ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΠΡΑΓΚΑΛΑΚΗ ΘΕΟ ΩΡΑ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΤΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Α.Π.Θ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Π. ΚΟΤΖΕΚΙ ΟΥ- ΡΟΥΚΑ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΤΩΝ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ LISTERIA MONOCYTOGENES ΚΑΙ ESCHERICHIA COLI O157:H7 ΜΕ ΤΗΝ ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΑΥΤΟΧΘΟΝΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ ΓΑΛΑΚΤΙΚΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΖΥΜΟΥΜΕΝΩΝ ΑΛΛΑΝΤΙΚΩΝ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΠΡΑΓΚΑΛΑΚΗ ΘΕΟ ΩΡΑ ΓΕΩΠΟΝΟΣ-ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Π. ΚΟΤΖΕΚΙ ΟΥ- ΡΟΥΚΑ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΤΩΝ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ LISTERIA MONOCYTOGENES ΚΑΙ ESCHERICHIA COLI O157:H7 ΜΕ ΤΗΝ ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΑΥΤΟΧΘΟΝΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ ΓΑΛΑΚΤΙΚΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΖΥΜΟΥΜΕΝΩΝ ΑΛΛΑΝΤΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΟΤΖΕΚΙ ΟΥ- ΡΟΥΚΑ Π., ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Α.Π.Θ ΜΠΛΟΥΚΑΣ Ι.Γ., ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Α.Π.Θ ΡΟΥΚΑΣ ΤΡΙΑΝΤΑΦΥΛΛΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Α.Π.Θ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010 1

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Πέντε καλλιέργειες γαλακτικών βακτηρίων, ειδικότερα τα στελέχη Lactobacillus sakei 8416, L. sakei 4413, L. sakei 8426, L. plantarum 7423 και L. curvatus 8427, χρησιµοποιήθηκαν ως καλλιέργειες εκκίνησης κατά την παρασκευή αλλαντικών αέρος. Παράλληλα παρασκευάστηκε και µια δοκιµή χωρίς την προσθήκη καλλιέργειας εκκίνησης, η οποία χρησιµοποιήθηκε ως µάρτυρας. Η ζύµωση και η ωρίµανση των αλλαντικών διήρκησαν 26 ηµέρες. Κατά τακτά χρονικά διαστήµατα µελετήθηκαν τα µικροβιολογικά χαρακτηριστικά των αλλαντικών, τα οποία συνεκτιµήθηκαν µαζί µε τα ποιοτικά χαρακτηριστικά των προϊόντων κατά την επιλογή των δύο αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης που µελετήθηκαν περαιτέρω ως προς την αντιµικροβιακή τους δράση. Η αντιµικροβιακή δράση των στελεχών L. sakei 8416 και L. sakei 4413 έναντι των παθογόνων µικροοργανισµών L. monocytogenes Scott A και E. coli O157:H7 atoxigenic διερευνήθηκε τόσο in vitro όσο και in situ. Kατά την in vitro µελέτη υγρό θρεπτικό υπόστρωµα (που περιείχε 1% πεπτόνη, εκχύλισµα κρέατος 2%, χλωριούχο νάτριο 2,8%, λακτόζη 0,1%, σακχαρόζη 0,3%, νιτρώδες νάτριο 0,02% και ασκορβικό Na 0,05% και ph 6,5) εµβολιάσθηκε µε πληθυσµό 7,25 log(cfu/g) των µικροοργανισµών L. sakei 8416 και L. sakei 4413, αντίστοιχα, καθώς και µε 5,6 log(cfu/g) L. monocytogenes Scott A ή µε 4,8 log(cfu/g) E. coli O157:H7 atoxigenic. Μετά από 48 h o πληθυσµός του παθογόνου µικροοργανισµού L. monocytogenes µειώθηκε κατά 1,61 και 1,46 log(cfu/g) αντίστοιχα, ενώ του µικροοργανισµού E. coli O157:H7 κατά 1,04 και 3,41 log(cfu/g) αντίστοιχα. Κατά τη µελέτη της αντιµικροβιακής δράσης των αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης in situ, στην κρεατόµαζα των αλλαντικών αέρος προστέθηκαν πληθυσµοί 5,49 log(cfu/g) L. sakei 8416 και 6,3 log(cfu/g) L. sakei 4413, αντίστοιχα, και ακολούθησε ο ενοφθαλµισµός της κρεατόµαζας µε 3,72 ή 3,56 log(cfu/g) L. monocytogenes Scott A (αντίστοιχα για τα δύο στελέχη των γαλακτικών βακτηρίων) είτε µε 3,82 και 3,96 log(cfu/g) E. coli O157:H7 atoxigenic (αντίστοιχα για τα δύο στελέχη των γαλακτικών βακτηρίων). Μετά από 26 ηµέρες, η µείωση του πληθυσµού του παθογόνου L. monocytogenes στα αλλαντικά αέρος που παρήχθηκαν µε την προσθήκη αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης ήταν σηµαντική σε σχέση µε το µάρτυρα (µείωση του παθογόνου µικροοργανισµού κατά 1,72 log(cfu/g) και 1,57 log(cfu/g), αντίστοιχα). Ο πληθυσµός του παθογόνου E. coli O157:H7 αν και µειώθηκε σηµαντικά στα αλλαντικά που παρήχθηκαν 2

µε την προσθήκη καλλιέργειας L. sakei 4413 (µείωση του πληθυσµού του παθογόνου κατά 1,54 και 1,96 log cfu/g αντίστοιχα) δεν εξαλήφθηκε πλήρως. Η χρήση επιλεγµένων αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης, µπορεί να συµβάλλει στη σηµαντική µείωση τυχόν επιµολύνσεων από τους παθογόνους µικροοργανισµούς L. monocytogenes και E. coli O157:H7. 3

ABSTRACT Selected autochthonous starter (SAS) cultures Lactobacillus sakei 8416, L. sakei 4413, and L. sakei 8426, L. plantarum 7423 and L. curvatus 8427 were used as starter cultures for sausage fermentation. A treatment without starter culture used as control treatment. Fermentation and rippenig time was 26 days. Microbiological characteristics were investigated and co-estimated with the product s quality characteristics. Two autocthonous starter cultures were selected and studied for their antibacterial activity. L.sakei 8416 and L.sakei 4413 antibacterial activity towards pathogen microorganisms L. monocytogenes Scott A and E. coli O157:H7 atoxigenic were investigated in vitro and in situ. For in vitro investigation a nutrient broth (containing meat extract 2%, bactotryptone 1%, NaCl 2,80%, lactose 0,10%, saccharose 0,30%, NaNO 2 0,02%, ascorbic Na 0,05% with ph value 6,5) were inoculated with 7,25 log(cfu/ml) L.sakei 8416 or L.sakei 4413, and with 5,6 log(cfu/ml) L.monocytogenes Scott A or 4,8 log(cfu/ml) E. coli O157:H7 atoxigenic. 48 hours processing time resulted in 1,61 and 1,46 decimal reduction of L.monocytogenes population, and 1,04 or 3,41 decimal reduction of E. coli O157:H7 population. To study antibacterial activity in situ, sausage batter was inoculated with 5.49 log (cfu/g) L.sakei 8416 or 6,3 log(cfu/g) L.sakei 4413 and of either 3.56-3.72 log(cfu/g) Listeria monocytogenes Scott A (respectively for the two strains) or 3.82-3.96 log(cfu/g) of Escherichia coli O157:H7 atoxigenic (respectively for the two strains). By the end of ripening period, the inhibition of L. monocytogenes was significant in both treatments (1.72 and 1,57 log(cfu/g) reduction respectively for the two strains). E. coli O157:H7 population even thaw decreased significaly using autocthonous starter culture (1.96 and 1.55 log(cfu/g) reduction) the microorganism was not eliminated. The use of selected autocthonous starter cultures can contribute to significant reduction of L. monocytogenes and E. coli O157:H7 populations. 4

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το πειραµατικό µέρος της παρούσας µεταπτυχιακής διατριβής πραγµατοποιήθηκε στις εγκαταστάσεις του εργαστηρίου Μικροβιολογίας Τροφίµων του Τοµέα Επιστήµης και Τεχνολογίας Τροφίµων, ενώ η παρασκευή των αλλαντικών αέρος στο εργαστήριο Επεξεργασίας και Μηχανικής Τροφίµων του Τοµέα Επιστήµης και Τεχνολογίας Τροφίµων της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. Την επίβλεψη της διατριβής είχε η καθηγήτρια της Γεωπονικής Σχολής κ. Παρθένα Κοτζεκίδου-Ρουκά. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά την κ. Κοτζεκίδου-Ρουκά για την αρωγή, τη συµπαράσταση, την επιστηµονική υποστήριξη, την καθοδήγηση και τις πολύτιµες συµβουλές της κατά τη διάρκεια του πειραµατικού µέρους της µεταπτυχιακής µου διατριβής όσο και κατά τη συγγραφή της. Επιπλέον θα ήθελα, επίσης, να ευχαριστήσω τον κ. Τριαντάφυλλο Ρουκά που δέχτηκε να συµµετάσχει στην τριµελή εξεταστική επιτροπή, για τις επιστηµονικές του συµβουλές σε όλες τις φάσεις της εκπόνησης της παρούσας εργασίας. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Ιωάννη Γ. Μπλούκα, για την παραχώρηση του εργαστηριακου χώρου, του εξοπλισµού, των πρώτων υλών αλλα και για την πολίτιµη βοήθεια του κατά την παρασκευή των αλλαντικών αέρος, καθώς και για τις επιστιµονικές του συµβουλές και την ηθηκή του συµπαράσταση. Ένα ευχαριστώ στους µεταπτυχιακούς συµφοιτητές-φίλους για τη στήριξη και την κατανόησή τους µέχρι τέλους. Τέλος, ένα τεράστιο ευχαριστώ στην οικογένειά µου και ιδιαίτερα στους γονείς µου, για την ηθική και υλική υποστήριξη, καθώς και την ανεξάντλητη υποµονή τους, χωρίς την οποία δε θα ήταν δυνατή η ολοκλήρωση της διατριβής µου. 5

