Ε Ν Θ Ε Τ Ο Π Ρ Ο Ϊ Ο Ν Τ Ω Ν

Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford, CT 06902 ΗΠΑ Τηλ.: +1 (203) 328-9500 ή (888) 329-0255, Φαξ: +1 (203) 328-9599 WWW.IMMUCOR.COM Η τεκμηρίωση και οι μεταφράσεις των προϊόντων υπάρχουν διαθέσιμες στον ιστότοπο: www.immucor.com MIA FORA NGS HLA Typing Kit Για διαγνωστική χρήση In vitro ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Ορισμός συμβόλων.. 1 Συλλογή δειγμάτων και προετοιμασία. 5 Αντιδραστήρια κατά αριθμό καταλόγου 2 Διαδικασία....... 5 Προοριζόμενη χρήση... 3 A. Παρεχόμενα υλικά 5 Περίληψη και εξήγηση....... 3 B. Απαιτούμενα, αλλά όχι παρεχόμενα υλικά. 5 Αρχές της διαδικασίας. 3 Οδηγίες χρήσης.... 5 Αντιδραστήρια... 3 Έλεγχος ποιότητας 12 A. Ταυτοποίηση.. 3 Περιορισμοί της διαδικασίας 12 B. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις. 3 Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης.. 13 Γ. Οδηγίες αποθήκευσης.. 4 Αντιμετώπιση προβλημάτων... 14 Δ. Καθαρισμός ή επεξεργασία που απαιτείται κατά τη χρήση.. Ε Ν Θ Ε Τ Ο Π Ρ Ο Ϊ Ο Ν Τ Ω Ν 4 Όρια έκθεσης... 15 Ε. Ενδείξεις αστάθειας.. 4 Πληροφορίες κατασκευαστή... 15 Απαιτήσεις εργαλείου.. 4 Χρησιμοποιούμενα σήματα κατατεθέντα.. 15 Ορισμός συμβόλων Κωδικός παρτίδας Αριθμός καταλόγου Περιορισμός θερμοκρασίας Χρήση μέχρι Σειριακός αριθμός SN Επαρκές για <n> δοκιμές Προσοχή Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Κατασκευαστής Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα Διαγνωστική ιατρική συσκευή In vitro Περιεχόμενα CONT Conformité Européene Σελίδα 1 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΤΑ ΑΡΙΘΜΟ ΚΑΤΑΛΟΓΟΥ MIA FORA NGS HLA Master Kit, αριθμός προϊόντος SR-800-10377 που αποτελείται από Κιτ αντιδραστηρίων τυπολόγησης MIA FORA NGS HLA (SR-800-10365) και Κιτ μαγνητικών σφαιριδίων (SR-800-10379). Κιτ αντιδραστηρίων τυπολόγησης MIA FORA NGS HLA (SR-800-10365): α) Αντιδραστήρια PCR: Αποτελούνται από εννιά (9) ατομικά φιαλίδια Αντιδραστήριο Αριθμός προϊόντος 1 Μίγμα HLA-A PCR SR 800 00326 2 Μίγμα HLA-B PCR SR 800 00327 3 Μίγμα HLA-C PCR SR 800 00328 4 Μίγμα HLA-DPA1 PCR SR 800 00329 5 Μίγμα HLA-DPB1 PCR SR 800 00330 6 Μίγμα HLA-DQA1 PCR SR 800 00331 7 Μίγμα HLA-DQB1 PCR SR 800 00332 Μίγμα HLA-DRB1-S 8 PCR Μίγμα HLA-DRB1-L 9 PCR SR-800-00333 SR-800-00334 Όγκος πλήρωσης Φύλαξη 450µL -20 έως -80 C 24 b) Αντιδραστήρια προετοιμασίας βιβλιοθήκης: Αποτελούνται από δώδεκα (12) ατομικά φιαλίδια Αντιδραστήριο Αριθμός προϊόντος Όγκος πλήρωσης 10 Ένζυμο κερματισμού SR-800-00335 67 µl 11 12 13 14 15 16 Ρυθμιστικό διάλυμα κερματισμού SR-800-00336 168 µl Ρυθμιστικό διάλυμα διακοπής SR-800-00337 225 µl Μίγμα ενζύμου τελικής αποκατάστασης SR-800-00338 34 µl Ρυθμιστικό διάλυμα τελικής αποκατάστασης SR-800-00339 168 µl Ουραίο ένζυμο σε σχήμα A SR-800-00340 17µL Ουραίο ρυθμιστικό διάλυμα σε σχήμα A SR-800-00341 118 µl 17 Ένζυμο λιγάσης SR-800-00342 34 µl 18 19 Ρυθμιστικό διάλυμα λιγάσης 2X SR-800-00343 917 µl Μίγμα ενζύμου/ρυθμιστικού SR-800-00344 84 µl διαλύματος PCR 20 Εκκινητές ενίσχυσης SR-800-00345 12 µl 21 Νερό χωρίς νουκλεϊνάση SR-800-00362 85 µl c) Πλακίδιο προσαρμογέα (SR-800-00349): Περιγραφή Πλακίδιο προσαρμογέων δείκτη Τρεις συμπληρωμένες στήλες πλακιδίου 96 φρεατίων Αριθμός σωμ. Όγκος πλήρωσης Φύλαξη -20 έως -80 C Φύλαξη SR-800-00349 5 µl/φρεάτιο -20 έως -80 C 24 Κιτ μαγνητικών σφαιριδίων (SR-800-10379): α) Μαγνητικά σφαιρίδια: Αποτελούνται από ένα (1) φιαλίδιο Περιγραφή Πληρωμένο φιαλίδιο, Agencourt AMPure Σφαιρίδιο XP Αριθμός σωμ. Όγκος πλήρωσης Φύλαξη SR-800-00378 5mL 2 έως 8 Σελίδα 2 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το κιτ τυπολόγησης MIA FORATM NGS HLA προορίζεται για ενίσχυση και προσδιορισμό αλληλουχίας των γονιδίων HLA -A, -B, -C, -DRB-1/3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1 και -DPB1 στην πλατφόρμα προσδιορισμού αλληλουχία φωτισμένων NGS. Το λογισμικό MIA FORA προορίζεται για χρήση ως οδηγός για τον καθορισμό τύπου HLA από τα δεδομένα που παράγονται,ε το κιτ βιβλιοθήκης MIA FORA NGS HLA. Η δοκιμή προορίζεται για χρήση σε εργαστήριο εξειδικευμένο στον χειρισμό DNA για ενίσχυση και προσδιορισμό αλληλουχίας. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΞΗΓΗΣΗ Η Αλληλουχία που βασίζεται στην τυπολόγηση ενισχυμένων εξονίων PCR των γονιδίων HLA είναι μια κοινή εργαστηριακή διαδικασία. Η ενίσχυση PCR χρησιμοποιείται για τον εμπλουτισμό στοχευμένων αλληλουχιών και η επακόλουθη τυπολόγηση HLA καθορίζεται για τις επιλεγμένες περιοχές. Άλλες μέθοδοι όπως ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές σημασμένους αλληλουχίας (SSOP), δοκιμές εκκινητών σημασμένες αλληλουχίας (SSP) χρησιμοποιούνται επίσης για τον καθορισμό τυπολόγησης HLA. Το σύστημα τυπολόγησης MIA FORA NGS HLA είναι νέα μεθοδολογία τυπολόγησης HLA που χρησιμοποιεί την ικανότητα να εντυπώσει όλες τις σχετικές περιοχές των θέσεων HLA κατά μεγάλο εύρος PCR. Εννιά κύρια μίγματα PCR που περιέχουν όλα τα απαραίτητα συστατικά για την ενίσχυση κάθε γονιδίου, στα οποία συμπεριλαμβάνονται ένζυμα, ρυθμιστικά διαλύματα, dntp (δεοξυριβονουκλεοζίτες 5'-τριφωσφορικά) και εκκινητές για μεγάλο εύρος ενίσχυσης PCR παρέχονται στο κιτ. Το ενισχυμένο DNA μπορεί να επεξεργαστεί χρησιμοποιώντας το κιτ βιβλιοθήκης MIA FORA NGS HLA για την παραγωγή βιβλιοθήκης DNA για τον προσδιορισμό αλληλουχίας στην φωτισμένη πλατφόρμα προσδιορισμού αλληλουχίας. Το κιτ επιτρέπει έως και 24 δείγματα προς προσδιορισμό αλληλουχίας μέσω πολλαπλών διαύλων χρησιμοποιώντας πλατφόρμα προσδιορισμού αλληλουχίας φωτισμένη. ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το κιτ τυπολόγησης MIA FORA NGS HLA σχεδιάστηκε για τον καθορισμό τυπολόγησης θέσεων HLA Τάξης I και Τάξης II HLA από προσδιορισμό αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδίου ή τα πιο πληροφοριακά αξόνια και ιντρόνια. Το κιτ τυπολόγησης MIA FORA NGS HLA χρησιμοποιεί μεγάλο εύρος PCR για την τυπολόγηση και εμπλουτισμό γονιδίων HLA, HLA -A, -B, -C, -DQA1, -DQB1, -DPA1 DPB1 και DRB1/3/4/5. Το κιτ αντιδραστηρίων προετοιμασίας βιβλιοθήκης MIA FORA NGS παράγει μια βιβλιοθήκη από το ενισχυμένο DNA για τον προσδιορισμό αλληλουχίας στην πλατφόρμα προσδιορισμού αλληλουχίας φωτισμένης. Το λογισμικό τυπολόγησης MIA FORA NGS HLA παρέχει την αλληλουχία των σχετικών γονιδίων HLA και πληροφοριών φάσης για την επίτευξη τυπολόγησης HLA υψηλής ανάλυσης. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ A. A. Ταυτοποίηση Ανατρέξτε στους πίνακες στην ενότητα Αντιδραστήρια κατά Αρ. καταλόγου για ολόκληρο τον κατάλογο προϊόντων και αρ. καταλόγου. B. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις 1. Για χρήση διαγνωστικών In Vitro μόνο εντός Ευρωπαϊκής Ένωσης. 