Ασκήσεις 1 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ

Ασκήσεις 1 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ 1. Η ανάλυση δειγμάτων DNA από δύο βακτηριακές καλλιέργειες έδωσε τα εξής αποτελέσματα: στην πρώτη καλλιέργεια βρέθηκε ποσοστό αδενίνης (Α) 28% και στη δεύτερη καλλιέργεια βρέθηκε ποσοστό γουανίνης (G) 28%. Να εξηγήσετε αν τα βακτήρια των δύο καλλιεργειών ανήκουν στο ίδιο ή σε διαφορετικό είδος. Στα βακτήρια, το DNA είναι δίκλωνο και κυκλικό μόριο. Με βάση τον κανόνα της συμπληρωματικότητας Α=Τ και G C, τα ποσοστά (%) των αζωτούχων βάσεων και η αναλογία των βάσεων (Α+T)/(G+C) σε κάθε δείγμα είναι: Βακτηριακό DNA 1 ης καλλιέργειας Βακτηριακό DNA 2 ης καλλιέργειας A T C G A+T/G+C 28 28 22 22 56/44 22 22 28 28 44/56 Η αναλογία των βάσεων (Α+T)/(G+C) διαφέρει από είδος σε είδος και σχετίζεται με το είδος του οργανισμού. Συνεπώς, τα βακτήρια των δύο καλλιεργειών ανήκουν σε διαφορετικά είδη. 2. Από το φυτό Zea mays (καλαμπόκι) απομονώθηκαν τρία διαφορετικά φυσιολογικά κύτταρα στα οποία προσδιορίστηκε το μέγεθος του γονιδιώματος σε ζεύγη βάσεων: στο 1 ο κύτταρο: 20 x 10 9 ζεύγη βάσεων στο 2 ο κύτταρο: 5 x 10 9 ζεύγη βάσεων στο 3 ο κύτταρο: 10 x 10 9 ζεύγη βάσεων Να εξηγήσετε γιατί υπάρχουν οι διαφορές αυτές στο μέγεθος του γονιδιώματος των τριών κυττάρων. Το φυτό Zea mays (καλαμπόκι) είναι ευκαρυωτικός οργανισμός. Το γενετικό υλικό ενός κυττάρου αποτελεί το γονιδίωμά του. Το γενετικό υλικό των κυττάρων είναι δίκλωνο DNA αφού έχει ζεύγη βάσεων. Τα κύτταρα στα οποία το γονιδίωμα υπάρχει σε δύο αντίγραφα, όπως είναι τα σωματικά κύτταρα των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, ονομάζονται διπλοειδή. Τα κύτταρα στα οποία το γονιδίωμα υπάρχει σε ένα μόνο αντίγραφο, όπως είναι οι γαμέτες των διπλοειδών οργανισμών, ονομάζονται απλοειδή. Επομένως: 1 ο κύτταρο 20 x 10 9 ζεύγη βάσεων: σωματικό κύτταρο, μετά την αντιγραφή του DNA 2 ο κύτταρο 5 x 10 9 ζεύγη βάσεων: γαμέτης κύτταρο 3 ο κύτταρο 10 x 10 9 ζεύγη βάσεων: σωματικό κύτταρο 3. Ένα σωματικό κύτταρο του ανθρώπου έχει φυσιολογικά 46 χρωμοσώματα. Πόσα μόρια DNA υπάρχουν συνολικά στο στάδιο της μετάφασης, στα χρωμοσώματα ενός σωματικού κυττάρου του ανθρώπου; Ο αριθμός των χρωμοσωμάτων είναι χαρακτηριστικός για κάθε είδος οργανισμού. Στη μετάφαση, η ποσότητα του DNA είναι ήδη διπλασιασμένη. Επομένως, ένα φυσιολογικό σωματικό κύτταρο του ανθρώπου, στο στάδιο της μετάφασης, έχει 46 χρωμοσώματα και συνολικά 92 μόρια DNA. 1

Ασκήσεις 2 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ 1. Μια πρωτεΐνη ενός ευκαρυωτικού κυττάρου αποτελείται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα 100 αμινοξέων. Το γονίδιο, από το οποίο κωδικοποιήθηκε η πρωτεΐνη, αποτελείται από πολύ περισσότερα νουκλεοτίδια από αυτά που κωδικοποιούν τα 100 αμινοξέα. Να αναφέρετε τους λόγους αυτής της διαφοράς. Η διαφορά μεγέθους γονιδίου και γονιδιακού προϊόντος μπορεί να οφείλεται: στα εσώνια (λόγω ευκαρυωτικού οργανισμού), στις 5 και 3 αμετάφραστες περιοχές του γονιδίου, στο κωδικόνιο λήξης, στην απομάκρυνση αμινοξέων από το αρχικό αμινικό άκρο, μετά τη μετάφραση του γονιδίου, και στην απομάκρυνση ενδιάμεσου πεπτιδίου, όπως γίνεται κατά τη μετατροπή της προϊνσουλίνης σε ινσουλίνη. 2. Δίνεται το παρακάτω τμήμα DNA, το οποίο αντιγράφεται. Στον κλώνο ΖΗ η αντιγραφή γίνεται με ασυνεχή τρόπο. Τα σημεία Δ και Η υποδεικνύουν τις θέσεις έναρξης της αντιγραφής του DNA. α) Να σχεδιάσετε τα συνεχή και ασυνεχή τμήματα των νέων κλώνων με βέλη, υποδεικνύοντας τους προσανατολισμούς των νέων και των μητρικών κλώνων. Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. β) Στον κλώνο που αντιγράφεται με συνεχή τρόπο, να γράψετε την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων και τον προσανατολισμό του πρωταρχικού τμήματος, το οποίο αποτελείται από 8 (οκτώ) νουκλεοτίδια. Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. α) Σε μια πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα, το πρώτο νουκλεοτίδιό της έχει πάντα μία ελεύθερη φωσφορική ομάδα, συνδεδεμένη στον 5' άνθρακα της πεντόζης του και το τελευταίο νουκλεοτίδιό της έχει ελεύθερο το υδροξύλιο στον 3' άνθρακα της πεντόζης του. Για το λόγο αυτό αναφέρεται ότι ο προσανατολισμός της πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας είναι 5' 3'. Οι DΝΑ πολυμεράσες λειτουργούν μόνο προς καθορισμένη κατεύθυνση και τοποθετούν τα νουκλεοτίδια στο ελεύθερο 3' άκρο της δεοξυριβόζης του τελευταίου νουκλεοτιδίου κάθε νέας, αναπτυσσόμενης αλυσίδας. Μεταξύ των διαδοχικών νουκλεοτιδίων σχηματίζεται ο 3-5 φωσφοδιεστερικός δεσμός. Ο δεσμός αυτός δημιουργείται μεταξύ του υδροξυλίου του 3' άνθρακα της δεοξυριβόζης του πρώτου νουκλεοτιδίου και της φωσφορικής ομάδας που είναι συνδεδεμένη στον 5' άνθρακα της δεοξυριβόζης του επόμενου νουκλεοτιδίου. Η αντιγραφή γίνεται με προσανατολισμό 5' 3' και κάθε νεοσυντιθέμενη αλυσίδα θα έχει τον ίδιο προσανατολισμό. Έτσι, σε κάθε 2

διπλή έλικα που παράγεται, οι δύο αλυσίδες θα είναι αντιπαράλληλες, δηλαδή το 3' άκρο της μιας είναι απέναντι από το 5' άκρο της άλλης Για να ακολουθηθεί αυτός ο κανόνας σε κάθε τμήμα DΝΑ που γίνεται η αντιγραφή, η σύνθεση του DΝΑ είναι συνεχής στη μια αλυσίδα και ασυνεχής στην άλλη αλυσίδα. β) Επειδή οι DNA πολυμεράσες δεν έχουν την ικανότητα να αρχίσουν την αντιγραφή, το κύτταρο έχει ένα ειδικό σύμπλοκο που αποτελείται από πολλά ένζυμα, το πριμόσωμα, το οποίο συνθέτει στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής μικρά τμήματα RNA, συμπληρωματικά και αντιπαράλληλα ως προς τις μητρικές αλυσίδες, τα οποία ονομάζονται πρωταρχικά τμήματα. Αφού η αντιγραφή γίνεται με προσανατολισμό 5' 3', και το πρωταρχικό τμήμα που θα συντεθεί στη θέση έναρξης της αντιγραφής στον συνεχή κλώνο θα έχει τον ίδιο προσανατολισμό. Έτσι λοιπόν, το πρωταρχικό τμήμα RNA που αποτελείται από οκτώ νουκλεοτίδα είναι: 5'-UCAGAUCU-3'. 3. Σ ένα μόριο DNA ευκαρυωτικού κυττάρου υπάρχουν δύο γονίδια Α και Β, όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα: α) Να ορίσετε τους προσανατολισμούς των αλυσίδων του DNA. β) Τα γονίδια Α και Β μεταγράφονται σε RNA. Να ορίσετε τους προσανατολισμούς του RNA που σχηματίζεται για κάθε γονίδιο. γ) Ποια είναι η κωδική αλυσίδα για το γονίδιο Α και για το γονίδιο Β; δ) Να ορίσετε τη θέση του υποκινητή για κάθε γονίδιο μ ένα βέλος. α) Μία πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα σχηματίζεται από την ένωση πολλών νουκλεοτιδίων με ομοιοπολικό δεσμό. Ο δεσμός αυτός δημιουργείται μεταξύ του υδροξυλίου του 3' άνθρακα της πεντόζης του πρώτου νουκλεοτιδίου και της φωσφορικής ομάδας που είναι συνδεδεμένη στον 5' άνθρακα της πεντόζης του επόμενου νουκλεοτιδίου. Ο δεσμός 3

