ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ: ΤΟ ΒΑΣΙΚΟ ΕΡΓΑΛΕΙΟ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ

ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ: ΤΟ ΒΑΣΙΚΟ ΕΡΓΑΛΕΙΟ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Σκοπός - Να γνωρίσετε την κατασκευή και τη λειτουργία του µικροσκοπίου. - H εξοικείωση µε τη χρήση του µικροσκοπίου. - Η ανάπτυξη υπευθυνότητας εκ µέρους των µαθητών για τη φροντίδα και τη προστασία του εργαστηριακού εξοπλισµού Στοιχεία θεωρίας Το 1950 ένας Ολλανδός οπτικός ο Ζαχαρίας Γιάνσεν σκέφτηκε ότι αν ένας φακός µεγεθύνει σε ορισµένο βαθµό τα αντικείµενα, δύο φακοί θα τα µεγεθύνουν περισσότερο. Τοποθέτησε από έναν φακό στις δύο άκρες ενός σωλήνα και διαπίστωσε ότι η µεγέθυνση ήταν πράγµατι µεγαλύτερη. Ο σωλήνας του Γιάνσεν µπορεί να θεωρηθεί το πρώτο µικροσκόπιο. Το 1658 ο Γιαν Σβάµερνταµ διέκρινε στο µικροσκόπιο τα ερυθρά αιµοσφαίρια. Το 1665 παρατηρήθηκαν από τον Άγγλο φυσικό Ρόµπερτ Χούκ ορθογώνιες οπές σε τοµή φελλού, που ονοµάστηκαν κύτταρα (από τη λέξη «κύτταρος», που σηµαίνει κυψέλη της κηρήθρας). Το 1676 ο ανός Άντονι βαν Λέβενχουκ χρησιµοποίησε µικρούς ανεξάρτητους φακούς, οι οποίοι µπορούσαν να µεγεθύνουν µέχρι και 200 φορές. Το 1931 ο Γερµανός µηχανικός Έρνστ Ρούσκα κατασκεύασε το πρώτο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο το οποίο µεγέθυνε τα αντικείµενα κατά 400 φορές. Το 1937 ο Καναδός φυσικός Τζέιµς Χίλιερ κατασκεύασε ένα ηλεκτρικό µικροσκόπιο που επιτύγχανε µεγέθυνση κατά 7000 φορές. Αργότερα ο ίδιος, αλλά και άλλοι επιστήµονες κατασκεύασαν ακόµα ισχυρότερα ηλεκτρονικά µικροσκόπια, ώσπου επιτεύχθηκαν µεγεθύνσεις που έφταναν τις 2.000.000 φορές. Ακολούθησε η κατασκευή άλλων τύπων µικροσκοπίων, όπως µικροσκόπιο εκποµπής πεδίου (1937), και το µικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων το οποίο γίνονται ορατά όλα τα µέρη ενός κυττάρου χωρίς να είναι αναγκαία η χρήση χρωστικών που καταστρέφουν το κύτταρο (1938). Τέλος το 1970 έγιναν παρατηρήσεις µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο σάρωσης, το οποίο έδινε µια τρισδιάστατη εικόνα, που πρόσφερε περισσότερες πληροφορίες για τη δοµή της εξεταζόµενης επιφάνειας. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ Ένα απλό σχολικό µικροσκόπιο αποτελείται από τρία βασικά συστήµατα, το οπτικό, το µηχανικό και το φωτιστικό. Ι. ΟΠΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το οπτικό σύστηµα αποτελείται από τον προσοφθάλµιο φακό ο οποίος προσαρµόζεται στον οπτικό σωλήνα. Στο κάτω µέρος του οπτικού σωλήνα, πάνω σε περιστρεφόµενο δίσκο είναι προσαρµοσµένοι οι αντικειµενικοί φακοί µε αύξουσα µεγεθυντική ικανότητα. Πάνω στους φακούς (προσοφθάλµιο και αντικειµενικούς) αναγράφεται η µεγεθυντική τους ικανότητα (π.