ΤΕΙ ΑΘΗΝΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΠΡΟΝΟΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ

1 ΤΕΙ ΑΘΗΝΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΠΡΟΝΟΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΩΝ ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ ΤΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΟΥ ΑΓΓΕΙΑΚΟΥ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ (VEG-R) ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΔΟΜΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΓΙΑ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΞΑΝΘΟΠΟΥΛΟΥ ΚΛΕΑΝΘΗ ΕΙΣΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΡΙΚΑΣ ΓΙΩΡΓΟΣ αναπληρωτης καθηγητης ΤΙΕ ΑΙΓΑΛΕΩ 2009

2 Η παρούσα εργασία έγινε στον ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος στο Ινστιτούτο Φυσικοχημείας, στα πλαίσια της ομώνυμης με την εργασία, έρευνας. Οι κάτωθι ερευνητές διεξήγαγαν την έρευνα Διονύσιος Βουρλούμης Αθανάσιος Παπακυριακού Μαρία Κατσαρού

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α) ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ σελίδα 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ σελίδα 1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΡΩΤΟ: ΚΑΡΚΙΝΟΣ σελίδα 6 1.ΑΙΤΙΑ σελίδα 6 2.ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΑ σελίδα 6 3.ΓΟΝΙΔΙΑ microrna σελίδα 7 4.ΟΓΚΟΣΤΑΛΤΙΚΑ ΓΟΝΙΔΙΑ σελίδα 7 5.ΜΕΘΟΔΟΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ σελίδα 8 5.1.ΜΗ ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΕΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΑΓΩΓΕΣ σελίδα 8 5.2.ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΕΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΑΓΩΓΕΣ σελίδα 9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΔΕΥΤΕΡΟ: ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ σελίδα 13 1.ΟΡΙΣΜΟΣ σελίδα 13 2.ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ σελίδα 13 3.ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ σελίδα 13 4.ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ σελίδα 14 4.1.Καρκινική αγγειογένεση σελίδα 14 5.ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ σελίδα 15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΤΡΙΤΟ: ΑΓΓΕΙΟΓΟΝΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ σελίδα 16 1.ΙΝΟΒΛΑΣΤΙΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ (G) σελίδα 16 2.ΜΕΤΑΜΟΡΦΩΤΙΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ-α (TG-alpha) σελίδα 19 3.ΜΕΤΑΜΟΡΦΩΤΙΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ-β (TG-beta) σελίδα 20 4.ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ (PDG) σελίδα 21 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΤΕΤΑΡΤΟ: O ΑΓΓΕΙΑΚΟΣ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΟΣ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ (VEG) ΚΑΙ ΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑΥΤΟΥ (VEGRs) σελίδα 26 1.ΓΕΝΙΚΑ σελίδα 26 2.ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΟΥ VEG σελίδα 26 3.ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΟΥ VEG σελίδα 28

4 Β) ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ σελίδα 31 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΡΩΤΟ: ΣΥΝΘΕΣΗ σελίδα 31 1.ΓΕΝΙΚΑ σελίδα 31 2.ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ σελίδα 31 3.ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ σελίδα 32 4.ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΑΠΟΔΟΣΕΙΣ σελίδα 34 5.ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ σελίδα 35 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΔΕΥΤΕΡΟ: ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ σελίδα 48 1.ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ σελίδα 48 2.ΧΗΜΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ 2.1 Χημική δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού σελίδα 48 2.2 Χημική δοκιμασία αναστολής του VEGR-2 (In vitro χημική δοκιμασία κινάσης) σελίδα 52

5 ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΩΝ ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ ΤΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΟΥ ΑΓΓΕΙΑΚΟΥ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ (VEG-R) ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΔΟΜΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΓΙΑ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ιατρικά ο καρκίνος είναι ένα σύνολο ασθενειών με κοινό χαρακτηριστικό τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Στις περισσότερες μορφές του οι αναπτυσσόμενοι όγκοι έχουν αναπτύξει την ικανότητα αγγειογένεσης, δηλαδή της δημιουργίας νέων αιμοφόρων αγγείων που διεισδύουν στον όγκο και εξασφαλίζουν την ανάπτυξη του. Συνεπώς είναι ευρέως αποδεκτή η άποψη οτι παρεμποδισμός του φαινομένου της αγγειογέννεσης μπορεί να αποτελέσει μια επαναστατική μέθοδος αντιμετώπισης της επάρατης νόσου, επειδή μια τέτοια στρατηγική θα συνοδεύεται με μειωμένες κυτταροτοξικές παρενέργειες σε σχέση με υπάρχοντες μη εξειδικευμένους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Για παράδειγμα εκτενείς ερευνητικές προσπάθειες στοχεύουν στην αναχαίτιση της δράσης του αγγειακού ενδοθηλιακού παράγοντα ανάπτυξη (Vascular Endothelial Growth actor, εφ εξής VEG) ο οποίος εκκρίνεται απο όλους τους στερεούς όγκους και είναι απο τους πιο σημαντικούς παράγοντες που προάγουν το φαινόμενο της αγγειογέννεσης. Πράγματι, η πρόσφατη κλινική επιτυχία και έγκριση του αντι-veg αντισωματος Avastin R για αντιμετώπιση του καρκίνου του παχέος εντέρου, αποδεικνύει την εγκυρότητα της παραπάνω υπόθεσης. Επειδή το αντίσωμα αυτό, ώς πρωτεϊνικό μόριο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο σε ενέσιμη μορφή και χαρακτηρίζεται απο υψηλό κόστος παραγωγής, υπάρχει εξαιρετικό ενδιαφέρον για την αντικατάσταση του απο μη πρωτεϊνικούς αναστολείς μικρού μοριακού βάρους που θα μπορούν να λαμβάνονται απο το στόμα υπο την μορφή χαπιού και θα έχουν μικρό κόστος παρασκευής. Επειδή είναι γνωστό οτι ο VEG δεν ενδείκνυται ως στόχος μικρών μοριακών αναστολέων εξαιτίας της μεγάλης μοριακής επιφάνειας αλληλεπίδρασης με το υποδοχέα του, είναι προτιμότερο να χρησιμοποίηθει η ενδοκυτταρική κινάση του υποδοχέα σαν στόχος για τους αναστολείς. Οι κινάσες είναι ένζυμα που καταλύουν την μεταφορά φωσφορικού οξέος απο το ATP σε συγκεκριμένο πρωτεϊνικό υπόστρωμα, παίρνοντας έτσι μέρος σε ενδοκυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Η τριτοταγής δομή τους χαρακτηρίζεται απο την ύπαρξη ενεργών κέντρων σε σχετικά βαθιές κοιλότητες της μοριακής επιφάνειας της κινάσης που προσφέρονται για την πρόσδεση μικρών μοριακών αναστολέων, σε αντίθεση με την σχετικά επίπεδη μοριακή επιφάνεια του VEG η οποία δεν είναι κατάλληλη για αυτό τον σκοπό. Ήδη υπάρχουν ερευνητικές δραστηριότητες σε μεγάλη κλίμακα στην

6 φαρμακευτική βιομηχανία για ανακάλυψη μικρών μοριακών αναστολέων της κίνασης του υποδοχέα του VEG Οι χημικές δομές αρκετών μικρών μοριακών αναστολέων της κινάσης του VEG-R έχουν ήδη δημοσιευθεί. Ο μηχανισνός δράσης τους σχετίζεται με την δήμευσή τους στο ενεργό κέντρο του ενζύμου, αναστέλνοντας την δράση του και διακόπτοντας κατ αυτόν τον τρόπο τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων που συμμετέχουν στην δημιουργία αγγείων. Κατά την διάρκεια αυτής της έρευνας στα εργαστήρια της φαρμακευτικής εταιρείας Novartis παρατηρήθηκε οτι μία κατηγορία αναστολέων της κινάσης του υποδοχέα VEG-R2 παρουσίασαν ισχυρή δραστικότητα in vitro και in vivo και ακολούθως εισήχθησαν σε κλινικές δοκιμές. Τα αποτελέσματα των ερευνών ήταν ενθαρρυντικά όσον αφορά την δραστικότητα των ουσιών κατα της άυξησης του μεγέθους των όγκων και αυτό αποδόθηκε στην αντι-αγγειογεννετική δράση τους. Συνεπώς, παρά την διακοπή της περαιτέρω μελέτης των ουσιών αυτών εξαιτίας κλινικών παρανεργειών, αποφασίσθηκε η ανάπτυξη συγγενών αναστολέων δεύτερης γενιάς. Οι προσπάθειες αυτές οδήγησαν στην ανάπτυξη μιας οικογένειας ουσιών που αντιπροσωπεύεται απο την ουσία AAL993 Ο τρόπος σύνδεσης του μορίου αυτού με το μόριο της κινάσης αποκαλύφθηκε με δημιουργία κρυστάλλων του συμπλόκου και χρήση κρυσταλλογραφίας με ακτίνες Χ. Η επιλυθήσα μοριακή δομή δείχνει οτι ο αναστολέας AAL993 συνδέεται εκτενώς με νέο κέντρο ένωσης της μοριακής επιφάνειας της κινάσης που δημιουργείται μετά απο αλλαγή χωροταξικής διαμόρφωσης της διατηρούμενης πεπτιδικής τριάδας ασπαρτικού οξέος-φενυλαλανίνης-γλυκίνης (DG). Συνεπώς ο αναστολέας αυτός κατατάσεται στο είδος των αλλοστερικών αναστολέων κινασών, παρόμοιων με τον αναστολέα BIRB796 της κινάσης p38 και του αναστολέα Imatinib της κινάσης Ab1 που αποτελεί το εξαιτερικά αποτελεσματικό φάρμακο Gleevec κατα της χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας. Η συγκεκριμένη κατηγορία αναστολέων τυγχάνει εξαιρετικού ενδιαφέροντος επειδή παρέχει τη δυνατότητα μεγάλης εξειδίκευσης δραστικότητας, εξαιτίας μειωμένης παρουσίας αλληλεπιδράσεων με το ευρέως