αυτός ονομάζεται 3'-5' φωσφοδιεστερικός δεσμός. Σε μια πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα, το πρώτο νουκλεοτίδιό της έχει πάντα μία ελεύθερη φωσφορική ομάδα, συνδεδεμένη στον 5' άνθρακα της πεντόζης του και το τελευταίο νουκλεοτίδιό της έχει ελεύθερο το υδροξύλιο στον 3' άνθρακα της πεντόζης του. Για το λόγο αυτό αναφέρεται ότι ο προσανατολισμός της πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας είναι 5' 3'. Στο δίκλωνο DNA, oι δύο αλυσίδες είναι αντιπαράλληλες, δηλαδή το 3' άκρο της μιας είναι απέναντι από το 5' άκρο της άλλης. β) Κατά την έναρξη της μεταγραφής ενός γονιδίου, η RNA πολυμεράση τοποθετεί τα ριβονουκλεοτίδια απέναντι από τα δεοξυριβονουκλεοτίδια της μιας αλυσίδας του DNA, σύμφωνα με τον κανόνα της συμπληρωματικότητας των βάσεων, όπως και στην αντιγραφή, με τη διαφορά ότι εδώ απέναντι από το δεοξυριβονουκλεοτίδιο που περιέχει αδενίνη τοποθετείται το ριβονουκλεοτίδιο που περιέχει ουρακίλη. Η RNA πολυμεράση συνδέει τα ριβονουκλεοτίδια που προστίθενται το ένα μετά το άλλο, με 3'-5' φωσφοδιεστερικό δεσμό. Η μεταγραφή έχει προσανατολισμό 5' 3'. γ) Το μόριο RNA που σχηματίζεται είναι συμπληρωματικό και αντιπαράλληλο ως προς τη μια αλυσίδα, της διπλής έλικας του DNA του γονιδίου. Η αλυσίδα αυτή είναι η μεταγραφόμενη και ονομάζεται μη κωδική. Η συμπληρωματική αλυσίδα του DNA του γονιδίου ονομάζεται κωδική. Συνεπώς κωδική αλυσίδα DNA γονιδίου και mrna έχουν τον ίδιο προσανατολισμό και τα ίδια 5 και 3 άκρα. Επομένως, για το γονίδο Α, κωδική είναι η αλυσίδα ΙΙ και για το γονίδιο Β, κωδική είναι η αλυσίδα Ι. δ) Κατά την έναρξη της μεταγραφής ενός γονιδίου, η RNA πολυμεράση προσδένεται στον υποκινητή με τη βοήθεια πρωτεϊνών που ονομάζονται μεταγραφικοί παράγοντες και προκαλεί τοπικό ξετύλιγμα της διπλής έλικας του DNA. Επομένως, ο υποκινητής βρίσκεται πάντοτε πριν από την αρχή κάθε γονιδίου και εντοπίζεται στο 5 άκρο της κωδικής αλυσίδας. 4. Στο παρακάτω τμήμα δίκλωνου μορίου DNA, μεταξύ των σημείων Κ και Λ περιέχεται ένα γονίδιο. Στο διάγραμμα υποδεικνύεται η θέση του υποκινητή του γονιδίου. 4

α) Να σημειώσετε στο σχήμα τους προσανατολισμούς των κλώνων του μορίου και να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. β) Να τοποθετήσετε στο σχήμα και στις κατάλληλες θέσεις το κωδικόνιο έναρξης του γονιδίου και ένα από τα κωδικόνια λήξης (της επιλογής σας). Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. α) Μία πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα του DNA σχηματίζεται από την ένωση πολλών δεοξυριβονουκλεοτιδίων με ομοιοπολικό δεσμό. Ο δεσμός δημιουργείται μεταξύ του υδροξυλίου του 3' άνθρακα της δεοξυριβόζης του πρώτου νουκλεοτιδίου και της φωσφορικής ομάδας που είναι συνδεδεμένη στον 5' άνθρακα της δεοξυριβόζης του επόμενου νουκλεοτιδίου και ονομάζεται 3'-5' φωσφοδιεστερικός δεσμός. Ανεξάρτητα από τον αριθμό των νουκλεοτιδίων από τα οποία αποτελείται η πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα, το πρώτο νουκλεοτίδιό της έχει πάντα μία ελεύθερη φωσφορική ομάδα συνδεδεμένη στον 5' άνθρακα της δεοξυριβόζης του και το τελευταίο νουκλεοτίδιό της έχει ελεύθερο το υδροξύλιο του 3' άνθρακα της δεοξυριβόζης του. Για το λόγο αυτό αναφέρεται ότι ο προσανατολισμός της πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας είναι 5' 3'. Στο δίκλωνο DNA, oι δύο αλυσίδες είναι αντιπαράλληλες, δηλαδή το 3' άκρο της μιας είναι απέναντι από το 5' άκρο της άλλης. β) Ο υποκινητής βρίσκεται πάντοτε πριν από την αρχή κάθε γονιδίου και εντοπίζεται στο 5 άκρο της κωδικής αλυσίδας. Κατά την έναρξη της μεταγραφής ενός γονιδίου, η RNA πολυμεράση προσδένεται στον υποκινητή με τη βοήθεια πρωτεϊνών που ονομάζονται μεταγραφικοί παράγοντες και προκαλεί τοπικό ξετύλιγμα της διπλής έλικας του DNA. Το μόριο RNA που συντίθεται είναι συμπληρωματικό και αντιπαράλληλο ως προς τη μια αλυσίδα της διπλής έλικας του DNA του γονιδίου. Η αλυσίδα αυτή είναι η μεταγραφόμενη και ονομάζεται μη κωδική. Η συμπληρωματική αλυσίδα του DNA του γονιδίου ονομάζεται κωδική. To RNA είναι το κινητό αντίγραφο της πληροφορίας ενός γονιδίου. Το κωδικόνιο έναρξης σε όλους τους οργανισμούς είναι το 5 AUG 3 και κωδικοποιεί το αμινοξύ μεθειονίνη. Υπάρχουν τρία κωδικόνια λήξης: το 5 UAG 3, το 5 UGA 3 και το 5 UAA 3. Η παρουσία των κωδικονίων αυτών στο μόριο του mrna οδηγεί στον τερματισμό της σύνθεσης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Ο όρος κωδικόνιο δεν αφορά μόνο το mrna αλλά και το γονίδιο από το οποίο παράγεται. Έτσι, για παράδειγμα, το κωδικόνιο έναρξης 5 AUG 3 αντιστοιχεί στο κωδικόνιο έναρξης της κωδικής αλυσίδας του γονιδίου 5 ATG 3. Το τμήμα ενός γονιδίου και του mrna του που κωδικοποιεί μια πολυπεπτιδική αλυσίδα, αρχίζει με το κωδικόνιο έναρξης και τελειώνει με το κωδικόνιο λήξης. 5

