ΟΛΓΑ ΜΠΟΥΝΤΑΓΚΙΔΟΥ ΔΙΕΥΡΥΝΣΗ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΚΡΟΚΙΝΗΣ ΜΕ ΣΚΟΠΟ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΧΕΣΗΣ ΔΟΜΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ

Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Τμήμα Χημείας Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων Πανεπιστήμιο Wageningen Τμήμα Τεχνολογίας και Διατροφής Εργαστήριο Οργανικής Χημείας ΟΛΓΑ ΜΠΟΥΝΤΑΓΚΙΔΟΥ Χημικός, Μεταπτυχιακή Φοιτήτρια του ΠΜΣ του τμήματος Χημείας με έμφαση στη Χημεία και Τεχνολογία Τροφίμων ΔΙΕΥΡΥΝΣΗ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΚΡΟΚΙΝΗΣ ΜΕ ΣΚΟΠΟ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΧΕΣΗΣ ΔΟΜΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ Επιβλέποντες Καθηγητές: κα. Μαρία Τσιμίδου, Καθηγήτρια στο Τμήμα Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κ. Teris van Beek, Καθηγητής στο Τμήμα Διατροφής και Τεχνολογίας του Πανεπιστημίου Wageningen Μεταπτυχιακή Εργασία Θεσσαλονίκη-Wageningen, 2009-2010

Στη Μητέρα μου, ii

ΠΡΟΛΟΓΟΣ ÿ Ευχαριστώ πολύ την κα. Μαρία Τσιμίδου για το ενδιαφέρον της για την πρόοδο των σπουδών μου και το μέλλον μου. Είναι αναμφίβολα εξαίρετη επιστήμονας αλλά αυτό που θαυμάζω είναι η ιδιαίτερη σοφία και διορατικότητα με την οποία προσεγγίζει τα θέματα είτε είναι επιστημονικά είτε είναι κοινωνικά. Με βοήθησε πολύ στο να αναγνωρίσω τις αδυναμίες μου..αποκόμισα πολλά από την τεράστια πείρα που διαθέτει σε επιστημονικά θέματα. Αγάπησα ακόμη περισσότερο τα φυσικά προϊόντα και ιδιαίτερα το ελαιόλαδο. Εκτιμώ και σέβομαι την ηθική της. ÿ Η Στέλλα Ορδούδη αποτέλεσε σε μεγάλο βαθμό καθρέφτη του εαυτού μου και βοήθησε επίσης στην αναγνώριση των αδυναμιών μου. Ακόμη, συνέβαλε πολύ στην συγγραφή της μεταπτυχιακής εργασίας μου. Διαθέτει εξαίρετη δεξιοτεχνία στη σωστή χρήση της ελληνικής γλώσσας. Αυτό που επίσης παρατήρησα είναι ότι διαθέτει κριτική και αφαιρετική σκέψη, κάτι σημαντικό για έναν ερευνητή. ÿ Ευχαριστώ τους: κ. Κιοσέογλου Β., κ. Μπλέκα Γ., κα. Παρασκευοπούλου Μ. και κα. Χατζηδημητρίου Ε. που υπήρξαν καθηγητές μου. ÿ Πολλά ευχαριστώ στις γραμματείς: την κα. Σταυρακάκη Λυδία, τη κα. Elly και την κα. Aleida. Όλες τους είναι απίστευτα ευγενικές και με καλή διάθεση για βοήθεια. ÿ Ο Νίκος Νενάδης έχει ταλέντο στη διδασκαλία και αν το καλλιεργήσει, θα γίνει εξαίρετος καθηγητής. Αυτό που θα θυμάμαι από τη Φανή Μαντζουρίδου είναι ότι πολλές φορές διατίθεται να βοηθήσει παρά τις «συνθήκες ανταγωνισμού» και το εκτιμώ. Η Ελένη Ναζίρη είναι από τα πιο αγνά άτομα που γνωρίζω. Η Ελευθερία Περιφάντση είναι δεξιοτέχνης στις διαπροσωπικές σχέσεις και ο Σταμάτης Στραφιώτης είναι ειλικρινής. Τους ευχαριστώ όλους για τη βοήθεια στο εργαστήριο. ÿ Ευχαριστώ από τα βάθη της καρδιάς μου τον κ. Teris van Beek για όλα όσα έκανε για μένα κατά τη διάρκεια της διαμονής μου στην Ολλανδία. Εκτίμησα ιδιαίτερα τον μοναδικό χαρακτήρα του και μια φιλοσοφία ζωής που είναι ξεχωριστή. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Elbert van der Klift και κ. Barrent για τη τεχνική υποστήριξη. Η συνεισφορά τους ήταν πολύ σημαντική για την πρόοδο της πτυχιακής μου εργασίας. iii

ÿ Χαίρομαι για τη φιλία με την Jacinthe Gagnone (Canada) και θαυμάζω τον Alexandre Villela (Brazil) για τον μοναδικό τρόπο σκέψης του, την καλοσύνη του και την απίστευτή εργατικότητα του. Απόλαυσα πολύ τα γεύματα μας στον βοτανικούς κήπους και αποκόμισα πολλά από τις συζητήσεις που είχαμε. ÿ Ευχαριστώ τη Cia Ahmad (Indonesia) για το laptop της, το ποδήλατο και την παρέα. Διαθέτει το χάρισμα της ενσυναίσθησης, απίστευτη γενναιοδωρία και είναι μια αληθινή ηγέτης. ÿ Ευχαριστώ την Shirani Widana Gamage (Sri Lanka) για την αφιλοκερδή παραχώρηση του δωματίου της στο Bornsesteeg. Είναι καλή επιστήμονας και θα γίνει εξαίρετη καθηγήτρια στη χώρα της. ÿ Τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στους: Villem van Heugten (the Netherlands), Johanna Molenaar (the Netherlands), Rara (Indonesia), Dita (Indonesia), Madeleine Florin (Australia) και Yoyo (China) για το ενδιαφέρον και την παρέα τους. Επέλεξα να συγκεκριμένα άτομα ανάμεσα σε πολλά γιατί ήθελα να τους τιμήσω για αυτό που είναι και τον χαρακτήρα που διαθέτουν. ÿ Ευχαριστώ την Αγάπη Πιλίδου για την άνευ όρων προσφορά, τη Φανή Παπασταματίου για την ψυχολογική στήριξη, τη Μαργαρίτα Ιωσηφίδου για την κατανόηση και τη Στέλλα Τσετίνη για τη φιλία. ÿ Ευχαριστώ την Αθηνά Μπουνταγκίδη που ήταν δίπλα μου όταν την είχα ανάγκη. ÿ Ευχαριστώ την κα. Anke και τον κ. Peter για την ευγενική καρδία τους, την αγάπη τους και τα υπέροχα ταξίδια. Είναι τιμή μου που γνώρισα τέτοιους ανθρώπους. ÿ Ευχαριστώ ιδιαιτέρως την μητέρα μου Νίνα, που όλη αυτή τη δύσκολη περίοδο πίστεψε πιο πολύ σε μένα από ότι εγώ η ίδια στον εαυτό μου. Σας ευχαριστώ όλους! Όλγα Μπουνταγκίδου iv

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 1.1 Φαινολικές Ενώσεις 1 1.1.1 Γενικά 1 1.1.2 Η περίπτωση των φαινολικών αλδεϋδών 2 1.1.2.1 Γενικά. 2 1.1.2.2 Αρωματικές αλδεΰδες 2 1.1.2.3 Υδροξυβενζαλδεΰδες 3 1.1.3 Αξιολόγηση ικανότητας φαινολικών ενώσεων να δεσμεύουν υπεροξυ-ρίζες/ Εκτίμηση σχέσης δομήςδραστικότητας (Structure-Activity Relationships, SARs)... 4 1.1.3.1 Γενικά. 4 1.1.3.1.1 Η περίπτωση των υδροξυβενζαλδεϋδών μελέτες SAR. 5 1.2 In Vitro Μέθοδοι Εκτίμησης Αντιοξειδωτικής Δράσης... 7 1.2.1 Γενικά. 7 1.2.2 Δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης (Crocin Bleaching Assay, CBA). 7 1.2.3 Δοκιμή δέσμευσης της DPPH. 10 1.2.4 Δοκιμή δέσμευσης της ABTS +.. 12 1.2.5 On-line μέθοδοι διαχωρισμού και εκτίμησης αντιοξειδωτικής δράσης... 13 1.2.5.1 Γενικά 13 1.2.5.2 On-line HPLC-DPPH.. 14 1.2.5.3 On-line HPLC-ABTS +.. 15 1.2.5.4 On-line δοκιμές δέσμευσης οξυγόνου απλής διεγερμένης κατάστασης, ανιόντος σουπεροξειδίου και/ή v

υπεροξειδίου του υδρογόνου (Singlet oxygen on-line assay, Superoxide anion and/or Ηydrogen peroxide on-line assays)... 16 1.2.6 Άλλες μέθοδοι 17 1.2.6.1 Δοκιμή Rancimat Μέθοδος επιταχυνόμενης οξείδωσης λιπαρού υποστρώματος.... 17 2. Αντικειμενικός Σκοπός και Περιεχόμενο της Εργασίας. 19 3. Διερεύνηση σχέσεων δομής αρωματικών αλδεϋδών-αντιοξειδωτικής δράσης 20 3.1 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ.. 21 3.1.1 Υλικά... 21 3.1.2 Πρότυπες ενώσεις.. 21 3.1.3 Διαλύτες. 22 3.1.4 Υλικά χρωματογραφίας-αντιδραστήρια 22 3.1.5 Όργανα-συσκευές. 23 3.1.6 Μέθοδοι... 23 3.1.6.1 Δοκιμή Αποχρωματισμού της Κροκίνης (CBA) 23 3.1.6.1.1 Προετοιμασία μητρικών διαλυμάτων και διαλυμάτων εργασίας. 24 3.1.6.1.2 Μελέτη κινητικής της αντίδρασης με τις υπεροξυ- ρίζες 24 3.1.6.2 Δοκιμή δέσμευσης της DPPH 25 3.1.6.3 Δοκιμή δέσμευσης της ABTS + 27 3.1.6.4 Δοκιμή επιταχυνόμενης οξείδωσης λιπαρού υποστρώματος... 27 3.1.6.4.1 Προετοιμασία υποστρώματος 27 vi

