Γενετικά τροποποιημένοι μικροοργανισμοί στο περιβάλλον

Γενετικά τροποποιημένοι μικροοργανισμοί στο περιβάλλον Δημήτριος Καρπούζας Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Βιοτεχνολογία Ποιότητα Διατροφής και Περιβάλλον

Γενετικά τροποποιημένοι μικροοργανισμοί (Genetically Modified Microorganisms, GMMs) Μικροοργανισμοί στο γενετικό υλικό των οποίων έχουν ενσωματωθεί εξωγενή γονίδια που δεν υπήρχαν στο γενετικό υλικό των μικροοργανισμών από του οποίους προήλθαν (άγριος τύπος)

Τι θα ακούσετε σήμερα; Εφαρμογές γενετικά τροποποιημένων μικροοργανισμών Θέματα ασφάλειας για το περιβάλλον από την ελευθέρωση γενετικά τροποποιημένων μικροοργανισμών - Μειωμένη ανταγωνιστικότητα και επιβίωση; - Κίνδυνος οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων, εμφάνιση γενετικών ανασυνδυασμών στο περιβάλλον; - Θέματα ασφάλειας Επιδράσεις ελευθέρωσης GMMs στην μικροβιακή οικολογία Παραδείγματα GMM που χρησιμοποιούνται στην πράξη

Που χρησιμοποιούνται οι γενετικώς τροποποιημένοι μικροοργανισμοί; Έχουν τους ίδιους στόχους με τα αντίστοιχα άγρια στελέχη με την διαφορά ότι έχουν γενετικώς τροποποιηθεί για μεγιστοποίηση της αποτελεσματικότητα τους

Βιολογικά γεωργικά φάρμακα Βιολογικά λιπάσματα Ενισχυτικά φυτικής ανάπτυξης Φορείς βιολογικής απορρύπανσης ή εξυγίανσης

Πιθανά προβλήματα από την απελευθέρωση και χρήση στο περιβάλλον GMMs Από την στιγμή της απελευθέρωσης στο περιβάλλον ένας GMMs θα ακολουθήσει δύο πιθανούς δρόμους 1. Θα επιτελέσει τον στόχο του και θα εξαλειφθεί (ασφαλές?) 2. Θα επιτελέσει τον στόχο του και θα επιβιώσει ως μέλος της μικροβιακής κοινότητας εφεξής (σίγουρα μη ασφαλές!!!)

Γενικά θεωρείται κοινώς αποδεκτό ότι οι GMMs είναι λιγότερο ανταγωνιστικοί και παρουσιάζουν χαμηλότερη βιωσιμότητα από ότι τα αντίστοιχα άγρια στελέχη από τα οποία προήλθαν (reduced fitness of GMMs) Θεωρία της υπέρβαρης αποσκευής (excess baggage) Θεωρία της ασυντόνιστης μηχανής (untuned engine) Θεωρία των εξημερωμένων ειδών (domesticated species)

Θεωρία της υπέρβαρης αποσκευής (excess baggage) Ι Η επιπλέον ενέργεια που χρειάζεται ένας GMMs για να διατηρεί ενεργά τα ξένα γονίδια που έχουν ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του τον καθιστούν λιγότερο ανταγωνιστικό και βιώσιμο στο περιβάλλον σε σχέση με τα αντίστοιχα άγρια στελέχη Brill (2007), Science 227: 381-384

Θεωρία της υπέρβαρης αποσκευής (excess baggage) ΙΙ Σύμφωνα με αυτή την θεωρία ο GMMs δεν μπορεί να επαναποκτήσει την αυξημένη ανταγωνιστικότητα και βιωσιμότητα του αντίστοιχου άγριου στελέχους από το οποίο προέκυψε παρα μόνο εάν «ξεφορτωθεί» τα ξένα γονίδια... έχει αποδειχθεί ότι δεν ισχύει απόλυτα!!