Συνδυαστικές ασκήσεις 2 ου & 4 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ 1. Ποιες κατηγορίες γονιδίων που υπάρχουν στο χρωμοσωμικό DNA ενός κυτταρικού τύπου δεν κλωνοποιούνται σε cdna βιβλιοθήκη; Δεν κλωνοποιούνται τα γονίδια που δεν µεταγράφονται σε mrna στο συγκεκριµένο κυτταρικό τύπο καθώς και τα γονίδια που µεταγράφονται σε trna, rrna, snrna. 2. Δίνεται το παρακάτω δίκλωνο τμήμα DNA το οποίο αντιγράφεται in vitro. 5 T A A G T A T A C T A A A C G A A T T C A T A T T A T 3 3 A T T C A T A T G A T T T G C T T A A G T A T A A T A 5 Κατά τη διάρκεια της αντιγραφής, οι DNA πολυμεράσες ενσωματώνουν κατά λάθος στη θέση 12, απέναντι από το νουκλεοτίδιο Α (αδενίνη) το νουκλεοτίδιο C (κυτοσίνη) αντί του νουκλεοτιδίου T (θυμίνη). Το λάθος αυτό παραμένει και μετά το τέλος της αντιγραφής. α) Να γράψετε τα δίκλωνα τμήματα DNA που θα προκύψουν μετά το τέλος της αντιγραφής και να δικαιολογήσετε την απάντησή σας. β) Πόσα τμήματα DNA θα προκύψουν, αν μετά το τέλος της αντιγραφής προσθέσουμε στο μείγμα το ένζυμο EcoRΙ; Να δικαιολογήσετε την απάντησή σας. α) Η διπλή έλικα του DNA ξετυλίγεται και κάθε αλυσίδα λειτουργεί σαν καλούπι για τη σύνθεση μιας νέας συμπληρωματικής αλυσίδας. Έτσι τα δύο θυγατρικά μόρια που προκύπτουν είναι πανομοιότυπα με το μητρικό και καθένα αποτελείται από μία παλιά και μία καινούργια αλυσίδα. Τα νέα μόρια DNA σχηματίζονται, καθώς δημιουργούνται δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των συμπληρωματικών αζωτούχων βάσεων Α=Τ και C G. Ο μηχανισμός αυτός ονομάστηκε ημισυντηρητικός. Τα κύρια ένζυμα που συμμετέχουν στην αντιγραφή του DNA ονομάζονται DNA πολυμεράσες. Οι DNA πολυμεράσες λειτουργούν μόνο προς καθορισμένη κατεύθυνση και τοποθετούν τα νουκλεοτίδια στο ελεύθερο 3' άκρο της δεοξυριβόζης του τελευταίου νουκλεοτιδίου κάθε αναπτυσσόμενης αλυσίδας. Μεταξύ των διαδοχικών νουκλεοτιδίων σχηματίζεται ο 3-5 φωσφοδιεστερικός δεσμός. Ο δεσμός αυτός δημιουργείται μεταξύ του υδροξυλίου του 3' άνθρακα της δεοξυριβόζης του πρώτου νουκλεοτιδίου και της φωσφορικής ομάδας που είναι συνδεδεμένη στον 5' άνθρακα της δεοξυριβόζης του επόμενου νουκλεοτιδίου. Έτσι, λέμε ότι η αντιγραφή γίνεται με προσανατολισμό 5' 3'. Κάθε νεοσυντιθέμενη αλυσίδα θα έχει προσανατολισμό 5' 3'. Στο δίκλωνο DNA, oι δύο αλυσίδες είναι αντιπαράλληλες, δηλαδή το 3' άκρο της μιας είναι απέναντι από το 5' άκρο της άλλης. Μετά την αντιγραφή του DNA: 1 ο θυγατρικό μόριο 5 T A A G T A T A C T A A A C G A A T T C A T A T T A T 3 καλούπι 3 A T T C A T A T G A T T T G C C T A A G T A T A A T A 5 συμπληρωματική διεύθυνση αντιγραφής θέση 12 (λάθος) 6

2 ο θυγατρικό μόριο διεύθυνση αντιγραφής 5 T A A G T A T A C T A A A C G A A T T C A T A T T A T 3 συμπληρωματική 3 A T T C A T A T G A T T T G C T T A A G T A T A A T A 5 καλούπι β) Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυμα, βακτηριακής προέλευσης, που αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA. Η EcoRI, που απομονώθηκε από το βακτήριο Escherichia coli, αναγνωρίζει την αλληλουχία: 5' GΑΑΤΤC 3' 3' CΤΤAAG 5' στο γονιδίωμα και κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ G και Α, με κατεύθυνση 5' 3', αφήνοντας μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις στα κομμένα άκρα. 1 ο θυγατρικό μόριο: Στο πρώτο μόριο δεν υπάρχει η συγκεκριμένη αλληλουχία που αναγνωρίζει η περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI, οπότε έχουμε ένα τμήμα DNA. 5 T A A G T A T A C T A A A C G A A T T C A T A T T A T 3 3 A T T C A T A T G A T T T G C C T A A G T A T A A T A 5 2 ο θυγατρικό μόριο: Στο δεύτερο μόριο υπάρχει μια φορά η συγκεκριμένη αλληλουχία, οπότε προκύπτουν δύο τμήματα DNA. 5 T A A G T A T A C T A A A C G A A T T C A T A T T A T 3 συμπληρωματική 3 A T T C A T A T G A T T T G C T T A A G T A T A A T A 5 καλούπι Επομένως, αν μετά το τέλος της αντιγραφής προσθέσουμε στο μείγμα την EcoRI, θα προκύψουν τρία τμήματα DNA. 3. Δίνεται το παρακάτω τμήμα βακτηριακού DNA, το οποίο κωδικοποιεί ένα ολιγοπεπτίδιο. Αλυσίδα 1: G T T G A A T T C T T A G C T T A A G T C G G G C A T G A A T T C T C Αλυσίδα 2: C A A C T T A A G A A T C G A A T T C A G C C C G T A C T T A A G A G α) Να προσδιορίσετε την κωδική και τη μη κωδική αλυσίδα του παραπάνω τμήματος DNA, επισημαίνοντας τα 5 και 3 άκρα των αλυσίδων του. Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. β) Το παραπάνω τμήμα DNA αντιγράφεται, και κατά τη διαδικασία της αντιγραφής δημιουργούνται τα παρακάτω πρωταρχικά τμήματα: i) 5 -GAGAAUUC-3 ii) 5 -UUAAGCUA-3 iii) 5 -GUUGAAUU-3 Να προσδιορίσετε ποια αλυσίδα αντιγράφεται, με συνεχή και ποια με ασυνεχή τρόπο. Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. γ) Το παραπάνω τμήμα DNA κόβεται με το ένζυμο EcoRI, προκειμένου να ενσωματωθεί σε ένα από τα δύο πλασμίδια Α και Β που δίνονται παρακάτω: 7

Ποιο από τα δύο πλασμίδια θα επιλέξετε για τη δημιουργία ανασυνδυασμένου πλασμιδίου; Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. Πόσοι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί θα διασπαστούν στο πλασμίδιο που επιλέξατε και πόσοι θα δημιουργηθούν κατά το σχηματισμό του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου; σ) H κωδική αλυσίδα DNA του γονιδίου όσο και το mrna του γονιδίου είναι συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες ως προς τη μεταγραφόμενη αλυσίδα του DNA του γονιδίου, τη μη κωδική, με τη διαφορά ότι όπου υπάρχει Τ στην κωδική αλυσίδα, στο mrna υπάρχει U στις αντίστοιχες θέσεις. Το κωδικόνιο έναρξης του mrna είναι το 5 -AUG-3 και το αντίστοιχο κωδικόνιο στην κωδική αλυσίδα του DNA του γονιδίου είναι το 5 -ATG-3. Το κωδικόνιο λήξης του mrna είναι είτε το 5 -UAG-3 είτε το 5 -UGA-3 είτε το 5 -UAA-3 και αντίστοιχα στην κωδική αλυσίδα DNA του γονιδίου τα κωδικόνια είναι είτε το 5 -ΤAG-3 είτε το 5 -ΤGA-3 είτε το 5 -ΤAA-3. Τα νουκλεοτίδια (αζωτούχες βάσεις) ανάμεσα στο κωδικόνιο έναρξης και στο κωδικόνιο λήξης διαβάζονται ανά τριάδες (κώδικας τριπλέτας), συνεχή και μη επικαλυπτόμενα. Δύο πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες είναι μεταξύ τους αντιπαράλληλες, δηλαδή το 3 άκρο της μιας είναι απέναντι από το 5 άκρο της άλλης. Ακόμη, το βακτηριακό DNA δεν περιέχει ενδιάμεσες αμετάφραστες περιοχές, τα εσώνια. μη κωδική κωδική 5 G T T G A A T T C T T A G C T T A A G T C G G G C A T G A A T T C T C 3 3 C A A C T T A A G A A T C G A A T T C A G C C C G T A C T T A A G A G 5 κωδικόνιο λήξης κωδικόνιο έναρξης β) Οι DΝΑ πολυμεράσες λειτουργούν μόνο προς καθορισμένη κατεύθυνση και τοποθετούν τα νουκλεοτίδια στο ελεύθερο 3' άκρο της δεοξυριβόζης του τελευταίου νουκλεοτιδίου κάθε αναπτυσσόμενης αλυσίδας επιμηκύνοντας τα πρωταρχικά τμήματα RNA. Έτσι, λέμε ότι η αντιγραφή γίνεται με προσανατολισμό 5' 3'. Μεταξύ των διαδοχικών νουκλεοτιδίων σχηματίζεται ο 3-5 φωσφοδιεστερικός δεσμός. Ο δεσμός αυτός δημιουργείται μεταξύ του υδροξυλίου του 3' άνθρακα της δεοξυριβόζης του πρώτου νουκλεοτιδίου και της φωσφορικής ομάδας που είναι συνδεδεμένη στον 5' άνθρακα της δεοξυριβόζης του επόμενου νουκλεοτιδίου. Κάθε νεοσυντιθέμενη αλυσίδα θα έχει προσανατολισμό 5' 3'. Έτσι, σε κάθε διπλή έλικα που παράγεται οι δύο αλυσίδες θα είναι αντιπαράλληλες. Για να ακολουθηθεί αυτός ο κανόνας σε κάθε τμήμα DΝΑ που γίνεται η αντιγραφή, η σύνθεση του DΝΑ είναι συνεχής στη μια αλυσίδα και ασυνεχής στην άλλη. Επειδή οι DNA πολυμεράσες δεν έχουν την ικανότητα να αρχίσουν την αντιγραφή, το κύτταρο έχει ένα ειδικό σύμπλοκο που αποτελείται από πολλά ένζυμα, το πριμόσωμα, το οποίο συνθέτει στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής μικρά τμήματα RNA, συμπληρωματικά και αντιπαράλληλα προς τις μητρικές αλυσίδες, τα οποία ονομάζονται πρωταρχικά τμήματα. Αφού η αντιγραφή γίνεται με προσανατολισμό 5 3 και το πρωταρχικό τμήμα που τοποθετείται στη θέση έναρξης της αντιγραφής θα έχει τον ίδιο 8