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 2 ABSTRACT... 4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 5 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ... 6 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΗΜΟΣΙΕΥΣΕΩΝ ΚΑΙ ΕΡΓΑΣΙΩΝ... 11 Α. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 12 1. ΖΥΜΟΥΜΕΝΑ ΤΡΟΦΙΜΑ... 12 2. ΑΛΛΑΝΤΙΚΑ ΑΕΡΟΣ... 15 2.1 Η ιστορία των αλλαντικών... 16 2.2 Αλλαντικά φυσικής ζύµωσης... 17 2.2.1 Μικροβιολογία ζύµωσης παραδοσιακών αλλαντικών αέρος... 18 2.3 Καλλιέργειες εκκίνησης... 21 2.3.1 Γαλακτικά βακτήρια... 24 2.3.1.1 Μεταβολική δραστηριότητα των γαλακτικών βακτηρίων... 26 2.3.1.2 Βιοχηµικά χαρακτηριστικά γαλακτικών βακτηρίων... 28 2.3.1.3 Ο ρόλος των γαλακτικών βακτηρίων στα αλλαντικά αέρος... 30 2.3.1.4 Παραγωγή βιογενών αµινών... 31 2.3.1.5 Κριτήρια επιλογής γαλακτικών βακτηρίων για χρήση ως καλλιέργειες εκκίνησης σε αλλαντικά αέρος... 35 2.4. Μικρόκοκκοι και σταφυλόκοκκοι... 37 2.4.1 Μικρόκοκκοι και σταφυλόκοκκοι στα αλλαντικά αέρος... 38 2.5 Μύκητες... 40 2.6 Ζύµες... 42 2.7 Αυτόχθονες καλλιέργειες εκκίνησης... 43 2.8 Προβιοτικές καλλιέργειες... 45 2.8.1 Κριτήρια επιλογής των γαλακτικών βακτηρίων για χρήση ως προβιοτικά στελέχη... 46 2.8.2 Προβιοτικές καλλιέργειες και ζυµούµενα αλλαντικά... 48 6

3. ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΡΑΣΗ ΤΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ ΕΚΚΙΝΗΣΗΣ 3.1 Η θεωρία των εµποδίων... 50 3.2 Βιοπροστασία και βιοπροστατευτικές καλλιέργειες... 52 3.2.1 Αντιµικροβιακές ουσίες που παράγονται από τα γαλακτικά βακτήρια... 54 3.2.1.1 Παραγωγή γαλακτικού οξέος και άλλων οργανικών οξέων... 54 3.2.1.2 Παραγωγή διοξειδίου του άνθρακα... 56 3.2.1.3 Παραγωγή διακετυλίου, ρευτερίνης και ακεταλδεϋδης... 56 3.2.1.4 Παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου... 58 3.2.1.5 Παραγωγή βακτηριοσινών... 59 3.2.1.5.1 Εφαρµογές βακτηριοσινών σε αλλαντικά αέρος... 62 3.2.1.5.2. Παράγοντες που επηρεάζουν τη δράση των βακτηριοσινών στα τρόφιµα....64 3.3 Παθογόνοι µικροοργανισµοί που µπορούν να αναπτυχθούν στα αλλαντικά αέρος και δηµόσια υγεία... 66 3.3.1 Listeria monocytogenes... 70 3.3.1.1 Ο µικροοργανισµός και τα χαρακτηριστικά του... 70 3.3.1.2 Παθογένεια και κλινικά χαρακτηριστικά... 71 3.3.1.3 Συσχετισµός της Listeria monocytogenes µε τα τρόφιµα... 72 3.3.1.4 Listeria monocytogenes kai zymo;ymena allantik;a... 73 3.3.2 Escherichia coli... 75 3.3.2.1 Ο µικροοργανισµός και τα χαρακτηριστικά του... 75 3.3.2.2 Παθογένεια και κλινικά χαρακτηριστικά... 76 3.3.2.3 Συσχετισµός της Escherichia coli µε τα τρόφιµα... 77 3.3.2.4 Escherichia coli και ζυµούµενα αλλαντικά... 77 4. Σκοπός της µελέτης... 79 5. Πειραµατικός σχεδιασµός... 82 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 83 1. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ... 83 Α ΚΕΦΑΛΑΙΟ... 83 1.1. Επιλογή στελεχών γαλακτικών βακτηρίων για χρήση ως καλλιέργειες εκκίνησης... 83 7

1.2. Έλεγχος παραγωγής υπεροξειδίου του υδρογόνου... 84 1.3. Έλεγχος παραγωγής διοξειδίου του άνθρακα... 85 Β ΚΕΦΑΛΑΙΟ... 86 1.4. Παρασκευή αλλαντικών αέρος µε προσθήκη καλλιεργειών εκκίνησης... 86 1.4.1. Προετοιµασία εµβολίου... 86 1.4.2. Πρώτες ύλες... 87 1.4.3. Παρασκευή αλλαντικών αέρος... 87 1.4.4. Μικροβιολογικές αναλύσεις... 89 1.4.5. Αποµόνωση στελεχών γαλακτικών βακτηρίων από τα αλλαντικά αέρος... 89 1.4.5.1. οκιµή καταλάσης - µικροσκοπική εξέταση... 89 1.4.5.2. οκιµή οξειδάσης, υπεροξειδίου του υδρογόνου και διοξειδίου του άνθρακα... 90 Γ ΚΕΦΑΛΑΙΟ... 91 1.2. Έλεγχος των αντιµικροβιακών ιδιοτήτων των καλλιεργειών εκκίνησης... 91 1.2.1. οκιµή αναστολής της ανάπτυξης παθογόνων µικροοργανισµών σε συνθετικό υπόστρωµα SB Medium... 91 ΚΕΦΑΛΑΙΟ... 93 1.3. οκιµή αναστολής της ανάπτυξης παθογόνων µικροοργανισµών σε αλλαντικά αέρος 93 1.3.1. Παρασκευή αλλαντικών αέρος... 93 1.3.2. Μικροβιολογικές αναλύσεις... 94 1.3.3. Φυσικοχηµικές αναλύσεις... 95 1.3.3.1. Προσδιορισµός ph... 95 1.3.3.2. Προσδιορισµός χλωριούχου νατρίου... 95 1.3.3.3 Προσδιορισµός υγρασίας... 96 1.3.3.4. Προσδιορισµός ενεργότητας νερού (a w )... 97 1.3.4. RT-PCR... 97 1.3.5. Οργανοληπτική αξιολόγηση... 97 1.4. Στατιστική ανάλυση... 99 2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α ΚΕΦΑΛΑΙΟ... 100 2.1 Καλλιέργειες εκκίνησης για αλλαντικά αέρος... 100 2.1.1 Επίδραση των επιλεγµένων καλλιεργειών στην εξέλιξη του ph σε συνθετικό υπόστρωµα (SB)... 100 8

2.1.2 Επίδραση των επιλεγµένων καλλιεργειών στην παραγωγή διοξειδίου του άνθρακα εξαρτώµενης από την αίµη καταλάσης και υπεροξειδίου του υδρογόνου... 100 Β ΚΕΦΑΛΑΙΟ... 102 2.2 Παρασκευή αλλαντικών αέρος µε προσθήκη αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης.. 102 2.2.1 Επίδραση των αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης στην ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων... 102 2.2.2 Επίδραση των αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης στην ανάπτυξη των βακτηρίων της οικογένειας Micrococcaceae... 104 2.2.3 Επίδραση των αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης στην ανάπτυξη των βακτηρίων της οικογένειας Enterobacteriaceae... 107 2.2.4 Αποµόνωση στελεχών... 108 2.2.5 Συμπεράσματα 2 ου πειράματος... 108 Γ ΚΕΦΑΛΑΙΟ... 109 2.3 Έλεγχος αντιµικροβιακών ιδιοτήτων των αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης in vitrο... 109 2.3.1 Επίδραση των στελεχών των γαλακτικών βακτηρίων στη µείωση του ph... 110 2.3.2 Επίδραση των στελεχών των γαλακτικών βακτηρίων στην εξέλιξη του πληθυσµού των γαλακτικών βακτηρίων σε συνθετικό υπόστρωµα (SB)... 110 2.3.3 Επίδραση των στελεχών των γαλακτικών βακτηρίων στη µείωση του πληθυσµού της Listeria monocytogenes Scott A σε συνθετικό υπόστρωµα... 112 2.3.4 Επίδραση των στελεχών των γαλακτικών βακτηρίων στη µείωση του πληθυσµού της Escherichia coli O157:H7 σε συνθετικό υπόστρωµα... 113 2.3.5 Συμπεράσματα 3 ου πειράματος... 115 ΚΕΦΑΛΑΙΟ... 116 2.4 Επίδραση των αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης L.sakei 8416 και L.sakei 4413 στη µείωση του πληθυσµού παθογόνων µικροοργανισµών σε αλλαντικά αέρος... 116 2.4.1 Επίδραση των αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης L.sakei 8416 και L.sakei 4413 στα φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά... 117 2.4.2 Επίδραση των αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης L.sakei 8416 και L.sakei 4413 στην ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων στα αλλαντικά αέρος... 120 9

