ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ ΤΗΣ ΝΤΟΠΑΜΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑ ΜΥΟΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΚΑΙ ΖΩΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ ΤΗΣ ΝΤΟΠΑΜΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑ ΜΥΟΣ ΛΑΜΠΑΣ ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΠΑΤΡΑ ΙΟΥΛΙΟΣ 2009

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή διεκπεραιώθηκε στο εργαστήριο Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζώων, του τμήματος Βιολογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά το χρονικό διάστημα 2007-2009. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Παναγιώτη Γιομπρέ γιατί από τα φοιτητικά μου χρόνια στο τμήμα Βιολογίας έδειξε μεγάλο ενδιαφέρον και με οδήγησε στον κόσμο των νευροεπιστημών μέσα από τη διπλωματική μου εργασία. Επιπλέον με ώθησε να συνεχίσω και με βοήθησε στην επιλογή μου για τη συγκεκριμένη μεταπτυχιακή διατριβή. Πάντα έβρισκα τις συμβουλές του εποικοδομητικές και χρήσιμες και μέσω αυτών θεωρώ ότι συνέβαλε στο να αποκτήσω έναν άλλο τρόπο σκέψης. Εκτός των άλλων, η βοήθεια και η καθοδήγησή του ήταν σημαντική σε όλη την πορεία μου στο εργαστήριο. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της τριμελούς μου, τον κ. Ματσώκη Νικόλαο, αναπληρωτή καθηγητή του τμήματος Βιολογίας και την κ. Μητσάκου Αδαμαντία, αναπληρώτρια καθηγήτρια του τμήματος Ιατρικής, για την προθυμία τους να συμμετάσχουν στην εξεταστική επιτροπή. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στον κ. Παναγόπουλο Νικόλαο, λέκτορα του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, για τις σημαντικές υποδείξεις και την πολύτιμη αρωγή στην εφαρμογή των πειραματικών μεθόδων αλλά και την καθοδήγησή του. Θα ήταν μεγάλη παράλειψη να μην ευχαριστήσω, όλους τους φοιτητές του εργαστηρίου Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζωικών Οργανισμών για την συνεργασία, το ευχάριστο και φιλικό περιβάλλον. Κλείνοντας, θα ήθελα ολόψυχα να πω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένεια μου για την πολύπλευρη υποστήριξή της καθ όλη την πορεία των σπουδών μου, αλλά και στους φίλους μου. 2

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γιομπρές Παναγιώτης ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ Αναπληρωτής καθηγητής του Τμήματος Βιολογίας, Σχολής Θετικών Επιστημών του Πανεπιστημίου Πατρών Νίκος Ματσωκης Αναπληρωτής καθηγητής του Τμήματος Βιολογίας, Σχολής Θετικών Επιστημών του Πανεπιστημίου Πατρών Αδαμαντία Μητσάκου Αναπληρώτρια καθηγήτρια του Τμήματος Ιατρικής, Σχολής Επιστημών της Υγείας του Πανεπιστημίου Πατρών

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6 ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑ 6 Λειτουργίες της παρεγκεφαλίδα 7 Δομή της Παρεγκεφαλίδας 7 Οι τρεις λειτουργικές μοίρες της παρεγκεφαλίδας 10 Μορφολογία του φλοιού της παρεγκεφαλίδας 11 Νευροδιαβιβαστές 13 Ρόλος της παρεγκεφαλίδας 14 ΣΥΝΔΕΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑΣ ΜΕ ΤΑ ΒΑΣΙΚΑ ΓΑΓΓΛΙΑ 15 Εισαγωγή στον Μεταφορέα της Ντοπαμίνης 18 DAT: Δομή Λειτουργία - Ρύθμιση 20 DAT και D 2 28 Αλληλεπιδράσεις με ενώσεις 31 Αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες 34 DAT-DA στην παρεγκεφαλίδα 39 Σκοπός της Διατριβής 43 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 44 ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΑ ΟΜΟΓΕΝΟΠΟΙΗΣΕΩΝ-ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΕΩΝ ΓΙΑ SDS- 44 PAGE ΚΑΙ WESTERN BLOT ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΑ ΟΜΟΓΕΝΟΠΟΙΗΣΕΩΝ ΓΙΑ ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ 45 ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΑ ΟΜΟΓΕΝΟΠΟΙΗΣΕΩΝ ΓΙΑ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ 47 ΣΥΝΑΠΤΟΣΩΜΑΤΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ 48 SDS-PAGE ΚΑΙ WESTERN IMMUNOBLOTING 48 RT-PCR-Κλωνοποίηση-Αλληλούχιση 52 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 62 Εντοπισμός του DAT στην παρεγκεφαλίδα μυός με την μέθοδο της 62 Ανοσοαποτύπωσης Εντοπισμός του DAT στην παρεγκεφαλίδα μυός με την μέθοδο της 69 Ανοσοκατακρήμνιση ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΣΥΝΑΠΤΟΣΩΜΑΤΩΝ (Etxra-Pro-meta) 75 4

RT-PCR-ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ mdat 77 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 82 Πρωτεΐνη DAT και Παρεγκεφαλίδα 84 Ανίχνευση με την μέθοδο Ανοσοαποτύπωσης- Ανοσοκαθίζησης 84 Κατανομή του DAT στα υποσυναπτικά κλάσματα του συναπτοσώματος (Etxra- 86 Pro-meta) RT-PCR-Κλωνοποίηση και αλληλούχιση του γονιδίου mdat 87 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 88 H. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 90 5

Εισαγωγη Παρεγκεφαλίδα Η ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας συνδέεται άμεσα με τον τρόπο κίνησης των ζώων, την επιδεξιότητα στην κίνηση των άκρων και την ισορροπία. Συνήθως είναι λίγο ανεπτυγμένη στα αμφίβια και στα ερπετά, μορφές που ζουν κοντά στο έδαφος, και καλά ανεπτυγμένη στους ευκίνητους οστεϊχθύες. Φθάνει στο απόγειο της εξέλιξής της στα πτηνά και στα θηλαστικά στα οποία είναι εκτεταμένη και αναδιπλωμένη. Το μεγάλο σχήμα των παρεγκεφαλιδικών ημισφαιρίων στον άνθρωπο γίνεται κατανοητό, λόγω των πολλών δεξιοτήτων, όπως η ομιλία, η δημιουργία και η χρήση των εργαλείων, τεχνολογίας σημαντικής για την επιβίωση κάτω από πάρα πολύ διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες. Τέλος, εξαιτίας συμβολικών εκφράσεων, όπως χορός, μουσική και άλλα. Η παρεγκεφαλίδα κείται ραχιαίως της γέφυρας και του προμήκους μυελού και προεκβάλλει προς το οπίσθιο μέρος της κεφαλής, περιβάλλοντας το εγκεφαλικό στέλεχος. Έχει πτυχωτή επιφάνεια και διαιρείται σε αρκετούς λοβούς, καθένας από τους οποίους έχει την δική του λειτουργία. Η παρεγκεφαλίδα δέχεται αισθητικές πληροφορίες από τον νωτιαίο μυελό, κινητικές πληροφορίες από τον φλοιό των εγκεφαλικών ημισφαιρίων και πληροφορίες σχετικές με την ισορροπία από την αίθουσα και τους ημικυκλικούς σωλήνες του έσω ωτός. Η σύγκληση όλων αυτών των πληροφοριών επιτρέπει στην παρεγκεφαλίδα να συντονίζει τον προγραμματισμό, τον χρόνο και τον τύπο ενέργειας των σκελετικών μυών κατά την διάρκεια της κίνησης (Fritschy and Grzanna, 1990). Ακόμη διαδραματίζει κάποιον ρόλο στη διατήρηση της στάσης του σώματος και στον συντονισμό τον κινήσεων της κεφαλής και των οφθαλμών. Είναι δηλαδή το κεντρικό νευρικό όργανο που ρυθμίζει τον τόνο των μυών, τις συνδυασμένες αρμονικές σωματικές κινήσεις και εξασφαλίζει την ισορροπία του σώματος. Αυτές οι λειτουργίες βελτιώνονται με την εξάσκηση και, έτσι, η παρεγκεφαλίδα παρεμβαίνει στη μάθηση κινητικών δεξιοτήτων. 6

Λειτουργίες της Παρεγκφαλίδας Η παρεγκεφαλίδα καταλαμβάνει μόλις το 10% του συνολικού όγκου του εγκεφάλου, αλλά παίζει σημαντικό και ίσως απαραίτητο ρόλο στις εγκεφαλικές λειτουργίες. Ρυθμίζει τις κινήσεις και τη στάση του σώματος έμμεσα, τροποποιώντας τις εντολές των κύριων κατιόντων κινητικών συστημάτων του εγκεφάλου. Βλάβες της παρεγκεφαλίδας δεν προκαλούν παράλυση, αλλά καταργούν το συντονισμό των κινήσεων των άκρων και των οφθαλμών, διαταράσσουν την ισορροπία και μειώνουν τον μυϊκό τόνο. Επομένως, τα χαρακτηριστικά της παρεγκεφαλιδικής βλάβης διαφέρουν εντυπωσιακά από εκείνα της βλάβης του κινητικού φλοιού, η οποία μειώνει τη δύναμη και την ταχύτητα της κίνησης και ελαττώνει την ικανότητα σύσπασης επιμέρους μυών. Ο τρόπος με τον οποίο η παρεγκεφαλίδα διορθώνει τις εντολές των κινητικών συστημάτων είναι ο παρακάτω: Σύμφωνα με την πιο ενδιαφέρουσα άποψη, η παρεγκεφαλίδα δρα σαν όργανο σύγκρισης το οποίο αντισταθμίζει τα σφάλματα της κίνησης, συγκρίνοντας την επιδιωκόμενη κίνηση με την πραγματική κίνηση: Πρώτον, μέσω συγκρίσεων εσωτερικών και εξωτερικών σημάτων ανάδρασης, η παρεγκεφαλίδα είναι ικανή να διορθώνει εκτελούμενες κινήσεις όταν αποκλίνουν από την επιθυμητή πορεία. Δεύτερον, η παρεγκεφαλίδα είναι ικανή να τροποποιεί κεντρικά κινητικά προγράμματα, ώστε οι κινήσεις που ακολουθούν να μπορούν να εκπληρώσουν το σκοπό τους με λιγότερα σφάλματα. Οι προσαρμογές αυτές φαίνεται ότι εξαρτώνται, εν μέρει, από την ικανότητα ορισμένων κατηγοριών ινών να τροποποιούν τα κυκλώματα της παρεγκεφαλίδας για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Έτσι, η δραστηριότητα των νευρώνων της παρεγκεφαλίδας μεταβάλλεται με την εμπειρία και παίζει σημαντικό ρόλο στην εκμάθηση κινητικών έργων (Kandel et al., 2003). Δομή της Παρεγκεφαλίδας Η παρεγκεφαλίδα αποτελεί μείζονα υποδιαίρεση του κεντρικού νευρικού συστήματος και καταλαμβάνει το μεγαλύτερο μέρος του οπίσθιου κρανιακού βόθρου. Αποτελείται από έναν εξωτερικό χιτώνα φαιής ουσίας (τον φλοιό της παρεγκεφαλίδας), από εσωτερική λευκή ουσία και από τρία ζεύγη εν τω βάθει 7