χ. προσοφθάλµιος 10Χ, αντικειµενικοί 4Χ, 10Χ, 40Χ και 100Χ). Το οπτικό σύστηµα µετακινείται από δύο κοχλίες το µικροµετρικό και το µακροµετρικό. ΙΙ. ΜΗΧΑΝΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το µηχανικό σύστηµα αποτελείται από τη βάση του µικροσκοπίου, την τράπεζα πάνω στην οποία τοποθετείται το παρασκεύασµα και στερεώνεται µε ένα πίεστρο. Στο µηχανικό σύστηµα ανήκει και ο βραχίονας (λαβή) του µικροσκοπίου µε τον οποίο µπορείς να το µεταφέρεις καθώς επίσης και οι κοχλίες µετακίνησης του παρασκευάσµατος (κάθετα ο πάνω και οριζόντια ο κάτω). ΙΙΙ. ΦΩΤΙΣΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το φωτιστικό σύστηµα περιλαµβάνει µια ενσωµατωµένη πηγή φωτός. Το φως διέρχεται από ένα διάφραγµα µε το οποίο µπορείς να αυξοµειώνεις την ένταση του. Στη συνέχεια φωτίζει το αντικείµενο που παρατηρείς, από κάτω προς τα πάνω. Αταµπασίδη Ελένη, ρ Βιολογίας 1

Στο φωτιστικό σύστηµα ανήκει και ο συµπυκνωτής. Σκοπός του είναι η εστίαση της φωτεινής πηγής στο επίπεδο του παρασκευάσµατος. Η κακή ρύθµιση του συµπυκνωτή έχει σαν αποτέλεσµα τον κατά πολύ περιορισµό της διακριτικής ικανότητας του οργάνου. ΜΕΓΕΘΥΝΣΗ Η τελική µεγέθυνση του αντικειµένου που παρατηρείς µπορεί να υπολογιστεί αν πολλαπλασιάσεις την µεγέθυνση του προσοφθάλµιου φακού επί τη µεγέθυνση που δίνει ο αντικειµενικός φακός που χρησιµοποιείς. Μεγέθυνση Μεγέθυνση Τελική µεγέθυνση προσοφθάλµιου αντικειµενικού 10Χ 4Χ 40Χ 10Χ 10Χ 100Χ 10Χ 40Χ 400Χ 10Χ 100Χ 1000Χ ΙΑΚΡΙΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ Είναι η πιο χαρακτηριστική ικανότητα ενός µικροσκοπίου καθώς είναι εκείνη που καθορίζει την ικανότητά του να διακρίνει ευκρινώς τις λεπτοµέρειες των αντικειµένων που παρατηρούµε σε µια µεγέθυνση και εξαρτάται κυρίως από τον αντικειµενικό φακό. Ως διακριτό όριο ορίζεται η ελάχιστη απόσταση µεταξύ δύο σηµείων ώστε αυτά να φαίνονται σαν δύο. Αν ένα µικροσκόπιο έχει διακριτική ικανότητα 0,3µ, δύο αντικείµενα θεωρούνται ξεχωριστά αν χωρίζονται µε µια απόσταση 0,3µ. Αν όµως τα ίδια αντικείµενα εξετάζονται µε ένα µικροσκόπιο που η διαχωριστική του ικανότητα είναι 0,5µ, τότε θα φαίνονται σ ένα σηµείο. Η διακριτική ικανότητα ενός καλού µικροσκοπίου είναι 0,2µ. Όσες δοµές είναι µικρότερες από την τιµή αυτή δεν είναι δυνατόν να παρατηρηθούν µε το φωτονικό µικροσκόπιο (ριβοσώµατα 150 Α ο, µικροσωληνίσκοι 250 Α ο, µεµβράνες 70 Α ο ). Τα σύγχρονα µικροσκόπια διαθέτουν διακριτικό όριο 1 Α ο ή και µικρότερο ( διάµετρος ατόµου υδρογόνου 1,08 Α ο ) ΠΩΣ ΤΟ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΜΕ: Ελέγχουµε ώστε στη θέση µικροσκόπησης να βρίσκεται ο αντικειµενικός φακός µε τη µικρότερη µεγέθυνση. Ανάβουµε τη φωτεινή πηγή του µικροσκοπίου και ανοίγουµε το διάφραγµα, ώστε να περνά το φως. Αν παρατηρήσουµε µέσα από τον προσοφθάλµιο φακό, θα πρέπει να βλέπουµε ένα φωτεινό κύκλο, ο οποίος ονοµάζεται οπτικό πεδίο. Τοποθετούµε στην τράπεζα του µικροσκοπίου την αντικειµενοφόρο πλάκα µε το παρασκεύασµα προς τα επάνω και το ακινητοποιούµε µε τα πίεστρα. Μετακινούµε (µε τους κοχλίες κίνησης του