7 διατηρούμενο κέντρο σύνδεσης του ATP. Αυτή η ιδιότητα τους καθιστά πιο επιλεκτικούς για την συγκεκριμένη κινάση με αποτέλεσμα την αυξημένη πιθανότητα για μειωμένη τοξικότητα. Επίσης το νέο κέντρο ένωσης της μοριακής επιφάνειας της κινάσης που δημιουργείται μετά απο αλλαγή χωροταξικής διαμόρφωσης της χαρακτηρίζεται απο μια βαθιά κοιλότητα και συνεπώς απο αυξημένες δυνατότητες για μεγάλη δραστικότητα. Έτσι άρχισε μία προσπάθεια ανακάλυψης μιας 3 ης γενεάς αναστολέων του VEG-R2, με χρήση μεθόδων δομικής βιολογίας που σκοπό της έχει τους παρακάτω στόχους: Α) την κατανόηση των λεπτομερειών αλληλεπίδρασης αλλοστερικών αναστολέων με την κινάση του VEG-R2 με χρήση ηλεκτρονικού υπολογιστή Β) την χρήση της γνώσης αυτής στην επιλογή νέων χημικών δομών που θα αντιστοιχούν σε νέες γενεές αναστολέων Γ) την παρασκευή των προτεινόμενων ενώσεων και μέτρηση της in vitro δραστικότητας τους Δ) την μελέτη της διασαφήνησης των σχέσεων δομής-δραστικότητας των ενεργών ενώσεων και Ε) την ανάπτυξη μεθοδολογίας βασιζόμενης σε αποσαφήνιση μοριακών αλληλεπιδράσεων με χρήση κρυσταλλογραφίας συμπλοκών που θα επιτρέψει την σύνθεση δομικών και στερεοχημικών αναλόγων των ενεργών ενώσεων, με απώτερο στόχο την εύρεση μορίων με πιο επιθυμητές φαρμακολογικές ιδιότητες. Κοινά χαρακτηριστικά των αλλοστερικών αναστολέων των κινασών είναι Α) η παρουσία μιας αμινοομάδας (η ουρίας) που συμμετέχουν στο σχηματισμό 2 δεσμών υδρογόνου με την κινάση, συγκεκριμένα με ένα γλουταμινικό οξύ και μια αμινική ομάδα της κύριας αλυσίδας Β) η υδροφοβική αλληλεπίδραση μιας λιποφιλικής ομάδας (τρι-φθορομεθυλοφενιλική ομάδα στην περίπτωση του ΑΑL993) με λιποφιλική κοιλότητα της κινάσης. Η διατήρηση αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι απαραίτητη για την στερεοχημική διατήρηση του αλλοστερικού κέντρου σύνδεσης. Οι υπόλοιπες ομάδες του μορίου ΑΑL993 θα αντικατασταθούν με καινούργιες ομάδες (R1,R2) με βάση μοντέλων που θα παραχθούν με χρήση ηλεκτρονικού υπολογιστή.συνίσταται ο σχεδιασμός μιάς ευέλικτης συνθετικής πορείας που να επιτρέπει τον σχηματισμό μιας βιβλιοθήκης συγγενών μορίων οποιουδήποτε τοποισομερούς. Μια τέτοια στρατηγική εξυπηρετεί όχι μόνο την οικονομία συνθετικών βημάτων αλλά επίσης την μελέτη της διασαφήνησης των σχέσεων δομής-δραστικότητας των ενεργών ενώσεων. Σε πρώτη φάση λοιπόν γίνεται μία υπολογιστική ανάλυση της υπάρχουσας κρυσταλλικής δομής της κινάσης του VEG-R2 από την βάση δεδομένων των πρωτεινών (Protein Data Bank) με σκοπό να κατασκευασθούν τρισδιάστατα μοριακά μοντέλα για τα σύμπλοκα της κινάσης με τους προτεινόμενους μικρούς μοριακούς αναστολείς. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται ηλεκτρονικοί υπολογιστές με διάφορα εξειδικευμένα πακέτα λογισμικού όπως Weblab Viewer, Pymol,Goot, MIIT. Η στρατηγική σχεδιασμού και επιλογής των συγκεκριμένων χημικών ουσιών για σύνθεση βασίζεται στα ακόλουθα κριτήρια Α) Αλλαγή των χημικών υποομάδων του αναστολέα ΑΑL993 για βελτιστοποίηση της βιολογικής δραστικότητας Β) Μεγιστοποίηση κάλυψης του κενού χώρου στο ενεργό κέντρο σύνδεσης που θα αυξάνει την συνεισφορά των δυνάμεων van der waals Γ) Αποφυγή συγκρούσεων με άτομα της πρωτεινης

8 Δ) Αποφυγή εισαγωγής πολλών περιστρεφόμενων δεσμών που θα επιβαρύνουν εντροπικά την ικανότητα σύνδεσης Ε) Επίτευξη νέων πολικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ατόμων του αναστολέα και της πρωτείνης ΣΤ) Εξάλειψη πολικών ομάδων που είναι ενταφιασμένες σε λιποφιλικές περιοχές της πρωτείνης ώστε να μειωθεί η επιβάρυνση στην δραστικότητα Ζ) Διατήρηση των βασικών αλληλεπιδράσεων που χαρακτηρίζουν τους αλλοστερικούς αναστολείς των κινάσων Η) Μεγιστοποίηση των μοριακών επαφών με μη διατηρούμενες δομικές περιοχές της κινάσης και αποφυγή επαφών με διατηρούμενες περιοχές (π.χ. κέντρο σύνδεσης ΑΤΡ) ώστε να μειωθεί ο κίνδυνος μειωμένης επιλεκτικότητας και συνέπεια τοξικότητας του αναστολέα. Σε δεύτερη φάση η σύνθεση νέων ενώσεων θα πραγματοποιηθεί με γνωστές τεχνικές κλασσικής οργανικής σύνθεσης σε διάλυμα και στερεή φάση. Τα προτεινόμενα προς σύνθεση μόρια αναμένεται να εμπλουτιστούν σημαντικά με νέες χημικές οντότητες, σαν αποτέλεσμα των μελετών μας στη φάση 1. Τα τελικά προίοντα, όπως επίσης και τα συνθετικά ενδιάμεσα θα χρησιμοποιηθούν για βιολογικές μελέτες αποσκοπώντας στην αναγνώριση σχέσεων δομής-δραστικότητας και κατ επέκταση τον προσδιορισμό των φαρμακοφόρων χαρακτηριστικών ομάδων. Για την μέτρηση της in vitro δραστικότητας των ενώσεων θα αναπτυχεί μέθοδος ενζυμικής δραστικότητας βασιζόμενη στην μέτρηση δράσης ΑΤΡασης παρόμοιας με το EnzCheck phosphate assay kit (Molecular Probe, OR USA) πού χρησιμοποιήθηκε για την κινάση p38. Ολα τα απαραίτητα αντιδραστήρια αποτελούν μέρος του kit το οποίο διατίθεται από το εμπόριο. Η ανάπτυξη της μεθόδου μέτρησης δραστικότητας θα γίνει στην φάση 1 του προγράμματος παράλληλα με την σύνθεση της ουσίας AAL993 που θα χρησιμοποιηθεί σαν σημείο αναφοράς για τις μετρήσεις δραστικότητας. Μελλοντικά, εφόσον τουλάχιστον μια ουσία έχει δραστικότητα (IC50) καλύτερη του 1 Μμ, παρέχεται η προοπτική κρυσταλλογραφικής ανάλυσης του συμπλόκου της ουσίας με την κινάση. Για τον σκοπό αυτό, θα εκφρασθεί η κινάση του VEG-R2 σε κύτταρα εντόμων με χρήση ανασυνδυασμένου βακουλοίου και θα απομονωθεί με τεχνικές χρωματογραφίας στήλης ανταλλαγής ανιόντων και στήλης συγγένειας (με σταυροσπορίνη) όπως περιγράφεται στην σχετική δημοσίευση. Ακολούθως συν-κρυστάλλωση και συλλογή κρυσταλλογραφικών δεδομένων σε κρυσταλλογραφικό εργαστήριο ή σε συγχροτρονιο θα οδηγήσουν στην ανεύρεση του τρόπου σύνδεσης του ανακαλυφθέντος αναστολέα. Η γνώση αυτή θα μπορεί να οδηγήσει μακροπρόθεσμα σε εκτενές ερευνητικό πρόγραμμα βελτίωσης των φαρμακολογικών ιδιοτήτων της νέας κλάσης αναστολέων με χρήση κύκλων σχεδιασμού φαρμάκων με βάση την δομή. Παράλληλα η αποκτώμενη εμπειρία μπορεί να οδηγήσει σε επέκταση των προσπαθειών σε συγγενείς κινάσες που επίσης αλληλεπιδρούν με την νέα κλάση αναστολέων. Η έρευνα αυτή μπορεί να οδηγήσει στη συγγραφή και κατάθεση διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας και μελλοντική προσοδοφόρα συνεργασία με φαρμακευτικές εταιρείες του εσωτερικού και εξωτερικού με απώτερο σκοπό την εύρεση περισσότερο δραστικών ουσιών και την ενδεχόμενη ανακάλυψη αποτελεσματικότερων αντικαρκινικών φαρμάκων.