2. Τα αποτελέσματα από αυτά τα κιτ δεν προορίζονται για χρήση ως μοναδική βάση επάνω στην οποία πραγματοποιείται μια κλινική απόφαση η οποία επηρεάζει τον ασθενή 3. Ξεχωριστά εργαστήρια ή κλειστοί χώροι εργαστηρίων θα πρέπει να προσδιορίζονται για τους χειρισμούς Pre-PCR καθώς και για τους χειρισμούς Post-PCR. 4. Ξεχωριστές πιπέτες θα πρέπει να προσδιορίζονται για τους χειρισμούς Pre-PCR καθώς και για τους χειρισμούς Post-PCR. 5. Βιοκίνδυνος: Όλα τα βιολογικά δείγματα και όλα τα δείγματα αίματος θα πρέπει να θεωρούνται ως δυνητικά μολυσμένα. Χρησιμοποιείτε τις Γενικές προφυλάξεις κατά τον χειρισμό. 6. Μην χρησιμοποιείτε ποτέ την πιπέτα με το στόμα. Αποφύγετε την επαφή των αντιδραστηρίων και των δειγμάτων με το δέρμα και τις βλεννώδεις μεμβράνες 7. Απορρίψτε τα χρησιμοποιημένα υλικά σύμφωνα με τους τοπικούς κανονισμούς και/ή τους κανονισμούς του ινστιτούτου για απόρριψη πιθανώς βιο-επικίνδυνων υλικών. 8. Η τεχνολογία PCR είναι ευπαθής σε μόλυνση, ιδιαίτερα από τα ίδια της τα προϊόντα. Οι εκνεφώσεις αμπλικονίων PCR που παράγονται κατά τα βήματα post-pcr αποτελούν συχνή πηγή μόλυνσης. Επομένως, θα πρέπει να ληφθούν μέτρα για την αποφυγή υπερβολικού πιτσιλίσματος και παραγωγής εκνεφώσεων. Τα πρότυπα εργαστηριακά μέτρα PCR που περιλαμβάνουν το σκούπισμα των επιφανειών εργασίας με διάλυμα που περιέχει 10% χλωρίνη που έχει παρασκευαστεί πρόσφατα πριν από την επεξεργασία ή την προετοιμασία δειγμάτων PCR με μια προσφάτως ανοιγμένη χλωρίνη τάξεως του 10%, η χρήση υπεριώδους φωτός (UV) σε καλυμμένους θαλάμους ή θαλάμους βιο-ασφάλειας ενδιάμεσα από τη χρήση, τον διαχωρισμό χώρου και χρόνου των πριν και μετά δραστηριοτήτων PCR, η χρήση κατάλληλων ποσοτήτων αντιδραστηρίων PCR, η χρήση θετικών και αρνητικών μαρτύρων, κ.λπ. θα πρέπει επίσης να τηρούνται κατά τη διάρκεια της χρήσης του κιτ. Χρήση συνεχούς, προσεκτικής τεχνικής συζευγμένης με ελεύθερη ενσωμάτωση παρακολούθηση των μαρτύρων θα διασφαλίσει μια προορατική προσέγγιση σε εγρήγορση για τον έλεγχο και την παρακολούθηση μόλυνσης PCR. 9. Τα εργαστήρια θα πρέπει να αξιολογούν τις δικές τους διαδικασίες καθαρισμού. 10. Η μόλυνση των αντιδραστηρίων ή δειγμάτων ενδέχεται να οδηγήσουν σε εσφαλμένα αποτελέσματα. Επομένως, θα πρέπει να ληφθούν μέτρα για την αποφυγή μόλυνσης αυτού του προϊόντος κατά τη χρήση. Μην χρησιμοποιείτε μολυσμένα αντιδραστήρια. 11. Χρησιμοποιήστε τα υγρά κιτ όπως παρέχονται. Το διάλυμα ή η μετατροπή ενδέχεται να οδηγήσουν σε εσφαλμένα αποτελέσματα. Μην αναμιγνύεται αντιδραστήρια ανάμεσα σε διαφορετικές παρτίδες. Σελίδα 3 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

12. Μην χρησιμοποιείτε φιαλίδια με διαρροή ή χωρίς ετικέτα. 13. Προηγουμένως παγωμένα δείγματα ή αντιδραστήρια θα πρέπει να αναμιγνύονται καλά και έπειτα να πραγματοποιούν φυγοκέντρηση μετά την απόψυξη πριν από τη δοκιμή. Αποφύγετε την παραγωγή αφρού και φυσαλίδων στα δείγματα. 14. Διατηρείτε όλα τα ένζυμα και τα βασικά μίγματα σε πάγο ή κρυοστάτη (2-8 C) κατά την απόψυξη. 15. Βεβαιωθείτε για τη σωστή στεγανοποίηση του σωληναρίου δειγμάτων πριν από την ενίσχυση για την αποφυγή ατμοποίησης. 16. Λόγω των εγγενών διαφορών στους μηχανισμούς της απόδοσης του θερμικού κύκλου, μπορεί να παρουσιαστεί ποικιλία σε αποτελέσματα όταν τα ρυθμισμένα θερμικά προφίλ μεταφέρονται ανάμεσα σε διαφορετικές κατασκευές και μοντέλα των εργαλείων θερμοκυκλοποιητή. Σε ορισμένες περιπτώσεις, είναι πιθανός ο συμβιβασμός της ειδικότητας και της ευαισθησίας των αντιδράσεων, γεγονός που οδηγεί σε εσφαλμένη ερμηνεία και αναφορά των δεδομένων. Οι τροποποιημένοι θερμοκυκλοποιητές και προφίλ πρέπει να αξιολογούνται από τον χρήστη. 17. Οι διαφορετικοί χρόνοι ή οι θερμοκρασίες επώασης από εκείνους που έχουν οριστεί ενδέχεται να οδηγήσουν σε εσφαλμένα αποτελέσματα. 18. Η απόκλιση από τις προτεινόμενες οδηγίες για χρήση ενδέχεται να οδηγήσει σε μικρότερη από την καλύτερη δυνατή απόδοση του προϊόντος. Ανάλογα με τη φύση και τη σοβαρότητα της απόκλισης ενδέχεται να παρουσιαστούν αποτυχημένοι προσδιορισμοί (μεμονωμένο δείγμα καθώς και τωρινές αποτυχίες) και/ή εσφαλμένα αποτελέσματα. Για παράδειγμα, έχουμε καθορίσει ότι η χρήση ανεπαρκούς/ανενεργού καθαρισμού σφαιριδίων στον προσδιορισμό ενδέχεται να οδηγήσει σε συχνές ειδοποιήσεις παρουσίασης ζημιάς σχετικά με τους προσαρμογείς δεικτών. 19. Συνιστάται να χρησιμοποιείτε ηλεκτροφόρηση γέλης για την ανάλυση προϊόντων ενίσχυσης γονιδίων HLA κατά μέγεθος. Τα προϊόντα PCR θα πρέπει να οπτικοποιούνται με αιθίδιο βρωμίδιο ή κόκκινη γέλη. Οι άλλες βαφές ενδέχεται να εμφανίζουν αδύναμες ζώνες. 20. Τα μαγνητικά σφαιρίδια χρησιμοποιούνται σε διάφορα βήματα του πρωτοκόλλου. Είναι σημαντικό να αφαιρεθεί η αιθανόλη πριν προχωρήσετε στο βήμα της έκλουσης χωρίς να επιτρέψετε στα σφαιρίδια να στεγνώσουν υπερβολικά. Η επιφάνεια των μαγνητικών σφαιριδίων θα πρέπει να φαίνεται γυαλιστερή χωρίς ορατά σημεία με συγκεντρωμένο υγρό. Ο κατάλληλος χρόνος στεγνώματος μπορεί να καθοριστεί εμπειρικά σε κάθε εργαστηριακό περιβάλλον (περίπου 5-10 λεπτά). 21. Χρησιμοποιήστε προσφάτως αραιωμένη αιθανόλη περιεκτικότητας 80% για τον καθαρισμό κάθε σφαιριδίου. 22. Μετά από τον καθαρισμό του κάθε σφαιριδίου υπάρχει ένα ασφαλές σημείο σταματήματος κατά το οποίο τα δείγματα ή η βιβλιοθήκη μπορεί να αποθηκευθεί στους -20 C για διάστημα έως και 4 ημέρες. 23. Προστατεύστε τα πλακίδια PicoGreen από φως προς αποφυγή της λεύκανσης. 24. Είναι ουσιαστικής σημασίας ότι η αντίδραση κερματισμού δεν υπερβαίνει τα 20 λεπτά και ο καθαρισμός εκείνου του σφαιριδίου πρέπει να εκτελεστεί αμέσως ώστε να διασφαλιστεί το σωστό εύρος του μεγέθους κερματισμού. 25. Το ουραίο πλακίδιο σχήματος A πρέπει να περάσει απευθείας στο βήμα σύνδεσης προσαρμογέα. 26. Κατά την προετοιμασία του πλακιδίου σύνδεσης, χρησιμοποιήστε καινούργια γάντια κατά τον χειρισμό του πλακιδίου προσαρμογέα. Προσεκτικά αφαιρέστε τη στεγανοποίηση του πλακιδίου. Επαληθεύστε ότι όλα τα φρεάτια στις στήλες 1, 2 και 3 περιέχουν διάλυμα περίπου 5 µl. 27. Η ενισχυμένη βιβλιοθήκη θα πρέπει να καθαριστεί εντός 1 ώρας ενίσχυσης. 28. Τα βήματα της βιβλιοθήκης για την μετά-ενίσχυση θα πρέπει να εκτελούνται σε δωμάτιο αλληλουχίας ή σε κουτί AirClean PCR με σκοπό την αποφυγή μόλυνσης του DNA με σύνδεση του προσαρμογέα δείκτη με τελικά προϊόντα που περιέχουν τις αλληλουχίες συστάδων Illumina. 29. Η προετοιμασία για ποσοτικοποίηση βιβλιοθηκών κατά qpcr πρέπει να πραγματοποιηθεί σε κουκούλα PCR και με φρέσκο ρυθμιστικό διάλυμα προς αποφυγή μόλυνσης. 