δείγµατος) την αντικειµενοφόρο πλάκα, ώστε αυτό που θέλουµε να παρατηρήσουµε να είναι στη µέση του οπτικού πεδίου. Παρατηρούµε από πλάγια και µετακινούµε, αν χρειάζεται, µε τον µακροµετρικό ή το µικροµετρικό κοχλία την τράπεζα, ώστε ο φακός να απέχει από το παρασκεύασµα περίπου 1mm. (ΠΡΟΣΟΧΗ να µην ακουµπήσει ο φακός στο παρασκεύασµα!) Παρατηρούµε µέσα από τους προσοφθάλµιους φακούς και µε µικρές κινήσεις του µικροµετρικού κοχλία προσπαθούµε να εστιάσουµε, ώστε να δούµε όσο γίνεται πιο καθαρά το παρασκεύασµα. (Επειδή η επιφάνεια του παρασκευάσµατος δεν είναι επίπεδη, χρησιµοποιούµε το µικροµετρικό κοχλία κίνησης της τράπεζας για να δούµε όλα τα σηµεία του δείγµατος) Αταµπασίδη Ελένη, ρ Βιολογίας 2

Μετακινώντας προσεχτικά την αντικειµενοφόρο πλάκα, φέρνουµε στο οπτικό µας πεδίο το τµήµα του παρασκευάσµατος που µας ενδιαφέρει. Είναι πιθανό να χρειάζεται να ρυθµίσουµε το φωτισµό µε το διάφραγµα, ώστε να έχουµε µεγαλύτερη ευκρίνεια. Αν η άσκηση απαιτεί µεγαλύτερη µεγέθυνση, περιστρέφουµε το δίσκο µε τους αντικειµενικούς φακούς διαδοχικά. Σε κάθε φακό εστιάζουµε χρησιµοποιώντας ΠΑΝΤΑ το µικροµετρικό κοχλία, µέχρι να βρεθεί στη θέση µικροσκόπησης ο φακός µε την επιθυµητή µεγέθυνση. Αν η άσκηση απαιτεί να σχεδιάσουµε, τοποθετούµε το φύλλο εργασίας στη δεξιά πλευρά του µικροσκοπίου οι δεξιόχειρες και στην αριστερή οι αριστερόχειρες και σηµειώνουµε τις παρατηρήσεις µας σε αυτό. Όταν η άσκηση ολοκληρωθεί, σβήνουµε τη φωτεινή πηγή, περιστρέφουµε το δίσκο ώστε ο αντικειµενικός φακός µε τη µικρότερη µεγέθυνση να βρεθεί στη θέση µικροσκόπησης και αφαιρούµε την αντικειµενοφόρο πλάκα µε το παρασκεύασµα. Καλύπτουµε το µικροσκόπιο µε το προστατευτικό κάλυµµα. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ ΓΙΑ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ Καθαρίζουµε µια αντικειµενοφόρο πλάκα και µια καλυπτρίδα. Τοποθετούµε το αντικείµενο που θέλουµε να παρατηρήσουµε στο κέντρο της αντικειµενοφόρου πλάκας. Προσθέτουµε µε το σταγονόµετρο (ή πιπέτα Pasteur) µια σταγόνα νερό ή άλλη ουσία (π.χ. χρωστική), ανάλογα µε τις απαιτήσεις της άσκησης. Ακουµπάµε µε κλίση περίπου 45 ο την καλυπτρίδα στην άκρη της σταγόνας και την αφήνουµε να πέσει αργά (αυτό µπορεί να γίνει και µε τη βοήθεια µιας ανατοµικής βελόνας) πάνω στο παρασκεύασµα. Με τον τρόπο αυτό δεν εγκλωβίζονται φυσαλίδες αέρα στο παρασκεύασµα. (ΠΡΟΣΟΧΗ! εν πρέπει το παρασκεύασµα να ξεπερνά τα όρια της καλυπτρίδας!) Για να µην υγρανθεί ο αντικειµενικός φακός, αφαιρούµε µε ένα απορροφητικό χαρτί ή ένα χαρτοµάντιλο, το νερό που προεξέχει από την καλυπτρίδα. Το παρασκεύασµα είναι έτοιµο για παρατήρηση. ΦΡΟΝΤΙ Α ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ Για να µετακινήσετε το µικροσκόπιο χρησιµοποιείστε και τα δύο σας χέρια. Το µικροσκόπιο να τοποθετείται στο κέντρο του πάγκου εργασίας. Για τον καθαρισµό των φακών χρησιµοποιείται ειδικό χαρτί (άλλα υλικά όπως χαρτοπετσέτες µπορεί να γδάρουν την επιφάνεια των φακών). ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ Α) Όλα τα µικροσκόπια παρουσιάζουν ένα είδος αντίστροφου ειδώλου επειδή οι φωτεινές ακτίνες από το αντικείµενο διασταυρώνονται προτού φτάσουν στο µάτι του παρατηρητή. Η εικόνα αντιστρέφεται από δεξιά στα αριστερά και από ορθή σε ανάποδη θέση. Β) Επειδή η επιφάνεια του παρασκευάσµατος δεν είναι επίπεδη, πρέπει να χρησιµοποιούµε το µικροµετρικό κοχλία κίνησης για να δούµε όλα τα σηµεία του δείγµατος. Αν και το δείγµα φαίνεται να είναι δύο διαστάσεων, υπάρχει ένα βάθος 2- Αταµπασίδη Ελένη, ρ Βιολογίας 3

10µ. Στις µεγάλες εστιάσεις οι φακοί δεν εστιάζουν σε όλο το βάθος του αντικειµένου. Σε κάθε εστίαση εστιάζεται ένα επίπεδο του αντικειµένου, ενώ τα ανώτερα και κατώτερα επίπεδα είναι θολά ή δεν φαίνονται και συνήθως επηρεάζουν την καθαρότητα της εικόνας. Γ) Όταν παρατηρούµε πολύ µικρού µεγέθους αντικείµενα, πρέπει να βεβαιωθούµε ότι αυτό που βλέπουµε δεν είναι κάποιες κηλίδες ή σκουπίδια των φακών του µικροσκοπίου. Αυτό το ελέγχουµε µετακινώντας ελαφρά το βερνιέρο κίνησης της πλάκας, για να δούµε αν µετακινείται αυτό στο οποίο εστιάσαµε. ) Η εστίαση στους φακούς που έχουν ένδειξη 20Χ, 40Χ και 100Χ γίνεται µόνο µε το µικροµετρικό κοχλία, γιατί η απόσταση εργασίας είναι µικρή και υπάρχει κίνδυνος να σπάσει το παρασκεύασµα. Ε) Σε κάθε παρασκεύασµα ανάµεσα στην αντικειµενοφόρο πλάκα και στην καλυπτρίδα παρεµβάλλεται ένα λεπτό στρώµα αέρα που αυξάνει την εκτροπή των φωτεινών ακτίνων και δυσχεραίνει τη µικροσκοπική παρατήρηση. Προς αποφυγή του παραπάνω προβλήµατος τα αντικείµενα µικροσκόπησης παρατηρούνται µέσα σε σταγόνες νερού ή άλλου υγρού. Για να µικρύνουµε το διακριτικό όριο βάζουµε κεδρέλαιο µεταξύ αντικειµενικού φακού και αντικειµένου. Με τον τρόπο αυτό οι ακτίνες που περνούν από το αντικείµενο δεν διαθλώνται πριν µπουν στον αντικειµενικό φακό, καθώς το κεδρέλαιο έχει σχεδόν ίδιο δείκτη διάθλασης µε το φακό. Το κεδρέλαιο παρεµβάλλεται µεταξύ του 100Χ φακού (καταδυτικού) και του αντικειµένου. Μετά τη χρήση του ο φακός των 100Χ πρέπει να καθαρίζεται προσεκτικά µε διάλυµα 7 µέρη αιθέρα και 3 µέρη αλκοόλης ή µε διάλυµα ξυλόλης. Παρατήρηση: Ο αντικειµενικός φακός 100Χ, ονοµάζεται καταδυτικός και τον χρησιµοποιούµε µόνο µε την βοήθεια ενός ειδικού ελαίου που ονοµάζεται κεδρέλαιο. Χρησιµοποιείται δε µόνο για ξηρά παρασκευάσµατα δηλαδή για παρασκευάσµατα χωρίς καλυπτρίδα ΧΡΩΣΕΙΣ Κατά τη παρατήρηση χρησιµοποιούνται χρωστικές ουσίες οι οποίες έχουν την ικανότητα να χρωµατίζουν συγκεκριµένα κύτταρα ή ενδοκυτταρικά στοιχεία διαπερνώντας τις πλασµατικές µεµβράνες. Οι χηµικές αυτές ουσίες δεσµεύονται εκλεκτικά σε διάφορα κυτταρικά συστατικά µε αποτέλεσµα το σύµπλεγµα να δίνει χρωµατιστές περιοχές. Οι χρωστικές διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: 1) στις βασικές ή κατιονικές όπου η χρωµοφόρος οµάδα, δηλαδή η προσδιοριστική του χρώµατος είναι κατιονική (π.