Προκαρυωτικοί οργανισµοί = βακτήρια, κυανοβακτήρια. - µονοκύτταροι - κυκλικό χρωµόσωµα, που δεν περικλείεται µέσα σε πυρηνική µεµβράνη. - απλοειδείς - δεν σχηµατίζουν ζυγώτες - δεν εκτελούν µείωση. - προσβάλλονται από ιούς που λέγονται βακτηριοφάγοι. METABIBAΣH ΓONI IΩN ΣE BAKTHPIA (1) Bακτηριακή σύζευξη (2) Mεταγωγή δια µέσου βακτηριοφάγου (3) Mετασχηµατισµός µε DNA BAKTHPIAKH ΣYZEYΞH Aπαιτεί διακυτταρική επαφή (Lederberg, Tatum, Davis) Eξαρτάται από την παρουσία του παράγοντα F: µικρό κυκλικό DNA (100kb) (επίσωµα). Mεταβίβαση γενετικής πληροφορίας µόνο προς την κατεύθυνση F + > F - (Hayes). Tα γονίδια του παράγοντα F δίνουν στο F + κύτταρο την ικανότητα να: (1) Aντιγράφει το F DNA αυτόνοµα (ανεξάρτητα από το κυρίως χρωµόσωµα) (2) Παράγει ινίδια (pili) που συνδέουν F + µε F - κύτταρα (3) Mεταφέρει αντίγραφο του επισώµατος F στο κύτταρο λήπτη (F - ) µέσω του ινιδίου. (4) Mεταφέρει αντίγραφο οποιουδήποτε DNA είναι συνδεµένο µε τον παράγοντα F στον λήπτη. (5) Eνσωµατώνει το επίσωµα στο κυρίως χρωµόσωµα (δια µέσου ανασυνδυασµού), οπόταν µεταφέρονται χρωµοσωµικά γονίδια κατά την σύζευξη. Στελέχη που έχουν τον F ενσωµατωµένο στο χρωµόσωµα λέγονται Hfr (high frequency of transfer). Mεταφέρουν το γονιδίωµά τους από το σηµείο ένθεσης του F (αρχή µεταφοράς) µε καθορισµένη φορά. Συνήθως η σύζευξη διακόπτεται τυχαία πριν από την µεταφορά του όλου γονιδιώµατος. (6) Aποσχίζει τον F από το χρωµόσωµα ενός κυττάρου Hfr ξαναδηµιουργώντας έτσι ένα F +. Aν αυτή η απόσχιση είναι ανακριβής το επίσωµα θα 1
συµπεριλάβει γονίδια γειτονικά στο το σηµείο ένθεσής του. Aυτός ο παράγοντας λέγεται F' και συµπεριφέρεται ακριβως όπως ο F, απλώς φέρνοντας µαζί του τα επιπλέον γονίδια. H µεταφορά γονιδίων µέσω του F' λέγεται και φυλοµεταγωγή. Bάσει των παραπάνω: F + x F - στην πλειοψηφία F + απόγονοι µε γονότυπο ίδιο µε τον F - γονέα (µεταβίβαση µόνο του επισώµατος F από τα F + στα F - ). Σπάνια µεταβίβαση χρωµοσωµικών γονιδίων χωρίς συγκεκριµµένη σειρά, λόγω τυχαίων γεγονότων δηµιουργίας Hfr στον γονικό F + πληθυσµό. Hfr x F - στην πλειοψηφία F - απόγονοι µε ανασυνδυασµένο γονότυπο. Mεταβίβαση γενετικών δεικτών από Hfr προς F - µε συγκεκριµµένη σειρά. Σπάνια µεταβίβαση του F (µεταφέρεται τελευταίος) δηµιουργώντας ανασυνδυασµένο Hfr. F' x F - στην πλειοψηφία F' µεροδιπλοειδείς απόγονοι µε χρωµοσωµικό γονότυπο του F - γονέα (µεταβίβαση µόνο του επισώµατος). H γενετική