30. Πραγματοποιήστε μετουσίωση δείγματος MiSeq με φρέσκο υδροξείδιο του νατρίου 0.2N 31. Πραγματοποιείτε όλες τις πλύσεις μετά τη λειτουργία και τη συντήρηση και τον συχνό καθαρισμό. C. Οδηγίες αποθήκευσης 1. Φυλάξτε το κιτ τυπολόγησης MIA FORA NGS HLA σε θερμοκρασία κάτω από -20ºC σε καταψύκτη με δυνατότητα χειροκίνητης απόψυξης. 2. Μην χρησιμοποιείτε εξαρτήματα μετά το πέρας της ημερομηνίας λήξης τους. 3. Να αποθηκεύετε τα μαγνητικά σφαιρίδια 2 C έως 8 C. D. Καθαρισμός ή επεξεργασία που απαιτείται για τη χρήση Ανατρέξτε στην ενότητα «Συλλογή δειγμάτων και προετοιμασία.» E. Ενδείξεις αστάθειας 1. Αν έχει δημιουργηθεί ίζημα από άλατα εκτός διαλύματος κατά την αποστολή ή την αποθήκευση, διαλυτοποιήστε ξανά εντελώς πριν από τη χρήση με περιδίνησησε θερμοκρασία δωματίου (18 έως 30 C). ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΕΡΓΑΛΕΙΟΥ 1. Θερμοκυκλοποιητής εξοπλισμένος με θερμαινόμενο καπάκι, ρυθμιζόμενους χρόνους διάκλισης και ελάχιστο θερμικό εύρος από 2 C έως 100 C και ακρίβεια τουλάχιστον +/- 0,5 C. Οι συνθήκες για τους θερμοκυκλοποιητές ίσως χρειαστεί να μεταποιηθούν με σκοπό τη βελτίωση των προφίλ. Ο θερμοκυκλοποιητής Veriti από την Applied Biosystems, όταν εκτελείται σε προεπιλεγμένη λειτουργία με τον ρυθμό διάκλισης (3,9ΊC/sec), έχει επικυρωθεί. 2. Κατάλληλη συσκευή ανάγνωσης φθοριζόντων πλακιδίων με φίλτρο διέγερσης ~ 485 nm και φίλτρο εκπομπών ~535 nm για μέτρηση συγκέντρωσης DNA όπως Victor X2, X3 έχει επικυρωθεί. 3. Κατάλληλη μέθοδος/εκχύλιση για την απομόνωση και καθαρισμό των τμημάτων DNA των περίπου 400-500 βασικών ζευγών σε μέγεθος. Ένα εργαλείο εκχύλισης επιλογής τέτοιου μεγέθους Pippin Prep TM έχει επικυρωθεί. 4. Προαιρετικό σύστημα χειρισμού υγρών για ημιαυτόματη κατασκευή βιβλιοθήκης. Ένα τέτοιο σύστημα Biomek 4000 έχει επικυρωθεί. 5. Πλατφόρμα αλληλούχησης illumina όπως το εργαλείο MiSeq έχει επικυρωθεί. 6. Διακομιστής και λογισμικό MIA FORA NGS: Αρ. προϊόντος Immucor SR-790-00017. Σελίδα 4 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ Το ανθρώπινο γενομικό DNA μπορεί να καθαριστεί από πλακούντες ολικού αίματος και λευκές στιβάδες χρησιμοποιώντας μια επικυρωμένη μέθοδο που πληροί τα κριτήρια παρακάτω. DNA που έχει εξαχθεί από αίμα διατηρημένο σε EDTA έχει ελεγχθεί και παρουσιάζεται σε εμφανιζόμενη αναμενόμενη απόδοση σε αυτόν τον προσδιορισμό. DNA που έχει εξαχθεί από αίμα διατηρημένο σε ηπαρίνη δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε αυτόν τον προσδιορισμό. Το απομονωμένο DNA θα πρέπει να είναι σε 10 mm TRIS-HCI, ph 8,0-9.0, ή σε νερό χωρίς νουκλεϊνάση. Αν υπάρχει ένας χηλικός παράγοντας όπως EDTA, η τελική συγκέντρωση του χηλικού παράγοντα δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα 0,5 mm. Η τελική συγκέντρωση DNA θα είναι από 5 έως 15 ng/µl. Τα μέτρα απορρόφησης του δείγματος DNA στα 260 και 280nm θα πρέπει να έχουν λόγο 165 έως 2,0. Το DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί αμέσως μετά την απομόνωση ή την αποθήκευση στους 20ΊC για τουλάχιστον 1 έτος. Η επαναλαμβανόμενη ψύξη/απόψυξη θα πρέπει να αποφεύγεται εφόσον αυτό μπορεί να οδηγήσει σε αποδόμηση του DNA. Τουλάχιστον 50% των γενομικών δειγμάτων DNA πρέπει να έχουν τμήματα μεγαλύτερα από 10 kb για επιτυχημένη ενίσχυση PCR μεγάλου εύρους. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ A. Παρεχόμενα υλικά (Ανατρέξτε στον πίνακα Αντιδραστήρια στην ενότητα Αριθμός καταλόγου για συγκεκριμένες πληροφορίες) Αντιδραστήρια PCR Αντιδραστήρια για προετοιμασία βιβλιοθήκης, πλακιδίου προσαρμογέων δείκτη, μαγνητικά σφαιρίδια Ampure B. Υλικά, αντιδραστήρια και εξοπλισμός: Απαιτούμενα αλλά όχι παρεχόμενα Θερμοκυκλοποιητές: Ο θερμοκυκλοποιητής ABI Veriti επικυρώθηκε Μαγνητικές θήκες για έκλουσης μικρού όγκου σε πλακίδια 96 φρεατίων: Το Alpaqua Magnum FLX έχει επικυρωθεί Μαγνητική θήκη για μαγνητικό διαχωρισμό μικροφυγοκεντρικών σωληναρίων: Ο μαγνήτης DynaMag-2 έχει επικυρωθεί Συσκευή φυγοκέντρησης πλακών επιφάνειας εργασίας και συσκευή φυγοκέντρησης σωληναρίων Πιπέτες, πολυκαναλικές πιπέτες και άκρα (1-20µL, 20-200µL, 1000µL) Κολλητικές ταινίες για πλακίδια PCR. Το κολλητικό φιλμ PCR Accuseal (E & K Scientific αριθ. καταλ. T796150, 4titude αριθ. καταλ. 4ti-0500) έχει επικυρωθεί Φυγοκεντρικά σωληνάρια 1,5mL και σωληνάρια ταινιών PCR Μηχανικός αναδευτήρας (Vortex) Σκληρές- Πλήρους ύψους πλακίδια με ημιπλαίσιο, 96 φρεατίων (E & K Scientific αριθ. καταλ. EK-75012, 4titude αριθ. καταλ. 4ti- 0770/C) Πλακίδιο 96 φρεατίων PP Μαύρη, τύπου καμινάδας πάτου v (E & K Scientific αριθ. καταλ. 21209, Greiner Bio-One αριθ. καταλ.651209) Πλακίδιο αντίδρασης MicroAmp Optical 96 φρεατίων (ThermoFisher Αριθ. καταλ. N8010560) Οπτική ταινία στεγανοποίησης MicroAmp, προηγμένη κόλληση (E & K Scientific αριθ. καταλ. T796400, ThermoFisher αριθ. καταλ. 4311971) Δεξαμενές αντιδραστηρίων Διάφανα επιθέματα ταινίας στεγανοποίησης Ταινία σφράγισης αλουμινίου Χαρτί φακού Ρύγχη πιπέτας μιας χρήσης με φίλτρο (ανθεκτικά στον ψεκασμό) που καλύπτουν το εύρος 0,1μL έως 1000 μl Αιθανόλη Βαθμός μοριακής βιολογίας 200 proof 10mM Tris-HCl ph 8,0 100% Tween 20 Υδροξείδιο του νατρίου,1n Νερό χωρίς νουκλεϊνάση 1,5% Αγαρόζη, χωρίς χρώμα, εσωτερικά πρότυπα, Pippin Prep TM, 250 bp -1,5kb, (Sage Science, CDF1510) PhiX Control, v3 (Illumina αριθ. καταλ. FC-110-3001) Αντιδραστήρια για καθορισμό συγκέντρωσης φθορίζοντος DNA: Το κιτ προσδιορισμού : Quant-iT Picogreen dsdna έχει επικυρωθεί Κιτ κύκλου MiSeq V2 300 (Illumina αριθ. καταλ. MS102-2002) Ακριβές μέθοδος/κιτ ποσοτικοποίησης βιβλιοθήκης: Το κιτ ποσοτικοποίησης βιβλιοθήκης KAPA έχει επικυρωθεί ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Η επεξεργασία του προσδιορισμού μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας ένα μη αυτόματο πρωτόκολλο που περιγράφεται παρακάτω ή με ένα αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο χρησιμοποιώντας έναν διαχειριστή υγρών. Λεπτομέρειες για το πρωτόκολλο αυτοματοποίησης χρησιμοποιώντας Biomek 4000 και μη αυτόματα πρωτόκολλα προσδιορισμού θα βρείτε διαθέσιμα στον δικό σας Ειδικό πωλήσεων ή Τεχνικής υποστήριξης της Immucor. ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ: Να είστε εξαιρετικά προσεκτικοί κατά τη διαδικασία κλασματοποίησης. Χρησιμοποιήστε βαθμονομημένες πιπέτες. Η μη τήρηση αυτών των ενεργειών ενδέχεται να οδηγήσει σε απώλεια αντιδραστηρίων και προσδιορισμού. Όλες οι θερμοκρασίες πρέπει να διατηρούνται με ακρίβεια. Φροντίστε ώστε τα μαγνητικά σφαιρίδια να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση. Σελίδα 5 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