χ κυανούν του µεθυλενίου, πράσινο του µεθυλίου) 2) στις όξινες ή ανιονικές οι οποίες περιέχουν ανιονικό χρωµοφόρο Συνηθέστερες χρωστικές: Κυανούν του µεθυλενίου: στο νερό(3.55%) και µικρότερη στην αλκοόλη(1.48%).είναι άριστη χρωστική για βακτηριολογικές µελέτες και µπορεί να χρησιµοποιηθεί για παρατηρήσεις στο µικροσκόπιο. Το κυανούν του µεθυλενίου ανάγεται µετά από πρόσληψη δύο ηλεκτρονίων από ένα δέκτη και µε τη σειρά του θα Αταµπασίδη Ελένη, ρ Βιολογίας 4

δώσει τα ηλεκτρόνια στο Ο2 αποτελώντας έτσι ένα παράλληλο δρόµο µεταφοράς ηλεκτρονίων στο οξυγόνο. Έτσι µπορεί να εκτιµηθεί η µεταβολική δραστηριότητα των µικροβίων µε την αναγωγή (αποχρωµατισµό) του κυανού του µεθυλενίου παρέχοντας µια γενική εικόνα για την ποιότητα π.χ του ακατέργαστου όσο και του παστεριωµένου γάλακτος. Η χρωστική υπάρχει έτοιµη στα εργαστήρια του Λυκείου και στο εµπόριο. Πράσινο του µεθυλίου: η βασική αυτή χρωστική αντιδρά µε τα σύµπλοκα πρωτεΐνης-dna λόγω των φωσφορικών ριζών του DNA. Για να παρασκευάσουµε τη χρωστική ρίχνουµε 2g σκόνης πράσινο του µεθυλίου σε 100 ml οινοπνεύµατος 50 0. Ιώδιο: ανήκει σε οµάδα ουσιών χωρίς χρωµοφόρες οµάδες δηλαδή χωρίς να είναι χρώµατα από χηµική άποψη. Χρησιµεύουν ως µικροχηµικοί δείκτες γιατί εµφανίζουν χρωµατικό αποτέλεσµα. Lugol: To ιώδιο είναι γνωστό ως χρωµατικός δείκτης για την ανίχνευση αµύλου όταν χρησιµοποιείται µε προσθήκη KI. (προσθέτουµε 4gr KI σε 100ml απιονισµένο νερό και αφού αναµειχθούν καλά προσθέτουµε 1-2gr I 2 )Η χρωµατική αντίδραση του ιωδίου σε τοµές νωπού φυτικού υλικού παρουσιάζει µια ποικιλότητα ανάλογα µε τη χηµική σύσταση: Μπλε : το ιώδιο τοποθετείται στις κοιλότητες του ελικοειδούς µορίου του αµύλου, µε αποτέλεσµα το χαρακτηριστικό βαθύ µπλε χρώµα Καφέ: κυτταρίνη, πρωτεΐνες, αλκαλοειδή Κίτρινο: πηκτίνη, υµενίνη, καλόζη ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ: ΤΟ ΒΑΣΙΚΟ ΕΡΓΑΛΕΙΟ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Αταµπασίδη Ελένη, ρ Βιολογίας 5

Φύλλο Εργασίας Α). Στην παρακάτω εικόνα του µικροσκοπίου, συµπλήρωσε τα κενά µε τους αριθµούς 1-14. Πίεστρα, περιστρεφόµενος δίσκος, βραχίονας, βάση, µακροµετρικός κοχλίας, µικροµετρικός κοχλίας, διάφραγµα, αντικειµενικός φακός 10Χ, αντικειµενικός φακός 40Χ, αντικειµενικός φακός 100Χ, οπτικός σωλήνας, προσοφθάλµιος φακός, τράπεζα, πηγή φωτός Β). 1. Υπολόγισε τη µεγέθυνση στην οποία θα παρατηρήσεις το παρασκεύασµα αν χρησιµοποιήσεις i) αντικειµενικό φακό 10Χ και προσοφθάλµιο 5Χ ii) αντικειµενικό φακό 40Χ και προσοφθάλµιο 10Χ... Σε ποια από τις δύο περιπτώσεις θα µπορέσεις να παρατηρήσεις µεγαλύτερο τµήµα του παρασκευάσµατος;.. 2. Προς ποια διεύθυνση θα κινηθεί το παρασκεύασµα στο οπτικό σου πεδίο, αν µετακινήσεις την αντικειµενοφόρο πλάκα i) προς τα δεξιά:. ii) προς τα αριστερά: iii) προς την πλευρά σου : iv) αντίθετα από την πλευρά σου:.. Αταµπασίδη Ελένη, ρ Βιολογίας 6