωριµία των µαθητών µε τα υλικά και τον εξοπλισµό Υλικά: Μικροσκόπιο και έτοιµα παρασκευάσµατα 1. ανθρώπινων µεταφασικών χρωµοσωµάτων 2. µίτωση σε κύτταρα ακρορίζιου Κεδρέλαιο. Σύστηµα προβολής διαφανειών. Φύλλα εργασίας. ένα κοµµάτι από φυτικό οργανισµό περίπου 4g (νωπό βάρος). 15 ml διάλυµα εκχύλισης DNA. Ογκοµετρικός σωλήνας των 10 ή 25 ml. (Για την παρασκευή 500 ml διαλύµατος εκχύλισης DNA, που είναι αρκετό για 50 εκχυλίσεις, χρειαζόµαστε: 25 ml απορρυπαντικού πιάτων, 8 gr µαγειρικό αλάτι και 450 ml νερό 1 ml διαλύµατος πεψίνης) 7

Υλικά: Ένας δοκιµαστικός σωλήνας σε υποστήριγµα. 1 µεγάλο γυάλινο χωνί + 1 διηθητικό χαρτί κοµµένο σε τετράγωνα (5X5 cm περίπου) που θα λειτουργήσει ως φίλτρο. 1 γουδάκι πορσελάνης. Φιάλη µε το διάλυµα εκχύλισης. Χρονόµετρο φωτογραφική µηχανή. Οινόπνευµα παγωµένο (φυλάσσεται στην κατάψυξη). Ένας αναδευτήρας (ξύλινο ραβδάκι). Μια γυάλινη κάψα για τη συλλογή των νουκλεϊκών οξέων. 8

Συντονισµός οµάδας! 1. Γνωριµία µε τα διαθέσιµα υλικά στον πάγκο σας. 2. Τα φύλλα εργασίας είναι ατοµικά και θα συµπληρωθούν σταδιακά κατά την πορεία του πειράµατος. εν αποτελούν εξέταση αλλά τις σηµειώσεις σας για την κατανόηση και την αποτύπωση των σταδίων του πειράµατος. 3. Κάθε φορά που δίνεται Ο ΗΓΙΑ από τον συντονιστή θα πρέπει όλοι να ακούµε προσεκτικά για να µη γίνουν λάθη κατά τα πειραµατικά στάδια. 4. Κάθε φορά που εφαρµόζετε µια Ο ΗΓΙΑ επιβάλλεται να ανταλλάσσετε απόψεις, αλλά αν είναι δυνατόν χαµηλόφωνα. 5. Μπορείτε να φωτογραφίζετε τα στάδια ώστε να έχετε υλικό για µια οµαδική παρουσίαση της δουλειάς σας στο τέλος Ας ξεκινήσουµε µε τα ερωτήµατα 1 και 2 από το φύλλο εργασίας 9

Φύλλο εργασίας ΕΡΩΤΗΜΑ 1: Ποιες κατηγορίες νουκλεϊκών οξέων γνωρίζετε; 1 2 ΕΡΩΤΗΜΑ 2: Σε ποια οργανίδια του φυτικού κυττάρου υπάρχει DNA; 1 2 3 1 η ΟΔΗΓΙΑ: Προσθέστε το φυτικό υλικό στο γουδάκι και με ήπιες κινήσεις λιώστε το. Ογκομετρήστε 15 ml διαλύματος εκχύλισης του φυτικού ιστού και προσθέστε το σταδιακά στο γουδάκι με το φυτικό υλικό ανακατεύοντας ήπια ώστε να μην υπάρξει δημιουργία αφρού. Αναμονή 5 λεπτά. Προγραμματίστε τα χρονόμετρά σας. (αν θέλετε φωτογραφίστε το υλικό σας στο στάδιο αυτό) 10

Ο ΗΓΙΑ 1η 1. Λιώνουµε (πολτοποιούµε) το υλικό µας, µε το γουδάκι. 11

2. Στη συνέχεια ογκοµετρούµε στον κύλινδρο 15 ml διαλύµατος εκχύλισης DNA. Τα προσθέτουµε στο φυτικό υλικό και αναδεύουµε ήπια, 12

3. Αναδεύουµε ήπια το µίγµα για ένα λεπτό. Προσπαθούµε να µη δηµιουργηθεί αφρός. Αναµονή για 6 λεπτά Επιστροφή στα φύλλα εργασίας Ερωτήµατα 3,4,5,6 Μια µικρή βοήθεια??? 13

Φύλλο εργασίας ΕΡΩΤΗΜΑ 3: Από ποια βιολογικά μακρομόρια δομούνται οι μεμβράνες των κυττάρων; 1 2 3 ΕΡΩΤΗΜΑ 4: Γιατί στο διάλυμα εκχύλισης φυτικού ιστού υπάρχει απορρυπαντικό; ΕΡΩΤΗΜΑ 5: Από τι αποτελείται το νουκλεόσωμα (βασική δομική μονάδα οργάνωσης της χρωματίνης);.... ΕΡΩΤΗΜΑ 6: Γιατί στο διάλυμα εκχύλισης φυτικού ιστού υπάρχει πεψίνη (πρωτεάση); 14