Το ενισχυμένο προϊόν μπορεί να αποθηκευτεί πριν από τη χρήση έως και 4 ημέρες -20ºC. Η ψύξη και η απόψυξη του ενισχυμένου προϊόντος γίνονται μόνο μία φορά. Η επαναλαμβανόμενη ψύξη και απόψυξη ενδέχεται να οδηγήσει σε αποδόμηση του ενισχυμένου προϊόντος και ενδεχομένως να φέρει αρνητικά αποτελέσματα αν χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία βιβλιοθήκης. A. Καθαρισμός γενομικού DNA Καθαρίστε το γενομικό DNA χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της επιλογής σας. Οι απαιτήσεις του δείγματος DNA είναι οι εξής: Τα δείγματα γενομικού DNA πρέπει να εξάγονται από πλακούντες ολικού αίματος και λευκές στιβάδες χρησιμοποιώντας μέθοδο εξαγωγής DNA η οποία μπορεί να δημιουργήσει DNA υψηλού μοριακού βάρους. Το DNA πρέπει να διαλυθεί σε νερό χωρίς νουκλεϊνάση και να αποθηκευθεί στους -20 o C ή πιο κάτω. Η τελική συγκέντρωση DNA θα πρέπει να είναι μεταξύ 5-15 ng/µl, διατηρώντας όλα τα δείγματα σε παρόμοιες συγκεντρώσεις. Προσαρμόστε, αν απαιτείται, με νερό χωρίς νουκλεϊνάση. Τουλάχιστον το 50% των εξαγχθέντων τμημάτων του γενομικού DNA θα πρέπει να είναι 10 Kb ή περισσότερο σε μέγεθος για επιτυχημένο μεγάλο εύρος PCR. B. Ενίσχυση DNA (PCR) Ρύθμιση PCR 1. Συμπληρώστε το Αρχείο γραμμικών κωδικών δειγμάτων (ένα αρχείο CSV Windows με διαχωρισμό με κόμμα) με ονόματα δειγμάτων και γραμμικούς κωδικούς εργασιών όπως φαίνεται στην Εικόνα 1. Εικόνα 1. Παράδειγμα Αρχείου γραμμικών κωδικών δειγμάτων 2. Δημιουργήστε ένα έργο στο λογισμικό MIA FORA αφού δημιουργήσετε ένα αρχείο γραμμικών κωδικών δειγμάτων με τα ονόματα δειγμάτων και τους γραμμικούς κωδικούς. Αυτό το όνομα έργου απαιτείται για το όνομα εκτέλεσης MiSeq. 3. Τοποθετήστε ετικέτες σε σκληρές- πλήρους ύψους πλακιδίων με ημιπλαίσιο, 96 φρεατίων. 4. Προετοιμάστε ένα πλακίδιο δείγματος με 100 µl γενομικού DNA ανά φρεάτιο για κάθε δείγμα σε συγκέντρωση 5-15 ng/µl διαλυμένο σε νερό χωρίς νουκλεϊνάση. Το πλακίδιο δείγματος θα πρέπει να έχει οργανωθεί στις στήλες 1, 2 και 3 του πλακιδίου 96 φρεατίων όπως φαίνεται στο πλακίδιο δειγμάτων στην Εικόνα 2. Το φρεάτιο A1 θα πρέπει να είναι ο αρνητικός μάρτυρας (NTC) 10mM Tris-HCl ph 8,0 που δεν περιέχει DNA, και ακολουθεί το δείγμα 1 στο B1, το δείγμα 2 στο C1 και συνεχίστε έως το δείγμα 23 στο H3 (Εικόνα 2, ΠΛΑΚΙΔΙΟ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ). 5. Αποψύξτε τα κύρια δείγματα PCR (P1-P9), αναμίξτε με αναστροφή ή με ελαφριά ανάδευση και περιδίνηση προς τα κάτω. 6. Πραγματοποιήστε φυγοκέντρηση του πλακιδίου δείγματος από το βήμα 4 σε φυγόκεντρο με υποδοχέα πλακιδίου για 2 λεπτά, για να διασφαλίσετε ότι το γενομικό DNA βρίσκεται στον πάτο του φρεατίου. 7. Διανέμετε 15 µl από PCR δειγμάτων P1-P9 σε στήλες 1-9 σε κάθε μία από τα τρία σκληρού κέλυφους πλακίδια PCR 96 φρεατίων με ημιπλαίσιο ώστε κάθε φρεάτιο σε μια στήλη να διαθέτει το ίδιο μίγμα PCR (Σχήμα 2). 8. Διανέμετε προσεκτικά για να αποφύγετε τις φυσαλίδες στο κύριο μίγμα PCR. 9. Διανέμετε τα δείγματα από το πλακίδιο δειγμάτων με πολυκαναλική πιπέτα ως εξής (Σχήμα 2): Στήλη 1 από πλακίδιο δείγματος: 10µL από NTC και δείγματα 1-7 στη στήλη 1 (A1-H1) σε καθεμία από τις εννιά στήλες PCR Plate1. Στήλη 1 από πλακίδιο δείγματος: 10µL από δείγματα 8-15 στη στήλη 2 (A2-H2) σε καθεμία από τις εννιά στήλες PCR Plate 2. Στήλη 1 από πλακίδιο δείγματος: 10µL από δείγματα 16-23 στη στήλη 3 (A3-H3) σε καθεμία από τις εννιά στήλες PCR Plate 3. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: τα δείγματα πρέπει να αναμιγνύονται απαλά για να αποφύγετε τις φυσαλίδες στο κύριο μίγμα PCR όπως φαίνεται στο Σχήμα 2. 10. Σφραγίστε τα πλακίδια PCR με κολλητικό φιλμ PCR. Πραγματοποιήστε σύντομη φυγοκέντρηση των πλακών PCR, τοποθετήστε σε 3 ξεχωριστούς θερμοκυκλοποιητές και εκτελέστε το πρόγραμμα MIA FORA HLA_PCR χρησιμοποιώντας τη ρύθμιση για θερμαινόμενο καπάκι, ανατρέξτε στον Πίνακα 1. ΣΗΜΕΙΟ ΑΣΦΑΛΟΥΣ ΔΙΑΚΟΠΗΣ Τα προϊόντα PCR μπορούν να αποθηκεύονται στους -20ºC έως 4 ημέρες έως ότου να είναι έτοιμα για το βήμα γονιδιακής ισορροπίας. Σελίδα 6 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

Σχήμα 2. Οργάνωση δειγμάτων και ρύθμιση PCR Πίνακας 1. Συνθήκες θερμοκυκλοποιητή για ενίσχυση Κύκλοι (15) Κύκλοι (20) Αρχική Μετουσίωση Επιφλόγιση επέκταση Μετουσίωση Επιφλόγιση Επέκταση Τελική Συγκράτηση συγκράτηση επέκταση 94 0 C /30s 94 0 C /1:15m 60 0 C /30s 66 0 C /7:30m 94 0 C /30s 60 0 C /30s 66 0 C /7:30m 66 0 C/10m 4 0 C/ 11. Προαιρετικά: Η ενίσχυση πρέπει να επαληθευτεί με την εκτέλεση μερικών αντιπροσωπευτικών δειγμάτων σε γέλη αγαρόζης 0,8% που περιέχει αιθίδιο βρωμίδιο ή κόκκινη γέλη. Η ηλεκτροφόρηση θα πρέπει να διεξάγεται στα 90 βολτ για 40 λεπτά. Τα τμήματα PCR ενδέχεται να ποικίλλουν μεταξύ των δειγμάτων λόγω διαφορών σε ιντρόνια. Τα παρόμοια μεγέθη για τα προϊόντα PCR φαίνονται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2: Μεγέθη προϊόντων ενίσχυσης Θέση HLA Μέγεθος (kb) HLA-A 3.2 HLA-B 4.1 HLA-C 4.4 HLA-DPA 5.0 HLA-DPB 5.2 HLA-DQA 5.8 HLA-DQB 6.3 HLA-DRB1 0.9 HLA-DRB2 5.6 Σελίδα 7 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

C. Ισορροπία και συσσώρευση προϊόντων PCR Η συγκέντρωση κάθε προϊόντος PCR μπορεί να καθοριστεί χρησιμοποιώντας ένα κατάλληλο αντιδραστήριο ποσοτικοποίησης φθορίζοντος DNA, όπως PicoGreen. Με βάση τις μετρήσεις φθορισμού, τα προϊόντα PCR από όλες τις εννιά αντιδράσεις PCR για κάθε δείγμα ισορροπούν και συσσωρεύονται σύμφωνα με την έξοδο από SironaQuant TM, διατίθεται στο σύστημα MIA FORA NGS HLA. Τότε γίνεται ο καθαρισμός των συσσωρευμένων δειγμάτων στην προετοιμασία για κερματισμό. Ισορροπία και συσσώρευση Σχήμα 3. Ρύθμιση προσδιορισμού PicoGreen 1. Προσδιορίστε την ποσότητα των προϊόντων PCR χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο PicoGreen : Φέρτε το αντιδραστήριο PicoGreen σε θερμοκρασία δωματίου και αραιώστε με διάλυμα 1X TE (50µL PicoGreen + 7450µL 1xTE). Αναδεύστε για ανάμιξη και προστατεύστε από το φως μέχρι τη χρήση. Σημείωση: Τηρήστε το ένθετο των προϊόντων των αντιδραστηρίων αν άλλα αντιδραστήρια χρησιμοποιούνται για ποσοτικοποίηση PCR. 2. Προετοιμάστε τα σειριακά αραιωμένα πρότυπα σε μικροφυγοκεντρικά σωληνάρια χρησιμοποιώντας τον μάρτυρα 100ng/µL που παρέχεται με το κιτ PicoGreen. Διανέμετε 20 µl κάθε πρότυπο σε Πλακίδιο 1 PicoGreen (μαύρα πλακίδια μέτρησης με ολόκληρο πλαίσιο) φρεάτια A10 E12 όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. Μεταφέρετε 20 µl ρυθμιστικό διαλύματος 1xTE στο Πλακίδιο 1 PicoGreen φρεάτια F10, F11, F12 όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. 3. Προσθέστε 20µL/αραιωμένου PicoGreen σε κάθε φρεάτιο των τριών πλακιδίων PicoGreen, συμπεριλαμβανομένων των βασικών φρεατίων στο πλακίδιο 1 όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. 