πυρήνων, οι οποίοι είναι οι κύριες δομές εξόδου της παρεγκεφαλίδας: τον οροφιαίο, τον εμβόλιμο (αποτελούμενο από δυο πυρήνες) και τον οδοντωτό πυρήνα. Η παρεγκεφαλίδα δέχεται ίνες από την περιφέρεια και από όλα τα επίπεδα του ΚΝΣ. Οι προσαγωγοί ίνες συνάπτονται με νευρώνες τόσο των εν τω βάθει πυρήνων όσο και του φλοιού της παρεγκεφαλίδας. Μολονότι οι απαγωγοί ίνες από τις περισσότερες περιοχές του φλοιού της παρεγκεφαλίδας καταλήγουν πρώτα στους εν τω βάθει πυρήνες, η φυλογενετικώς παλαιότερη μοίρα του φλοιού της παρεγκεφαλίδας (ο λοβός της κροκύδας και του οζιδίου, ο οποίος περιγράφεται παρακάτω) προβάλλει απευθείας στους αιθουσιαίους πυρήνες του εγκεφαλικού στελέχους, οι οποίοι έχουν ανάλογη λειτουργία με τους εν τω βάθει πυρήνες της παρεγκεφαλίδας. Οι εν τω βάθει πυρήνες της παρεγκεφαλίδας και οι αιθουσαίοι πυρήνες διαβιβάζουν όλες τις ώσεις της παρεγκεφαλίδας κυρίως στις κινητικές περιοχές του φλοιού των εγκεφαλικών ημισφαιρίων και του εγκεφαλικού στελέχους. Οι προσαγωγοί και οι απαγωγοί ίνες της παρεγκεφαλίδας σχηματίζουν τρία συμμετρικά ζεύγη δεματίων, τα οποία την συνδέουν με το εγκεφαλικό στέλεχος. Ένα εντυπωσιακό χαρακτηριστικό της επιφάνειας της παρεγκεφαλίδας είναι οι πολλές παράλληλες εγκάρσιες προεξοχές, οι οποίες ονομάζονται έλικες και οι οποίες εκτείνονται από την μια πλευρά στην άλλη. Δύο βαθιές εγκάρσιες σχισμές χωρίζουν την παρεγκεφαλίδα σε τρεις κύριους λοβούς: τον πρόσθιο λοβό, τον οπίσθιο λοβό και τον μικρό λοβό της κροκύδας και του οζιδίου. Δύο επιμήκεις αύλακες εμφανέστερες στην κάτω επιφάνεια του οπίσθιου λοβού της παρεγκεφαλίδας σημειώνουν την περιοχή του σκώληκα, μια λεπτή επιμήκη λωρίδα στη μέση γραμμή, η οποία χωρίζει το αριστερό από το δεξιό ημισφαίριο της παρεγκεφαλίδας. Το τμήμα του ημισφαιρίου που συνορεύει με τον σκώληκα ονομάζεται διάμεση μοίρα, το υπόλοιπο του ημισφαιρίου είναι η έξω μοίρα. Ο σκώληκας και οι δύο μοίρες του ημισφαιρίου συνδέονται με διαφορετικούς εν τω βάθει πυρήνες και σε διαφορετικές μοίρες των κατιόντων συστημάτων και αποτελούν λειτουργικώς χωριστές περιοχές της παρεγκεφαλίδας. Ο σκώληκας, με άμεσες προβολές στους αιθουσαίους πυρήνες και έμμεσες προβολές σε άλλα έσω συστήματα του εγκεφαλικού στελέχους και κατιόντα φλοιϊκά συστήματα, ελέγχει τους αξονικούς μυς και τους εγγύς μυς των άκρων. Η διάμεση μοίρα κάθε ημισφαιρίου προβάλλει στον φλοιό των εγκεφαλικών ημισφαιρίων και στο εγκεφαλικό στέλεχος από όπου εκφύονται τα έξω κατιόντα συστήματα, τα οποία ελέγχουν τους άπω μυς των άκρων. Η έξω μοίρα κάθε ημισφαιρίου προβάλλει στον 8

οδοντωτό πυρήνα, ο οποίος συνδέεται κυρίως με την κινητική και την προ-κινητική περιοχή του φλοιού των εγκεφαλικών ημισφαιρίων, δηλαδή με τις περιοχές που μετέχουν στον σχεδιασμό των εκούσιων κινήσεων. (Από Γεώργιος Παναγής: Νευροεπιστήμες και Συμπεριφορά, Ιατρικές Εκδόσεις 2002) 9

Οι τρεις λειτουργικές μοίρες της παρεγκεφαλίδας Η παρεγκεφαλίδα είναι οργανωμένη σε τρεις λειτουργικές μοίρες, η καθεμία από τις οποίες έχει χωριστές ανατομικές συνδέσεις με τον εγκέφαλο και με τον νωτιαίο μυελό: την αιθουσοπαρεγκεφαλίδα, την νωτιαιοπαρεγκεφαλίδα και την εγκεφαλοπαρεγκεφαλίδα. Αυτές οι τρεις μοίρες αντιστοιχούν περίπου στις ανατομικές υποδιαιρέσεις οι οποίες έχουν εμφανιστεί διαδοχικά κατά την φυλογένεση. Η αιθουσοπαρεγκεφαλίδα, η οποία συμπίπτει με τον λοβό της κροκύδας και του οζιδίου, εμφανίστηκε πρώτη κατά την εξέλιξη. Η νωτιαιοπαρεγκεφαλίδα και η εγκεφαλοπαρεγκεφαλίδα αποτελούν το σώμα της παρεγκεφαλίδας. Κάθε περιοχή δέχεται τις προσαγωγούς ίνες της κυρίως από διαφορετική πηγή και στέλνει τις ίνες της σε διαφορετική περιοχή του εγκεφάλου. Οι βλάβες κάθε περιοχής προκαλούν χαρακτηριστικά κλινικά σύνδρομα. Η αιθουσοπαρεγκεφαλίδα δέχεται τις προσαγωγούς ίνες από τους αιθουσαίους πυρήνες του προμήκους και προβάλλει άμεσα πίσω σε αυτούς, από όπου και η ονομασία της. Μέσω των προσαγωγών και των απαγωγών συνδέσεων με τους αιθουσαίους πυρήνες η αιθουσοπαρεγκεφαλίδα του ανθρώπου ρυθμίζει τις κινήσεις των οφθαλμών και την ισορροπία του σώματος κατά την διάρκεια της στάσης και του βαδίσματος. Η νωτιαιοπαρεγκεφαλίδα εκτείνεται εκ των πρόσω προς τα οπίσω μεταξύ της κεντρικής μοίρας του πρόσθιου και του οπίσθιου λοβού και περιλαμβάνει τον σκώληκα και την διάμεση μοίρα των ημισφαιρίων. Οι δύο αυτές περιοχές δέχονται αισθητικές πληροφορίες από την περιφέρεια. Η νωτιαιοπαρεγκεφαλίδα ονομάζεται έτσι, διότι κύρια πηγή των προσαγωγών ινών της είναι ο νωτιαίος μυελός. Μέσω των εν τω βάθει πυρήνων, η νωτιαιοπαρεγκεφαλίδα ελέγχει την έσω και την έξω μοίρα των κατιόντων κινητικών συστημάτων και επομένως, παίζει κύριο ρόλο στον έλεγχο των εκτελούμενων κινήσεων των άκρων. Η εγκεφαλοπαρεγκεφαλίδα αντιστοιχεί στην έξω μοίρα του ημισφαιρίου της παρεγκεφαλίδας. Οι ίνες της εκφύονται αποκλειστικά από τους γεφυρικούς πυρήνες, δηλαδή από τους νευρώνες στη βάση της γέφυρας οι οποίοι συγκροτούν πολλές μικρές ομάδες που χωρίζονται από τις δεσμίδες των φλοιονωτιαίων και των φλοιοπρομηκικών ινών οι οποίοι μεταφέρουν πληροφορίες από τον φλοιό των 10