2.4.3 Επίδραση των αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης L.sakei 8416 και L.sakei 4413 στη µείωση του πληθυσµού της Listeria monocytogenes Scott A σε αλλαντικά αέρος... 121 2.4.4 Επίδραση των αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης L.sakei 8416 και L.sakei 4413 στη µείωση του πληθυσµού της E.coli O157:H7 σε αλλαντικά αέρος... 122 2.4.5. RT-PCR... 124 2.4.6 Επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά... 124 2.4.7 Συµπεράσµατα 4 ου πειράµατος... 126 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 127 10

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΡΓΑΣΙΩΝ Baka, A.M., Papavergou, E.J., Pragalaki, T., Bloukas, J.G., Kotzekidou, P. «Effect of selected autochthonous starter cultures on processing and quality characteristics of Greek fermented sausages» Το άρθρο έχει δηµοσιευτεί στο περιοδικό Food Science and Technology, 44 (2011), 54-61. 11

Α. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Ζυµούµενα τρόφιµα Με τον όρο ζυµούµενα τρόφιµα ορίζονται τα προϊόντα εκείνα που παράγονται από µη επεξεργασµένες πρώτες ύλες µε τη δράση διαφόρων ειδών µικροοργανισµών και έχουν χαρακτηριστικά διαφορετικά της πρώτης ύλης. Σε ορισµένες περιπτώσεις οι πρώτες ύλες έχουν υποστεί θερµική επεξεργασία (π.χ. χρήση παστεριωµένου γάλακτος για την παραγωγή τυριών). Σε κάποιες επίσεις περιπτώσεις, τα ενδογενή ένζυµα που υπάρχουν στις πρώτες ύλες διαδραµατίζουν ιδιαίτερα σηµαντικό ρόλο στην πορεία της ζύµωσης (Buckenhuskes, 1993). Εικόνα 1.1: Χαρακτηριστικά παραδείγµατα ζυµούµενων τροφίµων και ποτών. Τα ζυµούµενα τρόφιµα υπήρχαν από την αρχαιότητα, αλλά η διαπίστωση ότι οι µικροοργανισµοί είναι υπεύθυνοι για τη ζύµωση έγινε στα τέλη του περασµένου αιώνα (Κοτζεκίδου, 2000). Συγκεκριµένα, οι µικροοργανισµοί µε τη δράση τους προκαλούν µεταβολές στα συστατικά της πρώτης ύλης µε αποτέλεσµα να παράγονται προϊόντα µε διαφορετικές φυσικοχηµικές ιδιότητες και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά (Πίνακας 1.1). Κατά συνέπεια η ζύµωση αποτελεί µέθοδο παραγωγής νέων προϊόντων αλλά και ταυτόχρονα µέθοδο συντήρησης αφού τα προϊόντα της µπορούν να διατηρηθούν για σηµαντικά µεγαλύτερο διάστηµα σε σχέση µε την πρώτη ύλη από την οποία παράγονται. Η συντήρηση των προϊόντων αυτών και η ασφάλεια του καταναλωτή από την κατανάλωση τους, εξασφαλίζεται λόγω της συνδυασµένης επίδρασης της ανταγωνιστικής µικροχλωρίδας, της µείωσης του ph και της παραγωγής κατά τη διάρκεια της ζύµωσης οργανικών οξέων, αλκοόλης και ουσιών µε αντιµικροβιακή δράση. Συµπληρωµατικά, στην συντήρηση των ζυµούµενων τροφίµων συµβάλλουν και άλλοι παράγοντες όπως η 12

προσθήκη χλωριούχου νατρίου και συντηρητικών, η ήπια θερµική επεξεργασία και η διατήρηση τους σε θερµοκρασίες ψύξης (Μπλούκας Ι., 2001). Πίνακας 1.1: Ζυµούµενα τρόφιµα ανά τον κόσµο και µικροοργανισµοί που χρησιµοποιήθηκαν στη ζύµωσή τους Είδος τροφίµου Γαλακτοκοµικά προϊόντα -Σκληρά τυριά χωρίς οπές -Τυριά µε µικρές οπές - Βούτυρο -Γιαούρτι -Kefir Ζυµούµενα αλλαντικά -Ζυµούµενα αλλαντικά (Ευρώπη) -Ζυµούµενα αλλαντικά (USA) Ζυµούµενα προϊόντα ψαριού Ζυµούµενα λαχανικά -Λάχανο -Πίκλες -Ζυµούµενες ελιές -Ζυµούµενα λαχανικά Σόγια σως Ζυµούµενα δηµητριακά -Ψωµί από ξινό ζυµάρι Αλκοολούχα ποτά -Κρασί (µηλογαλακτική ζύµωση) -Σάκε Μικροοργανισµός Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. lactis var. diacetylactis, Lc. lactis subsp. cremoris, Leuc. mesenteroides subsp. cremoris L. lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. lactis var. diacetylactis, L. lactis subsp. cremoris, Leuc. mesenteroides subsp. Cremoris L. delbrueckii subsp. bulgaricus, S. thermophilus L. kefir, L. kefiranofacies, L. Brevis L. sakei, L. curvatus P. acidilactici, P. pentosaceus L. alimentarius, C. piscicola Leuc. mesenteroides, L. plantarum, P. acidilactici Leuc. mesenteroides, P. cerevisiae, L. brevis, L. plantarum Leuc. mesenteroides, L. pentosus, L. plantarum P. acidilactici, P. pentosaceus, L. plantarum, L. fermentum T. halophilus L. sanfransiscensis, L. farciminis, L. fermentum, L. brevis, L. plantarum, L. amylovorus, L. reuteri, L. pontis, L. panis, L. alimentarius, W. cibaria O. oeni L. sakei B.=Bifidobacterium, C.=Carnobacterium, Lc.=Lactococcus, L.=Lactobacillus, Leuc.=Leuconostoc, O.=Oenococcus, P.=Pediococcus, S.=Streptococcus, T.=Tetragenococcus, W.=Weissella. (Frederic Leroy and Luc De Vuyst, 2006) Παρόλα αυτά η ζύµωση δεν θεωρείται πλέον απλά ένας τρόπος συντήρησης των τροφίµων. Με την πάροδο των χρόνων, ο άνθρωπος κατάφερε να ελέγχει τη διαδικασία της ζύµωσης, και τα ζυµούµενα τρόφιµα πλέον αποτελούν έναν ξεχωριστό κλάδο της βιοµηχανίας τροφίµων. Στη Γερµανία για παράδειγµα, το 25% περίπου των καταναλωτών προτιµούν τα ζυµούµενα τρόφιµα. Ως αποτέλεσµα της ζύµωσης, η γεύση, το άρωµα, η εξωτερική εµφάνιση, η δοµή, η σύσταση, η διάρκεια ζωής και η ασφάλεια των ζυµούµενων τροφίµων παρουσιάζουν διαφορετικές ιδιότητες συγκριτικά µε την πρώτη ύλη από την οποία παρήχθησαν. Η µείωση του ph της κρεατόπαστας για παράδειγµα, µπορεί να επιτευχθεί και µε προσθήκη γλυκονικής-δ-λακτόνης ή µε ζύµωση. Και στις δυο περιπτώσεις τα προϊόντα είναι ασφαλή για τον καταναλωτή, παρουσιάζουν ίδια διάρκεια ζωής και συνεκτικότητα, αλλά η χαρακτηριστική, επιθυµητή γεύση του αλλαντικού µπορεί να επιτευχθεί µόνο µε τη διαδικασία της ζύµωσης (Herbert et al., 1993). 13

Τα προϊόντα που παράγονται µε ζύµωση κατά κανόνα έχουν µεγαλύτερη θρεπτική αξία από την πρώτη ύλη από την οποία έχουν παραχθεί. Κατά τη ζύµωση, οι µικροοργανισµοί παράγουν βιταµίνες και ένζυµα, µε τα οποία οι κυτταρίνες και οι ηµικυτταρίνες, που αποτελούν δοµικά στοιχεία των φυτικών κυττάρων, διασπώνται σε απλούστερους και αφοµοιώσιµους από τον ανθρώπινο οργανισµό, υδατάνθρακες (Μπλούκας, 2001) 14