GMM Ε. coli που είναι ανθεκτικά στον βακτηριοφάγο Τ4 παρουσίαζαν 35% μειωμένη βιωσιμότητα από τα αντίστοιχα ευαίσθητα στελέχη όταν ο βακτηριοφάγος δεν ήταν παρόν Ύστερα από 400 γενεές ανάπτυξης των GMM Ε. coli και των ευαίσθητων στελεχών απουσία του βακτηριοφάγου κανένα από τα GM στελέχη του Ε. coli δεν απώλεσε την ανθεκτικότητα του στον ιό ενώ η μέση βιωσιμότητα τους αυξήθηκε σε επίπεδα ίδια με τα ανθεκτικά στελέχη Άρα η θεωρεία της υπέρβαρης αποσκευής δεν επιβεβαιώνεται σε όλες τις περιπτώσεις

Θεωρίατηςασυντόνιστηςμηχανής (untuned engine) Οι GMMs στους οποίους έχουν ενσωματωθεί γονίδια ξένης για αυτούς προέλευσης παρουσιάζουν χαμηλή βιωσιμότητα και ανταγωνιστικότητα στο περιβάλλον λόγω του ότι τα ξένα γονίδια δεν θα αλληλεπιδρούν σωστά με το υπόλοιπο γονιδίωμα του GMMs αλλοιώνοντας την φυσιολογική ισορροπία και λειτουργία του κυττάρου Davies (1987) Science, 235: 1329-1335

Θεωρία της εξημέρωσης των οργανισμών (Domesticated species) H γενετική τροποποίηση οργανισμών είναι κάτι ανάλογο με την εξημέρωση άγριων οργανισμών...όπως η επιλογή μικροοργανισμών για την παραγωγή ψωμιού, κρασιού, αντιβιοτικών Η γενετική τροποποίηση οδηγεί στην παραγωγή GMMs που εξυπηρετούν τις ανάγκες του ανθρώπου σε βάρος των χαρακτηριστικών που βοηθούν ένα μικροοργανισμό να επιβιώνει και να προσαρμόζεται στο περιβάλλον Davies (1987) Science, 235: 1329-1335

H προσθήκη ξένων γονιδίων στους GMMs μπορεί να οδηγήσει και σε αύξηση της βιωσιμότητας και ανταγωνιστικότητας τους Άμεση εξάρτηση με το περιβάλλον στο οποίο γίνεται η ελευθέρωση του GMM Ένα βακτήριο που έχει τροποποιηθεί για την αυξημένη διάσπαση ενός ρύπου θα παρουσιάζει μειωμένη ανταγωνιστικότητα σε έδαφος απουσία του ρύπου αλλά αυξημένη ανταγωνιστικοτητα σε έδαφος παρουσία του ρύπου

Συμπέρασμα Οι GMMs δεν είναι πάντα και απαραίτητα λιγότερο βιώσιμοι και ανταγωνιστοί στο περιβάλλον από τους αντίστοιχους μη γενετικά τροποποιημένους μικροοργανισμούς

Το βασικό ερώτημα όμως είτε εξαλειφθεί o GMMs είτε όχι είναι άλλο... Πόσο σταθερό και μη μεταβιβάσιμο είναι το εξωγενές γενετικό υλικό που έχει ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του GMMs;

Γενετικές ανταλλαγές μεταξύ των μικροοργανισμών στο περιβάλλον είναι ένα φυσικό φαινόμενο και έχει παρατηρηθεί σε πολλές περιπτώσεις Διαφορά με τα περισσότερα φυτά και ζώα

Οι υποστηρικτές των GMMs θα έλεγαν «αφού γενετικές ανταλλαγές πραγματοποιούνται φυσικά στο περιβάλλον γιατί να αποτελεί πρόβλημα η ελευθέρωση GMMs» Οι πολέμιοι των GMMs θα υποστήριζαν φυσικά ότι «η φύση πραγματοποιεί μόνη τις συγκεκριμένες γενετικές ανταλλάγες (δεν είναι παρά φύσιν) ώστε ο δέκτης του γενετικού υλικού να αποκτήσει κάποιο γενετικό πλεονέκτημα στο περιβάλλον, να επιβιώσει καλύτερα»

