-1090-9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΔΙΑΤΡΟΦΙΚΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ Α ΣΤΗΝ ΟΣΤΕΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΟΥ ΛΑΒΡΑΚΙΟΥ, DICENTRARCHUS LABRAX (LINNAEUS, 1758) Γλυνάτση Ν. 1, Mazurais D. 2, Χριστοδουλοπούλου Σ. 1, Γεωργακοπούλου Ε. 1, Καραμάνος Δ. 1, Darias M.J. 2, Cahu C.L. 2, Zambonino-Infante J.L. 2, Κουμουνδούρος Γ. 1 1 Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών, koumound@upatras.gr 2 Ifremer Marine Fish Nutrition Team, Nutrition Aquaculture & Genomics Research Unit Περίληψη Μελετήθηκε η επίδραση των διατροφικών επιπέδων βιταμίνης Α στην ανάπτυξη σκελετικών δυσπλασιών στο λαβράκι. Εφαρμόσθηκαν 7 διαφορετικά διατροφικά επίπεδα ρετινόλης (0, 5, 10, 15, 25, 35 και 70 mg ρετινόλης ανά Kg ξηράς τροφής) σε 21 νυμφικούς πληθυσμούς λαβρακιού (3 επαναλήψεις ανά διατροφική ομάδα) κατά τις πρώτες 45 ημέρες ανάπτυξης. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η συγκέντρωση της βιταμίνης Α επιδρά σημαντικά στην ανάπτυξη σκελετικών παραμορφώσεων στις νύμφες και τα ιχθύδια του λαβρακιού. Σημαντικά επηρεάστηκαν δομές του κρανίου (υοειδές τόξο, γνάθοι), η σπονδυλική στήλη, καθώς και τα σκελετικά στοιχεία των πτερυγίων. Τα βέλτιστα επίπεδα των εξεταζόμενων επιπέδων βιταμίνης Α στα οποία παρατηρούνται οι μικρότερες συχνότητες εμφάνισης δυσπλασιών διαφοροποιήθηκαν σημαντικά, ανάλογα με την εξεταζόμενη ανατομική περιοχή. Εντούτοις, η συγκέντρωση 5-10 mg Kg -1 παρατηρήθηκε σε πολλές περιπτώσεις να αντιστοιχεί στο βέλτιστο. Σε αυτό το εύρος παρατηρήθηκε και η μεγιστοποίηση του ρυθμού σωματικής αύξησης των ατόμων. Τα αποτελέσματα συζητούνται ως προς την υπόθεση της αλλαγής των διατροφικών προτιμήσεων του λαβρακιού κατά την πορεία της οντογένεσης. Λέξεις κλειδιά: ρετινόλη, νύμφες, ιχθύδια, σκελετικές δυσπλασίες. EFFECT OF DIETARY VITAMIN A ON THE OSTEOLOGICAL DEVELOPMENT OF european SEA BASS, DICENTRARCHUS LABRAX (LINNAEUS, 1758) Glynatsi Ν. 1, Mazurais D. 2, Christodoulopoulou S. 1, Georgakopoulou Ε. 1, Karamanos D. 1, Darias M.J. 2, Cahu C.L. 2, Zambonino-Infante J.L. 2, Koumoundouros G. 1 1 Biology Department,University of Patras, koumound@upatras.gr 2 Ifremer Marine Fish Nutrition Team, Nutrition Aquaculture & Genomics Research Unit Abstract The goal of this study was to examine the effect of vitamin A on the development of skeletal deformities. The experimental design involved 7 different dietary levels of retinol (0, 5, 10, 15, 25, 35, 70 mg retinol Kg -1 of dry food), in triplicate trials applied during the first 45 days post hatching. Results demonstrated that dietary Vitamin A significantly affected the development of skeletal deformities in both larval and juvenile stages. There was a significant effect on skull structures (hyoid arch and jaws), on the vertebral column and on the fin-supporting elements. The optimum levels of dietary vitamin A differed between the different anatomical areas. However, the range of 5-10 mg Kg -1 was identified as the common optimum. In this range of dietary retinol the growth rate was maximized. Results are discussed in respect to the hypothesis of switching dietary preferences of sea bass during ontogeny. Keywords: retinol, larvae, juveniles, skeletal deformities. 