2. Αλλαντικά αέρος Ως αλλαντικά αέρος, γνωστά επίσης και ως ζυµούµενα ή αφυδατωµένα αλλαντικά χαρακτηρίζονται τα προϊόντα κρέατος που παρασκευάζονται από σύγκοπτο κρέας και λαρδί µε την προσθήκη χλωριούχου νατρίου, νιτρωδών αλάτων, σακχάρων καθώς και άλλων βοηθητικών ουσιών, ενθηκεύονται σε φυσικές ή τεχνητές θήκες και στη συνέχεια υφίστανται ωρίµανση σε κατάλληλο περιβάλλον µε ελεγχόµενες συνθήκες θερµοκρασίας, σχετικής υγρασίας και κυκλοφορίας αέρα (Μπλούκας, 1998). Εικόνα 2.1: Ζυµούµενα αλλαντικά: ξηρά (αριστερά) και ηµίξηρα (δεξιά). Τα αλλαντικά αέρος ανάλογα µε το βαθµό συνοχής τους, ο οποίος καθορίζεται από την τεχνολογία παρασκευής, διακρίνονται σε διατµητά και επαλειφόµενα. Τα διατµητά αλλαντικά είναι συµπαγή, σκληρά και χαρακτηρίζονται από το γεγονός ότι µπορούν να κοπούν σε λεπτές φέτες, στις οποίες διακρίνονται ευκρινώς τα τεµάχια του λίπους. Τα επαλειφόµενα αλλαντικά, έχουν µαλακή σύσταση και χαρακτηρίζονται για την ικανότητά τους να επαλείφονται πάνω σε φέτα ψωµιού. Μια άλλη διάκριση των αλλαντικών αέρος µπορεί να γίνει µε βάση τη διάρκεια ωρίµανσης. Με βάση το χαρακτηριστικό αυτό τα αλλαντικά διακρίνονται σε ταχείας, ενδιάµεσης και µακράς περιόδου ωρίµανσης. Τέλος, σύµφωνα µε την Αµερικάνικη τεχνολογία µπορούν να διακριθούν µε βάση την περιεκτικότητα του τελικού προϊόντος σε υγρασία σε ξηρά και ηµίξηρα (Μπλούκας, 2007). Η ποιότητα του τελικού προϊόντος εξαρτάται από την ωρίµανση που πραγµατοποιείται κατά τη διάρκεια της αφυδάτωσης του. Αυτή η διαδικασία, 15

χαρακτηρίζεται από µια σύνθετη αλληλεπίδραση χηµικών και φυσικών αντιδράσεων που συνδέονται µε την ανάπτυξη της µικροχλωρίδας της κρεατόπαστας. Η ζύµωση των αλλαντικών µπορεί να γίνει είτε από την αυτόχθονη µικροχλωρίδα που προέρχεται από τις πρώτες ύλες, είτε µε χρήση καλλιεργειών εκκίνησης. Η φυσική ζύµωση των αλλαντικών αέρος περιλαµβάνει τη συµµετοχή των γαλακτικών βακτηρίων, κόκκων που δεν παράγουν κοαγκουλάση, και λιγότερο ζυµών και µυκήτων. Οι περισσότερες καλλιέργειες εκκίνησης που χρησιµοποιούνται σε αλλαντικά είναι µίγµατα γαλακτικών βακτηρίων και κόκκων που δεν παράγουν κοαγκουλάση (Toldra et al., 2001). 2.1 Η ιστορία των αλλαντικών αέρος Η παρασκευή κρεατοσκευασµάτων µε ζύµωση και ωρίµανση αποτελεί την αρχαιότερη ίσως µµέθοδο συντήρησης προϊόντων κρέατος. Πιστεύεται ότι οι πρώτοι λαοί που εφάρµοσαν τη συγκεκριµένη µέθοδο ήταν οι Βαβυλώνιοι το 1500 π.χ. και οι αρχαίοι Κινέζοι. Ωστόσο, οι πρώτες καταγραφές για την παρασκευή και την κατανάλωση αλλαντικών ωρίµανσης απαντούν στην Οδύσσεια του Οµήρου τον 9ο αιώνα π.χ. (Τoldrá, 2002). Την παραγωγή αλλαντικών στον Ελλαδικό χώρο από τους αρχαίους ακόµη χρόνους µαρτυρεί η ίδια η λέξη «αλλαντικό». Η λέξη αυτή προέρχεται από την αρχαία ελληνική λέξη «αλλας, γεν. άλλαντος» που σηµαίνει κοµµένο κρέας εντός εντέρου (Μπλούκας Ι., 2007). Οι αναφορές για αλλαντικά αέρος συνεχίζονται σε αρχαία ελληνικά κείµενα και κατά την µεταοµηρική εποχή (Τoldrá, 2002). Η παραγωγή ζυµούµενων προϊόντων κρέατος εφαρµόστηκε και κατά τη διάρκεια του Μεσαίωνα σε πολλές περιοχές της Ευρώπης. Η παρασκευή όµως αλλαντικών αέρος µε τη µορφή που γνωρίζουµε σήµερα, ξεκίνησε το 1730 περίπου στην Ιταλία, όπου τα αλλαντικά µετά την ενθήκευσή τους σε φυσικές θήκες, παρέµεναν εκτεθειµένα στον αέρα σε φυσικές συνθήκες, γεγονός άλλωστε στο οποίο οφείλουν και την ονοµασία τους. Στη Γερµανία, όπου η παρασκευή τέτοιων αλλαντικών άρχισε πριν από 150 χρόνια περίπου, τα αλλαντικά εκτός από αφυδάτωση δέχονταν και καπνισµό, λόγω των διαφορετικών κλιµατολογικών συνθηκών (χαµηλές θερµοκρασίες, υψηλότερη υγρασία) (Τoldrá, 2002). Στη χώρα µας η πρώτη παραγωγή αλλαντικών αέρος έγινε στις αρχές του 20 ου αιώνα στη Λευκάδα, οπού παράγεται και το παραδοσιακό σαλάµι Λευκάδος (Μπλούκας, 2007). Σήµερα τα αλλαντικά αέρος θεωρούνται ότι είναι από τα σηµαντικότερα προϊόντα της ελληνικής βιοµηχανίας κρέατος µε µια ετήσια παραγωγή περίπου 10.000 τόνων. Τα παραδοσιακά αλλαντικά αέρος φυσικής ωρίµανσης παράγονται σε µικρότερη κλίµακα και 16

η παρασκευή τους είναι περισσότερο µια µορφή τέχνης, η οποία εξαρτάται από τις ικανότητες και την εµπειρία του παρασκευαστή, και λιγότερο σε επιστηµονικά και τεχνολογικά µέσα. Η ωρίµανση τους πραγµατοποιείται αποκλειστικά από την ενδογενή µικροβιακή χλωρίδα και εξαρτάται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες που επικρατούν. Αυτή η ενδογενής µικροχλωρίδα αποτελείται από µια µεγάλη ποικιλία µικροοργανισµών, οι οποίοι προέρχονται από το νωπό κρέας, το οποίο ενδεχοµένως επιµολύνεται κατά τη διάρκεια της σφαγής, καθώς και από τις πρόσθετες ουσίες που χρησιµοποιούνται για την παραγωγή των αλλαντικών αέρος (Samelis, 1998). 2.2 Αλλαντικά φυσικής ζύµωσης Παραδοσιακά ζυµούµενα κρεατοσκευάσµατα παράγονται και καταναλώνονται σε διάφορα κράτη σε όλο τον κόσµο. Χαρακτηριστικά παραδείγµατα τέτοιων αλλαντικών αποτελούν το chorizo και το salchichon, τα οποία παράγονται στη κεντρική και δυτική Ισπανία (Benito et al., 2007). Τα αλλαντικά αυτά, παρασκευάζονται χωρίς προσθήκη καλλιέργειας εκκίνησης, κυρίως σε µικρής κλίµακας αλλαντοποιεία, και προτιµούνται από µεγάλη µερίδα καταναλωτών λόγω του χαρακτηριστικού αρώµατος και της γεύσης τους. Σε αυτές τις περιπτώσεις η ζύµωση πραγµατοποιείται από τους µικροοργανισµούς (κυρίως τα γαλακτικά βακτήρια), που ανήκουν είτε στη φυσική µικροχλωρίδα των πρώτων υλών, είτε σε επιµολύνσεις που πραγµατοποιούνται κατά τη διάρκεια της σφαγής του ζώου ή της επεξεργασίας της κρεατόπαστας (Baka et al., 2010. Ammor et al., 2005). Η διαδικασία της ζύµωσης εποµένως δεν είναι απόλυτα ελεγχόµενη. Κάθε αλλαντοποιείο έχει συγκεκριµένη µικροχλωρίδα που αποτελείται από επιθυµητούς µικροοργανισµούς, αλλά και από µικροοργανισµούς που θεωρούνται αλλοιωγόνοι και παθογόνοι (Ammor et al.,2005). Ως αποτέλεσµα δεν υπάρχει τρόπος να εξασφαλιστεί ότι ο πληθυσµός και το είδος των µικροοργανισµών της φυσικής µικροχλωρίδας θα είναι πάντα ο ίδιος, αλλά ούτε και ότι οι µικροοργανισµοί αυτοί θα συµπεριφερθούν πάντα µε τον ίδιο τρόπο. Για το λόγο αυτό το τελικό προϊόν δεν είναι τυποποιηµένο, δηλαδή µπορεί να παρουσιάζει ελαφρώς διαφορετικά οργανοληπτικά και φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά από παρτίδα σε παρτίδα. Ένα ακόµη πρόβληµα που δηµιουργείται κατά την παραδοσιακή ζύµωση των αλλαντικών είναι η πιθανότητα παραγωγής προϊόντων τα οποία δεν είναι ασφαλή για την υγεία του καταναλωτή (Benito et al., 2007). Επιπλέον, η χρήση απολυµαντικών µεθόδων στα αλλαντοποιεία, αν και θεωρείται απαραίτητη, έχει ως αποτέλεσµα την καταστροφή 17