3.1.6.4.2 Δοκιμή Rancimat 29 3.1.7 Υπολογισμός των συντελεστών κατανομής (LogP) 30 3.2 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ. 31 3.2.1 Εκτίμηση σχέσης δομής αντιοξειδωτικής δράσης υδροξυβενζαλδεϋδών με τη δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης (CBA) 31 3.2.2 Συγκριτική αποτίμηση αποτελεσμάτων δοκιμής αποχρωματισμού της κροκίνης με εκείνα που προέκυψαν από άλλες in vitro δοκιμές. 36 3.3 ABSTRACT... 44 4. Ανάπτυξη on-line HPLC-CBA μεθοδολογίας για την εκτίμηση της αντιοξειδωτικής δράσης μιγμάτων αντιοξειδωτικών... 45 4.1 An on-line HPLC-CBA procedure for detection of radical scavenging compounds: A first approach... 46 4.1.1 Abstract. 47 4.1.2 Introduction. 48 4.2 Experimental 48 4.2.1. Solvents and chemicals 48 4.2.2. Crocin stock solution 49 4.2.3. Preparation of AAPH solution.. 49 4.2.4. Preparation of sample solutions 49 4.2.5. Preparation of green tea extract... 50 4.2.6. Instrumental setup and operating conditions. 50 4.2.7. Off-line kinetic studies 51 vii

4.2.8. On-line HPLC-CBA procedure. 51 4.3 Results and discussion... 51 4.3.1. Initial conditions.. 51 4.3.2 Optimization of on-line experimental set-up.. 52 4.3.3. Determination of minimum detectable concentrations and minimum detectable amounts 55 4.3.4 Linearity of the procedure... 56 4.3.5. Application of the on-line HPLC-CBA procedure to a tea extract. 58 4.4 Conclusion.. 58 5. ΓΕΝΙΚΗ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ.. 59 6. ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ. 60 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 61 8. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ...... 72 viii

ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ Σελίδα Πίνακας 1.1 Πίνακας 3.1 Πίνακας 3.2 Πίνακας 3.3 Πίνακας 3.4 Table 4.1 Table 4.2 Table 4.3 Table 4.4 Σειρά μειούμενης ικανότητας των υδροξυβενζαλδευδών να δεσμεύουν αλκοξυή υδροξυ- ρίζες με τη δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης (Bors et al.,1984) 5 Ικανότητα υδροξυβενζαλδεϋδών και υδροξυβενζοϊκών οξέων να δεσμεύουν υπεροξυ- ρίζες, όπως εκτιμήθηκε με τη βοήθεια της CBA 32 Αντιοξειδωτική ικανότητα υδροξυβενζαλδεϋδών και υδροξυβενζοϊκών οξέων όπως εκτιμήθηκε με τη βοήθεια της δοκιμής δέσμευσης της DPPH 37 Ικανότητα υδροξυβενζαλδεϋδών και υδροξυβενζοϊκών οξέων να δεσμεύουν την ABTS +. 39 Αντιοξειδωτική ικανότητα υδροξυβενζαλδεϋδών και υδροξυβενζοϊκών οξέων όπως εκτιμήθηκε με τη βοήθεια της δοκιμής Rancimat... 41 Effect of different concentrations of AAPH solutions on the dynamic range for absorbance [eluent MeOH:H 2 O (50:50, v/v)]... 52 Effect of different concentrations of AAPH and crocin working solutions on the S/N ratio [20 μl injections of a 1 μm caffeic acid in eluent MeOH:H 2 O:H 3 PO 4 (50:50:0.1, v/v)]... 53 Effect of HPLC and reagent pump flow rates to the sensitivity expressed as Minimum Detectable Concentrations (Koleva et al., 2001) of caffeic acid in eluent (MeOH:H 2 O:H 3 PO 4 50:50:0.1, v/v)... 53 Minimum Detectable Amounts (MDA) of several hydrophilic antioxidants in the HPLC-CBA, HPLC-ABTS, HPLC-DPPH, and HPLC-CL on-line systems under isocratic conditions and injection volume 10 μl... 56 ix

ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σελίδα Σχήμα 1.1 Σχήμα 1.2 Σχήμα 1.3 Σχήμα 3.1 Figure 4.1 Figure 4.2 Figure 4.3 Figure 4.4 Figure 4.5 Figure 4.6 Κύρια δομικά χαρακτηριστικά ορισμένων κατηγοριών φαινολικών ενώσεων (O Connell and Fox, 2001) 1 Διάγραμμα ροής της διάταξης του on-line HPLC-DPPH συστήματος... 14 Διάγραμμα ροής της διάταξης του on-line HPLC-ABTS + συστήματος... 15 Αντίδραση ο-διφαινολών με τη ρίζα DPPH (Brand-Williams et al., 1995).. 38 Instrumental set-up for the HPLC-CBA on-line detection of radical-scavenging compounds. 50 Memorized chromatogram of blank injection at 440 nm with MeOH:H 2 O as a mobile phase in gradient elution conditions... 54 Chromatogram of blank injection after abstraction of memorized chromatogram at 440 nm with MeOH:H 2 O as a mobile phase in gradient elution conditions...... 54 Effect of sample solvent composition to the peak pattern. [AAPH: 0.355 mm, mobile phase; MeOH:H 2 O:H 3 PO 4 50:50:0.1 v/v; flow: 0.7 ml/min; crocin working solution 1.13 AU, T: 90 C, Injection volume: 20 μl, Abs=440 nm, Peak 1: 0.1 mm solution of caffeic acid in MeOH:H 2 O:H 3 PO 4 (50:50:0.1, v/v), Peak 2: 0.1 mm aqueous solution of caffeic acid, Peak 3: 0.1 mm solution of caffeic acid in methanol]... 55 Chromatogram of different concentrations of caffeic acid sequentially injected under isocratic conditions where 1: 0.1 µm, 2: 0.2 µm, 3: 0.4 µm, 4: 0.8 µm, 5: 1.6 µm, 6: 3.2 µm, 7: 6.4 µm, 8: 12.8 µm, 9: 25.6 µm και 10: 100 µm. Chromatographic conditions: mobile phase MeOH:H 2 O:H 3 PO 4 (50:50:0.1, v/v); Alltima C18 HPLC column (5 µm, 250 4.6 mmi.d.); injection volume: 20µL; Abs: 440nm and flow rate: 0.7mL/min... 57 Calibration curve for 0.8-12.8 μμ caffeic acid under optimized conditions... 57 x

Figure 4.7 Chromatograms of a) UV (265 nm) and b) VIS (440 nm) detection of green tea gunpowder aqueous extract. Chromatographic conditions: Alltima C18 HPLC column (5 μm, 250 x 4.6 mm i.d.); flow rate 0.7mL/min, sample volume 20 µl, isocratic conditions using as mobile phase a mixture of 10% MeOH acidified with 0.1% H 3 PO 4 (A) and 90% MeOH acidified with 0.1% H 3 PO 4 (B) at 70:30, v/v... 58 xi

ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΩΝ Σελίδα Φώτο 8.1 α) Κονιοποιημένα στίγματα του φυτού Crocus sativus L., β) Gingko biloba σε σκόνη... 72 Φώτο 8.2 α) Μητρικό διάλυμα κροκίνης, β) Διάλυμα εργασίας της κροκίνης, γ) εκχύλισμα Gingko biloba σε MeOH:H 2 O (50:50, v/v) 72 Φώτο 8.3 Οργανολογία της on-line HPLC-CBA μεθόδου..... 72 xii

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ Α Phenoxyl radical AAPH 2,2 -azobis (2-amidinopropane) hydrochloride ABTS 2,2 -azinobis (3-ethylbenothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt ACN Acetonitrile AE Antiradical efficiency AH Phenolic antioxidant AMVN 2,2'-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile) BDE Bond dissociation enthalpy CBA Crocin bleaching assay CL Chemiluminescence Cro Crocin DAD Diode array detector DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil radical EGCE Epigallocatechin gallate EC 50 Efficient concentration EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid GRAS Generally recognized as safe HAT Hydrogen atom transfer HPLC High performance liquid chromatography LC Liquid Chromatography MDA Minimum detectable amount MDC Minimum detectable concentration MeOH Methanol MS Mass spectrometry NMR Nuclear magnetic resonance OSI Oxidation stability index ORAC Oxygen radical absorbance capacity PBS Phosphate buffered saline PCL Photochemiluminescence PEEK Polyetheretherketones ROOH Lipid peroxides ROO peroxyl radical xiii

RSA Radical scavenging activity SAR Structure activity relationship SET Single electron transfer SIA Sequential injection analysis technique SPE Solid phase extraction SPLET Sequential proton loss electron transfer TBA Thiobarbituric acid TEAC Trolox equivalent antioxidant activity TEV Trolox equivalent value TFA Trifluoroacetic acid THF Tetrahydrofuran Trolox 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid UV Ultraviolet VIS Visible xiv