εγκεφαλικών ημισφαιρίων. Οι απαγωγοί ώσεις της εγκεφαλοπαρεγκεφαλίδας οδεύουν, μέσω του οδοντωτού πυρήνα στο θάλαμο και από εκεί στον κινητικό και στον προκινητικό φλοιό. Λόγω των συνδέσεών της με αυτές τις περιοχές του φλοιού, η εγκεφαλοπαρεγκεφαλίδα θεωρείται ότι παίζει ειδικό ρόλο στον σχεδιασμό και στην έναρξη της κίνησης. Μορφολογία του φλοιού της παρεγκεφαλίδας Ο φλοιός της παρεγκεφαλίδας εμφανίζει τρεις στιβάδες: τη μοριώδη στιβάδα, τη στιβάδα των κυττάρων Purkinje και την κοκκιώδη στιβάδα. Η εξωτερική μοριώδης στιβάδα αποτελείται κυρίως από τους νευράξονες των κοκκοειδών κυττάρων οι οποίοι πορεύονται παράλληλα προς τον διαμήκη άξονα της έλικας. Περιέχει επίσης διάσπαρτα αστεροειδή και καλαθιοφόρα κύτταρα, καθώς και τους δενδρίτες των υποκείμενων κυττάρων Purkinje και τις νευρογλοιακές ίνες του Bergman. Η στιβάδα των κυττάρων Purkinje βρίσκεται εσωτερικά της μοριώδους στιβάδας. Περιέχει τα μεγάλα κυτταρικά σώματα των κυττάρων Purkinje, τα οποία διατάσσονται το ένα δίπλα στο άλλο σε μια σειρά. Η εκτεταμένες δενδριτικές διακλαδώσεις των κυττάρων Purkinje εκτείνονται στη μοριώδη στιβάδα, σε ένα επίπεδο κάθετο στον κύριο άξονα της έλικας. Τα κύτταρα Purkinje τα οποία μεταβιβάζουν όλες τις απαγωγούς ώσεις του φλοιού της παρεγκεφαλίδας, στέλνουν τους νευράξονές τους στην υποκείμενη λευκή ουσία. Η εσωτερική κοκκώδης στιβάδα περιέχει μεγάλο αριθμό μικρών νευρώνων με πυκνή διάταξη, κυρίως μικρών κοκκοειδών κυττάρων. Ο αριθμός τους, περίπου 10 10, υπερβαίνει των συνολικό αριθμό των κυττάρων του φλοιού των εγκεφαλικών ημισφαιρίων! Λίγα μεγαλύτερα κύτταρα Golgi παρατηρούνται στην εξωτερική παρυφή της στιβάδας. Τα κύτταρα της κοκκώδους στιβάδας σχηματίζουν με τις σφαιρικές απολήξεις των προσαγωγών ινών σύνθετες συνάψεις, οι οποίες ονομάζονται παρεγκεφαλιδικά σπειράματα. Οι πληροφορίες που διατρέχουν την παρεγκεφαλίδα ενεργούν αρχικά στους εν τω βάθει πυρήνες, που μαζί με τους αιθουσαίους μεταβιβάζουν όλες τις απαγωγούς ώσεις από την παρεγκεφαλίδα. Τα κύτταρα Purkinje αποτελούν τους μόνους απαγωγούς νευρώνες του φλοιού της παρεγκεφαλίδας ενώ η δραστηριότητά τους καθορίζεται άμεσα και έμμεσα από δυο διεγερτικά προσαγωγά συστήματα ινών: τις 11

αναρριχητικές και τις βρυώδεις ή βλαστάνουσες ίνες οι οποίες εκφύονται αντίστοιχα από τους πυρήνες της γέφυρας και τον πυρήνα της κάτω ελαίας. Και τα δύο είδη ινών δίνουν παράπλευρους κλάδους, που αποτελούν το κύριο διεγερτικό κύκλωμα, στους εν τω βάθει πυρήνες της παρεγκεφαλίδας. Οι βρυώδεις ίνες, προερχόμενες από διάφορους πυρήνες του εγκεφαλικού στελέχους και από νευρώνες του νωτιαίου μυελού (νωτιαιοπαρεγκεφαλιδικά δεμάτια), αποτελούν την κύρια προσαγωγό οδό του φλοιού της παρεγκεφαλίδας. Οι βρυώδεις ίνες συνάπτονται με τα κοκκοειδή κύτταρα των οποίων οι νευράξονες προβάλλουν στην μοριώδη στιβάδα, όπου εκεί διχοτομούνται σε παράλληλες ίνες, οι οποίες εκτείνονται αρκετά χιλιοστόμετρα κατά μήκος του διαμήκους άξονα των ελίκων της παρεγκεφαλίδας. Αυτές οι παράλληλες ίνες διασταυρώνονται και πραγματοποιούν επαφές με τους δενδρίτες μιας σειράς κυττάρων Purkinje, που διατάσσονται κάθετα προς τις παράλληλες ίνες. Συνολικά κάθε κύτταρο Purkinje δέχεται συγκλίνουσες ώσεις από περίπου 200,000 παράλληλες ίνες κοκκοειδών κυττάρων και κάθε κοκκοειδές κύτταρο δέχεται ώσεις από πολλές βρυώδεις ίνες. Οι αναρριχητικές ίνες αποτελούν την άλλη ομάδα διεγερτικών προσαγωγών ινών για το φλοιό της παρεγκεφαλίδας. Εκφύονται από μια μόνο θέση του προμήκους μυελού, τον πυρήνα της κάτω ελαίας, και μεταφέρουν πληροφορίες τόσο από τον φλοιό των εγκεφαλικών ημισφαιρίων όσο και από τον νωτιαίο μυελό. Οι αναρριχητικές ίνες πήραν το όνομά τους από την μορφολογία των απολήξεων τους στα κύτταρα Purkinje. Οι ίνες αυτές διαπερνούν το φλοιό και ελίσσονται γύρω από το σώμα και τους δενδρίτες των κυττάρων Purkinje, όπου και πραγματοποιούν πάρα πολλές συνάψεις, κυρίως στην εγγύς μοίρα των δενδριτών. Έτσι, λοιπόν, κάθε αναρριχητική ίνα συνάπτεται μόνο με 1 έως 10 κύτταρα Purkinje ενώ κάθε Purkinje δέχεται ώσεις από μόνο μία αναρριχητική. Καλό θα ήταν να τονιστεί ότι η συναπτική σύνδεση των αναρριχητικών ινών με τα κύτταρα Purkinje είναι μια από τις ισχυρότερες στο νευρικό σύστημα και επιφέρει σε αυτά ένα χαρακτηριστικό πρότυπο ηλεκτροφυσιολογικής απόκρισης, το σύνθετο δυναμικό (complex spike). Η λειτουργική μονάδα της παρεγκεφαλίδας περιλαμβάνει το κύκλωμα: 1) εισερχόμενες ίνες (αναρριχόμενες και βρυώδεις), 2) το ισχυρό διεγερτικό μήνυμα προς τους «εν τω βάθει πυρήνες» και 3) την έξοδο. Το παραπάνω κύκλωμα βρίσκεται κάτω από την ανασταλτική επίδραση του κυκλώματος του παρεγκεφαλιδικού φλοιού. 12

Εντοπισμός νευροδιαβιβαστών στην παρεγκεφαλίδα Τα κοκκιώδη κύτταρα είναι μικροί γλουταμινεργικοί νευρώνες στους δενδρίτες των οποίων συνάπτονται οι βρυώδεις ίνες, δημιουργώντας έτσι μαζί με τις αξονικές απολήξεις των Golgi ειδικές ανατομικές και λειτουργικές εξειδικεύσεις του φλοιού της παρεγκεφαλίδας, τις ροζέτες (glomeruloes). Τα αστεροειδή και καλαθιοφόρα κύτταρα, τα οποία λειτουργούν ως διάμεσοι νευρώνες είναι ανασταλτικοί ενδονευρώνες που διεγείρονται από τις παράλληλες ίνες και συνάπτονται πάνω στους δενδρίτες των κυττάρων Purkinje με αποτέλεσμα την πρόσω αναστολή και τον περιορισμό χωρικά της διεγερτικής δράσης των παράλληλων ινών. Τα κύτταρα Purkinje σχηματίζουν ένα μονόστιβο στρώμα μεταξύ της μοριώδους και της κοκκιώδους στιβάδας. Είναι ανασταλτικοί νευρώνες και δίνουν συνάψεις στους εν τω βάθει πυρήνες. Τα Golgi κύτταρα διεγείρονται και αυτά από τις παράλληλες ίνες και συνάπτονται επί των κοκκιωδών κυττάρων, με αποτέλεσμα την ανάδρομη αναστολή τους. Γλουταμικό οξύ: Είναι ο κύριος νευροδιαβιβαστής των κοκκιωδών κυττάρων και εκπολώνει τα κύτταρα Purkinje όταν χορηγείται με ιοντοφόρηση στους δενδρίτες (Krnjevic και Phillips, 1963). Ακόμη υποδοχείς του GLU συναντάμε και στις τρεις στιβάδες του φλοιού της παρεγκεφαλίδας (NMDA στην κοκκώδη και μοριώδη, AMPA στη μοριώδη και υποδοχείς καινικού στην κοκκώδη) (Kwon et al., 2000). GABA (γ-αμινο-βουτυρικό οξύ): Είναι ο νευροδιαβιβαστής που απελευθερώνεται από τα κύτταρα Purkinje προς τους εν τω βάθει πυρήνες. Ακόμη τα καλαθοειδή και τα κύτταρα Golgi έχει βρεθεί ότι είναι GABA-εργικοί νευρώνες οι οποίοι δίνουν ανασταλτικές συνάψεις στα κύτταρα Purkinje. Αμίνες-Κατεχολαμίνες : Η νοραδρενεργική νεύρωση της παρεγκεφαλίδας έχει περιγραφεί λεπτομερώς από τους Olson, Fuxe και συνεργάτες, το 1972, Bloom, Battnberg και συνεργάτες, το1972, όπου τα κύτταρα Purkinje αποτελούν των κύριο στόχο των νοραδρενεργικών ινών που προέρχονται από τον υπομέλανα τόπο (ενώ παρατηρείται και ένα διάχυτο πλέγμα νοραδρενεργικών ινών στη στιβάδα των κοκκιωδών κυττάρων). Έχει δειχθεί ότι τα κύτταρα Purkinje αναστέλλονται από την απελευθέρωση της νοραδρεναλίνης μετά από διέγερση του υπομέλανα τόπου. Ακόμη η παρεγκεφαλίδα δέχεται νοραδρενεργικές συνάψεις και από τις ομάδες Α5 και Α7 13