εκτός των παθογόνων και αλλοιωγόνων µικροοργανισµών, και των µικροοργανισµών εκείνων που απαιτούνται για τη διεξαγωγή της ζύµωσης, γεγονός που δηµιουργεί προβλήµατα στα φυσικοχηµικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος αλλά και προβλήµατα ασφάλειας. Τα προαναφερόµενα προβλήµατα θα µπορούσαν να λυθούν µε δυο τρόπους, µε χρήση επιλεγµένων απολυµαντικών µέσων, που δεν επηρεάζουν την ανάπτυξη των επιθυµητών βακτηρίων, ή µε χρήση αυτόχθονων καλλιεργειών εκκίνησης (Ammor et al.,2005). 2.2.1 Μικροβιολογία ζύµωσης παραδοσιακών αλλαντικών αέρος Τα ζυµούµενα αλλαντικά είναι προϊόντα που παρουσιάζουν σηµαντικές διαφοροποιήσεις και ετερογένεια ανάµεσα σε διαφορετικές χώρες αλλά και σε διαφορετικές περιοχές της ίδιας χώρας. Κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης τους, λαµβάνουν χώρα πολύπλοκες φυσικές και βιοχηµικές διεργασίες, οι οποίες οδηγούν σε σηµαντικές αλλαγές των χαρακτηριστικών του αρχικού προϊόντος. Η ενδογενής µικροχλωρίδα των αλλαντικών αέρος συµµετέχει στη διαδικασία της ωρίµανσης και καθορίζει σε σηµαντικό βαθµό τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τελικού προϊόντος. Σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία, τα γαλακτικά βακτήρια (Lactobacillus spp.) και οι θετικοί κατά Gram κόκκοι που παράγουν καταλάση (Staphylococcus spp.) αποτελούν τις κυριότερες οµάδες µικροοργανισµών που διεξάγουν τη ζύµωση των αλλαντικών αέρος (Rantsiou & Cocolin, 2006). Στην παραδοσιακή παραγωγή αλλαντικών αέρος, η κύρια µικροχλωρίδα αποτελείται από γαλακτικά βακτήρια καθ όλη τη διάρκεια της ζύµωσης και της ωρίµανσης. Τα γαλακτικά βακτήρια, συνήθως βρίσκονται στο νωπό κρέας σε χαµηλούς πληθυσµούς (10 2-10 3 cfu/g), αλλά γρήγορα κυριαρχούν κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης, εξαιτίας του αναερόβιου περιβάλλοντος και της παρουσίας χλωριούχου νατρίου (NaCl), νιτρωδών και νιτρικών αλάτων, φτάνοντας ακόµα και πληθυσµούς της τάξης των 10 8-10 9 cfu/g. Τα γαλακτικά βακτήρια που αποµονώνονται συνήθως από αλλαντικά αέρος ανήκουν στα γένη Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Weissella και Enterococcus (Schillinger & Lucke, 1987 Hammes et al., 1990). Συγκεκριµένα έχουν ταυτοποιηθεί τα είδη Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Carnobacterium divergens, Carnobacterium maltaromaticum και Weissella viridescens. 18

Οι Lactobacillus farciminis και Lactobacillus alimentarius συναντώνται σπανιότερα (Dellapina et al., 1994). Οι L. sakei και L. curvatus κυριαρχούν έναντι των άλλων γαλακτικών βακτηρίων. Ο L. sakei αποτελεί το πιο ανταγωνιστικό είδος, και συχνά αποτελεί το ήµισυ έως και τα δύο τρίτα όλων των γαλακτικών βακτηρίων που αποµονώνονται από τα αλλαντικά αέρος, ενώ ο L. curvatus συναντάται συχνά σε ποσοστό µέχρι και το ένα τέταρτο του συνόλου τους. Η αυξηµένη ανταγωνιστικότητα των στελεχών του L. sakei έναντι των υπολοίπων γαλακτοβακίλλων οφείλεται στην πιο σύντοµη φάση προσαρµογής τους και στον υψηλότερο ρυθµό ανάπτυξης τους. Άλλοι γαλακτοβάκιλλοι που µπορεί να βρεθούν είναι οι L. plantarum, L. bavaricus (τώρα αναταξινοµήθηκαν ως L. sakei ή L. curvatus), L. brevis, L. buchneri, και L. paracasei. Πρόσφατα, νέα είδη π.χ. ο L. versmoldensis έχoυν αποµονωθεί από γερµανικά αλλαντικά ταχείας ωρίµανσης, όπου ήταν παρών σε συγκεντρώσεις µέχρι και 10 8 cfu/gr. Λιγότερο συχνά αποµονώνονται πεδιόκοκκοι από ευρωπαϊκά αλλαντικά. Οι πεδιόκοκκοι βρίσκονται πιο συχνά σε αλλαντικά στις Ηνωµένες Πολιτείες, στα οποία προστίθενται και ως καλλιέργειες εκκίνησης, µε σκοπό τη γρήγορη µείωση του pη της κρεατόπαστας. Εντερόκοκκοι αποµονώνονται κυρίως από ζυµούµενα κρεατοσκευάσµατα στη Νότια Ευρώπη, όπου παρατηρείται σηµαντική αύξηση του πληθυσµού τους ειδικά στα αρχικά στάδια της ζύµωσης, µε αποτέλεσµα να εµφανίζονται στο τελικό προϊόν σε συγκεντρώσεις από 10 2 έως και 10 5 cfu/gr. Η πιθανότητα επιµόλυνσης του κρέατος κατά τη σφαγή είναι ιδιαίτερα µεγάλη λόγω της ευρύτατης διάδοσης τους στις εγκαταστάσεις παραγωγής των τροφίµων και της παρουσία τους στο γαστρεντερικό σύστηµα των ζώων. Οι βιοχηµικές δράσεις των εντερόκοκκων κατά την ωρίµανση των αλλαντικών αέρος δεν έχουν µελετηθεί εκτενώς, σε αντίθεση µε την περίπτωση των τυριών και των γαλακτοκοµικών προϊόντων. Ωστόσο, φαίνεται ότι συνεισφέρουν στην ανάπτυξη του αρώµατος των αλλαντικών µέσω των γλυκολυτικών, πρωτεολυτικών και λιπολυτικών τους δράσεων. Οι απόψεις για τη σηµασία τους ποικίλλουν, αφού αφενός ενισχύουν τη γεύση των ζυµούµενων τροφίµων, και αφετέρου η παρουσία τους στο τρόφιµο δηµιουργεί προβλήµατα ασφάλειας, λόγω της πιθανής ύπαρξης και ανάπτυξης ευκαιριακά παθογόνων στελεχών. Στις περισσότερες περιπτώσεις κυριαρχούν στα αλλαντικά είδη του γένους Lactobacillus, και µόνο σε ορισµένα ελαφρώς όξινα αλλαντικά οι πληθυσµοί γαλακτοβάκιλλων και εντεροκόκκων βρίσκονται σε παρόµοια µεγέθη (Dellapina et al., 1994). 19

Στη ζύµωση των αλλαντικών αέρος συµµετέχουν και σταφυλόκοκκοι που δεν παράγουν κοαγκουλάση. Αµέσως µετά την παραγωγή της κρεατόµαζας ο πληθυσµός των βακτηρίων της οικογένειας Micrococcaceae κυµαίνεται στους 3,1-4,4 log cfu/g. Οι σταφυλόκοκκοι συµµετέχουν στην ανάπτυξη και στη σταθερότητα του χαρακτηριστικού ροδοκόκκινου χρώµατος των αλλαντικών µέσω της διάσπασης των νιτρικών και νιτρωδών αλάτων (Talon et al., 1999) και παράγουν αρωµατικές ουσίες και οργανικά οξέα, βελτιώνοντας το άρωµα του αλλαντικού. Παρουσιάζουν µικρή ανταγωνιστική δράση και συχνά ο πληθυσµός τους φτάνει τα 10 6-10 8 cfu/g κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης (Talon et al, 2007). Οι µη-παθογόνοι σταφυλόκοκκοι που δεν παράγουν κοαγκουλάση είναι κυρίως οι Staphylococcus xylosus και Staphylococcus carnosus. Στα προϊόντα αυτά ευνοείται η ανάπτυξη ζυµών και µυκήτων που συµβάλλουν επίσης στη δηµιουργία του επιθυµητού αρώµατος. Ο πληθυσµός τους στην αρχή της ζύµωσης κυµαίνεται από 2-4,5 log cfu/g κρεατόµαζας. Οι ζύµες αναπτύσσονται στην επιφάνεια του αλλαντικού, και συνήθως ανήκουν στο γένος Debaryomyces (συνήθως η Debaryomyces hansenii). Μια άλλη περίπτωση στην οποία παρατηρείται ανάπτυξη ζυµών είναι προς το τέλος της ζύµωσης. Το αρχικό ph της κρεατόπαστας είναι περίπου 6.0, και µειώνεται κατά τη διάρκεια της ζύµωσης και φτάνει σε τιµές µεταξύ 4.6 και 5.1. Στο σηµείο αυτό ζύµες, συνήθως του είδους Debaryomyces hansenii, αυξάνουν το ph του προϊόντος, µε αποτέλεσµα οι τελικές του τιµές να κυµαίνονται από 5.1 ως 5.5. Οι µύκητες που αναπτύσσονται, ανήκουν στο γένος Penicillium, θεωρούνται επιθυµητοί στην τεχνολογία παρασκευής των αλλαντικών, αφού σχηµατίζοντας ένα λεπτό υµένιο αποτρέπουν την τάγγιση του λίπους και ευνοούν τη διατήρηση του κόκκινου χρώµατος. Παράλληλα, αποικοδοµώντας το λίπος και τις πρωτεΐνες βελτιώνουν το άρωµα του αλλαντικού Οι µύκητες που αποµονώνονται, συνήθως ανήκουν στα γένη Penicillium nalgiovense και Penicillium chrysogenum, και χρησιµοποιούνται ως καλλιέργειες εκκίνησης κυρίως στη Νότια Ευρώπη. (Leroy et al, 2006) Τα αλλαντικά ειδικότερα στα πρώτα στάδια της ζύµωσης περιέχουν µεγάλο αριθµό εντεροβακτηρίων, ψευδοµονάδων, στρεπτοκόκκων και κλωστριδίων, µικροοργανισµοί που θεωρούνται ανεπιθύµητοι στη ζύµωση των αλλαντικών. Ο πληθυσµός των εντεροβακτηρίων αµέσως µετά την παρασκευή της κρεατόµαζας κυµαίνεται από 1,7-4,4 log cfu/g, ενώ των ψευδοµονάδων από 1,5-5,2 log cfu/g. Η ύπαρξη αλλοιωγόνων και κυρίως παθογόνων µικροοργανισµών σε µεγάλες συγκεντρώσεις, ίσως αποτελέσει σοβαρό κίνδυνο κατά την κατανάλωση του προϊόντος. Σε γενικές γραµµές δηλαδή, τα βακτήρια αυτά θεωρούνται ανεπιθύµητα, αν και έχει 20