9 Βάση της υπολογιστικής ανάλυσης που έγινε επιλέχθηκαν οι εξής ενώσεις C 3 N H O C H N R S O C N H N H C 3 R N N B r O H B r H O O H O 2 N O 2 N O H O H N N S S O H O H S N S N O O

10 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΡΩΤΟ ΚΑΡΚΙΝΟΣ 1.ΑΙΤΙΑ Ο καρκίνος προκαλείται απο αλλαγές που γίνονται είτε στα ογκογονίδια, είτε στα ογκοσταλτατικά γονίδια, είτε στα γονίδια microrna 2.ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΑ Τα ογκογονίδια ευθύνονται για τον πολλαπλασιασμό ή την απόπτωση ή και τα δύο, του κυττάρου. Μεταλλάξεις που μπορούν να γίνουν στα ογκογονίδια έχουν ως αποτέλεσμα την μη σωστή λειτουργία τους κάτι που με σειρά του οδηγεί στην διαταραχή του κυτταρικού κύκλου και τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό του κυττάρου. Στον πίνακα 1.1 μπορείτε να δείτε τα κυριότερα ογκογονίδια βάση των έως τώρα ερευνών. ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΑ c-ras lt3 c-myc c-akt c-os Her2/neu c-jun Stathmin 1/oncoprotein 18 c-src HARS c-bcl-2 c-raf c-sis Beta-catenin c-kit c-mdm2 c-met Notch (Πίνακας 1.1) Οι κατηγορίες στις οποίες χωρίζουμε τα ογκογονίδια είναι 1) Τα ογκογονίδια που κωδικοποιούν τους παράγοντες μεταγραφείς 2) Τα γονίδια που κωδικοποιούν τους αυξητικούς παράγοντες 3) Τα γονίδια που ευθύνονται για την έκκριση των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων 4) Τα γονίδια των επανασχεδιαστών χρωματίνης 5) Τα γονίδια των signal transducers και 6) Τα γονίδια των ρυθμιστών απόπτωσης Η ενεργοποίηση των ογκογονιδίων μπορεί να γίνει με έναν απο τους ακόλουθους τρόπους. 1) Χρωμοσωμική αναδιάταξη 2) Γονιδιακή ενίσχυση 3) Μετάλλαξη

11 3.ΓΟΝΙΔΙΑ microrna Τα γονίδια microrna αντίθετα απο τα άλλα γονίδια δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Τα γονίδια αυτά παράγουν ένα μόριο RNA αποτελούμενο απο 21 με 23 νουκλεοτίδια τα οποία ελεγχουν την γονιδιακή έκφραση. Έτσι ένα γονίδιο microrna μπορεί να ανοπτήσει σε ένα συμπληρωματικό αυτού μόριο mrna. Με αυτόν τον τρόπο η μετάφραση του γονιδίου σταματά και κατ επέκταση, ελέγχεται η έκφραση του γονιδιού απο το οποίο προήλθε το mrna. Γίνεται κατανοητό λοιπόν πως όταν το γονίδιο microrna μεταλλάσσεται δεν παράγεται το κατάλληλο μόριο RNA με αποτέλεσμα το αντίστοιχο mrna να εκφράζεται κανονικά. 4.ΟΓΚΟΣΤΑΛΤΙΚΑ ΓΟΝΙΔΙΑ Ογκοσταλτατικά γονίδια ονομάζουμε τα γονίδια που ο βιολογικός ρόλος τους είναι να μην επιτρέψουν στα κύτταρα να μετατραπούν σε καρκινικά. Αν λόγω κάποιας μετάλλαξης το γονίδιο αυτό χάσει την λειτουργικότητά του τότε υπάρχει πιθανότητα να μετατραπούν κάποια κύτταρα σε καρκινικά Μερικά παραδείγματα για το πως η μη λειτουργία των ογκοσταταλτικών γονιδίων οδηγεί στην αγγειογένεση είναι τα ακόλουθα. 1) Έχει ευρεθεί πως υπάρχει άμεση σύνδεση της απορύθμισης στην έκφραση του VEG-A, με την μη λειτουργία του APC γονιδίου. 2) Επίσης έχει ευρεθεί πως η απορύθμιση του αγγειστατικού παράγοντα Thrombospondin 1 οφείλεται στην μη λειτουργία του κυριότερου ογκοσταλτικού γονιδίου, του p53 Πλέον έχει αναγνωριστεί ένας μεγάλος αριθμός ογκοσταταλτικών γονιδίων. Τα σημαντικότερα εμφανίζονται στον πίνακα 1.2 (Πίνακας 1.2) ΟΓΚΟΣΤΑΤΑΛΤΙΚΑ Neurofibromin 1 CHEK2 CDH1 p14arf PTCH1 p16 TGBR2 p21 Maspin p27 APC p57 SMAD2 p53 SMAD4 p63 PTEN p73 Neurofibromin 2 WT1 SDHB BRCA1 SDHD BRCA2 PRb KL6 VHL ALK-5 ΜΚΚ4 STK11 5.ΜΕΘΟΔΟΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ

12 Οι μέθοδοι θεραπευτικής αγωγής χωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες, τις κλασσικές, μη επιλεκτικές θεραπείες και τις νεότερες επιλεκτικές θεραπείες. Ενώ οι κλασσικές θεραπείες, σαν την εγχείρηση, έχουν επιπτώσεις και σε υγειή ιστό οι επιλεκτικές θεραπείες έχουν ως στόχο τους αποκλειστικά και μόνο τα καρκινικά κύτταρα. Αυτή την στιγμή υπάρχουν εν εξελίξη πολλές έρευνες, που καθεμία προσεγγίζει διαφορετικά τον στόχο της επιλεκτικότητας. 5.1.ΜΗ ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΕΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΑΓΩΓΕΣ Σε αυτές περιλαμβάνονται οι εξής Α) Εγχείρηση Η εγχείρηση αποτελεί την πλέον γνωστή μέθοδο θεραπευτικής αγωγής. Οι γνωστότερες μορφές καρκίνου στις οποίες εφαρμόζεται είναι στην περίπτωση καρκίνου τους μαστού (μαστεκτομή), στην περίπτωση καρκίνου του παχέους εντέρου, στην περίπτωση καρκίνου στην περιοχή του παγκρέατος (παγκρεατοδωδεκαδακτυλεκτομή), στην περίπτωση του στομάχου (γαστρεκτομή) και στην περίπτωση του προστάτη. Η εγχείρηση δεν μπορεί να εφαρμοστεί αν έχει γίνει ήδη μετάσταση και φυσικά έχει το μειονέκτημα πως αφαιρείται όλο το όργανο που έχει προσβληθεί με φυσιολογικές ή ψυχολογικές επιπλοκές. Επίσης υπάρχουν περιπτώσεις που ο καρκίνος είναι μη εγχειρήσιμος. Αυτό μπορεί να συμβαίνει είτε λόγω της φύσης του καρκίνου (π.χ. λευχαιμίες), είτε λόγω της κατάστασης του ασθενούς (π.χ. ασθενής τρίτης ηλικίας). Σε αυτές τις περιπτώσεις εφαρμόζεται είτε ακτινοθεραπεία, είτε χημειοθεραπεία, είτε κάποια νεότερη επιλεκτική θεραπεία. Β) Ακτινοθεραπεία Η ακτινοθεραπεία αποτελεί μαζί με την εγχείρηση και την χημειοθεραπεία τις πλέον διαδεδομένες θεραπευτικές αγωγές κατά του καρκίνου. Η ακτινοθεραπεία χρησιμοποιείται είτε θεραπευτικά σε μη εγχειρήσιμους όγκους, είτε σαν επιπρόσθετη θεραπεία μετά την εγχείρηση με σκοπό την καταστροφή καρκινικών κυττάρων που τθχόν υπάρχουν σε άλλη περιοχή απ αυτήν που έγινε η εγχείρηση. Έτσι επιτυγχάνεται η μεγιστοποίηση του προσδόκιμου ζωής. Όπως και η χημειοθεραπεία, έτσι και η ακτινοθεραπεία επιδρά και σε υγειή κύταρα. Γ) Χημειοθεραπεία Η χημειοθεραπεία εφαρμόζεται στις περιπτώσεις που ο καρκίνος είναι μη χειρουργίσιμος ή σαν επιπρόσθετη θεραπεία έτσι ως ώστε να αντιμετωπιστούν καρκινικά κύτταρα που τυχόν υπάρχουν σε άλλη περιοχή ή όργανο απο αυτό που χειρουργήθηκε και δεν έχουν εντοπιστεί ακόμα. Κατά την χημειοθεραπεία, επηρρεάζονται εκτός των καρκινικών κυττάρων και υγειή κύτταρα. Η χημειοθεραπεία μπορεί να γίνει είτε με φάρμακα που έχουν κυτταροτοξικές ιδιότητες είτε με φάρμακα που εμφανίζυν την αντικαρκινική τους δράση με διαφορετικό τρόπο όπως για παράδειγμα δρώντας σε μη φυσιολογικές πρωτεϊνες των καρκινικών κυττάρων. Σε αυτές τις περιπτώσεις μπορεί να ανήκουν στις επιλεκτικές θεραπείες. Έχουν γίνει πολές έρευνες με στόχο την δημιουργία νέων και πιό επιλεκτικών φαρμάκων, με σκοπό να χρησιμοποιηθούν στην χημειοθεραπεία. Alkylating Agents AZQ, Altretamine, Bendamustine, Busulfan, Carmustine,