του εγκεφαλικού στελέχους και την locus subcoeruleus και τον πλάγιο δικτυωτό πυρήνα. Υπάρχουν ακόμη ενδείξεις για ντοπαμινεργικές προσαγωγές ίνες στους παρεγκεφαλιδικούς πυρήνες και στις στιβάδες των κυττάρων Purkinje καθώς και της κοκκώδους από τον μεσεγκέφαλο και το σύστημα των βασικών γαγγλίων (Panagopoulos et al., 1991, Giompres and Delis, 2005, Hook and Wise, 1995, Biggio et al., 1978). Τα κυτταρικά σώματα σεροτονινεργικών νευρώνων υπάρχουν στους πυρήνες ραφής του εγκεφαλικού στελέχους και γύρω από αυτούς και προβάλλουν ίνες σε όλα τα μέρη του φλοιού και του πυρήνα της παρεγκεφαλίδας. Οι σεροτονινεργικοί υποδοχείς εντοπίζονται στους δενδρίτες των κοκκοειδών κυττάρων οι οποίοι βρίσκονται πολύ έξω από το σπείραμα. Η ακετυλοχολίνη εντοπίζεται, τουλάχιστον σε αυτές τις περιοχές όπου οι βρυώδεις ίνες παρατηρήθηκαν να βάφονται στην ακετυλοχολινεστεράση (Plaitakis, 1992). Η ουσία Ρ και η σωματοστατίνη έχουν επίσης αναφερθεί ως πιθανοί νευροδιαβιβαστές στις βρυώδεις ίνες. Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημικές μεθόδους για την σήμανση του GLU στην παρεγκεφαλίδα, δείχθηκε ότι οι απολήξεις των βρυωδών ινών στην παρεγκεφαλίδα αρουραίων είναι πλούσιες σε αυτό το αμινοξύ. Ακόμη συναντάμε ίνες που χρησιμοποιούν το ασπαραγινικό οξύ και CFR, τις αναρριχητικές και τις βλαστάνουσες με GLU, Ach, 5-HT, TRH και άλλα όπως εγκεφαλίνες και νευροπεπτίδιο Υ. Στην παρεγκεφαλίδα του ζώου Didelphis virginiana, η εγκεφαλίνη έχει εντοπιστεί σε επιλεγμένους πληθυσμούς αναρριχομένων ινών, δίνοντας στοιχεία για χημική ετερογενετικότητα μέσα σε αυτά τα προσαγωγά συστήματα. Εντούτοις, δεν είναι σαφές αν η εγκεφαλίνη μπορεί να παίζει νευροδιαβιβαστικό ρόλο, ειδικά όταν κάποιος λάβει υπόψη την κατασταλτική δράση αυτού του νευροπεπτιδίου σε άλλες περιοχές του εγκεφάλου. Πρόσφατα ένα άλλο ολιγοπεπτίδιο, ο απελευθερωτικόςπαράγοντας κορτικοτροπίνης CRF, έχει ειδικά εντοπιστεί στο σύστημα της ελαιοπαρεγκεφαλίδας, πρώτα στις αξονικές απολήξεις των αναρριχομένων ινών αλλά επίσης και στις βρυώδεις προσαγωγούς ίνες (Plaitakis, 1992). 14

Ρόλος της παρεγκεφαλίδας Το πρώτο μοντέλο για το ρόλο της παρεγκεφαλίδας στο ΚΝΣ διατυπώθηκε ήδη από τον 19ο αιώνα από το Luciani, ο οποίος, βασισμένος στα συμπτώματα «ατονίας» των ασθενών του, θεώρησε ότι η παρεγκεφαλίδα ασκεί στο ΚΝΣ τονική διεγερτική δράση. Η υπόθεση αυτή διατηρήθηκε έως τα μέσα του 20ου αιώνα οπότε θεωρήθηκε ότι η παρεγκεφαλίδα ασκεί λεπτό έλεγχο στη στάση και στην κίνηση. Η παρεγκεφαλίδα θεωρήθηκε όργανο στο οποίο προσάγεται πληροφορία από όλο το σώμα και τον εγκεφαλικό φλοιό για να τροφοδοτηθεί αποκλειστικά το κινητικό σύστημα (ο κινητικός φλοιός και τα νωτιαία μονοπάτια). Προς το τέλος του 20ου αιώνα είχε διατυπωθεί πλειάδα υποθέσεων για το ρόλο της παρεγκεφαλίδας στο ΚΝΣ (Barinaga, 1996) με σημαντικότερη ότι είναι όργανο μάθησης και μνήμης (Glickstein and Yeo, 1990, Raymond et al., 1996). Έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι η παρεγκεφαλίδα δύναται να συγκρίνει την επιθυμητή με την πραγματοποιούμενη κίνηση και να επιδιορθώνει τυχόν λάθη και αποκλίσεις μέχρι το σύστημα να μάθει να εκτελεί τη δράση σωστά. Σύμφωνα με την υπόθεση αυτή η πληροφόρηση της παρεγκεφαλίδας για την τρέχουσα κατάσταση του σώματος διαμεσολαβείτε από την προβολή των βρυωδών ινών στα κοκκιώδη κύτταρα και κατ επέκταση από την προβολή των παράλληλων ινών στα κύτταρα Purkinje. Η πληροφόρηση για το τυχόν λάθος στην εκτελούμενη δραστηριότητα του οργανισμού διαμεσολαβείτε από την προβολή της κάτω ελαίας (αναρριχητικές ίνες) στα Purkinje κύτταρα. Η ταυτόχρονη πυροδότηση των παράλληλων και των αναρριχητικών ινών επί των κυττάρων Purkinje επιφέρει ελάττωση της αποτελεσματικότητας της σύναψης των παράλληλων ινών επί των κυττάρων Purkinje (Ito, 2001). Πρόκειται για το φαινόμενο της μακροχρόνιας αποδυνάμωσης το οποίο ρυθμίζει την ανασταλτική πυροδότηση των κυττάρων Purkinje επί των νευρώνων των εν τω βάθει πυρήνων και τελικά την έξοδο της παρεγκεφαλίδας προς το υπόλοιπο ΚΝΣ. Το φαινόμενο της μακροχρόνιας αποδυνάμωσης έχει δειχθεί αναλυτικά σε in vitro παρασκευάσματα. Πρόκειται για εξαιρετικά σύνθετο φαινόμενο που προϋποθέτει την απελευθέρωση του γλουταμικού οξέος και του ΝΟ από τις παράλληλες ίνες, του CRF και του ΙGF1 από τις αναρριχητικές ίνες ενώ σημαντικοί είναι οι υποδοχείς AMPA στη σύναψη των παράλληλων ινών επί των κυττάρων Purkinje. Η παρεγκεφαλίδα έχει θεωρηθεί ως σύστημα αναπαράστασης 15

/μοντελοποίησης οποιασδήποτε κατάστασης του υπόλοιπου ΚΝΣ ώστε να επιτυγχάνεται η αποτελεσματικότερη παρακολούθηση της λειτουργίας του (Wolpert et al., 1998). Έχει θεωρηθεί ικανή αλλά όχι αναγκαία δομή για το ΚΝΣ δεδομένου ότι με την απουσία της δεν καταρρέει το σύστημα αλλά αναπροσαρμόζεται με μικρότερη όμως αποτελεσματικότητα (Bower, 1997). Η παρεγκεφαλίδα έχει θεωρηθεί σύστημα εκτίμησης του χρόνου για μικρής τάξης χρονικές διάρκειες, όχι μόνο σε ότι αφορά την κίνηση αλλά και την αντίληψη γενικότερα (Ivry, 1996). Η δράση της έχει συσχετιστεί με λειτουργίες του αυτόνομου νευρικού συστήματος (Reis and Golavov, 1997), με το μεταιχμιακό σύστημα (Berman, 1997), με την ανάπτυξη στρατηγικών πλοήγησης στο χώρο (Gandhi et al., 2000), με αμιγώς νοητικές λειτουργίες (Kim et al., 1994, Gao et al, 1996, Allen et al., 1997) και με νοητικές εκπτώσεις (Schmahmann, 1998). ΣΥΝΔΕΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΕΓΚΕΦΑΛΙΔΑΣ ΜΕ ΤΑ ΒΑΣΙΚΑ ΓΑΓΓΛΙΑ Έχει δειχθεί ότι οι πυρήνες της παρεγκεφαλίδας προβάλλουν στους ντοπαμινεργικούς πυρήνες του μεσεγκεφάλου (Snider and Snider, 1976, Perciavalle et al., 1989), εύρημα που δηλώνει την ύπαρξη άμεσης σύνδεσης της παρεγκεφαλίδας με τα βασικά γάγγλια. Είναι επίσης γνωστό ότι οι θαλαμικοί πυρήνες της μέσης γραμμής είνα στόχος των νευρώνων εξόδου της παρεγκεφαλίδας και ότι προβάλλουν στο ραβδωτό σώμα. Έχει μάλιστα δειχθεί η ύπαρξη δισυναπτικής ανατομικής σύνδεσης μεταξύ του οδοντωτού πυρήνα και του πλευροραχιαίου τεταρτημορίου του ραβδωτού σώματος (Ichinoe et al, 2000). Είναι ακόμα γνωστό ότι οι πυρήνες της παρεγκεφαλίδας προβάλλλουν στον γεφυροσκελιαίο πυρήνα (Hazrati and Parent, 1992) ο οποίος συνδέεται αμφίδρομα με τους ντοπαμινεργικούς μεσεγκεφαλικούς πυρήνες. Οι υπομέλανας τόπος είναι ένας ακόμα πιθανός συνδετικός κρίκος μεταξύ της παρεγκεφαλίδας και των βασικών γαγγλίων δεδομένου ότι οι εν τω βάθει πυρήνες έχουν διαπιστωμένες ανατομικές προβολές προς αυτόν και ότι η νοραδρενεργική προβολή αυτού ασκεί ρυθμιστικό έλεγχο στην απελευθέρωση της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα (Lategan et al., 1990). Οι Hook και Wise (1995) έχουν υποθέσει ότι οι φλοιο-φλοιϊκές συνδέσεις του εγκεφαλικού φλοιού είναι δυνατόν να έχουν συντονιστικό ρόλο μεταξύ της θηλειάς φλοιού-βασικών γαγγλίων και της θηλειάς 16