προσανατολισμό. Οι αζωτούχες βάσεις τoυ πρωταρχικού τμήματος (i) και οι αζωτούχες βάσεις του πρωταρχικού τμήματος (ii) είναι συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες με αζωτούχες βάσεις που εντοπίζονται στην 1 η αλυσίδα ενώ οι αζωτούχες βάσεις του πρωταρχικού τμήματος (iii) είναι συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες με αζωτούχες βάσεις που εντοπίζονται στην 2 η αλυσίδα. Εφόσον στην 1 η αλυσίδα υπάρχουν δύο πρωταρχικά τμήματα, η αλυσίδα αυτή αντιγράφεται με ασυνεχή τρόπο και η 2 η αλυσίδα με συνεχή τρόπο. γ) Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυμα, βακτηριακής προέλευσης, που αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA. Η EcoRI, που απομονώθηκε από το βακτήριο Escherichia coli, αναγνωρίζει την αλληλουχία: 5' GΑΑΤΤC 3' 3' CΤΤAAG 5' στο γονιδίωμα και κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ G και Α, με κατεύθυνση 5' 3', αφήνοντας μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις στα κομμένα άκρα. Συνεπώς, θα επιλέξουμε το πλασμίδιο Α γιατί μόνο εκεί υπάρχει η συγκεκριμένη αλληλουχία. Επειδή η EcoRI κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ του νουκλεοτιδίου της G και του νουκλεοτιδίου της Α σπάζοντας τον 3-5 φ.δ., συνολικά θα διασπαστούν 2 φ.δ. στο δίκλωνο DNA του πλασμιδίου. Κατά το σχηματισμό του ανασυνδυασμένου DNA πλασμιδίου, θα σχηματισμούν 4 φ.δ. με τη δράση του ενζύμου DNA δεσμάση. 4. Δίνεται μείγμα μορίων DNA και ένας ανιχνευτής RNA. DNA μόριο Ι DNA μόριο ΙI Ανιχνευτής Κλώνος Κλώνος Ια 5 T A C C T C A A T C C G T A T T A 3 Ιβ 3 A T G G A G T T A G G C A T A A T 5 Κλώνος IΙα 3 C C G T A C G G A T T G A G G A A 5 Κλώνος IΙβ 5 G G C A T G C C T A A C T C C T T 3 5 U A C G G A U U G A 3 Nα περιγράψετε τις διαδικασίες που θα ακολουθούν προκειμένου ο ανιχνευτής να υβριδοποιήσει την κατάλληλη αλληλουχία DNA και να εξηγήσετε ποιος είναι ο κλώνος του DNA που θα υβριδοποιηθεί. 9

Αποδιάταξη: Επίδραση στο μείγμα μορίων DNA Ι και ΙΙ που απομονώθηκαν με κατάλληλες χημικές ουσίες ή με αύξηση της θερμοκρασίας οπότε σπάζουν οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των δύο συμπληρωματικών αλυσίδων και οι δύο αλυσίδες αποχωρίζονται η μία από την άλλη. Υβριδοποίηση: Οι δύο μονόκλωνες συμπληρωματικές αλυσίδες σε κατάλληλες συνθήκες μπορούν να επανασυνδεθούν. Στην ιδιότητα αυτή στηρίζεται η διαδικασία της υβριδοποίησης που είναι η σύνδεση μονόκλωνων συμπληρωματικών αλυσίδων DNA- DNA ή συμπληρωματικών αλυσίδων DNA-RNA. Η υβριδοποίηση είναι μια πολύ σημαντική ιδιότητα του DNA που μας δίνει τη δυνατότητα αν έχουμε έναν ανιχνευτή να το χρησιμοποιήσουμε για τον εντοπισμό του συμπληρωματικού του μορίου, όταν αυτό βρίσκεται μαζί με άλλα κομμάτια. Εντοπισμός: Η αλληλουχία των αζωτούχων βάσεων του ανιχνευτή, γνωστό μονόκλωνο μόριο DNA ή RNA πρέπει να είναι συμπληρωματική και αντιπαράλληλη ως προς την αλληλουχία των αζωτούχων βάσεων του τμήματος DNA του μορίου που θέλουμε να εντοπίσουμε, αφού προηγουμένως έχει αποδιαταχθεί. Ιχνηθέτηση: Η σήμανση χημικών μορίων, για παράδειγμα του ανιχνευτή, με τη χρήση ραδιενεργών ισοτόπων ή φθοριζουσών ουσιών, γίνεται για τον εύκολο εντοπισμό της περιοχής του DNA που μας ενδιαφέρει. Επομένως, ο ανιχνευτής εντοπίζει το DNA μόριο Ι και συγκεκριμένα το κλώνο Ια: DNA μόριο Ι Κλώνος Ια 5 T A C C T C A A T C C G T A T T A 3 Ανιχνευτής 3 A G U U A G G C A U 5 5. Παρακάτω σας δίνονται τέσσερις μονόκλωνες αλυσίδες DNA: 1. 5 - A A A T G A A A C C A G G A T A A G - 3 2. 5 - A A T T C G G G G G G C - 3 3. 5 - A A T T C T T A T C C T G G T T T C A T T T - 3 4. 5 - A A T T G C C C C C C G - 3 Οι αλυσίδες αυτές τοποθετούνται σε κατάλληλο περιβάλλον υβριδοποίησης. α) Να γράψετε τα μόρια DNA που θα προκύψουν μετά την υβριδοποίηση, τα οποία θα ονομάσετε υβριδοποιημένο μόριο 1 και υβριδοποιημένο μόριο 2. β) Στο ένα από τα δύο υβριδοποιημένα μόρια DNA που θα προκύψουν εμπεριέχεται γονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί ένα ολιγοπεπτίδιο. Να γράψετε το mrna που θα προκύψει και να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. γ) Το πεπτίδιο που προκύπτει από τη μετάφραση του παραπάνω mrna είναι: H 2 N Μεθειονίνη Λυσίνη Προλίνη Γλυκίνη COOH Ποιο είναι το αντικωδικόνιο του trna που θα τοποθετηθεί στο ριβόσωμα μετά την αποσύνδεση του trna, το οποίο μεταφέρει το αμινοξύ λυσίνη; Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. δ) Στα υβριδοποιημένα μόρια 1 και 2 προστίθεται το ένζυμο DNA δεσμάση. Να γράψετε τα πιθανά ανασυνδυασμένα μόρια DNA που θα προκύψουν από την δράση της DNA δεσμάσης, σημειώνοντας τους προσανατολισμούς των αλυσίδων και αιτιολογώντας την απάντησή σας. Εάν στη συνέχεια προστεθεί η περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI, να εξηγήσετε πόσα τμήματα DNA θα προκύψουν. 10

