ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ & ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΣΤΑ ΠΛΑΙΣΙΑ ΤΟΥ ΜΑΘΗΜΑΤΟΣ ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ & ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΙΤΛΟΣ ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ (MASS SPECTROMETRY, MS) ΖΩΗ ΛΙΤΟΥ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΘΕΜΑΤΟΣ: Γ. ΠΑΝΑΓΙΩΤΟΥ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΟ ΕΤΟΣ 2002-03 1

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η δραµατική ανάπτυξη της τεχνολογίας όσων αφορά γονιδιωµατικές µελέτες είχε µεγάλη επίδραση και στην προσπάθεια κατανόησης της χηµείας των πρωτεϊνών. Η πρωτεοµική, ασχολείται µε την ανάλυση πρωτεϊνών σε µεγάλη κλίµακα (π.χ., κυτταρικές σειρές, ιστοί) και περιλαµβάνει τρία κύρια πεδία. Πρώτον, το µικρο-χαρακτηρισµό πρωτεϊνών, που αφορά στον προσδιορισµό πρωτεϊνών σε µεγάλη κλίµακα και τις µετα- µεταφραστικές τους τροποποιήσεις. Η φωσφορυλίωση, η γλυκοζυλίωση και άλλες τροποποιήσεις είναι ιδιαίτερα σηµαντικές για τη λειτουργία των πρωτεϊνών επειδή καθορίζουν την ενεργότητα, τη σταθερότητα και τη θέση τους. Δεύτερον, τη διαφορική εµφάνιση της πρωτεοµικής για σύγκριση επιπέδων των πρωτεϊνών µε πιθανή εφαρµογή σε διάφορες ασθένειες. Και τρίτον, τη µελέτη αλληλεπιδράσεων µεταξύ πρωτεϊνών χρησιµοποιώντας τεχνικές όπως η φασµατοµετρία µαζών (Pandey & Mann, 2000). Λόγο της δυσκολίας πρόγνωσης της λειτουργίας µιας πρωτεΐνης µε βάση την οµολογία της µε άλλες πρωτεΐνες ή ακόµα και µε τρισδιάστατες δοµές, ο προσδιορισµός των συστατικών µιας πρωτεΐνης είναι σηµαντικός για την ανάλυση της λειτουργίας της. Μετά από την επανάσταση στη µοριακή βιολογία, η πρωτεοµική είναι χρήσιµη και για την κατανόηση της βιοχηµείας των πρωτεϊνών. Η φασµατοµετρία µαζών είναι µια µέθοδος µεγάλης κλίµακας λόγο του ότι µπορεί να χειριστεί µεγάλο αριθµό πρωτεϊνών (Anderson & Mann, 2000). Χρησιµοποιείται για τη µελέτη ιονισµένων µορίων σε αέρια φάση µε στόχο τον ποσοτικό (µπορούν να µετρηθούν σχετικές µοριακές µάζες οργανικών ενώσεων και βιοπολυµερών) και ποιοτικό προσδιορισµό συστατικών ενός µείγµατος, την αναγνώριση άγνωστων συστατικών, την ποσοτική ανάλυση γνωστών υλικών, τη µελέτη δραστικότητας σε αέρια φάση, το χαρακτηρισµό φυσικών ιδιοτήτων των ιόντων και την απόκτηση δοµικών πληροφοριών. Επίσης επιτυγχάνεται ευκολότερος εντοπισµός µετα-µεταφραστικών τροποποιήσεων µε χρήση της φασµατοµετρία µαζών (Anderson & Mann, 2000). Βασίζεται στον διαχωρισµό των µαζών φορτισµένων σωµατιδίων (κυρίως κατιόντων) µε την βοήθεια κατάλληλης διάταξης και την εύρεση της αντιστοιχίας των µαζών των λαµβανοµένων ιόντων µε, µε την δοµή της πρόδροµης ένωσης. Είναι µια τεχνική που σχετίζεται µε 2

πολύ υψηλά επίπεδα ιδιαιτερότητας και ευαισθησίας. Οι αναλύσεις µπορούν συχνά να ολοκληρωθούν µε πολύ µικρές ποσότητες - απαιτώντας ποσότητες υλικού, µερικές φορές µικρότερες από picogram (10-12 γραµµάρια). Προτιµάται η χρήση πεπτιδίων και γι αυτό το λόγο γίνεται διάσπαση των πρωτεϊνών σε πεπτίδια µε τη χρήση συγκεκριµένων πρωτεασών, όπως η τρυψίνη. Η φασµατοµετρία µαζών δεν είναι ίδια µε όλους τους άλλους τύπους φασµατοµετρίας. Παρόλο που δεν προϋποθέτει την απορρόφηση φωτός (ενέργεια) όπως οι άλλοι τύποι, συνεχίζει να καλείται φασµατοµετρία επειδή παρέχει µια µέθοδο που υπολογίζει δοµές και παράγει ένα "φάσµα" παρόµοιο µε αυτά που παράγονται από άλλες φασµατοσκοπικές µεθόδους. Είναι ιδιαίτερα σηµαντική σε σχέση µε άλλες αναλυτικές µεθόδους γιατί τα σήµατα που παράγoνται από το φασµατογράφο είναι αποτέλεσµα χηµικών αντιδράσεων όπως ιονισµός και κατακερµατισµός, και όχι κάποιες αλλαγές της ενεργειακής κατάστασης που συνήθως παίρνουµε από της άλλες µεθόδους φασµατοσκοπίας. Αυτή η χαρακτηριστική ιδιότητα, καθιστά τη φασµατοµετρία µαζών ιδιαίτερα σηµαντική. Η λειτουργία του φασµατογράφου µαζών συνοψίζεται στα παρακάτω βήµατα: 1. δηµιουργία ιόντων (µόρια που έχουν ηλεκτρικό φορτίο) σε αέρια φάση 2. διαχωρισµός των ιόντων στο χώρο ή το χρόνο ανάλογα µε την λόγο µάζα-φορτίο 3. µέτρηση της ποσότητας των ιόντων (κάθε λόγου µάζας-φορτίου) Οι τέσσερις σηµαντικοί παράµετροι της τεχνικής είναι η µάζα, το φορτίο, η ταχύτητα και η ένταση. Η δύναµη µε την οποία διαχωρίζονται τα ιόντα στο φασµατογράφο µαζών περιγράφεται από την διακριτικότητα (resolution), που ορίζεται ως R=m/delta m, Όπου m είναι η µάζα των ιόντων και delta m είναι η διαφορά µάζας µεταξύ δύο ευδιάκριτων κορυφών στο φάσµα των µαζών. Η φασµατοµετρία µαζών βασίζεται στην παραγωγή δέσµης ιοντικών θραυσµάτων (fragments) µε βοµβαρδισµό των εξεταζόµενων µορίων συνήθως µε ηλεκτρόνια υψηλής 3

ενέργειας. Τα παραγόµενα θραύσµατα στη συνέχεια διαχωρίζονται µε εφαρµογή ηλεκτρικού ή µαγνητικού πεδίου ή µε άλλες µεθόδους. Ο διαχωρισµός των ιόντων γίνεται µε βάση το λόγο µάζας προς φορτίο (m/z) κάθε ιοντικού θραύσµατος. Όπως γίνεται εποµένως σαφές η φασµατοµετρία δεν µετράει απευθείας µάζα αλλά το λόγο µάζα προς φορτίο. Στις περισσότερες περιπτώσεις τα θραύσµατα είναι µονοφορτισµένα (z=1) και για τον λόγο αυτό ο όρος "λόγος µάζα-προς-φορτίο" αντικαθίσταται από τον πλέον εύχρηστο όρο µάζα. Σήµερα µεγάλη ποικιλία φασµατογράφων είναι διαθέσιµη από έναν απλό ανιχνευτή για χρωµατογραφία αερίων (gas chromatography) µέχρι όργανα τεράστιου µεγέθους όπως επιταχυντές φασµατοµετρίας µαζών. Όλα όµως έχουν την ικανότητα ανάθεσης τιµής µάζας προς φορτίο στα ιόντα, παρόλο που οι αρχές λειτουργίας τους και οι τύποι των πειραµάτων που γίνονται σε αυτά τα µηχανήµατα διαφέρουν. Η φασµατοµετρία µαζών είναι ένα εργαλείο ανάλυσης που χρησιµοποιείται για µετρήσεις µοριακού βάρους (MW) δειγµάτων. Για µεγάλα δείγµατα, όπως βιοµόρια, τα µοριακά βάρη µετριούνται µε µια ακρίβεια 0.01% του συνολικού µοριακού βάρους του δείγµατος. Για παράδειγµα, ένας φασµατογράφος µε διακριτικότητα 1000 µπορεί να διαχωρίσει ένα ιόν µε m/z 100.0 από ένα ιόν µε m/z 100.1. Αυτό επιτρέπει ανίχνευση πολύ µικρών αλλαγών στη µάζα, όπως π.χ. αντικατάσταση ενός αµινοξέος µε ένα άλλο. Για µικρά οργανικά µόρια, το µοριακό βάρος µπορεί να µετρηθεί µε ακρίβεια 5 ppm, που συνήθως αρκεί για να πιστοποιηθεί ο µοριακός τύπος ενός συστατικού. Οι ατοµικές και µοριακές µάζες ορίζονται µε βάση τη µάζα ενός ισοτόπου του άνθρακα, του 12 C, του οποίου το ατοµικό βάρος είναι ακριβώς 12. Η πραγµατική µάζα του 12 C είναι 12 daltons, µε το ένα dalton να ισούται µε 1.661 10-24 g. Η µάζα ενός µορίου ή ενός ιόντος παριστάνεται σε daltons (Da) ή kilodaltons (kda). Είναι γεγονός ότι στις µέρες µας η φασµατοµετρία µαζών θεωρείται µια βασική τεχνική για την επίλυση προβληµάτων πάνω σε πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα. Αυτή η πρόοδος καθιστά εφικτό τον υπολογισµό µοριακών µαζών για µεγάλα µακροµόρια µε ακρίβεια που φτάνει τη µια µονάδα µάζας. Δίνεται έτσι η δυνατότητα, χρησιµοποιώντας ένα πολύ 4