13 Antimetabolites Antitumor Antibiotics Kinase Inhibitors Chlorambucil, Cyclophosphamide, Dacarbazine, Estramustine, Ifosfamide, Lomustin, Mafosfamide, Mechlorethamine, Melphalan, Procarbazine, Temozolomide, Thiotepa Capecitabine, Mercaptopurine, Cladribine, Methotrexate, Clofarabine, Nelarabine, Cytarabine, Pentostatin, ludarabine, Thioguanine, luorouracil, Trimetrexate, Gemcitabine, Troxacitabine, Hydroxyurea Bleomycin, Epirubicin, Dactinomycin, Idarubicin, Daunorubicin, Mitomycin-C, Doxorubicin, Mitoxantrone, Ecteinascidin 7-Hydroxystaurosporine, Gefitinib, Imatinib Mesylate, Mek Inhibitors, OSI-774 Platinum Compounds Carboplatin, Cisplatin, Oxaliplatin Proteasome Inhibitors ALLnL, CEP1612, Lactacystin, MG-132, PS-341, PS-519 Retinoids 9-cis retinoic acid, All-Trans Retinoic Acid, enretinide Taxanes Docetaxel, Xyotax, Paclitaxel / Taxol Topoisomerase Inhibitors Etoposide, Teniposide, Irinotecan, Topotecan Vinca Alkaloids Vinblastine, Vincristine, Vindesine, Vinorelbine 17-Allylamino-17-Demethoxygeldanamycin, ABVD, Λοιπά Alemtuzumab, Amsacrine, Epithilones, arnesyltransferase Inhibitors, L-asparaginase, Marimastat, MOPP, Trabectedin (Oxfordjournals.com) 5.2.ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΕΣ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΑΓΩΓΕΣ Δυστυχώς ακόμα και μετά απο μία επιτυχή επέμβαση και παρόλο την χημειοθεραπεία ή την ακτινοθεραπεία που μπορεί να επανακολούθησε σε ένα ποσοστό μεγαλύτερο του 35% ο όγκος επαναμφανίζεται. Έτσι γεννάται η ανάγκη για την εύρεση νέων επιλεκτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων. Σε αυτές περιλαμβάνονται οι εξής Α) Ορμονική θεραπεία Στις ορμονικές θεραπείες χορηγούνται ορμόνες ή ανταγωνιστές ορμονών με σκοπό να διαταράξουμε τον κυτταρικό κύκλο των κυτταρικών κυττάρων. Αυτή την στιγμή υπάρχει πληθώρα ορμονικών θεραπειών. Έτσι μπορεί να χρησιμοποιηθούν ανδρογόνα/αντιανδρογόνα, οιστρογόνα/αντιοιστρογόνα, αναστολείς αροματασών, κορτικοστεροειδή, ανταγωνιστές LHRH μεταξύ άλλων. Ανδρογόνα Αντιανδρογόνα Οιστρογόνα luoxymestrone, Testosterone Bicalytamide, Cyproterone Acetate, lutamide Diethylstilbestrol, Ethinylestradiol, osfestrol

14 Αντιοιστρογόνα Raloxifene, Tamoxifen, Toremifene Κορτικοστεροειδή Dexamethasone, Prednisone Gestonorone Caproate, Progestational agents Hydroxyprogesterone,Medroxyprogesterone, Megestrol Αναστολεις Aminoglutethimide, Anastrozole, ormestane, Letrozole αροματασών Ανταγωνιστές LHRH Buserelin, Goserelin, Leuprolide, Triptorelin (Oxfordjournals.com) Β) Γενετική θεραπεία Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, η καρκινογένεση οφείλεται είτε στην ενεργοποίηση κάποιου ογκογονιδίου, είτε στην μη καλή λειτουργία κάποιου γονιδίου καταστολής. Έτσι έχουν αναπτυχθεί διάφορες γονιδιακές θεραπείες. Πιο συγκεκριμένα χρησιμοποιείται η antisense θεραπεία. Στην antisense θεραπεία ξέροντας πως ένα γονίδιο οφείλεται για κάποια πάθηση (στην περίπτωση του καρκίνου, ογκογονίδιο) χρησιμοποιούμε ένα ολιγονουκλουετίδιο το οποίο προσδένεται στο mrna με αποτέλεσμα το τελευταίο να κατασταθεί ανενεργό. Το mrna ως γνωστόν είναι μονόκλωνο, απο την στιγμή λοιπόν που πλέον είναι δίκλωνο δεν μπορεί να επιτελέσει την λειτουργία του. Έτσι η πληροφορία του ογκογονιδίου δεν εκφράζεται. Antisense θεραπεία μπορεί να χρησμοποιηθεί και σε γονίδια τα οποία οφείλονται για την παραγωγή των αγγειογόνων παραγόντων. Γ) Όσες κάνουν χρήση αντισωμάτων Μία άλλη κατηγορία θεραπείας που έχει προταθεί είναι η ανοσοθεραπεία. Στην ανοσοθεραπεία μπορεί είτε το ανοσποιητικό σύστημα του ασθενούς να στραφεί κατά του καρκίνου, είτε να γίνει η χορήγηση έτοιμων αντισωμάτων που στόχο τους έχουν τα καρκινικά κύτταρα. Δ) Όσες έχουν στόχο την αναστολή της αγγειογένεσης Έχει παρατηρηθεί πως τα καρκινικά κύτταρα παρουσιάζουν αγγειογένηση. Έτσι λοιπόν μία θεραπευτική προσέγγιση εναντίον του καρκίνου είναι η αναστολή της αγγειογένεσης. Ο έλεγχος της αγγειογένεσης επιτυγχάνεται μέσω των αγγειογόνων και των αγγειοστατικών παραγόντων. Αν λοιπόν μπορέσουμε να σταματήσουμε την αγγειογένεση, στοχεύοντας τους αγγειογόνους παράγοντες και αναστέλοντας την δράση τους, τότε τα καρκινικά κύτταρα θα σταματήσουν να πολλαπλασιάζονται και δεν θα μεταστατήσουν. Υπάρχουν πολλές κατηγορίες αναστολέων. Κάποιοι είναι μορία μικρού μοριακού βάρους, άλλα είναι μόρια πρωτεϊνικής φύσεως, ενώ έχει επίσης προταθεί και η δημιουργία μονοκλωνικών αντισωμάτων ως αναστολείς της αγγειογένεσης. Οι αναστολείς αυτοί άλλοτε δρουν πάνω στους αγγειογόνους παράγοντες κι άλλοτε δρουν πάνω στους υποδοχείς των παραγόντων αυτών. Πολλοί αγγειογόνοι παράγοντες έχουν προταθεί ως οι καταλληλότεροι για ανστολή της αγγειογένεσης. Έτσι υπάρχουν έρευνες που στοχεύουν στον VEG, άλλες στον G, άλλες στον PDG, άλλες στον TG κλπ.

15 Τα φάρμακα που στοχεύουν στην αναστολή της αγγειογένεσης χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με την χημειοθεραπεία κάτι που έχει οδηγήσει σε θετικά αποτελέσματα. Υπάρχει λοιπόν μία μεγάλη πληθώρα απο έρευνες εν εξελίξη. Πάντα όμως ο στόχος είναι ίδιος: Η αναστολή της αγγειογένεσης με σκοπό τον μη πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Στους πίνακες πιο κάτω παρουσιάζονται κάποιοι απο τους κυριότερους αναστολείς. Κάποιοι βρίσκονται ακόμα στο στάδιο της έρευνας, ενώ σε άλλους η έρευνα έχει σταματήσει, οι οποίοι όμως αποτελούν την βάση για μετέπειτα έρευνα Drug Target Clinical development (2006) Μονοκλωνικό αντίσωμα Bavacizumab VEG-A Approved in Australia IMC-1121B VEGR-2 Phase I 2C3 VEG-A Preclinical Αναστολείς υποδοχέων της κινάσης τυροσίνης PTK-787 VEGR-1,-2 Phase III AEE788 VEGR-2, EGR Preclinical ZD6474 VEGR-1,-2,- 3, EGR Phase II ZD2171 VEGR-1,-2 Phase I SU11248(sunitinib) VEGR-1,-2, PDGR Phase II/III G013736 VEGR-1,-2 Phase II EP-7055 VEGR-1,-2,-3 Phase I P-547,632 VEGR-1,-2 Phase I/II GW786034 VEGR-1,-2,-3 Phase I BAY 43-9006 VEGR-1,-2, PDGR Phase III AMG706 VEGR-1,-2,-3 Phase I Soluble receptor chimeric protein VEG-Trap VEG-A, PIG Phase I Αναστολείς πολλαπλασιασμού ενδοθηλιακών κυττάρων Αναστολείς ιντεργκρίνης προαγγειογενετικής δράσης ABT-510 Endothelial CD36 Phase I/II Angiostatin Διάφορα Phase I Reduction of Approved in Thalidomide TN-a Australia Medi-522 Integrin av Phase I/II

16 EMD12194 (Cilengitide) Integrin av Phase I/II Αναστολείς metalloproteinase MMP-1, -2, -3, Merimastat Phase III -7, -9 Prinomastat MMP-2, -9 Phase III MMP-1, -2, -8, BMS 275291 Phase III -9, -13, -14 MMP-2, -9,- Neovastat Phase III 12, VEG Άλλα CDP-791 VEGR-2 Phase I Φάρμακα που στοχεύουν στο αγγειακό σύστημα Combretastatin AVE8062A ZD6126 AS1404 Endothelin tubulin Endothelin tubulin Endothelin tubulin Induction of TN-a Phase I/II Phase I Phase I Phase I ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΔΕΥΤΕΡΟ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ 1.ΟΡΙΣΜΟΣ