α) Υβριδοποιημένο μόριο 1: Αλυσίδα DNA 1: 5 - A A A T G A A A C C A G G A T A A G - 3 Αλυσίδα DNA 3: 3 - T T T A C T T T G G T C C T A T T C T T A A - 5 Υβριδοποιημένο μόριο 2: Αλυσίδα DNA 4: 5 - A A T T G C C C C C C G - 3 Αλυσίδα DNA 2: 3 - C G G G G G G C T T A A - 5 β) Το mrna μεταγράφεται με προσανατολισμό 5 3. Η κωδική αλυσίδα DNA του γονιδίου και το mrna του γονιδίου είναι συμπληρωματικές και αντιπαράλληλες ως προς τη μεταγραφόμενη αλυσίδα DNA του γονιδίου, τη μη κωδική, με τη διαφορά ότι όπου στην κωδική αλυσίδα υπάρχει Τ, στο mrna υπάρχει αντίστοιχα U. Επομένως, κωδική αλυσίδα DNA γονιδίου και mrna έχουν τον ίδιο προσανατολισμό και τα ίδια άκρα 5 και 3 άκρα. Επομένως, εντοπίζουμε στην αλληλουχία των αζωτούχων βάσεων, το κωδικόνιο έναρξης και με βήμα τριπλέτας, συνεχή και μη επικαλυπτόμενα, το κωδικόνιο λήξης. Στο υβριδοποιημένο μόριο 1: κωδικόνιο έναρξης κωδικόνιο λήξης κωδική 5 - A A A T G A A A C C A G G A T A A G - 3 μη κωδική 3 - T T T A C T T T G G T C C T A T T C T T A A - 5 mrna 5 - A A A U G A A A C C A G G A U A A G - 3 γ) H μετάφραση του mrna στα ριβοσώματα γίνεται με κατεύθυνση 5 3. Το κωδικόνιο έναρξης 5 AUG 3 του mrna κωδικοποιεί το αμινοξύ Η 2 Ν-met-COOH (μεθειονίνης) ενώ το κωδικόνιο λήξης δεν κωδικοποιεί κάποιο αμινοξύ. Επομένως, απέναντι από το 5 άκρο του mrna αντιστοιχεί το αμινικό άκρο (Η 2 Ν) της πεπτιδικής αλυσίδας και απέναντι από το 3 άκρο του mrna αντιστοιχεί το καρβοξυλικό άκρο (COOH) της πεπτιδικής αλυσίδας. Δηλαδή, η μεθειονίνη είναι το πρώτο αμινοξύ και η γλυκίνη το τελευταίο αμινοξύ της πεπτιδικής αλυσίδας. Κάθε ριβόσωμα αποτελείται από δύο υπομονάδες, μια μικρή και μια μεγάλη. Το ριβόσωμα έχει μια θέση πρόσδεσης του mrna στη μικρή υπομονάδα και δύο θέσεις εισδοχής των trna στη μεγάλη υπομονάδα. Στη μετάφραση, κατά τη διαδικασία της επιμήκυνσης της πεπτιδικής αλυσίδας, όταν το trna που μεταφέρει το αμινοξύ λυσίνη αποσυνδέεται από το ριβόσωμα και απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα, το ριβόσωμα κινείται κατά μήκος του mrna κατά ένα κωδικόνιο. Το trna που μεταφέρει το αμινοξύ προλίνη βρίσκεται ήδη πάνω στη μεγάλη υπομονάδα του ριβοσώματος και μετακινείται προς την 1 η θέση εισδοχής της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος. Έτσι απελευθερώνεται η 2 η θέση εισδοχής στη μεγάλη υπομονάδα του ριβοσώματος και εισέρχεται το trna που μεταφέρει τη γλυκίνη. Το κωδικόνιο του mrna 5 GGA 3 κωδικοποιεί τη γλυκίνη, η μεταφορά της οποίας γίνεται από το trna με αντικωδικόνιο 3 CCU 5 (συμπληρωματικό και αντιπαράλληλο) ως προς το κωδικόνιο του mrna. δ) Τα υβριδοποιημένα μόρια 1 και 2 παρουσιάζουν μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις που μπορούν να συνδεθούν μεταξύ τους λόγω συμπληρωματικότητας αζωτούχων βάσεων. Με τη δράση της DNA δεσμάσης ( ) μπορούν να συνενωθούν τα υβριδοποιημένα μόρια 1 και 2 ώστε να προκύψουν τα ανασυνδυασμένα μόρια 1 και 2, με τη δημιουργία του 3-5 φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ του νουκλεοτιδίου που έχει 11

ελεύθερο υδροξύλιο (3 ) στο ένα μόριο και του νουκλεοτιδίου που έχει ελεύθερη φωσφορική ομάδα (5 ) στο άλλο μόριο. Ανασυνδυασμένο μόριο 1: 3 ( ) 5 5 - A A A T G A A A C C A G G A T A A G A A T T C G G G G G G C 3 3 - T T T A C T T T G G T C C T A T T C T T A A G C C C C C C G T T A A 5 Υβριδοποιημένο μόριο 1 5 ( ) 3 Υβριδοποιημένο μόριο 2 Ανασυνδυασμένο μόριο 2: 3 ( ) 5 5 - A A A T G A A A C C A G G A T A A G A A T T G C C C C C C G 3 3 - T T T A C T T T G G T C C T A T T C T T A A C G G G G G G C T T A A 5 Υβριδοποιημένο μόριο 1 5 ( ) 3 Υβριδοποιημένο μόριο 2 Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυμα, βακτηριακής προέλευσης, που αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA. Η EcoRI, που απομονώθηκε από το βακτήριο Escherichia coli, αναγνωρίζει την αλληλουχία: 5' GΑΑΤΤC 3' 3' CΤΤAAG 5' στο γονιδίωμα και κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ G και Α, με κατεύθυνση 5' 3', αφήνοντας μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις στα κομμένα άκρα. Στο ανασυνδυασμένο μόριο 1 υπάρχει μόνο μια φορά η συγκεκριμένη αλληλουχία που αναγνωρίζει η περιοριστική ενδονουκλεάση, οπότε προκύπτουν δύο τμήματα DNA: 5 - A A A T G A A A C C A G G A T A A G A A T T C G G G G G G C - 3 3 - T T T A C T T T G G T C C T A T T C T T A A G C C C C C C G T T A A - 5 Στο ανασυνδυασμένο μόριο 2 δεν υπάρχει η συγκεκριμένη αλληλουχία που αναγνωρίζει η περιοριστική ενδονουκλεάση, οπότε έχουμε 1 τμήμα DNA: 5 - A A A T G A A A C C A G G A T A A G A A T T G C C C C C C G - 3 3 - T T T A C T T T G G T C C T A T T C T T A A C G G G G G G C T T A A - 5 Επομένως, με τη δράση της EcoRI, προκύπτουν συνολικά 3 τμήματα DNA. 6. Στην Εικόνα 1 δίνεται ένα πλασμίδιο που φέρει γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά αμπικιλίνη και στρεπτομυκίνη, έναν υποκινητή και αλληλουχίες λήξης της μεταγραφής. Στις θέσεις Α, Β, Γ και Δ βρίσκονται αλληλουχίες, οι οποίες αναγνωρίζονται από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες α, β, γ και δ αντίστοιχα. Το πλασμίδιο αυτό το χρησιμοποιούμε ως φορέα για την κλωνοποίηση ενός ανθρώπινου συνεχούς γονιδίου με σκοπό να παράγουμε ένα ολιγοπεπτίδιο σε καλλιέργειες in vitro. Στα βακτήρια που θα χρησιμοποιηθούν για τον μετασχηματισμό περιέχονται όλοι οι μεταγραφικοί παράγοντες που απαιτούνται για τη μεταγραφή και δεν περιέχονται πλασμίδια. 12

Εικόνα 1 α) Ποια από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες α, β, γ και δ είναι η κατάλληλη για τη χρήση του πλασμιδίου αυτού ως φορέα κλωνοποίησης; Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. β) Με ποιον τρόπο μπορούμε να επιλέξουμε τους βακτηριακούς κλώνους που έχουν προσλάβει πλασμίδιο (ανασυνδυασμένο ή μη) από τους κλώνους που δεν έχουν προσλάβει πλασμίδιο; Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. Στην Εικόνα 2 δίνεται τμήμα DNA το οποίο περιέχει το συνεχές ανθρώπινο γονίδιο που επιθυμούμε να εισαγάγουμε στο πλασμίδο της Εικόνας 1. Αλυσίδα I Αλυσίδα II OH- G C C A A T A T T A A A T G A G C A T G C C G T A G G A A T A T T C G G C G G T T A T A A T T T A C T C G T A C G G C A T C C T T A T A A G C C Εικόνα 2 γ) Να εντοπίσετε την κωδική αλυσίδα του γονιδίου της Εικόνας 2. Να γράψετε το mrna και να σημειώσετε τον προσανατολισμό του. Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. δ) Σύμφωνα με την Εικόνα 2, να γράψετε την αλληλουχία μήκους έξι ζευγών βάσεων που αναγνωρίζει η περιοριστική ενδονουκλεάση την οποία προσδιορίσατε στο ερώτημα Δ1, για την κλωνοποίηση του γονιδίου. ε) Να εξηγήσετε γιατί η κλωνοποίηση του γονιδίου της Εικόνας 2 στο πλασμίδο της Εικόνας 1 μπορεί να οδηγήσει: i) στη δημιουργία βακτηριακών κλώνων που παράγουν το ολιγοπεπτίδιο και ii) στη δημιουργία βακτηριακών κλώνων που δεν παράγουν το ολιγοπεπτίδιο παρόλο που περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. α) Το πλασμίδιο έχει δίκλωνο και κυκλικό DNA. Το πλασμίδιο που χρησιμοποιείται ως φορέας κλωνοποίησης πρέπει να έχει τη συγκεκριμένη αλληλουχία που αναγνωρίζει και κόβει μια περιοριστική ενδονουκλεάση μόνο μια φορά. Έτσι το πλασμίδιο μετατρέπεται σε γραμμικό μόριο DNA, με μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις. Το πλασμίδιο μπορεί να γίνει ξανά δίκλωνο όταν αναμιγνύεται με το κομμάτι DNA του οργανισμού-δότη που έχει προκύψει από τη δράση της ίδιας περιοριστικής ενδονουκλεάσης, επειδή τόσο στο πλασμίδιο όσο και στο τμήμα DNA του οργανισμού-δότη υπάρχουν μονόκλωνα, συμπληρωματικά άκρα και κυκλικό με τη δράση της DNA δεσμάσης, με τη δημιουργία του 3-5 φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ του νουκλεοτιδίου που έχει ελεύθερο υδροξύλιο 13