Γενικοί κανόνες για τους GMMs Ι 1. Τα εισαγόμενα γονίδια είναι προτιμότερο να τοποθετούνται στο χρωμόσωμα των μικροοργανισμών και όχι σε εξωχρωμοσωμικό DNA όπως πλασμίδια με την μορφή των οποίων μπορεί να μεταφερθεί σε άλλα μέλη της μικροβιακής κοινότητας με ευκολία (εξαιρέσεις!!) 2. Γενετική τροποποίηση που οφείλεται σε αφαίρεση ή σίγηση ενός γονιδίου είναι συνήθως πιο ασφαλής από την προσθήκη γονιδίου στο γονιδίωμα ενός GMMs

Γενικοί κανόνες για τους GMMs ΙΙ 3. Από την στιγμή που θα απελευθερωθεί ένας GMM στο περιβάλλον δεν μπορούμε να είμαστε απόλυτα σίγουροι ότι τον εξαλείψαμε οποιοδήποτε μέτρο και να πάρουμε (διακοπή απελευθέρωσης, απολύμανση) 4. Ο GMMs είτε θα επιβιώσει και θα αποτελέσει μέλος της ενδογενούς μικροβιακής κοινότητας είτε δεν θα επιβιώσει αλλά πιθανόν το γενετικό του υλικό να έχει ήδη μεταφερθεί σε άλλα μέλη της μικροβιακής κοινότητας

Πως μπορούμε να περιορίσουμε την γενετική ρύπανση που μπορεί να προκληθεί από την ελευθέρωση GMMs; Ενσωμάτωση συστημάτων εξάρτησης πλασμιδίων (plasmid addiction system) Ενσωμάτωση συστημάτων αυτοκτονίας ή περιορισμού (containment systems) Βασικόστόχοέχουντοπεριορισμότουκινδύνου διασποράς GMMs ή του γενετικού τους υλικού στο περιβάλλον

Συστήματα εξάρτησης πλασμιδίων I Στοχεύουν στον ενεργοποιημένο θάνατο μικροοργανισμών που χάνουν τα πλασμίδια που περιέχουν κατά την διάρκεια του πολλαπλασιασμού τους και έχουν ως στόχο την εξάλειψη από τον μικροβιακό πληθυσμό βακτηρίων που δεν περιέχουν πλασμίδια

Συστήματα εξάρτησης πλασμιδίων I Βρίσκεται στο χρωμοσωμικό DNA και αποτελείται από: 1. Γονίδιο που ελέγχει την παραγωγή τοξίνης (killer gene) 2. Γονίδιο που ελέγχει την παραγωγή «αντιδότου» (antidote) που μπορεί να είναι πρωτείνη που παρεμποδίζει την μετάφραση του mrna της τοξίνης

Συστήματα εξάρτησης πλασμιδίων I Στηρίζεται στον διαφορετικό ρυθμό με τον οποίο αποδομούνται η τοξίνη και το αντίδοτο Ητοξίνη(killer protein) παράγεται σε υψηλότερες ποσότητες και διασπάται με βραδύτερους ρυθμούς Το αντίδοτο διασπάται ταχύτατα από πρωτεάσες Σε βακτήρια χωρίς πλασμίδια, η συγκέντρωση του αντιδότου μειώνεται ταχύτατα σε σχέση με την τοξίνη που παραμένει περισσότερο σταθερή και οδηγεί σε θάνατο του βακτηρίου

Ενσωμάτωση συστημάτων αυτοκτονίας ήπεριορισμού Στηρίζονται γενικά στην ενσωμάτωση συστημάτων γονιδίων killer antikiller στο γονιδίωμα GM βακτηρίων Η ενεργοποίηση και απενεργοποίηση των killer-antikiller γονιδίων είναι συνδεδεμένη με ρυθμιστές και προαγωγείς καταβολικών μεταβολικών μονοπατιών οργανικών ρύπων (υποκατεστημένα βενζοικά παράγωγα, πολυαρωματικοί υδρογονάνθρακες, πολυχλωριωμένα διφαινύλια)