1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1 Φαινολικές Ενώσεις 1.1.1 Γενικά Τα τελευταία χρόνια έχει εκδηλωθεί μεγάλο ενδιαφέρον για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης των φυτοχημικών ενώσεων αφενός γιατί ασκούν ευεργετική επίδραση στην υγεία των ανθρώπων και αφετέρου διότι συμβάλλουν στη διατήρηση της ποιότητας και του χρόνου ζωής των τροφίμων, εμποδίζοντας την οξείδωση των λιπαρών συστατικών που εμπεριέχονται σε αυτά. Οι φαινολικές ενώσεις ανήκουν στην κατηγορία των περισσότερο μελετημένων ενώσεων καθώς παρουσιάζουν εκτός από αντιοξειδωτική δράση και ποικίλες άλλες επιθυμητές ιδιότητες στα τρόφιμα (χρωστική ικανότητα, αρωματικές ιδιότητες, αντιμικροβιακή δράση) και στην υγιεινή της διατροφής (αντικαρκινική δράση, αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες) (Lule and Xia et al., 2005). Οι φαινολικές ενώσεις είναι ομάδα οργανικών ενώσεων με μια ή περισσότερες υδροξυ-ομάδες στον αρωματικό δακτύλιο ή/και στους αρωματικούς δακτυλίους (Lule and Xia et al., 2005). Είναι δευτερογενείς μεταβολίτες που συντίθενται στα φυτά κατά την διάρκεια της αναπτυξής τους και επηρεάζονται από τους περιβαλλοντικούς παράγοντες (στρες) (Naczk and Shahidi, 2006). Προκύπτουν κυρίως από τις αντιδράσεις δύο βιοσυνθετικών οδών: του οξικού οξέος ή/και του σικιμικού οξέος (Harborne, 1989). Τα φλαβονοειδή, ισοφλαβονοειδή, φαινολικά οξέα, στιλβένια, λιγνάνες, κουμαρίνες και ταννίνες είναι μερικές από τις κατηγορίες των φαινολικών ενώσεων (Robards, 2003; Espın et al., 2007). O COOH CH 2 COOH CH=CH-COOH O O O O C6-C1 C6-C2 C6-C3 C6-C3-C6 C6-C2-C6 Συμπυκνωμένες Βενζοϊκά οξέα Φαινυλοξικά οξέα Κινναμωμικά οξέα Φλαβονοειδή Ανθρακινόνες Tαννίνες O Σχήμα 1.1 Κύρια δομικά χαρακτηριστικά ορισμένων κατηγοριών φαινολικών ενώσεων (O Connell and Fox, 2001). 1

1.1.2 Η περίπτωση των φαινολικών αλδεϋδών 1.1.2.1 Γενικά Οι αλδεΰδες ανήκουν στην οικογένεια των καρβονυλικών ενώσεων, που το κύριο χαρακτηριστικό τους είναι η ύπαρξη μιας ή περισσότερων αλδεϋδο-ομάδων στο μόριό τους και συγκαταλέγονται στις περισσότερο διαδεδομένες οργανικές ενώσεις, τόσο στη φύση όσο και στη χημική βιομηχανία (McMurry, 2001). Είναι εξαιρετικά δραστικές ενώσεις, παράγονται κατά την διάρκεια των αντιδράσεων στα διάφορα βιολογικά μονοπάτια, συνήθως έχουν μικρή διάρκεια ζωής στους ιστούς και έχουν ποικίλες χημικές και βιολογικές λειτουργίες (Goedde and Agarwal, 1990; Esterbauer et al., 1991; Nishikawa and Sakai, 1995; O Brien et al., 2005). 1.1.2.2 Αρωματικές αλδεΰδες Οι αρωματικές αλδεΰδες είναι κυρίως υποκαταστημένες βενζαλδεΰδες (O Brien et al., 2005). Παρουσία ενζύμων ή με χημική κατεργασία μετατρέπονται εύκολα στα αντίστοιχα οξέα (Ορδούδη, 2007) και έχουν βρεθεί σε διάφορα καρυκεύματα, βότανα και έλαια (O Brien et al., 2005). Οι αρωματικές αλδεΰδες εμφανίζουν ισχυρή αντιμυκητιακή και αντιβακτηριδιακή δράση, η οποία οφείλεται κατά κύριο λόγο στην παρουσία της καρβονυλικής ομάδας (Friedman et al., 2003; Fitzgerald et al., 2005). Αξίζει να σημειωθεί ότι η ίδια ομάδα είναι ομάδα-κλειδί για τις αρωματικές ιδιότητες της ένωσης. Έτσι, η κατανόηση της σημασίας της φαινολικής δομής για τις ιδιότητες των αλδεϋδών μπορεί να βοηθήσει στο σχεδιασμό ή την απομόνωση πιο αποτελεσματικών συντηρητικών που ταυτόχρονα διαθέτουν και άλλες επιθυμητές ιδιότητες (πολυλειτουργικά συστατικά) (Fitzgerald et al., 2005). Ωστόσο, θα πρέπει να γίνεται προσεκτική επιλογή των ενώσεων που πρόκειται να προστεθούν στα τρόφιμα, καθώς πολλές αρωματικές αλδεΰδες παρουσιάζουν μεταλλαξιγόνες και καρκινογόνες ιδιότητες στους ζωντανούς οργανισμούς. Ο βαθμός της κυτταροτοξικής δράσης σχετίζεται άμεσα με τον υδρόφοβο και ηλεκτρονιόφιλο χαρακτήρα της ένωσης (O Brien et al., 2005). Για παράδειγμα, η βενζαλδεΰδη που είναι το κύριο συστατικό στα αιθέρια έλαια των πυρήνων και σπόρων από πικραμύγδαλα, βερίκοκα, ροδάκινα, κεράσια, δαμάσκηνα (O Brien et al., 2005) και έχει χαρακτηριστεί ως ασφαλές πρόσθετο τροφίμων 2

(Generally Recognized As Safe, GRAS) στις ΗΠΑ και αποδεκτό αρωματικό συστατικό στην Ευρωπαϊκή Ένωση φαίνεται να είναι εκτός από ερεθιστική, αλλεργιογόνος αλλά και καρκινογόνος ένωση (Andersen, 2006; Varlet et al., 2007). 1.1.2.3 Υδροξυβενζαλδεΰδες Οι υδροξυβενζαλδεΰδες είναι μια υποκατηγορία των αρωματικών αλδεϋδών που είναι αρκετά διαδεδομένες στη φύση. Μεγάλη ποσότητα υδροξυβενζαλδεΰδών υπάρχει στις λιγνάνες του κόκκινου ξύλου βελανιδιάς, ξύλου λεύκας, άχυρο σιταριού, πυρήνες και φλοιούς ελαιοκάρπου, ξύλου ιτιάς, υποπροϊόντων σακχαροκάλαμου, ξύλου από ευκάλυπτο κ.α., από τις οποίες απελευθερώνονται με χημική ή ενζυμική κατεργασία (Tran and Chambers, 1986; Larsson et al., 1999; Martın et al., 2002; Garrote et al., 2004; Ορδούδη, 2007). Επίσης, κατά την παραλαβή των υδροξυβενζοϊκών οξέων από φυτικούς ιστούς αναφέρεται ορισμένες φορές και η παρουσία πρόδρομων υδροξυβενζαλδεϋδών οι οποίες στη συνέχεια μπορεί να οξειδωθούν εύκολα προς τα αντίστοιχα οξέα (Robards, 2003). Ακόμη, απαντούν στα βότανα (Melissa officinalis) (Shi and Chang, 2003; Karasova et al., 2006; Chen et al., 2006), αρωματικά φυτά (Vanilla planifolia) (Havkin-Frenkel et al., 1996; Fitzgerald et al., 2005), κόκκινα κρασιά (Rodriguez-Delgado et al, 2002; Ortega-Heras et al., 2007), αλκοολούχα ποτά (Tequila, Brandy) (Rodriguez, 2005), φλοιούς δέντρων (Del Alamo Sanza et al., 2004; Bedgood, 2005; Diaz-Maroto, 2008), όσπρια (φασόλια, φακές) (Bartolome et al., 1997; Luthria and Pastor-Corrales, 2006), ξηρούς καρπούς (αμύγδαλα, καρύδια) (Colaric et al., 2005; Prodanov et al., 2008; Garrido et al., 2008), φλοιούς άγριου ρυζιού (Asamarai et al., 1996) και διάφορους άλλους φυτικούς καρπούς. Oι υδροξυβενζαλδεΰδες έχουν αρωματικές ιδιότητες, αντιβακτηριδιακή και αντιμυκητιακή δράση και για αυτές τους τις ιδιότητες έχουν χρησιμοποιηθεί ως συντηρητικά ή/και ως αρωματικές ύλες στα τρόφιμα (O Brien et al., 2005; Shyamala et al., 2007; Ορδούδη, 2007). Τέλος, οι υδροξυβενζαλδεΰδες είναι περισσότερο λιπόφιλες σε σχέση με τα αντίστοιχα οξέα, ιδιότητα που θεωρείται σημαντική για τη καλύτερη διαπερατότητα των κυτταρικών μεμβρανών (O Brien et al., 2005). 3