(3 ) στο ένα μόριο και του νουκλεοτιδίου που έχει ελεύθερη φωσφορική ομάδα (5 ) στο άλλο μόριο. Επομένως, η κατάλληλη περιοριστική ενδονουκλέαση για το συγκεκριμένο πλασμίδιο είναι η δ. Η περιοριστική ενδονουκλεάση γ απορρίπτεται γιατί κόβει το DNA μέσα στην περιοχή του υποκινητή, άρα δεν θα μπορούσε να προσδεθεί η RNA πολυμεράση για να ξεκινήσει η μεταγραφή του γονιδίου, ενώ οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες α και β κόβουν το πλασμίδιο σε δύο διαφορετικά σημεία, άρα δεν θα μπορούσε να γίνει ξανά κυκλικό. β) Συνήθως χρησιμοποιούνται ως ξενιστές, βακτήρια που δεν έχουν πλασμίδια και επομένως είναι ευαίσθητα σε αντιβιοτικά. Για να μπει ένα πλασμίδιο μέσα στο βακτήριο, τα τοιχώματα του βακτηρίου γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια, μετά από κατάλληλη κατεργασία (μετασχηματισμός). Η επιλογή των μετασχηματισμένων βακτηρίων, δηλαδή αυτών που δέχτηκαν κάποιο πλασμίδιο στηρίζεται στην ικανότητα ανάπτυξής τους σε καλλιέργεια παρουσία αντιβιοτικού, επειδή το πλασμίδιο περιέχει γονίδια που προσδίδουν στα βακτήρια-ξενιστές ανθεκτικότητα στο συγκεκριμένο αντιβιοτικό. Σε θρεπτικό υλικό καλλιέργειας που έχουμε προσθέσει το αντιβιοτικό αμπικιλίνη ή στρεπτομυκίνη, αναπτύσσονται μόνο τα μετασχηματισμένα βακτήρια, δηλαδή αυτά που φέρουν το συγκεκριμένο πλασμίδιο, με ανασυνδυασμένο DNA ή μη, δημιουργώντας κλώνο βακτηρίων. Όσα βακτήρια δεν μετασχηματίστηκαν είναι ευαίσθητα στην παρουσία του αντιβιοτικού και συνεπώς δεν πολλαπλασιάζονται. γ) Κάθε πολυνουκλεοτική αλυσίδα έχει ένα ελεύθερο 5 άκρο (φωσφορική ομάδα) και ένα ελεύθερο 3 άκρο (υδροξύλιο). Οι δύο αλυσίδες του DNA είναι μεταξύ τους αντιπαράλληλες, δηλαδή απέναντι από το 5 άκρο της μιας αλυσίδας βρίσκεται το 3 άκρο της άλλης αλυσίδας. Στην αλυσίδα Ι, με προσανατολισμό 5 3, εντοπίζουμε το κωδικόνιο έναρξης 5 ATG 3 και με βήμα τριπλέτας, συνεχή και μη επικαλυπτόμενα, το κωδκόνιο λήξης 5 ΤΑΑ 3. Άρα η αλυσίδα Ι είναι η κωδική. Η αλυσίδα ΙΙ είναι η μη κωδική, η οποία είναι συμπληρωματική και αντιπαράλληλη ως προς την αλυσίδα Ι του γονιδίου. Η μεταγραφή γίνεται με προσανατολισμό 5 3. Το mrna είναι συμπληρωματικό και αντιπαράλληλο με τη μη κωδική αλυσίδα του γονιδίου, τη μεταγραφόμενη αλυσίδα του γονιδίου. Κωδική αλυσίδα DNA του γονιδίου και mrna έχουν τον ίδιο προσανατολισμό, τα ίδια άκρα 5 και 3, την ίδια αλληλουχία αζωτούχων βάσεων με τη μόνη διαφορά ότι όπου στην κωδική αλυσίδα υπάρχει Τ, στο mrna υπάρχει αντίστοιχα U κωδικόνιο λήξης κωδικόνιο έναρξης Αλυσίδα Ι (κωδική) 3 G C C A A T A T T A A A T G A G C A T G C C G T A G G A A T A T T C G G 5 Αλυσίδα ΙΙ (μη κωδική) 5 C G G T T A T A A T T T A C T C G T A C G G C A T C C T T A T A A G C C 3 mrna 3 G C C A A U A U U A A A U G A G C A U G C C G U A G G A A U A U U C G G 5 δ) Η περιοριστική ενδονουκλεάση αναγνωρίζει την αλληλουχία αζωτούχων βάσεων: 3 A A T A T T 5 5 T T A T A A 3 η οποία εντοπίζεται στα άκρα του γονιδίου: 3 G C C A A T A T T A A A T G A G C A T G C C G T A G G A A T A T T C G G 5 5 C G G T T A T A A T T T A C T C G T A C G G C A T C C T T A T A A G C C 3 14

ε) Ένα γονίδιο για να εκφραστεί πρέπει να φέρει κατά σειρά την περιοχή του υποκινητή, πάνω στην οποία προσδένεται η RNA πολυμεράση για να ξεκινήσει η μεταγραφή του γονιδίου, το κωδικόνιο έναρξης, το κωδικόνιο λήξης και την αλληλουχία λήξης της μεταγραφής. i) Οι βακτηριακοί κλώνοι παράγουν το ολιγοπεπτίδιο. Στην περίπτωση αυτή, στην κωδική αλυσίδα του γονιδίου, μετά την περιοχή του υποκινητή, υπάρχει κωδικόνιο έναρξης και με βήμα τριπλέτας κωδικόνιο λήξης, άρα μπορεί να γίνει μεταγραφή και μετάφραση του παραπάνω τμήματος DNA. ii) Οι βακτηριακοί κλώνοι δεν παράγουν το ολιγοπεπτίδιο. Στην περίπτωση αυτή, στην κωδική αλυσίδα του γονιδίου, μετά την περιοχή του υποκινητή, δεν υπάρχει κωδικόνιο έναρξης, άρα δεν μπορεί να γίνει η γονιδιακή έκφραση του παραπάνω τμήματος DNA. 15

Ασκήσεις 5 ου ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ 1. Στο φυτό μοσχομπίζελο το χρώμα των σπερμάτων μπορεί να είναι είτε κίτρινο είτε πράσινο, ενώ το ύψος του είναι είτε ψηλό είτε κοντό. Τα γονίδια που ελέγχουν τις παραπάνω ιδιότητες βρίσκονται σε διαφορετικά ζεύγη ομολόγων χρωμοσωμάτων. Εάν έχετε στη διάθεσή σας ένα ψηλό μοσχομπίζελο με κίτρινα σπέρματα, να κάνετε τις κατάλληλες διασταυρώσεις που απαιτούνται για να βρείτε το γονότυπό του. Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. Για να βρούμε το γονότυπο του φυτού με φαινότυπο κίτρινο ψηλό πρέπει να κάνουμε διασταύρωση ελέγχου. Διασταύρωση ελέγχου ονομάζεται η διασταύρωση ενός ατόμου άγνωστου γονότυπου με ένα άτομο ομόζυγο για το υπολειπόμενο αλληλόμορφο το οποίο έχει ένα μόνο φαινότυπο. Συνεπώς, ο χαρακτήρας κίτρινο χρώμα σπέρματος ελέγχεται από το επικρατές αλληλόμορφο (Κ) και μπορεί να έχει γονότυπο ΚΚ ή Κκ. Ο χαρακτήρας ύψος μοσχομπίζελου ψηλό ελέγχεται από το επικρατές αλληλόμορφο (Ψ) και μπορεί να έχει γονότυπο ΨΨ ή Ψψ. Επομένως, το φυτά με φαινότυπο κίτρινο ψηλό μπορεί να έχει 4 διαφορετικούς γονότυπους: ΨΨΚΚ, ΨψΚΚ, ΨΨΚκ και ΨψΚκ. Με βάση τις φαινοτυπικές αναλογίες των απογόνων που προκύπτουν από τις παρακάτω διασταυρώσεις ελέγχου μπορούμε να προσδιορίσουμε το γονότυπο του φυτού που ψάχνουμε. ψηλό-κίτρινο πράσινο-κοντό α) P: ΨΨΚΚ x ψψκκ Γαμέτες: ΨΚ ψκ Απόγονοι: ΨψΚκ Φαινοτυπική αναλογία: όλα τα φυτά με ψηλά και κίτρινα σπέρματα ψηλό-κίτρινο πράσινο-κοντό β) P: ΨψΚΚ x ψψκκ Γαμέτες: ΨΚ, ψκ ψκ Απόγονοι: ΨψΚκ, ψψκκ Φαινοτυπική αναλογία: φυτά ψηλά με κίτρινα σπέρματα φυτά κοντά με κίτρινα σπέρματα ψηλό-κίτρινο πράσινο-κοντό γ) P: ΨΨΚκ x ψψκκ Γαμέτες: ΨΚ, Ψκ ψκ F 1 : ΨψΚκ, Ψψκκ Φαινοτυπική αναλογία: φυτά ψηλά με κίτρινα σπέρματα φυτά ψηλά με πράσινα σπέρματα 16