αποδειχθεί ότι πιθανόν να συµβάλουν ορισµένες φορές στην αναγωγή των νιτρικών σε νιτρώδη, καθώς στην δηµιουργία πτητικών ενώσεων µέσω της πρωτεόλυσης και της λιπόλυσης. Λόγω της µείωσης του ph, της δηµιουργίας αναερόβιων συνθηκών και της ταχύτατης ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων, ο πληθυσµός των εντεροβακτηρίων και των άλλων ψυχρόφιλων βακτηρίων µειώνεται σταδιακά, µέχρι την πλήρη καταστροφή τους µετά από κάποιες µέρες. Υπάρχει τέλος πιθανότητα οι πρώτες ύλες να περιέχουν παθογόνους µικροοργανισµούς, όπως ο Staphylococcus aureus, η Listeria monocytogenes, το Clostridium perfrigens, η Escherichia coli κτλ (Talon et al., 2006). Η σύνθεση της µικροχλωρίδας των αλλαντικών αέρος σχετίζεται άµεσα µε την τεχνική ωρίµανσης που χρησιµοποιείται. Αλλαντικά µε µικρότερους χρόνους ωρίµανσης έχουν περισσότερους γαλακτοβάκιλλους από τα αρχικά στάδια της ωρίµανσης και ένα όξινο άρωµα κυριαρχεί στο προϊόν. Αντίθετα, αλλαντικά µε µεγαλύτερους χρόνους ωρίµανσης περιέχουν Gram-θετικούς κόκκους που παράγουν κοαγκουλάση σε υψηλότερους πληθυσµούς. Τα αλλαντικά αέρος µεσογειακής προέλευσης χαρακτηρίζονται γενικά από µεγαλύτερους χρόνους ωρίµανσης, σε αντίθεση µε αυτά που προέρχονται από χώρες της Βόρειας Ευρώπης (Lucke, 2000). 2.3 Καλλιέργειες εκκίνησης Σύµφωνα µε τον Hammes (1998), οι καλλιέργειες εκκίνησης περιέχουν δραστικά ή µη κύτταρα µικροοργανισµών που αναπτύσσουν την επιθυµητή µεταβολική δραστηριότητα στο κρεατοσκεύασµα, και χρησιµοποιούνται για να βελτιώσουν τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τροφίµου. Η προσθήκη επιθυµητών µικροοργανισµών στα τρόφιµα, µπορεί να έχει τέσσερις διαφορετικούς σκοπούς: (1) βελτίωση της ασφάλειας (αδρανοποίηση των παθογόνων µικροοργανισµών), (2) βελτίωση της σταθερότητας (παράταση του χρόνου ζωής του τροφίµου µέσω της παρεµπόδισης ανεπιθύµητων µεταβολών που προκαλούνται από αλλοιωγόνους µικροοργανισµούς ή από αβιοτικές αντιδράσεις), (3) επεξεργασία της πρώτης ύλης ώστε να αποκτήσει νέες οργανοληπτικές ιδιότητες και (4) απόκτηση ωφέλιµων για την υγεία δράσεων (διαµέσου θετικών επιδράσεων στη µικροβιακή χλωρίδα του εντέρου) (Lücke, 2000). 21

Καλλιέργειες εκκίνησης Γαλακτικά βακτήρια Lactobacillus sakei, L. curvatus, L. pentosus, L. plantarum, L. casei, L.acidophilus, L..alimentarius Lactococcus lactis Pediococcus acidilactici, P. Pentosaceus Micrococacceae Staphylococcus carnosus subsp. carnosus, St. carnosus subsp. utilis, St. xylosus Kocuria varians Streptomyces griseus Ζύµες Debaryomyces hansenii, Candida famata Μύκητες Penicilium nalgiovense, P. Chrysogenum Οι καλλιέργειες «εκκίνησης» (starter cultures) χρησιµοποιούνται εξ ορισµού µε σκοπό είτε τη µεταβολή των οργανοληπτικών ιδιοτήτων των τροφίµων είτε την παραγωγή νέων τροφίµων. Πίνακας 2.3.1. Κύριες καλλιέργειες εκκίνησης στην τεχνολογία αλλαντικών ωρίµανση (Hammes & Hertel, 1998) Για την επίτευξη αυτών των στόχων προτιµούνται οι αυτόχθονες καλλιέργειες εκκίνησης, οι οποίες αποτελούνται από στελέχη µικροοργανισµών που αποµονώθηκαν από ζυµούµενα τρόφιµα, στα οποία η ζύµωση πραγµατοποιήθηκε µόνο µε τη δράση της ενδογενούς µικροχλωρίδας. Τα γαλακτικά βακτήρια που προέρχονται από ζυµούµενα προϊόντα κρέατος προσαρµόζονται πιο εύκολα στις συνθήκες ζύµωσης των αλλαντικών και για το λόγο αυτό προτιµούνται ως καλλιέργειες εκκίνησης, σε σχέση µε τα στελέχη που έχουν αποµονωθεί από άλλα τρόφιµα. Η προσθήκη καλλιεργειών µπορεί να εξυπηρετεί και άλλους σκοπούς. Οι ανταγωνιστικές καλλιέργειες για παράδειγµα, οι οποίες προστίθενται στα τρόφιµα προκειµένου να αναστείλουν την ανάπτυξη παθογόνων µικροοργανισµών ή/και να παρατείνουν τη διάρκεια ζωής των προϊόντων ονοµάζονται προστατευτικές ή βιοπροστατευτικές καλλιέργειες. Υπάρχουν τέλος και οι προβιοτικές καλλιέργειες, οι οποίες προστίθενται στα τρόφιµα µε στόχο τη βελτίωση της κατάστασης της υγείας του καταναλωτή, µέσω της ενίσχυσης της αυτόχθονης µικροχλωρίδας του εντέρου και του ανταγωνισµού κατά των παθογόνων µικροοργανισµών (Leroy et al., 2006). 22

Πίνακας 2.3.2. Mεταβολική δραστηριότητα και επίδραση των διαφόρων καλλιεργειών εκκίνησης στο τελικό προϊόν Είδος µικροοργανισµού Γαλακτικά βακτήρια Κόκκοι που παράγουν καταλάση Γένος µικροοργανισµού L. plantarum, L. pentosus, L. sakei, L. curvatus, P. pentosaceus, P. Acidilactici S. carnosus, S. xylosus, M. Varians Μεταβολική δραστηριότητα Παραγωγή γαλακτικού οξέος Αναγωγή νιτρικών Κατανάλωση οξυγόνου ιάσπαση υπεροξειδίων Λυπόλιση Ζύµες Debaryomyces hansenii Κατανάλωση οξυγόνου Λυπόλιση Μύκητες Penicillium nalgiovense Βιότυποι 2,3,6 Κατανάλωση οξυγόνου ιάσπαση υπεροξειδίων Πρωτεόλυση Λυπόλιση Επίδραση στο τελικό προϊόν Αναστολή της ανάπτυξης παθογόνων και αλλοιωγόνων µικροοργανισµών Σχηµατισµός χρώµατος Αφυδάτωση Μείωση νιτρωδών Σχηµατισµός και σταθεροποίηση χρώµατος Προστασία από οξείδωση Σχηµατισµός πτητικών ουσιών Προστασία από οξείδωση Σχηµατισµός πτητικών ουσιών Σταθεροποίηση χρώµατος Προστασία από οξείδωση Σχηµατισµός πτητικών ουσιών (Friedrich-Karl Licke, 1994) Τα είδη που χρησιµοποιούνται συνήθως ως εµπορικά παρασκευάσµατα καλλιεργειών εκκίνησης σε ζυµούµενα προϊόντα κρέατος είναι τα L. sakei, L. curvatus, L. plantarum, L. pentosus, Lactobacillus casei, Pediococcus pentosaceus και Pediococcus acidilactici. Για τη βελτίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών χρησιµοποιούνται εκτός από τα γαλακτικά βακτήρια και άλλα είδη µικροοργανισµών, όπως κόκκοι που παράγουν καταλάση (Staphylococcus, Kocuria), ζύµες (Debaromyces) και µύκητες (Penicillium) (Ammor et al., 2006). Σήµερα θεωρείται ολοένα και σηµαντικότερη η χρήση των καλλιεργειών εκκίνησης, αφού παρουσιάζουν επιθυµητές ιδιότητες που δεν συναντώνται στις φυσικές καλλιέργειες, βοηθούν στη βελτιστοποίηση της διαδικασίας ζύµωσης των αλλαντικών και στην παραγωγή πιο εύγευστων, ασφαλέστερων, και πιο υγιεινών προϊόντων (Ammor et al., 2007). 23