µικρό δείγµα, παρατήρησης µεταµεταφραστικών τροποποιήσεων των πρωτεϊνών, πιστοποίησης των επιπτώσεις της µεταλλογένεσης, αλληλούχισης των πρωτεϊνών και αλληλεπίδρασης µεταξύ µακροµορίων. Η χρησιµοποίηση φασµατοµετρίας µαζών στην έρευνα βιολογικών διεργασιών ξεκίνησε στα τέλη του 1930, µε τη χρήση σταθερών ισοτόπων φασµατοµετρία µαζών µε το λόγο ισοτόπων. Στόχος ήταν η ανακάλυψη των δυναµικών καταστάσεων των οργανισµών. Στις αρχές του 1980, µια τροµερή αλλαγή έκανε τη µέθοδο αυτή ακόµα πιο χρήσιµη στις βιολογικές αναλύσεις. Παρουσιάστηκαν νέες τεχνικές ιονισµού [fast atom bombardment (FAB), plasma desorption (PD) και thermospray (TSP)] που επέτρεψαν την παραγωγή ιόντων σε αέρια φάση από φορτισµένα και πολωµένα συστατικά χωρίς να χρειάζεται προηγουµένως η δηµιουργία χηµικών παραγώγων. Αυτές οι νέες τεχνικές ιονισµού, όχι µόνο εξοικονόµησαν χρόνο στην προετοιµασία των δειγµάτων και την ανάπτυξη των µεθόδων, αλλά έκαναν τη φασµατοµετρία µαζών µέθοδο για ανάλυση µακροµορίων µε µεγάλες µάζες. Κάτι που δεν ίσχυε παλιότερα. Την τελευταία δεκαετία έχουν δηµιουργηθεί και άλλες µέθοδοι ιονισµού [electrospray (ES) και ιονισµός matrix assisted laser desorption (MALD)] αυξάνοντας ακόµα περισσότερη τη χρήση της φασµατοµετρίας µαζών στη βιολογία. Σήµερα, πρωτεΐνες µε µοριακές µάζες µεγαλύτερες των 100,000 Da µπορούν να µετρηθούν µε 1000 φορές µεγαλύτερη ακρίβεια από ότι µε ηλεκτροφόρηση (gel electrophoresis). Φυσικά αυτό οφείλεται και στην σηµαντική πρόοδο της ηλεκτρονικής και την ανάπτυξη της τεχνολογίας αναλυτών. 5

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σε γενικές γραµµές, η φασµατοµετρία µαζών περιλαµβάνει τα συστήµατα εισαγωγής του δείγµατος (sample inlet systems), την πηγή των ιόντων (ion sources), τον αναλυτή (φίλτρο) των µαζών (mass analyzers), ανιχνευτή ιόντων (detector) και ανάλυση των δεδοµένων όπως παρουσιάζονται στην Εικ. 1. Εικόνα 1: Παρουσίαση της διαδικασία που ακολουθείται στη φασµατοµετρία µαζών. ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗΣ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ (SAMPLE INLET SYSTEMS) Τα συστήµατα εισόδου επιτρέπουν την εισαγωγή ενός αντιπροσωπευτικού δείγµατος στην πηγή των ιόντων. Υπάρχουν διαφορετικοί τύποι εισαγωγής που περιλαµβάνουν τα batch inlets, direct probe inlets, και chromatographic inlets. 6

ΠΗΓΕΣ ΙΟΝΤΩΝ (ION SOURCES) Το πρωταρχικό σηµείο στην ανάλυση µε φασµατοµετρία µαζών είναι ο σχηµατισµός ιόντων σε αέρια µορφή. Υπάρχουν πολλές διαθέσιµες τεχνικές ιονισµού που παράγουν φορτισµένα µόρια σε αέρια µορφή, από ιονισµό απλών ηλεκτρονίων µε πρόσκρουση [simple electron (impact) ionization (EI)] και χηµικό ιονισµό [chemical ionization (CI)], µέχρι τεχνικές ιονισµού αντιστροφή διαδικασία προσρόφηση (desorption) µε acronyms όπως FAB, PD, ES και MALDI. Παλιότερα ήταν προαπαιτούµενο το δείγµα να είναι σε αέρια µορφή, αλλά σήµερα υπάρχει δυνατότητα εφαρµογής της τεχνικής σε υγρά και στερεά δείγµατα, τα οποία µετατρέπονται σε αέρια φάση, είτε πριν, είτε κατά τη διάρκεια του ιονισµού. Τα δείγµατα σε αέρια µορφή, µπορεί να είναι απευθείας συνδεδεµένα µε το όργανο και να περάσουν σε αυτό µέσω µιας τριχοειδούς βαλβίδας. Δείγµατα σε υγρή και στερεή µορφή µπορούν να εισαχθούν στο όργανο µέσω ενός septum inlet ή ενός συστήµατος vacuum-lock. Το δείγµα βοµβαρδίζεται µε ηλεκτρόνια υψηλής ενέργειας, µεγαλύτερη από την ενέργεια ιονισµού των περισσότερων συστατικών. Μερικά από τα M + ιόντα τεµαχίζουν σε µικρότερα µέρη. Ένα από τα τµήµατα φέρει το φορτίο και ανιχνεύεται, ενώ τα άλλα είναι ουδέτερα και εποµένως δεν ανιχνεύονται. Οι παράγοντες που επηρεάζουν τον κατακερµατισµό περιλαµβάνουν: 1. τη δύναµη των δεσµών-ασθενείς δεσµοί είναι πιθανότερο να σπάσουν 2. τη σταθερότητα των κατακερµατισµένων ιόντων (η ικανότητα να φέρουν φορτίο) 3. την εσωτερική ενέργεια των θραυσµάτων (fragments) 4. το χρόνος µεταξύ κατακερµατισµού και ανίχνευσης µεγαλύτερη χρονική διάρκεια δείχνει την ύπαρξη περισσότερου χρόνου για κατακερµατισµό σε µικρότερα θραύσµατα. Η ικανότητα ενός φασµατόµετρου µαζών να διαφοροποιήσει το ένα ιοντικό θραύσµα από το άλλο συνήθως αναφέρεται ως «διαχωριστική ικανότητα»(resolution). Το µηχάνηµα λειτουργεί σε χαµηλές πίεση ώστε να αποφευχθούν συγκρούσεις µεταξύ των ιόντων µε µόρια που υπάρχουν στον αναλύτη σε αέρια µορφή, κατά την πτήση από 7

την πηγή στον ανιχνευτή. To κενό που έχει δηµιουργηθεί, είναι τέτοιο ώστε το µέσο µήκος ελεύθερης κίνησης (mean free path length) του ιόντος, δηλαδή η µέση απόσταση που θα ταξιδέψει ένα ιόν πριν συγκρουστεί µε ένα άλλο αέριο µόριο, να είναι µεγαλύτερη της απόστασης από την πηγή µέχρι τον ανιχνευτή. Πολλά πειράµατα έχουνε γίνει ώστε να βρεθεί η κατάλληλη πτώση πίεσης από την οποία πρέπει να περάσει το δείγµα, µπαίνοντας στο µηχάνηµα. Ένα συστατικό βοµβαρδίζεται µε µια δέσµη ηλεκτρονίων που έχουν αρκετή ενέργεια ώστε να κατακερµατίζει το µόριο. Υπερβολική ενέργεια θα οδηγήσει σε περαιτέρω κατακερµατισµό του µοριακού ιόντος σε θυγατρικά ιόντα µε µικρότερο λόγο µάζας προς φορτίο. Παρόλο που από την πηγή των ιόντων παράγονται την ίδια στιγµή και θετικά και αρνητικά ιόντα µόνο µια πολικότητα καταγράφεται κάθε στιγµή έτσι κάθε φάσµα αποτελείται είτε από θετικά είτε από αρνητικά φορτισµένα ιόντα. Συνήθως καταγράφονται φάσµατα µαζών ιονισµού θετικών ιόντων. Τα θετικά ιόντα που παράγονται από πρόσκρουση µε ηλεκτρόνια επιταχύνονται στο κενό (π.χ., µέσω ενός µαγνητικού πεδίου), διαχωρίζονται µε βάση το λόγο µάζας προς φορτίο και έλκονται από σχισµές της πηγής των ιόντων και του αναλυτή µάζας. Τα αρνητικά ιόντα και τα ηλεκτρόνια έλκονται από µια παγίδα θετικά φορτισµένων ηλεκτρονίων (Εικ.2). Εικόνα 2: Παρουσίαση θετικών ιόντων που οδηγούνται προς ανάλυση και αρνητικών και ουδέτερων ιόντων που αποµακρύνονται. 8