4. Προσθέστε 19 µl ρυθμιστικό διαλύματος 1xTE σε τρία πλακίδια PicoGreen στην ίδια μορφή με τα τρία πλακίδια PCR. Προσθέστε προϊόντα PCR 1 µl στα τρία πλακίδια PicoGreen έτσι ώστε η οργάνωση να αντιστοιχεί στα αρχικά πλακίδια PCR για να παρασκευάσετε προϊόντα PCR με αραίωση 1:20. Ο τελικός όγκος είναι 40µL σε όλα τα μετρήσιμα φρεάτια. 5. Πραγματοποιήστε φυγοκέντρηση στο πλακίδιο και επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 5 λεπτά. προστατεύστε τα πλακίδια από το φως κατά τη διάρκεια της επώασης. 6. Μετρήστε τον φθορισμό με φίλτρο με διέγερση ~ 485 nm /εκπομπή ~535 nm, 0.1s (Victor X3) 7. Αποθηκεύστε το αρχείο εξόδου χρησιμοποιώντας την ακόλουθη σύμβαση ονομασίας: (Σημείωση: Windows: χρησιμοποιήστε οριοθετημένη καρτέλα κειμένου, MacOS: χρησιμοποιήστε μορφοποιημένο κείμενο Windows). Project_Plate#_COLUMN1_Date.txt (e.g. ProjectX_01_COLUMN1_123115.txt) Project_Plate#_COLUMN2_Date.txt (e.g. ProjectX_02_COLUMN2_123115.txt) Project_Plate#_COLUMN3_Date.txt (e.g. ProjectX_03_COLUMN3_123115.txt) Εκτελέστε το Πρόγραμμα ισορροπίας SironaQuant στο λογισμικό MIA FORA. Η συνιστώμενη τιμή pmole βρίσκεται μεταξύ 0,0035 έως 0,0009 pmol. 8. Εκτελέστε περιστροφή προς τα κάτω των πλακών PCR και τοποθετήστε ετικέτες για το επόμενο βήμα ως Project_pooled PCR_date 9. Αραιώστε τα προϊόντα PCR από κάθε θέση με ρυθμιστικό διάλυμα 10mMTris HCl ph8,0 σύμφωνα με την έξοδο SironaQuant πριν από τη συσσώρευση. 10. Συνενώστε τα προϊόντα PCR από και τα 9 αντιδραστήρια PCR για κάθε δείγμα μεταφέροντας όγκους που καθορίζονται στην έξοδο SironaQuant. 11. Σφραγίστε τα πλακίδια και αποθηκεύστε στους -20 αν δεν συνεχίσετε αμέσως στο επόμενο βήμα του καθαρισμού των σφαιριδίων. 12. Φέρτε τα μαγνητικά σφαιρίδια σε θερμοκρασία δωματίου και αναμίξτε τα μαγνητικά σφαιρίδια με περιδίνηση σε ίσα επαναιωρούμενα σφαιρίδια. 13. Προσθέστε 55 μl σφαιριδίων ανά φρεάτιο συνενωμένων δειγμάτων. Αναμίξτε DNA και σφαιρίδια καλά χρησιμοποιώντας την κουνώντας την πιπέτα πάνω και κάτω τουλάχιστον 10 φορές. Σελίδα 8 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

14. Επωάστε το Μίγμα σφαιριδίων DNA σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Μεταφέρετε τα πλακίδια στον μαγνήτη για πέντε λεπτά. 15. Με προσοχή αφαιρέστε το υπερκείμενο υγρό χωρίς να ανακινήσετε τα σφαιρίδια ενώ το πλακίδιο βρίσκεται επάνω στον μαγνήτη. 16. Αφήστε το πλακίδιο επάνω στον μαγνήτη για τα βήματα πλύσης με αιθανόλη. Προσθέστε 200µLof προσφάτως αραιωμένης αιθανόλης πυκνότητας 80% σε κάθε φρεάτιο και επωάστε για 30 δευτερόλεπτα, έπειτα αφαιρέστε με προσοχή και απορρίψτε την αιθανόλη. 17. Επαναλάβετε την πλύση με αιθανόλη δύο ακόμη φορές (για 3 πλύσεις συνολικά). Αφαιρέστε όλα τα ίχνη αιθανόλης μετά τη Τρίτη πλύση. 18. Αφαιρέστε το πλακίδιο από τον μαγνήτη και αφήστε τα σφαιρίδια να στεγνώσουν στον αέρα. Η επιφάνεια των μαγνητικών σφαιριδίων θα πρέπει να είναι γυαλιστερή χωρίς ορατά σημεία με συγκεκριμένο υγρό. Ο κατάλληλος χρόνος στεγνώματος μπορεί να καθοριστεί εμπειρικά σε κάθε εργαστηριακό περιβάλλον (5-10 λεπτά). 19. για 8-10 λεπτά. 20. Προσθέστε 35 μl θερμοκρασίας δωματίου 10mMTris-HCl ph8,0 σε κάθε φρεάτιο. Αναμίξτε καλά με την πιπέτα και επωάστε για 5 λεπτά. 21. Τοποθετήστε το πλακίδιο στον μαγνήτη και επωάστε για 5 λεπτά ή έως ότου το διάλυμα είναι καθαρό. 22. με το πλακίδιο στον μαγνήτη, μεταφέρετε 30 µl εκλούσματος σε ένα νέο πλακίδιο PCR 96 φρεατίων με την ετικέτα: Project_Balanced_clean_date. ΣΗΜΕΙΟ ΑΣΦΑΛΟΥΣ ΔΙΑΚΟΠΗΣ Τα συσσωρευμένα και καθαρά δείγματα μπορούν να αποθηκεύονται στους -20ΊC έως 4 ημέρες έως ότου να είναι έτοιμα για το βήμα του κερματισμού. D. Κατασκευή βιβλιοθήκης αλληλουχίας a. Κερματισμός 1. Ρυθμίστε ένα εργαστηριακό χρονόμετρο για 20 λεπτά πριν από το βήμα 8. 2. Διαμοιράστε 20uL ρυθμιστικού διαλύματος από το σωληνάριο 12 σε κάθε φρεάτιο της στήλης 11 του νέου πλακιδίου 96 φρεατίων με ετικέτα να αναγράφει πλακίδιο κερματισμού. Διατηρήστε το πλακίδιο σε πάγο έως το βήμα 8. 3. Προετοιμάστε το κύριο μίγμα προς κερματισμό μεταφέροντας 134 µl του σωληναρίου 11 (Ρυθμιστικό διάλυμα κερματισμού) στο σωληνάριο 10 (Ένζυμο κερματισμού). Αναμίξτε καλά με περιδίνηση και πραγματοποιήστε σύντομη φυγοκέντρηση. 4. Τοποθετήστε με πιπέτα 23 µl του κυρίου μίγματος κερματισμού που ετοιμάστηκε στο βήμα 3 μέσα σε κάθε φρεάτιο της στήλης 12 του πλακιδίου κερματισμού για να δημιουργήσετε τη στήλη κυρίου μίγματος "περιέκτης". 5. Από τη στήλη 12, μεταφέρετε 6 µl του κυρίου μίγματος κερματισμού σε κάθε φρεάτιο των στηλών 1, 2 και 3 του πλακιδίου κερματισμού. 6. Μεταφέρετε 14 µl δείγματος της στήλης 1 του πλακιδίου με τα συσσωρευμένα, καθαρά σφαιρίδια από την προηγούμενη ενότητα (Project_Balanced_clean_date) στη στήλη 1 του πλακιδίου κερματισμού. Αναμίξτε ανακινώντας την πιπέτα πάνω και κάτω 5 φορές. 7. Μεταφέρετε 14 µl δείγματος της στήλης 2 του πλακιδίου με τα συσσωρευμένα, καθαρά σφαιρίδια από την προηγούμενη ενότητα (Project_Balanced_clean_date) στη στήλη 2 του πλακιδίου κερματισμού. Αναμίξτε ανακινώντας την πιπέτα πάνω και κάτω 5 φορές. 8. Μεταφέρετε 14 µl δείγματος της στήλης 3 του πλακιδίου με τα συσσωρευμένα, καθαρά σφαιρίδια από την προηγούμενη ενότητα (Project_Balanced_clean_date) στη στήλη 3 του πλακιδίου κερματισμού. Αναμίξτε ανακινώντας την πιπέτα πάνω και κάτω 5 φορές. 9. Μεταφέρετε το πλακίδιο κερματισμού στην επιφάνεια του πάγκου, ΕΚΚΙΝΗΣΤΕ ΤΟ ΧΡΟΝΟΜΕΤΡΟ και επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Είναι εξαιρετικά σημαντικό η αντίδραση να μην υπερβαίνει τα 20 λεπτά. 10. Αφού περάσουν τα 20 λεπτά επώασης, αμέσως μεταφέρετε 5 µl ρυθμιστικού διαλύματος με ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ από τη στήλη 11 στις στήλες 1, 2 και 3 και αναμίξτε καλά ανακινώντας την πιπέτα πάνω και κάτω 5 φορές μετά από κάθε προσθήκη. 11. Τοποθετήστε στην πιπέτα 200 µl μαγνητικών σφαιριδίων θερμοκρασίας δωματίου σε κάθε φρεάτιο της στήλης 10 του πλακιδίου με τα δείγματα κερματισμού ή σε ένα καθαρό σωληνάριο ταινιών PCR. 12. Από τη στήλη 10, προσθέστε 40 µl μαγνητικών σφαιριδίων σε κάθε φρεάτιο του κερματισμένου DNA και αναμίξτε αργά ανακινώντας την πιπέτα πάνω και κάτω 10 φορές. Επωάστε το Μίγμα σφαιριδίων DNA σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. 13. Μεταφέρετε το πλακίδιο στον μαγνήτη για 5 λεπτά για να συνδεθούν τα σφαιρίδια στα πλαϊνά των φρεατίων και με προσοχή απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό χρησιμοποιώντας πιπέτα. 14. Αφήστε το πλακίδιο επάνω στον μαγνήτη για τα βήματα πλύσης με αιθανόλη. Πλύνετε κάθε φρεάτιο με 200 µl αιθανόλης σε ποσοστό 80%, επωάστε για 30 δευτερόλεπτα και με προσοχή αφαιρέστε το υγρό με μια πολυκαναλική πιπέτα χωρίς να ανακινήσετε τα σφαιρίδια. 15. Επαναλάβετε την πλύση με αιθανόλη ακόμη μία φορά και συνολικά για 2 πλύσεις. 16. Αφαιρέστε το πλακίδιο από τον μαγνήτη και αφήστε να στεγνώσει στον αέρα για να εξατμιστεί η αιθανόλη έως ότου η όψη του ιζήματος των μαγνητικών σφαιριδίων γίνει γυαλιστερή. 17. Αφαιρέστε το πλακίδιο από τον μαγνήτη. Προσθέστε 20 µl θερμοκρασίας δωματίου 10mM Tris-HCl ρυθμιστικού διαλύματος ph8,0 στα σφαιρίδια, αναμίξτε με την πιπέτα και επωάστε για 5 λεπτά εκτός του μαγνήτη. 18. Τοποθετήστε το πλακίδιο στον μαγνήτη και επωάστε για 5 λεπτά. 19. Μεταφέρετε 15 µl αναμίγματος στα νέα πλακίδια PCR με σκληρό κέλυφος 96 φρεατίων με την ετικέτα Project_Fragmented_Clean_Date και σφραγίστε το πλακίδιο. Τώρα τα δείγματα είναι έτοιμα για το βήμα Τελική αποκατάσταση. Σελίδα 9 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