17 Η αγγειογένεση αποτελεί την διαδικασία σχηματισμού νέων αγγείων, απο ένα προυπάρχον αγγειακό δίκτυο, και διακρίνεται σε φυσιολογική, που αναστέλεται σε χρονικό διάστημα ημερών ή εβδομάδων και σε παθολογική που εξελίσσεται χρονίως και συνδυάζεται με τον καρκίνο. 2.ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ Η έκταση της αγγειογένεσης καθορίζεται απο την ισορροπία μεταξύ των αγγειογόνων και των αγγειοστατικών παραγόντων που εκκρίνονται απο τον όγκο και το μικροπεριβάλλον. Η αγγειογένεση αρχίζει με την αύξηση της διαπερατότητας της μεμβράνης των αγγείων σε ανταπόκριση στο οξείδιο του αζώτου. Μετά τα ενδοθηλιακά κύτταρα πολλαπλασιάζονται και μεταναστεύουν μέσω της κυτταρικής μεμβράνης. Σε αυτό το σημείο οι διάφοροι αγγειογόνοι παράγοντες και οι υποδοχείς αυτών, αλληλεπιδρούν μεταξύ τους εκτός της συμβολής τους στην διαδικασία της αγγειογένεσης αυτής καθε αυτής. Ύστερα τα κύτταρα τοποθετούνται σε σειρά στην αποδομημένη απο πρωτεάσες μεσοκυττάριο ουσία, ώστε να σχηματίσουν τριχοειδικούς ή σωληνωδείς σχηματισμούς. Αυτές οι δομές δημιουργούν ένα δίκτυο ανοστομόσεων το οποίο υπόκειται σε σημαντική αναδιάταξη πριν δημιουργηθούν τα πλήρως λειτουργούντα τριχοειδή και η οποία βασίζεται κάθε φορά στις τοπικές ανάγκες. Προς το παρόν δεν ξερουμε τον μηχανισμό πο καθορίζει ποιά ενδοθηλιακά κύτταρα θα ανήκουν σε μία αρτηρία ή σε μία φλέβα ή σε ένα τριχοειδές 3.ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Φυσιολογικώς, οπότε είναι ελεγχόμενη και σύντομη, διαρκεί απο μερικές μέρες έως μερικές εβδομάδες. H αγγειογένεση συμβαίνει στην εμβρυογένεση και κατά την διάρκεια της κυοφορίας στις γυναίκες και ειδικότερα κατά την διάρκεια της ανάπτυξης του πλακούντα. Εκτός αυτού στις γυναίκες συμβαίνει κατά την διάρκεια του σχηματισμού του ωχρού σωματίου και στην μήτρα σε ορισμένες φάσεις του ωοθηκικού κύκλου. Επίσης η αγγειογένεση συμβαίνει κατά την διάρκεια της ενδομητρίωσης. Το περιτοναϊκό περιβάλλον είναι ιδιαίτερα αγγειογενές και σε αυτό βρίσκουμε σε μεγάλη συγκέντρωση τους διαφόρους αγγειογόνους παράγοντες. Σε άλλα όργανα που παρατηρείται ενδομητρίωση και κατ επέκταση αγγειογένεση είναι στους πνεύμονες, στον δερματικό ιστό και στους μυς. Σε αντίθεση με την αγγειογένεση που γίνεται στα έμβρυα η αγγειογένεση που συμβαίνει στους ενηλίκους συμβαίνει κατά κύριο λόγο σε ώριμα αγγεία 4.ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Η αγγειογένεση συμβαίνει κατά κύριο λόγο σε παθολογικές καταστάσεις. Σε αυτές τις περιπτώσεις η αγγειογένεση εξελίσσεται χρονίως. Οι κυριότερες απ αυτές είναι οι περιπτώσεις τραυματισμού, ειδικά στο έμφραγμα του μυοκαρδίου, η διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια, η αθηρωματική πλάκα, η ψωρίαση, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, η αθηροσκλήρωση και η παραγωγική αμφιβληστροειδοπαθεια. Ιδιαίτερη σημασία όμως δινεται στις

18 μέρες μας στην σύνδεση της αγγειογένεσης με τις διάφορες περιπτώσεις στερεών νεοπλασματικών ασθενειών, στις οποίες η αγγειογένεση είναι ιδιαίτερα έντονη και συνεχής 4.1.Καρκινική αγγειογένεση Κλινικές δοκιμές έχουν καταλήξει πως στις περιπτώσεις στερεών όγκων στους οποίους παρουσιάζεται αγγειογένεση η πρόγνωση είναι άσχημη. Η επιβίωση των κυττάρων εξαρτάται απο την παροχή οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών και την αποβολή τοξικών ουσιών που έχουν παραχθεί κατά τον μεταβολισμό του. Το οξυγόνο μπορεί να διαχυθεί απο τα τριχοειδή έως και 150 με 200 mm. Όταν όμως τα κύτταρα βρίσκονται μακρύτερα απο αυτήν την απόσταση απο μία παροχή αίματος τότε αρχίζουν και πεθαίνουν. Τα παραπάνω φυσικά ισχύουν και για τα καρκινικά κύτταρα. Έτσι όταν ο όγκος είναι μεταξύ 1mm με 2mm απαιτείται η δημιουργία νέων αγγείων τα οποία θα επιτελέσουν τις λειτουργίες που αναφέρθηκαν πιο πάνω. Αυτό λοιπόν επιτυγχάνεται με την αγγειογένεση. Για να συμβεί όμως αυτό θα πρέπει να διαταραχθεί η λεπτή ισορροπία μεταξύ των αγγειογόνων και των αγγειοστατικών παραγόντων, υπέρ των αγγειογόνων παραγόντων. Με την έκκριση παρακρινών και αυτοκρινών εκκρίσεων ευνοείται η έκκριση των αγγειογόνων παραγόντων έναντι των αγγειοστατικών με αποτέλεσμα την έναρξη της αγγειογένεσης. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται αγγειογόνος διακόπτης Έτσι ο όγκος πλέον έχει την δυνατότητα να αναπτυχθεί ακόμα και να μεταστατήσει. Η αλλαγή της ισορροπίας αυτής συμβαίνει στα πρώτα στάδια της καρκινογένεσης κι οφείλεται είτε σε γενετικές αλλαγές, είτε σε περιβαλλοντικούς παράγοντες που δημιουργήθηκαν λόγω του όγκου, είτε και στους δύο προαναφερθέντες παράγοντες Στους περιβαλλοντικούς παράγοντες συμπεριελαμβάνονται η υπόξια και το χαμηλό ph. Οι γενετικές βλάβες απο την άλλη, γίνονται στα ογκοσταταλτικά γονίδια και μπορεί να οδηγήσουν είτε στην αύξηση της έκκρισης των αγγειογόνων παραγόντων, είτε στην μείωση των αγγειοστατικών Η αγγειογένεση στα καρκινικά κύτταρα λέγεται πως είναι όμοια με την φυσιολογική αγγειογένεση σε κάποια χαρακτηριστικά αλλά δεν τερματίζεται, τα κύτταρα δεν ωριμάζουν και είναι σε σημαντικό βαθμό πιο χαοτική. Πιο συγκεκριμένα, τα καρκινικά κύτταρα δεν είναι λειτουργικά και δομικά φυσιολογικά. Τα αγγεία είναι πολυεπίπεδα, οι τριχοειδείς και οι σωληνοειδείς σχηματισμοί που δημιουργούνται κατά την διάρκεια της αγγειογένεσης είναι διασταλμένοι, περιπεπλεγμένοι και ανόμοιοι, περιέχουν μεσοκυττάρια και διακυττάρια κενά, παρουσιάζουν σχετικά ανεξέλεγκτη διαπερατότητα, και υφίστανται σταθερή αναδιαμόρφωση Αυτό πιθανόν να συμβαίνει λόγω της ανισορροπίας των αγγειογόνων παραγόντων.

19 5.ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ Ο έλεγχος της αγγειογένεσης επιτυγχάνεται μέσω των αγγειογόνων και των αγγειοστατικών παραγόντων του οργανισμού, που λειτουργούν ως διακόπτες λειτουργίας. Οι μεν αγγειογόνοι παράγοντες προωθούν την αγγειογένεση, οι δε αγγειοστατικοί την αναστέλουν. Στους κάτωθι πίνακες εμφανίζονται οι κυριότεροι αγγειογόνοι και αγγειοστατικοί παράγοντες. ΑΓΓΕΙΟΓΟΝΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Όξινος και βασικός αυξητικός παράγων (Ga και Gb) Platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECG) Granulocyte colony-stimulating factor (G- CS) Platelet-derived growth factor (PDG) Hepatocyte Growth actor (HG) Placental Growth actor (PG) Interleukin-8 (IL-8) Pleiotrophin (PTN) ollistatin Proliferin Del-1 Leptin Angiogenin Midkine Μεταμορφωτικός αυξητικός παράγωνάλφα (TG-alpha) Μεταμορφωτικός αυξητικός παράγωνβήτα (TG-beta) Νεοπλασματικός νεκρωτικός παράγωνάλφα (TN-alpha) Αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγων (VEG) Angiopoietin-1 Progranulin Πίνακας 2.1 ΑΓΓΕΙΟΣΤΑΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ

20 Angioarrestin Platelet factor-4 (P4) Angiostatin Gro-beta Antiangiogenic antithrombin III Metalloproteinase inhibitors (TIMPs) Cartilage-derived inhibitor (CDI) Placental ribonuclease inhibitor CD59 Kringle 5 Endostatin Retinoids ibronectin fragment Prolactin 16kD fragment Tetrahydrocortisol-S 2-Methoxyestradiol Heparinases Vasculostatin Heparin hexasaccharide fragment Plasminogen activator inhibitor Human Chorionic gonadotropin (hcg) Transforming growth factor-beta (TG-b) Interferon alpha/beta/gammma Thrombospondin-1 (TSP-1) Interferon inducile protein (IP-10) Proliferin-related protein (PRP) Interleukin-12 Vasostatin Πίνακας 2.2 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΤΡΙΤΟ

21 ΑΓΓΕΙΟΓΟΝΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ 1.ΙΝΟΒΛΑΣΤΙΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ (G) Η οικογένεια των ινοβλαστικών αυξητικών παραγόντων έχει 22 (είκοσι δύο) μέλη. Μαζί με αυτά έχουν επίσης ταυτοποιηθεί 4 (τέσσερις) κινάσες της τυροσίνης ως υποδοχείς αυτών. Ο κάθε υποδοχέας με τη σειρά του έχει πολλές παραλλαγές. Οι περισσότεροι Gs δένονται με ορισμένες ομάδες υποδοχέων, ο G1 δένει με όλους τους γνωστούς υποδοχείς των G, ενώ ο G7 μπορεί να αλληλεπιδράσει μόνο με μια συγκεκριμένη παραλλαγή του GR2, τον GR2IIIb. Ο G1 είναι γνωστός και ως Ga, δηλαδή ως όξινος ινοβλαστικός αυξητικός παράγων, ενώ ο G2 είναι γνωστός και ως Gb, δηλαδή ως βασικός ινοβλαστικός παράγων. Οι ινοβλαστικοί αυξητικοί παράγοντες μπορούν να προκαλέσουν τον τερματισμό του κυτταρικού κύκλου, τον πολλαπλασιασμό ή και την διαφοροποίηση των κυττάρων αναλόγως το βιολογικό πλαίσιο στο οποίο βρίσκονται κάθε φορά. Οι ινοβλαστικοί αυξητικοί παράγοντες, και ειδικότερα ο βασικός (Gb), είναι ένας ισχυρά μιτωτικός και αγγειογόνος παράγοντας με άμεση αγγειογόνα επίδραση. Παρόλα αυτά στα όργανα που απαντάται σε αφθονία ο ρυθμός ανανέωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι μικρός. Αυτό μάλλον οφείλεται στο γεγονός οτι ο ινοβλαστικός αυξητικός παράγων δεν ελευθερώνεται εύκολα απο τα κύτταρα. Επίσης μετά την απελευθέρωση τους αποθηκεύονται στην υποενδοθηλιακή θεμελιακή ουσία. Έτσι τα ενδοθηλιακά κύτταρα προστατεύονται, αφ ενός υπο φυσιολογικές συνθήκες απο τον παράγοντα αυτό, αφ ετέρου σε ένα τραυματισμό, παραδείγματος χάριν, μπορεί να ελευθερωθεί απο την περιοχή αποθήκευσής του και να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό γειτονικών ενδοθηλιακών κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον πως οι ινοβλαστικοί αυξητικοί παράγοντες διεγείρουν την σύνθεση και ελευθέρωση του ενεργοποιού του πλασμινογόνου και κολλαγενασών απο τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Απο τους 22 (εικοσι δυο) Gs οι G1, G2, G4 και G5 έχουν εμφανίσει αγγειογόνες ιδιότητες in vivo. Φυσιολογικώς οι G1, G2, G4, G7 και G8 βρίσκονται στο ενδομήτριο, με τους τέσσερις πρώτους να εκφράζονται στο ανθρώπινο ενδομήτριο. Σε αυτό οι Gs συνεργάζονται με τους VEGs. Οι Gs έχουν κλινική σημασία στα μελανώματα, στα σαρκώματα, στους παγκρεατικούς και τους ουρογεννητικούς όγκους. α) G1/Ga

22 Βρίσκεται κυρίως στον νευρικό ιστό, περιλαμβάνει τον αυξητικό παράγοντα των ενδοθηλιακών κυττάρων και τους αυξητικούς παράγοντες που προέρχονται απο τον αμφιβληστροειδή χιτώνα του οφθαλμού. β) G2/Gb Ο βασικός ινοβλαστικός αυξητικός παράγων έχει βρεθεί στον υποθάλαμο και σε άλλες περιοχές του εγκεφάλου, στα οστά, στον χόνδρο, στα επινεφρίδια, στους νεφρούς, στον πλακούντα, στο ωχρό σωμάτιο, στους οφθαλμούς και στα μακροφάγα. Τέλος σημαντικό είναι να αναφερθεί πως έχει βρεθεί επίσης και σε νεοπλάσματα. 2.ΜΕΤΑΜΟΡΦΩΤΙΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ-α (TG-alpha)

23 Ο μετομορφωτικός αυξητικός παράγων άλφα είναι ένα πεπτιδικό μόριο το οποίο συμβάλλει στην αγγειογένεση (φυσιολογική και παθολογική) και έχει άμεση μιτωτική επίδραση στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο TG-α είναι ένας εκ των κυριοτέρων αυξητικών παραγόντων που εμφανίζονται στηυν παθολογικώς γεννόμενη αγγειογένεση απο τα καρκινικά κύτταρα. Υπερέκφραση αυτού, εννίοτε μαζί με τον EGR, έχει ανιχνευθεί στα περισσότερα καρκινώματα του ανθρώπου και αποτελεί ένδειξη κακής πρόγνωσης. Στην φυσική του μορφή έχει 50 αμινοξέα και ο μοριακός τύπος του είναι C 239 H 348 N 70 O 72 S 6 Ο μεταμορφωτικος αυξητικος παράγων-α ασκεί την δράση του μέσω των υποδοχέων του EG. Τέλος θα πρέπει να προσεχθεί πως ο Μεταμορφωτικός παράγοντας-α δεν έχει καμία δομική συγγένεια με το Μεταμορφωτικό αυξητική παράγοντα-β. 3.ΜΕΤΑΜΟΡΦΩΤΙΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ-β (TG-beta)

24 Ο μεταμορφωτικός αυξητικός παράγοντας-β είναι ένα απο τα μόρια τα οποία προωθούν την αγγειογένεση είτε αυτη είναι φυσιολογική, είτε παθολογική. Αποτελούν μια απο τις καλύτερα μελετημένες ομάδες μορίων που σχετίζονται με την αγγειογένεση, μαζι με τους Gs και VEGs. Έχει βρεθεί, υπο φυσιολογικές συνθήκες, στους νεφρούς, τον πλακούντα, σε αιμοπετάλια, αλλά και παθολογικώς σε νεοπλάσματα. Η οικογένεια των TG-β αποτελείται απο πολλά μέλη. Εκ των σημαντικοτέρων είναι τα τρία ισομορφή των θηλαστικών, τα οποία αν και δομικά όμοια με τα άλλα έχουν ιδιαίτερες λειτουργικές ιδιότητες. Αυτά είναι τα TG-β1, TG-β2 και TG-β3. Το καθένα απο αυτά έχει κοινές, αλλά και μοναδικές λειτουργείες. In vitro έχουν επιδείξει μιτογονική δράση στους ινοβλάστες, αλλά αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των περισσοτέρων άλλων κυττάρων. Επίσης οι TG-βs διεγείρουν την έκφραση εξωκυττάριων πρωτεινών και ιντεκρινών. Σε αυξημένα επίπεδα βρίσκονται στον καρκίνο του μαστού Οι TG-βs έχουν ως υποδοχέα ένα σύμπλεγμα κινάσης της σερίνης και της θρεονίνης. (TβR1, TβR2). 4.ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑΚΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ (PDG)

25 Ο αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγων είναι μια οικογένεια κατιονικών ομοδιμερών και ετεροδιμερών ενωμένων δισουλφιδίων Α- και Β- αλυσίδων. Τα ώριμα κομμάτια των Α- και Β- αλυσίδων του PDG έχουν μήκος περίπου 100 αμινοξέων και εμφανίζουν περι του 60% ομοιότητα στην ακολουθία τους. Οκτώ υπολλέιματα κυστινών διατηρούνται τέλεια μεταξύ των δυο αλυσίδων. Δύο απο τα υπολλείματα κυστινών (το δεύτερο και το τέταρτο) συμμετέχουν στην δημιουργία κυστινικών δεσμών μεταξύ των δύο υποομάδων του PDG διμερούς. Τα άλλα έξι πέρνουν μέρος στην δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών μετξύ των αλυσίδων. (το πρώτο ζεύγος με το έκτο, το τρίτο με το έβδομο, και το πέμπτο με το όγδοο). Ο PDG έχει απομονωθεί και κρυσταλλοποιηθεί. Η τρισδιάστατη δομή του μοιάζει με αυτή του VEG, ο οποίος έχει παρόμοια ακολουθία αμινοξεων με αυτήν του PDG, καθώς επίσης και με αυτήν του νευρικου αυξητικού παράγοντα και του μεταμορφωτικού αυξητικού παράγοντα-β, παρόλο που δεν έχουν καμία ομοιότητα στην ακολουθία των αμινοξέων τους. Όλοι αυτοί οι παράγοντες είναι διμεροί και παρουσιάζουν χαρακτηριστικούς κυστικούς δεσμούς στην δομή τους. Τα ανθρώπινα αιμοπετάλια και καλλιέργειες κυτταρικών σειρών εκφράζουν φυσιολογικώς και τα τρία διαφορετικά PDG μόρια, (με δύο Α αλυσίδες, με δύο Β αλυσίδες και με Α και Β αλυσίδες). Οι αιμοπεταλιακοί αυξητικοί παράγοντες συνθέτονται απο διάφορους τύπους κυττάρων. (Πίνακας 1) Η σύνθεση συχνά αυξάνεται προς ανταπόκριση εξωτερικών ερεθισμάτων, όπως για παράδειγμα στον ερεθισμό με διαφόρους αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες. Η έκφραση του PDG-A αυξάνεται στα ανθρώπινα λεία μυϊκά κύτταρα της ουρήθρας κατα την διάρκεια της εγκυμοσύνης. Τα περισσότερα είδη κυττάρων που εκφράζουν τον PDG παράγουν και τις δύο αλυσίδες (Α- και Β-), αλλά η έκφραση των δύο αυτών αλυσίδων ρυθμίζεται ανεξαρτήτως κατα τη διάρκεια της μεταγραφής καθώς επίσης και μετά απο αυτην. ΠΙΝΑΚΑΣ 1: ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙ ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΤΟΝ PDG Ο αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας αντιδρά και με διαλυτές πρωτεϊνες, εκτός απο μόρια matrix. Ο PDG συνδέεται με την α 2 - μακροσφαιρίνη. Aυτήν η