1. Εισαγωγή Η ανάπτυξη σκελετικών παραμορφώσεων στους εκτρεφόμενους πληθυσμούς αποτελεί για την ιχθυοκαλλιέργεια σοβαρό πρόβλημα ποιότητας προϊόντος και κόστους παραγωγής. Οι σκελετικές παραμορφώσεις δεν έχουν ειδο-ειδική έκφραση και αναπτύσσονται κατά τα πρώιμα οντογενετικά στάδια από τη συνεργατική δράση διάφορων γενεσιουργών παραγόντων (Koumoundouros et al. 2002; Sfakianakis et al., 2006; Villeneuve et al., 2005a, 2005b). Το αβιοτικό περιβάλλον εκτροφής, η διατροφή, καθώς και γενετικής φύσης αίτια συγκαταλέγονται στους σημαντικότερους γενεσιουρ-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ γούς παράγοντες των σκελετικών δυσπλασιών. Μελέτες έχουν δείξει τη στενή σχέση μεταξύ της διατροφής των νυμφών και της ανάπτυξης σκελετικών ανωμαλιών (Zambonino Infante et al., 1997; Zambonino Infante & Cahu, 1999; Cahu et al., 2003). Ανάμεσα στα απαραίτητα θρεπτικά, η βιταμίνη Α κατέχει εξέχουσα σημασία. Τα ρετινοειδή είναι μεταβολίτες της βιταμίνης Α και ρυθμίζουν βιολογικές λειτουργίες όπως την κυτταρική διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό και τη μορφογένεση (Ross et al., 2000; Haga et al., 2002). Η απουσία ή η περίσσεια βιταμίνης Α ευθύνεται για περιπτώσεις τερατογένεσης σε θηλαστικά, αμφίβια, πτηνά και ιχθύες, μέσω της μη φυσιολογικής έκφρασης μορφογενετικών γονιδίων (Ross et al., 2000; Haga et al., 2002; Villeneuve et al., 2005a, 2006). Αν και το λαβράκι [Dicentrarchus labrax (Linnaeus, 1758)] αποτελεί ένα από τα κύρια είδη της ευρωπαϊκής ιχθυοκαλλιέργειας, ελάχιστα είναι γνωστά για την επίδραση της διατροφής των πρώιμων αναπτυξιακών σταδίων στην ανάπτυξη σκελετικών δυσπλασιών (Villeneuve et al. 2005a, 2005b, 2006). Στην παρούσα εργασία διερευνάται η επίδραση της βιταμίνης Α στην ανάπτυξη σκελετικών δυσπλασιών στο λαβράκι, με στόχο τον προσδιορισμό των βέλτιστων διατροφικών επιπέδων κατά το κρίσιμο νυμφικό στάδιο. 2. Υλικά και Μέθοδοι 2.1 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΙ ΠΛΗΘΥΣΜΟΙ Νύμφες λαβρακιού ηλικίας τριών ημερών μετά την εκκόλαψη ελήφθησαν από τον ιχθυογεννητικό σταθμό «Ecloserie Marine de Gravelines» (Gravelines, Γαλλία). Οι νύμφες εγκλιματίστηκαν και διαχωρίστηκαν σε 21 κυλινδροκωνικές δεξαμενές (χωρητικότητας 35 λίτρων), με αρχική πυκνότητα 60 άτομα ανά λίτρο. Η αλατότητα του νερού ήταν 35, ενώ η συγκέντρωση οξυγόνου >6 mg/l και ο ρυθμός ανανέωσης του νερού 30% του όγκου της δεξαμενής ανά ώρα (ταχύτητα ροής: 0.18L/ min). Η θερμοκρασία του νερού ήταν 20 ο C, η φωτοπερίοδος 24/0 φως/σκοτάδι και η ένταση του φωτός στην επιφάνεια του νερού 9 W/m². Σε όλη τη διάρκεια των πειραμάτων τα άτομα τράφηκαν με ξηρή τροφή. Η εφαρμογή των διαφορετικών διατροφικών συνθηκών έγινε από την έναρξη του νυμφικού σταδίου (9η ημέρα μετά την εκκόλαψη, dph, 20 o C) μέχρι την ηλικία των 45 dph. Μετά το τέλος εφαρμογής των διαφορετικών συνθηκών, οι 21 πληθυσμοί υποβλήθηκαν σε κοινές διατροφικές συνθήκες μέχρι την ηλικία των 100 dph. Εφαρμόσθηκαν 7 διαφορετικά διατροφικά επίπεδα ρετινόλης σε τρεις επαναλήψεις(0, 5, 10, 15, 25, 35 και 70 mg ρετινόλης ανά Kg ξηράς τροφής). 