15

To DNA µέσα στον πυρήνα του κυττάρου είναι διπλωµένο (πακεταρισµένο) και προστατευµένο από πρωτεΐνες. Η πεψίνη (meat tenderizer) κόβει και αποµακρύνει τις πρωτεΐνες από το DNA. ΧΡΟΝΟΣ ΓΙΑ ΤΟ ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Αφού συµπληρώσετε τα αντίστοιχά ερωτήµατα στο Φύλλο εργασίας διαβάζουµε την 2 η ΟΔΗΓΙΑ 16

4. Τοποθετούµε ένα χωνί σε ένα δοκιµαστικό σωλήνα. 5. Βάζουµε µία γάζα ή/και διηθητικό χαρτί µέσα στο χωνί. 6. Ρίχνουµε το µίγµα του απορρυπαντικού µε το πολτοποιηµένο υλικό µας, στη γάζα και φιλτράρουµε το µίγµα µέσα στο σωλήνα ή σε ποτήρι ζέσεως. Ο ΗΓΙΑ 2η 7. Ξεπλένουµε το γουδάκι µε άλλα 10 ml διαλύµατος εκχύλισης και φιλτράρουµε και αυτό το τελευταίο υγρό. Αναµονή για τη διήθηση του υλικού µας. Επιστροφή στα φύλλα εργασίας ΕΡΩΤΗΜΑΤΑ 7,8 17

Φύλλο εργασίας ΕΡΩΤΗΜΑ 7: Λαμβάνοντας υπόψη τη δομή του νουκλεοτιδίου, τι φορτίο πιστεύετε ότι έχει το DNA; ΕΡΩΤΗΜΑ 8: Γιατί στο διάλυμα εκχύλισης υπάρχει NaCL (Na + );........ 18

19

Ο ΗΓΙΑ 3η 8. Προσθέτουµε µε προσοχή το παγωµένο οινόπνευµα στο σωλήνα µε το υγρό που συλλέξαµε µέχρι να γεµίσει περίπου ως τη µέση και να σχηµατίσει µία δεύτερη στοιβάδα πάνω από το φιλτραρισµένο υλικό, καθώς έχει µικρότερη πυκνότητα και επιπλέει σε αυτό. 20

9. Κρατάµε το δοκιµαστικό σωλήνα ακίνητο, στο ύψος των µατιών µας, χωρίς να τον µετακινούµε και παρατηρούµε τι συµβαίνει. Τα λιπίδια και οι πρωτεΐνες κινούνται στον πυθµένα της υδάτινης στοιβάδας, ενώ τα νουκλεϊκά οξέα ανέρχονται από την υποκείµενη στοιβάδα, στη στοιβάδα της αιθανόλης. Τα νουκλεϊκά οξέα είναι αδιάλυτα στην αιθανόλη γι αυτό και τα διακρίνουµε σαν νέφος Αν το νέφος είναι πολύ αραιό µπορούµε να προσθέσουµε λίγο άλας NaCl! ΕΠΙΣΤΡΟΦΗ ΣΤΟ ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΟΔΗΓΙΑ 4 η 21

Στα µικροσκόπια είναι τοποθετηµένα έτοιµα παρασκευάσµατα ανθρώπινου καρυότυπου ή ακροριζίων σε µίτωση προς παρατήρηση. Αυξήστε προοδευτικά τη µεγένθυνση των αντικειµενικών φακών. Παρατηρήστε τα χρωµοσώµατα. Ο ΗΓΙΑ 4η Προσθέστε κεδρέλαιο και παρατηρήστε στη µεγέθυνση Χ 100. Παρατηρήστε τα χρωµοσώµατα. Επιστροφή στα φύλλα εργασίας Ερωτήµατα 9,10. 22

Φύλλο εργασίας ΕΡΩΤΗΜΑ 9: Σε ποια στάδια του κυτταρικού κύκλου βρίσκονται τα χρωμοσώματα των έτοιμων παρασκευάσματων; Τι πιστεύετε ότι ισχύει για τα νουκλεϊκά οξέα που συλλέξατε; Θα μπορούσαμε να τα δούμε και αυτά; ΕΡΩΤΗΜΑ 10: Πως ξέρετε ότι το υλικό που συλλέξατε είναι νουκλεϊκά οξέα; 23

Ο ΗΓΙΑ 5η Χρησιµοποιώντας µία γυάλινη ή ξύλινη ράβδο ή µια µεταλλική βελόνα, πλησιάζουµε το σύννεφο που διαχωρίζεται και στρέφοντας αργά τη ράβδο, το τυλίγουµε γύρω της. 24

Τέλος αποµακρύνουµε τη ράβδο από το υγρό (αιθανόλη). 25

Συλλέγουµε όσο περισσότερο υλικό µπορούµε από όλες τις οµάδες και αν έχει υπολείµµατα χρωστικών ξεπλένουµε µε πυκνό διάλυµα αιθανόλης (95% v/v). 26