26 αντίδραση, στην οποία συμμετέχει ο PDG-BB αλλά όχι ο PDG-AA, ρυθμίζει την ποσότητα του διαθέσιμου PDG προς αντίδραση με τους υποδοχείς του. Οι υποδοχείς του PDG έχουν απομονωθεί. Κάθε μόριο PDG φέρει δύο επιτόπους, ο καθένας εκ των οποίων προσδένεται με έναν εκ των δύο υποδοχέων (αυποδοχέας και β-υποδοχέας) Ο α-υποδοχέας προσδένεται και με τις δύο αλυσίδες (Ακαι Β-) εξίσου αποτελεσματικά, ενώ ο β-υποδοχέας προσδένεται μόνον με την Β- αλυσίδα. Έτσι το μόριο PDG-AA δένεται με ένα ομοδιμερές μόριο υποδοχέα αα, το μόριο PDG-ΑΒ δένεται είτε με ένα ομοδιμερές μόριο υποδοχέα αα είτε με ένα ετεροδιμερές μόριο υποδοχέα αβ, ενώ τέλος το μόριο PDG-BB προσδένεται είτε με τα ομοδιμερή μόρια υποδοχέα αα, και ββ είτε με το ετεροδιμερές μόριο υποδοχέα αβ. Τα PDG μόρια, μετά απο έρευνες που έγιναν σε ποντίκια, ανακαλύφθηκε πως παίζουν σημαντικό ρόλο κατα την εμβρυογένεση. Ιδιαίτερα στην ανάπτυξη των

νεφρών, των αιμοφόρων αγγείων, των πνευμόνων και του κεντρικού νευρικού συστήματος. Τα PDG μόρια φαίνεται πως έχουν αγγειογενετικές ιδιότητες ενώ οι υποδοχείς τους εκφράζονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών αγγείων. Η αγγειογενετική τους ιδιότητα όμως φαίνεται να είναι ισχνότερη αυτή των VEG και G. Έτσι λοιπόν ο PDG φαίνεται πως δεν είναι σημαντικός κατα τον αρχικό σχηματισμό των αιμοφόρων αγγείων. Αυτό καταφάνηκε απο τα πειράματα με τα ποντίκια αφού όταν τα γονίδια που εκφράζουν το PDG απενεργοποιήθηκαν, τα ποντίκια δεν εμφάνισαν κάποιο πρόβλημα στα αιμοφόρα αγγεία τους. Παρόλα αυτά σε συγκεκριμένα όργανα η δράση του PDG κατα την αγγειογένεση μπορεί να είναι σημαντική. Έτσι η διέργεση της παραγωγής του PDG- ΑB στα καρδιακά μικροαγγειακά κύτταρα, οδηγεί στην επαγωγή και των δύο παραγόντων von Willebrand και σεα αυτήν του VEG και VEG R2, υποδηλώνοντας τον σημαντικό ρόλο του PDG στην καρδιακή αγγειογένεση. Μια άλλη σημαντική δράση του PDG στο αγγειακό σύστημα είναι ο παλίνδρομος έλεγχος στην συνάθροιση των αιμοπεταλίων. Η διέργεση του PDG οδηγεί στην σε μείωση της συνάθροισης των αιμοπεταλίων. Τα ανθρώπινα αιμοπετάλια τα οποία είναι πλούσια πηγή PDG, έχουν PDG α-υποδοχείς αλλά όχι β-υποδοχείς, και οι υποδοχείς του PDG έχουν επιδειχθεί στα μεγακαρυοκύτταρα, που είναι φυσικά οι πρόγονοι των αιμοπεταλίων. Τέλος ο PDG συμμετέχει και στην επούλωση των πληγών μαζί με άλλους αυξητικούς παράγοντες. Ο αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας διεγείρει την χημοταξία των ινοβλαστών, των λείων μυικών κυττάρων, των ουδετερόφιλων και των μακροφάγων. Επίσης διεγείρει τα μακροφάγα να παράγουν και να εκκρίνουν άλλους αυξητικούς παράγοντες που λαμβάνουν μέρος στις διάφορες φάσεις της επούλωσης. Επι προσθέτως ο PDG διεγείρει την παραγωγή διαφόρων μορίων όπως της φιμπρονεκτίνης και του κολλαγόνου. Για να δράσει ο PDG in vivo θα πρέπει να είναι παρόν πάνω στην πληγή. Αρχικές παρατηρήσεις αποκάλυψαν πως ο PDG απελευθερώνεται απο τα αιμοπετάλια και εκκρινεται απο τα ενεργοποιημένα μακροφάγα, απο τα διεργεμένα απο την θρομβίνη ενδοθηλιακά κύτταρα, τα λεία μυικά κύτταρα των αρτηριών που έχουν υποστεί βλάβη, τους ενεργοποιημένους ινοβλάστες καθώς επίσης και απο τα επιδερμικά κερατινοκύτταρα. Πιο πρόσφατες μελέτες απεκάλυψαν πως ο PDG είναι παρόν στα υγρά της πληγής απο μαλακό ιστό. Έχει ευρεθεί πως ο PDG προκαλεί κακοήθη εξαλαγή και κακοήθης όγκους. Έτσι δημιουργείται το ερώτημα αν ο PDG συμεττέχει ως ένας αυτοκρινής αυξητικός παράγων στην ανάπτυξη αυτόματων όγκων στους ανθρώπους. Μελετήθηκαν λοιπόν ένας μεγάλος αριθμός καρκινικών τύπων σχετικά με την έκφραση του PDG και τους υποδοχείς του, σε αυτούς. Απο αυτήν την έρευνα βρέθηκε πως πολλοί όγκοι εκφράζουν τον PDG και τους υποδοχείς αυτού και πως σε αυτούς μια αυτοκρινής διέργεση μπορεί να υπερισχύσει. Αυτές οι μελέτες πρέπει να ερμηνευτούν με προσοχή. Πρώτα απ όλα σε πολλές απ αυτές τις περιπτώσεις η έκφραση των φυσιολογικών κυττάρων του PDG δεν μας είναι γνωστή. Δέυτερον σε πολλούς όγκους μετρήθηκε η έκφραση του mrna. Τρίτον όλες οι μελέτες περιορίστηκαν στην ανάλυση της έκφρασης και δεν έγιναν προσπάθειες μελέτης της ενεργοποίησης των υποδοχέων. Τέλος ακόμα και αν μια αυτοκρινής ενεργοποίηση του υποδοχέα συμβεί, δεν είναι γνωστό η σημαντικότητα αυτής για την ανάπτυξη του καρκίνου. 27

Στο ανθρώπινο γλοίωμα, PDG α-υποδοχέα θετικά κύτταρα βρίσκονται σε όλους τους ιστολογικούς βαθμούς κακοήθειας, αν και απαντώνται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις σε υψηλού βαθμού όγκους. Ύψηλά επίπεδα έκφρασης α-υποδοχέα ευρίσκονται ιδιαίτερα σε όγκους χωρίς γονιδιακή ενίσχυση του γονιδίου για τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EG). Η ανάπτυξη κυττάρων με ορισμένο ανθρώπινο γλοίωμα in vitro και in vivo μπορεί να ανασταλεί με την χρήση PDG ανταγωνιστών. Αυτές οι μελέτες όμως έχουν περιοριστεί σε κυτταρικές σειρές που έχουν προσαρμοστεί και επιλεγεί για ανάπτυξη σε καλλιέργεια. Εκτός απο αυτοκρινής αυξητικός παράγοντας ο PDG συμμετέχει και στην παρακρινή διέργεση κυττάρων στρώματος. Σε διάφορους τύπους όγκων υπάρχει συμπληρωματική έκφραση του PDG στα καρκινικά κύτταρα και των υποδοχέων του στα κύτταρα στρώματος. Σε αυτούς τους όγκους περιλαμβάνονται μεταξύ άλλων και στον καρκίνου του στήθους, στον ορθοκολικό καρκίνο και ορισμένους τύπους καρκίνου του πνεύμονα. Επι προσθέτως η ανάπτυξη της μυελοίνωσης σε χρόνια μυελογενής λευχαιμία αποδίδεται στο PDG. (9) 28