Τα φασµατόµετρα µαζών λειτουργούν κάτω από υψηλό κενό ώστε να αφαιρούνται οι ατµοσφαιρικές παρεµβάσεις που µπορούν να επηρεάσουν τη διαδικασία ιονισµού. Όλα τα φασµατόµετρα µαζών έχουν συσκευές ασφάλειας έτσι ώστε η πηγή ιόντων να µην λειτουργεί έως ότου επιτυγχάνεται το επιθυµητό υψηλό κενό. Η ανάλυση της πληροφορίας που δίνεται από τη φασµατοµετρία µαζών περιλαµβάνει την επανένωση (re-assembling) των θραυσµάτων, πηγαίνοντας προς τα πίσω ώστε να δηµιουργήσει το αρχικό µόριο. ΜΕΘΟΔΟΙ ΙΟΝΙΣΜΟΥ Η περιοχή ιονισµού είναι ο χώρος στον οποίο ένα µέρος του δείγµατος (στις περισσότερες τεχνικές ιονισµού απαιτείται να βρίσκεται στην αέρια φάση) ιονίζεται και τα παραγόµενα ιόντα οδηγούνται στο φίλτρο µαζών. Ανάλογα µε τις φυσικοχηµικές ιδιότητες των δειγµάτων, επιλέγονται διαφορετικές µέθοδοι ιονισµού. Ένας παράγοντας στην επιλογή της τεχνικής ιονισµού είναι η θερµοσταθερότητα. Για παράδειγµα, δείγµατα όπως τα πεπτίδια και οι πρωτεΐνες χρησιµοποιούνται ήπιες µέθοδοι ιονισµού, ενώ για άλλα πτητικά δείγµατα χρησιµοποιούνται τεχνικές χηµικού ιονισµού. Υπάρχουν αρκετές µέθοδοι παραγωγής ιόντων και παρουσιάζονται παρακάτω: 1α. Ηλεκτρονιακός Ιονισµός (Electron Ionization, EI) Είναι η πρώτη µέθοδος ιονισµού και συνεχίζει και σήµερα να χρησιµοποιείται ευρέως. Η µέθοδος βασίζεται στον ιονισµό ενός µορίου που προκαλείται από την σύγκρουση του µε ταχέως κινούµενα ηλεκτρόνια. Σε ένα θερµαινόµενο θάλαµο δηµιουργείται µια δέσµη ενεργητικών ηλεκτρονίων λόγο διέλευσης ρεύµατος µέσα από ένα πυρακτωµένο νήµα βολφραµίου (W) ή ρηνίου (Re). Ένας µόνιµος µαγνήτης τοποθετείται σε ολόκληρο το θάλαµο ιόντων για να παράγει µια µαγνητική ροή παράλληλη µε τη δέσµη των ηλεκτρονίων. Τα ηλεκτρόνια αφήνουν την επιφάνεια του νήµατος και επιταχύνονται µε τη βοήθεια ηλεκτρικού πεδίου, προς το θάλαµο πηγής ιόντων όπου υπάρχει θετικό δυναµικό (ίσο µε την επιταχυνόµενη τάση). Η ενέργεια που αποκτούν είναι ίση µε την τάση µεταξύ του νήµατος πυράκτωσης και του θαλάµου παραγωγής (συνήθως 70 ev). 9

Τα ηλεκτρόνια (που είναι αρνητικά φορτισµένα) έλκονται µακριά από το νήµα προς µια παγίδα. Η παγίδα ηλεκτρονίων συγκρατείται σε ένα σταθερό θετικό δυναµικό σε σχέση µε το θάλαµο παραγωγής. Ένα κλάσµα της δέσµης ηλεκτρονίων θα συγκρουστεί µε την παγίδα ηλεκτρονίων παράγοντας το ρεύµα της παγίδας. Αυτό χρησιµοποιείται ως κύκλωµα ανατροφοδότησης για να σταθεροποιεί τη δέσµη ηλεκτρονίων. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την κίνηση της δέσµης ηλεκτρονίων από το νήµα πυράκτωσης προς την παγίδα, αυξάνοντας την πιθανότητα και την αποδοτικότητα του ιονισµού. Τα αέρια µόρια προς ανάλυση εισάγονται στη διαδροµή κίνησης της δέσµης των ηλεκτρονίων όπου µπορούν να ιονιστούν από ηλεκτρονικές αλληλεπιδράσεις µε αυτήν. Ο ιονισµός µπορεί επίσης να παρουσιαστεί µε άµεση ενσφήνωση ενός ηλεκτρονίου µε το µόριο προς ανάλυση. Τα µόρια (δείγµα) που βρίσκονται σε αέρια φάση κατευθύνονται προς αυτή τη δέσµη υψηλής ενέργειας. Η αλληλεπίδραση που προκύπτει προκαλεί την απώλεια ενός ηλεκτρονίου από το µόριο, παράγοντας ένα θετικά φορτισµένο µοριακό ιόν. Ανάλογα µε το συστατικό και την δύναµη ιονισµού, το µοριακό ιόν µπορεί έπειτα να κατακερµατιστεί. Η τάση απόκρουση των θετικών ιόντων και η τάση διέγερσης των αρνητικών παράγουν ένα ηλεκτρικό πεδίο στο θάλαµο, ώστε τα ιόντα να βγαίνουν από την πηγή µέσω της σχισµής εξόδου των ιόντων (ion exit slit). Μια απεικόνιση του ηλεκτρονιακού ιονισµού εµφανίζεται στην Εικ. 3. Έπειτα µπορεί να γίνει ανάλυση µάζας των ιόντων. Εικόνα 3: Ηλεκτρονιακός ιονισµός (http://www-methods.ch.cam.ac.uk/meth/ms/) 10

1β. Χηµικός ιονισµός (Chemical Ionisation, CI) Αυτή η πηγή ιόντων είναι παρόµοια µε την πηγή ιονισµού ηλεκτρονίων αλλά εδώ ο ιονισµός δεν επιτυγχάνεται µε άµεση αλληλεπίδραση µε τη δέσµη ηλεκτρονίων, αλλά οι αντιδράσεις είναι µεταξύ ιόντων και µορίων για την παραγωγή ιόντων, χρησιµοποιώντας ένα αέριο (µε γενικό τύπο RH), όπως µεθάνιο CH 4, ισοβουτάνιο (CH 3 ) 3 CH ή αµµωνία NH 3 το οποίο ιονίζεται µε ηλεκτρονιακό ιονισµό προς RH +. Αυτή είναι µια λιγότερο δυναµική-δραστική διαδικασία σε σχέση µε τον ιονισµό ηλεκτρονίων. Αυτά τα ιόντα είναι συνήθως σχετικά σταθερά, τείνοντας να µην κατακερµατίζονται τόσο εύκολα όσο τα ιόντα που παράγονται από τον ιονισµό ηλεκτρονίων. 1γ. Φωτοϊονισµός (Photoionization, PI) Η µέθοδος του φωτοϊονισµού χρησιµοποιεί πηγή φωτός (συνήθως υπεριώδες, λ < 350 nm) για τον ιονισµό, µε την βοήθεια laser ή λυχνίας Hg ή Xe. Η ενέργεια των φωτονίων είναι µόλις αρκετή για τον ιονισµό µορίων και ελευθέρων ριζών µε χαµηλά δυναµικά ιονισµού. Ο ηλεκτρονιακός ιονισµός και ο χηµικός ιονισµός είναι γενικά οι τεχνικές για µικρά (< 800 Da), πτητικά, θερµοσταθερά συστατικά. Η συνηθέστερα χρησιµοποιούµενη µέθοδος ιονισµού σε αέρια φάση είναι του ηλεκτρονιακού ιονισµού, µε πλεονεκτήµατα την καλή κατανόηση του µηχανισµού της, την καθολικότητα της εφαρµογής της σε όλες τις πτητικές χηµικές ενώσεις και την αναπαραγωγισιµότητα των λαµβανοµένων φασµάτων µάζας. Δίνει έτσι δοµικές πληροφορίες. Τα σοβαρότερα µειονεκτήµατα της µεθόδου του ηλεκτρονιακού ιονισµού είναι η απαιτούµενη πτητικότητα της χηµικής ένωσης (ή µίγµατος ενώσεων) και ο εκτενής µοριακός κατακερµατισµός που συνοδεύει τον ιονισµό. Όταν ο κατακερµατισµός δεν είναι επιθυµητός, χρησιµοποιούνται οι άλλες δύο µέθοδοι ιονισµού µορίων στην αέρια φάση, ο χηµικός ιονισµός και ο φωτοϊονισµός. Το πλεονέκτηµα του χηµικού ιονισµού σε σχέση µε τον ηλεκτρονιακό ιονισµό είναι η χαµηλή ενέργεια η οποία εναποτίθεται στο παραγόµενο κατιόν µε αποτέλεσµα το µικρό ποσοστό κατακερµατισµού του µε επακόλουθη ευκολία προσδιορισµού του µοριακού βάρους. Ο χηµικός ιονισµός δίνει πληροφορίες µοριακού βάρους. Τα φάσµατα από ιονισµό ηλεκτρονίων µπορούν να χρησιµοποιηθούν για σύγκριση µε βιβλιοθήκες. Η 11