ψηλό-κίτρινο πράσινο-κοντό δ) P: ΨψΚκ x ψψκκ Γαμέτες: ΨΚ, Ψκ, ψκ, ψκ ψκ F 1 : ΨψΚκ, Ψψκκ, ψψκκ, ψψκκ Φαινοτυπική αναλογία: φυτά ψηλά με κίτρινα σπέρματα φυτά ψηλά με πράσινα σπέρματα φυτά κοντά με κίτρινα σπέρματα φυτά κοντά με πράσινα σπέρματα Σύμφωνα με τον 1 ο νόμο του Μέντελ ή νόμο του διαχωρισμού των αλληλόμορφων γονιδίων, κατά την παραγωγή των γαμετών κατά τη μείωση διαχωρίζονται τα δύο ομόλογα χρωμοσώματα και συνεπώς και τα δύο αλληλόμορφα γονίδια. Σε ένα φυτό ετερόζυγου γονότυπου σχηματίζονται δύο ειδών γαμέτες σε ίση αναλογία ενώ σ ένα φυτό ομόζυγου γονότυπου προκύπτει μόνο ένας τύπος γαμέτη. Σύμφωνα με τον 2 ο νόμο του Μέντελ ή νόμο της ανεξάρτητης μεταβίβασης των γονιδίων, το γονίδιο που ελέγχει ένα χαρακτήρα δεν επηρεάζει τη μεταβίβαση του γονιδίου που ελέγχει έναν άλλο χαρακτήρα. Σήμερα είναι γνωστό ότι αυτό ισχύει μόνο για γονίδια που βρίσκονται σε διαφορετικά ζεύγη ομόλογων χρωμοσωμάτων. Ο ανεξάρτητος διαχωρισμός των γονιδίων γίνεται, επειδή τα χρωμοσώματα κάθε γονέα συνδυάζονται με τυχαίο τρόπο κατά τη δημιουργία των γαμετών. Σε κάθε διασταύρωση, οι απόγονοι προκύπτουν από τον τυχαίο συνδυασμό των γαμετών. 2. Θεωρούμε τρία φυτά που παράγουν κίτρινα και στρογγυλά μπιζέλια. Τα τρία φυτά τα συμβολίζουμε με Α, Β, Γ. Το καθένα από αυτά τα φυτά διασταυρώνεται με φυτό που παράγει πράσινα και ρυτιδωμένα μπιζέλια που συμβολίζεται με Δ. Από κάθε διασταύρωση παράγονται 100 φυτά. Η διασταύρωση Α x Δ έδωσε: 51 φυτά που παράγουν κίτρινα και στρογγυλά μπιζέλια και 49 φυτά που παράγουν πράσινα και στρογγυλά μπιζέλια Η διασταύρωση Β x Δ έδωσε: 100 φυτά που παράγουν κίτρινα και στρογγυλά μπιζέλια Η διασταύρωση Γ x Δ έδωσε: 24 φυτά που παράγουν κίτρινα και στρογγυλά μπιζέλια 26 φυτά που παράγουν κίτρινα και ρυτιδωμένα μπιζέλια 25 φυτά που παράγουν πράσινα και στρογγυλά μπιζέλια 25 φυτά που παράγουν πράσινα και ρυτιδωμένα μπιζέλια Θεωρούμε ότι τα γονίδια που ελέγχουν την έκφραση των γνωρισμάτων βρίσκονται σε διαφορετικά ζεύγη ομολόγων χρωμοσωμάτων. α) Να αιτιολογήσετε τον τρόπο με τον οποίο κληρονομούνται τα δύο γνωρίσματα. β) Να αιτιολογήσετε τους γονοτύπους των Α, Β και Γ φυτών. Φυτό Α Φυτό Β κίτρινα, στρογγυλά Φυτό Γ Φυτό Δ πράσινα, ρυτιδωμένα 17

α) Από τη διασταύρωση B (κίτρινα-στρογγυλά) x Δ (πράσινα-ρυτιδωμένα), όλοι οι απόγονοι (100 φυτά) έχουν κίτρινα και στρογγυλά μπιζέλια. Επομένως, τα γνωρίσματα κίτρινα και στρογγυλά ελέγχονται από τα επικρατή αλληλόμορφα των γονιδίων τους: Κ: κίτρινα Σ: στρογγυλά κ: πράσινα σ: ρυτιδωμένα Από τη διασταυρώση Γ (κίτρινα-στρογγυλά) x Δ (πράσινα-ρυτιδωμένα), οι φαινοτυπικές αναλογίες στους απογόνους είναι 1 : 1 : 1 : 1, ανεξαρτήτως φύλου, γεγονός που δείχνει ότι έχουμε αυτοσωμική κληρονομικότητα. Για την κληρονόμηση κάθε χαρακτηριστικού ισχύει ο 1 ος νόμος του Μέντελ ή νόμος του διαχωρισμού των αλληλόμορφων γονιδίων, κατά την παραγωγή των γαμετών κατά τη μείωση διαχωρίζονται τα δύο ομόλογα χρωμοσώματα και συνεπώς και τα δύο αλληλόμορφα γονίδια. Σε ένα φυτό ετερόζυγου γονότυπου σχηματίζονται δύο ειδών γαμέτες σε ίση αναλογία ενώ σ ένα φυτό ομόζυγου γονότυπου προκύπτει μόνο ένας τύπος γαμέτη. Για την κληρονόμηση και των δύο χαρακτηριστικών ισχύει ο 2 ος νόμος του Μέντελ ή νόμος της ανεξάρτητης μεταβίβασης των γονιδίων. Το γονίδιο που ελέγχει ένα χαρακτήρα δεν επηρεάζει τη μεταβίβαση του γονιδίου που ελέγχει έναν άλλο χαρακτήρα. Σήμερα είναι γνωστό ότι αυτό ισχύει μόνο για γονίδια που βρίσκονται σε διαφορετικά ζεύγη ομόλογων χρωμοσωμάτων. Ο ανεξάρτητος διαχωρισμός των γονιδίων γίνεται, επειδή τα χρωμοσώματα κάθε γονέα συνδυάζονται με τυχαίο τρόπο κατά τη δημιουργία των γαμετών. Σε κάθε διασταύρωση, οι απόγονοι προκύπτουν από τον τυχαίο συνδυασμό των γαμετών. β) Διασταύρωση Β x Δ: κίτρινα-στρογγυλά πράσινα-ρυτιδωμένα Ρ: ΚΚΣΣ x κκσσ Γαμέτες: ΚΣ κσ Απόγονοι: ΚκΣσ Φαινότυπος: κίτρινα-στρογγυλά Ο γονότυπος του φυτού Δ είναι ομόζυγος για τα υπολειπόμενα αλληλόμορφα, άρα δίνει μόνο έναν τύπο γαμέτη. Σε μια διασταύρωση ελέγχου για να έχουμε μόνο έναν τύπο απογόνων, πρέπει το άτομο που διασταυρώθηκε να είναι ομόζυγο και για τα δύο χαρακτηριστικά προκειμένου να μας δώσει μόνο ένα τύπο γαμέτη. Διασταύρωση Γ x Δ: κίτρινα-στρογγυλά πράσινα-ρυτιδωμένα Ρ: ΚκΣσ x κκσσ Γαμέτες: ΚΣ, Κσ, κσ, κσ κσ Απόγονοι: ΚκΣσ Κκσσ κκσσ κκσσ Φαινότυποι: κίτρινα κίτρινα πράσινα πράσινα στρογγυλά ρυτιδωμένα στρογγυλά ρυτιδωμένα Ο γονότυπος του φυτού Δ είναι ομόζυγος για τα υπολειπόμενα αλληλόμορφα, άρα δίνει μόνο έναν τύπο γαμέτη. Σε μια διασταύρωση ελέγχου για να έχουμε τέσσερις τύπους απογόνων πρέπει το άτομο που διασταυρώθηκε να είναι ετερόζυγο και για τα δύο χαρακτηριστικά προκειμένου να μας δώσει τέσσερις τύπους γαμετών με ίση πιθανότητα για τον καθένα. 18