ΣΗΜΕΙΟ ΑΣΦΑΛΟΥΣ ΔΙΑΚΟΠΗΣ Τα κερματισμένα και καθαρισμένα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν στους -20 C έως ότου είναι έτοιμα για το βήμα Τελική αποκατάσταση. Είναι ασφαλές να αποθηκεύσετε το καλά σφραγισμένο κερματισμένο και καθαρισμένο πλακίδιο έως και 4 ημέρες στους -20 C. b. Τελική αποκατάσταση 1. Αναγράψτε ξανά το προηγουμένως τμηματοποιημένο και καθαρισμένο πλακίδιο ως: Project_Endrepair_Date 2. Προετοιμάστε το κύριο μίγμα Τελικής αποκατάστασης προσθέτοντας 136 µl του σωληναρίου 14 (Ρυθμιστικό διάλυμα τελικής αποκατάστασης) στο σωληνάριο 13 (Ένζυμο τελικής αποκατάστασης), αναδεύσατε, πραγματοποιήστε σύντομη φυγοκέντρηση και τοποθετήστε το σωληνάριο σε πάγο. 3. Τοποθετήστε με πιπέτα 18,5 µl του κυρίου μίγματος Τελικής αποκατάστασης που ετοιμάστηκε στο βήμα 1 στη στήλη 12 του πλακιδίου Τελικής αποκατάστασης με την ετικέτα Project_Endrepair_Date, για να δημιουργήσετε μια στήλη "περιέκτης". 4. Από τη στήλη 12, μεταφέρετε 5 µl κυρίου μίγματος Τελικής αποκατάστασης στις στήλες 1, 2 και 3 του ισορροπημένου, κερματισμένου και καθαρισμένου DNA με την ετικέτα Project_Fragmented_Clean_Date που ετοιμάστηκε στην προηγούμενη ενότητα και αναμίξτε ανακινώντας την πιπέτα 5 φορές. 5. Σφραγίστε το πλακίδιο με κολλητικό φιλμ PCR και πραγματοποιήστε σύντομη φυγοκέντρηση για να βεβαιωθείτε ότι όλο το υγρό βρίσκεται στον πάτο του φρεατίου. 6. Μεταφέρετε το πλακίδιο Τελικής αποκατάστασης με την ετικέτα Project_Endrepair_Date σε θερμοκυκλοποιητή και εκτελέστε το πρόγραμμα MIA FORA_End_Repair, όπως φαίνεται στον πίνακα 3. 7. Διατηρήστε το πλακίδιο στους -20 C έως ότου είναι έτοιμο για την καταληκτική ακολουθία A. Πίνακας 3: Πρόγραμμα θερμοκυκλοποιητή για τελική αποκατάσταση MIA FORA_End_Repair 20 C για 30 λεπτά 70 για 10 λεπτά 4 C διατήρηση c. Καταληκτική ακολουθία A 1. Προετοιμάστε το κύριο μίγμα καταληκτικής ακολουθίας Α προσθέτοντας 85 µl του σωληναρίου 16 (Ρυθμιστικό διάλυμα καταληκτικής ακολουθίας Α) στο σωληνάριο 15 (Ένζυμο καταληκτικής ακολουθίας Α), αναδεύσατε, πραγματοποιήστε σύντομη φυγοκέντρηση και τοποθετήστε το σωληνάριο σε πάγο. 2. Τοποθετήστε με πιπέτα 12 µl του κυρίου μίγματος καταληκτικής ακολουθίας Α που ετοιμάστηκε στο βήμα 1 στη στήλη 11 του πλακιδίου Τελικής αποκατάστασης για να δημιουργήσετε μια στήλη "περιέκτης". 3. Από τη στήλη 11, μεταφέρετε 3 µl κυρίου μίγματος καταληκτικής ακολουθίας Α στις στήλες 1, 2 και 3 του πλακιδίου τελικής αποκατάστασης με την ετικέτα Project_Endrepair_Date από την προηγούμενη ενότητα και αναμίξτε ανακινώντας την πιπέτα προς τα πάνω και κάτω 5 φορές. Αναγράψτε ξανά στην ετικέτα την ένδειξη Project_Atail_Date. 4. Τοποθετήστε το πλακίδιο στον θερμοκυκλοποιητή και εκτελέστε το πρόγραμμα MIA FORA_A-tail, όπως φαίνεται στον πίνακα. 5. ΠΡΟΧΩΡΗΣΤΕ ΑΠΕΥΘΕΙΑΣ ΣΤΟ ΒΗΜΑ ΣΥΝΔΕΣΗΣ ΠΡΟΣΑΡΜΟΓΕΩΝ ΔΕΙΚΤΗ εντός 30 λεπτά. Πίνακας 4: Πρόγραμμα θερμοκυκλοποιητή για καταληκτική ακολουθία Α MIA FORA_A-tail 37 για 30 λεπτά 75 για 20 λεπτά 4 C διατήρηση d. Σύνδεση προσαρμογέων δείκτη 1. Χρησιμοποιήστε καινούργια γάντια όταν χειρίζεστε το πλακίδιο υποδοχέα. Εκτελέστε σύντομη ιδιοπεριστροφή του πλακιδίου υποδοχέα πριν αφαιρέσετε την ασφάλιση του πλακιδίου. Προσεκτικά αφαιρέστε την ασφάλιση του πλακιδίου από το πλακίδιο υποδοχέα. Βεβαιωθείτε ότι όλα τα φρεάτια στις στήλες 1, 2 και 3 περιέχουν διάλυμα περίπου 5 µl. 2. Προετοιμάστε το κύριο μίγμα σύνδεσης προσθέτοντας 850 µl από το σωληνάριο 18 (Ρυθμιστικό διάλυμα λιγάσης) στο σωληνάριο 17 (Ένζυμο λιγάσης), αναδεύσατε, πραγματοποιήστε σύντομη φυγοκέντρηση και τοποθετήστε το σωληνάριο σε πάγο. 3. Τοποθετήστε με πιπέτα 95 µl του κυρίου μίγματος σύνδεσης που ετοιμάστηκε στο βήμα 2 στη στήλη 10 του πλακιδίου καταληκτικής ακολουθίας Α με την ετικέτα Project_Atail_Date από την προηγούμενη ενότητα για να δημιουργήσετε μια στήλη "περιέκτης". Αναγράψτε ξανά στην ετικέτα την ένδειξη Project_Ligation_Date. 4. Από τη στήλη 10, μεταφέρετε 26 µl κυρίου μίγματος σύνδεσης σε κάθε φρεάτιο στις στήλες 1, 2 και 3 του πλακιδίου καταληκτικής ακολουθίας Α και αναμίξτε ανακινώντας την πιπέτα προς τα πάνω και κάτω τουλάχιστον 5 φορές. 5. Μεταφέρετε 2,5 µl υποδοχέα στα αντίστοιχα φρεάτια του πλακιδίου σύνδεσης. 6. Αναμίξτε καλά και σφραγίστε το πλακίδιο με κολλητικό φιλμ PCR. Εκτελέστε σύντομη φυγοκέντρηση. Σελίδα 10 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

7. Μεταφέρετε το πλακίδιο σύνδεσης σε έναν θερμοκυκλοποιητή και εκτελέστε το πρόγραμμα MIA FORA_ligation, όπως φαίνεται στον πίνακα 5. Πίνακας 5: Πρόγραμμα θερμοκυκλοποιητή για σύνδεση υποδοχέα MIA FORA_ligation 25 για 30 λεπτά 65 για 10 λεπτά 4 C διατήρηση e. Σταθεροποίηση υποδοχέα-συνδεδεμένων προϊόντων 1. Συνδυάστε 20µL από κάθε φρεάτιο του πλακιδίου Project_Ligation_Date από την προηγούμενη ενότητα σε ένα σωληνάριο Eppendorf 1,5 ml. Αναγράψτε στο σωληνάριο την ετικέτα «Έργο-Ημερομηνία-Σταθεροποιήθηκε». 2. Προσθέστε 865 µl μαγνητικών σφαιριδίων στο σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης με την ετικέτα Έργο-Ημερομηνία- Σταθεροποιήθηκε (Project-Date-Consolidated). Αναμίξτε καλά με περιδίνηση. Επωάστε για 10 λεπτά. 3. Μεταφέρετε το σωληνάριο στη μαγνητική θήκη έως ότου το διάλυμα είναι καθαρό, 5 8 λεπτά. Αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό. 4. Ενώ εξακολουθεί να βρίσκεται στον μαγνήτη, προσθέστε 1 ml 80% αιθανόλης και επωάστε για 30 δευτερόλεπτα. Αφαιρέστε το 80% αιθανόλης χωρίς να ανακινήσετε τα σφαιρίδια. 5. Επαναλάβετε την πλύση με αιθανόλη (βήμα 4) συνολικά για 2 πλύσεις. Αφαιρέστε όση περισσότερη αιθανόλη είναι δυνατόν από το σωληνάριο. 6. Αφαιρέστε το σωληνάριο από τη μαγνητική θήκη και αφήστε τα σφαιρίδια να στεγνώσουν στον αέρα για 5-10 λεπτά έως ότου η όψη του ιζήματος των μαγνητικών σφαιριδίων γίνει γυαλιστερή. 