µέθοδος του φωτοϊονισµού δεν χρησιµοποιείται για την ανάλυση των κοινών µορίων και αποτελεί µία µέθοδο ιονισµού σε ερευνητικό επίπεδο για την ανάλυση και ανίχνευση ασταθών ελευθέρων ριζών που παράγονται σε χηµικές αντιδράσεις, οι οποίες θα θρυµµατιζόταν εντελώς κατά τον ηλεκτρονιακό ιονισµό. Μάλιστα, µε κατάλληλη επιλογή του µήκους κύµατος της ιονίζουσας ακτινοβολίας είναι δυνατή η εκλεκτική ανίχνευση ορισµένων µορίων ή ελευθέρων ριζών. 2. Γρήγορος βοµβαρδισµός ατόµων (Fast Atom Bombardment, FAB) και φασµατοµετρία µαζών δευτερογενών ιόντων υγρών (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry, LSIMS) Αυτή η τεχνική, αναπτύχθηκε στις αρχές της δεκαετίας του '80, προσθέτοντας µια νέα σειρά συστατικών που µπορούσαν να αναλυθούν µε φασµατοµετρία µαζών. Αν και σήµερα δεν θεωρείται ιδιαίτερα ευαίσθητη σε σύγκριση µε πιο πρόσφατες µεθόδους ιονισµού, η FAB συνεχίζει να είναι σηµαντική λόγο της ταχύτητάς της, της αξιοπιστίας της και του εύρους της, για δείγµατα που η ποσότητα και η καθαρότητα δεν είναι πρόβληµα. Το δείγµα αρχικά διαλύεται σε µια υγρή µήτρα (matrix) στόχου ή να εφαρµοστεί διαλυµένο σε έναν αναµίξιµο διαλύτη. Αυτό είναι ένα σύµπηκτο, υγρό χαµηλό πίεσης. Μερικά µικρόλιτρα αυτού του υγρού τοποθετούνται σε έναν µικρό µεταλλικό στόχο στο τέλος ενός ανιχνευτή που παρεµβάλλεται µέσα στο φασµατόµετρο. Η υγρή επιφάνεια βοµβαρδίζεται µε µια δέσµη ατόµων υψηλής κινητικής ενέργειας (xenon ή argon) ή ιόντων (caesium). Οι µέθοδοι FAB και LSIMS περιλαµβάνουν το βοµβαρδισµό ενός στερεού µείγµατος αναλύτη και µήτρας από µια γρήγορη δέσµη σωµατιδίων (fast particle beam). Στη FAB, η δέσµη σωµατιδίων είναι συνήθως ουδέτερο αδρανές αέριο, συνήθως Ar ή Xe, µε ενέργειες βοµβαρδισµού 4-10 KeV, ενώ στην LSIMS, η δέσµη σωµατιδίων είναι ιόν, συνήθως CS+, µε ενέργειες βοµβαρδισµού 2-30KeV. Τα µόρια ψεκάζονται από την επιφάνεια, µετατρέπονται σε αέρια φάση και ιονίζονται. Η δέσµη σωµατιδίων δηµιουργείται στην επιφάνεια του αναλύτη, και µεταφέρει αρκετή από την ενέργειά της στον περιβάλλοντα χώρο, δηµιουργώντας στιγµιαίες συγκρούσεις και διασπάσεις. Τα ιόντα που προκύπτουν τείνουν να σταθεροποιηθούν και 12

κατακερµατίζονται µερικώς. Μέσα από αυτή τη διαδικασία, εκτινάσσονται από την επιφάνεια κάποια θετικά και αρνητικά ιόντα, και αυτά τα «ψεκασµένα» ή δευτερεύοντα ιόντα φεύγουν από την πηγή και κατευθύνονται προς ανάλυση. Η πολικότητα της περιοχής εξόδου µπορεί να αλλάξει ανάλογα µε το είδος δείγµατος που αναλύεται. Στην Εικ. 4 η έξοδος είναι αρνητικά φορτισµένη και αυτό γιατί αναλύονται µόνο τα θετικά φορτισµένα ιόντα. Στην τεχνική LSIMS η δέσµη ατόµου αντικαθίσταται από δέσµη ιόντος. Μια δυναµική έκδοση FAB υπάρχει που συχνά αναφέρεται ως «συνεχής ροή FAB» επιτυγχάνοντας διασύνδεση µε άλλες τεχνικές (HLPC και CZE). Εικόνα 4: Σχηµατική αναπαράσταση µιας fast atom bombardment πηγής ιόντων. (http://www-methods.ch.cam.ac.uk/meth/ms/). Η FAB/LSIMS είναι χρήσιµη για µεγάλα (5,000 Da) πολικά και θερµοσταθερά µόρια, όπως πεπτίδια, µικρές πρωτεΐνες και άλλα βιοπολυµερή. Συγκριτικά, δεν είναι ισχυρές µέθοδοι ιονισµού. 3. Ιονισµός µε ηλεκτροψεκασµό (Electrospray Ionization, ESI) Τα πρώτα πειράµατα στα οποία χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος του ηλεκτροψεκασµού ήταν στα τέλη του 1930 από τον Chapman. Η χρησιµοποίηση του ηλεκτροψεκασµού για ιονισµό δειγµάτων στη φασµατοµετρία µαζών έγινε από τον Dole et al. στα τέλη του 13

1960. Η δουλειά αυτή καθόρισε της βασικές πειραµατικές παραµέτρους, και είχε ως αποτέλεσµα τον ιονισµό δειγµάτων µεγάλης µάζας. Η πιο σηµαντική ανακάλυψη ήταν το φαινόµενο πολλαπλών φορτιών. Το 1980, οι Fenn και Mann et al. ανέπτυξαν την µέθοδο φασµατοµετρίας µαζών µε ιονισµό ηλεκτροψεκασµού (ESI-MS) όπως είναι σήµερα γνωστή. Η παραγωγή ιόντων από εξάτµιση φορτισµένων σταγονιδίων επιτυγχάνεται µέσω ψεκασµού. Είναι µια από τις τεχνικές ιονισµού ατµοσφαιρικής πίεσης (atmospheric pressure ionization, API) και άρχισε να χρησιµοποιείται στις αρχές του 1990. Το δείγµα διαλύεται και περνάει µέσα από ένα λεπτό ανοξείδωτο ατσάλινο τριχοειδές. Στην άκρη του τριχοειδούς υπάρχει ατµοσφαιρική πίεση και εφαρµόζεται και ένα δυναµικό. Το υψηλό δυναµικό δηµιουργεί ένα ηλεκτροστατικό ψεκασµό φορτισµένων σταγονιδίων που έχουν όλα την ίδια πολικότητα και περιέχουν το δείγµα. Κατά τη διαδικασία του ψεκασµού χρησιµοποιείται και η βοήθεια ενός ρεύµατος αέριου αζώτου που κινείται µέσα σε ένα σωλήνα παράλληλα µε το κεντρικό τριχοειδές. Ο διαλύτης εξατµίζεται, το µέγεθος του σταγονιδίου ελαττώνεται και η συγκέντρωση φορτίου στην επιφάνεια του σταγονιδίου αυξάνεται. Τελικά, το σταγονίδιο εκρήγνυται και δηµιουργεί µικρότερα, χαµηλότερου φορτίου σταγονίδια. Εικόνα 5: Σχηµατικό διάγραµµα µιας τυπικής πηγής ηλεκτροψεκασµού (http://wwwmethods.ch.cam.ac.uk/meth/ms/). 14

Η διαδικασία συνεχίζεται µέχρι να σχηµατιστούν µεµονωµένα φορτισµένα ιόντα. Σχηµατική αναπαράσταση της τεχνικής εµφανίζεται στην Εικ. 5. Τα ιόντα σε αέρια φάση περνάνε σε υψηλό κενό για ανάλυση των µαζών. Ο ηλεκτροψεκασµός θεωρείται µια ιδιαίτερα ήπια τεχνική ιονισµού γιατί τα µόρια που παράγονται, υφίστανται µικρό κατακερµατισµό ακόµα και αν είναι πολύ πολικά και θερµικά ασταθή. Είναι κατάλληλη για συστατικά παρόµοια µε αυτά που χρησιµοποιούνται στην τεχνική MALDI, αλλά µε µειωµένη ευαισθησία. Είναι επίσης κατάλληλη για διασύνδεση µε τεχνικές χρωµατογραφίας, όπως high performance liquid chromatography (HPLC), capillary zone electrophoresis (CZE) και capillary electrochromatography (CEC). Ο ιονισµός µε νανοψεκασµό (nanospray ionisation, nano-esi) είναι η ίδια τεχνική µε τον ηλεκτροψεκασµό, µόνο που χρησιµοποιείται µικρότερος ρυθµός ροής (Wilm & Mann, 1996). Μια κοινή εφαρµογή αυτής της τεχνικής χρησιµοποιείται για εύρεση µοριακών βαρών των συστατικών πρωτεΐνης και περαιτέρω ανάλυση κάθε συστατικού µε πολλαπλές φασµατοµετρίες µάζας (MS-MS). Με αυτή την τεχνική βελτιώνεται η ευαισθησία. Λόγο της δυνατότητάς της να διατηρείται για αρκετό χρόνο επιτρέπει επιλογή σχετιζόµενων κορυφών και καταγραφές υψηλής ποιότητας µέσω MS-MS. Το µειονέκτηµα είναι ότι δεν επιτρέπει απευθείας σύνδεση µε LC, παρόλο που δίνονται κάποιες εναλλακτικές λύσεις. Μικροψεκασµός χρησιµοποιείται επίσης για in vivo µελέτες µεταβολισµού σε εγκεφάλους ποντικιών (Roepstorff, 1997). 4. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Η µελέτη πολικών συστατικών ήταν πάντοτε πρόβληµα για τη φασµατοµετρία µαζών. Βρέθηκε στις αρχές της δεκαετίας του 1960 ότι η ακτινοβολία οργανικών δειγµάτων µικρής µάζας µε παλµούς ακτίνων λέιζερ (laser pulse) µεγάλης έντασης, παράγει ιόντα των οποίων η µάζα µπορεί να αναλυθεί. Πάνω σε αυτή την αρχή δηµιουργήθηκε η τεχνική Laser Desorption (LD). Η τεχνική LD απαιτεί τη µεταφορά ενέργειας από τη δέσµη λέιζερ στον αναλύτη σε όσο το δυνατόν λιγότερο χρόνο, ώστε να αποφευχθεί διάσπαση των µορίων. Όσων αφορά τα όρια µεγέθους µάζας προς ανάλυση, εξαρτώνται 15

από την ενέργεια που χρειάζεται για να προκαλέσει ηχηρή διέγερση και την ενέργεια µεταφοράς που πρέπει να είναι µεγαλύτερη από την ενέργεια διαχωρισµού του αναλύτη. Άλλος ένας περιορισµός είναι ο µικρός χρόνος µεταξύ διάσπασης και του παλµού του λέιζερ. Το 1987 βρέθηκε ότι η χρήση µιας µήτρας στην τεχνική LD µπορούσε να οδηγήσει σε αποφυγή του περιορισµού λόγο µεγέθους µάζας. Η µήτρα απαιτεί ισχυρή απορρόφηση µήκους κύµατος του λέιζερ αν η µάζα δεν είναι αρκετά µεγάλη. Μια µικρή συγκέντρωση του αναλύτη εξαπλώνεται οµοιόµορφα στη στερεή ή υγρή µήτρα και τοποθετείται σε µια µεταλλική πλάκα για να εκτεθεί στον παλµό της δέσµης λέιζερ (Εικ. 6). Η µικρή συγκέντρωση του αναλύτη έχει το πλεονέκτηµα ότι αυξάνει την ικανότητα µεταφοράς ενέργειας από το λέιζερ στον αναλύτη (µήτρα), ενώ προβλήµατα που σχετίζονται µε το διαχωρισµό του αναλύτη µειώνονται. Εικόνα 6: Σχηµατική αναπαράσταση της µεθόδου MALDI (http://wwwmethods.ch.cam.ac.uk/meth/ms/). 16