φλοιού-παρεγκεφαλίδας. Η προβολή των βασικών γαγγλίων και της παρεγκεφαλίδας σε κοινές κινητικές και μη κινητικές περιοχές του εγκεφαλικού φλοιού είναι πιθανόν να αρκεί ώστε τα δύο αυτά σημαντικά κυκλώματα να αλληλεπιδρούν και να συντονίζονται, δεδομένου μάλιστα ότι οι φλοιϊκές περιοχές προβολής τους, έχουν απαγωγές προβολές τόσο προς τα βασικά γάγγλια όσο και προς την παρεγκεφαλίδα. Παράλληλα έχει διαπιστωθεί η ύπαρξη ντοπαμινεργικής προβολής από το κοιλιακό καλυπτρικό πεδίο προς την παρεγκεφαλίδα (Ikai et al., 1994) όπως επίσης η παρουσία ινών ανοσοθετικών για την υδροξυλάση της τυροσίνης (Nelson et al., 1997) και τη ντοπαμίνη (Panagopoulos et al., 1991). Στην παρεγκεφαλίδα έχει μελετηθεί το σύστημα επαναπρόσληψης της ντοπαμίνης (Efthimiopoulos et al., 1991) και έχουν εντοπιστεί όλοι οι υποδοχείς της ντοπαμίνης (Khan et al, 1998). Άρα, η παρεγκεφαλίδα και τα βασικά γάγγλια συνδέονται ανατομικά σε τρία επίπεδα: στο επίπεδο του μεσεγκεφάλου με άμεσες και έμμεσες συνδέσεις, στο επίπεδο των θαλαμικών πυρήνων της μέσης γραμμής και στο επίπεδο του εγκεφαλικού φλοιού. Η ύπαρξη λειτουργικής σύνδεσης μεταξύ παρεγκεφαλίδας και βασικών γαγγλίων έχει επίσης δειχθεί. Ηλεκτρικός ερεθισμός των εν τω βάθει πυρήνων της παρεγκεφαλίδας επιφέρει ελάττωση της απελευθέρωσης της ντοπαμίνης στο ντοπαμινεργικό μεσεγκέφαλο στόχο (ο αντίπλευρος προκειμένου για τον οδοντωτό και εμβόλιμο πυρήνα, ο ομόπλευρος προκειμένου για τον οροφιαίο πυρήνα) και αύξηση της απελευθέρωσης της ντοπαμίνης στο αντίστοιχο ραβδωτό σώμα. Το αντίθετο ακριβώς πρότυπο παρατηρήθηκε στο άλλο ημισφαίριο και αποδόθηκε στην αλληλεπίδραση των δύο μεσο-ραβδωτών ντοπαμινεργικών προβολών (Nieoullon et al., 1978, 1980). Επίσης, εκφύλιση του παρεγεκφαλιδικού φλοιού επέφερε τροποποίηση των συνολικών επιπέδων της ντοπαμίνης του πρόσθιου εγκεφάλου και πιο συγκεκριμένα μικρότερα επίπεδα της ντοπαμίνης στο ημισφαίριο-στόχο (ομόπλευρο για τον οροφιαίο πυρήνα και αντίπλευρο για τον εμβόλιμο πυρήνα) συγκριτικά με το άλλο ημισφαίριο στο οποίο τα επίπεδα της ντοπαμίνης είτε αυξήθηκαν είτε παρέμεναν σταθερά (Snider and Snider, 1979). Ενδοπεριτοναϊκή έγχυση απομορφίνης προκάλεσε στα πειραματόζωα μονόπλευρες περιστροφές πάντοτε μακριά από το ημισφαίριο με τα χαμηλότερα επίπεδα ντοπαμίνης και διατυπώθηκε η υπόθεση ότι εμφανίστηκε φαινόμενο υπερευαισθησίας των υποδοχέων της ντοπαμίνης στο ημισφαίριο με τα υψηλότερα επίπεδα της ντοπαμίνης. Θεωρήθηκε δε ότι τα υψηλότερα επίπεδα 17

ντοπαμίνης αντικατοπτρίζουν ελαττωμένο ρυθμό απελευθέρωσης της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα και συσσώρευση της ντοπαμίνης προσυναπτικά. Από την άλλη, ηλεκτρικός ερεθισμός του σκώληκα έχει δειχθεί ότι επιφέρει αύξηση στην απελευθέρωση της ντοπαμίνης από τον επικλινή πυρήνα (Dempesy and Richardson, 1987), αποτέλεσμα που έρχεται σε αντίφαση με τα προαναφερθέντα των Snider και Snider δεδομένου ότι ηλεκτρικός ερεθισμός του παρεγκεφαλιδικού φλοιού αναμένεται να επιφέρει τα αντίθετα αποτελέσματα από τον ηλεκτρικό ερεθισμό των εν των βάθει πυρήνων λόγω της ενδιάμεσης ανασταλτικής σύναψης των κυττάρων Purkinje. Η αντίφαση πιθανόν οφείλεται στο διαφορετικό πρότυπο ηλεκτρικού ερεθισμού των δύο πρωτοκόλλων και δείχνει και την πολυπλοκότητα του φαινομένου. Εισαγωγή στον Μεταφορέα της Ντοπαμίνης Στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ), η ντοπαμίνη ελέγχει σημαντικές φυσιολογικές λειτουργίες όπως η έκκριση ορμονών, η ρύθμιση της κίνησης, γνωστικές πορείες και περίπλοκες συμπεριφορές που έχουν σχέση με το συναίσθημα και την ανταμοιβή. Πρόσφατα διαπιστώθηκε ότι ο DAT παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, λειτουργία και στην συντήρηση του ντοπαμινεργικού συστήματος. Από μελέτες έχει διαπιστωθεί ότι το mrna του DAT είναι παρόν μόνο σε νευρώνες που γίνεται σύνθεση DA και ότι η αντίστοιχη πρωτεΐνη συμπίπτει με την ντοπαμινεργική εννεύρωση διάφορων περιοχών του εγκεφάλου, όπως ο κοιλιακός μεσεγκέφαλος, medial forebrain bundle, και το ραχιαίο και κοιλιακό ραβδωτό (Ciliax et al., 1995, Freed et al., 1995). Η ντοπαμινεργική συναπτική νευροδιαβίβαση είναι υπεύθυνη και για ανώμαλες καταστάσεις κυρίως με ψυχικές διαταραχές, όπως κατάθλιψη, σχιζοφρένια, το σύνδρομο ADHD (Διαταραχή Ελλειμματικής Προσοχής - Υπερκινητικότητας) και νόσο του Parkinson (Carlsson, 1987, Roth and Elsworth, 1995, Greengard, 2001). Η ντοπαμινεργική διαβίβαση ξεκινά με την απελευθέρωση της ντοπαµίνης και πραγματοποιείται µε τον μηχανισµό της Ca +2 -εξαρτώµενης συναπτικής εξωκύττωσης, ο οποίος λαµβάνει χώρα στις συναπτικές απολήξεις των κατεχολαµινεργικών αξόνων που διατρέχουν την περιοχή-στόχο τους. Η ντοπαµίνη που απελευθερώνεται στον εξωκυττάριο χώρο αδρανοποιείται µε δύο μηχανισμούς, µε ενζυµικό καταβολισμό και 18