1.1.3 Αξιολόγηση ικανότητας φαινολικών ενώσεων να δεσμεύουν υπεροξυ-ρίζες/ Εκτίμηση σχέσης δομής-δραστικότητας (Structure- Activity Relationships, SARs) 1.1.3.1 Γενικά Η διερεύνηση σχέσεων δομής-αντιοξειδωτικής δράσης αποσκοπεί γενικά στη βαθύτερη κατανόηση των μηχανισμών απόσπασης ατόμων υδρογόνου ή ηλεκτρονίων από τα δραστικά μόρια, το ρόλο των υποκαταστατών και την επιλογή των πιο δραστικών μορίων (Ορδούδη, 2007). Tα βασικά κριτήρια που πρέπει να πληροί μια φαινολική ένωση για να είναι καλός παρεμποδιστής της οξείδωσης είναι τα εξής: 1) ο δεσμός Ο-Η να έχει χαμηλή ενθαλπία διάστασης δεσμού (Βond Dissociation Enthalpy, BDE) ώστε να μπορεί εύκολα να αποσπαστεί το υδρογόνο από τη ρίζα και 2) η φαινοξυ- ρίζα που προκύπτει από τη διαδικασία μεταφοράς ατόμων υδρογόνου (Hydrogen Atom Transfer, HAT) να είναι σταθερή (Tsimidou et al., 2006; Siquet et al., 2006). Επιπλέον, ο αριθμός των υδροξυ- υποκαταστατών, η μεταξύ τους θέση (ορθο-, μετα-, παρα-), η δυνατότητα σχηματισμού ενδομοριακού δεσμού υδρογόνου, η παρουσία άλλων χαρακτηριστικών ομάδων (-OCH 3, -COOH, -CHO), η δυνατότητα επέκτασης της συζυγίας στην πλευρική ανθρακική αλυσίδα (π.χ. CH=CH-COOH), η δυνατότητα και η ευκολία του ιονισμού των υποκαταστατών, το μήκος της πλευρικής αλυσίδας, η δυνατότητα σχηματισμού δεσμών υδρογόνου μεταξύ της φαινολικής ένωσης και του διαλύτη και η μορφή των φαινολικών ενώσεων (γλυκοζίτες, ολιγομερείς ή πολυμερείς δομές) επιφέρουν μεταβολές στην αντιοξειδωτική τους δράση (Natella et al., 1999; Marinova and Yanishlieva, 2003; Sroka and Cisowski, 2003; Becker et al., 2004; Di Majo et al., 2005; Siquet et al., 2006; Ορδούδη, 2007; Bortolomeazzi et al., 2007; Laguerre et al., 2007; Di Majo et al., 2008). 4

1.1.3.1.1 Η περίπτωση των υδροξυβενζαλδεϋδών μελέτες SAR Οι μελέτες που αφορούν στην αντιοξειδωτική δράση αλδεϋδών είναι μάλλον περιορισμένες και όχι συστηματικές μέσα στην κατηγορία αυτή. Για παράδειγμα, αναφορά στην αντιοξειδωτική ικανότητα ορισμένων υδροξυβενζαλδεϋδών που εκτιμήθηκε με τη βοήθεια της δοκιμής αποχρωματισμού της κροκίνης γίνεται από τους Bors et al. (1984). Τα αποτελέσματά παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.1. Πίνακας 1.1 Σειρά μειούμενης ικανότητας των υδροξυβενζαλδευδών να δεσμεύουν αλκοξυ- ή υδροξυ- ρίζες με τη δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης (Bors et al.,1984). ΑΗ 1 k rel 2 (t-bo ) k rel (13-LO ) k rel (HO ) 2-υδροξυβενζαλδεΰδη 1 1 1 (σαλικυλική αλδεΰδη) 4-υδροξυβενζαλδεΰδη 5 * 3 3 (π-υδροξυβενζαλδεΰδη) 4-μεθοξυ-2-υδροξυβενζαλδεΰδη 3 4 * 3-μεθοξυ-4-υδροξυβενζαλδεΰδη 4 3 * (βανιλλίνη) 3,4-διυδροξυβενζαλδεΰδη 2 2 2 (πρωτοκατεχική αλδεΰδη) 1 φαινολική ένωση 2 σχετικές σταθερές ταχύτητας κάθε ΑΗ (k rel =k AH /k κροκίνη ) 3 δεν αναφέρονται τιμές από τους Bors et al. (1984) Από τον Πίνακα 1.1 φαίνεται ότι η σαλικυλική αλδεΰδη που διαθέτει μια ΟΗ ομάδα σε ορθο- θέση ως προς την CHO είναι περισσότερο δραστική από την πρωτοκατεχική αλδεΰδη που φέρει δύο ΟΗ υποκαταστάτες σε όρθο- θέση. Η παραπάνω σειρά δραστικότητας δεν είναι αναμενόμενη καθώς είναι ευρέως γνωστό ότι δύο υδροξυ- υποκαταστάτες σε ορθο- θέση αυξάνουν την δραστικότητα της φαινολικής ένωσης. Αντίθετα, η π-υδροξυβενζαλδεΰδη που επίσης είναι μονοϋδροξυφαινόλη εμφανίζεται αδρανής. Η βανιλλίνη είναι λιγότερο δραστική από τη πρωτοκατεχική αλδεΰδη καθώς η φαινοξυ- ρίζα που σχηματίζεται σταθεροποιείται με λιγότερες δομές συντονισμού. Ακόμη, η βανιλλίνη έχει βρεθεί ότι είναι λιγότερο δραστική από το βανιλλικό οξύ με τη δοκιμή δέσμευσης της DPPH και τη δοκιμή αποχρωματισμού β- καροτενίου/λινελαϊκού οξέος (Brand-Williams, 1995; Aruoma et al., 2003; Shyamala 5

et al., 2007). Αντίθετα, η ίδια ένωση εμφανίστηκε πιο δραστική από το οξύ με την δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης (Ορδούδη, 2007). H πρωτοκατεχική αλδεΰδη (3,4-διυδροξυβενζαλδεΰδη) βρέθηκε περισσότερο δραστική από το πρωτοκατεχικό οξύ με τη δοκιμή δέσμευσης της DPPH, τη δοκιμή οξείδωσης μεθυλεστέρων του λινελαϊκού οξέος, τη δοκιμή δέσμευσης της ABTS + και με τη δοκιμή δέσμευσης του ανιόντος του σουπεροξειδίου (Davalos et al., 2004; Lee et al., 2006). Οι Davalos et al. (2004) πιστεύουν πως αυτό οφείλεται στην συνεργιστική δράση των ιδιοτήτων της χαρακτηριστικής ομάδας όπως η ευκολία οξείδωσης και πόλωση του δεσμού C=O. Οι Bortolomeazzi et al. (2007) ανέφεραν ότι η συριγκική αλδεΰδη (3,5- διμεθοξυ-4-υδροξυβενζαλδεΰδη) είναι πιο δραστική από τη βανιλλίνη με τη δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης και τη δοκιμή δέσμευσης της DPPH. Οι ερευνητές υποθέτουν ότι η συμπεριφορά αυτή σχετίζεται με τη παρουσία της δεύτερης μεθοξυομάδας, η οποία σταθεροποιεί καλύτερα τη φαινοξυ-ρίζα. Η Ορδούδη (2007) παρατήρησε την εξής σειρά μειούμενης δραστικότητας μεταξύ των παραγώγων γουαϊακόλης που φέρουν προπενοϊκή αλυσίδα όπως εκτιμήθηκε με τη βοήθεια της CBA: κωνιφερυλική αλδεΰδη = φερουλικός αιθυλεστέρας > φερουλικό οξύ = κωνιφερυλική αλκοόλη ισοευγενόλη. Η ισχυρότερη δράση της αλδεΰδης και του εστέρα μπορεί να σχετίζεται με τον ηλεκτρονιόφιλο χαρακτήρα των χαρακτηριστικών ομάδων σε σχέση με εκείνη του οξέος και της αλκοόλης. Δεδομένου ότι η αντιοξειδωτική δράση των φαινολικών ενώσεων σχετίζεται κυρίως με την ικανότητά τους να δεσμεύουν τις ελεύθερες ρίζες, οι δοκιμές που επιλέχτηκαν να παρουσιαστούν στη συνέχεια ικανοποιούν αυτό το κριτήριο. Στην παρούσα εργασία δίνεται ιδιαίτερη έμφαση στη δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης καθώς φαίνεται να αποτελεί μια υποσχόμενη τεχνική διερεύνησης σχέσεων δομής-δραστικότητας συγγενών δομικά ενώσεων. Επιπλέον, γίνεται αναφορά στις τεχνικές των οποίων οι αρχές χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη νέας μεθοδολογίας για on-line διαχωρισμό και εκτίμηση αντιοξειδωτικής δράσης φαινολικών ενώσεων. 6