2.3.1 Γαλακτικά βακτήρια (Lactic acid bacteria, LAB) Ιστορικές αναφορές ανάγουν τη χρήση τροφίµων-προϊόντων ζύµωσης από γαλακτικά βακτήρια ήδη από το 3200 π.χ., ενώ η ιδέα της συγκρότησης µιας οµάδας µικροοργανισµών που προκαλεί ζύµωση και πήξη του γάλακτος υπό την ονοµασία «βακτήρια του γαλακτικού οξέως» τέθηκε από τις αρχές και κορυφώθηκε τα τέλη του 19 ου αιώνα, µε την καθοριστική συµβολή του Pasteur στη µελέτη της γαλακτικής ζύµωσης. Σύµφωνα µε τον ορισµό του Orla-Jensen S. το 1919, ως «πραγµατικά γαλακτικά βακτήρια, Lactobacteriaceae» ορίζεται µια οµάδα Gram θετικών µικροοργανισµών, σχήµατος βακίλου ή κόκκου, που δεν παρουσιάζουν τυπικά αυτόνοµη κίνηση ή σχηµατισµό ενδοσπορίων και οι οποίοι χαρακτηρίζονται από ικανότητα ζύµωσης των υδατανθράκων και των ανωτέρων αλκοολών προς γαλακτικό οξύ αποκλειστικά, ή µίγµα γαλακτικού και οξικού οξέος, αιθανόλης και διοξειδίου του άνθρακα. Τα γαλακτικά βακτήρια έχουν πάρει το όνοµα τους από το κύριο προϊόν της ζύµωσης της λακτόζης που είναι το γαλακτικό οξύ, µε µια από τις τρεις στερεοχηµικές µορφές του, το D(-) γαλακτικό οξύ, το L(+) γαλακτικό οξύ και το ρακεµικό µείγµα DL των δυο µορφών. Τα γαλακτικά βακτήρια περιλαµβάνουν ένα ευρύ φάσµα µικροβιακών γενών και ειδών και κατέχουν ιδιαίτερα σηµαντικό ρόλο στη βιοµηχανία τροφίµων, ως αναπόσπαστο µέρος πολλών διαδικασιών ζύµωσης, που συµβάλλουν στη διατήρηση αλλά και στην αλλοίωση των τροφίµων (Stiles et al., 1997). Η οµάδα των γαλακτικών βακτηρίων περιλαµβάνει τα ακόλουθα 12 γένη: Lactobacillus, Lactococcus, Lactaspaera, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Carnobacterium, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagοcoccus και Weissela. Πρέπει να τονιστεί ότι δεν υπάρχει κοινά αναγνωρισµένος από όλους τους ερευνητές ορισµός των γαλακτικών βακτηρίων στη βιβλιογραφία (Limsowtin & Broom, 2002). Η ταξινόµηση των γαλακτικών βακτηρίων εξακολουθεί να αποτελεί ένα ανοιχτό πεδίο έρευνας και απαιτεί πολύπλευρη προσέγγιση, µε τεχνικές που αφορούν τόσο στα φαινοτυπικά όσο και στα φυλογενετικά χαρακτηριστικά των βακτηρίων. Τα γαλακτικά βακτήρια είναι µεσόφιλα και αναπτύσσονται σε θερµοκρασίες από 10 έως 40 ο C (µε άριστη τιµή τους 30 ο C). Είναι αρνητικά στη δοκιµή καταλάσης, αναπτύσσονται υπό µικροαερόφιλες έως αυστηρά αναερόβιες συνθήκες, αλλά µπορούν να αναπτυχθούν και παρουσία οξυγόνου και δεν ανάγουν τα νιτρώδη (Klein et al, 1998). Το σχήµα τους λόγω της µεγάλης ποικιλοµορφίας ποικίλλει από σφαιρικό έως ραβδόµορφο, 24

µε όλες τις ενδιάµεσες καταστάσεις. Οι διατάξεις των κυττάρων επίσης ποικίλλουν ανάλογα µε το γένος, από µεµονωµένα κύτταρα, ζεύγη κυττάρων, τετράδες σε δυο επίπεδα και τέλος αλυσίδες, βραχείες ή επιµήκεις. Η πιο χαρακτηριστική τους ιδιότητα είναι η πήξη του γάλακτος λόγω της παραγωγής γαλακτικού οξέος. Συνθέτουν ATP µέσω των ζυµώσεων των υδατανθράκων και όχι µέσω της αναπνευστικής οδού λόγω της αδυναµίας τους να συνθέτουν κυτόχρωµα και άλλα συστατικά που περιέχουν αίµη και έτσι δεν µπορούν να χρησιµοποιήσουν το οξυγόνο ως τελικό αποδέκτη ηλεκτρονίων (Limsowtin & Broom, 2002. Salminen & Ouwehand, 2002). Έχουν περιορισµένες ικανότητες βιοσύνθεσης και µεγάλες διατροφικές απαιτήσεις σε αµινοξέα, βιταµίνες, πουρίνες και πυριδίνες και συγκεκριµένα πεπτίδια απαραίτητα για την ανάπτυξη τους (Stiles & Holzapfel, 1997). Τα γαλακτικά βακτήρια αποτελούν µέρος της ανθρώπινης εντερικής µικροχλωρίδας, µε πληθώρα ευεργετικών επιδράσεων, γεγονός που δικαιολογεί το έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον που συγκεντρώνει η µελέτη των προβιοτικών τους ιδιοτήτων (Klein et al., 1998). Με αφορµή την εξαιρετική τους δράση στον οργανισµό του ανθρώπου, πολλά στελέχη κυρίως των ειδών Lactobacillus, Enterococcus και Bifidobacterium παρουσιάζουν εξαιρετικό διατροφικό ενδιαφέρον, καθώς χρησιµοποιούνται ως προβιοτικές καλλιέργειες (Holzapfel et al., 2001). Τα γαλακτικά βακτήρια πέραν της βιοµηχανίας του γάλακτος, στην οποία σήµερα χρησιµοποιούνται ευρύτατα, βρίσκουν εφαρµογή στην παραγωγή: Ζυµούµενων αλλαντικών Ζυµούµενων φυτικών προϊόντων Κρασιών Αρτοσκευασµάτων Ζωοτροφών Στις υδατοκαλλιέργειες ως εναλλακτικός τρόπος θεραπείας των νοσηµάτων των αλιευµάτων, µε σκοπό τη µείωση των αντιβιοτικών. 25

Εικόνα 2.3.1: Οι κύριες φυλογενετικές οµάδες των LAB και των σχετικών Gram (+) βακτηρίων µε χαµηλό (πάνω µέρος) και υψηλό (κάτω µέρος) περιεχόµενο βάσεων G+C στο DNA. (Stiles & Holzapfel., 1997) 2.3.1.1 Μεταβολική δραστηριότητα των γαλακτικών βακτηρίων Τα γαλακτικά βακτήρια από πλευράς µεταβολισµού διαιρούνται σε δυο κατηγορίες: α) υποχρεωτικώς οµοζυµωτικά, τα οποία χρησιµοποιούν τη µεταβολική οδό των Embden-Meyerhof-Parnas και παράγουν 2 µόρια γαλακτικού οξέος από ένα µόριο εξόζης. Τα οµοζυµωτικά βακτήρια παράγουν το ένζυµο FDA αλδολάση που καταλύει τη διάσπαση της εξόζης σε δύο τριόζες, οι οποίες στη συνέχεια µετατρέπονται σε γαλακτικό οξύ µε ταυτόχρονη παραγωγή δύο µορίων ΑΤΡ. εν έχουν τη δυνατότητα 26