µε επαναπρόσληψη. Ο ενζυµικός καταβολισµός διαµεσολαβείται από δύο ένζυμα, τη µονοάµινο-οξειδάση (MAO) και την Ο-µεθυλοτρανσφεράση των κατεχολαµινών (COMT). Η επαναπρόσληψη της ντοπαμίνης συντελείτε διαμέσου του μεταφορέα της νευρωνικής πλασματικής μεμβράνης (DAT) και είναι σημαντική για τη διατήρηση της ομοιόστασης της στο ΚΝΣ (Giros et al., 1996). Ο DAT φτάνει στην πλασματική μεμβράνη μέσω δυο οδών. Της βιοσυνθετικής, ενδοπλασματικό δίκτυο- Golgiκυστίδια μεταφοράς-αξονική απόληξη καθώς και μέσω ανακύκλωσης όπου εγκαταλείπει την μεμβράνη μέσω ενδοκύττωσης και επιστρέφει πάλι περνώντας απο τις ενδοσωματικές δεξαμενές. Σύμφωνα με τελευταίες μελέτες πάνω στην κυστιδική μεταφορά από το ER προς την απόληξη φαίνεται να εμπλέκονται μηχανισμοί που συνδέονται με COPII καλυμμένα κυστίδια (Miranda et al., 2003). Όμως οι μοριακοί μηχανισμοί που ελέγχουν την όλη διαδικασία παραμένουν άγνωστοι. Οποιαδήποτε βλάβη ή δυσλειτουργία σε κάποια από τα παραπάνω βήματα εμπλέκεται στις παθολογικές καταστάσεις του ντοπαμινεργικού συστήματος, που οφείλονται συνήθως σε μη φυσιολογική έκφραση του DAT στην επιφάνεια με αποτέλεσμα αλλαγές στο χρόνο εκκένωσης της DA απο το συναπτικό χώρο. Ο DAT επιδέχεται πολλές τροποποιήσεις (φοσφωρυλίωση, γλυκοζυλίωση) καθώς και αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες τόσο κυτταροπλασματικές όσο και της εξωκυττάριας ύλης καθώς και υποστρώματα, αγωνιστές, blockers και ψυχοτρόπες ουσίες, οι οποίες ρυθμίζουν την έκφραση και την λειτουργία του. Εντοπισμός. Μετά από ιστοχημικές έρευνες στον εγκέφαλο του αρουραίου για τον DAT, βρέθηκε ότι στα ντοπαμινεργικά κύτταρα της μέλαινας ουσίας (SN, A9 cell group) και της κοιλιακής καλυπτριδικής περιοχής (VTA, A10 cell group) παρουσιάζεται η μέγιστη έκφραση του mrna του DAT ενώ χαμηλά επίπεδα έκφρασης του mrna του DAT εντοπίσθηκαν στον ραχιαίο-μεσαίο πυρήνα, προοπτικό περικοιλιακό πυρήνα του υποθαλάμου και στον κοιλιακό προμαστοειδή πυρήνα, στον πυρήνα του Barrington, στα διασκορπισμένα κύτταρα του pontine tegmentum. Στον εγκέφαλο η ανοσοενεργότητα του DAT είναι μέγιστη στο ραβδωτό και στον επικλινή πυρήνα, ενώ τους ακολουθούν ο olfactory tubercle, μελαινοραβδωτό δεμάτιο και ο πλάγιος habenula, στα στρώματα Ι, ΙΙ και ΙΙΙ του cingulate φλοιού καθώς και στον μεσαίο προμετωπιαίο φλοιό (Ciliax et al. 1995, Hoffman et al., 1998). Στο περιφερικό σύστημα ο DAT έχει ανιχνευθεί στον αμφιβληστροειδή χιτώνα του ματιού, στην γαστρεντερική περιοχή, στους πνεύμονες, 19

στο πάγκρεας, στα νεφρά, στα λεμφοκύτταρα και με τελευταίες μελέτες έχει βρεθεί και στο ρινικό βλεννογόνο (Amenta et al., 2001, Mitsuma et al., 1998, Gordon and Barnes, 2003, Nagendra et al., 2006). Ο εντοπισμός του DAT στα λεμφοκύτταρα είναι ιδιαίτερα μυστηριώδης, αφού υποδηλώνει ότι ο DAT παίζει ρόλο τόσο στην ανοσία, όσο και στις ανοσολογικές αντιδράσεις με τα ψυχοδιεγερτικά φάρμακα. Η DAT πρωτεΐνη βρίσκεται σε αφθονία τόσο στους άξονες και στους δενδρίτες όσο και στα νευρικά περικάρυα των μεσο-μεταιχμιακών και των μελαινοραβδωτών DA νευρώνων (Ninemberg et al., 1996, Sesack et al., 1998). Χρησιμοποιώντας ειδικό αντιορό για επίτοπους του DAT, εδήχθη ότι στην VTA ο DAT ήταν περισσότερο συνδεδεμένος με ενδοκυττάριες μεμβράνες στα περικάρυα και στους μεγάλους εγγύς δενδρίτες ενώ, επίσης, εντοπιζόταν στις πλασματικές μεμβράνες πιο μακρινών δενδριτών καθώς και σε αμύελους νευράξονες (Garris et al., 1994). Στον επικλινή πυρήνα που έχει και διαφορετική πυκνότητα του DAT στον πυρήνα και στο κέλυφος δεν παρουσιάστηκε σημαντική διαφορά στον υποκυττάριο εντοπισμό του DAT στους κιρσοειδέις νευρώνες. Οι ντοπαμινεργικές απολήξεις στον προμετωπιαίο φλοιό του επίμυ επιδεικνύουν χαμηλά επίπεδα της DAT πρωτεΐνης σε σχέση με το ραβδωτό και άλλες περιοχές του πρόσθιου εγκέφαλου (Sesack et al., 1998, Hoffman et al., 1998). Αξιοσημείωτη είναι η αποκάλυψη ότι ο DAT κατά προτίμηση εντοπίζεται περισυναπτικά παρά σαν συναπτικό κομμάτι της προσυναπτικής μεμβράνης, με την βοήθεια ανοσοχημικών τεχνικών ανάλυσης της υπερδομής των μορίων (Ninemberg et al., 1996, Sesack et al., 1998) καθώς και με βολταμετρικές έρευνες (Garris et al., 1994). DAT: Δομή Λειτουργία - Ρύθμιση Ο DAT είναι μέλος της οικογένειας των νευρωνικών μεμβρανικών μεταφορέων που εξαρτώνται από Na + /Cl - (SLC6). Αυτή η οικογένεια περιέχει επίσης τους μεταφορείς για την νορεπινεφρίνη (NET), τη σεροτονίνη (SERT), το γ- αμινοβουτυρικό οξύ (GAT), καθώς και των αμινοξέων, γλυκίνη (GLYT), ταυρίνη, προλίνη, μπεταΐνη και κρεατίνη. (Gainetdinov et al., 2003, Chen et al., 2004). Το γονίδιο που κωδικοποιεί τον DAT κλωνοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1991 από διαφορετικές ομάδες ερευνητών (Giros et al., 1991), ταυτόχρονα με τους ΝΕΤ και SERT όπως και τους ανασταλτικούς νευροδιαβιβαστές GΑΒΑ και γλυκίνη. Το 20

mdat (mouse), γονίδιο (Slc6a3) εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 13 C1; 13 41.0 cm και καλύπτει πάνω από 41,9 kb. Το ώριμο-mrna του DAT αποτελείται από 3456 bp. Οι DAT των θηλαστικών επιδεικνύουν υψηλή ταυτοποίηση στις αμινοξικές αλληλουχίες τόσο ανάμεσα στα είδη όσο και με τον νοραδρενικό μεταφορέα (~67%), SERT (~49%) και γ-αμινοβουτυρικού οξέως (GABA) μεταφορέα (~45%). Ο mdat [(Slc6a3_MOUSE) Sodium-dependent dopamine transporter (DA transporter) (DAT) Mus musculus] έχει 619 αμινοξέα και σαν πρωτεΐνη ανιχνεύεται περίπου στα 68805 Da. (Από Nianhang Chen, Maarten E.A. Reth, European Journal of Pharmacology 405(2000)329-339) Ο DAT είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με Μ.Β. ~80 kda, το οποίο γίνεται ~50 kda μετά από ενζυμική απομάκρυνση των γλυκο-ομάδων. Αποτελείται από 619 αμινοξέα που διατρέχουν την κυτταρική μεμβράνη 12 φορές (12 ΤΜD) με το αμινοτελικό άκρο και το καρβοξυτελικό άκρο ενδοκυτταρικά (Giros et al., 1993). Εντοπίζεται μόνο περισυναπτικά της προσυναπτικής απόληξης και πιστεύεται ότι ελέγχει την ένταση και την διάρκεια της ντοπαμινεργικής νευροδιαβίβασης μέσω μείωσης της συγκέντρωσης της DA στον εξωκυττάριο χώρο. Η πρόσληψη της ντοπαμίνης απαιτεί την παράλληλη είσοδο ιόντων Να+ και έξοδο ιόντων Cl- σε αναλογία 1 μόριο νευροδιαβιβαστή/ 2 ιόντα Να + / 1 ιόν Cl-, αντίθετα προς την ηλεκτροχημική βαθμίδωση και υποβοηθούμενη απο την αντλία Να + /Κ + (Gu et al., 1994, 1996, Rudnick, 1998). Για την μεταφορά της DA, έχει προταθεί ένας μηχανισμός που αποτελείται από εσωτερικές και εξωτερικές πύλες που ρυθμίζουν την κίνηση του υποστρώματος στο ενδοκυττάριο περιβάλλον της απόληξης (Jardetzky, 21

1966, Rudnick, 1998). Η ντοπαμίνη μπορεί να υφίσταται σε ανιονική, κατιονική καθώς και μορφή διπολικού ιόντος, ανάλογα με το ph του περιβάλλοντος στο οποίο βρίσκεται. Έρευνες έδειξαν ότι όλα τα υποστρώματα των μεταφορέων ντοπαμίνης είναι παράγωγα φαινυλαμίνης που είναι θετικά φορτισμένα σε φυσιολογικό ph (Carnerio et al., 2002). Εδώ θα πρέπει να επισημάνουμε ότι ο DAT μεταφέρει DA και στην συναπτική σχισμή, λόγω συσσώρευσης του ενδοκυττάριου υποστρώματος δημιουργούνται οι κατάλληλες θερμοδυναμικές συνθήκες που προάγουν την αντίστροφη μεταφορά, έχοντας σαν επακόλουθο την εκροή υποστρώματος από τον ενδο στον εξωκυττάριο χώρο (Fischer and Cho, 1979, Liang and Rutledge, 1982). Για την διαλεύκανση της περιοχής πρόσδεσης και μετατόπισης-μεταφοράς αρχικά της DA και έπειτα υποστρωμάτων όπως κοκαΐνης, αμφεταμίνης και γενικά τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών ουσιών, έχουν πραγματοποιηθεί μελέτες με δημιουργία χιμαιρικών μοντέλων DAT-NET (Buck and Amara, 1994, Giros et al., 1994). Τα αποτελέσματα αυτών των ερευνών υποδεικνύουν ότι η περιοχή που περικλείεται μεταξύ ΤΜ6-ΤΜ8 είναι σημαντική για την συγγένεια και πρόσδεση κοκαΐνης, αμφεταμίνης και γενικά τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών ουσιών ενώ τα αμινοξικά κατάλοιπα που εκτείνονται από το ΤΜ9 μέχρι και το άκρο της καρβοξυτελικής ουράς ευθύνονται για την υψηλή συγγένεια με το υπόστρωμα. Οι περιοχές που εμπλέκονται στην μεταφορά του υποστρώματος είναι αδιευκρίνιστες και μάλιστα φέρνουν σε αντιπαράθεση δυο μεγάλες ερευνητικές ομάδες. Αυτή του Giros (1994) να προτείνει μια περιοχή μεταξύ ΤΜ4-ΤΜ8 και την μελέτη των Buck και Amara (1994) να υποδεικνύουν τα πρώτα πέντε διαμεμβρανικά τμήματα για την ίδια λειτουργία. Ανάμεσα στα ΤΜ3 και ΤΜ4 υπάρχει μια μεγάλη εξωκυτταρική θηλιά που διαθέτει τρεις πιθανές θέσεις Ν-γλυκοζυλίωσης. Ο DAT in vivo είναι σε μεγάλο βαθμό γλυκοζυλιωμένος και διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι η γλυκοζυλίωση, είναι απαραίτητη για την έκφραση του μεταφορέα στην πλασματική μεμβράνη, αλλά όχι και για την πρόσδεση του υποστρώματος. (Vaughan et al., 1996, Torres et al., 2003). Ενισχύοντας αυτά τα ευρήματα ο Carneiro και συνεργάτες (2002), γνωρίζοντας τις ακριβείς θέσεις Ν-γλυκοζυλίωσης στις ασπαραγίνες (Asp) DAT, δημιούργησαν μια σειρά από μεταλλάξεις όπου αντικαθιστούσαν κάθε μια από τις ασπαραγίνες με αλανίνη (Ala) τις οποίες μετέφεραν και προκάλεσαν την έκφρασή τους σε HEK-293 κυτταρικές σειρές, για να αναλύσουν την μεταφορά, το μέγεθος της πρωτεΐνης και 22