7. Επαναλάβετε την εναιώρηση σε 63 μl θερμοκρασίας δωματίου 10mMTris-HCl ph8,0, αναδεύστε και επωάστε για 5 λεπτά. 8. Τοποθετήστε το σωληνάριο στον μαγνήτη έως ότου το διάλυμα είναι διάφανο και μεταφέρετε 60 µl εκλούσματος που περιέχει καθαρισμένα συνδεδεμένα δείγματα υποδοχέα σε ένα καθαρό σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης. ΣΗΜΕΙΟ ΑΣΦΑΛΟΥΣ ΔΙΑΚΟΠΗΣ Τα συσσωρευμένα και καθαρισμένα συνδεδεμένα δείγματα υποδοχέα (Βιβλιοθήκη) μπορούν να αποθηκευτούν στους -20 C έως ότου είστε έτοιμοι να εκτελέσετε την Επιλογή μεγέθους για διάστημα έως και 4 ημερών. f..επιλογή μεγέθους και ενίσχυση βιβλιοθήκης επιλεγμένης με το μέγεθος (Pippin Prep) ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ενισχυμένη βιβλιοθήκη θα πρέπει να καθαριστεί εντός 1 ώρας ενίσχυσης. 1. Πραγματοποιήστε μια κατάλληλη μέθοδο επιλογής μεγέθους στην προετοιμασία της βιβλιοθήκης για να απομονώσετε τμήματα περίπου 400-500 ζευγών βάσεων. Τηρήστε το εγχειρίδιο οδηγιών του προϊόντος αν δεν χρησιμοποιήσετε Pippin Prep. 2. Αναμίξτε 30 µl Βιβλιοθήκης με 10µL της κατάλληλης σήμανσης και φορτώστε σε μια γραμμής της κασέτας Pippin. 3. Δημιουργήστε και εκτελέστε ένα πρόγραμμα για να επιλέξετε Βιβλιοθήκη με μέγεθος κερματισμού μεταξύ 400-500bp. 4. Αποψύξτε μονάδες ενίσχυσης από το Κιτ προετοιμασίας βιβλιοθήκης, σωληνάρια 19, 20, 21 και ετοιμάστε την αντίδραση σε πάγο σε σωληνάρια ταινιών PCR 0,2 ml ως εξής: Αναμίξτε 25µL μίγματος ενίσχυσης από σωληνάριο 19, 2µL εκκινητές από σωληνάριο 20, 18 µl νερό χωρίς νουκλεϊνάση από σωληνάριο 21 και 5µL έκλουση επιλεγμένου μεγέθους. 5. Αναμίξτε απαλά με περιδίνηση προς τα κάτω. Μεταφέρετε τον κυκλοθερμοποιητή και ενισχύστε με το MIA FORA_Library_PCR όπως φαίνεται στον πίνακα 6. Πίνακας 6: MIA FORA_Library_PCR Κύκλος (1) Κύκλοι (12) Κύκλος (1) Αρχική Μετουσίωση Επιφλόγιση Επέκταση Τελική επ Συγκράτηση συγκράτηση 98 0 C /30s 98 0 C /15s 65 0 C /30s 72 0 C /30 s 72 0 C/5m 4 0 C/ E. Προετοιμασία ακολουθίας για MiSeq ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ανοίξτε και χειριστείτε όλα τα βήματα μετά την ενίσχυση σε ειδικό χώρο του εργαστηρίου, και προτιμότερο σε χώρο με ασφαλή κάλυψη PCR για την αποφυγή μόλυνσης των επιφανειών εργασίας και των αντιδραστηρίων ακολουθίας. 1. Μεταφέρετε 50μL ενισχυμένη Βιβλιοθήκη σε ένα σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης. Προσθέστε 50µL θερμοκρασίας δωματίου μαγνητικών σφαιριδίων στη Βιβλιοθήκη. Αναμίξτε καλά και επωάστε για 10 λεπτά. 2. Αφού περάσουν τα 10 λεπτά, τοποθετήστε το σωληνάριο στη μαγνητική θήκη σωληναρίων έως ότου το διάλυμα είναι καθαρό, περίπου 5-8 λεπτά. Αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό. 3. Ενώ βρίσκεστε στο μαγνήτη, προσθέστε 200 µl 80% αιθανόλης και επωάστε για 30 δευτερόλεπτα. Αφαιρέστε το 80% αιθανόλης χωρίς να ανακινήσετε τα σφαιρίδια. 4. Επαναλάβετε την πλύση αιθανόλης (βήμα 3) για 2 πλύσεις συνολικά. Αφαιρέστε όσο περισσότερη αιθανόλη είναι δυνατό από το σωληνάριο. 5. Αφαιρέστε το σωληνάριο από τη μαγνητική θήκη και αφήστε τα σφαιρίδια να στεγνώσουν στον αέρα για 5-10 λεπτά έως ότου το ίζημα μαγνητικών σφαιριδίων αποκτήσει γυαλιστερή επιφάνεια. Σελίδα 11 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

6. Επαναιωρήστε τα σφαιρίδια σε 17 µl θερμοκρασίας δωματίου 10mMTris-HCl ph8,0. Αναδεύστε και επωάστε για 5 λεπτά. 7. Τοποθετήστε το σωληνάριο στον μαγνήτη έως ότου το διάλυμα είναι διάφανο και μεταφέρετε 15 µl εκλούσματος που περιέχει καθαρή, ενισχυμένη βιβλιοθήκη αλληλουχίας σε ένα καθαρό μικροφυγοκεντρικό σωληνάριο. ΣΗΜΕΙΟ ΑΣΦΑΛΟΥΣ ΔΙΑΚΟΠΗΣ Είναι δυνατή η αποθήκευση των αραιωμένων δειγμάτων σε θερμοκρασία -20ºC για έως και 4 ημέρες. 8. Καθορίστε τη συγκέντρωση της Βιβλιοθήκης χρησιμοποιώντας μεθόδους που μετρούν με ακρίβεια τη συγκέντρωση DNA. Η Immucor συνιστά μεθόδους qpcr για τον υπολογισμό συγκέντρωσης Βιβλιοθήκης. 9. Η ενισχυμένη βιβλιοθήκη πρέπει να είναι τουλάχιστον 10 nm σε συγκέντρωση. Η διανομή μεγέθους της βιβλιοθήκης μπορεί να καθοριστεί χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης ή οποιοδήποτε σύστημα τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης για να επαληθεύσετε το μέγεθος των τελικών βιβλιοθηκών. 10. Αραιώστε τη βιβλιοθήκη σε 4 nm και έπειτα ετοιμάστε μια τελική μετουσιωμένη βιβλιοθήκη 12 pm για ακολουθία. Η βιβλιοθήκη μπορεί να εμβολιαστεί με μάρτυρα 5% PhiX αν είναι επιθυμητό. 11. Φορτώστε τη μετουσιωμένη βιβλιοθήκη σε κασέτα και εκτελέστε ένα σύστημα ακολουθίας MiSeq. 12. Ακολουθήστε τις οδηγίες MiSeq για την ακολουθία της βιβλιοθήκης χρησιμοποιώντας ένα κιτ MiSeq V2 300 κύκλων. Βεβαιωθείτε ότι το όνομα αρχείου στο φύλλο δειγμάτων MiSeq αντιστοιχεί στο.ονομα του έργου που έχει παραχθεί κατά την εγκατάσταση PCR. F. Ανάλυση δεδομένων Τα αρχεία fastq που έχουν δημιουργηθεί από το εργαλείο MiSeq θα πρέπει να αναλυθούν με το λογισμικό MIA FORA για τη δημιουργία τυπολόγησης HLA. Το φύλλο δειγμάτων με τα ονόματα δειγμάτων και τους γραμμικούς κωδικούς, καθώς και τα αντίστοιχα αρχεία fastq θα πρέπει να φορτώνονται στο αρχείο έργων του λογισμικού MIA FORA. Για χρήση του λογισμικού MIA FOR A, τηρήστε τον Οδηγό χρήσης λογισμικού. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Ενίσχυση PCR: Η ανάλυση της γέλης αγαρόζης δεν θα πρέπει να δείχνει καθόλου προϊόν στον αρνητικό μάρτυρα (NTC) ώστε η εκτέλεση να είναι έγκυρη. Η γέλη αγαρόζης των ενισχυμένων προϊόντων μπορεί να παρουσιάσει ποικιλίες στο μέγεθος με βάση τις διαφορές σε ακολουθίες ιντρονίων. Ανατρέξτε στον Πίνακα 2 για το κατά προσέγγιση μέγεθος των ζωνών. 2. Προετοιμασία βιβλιοθήκης: Με το Κιτ βιβλιοθήκης θα πρέπει να παράγεται μια βιβλιοθήκη όταν το επίπεδο DNA εισόδου στο SironaQuant είναι μεταξύ 0,0009 και 0,0035 pmol. Η τελική συγκέντρωση στη βιβλιοθήκη θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 10 nm και θα πρέπει να προσδιορίζεται με ακρίβεια πριν από την ακολουθία. Οι βιβλιοθήκες θα πρέπει να αραιωθούν σε 4nM πριν από τη μετουσίωση. Η ομαδοποίηση σε κιτ V2 MiSeq μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με την ακρίβεια του προσδιορισμού ποσότητας. Τυπικά, οι πυκνότητες συστάδων των βιβλιοθηκών 12 pm θα πρέπει να ποικίλλουν από 600-800 K/mm 2 Πρέπει να δοθεί προσοχή ώστε να προσδιορίζεται με ακρίβεια η ποσότητα της βιβλιοθήκης. Όλα τα μετά συσσωρευμένα προϊόντα υποδοχέα πρέπει να περιέχονται σε καλύπτρα PCR ή σε χαρακτηρισμένο χώρο και προσφάτως αραιωμένα αντιδραστήρια πρέπει να έχουν προετοιμαστεί για την αποφυγή μόλυνσης. 3. Η τυπολόγηση HLA παράγεται από το λογισμικό MIA FORA NGS και παρέχεται σε αναφορά. Τηρήστε το Εγχειρίδιο χρήσης λογισμικού MIA FORA για ανάλυση δεδομένων τυπολόγησης HLA. ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Απαιτείται ένας αρνητικός μάρτυρας και ένας προαιρετικός γνωστός μάρτυρας να εκτελεστούν με εύκολη δοκιμή, όπως τυφλό δείγμα νερού και ένα προηγουμένως τυπωμένο δείγμα αντίστοιχα. Η αφαίρεση των ασφαλίσεων του πλακιδίου πρέπει να πραγματοποιηθεί με εξαιρετική προσοχή και τα πλακίδια να αναμιχθούν με περιδίνηση πριν από το άνοιγμα. Πρέπει να χρησιμοποιούνται νέες ασφάλειες πλακιδίων σε κάθε βήμα όπου τα πλακίδια πρέπει να σφραγιστούν. Τα χρησιμοποιημένα ρύγχη των πιπετών θα πρέπει να τοποθετούνται σε κατάλληλα δοχεία και να απορρίπτονται. Η ρύθμιση του PCR πρέπει να πραγματοποιείται σε χώρο Pre-PCR ξεχωριστό από τον χώρο όπου γίνεται η επεξεργασία των ενισχυμένων προϊόντων. Όλο το γενομικό DNA πρέπει να αραιωθεί σε νερό χωρίς νουκλεϊνάση. Μετά την επιλογή μεγέθους και την ενίσχυση DNA, η διαχείριση της ενισχυμένης βιβλιοθήκης πρέπει να πραγματοποιείται σε ξεχωριστό χώρο, ιδανικά σε καλύπτρα PCR και η διαχείρισή της να γίνεται με ξεχωριστό σετ πιπετών. Θα πρέπει να είστε ιδιαίτερα προσεκτικοί ώστε να μην μολυνθούν οι περιοχές εργασίας με ενισχυμένες βιβλιοθήκες. Η δοκιμασία πρέπει να εκτελεστεί όπως συνιστάται σε αυτό το ένθετο προϊόντος, καθώς επίσης όπως εκτελείται με κάθε άλλη διαδικασία ποιοτικού ελέγχου που συμφωνεί με τις τοπικές απαιτήσεις και τις απαιτήσεις της πολιτείας, της ομοσπονδίας και/ή των υπηρεσιών διαπίστευσης. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ 1. Το PCR και ο προσδιορισμός που περιγράφονται σε αυτό το ένθετο προϊόντος απαιτούν συνθήκες ελεγχόμενες με ακρίβεια. Οι αποκλίσεις από επικυρωμένες παραμέτρους ενδέχεται να οδηγήσουν σε αποτυχία του προϊόντος. 2. Αν τουλάχιστον το 50% των αρχικών τμημάτων DNA είναι μικρότερο από 10 kb, ενδέχεται να μην είναι δυνατή η δημιουργία επαρκούς ποσότητας για προϊόν PCR. 3. Αν η τελική συγκέντρωση βιβλιοθήκης είναι κάτω από 10 nm, ενδέχεται να μην υπάρξουν ακριβή επακόλουθα αποτελέσματα. 4. Θα παρατηρηθούν ασάφειες στο 4 ο πεδίο λόγω έλλειψης κάλυψης σε πεδίο ιντρονίων. 5. Τα πρόσθετα στο μίγμα PCR ενδέχεται να παρέμβουν με συχνά χρησιμοποιούμενα μη τοξικά εναλλακτικά του αιθιδίου βρωμιδίου που χρησιμοποιούνται σε ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης και ενδέχεται να οδηγήσουν σε χαμηλή ένταση ζωών. 6. Οι γέλες αγαρόζης SYBR με πράσινες κηλιδώσεις δεν λειτουργούν με προϊόντα PCR. Το αιθίδιο βρωμίδιο ή GelRed θα πρέπει να χρησιμοποιούνται για οπτικοποίηση των προϊόντων PCR. Σελίδα 12 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)

7. Ο εκκινητής DPB1 δεν ενισχύει το εξόνιο 1 ή το εξόνιο 5. Επομένως, κάθε γνωστός πολυμορφισμός σε αυτά τα εξόνια δεν θα πραγματοποιήσει ακολουθία και θα καταχωρηθεί ως ασάφειες στην αναφορά. 8. Η έλλειψη γενομικών ακολουθιών αναφοράς για τον εκκινητή DPB1 και τα χαμηλά επίπεδα πολυμορφισμού σε ιντρόνιο 2 (μεταξύ εξονίου 2 και 3) αποτελεί πρόκληση στην εκτέλεση της ανάλυσης φάσεων για ετερόζυγα δείγματα. Επομένως, ενδεχομένως να υπάρχει μια ασάφεια γενότυπου η οποία δεν είναι δυνατό να επιλυθεί. 9. Ο πρόσθιος εκκινητής για κάλυψη DPB1 με τις πρώτες μερικές βάσεις στο εξόνιο 2. Επομένως, οι πολυμορφισμοί σε εκείνες τις ακολουθίες δεν θα εντοπίζονται από την ακολουθία. 10. Οι θέσεις DRB ενισχύονται ως δύο τμήματα ένα που ενισχύει το εξόνιο 1 και το άλλο που ενισχύει τα εξόνια 2 έως 6. Το ιντρόνιο 1 δεν ενισχύεται πλήρως. Επομένως οι φάσεις ολόκληρης της θέσης δεν είναι δυνατές για DRB1/3/4/5 και οποιοιδήποτε πολυμορφισμοί παρουσιάζονται σε Ιντρόνιο 1 θα έχουν ως αποτέλεσμα ασάφειες στο 4 ο πεδίο. 11. Ο ανάστροφος εκκινητής για DRB εξόνια 2 έως 6 καλύπτει το ένα τρίτο του εξονίου 6, επομένως οι πολυμορφισμοί σε εκείνες τις ακολουθίες δεν θα καθοριστούν από την ακολουθία. 12. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα προϊόντα ενίσχυσης εξονίου 1 του DRB1,3,4,5 αντιστοιχίζονται ανεπαρκώς σε εξόνιο 1 των γνωστών ακολουθιών αναφοράς του DRB5. Επομένως, το contig για εξόνιο 1 δεν είναι πιθανό να δημιουργθεί για DRB5. Εφόσον δεν υπάρχουν γνωστοί πολυμορφισμοί εξονίου 1 για DRB5, δεν προκαλείται καμία ασάφεια στην τυπολόγηση HLA για DRB5. 13. Λόγω της σύνθετης φύσης της τυπολόγησης HLA, η ερμηνεία των δεδομένων πρέπει να εκτελείται από εξειδικευμένο προσωπικό και εργασίες τυπολόγησης. ΙΔΙΑΙΤΕΡΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Πραγματοποιήθηκαν κλινικές μελέτες σε τρεις τόπους για την αξιολόγηση της απόδοσης του κιτ τυπολόγησης MIA FORA NGS HLA. Πραγματοποιήθηκε σύγκριση της απόδοσης του προσδιορισμού με προηγούμενο κιτ τυπολόγησης που περιελάμβανε Τυπολόγηση υψηλής ανάλυσης βασισμένη σε αλληλουχία (SBT) όπου είναι δυνατόν, και τυπολόγηση χαμηλότερης ανάλυσης όπου το SBT δεν είναι διαθέσιμο. Τα δείγματα επιλέχθηκαν από τις θέσεις δοκιμής για να αντιπροσωπεύσουν ένα διαφορετικό σετ τύπων HLA που θα μπορούσαν να ληφθούν υπόψη στην πορεία φυσιολογικών λειτουργιών. Ένα σύνολο 206 δειγμάτων δοκιμάστηκε από τις θέσεις σε 3 εκτελέσεις και η καθεμία χρησιμοποιώντας δύο παρτίδες αντιδραστηρίων. Η τυπολόγηση HLA καθορίστηκε για θέσεις HLA-A, -B, -C, -DPA1, -DPB1, -DQA1, -DQB1 και -DRB 1/3/4/5. Ένα σύνολο 3.692 αλληλόμορφων αξιολογήθηκε με αυτά τα 206 δείγματα. Τα αποτελέσματα παρουσίασαν ότι οι τύποι HLA επιτεύχθηκαν από έναν προσδιορισμό MIA FORA, χωρίς επανάληψη δοκιμής των αποτυχιών και ασύμφωνων θέσεις, ήταν 99,34%.Μετά την επανάληψη δοκιμών των αποτυχημένων και των ασύμφωνων θέσεων, η συνολική συμφωνία ήταν 99,74%. Θέση Πίνακας 8: Σύνοψη Συνολικής συμφωνίας Αριθμός δοκιμ. θέσεων Αριθμός δείγματα Αριθμός αλληλόμορφων για ανάλυση συμφωνίας Συμφωνία μετά την επανάληψη δοκιμών Θέση1 68 748 1223 1220 (99,75%) Θέση2 69 759 1064 1063 (99,91%)* Θέση3 69 759 1241 1236 (99,59%) * Δεν πραγματοποιήθηκε επανάληψη δοκιμής σε αυτή τη θέση. Μία θέση DQB1 είχε ανεπαρκή δεδομένα. Πίνακας 9: Σύνοψη κλινικών δοκιμών ανά θέση Θέσεις HLA Αρχική συμφωνία Συμφωνία μετά την επανάληψη δοκιμής** HLA-A 100.00% 100.00% HLA-B 99,76% 99,76% HLA-C 99,51% 100,00% DPA1 99,72% 100,00% DPB1 99,44% 99,72% DQA1 99,26% 100,00% DQB1 98,48% 99,27% DRB1 98,54% 99,03% DRB3/4/5 99,43% 100,00% Σύνολο 99,34% 99,74% ** Οι επαναλήψεις δοκιμών που περιελάμβαναν κλήσεις με σήμανση για επανεξέταση και θα μπορούσαν να μην έχουν επιλυθεί από τον μη αυτόματο έλεγχο δεδομένων. Για τις κλήσεις που θα μπορούσαν να μην πραγματοποιηθούν λόγω ανεπαρκών δεδομένων (ενισχύσεις 11/1854) επίσης πραγματοποιήθηκαν επαναλήψεις δοκιμών. Σημείωση: Για λεπτομερή χαρακτηριστικά συγκεκριμένης απόδοσης, παρακαλούμε επικοινωνήστε με την Immucor Transplant Diagnostics, Inc. στον αριθμό τηλεφώνου 1-888-329-0255. Σελίδα 13 από 15 LC1618CEEL.1 (06/16)