Συστήματα αυτοκτονίας ή περιορισμού 1 Τα απαραίτητα συστατικά του συστήματος 1 είναι Ένα «killer gene» που παράγει τοξίνη θανατηφόρα για τον μικροοργανισμό Μια αλυσίδα ρυθμιστών που ελέγχουν την έκφραση του «killer gene» ως απόκριση στην απουσία ή παρουσία περιβαλλοντικών σημάτων

Ενσωμάτωση συστημάτων αυτοκτονίας ή περιορισμού 1 Παρουσία του ρύπου ο κατασταλτικός ρυθμιστής (repressor) αναστέλλει την έκφραση του killer gene και της τοξίνης με αποτέλεσμα να αναστέλλεται ο θάνατος του GMM

Ενσωμάτωση συστημάτων αυτοκτονίας ή περιορισμού 1 Με την ολοκλήρωση της διάσπασης του ρύπου δεν ενεργοποιείται ο κατασταλτικός ρυθμιστής του killer gene με αποτέλεσμα να παράγεται η τοξίνη που προκαλεί θανάτωση του μικροοργανισμού με το που ολοκληρωθεί η διάσπαση του ρύπου

Το σύστημα αυτό παρουσιάζει το πρόβλημα ότι η τοξίνη παράγεται μόνο όταν δεν υπάρχει στο περιβάλλον ο ρύπος συνεπώς δίνει τον απαραίτητο χρόνο στο σύστημα για να εμφανιστούν μεταλλάξεις στην ρύθμιση έκφρασης των γονιδίων Εμφάνιση GMMs που θα επιβιώσουν και είναι πιθανό να διασπείρουν το γενετικό τους υλικό

Συστήματα αυτοκτονίας ή περιορισμού 2 Το killer gene είναι συστατικό γονίδιο κατά συνέπεια η τοξίνη παράγεται συνεχώς ενώ το γονίδιο που κωδικοποιεί την παραγωγή του αντιδότου ρυθμίζεται θετικά από την παρουσία του ρύπου (ή τωνρύπων) στο περιβάλλον Παρουσία του ρύπου παράγεται το αντίδοτο και αναστέλεται η δράση της τοξίνης και ο θάνατος του GMMs

Ενσωμάτωση συστημάτων αυτοκτονίας ή περιορισμού 2 Με την ολοκλήρωση της διάσπασης του ρύπου δεν παράγεται το αντίδοτο και συνεπώς η συνεχής παραγωγή της τοξίνης οδηγεί στον θάνατο του GMMs

Ενσωμάτωση συστημάτων αυτοκτονίας ή περιορισμού 2 Το σύστημα αυτό παρουσιάζει το πλεονέκτημα ότι η παραγωγή της τοξίνης είναι συνεχής με αποτέλεσμα ο θάνατος των GMM απουσίατουρύπουναείναιάμεσοςώστε να μην υπάρχει χρόνος να αναπτυχθούν μεταλλάξεις που να οδηγήσουν σε GMM που να επιβιώνουν

Το παραπάνω σύστημα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την κατασκευή GMM που να χρησιμοποιηθούν για την απορρύπανση εδαφών από έναν ή περισσότερους ρύπους Στο σύστημα μπορούν να χρησιμοποιηθούν περισσότεροι του ενός προαγωγείς του γονιδίου antidote που παράλληλα είναι και προαγωγείς καταβολικών μονοπατιών για διάφορους ρύπους (Pm, Ptac) ώστε το σύστημα να αναγνωρίζει δύο ή τρεις ομάδες ρύπων (τολουόλιο, βενζοικά)

Σύστημα αυτοκτονίας ή περιορισμού 3 Δύο σετ killer antikiller genes ενσωματώνονται στο γενετικό υλικό των GMMs 1. Killer gene Α στο χρωμόσωμα antikiller gene Α σε πλασμίδιο 2. Killer gene Β σε πλασμίδιο antikiller gene Β σε χρωμόσωμα