διαμερισματοποίηση της. Όπως ήταν αναμενόμενο σε μεμονωμένες αντικαταστάσεις καταλοίπων Asp, παρατηρήθηκε μείωση στο μοριακό βάρος της πρωτεΐνης, υποδηλώνοντας ότι και οι τρεις ομόλογες θέσεις είναι γλυκοζυλιωμένες. Όσον αφορά την ικανότητα μεταφοράς τα μονομερή μεταλλάγματα παρουσίασαν παρόμοια ικανότητα πρόσληψης όσο και μετανάστευσης στην μεμβράνη, με αυτή του άγριου τύπου DAT, καταδεικνύοντας ότι η γλυκοζυλίωση δεν είναι απαραίτητη για την διαδικασία της πρόσδεσής και της μεταφοράς του υποστρώματος. Έπειτα αφαίρεσαν όλες τις γλυκοζυλιομένες περιοχές θέλοντας να εντοπίσουν κάποια εναλλαγή στην έκφραση και την λειτουργία του μεταφορέα. Έτσι με ανοσοφθορισμό εντόπισαν υποκυτταρικά τον μη-γλυκοζυλιομένο DAT και σε συνδυασμό με την καθήλώση του μεβρανικού DAT με βιοτινυλίωση φάνηκε μια μείωση της μεταφορικής δραστηριότητας του μεταφορέα, η οποία ήταν αποτέλεσμα της αυξημένης κατακράτησης-διατήρησης της μη γλυκοζυλιομένης δομής σε ενδοκυτταρικά διαμερίσματα. Συμπερασματικά, η απομάκρυνση και των τριών θέσεων γλυκοζυλίωσης μερικώς ελαττώνει την διακίνηση του μεταφορέα στην πλασματική μεμβράνη, εν τούτοις το μη γλυκοζυλιωμένο μετάλλαγμα είναι ακόμη ικανό να σχηματίσει τη λειτουργική δομή του μεταφορέα στην μεμβράνη. Τέλος ο Kuhar και συνεργάτες εντόπισαν διαφορές στο μοτίβο γλυκοζυλίωσης του DAT α) σε διαφορετικές εγκεφαλικές περιοχές (επικλινής πυρήνας έναντι ραβδωτού, Lew et al., 1991), β) σε διαφορετικά είδη (Patel, et al., 1993) καθώς και γ) κατά τα στάδια ανάπτυξης (Patel et al., 1994). Η αποσαφήνιση της αλληλουχίας των αμινοξέων του DAT (πρωτοταγής δομή) αποκάλυψε διάφορα πιθανά σημεία φωσφορυλίωσης από πρωτεϊνικές κινάσες (Giros et al., 1991, Shimada et al., 1991, Usdin et al., 1991). Οι αναμενόμενες ενδοκυτταρικές περιοχές του hdat περιέχουν κατάλοιπα από 15 σερίνες (Ser), 9 θρεονίνες (Τhr) και 5 τυροσίνες (Tyr). Τα περισσότερα από αυτά συναντώνται σε ομόλογες αλληλουχίες πρωτεϊνικών κινασών C (PKC), της πρωτεϊνικής κινάσης εξαρτώμενης από camp (PKA) και από cgmp (PKG) καθώς και της κινάσης που εξαρτάται από ασβέστιο και καλμοδουλίνη (CaMK). Κάποιες από αυτές τις περιοχές είναι πολύ συντηρημένες σε όλη την οικογένεια των μεταφορέων των νευροδιαβιβαστών, περιλαμβάνοντας PKC/PKG ομόλογες αλληλουχίες στην δεύτερη ενδοκυτταρική θηλιά και διάφορες θέσεις στο Ν και C-τελικό άκρο, κοντά στα ΤΜ1 και ΤΜ 12 (Vaughan, 2004). Έπειτα από μεταβολική φωσφοριλίωση του DAT με χρήση 32 PO 4 κατέδειξε ότι οι ισομορφές του DAT σε άνθρωπο, αρουραίο και ποντικό 23

είναι φωσφοπρωτεΐνες. Μελέτες που έχουν γίνει τόσο σε ιστό ραβδωτού όσο και σε καλλιέργειες κυττάρων, δείχνουν ότι ο DAT επιδεικνύει βασική φωσφοριλίωση, η οποία προκαλείται από επώαση με ενεργοποιητές της PKC, πχ. PMA (phorbol 12- myristate 13-acetate), αναστολείς φωσφατασών (PPI), πχ. oκαϊδικό οξύ (ΟΑ) ή και άλλα υποστρώματα όπως αμφεταμίνη (AMPH) και μεθαμφεταμίνη (METH) (Huff et al., 1997, Vaughan et al. 1997; Cowell et al., 2000, Granas et al., 2003, Lin et al. 2003; Cervinski et al. 2005). Αυτές οι ουσίες επίσης μεταβάλλουν την έκφραση του DAT στην επιφάνεια του κυττάρου και τις ιδιότητές του, γεγονός που ώθησε πολλές ερευνητικές ομάδες στην διευκρίνηση της σχέσης μεταξύ φωσφοριλίωσης και ρύθμισης του μεταφορέα. Η PKC αποτελεί την πιο διεξοδικά μελετημένη κινάση σε σχέση με την εμπλοκή της στην ρύθμιση του DAT και βέβαια πληθώρα μελετών έγιναν και με διάφορες άλλες κινάσες. Έχει αποδειχθεί ότι η δραστηριότητα του DAT διαμορφώνεται από ενεργοποιητές και αναστολείς της ΡΚΑ, CaMK, PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase), PKB/Akt, ΜΑΡΚ (mitogen activated protein kinase) και κινάσες τυροσίνης (Uchikawa et al. 1995; Batchelor and Schenk 1998; Doolen and Zahniser 2001; Carvelli et al. 2002; Lin et al., 2003, Moron et al., 2003, Page et al., 2004, Garcia et al., 2005), αλλά μόνο λιγοστά στοιχεία έχουν μέχρι σήμερα αναφερθεί σε σχέση με την πιθανή ανάμειξή τους στην φωσφοριλίωση του DAT. Επιπροσθέτως, παραμένει ακόμη άγνωστο το φυσιολογικό ερέθισμα και ο υποδοχέας που ρυθμίζει την φωσφοριλίωση και την in vivo λειτουργία του DAT. Έχει δειχθεί ότι ενεργοποίηση του υποδοχέα του γλουταμινικού που συνδέεται με την PKC (mglur) σε ιστό από ραβδωτό οδηγεί σε μειω-ρύθμιση του DAT (Page et al. 2001), αλλά προσπάθειες από την ομάδα των Foster και Vaughan (2006) να εντοπίσουν μεταβολή στην φωσφοριλίωση του DAT με χρήση αγωνιστών για τον mglur ήταν αρνητικές (Cervinski et al., 2005). Επίσης σε ΕΜ4 κύτταρα με ενσωματωμένο τον hdat, παρατηρήθηκε ότι οι υποδοχείς της ουσίας Ρ (hnk-1) συνδυάζονται με την PKC με αποτέλεσμα την μειω-ρύθμιση της μεταφοράς DA και αύξηση της φωσφοριλίωσης του DAT (Granas et al., 2003), όμως αυτή η συσχέτιση δεν έχει ακόμη αποδειχθεί σε νευρικό ιστό. Σημαντικό ρόλο παίζουν και οι φωσφατάσες, όπως PP1, PP2A και PP2B οι οποίες απομακρύνουν τις φωσφο-ομάδες και συνεπώς ανταγωνίζονται τις κινάσες. Τα αποτελέσματα in vivo τόσο των κινασών, των φωσφατασών καθώς και των ενεργοποιητών και αναστολέων τους, στην φωσφορυλίωση και αποφωσφορυλίωση του DAT φαίνονται στις παρακάτω εικόνες, όπου έχουν επιδράσει με διαφορετικές ουσίες σε ιστό ραβδωτού από ποντίκι. 24