1.2 In Vitro Μέθοδοι Εκτίμησης Αντιοξειδωτικής Δράσης 1.2.1 Γενικά Η εκτίμηση της αντιοξειδωτικής δράσης απαιτεί αξιόπιστα αναλυτικά εργαλεία. Πολλές in vitro μέθοδοι χρησιμοποιούνται ευρέως για την αξιολόγηση της δράσης τόσο των μεμονωμένων αντιοξειδωτικών όσο και μιγμάτων τους. Τα τελευταία χρόνια αμφισβητήθηκε η αξιοπιστία τους καθώς οι πειραματικές συνθήκες εφαρμογής τους απέχουν από τις πραγματικές (τρόφιμα ή βιολογικά συστήματα). Στη συνέχεια παρουσιάζονται οι αρχές και τα βασικά χαρακτηριστικά των δοκιμών που αξιοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. 1.2.2 Δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης (Crocin Bleaching Assay, CBA) Η δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης αναπτύχθηκε από τους Bors et al. το 1984 και μέχρι σήμερα παρουσιάστηκαν διάφορες τροποποιήσεις του αρχικού πρωτοκόλλου από άλλους ερευνητές. Στη δοκιμή CBA χρησιμοποιείται η «κροκίνη» που είναι ένα μίγμα εστέρων της κροκετίνης (8,8 -διαποκαροτενο-8,8 -διοϊκό οξύ) με σάκχαρα και/ή μεθανόλη. Το κύριο συστατικό του μίγματος είναι η α-κροκίνη, διγεντιοβιοζυλ- εστέρας της κροκετίνης (8,8 -διαποκαροτενο-8,8 -διοϊκό οξύ) [crocetin-di(β-d-gentiobiosyl) ester] (Ordoudi and Tsimidou, 2006a). Νερό, μεθανόλη ή υδατομεθανολικά μίγματα σε διάφορες αναλογίες χρησιμοποιούνται συνήθως για την εκχύλιση των υδατοδιαλυτών αυτών καροτενοειδών από τα αποξηραμένα κόκκινα στίγματα του φυτού Crocus sativus L. Πιθανές παρεμποδίσεις απομακρύνονται από το άρτυμα με διαδοχικές πλύσεις με διαιθυλαιθέρα (Ορδούδη, 2007). Η κροκίνη αποχρωματίζεται κατά την αντίδρασή της με ελεύθερες αλκοξυ- ή υπεροξυ- ρίζες που παράγονται εκλεκτικά με φωτόλυση υδροϋπεροξειδίων ή με θερμική αποικοδόμηση αζω-εκκινητών (Bors et al., 1984; Tubaro et al., 1996). Με την προσθήκη ισχυρού αντιοξειδωτικού στο μίγμα της αντίδρασης λαμβάνουν χώρα αντιδράσεις ανταγωνιστικής φύσης ως προς τη δέσμευση ελευθέρων ριζών με συνέπεια τη μείωση της ταχύτητας αποχρωματισμού της κροκίνης. Η μελέτη της 7

κινητικής της αντίδρασης πραγματοποιείται με την καταγραφή της μεταβολής της απορρόφησης στα 440 nm (Τubaro et al., 1996). Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα κατά την δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης θεωρείται ότι είναι οι εξής (Ordoudi and Tsimidou, 2006a): 1 ο στάδιο: σχηματισμός υπεροξυ-ριζών: Θέρμανση RN=NR 2R + N 2 R + O 2 ROO * όπου RN=NR: αζω-εκκινητής (π.χ. AAPH), R : αλκυλο-ρίζα, ROO : υπεροξυ-ρίζα 2 ο Στάδιο: Ανταγωνιστικές αντιδράσεις ανάμεσα στη κροκίνη και το αντιοξειδωτικό για την δέσμευση των ελευθέρων ριζών ROO + crocin ROOH + crocin ROO + AH ROOH + A * όπου AH: φαινολική ένωση, crocin: κροκίνη, A : φαινοξυ- ρίζα Σύμφωνα με τους Bors et al. (1984) ο αποχρωματισμός της κροκίνης οφείλεται στην απόσπαση ατόμου υδρογόνου από το πολυενικό τμήμα του καροτενοειδούς. Η οξείδωση της κροκίνης μπορεί ακόμη να αποδοθεί σε προσθήκη της ρίζας στη πολυενική δομή ή/και σε αντιδράσεις μεταφοράς ηλεκτρονίου. Η φαινοξυ- ρίζα μπορεί να οξειδωθεί περαιτέρω με αντίδρασή της με δεύτερη υπεροξυρίζα προς σχηματισμό σταθερής ο- ή π-κινόνης ή μπορεί να αναχθεί προς την αρχική ένωση κατά την αλληλεπίδραση με άλλη ημικινοειδή ρίζα (Ορδούδη, 2007). Ως βασικός μηχανισμός δέσμευσης ελευθέρων ριζών στη CBA θεωρήθηκε ο μηχανισμός μεταφοράς ατόμου υδρογόνου (Hydrogen Atom Transfer, HAT). Οι ογκώδεις γεντιοβιοζυλομάδες θεωρήθηκε ότι παρεμποδίζουν τον αποχρωματισμό της κροκίνης λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης στην προσέγγιση των ριζών (Bors et al., 1984). Παρεμπόδιση προκαλούν ακόμη οι χρωστικές που απορροφούν στην ίδια 8

περιοχή του φάσματος με την κροκίνη (π.χ. καροτενοειδή) καθώς και ενώσεις που φέρουν σουλφυδρυλικές ομάδες ( SH) (Bors et al., 1984). Στην περίπτωση που χρησιμοποιείται η υδατοδιαλυτή κατιονική αζω-ένωση AAPH [δις-υδροχλωρικό άλας του 2,2 -αζω-δις-(2-μεθυλoδιαμινο-προπανίου)] για την παραγωγή υπεροξυ-ριζών, τα δομικά της χαρακτηριστικά επηρεάζονται σημαντικά από την τιμή ph του υδατικού ρυθμιστικού διαλύματος και τη θερμοκρασία. Με την αύξηση του ph, σε τιμές πάνω από 5,5 έχουμε αύξηση της παραγωγής υπεροξυ-ριζών. Αντίθετα, η αποικοδόμηση του AAPH ακολουθεί την αντίστροφη πορεία: με μείωση της τιμής του ph περισσότερες -C(NH 2 )=ΝΗ + 2 ομάδες του AAPH μετατρέπονται σε CONH 2 ομάδες (Hanlon and Seybert, 1997). Από την άλλη πλευρά, με αύξηση της τιμής του ph, παρατηρείται μείωση του δυναμικού αναγωγής μερικών ενώσεων (π.χ. ασκορβικό οξύ). Για το λόγο αυτό οι Tubaro et al. (1998) πρότειναν την εφαρμογή της δοκιμής σε ουδέτερη τιμή ph. Η μέθοδος απαιτεί απλό εργαστηριακό εξοπλισμό και οργανολογία, είναι γρήγορη, ευαίσθητη και δεν απαιτεί εξειδίκευση του αναλυτή. Η δοκιμή δεν απαιτεί τη χρήση τοξικών οργανικών διαλυτών. Η εφαρμογή της για την εκτίμηση της δραστικότητας λιπόφιλων αντιοξειδωτικών γίνεται δυνατή είτε με τη χρήση λιπόφιλου αζω- εκκινητή (π.χ. AMVN) (Tubaro et al., 1998, Lussignoli et al., 1999) ή/με αντικατάσταση της κροκίνης με πιο υδρόφοβο καροτενοειδές (π.χ.κανθαξανθίνη) σε διαλύτη εξάνιο (Bors et al., 1984). Το γεγονός ότι η κροκίνη δεν είναι διαθέσιμη εμπορικά (Knasmüller et al., 2008; Prior et al., 2005) και πρέπει να απομονωθεί από την πρώτη ύλη (σαφράνι) δεν φαίνεται να μειώνει την αναπαραγωγιμότητα των αποτελεσμάτων μεταξύ των εργαστηρίων όπως προκύπτει από τα αποτελέσματα των Chatterjee et al. (2005) και Ordoudi and Tsimidou (2006a). Πράγματι, χρησιμοποιήθηκε ινδικός κρόκος εμπορίου ( 1US$/g ) από τους Chatterjee et al. (2005) με συγκρίσιμα αποτελέσματα με αυτά του κρόκου από την Sigma ( 37,7US$/g). Οι Ordoudi and Tsimidou (2006a) διαπίστωσαν ότι κάτω από ορισμένες προϋποθέσεις κατά την προετοιμασία των διαλυμάτων του κρόκου (απομάκρυνση παρεμποδίσεων, ρύθμιση της συγκέντρωσης των κροκινών στο διάλυμα εργασίας), κάθε αυθεντικό δείγμα κρόκου εμπορίου θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στη δοκιμή. Οι Singh and Singh (2008) αναφέρουν ότι το κύριο μειονέκτημα της μεθόδου σχετίζεται με την αρχή της μεθόδου, δηλ. ότι μετράται η ικανότητα του αντιοξειδωτικού να ανταγωνίζεται την κροκίνη για τη δέσμευση υπεροξυ- ρίζων ενώ 9

στις αδυναμίες της μεθόδου συγκαταλέγεται η μη ύπαρξη κοινού τρόπου έκφρασης των αποτελεσμάτων στις διάφορες μελέτες (Prior et al., 2005; Knasmüller et al., 2008) και η δυσκολία εξαγωγής συμπερασμάτων για τη στοιχειομετρία των αντιδράσεων. Τέλος, αναφέρεται ότι η χρήση συνθετικού άζω-εκκινητή AAPH και οι in vitro συνθήκες της CBA δεν μπορούν να περιγράψουν τα πραγματικά φαινόμενα που συμβαίνουν στα τρόφιμα και τα βιολογικά συστήματα (Ορδούδη, 2007). Η δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης έχει εφαρμοστεί για την εκτίμηση της αντιοξειδωτικής δράσης κόκκινων και λευκών κρασιών (Tubaro et al., 1998; Di Majo et al., 2008), εκχυλισμάτων από γίγαρτα (Hatzidimitriou et al., 2007), πλάσματος και ορού αίματος (Tubaro et al., 1998; Chatterjee et al., 2005), φαινολικών ενώσεων (κινναμωμικά οξέα, φλαβονοειδή) (Bors et al., 1984; Natella et al., 1999; Di Majo et al., 2005; Perjesi et al., 2007), φυτικών εκχυλισμάτων (δενδρολίβανου, T. Arjuna) (Chatterjee et al., 2005; Bortolomeazzi et al., 2007), ροφημάτων (καφές, τσάι) (Ορδούδη, 2007), φαινολικών συστατικών καπνού (Bortolomeazzi et al., 2007; Soldera et al., 2008), ενώσεων με φαρμακευτικές ιδιότητες (φυτοοιστρογόνα) (Ορδούδη, 2007), παστεριωμένου γάλακτος με χαμηλά λιπαρά, ψωμιού (Manzocco et al., 2002) και παρθένου ελαιόλαδου (Bortolomeazzi et al., 2007). Τέλος, η δοκιμή αποχρωματισμού της κροκίνης φαίνεται ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί όχι μόνο για τη εκτίμηση της αντιοξειδωτικής δράσης των πρότυπων ενώσεων και μιγμάτων αλλά επιπλέον και για μελέτες σχέσεων-δομής δραστικότητας συγγενών δομικά ενώσεων και το οποίο φαίνεται να αποτελεί το ισχυρότερο πλεονέκτημα της μεθόδου σε σχέση με άλλες δοκιμές. 1.2.3 Δοκιμή δέσμευσης της DPPH Από τις πλέον διαδεδομένες μεθόδους εκτίμησης της αντιοξειδωτικής δράσης είναι η δοκιμή δέσμευσης της DPPH, δηλαδή της ιώδους ρίζας του 1,1-διφαινυλο-2- πικρυλυδραζυλίου (DPPH ). Η ρίζα αυτή δε διμερίζεται και ενώ δέχεται πολύ εύκολα μονήρη ηλεκτρόνια ή άτομα υδρογόνου, οξειδώνεται πολύ δύσκολα (Braude et al., 1954; Russel 1954; Blois, 1958). Κατά την αντίδραση με δότες ατόμων υδρογόνου, η ρίζα αποχρωματίζεται αναγόμενη προς DPPH-H (κίτρινο χρώμα) που απορροφά σε μικρότερο μήκος κύματος (340 nm) (Ορδούδη, 2007; Moon and Shibamoto, 2009). Η 10

