Η «ενδιάμεση» επικράτεια της ζωής: Archaea Κωνσταντίνος Αρ. Κορμάς Τμήμα Γεωπονίας Ιχθυολογίας & Υδάτινου Περιβάλλοντος (www.apae.uth.gr) Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας (www.uth.gr) Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Μικροβιακή Βιοτεχνολογία» ΕΚΠΑ Αθήνα, 04122009 *Email: kkormas@uth.gr URL: http://kkormas.users.uth.gr
Περιεχόμενα Ορισμοί Χαρακτηριστικά και εξελικτική ιστορία Archaea Archaea από ψυχρά νερά και έδαφος Αrchaea από ακραία περιβάλλοντα: υδροθερμικές πηγές βαθιάς θάλασσας και χερσαίες θερμοπηγές Archaea και ιοί Βιοποικιλότητα των Archaea και άνθρωπος Βιοτεχνολογικές εφαρμογές των Archaea
Προτεινόμενες πηγές Άρθρα Chaban B, Ng SYM, Jarrell KF (2005) Archaeal habitats from the extreme to the ordinary. Can. J. Microbiol. 52:73116 DeLong EF (1998) Everything in moderation: Archaea as 'nonextremophiles'. Curr. Opin. Gen. Develop. 8:649654 Egorova K, Antanikian G (2005) Industrial relevance of thermophilic Archaea. Curr. Opin. Microbiol. 8:649655 Robertson CE, Harrin JK, Spear JS, Pace NR (2005) Phylogenetic diversity and ecology of environmental Archaea. Curr. Opin. Microbiol. 8:638642 Rother M, Metcalf WM (2005) Genetic technologies for Archaea. Curr. Opin. Microbiol. 8:745 751 Koonin EV (2006) Big time for small genomes.genome Res. 7:418421 Βιβλία Cavicchioli R (ed) (2007) Archaea. Molecular and cellular biology. ASM Press, Washington DC Klenk HP, Garrett R (eds) (2007) Archaea: evolution, physiology, and molecular biology. Blackwell Publishing, Malden, MA Friend T (2007) The third domain. The untold story of Archaea and the future of biotechnology. Joseph Henry Press, Washington, D.C. Staley JT, Reysenbach AL (2002) Biodiversity of microbial life. Foundation of earth's biosphere. WileyLiss, New York
Προτεινόμενες ιστοσελίδες... Ιστοσελίδες ArchaeaWeb: www.archaea.unsw.edu.au/ Tree of Life: http://tolweb.org/tree/phylogeny.html International Society for Microbial Ecology: www.microbes.org/ Microbe Zoo: commtechlab.msu.edu/sites/dlcme/zoo/
Στοιχεία της μικροβιακής ζωής Top 10 Reasons to be a Microbe: #10 - You're extremely cultured (L. acidophilus) #9 - Nobody cares if you have alternate lifestyles (mixotrophs) #8 - You can pass gas freely (methanogens) #7 - You can smell bad and nobody cares (sulfidogens) #6 - Consorting with others is encouraged (mats) #5 - Making alcohol won't get you arrested (fermenters) #4 - Even if life's the shits, you're happy! (E. coli) #3 - Sex is not only beneficial but encouraged (conjugation) #2 - You can lie in the sun all day (phototrophs) And the Number One Reason to be a Microbe: Your Main Function is to Multiply!