Ενσωμάτωση συστημάτων αυτοκτονίας ή περιορισμού 3 Τα killer gene είναι συστατικά γονίδια που οδηγούν στην συνεχή παραγωγή τοξίνης ενώ τα antikiller genes βρίσκονται υπό την ρύθμιση του προαγωγέα διαφόρων καταβολικών μονοπατιών για οργανικούς ρύπους (χαμηλή εξειδίκευση)

Ενσωμάτωση συστημάτων αυτοκτονίας ή περιορισμού 3 Παρουσία του ρύπου, ενεργοποιείται η παραγωγή του αντιδότου από το antikiller gene με αποτέλεσμα την απενεργοποίηση της τοξίνης που παράγεται συνεχώς

Ενσωμάτωση συστημάτων αυτοκτονίας ή περιορισμού 3 Απουσία του ρύπου, δεν ενεργοποιείται η παραγωγή του αντιδότου από το antikiller gene με αποτέλεσμα την συσσώρευση της τοξίνης και τον ταχύτατο θάνατο του GMMs

Ενσωμάτωση συστημάτων αυτοκτονίας ή περιορισμού 3 Στην περίπτωση που ο GMM απωλέσει το πλασμίδιο που περιέχει τα γονίδια που ελέγχουν τον καταβολισμό ενός ρύπου μαζί με το σύστημα των killer antikiller genes???? Το βακτήριο που θα αποτελέσει τον αποδέκτη του πλασμιδίου θα πεθάνει λόγω της έκφρασης του killer gene που περιέχεται στο πλασμίδιο Περιορισμός του κίνδυνου διασποράς γενετικού υλικού από GMMs

Η ολοκλήρωση της διάσπασης του ρύπου συμπίπτει με την μείωση του πληθυσμού του GMM σε επίπεδα χαμηλότερα απότοόριοανίχνευσης

Ποιές διαδικασίες και πειραματικά δεδομένα απαιτούνται για την έγκριση χρήσης ένος GMMs Οι διαδικασίες αυτές περιγράφονται με λεπτομέρειες στην κοινοτική οδηγία 2001/18/ΕC Η οδηγία αυτή στηρίχτηκε σε προηγούμενες οδηγίες (90/220/EC) που αφορούσαν κυρίως διαδικασίες έγκρισης για την απελευθέρωση μικροοργανισμών μη γενετικά τροποποιημένων και επισημαίνει την αναγκαιότητα για πειραμάτα πεδίου

Πειράματα σε επίπεδο μικρόκοσμων Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων - ασφάλεια Πειράματα σε επίπεδο αγρού

Ποιά χαρακτηριστικά των GMMs ελέγχονται κυρίως; 1. Πιθανές επιδράσεις σε οργανισμούς μη-στόχους 2. Υπολειμματικότητα και παραμονή των GMMs στο περιβάλλον (Τι θέλουμε εμείς για ασφάλεια?) 3. Ικανότητα διασποράς των GMMs στο περιβάλλον 4. Πιθανές επιδράσεις στην μικροβιακή ποικιλότητα και στις λειτουργίες σε επίπεδο οικοσυστήματος 5. Πιθανότητα μεταβίβασης και διασποράς των εισαχθέντων γονιδίων σε άλλους μικροοργανισμούςμέλη της ενδογενούς μικροβιακής κοινότητας

1. Πιθανές επιδράσεις σε οργανισμούς μη-στόχους Εκτοπισμός πληθυσμού μικροοργανισμών μη-στόχων (ice minus?) Αλλεργιογόνο δράση σε ανθρώπους και άλλους ζωικούς οργανισμούς μη στόχους Τοξικότητα σε ανθρώπους και άλλους ζωικούς οργανισμούς μη στόχους Παθογένεση σε ανθρώπους και άλλους ζωικούς οργανισμούς μη στόχους