χρονική διάρκεια της δοκιμής ποικίλει από 10 λεπτά μέχρι 6 ώρες (Frankel and Meyer, 2000). Η συγκέντρωση της ρίζας σε οργανικούς διαλύτες μπορεί να προσδιοριστεί με τη μέτρηση της μείωσης της απορρόφησης στα 517 nm (Moon and Shibamoto, 2009). Τα αποτελέσματα εκφράζονται συνήθως σε τιμές αποτελεσματικής συγκέντρωσης EC 50 (μείωση της αρχικής συγκέντρωσης DPPH κατά 50%) και χρόνους Τ EC50 (χρόνος που χρειάζεται για την επίτευξη της σταθερής κατάστασης όταν η συγκέντρωση του αντιοξειδωτικού είναι ίση με τη EC 50 ) (Prior et al., 2005). Η μέθοδος είναι εύκολη, ακριβής, ευαίσθητη και οικονομική καθώς η ρίζα είναι σταθερή και δεν χρειάζεται να παραχθεί όπως σε άλλες δοκιμές (Singh and Singh, 2008). Οι περιορισμοί της μεθόδου απορρέουν από το γεγονός ότι η ρίζα είναι αδιάλυτη στο νερό (Arnao et al., 1999), δεν έχει ομοιότητα με τις υπεροξυ- ρίζες που σχετίζονται με την οξείδωση των ακόρεστων λιπιδίων (Huang et al., 2005). Η αντίδραση με τη DPPH εκτιμάται ότι πραγματοποιείται μέσω μηχανισμού μεταφοράς ηλεκτρονίων (Single Electron Transfer, SET) και λιγότερο μέσω του μηχανισμού ΗΑΤ (Magalhães et al., 2008). Παρεμπόδιση προκαλούν επίσης ενώσεις που απορροφούν στο μέγιστο απορρόφησης της DPPH (π.χ. καροτενοειδή) (Prior et al., 2005), η παρουσία άλλων ριζών (αλκυλο-) που αντιδρούν με τη DPPH (Singh and Singh, 2008). Ακόμη και τα οξέα ή βάσεις που υπάρχουν στο διαλύτη μπορούν να μεταβάλλουν την ταχύτητα των αντιδράσεων καθώς επηρεάζουν τον βαθμό ιονισμού των φαινολών (MacDonald- Wicks et al., 2006). Η δομή του μορίου του αντιοξειδωτικού παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην κινητική των αντιδράσεων καθώς η προσέγγιση της ρίζας παρεμποδίζεται στερεοχημικά από ενώσεις με ογκώδεις υποκαταστάτες (Magalhães et al., 2008). Ένα ακόμη μειονέκτημα είναι το γεγονός ότι αλλάζοντας την αναλογία αντιοξειδωτικού προς τη ρίζα, μεταβάλλεται ο χρόνος που χρειάζεται για την επίτευξη της σταθερής κατάστασης (Frankel and Meyer, 2000). Επιπροσθέτως, το οξυγόνο μπορεί να αντιδράσει με τη ρίζα παρουσία φωτός και να μειώσει την απορρόφησή του. Η απορρόφηση επιπλέον μειώνεται στα διαλύματα μεθανόλης και ακετόνης (Singh and Singh, 2008). Τα δείγματα που περιέχουν πρωτεΐνες (π.χ. πλάσμα) δεν μπορούν να εξεταστούν με την μέθοδο αυτή λόγω κατακρήμνισης των τελευταίων σε αλκοολικό περιβάλλον (Sanchez-Moreno, 2002). 11

Η μέθοδος έχει βρει ίσως τις περισσότερες από κάθε άλλη μέθοδο εφαρμογές όπως η σύγκριση των ομόλογων σειρών αντιοξειδωτικών (Becker et al., 2004), η εκτίμηση της αντιοξειδωτικής δράσης φαινολικών ενώσεων (Scherer and Godoy, 2009; Frankel and Meyer, 2000), κρασιών (Frankel and Meyer, 2000), συστατικών καπνού (Bortolomeazzi et al., 2007), μεθανολικών διαλυμάτων μελιού (Saxena et al., 2010), εκχυλίσματος και αιθέριου ελαίου του φυτού Salvia pisidica (Ozkan et al., 2010), φυτικών εκχυλισμάτων τσαγιού (Aspalathus linearis, Cyclopia species, Camellia sinensis) (Joubert et al., 2008), εκχυλισμάτων εδώδιμων και φαρμακευτικών φυτών (Marwah et al., 2007), αντιοξειδωτικών στα φρούτα, λαχανικά, δημητριακά, φύκια και μανιτάρια (Moon and Shibamoto, 2009). 1.2.4 Δοκιμή δέσμευσης της ABTS + Στη δοκιμή δέσμευσης της ABTS + χρησιμοποιείται η κατιονική ρίζα του διςαμμωνιακού άλατος του 2,2 -αζινο-δις-(3-αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικού οξέος) (ABTS + ) η οποία έχει μπλε-πράσινο χρώμα (Tyrakowska et al., 1999) και παράγεται συνήθως με οξείδωση της περίσσειας του ABTS (άχρωμο) από το υπερθειϊκό κάλιο (Roginsky and Lissi., 2005, Frankel and Meyer, 2000). H αντίδραση του αντιοξειδωτικού με τη ρίζα ολοκληρώνεται σε εξαιρετικά σύντομο χρονικό διάστημα (6 min) και η μεταβολή της απορρόφησης του διαλύματος της ρίζας καταγράφεται στα 734 nm (Νενάδης, 2004). Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε τιμές TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), δηλαδή, τη συγκέντρωση σε mm του Trolox που είναι το υδατοδιαλυτό ανάλογο της βιταμίνης Ε (Becker et al., 2004; Roginsky and Lissi., 2005). Το μειονεκτήματα της μεθόδου είναι το γεγονός ότι η σταθεροποίηση του μητρικού διαλύματος της ρίζας απαιτεί περίπου 16 ώρες. Ακόμη, η ρίζα είναι ασταθής και σχεδόν δυσδιάλυτη σε οργανικούς διαλύτες με εξαίρεση την αιθανόλη. Ακόμη, η ABTS + είναι ασταθής σε θερμοκρασίες άνω των 35 C, όπως και σε τιμές ph μεγαλύτερες από 7,5 (Νενάδης, 2004). Ένας επιπλέον περιορισμός είναι το γεγονός ότι μπορεί να προκύψουν εσφαλμένα αποτελέσματα λόγω του ότι η δέσμευση της ABTS + μπορεί να επηρεάζεται από άλλους παράγοντες (π.χ. αποσύνθεση της ρίζας) (Frankel and Meyer, 2000; Arts et al., 2003). Επιπροσθέτως η 12