Könneke et al (2005)
Könneke et al (2005)
Archaea Ανακαλύφθηκαν στα τέλη της δεκαετίας του 1970 (Carl Woese) με τη σύγκριση αλληλουχίων 16S rrna γονιδίων από τις θερμοπηγές του Yellowstone, USA Μοιάζουν με Bacteria στο μικροσκόπιο αλλά διαφέρουν βιοχημικά και γενετικά Ιδιαίτερα κοινοί σε ακραία περιβάλλοντα (υπερθερμόφιλοι, αλόφιλοι, οξύφιλοι, κάτοχοι μοναδικών βιοχημικών διεργασιών)
Archaea vs. Bacteria... Χαρακτηριστικά Bacteria Archaea Λιπίδια κυτταρικού τοιχώματος Σύνθεση ΑΤΡ μέσω φωτός Χρωμόσωμα/τα Πυρηνική μεμβράνη Ιστόνες Αντιγραφή DNA Ισοπρενοειδή με εστερικό δεσμό σε γλυκερόλη Φωτοσύνθεση Τουλάχιστον ένα κυκλικό, σπάνια γραμμικό Απούσα Απούσες Ειδική Ισοπρενοειδή με αιθερικό δεσμό σε γλυκερόλη Κατλυτικό σύστημα βακτηριορουβερίνων (π.χ. βακτηριοροδοψίνη) Κυκλικό Απούσα Παρούσες Παρόμοια με αυτήν των Eukarya
...Archaea vs. Bacteria Χαρακτηριστικά mrna Ολοένζυμο RNA πολυμεράσης rrna Μεταγραφή Έναρξη μετάφρασης Bacteria Πιθανώς πολυσιστρονικό α 2 ββ σ 5S, 16S, 23S Ειδική (γενικώς ξεκινά με αποκαταστολή) Μέσω της αλληλουχίας Shine Delgarno Archaea Πιθανώς πολυσιστρονικό Μέχρι 13 υπομονάδες 5S, 16S, 23S Απλουστευμένος μηχανισμός, παρόμοιος με αυτόν των Eukarya Μερικές φορές μέσω της αλληλουχίας Shine Delgarno
Μικροβιακή εξέλιξη και βιοποικιλότητα Ασπόνδυλα Ευκαρυώτες Μακροσκοπικά φύκη Μικροσκοπικά φύκη Οξυγενή κυανοβακτήρια Περιβάλλον Προκαρυώτες Αερόβια βακτήρια Φωτοσυνθετικά βακτήρια Αναερόβια βακτήρια Οξυγονωμένο Ανοξικό Ποικιλότητα μορφών ζωής Βιολογική εξέλιξη Ετερότροφοι Προκαρυωτικά κύτταρα Αυτότροφοι (φωτοσυνθετικ οί) οργανισμοί Ευκαρυωτικά κύτταρα (εγγενής αναπαραγωγή Σχηματισμός Γης Χημική εξέλιξη 4.5 4.0 ισ. Χρόνια πριν από σήμερα 2.0 0.0
Το δέντρο της ζωής με τα κυριότερα εξελικτικά βήματα (από CavallierSmith (2002))
Από Stetter (2006) Υπερθερμόφιλοι
Φύλα Archaea Crenarchaeota Euryarchaeota Korarchaeota Υπερθερμόφιλοι, οξύφιλοι, κύκλος θείου, συμβιώτες ασπονδύλων Υπερθερμόφιλοι, αυτο και ετερότροφοι, μεθανογόνοι, αλόφιλοι, μεταβολισμό μετάλλων Obisidian Pool, Yellowstone National Park, USA, υπερθερμόφιλοι
Nanoarchaeota Huber et al (2002) Nature 417:6367 Υπερθερμόφιλοι (θαλάσσια υδροθερμική πηγή Ισλανδίας, 90ºC) Προσκλημμένο σε κύτταρα Ignicoccus sp. (απαραίτητη συνθήκη αύξησης: ο πρώτος υπερθερμόφιλος συμβιώτης Αρχαίων?) Σφαιρικά ~0,4 μmø Το μικρότερο γονιδίωμα Archaea μέχρι σήμερα: ~0,5 Μb(και πολύ κοντά σ αυτό του Mycoplasma genitalium = 0,58 Μb)
Nanoarchaeota Μεγάλη γενετική απόσταση από οποιοδήποτε γνωστό Αρχαίο Huber et al (2002) Nature 417:6367
Korarchaeota Εκπροσωπείται από λίγες αλληλουχίες 16S rrna και μόνο! «Εμφανίζεται» στη βάση του φυλογενετικού δένδρου (εφόσον συμπεριλαμβάνονται εκπρόσωποι των Eukarya) Ανακαλύφθηκαν στο Yellowstone, USA Απαντώνται σε παρόμοι περιβάλλοντα με υψηλές συγκεντρώσεις σιδήρου, ενώσεων θείου και πιθανώς υδρογόνου Σχηματίζουν δομές όπως αυτές των στροματολιτών