29 O ΑΓΓΕΙΑΚΟΣ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΟΣ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ (VEG) ΚΑΙ ΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑΥΤΟΥ (VEGRs) 1.ΓΕΝΙΚΑ Ο κυριότερος αγγειογόνος παράγοντας που έχει μελετηθεί, κι ενδιαφέρει άλλωστε την παρούσα εργασία, είναι ο αγγειακός ενδοθηλιακός αναπτυξιακός παράγοντας (VEG). Η οικογένεια των VEG αποτελείται απο πέντε κύρια μέλη και τον πλακουντικό αγγειακό παράγοντα (PG). Τα πέντε κύρια μέλη του VEG είναι, ο VEG-A, ο VEG-B, ο VEG-C, ο VEG-D, κι ο VEG-E. Ο VEG έχει τρεις υποδοχείς κινάσης τυροσίνης, τον VEGR-1 (lt-1), τον VEGR-2 (KDR/lk-1) και τον VEGR-3 (lt-4) οι οποίοι εκτελούν της λειτουργίες του VEG, ενώ μπορεί να συνδεθεί και με τις Nrp-1 και Nrp-2, που είναι υποδοχείς για τις Semaphorins Παρόλη την ονομασία του ο VEG δεν ευρίσκεται μόνο στα ενδοθηλιακά κύτταρα, αλλά και στα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs), στα μονοκύτταρα, στους οστεοβλάστες και στους νευρώνες Η παραγωγή των VEG καθορίζεται απο πολλούς παράγοντες όπως κάποιες κυτοκίνες, κάποιους αυξητικούς παράγοντες και κάποιους φυσιολογικούς παράγοντες. Στους αυξητικοί παράγοντες συμπεριλαμβάνονται o PDG, ο TN-α, G-4, ο bg, ο RG-β, ο Angiotensin-2, η Ιντερλευκίνη-1, η Ιντερλευκίνη-6 κι οι Ang-1 και Ang-2 Στους φυσιολογικοί παράγοντες συμπεριλαμβάνονται η υποξία που έχει βασικό ρόλο στις παθολογικές περιπτώσεις αγγειογένεσης (όπως σε περιπτώσεις όγκων) κι είναι είναι απο τους σημαντικότερους παράγοντες που διεγείρουν την έφραση του VEG-A. Η υποξία προκαλεί την παραγωγή μία πρωτεΐνης που λέγεται HIPC κι η οποία με την σειρά της προκαλεί την αύξηση της μεταγραφής του mrna του VEG-A. Επίσης η ίδια ορμόνη αυξάνει και τον VEGR-1. Επίσης αυξάνει την σταθερότητα των ισομορφών του VEG-A. Η ορμόνη αυτή όμως δεν έχει κανένα αποτέλεσμα στο mrna των VEG-B και VEG-C

30 2.ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΟΥ VEG 2.1) VEG-A Ο VEG-A παλαιότερα ήταν γνωστός ως VP. Πλέον μπορεί να ευρεθεί στην βιβλιογραφία είτε ως VEG-A, είτε απλά ως VEG, αφού είναι ο κυριότερος VEG παράγοντας. Ο VEG-Α είναι μία ομοδιμερική γλυκοπρωτεΐνη και είναι το κυριότερο μέλος της οικογένειας των VEG. Το γονίδιο του βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6p21.3 και αποτελείται απο οχτώ εξώνια που διαχωρίζονται απο επτά εσώνια. Το παραπάνω έχει ως αποτέλεσμα να δημιουργηθούν πέντε ισόμορφα που το καθένα είναι διαφορετικού βάρους και η τιμή τους κυμαίνεται απο 30 kda έως 46 kda. Αυτή η ετερογένεια οφείλεται στους διάφορους εναλλακτικούς τρόπους με τους οποίους μπορεί να γίνει η συρραφή (το μάτισμα) των τελευταίων εξωνίων. Σε όλα τα ισομορφή υπάρχουν τα τέσσερα πρώτα εξώνια. Ο VEG-A 145 δεν έχει το εξώνιο 7, ενώ ο VEG-A 121 δεν έχει τα εξώνια 6 και 7. Τα ισόμορφα αυτά είναι ο VEG-A 121, ο VEG-A 145, VEG-A 165, ο VEG-A 189, κι ο VEG-A 206,. Ο αριθμός συμβολίζει τον αριθμό των αμινοξέων που περιέχει. Στους ιστούς θα ευρεθούν σε υψηλότερες συγκεντρώσεις οι VEG-A 121 και VEG-A 165, ενώ ο VEG-A 145 είναι ο πιο σπάνιος. O VEG-A 206 αναβρίσκεται μόνο στην βιβλιοθήκη cdna του συκωτιού ενός εμβρύου. Οι VEG-A 145, VEG-A 165, VEG-A 189, και VEG 206 προσδένονται σε πρωτεογλυκάνες ηπαρίνης και θειικής ηπαράνης ενώ ο VEG-A 121 όχι. Μετά από πειράματα έχει αποδειχθεί πως ο VEG-A 165 καθορίζει την μορφολογία του αγγείου, ενώ έχει αποδειχθεί πως ο VEG-A 121 αυξάνει την διάμετρο του αγγείου. Ο VEG-Α λαμβάνει μέρος στην μίτωση, την αγγειογένεση, συμβάλει στην επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, προωθεί την χημειοταξία των μονοκυττάρων, αυξάνει την παραγωγή των Β λεμφοκυττάρων, αυξάνει την διαπερατότητα των αγγείων κι έχει αιμοδυναμικά αποτελέσματα. Επίσης καθορίζει την μορφολογία των αγγείων, το μεγεθός τους και άλλα χαρακτηριστικά τους. Τέλος προωθεί την διαφοροποίηση των αγγειοβλαστών. Δύο ανεξάρτητες έρευνες απέδειξαν πως ο VEG-A είναι απαραίτητος στην αγγειογένεση και ειδικά στην αγγειογένεση που γίνεται κατά τον σχηματισμό του εμβρύου. Ο VEG-A έχει λεμφιογένετικά αποτελέσματα κάτι που συνδέεται με τα μακροφάγα Ο VEG-A παράγεται στις περιπτώσεις τραυματισμού του δέρματος, κυρίως απο τα μακροφάγα και στο ανθρώπινο ενδομήτριο. Κυριότεροι παράγοντες που ελέγχουν την παραγωγή του είναι η υποξία η οποία έχει ως αποτέλεσμα την έκκριση

31 του VEG-A. Επίσης οι κυτοκίνες IL-10 και IL-13 μειώνουν την παραγωγή του VEG-A, ενώ η υπογλυκαιμία αυξάνει την έκφραση του. Τέλος παρατηρείται και ορμονικός έλεγχος της έκφρασής του. Ο VEG έχει σημαντικό ρόλο και σε παθολογικές περιπτώσεις, όπως είναι αυτές των στερεών όγκων, οπότε κι υπερεκφράζεται, και κάποιων αιματολογικών καταστάσεων. Στον καρκίνο μάλιστα υπάρχει συσχετισμός μεταξύ της έκφρασής του και της επιβίωσης του ασθενούς. Αυτό τον κάνει κατάλληλο στόχο εναντίον του καρκίνου. 2.2) VEG-B Η ακολουθία των αμινοξέων του VEG-B είναι κατά 44% κοινή με αυτην του VEG-A. Υπάρχουν και στον VEG-B αρκετά ισομορφή με τα κυριότερα να είναι αυτά με 167 και 186 αμινοξέα. Εκφράζεται ιδιαιτέρως στην καρδιά του εμβρύου, και στο καρδιακό, στο μυικό σύστημα, στο πάγκρεας, και τα οστά αλλά όχι απο τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο VEG-B 167 προσδένεται στην ηπαρίνη, ενώ ο VEG-B 186 εκκρίνεται ελεύθερα απο τα κύτταρα. Η έκφραση του VEG-B συμπίπτει με αυτήν του VEG-A αν και η υποξία δεν προκαλεί την έκκρισή του, όπως συμβαίνει στον VEG-A. Το γονίδιο το οποίο κωδικοποιεί τον VEG-B βρίσκεται στο χρωμόσωμα 11q13. Ο VEG-B προσδένεται με τον VEGR-1 και τον Nrp-1 και μπορεί να σχηματίσει ετεροδιμερή με τον VEG-A. Υπάρχουν δύο ισομορφή, ο VEG-B 167 κι ο VEG-B 186. Ο ακριβής ρόλος του VEG-B in vivo δεν έχει εξακριβωθεί ακόμα. 2.3) VEG-C Ο VEG-C είναι κοινός με τον VEG-A κατά 30% περίπου και αποτελείται απο 419 αμινοξέα και η μάζα του είναι 47kDa. Το γονίδιό του βρίσκεται στο χρωμόσωμα 4q34. Η εκκρισή του προκαλείται απο προφλεγμονώδεις κυτοκίνες αλλά όχι απο την υποξία. Ο VEG-C προκαλεί λεμφαγγειογένεση και σε αντίθεση με τους VEG-A και VEG-B παράγεται ως ώριμη πρωτεΐνη. Τα διαφορετικά ισομορφή του VEG-C και του VEG-D είναι αποτέλεσμα πρωτοελυτικής επεξεργασίας κι όχι διαφορετικού γενετικού ματίσματος. Η ώριμη μορφή του VEG-C προάγει την μίτωση και την μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων ενώ συμβάλει και στην επιβίωσή τους. Ο VEG-C εκφράζεται μαζί με τον υποδοχέα του, τον VEGR-3 Η αναστολή του μπορεί να συμβάλλει στην αναστολή της λεμφικής μετάστασης του καρκίνου. Τέλος τα καρκινικά κύτταρα του καρκίνου του μαστού εκφράζουν τον VEG-C 2.4) VEG-D Ο VEG-D παλιότερα συγκαταλεγόταν στους αυξητικούς παράγοντες που προκαλούνται απο το c-fos. Μετανομάστηκε όμως λόγω των ιδιοτήτων του. Η αλληλουχία των αμινοξέων του ομοιάζει περισσότερο με αυτήν του VEG-C, όπου παρατηρείται μία ταυτοποίηση κατά 23,3%. Προκαλεί μίτωση στα ενδοθηλιακά κύτταρα in vitro και είναι παράγοντας που προκαλεί λεμφαγγειογένεση. Η γονιδιακή του έκφραση προκαλείται απο τον μεταγραφικό παράγοντα c-fos.ευρίσκεται κυρίως στους πνεύμονες, την καρδιά, τους μυς και το λεπτό έντερο. Ιδιαίτερη σημασία έχει κατά το τελευταίο τρίμηνο της κήυσης όπου και συμβάλει στην δημιουργία των αγγείων στους πνεύμονες. Το γονίδιό του βρίσκεται στο χρωμόσωμα Xp22.31 Όπως και ο VEG-C έτσι κι με τον VEG-D, αν αναστείλουμε την δράση του μπορεί να αναστείλουμε την λεμφική μετάσταση του καρκίνου.