ρίζα έχει χαμηλή εκλεκτικότητα ως προς ενώσεις δότες ατόμων υδρογόνου καθώς αντιδρά και με ΟΗ ομάδες που δεν συμβάλλουν στην αντιοξειδωτική δράση (Roginsky and Lissi, 2005). Κάθε ένωση με χαμηλότερο δυναμικό οξείδωσης από την ABTS +, μπορεί να ανάγει τη ρίζα (Magalhães et al., 2008). Ακόμη, ο χρόνος των 6 min μπορεί να μην είναι αρκετός για την ολοκλήρωση των αντιδράσεων και οι τιμές TEAC που θα προκύψουν να είναι μικρότερες από τις πραγματικές (Prior et al., 2005). Επίσης, η ρίζα ABTS + όπως και η ρίζα DPPH είναι συνθετική και δεν υπάρχει σε κανένα βιολογικό σύστημα (Becker et al., 2004). Από την άλλη, η μέθοδος είναι απλή, γρήγορη, μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μεγάλο εύρος τιμών ph και υπάρχει δυνατότητα αυτοματοποίησης (Prior et al., 2005). Η δοκιμή έχει βρει εφαρμογή στην εκτίμηση της δραστικότητας τόσο υδρόφιλων όσο και λιπόφιλων ενώσεων καθώς η ρίζα είναι διαλυτή τόσο σε νερό όσο και όξινο διάλυμα αιθανόλης (Singh and Singh, 2008). Η δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της αντιοξειδωτικής δράσης των εκχυλισμάτων φύλλων ελιάς (Benavente-Garcia et al., 1999), βιολογικών υγρών, φρούτων, λαχανικών, βοτάνων, δημητριακών, μελιού, ελαιόλαδου, κρασιών (Fernandez-Pachon et al., 2008), αιθέριων ελαίων, ξυδιού, φαρμακευτικών φυτών, ροφημάτων (Moon and Shibamoto, 2009), αλλά και σε μελέτες SAR (Νενάδης, 2004; Singh and Singh, 2008). 1.2.5 On-line μέθοδοι διαχωρισμού και εκτίμησης αντιοξειδωτικής δράσης 1.2.5.1 Γενικά Τα τελευταία χρόνια γίνεται μια προσπάθεια σύζευξης των διαχωριστικών τεχνικών με μεθόδους εκτίμησης αντιοξειδωτικής δράσης. Το κύριο πλεονέκτημα των μεθόδων αυτών είναι η δυνατότητα ταυτοποίησης των συστατικών ενός μίγματος με ταυτόχρονη εκτίμηση της δράσης. Αυτό βοηθά στην εξοικονόμηση χρόνου, κόπου και χρημάτων στα ερευνητικά εργαστήρια. Η σύζευξη αύτη όμως δεν είναι εύκολη υπόθεση, καθώς πολλές παράμετροι όπως ο τύπος της ρίζας, οι ιδιότητες των συστατικών ενός μίγματος, η θερμοκρασία του συστήματος, το ph των διαλυμάτων, τα χαρακτηριστικά του σπειράματος αντίδρασης κτλ. παίζουν σημαντικό ρόλο στην 13

επιτυχία ή μη μιας τέτοιας προσπάθειας και είναι πολλές φορές δύσκολο να ελεχθούν και να συνδιαστούν μεταξύ τους ικανοποιητικά. 1.2.5.2 On-line HPLC-DPPH Οι Koleva et al. δημοσίευσαν το 2000 την on-line δοκιμή HPLC-DPPH. Στα επόμενα χρόνια η έρευνα εστιάστηκε στη βελτίωση της ευαισθησίας της μεθόδου και σε μια προσπάθεια σύζευξης επιπλέον τεχικών όπως MS, NMR κτλ. στο on-line σύστημα (Polasek et al., 2004; Nuengchamnong et al., 2005; Pukalskas et al., 2005). Διαλύτες (MeOH/ ACN/ H 2O) Βαλβίδα εισαγωγής δείγματος Στήλη UV ανιχνευτής Καταγραφικό σύστημα Καταγραφικό σύστημα DAD Σπείραμα αντίδρασης DPPH Σχήμα 1.2 Διάγραμμα ροής της διάταξης του on-line HPLC-DPPH συστήματος. Στη δοκιμή αυτή, οι εξεταζόμενες ενώσεις αφού διαχωριστούν στον υγρό χρωματογράφο, κατευθύνονται στο σπείραμα αντίδρασης όπου αντιδρούν με τη DPPH. Η ανηγμένη μορφή της ρίζας (DPPH-Η) ανιχνεύεται ως αρνητική κορυφή από την απορρόφηση στα 517 nm. Η συγκέντρωση του μητρικού διαλύματος DPPH, ο χρόνος αντίδρασης μεταξύ αντιοξειδωτικού και DPPH και τέλος η σύσταση και το ph της κινητής φάσης επηρεάζουν την ταχύτητα αντίδρασης του αντιοξειδωτικού με τη DPPH και συνεπώς και την τιμή της απορρόφησης στα 517 nm. Επίσης, παρατηρείται θολερότητα κατά την ανάμιξη του ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού οξέος και φωσφορικών αλάτων (ph 6,6) με το διάλυμα της ρίζας ενώ τα πολύ όξινα συστήματα (pη 2-3) προκαλούν δραστική μείωση στην απορρόφηση της DPPH αν ο χρόνος αντίδρασης είναι μεγαλύτερος από 0,6 min (Kosar et al., 2004b). Η DPPH. είναι σταθερή σε ph μεταξύ 5-6,5 (Koleva et al, 2000). Για αυτό το λόγο, οι Dapkevicius et al. (2001) προτείνουν την εξουδετέρωση του διαλύματος έκλουσης μετά τον υγροχρωματογραφικό διαχωρισμό των συστατικών του δείγματος. Επίσης, τονίζουν ότι η εσφαλμένη εκτίμηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας λόγω σύντομου 14

χρόνου παραμονής στο σπείραμα αντίδρασης των αντιοξειδωτικών μπορεί να δώσει μη αντιπροσωπευτικές τιμές ορίων ανίχνευσης (Dapkevicius et al., 2001). Επιπροσθέτως, οι Bartasiute et al. (2007) παρατήρησαν ότι η κινητική της αντίδρασης μεταξύ της ρίζας και του αντιοξειδωτικού διαφοροποιείται ανάλογα με το περιβάλλον της δοκιμής. Σε διαλύτη καθαρή μεθανόλη, η αντίδραση παρουσιάζει αργή κινητική (200-250 s) και οδεύει βραδέως προς την ολοκλήρωση, ενώ σε διαλύτη μεθανόλη-νερό (60-40, v/v) με τιμή ph 7,4 αποκαθίσταται ταχύτατα (2 s) θερμοδυναμική ισορροπία. Η δοκιμή βρήκε εφαρμογή στην ανάλυση ποικίλων φυτικών εκχυλισμάτων και φαινολικών ενώσεων (Perez-Bonilla et al., 2006; Koleva et al., 2000; Dapkevicius et al., 2001; Kosar et al., 2003; Kosar et al., 2004α; Miliauskas et al., 2004; Nuengchamnong et al., 2005; Pukalskas et al., 2005; Bartasiute et al., 2007). 1.2.5.3 On-line HPLC-ABTS + Το 2001 οι Koleva et al. δημοσίευσαν μια on-line δοκιμή βασισμένη αυτή τη φορά στη ρίζα ABTS + (Koleva et al., 2000, Koleva et al., 2001). Στη δοκιμή αυτή, τα συστατικά του μίγματος αφού διαχωριστούν στον υγρό χρωματογράφο, κατευθύνονται στο σπείραμα αντίδρασης όπου αντιδρούν με τη ABTS +. Η ποσότητα της ρίζας που δεσμεύεται από την εξεταζόμενη ένωση υπολογίζεται με την μείωση της απορρόφησης της ABTS + στα 734 nm (Koleva et al., 2000). Διαλύτες (MeOH/ ACN/ H 2O) Βαλβίδα εισαγωγής δείγματος Στήλη UV ή DAD ανιχνευτής Καταγραφικό σύστημα Καταγραφικό σύστημα UV-Vis ανιχνευτής Σπείραμα αντίδρασης ABTS + Σχήμα 1.3 Διάγραμμα ροής της διάταξης του on-line HPLC-ABTS + συστήματος. Η παρασκευή της ABTS + γίνεται με την οξείδωση του ABTS παρουσία υπερθειικού καλίου (K 2 S 2 O 8 ) κάθε δύο ημέρες. Τα διαλύματα εργασίας παρασκευάζονται καθημερινά σε διάλυμα PBS (Phosphate Buffered Saline):ΜeOH 90:10, v/v (ph 7,4). 15

Ο διαλύτης που χρησιμοποιείται, ο χρόνος αντίδρασης και το πρωτόκολλο της δοκιμής που ακολουθείται είναι σημαντικά για την τιμή TEAC που θα ληφθεί. Για παράδειγμα, το β-καροτένιο είναι πολύ δραστικό σε τετραϋδροφουράνιο (Tetrahydrofuran, ΤHF), δύο φορές λιγότερο δραστικό σε αιθανόλη και καθόλου δραστικό σε ακετόνη (Koleva et al., 2001, Niederlander et al., 2008) ενώ ένας χρόνος αντίδρασης τουλάχιστον 1 min είναι απαραίτητος για την ολοκλήρωση των αντιδράσεων όλων των αντιοξειδωτικών (Cano et al., 2002). Επιπλέον, η παρουσία του ABTS που δεν αντέδρασε στο διάλυμα εργασίας είναι σημαντική για την σταθερή παραγωγή της ρίζας ABTS + καθώς αυτό εμποδίζει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του πρωταρχικού οξειδωτικού (K 2 S 2 O 8 ) και των συστατικών του δείγματος. Επίσης αποτρέπει την υπερεκτίμηση δράσης ενώσεων ως αποτέλεσμα ανασταλτικής επίδρασης στον σχηματισμό της ρίζας από ορισμένες ενώσεις. Η σύγκριση της μεθόδου με μεθόδους on-line χημειοφωταύγεια και on-line DPPH, έδειξε ότι η on-line HPLC-ABTS + παρέχει την καλύτερη συνολικά ευαισθησία (χαμηλότερα όρια ανίχνευσης). Η βαθμωτή και η ισοκρατική έκλουση με κινητή φάση μέχρι 100% σύσταση σε οργανικό διαλύτη (μεθανόλη ή ακετονιτρίλιο) και τιμή ph μέχρι 3 μπορεί να συνδυαστεί με τη δοκιμή. Ισχυρά οξέα όπως το τριφθοροoξικό οξύ (TFA) πρέπει να αποφεύγονται (Koleva et al., 2001). Η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τη εξέταση της αντιοξειδωτικής δράσης των εκχυλισμάτων σιδερίτη και δενδρολίβανου (Koleva et al., 2001), υδρόφιλων και λιπόφιλων αντιοξειδωτικών (Koleva et al., 2001; Cano et al., 2002), φαινολικών ενώσεων (Koleva et al., 2001; Exarchou et al., 2006), αντιοξειδωτικών στα σμέουρα (Beekwilder et al., 2005), εκχυλίσματων καφέ (Stalmach et al., 2006), ξύλου ελιάς (Perez-Bonilla et al., 2006) και τσαγιού (Stewart et al., 2005). 1.2.5.4 On-line δοκιμές δέσμευσης οξυγόνου απλής διεγερμένης κατάστασης, ανιόντος σουπεροξειδίου και/ή υπεροξειδίου του υδρογόνου (Singlet oxygen on-line assay, Superoxide anion and/or Ηydrogen peroxide on-line assays) Πέντε on-line δοκιμές με ενεργά είδη οξυγόνου όπως υπεροξείδιο του υδρογόνου και/ή ανιόν σουπεροξειδίου έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία μέχρι το 2007. Οι τέσσερεις on-line δοκιμές βασίζονται στην χημειοφωταύγεια λουμινόλης με 16