2.2 ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ Για τη μελέτη των σκελετικών δυσπλασιών, από κάθε πληθυσμό λήφθηκε τυχαίο δείγμα 50±5 νυμφών στο τέλος εφαρμογής των διαφορετικών συνθηκών (45 dph), καθώς και 50±2 ιχθυδίων 55 ημέρες αργότερα (100 dph, 35-45 mm SL). Μετά την αναισθητοποίησή τους, τα δείγματα των νυμφών συντηρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 5%, ενώ εκείνα των ιχθυδίων στους -20 ο C. Ακολούθησε χρώση των χόνδρινων και των οστέινων δομών των νυμφών (Park and Kim 1984), και ραδιογράφηση των ιχθυδίων (Koumoundouros et al., 2000). Το μεσουραίο μήκος των νυμφών μετρήθηκε τρεις ημέρες μετά τη χρώση τους με ατομικές φωτογραφήσεις σε στερεοσκόπιο. Συνολικά μελετήθηκαν 1098 νύμφες και 1053 ιχθύδια. Τα δείγματα νυμφών χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη των παραμορφώσεων που αναπτύσσονται κατά τη διάρκεια του νυμφικού σταδίου (Koumoundouros et al., 1997a, 1997b, 2001a, 2002). Οι ακτινογραφίες αξιοποιήθηκαν κυρίως για τη μελέτη της αιματικής λόρδωσης, η οποία στο λαβράκι αναπτύσσεται στο στάδιο των ιχθυδίων (Sfakianakis et al., 2006). -1091-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ 2.3 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η επίδραση των διατροφικών επιπέδων ρετινόλης στο μέγεθος των νυμφών εξετάστηκε με τις μη παραμετρικές δοκιμές Kruskal-Wallis και Mann Whitney U-test (Sokal & Rohlf, 1981). Το G-test (Sokal & Rohlf, 1981) εφαρμόστηκε για να ελεγχθεί αν οι παρατηρούμενες διαφορές των συχνοτήτων των δυσπλασιών μεταξύ των διαφορετικών πειραματικών συνθηκών ήταν στατιστικά σημαντικές. 3. Αποτελέσματα Η στατιστική επεξεργασία των μηκών έδειξε ότι τα διατροφικά επίπεδα ρετινόλης επηρέασαν σημαντικά το μέγεθος των νυμφών λαβρακιού στην ηλικία των 45 dph, με το βέλτιστο για τη μέγιστη σωματική αύξηση να παρατηρείται στα 5 και 10 mg ρετινόλης ανά Kg τροφής. Οι σκελετικές παραμορφώσεις που αναπτύχθηκαν σε όλες τις ανατομικές περιοχές του σκελετού (κρανίο, σπονδυλική στήλη και τα πτερύγια). Στο κρανίο, οι παραμορφώσεις επηρέασαν τα γναθικά και προγναθικά οστά (σύνδρομο pugheadness), τα οδοντικά (κοντύτερη κάτω γνάθος) καθώς και το γλωσσοϋοειδές (πλάγια και κοιλιακή μετατόπιση). Οι παραμορφώσεις της σπονδυλικής στήλης περιελάμβαναν την αιματική λόρδωση, καθώς επίσης και τη μετατροπή του τελευταίου προαιματικού σπονδύλου σε αιματικό. Στα πτερύγια, οι παρατηρούμενες παραμορφώσεις επηρέασαν τα στηρικτικά οστά του ραχιαίου και των κοιλιακών πτερυγίων, συχνά διαφοροποιώντας και τις αντίστοιχες ακτίνες. Οι παραμορφώσεις του ουραίου πτερυγίου αφορούσαν στα στηρικτικά στοιχεία του (επουραία, υπουραία, παρυπουραία οστά, ουρόστυλο, προουραία κέντρα). Η επίδραση της ρετινόλης στην ανάπτυξη σκελετικών παραμορφώσεων αποδείχθηκε στατιστικά σημαντική για όλες τις ανατομικές περιοχές που εξετάσθηκαν (p<0,05). Η συχνότητα εμφάνισης των κρανιακών παραμορφώσεων ελαττώθηκε σε συγκέντρωση ίση με 0 και 5 mg ρετινόλης ανά Kg τροφής (Εικ. 1Α, 1Β, 1Γ). Οι παραμορφώσεις της σπονδυλικής στήλης ακολούθησαν αντίθετο πρότυπο απόκρισης, με τις υψηλότερες (6 και 65%, Εικ. 1Δ και 1Ε) συχνότητες να εμφανίζονται απουσία ρετινόλης. Οι παραμορφώσεις των πτερυγίων δεν είχαν ενιαίο πρότυπο απόκρισης. Η συχνότητα ανάπτυξης παραμορφώσεων στο ραχιαίο πτερύγιο ελαττώθηκε σε συγκέντρωση 10 mg ρετινόλης ανά Kg τροφής (Εικ. 2Α), ενώ στα κοιλιακά πτερύγια ελαχιστοποιήθηκε σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες του 0 mg ρετινόλης ανά Kg τροφής (Εικ. 2Γ). Τέλος, η ανάπτυξη παραμορφώσεων του ουραίου