ζύµωσης των πεντοζών λόγω έλλειψης τους ενζύµου φωσφοκετολάση. Στην οµάδα των υποχρεωτικώς οµοζυµωτικών βακτηρίων ανήκουν τα γένη Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus και τα περισσότερα είδη του γένους Pediococcus (Vandamme et al. 1996, Stiles & Holzapfel 1997). β) υποχρεωτικώς ετεροζυµωτικά, τα οποία ακολουθούν τον κύκλο του 6- φωσφογλυκονικού οξέος/φωσφοκετολάσης µετατρέποντας ένα µόριο εξόζης σε ένα µόριο CO 2, ένα µόριο γαλακτικού οξέος και αιθανόλης ή οξικού οξέος µε παραγωγή ενός µορίου ΑΤΡ (Axelsson 1993, Stiles & Holzapfel 1997, Caplice & Fitzgerald 1999). Τα ετεροζυµωτικά βακτήρια οξειδώνουν την 6-φωσφογλυκόζη σε 6- φωσφογλυκονικό οξύ και στη συνέχεια µε αποκαρβοξυλίωση και διάσπαση της παραγόµενης πεντόζης, παράγουν ισοµοριακές ποσότητες των προαναφερθέντων τελικών προϊόντων (C-3 και C-2). Η ζύµωση των πεντοζών είναι εφικτή επειδή τα βακτήρια αυτά παράγουν το ένζυµο φωσφοκετολάση. Η αναλογία αιθανόλης/οξικού οξέος που παράγεται εξαρτάται από το δυναµικό οξειδοαναγωγής του συστήµατος, ενώ παρουσία Ο 2 ή φρουκτόζης δε σχηµατίζεται αιθανόλη αλλά Η 2 Ο 2 ή µαννιτόλη, αντίστοιχα (Kandler, 1983). Τα ετεροζυµωτικά βακτήρια περιλαµβάνουν τα γένη Leuconostoc και Carnobacterium, και είδη του γένους Lactobacillus µε κυριότερους εκπροσώπους τους L. brevis, L. fermentum, L. kefir, L. reuteri και τον Pediococcus pentosaceus (Vandamme et al. 1996, Stiles and Holzapfel 1997). γ) προαιρετικώς ετεροζυµωτικά, τα οποία ζυµώνουν τις εξόζες όπως τα οµοιοζυµωτικά βακτήρια αλλά και τις πεντόζες, όπως τα ετεροζυµωτικά βακτήρια, λόγω της ύπαρξης µιας επαγώγιµης φωσφοκετολάσης, η οποία ενεργοποιείται παρουσία πεντοζών (Axelsson, 1993 Stiles & Holzapfel, 1997). Παρόµοια στροφή των προαιρετικώς ετεροζυµωτικών βακτηρίων προς τις ετεροζυµωτικές οδούς µεταβολισµού προκαλούν και άλλες µεταβολές των συνθηκών ανάπτυξης, όπως είναι ο περιορισµός της διαθεσιµότητας γλυκόζης. Στα προαιρετικώς ετεροζυµωτικά γαλακτικά βακτήρια υπάγεται το υπογένος streptobacteria του γένους Lactobacillus, µε κυριότερους εκπροσώπους τους L. alimentarius, L. casei, L. curvatus, L. plantarum, L. sakei και τον Pediococcus acidilactici (Vandamme et al. 1996 Stiles & Holzapfel 1997). 27

Σχήµα 2.3.1.1.1: Ζύµωση της γλυκόζης από οµογαλακτικά και ετερόγαλακτικά βακτήρια (Caplice & Fitzgerald, 1999). 2.3.1.2 Βιοχηµικά χαρακτηριστικά των γαλακτικών βακτηρίων παρακάτω: Οι κυριότερες βιοχηµικές δραστηριότητες των γαλακτικών βακτηρίων είναι οι Ζύµωση της γλυκόζης ή γαλακτική ζύµωση. Η γαλακτική ζύµωση αναλύθηκε στο κεφάλαιο 2.3.1.1. Ζύµωση των κιτρικών αλάτων. Τα κιτρικά άλατα υπάρχουν σε µικρή ποσότητα στο γάλα και ο µεταβολισµός τους συµβάλλει στο σχηµατισµό αρώµατος των γαλακτοκοµικών προϊόντων. Μερικά είδη γαλακτικών βακτηρίων (Leuconostoc sp. και L.lactis subsp. diacetilactis) µεταβολίζουν το κιτρικό οξύ σε διακετύλιο και διοξείδιο του άνθρακα. Πρωτεόλυση. Τα γαλακτικά βακτήρια είναι ασθενώς πρωτεολυτικά και διαθέτουν ένα πολύπλοκο σύστηµα που αποτελείται από πρωτεϊνάσες του κυτταρικού τοιχώµατος και 28

πολλές πρωτεϊνάσες του κυτοπλάσµατος. Επιδεικνύουν µικρή ενδοπεπτιδασικη δραστηριότητα µε ασήµαντη παραγωγή πεπτιδίων, αλλά µεγάλη αµινοπεπτιδιακή δραστηριότητα µε σηµαντική παραγωγή αµινοξέων. Το πρωτεϊνικό σύστηµα των γαλακτικών βακτηρίων αποτελείται από: 1. σύστηµα πρωτεϊνασών η ενδοπεπτιδασών που υδρολύουν την καζεΐνη και τους εσωτερικούς πεπτιδικούς δεσµούς σε πεπτίδια. 2. σύστηµα εξωπεπτιδασών που υδρολύουν τα πεπτίδια σε µικρότερα πεπτίδια και αµινοξέα. Οι κυριότερες από αυτές είναι οι αµινοπεπτιδάσες, καρβοξυπεπτιδάσες, δι- ή τρι-πεπτιδρυλικές-πεπτιδάσες 3. σύστηµα µεταφοράς αµινοξέων και πεπτιδίων στο κύτταρο των γαλακτικών βακτηρίων 4. ενδοκυτταρικές πεπτιδάσες µέσα στο κυτταρόπλασµα που υδρολύουν τα πεπτίδια σε αµινοξέα. Καταβολισµός λιπών. Η λιπολυτική δραστηριότητα των γαλακτικών βακτηρίων είναι περιορισµένη, γιατί αφενός το λιποδιαλυτικό τους σύστηµα είναι ασθενές και αφετέρου γιατί έχουν την ικανότητα να υδρολύουν τα µονογλυκερίδια και τα διγλυκερίδια, ενώ το λίπος αποτελείται κυρίως από τριγλυκερίδια. Γενικά τα είδη του γένους Streptococcus είναι περισσότερο λιποδιαλυτικά από τα είδη του γένους Lactobacillus sp. Προπιονική ζύµωση. Τα βακτήρια του γένους Propionobacterium spp. έχουν την ικανότητα να παράγουν προπιονικό οξύ χρησιµοποιώντας διάφορα υποστρώµατα (γλυκόζη, πυροσταφυλικό) και κυρίως γαλακτικό οξύ. Η ζύµωση αυτή βρίσκει εφαρµογή σε διάφορους τύπους ελβετικών τυριών (Axelsson, 1993). Μεταβολίτες που παράγονται από τα γαλακτικά βακτήρια. Οι ουσίες που µπορούν να παραχθούν από τα γαλακτικά βακτήρια είναι: 1. οργανικά οξέα 2. διοξείδιο του άνθρακα (CO 2 ) 3. υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) 4. διακετύλιο 5. ακεταλδεϋδη 6. µεταβολίτες µικρού ΜΒ µη πρωτεϊνικής δοµής 7. µεταβολίτες πρωτεϊνικής φύσεως που χαρακτηρίζονται ως βακτηριοσίνες. 29

Οι µεταβολίτες αυτοί παρέχουν ασφάλεια και σταθερότητα στα ζυµούµενα προϊόντα, και η γαλακτική ζύµωση ως διεργασία συντήρησης βασίζεται µερικά σε αυτούς τους µεταβολίτες, οι οποίοι συναθροίζονται σε παρεµποδιστικά επίπεδα έναντι των παθογόνων βακτηρίων σε τρόφιµα και ποτά. Η αντιµικροβιακή δράση των παραπάνω παραγόντων είναι συνήθως συνεργιστική (Lindgren & Dobrogosz, 1990). Αναλυτικά στοιχεία για τους προαναφερόµενους µεταβολίτες θα παρατεθούν στο κεφάλαιο 3.2.1. 2.3.1.3 Ο ρόλος των γαλακτικών βακτηρίων στα αλλαντικά αέρος Τα γαλακτικά βακτηρία αποτελούν την κύρια µικροχλωρίδα ζύµωσης των αλλαντικών αέρος. Ο ρόλος τους στη διαδικασία της ζύµωσης είναι πολλαπλός. Οι σηµαντικότερες δράσεις τους στην πορεία της ζύµωσης είναι: 1. Η γρήγορη και επαρκής παραγωγή οργανικών οξέων: Η παραγωγή οργανικών οξέων (και κυρίως του γαλακτικού οξέος) από υδατάνθρακες είναι ο σηµαντικότερος ρόλος των γαλακτικών βακτηρίων στη ζύµωση των αλλαντικών αέρος. Η παραγωγή γαλακτικού οξέος επιφέρει: α) µείωση του ph στο 4,8-5. Aυτές οι τιµές ph αντιστοιχούν στο ισοηλεκτρικό σηµείο του κρέατος, στο οποίο το κρέας έχει τη µικρότερη ικανότητα συγκράτησης νερού, µε αποτέλεσµα να διευκολύνεται η αφυδάτωση του προϊόντος, β) µετουσίωση των πρωτεϊνών του κρέατος που έχουν εκχειλιστεί µεταξύ των τεµαχίων κρέατος και λαρδιού µε αποτέλεσµα τη βελτίωση της δοµής του προϊόντος, γ) βοηθά στη δηµιουργία της επιθυµητής όξινης γεύσης του, δ) επιτυγχάνεται η µικροβιολογική σταθερότητα του αλλαντικού, στ) δηµιουργεί όξινες συνθήκες, οι οποίες αυξάνουν τη δραστικότητα της καθεψίνης D, µε αποτέλεσµα την πρωτεόλυση των πρωτεϊνών και ζ) έχει αναφερθεί ότι η γρήγορη µείωση του ph που προκαλείται από τις καλλιέργειες εκκίνησης που δεν παράγουν βιογενείς αµίνες, µπορεί κατά ένα µεγάλο µέρος να αποτρέψει τη συσσώρευση βιογενών αµινών στα αλλαντικά (Benito et al., 2007). Τα στελέχη που παράγουν βιογενείς αµίνες δεν χρησιµοποιούνται ως καλλιέργειες εκκίνησης. Ο άµεσος και γρήγορος σχηµατισµός των οργανικών οξέων από την αρχή της ζύµωσης, και η παραγωγή επαρκούς ποσότητας οργανικών οξέων που επιτρέπουν την πτώση του ph σε τιµές κάτω από 5.1, είναι εποµένως απαραίτητα χαρακτηριστικά των 30