Πιο αναλυτικά, στην τεχνική MALDI ακολουθούνται τα εξής βήµατα: (i) Ο σχηµατισµός ενός «στερεού διαλύµατος» (κρυσταλλικού). Τα µόρια προς ανάλυση απλώνεται στη µήτρα έτσι ώστε να είναι εντελώς αποµονωµένα το ένα από το άλλο. (ii) Διέγερση της µήτρας. Το γεγονός ότι ενέργειας λέιζερ στο στερεό διάλυµα απορροφάται από τη µήτρα, προκαλεί γρήγορη παλµική διέγερση, µε αποτέλεσµα τον κατακερµατισµό στο στερεό διάλυµα. Φτιάχνονται έτσι οµάδες που αποτελούνται από µεµονωµένα µόρια και περιβάλλονται από ουδέτερα και διεγερµένα µόρια της µήτρας. Τα µόρια της µήτρας εξατµίζονται από τις οµάδες αφήνοντας τα διεγερµένα µόρια προς ανάλυση. (iii) Ιονισµός του αναλύτη. Τα µόρια προς ανάλυση µπορούν να ιονιστούν µε απλή πρωτονίωση. Αρνητικά φορτισµένα ιόντα σχηµατίζονται µε αποπρωτονίωση του αναλύτη. Αυτές οι αντιδράσεις ιονισµού γίνονται αµέσως µετά την ακτινοβόληση. Είναι µια τεχνική κατάλληλη για παρόµοια συστατικά που χρησιµοποιούνται στην τεχνική FAB, αλλά έχει πολύ µεγαλύτερη ευαισθησία (100-1000 φορές καλύτερη) και δεν έχει περιορισµούς στα όρια µάζας. Η ανάλυση των δισουλφιδικών δεσµών έχει αναπτυχθεί ιδιαίτερα λόγο την ανάπτυξης των µεθόδων MALDI και ηλεκτροψεκασµού (ESI) (Jeffrey et al., 2002). Άλλες τεχνικές ιονισµού είναι οι: field ionisation, field desorption, thermospray/plasmaspray και particle beam. ΑΝΑΛΥΤΗΣ ΜΑΖΑΣ (MASS ANALYZERS) Ο διαχωρισµός µαζών είναι το κρισιµότερο στάδιο στην πορεία µιας ανάλυσης και έχουν αναπτυχθεί µέθοδοι διαχωρισµού που διαφέρουν ως προς τα χαρακτηριστικά τους, τις δυνατότητες και τους περιορισµούς τους. Γενικά, δεν φαίνεται να υπάρχει µία µέθοδος διαχωρισµού µαζών που να είναι εξ' ίσου αποτελεσµατική σε όλες τις εφαρµογές της ανάλυσης µε φασµατογραφία µάζας. 17

Ο σκοπός του φίλτρου µαζών είναι ο διαχωρισµός δέσµης ιόντων σύµφωνα µε την µοριακή τους µάζα σε σχέση µε µια δέσµη ιόντων µε παρόµοιας µάζας (ταξινοµούνται µε βάση το λόγο µάζας προς φορτίο) και η επιλογή των ιόντων µε µάζα σε συγκεκριµένη περιοχή έχοντας τη δυνατότητα να µεγιστοποιεί τις διαχωρισµένες εντάσεις (µε διακριτική ικανότητα συνήθως 1 amu) τα οποία συνεχίζουν την πορεία τους στον ανιχνευτή ιόντων. Τα ταξινοµηµένα µε βάση τη µάζα ιόντα, ανιχνεύονται από έναν πολλαπλασιαστή ηλεκτρονίων και το σήµα που προκύπτει στέλνεται σε ένα σύστηµα δεδοµένων για επεξεργασία. Η λειτουργία του αναλυτή µάζας είναι ανάλογη µε αυτή του πλέγµατος στον οπτικό φασµατογράφο (optical spectrometer). Στη φασµατοµετρία µαζών, ο σκεδασµός (dispersion) βασίζεται στο λόγο µάζας προς φορτίο των ιόντων και όχι στο µήκος κύµατος των πρωτονίων. Τα φασµατόµετρα µαζών κατηγοριοποιούνται µε βάση τον τύπο του αναλυτή µάζας στο όργανο. Τα ιόντα που παράγονται απωθούνται εκτός της πηγής ιόντων και επιταχύνονται προς την περιοχή της ανάλυσης. Παρόλο που παράγονται ταυτόχρονα και θετικά και αρνητικά ιόντα, επιλέγεται µια πολικότητα, και είτε θετικά είτε αρνητικά φορτισµένα ιόντα αναλύονται και καταγράφονται. Τα µόρια που δεν ιονίζονται και παραµένουν ουδέτερα, αποµακρύνονται και δεν ανιχνεύονται. Όλα τα φίλτρα µαζών βασίζονται στην εφαρµογή ηλεκτρικών και µαγνητικών πεδίων που επιδρούν στην κίνηση φορτισµένων σωµατιδίων (ιόντων). Στην πλειονότητα των περιπτώσεων τα παραγόµενα ιόντα είναι απλά φορτισµένα (z=1) και οι εξαιρέσεις (z > 1) πρέπει να αναζητηθούν σε µόρια µε πολύ χαµηλά δυναµικά ιονισµού (π.χ. θειούχες ενώσεις ή χηµικές ενώσεις βαρέων στοιχείων). Παρ όλα αυτά, η δηµιουργία ιόντων µε φορτίο z > 1 δεν συµβαίνει σε µεγάλο βαθµό και οι εντάσεις τους σε ένα φάσµα µάζας είναι µικρές. Συνήθως οι τύποι αναλυτών µάζας που χρησιµοποιούνται είναι: 18

1α. Μαγνητικό πεδίο (Magnetic sector) Η µέθοδος του µαγνητικού πεδίου (magnetic sector mass filter) είναι η πρώτη που χρησιµοποιήθηκε, η πιο δαπανηρή, αλλά µε τη µεγαλύτερη ακρίβεια. Είναι µια κλασσική µέθοδος διαχωρισµού και ανάλυσης µαζών. Τα ιόντα µετά την δηµιουργία τους εστιάζονται κατάλληλα µε «φακούς ιόντων» (ανοµοιογενή ηλεκτρικά πεδία που συγκλίνουν τις τροχιές των ιόντων) µε σκοπό την αύξηση της ευαισθησίας της µεθόδου και οδηγούνται σε ένα χώρο όπου µαγνητικό πεδίο συγκεκριµένης έντασης εφαρµόζεται κάθετα στην κατεύθυνση κίνησης των ιόντων. Τα ιόντα εισέρχονται στο µαγνητικό πεδίο έχοντας ευθύγραµµη οµαλή πορεία, και αναγκάζονται να ακολουθήσουν κυκλική τροχιά, της οποίας η ακτίνα εξαρτάται από τον λόγο m/z. Συνεπώς, αν ο ανιχνευτής βρίσκεται σε συγκεκριµένη θέση που αντιστοιχεί σε µία τροχιά µε συγκεκριµένη ακτίνα, µόνο τα ιόντα µε συγκεκριµένο λόγο m/z, ο οποίος ικανοποιεί την ανωτέρω ισότητα φθάνουν στον ανιχνευτή (Εικ. 7). Η σάρωση σε όλες τις επιθυµητές µάζες (ή ακριβέστερα τον λόγο m/z) γίνεται είτε µεταβάλλοντας την ένταση του µαγνητικού πεδίου ή µεταβάλλοντας το αρχικό δυναµικό επιτάχυνσης των ιόντων. Ο δεύτερος τρόπος έχει το πλεονέκτηµα της έλλειψης υστέρησης της µεταβολής του µαγνητικού πεδίου, όµως η ευαισθησία είναι σχετικά ανάλογη του λόγου m/z. Η αναπόφευκτη θερµική κίνηση των ιόντων προκαλεί µία µείωση της θεωρητικά άπειρης διακριτικής ικανότητας, η οποία µπορεί να βελτιωθεί σηµαντικά µε την χρήση σχισµών (slits) οι οποίες τοποθετούνται πριν την είσοδο στο µαγνητικό πεδίο και περιορίζουν την είσοδο σε ιόντα που κινούνται σε συγκεκριµένη κατεύθυνση. Εικόνα 7: Διαχωρισµός µαζών µε τη χρήση µαγνητικού πεδίου. 19