χαρτογράφηση επιτυγχάνεται µε διασταυρώσεις Hfr x F - και ανάλυση της σειράς µεταβίβασης γενετικών δεικτών (µέθοδος διακεκοµµένης διασταύρωσης). Mετά την εξακρίβωση της σειράς µεταβίβασης γονιδίων από ένα συγκεκριµµένο Hfr, µπορούµε να µετρήσουµε συχνότητα ανασυνδυασµού µεταξύ γενετικών δεικτών για πιο λεπτοµερή χαρτογράφηση. Λόγω της µεροζυγωτικής κατάστασης, πρέπει να επιλέξουµε για το "αργότερο" γονίδιο (αυτό που µεταφέρεται τελευταίο) για να είµαστε σίγουροι ότι µετράµε συχνότητα διασκελισµών και όχι τυχαία διακοπή της µεταφοράς του εξωγονιδιώµατος. ΣHM: Aνασυνδυασµός σε βακτηριακές διασταυρώσεις λαµβάνει χώρα ανάµεσα από ένα κυκλικό χρωµόσωµα (το ενδογονιδίωµα) και ένα ευθύγραµµο τµήµα του γονιδιώµατος του Hfr (το εξωγονιδίωµα). Mόνο διπλοί διασκελισµοί µπορούν να δώσουν βιώσιµα κυκλικά χρωµοσώµατα στους απογόνους. Aντίθετα µε τους κλασικούς (Mendelian) µηχανισµούς, το ένα από τα δύο αµοιβαία προϊόντα του ανασυνδυασµού χάνεται (αυτό που καταλήγει στο µη βιώσιµο ευθύγραµµο χρωµοσωµικό κοµµάτι). Aυτά τα χαρακτηριστικά ορίζουν την µεροζυγωτική γενετική (µεροζυγώτης = F - κύτταρο που έχει παραλάβει κοµµάτι του γονιδιώµατος ενός Hfr). 2
ΒΑΚΤΗΡΙΟΦΑΓΟΙ Aκόµη πιο λεπτοµερής χαρτογράφηση επιτυγχάνεται µε την µεταγωγή. Πριν ασχοληθούµε µε την φαγο-µεταγωγή, δυο λόγια γενικά για τους βακτηριοφάγους: - ιοί που προσβάλλουν βακτήρια - σωµατίδια αποτελούµενα από ένα νουκλεϊκό οξύ (DNA ή RNA) περικλεισµένο σε πρωτεϊνικό καψίδιο (όπως όλοι οι ιοί). - κατά την προσβολή του κυττάρου ξενιστή τους εισάγουν µόνο το νουκλεϊκό οξύ τους στο κύτταρο (όπως όλοι οι ιοί). - οι γενετικές πληροφορίες του φάγου αναπρογραµµατίζουν τον ξενιστή προς ώφελος του πολλαπλασιασµού του φάγου καταλήγοντας σε λύση του κυττάρου και απελευθέρωση νέων ιοσωµάτων. Oι µολυσµατικοί (virulent) βακτηριοφάγοι προξενούν υποχρεωτικά λύση του ξενιστή τους. Aλλοι, οι λεγόµενοι ήπιοι (temperate), έχουν την εκλογή µεταξύ λύσης και λυσιγονίας. Λυσιγόνα βακτήρια είναι αυτά που περιέχουν ένα φαγικό γονιδίωµα σε λανθάνουσα κατάσταση, τον προφάγο: - το προφαγικό γονιδίωµα µπορεί να είναι ενσωµατωµένο στο χρωµόσωµα του ξενιστή, ή να είναι εξωχρωµοσωµικό πλασµίδιο. - όλες οι λειτουργίες (γονίδια) του φάγου είναι κατεσταλµένα κατά την φάση της λυσιγονίας, εκτός από αυτές που προσδίδουν στον λυσιγόνο ξενιστή ανοσία στην υπερµόλυνση από άλλα ιοσώµατα (του ίδιου είδους). - το προφαγικό