~300 αλληλουχίες
Crenarchaeota σε χαμηλές θερμοκρασίες... Ενδιαίτημα Group 1a Group 1b Group 1c Group 2 Group 3 Group 4 Θάλασσα Πλαγκτόν + Ψάρια + Ιζήματα + + Ασπόνδυλα + Εσωτερικά νερά Πλαγκτόν + Άλλα Ιζήματα + + + Βαθιά paleosol + + ασικά εδάφη + Αγροτικά εδάφη + Παράκτιο αλίπεδο + + + Ρυπασμένο έδαφος + Έδαφος ορυζώνων + + Αναερόβιος ζυμωτήρας +
...Crenarchaeota σε χαμηλές θερμοκρασίες... Σημαντικό μέρος της βιομάζας σε μερικά περιβάλλοντα, π.χ. Ανταρκτική 530% του ολικού πλαγκτικού rrna ή στην ανοιχτή θάλασσα >100 m αποτελούν το 2030% του ολικού πλαγκτικού rrna) Λιγότερο άφθονα σε πιο εύτροφα περιβάλλοντα από την ανοιχτή θάλασσα Λιγότερο άφθονα σε γλυκά νερά από τη θάλασσα Αφθονότερα στο οξικό μέρος λιμνών παρά στο ανοξικό
Οικοφυσιολογία Crenarchaeota... Κυρίως παραμένει άγνωστη... και κατά συνέπεια συμπεραίνεται από τους ελάχιστους γνωστούς καλλιεργημένους εκπροσώπους, οικολογικά δεδομένα και γονιδιωματική (ένας εκπρόσωπος από 200 m βάθος στη θάλασσα και ένας συμβιώτης θαλάσσιου σπόγγου)
...Οικοφυσιολογία Crenarchaeota Ενεργειακός μεταβολισμός: χημειολιθοτροφία (συμπεριλαμβανομένης της μεθανογένεσης), θείο και υδρογόνο Αερόβιος και αναερόβιος ετερότροφος μεταβολισμός πιο σπάνιος Φωτότροφος μεταβολισμός (αλλά όχι ως πρωτογενή παραγωγή) περιορίζεται στους αλόφιλους εκπροσώπους Περιορισμένος μεταβολισμός αζώτου Οι θερμόφιλοι εκπρόσωποι σχεδόν αποκλειστικά μεταβολίζουν αναερόβια το υδρογόνο και το θείο
...Οικοφυσιολογία Crenarchaeota Herfort et al (2007) Μεγαλύτερη αφθονία την άνοιξη και το καλοκαίρι. Επικράτηση μικρού μεγέθους φυτοπλαγκτικών κυττάρων σε σχέση με τα Euryarchaeota (επικράτηση το χειμώνα, φυτοπλαγκτικά κύτταρα >3μm) Συσχέτιση αφθονίας με αντίγραφα amoa Νιτροποιοί? Πιθανόν τα καταλαμβάνουν διαφορετικούς οικολογικούς θώκους στη θάλασσα
Cenarchaeum symbiosum Εξειδικευμένος συμβιώτης του θαλάσσιου σπόγγου Axinella mexicana Διαφορικό FISH Group 1a Μεταβολικώς ενεργός (κύτταρα υπό διπλασιασμό στους 10ºC) Περίπου 65% όλων των κυττάρων του σπόγγου έξοχο «φυσικό» εργαστήριο μελέτης των Crenarchaeota DAPI=κίτρινο, rrna=κόκκινο
Archaea σε υδροθερμικές πηγές βαθιάς θάλασσας
Archaea σε υδροθερμικές πηγές βαθιάς θάλασσας Kormas et al (2006)
Kormas et al (2006) Environ Microbiol
Stetter (2006)
Archaea στο έδαφος Ελάχιστα μελετημένα (σε σχέση με υδάτινα και ακραία συστήματα) Μεθανιογόνα στις ρίζες του ρυζιού (πιθανώς εμπλέκονται σε ζυμώσεις) Σε ορισμένες περιπτώσεις, κοινά μοριακά αποτυπώματα με θάλασσα (Crenarcahaeota κυρίως του Group 1) Οι μέχρι τώρα ενδείξεις, φανερώνουν μεγάλη πολυπλοκότητα των κοινωνιών των Αρχαίων στο έδαφος
Archaea από ελληνικές θερμοπηγές... Λαγκαδάς Ελευθερές Θερμοπύλες Αιδηψός Πολιχνίτος
Archaea από ελληνικές θερμοπηγές... 90 80 Temperature ( o C) 70 60 50 40 30 20 Vou Kri Lag Thp Thm Ele Pol Edi Kormas et al unpublished