Η αύξηση της διακριτικής ικανότητας συντελεί στη δυνατότητα διαχωρισµού ιόντων µε διαφορές µάζας της τάξεως των 0.01 amu. Επιπλέον, η µαγνητική µέθοδος διαχωρισµού µαζών χαρακτηρίζεται από εξαιρετικά καλή ευαισθησία, αναπαραγωγίσιµα φάσµατα µάζας, υψηλή δυναµική περιοχή (µεγάλη κλίµακα µαζών). Επίσης, µπορεί να εφαρµοστεί σε ποσοτικές αναλύσεις. Το σηµαντικότερο µειονέκτηµα της µεθόδου είναι το υψηλότατο κόστος. 1β. Ανάλυση Διπλής Εστίασης [Double Focussing (Sector) Analysis] Στη φασµατοµετρία µάζας διπλής εστίασης (Double focusing) χρησιµοποιείται ένας συνδυασµός µαγνητικών και ηλεκτρικών πεδίων που εστιάζει και διαχωρίζει ιόντα. Η διάταξη του οργάνου εµφανίζεται στην Εικ. 8, όπου ένα µαγνητικό πεδίο ακολουθείται από ένα ηλεκτρικό πεδίο. Τα ιόντα επιταχύνονται από την πηγή, λόγο της επιταχυνόµενης τάσης, και εισάγονται στον ηλεκτροστατικό αναλυτή, που λειτουργεί ως συσκευή εστίασης ενέργεια (energy focusing device). Υπάρχει µια σχισµή που ενεργεί ως φίλτρο και επιλέγει µια συγκεκριµένη τιµή m/z. Το ηλεκτρικό πεδίο εστιάζει τα ιόντα µε βάση διαφορές στην κινητική τους ενέργεια τη στιγµή που εξέρχονται από την πηγή. Η «διπλή εστίαση» επιτρέπει ακόµα και το διαχωρισµό ιόντων ίδιας µάζας αλλά µε διαφορετικό χηµικό τύπο. Εικόνα 8: Φασµατοµετρία µαζών δύο πεδίων (ηλεκτροστατικό/µαγνητικό) 20

Παρόλο που έχουν δηµιουργηθεί νέες τεχνικές, φτηνότερες και πολύ πιο εξειδικευµένες, η ανάλυση µε πεδία συνεχίζει να είναι ιδιαίτερα σηµαντική για την υψηλή ανάλυση µαζών, ιδιαίτερα φορτισµένων ιόντων µεγάλης µάζας, κάτι που µέχρι σήµερα δεν είναι τόσο εύκολο µε τις άλλες τεχνικές. 2. Τετραπολικός αναλυτής µαζών (Quadrupole Mass Analyser) Αποτελεί µία από τις νεώτερες µεθόδους διαχωρισµού µαζών, οικονοµικότερη σε σχέση µε τη χρήση µαγνητικού φίλτρου µαζών, µε αποτέλεσµα την ευρύτερη χρήση της. Το τετραπολικό φίλτρο µαζών, το οποίο αποτελείται από τέσσερις παράλληλους πόλους ή ράβδους. Ο διαχωρισµός µαζών βασίζεται στην κίνηση των ιόντων που επιτυγχάνεται µε την υπέρθεση ενός εναλλασσόµενου ηλεκτρικού πεδίου µε συχνότητα στην περιοχή των ραδιοκυµάτων (RF, radiofrequency), σε ένα συνεχές (DC) ηλεκτρικό πεδίο. Το DC-RF πεδίο εφαρµόζεται στις τέσσερις παράλληλες ράβδους, όπως δείχνεται στην Εικ. 9. Τα ιόντα µε κατεύθυνση παράλληλη στις ράβδους, αναγκάζονται να κινηθούν σε µία τροχιά ταλάντωσης ανάµεσα στους άξονες Χ και Υ. Όταν το πλάτος της ταλάντωσης του ιόντος παραµένει σταθερό στο χρόνο, η τροχιά χαρακτηρίζεται ως σταθερή, ενώ αν το πλάτος της ταλάντωσης αυξάνει µε την πάροδο του χρόνου, η τροχιά χαρακτηρίζεται ως ασταθής. Όπως είναι προφανές, µία σταθερή τροχιά έχει σαν αποτέλεσµα την δίοδο ενός ιόντος διαµέσου του χώρου καθ' όλο το µήκος των ράβδων, ενώ αντίθετα, αν η τροχιά είναι ασταθής, το ιόν τελικά προσκρούει πάνω στις ράβδους, εξουδετερώνεται και δεν κατορθώνει να φτάσει στον ανιχνευτή (που βρίσκεται στο άλλο άκρο των ράβδων). Συνεπώς µόνο ιόντα µε συγκεκριµένη m/z κατορθώνουν να φτάσουν στον ανιχνευτή. Η µάζα m είναι ανάλογη του V και διακριτική ικανότητα µπορεί να ρυθµιστεί µε την µεταβολή του U. Επιπλέον, λόγω της θερµικής κίνησης των ιόντων, η ανεξαρτησία της διακριτικής ικανότητας από την µάζα ισχύει µόνο για επαρκή χρόνο παραµονής στο τετραπολικό πεδίο και αρκετά στενή κατανοµή ταχυτήτων στον άξονα Ζ. 21

Εικόνα 9: Τετραπολικός αναλυτής µαζών Η διαπερατότητα των ιόντων δια µέσου του τετραπολικού φίλτρου µειώνεται µε την αύξηση της διακριτικής ικανότητας (αύξηση του U). Η σάρωση της κλίµακας µαζών συνήθως γίνεται είτε µε µεταβολή της κυκλικής συχνότητας ω, ή µε παράλληλη µεταβολή των εντάσεων των πεδίων U και V (amplitude), κρατώντας τον λόγο U/V σταθερό. Τα πλεονεκτήµατα του τετραπολικού φίλτρου µαζών είναι το µικρό κόστος και η αναπαραγωγισιµότητα των λαµβανοµένων φασµάτων µάζας. Μειονεκτήµατα του είναι η χαµηλή διακριτική ικανότητα (1 amu) και η εξάρτηση της διαπερατότητας ενός ιόντος από την µάζα του. Οι τετραπολικοί φασµατογράφοι µάζας χρησιµοποιούνται ευρέως σε χηµικές αναλύσεις και συνήθως χρησιµοποιούνται µετά από αέρια χρωµατογραφία (Gas Chromatography, GC) µε την οποία επιτυγχάνεται διαχωρισµός των συστατικών ενός µίγµατος, για ευκολότερη ταυτοποίηση κάθε συστατικού. 22

3. Ανάλυση µε χρήση τετραπολικής παγίδας ιόντων (Ion Trap Analysis) Ανάλυση µε χρήση τετραπολικής παγίδας ιόντων λειτουργεί µε παρόµοιο τρόπο µε το τετραπολικό φίλτρο µάζας, µόνο που δεν λειτουργεί ως φίλτρο. Η παγίδα ιόντων καταχωρεί τα ιόντα για επόµενα πειράµατα και ανάλυση. Χρησιµοποιεί πεδία που παράγονται από τάσεις συχνοτήτων στην περιοχή των ραδιοκυµάτων RF (ή από συνεχές DC ηλεκτρικό πεδίο) που εφαρµόζονται στα ηλεκτρόδια τα οποία έχουν µια συγκεκριµένη διάταξη. Εικόνα 10α: Παγίδα ιόντων (http://www-methods.ch.cam.ac.uk/meth/ms/). Υπάρχει ένας δακτύλιος ηλεκτροδίων στη µέση µε δύο επιφάνειες ηλεκτροδίων να τον σκεπάζουν και από τις δύο πλευρές (εισόδου και εξόδου). Τα ιόντα που παράγονται µπαίνουν στην παγίδα από την επιφάνεια του ηλεκτροδίου εισόδου. Για επιλεγµένα όρια λόγου µάζας προς φορτίο, που καθορίζονται από τις τάσεις που εφαρµόζονται, η συσκευή παγιδεύει ιόντα στο χώρο που έχουν σχηµατίσει τα ηλεκτρόδια (Εικ. 10α). Τα ιόντα µένουν εκεί παγιδευµένα µε µια σταθερή τροχιά ταλάντωσης. Η ταλάντωση εξαρτάται από το δυναµικό παγίδευσης και το λόγο µάζας προς φορτίο των ιόντων. Κατά τη διάρκεια της ανίχνευσης, το δυναµικό των ηλεκτροδίων µεταβάλλεται, προκαλώντας αστάθειες στην τροχιά των ιόντων, εξωθώντας τα µε βάση τον αυξανόµενο λόγο µάζας προς φορτίο, από την επιφάνεια ηλεκτροδίου εξόδου. Στις Εικ. 10β και 10γ παρουσιάζεται πραγµατική φωτογραφία µεθόδου διαχωρισµού µαζών ion trap (Φλέµινγκ, 2002). 23

Εικόνα 10β: Παγίδα ιόντων (Φλέµινγκ, 2002). Εικόνα 10γ: Παγίδα ιόντων (Φλέµινγκ, 2002). 4. Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR) Είναι ίσος το πιο περίπλοκο όργανο ανάλυσης. Στο φασµατόµετρο FT-ICR τα ιόντα είναι παγιδευµένα ηλεκτροστατικά µέσα σε ένα κυβικό κελί σε ένα σταθερό µαγνητικό πεδίο. Μια οµοιοπολική τροχιακή κίνηση («cyclotron») προκαλείται από την εφαρµογή µιας παλµικής ραδιοσυχνότητας µεταξύ των επιφανειών διέγερσης. Τα ιόντα βρίσκονται σε µια τροχιά και παράγουν ένα εξασθενηµένο σήµα στις επιφάνειες ανίχνευσης του κελιού. Η συχνότητα του σήµατος από κάθε ιόν είναι ίση µε την τροχιακή συχνότητα της, η οποία είναι στη συνέχεια αντιστρόφως ανάλογη προς την τιµή m/z. Η ένταση του σήµατος κάθε συχνότητας είναι ανάλογη προς τον αριθµό ιόντων που έχουν τη συγκεκριµένη τιµή m/z. Το σήµα ενισχύεται, υπολογίζονται τα συστατικά συχνοτήτων 24