Επίπεδα φωσφορυλιομένου DAT με αυτοραδιογραφία και SDS-PAGE, όπου παρατηρείται μεγάλη αύξηση της φωσφορυλίωσης στην επώαση με ΟΑ. Αναστολή της αποφωσφορυλίωσης του DAT από συγκεκριμένους αναστολεις φωσφατασών. Ένα σημαντικό βήμα στην κατανόηση της δράσης και των αποτελεσμάτων των παραπάνω ουσιών, έγινε με τον εντοπισμό των θέσεων φωσφορυλίωσης του DAT. Σε πειράματα σήμανσης με 32 ΡΟ 4 σε ιστό ραβδωτού από φυσιολογικό αρουραίο, που είχε προεπωαστεί με ΡΜΑ και ΟΑ, έχει δειχθεί ότι φωσφορυλίωση λαμβάνει χώρα κυρίως σε κατάλοιπα σερίνης. (Foster et al., 2002a, b). Επίσης έχουν παρατηρηθε ί χαμηλά επίπεδα φωσφοθρεονίνης αλλά καθόλου φωσφοτυροσίνης (Vaurhan, 2004). Η περιοχή φωσφορυλίωσης του DAT αρχικά αναγνωρίστηκε με χαρτογράφηση πεπτιδίων σε σεσημασμένο με 32 ΡΟ 4 μεταφορέα. Αυτές οι μελέτες επέδειξαν ότι πεπτίδια από το Ν-τελικά άκρο περιείχαν την βασική και την προκαλούμενη από ΡΜΑ και ΟΑ φωσφορυλίωση, αφήνοντας εκτός το C-τελικό άκρο και τις ενδοκυτταρικές θηλιές. (Foster et al., 2002b). Το Ν-τελικό άκρο του rdat περιέχει 9 σερίνες αραιά κατανεμημένες, έξι από τις οποίες απαντώνται και στον hdat ενώ μια επιπρόσθετη χαρτογράφηση του rdat υποδείκνυε ότι η πλειονότητα της σήμανσης με 32 ΡΟ 4 παρατηρήθηκε στην ομάδα των σερινών που βρίσκονται κοντά στο απώτερο Ν-τελικό άκρο της πρωτεΐνης. Αυτό το εύρημα, αργότερα επιβεβαιώθηκε με απομάκρυνση των πρώτων 22 και 21 καταλοίπων σε άνθρωπο και αρουραίο αντίστοιχα, όπου είχαμε κατάργηση τόσο της βασικής όσο και της ΡΜΑ προκαλούμενης φωσφορυλίωσης (Granas et al., 2003, Cervinski et al., 2005). 25

Τα παραπάνω αποτελέσματα μαρτυρούν ότι η φωσφορυλίωση, είτε είναι φυσιολογική είτε προκαλούμενη λαμβάνει χώρα στην ίδια περιοχή. Η ομάδα των σερινών στο Ν-τελικό άκρο περιέχει 5 σερίνες στις θέσεις 2, 4, 7, 12 και 13 που είναι ταυτόσημες σε rdat και hdat, όπως και μια σερίνη στην θέση 21 που είναι μοναδική για τον rdat, όμως ο αριθμός και οι θέσεις φωσφορυλίωσης παραμένουν άγνωστες. Μόνο οι σερίνες 7 και 21 είναι ομόλογες με περιοχές της PKC και μερικά πειράματα κατέδειξαν απώλεια της προκαλούμενης από ΡΜΑ φωσφορυλίωσης μετά από μετάλλαξη στην σερίνη 7 (Lin et al., 2003) ενώ σε μεμονωμένα μεταλλάγματα, όπου για κάθε σερίνη έγινε αντικατάσταση με αλανίνη, εντοπίζοναται τόσο την φυσιολογική όσο και την προκαλούμενη από ΡΜΑ φωσφορυλίωση (Foster et al., 2003a), υπαινίσσοντας ότι η προκαλούμενη από την PKC φωσφορυλίωση λαμβάνει χώρα σε περισσότερα από ένα σημεία, ακόμη και σε μη αναμενόμενα. Τέλος ένα άλλο αναπάντητο ερώτημα παραμένει ο εντοπισμός της φωσφοθρεονίνης στην αμινοξική αλληλουχία, αφού δεν βρίσκεται εντός της περιοχής 21/22 του Ν-τελικού άκρου. Η χορήγηση ΡΜΑ και ΟΑ εκτός από το γεγονός ότι προάγουν την φωσφορυλίωση του DAT επίσης συντελούν και στην μείωση της μεταφοράς DA (Zahniser and Doolen, 2001, Vaughan, 2004). Έχουν προταθεί δυο πιθανοί μηχανισμοί για να εξηγήσουν αυτό το φαινόμενο. Ο πρώτος είναι η ενδοκυττάρωση του DAT, η οποία δεν επιτρέπει στον DAT να παραμείνει στην μεμβράνη ώστε να έχει πρόσβαση στο υπόστρωμα και η δεύτερη μέσω ρύθμισης της δραστηριότητας του DAT στα στάδια μετανάστευσης στο κυτταρόπλασμα (trafficking). Οι DAT κυκλοφορούν γρήγορα μεταξύ πλασματικής μεμβράνης και ενδοσωματικών διαμερισμάτων είτε φυσικά είτε προκαλούμενοι από την PKC, ενώ έχει προταθεί ότι η αυξημένη εσωτερίκευση του DAT από την PKC προκαλείται λόγω επιτάχυνσης της ενδοκυττάρωσης και μειωμένης επιστροφής του πίσω στην μεμβράνη (Daniels and Amara, 1999, Melikian and Buckley, 1999, Loder and Melikian, 2003). Η συσχέτιση της φωσφορυλίωσης του DAT με την μειωμένη επιφανειακή έκφραση και δραστηριότητά του οδήγησαν στην υπόθεση ότι η φωσφορυλίωση ήταν ένα σινιάλο εσωτερίκευσης του μεταφορέα και μάλιστα με τρόπο ανάλογο της απευαισθητοποίησης των υποδοχέων των G-συνεζευγμένων πρωτεϊνών (GPCR) (Gainetdinov et al., 2004). Εν τούτοις μελέτες όπου έγινε απαλοιφή των ομάδων σερίνης από το Ν-τελικό άκρο των hdat και rdat και συνεπώς καταργείται η φωσφορυλίωση, έδειξαν ότι αυτή δεν επηρεάζει την 26

μειορύθμιση ή την εσωτερίκευση του DAT που προκαλείται από την PKC, τονίζοντας ότι η μειωρύθμιση του DAT συμβαίνει και απουσία φωσφορυλίωσης (Granas et al., 2003; Cervinski et al., 2005). Πιο πρόσφατα, ανακαλύφθηκαν μοτίβα περιοχές στο C-τελικό άκρο, που διαμεσολαβούν τόσο στην φυσική όσο και στην προκαλούμενη από PKC ρύθμιση της ενδοκυττάρωσης, τα οποία δεν περιέχουν σερίνες ή θρεονίνες (Holton et al., 2005). Τα παραπάνω ευρήματα αποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση του DAT δεν αποτελεί σινιάλο για εσωτερίκευση, όπως αρχικά είχε προταθεί, αλλά η πρόκληση τόσο μειω-ρύθμισης μέσω ενός PKC εξαρτώμενου τρόπου, όσο και ενδοκυττάρωσης πρέπει να συμβαίνει μέσω φωσφορυλίωσης μορίων στο κυτταρόπλασμα ή και άλλων πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τον DAT. Άρα η φωσφορυλίωση του DAT μπορεί να εξυπηρετεί ένα διαφορετικό ρόλο, όπως ο έλεγχος της λειτουργίας του μεταφορέα στην πλασματική μεμβράνη ή ρύθμιση των τελευταίων γεγονότων της κυκλοφορίας του μεταφορέα. Επιπροσθέτως η λειτουργία του DAT μπορεί ακόμη να μεταβληθεί γρήγορα είτε θετικά είτε αρνητικά και από διάφορα άλλα σηματοδοτικά μόρια / μονοπάτια (Zahniser and Doolen, 2001). Η μεταφορά της DA αυξάνεται με ένα CaMKεξαρτώμενο τρόπο, μέσω ενεργοποιητών της ΡΚΑ (Batchelor and Schenk, 1998, Page et al., 2004) και του Ca2+ (Uchikawa et al., 1995), χωρίς να μεταβάλλεται το επίπεδο φωσφορυλίωσης του DAT (Vaughan et al., 1997; Vaughan, 2004). Στην αυξορύθμιση του DAT, επίσης εμπλέκονται οι MAPK και PI3K (Carvelli et al., 2002, Moron et al., 2003) όπως επίσης και στην βασική φωσφορυλίωση του μεταφορέα (Lin et al., 2003). Από την άλλη μείωση στην ταχύτητα μεταφοράς της DA έχει παρατηρηθεί έπειτα από χορήγηση αναστολέων της πρωτεϊνικής κινάσης της τυροσίνης (Zahniser and Doolen, 2001) ή μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) (Lonart and Johnson, 1994, Pogun et al., 1994), αν και έχει επίσης αναφερθεί αύξηση της δραστηριότητας του DAT (West et al., 2002, Volz and Schenk, 2004). Αυτά τα αποτελέσματα έρχονται να μας υποδείξουν τον πιθανό-δυνητικό ρόλο των κινασών, ΝΟ σινιάλων και της PKC στην αμοιβαία ρύθμιση των επιπέδων του DAT στην πλασματική μεμβράνη, ενδεχομένως συνδυάζοντας μηχανισμούς εξαρτώμενους και μη από την φοσφωρυλίωση του μεταφορέα. Μελέτες του DAT έδειξαν ότι ο μεταφορέας υφίσταται στην πλασματική μεμβράνη σαν πολυμερές και συγκεκριμένα σαν ολιγομερές-τετραμερές (διμερήδιμερών) (Hastrup et al., 2001). Διάφορες περιοχές του DAT έχουν ενοχοποιηθεί για 27