γονιδίωµα µεταδίδεται µιτωτικά (σαν κοινό βακτηριακό γονίδιο / πλασµίδιο) χωρίς παραγωγή ιοσωµάτων. - κάτω από ορισµένες συνθήκες οι λειτουργίες του φάγου µπορούν να επαχθούν και επακολουθεί λύση. Eνα παράδειγµα επαγωγής προφάγου είναι η ζυγωτική επαγωγή, που λαµβάνει χώρα όταν προφάγος εισάγεται σε µή άνοσο κυτταρόπλασµα δια µέσου βακτηριακής σύζευξης, δηλαδή: [(λ) σηµαίνει ότι το συγκεκριµµένο στέλεχος είναι λυσιγόνο για τον βακτηριοφάγο λ] F + x F - (λ) F + (λ) και σπανιότερα ανασυνδυασµένοι F - (λ) τύποι F + (λ) x F - F + και ανασυνδυασµένοι F -, όλοι χωρίς προφάγο Hfr x F - (λ) F - (λ) ανασυνδυασµένοι τύποι Hfr (λ) x F - F - µη λυσιγόνοι ανασυνδυασµένοι τύποι µέχρι κάποιο γονίδιο. "Aργότερα" γονίδια (αυτά που βρίσκονται µετά το σηµείο 3
ένθεσης του προφάγου) δεν ανακτώνται ανάµεσα στους ανασυνδυασµένους τύπους (έχουν υποστεί λύση λόγω ζυγωτικής επαγωγής του φάγου λ, που εισήλθε στο µη άνοσο F - κυτταρόπλασµα). Hfr (λ) x F - (λ) F - (λ). Oλα τα γονίδια του Hfr µπορούν να συµµετάσχουν σε ανασυνδυασµό - απλώς τα γονίδια µετά τον προφάγο εισέρχονται στο άνοσο F - κύτταρο πιο καθυστερηµένα. METAΓΩΓH H ικανότητα ορισµένων βακτηριοφάγων να µεταβιβάζουν βακτηριακά γονίδια από ένα κύτταρο σε άλλο - χωρίζεται σε γενικευµένη και εξειδικευµένη. Γενικευµένη: τυχαίο τµήµα βακτηριακού DNA εισάγεται κατά λάθος στην κεφαλή φάγου (αντί για το φαγικό γονιδίωµα) κατά την διαδικασία σχηµατισµού ιοσωµάτων, όταν το DNA του ξενιστή έχει κοµµατιαστεί. Mετά από προσβολή βακτηρίου από τέτοιο µετάγον ιόσωµα, πρέπει να επακολουθήσει διπλός διασκελισµός για να ενσωµατωθεί το µεταφερόµενο τµήµα στο γονιδίωµα του λήπτη (µεροζυγωτική κατάσταση όπως στην σύζευξη Hfr x F - ). Συχνότητα ταυτόχρονης µεταγωγής είναι µέτρο σύνδεσης γονιδίων. Eπειδή η κεφαλή του φάγου έχει χωρητικότητα µόνο για ένα µικρό τµήµα του γονιδιώµατος, µόνο πολύ κοντινά γονίδια παρουσιάζουν συν- µεταγωγή. Π.χ. µε τον φάγο P1, η µεγαλύτερη απόστααση γονιδίων που δίνει συν-µεταγωγή είναι 90kb ή 2min. Eξειδικευµένη: (βλ. εικόνα) όταν επάγεται ήπιος προφάγος µπορεί να αποσχισθεί από το βακτηριακό χρωµόσωµα επακριβώς ή µε κάποια ανακρίβεια. Στην δεύτερη (πιο σπάνια) περίπτωση συµπεριλαµβάνει γειτονικά γονίδια (πάντα τα ίδια, γιατί οι ήπιοι φάγοι έχουν συγκεκριµµένα σηµεία ένθεσης στο χρωµόσωµα του ξενιστή) στο γονιδίωµα των απογόνων φάγων. Συγχρόνως, αφήνει πίσω φαγικά γονίδια και έτσι ο µετάγων φάγος είναι ελαττωµατικός στις λειτουργίες λύσης κσι λυσιγονίας, π.χ. ο λdgal (λ defective gal + ) φέρει το γονίδιο gal, που είναι δίπλα στο σηµείο ένθεσης του βακτηριοφάγου λ. Mετάγοντες φάγοι όπως ο λdgal χρειάζονται ταυτόχρονη µόλυνση µε βοηθητικό φάγο (άγριου τύπου) για να ενσωµατωθούν στο γονιδίωµα νέου 4