και φτιάχνεται το φάσµα µαζών. Εάν η πίεση στο κελί είναι πολύ χαµηλή, η τροχιακή κίνηση ιόντων µπορεί να διατηρηθεί για πολλούς κύκλους και η συχνότητα µπορεί να µετρηθεί µε µεγάλη ακρίβεια. Το όργανο εποµένως µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την παραγωγή φασµάτων υψηλής ανάλυσης (Εικ. 11). Εικόνα 11: Σχηµατική αναπαράσταση παγίδευσης, διέγερσης και ανίχνευση ιόντος για την παραγωγή φάσµατος µάζας στη φασµατοµετρία µαζών FT-ICR. Πλέον είναι εφικτός ο συνδυασµός ESI µε FTICR και ion trap. Το πλεονέκτηµα αυτής της ανάλυσης είναι η υψηλή διαχωριστικότητα και ευαισθησία που επιτρέπει πολλαπλές αντιδράσεις κατακερµατισµού (Roepstorff, 1997). 5. Χρόνος πτήσης (Time-of-Flight, TOF) Το φίλτρο µαζών µε την ονοµασία Time-of-flight διαχωρίζει ιόντα µε βάση το διαφορετικό χρόνο πτήσης τους για µια γνωστή απόσταση. Χρησιµοποιεί την εξάρτηση της ταχύτητας από την µάζα ενός ιόντος που κινείται σε χώρο απαλλαγµένο ηλεκτροµαγνητικών πεδίων. Το σχηµατιζόµενο ιόν επιταχύνεται µε συγκεκριµένη ταχύτητα, κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου δυναµικού, έτσι ώστε τα ιόντα µε παρόµοιο φορτίο να έχουν ίδια κινητική ενέργεια. Μετά την αρχική επιτάχυνση, το ιόν εισέρχεται σε χώρο που δεν υπάρχει ηλεκτρικό πεδίο, στον οποίο κινείται ευθύγραµµα και οµαλά µέχρι τον ανιχνευτή, σε έναν σωλήνας πτήσης, για συγκεκριµένο χρονικό διάστηµα. Όσο µικρότερη µάζα έχει το ιόν, τόσο µεγαλύτερη ταχύτητα και µικρότερο 25

χρόνο πτήσης θα έχει. Ο χρόνος πτήσης από την πηγή ιόντων µέσω του σωλήνας πτήσης στον ανιχνευτή, που µετριέται σε microseconds, µπορεί να µετασχηµατιστεί στην τιµή m/z. Στην ιδανική περίπτωση, όλα τα ιόντα που παράγονται θα φύγουν από την πηγή την ίδια χρονική στιγµή, µε την ίδια κινητική ενέργεια, λόγο επιτάχυνσης από την ίδια διαφορά δυναµικού. Συνήθως όµως, ο χρόνος πτήσης των ιόντων που παράγονται. εξαρτάται µόνο από τη µάζα και το φορτίο των παραγόµενων ιόντων. Για να παραχθεί ένα αξιόπιστο φάσµα µαζών, πρέπει να είναι γνωστός µε µεγάλη ακρίβεια ο χρόνος εκκίνησης του ιόντος από την πηγή ιονισµού. Είναι προφανές ότι η δηµιουργία ιόντων και η τελική ανίχνευση τους δεν είναι δυνατόν να πραγµατοποιείται µε συνεχή τρόπο, αλλά µόνο µε την µορφή παλµών. Ως εκ τούτου, η τεχνική συνιστάται στην χηµική ανάλυση διαδικασιών που εκτελούνται παλµικά (φωτοδιάσπαση και απόξεση επιφανειών, µε παλµικό laser), για παράδειγµα, MALDI. Η φασµατοµετρία µε χρήση MALDI-TOF είναι η πιο απλή µορφή αναλυτή µαζών και προσφέρει υψηλή ευαισθησία και γρήγορη ανίχνευση. Δύο παράγοντες που συµβάλλουν στην διάδοση ενέργειας των ιόντων στο σηµείο ανίχνευσης, φαίνονται να είναι αρµόδιοι για την υψηλή ανάλυση. Ένας είναι η ανοµοιογένεια στο στρώµα δειγµάτων και οι άλλες συγκρούσεις µεταξύ των ιόντων και της µήτρας κατά τη διάρκεια επιτάχυνσης στη διαστελλόµενη στήλη. Η κατασκευή οµοιογενούς, λεπτού στρώµατος µήτρα οδήγησε στη βελτιωµένη διαχωριστική ικανότητα. Ο διαχωρισµός έγινε ακόµη καλύτερος λόγο της εισαγωγής της παλλόµενης εξαγωγής ιόντων, που γενικά ονοµάζεται καθυστερούµενη εξαγωγή (delayed extraction, DE). Η DE µειώνει τον αριθµό και την ενέργεια των συγκρούσεων στη διαστελλόµενη στήλη. Ο κατακερµατισµός έγινε επίσης περισσότερο αποδοτικός, και η ανάλυση πεπτιδίων έγινε καλύτερη, συνδυάζοντας ανάλυση ion trap και TOF είτε παγιδεύοντας και κατακερµατίζοντας τα ιόντα στην παγίδα ιόντων και αναλύοντας τις µάζες των κατακερµατισµένων ιόντων µε χρήση τεχνικής TOF, είτε φορτώνοντας τα ιόντα στο ion trap ώστε να γίνει εκεί και ο κατακερµατισµός και η ανάλυση (Roepstorff, 1997). Επίσης ο συνδυασµός νανοηλεκτροψεκασµού µε TOF υπόσχεται ανάλυση µε ακόµη µεγαλύτερη ευαισθησία. 26

Εικόνα 12: Σχηµατική αναπαράσταση του φίλτρου µαζών Time-of-flight. ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ (DETECTORS) Τα ιόντα διαχωρίζονται στον αναλυτή (mass analyzer) µε βάση το λόγο µάζας προς φορτίο και µετά συλλέγονται από έναν ανιχνευτή (detector). Ο ανιχνευτής ιόντων συλλαµβάνει τα προσπίπτοντα ιόντων και τα µετατρέπει σε ανάλογο ηλεκτρικό ρεύµα. Υπάρχουν µεταγωγείς (transducers) που µετατρέπουν τη δέσµη των ιόντων σε ένα ηλεκτρικό σήµα. Το σύστηµα δεδοµένων επεξεργάζεται το µέγεθος των ηλεκτρικών σηµάτων, το ψηφιοποιεί, το αποθηκευεί στη µνήµη ενός υπολογιστή, και παρουσιάζει το φάσµα των µαζών. Τα αποτελέσµατα εµφανίζονται σε ένα γράφηµα σχετικής έντασης ως προς το λόγο µάζας προς φορτίο κατά τη διάρκεια µιας ελεγχόµενης ανίχνευσης των µαγνητικών ή ηλεκτρικών πεδίων. Το µέγεθος των κορυφών σχετίζεται µε την ύπαρξη ιόντων και κατακερµατισµένων ιόντων που παράγονται. Οι κορυφές κανονικοποιούνται, η πιο έντονη κορυφή στο φάσµα ονοµάζεται µητρική κορυφή (base peak) και αντιστοιχεί στο µοριακό βάρος του µορίου. Με βάση αυτή την κορυφή που χρησιµοποιείται ως αναφορά, υπολογίζεται το ύψος κάθε κορυφής. Βοηθάει στην ταυτοποίηση των πιθανών µοριακών τύπων των υπολοίπων κορυφών, καθώς και την µέτρηση των µεταξύ τους διαφορών µάζας. Στη µητρική κορυφή, ανατίθεται αυθαίρετα ένα µέγιστο ύψος 100 27

(µερικές φορές 1000). Επίσης υπολογίζεται για κάθε κορυφή η τιµή µάζα προς φορτίο (m/z). Αυτή η ανάθεση βασίζεται συνήθως στο χρόνο εµφάνισης των κορυφών και το ρυθµό ανίχνευσης. Η µετατροπή σε m/z χρειάζεται ιδιαίτερη προσοχή. Οι κορυφές είναι συνήθως πολύ έντονες και συχνά παρουσιάζονται σαν κατακόρυφες γραµµές. Το φάσµα µπορεί να συγκριθεί µε µια βιβλιοθήκη φασµάτων ώστε να ταυτοποιηθούν τα συστατικά µε βάση το πρότυπο κατακερµατισµού και το λόγο των κορυφών. Συνήθως η µητρική κορυφή αντιστοιχεί στο ισοτοπικά "ελαφρύτερο" ιόν, εκτός αν το θραύσµα περιέχει άτοµα στοιχείων (όπως τα B, Fe, Se, Hg), των οποίων τα πλέον άφθονα ισότοπα είναι εκείνα µε µεγαλύτερη µάζα. Η σχετική ένταση των ισοτοπικών κορυφών αποτελεί χρήσιµο µέσο ταυτοποίησης ιοντικών θραυσµάτων της ίδιας ονοµαστικής µάζας, που δεν µπορούν να διαχωριστούν παραπέρα µε φασµατογράφο µαζών χαµηλής διαχωριστικής ικανότητας. Η φασµατογραφία µάζας αποτελεί µία ποσοτική αναλυτική τεχνική µε µία συνεχώς ανανεούµενη ποικιλία µεθόδων ιονισµού, διαχωρισµού µαζών και ανίχνευσης ιόντων. Ένα χαρακτηριστικό ενός φάσµατος µαζών είναι ο πλούτος δοµικών στοιχείων που παρέχει Λόγω της µεγάλης ποσότητας πληροφοριών που µπορούν να παραχθούν και του µεγάλου αριθµού παραµέτρων που αλλάζουν σε µικρά χρονικά διαστήµατα,, απαιτείται γρήγορη απόκτηση και επεξεργασία της πληροφορίας αυτής. Οι υπολογιστές και οι µικροεπεξεργαστές είναι ουσιαστικοί για τον έλεγχο φασµατόµετρων µάζας και την απόκτηση φάσµατος, την αποθήκευση, το χειρισµό και την παρουσίαση των δεδοµένων. Διάφορες µεταβλητές των οργάνων ελέγχονται και επιτηρούνται κατά τη διάρκεια της συλλογής των δεδοµένων. Τα συστήµατα δεδοµένων που βασίζονται σε υπολογιστές περιλαµβάνουν το λογισµικό για τον ποσοτικό προσδιορισµό, την ερµηνεία των φασµάτων και τον προσδιορισµό συστατικών µέσω διαδικτύου µε τη χρήση βιβλιοθηκών που περιέχουν φάσµατα (Εικ. 13). 28