Μελέτη της επίδρασης GM Ps. Fluorescens στην λειτουργία της μικροβιακής κοινότητας στην ριζόσφαιρα φυτών μπιζελιού Φυτά μπιζελιού εμβολιάστηκαν με: 1. Aγρια στέλεχη του βακτηρίου P. fluorescens που παράγουν το αντιβιοτικό DAPG και χρησιμοποιείται στην καταπολέμηση φυτοπαθογόνων 2. GM στελέχη στα οποία έχει απενεργοποιηθεί η δυνατότητα παραγωγής DAPG

Αποτελέσματα ΗπαρουσίαGM P. fluorescens προκάλεσε σημαντική αύξηση στην δραστηριότητα των ενζύμων φωσφατάση, φωσφοδιεστεράση και άρυλ-σουλφατάση σε σχέση με το άγριο στέλεχος ΗπαρουσίαGM P. fluorescens προκάλεσε σημαντική μείωση στα ένζυμα β-γλυκοσιδάση, β-γαλακτοσιδάση και Ν-ακέτυλο γλυκοσαμινιδαση σε σχέση με το άγριο στέλεχος

Η ελευθέρωση GMMs μπορεί να προκαλέσει μεταβολή στην σύσταση αλλά και στην λειτουργία της μικροβιακής κοινότητας Ηεπίδρασηαυτή οφείλεται στην παρουσία του GMM Ηεπίδρασηαυτήοφείλεται στην μη παραγωγή αντιβιοτικού από τους GMM Επίδραση λογω αντιβιοτικού και όχι λόγω GMM

Μέθοδοι ανίχνευσης GMM στο περιβάλλον μετά την ελευθέρωση τους Απευθείας καταμέτρηση σε εκλεκτικά υποστρώματα Ανοσολογικές μέθοδοι (ELISA) Πρωτείνες δείκτες (gfp, lux συστήματα) Μοριακές βιολογικές μέθοδοι (ποσοτική PCR)

Παραδείγματα απελευθέρωσης γενετικά τροποποιημένων μικροοργανισμών από την πράξη

Agrobacterium radiobacter (No-Gall ) Άγρια στελέχη του βακτηρίου A. radiobacter είχαν την δυνατότητα να καταπολεμούν το βακτήριο A. tumefaciens που προκαλεί «καρκίνο» σε διάφορα καλλιεργούμενα φυτά παράγοντας ένα ισχυρό αντιβιοτικό (agrocin 84) η παραγωγή του οποίου ελέγχεται από πλασμιδιακό γονίδιο Το GM A. radiobacter είχε απωλέσει την ικανότητα του να μπορεί να μεταβιβάζει το πλασμίδιο σε άλλους μικροοργανισμούς στο περιβάλλον χρησιμοποιήθηκε ως εντομοκτόνο σε δενδρώδεις καλλιέργειες (Ασφαλές!!!!)

Pseudomonas fluorescens Ι Η Monsanto παρασκεύασε ένα GM στέλεχος του βακτηρίου P. fluorescens (ενισχύει την ανάπτυξη του φυτού) στο γονιδίωμα του οποίου είχαν ενσωματωθεί δύο γονίδια από το βακτήριo Ε. coli (laczy) για την ανίχνευση του μετά την ελευθέρωση Τα GM στελέχη ελευθερώθηκαν στην ριζόσφαιρα φυτών σιταριού και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το βακτήριο παρέμεινε στην ριζόσφαιρα των φυτών που εμβολιάστηκαν για 3 εβδομάδες και δεν υπήρξε μεταφορά γενετικού υλικού σε άλλα βακτηριακά είδη της ενδογενούς μικροβιακής κοινότητας στην ριζόσφαιρα

Pseudomonas fluorescens ΙΙ Η Monsanto παρασκεύασε ένα GM στέλεχος του βακτηρίου P. fluorescens στο γονιδίωμα του οποίου είχαν ενσωματωθεί τα cry γονίδια που ελέγχουν την παραγωγή της δ-ενδοτοξίνης του βακτηρίου B. thuringiensis