εκκινητές τα ενεργά αυτά είδη οξυγόνου και η μια δοκιμή βασίζεται στον φθορισμό για την ανίχνευση του σήματος (Niederländer et al., 2008). Ακόμη, η τεχνική έγχυσης δείγματος σε συνεχή ροή (Flow Injection Analysis, FIA) συνδυάστηκε με τον φωτοχημικό αντιδραστήρα παραγωγής οξυγόνου απλής διεγερμένης κατάστασης ως ενεργό είδος οξυγόνου για αξιολόγηση αντιοξειδωτικής δράσης από τους Niederländer et al. το 1994. Δεν έγινε καμία προσπάθεια σύζευξης του αντιδραστήρα με υγρό χρωματογράφο. Η κάθε δοκιμή έχει τις ιδιαιτερότητες της και ακολουθεί του δικούς της ξεχωριστούς μηχανισμούς εκκίνησης. Σε σχέση με τις on-line δοκιμές HPLC-DPPH και HPLC-ABTS + είναι πολύπλοκες, χρονοβόρες και με υψηλότερο κόστος αλλά γενικά εκτιμάται ότι αντανακλούν με μεγαλύτερη ακρίβεια τις οξειδώσεις που συμβαίνουν στα in vivo συστήματα (Niederländer et al., 2008). 1.2.6 Άλλες μέθοδοι 1.2.6.1 Δοκιμή Rancimat Μέθοδος επιταχυνόμενης οξείδωσης λιπαρού υποστρώματος Η δοκιμή Rancimat στηρίζεται στη μέτρηση της μεταβολής στην ηλεκτρική αγωγιμότητα λόγω του σχηματισμού πτητικών ενώσεων χαμηλού μοριακού βάρους που σχηματίζονται κατά τη θερμική οξείδωση ελαίου ή λίπους κάτω από σταθερή διοχέτευση ρεύματος αέρα (Warner and Eskin, 1995).Οι υψηλές θερμοκρασίες (100-120 C) προκαλούν μείωση του χρόνου σταθερότητας του εξεταζόμενου εξευγενισμένου ελαίου (Pokorny et al., 2001). Το τελικό σημείο ή η περίοδος επαγωγής εκφράζει τον δείκτη σταθερότητας του ελαίου (OSI) σε μια συγκεκριμένη θερμοκρασία. Η μέθοδος έχει πολύ καλή αναπαραγωγιμότητα και μπορεί να μας δώσει πληροφορίες για την αποτελεσματικότητα διαδικασιών εξευγενισμού, ύπαρξης προσμίξεων και εκτίμησης της μεταβολής της ποιότητας των ελαίων με την προσθήκη των αντιοξειδωτικών. Μπορεί επιπλέον να χρησιμοποιηθεί για την επιλογή κατάλληλων μιγμάτων ελαίων για συγκεκριμένους σκοπούς (Warner and Eskin, 1995). Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι το γεγονός ότι δεν μπορούν να εξεταστούν άμεσα τρόφιμα που περιέχουν λίπος και πρέπει να προηγηθεί ένα στάδιο απομόνωσης 17

του λίπους. Επιπλέον, η οξείδωση των ελαίων σε υψηλές θερμοκρασίες (100-120 C) επηρεάζει τον μηχανισμό της αυτοξείδωσης, καθώς και τη σταθερότητα, τη δραστικότητα και τη πτητικότητα των αντιοξειδωτικών και των προϊόντων οξείδωσης (Warner and Eskin, 1995; Pokorny et al., 2001). 18

2. Αντικειμενικός Σκοπός και Περιεχόμενο της Εργασίας Η μελέτη της δυνατότητας διεύρυνσης των εφαρμογών της δοκιμής αποχρωματισμού της κροκίνης (CBA) στην εξέταση δομικά συγγενών φαινολικών ενώσεων ή/και πολύπλοκων μιγμάτων αποτέλεσε τον αντικειμενικό σκοπό της παρούσας εργασίας και υλοποιήθηκε σε δύο φάσεις. Μέρος Α: Εξετάστηκε η ικανότητα δέσμευσης ελευθέρων ριζών από μια σειρά υδροξυβενζαλδεϋδών τόσο με τη βοήθεια της CBA όσο και άλλων ευρέως χρησιμοποιούμενων δοκιμών αντιοξειδωτικής δράσης (DPPH, ABTS +, Rancimat) προκειμένου να αξιολογηθεί η δυνατότητα εκτίμησης SAR. Δεδομένου ότι ελάχιστα στοιχεία υπάρχουν διαθέσιμα για την αντιοξειδωτική δράση των αλδεϋδών, γνωστών δραστικών οργανικών ενώσεων, εκτιμήθηκε ότι τα συνολικά ευρήματα θα βοηθήσουν στην αξιολόγησή τους ως φυσικά αντιοξειδωτικά. Μέρος Β: Διερευνήθηκε η δυνατότητα on-line σύζευξης της CBA με μια διαχωριστική τεχνική (HPLC) ώστε να είναι δυνατή η εξέταση πολύπλοκων μιγμάτων φυσικών προϊόντων ή/και βιολογικών υγρών. Η πειραματική διαδικασία εκτελέσθηκε στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας του Πανεπιστημίου Wageningen της Ολλανδίας που διέθετε την κατάλληλη τεχνογνωσία στο πλαίσιο της επίσκεψης μέσω του προγράμματος Δια Βίου Μάθηση LLP/Erasmus 2007-2013 της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Για τον λόγο αυτό τα αποτελέσματα της πειραματικής εργασίας παρουσιάζονται ως δύο διαφορετικές ενότητες: α) Διερεύνηση σχέσεων δομής αρωματικών αλδεϋδών-αντιοξειδωτικής δράσης και β) Ανάπτυξη on-line HPLC-CBA μεθοδολογίας για την εκτίμηση της αντιοξειδωτικής δράσης μιγμάτων αντιοξειδωτικών. 19

3 Διερεύνηση σχέσεων δομής αρωματικών αλδεϋδών-αντιοξειδωτικής δράσης 20

3.1 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.1.1 Υλικά Αποξηραμένα στίγματα του φυτού Crocus sativus L. διατέθηκαν από τον Αναγκαστικό Συνεταιρισμό Κροκοπαραγωγών Κοζάνης (Κρόκος Κοζάνης) και χρησιμοποιήθηκαν ως σκόνη έπειτα από κονιοποίηση σε κατάλληλη ηλεκτρική συσκευή και αποθήκευση σε γυάλινους περιέκτες στους 4 C. To εξευγενισμένο ελαιόλαδο ήταν ευγενική προσφορά της εταιρείας ΕΛΑΪΣ Α.Ε. (Πειραιάς). 3.1.2 Πρότυπες ενώσεις Η προμήθεια των πρότυπων ενώσεων που χρησιμοποιήθηκαν για το σκοπό της παρούσας διατριβής έγινε από διάφορες εταιρείες. Συγκεκριμένα: α) οι ενώσεις 3,4-διυδροξυκινναμωμικό οξύ ή καφεϊκό οξύ (99%), 4-υδροξυ-3- μεθοξυβενζαλδεΰδη ή βανιλλίνη, 4-υδροξυ-3-μεθοξυβενζοϊκό οξύ ή βανιλλικό οξύ, 3,4-διυδροξυβενζοϊκό οξύ ή πρωτοκατεχικό οξύ (98%), 3,5-διμεθοξυ-4- υδροξυβενζοϊκό οξύ ή συριγκικό οξύ και 4-υδροξυβενζοϊκό οξύ ήταν προϊόντα της εταιρείας Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). β) η ένωση 3,4-διυδροξυβενζαλδεΰδη ή πρωτοκατεχική αλδεΰδη (98%) αγοράστηκε από την εταιρεία Alfa Aesar (Heysam, Lancaster). γ) η ένωση 2-υδροξυβενζοϊκό οξύ ή σαλικυλικό οξύ (>99%), ήταν προϊόν της εταιρείας Fluka Chemie GmbH (Buchs, Switzerland). δ) οι ενώσεις 3,5-διμεθοξυ-4-υδροξυβενζαλδεΰδη ή συριγκική αλδεΰδη (98%), 6- υδροξυ-2,5,7,8-τετραμεθυλο-χρωμαν-2-ικό οξύ ή Trolox (97%), 4- υδροξυβενζαλδεΰδη, αγοράστηκαν από την εταιρεία Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinhem, Germany). ε) η ένωση 2-υδροξυβενζαλδεΰδη ή σαλικυλική αλδεΰδη (98%) ήταν προϊόν της εταιρίας Merck (Darmstadt, Germany). 21