Archaea από ελληνικές θερμοπηγές... Πολιχνίτος: : Η θερμότερη πηγή σε ευρωπαΐκό έδαφος 92 C 79 C Kormas et al unpublished
Archaea από ελληνικές θερμοπηγές... 1,000,000 900,000 800,000 Bacterial cells/ml 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 100,000 - Edi Pol Lag Ele Thp Thm Kri Vou Kormas et al unpublished
Archaea από ελληνικές θερμοπηγές... 60 No. of clones analysed 50 40 30 20 10 0 Archaea 0 50 100 150 200 250 Cumulative phylotype rank Pol Edi Ele Lag Kormas et al unpublished
Archaea από ελληνικές θερμοπηγές... 120 No. of clones analysed 100 80 60 40 20 Thp Archaea 0 0 500 1000 1500 2000 Cumulative phylotype rank
Archaea από ελληνικές θερμοπηγές... 4.0 3.5 Archaea Shannon diversity index H 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Pol Edi Thp Ele Lag Kormas et al (2009)
Archaea Crenarchaeota >> Euryarchaeota Kormas et al (2009)
Kormas et al (2009)
Archaea από ελληνικές θερμοπηγές... Νέα πρότυπα ποικιλότητας Archaea Η ποικιλότητα φαίνεται ότι δεν καθορίζεται κυρίως από τη θερμοκρασία αλλά μάλλον από τη διαθεσιμότητα υποστρωμάτων (ενέργεια και/ήάνθρακας) Δε φαίνεται να υπάρχει θετική ή αρνητική σχέση αφθονίας ποικιλότητας Ενδείξεις για ευρεία μεταφορά μικροοργανισμών στην υποεπιφάνεια (θαλάσσιοι υπερθερμόφιλοι βρέθηκαν σε χερσαίες πηγές, κοινοί φυλότυποι σε απομακρυσμένες μεταξύ τους πηγές, π.χ. Αιδηψός και Πολιχνίτος) Εξαίρετα συστήματα για προσπάθειες απομόνωσης ακαλλιέργητων μικροοργανισμών Kormas et al (2009)
Υπερθερμόφιλα Archaea και ιοί... Πρώτες μελέτες σε Euryarchaeota (υπεραλόφιλους και μεθανογόνους): κεφάλιουρά ιοί Myoviridae και Siphoviridae Μετέπειτα μελέτες σε υπερθερμόφιλα Crenarchaeota: συνήθεις μορφολογίες αλλά και νέες Μέχρι σήμερα: ~25 ιοί των γενών Sulfolobus, Acidianus (υπεροξύφιλοι), Pyrobaculum, Thermoproteus (υποχρεωτικώς αναερόβιοι) των Crenarchaeota
Υπερθερμόφιλα Archaea και ιοί... 12 έως 11 συστατικές πρωτεΐνες Πρωτεΐνες πρόσδεσης στο DNA: αντοχή σε ακραίες συνθήκες (έως 97ºC και ph 2) Λιπιδικός φάκελος: απλούστερα λιπίδια από αυτά των ξενιστών... Η μόλυνση συμβαίνει στη βέλτιστη θερμοκρασία αύξησης των ξενιστών (~80ºC) πραγματικοί υπερθερμόφιλοι ιοί (?) Ιοίοξύφιλωνγενώνείναιμηλυτικοίκαιοιιοίπαραμένουνστα θυγατρικά κύτταρα μετά την κυτταρική διαίρεση (προστασία?) Λίγα είναι γνωστά για το διπλασιασμό του DNA και τη μεταγραφή προσπάθεια αποσαφήνισής του μέσω γονιδιώματος
Υπερθερμόφιλα Archaea και ιοί... Η μοναδικότητα των πρωτεΐνών αντικατοπτρίζεται και στο γονιδίωμα τους Μέγεθος: κυκλικά (προηγούμενη κυτταρική ζωή?) 15 75 Kb ή γραμμικά 25 45 Kb Το τμήμα που κωδικοποιεί για τα ιικά συστατικά είναι εξελικτικώς σταθερό και το υπόλοιπο γονιδίωμα ποικίλει πολύ
Βιοποικιλότητα Archaea και άνθρωπος Οικοθέσεις στο ανθρώπινο σώμα: Euryarchaeota (μεθανογόνα): ούλα, κόλπος, κόπρανα (άφθονα με χαμηλή ποικιλότητα) Crenarcaheota: κόπρανα (Sulfolobus spp.) Ρόλος των Crenarchaeota(?) σχετίζεται με παθολογικές καταστάσεις (π.χ. περιοδοντίτιδα) προάγει την ανθρώπινη υγεία (?) μάλλον αυτόχθονοι του ανθρώπινου πεπτικού (βρέθηκε σε άτομα με διαφορετικές δίαιτες)