πτερυγίου ευνοήθηκε απουσία ρετινόλης (Εικ. 2Β). -1092-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Εικ. 1: Επίδραση της ρετινόλης στην ανάπτυξη παραμορφώσεων στο κρανίο και στη σπονδυλική στήλη. Α. σύνδρομο pugheadness. Β. παραμόρφωση του υοειδούς τόξου. Γ. κοντή κάτω γνάθος. Δ. αιματική λόρδωση. Ε. μετατροπή του 12 ου προαιματικού σπονδύλου σε αιματικό. Οι γραμμές σφάλματος ισοδυναμούν με 1SE. Οι διαφορετικοί εκθέτες υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές. Εικ. 2: Επίδραση της ρετινόλης στην ανάπτυξη παραμορφώσεων στα πτερύγια. Α. ραχιαίο πτερύγιο. Β. ουραίο πτερύγιο. Γ. κοιλιακά πτερύγια. Οι γραμμές σφάλματος ισοδυναμούν με 1SE. Οι διαφορετικοί εκθέτες υποδηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές. 4. Συμπεράσματα - Συζήτηση Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδεικνύουν πως τα διατροφικά επίπεδα ρετινόλης για τη βέλτιστη ανάπτυξη των νυμφών του λαβρακιού εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από την ανατομική περιοχή που εξετάζεται. Γεγονός που θα μπορούσε να θεωρηθεί πως έρχεται σε αντίθεση με ένα ενιαίο πρότυπο που θα αναμένονταν για το είδος. Εντούτοις, αυτή η διαφοροποίηση ερμηνεύ- -1093-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ εται λαμβάνοντας υπόψη την οντογένεση των διαφορετικών ανατομικών περιοχών του σκελετού. Συγκεκριμένα στο λαβράκι, δομές όπως οι γνάθοι και το υοειδές τόξο εμφανίζονται στο λεκιθοφόρο νυμφικό στάδιο και μέχρι τα 6,5-7,5 mm TL (ολικό μήκος) (Gluckmann et al., 1999), αρκετά πριν από την ανάπτυξη των σπονδύλων (9-15 mm TL, Marino et al., 1993) και των στηρικτικών στοιχείων των πτερυγίων (6,5-15,0 mm για το ουραίο πτερύγιο, 9,0-14,0 mm για το ραχιαίο και 11,3 mm SL, Koumoundouros et al., 2001b; Marino et al., 1993). Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω θα μπορούσε να προταθεί πως τα μητρικής προέλευσης αποθέματα βιταμίνης Α επαρκούν μέχρι το τέλος του σταδίου της λεκιθοφόρου νύμφης (Koumoundouros et al., 2001b), ενώ ακολούθως η ποσότητα της χορηγούμενης -μέσω της τροφής- βιταμίνη Α πρέπει να αυξάνεται σταδιακά. 5. Ευχαριστίες Η εργασία χρηματοδοτήθηκε από το Ευρωπαϊκό Ερευνητικό Πρόγραμμα FineFish (COLL- CT-2005-012451). 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Cahu, C., Zambonino Infante, J. & Takeuchi, T., 2003. Nutritional components affecting skeletal development in fish larvae. Aquaculture 227 (1-4): 245-258. Gluckmann, I., Huriaux, F., Focant, B. & Vandewalle, P., 1999. Postembryonic development of the cephalic skeleton in Dicentrarchus labrax (Pisces, Perciformes, Serranidae). Bulletin of Marine Science, 65 (1): 11-36. Haga, Y., Suzuki, T. & Takeuchi, T., 2002. Retinoic acid isomers produce malformations in postembryonic development of the Japanese flounder, Paralichthys olivaceus. Zoological Science, 19 (10): 1105-1112. Koumoundouros G., Gagliardi F., Divanach P., Boglione C., Cataudella S. & Kentouri M., 1997a. Normal and abnormal osteological development of caudal fin in Sparus aurata L. fry. Aquaculture, 149 (3-4): 215-226. Koumoundouros, G., Oran, G., Divanach, P., Stefanakis, S. & Kentouri, M., 1997b. The opercular complex deformity in intensive gilthead sea bream (Sparus aurata L.) larviculture. Moment of apparition and description. Aquaculture, 156 (1-2): 165-177. Koumoundouros, G., Divanach, P. & Kentouri, M., 2001a. The effect of rearing conditions on development of saddleback syndrome and caudal fin deformities in Dentex dentex (L.). Aquaculture, 200 (3-4): 285-304. Koumoundouros, G., Divanach, P., Anezaki, L. & Kentouri, M., 2001b. Temperature induced ontogenetic plasticity in sea bass (Dicentrarchus labrax). Marine Biology, 139 (5): 817-830. Koumoundouros, G., Divanach, P., Savaki, A. & Kentouri, M., 2000. Effects of three preservation methods on the evolution of swimbladder radiographic appearance in sea bass and sea bream juveniles. Aquaculture, 182 (1-2): 17-25. Koumoundouros, G., Maingot, E., Divanach, P.& Kentouri, M., 2002. Kyphosis in reared sea bass: ontogeny and effects on mortality. Aquaculture, 209 (1-4): 49-58. Marino, G., Boglione, C., Bertolini, B., Rossi, A., Ferreri, F. & Cataudella, S., 1993. Observations on development and anomalies in the appendicular skeleton of sea bass, Dicentrarchus labrax L. 1758, larvae and juveniles. Aquaculture and Fisheries Management, 24 (4): 445-456. Park, E.H. & Kim, D.S., 1984. A procedure for staining cartilage and bone of whole vertebrate larvae while rendering all other tissues transparent. Stain Τechnology, 59 (5): 269 272. Ross, S.A., McCaffery, P.J., Drager, U.C. & De Luca, L.M., 2000. Retinoids in embryonal development. Physiological Reviews 80 (3): 1021-1054. Sfakianakis, D.G., Koumoundouros, G., Divanach, P. & Kentouri, M., 2004. Osteological development of the vertebral column and of the fins of Pagellus erytrinus (L. 1758). Temperature effect on the developmental plasticity and morphoanatomical abnormalities. Aquaculture, 232 (1-4): 407-424. Sfakianakis, D.G., Georgakopoulou, E., Papadakis, I., Divanach, P., Kentouri, M. & Koumoundouros, G., 2006. Environmental determinants of haemal lordosis in European sea bass, Dicentrarchus labrax (Linnaeus, 1758). Aquaculture, 254 (1-4): 54 64. Villeneuve, L., Gisbert, E., Le Delliou, H., Cahu, C.L. & Zambonino-Infante, J.L., 2005a. Dietary levels of all-trans retinol affect retinoid nuclear receptor expression and skeletal development in European sea bass larvae. British Journal of Nutrition, 93 (6): 791-801. Villeneuve, L., Gisbert, E., Zambonino-Infante, J.L., Quazuguel, P. & Cahu, C.L., 2005b. Effect of nature of dietary lipids on European sea bass morphogenesis: implication of retinoid receptors. British Journal of Nutrition, 94 (6): 877-884. Villeneuve, L., Gisbert, E., Moriceau, J., Cahu, C.L. & Zambonino-Infante, J.L., 2006. Intake of high levels of vitamin A and -1094-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ polyunsaturated fatty acids during different developmental periods modifies the expression of morphogenesis genes in European sea bass (Dicentrarchus labrax). British Journal of Nutrition 95 (4): 677-687. Zambonino-Infante, J.L., Cahu, C. & Peres, A., 1997. Partial substitution of di- and tripeptides for native protein in sea bass diet improves Dicentrarchus labrax larval development. Journal of Nutrition, 127 (4): 608-614. Zambonino-Infante, J.L. & Cahu, C., 1999. High dietary lipids levels enhance digestive tract maturation and improve Dicentrarchus labrax larval development. Journal of Nutrition, 129 (6): 1195-1200. -1095-