Συλλέξατε το «νέφος» που σχηµατίστηκε στη στιβάδα της αλκοόλης! Πως είµαστε σίγουροι ότι πρόκειται για νουκλεϊκά οξέα????? (ερώτηµα 10 στο Φ.Ε.) 27

6 η ΟΔΗΓΙΑ: Σε δοκιμαστικό σωλήνα προσθέτουμε σε 1 ml H 2 SO 4 2M, τα νουκλεϊκά οξέα που συλλέξαμε, τα οποία νωρίτερα έχουμε διαλύσει σε μικρό όγκο νερού(1 ml). Προετοιμάζουμεκαιέναδοκιμαστικόσωλήναπουθαπροσθέσουμε1mlH 2 SO 4 2Mκαι1mlνερό χωρίς νουκλεϊκά οξέα, ώστε να το χρησιμοποιήσουμε ως μάρτυρα, για τη σύγκριση του χρωματικού αποτελέσματος. Αναμίξτε καλά το περιεχόμενό τους και τοποθετείστε τους σε υδατόλουτρο 95 o C για 15 min. Προγραμματίστε τα χρονόμετρά σας. Με το οξύ και τη θέρμανση θα σπάσουν οι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί. Στο διάλυμα θα απελευθερωθούν δεοξυριβόζες από το DNA. Προσθέστε 2 ml χρωστικής (αντιδραστήριο της διφαινυλαμίνης) που βάφει επιλεκτικά τη δεοξυριβόζη και θερμαίνουμε πάλι σε υδατόλουτρο 95 o C για 5 min. Προγραμματίστε πάλι τα χρονόμετρά σας. Παρατηρούμε τη μεταβολή του χρώματος σε σκούρο γαλάζιο. Το χρώμα του μάρτυρα δε μεταβάλλεται. 28

Ένας τρόπος να διαπιστώσουµε αν η ουσία που αποµονώσαµε είναι πράγµατι DNA είναι να επιδράσουµε µε αντιδραστήριο διφαινυλαµίνης. 29

Ο ΗΓΙΑ 6η Αρχικά το υλικό που συλλέξαµε, προστίθεται σε 2 ml διαλύµατος H 2 SO 4 2M και θερµαίνουµε για 15 λεπτά σε υδατόλουτρο στους 95 ο C To αντιδραστήριο διφαινυλαµίνης είναι αρχικά διαφανές. Η αντιδραση διφαινυλαµίνης δεν είναι ειδική για το DNA αλλά για τις δεοξυριβόζες και δίνει µπλέ χρώµα. 30

Ο ΗΓΙΑ 6η Μετά το τέλος της επώασης παρατηρούµε την αλλαγή χρώµατος σε σχέση µε το µάρτυρα Μετά τη θέρµανση προσθέτουµε 2 ml αντιδραστηρίου διφαινυλαµίνης και θερµαίνουµε για άλλα 5 λεπτά. 31

Βιβλιογραφία Αποµόνωση DNA, από http://en.wikipedia.org/wiki/dna_extraction Εργαστηριακός οδηγός Γ Λυκείου, 2000, από (http://ekfe.eyr.sch.gr/erg_odhgoi/erg_od_bio_g_kat_lyk.pdf) Δουρής, B., (1996), Κραββαρίτη, Λ., (2010), ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ KAI ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΑΘΗΝΑ 2015 Καββαδίας, Σπ., 2009, Εργαστηριακή αποµόνωση DNA από φράουλες. Φύλλο εργασίας, 1ο ΓΕΛ Αργοστολίου Παλαιολόγου, Δ., Κατσαρέλη Ε., Παπανικολάου, Γ., 2015 Αποµόνωση DNA, Κεφάλαιο 5, από https://repository.kallipos.gr/bitstream/11419/645/1/02_chapter_05.pdf Βάτσιος Ξ., 2012, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ), ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Μαβίδης Μ., 2015, Αποµόνωση Γενετικού Υλικού (DNA), από https://e-class.teilar.gr/modules/document/file.php/diet146.pdf Dische, Z., 1955 New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal., 2:313 358. [PubMed] Patterson J., Mura C., 2013, Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples, J Vis Exp. (72): 50225. Published online, από: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3597041/ Stumpf, P., K., 1947, A colorimetric method for the estimation of deoxyribonucleic acid, από http://www.jbc.org/content/169/2/367.full.pdf Burton, K., 1956, A Study of the Conditions and Mechanism of the Diphenylamine Reaction for the Colorimetric Estimation of Deoxyribonucleic Acid, Biochem., 62, 315-323 32

Ευχαριστίες Ευχαριστούµε τους µαθητές των τµηµάτων ΓΘΣ1 και ΓΘΣ2 (σχολική χρονιά 2016-2017) για τη συµµετοχή τους και την ευρυµατικότητά τους στην εκτέλεση και παρουσίαση της εργαστηριακής αυτής άσκησης. 33