Εικόνα 13: Το σύστηµα δεδοµένων επεξεργάζεται το µέγεθος των ηλεκτρικών σηµάτων, και παρουσιάζει το φάσµα των µαζών (Φλέµινγκ, 2002). Μέθοδοι ανίχνευσης ιόντων Οι µέθοδοι ανίχνευσης ιόντων στηρίζονται στη δευτερογενή εκποµπή ηλεκτρονίων κατά τη σύγκρουση ηλεκτρονίων ή ιόντων σε επιφάνεια, κατάλληλα επιστρωµένη µε ειδικά υλικά ή πολωµένη σε πολύ υψηλό δυναµικό (kv). Συνήθως χρησιµοποιείται το "φαινόµενο χιονοστιβάδας" (avalanche effect), κατά το οποίο η αρχική εκποµπή ηλεκτρονίων δίνει αφορµή σε επιπλέον εκποµπή από πολλαπλές προσπτώσεις των δευτερογενώς παραγοµένων ηλεκτρονίων και την τελική ενίσχυση του ασθενέστατου ρεύµατος των αρχικών ιόντων σε µετρήσιµο ρεύµα ηλεκτρονίων. Οι συνηθέστερες τεχνικές ανίχνευσης ιόντων είναι οι: Κύπελλο (cup) Faraday, Ηλεκτρονοπολλαπλασιαστής (Secondary Electron Multiplier, SEM), Ανιχνευτής Daly, Channeltron, Πλάκα µικροδιόδων (Microchannel plate). Η ευαισθησία του Faraday cup είναι σχετικά µικρή, µε σηµαντικό πλεονέκτηµα το χαµηλό κόστος. Η SEM έχει καλή ευαισθησία αλλά σχετικά υψηλό κόστος. Η Πλάκα µικροδιόδων έχει µεγάλη ευαισθησία, ενώ η δυνατότητα κατασκευής µεγάλης επιφάνειας από πολλές οπές τριχοειδών επιτρέπει την χρήση του σε συστήµατα µέτρησης πολλών µαζών ταυτόχρονα 29

(multichannel detector, focal plane array detectors) σε συνδυασµό µε φίλτρο µαζών µαγνητικού πεδίου. ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΙ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗΣ Η φασµατοµετρία µαζών (MS) χρησιµοποιείται ως ανιχνευτής για τεχνικές διαχωρισµού όπως η Αέρια Χρωµατογραφία (gas chromatography, GC), η υγρή χρωµατογραφία (liquid chromatography, LC) ή η capillary ηλεκτροφόρηση λόγο της µεγάλης της ευαισθησίας και της ικανότητάς της να αναγνωρίζει χηµικές ενώσεις. Σε αυτό το συνδυασµό περιλαµβάνονται συνήθως και τεχνικές ιονισµού. Επίσης χρησιµοποιείται ο συνδυασµός δύο ή περισσότερων ίδιων σταδίων ανάλυσης µαζών. GC-MS Χρησιµοποιείται για πτητικά, µη-πολικά δείγµατα. Το δείγµα εισάγεται στη στήλη της αέριας χρωµατογραφίας (Gas chromatography, GC) και από εκεί περνάει στην πηγή των ιόντων. Τα συστατικά διαχωρίζονται την ώρα που περνούν από τη στήλη στην πηγή ιόντων. Η σύνδεση αυτή επιτρέπει τον διαχωρισµό και τον περαιτέρω προσδιορισµό συστατικών µιγµάτων υψηλής πολυπλοκότητας µε µεγάλο βαθµό βεβαιότητας. LC-MS Τα δείγµατα διαλύονται σε κατάλληλο διαλύτη και το διάλυµα εισάγεται στο φασµατογράφο µαζών µε µια κατάλληλη αντλία [π.χ., υγρή χρωµατογραφία υψηλής πίεσης (HPLC), Εικ. 14]. Το υγρό ψεκάζεται ώστε να φτιαχτούν σταγονίδια τα οποία περνώντας από µια σειρά διαδικασιών θα αφαιρέσουν το διαλύτη και θα µείνουν στερεά σωµατίδια (δείγµα) που θα ιονιστούν. 30

Εικόνα 14: Εισαγωγή δείγµατος στο φασµατογράφο µαζών µε µια κατάλληλη αντλία HPLC (Φλέµινγκ, 2002) Σε τεχνικές όπως GC/MS, LC/MS ή και άλλους συνδυασµούς, τα δεδοµένα αποτελούντα από µια σειρά φασµάτων µάζας που παίρνονται ανά τακτά χρονικά διαστήµατα κατά τη διάρκεια της χρωµατογραφίας. Αρχικά συγκεντρώνονται οι εντάσεις όλων των ιόντων για κάθε φάσµα και το σύνολο αυτό σχεδιάζεται δίνοντας όλα τα ιόντα της χρωµατογραφίας (total ion chromatogram, TIC) όπως φαίνεται στην Εικ. 15. Η τεχνική αυτή εµφανίζει συγκεκριµένα συστατικά ενός πολύπλοκου µείγµατος, χωρίς να χρειάζεται εξέταση µεµονωµένων φασµάτων µάζας. Είναι συνεπώς ένα εξαιρετικά δυνατό εργαλείο ανάλυσης για αναγνώριση και ποσοτικοποίηση χηµικών ενώσεων. Η φασµατοµετρία µαζών παρέχει οριστικό προσδιορισµό συστατικών, κάτι που δεν µπορεί να γίνει µε τεχνικές GC-PID, GC-FID, ή GC-ECD. Όταν τα δείγµατα που βγαίνουν από τη φασµατοµετρία µαζών εισάγονται σαν δείγµατα εισόδου σε άλλες µεθόδους όπως gas chromatography (GC), high performance liquid chromatography (HPLC) ή capillary electrophoresis (CE), χρειάζονται ειδικές συνδέσεις ώστε να αποφευχθεί υπερφόρτωση αερίων. 31

Εικόνα 15: Σχηµατική αναπαράσταση του TIC σε συνδυασµό τεχνικών. Φασµατοµετρία µαζών δύο σταδίων ή πολλαπλών σταδίων (Tandem or multi stage mass spectrometry, MS/MS) Ο συνδυασµός δύο ίδιων σταδίων ανάλυσης µαζών (MS/MS) µπορεί να είναι πολύ χρήσιµος στον προσδιορισµό συστατικών σε σύνθετα µίγµατα και στον καθορισµό δοµών άγνωστων ουσιών. Επιλέγονται ιόντα συγκεκριµένης τιµής m/z στο πρώτο στάδιο ανάλυσης και τα παραγόµενα ιόντα περνάνε στο δεύτερο στάδιο για περαιτέρω ανάλυση (Εικ. 16). Η µεταφορά από το πρώτο στάδιο στο δεύτερο απαιτεί τον ενδιάµεσο κατακερµατισµό των επιλεγµένων ιόντων. Το ιόντα συγκρούονται µέσα σε ένα ειδικό κελί µε τη βοήθεια ενός αδρανούς αερίου. Ο διαχωρισµός των ιόντων είναι γνωστός και ως collision induced dissociation (CID). Αυτός ο συνδυασµός σταδίων έχει ιδιαίτερα σηµαντικές εφαρµογές. Υπάρχουν και µηχανήµατα που συνδυάζουν περισσότερα των δύο σταδίων και χρησιµοποιούνται για µελέτες δοµών και ακολουθιών. Ο συνδυασµός τριών ή και τεσσάρων αναλυτών έχουν δηµιουργηθεί, χωρίς να είναι απαραίτητα όλοι οι αναλυτές ίδιου τύπου. Τα πιο γνωστοί συνδυασµοί είναι quadrupole-quadrupole, magnetic sector-quadrupole, magnetic sector-magnetic sector, και πιο πρόσφατα quadrupole-time-of-flight. Στις περισσότερες περιπτώσεις οι µέθοδοι ιονισµοί είναι συγκεκριµένοι. 32

Εικόνα 16: Τεχνική MS/MS. Στην πρώτη ανάλυση γίνεται επιλογή ιόντων συγκεκριµένης τιµής m/z, ενώ στη δεύτερη ανάλυση γίνεται περαιτέρω ανάλυση των παραγόµενων ιόντων. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η φασµατοµετρία µαζών είναι µια ισχυρή µέθοδος ανάλυσης που χρησιµοποιείται για τον γρήγορο προσδιορισµό άγνωστων συστατικών, τον ποσοτικό προσδιορισµό γνωστών συστατικών σε µοριακό επίπεδο και τον καθορισµό δοµής και χηµικών ιδιοτήτων µορίων. Η ανίχνευση των συστατικών επιτυγχάνεται µε πολύ µικρές ποσότητες (10-12g, 10-15 moles συστατικού µάζας 1000 Daltons). Αυτό σηµαίνει ότι µπορούν να προσδιοριστούν συστατικά µε πολύ µικρές συγκεντρώσεις σε σύνθετα µίγµατα. Η µέθοδος προτιµάται και για το χαρακτηρισµό τροποποιήσεων στη δευτεροταγή δοµή στη φύση και για πρωτεΐνες που έχουν ανασυνδυαστεί. Χρησιµοποιείται επίσης και για εξόρυξη πληροφοριών σε σχέση µε την ακολουθία σε µελέτες πρωτεοµάτων και σε συνδυασµό µε άλλες τεχνικές µπορεί να χρησιµοποιηθεί για µελέτες σχετικά µε το δίπλωµα µιας πρωτεΐνης ή την τεταρτοταγή δοµή της. Σε µια κλασσική πρωτεοµική µελέτη, ένα σύνολο πρωτεϊνών αποµονώνονται (π.χ., µε ανοσοκατακρήµνιση) και ακολουθεί ένα βήµα διαχωρισµού (π.χ., µε ηλεκτροφόρηση πηκτωµάτων µιας ή δύο 33