λήπτη. Tα παραγόµενα λυσιγόνα στελέχη έχουν συνήθως δύο ενσωµατωµένους φάγους: έναν λ και έναν λdgal (και είναι µεροδιπλοειδή για το gal). Aυτά τα στελέχη, όταν λυθούν, παράγουν υπερκείµενα λύσης µε ψηλή συχνότητα µεταγωγής (high frequency transducing or HFT lysates), λόγω της συχνής τώρα παραγωγής ιοσωµάτων λdgal, από την σωστή πλέον απόσχιση του προφάγου λdgal. Σε σπανιώτερες περιπτώσεις η µεταβίβαση του gal από τον µετάγοντα φάγο στο χρωµόσωµα του λήπτη µπορεί να επιτευχθεί µε τον µεροζυγωτικό µηχανισµό του οµόλογου ανασυνδυασµού µε το ενδογενές γονίδιο gal. 5
METAΣXHMATIΣMOΣ Bασίζεται στην ικανότητα ορισµένων βακτηρίων, κάτω από συγκεκριµένες συνθήκες (π.χ. stress πείνας), να προσλαµβάνουν (γυµνό) DNA από το περιβάλλον µέσο. Kάποια είδη έχουν αυτή την ικανότητα στη φύση, π.χ. Streptoccus pneumoniae, Haemophilus influenzae, ή Bacillus subtilis, ενώ άλλα µόνο µετά από ειδική διαπερατοποίηση του κυτταρικού τους τοιχώµατος στο εργαστήριο, π.χ. E. coli. Aν βακτηριακό χρωµοσωµικό DNA (αναγκαστικά κοµµατιασµένο) ενός π.χ. αγρίου στελέχους τοποθετηθεί στο θρεπτικό υλικό στελέχους α - β -, θα παραχθούν µετασχηµατισµένοι τύποι α + β -, α - β + και α + β +. H συχνότητα διπλά µετασχηµατισµένων τύπων (α + β + ) µας δίνει πληροφορία για την γενετική σύνδεση των γονιδίων α και β. Για να δηµιουργηθούν µετασχηµατισµένοι απόγονοι, πρέπει να λάβει χώρα διπλός ανασυνδυασµός µεταξύ του εισαγµένου τµήµατος DNA και του χρωµοσώµατος (µεροζυγωτική κατάσταση). TO ΓONI IΩMA THΣ E. coli 1963: Περίπου 100 γονίδια είχαν χαρτογραφηθεί µε τη βοήθεια διακοπτόµενης σύζευξης - συνολικός χάρτης 90min, ο χρόνος µεταφοράς ολοκλήρου του χρωµοσώµατος από ένα Hfr στέλεχος. 1990: Περίπου 1400 γονίδια σε χάρτη στρογγυλοποιηµένο στα 100"min". Xαρτογράφηση µέσω ανασυνδυασµού / µεταγωγής µε P1 / µετασχηµατισµού. 1997: Oλοκλήρωση της αλληλούχισης του γονιδιώµατος. 4600kb που περιέχουν 4288 γονίδια. Σχεδόν 90% της αλληλουχίάς είναι κωδική για πρωτεΐνες. Kαλή συµφωνία µε τον γενετικό χάρτη του 1990. 2000: H λειτουργία του 40% των γονιδίων της E. coli παραµένει µυστήριο. 6