Archaea και περιοδοντίτιδα [Lepp et al (2004)] Έχει επιβεβαιωθεί η ύπαρξη μεθανογόνων Αρχαίων σε ασθενείς με περιοδοντίτιδα με τη χρήση 16S rrna και FISH Κυρίως Methanobrevicater spp. (συμβιώτες πεπτικών συστημάτων ζώων) Ρόλος (?): συντροφικές σχέσεις σε περιοδοντικές κοιλότητες που προάγουν λειτουργίες ζύμωσης κατά την περιοδοντίτιδα
Archaea και ανθρώπινη υγεία Δεν έχουν βρεθεί γονίδια παθογένειας στα γονιδιώματα των Αρχαίων αλλά (ίσως) έχουν τη δυνατότητα παθογένειας Μοιράζονται μερικά χαρακτηριστικά με παθογόνα Βακτήρια: Σχεδόν απρόσκοπτη πρόσβαση σε ξενιστές Ικανότητα μακρόχρονης εποίκισης βιολογικών επιφανειών (π.χ. αναερόβια Αρχαία στο ανθρώπινο έντερο, κόλπο και στοματική κοιλότητα) Συνύπαρξη (συντροφισμός) με αμιγώς ενδογενή Βακτήρια Επιδεκτικότητα Αρχαίων σε αντιβιοτικά Πιθανώς να ευθύνονται για «ανεξήγητες» ανθρώπινες ασθένειες Μεθοδολογικοί περιορισμοί στη μελέτη των Αρχαίων σε υγιείς και μη ανθρώπους.
Βιοτεχνολογικές εφαρμογές των Archaea Eichler J (2001) Biotechological uses of archaeal extremozymes. Biotechnol. Adv. 9:261278 Schiraldi et al. (2002) Perspectives on biotechnological applications of archaea. Archaea 1:7586 Ένζυμα... (Υπερ)θερμόφιλες πρωτεάσες, εστεράσες/λιπάσες, γλυκοζιδουδρολάσες (βιομηχανία τροφίμων, φαρμάκων, δερμάτινων, υφασμάτων Σταθερά σε υψηλές θερμοκρασίες Πρωτεάσες (Pyrococcus furiosus, Sulfolobus solfataricus, Aeropyrum pernix) Αλόφιλες πρωτεάσες (Haloferax mediterranei, Haloarcula marismortui), αντοχή σε διαλύτες με αυξημένη πολικότητα (π.χ. Σύνθεση πεπτιδίων
...Ένζυμα Εστεράσες/λιπάσες (Pyrobaculum caldifontis, P. furiosus, Archaeoglobus fulgidus, Sulfolobus solfataricus), οι σημαντικότεροι βιοκαταλύτες στην οργανική σύνθεση, βιομηχανία τροφίμων, λιπαντικών, καλλυντικών και χαρτιού. Γλυκοσιδάσες (Thermococcus aggregans, T. ziligii, T. kodakarensis, Picrophilus, Thermophilus, Pyrobaculum horikoshii, P. Furiosus, P. abyssi, Halorhabdus utahensis). Υδρόλυση αμύλου και βπολυσακχαριτών. Βιομηχανία τροφίμων: ζάχαρης, σιρόπια γλυκόζης/φρουκτόζης για αναψυκτικά ααμυλάσες, γλυκοαμυλάσες, αγλυκοσιδάσες, πουλλουλανάσες (αποικοδομεί πουλλουλάνη=μαλτοτριόζη) Κυτταρινάσες, ημικυτταρινάσες (κυρίως αποικοδόμηση ξυλάνης, μεγάλο εύρος βιομηχανικών χρήσεων) Χιτινάσες (απόβλητα επεξεργασίας αλιευμάτων, καλλυντικά [χιτοζάνη], φωτογραφικά προϊόντα
Inteins Διαθέτουν μηχανισμό τεμαχισμούεπανένωσης πρωτεϊνών Τεράστιο δυναμικό χρησιμότητας τους στην πρωτεϊνική μηχανική και στην κατανόηση μηχανισμών συναρμολόγησης πρωτεϊνών (μεταμεταφραστικό στάδιο) Έχουν αναγνωριστεί σε τουλάχιστον 17 γονιδώματα των Archaea (Archaeoglobus fulgidus, Methanosarcina acetivorans, Pyrococcus aeropyrum, Sulfolobus solfataricus, S. acidocaldarius)