Διασταύρωση Α x Δ: κίτρινα-στρογγυλά πράσινα-ρυτιδωμένα Ρ: ΚκΣΣ x κκσσ Γαμέτες: ΚΣ, κσ κσ Απόγονοι: ΚκΣσ κκσσ Φαινότυποι: κίτρινα πράσινα στρογγυλά στρογγυλά Ο γονότυπος του φυτού Δ είναι ομόζυγος για τα υπολειπόμενα αλληλόμορφα, άρα δίνει μόνο έναν τύπο γαμέτη. Σε μια διασταύρωση ελέγχου για να έχουμε δύο τύπους απογόνων για το ένα γνώρισμα (κίτρινα, πράσινα) πρέπει το άτομο που διασταυρώθηκε να είναι ετερόζυγο προκειμένου να μας δώσει δύο τύπους γαμετών με ίση πιθανότητα για τον καθένα. Όσον αφορά το άλλο χαρακτηριστικό (στρογγυλά), πρέπει το άτομο που διασταυρώθηκε να είναι ομόζυγο προκειμένου να μας δώσει μόνο ένα τύπο γαμέτη. 3. Ένας γεωργός καλλιεργεί στο κτήμα του ένα φυτό που έχει κίτρινα ή κόκκινα άνθη και καρπούς με στρογγυλό ή ωοειδές σχήμα. Από τη διασταύρωση φυτών με κίτρινα άνθη και στρογγυλούς καρπούς με φυτά που έχουν κόκκινα άνθη και ωοειδείς καρπούς πήρε μόνο φυτά με πορτοκαλί άνθη και ωοειδούς καρπούς. Τα στελέχη που διασταυρώθηκαν ήταν αμιγή και τα γονίδια που ελέγχουν τις δύο ιδιότητες βρίσκονται σε διαφορετικά ζεύγη ομολόγων χρωμοσωμάτων. α) Να κάνετε τη διασταύρωση και να αιτιολογήσετε τα αποτελέσματα. β) Αν διασταυρωθούν μεταξύ τους τα φυτά, που προέκυψαν από την πρώτη διασταύρωση, να υπολογίσετε την πιθανότητα να προκύψουν φυτά με πορτοκαλί άνθη και στρογγυλούς καρπούς. α) Από τη διασταύρωση αμιγών φυτών με κίτρινα άνθη x κόκκινα άνθη εμφανίζεται στους απογόνους νέος φαινότυπος πορτοκαλί άνθη, συνεπώς έχουμε ατελώς επικρατή αλληλόμορφα για το χαρακτηριστικό αυτό: Κ 1 Κ 1 : κίτρινα άνθη Κ 2 Κ 2 : κόκκινα άνθη Κ 1 Κ 2 : πορτοκαλί άνθη Από τη διασταύρωση αμιγών φυτών με στρογγυλό σχήμα καρπών x ωοειδές σχήμα καρπών, όλοι οι απόγονοι εμφανίζουν το χαρακτηριστικό ωοειδές σχήμα καρπών, συνεπώς το αλληλόμορφο που ελέγχει το χαρακτηριστικό αυτό είναι επικρατές: ΩΩ: ωοειδές σχήμα καρπών Ωω: ωοειδές σχήμα καρπών ωω: στρόγγυλο σχήμα καρπών P: Κ 1 Κ 1 ωω X Κ 2 Κ 2 ΩΩ Γαμέτες: Κ 1 ω Κ 2 Ω F 1 : Κ 1 Κ 2 Ωω Για τη διασταύρωση κάθε χαρακτηριστικού ισχύει ο 1 ος νόμος του Μέντελ ή νόμος του διαχωρισμού των αλληλόμορφων γονιδίων, κατά την παραγωγή των γαμετών κατά τη μείωση διαχωρίζονται τα δύο ομόλογα χρωμοσώματα και συνεπώς και τα δύο αλληλόμορφα γονίδια. Σε ένα φυτό ετερόζυγου γονότυπου σχηματίζονται δύο ειδών γαμέτες σε ίση αναλογία ενώ σ ένα φυτό ομόζυγου γονότυπου προκύπτει μόνο ένας τύπος γαμέτη. Για τις διασταυρώσεις και των δύο χαρακτηριστικών ισχύει ο 2 ος νόμος του Μέντελ ή νόμος της ανεξάρτητης μεταβίβασης των γονιδίων. Το γονίδιο που ελέγχει ένα χαρακτήρα 19

δεν επηρεάζει τη μεταβίβαση του γονιδίου που ελέγχει έναν άλλο χαρακτήρα. Σήμερα είναι γνωστό ότι αυτό ισχύει μόνο για γονίδια που βρίσκονται σε διαφορετικά ζεύγη ομόλογων χρωμοσωμάτων. Ο ανεξάρτητος διαχωρισμός των γονιδίων γίνεται, επειδή τα χρωμοσώματα κάθε γονέα συνδυάζονται με τυχαίο τρόπο κατά τη δημιουργία των γαμετών. Οι απόγονοι προκύπτουν από τον τυχαίο συνδυασμό των γαμετών. F 1 x F 1 : Κ 1 Κ 2 Ωω X Κ 1 Κ 2 Ωω Κ Γαμέτες: 1 Ω, Κ 1 ω, Κ 1 Ω, Κ 1 ω, Κ 2 Ω, Κ 2 ω Κ 2 Ω, Κ 2 ω Κ 1 Ω Κ 1 ω Κ 2 Ω Κ 2 ω Κ 1 Ω Κ 1 Κ 1 ΩΩ Κ 1 Κ 1 Ωω Κ 1 Κ 2 ΩΩ Κ 1 Κ 2 Ωω Κ 1 ω Κ 1 Κ 1 Ωω Κ 1 Κ 1 ωω Κ 1 Κ 2 Ωω Κ 1 Κ 2 ωω Κ 2 Ω Κ 1 Κ 2 ΩΩ Κ 1 Κ 2 Ωω Κ 2 Κ 2 ΩΩ Κ 2 Κ 2 Ωω Κ 2 ω Κ 1 Κ 2 Ωω Κ 1 Κ 2 ωω Κ 2 Κ 2 Ωω Κ 2 Κ 2 ωω Πιθανότητα να προκύψουν φυτά με πορτοκαλί άνθη και στρογγυλό σχήμα καρπών 2/16 4. Μια φυσιολογική γυναίκα παντρεύεται έναν άνδρα και αποκτούν δύο παιδιά, το Γιάννη και την Ελένη. Ο Γιάννης παρουσιάζει οικογενή υπερχοληστερολαιμία και β-θαλασσαιμία, ενώ η Ελένη δεν παρουσιάζει καμία από τις δύο ασθένειες. α) Να γράψετε τους πιθανούς γονότυπους των γονέων και των παιδιών και να δικαιολογήσετε την απάντησή σας. β) Εάν οι συγκεκριμένοι γονείς αποκτήσουν και τρίτο παιδί, να προσδιορίσετε την πιθανότητα να πάσχει μόνο από υπερχοληστερολαιμία, χωρίς να ληφθεί υπόψη η β- θαλασσαιμία. Η οικογενής υπερχοληστερολαιµία οφείλεται σε αυτοσωµικό επικρατές γονίδιο ενώ η β- θαλασσαιµία οφείλεται σε αυτοσωµικό υπολειπόµενο γονίδιο. Σύμφωνα με τον 1 ο νόμο του Μέντελ ή νόμο του διαχωρισμού των αλληλόρφων γονιδίων, κατά την παραγωγή των γαμετών κατά τη μείωση διαχωρίζονται τα δύο ομόλογα χρωμοσώματα και συνεπώς και τα δύο αλληλόμορφα γονίδια. Σε ένα άτομο ετερόζυγου γονότυπου σχηματίζονται δύο ειδών γαμέτες σε ίση αναλογία ενώ σ ένα άτομο ομόζυγου γονότυπου προκύπτει μόνο ένας τύπος γαμέτη Σύμφωνα με τον 2 ο νόμο του Μέντελ ή νόμο της ανεξάρτητης μεταβίβασης γονιδίων, το γονίδιο που ελέγχει ένα χαρακτήρα δεν επηρεάζει τη μεταβίβαση του γονιδίου που ελέγχει έναν άλλο χαρακτήρα. Σήμερα είναι γνωστό ότι αυτό ισχύει μόνο για γονίδια που βρίσκονται σε διαφορετικά ζεύγη ομόλογων χρωμοσωμάτων. Ο ανεξάρτητος διαχωρισμός των γονιδίων γίνεται, επειδή τα χρωμοσώματα κάθε γονέα συνδυάζονται με τυχαίο τρόπο κατά τη δημιουργία των γαμετών. Οι διασταυρώσεις αυτού του τύπου, που μελετάται ο τρόπος κληρονόμησης δύο χαρακτήρων, ονομάζονται διασταυρώσεις διυβριδισμού. Στις διασταυρώσεις αυτές κάθε γονέας μπορεί να παράγει γαμέτες με ίση πιθανότητα για τον καθένα. Οι απόγονοι προκύπτουν από τον τυχαίο συνδυασμό των γαμετών. Α: οικογενής υπερχοληστερολαιµία α: φυσιολογικό Β: φυσιολογικό β: β-θαλασσαιµία 20